ES2366380T3

ES2366380T3 - Método para el tratamiento o prevención de hiperplasia prostática benigna utilizando proteínas formadoras de poros modificadas.

Info

Publication number: ES2366380T3
Application number: ES06761050T
Authority: ES
Inventors: James Thomas Buckley
Original assignee: Protox Therapeutics Inc
Current assignee: Protox Therapeutics Inc
Priority date: 2005-06-14
Filing date: 2006-06-14
Publication date: 2011-10-19
Anticipated expiration: 2026-06-14
Also published as: US20160375095A1; EP1891093A4; JP2008546650A; WO2006133553A1; IL188143A; US8916161B2; US9950029B2; AU2006257664A1; CA2611839C; DE602006020867D1; CN101238145B; KR101365538B1; US20100233191A1; ATE502954T1; EP1891093A1; JP5220594B2; KR20080042067A; DK1891093T3; ZA200710813B; CA2611839A1

Abstract

Una proteína formadora de poros modificada para utilizarla en el tratamiento de la hiperplasia prostática benigna (HPB), obteniendo dicha proteína formadora de poros modificada de una proteína de proaerolisina formadora de poros naturalmente presente y que comprende una o más modificaciones selectivas para la próstata seleccionadas de una secuencia de activación clivable por una proteasa específica para la próstata, y uno o más dominios diana específicos para la próstata capaces de dirigirse selectivamente a las células prostáticas, donde dicha proteína formadora de poros modificada es capaz de matar selectivamente las células prostáticas.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de la hipertrofia prostática benigna y, en particular, al uso de proteínas formadoras de poros modificadas para el tratamiento de la hiperplasia prostática benigna (HPB).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se han descrito muchas proteínas citolíticas (Lesieur et al. Mol. Membr. Biol. 14:45064, 1997). Estas proteínas citotóxicas presentes naturalmente incluyen proteínas de mamíferos como la perforina y proteínas bacterianas como la aerolisina (producida por Aeromonas hydrophila), α-hemolisina (producida por Staphylococcus aureus), toxina alfa (producida por Clostridium septicum), -toxina (producida por Bacillus thuringiensis), antígeno protector de antrax, toxina VCC de Vibrio cholerae, leucocidinas Staphylococcus, toxina LSL de Laetiporus sulphureus, toxina épsilon de Clostridium perfringens, e hidralisinas producidas por Cnidaria spp.

Algunas de estas proteínas citotóxicas, como, por ejemplo, la proaerolisina y la toxina alfa, se sintetizan como protoxinas inactivas. Estas protoxinas contienen funcionalidades específicas entre las que se incluyen un dominio de unión, que permite la unión de la protoxina a una célula, un dominio de toxina, y un dominio de péptido inhibidor N-terminal o C-terminal que contiene un sitio de clivaje de la proteasa. El clivaje del dominio de péptido inhibidor en el sitio de clivaje de la proteasa provoca la activación de la protoxina, causando la oligomerización de la citotoxina en la membrana plasmática, produciendo poros que conducen a la muerte rápida de la célula citolítica (Rossjohn et al. J. Struct. Biol. 121:92-100, 1998). La formación de poros altera físicamente las membranas celulares y provoca la muerte de células en todas las fases del ciclo celular, incluyendo las células no proliferativas (es decir, se detienen). Estas citotoxinas no son específicas por lo que respecta al tipo de células que son capaces de matar, dado que sus dominios de unión se dirigen a moléculas presentes en la mayoría de las células, y generalmente son activadas por proteasas que no son específicas de una célula.

Se ha propuesto que las proteínas formadoras de poros citolíticas o sus versiones modificadas presentan un potencial terapéutico para el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, la Patente estadounidense nº 5.777.078 describe agentes formadores de poros que son activados en la superficie de una célula por una serie de condiciones, incluyendo la proteolisis, para lisar la célula. Estos agentes formadores de poros se pueden utilizar generalmente para destruir células no deseadas asociadas con una condición patológica en un animal. Estas células incluyen, a título meramente enunciativo, células tumorales, células que están crónicamente infectadas con un virus, o células que cuando están mal reguladas o expresadas provocan un estado patológico, como, por ejemplo, las células del sistema inmunológico. WO 98/20135 describe métodos y composiciones relacionados con las proproteínas de la exotoxina Pseudomonas modificadas para que presenten una toxicidad selectiva. La exotoxina es modificada para que sea activada por una proteasa deseada mediante la inserción de una secuencia sensible a la proteasa en la proproteína. En un ejemplo la exotoxina es modificada para insertar un sitio de clivaje de un antígeno prostático específico (PSA) al objeto de fijar como objetivo y matar a las células cancerígenas prostáticas.

La Solicitud de Patente estadounidense nº 2004/0235095 describe el uso de proteínas formadoras de poros citolíticas modificadas para el tratamiento del cáncer de próstata y otros tipos de cánceres. Las proteínas citolíticas pueden ser modificadas para incluir un sitio de clivaje específico para la próstata y/o un dominio diana específico para la próstata y se pueden utilizar para fijar como objetivo y matar selectivamente a las células cancerígenas prostáticas.

El cáncer se caracteriza por un incremento del número de células neoplásicas o anómalas derivadas de un tejido normal, que proliferan para formar una masa tumoral, la invasión de tejidos adyacentes por parte de estas células tumorales neoplásicas, y la generación de células malignas que finalmente se propagan a través de la sangre o del sistema linfático a los nódulos linfáticos regionales y a lugares distantes mediante un proceso denominado metástasis. En un estado canceroso, una célula prolifera en condiciones en las que las células normales no proliferarían. Por lo general, a diferencia de las células normales, las células cancerígenas continúan reproduciéndose, no se especializan ni maduran, y tienen la capacidad de propagarse desde el tejido de origen a otros lugares del cuerpo. Por lo general, estas características de las células cancerígenas se producen como consecuencia de cambios en el patrón relativo de la expresión genética dentro de estas células en comparación con el de las células normales. Muchas estrategias para desarrollar terapias para el tratamiento del cáncer se han concentrado en aprovechar las diferencias en la expresión genética entre las células normales y las células cancerígenas, y se fijan como objetivo a las células cancerígenas utilizando marcadores moleculares que son específicos para las células cancerígenas.

Por lo contrario, la hiperplasia prostática benigna (HPB, también conocida como hipertrofia prostática benigna) es un estado no canceroso resultante de un aumento de tamaño de la glándula prostática como consecuencia de la progresión natural del crecimiento de la próstata con la edad. El aumento de tamaño de la próstata puede ser resultado de una mayor proliferación de las células prostáticas o de un aumento del tamaño de las células prostáticas. Habitualmente este crecimiento progresivo de la próstata no causa problemas hasta que se alcanza una edad avanzada. El Instituto Nacional de Salud (NIH) estadounidense calcula que el 60% de los hombres estadounidenses de más de 60 y menos de 70 años tienen síntomas de HPB, y que esta condición afecta a más del 90% de los hombres de entre 70 y 80 años. Aproximadamente 115 millones de hombres en todo el mundo del grupo de edades de más de 50 años presentan diversos grados de HBP. Debido al envejecimiento de la población, se espera que la prevalencia aumente de forma sustancial en los próximos 20 años. La HPB severa puede provocar graves problemas, tales como infecciones del tracto urinario, daños en la vejiga y renales, incluyendo litiasis vesical, incontinencia y, lo que es más importante, hematuria grave y fallo renal debido a la uropatía obstructiva.

En la actualidad hay varias estrategias disponibles para el tratamiento de la HPB. Estas incluyen la espera vigilante, la terapia médica como la terapia con el bloqueador alfa y la terapia con finasterida, dilatación con balón y diversos procedimientos quirúrgicos, tales como la incisión transuretral de la próstata (ITUP), la resección transuretral de la próstata (RTUP) y la prostatectomía abierta. Pocos tratamientos carecen de consecuencias adversas y este es particularmente el caso de los tratamientos para la HPB, donde existe un delicado equilibrio entre las ventajas y las desventajas de los tratamientos disponibles. Entre los eventos adversos asociados con los tratamientos disponibles actuales para la HPB se encuentran la impotencia (en diversos procedimientos quirúrgicos, que oscilan entre el 4% y el 40%, la incidencia de la impotencia también aumenta después de algunos tratamientos médicos), la incontinencia (incontinencia por estrés aproximadamente del 3% después de la cirugía, con la incontinencia urinaria total aproximándose al 1%) y la necesidad de un nuevo tratamiento. El análisis combinado de los datos publicados estimó que la probabilidad media de la mortalidad perioperatoria (muerte en el plazo de 90 días a partir de un procedimiento) era del 1,5% para la RTUP. En el caso de la cirugía abierta era del 2,4% y del 3,5% para la dilatación con balón.

En la actualidad, la terapia hormonal utilizada con más frecuencia es la administración oral de finasterida. La finasterida, comercializada con el nombre comercial de Proscar™ de Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., es un compuesto sintético 4-azasteroide, un inhibidor específico de la 5α-reductasa Tipo II, y una enzima intracelular que convierte la testosterona andrógena en 5α-dihidrotestosterona (DHT). La finasterida ayuda a encoger la próstata agradada y reduce el PSA elevado debido a las condiciones prostáticas benignas. No obstante, se sabe que la finasterida causa efectos secundarios indeseables, que incluyen impotencia o una reducción del deseo sexual, problemas de eyaculación y aumento del tamaño y/o dolor en el pecho. La dutasterida (Duagen) es otro fármaco para el tratamiento de la HPB y es capaz de bloquear la 5α-reductasa tanto de tipo I como de tipo II. Los efectos secundarios sexuales son similares a los de la finasterida.

Los agentes bloqueadores del receptor adrenérgico alfa-1 también se utilizan actualmente para el tratamiento clínico de la hiperplasia prostática benigna. Algunos ejemplos son el hidrocloruro de tamsulosina, hidrocloruro de terazosina, hidrocloruro de alfuzosina y mesilato de doxazosina. La reducción de los síntomas de la HPB y la mejora del flujo de orina tras la administración de un agente bloqueador del receptor adrenérgico alfa-1 están relacionadas con la relajación del músculo liso producida por el bloqueo de los receptores adrenérgicos alfa-1 en el cuello de la vejiga y la próstata.

Por otra parte, también se han utilizado extractos y esteroles de plantas para el tratamiento de la hiperplasia prostática benigna.

La Solicitud de Patente estadounidense nº 20040081659 describe conjugados útiles para tratar la HPB, que comprenden 1) oligopéptidos con secuencias de aminoácidos que son selectiva y proteolíticamente clivados por el PSA, químicamente unidos a 2) agentes citotóxicos alcaloides de vinca. Teóricamente, la actividad citotóxica del alcaloide es baja en el conjugado y aumenta cuando la unión es clivada por el PSA.

La Solicitud de Patente europea 0652014 describe un tratamiento para la HPB que comprende la administración del PSA (antígeno prostático específico) unido a un portador inmunógeno para inducir la producción de anticuerpos contra el PSA. También se pueden utilizar anticuerpos contra el PSA. El portador inmunógeno puede ser la toxina del tétanos, la toxina de la difteria o la toxina del cólera cadena B.

La Patente estadounidense nº 6.379.669 describe un método para fijarse por objetivo un órgano específico, uniendo un agente terapéutico a un anticuerpo o fragmentos del mismo. Estos agentes terapéuticos unidos (o inmunoconjugados) se pueden utilizar para tratar el cáncer de próstata, la HPB o la prostatitis. Los inmunoconjugados incluidos son anticuerpos contra el PSA que se unen a diversos agentes bioactivos. Los agentes bioactivos pueden incluir toxinas bacterianas. Del mismo modo, en la Solicitud de Patente estadounidense nº 20020001588, la unión química de anticuerpos y diversos agentes terapéuticos bioactivos se estudia en más profundidad.

Esta información de fondo se proporciona al objeto de dar a conocer información que el solicitante considera que puede ser relevante para la presente invención. No se pretende necesariamente reconocer ni se debe interpretar que ninguna de las informaciones precedentes constituye el estado anterior de la técnica con respecto a la presente invención.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Un objeto de la presente invención consiste en proporcionar un método para tratar o prevenir la hiperplasia prostática benigna utilizando proteínas formadoras de poros.

La invención se define en las reivindicaciones.

De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, se proporciona una proteína formadora de poros modificada para utilizarla en la reducción del tamaño de la próstata en un sujeto, obteniendo dicha proteína formadora de poros modificada de una proteína formadora de poros naturalmente presente y que comprende una o más modificaciones selectivas para la próstata seleccionadas de una secuencia de activación clivable por una proteasa específica para la próstata, y uno o más dominios diana específicos para la próstata capaces de dirigirse selectivamente a las células prostáticas, en los que dicha proteína formadora de poros modificada es capaz de matar selectivamente las células prostáticas.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona una proteína formadora de poros modificada para utilizarla en el tratamiento de la hiperplasia prostática benigna (HPB), obteniendo dicha proteína formadora de poros 15 modificada de una proteína de proaerolisina formadora de poros naturalmente presente y que comprende una o más modificaciones selectivas para la próstata seleccionadas de una secuencia de activación clivable por una proteasa específica para la próstata, y uno o más dominios diana específicos para la próstata capaces de dirigirse selectivamente a las células prostáticas, en los que dicha proteína formadora de poros modificada es capaz de matar selectivamente las células prostáticas.

De acuerdo con otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un uso de una proteína formadora de poros modificada de la invención en la preparación de un medicamento para reducir el tamaño de la próstata en un sujeto, obteniendo dicha proteína formadora de poros modificada de una proteína formadora de poros naturalmente presente y que comprende una o más modificaciones selectivas para la próstata seleccionadas de una secuencia de activación clivable por una proteasa específica para la próstata, y uno o más dominios diana específicos para la próstata capaces de dirigirse selectivamente a las células prostáticas, en los que dicha proteína formadora de poros modificada es capaz de matar selectivamente las células prostáticas.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un uso de una proteína formadora de poros modificada de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la hiperplasia prostática benigna (HPB).

De acuerdo con otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método para reducir el tamaño de la próstata en un sujeto, que comprende la administración a dicho sujeto de una cantidad efectiva de una proteína formadora de poros modificada, obteniendo dicha proteína formadora de poros modificada de una proteína formadora de poros naturalmente presente y que comprende una o más modificaciones selectivas para la próstata seleccionadas de una secuencia de activación clivable por una proteasa específica para la próstata, y uno o más dominios diana específicos para la próstata capaces de dirigirse selectivamente a las células prostáticas, en los que dicha proteína formadora de poros modificada es capaz de matar selectivamente las células prostáticas.

De acuerdo con otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método para tratar la hiperplasia prostática benigna (HPB) en un sujeto, que comprende la administración a dicho sujeto de una cantidad efectiva de una proteína formadora de poros modificada, obteniendo dicha proteína formadora de poros modificada de una proteína formadora de poros naturalmente presente y que comprende una o más modificaciones selectivas para la próstata seleccionadas de una secuencia de activación clivable por una proteasa específica para la próstata, y uno o más dominios diana específicos para la próstata capaces de dirigirse selectivamente a las células prostáticas, en los que dicha proteína formadora de poros modificada es capaz de matar selectivamente las células prostáticas.

De acuerdo con otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona una proteína de proaerolisina modificada que comprende una o más mutaciones en un dominio de unión al lóbulo grande, y una o más modificaciones específicas para la próstata seleccionadas de un dominio diana específico para la próstata capaz de dirigirse selectivamente a las células prostáticas y una secuencia de activación clivable por una proteasa específica para la próstata, donde dicha proaerolisina modificada es capaz de matar selectivamente las células prostáticas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS ILUSTRACIONES

Estas y otras características de la invención resultarán más evidentes en la siguiente descripción detallada en la que se hace referencia a las ilustraciones adjuntas.

La Figura 1 presenta un esquema de los dominios de proaerolisina (no ilustrados a escala) y muestra el resultado de la activación por furina.

La Figura 2 representa un gráfico de barras que muestra los resultados de un ensayo de hemolisis en el que la MPP1 es preincubada con plasma humano o plasma humano al que se le ha añadido PSA enzimáticamente activo

(10.000 ng/ml).

La Figura 3 representa un gráfico que compara la toxicidad in vitro de varias MPP de acuerdo con las realizaciones de la invención con la de la proaerolisina. Las MPP se obtienen de la proaerolisina e incluyen un sitio de clivaje de PSA en lugar del sitio de furina natural.

Las Figuras 4A a 4E son ilustraciones esquemáticas (no a escala) que muestran cómo la proteína de la proaerolisina se puede modificar para generar varias MPP diferentes obtenidas de la proaerolisina, de acuerdo con realizaciones de la presente invención. El símbolo “*” representa una o más mutaciones puntuales y/o una o más deleciones que reducen la función del dominio de unión a proaerolisina (es decir, la capacidad para concentrarse en una membrana celular).

La Figura 4A representa una ilustración esquemática de una proaerolisina natural. La Figura 4B representa una ilustración esquemática de una MPP obtenida de proaerolisina, con una secuencia de activación modificada para incluir un sitio de clivaje de proteasa específica para la próstata. La Figura AC representa una ilustración esquemática de una MPP obtenida de proaerolisina, con una secuencia de activación modificada para incluir uno o más sitios de clivaje de proteasa específica para la próstata. La Figura 4D representa una ilustración esquemática de una MPP obtenida de proaerolisina, con una secuencia de activación modificada para incluir un sitio de clivaje de proteasa específico para la próstata y con un dominio de unión natural con deleciones funcionales. El dominio de unión natural con deleciones funcionales es generado mediante una o más mutaciones puntuales o una o más deleciones. La Figura 4E representa una ilustración esquemática de una MPP obtenida de proaerolisina, con una secuencia de activación modificada para incluir un sitio de clivaje de proteasa específico para la próstata y con un dominio de unión natural sustituido funcionalmente. El dominio de unión natural con deleciones funcionales es generado como se describe en la Figura 4D. En esta realización, se pueden añadir uno o más dominios diana específicos para la próstata en el N-terminal de la MPP o en el extremo C-terminal del dominio de la toxina de la MPP.

La Figura 5A representa una ilustración esquemática de una MPP obtenida de proaerolisina, con una secuencia de activación modificada para incluir un sitio de clivaje de proteasa específico para la próstata y con un dominio de unión natural sustituido funcionalmente 5. El dominio de unión natural es modificado mediante una o más mutaciones puntuales o una o más deleciones. Opcionalmente se pueden añadir uno o más dominios diana específicos para la próstata en la MPP en Y215C o A300C. La Figura 5B representa una ilustración esquemática de una MPP obtenida de proaerolisina, con una secuencia de activación modificada para incluir un sitio de clivaje de proteasa específico para la próstata y con un dominio de unión natural con deleciones funcionales. En el dominio de unión natural se realizan deleciones funcionales mediante la deleción de uno de los dominios de unión naturales de la proaerolisina. La Figura 5C representa una ilustración esquemática de una MPP obtenida de proaerolisina, con una secuencia de activación modificada para incluir un sitio de clivaje de proteasa específico para la próstata y con un dominio de unión natural sustituido funcionalmente. En esta realización, se pueden añadir uno o más dominios diana específicos para la próstata en el extremo N-terminal del dominio de la toxina de la MPP o en el extremo C-terminal del dominio de la toxina de la MPP. En uno de los dominios de unión naturales de la MPP se realizan las deleciones descritas en la Figura 5B. La Figura 5D representa una ilustración esquemática de una MPP obtenida de proaerolisina, con una secuencia de activación modificada para incluir un sitio de clivaje de proteasa específico para la próstata y con un dominio de unión natural sustituido funcionalmente. Se pueden añadir uno o más dominios diana específicos para la próstata en la MPP en Y215C o A300C. En uno de los dominios de unión naturales de la MPP se realizan las deleciones descritas en la Figura 5B.

De acuerdo con una realización de la invención, la Figura 6A representa una ilustración esquemática de una MPP obtenida de proaerolisina con un dominio de unión natural sustituido funcionalmente. La MPP comprende también uno o más dominios diana específicos para la próstata. Se realizan deleciones funcionales en un dominio de unión natural de la MPP mediante la mutación o deleción de uno o más residuos de aminoácidos. De acuerdo con una realización de la invención, la Figura 6B representa una ilustración esquemática de una MPP obtenida de proaerolisina con un dominio de unión natural sustituido funcionalmente. La MPP comprende también uno o más dominios diana específicos para la próstata añadidos a proaerolisina en Y215C o A300C. Se realizan deleciones funcionales en un dominio de unión natural de la MPP mediante la mutación o deleción de uno o más residuos de aminoácidos. De acuerdo con una realización de la invención, la Figura 6C representa una ilustración esquemática de una MPP obtenida de proaerolisina con un dominio de unión natural sustituido funcionalmente. La MPP comprende también uno o más dominios diana específicos para la próstata. En el dominio de unión natural se realizan deleciones funcionales mediante la deleción de uno de los dominios de unión naturales de la proaerolisina. De acuerdo con otra 5 realización de la invención, la Figura 6D representa una ilustración esquemática de una MPP obtenida de proaerolisina con un dominio de unión natural sustituido funcionalmente. La MPP comprende también uno o más dominios diana específicos para la próstata añadidos a proaerolisina en Y215C o A300C. En el dominio de unión natural se realizan deleciones funcionales mediante la deleción de uno de los dominios de unión naturales de la proaerolisina.

La Figura 7 representa una secuencia de ADNc de proaerolisina natural (SEC. ID. Nº 1).

La Figura 8 representa una secuencia de aminoácido de proaerolisina natural (SEC. ID. Nº 2).

La Figura 9 representa la secuencia de ADNc (SEC. ID. Nº 3) de una MPP, de acuerdo con una realización de la invención (MPP1), en la que el sitio de la furina de la proaerolisina ha sido sustituido por un sitio de clivaje del PSA.

La Figura 10 representa la secuencia de aminoácido (SEC. ID. Nº 4) de una MPP, de acuerdo con una realización de la invención (MPP1), en la que el sitio de la furina de la proaerolisina ha sido sustituido por un sitio de clivaje del PSA.

La Figura 11 representa la secuencia de aminoácido (SEC. ID. Nº 5) de un sitio de clivaje del PSA que se encuentra en las proteínas humanas semenogelinas I y II.

La Figura 12 representa la secuencia de ADNc (SEC. ID. Nº 6) de una MPP, de acuerdo con una realización de la invención (MPP2), en la que el sitio de la furina de la proaerolisina ha sido sustituido por un sitio de clivaje del PSA.

La Figura 13 representa la secuencia de aminoácido (SEC. ID. Nº 7) de una MPP, de acuerdo con una realización de la invención (MPP2), en la que el sitio de la furina de la proaerolisina ha sido sustituido por un sitio de clivaje del PSA.

La Figura 14 representa un ejemplo de un sitio de clivaje del PSA (SEC. ID. Nº 8).

La Figura 15 representa la secuencia de ADNc (SEC. ID. Nº 9) de una MPP, de acuerdo con una realización de la invención (MPP3), en la que el sitio de la furina de la proaerolisina ha sido sustituido por un sitio de clivaje del PSA.

La Figura 16 representa la secuencia de aminoácido (SEC. ID. Nº 10) de una MPP, de acuerdo con una realización de la invención (MPP3), en la que el sitio de la furina de la proaerolisina ha sido sustituido por un sitio de clivaje del PSA.

La Figura 17 representa un segundo ejemplo de un sitio de clivaje del PSA (SEC. ID. Nº I 1).

La Figura 18 representa la secuencia de ADNc (SEC. ID. Nº 12) de una MPP, de acuerdo con una realización de la invención (MPP4), en la que el sitio de la furina de la proaerolisina ha sido sustituido por un sitio de clivaje del PSA.

La Figura 19 representa la secuencia de aminoácido (SEC. ID. Nº 13) de una MPP, de acuerdo con una realización de la invención (MPP4), en la que el sitio de la furina de la proaerolisina ha sido sustituido por un sitio de clivaje del PSA.

Las Figuras 20 a 27 representan las secuencias de aminoácido de sitios de clivaje del PSA alternativos de acuerdo con la presente invención (SEC. ID. Nº 14 a 21, respectivamente).

La Figura 28 representa una secuencia de aminoácido (SEC. ID. Nº 22) de la hormona que libera a la hormona luteinizante (LHRH) natural.

La Figura 29 representa una secuencia de aminoácido (SEC. ID. Nº 23) de la hormona que libera a la hormona luteinizante (LHRH) modificada.

La Figura 30 representa la secuencia de aminoácido (SEC. ID. Nº 24) de una MPP, de acuerdo con una realización de la presente invención (MPP6), en la que el sitio de la furina de la proaerolisina ha sido sustituido por un sitio de clivaje del PSA y en la que el dominio de unión natural de la proaerolisina ha sido modificado.

La Figura 31 representa la secuencia de aminoácido de una MPP, de acuerdo con una realización de la presente invención (MPP7), en la que el sitio de la furina de la proaerolisina se mantiene y se realiza una deleción del dominio de unión natural de la proaerolisina para sustituirlo por la SEC. ID. Nº 23 (SEC. ID. Nº 25).

La Figura 32 representa el efecto de una MPP, de acuerdo con una realización de la invención (MPP5), en la glándula prostática de los monos después de tres días de tratamiento. A y B representan las glándulas prostáticas de los monos de control tratados con el vehículo solamente; C y D representan las glándulas prostáticas de monos tratados con 1 g de la MPP; E y F representan las glándulas prostáticas de monos tratados con 5 g de la MPP; y G y H representan las glándulas prostáticas de monos tratados con 25 g de la MPP.

La Figura 33 representa los efectos de una MPP, de acuerdo con una realización de la invención (MPP5), en la glándula prostática de los monos después de 15 días de tratamiento. A y B representan las glándulas prostáticas de los monos de control tratados con el vehículo solamente; C y D representan las glándulas prostáticas de monos tratados con 1 g de la MPP; E y F representan las glándulas prostáticas de monos tratados con 5 g de la MPP; y G y H representan las glándulas prostáticas de monos tratados con 25 g de la MPP.

La Figura 34 representa la secuencia del nucleótido de la MPP5 (SEC. ID. Nº 30). El codón de inicio ATG y el codón de terminación TAA están subrayados y en negrita. Los sitios de restricción Hindlll y EcoRI están en negrita. El sitio de corte del PSA está subrayado y la etiqueta 6 His está en cursiva y negrita.

La Figura 35 representa la secuencia de aminoácido de la MPP5 (SEC. ID. Nº 31). La secuencia de aminoácido se obtuvo de la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 34. Los aminoácidos 427 a 432 (el sitio de corte del PSA) están subrayados y en negrita. La etiqueta 6 His está en negrita.

La Figura 36 representa la activación de la MPP5 en medios acondicionados con fragmentos de tejido prostático, sometidos a ensayo por grado de hidrólisis de glóbulos rojos lavados.

La Figura 37 representa la capacidad de los sueros de diversas especies para la clivación de MPP5.

La Figura 38 representa el efecto de la MPP5 sobre las próstatas de los monos.

La Figura 39 representa la respuesta humoral a la administración de MPP5 en monos.

La Figura 40 representa la secuencia del nucleótido (SEC. ID. Nº 73) de una toxina alfa Clostridium septicum natural.

La Figura 41 representa la secuencia del aminoácido (SEC. ID. Nº 74) de una toxina alfa Clostridium septicum natural.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención reivindicada se refiere al uso de proteínas formadoras de poros modificadas para el tratamiento de la HPB. Las MPP se obtienen de proteínas formadoras de poros naturales (nPP) que matan a las células penetrando por la membrana y formando poros o canales en las membranas celulares de las células diana, provocando la muerte de las células. En una realización, la MPP penetra por la membrana celular, de forma irreversible, y así las células espectadoras no se ven afectadas. Las MPP comprenden modificaciones selectivas para la próstata que dotan a las MPP de la capacidad de dirigirse selectivamente a las células prostáticas normales con respecto a las células de otros tejidos. Las MPP son capaces de matar selectivamente células prostáticas normales in vivo y de reducir el peso o el volumen de la glándula prostática normal in vivo. De este modo, de acuerdo con la presente invención, las MPP pueden utilizarse solas o en combinación con otras terapias para el tratamiento de la HPB. Esto contrasta con las moléculas descritas en la Solicitud de Patente estadounidense nº 20040235095, que describe el uso de proteínas citolíticas modificadas para tratar el cáncer de próstata localizado o metastásico.

Definiciones

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos empleados en el presente tienen el significado que entendería normalmente una persona con unos conocimientos normales del campo al que pertenece esta invención.

Por lo general, las técnicas y procedimientos se realizan de acuerdo con métodos convencionales en el campo y diversas referencias generales (véase, en general, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., y Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York: Plenum Press (1983) for fluorescence techniques). Las técnicas estándar son empleadas para las síntesis químicas, análisis químicos y ensayos biológicos. A lo largo de toda la divulgación, se entenderá que los siguientes términos, a menos que se indique lo contrario, tienen los significados siguientes.

En el presente, el término “aproximadamente” se refiere a una variación de +/-10% con respecto al valor nominal. Se entenderá que dicha variación está siempre incluida en cualquier valor determinado proporcionado en el presente, se mencione específicamente o no.

El término “específico para la próstata” empleado en el presente con respecto a una entidad o fracción indica que la entidad/fracción o una propiedad de la entidad/fracción es selectiva para las células prostáticas en comparación con otros tipos de células. Por ejemplo, una entidad/fracción específica para la próstata puede ser selectivamente expresada por células prostáticas, selectivamente asociada con células prostáticas, selectivamente activada por células prostáticas, ser capaz de unirse selectivamente a células prostáticas, o similares.

El término “secuencia de activación específica para la próstata”, empleado en el presente, se refiere a una secuencia de residuos de aminoácidos que incorpora uno o más sitios de clivaje de la proteasa específica para la próstata, que son selectivamente sometidos a clivaje o hidrólisis por una proteasa específica para la próstata.

El término “dominio diana específico para la próstata”, empleado en el presente, se refiere a una molécula como un ligando peptídico, toxina o anticuerpo, que es capaz de unirse selectivamente a una célula prostática en comparación con su capacidad para unirse a otros tipos de células.

El término “gen”, utilizado en el presente, se refiere a un segmento de ácido nucleico que codifica una proteína individual o ARN (también denominada “secuencia de codificación” o “región de codificación”), junto con regiones reguladoras asociadas, como promotores, operadores, terminadores y similares, que pueden ubicarse en corriente ascendente o corriente descendente de la secuencia de codificación.

El término “hibridizar selectivamente”, utilizado en el presente, se refiere a la capacidad de un ácido nucleico para unirse de forma detectable y específica a un segundo ácido nucleico. Los polinucleotidos, oligonucleotidos y fragmentos de los mismos se hibridizan selectivamente para dirigirse a cadenas de ácido nucleico en unas condiciones de hibridización y lavado que minimizan cantidades considerables de la unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Se pueden utilizar unas condiciones muy rigurosas para conseguir unas condiciones de hibridización selectivas conocidas en el campo y debatidas en el presente. Típicamente, las condiciones de hibridización y lavado se realizan de forma muy rigurosa, de acuerdo con los procedimientos de hibridización convencionales. Las condiciones de lavado son típicamente 1-3 x SSC, 0,1-1% SDS, 50-70°C con un cambio de solución de lavado después de aproximadamente 5 a 30 minutos.

Los términos “correspondiente a” o “corresponde a” indican que una secuencia de polinucleótidos es idéntica a la totalidad o una parte de una secuencia de polinucleótidos de referencia. Por lo contrario, el término “complementario a” se utiliza en el presente para indicar que la secuencia de polinucleótidos es idéntica a la totalidad o una parte de la cadena complementaria de una secuencia de polinucleótidos de referencia. A título ilustrativo, la secuencia de nucleótidos “TATAC” corresponde a una secuencia de referencia “TATAC” y es complementaria a una secuencia de referencia “GTATA”.

Los siguientes términos se utilizan en el presente para describir las relaciones de las secuencias entre dos o más polinucleótidos o dos o más polipéptidos: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de la secuencia", "identidad porcentual de la secuencia" e "identidad sustancial". Una “secuencia de referencia” es una secuencia definida utilizada como base para la comparación de una secuencia; una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, por ejemplo, como un segmento de una secuencia de proteína, gen o ADNc entera o puede comprender una secuencia completa de proteína, gen o ADNc. Por lo general, una secuencia de polinucleótidos de referencia tiene al menos 20 nucleótidos de longitud y a menudo al menos 50 nucleótidos de longitud. Por lo general, una secuencia de polipéptidos de referencia tiene al menos 7 aminoácidos de longitud y a menudo al menos 17 aminoácidos de longitud.

Una “ventana de comparación”, en el presente documento, se refiere a un segmento conceptual de la secuencia de referencia de al menos 15 posiciones contiguas del nucleótido o al menos 5 posiciones contiguas del aminoácido sobre el que se puede comparar una secuencia candidata con la secuencia de referencia y donde la porción de la secuencia candidata de la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (por ejemplo, espacios) del 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para una alineación óptima de las dos secuencias. La presente invención contempla diversas longitudes para la ventana de comparación, hasta e incluyendo la longitud total de la secuencia de referencia o candidata. La alineación óptima de las secuencias para alinear una ventana de comparación se puede realizar utilizando el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Adv. Appl Math. (1981) 2:482), el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (1970) 48:443), el método de la búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) (1988) 85:2444), utilizando aplicaciones informatizadas de estos algoritmos (tales como GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 573 Science Dr., Madison, WI), utilizando software informático a disposición del público, como ALIGN o Megalign (DNASTAR), o mediante la inspección. Entonces se selecciona la mejor alineación (es decir, la que proporciona el mayor porcentaje de identidad sobre la ventana de comparación).

El término “identidad de la secuencia” significa que dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos son idénticas (es decir nucleótido a nucleótido o aminoácido a aminoácido).

El término “identidad porcentual (%) de la secuencia”, en el presente documento con respecto a una secuencia de referencia se define como el porcentaje de residuos de nucleótido o aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de la secuencia de polipéptidos de referencia sobre la ventana de comparación tras una alineación óptima de las secuencias e introduciendo espacios, si es necesario, para conseguir la identidad porcentual de la secuencia máxima, sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de la secuencia.

El término “identidad sustancial” utilizado en el presente denota una característica de una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos, en la que el polinucleótido o polipéptido comprende una secuencia que tiene al menos una identidad de secuencia del 50% en comparación con una secuencia de referencia sobre la ventana de comparación. Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos que tienen al menos una identidad de secuencia del 60%, al menos una identidad de la secuencia del 70%, al menos una identidad de la secuencia del 80%, o al menos una identidad de la secuencia del 90% en comparación con una secuencia de referencia sobre la ventana de comparación también se considera que tienen una identidad sustancial con la secuencia de referencia.

El término “deleción funcional” utilizado en el presente denota una mutación, una deleción parcial o completa, una inserción u otra variación introducida en una secuencia genética que hace que esa parte de la secuencia genética no sea funcional. Por ejemplo, la deleción funcional de un dominio de unión de la proaerolisina (PA) provoca una reducción de la capacidad de la PA para unirse a la membrana celular y para concentrarse sobre la misma. Esta deleción funcional se puede invertir insertando otro dominio de unión funcional en la proaerolisina, como un dominio diana específico para la próstata, por ejemplo, un péptido de la LHRH. Esta inversión de una deleción funcional se denomina en el presente “sustitución funcional”. En otro ejemplo, la deleción funcional de un sitio de clivaje de furina de la PA natural provoca una reducción de la capacidad de la PA para ser clivada y activada por furina, en comparación con una molécula de PA natural.

Los términos “terapia” y “tratamiento” utilizados indistintamente en el presente se refieren a una intervención realizada con la intención de mejorar el estado de un sujeto. La mejora puede ser subjetiva u objetiva y está relacionada con la mejoría de los síntomas asociados con la patología, la contención de su desarrollo o alteración de una enfermedad o trastorno que se está tratando. Por tanto, los términos terapia y tratamiento se utilizan en el sentido más amplio e incluyen la prevención (profilaxis), moderación, reducción y cura de una enfermedad o trastorno en diversas fases. El término también incluye la prevención del deterioro del estado de un sujeto. Por tanto, los sujetos que necesitan terapia/tratamiento incluyen a quienes ya tienen la enfermedad o el trastorno, así como los que son propensos o corren el riesgo de desarrollar la enfermedad o el trastorno y en quienes esta enfermedad o trastorno se ha de prevenir.

El término “mejorar” incluye la detención, prevención, reducción o mejoría de uno o más de los síntomas, signos y características de la enfermedad o el trastorno que se está tratando, sea temporalmente o a largo plazo.

El término “sujeto” o “paciente” utilizado en el presente se refiere a un animal que necesita tratamiento.

El término “animal” utilizado en el presente se refiere a animales tanto humanos como no humanos, incluyendo, a título meramente enunciativo, mamíferos, aves y peces.

La administración de las proteínas o los polipéptidos de la invención “en combinación con” uno o más agentes terapéuticos o tratamientos adicionales está pensada para incluir la administración simultánea (concurrente) y la administración consecutiva. La administración consecutiva está prevista para abarcar la administración del agente o los agentes terapéuticos o el tratamiento adicional y el compuesto o los compuestos de la invención al sujeto en diversos órdenes y por diversas vías.

Los términos “antígeno” y “material antigénico” se utilizan indistintamente en el presente para referirse a una molécula, moléculas, una porción o porciones de una molécula, o una combinación de moléculas, hasta e incluyendo células completas y tejidos, que son capaces de inducir una respuesta inmunológica en un animal. El material antigénico puede comprender un único epitope o determinante antigénico o puede comprender una pluralidad de epitopes o determinantes antigénicos.

El término “respuesta inmunológica”, utilizado en el presente, se refiere a una alteración en la reactividad del sistema inmunológico de un animal en respuesta a un antígeno o material antigénico y puede implicar la producción de anticuerpos, la inducción de la inmunidad mediada por células, la activación del complemento y/o el desarrollo de tolerancia inmunológica.

El término “inhibir” utilizado en el presente significa disminuir, reducir, ralentizar o prevenir.

“Par de unión” se refiere a dos fracciones (por ejemplo, químicas o bioquímicas) que tienen una afinidad entre sí. Entre los ejemplos de pares de unión se incluyen homodímeros, heterodímeros, antígeno/anticuerpo, lectina/avidina, polinucleótido/sonda, oligonucleótido, anticuerpo/anti-anticuerpo, receptor/ligando, enzima/ligando y similares. “Un miembro de un par de unión” se refiere a una fracción del par, como un antígeno o ligando.

“Polinucleótido aislado” se refiere a un polinucleótido de origen genómico, de ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos, que, en virtud de su origen, el “polinucleótido aislado” (1) no está asociado con la célula en la que el “polinucleótido aislado” se encuentra naturalmente presente, o (2) está operativamente unido a un polinucleótido al que no está unido por naturaleza.

El término “polipéptido” se utiliza en el presente como término genérico para referirse a una secuencia de aminoácidos de al menos 20 aminoácidos de longitud que puede ser una secuencia de proteínas natural, un fragmento de una secuencia de proteínas natural, una variante de una secuencia de proteínas natural, un derivado de una secuencia de proteínas natural o un análogo de una secuencia de proteínas natural. Por tanto, las secuencias de proteínas naturales y fragmentos, variantes, derivados y análogos de secuencias de proteínas naturales, definidos en el presente, se consideran especies del genéro polipéptido.

El término “polipéptido aislado” utilizado en el presente se refiere a un polipéptido que, en virtud de su origen, no está asociado con otros polipéptidos con los que normalmente se asocia naturalmente, y/o está aislado de la célula en la que normalmente ocurre y/o está libre de otros polipéptidos de la misma fuente celular y/o está expresado por una célula de una especie diferente, y/o no ocurre naturalmente.

Los términos “naturalmente presente” o “natural” utilizados en el presente, aplicados a un objeto, se refieren al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos que está presente en un organismo (incluyendo virus) que se puede aislar de una fuente en la naturaleza y que no ha sido intencionalmente modificada por el hombre en el laboratorio es una secuencia naturalmente presente.

“Operativamente unido” se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos mantienen una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Una secuencia de control “operativamente unida” a una secuencia de codificación está ligada de tal forma que la expresión de la secuencia de codificación se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.

“Secuencia de control” se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión de las secuencias de codificación y no codificación a las que están ligadas. La naturaleza de estas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, estas secuencias de control incluyen generalmente el promotor, el sitio de unión ribosomal y la secuencia de terminación de la transcripción; en eucariotas, estas secuencias de control incluyen por lo general promotores y secuencias de terminación de la transcripción. El término “secuencias de control” está previsto que incluya, como mínimo, componentes cuya presencia puede influir en la expresión, y puede incluir también componentes adicionales cuya presencia es provechosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de las parejas de fusión.

El término “polinucleótido” se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de largo, sean ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquiera de los tipos de nucleótido. El término incluye formas de ADN o ARN de cadena única o doble.

El término “fragmento de polipéptido” se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal y/o carboxiterminal, pero en el que la secuencia de aminoácidos restante es normalmente idéntica a las posiciones correspondientes de la secuencia presente en la naturaleza deducida, por ejemplo, de una secuencia de ADNc completa. Normalmente los fragmentos tienen al menos 5, 6, 8 o 10 aminoácidos de largo. En una realización, un fragmento tiene al menos 14 aminoácidos de largo. En otra realización, un fragmento tiene al menos 20 aminoácidos de largo. En una tercera realización, un fragmento tiene al menos 50 aminoácidos de largo. En una cuarta realización, el fragmento tiene al menos 70 aminoácidos de largo.

El término “etiqueta” o “etiquetado” se refiere a la incorporación de un marcador detectable, como, por ejemplo, la incorporación de un aminoácido radioetiquetado o a la adición a un polipéptido de fracciones biotinil que se pueden detectar mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que se puede detectar por medios ópticos o colorimétricos). Hay diversos métodos de etiquetado de polipéptidos y glicoproteínas conocidos en el campo y pueden ser utilizados. Entre los ejemplos de etiquetas para polipéptidos se incluyen, a título meramente enunciativo, los siguientes: radioisótopos (como 3H, 14C, 35S, I25I, 131I), etiquetas fluorescentes (como F1TC, rodamina, fósforos lantánidos), etiquetas enzimáticas (o genes indicadores) (como peroxidasa de rábano, β-galactosidasa, β-latamasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), grupos quimioluminiscentes, de biotinil, epitopes de polipéptidos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (como secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión al metal, etiquetas de epitopes). En algunas realizaciones, las etiquetas se añaden mediante brazos separadores de diversas longitudes para reducir el potencial impedimento estérico.

Los aminoácidos naturalmente presentes se identifican siempre mediante las abreviaturas convencionales de tres letras o una letra que se indican a continuación, que son generalmente aceptadas en el campo de los péptidos y recomendadas por la comisión de la IUPAC-IUB en la nomenclatura bioquímica:

5

10

15

20

25

30

35

Tabla 1. Códigos de aminoácidos

Nombre: Código de Código de Nombre Código de Código de

3 letras: 1 letra 3 letras 1 letra

Alanina: Ala A Leucina Leu L

Arginina: Arg R Lisina Lys K

Asparagina: Asn N Metionina Met M

Ácido: Asp D Fenilalanina Phe F

aspártico

Cisteína: Cys C Prolina Pro P

Ácido: Glu E Serina Ser S .

glutámico

Glutamina: Gin Q Treonina Thr T

Glicina: Gly G Triptófano Trp W

Histidina: His H Tirosina Tyr Y

Isoleucina: He I Valina Val V

Las secuencias de péptidos recogidas en el presente están escritas de conformidad con la convención generalmente aceptada, en la que el aminoácido N-terminal se encuentra a la izquierda y el aminoácido C-terminal se encuentra a la derecha. Por convención, los aminoácidos L se representan en mayúsculas y los aminoácidos D en minúsculas.

Proteínas formadoras de poros modificadas (MPP)

Las proteínas formadoras de poros modificadas (MPP) de la presente invención se obtienen de proteínas formadoras de poros naturalmente presentes (nPP) y han sido modificadas para incluir una o más modificaciones selectivas para la próstata, al objeto de que sean capaces de matar selectivamente a las células prostáticas normales frente a las células de otros tejidos normales. Por matar selectivamente a las células prostáticas normales frente a las células de otros tejidos normales se entiende que las MPP son capaces de matar células prostáticas normales de forma más efectiva que otros tipos de células normales, como, por ejemplo, células del pulmón, del bazo o de la sangre. Las MPP adecuadas incluyen las descritas en la Solicitud de Patente estadounidense nº 20040235095.

1. Proteínas formadoras de poros naturalmente presentes (nPP)

Las PP adecuadas de las que se pueden obtener las MPP de la presente invención son proaerolisinas que sean capaces de formar poros o canales en la membrana de una célula diana provocando la muerte celular. Estas se producen como protoxinas y posteriormente son activadas mediante clivaje proteolítico. Las nPP son grandes proteínas citotóxicas que se sintetizan como protoxinas que son activadas mediante clivaje de proteasa en una secuencia de activación para formar poros o canales en la membrana celular de células diana, provocando así una muerte rápida de las células citolíticas. Las nPP tienen las características siguientes: una actividad formadora de poros que se activa mediante la eliminación de un dominio inhibidor a través del clivaje de proteasa y la capacidad de unirse a receptores que están presentes en membranas celulares a través de uno o más dominios de unión. Muchas de estas nPP han sido clonadas y se han producido formas recombinantes (véase, por ejemplo, Imagawa et al, FEMS. Microbiol. Lett. 117:287-92,1994; Meza et al. FEMS Microbiol. Lett. 145:333-9,1996).

Las MPP se obtienen de la proaerolisina. Entre los ejemplos se incluyen, a título meramente enunciativo, la proaerolisina de Aeromonas hydrophila, Aeromonas trota y Aeromonas salmonicida, (Ballard et al., Infect. Immun. 63:340-4, 1995; Gordon et al. J. Biol. Chem. 274:27274-80, 1999; Nº de acceso Genbank S75954).

Los polipéptidos de proaerolisina (PA) de la especie Aeromonas señalados anteriormente han sido caracterizados. Estos polipéptidos muestran una identidad de las secuencias de los pares superior al 80% entre sí (Parker et al., Progress in Biophysics & Molecular Biology 88 (2005) 91-142). Cada uno de estos polipéptidos de PA es una protoxina de aproximadamente 52 kDa con aproximadamente 470 residuos de aminoácidos. La secuencia de ADNc para la PA natural A. de hydrophila se muestra en la SEC. ID. Nº: 1 (Figura 7) y la correspondiente secuencia de aminoácidos de esta PA natural se muestra en la SEC. ID. Nº 2 (Figura 8). Las secuencias de nucleótidos y proteínas de muchas nPP naturalmente presentes son conocidas en el campo. En la siguiente Tabla se recogen, a título meramente enunciativo, algunos ejemplos:

5

10

15

20

25

30

35

40

Tabla 2: Ejemplos de nPP y los correspondientes números de acceso GenBank™

nPP: Secuencia de nucleótidos (Nº de acceso GenBank™) Secuencia de aminoácidos (Nº de acceso GenBank™)

Aerolisina Aeromonas hydrophila: Buckley AerA, sin corrección; Ml 6495 Buckley AerA con corrección P09167

Proaerolisina A. sobria1: Y00559 CAA68642

Hemolisina A. sobria2: X65046 CAA46182

Proaerolisina A. trota3: AF064068 AAC26217

Hemolisina A, salmonicida4 ,: X65048 CAA46184

1 Hussleine/ al, Mol. Microbiol. 2 (4), 507-517 (1988)

2 Hirono et al, Microb. Pathog. 13 (6), 433-446 (1992)

3 Kahn et al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (7), 2473-2478 (1998)

4 Hirono et al., Microb. Pathog. 15 (4), 269-282 (1993)

La proteína de la PA A. hydrophila incluye un dominio de unión (aproximadamente los aminoácidos 1-83 de la SEC. ID. Nº: 2) en lo que se conoce como el lóbulo pequeño del polipéptido y denominado en el presente como el dominio de unión del lóbulo pequeño (SBD) y un dominio del péptido inhibidor C-terminal (CIP) (aproximadamente los aminoácidos 427-470 de la SEC. ID. Nº 2) que se elimina mediante clivaje de proteasa en una secuencia de activación para activar la PA. El clivaje en la secuencia de activación para eliminar el dominio CIP se puede realizar con diversas proteasas omnipresentes, incluyendo la furina y tripsina. Los residuos de aminoácidos de aproximadamente 84-426 de la SEC. ID. Nº: 2 son conocidos como el lóbulo grande del polipéptido de la PA y contienen un dominio de toxina y otros dominios funcionales, entre los que se incluyen un segundo dominio de unión, denominado en el presente como el dominio de unión del lóbulo grande (LBD). La secuencia de ADNc para la PA natural A. hydrophila se muestra en la SEC. ID. Nº 1.

De acuerdo con la presente invención, las MPP se obtienen de polipéptidos de proaerolisina. En otra realización, las MPP se obtienen de polipéptidos de proaerolisina de A. hiydrophila.

La presente invención incluye también MPP obtenidas de fragmentos de nPP biológicamente activos. Los fragmentos de nPP biológicamente activos son aquellos capaces de formar poros y matar células. Los fragmentos adecuados incluyen aquellos capaces de ser activados para formar poros en células diana mediante la eliminación de un dominio CIP. Por ejemplo, en el caso de la PA, un fragmento adecuado sería uno compuesto por un dominio de unión de la proteína, así como el dominio CIP y la secuencia de activación. De este modo, en una realización de la invención, la MPP se obtiene de un fragmento de proaerolisina que incluye un dominio de unión, el dominio CIP y la secuencia de activación. En otra realización, la MPP se obtiene de un fragmento de proaerolisina que se compone del dominio de unión, la secuencia de activación, pero solamente parte de un dominio CIP.

2. Modificaciones específicas para la próstata

De acuerdo con la presente invención, la nPP seleccionada es modificada para formar una MPP mediante la inclusión de una o más modificaciones específicas para la próstata. Las modificaciones específicas para la próstata contempladas por la presente invención incluyen la incorporación de una secuencia de activación específica para la próstata y/o la deleción funcional (incluyendo la sustitución funcional) de uno o más dominios de unión, y/o la adición de un dominio diana específico para la próstata.

En una realización, las MPP, de acuerdo con la presente invención, comprenden una secuencia de activación específica para la próstata que permite la activación selectiva de las MPP en las células prostáticas. Se puede generar una secuencia de activación específica para la próstata mediante la modificación de la secuencia de activación natural de una nPP, o se puede generar mediante la adición de una secuencia de activación específica para la próstata a una nPP que no tiene una secuencia de activación natural. En otra realización, las MPP comprenden una secuencia de activación específica para la próstata y uno o más dominios diana específicos para la próstata. En otra realización, las MPP comprenden una secuencia de activación específica para la próstata y una modificación del SBD. En otra realización, las MPP comprenden una secuencia de activación específica para la próstata y una modificación del LBD.

En una realización, las MPP, de acuerdo con la presente invención, comprenden uno o más dominios diana específicos para la próstata que permiten la activación selectiva de las MPP en las células prostáticas. En otra realización, las MPP comprenden uno o más dominios diana específicos para la próstata y una modificación del SBD. En otra realización, las MPP comprenden un dominio diana específico para la próstata y una modificación del LBD.

En otra realización más, las MPP comprenden una secuencia de activación específica para la próstata, uno o más dominios diana específicos para la próstata y una modificación del LBD. En otra realización, las MPP comprenden una secuencia de activación específica para la próstata, uno o más dominios diana específicos para la próstata y una modificación del SBD.

En una realización, las MPP comprenden una secuencia de activación específica para la próstata y una o más modificaciones en el dominio de unión natural. En una realización, las MPP comprenden un dominio diana específico para la próstata y una o más modificaciones en el dominio de unión natural. En otra realización más, las MPP comprenden una secuencia de activación específica para la próstata, un dominio diana específico para la próstata y una o más modificaciones en el dominio de unión natural.

Algunos ejemplos representativos, aunque a título meramente enunciativo, de las combinaciones de modificaciones específicas para la próstata que se pueden realizar en la proaerolisina se muestran en las Figuras 4, 5 y 6.

Modificación de la secuencia de activación

Como se ha indicado anteriormente, una nPP puede ser modificada para incorporar una secuencia de activación específica para la próstata mediante la modificación de la secuencia de activación natural para obtener una secuencia de activación específica para la próstata, o se puede añadir una secuencia de activación específica para la próstata a una nPP que no tiene una secuencia de activación natural. De acuerdo con la presente invención, una secuencia de activación específica para la próstata es una secuencia de aminoácidos que incorpora uno o más sitios de clivaje de proteasa específicos para la próstata. Un sitio de clivaje de proteasa específico para la próstata es una secuencia de aminoácidos que es reconocida e hidrolizada (sometida a clivaje) de forma selectiva y eficiente mediante una proteasa específica para la próstata. En una realización, una proteasa específica para la próstata es una proteasa que se expresa en niveles más elevados en las células prostáticas que en otros tipos de células. Entre los ejemplos de proteasas específicas para la próstata se incluyen, a título meramente enunciativo: las secuencias de clivaje del PSA (antígeno prostático específico), PSMA (antígeno prostático específico de membrana) y HK2 (calicreína glandular humana 2). Numerosos ejemplos de sitios de clivaje reconocidos por estas proteasas específicas para la próstata son conocidos en el campo y se describirán en mayor profundidad más adelante.

Las modificaciones de la secuencia de activación naturalmente presente para obtener una secuencia de activación de proteasa específica para la próstata se pueden conseguir tal y como se conoce en el campo. La modificación de la secuencia de activación naturalmente presente se traduce en la deleción funcional de la secuencia de activación natural. La deleción funcional se puede conseguir mediante mutación, deleción parcial o completa, inserción u otra variación realizada en la secuencia de activación naturalmente presente que la inactive. En una realización, la secuencia de activación naturalmente presente de la nPP se somete a deleción funcional mediante la inserción de una secuencia de activación específica para la próstata. En otra realización, la deleción funcional de la secuencia de activación naturalmente presente se consigue mediante mutaciones en uno o más de los residuos de los aminoácidos de la secuencia de activación natural que produce una secuencia de activación específica para la próstata. En una realización alternativa, la secuencia de activación naturalmente presente de la nPP se somete a deleción funcional, sustituyendo el sitio de clivaje de la proteasa natural de la secuencia de activación por un sitio de clivaje de la proteasa específico para la próstata.

En una realización, el sitio o los sitios de clivaje de proteasa específicos para la próstata sustituyen funcionalmente al sitio de clivaje de proteasa natural de la MPP. Por ejemplo, un sitio de clivaje de proteasa específico para la próstata puede sustituir funcionalmente al sitio de clivaje de furina natural de la PA (véase la FIG. 4B). Esta sustitución produce una MPP que se vuelve citolíticamente activa en presencia de una proteasa enzimáticamente activa específica para la próstata, como PSA, PSMA o HK2. Los sitios de clivaje de PSA, PSMA o HK2 adecuados son conocidos en el campo y se describen a continuación.

En otra realización de la invención, las MPP, de acuerdo con la presente invención, se pueden generar mediante la deleción del sitio de clivaje de proteasa natural de la nPP e insertando una secuencia de activación específica para la próstata. Por ejemplo, el sitio de clivaje de furina de la PA (aminoácidos 427-432 de la SEC. ID. Nº 2) se puede someter a deleción e insertarse un sitio de clivaje de proteasa específico para la próstata, como el sitio de clivaje del PSA (véase la FIG. 4B).

En otra realización, el sitio de clivaje de proteasa natural del nPP se muta de forma que deja de ser funcional y se inserta una secuencia de activación específica para la próstata dentro del sitio de clivaje de proteasa mutado, o se añade al N-terminal o C-terminal del sitio de clivaje de proteasa natural. Por ejemplo, el sitio de clivaje de furina de la PA se puede mutar y se inserta un sitio de clivaje de proteasa específico para la próstata, como el sitio de clivaje de PSA, o se añade al N-terminal o C-terminal del sitio de furina mutado (véase la FIG. 4C).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

En otra realización más, se añade una secuencia de activación específica para la próstata a una nPP que no tiene una secuencia de activación naturalmente presente.

Sitios de clivaje específicos para la próstata

Como se ha señalado anteriormente, diversas proteasas específicas para la próstata y los sitios de clivaje de proteasa que reconocen son conocidos en el campo. Entre los ejemplos se incluyen, a título meramente enunciativo, el PSA, PSMA y HK2.

En una realización, la MPP es modificada para incluir una secuencia de activación específica para la próstata que incluye un sitio de clivaje específico para el PSA. Un sitio de clivaje específico para el PSA es una secuencia de aminoácidos que es reconocida e hidrolizada (sometida a clivaje) de forma selectiva y eficiente mediante un antígeno prostático específico (PSA). El PSA es una serín proteasa con la capacidad de reconocer e hidrolizar secuencias de péptidos específicas. Es secretado por células prostáticas en una forma enzimáticamente activa y se queda inactivado después de entrar en la circulación. Dado que ni la sangre ni ningún tejido normal salvo la próstata contiene PSA enzimáticamente activo, la actividad proteolítica del PSA se puede utilizar para activar las MPP en la glándula prostática. Diversos sitios de clivaje específicos para PSA son conocidos en el campo. Entre los ejemplos se incluyen, a título meramente enunciativo, los de las SEC. ID. Nº 5, 8, 11, y 14-21, así como los divulgados en las Patentes estadounidenses nº 5.866.679, 5.948.750, 5.998.362, 6.265.540, 6.368.598 y 6.391.305. En una realización, la MPP tiene una secuencia de activación que incluye el sitio de clivaje de PSA mostrado en la SEC. ID. Nº 5.

Se conocen otros sitios de clivaje específicos para PSA, basados en el mapa de clivaje de PSA de las proteínas seminales humanas semenogelinas I y II, y en un ensayo basado en la membrana de celulosa (véase la Tabla 3 y Denmeade et al., Cancer Res., 57:4924-30, 1997) y se pueden utilizar para producir las MPP modificadas de conformidad con la presente invención. Por ejemplo, las MPP, de acuerdo con la presente invención, se pueden modificar para incluir uno de los sitios de clivaje de PSA mostrados en la Tabla 3, que pueden sustituir el sitio de activación de la proteasa furina natural de la proaerolisina (aminoácidos 427-432 de la SEC. ID. Nº 2), conocidos en el campo.

En una realización, la MPP tiene una secuencia de aminoácidos de alguna de las SEC. ID. Nº 3,4, 6, 7,9, 10, 12, 13 y 24, que incluye una secuencia de activación que contiene un sitio de clivaje de PSA.

Tabla 3: Sustratos de PSA (sitios de clivaje de PSA) y cinética de la hidrólisis de PSA.*

Sustrato de PSA (SEC. ID. Nº): Km(M) Kcal (s-1) Kcal/km (s-1M1)

KGISSQY(15): 160 0.043 270

SRKSQQY(16): 90 0.023 260

ATKSKQH (17): 1310 0.0091 6.9

KGLSSQC(18): 300 0.0017 5.6

LGGSSQL(19): 900 0.0037 4.1

EHSSKLQ (20): 1165 0.012 10.6

HSSKLQ (5): 470 0.011 23.6

SKLQ (21): 813 0.020 24.6

* Los péptidos fueron etiquetados fluorescentemente (aminometil cumarina). Los ensayos se realizaron en 50 mMTris,0,1 MNaCl,pH7,8.

En otra realización, la MPP comprende una secuencia de activación específica para la próstata que incluye un sitio de clivaje específico para el PSMA. Algunos ejemplos de sitios de clivaje específicos para PSMA son conocidos en el campo y se pueden encontrar, por ejemplo, en la Publicación Internacional nº WO 02/43773. En términos generales, un sitio de clivaje de PSMA incluye al menos el dipéptido X1. X2 El dipéptido contiene los animoácidos Glu

o Asp en la posición X1. X2 puede ser Glu, Asp, Gin o Asn. Los tripéptidos X1X2X3 también son apropiados, con X1 y X2 definidos anteriormente, con X3 como Glu, Asp, Gin o Asn. Los tetrapéptidos X1X2X3X4 también son apropiados, con X1-3 definidos anteriormente, y con X4 como Glu, Asp, Gin o Asn. Los pentapéptidos X1X2X3X4X5 también son apropiados, con X1-4 definidos anteriormente, y con X5 como Glu, Asp, Gin o Asn. Los hexapéptidos X1X2X3X4X5X6 también son apropiados, con X1-5 definidos anteriormente, y con X6 como Glu, Asp, Gin o Asn. Se pueden construir otros péptidos con una longitud de secuencia mayor de una forma similar. Por lo general, los péptidos son de la siguiente secuencia: X1...Xn, donde n es 2 a 30,2 a 20,2 a 15, o 2 a 6, 5 donde X1 es Glu, Asp, Gin o Asn. En una realización, X1 es Glu o Asp, y X2-Xn se seleccionan independientemente de entre Glu, Asp, Gin y Asn. Otras secuencias de péptidos posibles son como las anteriores, salvo por el hecho de que X2-Xn-1 se seleccionan independientemente de entre Glu y Asp, y Xn se selecciona independientemente de entre Glu, Asp, Gin y Asn. Algunos ejemplos de sitios de clivaje de PSMA son Asp-Glu, Asp-Asp, Asp-Asn, Asp-Gin, Glu-Glu-Glu, Glu-Asp-Glu, Asp-Glu-Glu, Glu-Glu-10 Asp, Glu-Asp-Asp, Asp-Glu-Asp, Asp-Asp-Glu, Asp-Asp-Asp, GIu-Glu-Gln, Glu-Asp-Gln, Asp-Glu-Gln, Glu-Glu-Asn, Glu-Asp-Asn, Asp-Glu-Asn, Asp-Asp-Gin, y Asp-Asp-Asn.

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En una realización adicional, la MPP comprende una secuencia de activación específica para la próstata que incluye un sitio de clivaje específico para HK2. Algunos ejemplos de sitios de clivaje específicos para HK2 también son conocidos en el campo y se describen, por ejemplo, en la Publicación International nº WO01/09165. El sitio de clivaje reconocido por HK2 está flanqueado por al menos una secuencia de aminoácidos X4X3X2X1. Esta secuencia de aminoácidos contiene el aminoácido arginina, histidina o lisina en la posición X1. X2 puede ser arginina, fenilalanina, lisina o histidina. X3 puede ser lisina, serina, alanina, histidina o glutamina. X4 puede ser de 0 a 20 aminoácidos más y puede ser al menos dos aminoácidos más. En una realización, el sitio de clivaje de HK2 incluye una secuencia para X4 que es sustancialmente idéntica a los 20 aminoácidos de la secuencia de semenogelina I o semenogelina II natural que son los aminoácidos cuarto a vigésimo cuarto del extremo N-terminal de sitios de clivaje de semenogelina reconocidos. La secuencia de aminoácidos puede comprender también X-1, que está unida al carboxiterminal de X1 para crear la secuencia de aminoácidos X4X3X2X1X-1. X.j tiene hasta 10 aminoácidos más y puede incluir diversos aminoácidos. X1 puede tener una leucina, alanina o serina unida al carboxi-terminal de X1. X-1 puede incluir aminoácidos L o D. El sitio de clivaje de HK2 está ubicado en el extremo carboxi-terminal de X1.

Algunos ejemplos de sitios de clivaje de HK2 se muestran en la Tabla 4 (cabe señalar que el símbolo][ denota un sitio de clivaje de HK2):

Tabla 4: Ejemplos de sitios de clivaje de HK2

Lys-Arg-Arg ][: SEC. ID. Nº 32 Ser-Arg-Arg ][ Leu SEC. ID. Nº 53

Ser-Arg-Arg )[: SEC. ID. Nº 33 Ala-Arg-Arg ][Leu SEC. ID. Nº 54

Ala-Arg-Arg ][: SEC. ID. Nº 34 Ala-Arg-Arg ][ Ser SEC. ID. Nº 55

His-Arg-Arg ][: SEC. ID. Nº 35 His-Arg-Arg ][Ala SEC. ID. Nº 56

Gln-Arg-Arg ][: SEC. ID. Nº 36 Gln-Arg-Arg ][Leu SEC. ID. Nº 57

Ala-Phe-Arg ][: SEC. ID. Nº 37 Ala-Phe-Arg ][Leu SEC. ID. Nº 58

Ala-Gln-Arg ][: SEC. ID. Nº 38 Ala-Gln-Arg ][Leu SEC. ID. Nº 59

Ala-Lys-Arg ][: SEC. ID. Nº 39 Ala-Lys-Arg ][Leu SEC. ID. Nº 60

Ala-Arg-Lys ][: SEC. ID. Nº 40 Ala-Arg-Lys ][Leu SEC. ID. Nº 61

Ala-His-Arg ][: SEC. ID. Nº 41 Ala-His-Arg ][ Leu SEC. ID. Nº 62

Gln-Lys-Arg-Arg ][: SEC. ID. Nº 42 His-Ala-Gln-Lys-Arg-Arg ][ Leu SEC. ID. Nº 63

Lys-Ser-Arg-Arg ][: SEC. ID. Nº 43 Gly-Gly-Lys-Ser-Arg-Arg ][ Leu SEC. ID. Nº 64

Ala-Lys-Arg-Arg ][: SEC. ID. Nº 44 His-Glu-Gln-Lys-Arg-Arg ][ Leu SEC. ID. Nº 65

Lys-Lys-Arg-Arg ][: SEC. ID. Nº 45 His-Glu-Ala-Lys-Arg-Arg ][ Leu SEC. ID. Nº 66

His-Lys-Arg-Arg ][: SEC. ID. Nº 46 Gly-Gly-Gln-Lys-Arg-Arg ][ Leu SEC. ID. Nº 67

Lys-Ala-Phe-Arg ][: SEC. ID. Nº 47 His-Glu-Gln-Lys-Arg-Arg ][ Ala SEC. ID. Nº 68

Lys-Ala-Gln-Arg ][: SEC. ID. Nº 48 Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg ][ Leu SEC. ID. Nº 69

Lys-Ala-Lys-Arg ][: SEC. ID. Nº 49 His-Glu-Gln-Lys-Arg-Arg ][Ser SEC. ID. Nº 70

Lys-Ala-Arg-Lys ][: SEC. ID. Nº 50 Gly-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg ][ Leu SEC. ID. Nº 71

Lys-Ala-His-Arg ][: SEC. ID. Nº 51 Gly-Gly-His-Lys-Arg-Arg ][ Leu SEC. ID. Nº 72

Lys-Arg-Arg ][ Leu: SEC. ID. Nº 52

Adición de un dominio diana específico para la próstata

En una realización de la invención, las MPP comprenden uno o más dominios diana específicos para la próstata para poder dirigirse selectivamente las células prostáticas. El dominio diana específico para la próstata es capaz de dirigir la MPP a la célula prostática, donde la MPP se puede activar y posteriormente matar a la célula prostática. El dominio diana se puede ubicar en el N-terminal o C-terminal de la MPP o en ambos. Alternativamente, el dominio diana se puede ubicar en otra región de la MPP, siempre que no interfiera con la actividad formadora de poros de la MPP.

Algunos ejemplos de dominios diana específicos para la próstata adecuados incluyen, a título meramente enunciativo, moléculas como un ligando peptídico, una toxina o un anticuerpo, que tiene una especificidad superior para las células prostáticas que para otros tipos de células. En una realización, un dominio de unión específico para el tejido prostático tiene un KD inferior en las células o tejidos prostáticos que en otros tipos de células (es decir, se une selectivamente a tejidos prostáticos en comparación con otros tejidos normales), por ejemplo al menos un KD diez veces inferior, como un KD al menos 20, 50, 75, 100 o incluso 200 veces inferior. Esas moléculas se pueden utilizar para dirigir una MPP a la próstata. Entre los ejemplos se incluyen, a título meramente enunciativo: anticuerpos que reconocen proteínas que son relativamente específicas para la próstata como PSA, PSMA, HK2, prostasina y hepsina; ligandos que tienen receptores específicos para la próstata , tales como la hormona que libera a la hormona luteinizante (LHRH) natural y sintética; y endotelina (que se une al receptor de endotelina correspondiente).

En una realización de la invención, la adición del dominio diana específico para la próstata provoca la deleción funcional del dominio de unión natural de la nPP. En otra realización, el dominio de unión a la proteína anclado a GPI no específico de la proaerolisina es sometido a deleción funcional y sustituido por un dominio diana específico para la próstata. Algunos ejemplos específicos de MPP obtenidas de proaerolisina que se han sometido a deleción funcional del dominio de unión natural se ilustran en las FIG. 4D y 5B. Algunos ejemplos de MPP obtenidas de proaerolisina que incluyen un dominio diana específico para la próstata que sustituye funcionalmente al dominio de unión natural de la proaerolisina se ilustran en las FIGS. 4E, 5A, 5C, 5D y 6A-6D.

Se pueden unir uno o más dominios de unión específicos para el tejido prostático a uno o más aminoácidos de la MPP, aunque idealmente, no interfieren de forma significativa en la capacidad para formar poros en las membranas celulares o, cuando sea aplicable, en la capacidad de la MPP para ser activada por una proteasa específica para la próstata, como el PSA. Los métodos de conjugar proteínas o péptidos con las MPP son conocidos en el campo e incluyen, por ejemplo, el cambio del aminoácido N-terminal de la proteína a modificar por un Cys u otro aminoácido, antes de añadir el dominio de unión específico para el tejido prostático, para contribuir a la unión del dominio de unión específico para el tejido prostático con la MPP.

En una realización, los dominios de unión específicos para el tejido prostático se unen o insertan en el extremo N-terminal y/o C-terminal de una MPP obtenida de proaerolisina (véase, por ejemplo, las FIGS. 4E y 5C). En algunos ejemplos, el dominio de unión natural de la proaerolisina se somete a deleción (es decir, los aminoácidos 1-83 de la SEC. ID. Nº 2 o 4), de forma que la adición o unión de un dominio de unión específico para el tejido prostático al N-terminal resulta en la adición al aminoácido 84 de la SEC. ID. Nº 2 o 4 (váse, por ejemplo, las FIGS. 5C y 6C). En otros ejemplos, se introducen pequeñas deleciones o mutaciones puntuales en el dominio de unión natural de la proaerolisina, de forma que la adición o unión de un dominio de unión específico para el tejido prostático al N-terminal resulta en la adición al aminoácido 1 de la SEC. ID. Nº 2 o 4 (o del aminoácido que sea N-terminal después de la deleción funcional del dominio de unión de proaerolisina natural (véase, por ejemplo, las FIGS. 4E y 5D).

Anticuerpos como dominios diana específicos para la próstata

En una realización, el dominio diana específico para la próstata es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un antígeno que está asociado con células prostáticas, dirigiendo de este modo la MPP a las células prostáticas. Los antígenos asociados con células prostáticas a los que se pueden unir específicamente estos dominios diana específicos para la próstata incluyen el PSA, PSMA y el receptor de LHRH, cuya expresión es elevada en las células prostáticas. Los anticuerpos se pueden añadir al extremo N-terminal o C-terminal de la MPP utilizando métodos de fusión genética bien conocidos en el campo (véase, por ejemplo, Debinski y Pastan, Clin. Cancer Res. 1:1015-22, 1995). Alternativamente, los anticuerpos se pueden unir a una MPP mediante reticulación covalente (véase, por ejemplo, Woo et al. Arch. Pharm. Res. 22(5):459-63,1999 y Debinski y Pastan, Clin. Cancer Res. 1(9):1015-22, 1995). La reticulación puede ser no específica, por ejemplo utilizando un agente reactivo para lisina homobifuncional reticulador, o puede ser específico, por ejemplo utilizando un agente reticulador que reacciona con grupos amino en el anticuerpo y con residuos de cisteína ubicados en la MPP. En una realización, los aminoácidos de la proaerolisina como los aminoácidos Cys19, Cys75, Cys159, y/o Cys164 de la SEC. ID. Nº 2 se pueden utilizar para reticular anticuerpos con la molécula de proaerolisina modificada. Por ejemplo, el anticuerpo podría sustituir al dominio de unión natural de la nPP a modificar o se podría añadir el anticuerpo a una MPP que ya tenga mutaciones en el dominio de unión natural. Esta MPP también puede incluir una secuencia de activación específica para la próstata al objeto de incrementar la especificidad. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo de cadena única del PSMA fusionado con el dominio de la toxina de la PA.

Los anticuerpos adecuados incluyen anticuerpos intactos así como fragmentos de anticuerpos como, por ejemplo, (i) un fragmento de Fab compuesto por los dominios de VL, VH, CL y CHI; (ii) un fragmento de Fd compuesto por los dominios de VH y CHI; (iii) un fragmento de Fv compuesto por los dominios de VL y VH de un único brazo de un anticuerpo, (iv) un fragmento de dAb (Ward et al., Nature 341:544-6, 1989) compuesto por un dominio de VH; (v) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada; y (vi) un fragmento de F(ab')2, un fragmento bivalente compuesto por dos fragmentos de Fab unidos por un puente de disulfuro en la región de la bisagra. Entre los anticuerpos adecuados se incluyen anticuerpos de Fv de cadena única, que se preparan mediante métodos recombinantes resultantes en los dos dominios de un fragmento de Fv unidos por un enlace sintético (Bird et al. Science 242:423-6, 1988; y Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-83, 1988), y anticuerpos camélidos (véase, por ejemplo, Tanha et al., J. Biol. Chem. 276:24774-80,2001).

En otra realización, los fragmentos del anticuerpo son capaces de reticular su antígeno diana, por ejemplo segmentos bivalentes tales como fragmentos de F(ab')2. Alternativamente, un fragmento de anticuerpo que no se reticula por sí mismo con su antígeno diana (por ejemplo, un fragmento de Fab) se puede utilizar conjuntamente con un anticuerpo secundario que sirve para reticular el fragmento del anticuerpo, reticulando así el antígeno diana. Los anticuerpos se pueden fragmentar utilizando técnicas convencionales y los fragmentos seleccionados por utilidad de la misma manera que se describe para los anticuerpos completos y como se sabe en el campo. También está previsto que un anticuerpo incluya nanocuerpos, así como moléculas bioespecíficas y quiméricas que se unen específicamente al antígeno diana.

"Se une específicamente", cuando se utiliza con respecto a un anticuerpo, se refiere a la capacidad de los anticuerpos individuales a inmunorreaccionar específicamente con un antígeno específico. La unión es una reacción de unión no aleatoria entre la molécula de un anticuerpo y un determinante antigénico del antígeno. La especificidad de la unión deseada está típicamente determinada desde el punto de referencia de la capacidad del anticuerpo para unirse diferencialmente al antígeno específico y a un antígeno no relacionado, y, por tanto, distingue entre dos antígenos diferentes, en particular cuando los dos antígenos tienen epitopes únicos. Un anticuerpo que se une específicamente a un epitope en particular se denomina “anticuerpo específico”.

Pequeños ligandos peptídicos como dominios diana específicos para la próstata

En una realización, el dominio diana específico para la próstata es un pequeño ligando peptídico que se une a su correspondiente receptor específico para la próstata, expresado en la membrana de las células prostáticas. Entre los ejemplos se incluyen, a título meramente enunciativo, los péptidos agonistas de la hormona que libera a la hormona luteinizante (LHRH) natural y sintética (véase, por ejemplo, el nº de acceso Genbank CAA25526 y las SEC. ID. Nº 22 y 23), que se unen con gran afinidad a los receptores de LHRH, y los péptidos que pueden unirse selectivamente al PSMA. Los receptores de LHRH son desplegados por células prostáticas y solamente algunas otras células. Esta expresión diferencial proporciona especificidad de unión.

Los pequeños ligandos peptídicos pueden ser modificados como se conoce en el campo, al objeto de facilitar su adición a la MPP. Por ejemplo, determinados residuos de LHRH, como Gly en la sexta posición (Gly6), pueden ser sustituidos sin comprometer la afinidad de unión del receptor (Janaky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:972-6, 1992; Nechushtan et al., J. Biol. Chem., 272:11597-603. 1997). Por tanto, se puede producir una MPP (en la que el dominio de unión natural se somete a deleción funcional) que se acople covalentemente con D-Lys6 de LHRH purificada (en la amina épsilon de esta lisina).

D-Lys6 de LHRH (SEC. ID. Nº 23) se puede añadir en diversas posiciones dentro de una nPP para proporcionar una MPP con un dominio diana específico para la próstata. Como se ha señalado anteriormente, la adición del pequeño ligando peptídico no interferirá de forma significativa en la capacidad de la toxina de penetrar por la membrana para formar un poro. Por ejemplo, la amina épsilon del análogo D-Lys6 se puede unir al amino-terminal de la MPP, utilizando métodos conocidos en el campo, como, por ejemplo, mediante un enlace de ácido dicarboxílico. La activación de la MPP mediante clivaje de la secuencia de activación provocará la liberación de la porción inhibidora C-terminal, mientras que la toxina continuará unida al receptor de LHRH.

Alternativa o adicionalmente, el pequeño ligando peptídico se puede unir directamente al C-terminal de la MPP. Por ejemplo, la amina épsilon del análogo D-Lys6 de la LHRH se puede unir directamente al carboxilo C-terminal de la MPP mediante la adición de un Cys al C-terminal de la MPP, reticulando así este Cys a la amina épsilon del análogo D-Lys6 de la LHRH. Esta unión producirá una MPP en la que el péptido de la LHRH se une al dominio inhibidor C-terminal. La activación de la MPP mediante clivaje de la secuencia de activación liberará la MPP y dejará el fragmento inhibidor unido al receptor de LHRH. Por otra parte, se pueden producir proteínas de fusión recombinante en las que los péptidos de LHRH modificados se fusionan tanto al N-terminal como al C-terminal de la MPP.

También se contempla que el pequeño ligando peptídico se puede unir a una MPP a través de un puente de disulfuro. Por ejemplo, se introduce un residuo de cisteína en la sexta posición del péptido de la LHRH y el péptido unido a una MPP a través de un puente de disulfuro. La cisteína con la que el péptido forma un puente de disulfuro puede estar presente en la secuencia de la nPP natural o se puede mutar la nPP para incluir un residuo de cisteína. En una realización, una MPP obtenida de PA puede tener un residuo de cisteína introducido, por ejemplo en los aminoácidos 215 y/o 300 de la SEC. ID. Nº 2, donde el aminoácido 215 y/o 300 ha sido mutado en una cisteína.

En otra realización, se produce una proteína recombinante en la que el péptido de LHRH se fusiona con el aminoterminal de la MPP.

Alternativa o adicionalmente, se puede producir una MPP uniendo o enlazando uno o más dominios diana específicos de la próstata a otros aminoácidos de la MPP. Por ejemplo, para las MPP obtenidas de la proaerolisina, se pueden utilizar aminoácidos como el aminoácido 215 o 300 de la SEC. ID. Nº 2 o 4 (veáse, por ejemplo, las FIGS. 5A, 5D, 6B y 6D) para unir uno o más dominios diana específicos para la próstata. En algunos ejemplos, un aminoácido Cys sustituye al aminoácido natural en esa posición. Por ejemplo, se pueden introducir los siguientes cambios en la SEC. ID. Nº 2 o 4: Tyr215Cys o Ala300Cys. Alternativamente, se pueden utilizar los residuos de cisteína presentes en la secuencia natural de la nPP. Para las MPP obtenidas de proaerolisina, los aminoácidos como Cys 19, Cys75, Cys 159 y/o Cys 164 de la SEC. ID. Nº: 2, son adecuados para este propósito.

En una realización, la MPP se obtiene de proaerolisina y tiene una secuencia seleccionada de la 25 SEC. ID. Nº 24 y 25, que se compone de LHRH como un dominio diana específico para la próstata.

Modificaciones en el dominio de unión natural de las MPP

De acuerdo con la presente invención las MPP se obtienen de nPP que comprenden uno o más dominios de unión, conocidos en el campo. En el contexto de la presente invención, cuando una nPP comprende un dominio de unión, se considera un "dominio de unión al lóbulo grande". De acuerdo con la invención presente, las MPP pueden comprender modificaciones en uno o más de los dominios de unión, según resulte aplicable. Por ejemplo, la proaerolisina normal de la especie Aeromonas se compone de dos dominios de unión: un dominio de unión al lóbulo pequeño y un dominio de unión al lóbulo grande. Por lo contrario, la toxina alfa natural de Clostridium septicum comprende solamente un dominio de unión al lóbulo grande. En una realización, las modificaciones de los dominios de unión incluyen la deleción funcional de un dominio de unión. Un dominio de unión sometido a deleción funcional en una MPP resulta en una MPP que tiene una capacidad atenuada para unirse a su receptor de la superficie celular, aunque conserva su capacidad formadora de poros. Las deleciones funcionales se pueden realizar mediante la deleción o mutación de uno o más dominios de unión de una MPP. En una realización, se puede someter a deleción todo el dominio de unión o porciones del mismo. En una realización adicional, también se puede utilizar la inserción de secuencias heterólogas en el dominio de unión para someter a deleción funcional el dominio de unión. La adición de estas secuencias heterólogas puede conferir una funcionalidad adicional a la MPP (es decir, la sustitución funcional del dominio de unión). Por ejemplo, la adición de una secuencia heteróloga puede resultar en la adición de una región que puede funcionar como un dominio de unión específico para la próstata, tal y como se describe en el presente. En otra realización más, también se pueden realizar mutaciones puntuales en la secuencia de aminoácidos del dominio de unión natural de la nPP, para reducir la capacidad del dominio de unión para unirse a su receptor. A continuación se describen estas modificaciones con más detalle.

Las MPP que carecen de un dominio de unión conservan su actividad citolítica, pero puede ser necesario administrarlas a dosis más elevadas para garantizar la concentración de la toxina en la membrana celular. Las MPP con deleciones funcionales en el dominio de unión se pueden preparar utilizando métodos conocidos en el campo. Estos métodos incluyen el uso de la tecnología de ADN recombinante, tal y como se describe en Sambrook et al., supra. Alternativamente, las deleciones funcionales del dominio de unión también se pueden conseguir mediante la modificación directa de la propia proteína, de acuerdo con métodos conocidos en el campo, tales como la proteolisis, para generar fragmentos de la MPP, que posteriormente se pueden unir químicamente.

En una realización de la invención, la MPP se modifica mediante deleción funcional de su dominio de unión del lóbulo pequeño (SBD). Algunos ejemplos de deleciones funcionales de la SBD se pueden realizar en el polipéptido de la proaerolisina A. hydrophila como sigue. El SBD completo, correspondiente al aminoácido 1-83 de la SEC. ID. Nº 2, se puede someter a dilación, o bien porciones de esta región, como, por ejemplo, los aminoácidos 45-66 de la SEC. ED. Nº 2. Alternativamente, se pueden realizar mutaciones puntuales como las que siguen W45A, I47E, M57A,Y61A, K66Q (números de aminoácidos se refieren a la SEC. ID. Nº 2 o SEC. ID. Nº 4) y como se describe en Mackenzie et al. J. Biol. Chem. 274: 22604-22609, 1999. En la FIG. 4D se muestra un diagrama esquemático que representa un ejemplo de una MPP con una o más mutaciones en un dominio de unión, donde * representa una o más mutaciones o deleciones.

En una realización de la invención, la nPP se modifica mediante deleción funcional de su dominio de unión al lóbulo grande (LBD). Algunos ejemplos de deleciones del LBD de la proaerolisina (comprendido aproximadamente en los residuos de aminoácidos 84-426 de la SEC. ID. Nº 2) que se pueden realizar para proporcionar las MPP son los siguientes. Se puede realizar una deleción de todo el LBD de la proaerolisina. Alternativamente, en una realización de la invención, la MPP obtenida de proaerolisina se compone de una o más mutaciones puntuales del LBD en los residuos de aminoácidos Y162, W324, R323, R336, y/o W127. En otra realización de la invención, la MPP obtenida de la proaerolisina se compone de una o más mutaciones puntuales en las posiciones W127 y/o R336. En otra realización más, la MPP obtenida de la proaerolisina se compone de las mutaciones puntuales Y162A y/o W324A. En otra realización más, la MPP obtenida de la proaerolisina se compone de las mutaciones puntuales R336A, R336C y/o W127T. En otra realización, las MPP comprenden mutaciones en otros residuos que interactúan directamente con el ligando de la proteína GPI.

Otras modificaciones de las MPP

La presente invención contempla otra modificación de las MPP que no afecta a la capacidad de las MPP para dirigirse selectivamente a las células prostáticas. Estas modificaciones incluyen sustituciones, inserciones o deleciones, y modificaciones de aminoácidos para reducir la antigenicidad, y modificaciones para mejorar la estabilidad o mejorar la farmacocinética de las MPP. En una realización, otras modificaciones en la MPP resultan en un polipéptido que difiere solamente en un número pequeño de aminoácidos de la MPP. Estas modificaciones incluyen deleciones (por ejemplo de 1-3 o más aminoácidos), inserciones (por ejemplo de 1-3 o más residuos), o sustituciones que no interfieren en la capacidad de las MPP para dirigirse de forma selectiva y matar a las células prostáticas normales. En una realización, otras modificaciones de las MPP resultan en un polipéptido que conserva al menos una identidad de la secuencia del 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o superior con la MPP y mantiene la capacidad de dirigirse selectivamente y matar a las células prostáticas normales.

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45

Las MPP pueden ser modificadas mediante una sustitución por la que se ha eliminado al menos un residuo de la secuencia de aminoácidos y se ha insertado en su lugar un residuo diferente. En una realización, la sustitución es una sustitución conservadora. Una sustitución conservadora es aquella en la que uno o más aminoácidos (por ejemplo 2, 5 o 10 residuos) son sustituidos por residuos de aminoácidos que tienen unas propiedades bioquímicas similares. Típicamente, las sustituciones conservadoras tienen muy poco o ningún impacto sobre la actividad de un polipéptido resultante. Por ejemplo, idealmente, una MPP que incluye una o más sustituciones conservadoras conserva la actividad de la nPP correspondiente. Entre los ejemplos de aminoácidos que pueden ser sustituidos por un aminoácido original en una proteína y que se consideran sustituciones conservadoras se incluyen: Ser para Ala; Lys para Arg; Gin o His para Asn; Glu para Asp; Ser para Cys; Asn para Gin; Asp para Glu; Pro para Gly; Asn o Gin para His; Leu o Val para He; He o Val para Leu; Arg o Gin para Lys; Leu o He para Met; Met, Leu o Tyr para Phe; Thr para Ser; Ser para Thr; Tyr para Trp; Trp o Phe para Tyr; y He o Leu para Val.

Una MPP puede ser modificada para incluir una o más sustituciones conservadoras manipulando la secuencia de nucleótidos que codifica esa proteína, utilizando, por ejemplo, procedimientos estándar como mutagénesis dirigidas al sitio o PCR. Se puede encontrar más información sobre sustituciones conservadoras, entre otros lugares, en Ben-Bassat et al., (J. Bacterid. 169:751-7, 1987), O'Regan et al., (Gene 77:237-51, 1989), Sahin-Toth et al., (Protein Sci. 3:240-7, 1994), Hochuli et al,, (Bio/Technology 6:1321-5, 1988), WO 00/67796 (Curd et al.) y en libros de texto estándar de genética y biología molecular.

En otra realización, la sustitución es una sustitución permisiva. Las sustituciones permisivas son sustituciones de aminoácidos no conservadoras, pero tampoco alteran de forma significativa la actividad de la MPP. Un ejemplo de sustitución de Cys para Ala en la posición 300 de la SEC. ID. Nº 2 o 4 en un polipéptido de proaerolisina.

En una realización, las MPP se modifican para incluir uno o más sustituciones de residuos únicos de los aminoácidos. En otra realización, las MPP se modifican para incluir una sustitución de aminoácidos. En otra realización, las MPP se modifican para incluir de 2 a aproximadamente 10 sustituciones de aminoácidos. En otra realización, las MPP se modifican para incluir de 3 a aproximadamente 5 sustituciones de aminoácidos.

Algunos ejemplos, a título meramente enunciativo, de otras modificaciones de las MPP obtenidas de proaerolisina se recogen en la Tabla 5.

Tabla 5: Ejemplos de mutaciones únicas de MPP obtenidas del polipéptido de una proaerolisina natural

H107N: G202C G251C T284C H341N

K22C: H121N W203C E252C V285C

W127T: T253S V293C K361C N459C

C164S: D216C T253C K294C K369Q

Q254C: K294Q W371L D372N I445C

Y135A: R220Q E296C K299C K349C

Y135F: K171C K238C W373L A418C

K22C: A300C S256C K309C H332N

H186N: P248C E258C I416C Q263C

K198C: L249C I259C G417C

K114C: C159S V201C V250C

También se contemplan realizaciones peptidomiméticas y organomiméticas, en las que la disposición tridimensional de los componentes químicos de estos peptidomiméticos y organomiméticos imitan la disposición tridimensional de la columna vertebral del polipéptido y las cadenas laterales del aminoácido que componen el polipéptido, resultando en unos peptidomiméticos y organomiméticos de una MPP que tienen la capacidad de lisar células prostáticas. Para las aplicaciones de modelización informática, un farmacóforo es una definición tridimensional idealizada de los requisitos estructurales para la actividad biológica. Los peptidomiméticos y organomimétidos pueden ser diseñados para ajustarse a cada farmacóforo con el software de modelización informática actual (utilizando el diseño del fármaco asistido por ordenador o CADD). Véase Walters, "Computer-Assisted Modeling of Drugs", en Klegerman & Groves, eds., 1993, Pharmaceutical Biotechnology, Interpharm Press: Buffalo Grove, III., pp. 165-174 and Principles of Pharmacology (ed. Munson, 1995), capítulo 102, para obtener una descripción de las técnicas utilizadas en CADD.

Otras modificaciones que se pueden introducir en las MPP incluyen, por ejemplo, modificaciones en los grupos de ácido carboxílico de la MPP, sea el carboxi-terminal o la cadena lateral, en la que estos grupos se encuentran en forma de una sal de un catión farmacéuticamente aceptable o esterificado para formar un éster

10 C1-C16, o convertidos en una amida de la fórmula NR1R2, donde R1 y R2 son cada una independientemente el alquilo H o C1-C16, o combinados para formar un anillo heterocíclico, como un anillo de 5 o 6 miembros. Los grupos amino del polipéptido, sea amino-terminal o la cadena lateral, pueden encontrarse en forma de una sal de adición ácida farmacéuticamente aceptable, como HC1, HBr, acética, benzoica, tolueno sulfónica, maleica, tartárica y otras sales orgánicas, o pueden ser modificados a dialquilamino o alquilo C1-C16 o también convertidos a una amida.

Otras modificaciones incluyen la conversión de grupos de hidroxilo de la cadena lateral del polipéptido en alkoxi C1C16 o en un éster C1-C16 utilizando técnicas bien reconocidas. El fenilo y los anillos fenólicos de la cadena lateral del polipéptido pueden ser sustituidos por uno o más átomos de halógeno, como F, CI, Br o I, o por alquilo C1-C16, alcoxi C1-C16, ácidos carboxílicos y ésteres de los mismos, o amidas de estos ácidos carboxílicos. Los grupos de metileno de las cadenas laterales del polipéptido se pueden extender a alquilenos C2-C4 homólogos. Los tioles se pueden proteger con uno de una serie de grupos de protección bien reconocidos, como grupos de acetamida. Aquellos con conocimientos en el campo también reconocerán métodos para introducir estructuras cíclicas en los polipéptidos descritos en el presente, para seleccionar y proporcionar restricciones conformacionales a la estructura que resultan en una estabilidad mejorada. Por ejemplo, se puede añadir un residuo de cisteína carboxi-terminal o amino-terminal al polipéptido, de forma que cuando se oxide el polipéptido contendrá un enlace de disulfuro, generando un péptido cíclico. Otros métodos que ciclizan el péptido incluyen la formación de tioéteres y ésteres y amidas carboxiterminales y amino-terminales.

La presente invención contempla también otras modificaciones de las MPP en las que las MPP están unidas o inmovilizadas en una superficie, como una perla. La perla también puede incluir un ligando específico para la próstata, al objeto de mejorar la afinidad con una célula prostática. Inmovilizado se refiere a la unión a una superficie, como una superficie sólida. Una superficie sólida puede ser polimérica, como el poliestireno o polipropileno. La superficie sólida puede ser en forma de una perla. En una realización, la superficie incluye una MPP inmovilizada y en otras realizaciones incluye también uno o más ligandos de unión específicos para la próstata, como el péptido de LHRH, el anticuerpo de PSMA y el anticuerpo de cadena única de PSMA. En otra realización, la MPP se libera de la perla una vez que la perla alcanza el objetivo de la célula prostática. Los métodos para inmovilizar péptidos sobre una superficie sólida son conocidos en el campo y se pueden encontrar en WO 94/29436 y en la Patente estadounidense nº 5.858.358.

La presente invención contempla también que la MPP puede comprender otras modificaciones orientadas a mejorar las propiedades farmacocinéticas de la molécula cuando se administra a un sujeto. Diversas modificaciones para reducir la inmunogenicidad y/o mejorar la vida útil de las proteínas terapéuticas son conocidas. Por ejemplo, las MPPs pueden sufrir glicosilación, isomerización o deglicosilación de acuerdo con métodos estándar conocidos en el campo. De igual modo, la MPP puede ser modificada mediante modificación covalente no naturalmente presente, por ejemplo mediante la adición de fracciones de glicol de polietileno (pegilación) o lipidación. En una realización, las MPP de la invención se conjugan con glicol de polietileno (PEGilados) para mejorar sus perfiles farmacocinéticos La conjugación puede ser realizada mediante técnicas conocidas por las personas con conocimientos en el campo (véase, por ejemplo, Deckert et al., Int. J. Cancer 87: 382-390, 2000; Knight et al., Platelets 15: 409-418, 2004; Leong et al., Cytokine 16: 106-119, 2001; y Yang et al., Protein Eng. 16: 761-770, 2003). En una realización, los epitopes antigénicos pueden ser identificados y alterados mediante mutagénesis. Los métodos para identificar epitopes antigénicos son conocidos en el campo (véase, por ejemplo, Serte el al., Biologicals 29:271-276), dado que son métodos para mutar esos epitopes antigénicos.

Métodos para preparar las MPP

De acuerdo con la presente invención, las MPP se pueden preparar mediante muchos métodos estándar, conocidos en el campo. Las modificaciones de la MPP se pueden realizar, por ejemplo, aplicando técnicas de ingeniería al ácido nucleico codificando la MPP utilizando tecnología de ADN recombinante. Alternativamente, las modificaciones de la MPP se pueden realizar modificando el polipéptido de la MPP en sí, utilizando modificaciones químicas y/o proteolisis limitada. Las combinaciones de estos métodos también se pueden utilizar para preparar las MPP de acuerdo con la presente invención, dado que también son conocidas en el campo.

Preparación de las MPP utilizando métodos recombinantes

Como se conoce en el campo, por lo general la ingeniería genética de una proteína requiere que el ácido nucleico que codifica la proteína sea primero aislado y clonado. Las secuencias para diversas nPP están disponibles en GenBank como se señala en el presente. El aislamiento y la clonación de la secuencia de ácido nucleico 5 que codifica estas proteínas se puede conseguir por tanto utilizando técnicas estándar [véase, por ejemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, NY (1997 y actualizaciones); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold-Spring Harbor Press, NY (2001)]. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico se puede obtener directamente de un organismo adecuado, como Aeromonas hydrophila, extrayendo el ARNm mediante técnicas estándar y después sintetizando el ADNc de la plantilla de ARNm (por ejemplo, mediante RTPCR). Alternativamente, la secuencia de ácido nucleico que codifica la nPP se puede obtener de un banco de ADNc

o ADN genómico mediante procedimientos estándar. El ADNc aislado o ADN genómico está insertado en un vector adecuado. Una persona con conocimientos en el campo apreciará que el vector preciso utilizado no es crítico para la invención inmediata. Algunos ejemplos de vectores adecuados incluyen, a título meramente enunciativo, plásmidos, fagémidos, cósmidos, bacteriófago, baculovirus, retrovirus o virus ADN. El vector puede ser un vector de clonado o un vector de expresión.

Una vez que se ha obtenido la secuencia de ácido nucleico que codifica la nPP, se pueden realizar mutaciones en uno o más de los dominios de unión o la secuencia de activación en ubicaciones específicas preseleccionadas mediante técnicas de mutagénesis dirigidas al sitio in vitro bien conocidas en el campo. Esto se puede conseguir, por ejemplo, mediante técnicas basadas en PCR para las que se diseñan cebos que incorporan una o más faltas de identidad, inserciones o deleciones del nucleótido. La presencia de la mutación se puede verificar mediante una serie de técnicas estándar, por ejemplo mediante análisis de restricción o secuenciación de ADN.

Si se desea, tras la introducción de la mutación o mutaciones adecuadas, la secuencia de ácido nucleico que codifica la MPP se puede insertar en un vector de expresión adecuado. Algunos ejemplos de vectores de expresión adecuados incluyen, a título meramente enunciativo, plásmidos, fagémidos, cósmidos, bacteriófagos, baculovirus, retrovirus y virus ADN.

Una persona con conocimientos en el campo entenderá que el vector de la expresión puede incluir también elementos reguladores, como elementos transcripcionales, necesarios para una transcripción eficiente de las secuencias de codificación de MPP. Algunos ejemplos de elementos reguladores que se pueden incorporar en el vector incluyen, a título meramente enunciativo, promotores, facilitadores, terminadores y señales de poliadenilación. La presente invención, por tanto, proporciona vectores que se componen de un elemento regulador operativamente unido a una secuencia de ácido nucleico que codifica una MPP modificada genéticamente. Una persona con conocimientos en el campo apreciará que la selección de los elementos reguladores adecuados es dependiente de la célula hospedadora elegida para la expresión de la MPP modificada genéticamente y que estos elementos reguladores se pueden obtener de diversas fuentes, incluyendo genes bacterianos, fúngicos, virales, de mamíferos o insectos.

Por ejemplo, se puede utilizar un promotor específico para la próstata sensible a la testosterona y otros andrógenos para promover la expresión genética en las células prostáticas. Algunos ejemplos incluyen, a título meramente enunciativo, el promotor de la probasina; el promotor del antígeno específico para la próstata (PSA); el promotor del antígeno prostático específico de membrana (PSMA); y el promotor de calicreína glandular humana 2 (HK2).

En el contexto de la presente invención, el vector de expresión puede contener adicionalmente secuencias de ácido nucleico heterólogo que facilitan la purificación de la MPP expresada. Algunos ejemplos de estas secuencias de ácido nucleico heterólogo incluyen, a título meramente enunciativo, etiquetas de afinidad como etiquetas de afinidad al metal, etiquetas de histidina, secuencias de codificación de avidina/estreptavidina, secuencias de codificación de glutación S-transferasa (GST) y secuencias de codificación y secuencias de codificación de biotina. Los aminoácidos correspondientes a la expresión de los ácidos nucleicos se pueden eliminar de la MPP expresada antes del uso, de acuerdo con métodos conocidos en el campo. Alternativamente, los aminoácidos correspondientes a la expresión de las secuencias de ácido nucleico heterólogas se pueden conservar en la MPP, siempre que no interfieran en la capacidad de la MPP para dirigirse a las células prostáticas y matarlas.

En una realización de la invención, la MPP se expresa como una proteína con una etiqueta de histidina. En otra realización, la etiqueta de histidina se ubica en el carboxi-terminal de la MPP.

Los vectores de expresión se pueden introducir en un tejido o una célula hospedadora apropiada mediante uno de los diversos métodos conocidos en el campo. Estos métodos se pueden encontrar generalmente descritos en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, NY (1997 y actualizaciones); Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold-Spring Harbor Press, NY (2001) e incluyen, por ejemplo, una transfección estable o transitoria, lipofección, electroporación e infección con vectores virales recombinantes. Una persona con conocimientos en el campo entenderá que la selección de la célula hospedadora apropiada para la expresión de la MPP dependerá del vector elegido. Algunos ejemplos de células hospedadoras incluyen, a título meramente enunciativo, células bacterianas, de levadura, de insectos, de plantas y mamíferos.

Por otra parte, se puede elegir una célula hospedadora que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto genético de una forma específica y deseada. Estas modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, clivaje) de productos de proteína pueden ser importantes para la función de la proteína. Las diferentes células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación post-translacionales de las proteínas y productos genéticos. Se pueden elegir las líneas celulares o los sistemas hospedadores apropiados para garantizar la correcta modificación y procesamiento de la proteína extraña expresada. A tal efecto, se pueden utilizar las células hospedadoras eucarióticas que poseen la maquinaria celular para el buen procesamiento de la transcripción primaria y para modificaciones posttranslacionales como la glicosilación y la fosforilación del producto genético. Estas células hospedadoras de mamífero incluyen, a título meramente enunciativo, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38.

Los métodos de clonación y expresión de las proteínas son bien conocidos en el campo. Las descripciones detalladas de las técnicas y sistemas para la expresión de proteínas recombinantes se pueden encontrar, por ejemplo, en Current Protocols in Protein Science (Coligan, J.E., et al., Wiley & Sons, New York). Aquellos con conocimientos en el campo de la biología molecular entenderán que se pueden utilizar diversos sistemas de expresión para proporcionar la proteína recombinante. La célula hospedadora precisa utilizada no es crítica para la invención. Por consiguiente, la presente invención contempla que las MPP se pueden producir en una hospedadora procariótica (por ejemplo, E. coli, A. salmonicida o B. subtilis) o en una hospedadora eucariótica (por ejemplo, Saccharomyces o Pichia; células de mamífero, como COS, NIH 3T3, CHO, BHK, 293, o células HeLa; o células de insecto).

Las MPP se pueden purificar de las células hospedadoras mediante técnicas estándar conocidas en el campo. Si se desea, los cambios en la secuencia de aminoácidos introducidos en la proteína se pueden determinar mediante técnicas de secuenciación de péptidos estándar, utilizando la proteína intacta o fragmentos proteolíticos de la misma.

Como alternativa a un procedimiento dirigido para introducir mutaciones en proteínas formadoras de poros naturalmente presentes, un gen clonado que expresa una proteína formadora de poros se puede someter a mutagénesis aleatoria mediante técnicas conocidas en el campo. La posterior expresión y selección de las formas mutantes de la proteína así generadas permitiría la identificación y el aislamiento de las MPP de acuerdo con la presente invención.

Las MPP de acuerdo con la presente invención también se pueden preparar como fragmentos o proteínas de fusión. Una proteína de fusión es una que incluye una MPP unida a otras secuencias de aminoácidos que no inhiben la capacidad de la MPP para dirigirse y matar selectivamente a las células prostáticas normales. En una realización, las otras secuencias de aminoácidos no tienen más de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, o 50 residuos de aminoácidos de longitud.

Los métodos para realizar proteínas de fusión son bien conocidos por las personas con conocimientos en el campo. Por ejemplo, la Patente estadounidense nº 6.057.133 revela métodos para realizar moléculas de fusión compuestas por una variante de la interleucina-3 humana (hIL-3) o proteínas mutantes funcionalmente unidas a un factor de estimulación de una segunda colonia, citocina, linfocina, interleucina, el factor de crecimiento hematopoyético o una variante de IL-3. La Patente estadounidense nº 6.072.041 para Davis et al. revela la generación de proteínas de fusión compuestas por una única cadena de la molécula Fv dirigida contra un receptor transcitótico unido covalentemente a una proteína.

Se pueden utilizar métodos similares para generar proteínas de fusión que comprenden MPP (o variantes, fragmentos, etc. de las mismas) unidas a otras secuencias de aminoácidos, como un dominio diana específico para la próstata (por ejemplo, LHRH o un anticuerpo). Las regiones de enlace se pueden utilizar para separar las dos porciones de la proteína entre sí y para proporcionar flexibilidad entre ellas. Por lo general, la región de enlace es un polipéptido de entre 1 y 500 aminoácidos de longitud, por ejemplo menos de 30 aminoácidos de longitud. En general, el enlace que une las dos moléculas puede estar diseñado para (1) permitir que las dos moléculas se plieguen y actúen independientemente la una de la otra, (2) que no tengan una propensión a desarrollar una estructura secundaria ordenada que podría interferir con los dominios funcionales de las dos proteínas (3) que tengan unas características mínimas hidrófobas o cargadas que podrían interactuar con los dominios de la proteína funcional y/o (4) que proporcionen la separación estérica de las dos regiones. Típicamente los aminoácidos de la superficie de las regiones flexibles de la proteína incluyen Gly, Asn y Ser. Otros aminoácidos neutros, como Thr y Ala, también se pueden utilizar en la secuencia del enlace. Se pueden incluir aminoácidos adicionales en el enlace para proporcionar sitios de restricción únicos en la secuencia del enlace para facilitar la construcción de las fusiones. También se pueden incluir otras fracciones, según se desee. Estas pueden incluir una región de unión, como avidina

o un epitope, o una etiqueta, como una etiqueta de polihistidina, que pueden ser útiles para la purificación y el procesamiento de la proteína de fusión. Por otra parte, se pueden unir marcadores detectables a la proteína de fusión, de forma que el tráfico de la proteína de fusión a través un cuerpo o una célula se pueda controlar convenientemente. Estos marcadores incluyen radionúclidos, enzimas, fluoróforos y similares.

La fusión de las secuencias de ácido nucleico de la MPP con la secuencia de ácido nucleico de otra proteína (o variante, fragmento, etc. de la misma) se puede realizar mediante el uso de vectores intermedios. Alternativamente, se puede clonar un gen directamente en un vector que contiene el otro gen. Se pueden utilizar enlaces y adaptadores para unir las secuencias de ácido nucleico, así como sustituir las secuencias perdidas, cuando un sitio de restricción sea interno a la región de interés. El material genético (ADN) que codifica un polipéptido, enlace de péptido, y el otro polipéptido se insertan en un vector de expresión adecuado que se utiliza para transformar células procarióticas o eucarióticas, como bacterias, levadura, células de insectos o células de mamíferos. El organismo transformado se cultiva y la proteína se aísla mediante técnicas estándar, por ejemplo utilizando un marcador detectable como la cromatografía de afinidad con quelato de níquel, si se utiliza una etiqueta de polihistidina. El producto resultante es por tanto una nueva proteína, una proteína de fusión, que tiene la MPP unida a una segunda proteína, opcionalmente a través de un enlace. Para confirmar que la proteína de fusión es expresada, la proteína purificada puede ser, por ejemplo, sometida a electrofóresis en geles de poliacrilamida-SDS, y transferida en filtros de membrana de nitrocelulosa utilizando métodos establecidos. Los productos de proteína pueden ser identificados mediante inmunoblot, utilizando anticuerpos dirigidos contra los componentes individuales, como una etiqueta de prohistidina y/o la MPP.

Si, de acuerdo con la presente invención, las MPP se producen mediante la expresión de un gen fusionado, una unión del péptido sirve de enlace entre la MPP y el dominio diana específico para la próstata. Por ejemplo, una proteína de fusión recombinante de un fragmento de Fv de cadena única de un anticuerpo y una toxina de una proteína formadora de poros se pueden realizar de acuerdo con métodos conocidos en el campo, por ejemplo Huston et al., Meth. Enzymol. 203:46-88, 1991.

Una persona que tenga unos conocimientos normales en el campo apreciará que el ADN se puede alterar de diversas formas sin que afecte a la actividad biológica de la proteína modificada. Por ejemplo, la PCR se puede utilizar para producir variaciones en la secuencia de ADN que modifica una MPP. Estas variaciones en la secuencia de ADN que codifica una MPP se pueden utilizar para optimizar la preferencia por el codón en una célula hospedadora utilizada para expresar la proteína o puede contener otros cambios en la secuencia que facilitan la expresión.

Otros métodos para preparar las MPP

Los dominios diana específicos para la próstata y enlaces opcionales anteriormente señalados se pueden añadir a las MPP de la presente invención a través de una unión covalente o no covalente, o ambas. Las interacciones no covalentes pueden ser iónicas, hidrófobas o hidrófilas, como las interacciones implicadas en la interacción de una cremallera de leucina o anticuerpo-proteína G (Derrick et al., Nature 359:752, 1992). Algunos ejemplos de interacciones no covalentes adicionales incluyen, a título meramente enunciativo, los siguientes pares de unión: antígeno o hapteno con anticuerpo; anticuerpo con anti-anticuerpo; receptor con ligando; enzima o fragmento de enzima con sustrato, análogo de sustrato o ligando; biotina o lectina con avidina o estreptavidina; lectina con carbohidrato; pares de motivos de cremallera de leucina (véase, por ejemplo, la Patente estadounidense nº 5.643.731), así como diversos homodímeros y heterodímeros conocidos en el campo. Como se conoce en el campo, la MPP puede ser modificada para incluir un miembro del par de unión, y el dominio diana específico para la próstata puede ser modificado para incluir el otro miembro del par de unión.

Un enlace covalente puede adoptar la forma de una unión de disulfuro. El ADN que codifica uno de los componentes se puede modificar para que contenga un codón de cisteína único. Alternativamente, se puede hacer uso de un residuo de cisteína naturalmente presente. El segundo componente se puede derivatizar con un grupo de sulfhidrilo reactivo con la cisteína del primer componente. Alternativamente, un grupo de sulfhidrilo, por sí mismo o como parte de un residuo de cisteína, se puede introducir utilizando técnicas del polipéptido en fase sólida. Por ejemplo, la introducción de grupos de sulfhidrilo en los péptidos es descrita por Hiskey (Peptides 3:137,1981).

Las proteínas se pueden modificar químicamente mediante técnicas estándar para añadir un grupo de sulfhidrilo. Por ejemplo, el reactivo de Traut (2-iminotiolano-HCI) (Pierce Chemicals, Rockford, III.) se puede utilizar para introducir un grupo de sulfhidrilo en aminas primarias, como residuos de lisina o aminas N-terminales. Una proteína o péptido modificado con el reactivo de Traut puede entonces reaccionar con una proteína o un péptido que ha sido modificado con reactivos como N-succinimidilo 3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) o succinimidilo 4-(Nmaleimidometil)ciclohexano-l-carboxilato (SMCC) (Pierce Chemicals, Rockford, Ill.).

Una vez que los grupos de sulfhidrilo correctos están presentes en cada componente, los dos componentes son purificados, los grupos de sulfuro de cada componente son reducidos; los componentes son mezclados; y se permite que la formación de la unión de disulfuro continúe hasta completarse a temperatura ambiente. Para mejorar la eficiencia de la reacción de unión, el residuo de cisteína de uno de los componentes, por ejemplo, cisteína-MPP, se puede activar antes de la adición a la mezcla de reacción de ácido 5,5'-ditiobis (2-nitrobenzoico) (DTNB) o 2,2'ditiopiridina, utilizando métodos conocidos en el campo. Tras la reacción, la mezcla es dializada en solución salina fosfatada para retirar las moléculas no conjugadas. La cromatografía de Sephadez o similar se realiza después para separar el compuesto de la invención de sus partes componentes basándose en su tamaño.

Los componentes también se pueden unir utilizando el polímero, glicol de monometoxi-polietileno (mPEG), descrito en Maiti et al., Int. J. Cancer Suppl. 3:17-22, 1988.

El dominio diana específico para la próstata y la nPP o MPP también se pueden conjugar a través de uso de químicas de conjugación estándar conocidas en el campo, tales como una unión mediada por carbodiimida (por ejemplo, DCC, EDC o EDC activada), y el uso de 2-iminotiolano para convertir grupos epsilon amino en tioles para reticular y el éster de m-maleimidobenzoil-n-hidroxisuccinimidilo (MBS) como agente reticulador. Se pueden emplear varios otros métodos de conjugación conocidos en el campo para unir el dominio diana específico para la próstata y la nPP o MPP.

Preparación de MPP a gran escala

La preparación de las MPP también se puede realizar a gran escala, por ejemplo para los fines de la fabricación, utilizando técnicas estándar conocidas en el campo, tales como procesos de fermentación a gran escala para la producción de proteínas recombinantes, y ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados para la purificación de proteínas recombinantes.

Métodos para probar las MPP

Las MPP, de acuerdo con la presente invención, conservan su actividad formadora de poros y matan selectivamente a las células prostáticas. La capacidad de las MPP para matar selectivamente a las células prostáticas se puede probar utilizando técnicas estándar conocidas en el campo. Algunos ejemplos de los métodos para probar las MPP candidatas se proporcionan más abajo en los Ejemplos incluidos en el presente. Una persona con conocimientos en el campo entenderá que otros métodos para probar las MPP candidatas son conocidos en el campo y también son adecuados para probar las MPP de acuerdo con la presente invención.

Métodos in vitro

De acuerdo con la presente invención, las MPP que contienen una secuencia de activación específica para la próstata se pueden probar para analizar su capacidad para ser sometidas a clivaje con la proteasa específica para la próstata apropiada, de acuerdo con métodos conocidos en el campo. Por ejemplo, la MPP puede ser incubada con diversas concentraciones de la proteasa apropiada y los productos de incubación pueden ser sometidos a electroforesis en geles de SDS-PAGE, y el clivaje de la MPP se puede evaluar examinando el tamaño del polipéptido sobre el gel.

Para determinar si las MPP que han sido incubadas con proteasa conservan la actividad formadora de poros y, por tanto, la capacidad para matar células después de la incubación con la proteasa, los productos de la reacción pueden ser probados en un ensayo de hemólisis conocido en el campo. Un ejemplo de ensayo apropiado se describe en Howard, S.P., y Buckley, J.T. 1985. Activation of the hole-forming toxin aerolysin by extracellular processing. J. Bacteriol. 163:336-340.

De acuerdo con la presente invención, las MPP se pueden probar para analizar su capacidad de matar células prostáticas como se conoce en el campo. Por ejemplo, la capacidad de las MPP para matar células prostáticas se puede probar in vitro utilizando una línea celular prostática adecuada. En general, las células de la línea celular seleccionadas para la prueba se cultivan a una densidad apropiada y se añade la MPP candidata. Después de un tiempo de incubación apropiado (por ejemplo, aproximadamente de 48 a 72 horas), se valora la supervivencia de las células. Los métodos para determinar la supervivencia de las células son bien conocidos en el campo e incluyen, a título meramente enunciativo, el test de reducción de resazurina (véase Fields & Lancaster (1993) Am. Biotechnol. Lab. 11:48-50; O'Brien et al, (2000) Eur. J. Biochem. 267:5421-5426 y la Patente estadounidense nº 5.501.959), el ensayo de sulfohodamina (Rubinstein et al, (1990) J. Natl. Cancer Inst. 82:113-118) o el test del rojo neutro (Kitano et al, (1991) Euro. J. Clin. Investg. 21:53-58; West et al, (1992) J. Investigative Derm. 99:95-100) o el ensayo con azul de tripano. También se pueden utilizar numerosos kits disponibles en el mercado, tales como CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega). La citotoxicidad se determina mediante comparación de la supervivencia de las células en el cultivo tratado con la supervivencia de las células en uno o más cultivos de control, por ejemplo, cultivos sin tratar y/o cultivos pretratados con un compuesto de control (típicamente un terapéutico conocido) u otro control apropiado. Las MPP consideradas efectivas para matar células prostáticas normales son capaces de reducir la supervivencia de las células, por ejemplo, al menos en un 10%, al menos en un 20%, al menos en un 30%, al menos en un 40% o al menos en un 50%.

Las MPP que comprenden un dominio diana específico para la próstata pueden ser evaluadas para analizar su capacidad de dirigirse selectivamente a las células prostáticas, por ejemplo, comparando la habilidad de la MPP para matar células prostáticas normales con su capacidad para matar células de otros tejidos. Alternativamente, se pueden utilizar citometrías de flujo conocidas en el campo para determinar si una MPP que comprende un dominio diana específico para la próstata es capaz de dirigirse selectivamente a las células prostáticas. Otra alternativa más consiste en incorporar el ligando de unión para el dominio diana específico para la próstata en membranas de lípidos artificiales y se puede medir la capacidad de la MPP para formar canales utilizando métodos conocidos para quienes tienen conocimientos en el campo.

Los ensayos que se pueden utilizar para probar las MPP de acuerdo con la presente invención para analizar su capacidad para lisar específicamente células prostáticas se describe, por ejemplo, en los Ejemplos 2 y 3. Por ejemplo, se puede evaluar la capacidad de una MPP que tiene un sitio de clivaje de PSA para lisar específicamente las células que producen PSA en comparación con su habilidad para lisar células que no producen PSA. Las MPP, de acuerdo con la presente invención, cuando contactan con una célula productora de PSA (como células prostáticas), promueven la lisis y la muerte de la célula, a concentraciones inferiores de las necesarias para matar una célula no productora de PSA, por ejemplo, unas concentraciones 2 veces, 5 veces, 10 veces o 100 veces inferiores.

Se conocen diversas líneas celulares prostáticas adecuadas para probar las MPP candidatas en el campo y muchas están a la venta en el mercado (por ejemplo de American Type Culture Collection, Manassas, VA). Entre los ejemplos de líneas celulares prostáticas adecuadas para realizar pruebas in vitro se incluyen, a título meramente enunciativo, PNT1A, PNT2, BPH-1, DuK50, NRP152, PS-1.

Si es necesario, la toxicidad de las MPP para las células no prostáticas también se puede evaluar inicialmente in vitro utilizando técnicas estándar. Por ejemplo, los fibroblastos primarios humanos se pueden transfectar in vitro con la MPP y posteriormente testarse en diferentes puntos tras el tratamiento, al objeto de comprobar su viabilidad utilizando un ensayo de viabilidad estándar, como los ensayos anteriormente descritos, o el ensayo de exclusión con azul de tripano. Las células también se pueden someter a ensayo para comprobar su capacidad para sintetizar ADN, por ejemplo utilizando un ensayo de incorporación de timidina, y en busca de cambios en la dinámica del ciclo celular, por ejemplo, utilizando un ensayo de clasificación celular estándar conjuntamente con un flurocitómetro (FACS).

Según la presente invención, la actividad de las MPP en plasma o suero también se puede probar como se conoce en el campo. Por ejemplo, las MPP se pueden incubar con suero durante un período de tiempo adecuado, después del cual se mide el grado de activación de la MPP utilizando, por ejemplo, electrofóresis y análisis densitométrico de las bandas sometidas a electrofóresis correspondientes a la MPP activada.

Métodos in vivo

De acuerdo con la presente invención, la toxicidad de las MPP se puede testar in vivo según métodos conocidos en el campo. Por ejemplo, la toxicidad sistémica total de las MPP se puede testar determinando la dosis que mata el 100% en ratón (es decir, LD100), tras una única inyección intravenosa como se describe en el Ejemplo 4. La toxicidad debida a la administración sistémica o intraprostática de una MPP se puede evaluar in vivo, por ejemplo, administrando la MPP a perros, ratas o monos.

La capacidad de las MPP según la presente invención para reducir el tamaño de la próstata, indicando así su idoneidad para el tratamiento de la HPB, se puede testar in vivo utilizando modelos animales conocidos en el campo. Por ejemplo, la actividad in vivo de las MPP se puede probar utilizando perros o primates no humanos, como el macaco cangrejero, el chimpancé o babuino. Las MPP se pueden administrar, por ejemplo, mediante inyección intraprostática perianal. Los cambios del volumen prostático tras la administración se pueden evaluar, por ejemplo, mediante resonancia magnética o examen postmortem del tejido prostático y/o la determinación del peso prostático.

Como se ha señalado, las MPP capaces de reducir el tamaño de la glándula prostática en un modelo animal, o atenuar el ritmo de crecimiento de la glándula prostática, se consideran adecuadas para el tratamiento de la HPB. La reducción del tamaño de la glándula prostática se refiere a una disminución del peso o del volumen de una glándula prostática, y la atenuación del ritmo de crecimiento de la glándula prostática se refiere a la situación en la que se produce un incremento mínimo o nulo del peso o volumen de la glándula prostática en un animal, tras la administración del compuesto de ensayo. En una realización, las MPP contempladas por la presente invención, cuando se administran a un animal, son capaces de reducir el tamaño de la glándula prostática, por ejemplo, al menos en un 10%, 20%, 30%, 40% o 50%.

Determinación y reducción de la antigenicidad de la MPP

Las proteínas terapéuticas pueden provocar cierto nivel de respuesta del anticuerpo cuando se administra a un sujeto, que, en algunos casos, puede provocar efectos secundarios potencialmente graves. Por tanto, si es necesario, la antigenicidad de las MPP se puede evaluar como se conoce en el campo y como se describe a continuación. Por otra parte, se describen los métodos para reducir la potencial antigenicidad.

La cinética y magnitud de la respuesta del anticuerpo a las MPP aquí descritas se pueden determinar, por ejemplo, en un ratón inmunocompetente, y se pueden utilizar para facilitar el desarrollo de un régimen de dosificación que se puede utilizar en un humano inmunocompetente. A los ratones inmunocompetentes, como la cepa C57-BL6, se les administran dosis intravenosas de la MPP. Los ratones son sacrificados a diversos intervalos (por ejemplo, tras una dosis, tras múltiples dosis) y se obtiene el suero. Se puede utilizar un ensayo basado en ELISA para detectar la presencia de anticuerpos contra la MPP.

Para reducir la antigenicidad de las MPP de acuerdo con la presente invención, el dominio de unión natural de la MPP se puede someter a deleción funcional y sustituirse, por ejemplo, por un dominio diana específico para la próstata, tal y como se ha descrito anteriormente. La antigenicidad de estas MPP se puede determinar tras la exposición a diversos programas de la MPP que carecen de porciones del dominio de unión natural, utilizando los métodos descritos anteriormente. Otro método que se puede utilizar para permitir el tratamiento continuado con MPP consiste en utilizar MPP alternativas administradas secuencialmente y obtenidas de otras nPP con antigenicidad no solapada. Por ejemplo, una MPP obtenida de proaerolisina se puede utilizar alternativamente con una MPP obtenida la toxina alfa Clostridium septicum o la toxina delta Bacillus thuringiensis. Todas estas MPP se dirigirían a las células prostáticas, pero no serían reconocidas ni neutralizadas por los mismos anticuerpos. Otro ejemplo consiste en utilizar una MPP obtenida de tejidos humanos, como la perforina humana producida por células T humanas citolíticas. Estas MPP se pueden administrar y no producir una respuesta del anticuerpo porque las proteínas son de origen humano.

Compuestos farmacéuticos

La presente invención proporciona compuestos farmacéuticos que se componen de una MPP y uno o más portadores, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes no tóxicos farmacéuticamente aceptables. Si se desea, otros ingredientes activos se pueden incluir en los compuestos. Como se ha indicado anteriormente, estos compuestos se utilizan en el tratamiento de la HPB.

Los compuestos farmacéuticos pueden comprender desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 95% de una MPP de la invención. Los compuestos formulados para la administración en forma de una sola dosis pueden comprender, por ejemplo, desde aproximadamente el 20% hasta aproximadamente el 90% de las MPP de la invención, mientras que los compuestos que no son en forma de una sola dosis pueden comprender, por ejemplo, desde aproximadamente el 5% hasta aproximadamente el 20% de las MPP de la invención. La concentración de la MPP en la formulación final puede ser de tan solo 0,01 g/mL. Por ejemplo, la concentración en la formulación final puede estar entre aproximadamente el 0,01 g/mL y el 1.000 g/mL. En una realización, la concentración en la formulación final es de entre aproximadamente el 0,01 g/mL y aproximadamente 100 g/mL. Algunos ejemplos, a título meramente enunciativo, de las formas de dosis unitarias incluyen grageas, tabletas, ampollas, viales, supositorios y cápsulas.

La composición puede ser una solución líquida, suspensión, emulsión, tableta, píldora, cápsula, formulación de liberación prolongada o polvo. Para las composiciones sólidas (por ejemplo, en forma de polvo, píldora, tableta o cápsula), los portadores sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio o estearato de magnesio. La composición se puede formular como un supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales como los triglicéridos.

Para la administración a un animal, las composiciones farmacéuticas se pueden formular para la administración por diversas vías. Por ejemplo, las composiciones se pueden formular para la administración oral, tópica, rectal o parenteral, o para la administración por inhalación o pulverización. El término parenteral utilizado en el presente incluye inyecciones subcutáneas, intravenosas, intramusculares, intratecal, intraesternal o técnicas de infusión. También se contempla la infusión o inyección directa en la glándula prostática. La administración potenciada por convección, una técnica de administración estándar para las toxinas de las proteínas, también se contempla en la presente invención.

Las MPP se pueden administrar junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Idealmente, este vehículo mejoraría la estabilidad y/o las propiedades de la administración. De este modo, la presente invención también prevé la formulación de la MPP con un vehículo adecuado, como una vesícula de membrana artificial (incluyendo un liposoma, noisoma, nanosoma y similares), micropartícula o microcápsula, o como una formulación coloidal que comprende un polímero farmacéuticamente aceptable. El uso de estos vehículos/polímeros puede ser beneficioso para conseguir la liberación prolongada de las MPP. Alternativa o adicionalmente, las formulaciones de MPP pueden incluir aditivos para estabilizar la proteína in vivo, como albúmina sérica humana u otros estabilizantes para tratamientos de proteína conocidos en el campo.

Los compuestos farmacéuticos para uso oral se pueden formular, por ejemplo, como tabletas, perlas, pastillas, suspensiones acuosas u oleaginosas, granulados o polvos dispersables, cápsulas blandas o duras para emulsión, jarabes o elixires. Estos compuestos se pueden preparar de acuerdo con métodos estándar conocidos en el campo para la fabricación de compuestos farmacéuticos y pueden contener uno más agentes seleccionados del grupo de los agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y agentes conservantes, al objeto de proporcionar preparados sabrosos y farmacéuticamente elegantes. Las tabletas contienen el ingrediente activo junto con excipientes no tóxicos farmacéuticamente aceptables incluyendo, por ejemplo, diluyentes inertes, como carbonato cálcico, carbonato sódico, lactosa, fosfato cálcico o fosfato sódico; agentes granulantes y desintegrantes, como almidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes, como almidón, gelatina o acacia; y agentes lubricantes, como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Las tabletas pueden estar sin recubrir o pueden ser recubiertas por técnicas conocidas al objeto de retrasar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal y, de este modo, proporcionar una acción sostenida durante un período más prolongado. Por ejemplo, se puede emplear un material retardante como el monoestearato de glicerilo o distearato de glicerilo.

Los compuestos farmacéuticos para uso oral también se pueden presentar como cápsulas de gelatina dura en las que el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte como, por ejemplo, carbonato cálcico, fosfato cálcilo o caolín, o como cápsulas de gelatina blanda en las que el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio oleaginoso, como aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.

Los compuestos farmacéuticos formulados como suspensiones acuosas contienen el compuesto o los compuestos activos junto con uno o más excipientes adecuados como, por ejemplo, con agentes de suspensión, como carboximetilcelulosa sódica, celulosa de metilo, hidropropilmetilcelulosa, alginato sódico, polivinilpirrolidona, hidroxipropil-β- ciclodextrina, goma tragacanto, goma arábiga; agentes dispersantes o humectantes, como fosfátidos naturalmente presentes, como lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo, estearato de polioxietileno, productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo, heptadecaetilenoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales obtenidos de ácidos grasos y un hexitol, por ejemplo, monooleato de sorbitol polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales obtenidos de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de sorbitán de polietileno. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservantes, como etilo o n-propil p-hidroxi-benzoato, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes aromatizantes o uno o más agentes edulcorantes, como sacarosa o sacarina.

Los compuestos farmacéuticos se pueden formular como suspensiones oleginosas, suspendiendo el compuesto o los compuestos activos en un aceite vegetal, como aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo, aceite de coco, o en un aceite mineral como parafina líquida. Las suspensiones oleaginosas pueden contener un agente espesante, como cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico. Se pueden añadir los agentes edulcorantes indicados anteriormente y/o agentes aromatizantes para proporcionar preparados orales sabrosos. Estos compuestos se pueden conservar mediante la adición de un antioxidante como ácido ascórbico.

Los compuestos farmacéuticos se pueden formular como gránulos o polvos dispersantes, que posteriormente se pueden utilizar para preparar una suspensión acuosa mediante la adición de agua. Estos gránulos o polvos dispersantes proporcionan el ingrediente activo junto con uno o más agentes dispersantes o humectantes, agentes de suspensión y/o conservantes. Algunos ejemplos de agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados son los mencionados anteriormente. Otros excipientes, como agentes edulcorantes, aromatizantes y colorantes, se pueden incluir en estos compuestos.

Los compuestos farmacéuticos de la invención también se pueden formular como emulsiones de aceite en agua. La fase del aceite puede ser un aceite vegetal como aceite de oliva o aceite de cacahuete, o un aceite mineral, como parafina líquida, o bien una mezcla de estos aceites. Los agentes emulsionantes adecuados para su inclusión en estos compuestos incluyen gomas naturalmente presentes, como goma arábiga o goma de tragacanto; fosfátidos naturalmente presentes, como semillas de soja, lecitina; o ésteres o ésteres parciales obtenidos de ácidos grasos y hexitol, anhídridos, como monooleato de sorbitán, y productos de condensación de los mencionados ésteres parciales con óxido de etileno, como monooleato de sorbitán de polioxietileno. Las emulsiones también pueden contener opcionalmente agentes edulcorantes y aromatizantes.

Los compuestos farmacéuticos se pueden formular como un jarabe o elixir, combinando el ingrediente o los ingredientes activos con uno o más agentes edulcorantes, como el glicerol, el glicol de propileno, sorbitol o sacarosa. Estas formulaciones también pueden contener opcionalmente uno o más agentes emolientes, conservantes, aromatizantes y/o colorantes.

Los compuestos farmacéuticos se pueden formular como una suspensión oleaginosa o acuosa inyectable estéril de acuerdo con métodos conocidos en el campo y utilizando uno o más agentes dispersantes o humectantes adecuados y/o agentes de suspensión, como los mencionados anteriormente. El preparado inyectable estéril puede ser una solución inyectable estéril o una suspensión en un diluyente o disolvente no tóxico y farmacéuticamente aceptable, como una solución en 1,3-butanodiol. Los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear incluyen, a título meramente enunciativo, agua, solución de Ringer, solución de Ringer lactada y solución de cloruro sódico isotónico. Otros ejemplos incluyen, aceites fijos estériles, que son convencionalmente utilizados como medio disolvente o de suspensión, y diversos aceites fijos blandos como, por ejemplo, monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. También se pueden utilizar ácidos grasos, como ácido oleico, en la preparación de inyectables.

Otros compuestos farmacéuticos y métodos para preparar compuestos farmacéuticos son conocidos en el campo y se describen, por ejemplo, en “Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (formerly "Remingtons Pharmaceutical Sciences")', Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Philidelphia, PA (2000).

Los compuestos farmacéuticos de la presente invención anteriormente descritos incluyen una o más MPP de la invención en una cantidad efectiva para conseguir el fin previsto. Por tanto, el término “dosis terapéuticamente efectiva” se refiere a la cantidad de la MPP que mejora los síntomas o características de la HPB. La determinación de una dosis terapéuticamente efectiva de un compuesto resulta sencilla para una persona con conocimientos en el campo. Por ejemplo, la dosis terapéuticamente efectiva se puede calcular inicialmente en ensayos de cultivos celulares o en modelos animales, como los anteriormente descritos. Los modelos animales también se pueden utilizar para determinar el rango de la concentración apropiada y la vía de administración. Esta información se puede utilizar después para determinar las dosis útiles y las vías de administración en otros animales, incluyendo los humanos, utilizando métodos estándar conocidos por las personas con conocimientos en el campo.

La eficacia terapéutica y la toxicidad también se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar, como, por ejemplo, la determinación de la dosis efectiva media, o ED50 (es decir, la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población) y la dosis letal media, o LD50 (es decir, la dosis letal para el 50% de la población). El ratio de dosis entre los efectos terapéuticos y los efectos tóxicos es conocido como el “índice terapéutico”, que se puede expresar como el ratio LD50/ED50. Los datos obtenidos de ensayos de cultivos celulares y estudios con animales se pueden utilizar para formular un rango de dosis para uso humano o animal. La dosis contenida en estos compuestos se encuentra normalmente dentro de un rango de concentraciones que incluyen la ED50 y demuestra escasa o ninguna toxicidad. La dosis varía dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada, de la sensibilidad del sujeto, de la vía de administración y similares. La dosis exacta que se debe administrar a un sujeto puede ser determinada por el médico, a la luz de los factores asociados con el sujeto que precisa el tratamiento. La dosis y administración se ajustan para proporcionar unos niveles suficientes de la MPP y/o para mantener el efecto deseado. Entre los factores a tener en cuenta a la hora de determinar una dosis apropiada se incluyen la gravedad del estado de la enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el sexo del sujeto, la dieta, el tiempo y la frecuencia de administración, la combinación o combinaciones de fármacos, la sensibilidad a las reacciones y la tolerancia/respuesta a la terapia. Los regímenes de dosificación pueden ser diseñados por el médico, dependiendo de los factores anteriores, así como factores como la semivida y la tasa de eliminación de la formulación en particular.

Las cantidades farmacéuticamente efectivas de las MPP de la presente invención se pueden formular con portadores farmacéuticamente aceptables para la administración parenteral, oral, nasal, rectal, tópica, transdérmica

o similares, de acuerdo con métodos convencionales. Las formulaciones también pueden incluir uno o más diluyentes, material de relleno, emulsionantes, conservantes, tampones, excipientes y similares, y pueden ser proporcionadas en formas como líquidos, polvos, emulsiones, supositorios, liposomas, parches transdérmicos y tabletas, por ejemplo. Los sistemas de liberación lenta o prolongada, incluyendo cualquiera de una serie de biopolímeros (sistemas de base biológica), sistemas que emplean liposomas y sistemas de administración polimérica también se pueden utilizar con los compuestos descritos en el presente para proporcionar una fuente continua o a largo plazo de la MPP. Estos sistemas de liberación lenta son aplicables a formulaciones, por ejemplo, para uso oral, tópico y parenteral. El término “portador farmacéuticamente aceptable” se refiere a un medio portador que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica de los ingredientes activos y que no es tóxica para el hospedador ni para el paciente. Una persona con conocimientos en el campo puede formular los compuestos de la presente invención de una manera apropiada y de conformidad con las prácticas aceptadas, como las divulgadas en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton Pa., 19th ed., 1995

En una realización, la MPP se conjuga con un polímero soluble en agua, por ejemplo para aumentar la estabilidad o la vida útil en la circulación o para reducir la inmunogenicidad. Los polímeros solubles en agua clínicamente aceptables incluyen, a título meramente enunciativo, glicol de polietileno (PEG), propionaldehído de glicol de polietileno, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona (PVP), homopolímeros de glicol de polipropileno (PPG), polioles polioxietilados (POG) (como glicerol) y otros polioles polioxietilados, sorbitol polioxietilado, o glucosa polioxietilada y otros polímeros de carbohidratos. Los métodos para conjugar polipéptidos con polímeros solubles en agua como PEG se describen, por ejemplo, en la Pub. de la Patente estadounidense nº 20050106148 y las referencias citadas en ella.

Uso de las MPP para el tratamiento de la hiperplasia prostática benigna (HPB)

Las MPP de acuerdo con la presente invención matan selectivamente a las células prostáticas normales con respecto a las células de otros tejidos normales. De este modo, las MPP de acuerdo con la presente invención son útiles para el tratamiento o la prevención de la HPB.

En una realización, el tratamiento de la HPB se refiere a una reducción del tamaño de la glándula prostática, en un sujeto con HPB. El tamaño de la glándula prostática se puede medir en términos de su volumen, por métodos conocidos en el campo entre los que se incluyen, por ejemplo, la planimetría, el cálculo del volumen de la elipse prolata (HWL) y una técnica de medición del volumen elipsoide. El tamaño de la próstata también se puede medir directamente, por ejemplo mediante una exploración rectal digital, o citoscopia o ultrasonidos rectales, o de forma indirecta, por ejemplo, midiendo los cambios en los niveles de PSA en sangre o los cambios en las proporciones de PSA libre y PSA total en sangre.

En una realización, la administración de la MPP reduce el volumen de la glándula prostática en un sujeto. Por ejemplo, los métodos revelados pueden reducir el volumen prostático, por ejemplo, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30% al menos un 40% o al menos un 50%.

En otra realización, el tratamiento de la HPB se refiere a una reducción del grado de gravedad de uno o más de los síntomas de la enfermedad. Entre los síntomas de la HPB se incluyen cambios o problemas al orinar, tales como un flujo vacilante, interrumpido o débil, urgencia y fugas o goteo, o micción más frecuente, especialmente por las noches. Estos síntomas también son conocidos como síntomas del tracto urinario inferior (LUTS). Los LUTS puedenser medidos como se conoce en el campo, utilizando el Índice de Síntomas de la Asociación Estadounidense de Urología (AUA), el Sistema de Puntuación de Madsen-Iversen o el Sistema de Boyarsky.

En otra realización, el tratamiento de la HPB se refiere a la prevención o inhibición del crecimiento continuado de la glándula prostática y se puede medir mediante una reducción del índice de aumento del volumen o del índice de incremento del PSA en la sangre o la reducción de los síntomas de la HPB, como se ha descrito anteriormente.

Terapia de combinación

De acuerdo con la presente invención, las MPP pueden utilizarse solas o en combinación con uno o más tratamientos adicionales para la HPB. Los tratamientos adicionales para la HPB incluyen la administración de fármacos como antagonistas a-l-adrrenoreceptores e inhibidores de 5-α reductasa, fitoterapias, procedimientos quirúrgicos y técnicas mínimamente invasivas.

Algunos ejemplos de antagonistas α-l-adrenorreceptores son la alfuzosina/prazosina, tamsulosina, terazosina y doxazosina. Algunos ejemplos de inhibidores de 5-a reductasa son la finasterida y dutasterida.

Algunos ejemplos de fitoterapias incluyen el palmito (Serenoa repens), ciruelo africano (Pygeum africanum), patata africana (Hipoxis rooperi), equinacea (Echinacea purpurea), calabacín (Cucurbita pepo), centeno (Secale cereale) y ortiga mayor (Urtica dioica).

Algunos ejemplos de procedimientos quirúrgicos son la resección transuretral de la próstata (TURP), la ablación transuretral con aguja (TUNA), la incisión transuretral de la próstata (TUIP), la termoterapia transuretral con microondas (TUMT), la prostatectomía láser, la dilatación con balón, la vaporización eléctrica y la prostatectomía abierta.

Si es necesario reducir una respuesta inmunológica sistémica a las MPP, se pueden administrar terapias inmunosupresoras en combinación con las MPP. Algunos ejemplos de terapias inmunosupresoras incluyen, a título meramente enunciativo, corticosteroides sistémicos o tópicos (Suga et al., Ann. Thorac. Surg. 73:1092-7, 2002), ciclosporina A (Fang et al., Hum. Gene Ther. 6:1039-44, 1995), ciclofosfamida (Smith et al., Gene Ther. 3:496502,1996), deoxispergualina (Kaplan et al., Hum. Gene Ther. 8:1095-1104, 1997) y anticuerpos para las células T y/o B [por ejemplo contra el ligando a CD40, anticuerpos contra CD4, anticuerpos contra CD20 (Rituximab)] (Manning et al., Hum. Gene Ther. 9:477-85, 1998). Estos agentes se pueden administrar antes, durante o después de la administración de la MPP. Las MPP de la presente invención se pueden administrar por separado, secuencial

o simultáneamente con los tratamientos anteriormente mencionados.

Administración de MPP

Una cantidad terapéuticamente efectiva de una MPP, de acuerdo con la presente invención, o un ácido nucleico que codifica una MPP, se puede administrar local o sistémicamente, utilizando métodos conocidos en el campo, a sujetos que padecen HPB.

En una realización, las MPP se inyectan en la glándula prostática (intraprostáticamente) en un sujeto que padece HPB. Por ejemplo, se puede utilizar un planteamiento de administración similar al planteamiento de la inyección múltiple de la braquiterapia, en la que múltiples alícuotas de los péptidos purificados, adaptados como composiciones o formulaciones y en la forma de dosis apropiada, se pueden inyectar utilizando una aguja a través del peritoneo.

Adicional o alternativamente, las MPP se pueden administrar sistémicamente, por ejemplo por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea u oral, a un sujeto que padece HPB.

Una cantidad terapéuticamente efectiva de una MPP se refiere a una cantidad suficiente para conseguir un efecto biológico deseado, por ejemplo una cantidad que es efectiva para reducir el tamaño (es decir, el volumen y/o el peso) de una glándula prostática o atenuar el ritmo de crecimiento de la glándula prostática, o para reducir los síntomas de la HPB. En una realización, es una cantidad suficiente para reducir los signos o síntomas de la HPB en un sujeto. En determinados ejemplos, es una cantidad efectiva para reducir el volumen de una glándula prostática al menos en un 10%, 20%, 30%, 40% o 50%. En otra realización, es una cantidad suficiente para prevenir un nuevo aumento del volumen o del peso de la glándula prostática. Las dosis efectivas se pueden extrapolar de las curvas de respuesta a la dosis obtenidas de los sistemas de ensayo in vitro o en modelos animales.

Una cantidad efectiva de una MPP se puede administrar en una sola dosis o en varias dosis, por ejemplo diarias, durante el seguimiento de un tratamiento. No obstante, la cantidad efectiva de la MPP dependerá del sujeto tratado, la gravedad y el tipo de la condición que se va a tratar, y la forma de administración. En una realización, una cantidad terapéuticamente efectiva de una MPP puede variar desde aproximadamente 0,01 a 50 g por gramo de peso prostático, administrada intraprostáticamente. En otra realización, una cantidad terapéuticamente efectiva de una MPP puede variar desde aproximadamente 0,02 a 40 g por gramo de peso prostático, administrada intraprostáticamente. En otra realización, una cantidad terapéuticamente efectiva de una MPP puede variar desde aproximadamente 0,02 a 35 g por gramo de peso prostático, administrada intraprostáticamente. En otra realización, una cantidad terapéuticamente efectiva de una MPP puede variar desde aproximadamente 0,03 a 25 g por gramo de peso prostático, administrada intraprostáticamente. En otra realización, una cantidad terapéuticamente efectiva de una MPP puede variar desde aproximadamente 0,04 a 20 g por gramo de peso prostático, administrada intraprostáticamente. En otra realización, una cantidad terapéuticamente efectiva de una MPP puede variar desde aproximadamente 0,04 a 10 g por gramo de peso prostático, administrada intraprostáticamente.

En una realización, una dosis intravenosa efectiva intraprostáticamente de una MPP para un humano de 70 kg es de aproximadamente 1 mg a 10 mg de MPP. En otra realización, una dosis intravenosa efectiva es de aproximadamente 1 mg a 5 mg. En otra realización, una dosis intravenosa efectiva es de aproximadamente 1 mg a 3 mg. En otra realización, una dosis intravenosa efectiva es de aproximadamente 2,8 mg. En una realización, una dosis intraprostática efectiva de una MPP para un humano de 70 kg es de aproximadamente 10 mg a 100 mg de MPP. En otra realización, una dosis intraprostática efectiva de una MPP para un humano de 70 kg es de aproximadamente 10 mg a 50 mg de MPP. En otra realización, una dosis intraprostática efectiva de una MPP para un humano de 70 kg es de aproximadamente 10 mg a 30 mg de MPP. En otra realización, una dosis intraprostática efectiva de una MPP es de aproximadamente 28 mg para un humano de 70 kg.

Expresión in vivo de las MPP

Alternativamente a (o adicionalmente a) la administración de las MPP para tratar la HPB, el tratamiento a largo plazo

o sistémica de la HPB se puede conseguir expresando ácidos nucleicos que codifican MPP in vivo.

Ácidos nucleicos que codifican MPP

La presente invención contempla el uso de ácidos nucleicos o moléculas de ADN que codifican MPP para el tratamiento de la HPB. Estas moléculas de ADN se pueden obtener mediante técnicas estándar de un laboratorio de biología molecular y la información de la secuencia divulgada en el presente.

El nucleótido y las moléculas de ADN apropiadas incluyen aquellas que hibridizan en condiciones rigurosas las secuencias de ADN divulgadas, o fragmentos de las mismas, siempre que codifiquen una MPP funcional. Las condiciones de hibridación resultantes en determinados grados de rigurosidad varían dependiendo de la naturaleza del método de hibridación y de la composición y longitud del ADN hibridizante utilizado. Por lo general, la temperatura de hibridización y la fuerza iónica (especialmente la concentración de Na+) del tampón de hibridización determina la rigurosidad de la hibridación. Los cálculos relativos a las condiciones de hibridación necesarias para conseguir cantidades particulares de rigurosidad se debaten en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, capítulos 9 y 11). La hibridización con una sonda diana etiquetada con [32P]-dCTP generalmente es transportada en una solución de elevada fuerza inónica como 6 veces SSC a una temperatura de aproximadamente 5-25°C por debajo de la temperatura de fusión, Tm. Un ejemplo de condiciones rigurosas es una concentración de sal de al menos aproximadamente 0,01 a 1,0 M Na de concentración de iones (u otras sales) a un pH de 7.0 a 8.3 y una temperatura de al menos 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas también se pueden conseguir con la adición de agentes desestabilizantes como formamida. Por ejemplo, unas condiciones de 5 veces SSPE (750 mM NaCl, 50 mM Na fosfato, 5 mM EDTA, pH 7.4) a 25-30° C son adecuadas para las hibridizaciones de sonda específicas para los alelos.

La degeneración del código genético permite también variaciones en la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN, manteniendo al mismo tiempo la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada. Por ejemplo, el aminoácido Ala es codificado por el triplete de codones de nucleótidos GCT, GCG, GCC y GCA. De este modo, la secuencia de nucleótidos se podría modificar sin afectar a la composición de aminoácidos de la proteína codificada o a las características de la proteína. Basándose en la degeneración del código genético, las moléculas de ADN variantes pueden ser obtenidas de una molécula de ADN de referencia utilizando técnicas de mutagénesis de ADN estándar como las anteriormente descritas o mediante síntesis de las secuencias de ADN. Las secuencias de ADN que no hibridizan bajo condiciones rigurosas con las secuencias de ADN divulgadas en virtud de la variación de la secuencia basándose en la degeneración del código genético también son contempladas por la presente divulgación.

La presente invención proporciona métodos para expresar las MPP, por ejemplo un polipéptido de proaerolisina modificada en una célula o tejido in vivo. En un ejemplo, la transfección de la célula o el tejido se produce in vitro. En este ejemplo, la célula o tejido (como un injerto) es retirado de un sujeto y posteriormente transfectado con un vector de expresión que contiene un ADNc que codifica la proteína de interés. Las células transfectadas producirán proteína funcional y podrán ser reintroducidas en el sujeto. En otro ejemplo, un ácido nucleico que codifica la proteína de interés es administrado a un sujeto directamente (por ejemplo, por vía intravenosa o intraprostática) y la transfección se produce in vivo.

Los procedimientos científicos y médicos necesarios para la transfección de células humanas son ahora rutinarios. Una estrategia general para transferir genes a las células del donante se divulga en la Patente estadounidense nº

5.529.774. Por lo general, un gen que codifica una proteína que tiene los efectos terapéuticamente deseados es clonado en un vector de expresión viral y posteriormente ese vector es introducido en el organismo diana. El virus infecta las células y produce la secuencia de proteína in vivo, donde tiene el efecto terapéutico deseado (Zabner et al. Cell 75:207-16, 1993).

Puede que solo resulte necesario introducir el ADN o los elementos de las proteínas en determinadas células o tejidos, como la próstata. No obstante, en algunos casos, desde el punto de vista terapéutico puede resultar más efectivo y sencillo tratar todas las células de un sujeto y diseminar de forma más amplia el vector, por ejemplo mediante administración intravascular (i.v.) u oral.

La secuencia de ácido nucleico que codifica la MPP está bajo el control de un promotor adecuado. Los promotores adecuados que se pueden emplear incluyen, a título meramente enunciativo, el promotor natural del gen, el promotor LTR retroviral, o promotores adenovirales, como el promotor MLP; el promotor CMV; el promotor RSV; promotores inducibles, como el promotor MMTV; el promotor de metalotioneina; promotores de choque térmico; el promotor de la albúmina; el promotor de histona; el promotor de-actin; promotores TK; promotores del parvovirus B19; y el promotor de ApoAI. En un ejemplo, el promotor es un promotor específico para la próstata, como un promotor de probasina. No obstante, la divulgación no se limita a promotores o genes extraños específicos.

El ácido nucleico recombinante se puede administrar al sujeto mediante métodos conocidos que permite que el ácido nucleico recombinante alcance las células apropiadas. Estos métodos incluyen la inyección, infusión, deposición, implantación o administración tópica. Las inyecciones pueden ser intradérmicas o subcutáneas: el ácido nucleico recombinante se puede administrar como parte de un vector viral, como los virus del avipox, virus de la vacuna recombinante, ADN o cadenas de adenovirus de replicación deficiente, o en forma no infecciosa, como ADN desnudo o ADN encapsulado en liposoma, como se describe detalladamente más abajo.

Los vectores adenovirales incluyen básicamente el genoma adenoviral completo (Shenk et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 111: 1-39, 1984). Alternativamente, el vector adenoviral es un vector adenoviral modificado en el que se ha eliminado al menos una porción del genoma adenoviral. En un ejemplo, el vector incluye un 5' ITR adenoviral; un 3' ITR adenoviral; una señal de encapsidación adenoviral; una secuencia de ADN que codifica un agente terapéutico; y un promotor para expresar la secuencia de ADN que codifica un agente terapéutico. El vector está libre de al menos la mayoría de las secuencias de ADN EI y E3 adenovirales, pero no está necesariamente libre de todas las secuencias de ADN E2 y E4, y las secuencias de ADN que codifican proteínas adenovirales transcritas por el promotor MLP. En otro ejemplo, el vector es un virus adenoasociado (AVV), como el descrito en la Patente estadounidense nº 4.797.368 (Carter et al.) y en McLaughlin et al. (J. Virol. 62:1963-73, 1988) y AAV tipo 4 (Chiorini et al. J. Virol. 71:6823-33, 1997) y AAV tipo 5 (Chiorini et al. J. Virol. 73:1309-19,1999).

Este vector se puede construir de acuerdo con técnicas estándar, utilizando un plásmido lanzadera que contiene, comenzando en el extremo 5’, un 5’ ITR adenoviral, una señal de encapsidación adenoviral, y una secuencia de intensificación EI a; un promotor (que puede ser un promotor adenoviral o un promotor extraño); una secuencia líder tripartita, un sitio de clonación múltiple (que puede ser como el descrito en el presente); una señal de poli-A; y un segmento de ADN que corresponde a un segmento del genoma adenoviral. El segmento de ADN sirve como sustrato para la recombinación homóloga con un adenovirus modificado o mutado, y puede abarcar, por ejemplo, un segmento del genoma del adenovirus 5’ no más largo que desde la base 3329 a la base 6246. El plásmido puede incluir también un marcador seleccionable y un origen de replicación. El origen de replicación puede ser un origen de replicación bacteriano. Una secuencia de ADN deseada que codifica un agente terapéutico se puede insertar en el sitio de clonación múltiple del plásmido.

Algunos ejemplos de vectores que se pueden utilizar para practicar los métodos divulgados en el presente incluyen, a título meramente enunciativo, los recogidos en: WO 95/27512 de Woo et al.; WO 01/127303 de Walsh et al.; Patente estadounidense nº 6.221.349 de Couto et al.; Patente estadounidense nº 6.093.392 de High et al.

Ensayos clínicos

Una persona con conocimientos en el campo apreciará que, tras la efectividad demostrada de las MPP para el tratamiento de la HPB en modelos in vitro y animales, las MPP deberían ser probadas en ensayos clínicos, al objeto de evaluar en más profundidad su eficacia en el tratamiento de la HPB y para obtener la aprobación reguladora para el uso terapéutico. Como se conoce en el campo, los ensayos clínicos progresan a través de fases de prueba, que se identifican como fases I, II, III y IV.

Inicialmente las MPP serán evaluadas en un ensayo de fase I. Normalmente los ensayos de fase I se utilizan para determinar el mejor modo de administración (por ejemplo, una píldora o una inyección), la frecuencia de administración y la toxicidad de los compuestos. Con frecuencia los estudios de fase I incluyen pruebas de laboratorio, como análisis de sangre y biopsias, para evaluar los efectos del potencial terapéutico en el organismo del paciente. Para un ensayo de fase I, se trata a un pequeño grupo de pacientes con HPB con una dosis específica de MPP. Durante el ensayo, la dosis se aumenta normalmente grupo a grupo, al objeto de determinar la dosis máxima tolerada (MTD) y las toxicidades limitadoras de la dosis (DLT) asociadas con el compuesto. Este proceso determina una dosis apropiada para utilizarla en un posterior ensayo de fase II.

Un ensayo de fase II se puede realizar para evaluar en profundidad la efectividad y seguridad de la MPP. En los ensayos de fase II, la MPP es administrada a grupos de pacientes con HPB, utilizando la dosis considerada efectiva en los ensayos de fase I.

Los ensayos de fase III se concentran en determinar cómo la MPP se compara con el tratamiento estándar o aceptado de forma más general. En los ensayos de fase III, los pacientes son asignados de forma aleatoria a uno de dos o más “brazos”. En un ensayo con dos brazos, por ejemplo, un brazo recibirá el tratamiento estándar (grupo de control) y el otro brazo recibirá el tratamiento con MPP (grupo de investigación).

Los ensayos de fase IV se utilizan para evaluar más profundamente la efectividad y seguridad a largo plazo de una MPP. Los ensayos de fase IV son menos frecuentes que los ensayos de fase I, II y III, y se producen después de que la MPP haya sido aprobada para el uso estándar.

Elegibilidad de los pacientes para los ensayos clínicos

Los criterios de elegibilidad de los participantes pueden ser generales (por ejemplo, la edad, el sexo, el tipo de enfermedad) o específicos (por ejemplo, el tipo y número de tratamientos previos, características de la enfermedad, recuentos de células sanguíneas, función de los órganos). En una realización, a los pacientes elegibles se le ha diagnosticado HPB. Los criterios de elegibilidad también pueden variar con la fase del ensayo. Los pacientes elegibles para los ensayos clínicos también pueden ser elegidos basándose en la medición objetiva de la obstrucción urinaria y por el hecho de que no respondan al tratamiento oral de la HPB. Por ejemplo, en los ensayos de fase I y II, los criterios suelen excluir a los pacientes para los que el tratamiento de investigación puede entrañar un riesgo debido a una función orgánica anómala o a otros factores. En los ensayos de fase II y III, normalmente se incluyen criterios adicionales relativos al tipo y la fase de la enfermedad, y al número y tipo de tratamientos previos.

Los ensayos de fase I normalmente comprenden 15 a 30 participantes para los que otras opciones de tratamiento no han sido efectivas. Los ensayos de fase II normalmente comprenden hasta 100 participantes que ya han recibido una terapia con fármacos o cirugía, pero para los que el tratamiento no ha sido efectivo. La participación en ensayos de fase II normalmente se limita basándose en el tratamiento anterior recibido. Los ensayos de fase III normalmente comprenden de cientos a miles de participantes. Este gran número de participantes es necesario para determinar si existen diferencias reales entre la efectividad de la MPP y el tratamiento estándar. La fase IV puede comprender pacientes que van desde aquellos a los que se le ha diagnosticado recientemente la HPB hasta aquellos con una enfermedad extensiva, al objeto de cubrir las diversas fases de la enfermedad.

Una persona con conocimientos en el campo apreciará que los ensayos clínicos deberían ser diseñados para ser lo más inclusivos posible, sin que la población del estudio sea demasiado diversa como para terminar si el tratamiento podría ser igualmente efectivo en una población definida conforme a términos más restrictivos. Cuanto más diversa sea la población incluida en el ensayo, más aplicables podrían ser los resultados a la población general, en particular en los ensayos de fase III. La selección de los participantes apropiados en cada fase del ensayo clínico se considera dentro de las capacidades normales de una persona que trabaja en el campo.

Evaluación de los pacientes antes del tratamiento

Antes del comienzo del estudio, se pueden utilizar diversas medidas conocidas en el campo para clasificar primero a los pacientes. Los pacientes pueden ser valorados primero, por ejemplo, utilizando el índice de síntomas de la hiperplasia benigna, que se encuentran en el sitio web de Family Practice Notebook. Los pacientes también pueden ser clasificados con arreglo al tipo y/o a la fase de su enfermedad y/o por el tamaño de la próstata.

Administración de MPP en ensayos clínicos

Normalmente la MPP se administra a los participantes del ensayo mediante inyección. En una realización, la MPP se administra mediante inyección intraprostática.

Se pueden probar diversas dosis de la MPP. Contando con la información de las pruebas preclínicas, un médico competente podría determinar con facilidad las dosis apropiadas de la MPP para su uso en ensayos clínicos. En una realización, un rango de dosis es desde aproximadamente 0,01 g/g de próstata hasta aproximadamente 50 g/g de próstata. En una realización, un rango de dosis es desde aproximadamente 0,02 g/g de próstata hasta aproximadamente 40 g/g de próstata. En una realización, un rango de dosis es desde aproximadamente 0,02 g/g de próstata hasta aproximadamente 35 g/g de próstata. En una realización, un rango de dosis es desde aproximadamente 0,03 g/g de próstata hasta aproximadamente 25 g/g de próstata. En una realización, un rango de dosis es desde aproximadamente 0,04 g/g de próstata hasta aproximadamente 20 g/g de próstata. En una realización, un rango de dosis es desde aproximadamente 0,04 g/g de próstata hasta aproximadamente 10 g/g de próstata. En una realización, un rango de dosis es desde aproximadamente 0,1 g/g de próstata hasta aproximadamente 5 g/g de próstata. En una realización, un rango de dosis es desde aproximadamente 0,2 g/g de próstata hasta aproximadamente 3 g/g de próstata. En una realización, un rango de dosis es desde aproximadamente 0,5 g/g de próstata hasta aproximadamente 2 g/g de próstata.

Control farmacocinético

Para cumplir los criterios de la fase I, la distribución de la MPP es controlada, por ejemplo, mediante análisis químicos de muestras, como de sangre u orina, recogidas a intervalos regulares. Por ejemplo, las muestras se pueden tomar a intervalos regulares de hasta aproximadamente 72 horas después del comienzo de la infusión.

Si el análisis no se realiza inmediatamente, las muestras se pueden poner en hielo seco después de su recogida para transportarlas con posterioridad a un congelador donde se almacenarán a 70ºC bajo cero hasta que se pueda realizar el análisis. Las muestras se pueden preparar para el análisis utilizando técnicas estándar conocidas en el campo y la cantidad de MPP presente se puede determinar, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC).

Los datos farmacocinéticos se pueden generar y analizar en colaboración con un farmacólogo clínico experto y pueden ser utilizados para determinar, por ejemplo, la eliminación, la semivida y la concentración plasmática máxima.

Control del resultado del paciente

El criterio de valoración de un ensayo clínico es un resultado medible que indica la efectividad de un compuesto bajo evaluación. El criterio de valoración se establece antes del comienzo del ensayo y variará dependiendo del tipo y la fase del ensayo clínico. Algunos ejemplos de puntos de valoración incluyen, por ejemplo, la reducción del volumen prostático, la reducción en sangre de los niveles de PSA, la mejora de los síntomas del tracto urinario, la mejora del flujo urinario y la reducción de la retención urinaria aguda. Otros criterios de valoración incluyen la toxicidad y la calidad de vida.

Kits farmacéuticos

La presente invención proporciona adicionalmente los kits o envases terapéuticos que contienen una o más MPP o un compuesto farmacéutico compuesto por una o más MPP para su uso en el tratamiento de la HPB. Las MPP se pueden proporcionar en el kit en forma de dosis unitaria. Los componentes individuales del kit se pueden envasar en contenedores separados, junto a los que se adjunta, cuando resulta aplicable, una notificación en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, reflejando dicha notificación la aprobación de la agencia para la fabricación, el uso o la venta para administración humana o animal. Opcionalmente el kit puede contener también uno o más agentes terapéuticos para el uso en combinación con las MPP de la invención. Opcionalmente el kit puede contener instrucciones o indicaciones explicando el método de uso o el régimen de dosis para las MPP y/o los agentes terapéuticos adicionales.

Cuando los componentes del kit se proporcionan en una o más soluciones líquidas, la solución líquida puede ser una solución acuosa, por ejemplo una solución acuosa estéril. En este caso el medio del contenedor puede ser por sí mismo un inhalador, una jeringa, una pipeta, un gotero ocular o cualquier otro aparato similar, con el que se puede administrar la composición a un paciente o aplicarse y mezclarse con los demás componentes del kit.

Los componentes del kit también pueden suministrarse en forma seca o liofilizada y el kit puede contener adicionalmente un disolvente adecuado para la reconstitución de los componentes liofilizados. Independientemente del número o del tipo de contenedores, los kits de la invención también pueden contener un instrumento para ayudar a la administración del compuesto al paciente. Este instrumento puede ser un inhalador, una jeringa, una pipeta, un fórceps, una cuchara de medición, un gotero ocular o un vehículo de administración similar médicamente aprobado.

La invención se describirá ahora con referencia a ejemplos específicos. Se entenderá que los siguientes ejemplos están diseñados para describir las realizaciones de la invención y no tienen por objeto limitar la invención de ningún modo.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1: GENERACIÓN DE MPP ACTIVADAS POR EL PSA

Este ejemplo describe métodos utilizados para producir las MPP de acuerdo con realizaciones de la invención mostradas en la Tabla 6, que son activadas por el PSA. Estas MPP se obtienen de la proaerolisina. Una persona con conocimientos en el campo entenderá que se pueden utilizar métodos similares para producir otras MPP que son activadas por el PSA y cualquier otra proteasa específica para la próstata. Estas proteínas se pueden producir sustituyendo la secuencia de furina de la proaerolisina por un sitio de clivaje de proteasa específico para la próstata, como una secuencia de clivaje específica para PSA.

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Tabla 6: Comparación de las MPP con una secuencia de activación que contiene un sitio de clivaje de proteasa sometido a clivaje por PSA con proaerolisina natural

MPP (SEC. ID. Nº): Cambios introducidos (SEC. ID. Nº) Comparación con peso de proaerolisina ADSHSSKLQSVDGAGQGLRLEIPLD) (aa 424-448 de SEC. ID. Nº: 2)

MPP1 (3&4): KVRRAR (aa 427-432 de SEC. ID. Nº: 2) cambiado por ADSHSSKLQSVDGAGQGLRLEIPLD) (aa 424-448 de SEC. ID. Nº: 4)

MPP2 (6&7): HSSKLQ (5)

MPP3 (9 & 10): KVRRARSV (aa 427-434 de SEC. ID. Nº: 2).cambiado por HSSKLQSA (8) KVRRAR (aa 427-432 de SEC. ID. Nº: 2) cambiado por QFYSSN (U) ADSHS SKLQS ADG AGQGRLEIPLD (aa 424-448 de SEC. ID. Nº: 7) ADSQFYSSNSVDGAGQGLRLEIPLD (aa 424-448 de SEC. ID. Nº: 10)

MPP4 (12 & 13): KVRRAR (aa 427-432 de SEC. ID. Nº: 2) cambiado por GISSFQS (14) ADSGISSFQSSVDGAGQGLRLEIPLD (aa 424-449 de SEC. ID. Nº: 13)

Las MPP mostradas en la Tabla 6 incluyen una secuencia de proaerolisina (PA natural mostrada en las SEC. ID. Nº 1 y 2) en la que el sitio de reconocimiento de la proteasa de la furina de los seis aminoácidos (aminoácidos 427 a 432 de la SEC. ID. Nº 2) ha sido sustituido por un sitio de clivaje de PSA. Por ejemplo, MPP1 (SEC. ID. Nº 3 y 4), incluye una secuencia de proaerolisina en la que el sitio de clivaje de furina ha sido sustituido por el sustrato de PSA HSSKLQ (SEC. ID. Nº: 5).

La PCR recombinante se ha utilizado para sustituir el sitio de furina de la aerolisina (aminoácidos 427 a 432 de SEC. ID. Nº: 2) por un sitio de clivaje específico de la PSA (SEC. ID. Nº 5, 8,11 o 14) empleando métodos anteriormente descritos (Vallette et al., Nucl. Acids Res. 17:723-33, 1988). Brevemente, la PCR recombinante se realizó en un volumen final de 50 l que contenían 0,2 M de deoxinucleósido trifosfato (dNTPs), 0,5 M de cebadores directos y cebadores inversos, 0,1 g de ADN templado y 2,5 unidades de polimerasa pfu clonada en tampón de reacción pfu [20 mM Tris-HCI (pH 8.8), 10 mM KCI, 10 mM (NH4)2S04, 2 mM MgSO4, 0,1% Triton X-100, y 0,1 rag/ml BSA].

Las células transformadas por cribado para la inserción de proaerolisina se realizaron mediante PCR utilizando la polimerasa Taq. Se preparó un cóctel en tampón de reacción de PCR [50 mM KCI, 1,5 mM MgCb, y 10 mM Tris-HCI (pH 9.0)] que contenía 0,2.mM dNTPs, 0,5 pM de cebadores directos e inversos, y 5 unidades de polimerasa Taq. Diez muestras pi de este cóctel se repartieron en partes alícuotas en tubos de 0,2 ml y las células transformadas se añadieron utilizando palillos estériles.

Los productos de PCR finales se digirieron utilizando enzimas de restricción apropiadas, posteriormente ligadas al vector de clonado pTZ18u (BioRad) para la amplificación. Brevemente, las digestiones de restricción se realizaron a 37°C durante 90 minutos en tampón Pharmacia One-Phor-All [10 mM Tris-acetata (pH 7,5), 10 mM Mg-acetato, y 50 mM K-acetato] que contenía aproximadamente una unidad de enzima de restricción por cada µg de ADN. La inserción resultante y el ADN del vector TZ18u se mezclaron en un ratio aproximado de 5:1 y se calentaron a 45°C durante 15 minutos. Posteriormente, las muestras se diluyeron en tampón One-Phor All y se les añadió ATP hasta una concentración final de 1 mM para uniones de extremo cohesivo o 0,5 mM para uniones de extremo romo. Posteriormente, se añadieron 11 unidades de T4 ADN ligasa a cada muestra y las muestras se mezclaron con suavidad. Las uniones se realizaron a 13°C durante 4 horas (uniones de extremo cohesivo) o 16 horas (uniones de extremo romo).

La secuenciación de ADN se efectuó para garantizar la realización de las sustituciones correctas. La inserción fue posteriormente aislada del vector de clonado y subclonada en el plásmido hospedador de rango amplio pMMB66HE (Furste et al., Gene 48:119-131, 1986) para la expresión en E. coli. Las células de E. coli DH5α se capacitaron utilizando el método de lavado con CaCl2 anteriormente descrito (Cohen et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69:2110-4, 1972). Las células en la fase logarítmica (OD600=0.4-0.7) se cosecharon mediante centrifugación y se lavaron en ¼ de volumen de 100 mM MgCl2 frío. Las células se peletizaron de nuevo y se volvieron a suspender en dos volúmenes de 100 mM CaCl2 frío. Posteriormente las células fueron incubadas en hielo durante unos 45 minutos. A continuación las células se centrifugaron y se volvieron a suspender en 1/10 de volumen de 100 mM CaCl2. La incubación continuó durante otros 45 minutos antes de la adición de glicerol a una concentración final del 15%. Las células competentes se almacenaron a 70ºC bajo cero hasta su utilización.

La transformación de los plásmidos recombinantes en células de E. coli competentes se realizó de acuerdo con el método de Inoue et al. (Gene 96: 23-8, 1990). Las células competentes (200 l alícuotas) se incubaron con 0,5-10 g de ADN durante una hora en hielo. Posteriormente las células se sometieron a un choque de calor a 42ºC durante 4 minutos. Las células se devolvieron rápidamente al hielo durante 5 minutos. Posteriormente, se añadieron 500 l de medios LB a cada muestra y las células se incubaron durante una hora a 37°C con agitación suave. Se colocaron las alícuotas (150 l) en una placa de agar LB con 50 g/ml de ampicilina. Estas placas se incubaron durante la noche a 37ºC.

Los clones de pMMB66HE recombinantes se transfirieron a una cadena de Aeromonas salmonicida cadena CB3 (véase Buckley, Biochem. Cell. Biol. 68:221-4, 1990) por conjugación, utilizando la técnica de acoplamiento de filtros de Harayama et al. (Mol. Gen. Genet. 180:47-56, 1980). El uso de esta cadena deficiente en proteasa de A. salmonicida resultó en la producción de MPP que no estaban contaminadas por aerolisina activada y en la producción de grandes cantidades de proteína. Las MPP fueron purificadas mediante cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía de intercambio de iones, tal y como se ha descrito anteriormente (Buckley, Biochem. Cell. Biol. 68:221-4, 1990). Este método resultó en preparados de las MPP idénticos de un lote a otro.

EJEMPLO 2: MPP1 LISA ESPECÍFICAMENTE CÉLULAS PRODUCTORAS DE PSA IN VITRO

Este ejemplo describe métodos utilizados para determinar la especificidad de las MPP de acuerdo con realizaciones de la invención descritas en el Ejemplo 1. Estos métodos se pueden utilizar para probar la especificidad de las MPP que incluyen un sitio de clivaje específico para PSA.

La MPP1 se probó frente a células LNCaP productoras de PSA (American Type Culture Collection, Manassas, Va.) y células TSU no productoras de PSA (Dr. T. Itzumi, Teikyo University, Japón). Las células se incubaron en presencia de 10-12 M a 10-6 M MPP1 durante 24 horas. Posteriormente las células se contaron y puntuaron con arreglo al porcentaje de células viables basándose en la capacidad para excluir el azul de tripano. La concentración necesaria para matar el 50% de las células (IC50) se determinó para MPP1 frente a las líneas LNCaP y TSU.

La LD50 de MPP1 frente a las células productoras de PSA era de 10-10 M. Por lo contrario, frente a las células TSU no productoras de PSA, el LD50 fue de entre 5 x 10-8 M. Este resultado demuestra que la MPP1 es específicamente activada por el PSA, como pone de manifiesto una diferencia de 500 veces en la toxicidad frente a las líneas de células humanas productoras de PSA y no productoras de PSA.

EJEMPLO 3: MPP1 NO SE ACTIVA EN LA SANGRE QUE CONTIENE PSA

Las MPP que incluyen un sitio de clivaje de PSA no deberían ser activadas en sangre, porque el PSA es enzimáticamente inactivado en la sangre debido a la presencia de un gran exceso molar de inhibidores de proteasa sérica, como alfa-1-antiquimotripsina y alfa -2-macroglobulina.

Para probar la activación no específica de la MPP por parte de otras proteasas séricas y el PSA en el suero humano, se realizó un ensayo de hemolisis sensible como sigue. Se añadieron glóbulos rojos (RBC, 2% v/v) al plasma o tampón que contenía MPP1 ± PSA. El grado de hemolisis se probó midiendo la liberación de hemoglobina en el supernatante. La adición de 0,1% de Triton resulta en una hemolisis del 100% en unos segundos y se utilizó como control positivo. La cantidad de hidrolisis se expresó como un ratio de absorbancia de la muestra a 540 nm con respecto a la absorbancia de la muestra tratada con Triton. La preincubación de la MPP1 (10-8 M) con PSA en tampón acuoso solamente durante una hora antes de añadir RBC resultó en una hemolisis aproximadamente del 45% (FIG. 2).

Para determinar si la MPP1 se activa en plasma humano, se incubó MPP1 (10*8 M) en 50% de plasma humano durante una hora. En un experimento relacionado, el exceso de PSA (10.000 ng/ml) se añadió primero al plasma humano y permitió incubar durante varias horas. La MPP1 que contenía plasma ± PSA fue posteriormente incubada con RBC humanos (2% v/v). La adición de MPP1 a plasma humano, o plasma humano al que se le ha añadido una elevada concentración de PSA, resultó en una hemolisis no apreciable (es decir, <1% del control de Triton, FIG. 2). Estos resultados demuestran que la MPP1 se puede administrar sistémicamente sin ninguna activación significativa en la sangre, incluso cuando la sangre contenga PSA mensurable.

EJEMPLO 4: TOXICIDAD IN VITRO E IN VIVO DE MPP1, MPP2 Y MPP3

Este ejemplo describe métodos utilizados para determinar la toxicidad in vitro e in vivo de las MPP.

Para determinar la toxicidad in vitro, se realizó un ensayo de viabilidad celular como sigue. Las células T de linfoma de murino EL4 (ATCC T1B-39) se cultivaron a 105 células por pozo en MTS/PMS Cell Titer 96 (Promega). MPP1, MPP2 y MPP3 a 1 x 10-13 M - 1 x 10-7 M se añadieron como se muestra en la FIG. 3 y se incubaron con la células durante 4 horas a 37ºC. Posteriormente se determinó la viabilidad celular leyendo la placa en un lector de placas, tal y como indica el fabricante del kit MTS/PMS. Como se muestra en la FIG. 3, las MPP son menos tóxicas que la proaerolisina natural, con una LC50 de 4X10-9 (MPP1), 1X10-9 (MPP2), y 1X10-7 (MPP3), frente a la LC50 de 1,5X10-10 para la natural.

Para determinar la toxicidad in vivo, las MPP se administraron al ratón por vía intravenosa. La proaerolisina natural (SEC. ID. Nº 2) era altamente tóxica para el ratón; una dosis de 1 g causó la muerte en una hora y la LD100 a las 24 horas (es decir, la dosis que mata el 100% de los animales en el plazo de 24 horas) tras una única inyección IV fue de 0,1 g. En contraste, la LD100 de MPP1 (SEC. ID. Nº 4) a las 24 horas después de la inyección fue 25 veces superior (es decir 2,5 g de dosis total).

EJEMPLO 5: PREPARACIÓN DE MPP5 (MPP CON UNA ETIQUETA DE HISTIDINA)

Una MPP con una etiqueta de histidina de acuerdo con la presente invención (MPP5) se preparó como sigue. La inserción del plásmido que contiene el gen que codifica MPP1 fue modificada para facilitar la purificación y el resultado. Un tramo de 35 nucleótidos, incluyendo el sitio de unión del ribosoma y el codón de inicio de ATG, que cuando se transcribe, forma una estructura de bucle secundaria, que causa la reducción en la producción de proteína (Burr et al, J. Bacteriol. 183: 5956-63, 2001) fue modificado para prevenir la formación del bucle, dejando 23 nucleótidos en corriente ascendente del codón de inicio de ATG (Diep et al., Mol. Microbiol. 30: 341-52, 1998). Esto incrementó la cantidad de MPP que se podría liberar en el supernatante del cultivo de CB3 (Burr et al., J. Bacteriol.

183: 5956-63,2001). La estructura con la nueva secuencia en corriente ascendente es designada como la estructura del promotor 123. El cambio se realizó digiriendo la estructura de MPP1 con Kpnl y EcoRI, seguida por la unión del fragmento resultante en el sitio KpnI/EcoRI de l23-aerA: pTZ18U. La estructura resultante se denominó l23-MPPl: pTZ18U.

La adición de una etiqueta His se realizó utilizando un protocolo de dos pasos QuikChange (Stratagene). En el primer paso, se añadieron 3 residuos His al extremo del ADN l23-MPPl sintetizando dos cebadores (los codones 3 CAT codifican los residuos His adicionales):

EndHisl (sentido): 5'-GCT GCC AAT CAA CAT CAT CAT TAA CGG CAG CGC-3' (SEC. ID. Nº 26)

EndHisl (antisentido) 5'-GCG CTG CCG TTA ATG ATG ATG TTG ATT GGC AGC-3' (SEC. ID. Nº 27)

Estos cebadores se utilizaron en el protocolo sugerido por Stratagene para el kit QuikChange. Una vez que la adición del ADN para los 3 residuos His se confirmó mediante secuenciación, se realizó una segunda reacción QuikChange para añadir nucleótidos para los 3 residuos His finales. En este paso, los cebadores utilizados fueron:

EndHis2 (sentido) 5M3CC AAT CAA CAT CAT CAT CAT CAT CAT TAA CGG CAG CGC-3'(SEC. ID. Nº 28)

EndHis2 (antisentido) 5'-GCC AAT CAA CAT CAT CAT CAT CAT CAT TAA CGG CAG CGC-3' (SEC. ID. Nº 29)

Tras la segunda ronda de PCR, los clones fueron cribados y secuenciados para confirmar que los 6 residuos His estaban correctamente insertados en el extremo de 123-MPPl en el marco de lectura correcto, y que no se había introducido ningún otro cambio en la secuencia y123-MPPl. El plásmido resultante se denominó 123-MPP5: pTZ18U, y la región de la inserción 123-PSAH6 fue secuenciada (véase la Figura 34).

La secuencia de ácido nucleico de 123-MPP5 difiere de la de la estructura de MPP1 en la región antes del codón de inicio de ATG, con el promotor 123 sustituyendo a la secuencia de corriente ascendente normal. La secuencia también tiene las repeticiones de CAT adicionales inmediatamente antes del codón de terminación TAA. Cuando el marco de lectura abierto de 123-MPP5 fue trasladado a la secuencia de aminoácidos, la única diferencia apreciada en comparación con la secuencia de aminoácidos de MPP1 fue la adición de 6 residuos de histidina en el C-terminal de la proteína.

Clonación de 123-MPP5 en el vector de expresión pMMB208

La 123-MPP5 creada como resultado de la adición del promotor 123 y la etiqueta His se clonó en el plásmido pMMB208. Este plásmido se seleccionó porque confiere resistencia al cloranfenicol, contiene un promotor tac inducible por IPTG y se puede movilizar en Aeromonas salmonicida mediante transconjugación. De este modo, la inserción PAH6 de 123-PSA fue clonada en los sitios HindlII y EcoRl del plásmido pMMB208. El plásmido resultante, 123-MPP5::208, fue transconjugado en la cadena CB3 de A. salmonicida para la producción de MPP5.

Al objeto de purificar GLP MPP5, 30 L de medios definidos estériles ajustados a un pH inicial de 6,90 ± 0,15 y a una temperatura de 27 °C fueron inoculados con aproximadamente 1% v/v del inóculo del matraz de agitación. El pH del medio se mantuvo a 6,90 ± 0,15 mediante adición automática de ácido/álcali estéril durante la fermentación. Las RPM y SLM del fermentador se ajustaron para mantener la tensión de oxígeno disuelto (DOT) de > 20% en el recipiente en todo momento. La expresión de la MPP5 se indujo mediante la adición de isopropil tiogalactopiranosida (IPTG) cuando la densidad celular alcanzó un OD a 600 nm de 0,3 – 0,6. La proteína expresada se secretó en el

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medio y se cosechó varias horas después de la inducción. El supernatante que contiene MPP5 se recuperó utilizando un filtro 60 SP CUNO. Tras la separación celular, el supernatante se concentró utilizando una membrana TFF 30,000 NMWC. El supernatante concentrado se purificó utilizando dos pasos cromatográficos que produjeron proteína de una pureza aceptable; la cromatografía quelante de níquel, seguida de una cromatografía de intercambio de aniones. La MPP5 que contiene fracciones del paso de la cromatografía de intercambio de aniones se agrupó y el material resultante se concentró en aproximadamente 1 mg/mL mediante ultrafiltración y posteriormente se diafiltró en el tampón de la formulación. La MPP5 purificada se filtró en condiciones estériles utilizando un filtro absoluto de 0,22 urn en un armario de seguridad biológica certificado y se congeló a 70ºC bajo cero hasta que fue necesaria. El producto final de MPP5 purificada utilizando este proceso fue aproximadamente de 100 mg/L.

EJEMPLO 6: UN ESTUDIO DE LA TOXICIDAD AGUDA DE LA INYECCIÓN DE UN BOLO INTRAVENOSO O INTRAPROSTÁTICO DE MPP5 EN LA RATA ALBINA

Este ejemplo muestra los resultados preliminares de un estudio que indica que la administración intraprostática de MPP con una etiqueta de histidina (MPP5) en ratas fue capaz de reducir el peso de la glándula prostática.

Resumen de los resultados

El objetivo de este estudio era confirmar la dosis máxima tolerada (MTD) e investigar la toxicidad potencial y toxicocinética de una MPP (MPP5) tras una única inyección intraprostática o la inyección de un bolo intravenoso en ratas macho seguida de un período de observación de 1, 14, o 28 días. La MPP5 es una molécula de proaerolisina con una etiqueta de histidina que comprende un sitio de clivaje de PSA.

El diseño del estudio se detalla en las Tablas 7 y 8:

Tabla 7: Diseño del estudio de la MTD

Grupo: Tratamiento Nivel de dosis (g) Volumen de dosis (L) Número machos de

IP: IV IP IV

6: MPP5 10 20 500 3 3

7: MPP5 20 20 500 3 3

8: MPP5 40 20 500 3 3

9: MPP5 50 - 500 - 3

IP - Intraprostática, IV - Intravenosa, Los animales fueron retirados tras un período de observación de 48 horas

Tabla 8: Diseño del estudio principal y toxicocinético

Grupo: Tratamiento Nivel dosis (g) de Vía Estudio terminal Día 2 principal Sacrificio de machos por grupo Día 15 Día 29 Animales del estudio TK

1: Control 0 IP 7 7 6 9

2: MPP5 2 IP 7 7 6 9

3: MPP5 10 IP 7 7 6 9

4: MPP5 25 IP 7 7 6 . 9

5: MPP5 25 IV 7 7 6 9

IP - Intraprostática (20L), IV - Intravenosa (0,05 mL), TK - Toxicocinético

Se evaluó lo siguiente: signos clínicos, peso corporal, consumo de alimentos, oftalmología, hematología, química en suero, urinálisis, toxicocinética, observaciones macroscópicas en la necropsia, peso de los órganos e histopatología. No se produjeron efectos sobre el peso corporal, la ganancia de peso corporal, el consumo de alimentos, la oftalmología o los parámetros del urinálisis. Un animal de la MTD tratado intraprostáticamente con 40 g fue encontrado muerto el Día 2. Antes de la muerte no se produjeron signos clínicos relacionados con el tratamiento. Se observaron puntos oscuros en el estómago y una zona oscura e hinchazón en el lugar de la inyección (próstata). Dos animales del estudio principal tratados intraprostáticamente con 25 g se encontraron muertos el Día 2. Antes de la muerte no se produjeron signos clínicos relacionados con el tratamiento en uno de los animales, pero en el otro se observaron manchas en la piel (en el hocico), piel azul, un descenso de la actividad, debilidad, reducción del tono muscular, descarga de líquido transparente (periorbital), ojos pálidos, dificultad para respirar, se tumbaba de lado y estaba frío al tacto. Las conclusiones macroscópicas en un animal incluían: una zona oscura en el sitio de la inyección (próstata); puntos oscuros en los testículos; líquido blanco transparente en la cavidad abdominal, incluyendo material blanco junto al hígado. En el otro animal, se apreciaron lesiones en la grasa y el yeyuno, incluyendo decoloración. Se apreciaron adherencias en el hígado, engrosamiento del páncreas, múltiples zonas oscuras en el estómago y el timo, y puntos oscuros en la grasa abdominal, adyacente al epididimo. No se identificó una causa específica para la muerte de estos machos, aunque se ha dado por hecho que la gravedad de la inflamación prostática con su proximidad a los riñones y las alteraciones degenerativas sistémicas concurrentes contribuyeron a la muerte de estos animales.

Se apreciaron signos clínicos relacionados con el tratamiento en animales tratados con todos los niveles de dosis MTD IP. Se observaron manchas rojas en la piel de algunos animales de todos los grupos en uno o más sitios, incluyendo el hocico, la mandíbula, las patas delanteras, la zona periorbital y cervical ventral/dorsal entre los Días 1 y 4. La decoloración de la piel azul (sitio quirúrgico, abdominal, urogenital o inguinal) se apreció a los 20 y 40 g en 1/3 de los animales de cada grupo, incluyendo hinchazón urogenital en un animal del grupo de 40 g. En los animales de la MTD tratados intravenosamente, se observaron puntos rojos en la piel (hocico y región periorbital) con una mayor incidencia en los animales tratados con 50 g.

Los puntos rojos en la piel (el hocico) se observaron predominantemente en los animales del estudio principal de todos los niveles de dosis IP incluyendo los controles, pero generalmente con una mayor incidencia en los animales tratados. Este signo clínico se considero probablemente relacionado con el tratamiento. Los puntos rojos en la piel (el hocico) también se observaron en todos los animales del estudio principal IV. Se observaron signos clínicos adicionales en el sitio de la inyección (cola) e incluyeron costras en la piel y/o enrojecimiento u otra decoloración. Por otra parte, dos animales precisaron la amputación de la cola debido a lesiones y a una supuesta automutilación. Estos últimos cambios sugirieron un potencial irritante de la formulación del artículo de ensayo que fue también respaldado tras los exámenes histopatológicos.

Se apreció un incremento relacionado con la dosis en algunos de los parámetros de los glóbulos blancos de los animales IP del estudio principal el Día 2. Los recuentos de glóbulos blancos, neutrófilos, monocitos y basófilos incrementaron en todos los grupos tratados con 10 y/o 25 g. También se apreciaron incrementos en la MCHC a 25 g y en MPV en todos los niveles de dosis. Se apreciaron disminuciones en los reticulocitos relativos y absolutos en todos los niveles de dosis. Se apreció un incremento ligero aunque relacionado con la dosis en el tiempo de tromboplastina parcial activado en todos los niveles de la dosis IP. Se observaron cambios similares en los animales tratados intravenosamente con 25 g. Aumentaron los recuentos de glóbulos blancos, neutrófilos y basófilos. La MCHC, MPV y el índice de distribución de glóbulos rojos (RDW) también aumentaron y los reticulocitos relativos y absolutos descendieron. En los animales retirados tras 14 días de observación, se apreciaron aumentos en el RDW y MPV solamente y después de 28 días no se apreciaron diferencias en los parámetros hematológicos. Los cambios observados en los animales retirados tras un día de observación se consideraron relacionados con el artículo del ensayo. Los resultados mostrados tras el período de observación de 15 días y de 28 días demuestran la recuperación con respecto a estos cambios.

Los incrementos relacionados con la dosis de la concentración media de aminotransferasa de aspartato y la aminotransferasa de alanina se observaron en el Día 2 y se consideraron marcados a 25 g. Los incrementos en la concentración de bilirrubina directa, urea, creatinina y triglicéridos también se observaron a 25 g IP. Se apreciaron descensos en la concentración de glucosa a 25 g y la concentración de albúmina se redujo a >10 g con una reducción asociada del ratio de albúmina/globulina y un descenso de la concentración de proteína total a 25 g solamente. En los animales tratados con 25 g IV, se apreció un ligero aumento de la concentración de urea y de calcio y un ligero aumento de la concentración de globulina también se apreció con el correspondiente descenso del ratio de albúmina/globulina. Estos cambios se consideraron relacionados con la inflamación observada en el sitio de la inyección. El Día 29 se apreció un incremento de la concentración de alanina aminofosfotasa y un descenso de la concentración de bilirrubina indirecta a 25 g IP solamente.

La semivida terminal del compuesto se estimó en 12,8 horas para la administración intravenosa. La Cmax se podría volver a extrapolar hasta las 0 horas con un valor de 81,3 ng/mL. El valor máximo observado (en el momento de la primera muestra) fue de 74,3 ng/mL. La eliminación sistémica (CL) y el volumen de distribución (Vz) se calcularon como 46,3 mlVh y 841 mL, respectivamente. Tras la administración intraprostática, la tmax observada se produjo 4 horas después de la dosis en todos los casos, con niveles máximos de 2,95 y 3,51 ng/mL a 10 y 25 g, respectivamente. La AUC0-tlast observada pareció descender con la dosis máxima, debido a la tlast diferente. La linearidad de la dosis para la vía intraprostática se valoró USUlg Cmax y AUC0-tlast. Ambos parámetros de exposición normalizadas a la dosis se redujeron de 10 a 25 g y las biodisponibilidades correspondientes estimadas fueron de 23,7 y 4,38%, todos ellos indicadores de una absorción limitada de MPP5 en la circulación sistémica de la próstata con un nivel de dosis mayor.

Durante la fase de MTD, las dosis únicas IP de MPP5 a 40 g en ratas macho estuvieron asociadas con la mortalidad sin ninguna causa específica de muerte. Una única dosis IV de MPP5 en ratas macho fue tolerada hasta una dosis máxima de 50 g.

Durante la fase del estudio principal, una única inyección IP de MPP5 en ratas macho resultó en la muerte de dos ratas a 25 g, alteraciones del peso de los órganos, microscópicas y macroscópicas en el sitio de la inyección prostática a >2g. La causa de la muerte de los dos machos no se pudo determinar con certeza, aunque se asumió que la gravedad de la inflación prostática y los cambios asociados contribuyeron al deterioro/la muerte de estos

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animales. Los demás cambios relacionados con el artículo del ensayo se observaron a los 2, 15, y/o 29 días del período de recuperación. Las alteraciones del peso de los órganos, microscópicas y macroscópicas en otros tejidos se consideraron secundarias a los cambios en el sitio de inyección prostático.

Una única inyección IV de MPP5 en ratas macho provocó alteraciones microscópicas y/o macroscópicas en el sitio de la inyección de la vena de la cola a una dosis de >25 g. Estos cambios se observaron a los 2, 15 y 29 días del período de recuperación con una recuperación progresiva a 25 g y fueron indicativos de un efecto irritante del artículo del ensayo. Las alteraciones microscópicas y macroscópicas en otros tejidos se consideraron secundarias a los cambios en el sitio de inyección. Los cambios del peso orgánico del hígado y el bazo en el Día 2 no presentaban una correlación microscópica y se recuperaron para el Día 15.

En conclusión, la administración de MPP5 mediante una única inyección intraprostática a niveles de dosis de hasta 40 g o la inyección intravenosa a unos niveles de dosis de hasta 50 g provocaron una mortalidad a 25 g y 40 g IP sin una causa clara de muerte. No obstante, el alcance de la inflamación prostática relacionada con el artículo del ensayo y con la proximidad con los riñones, así como la degeneración sistémica concurrente se consideraron factores que contribuyeron a las muertes. En su mayoría se apreciaron cambios reversibles en los signos clínicos (>2g), los parámetros hematológicos, clínicos y de bioquímica a >10 g. Los cambios patológicos persistieron a todos los niveles de dosis de forma relacionada con la dosis, aunque demostraron síntomas de regresión en animales tratados intravenosamente. Consecuentemente, el nivel sin efecto observable (NOEL) no se determinó para la vía intraprostática ni intravenosa.

Procedimientos experimentales

3.1 Sistema de ensayo

Se utilizaron un total de 180 ratas macho Sprague Dawley (Crl:CD® (SD) IGS BR) (Rattus norvegicus). Al comienzo del tratamiento, los animales tenían de 12 a 15 semanas de edad y tenían un peso de entre 399 y 495 g.

3.2 Tratamientos veterinarios

Los Días 4 y 7 se realizaron amputaciones de las colas de los animales 5010 y 5004, respectivamente, debido a la sospecha de automutilación. Dado que estos animales fueron tratados por vía intravenosa, el tejido amputado se conservó en formalina al 10% en tampón neutro para la evaluación patológica.

Antes del tratamiento todos los animales fueron pesados y asignados aleatoriamente a los grupos de tratamiento, utilizando un procedimiento de aleatorización informática. La aleatorización se realizó mediante estratificación utilizando el peso corporal como parámetro. Los animales con mala salud no fueron asignados a grupos. El diseño del estudio se detalla en la Tabla 9 (MTD) y en la Tabla 7 (Principal).

Tabla 9:

Estudio de la MTD

Grupo: Tratamiento Nivel de dosis (g) Volumen de dosis (L) Número de machos

IP IV: IP IV

6: MPP5 10 20 500 3 3

7: MPP5 20 20 500 3 3

8: MPP5 40 20 500 3 3

9: MPP5 50 - 500 - 5

IP - Intraprostática, IV - Intravenosa

Los animales asignados al Estudio de la MTD fueron retirados tras un período de observación de 48 horas. El Día 1, los animales 6001 y 8001 asignados al régimen de dosis IP fueron sustituidos por los animales de repuesto 6101 y 8101, respectivamente, debido a un error técnico (al administrárseles una dosis 10 veces superior a la dosis asignada). Más tarde, ese mismo día, el animal 8001 (400 g) fue encontrado muerto aproximadamente 4 horas después de la dosis y el animal 6001 (100 g) fue sometido a eutanasia al final del Día 1 debido a su mal estado. Estos animales se sometieron a una necropsia incluyendo un examen externo e interno detallado. Sin embargo, no se conservaron tejidos para el examen histopatológico. Antes de la muerte, los signos clínicos para el animal 6001 incluyeron debilidad, reducción del tono muscular, ojos parcialmente cerrados, frío al tacto, descenso de la actividad y paso anómalo. Los signos clínicos para el animal 8001 incluían el hecho de que se tumbaba de lado, tenía dificultad para respirar, reducción del ritmo respiratorio, piel azul, ojos pálidos, frío al tacto, descenso de la actividad, debilidad y reducción del tono muscular. El examen bruto para el animal 6001 reveló solamente una única zona oscura en el sitio de administración (próstata). En el caso del animal 8001, se apreciaba una decoloración oscura bilateral en los nódulos linfáticos mandibulares e hinchazón en el sitio de la inyección (próstata). Estas muertes se consideraron probablemente relacionadas con la elevada administración de MPP5 y fueron comunicadas al objeto de proporcionar más referencias para la MTD de este estudio.

El Día 13 (estudio MTD), se añadieron más animales a un nivel de dosis de 50 g por vía intravenosa, al objeto de explorar en más profundidad la toxicidad de la MPP5 a través de esta vía, debido a las observaciones limitadas comprobadas a < 40 g.

Antes del inicio de la dosis, el animal 1025 se consideró inadecuado para la participación en el estudio debido a una mala oclusión y fue sustituido por un animal de repuesto, que pasó a ser el animal 1125. Todos los animales que quedaron sin asignar a grupos fueron liberados del estudio y su disposición documentada.

3.3. Artículos de control del vehículo y del ensayo

El artículo del ensayo fue la MPP5 (número de lote PT1C-MF-PAL-DS-001), a una concentración de 3,2 mg/mL. El artículo del ensayo era un sólido incoloro cuando estaba congelado y fue congelado a 20ºC bajo cero, apartado de la luz directa. El control del vehículo fue solución tampón de fosfatos-EDTA, pH 7.4.

3.4 Preparación de formulaciones de la dosis

Las formulaciones de la dosis fueron preparadas el día del uso. Cada día, las cantidades apropiadas de los 3,2 mg/mL de la solución madre de MPP5 fueron medidas y diluidas con cantidades apropiadas de PBS, ImMEDTA.

3.5 Administración del artículo de control/del ensayo

Estudio de la MTD

A grupos de tres ratas se les administró una dosis intraprostática o intravenosa, tal y como se describe en la sección

3.2 y en la Tabla 9, en un único día y se observaron en busca de signos clínicos y de la potencial toxicidad durante hasta 48 horas después de la dosis. Para la administración intravenosa, el artículo del ensayo se administró mediante inyección intravenosa, a través de la vena de la cola a un volumen de dosis de 0,5 mL.

Para los grupos intraprostáticos, antes de la administración de la dosis los animales fueron anestesiados con isoflurano. Al menos una hora antes de la cirugía y hasta dos días después de la cirugía, los animales recibieron una inyección antibiótica intramuscular de penicilina G benzatina y penicilina G procaína (0,1 mL). Los animales también recibieron una inyección subcutánea de buprenorfina (0,05 mg/kg) el día de la cirugía.

Utilizando la cuchilla de un escalpelo, se realizó una incisión central de aproximadamente 2 cm, comenzando a 0,5 cm cranealmente del pene. El abdomen se cortó a la misma longitud. Los dos lóbulos ventrales de la próstata se localizaron y se inyectaron 20 L de la fórmula de MPP5 o PBS/EDTA pH 7.4 en el lóbulo ventral derecho utilizando una jeringa apropiada. Antes de cerrar, el sitio fue irrigado con una inyección de cloruro sódico templado al 0,9% (aproximadamente a 37ºC), U.S.P. El sitio se cerró en capas utilizando el material de sutura apropiado.

Para los animales asignados a la vía intravenosa, el artículo del ensayo se administró mediante inyección intravenosa, a través de la vena de la cola a un volumen de dosis de 0,5 mL.

Estudio principal

A los animales se les administró la dosis de acuerdo con los procedimientos establecidos durante la fase de la MTD. Para los animales asignados a la vía intravenosa, el artículo del ensayo se administró mediante inyección intravenosa, a través de la vena de la cola a un volumen de dosis de 0,05 mL. Una vez completado el tratamiento, los animales del estudio principal se mantuvieron sin dosis durante un período de recuperación de 1, 14 o 28 días.

3.6 Observaciones

Observaciones clínicas: Todos los animales fueron observados dos veces al día (una vez el día de la llegada y en la necropsia) para analizar la mortalidad y los signos de mala salud y/o la reacción al tratamiento a lo largo del estudio. Por otra parte, se realizó un examen detallado al menos una vez antes del comienzo del tratamiento y diariamente a lo largo de los períodos de tratamiento y recuperación (animales del estudio principal y de la MTD).

Pesos corporales: Los pesos corporales individuales se midieron para todos los animales el día de la aleatorización y dos veces por semana durante los períodos de tratamiento y recuperación (animales del estudio principal). Por otra parte, cada animal del estudio principal/la recuperación fue pesado (en ayunas) antes de la necropsia prevista. Los animales del estudio de la MTD fueron pesados antes de la dosis y antes del sacrificio terminal.

Consumo de alimentos: El consumo de alimentos individual para todos los animales del estudio principal se midió semanalmente comenzando la última semana del período de pretratamiento y durante los períodos de tratamiento y recuperación.

Oftalmología: Una vez antes del comienzo del tratamiento (todos los animales) y de nuevo antes de la necropsia (animales del estudio principal), se realizaron exámenes funduscópicos (oftalmoscopia indirecta) y biomicroscópicos (lámpara de hendidura) por parte de un oftalmólogo veterinario colegiado.

Investigaciones del laboratorio: Se realizaron análisis de muestras de sangre para la hematología y química sérica a todos los animales del estudio principal en la necropsia en los Días 2, 15 y 29. Los alimentos fueron retirados durante una noche de los animales antes de tomar las muestras de sangre. Las muestras de sangre se recogieron de la aorta abdominal bajo anestesia con isoflurano.

Las muestras de orina se recogieron antes de la necropsia los Días 2, 15 y 29 a los animales del estudio principal, colocadas en jaulas de metabolismo durante un período de recogida de aproximadamente 16 horas, durante las que los animales estuvieron privados de alimentos.

Los parámetros hematológicos examinados fueron: el tiempo de tromboplastina parcial activado, la morfología de la célula sanguínea, los índices de eritrocitos (MCV, MCH, MCHC and RDW); hematocrito, hemoglobina, volumen de plaquetas medio, recuento de plaquetas, tiempo de protrombina, recuento de glóbulos rojos, recuento de reticulocitos (absoluto y relativo), recuento de glóbulos blancos (total, absoluto y diferencial porcentual).

Los parámetros de la química sérica examinados fueron: Ratio de alanina aminotransferasa A/G (calculado), albúmina, fosfatasa alcalina, aspartato aminotransferasa, nitrógeno de la urea en sangre, cloruro cálcico, colesterol, creatinina, globulina (calculada), glucosa, fósforo inorgánico, potasio, sodio, bilirrubina total, proteína total, triglicéridos.

Los parámetros del urinálisis examinados fueron: bilirrubina, aspecto y color de la sangre, creatinina, glucosa, cetona, microscopia de nitrito del depósito centrifugado, pH, proteína, volumen de urobilinógeno de gravedad específica.

Evaluación de la inmunogenicidad (Día 14 y Día 28 del Estudio principal solamente)

Las muestras de sangre se recogieron de cada rata del estudio principal antes de la dosis (línea de base) de una vena yugular y en el sacrificio terminal de la aorta abdominal tras la anestesia con isoflurano (junto con muestras de sangre para la patología clínica). Las muestras se colocaron en tubos de separación de suero, se invirtieron en varias ocasiones, se dejaron coagular a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos y posteriormente se centrifugaron a 1200 g aproximadamente durante 10 minutos a aproximadamente 4ºC.

3.7 Toxicocinética

El Día 1 del Estudio, las muestras de sangre (-0,5 mL) se tomaron por venipuntura de la vena yugular en tubos K3 EDTA alternativamente de tres ratas del estudio toxicocinético por grupo por punto en el tiempo, antes de la dosis, 15 y 30 minutos y 1, 2, 4, 8, 24 y 48 horas después de la dosis. Las muestras de sangre se colocaban inmediatamente en hielo seco hasta que se separaban por centrifugación refrigerada (aproximadamente 2 a 8 ºC) a unas 2700 rpm durante 10 minutos. El plasma era separado, transferido a un segundo tubo y colocado en hielo seco. Las muestras de plasma se almacenaron aproximadamente a 20°C bajo cero y se analizaron para comprobar los niveles de MPP5.

Las muestras de plasma se analizaron mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) basándose en el principio del sandwich del anticuerpo. El anticuerpo de captura (anticuerpo monoclonal contra aerolisina de ratón) específico para la MPP5 fue revestido en la placa de microtítulos de 96 pocillos para crear la fase sólida, que capturó el analito presente en los estándares y las muestras para el control de calidad. El anticuerpo secundario (anticuerpo policlonal contra la aerolisina de conejo) que se une a un epitope diferente de la molécula del analito fue posteriormente añadido al sandwich completo anticuerpo-analito-anticuerpo. Posteriormente se añadió el conjugado de la enzima del anticuerpo de detección (IgG de cabra contra conejo, conjugado de peroxidasa de rábano silvestre) que se une a la región constante del anticuerpo de la IgG de conejo. El conjugado capturado fue visualizado utilizando el sustrato de tetrametilbencidina y medido a 450 nm utilizando el lector de placas SpectraMAX.

Para la vía de dosis intraprostática, el análisis toxicocinético no compartimental se realizó sobre los datos de concentración plasmática 20. En la práctica, el análisis toxicocinético incluyó evaluaciones de tmax, Cmax, AUC, k y t1/2. Los valores de tmax y Cmax son valores observados. Siempre que resultó posible, el parámetro de AUC se calculó mediante el método de la regla trapezoidal (Gibaldi y Perrier, 1982) utilizando el programa de software informático estándar WinNonlin (Versión 3.2). La k se determinó mediante el análisis de regresión lineal de los puntos de tiempo seleccionados en la fase terminal aparente de la 25 concentración frente a las curvas del tiempo. La semivida terminal aparente se calculó como sigue: t1/2=ln2/k.

Para la vía de dosis intravenosa, el análisis toxicocinético no compartimental se realizó sobre los datos de concentración plasmática. En la práctica, el análisis toxicocinético incluyó la valoración de tmax, Cmax, AUC, k, t1/2, Vz y

CL. La Cmax se volverá a extrapolar hasta las 0 horas. El parámetro de AUC se calculó mediante el método de la regla trapezoidal (Gibaldi y Perrier, 1982) utilizando el programa de software informático estándar WinNonlin (Versión 3.2). La k se determinó mediante el análisis de regresión lineal de los puntos de tiempo seleccionados en la fase terminal aparente de la concentración frente a las curvas del tiempo. La semivida terminal aparente se calculó como sigue: t1/2=ln2/k. La eliminación (CL) se calculó por la dosis/AUC y el volumen aparente de 5 distribución (Vz) se calculó como CIA.

3.8. Procedimientos terminales

Patología bruta: Los animales del estudio MTD encontrados muertos durante el estudio se sometieron a necropsia sin preservación del tejido. Todos los animales del estudio principal y la recuperación encontrados muertos durante el estudio se sometieron a necropsia y se preservaron muestras del tejido.

Al completarse el período de tratamiento y recuperación, todos los animales supervivientes fueron exsanguinados en la aorta abdominal tras anestesia con isoflurano y se tomaron muestras de sangre para las investigaciones del laboratorio. Al objeto de evitar el cambio autolítico, se realizó un examen completo de la patología bruta del cadáver lo antes posible tras la eutanasia a todos los animales del estudio principal.

Pesos de los órganos: Para cada animal del estudio principal sometido a eutanasia en la necropsia programada, los siguientes órganos fueron diseccionados libres de grasa y pesados: las glándulas adrenales, el cerebro, el corazón, los riñones, el hígado, los pulmones, los testículos, la pituitaria, la próstata, el bazo, el timo, los lóbulos tiroides (con paratiroides). Los órganos dobles se pesaron juntos y se calcularon los ratios de peso de los órganos con respecto al peso corporal.

Preservación de tejidos: Al completarse la necropsia de cada animal del estudio principal, los siguientes tejidos y órganos se preservaron: Anomalías, identificación animal, adrenales, aorta (torácica), hueso y médula (esternón), cerebro (cerebro, cerebelo, cerebro medio y bulbo raquídeo), ciego, colon, duodeno, epididimo, esófago, ojos, glándulas de Harder, corazón (incluyendo la sección de la aorta), íleo, sitio de inyección (próstata) en los Grupos 1 a 4, sitio de inyección (vena de la cola) en el Grupo 5, yeyuno, riñones, glándulas lacrimales, hígado (muestra de dos lóbulos), pulmones (muestra de dos lóbulos), nódulos linfáticos (mandibular y mesentérico), glándula mamaria (inguinal), cavidades nasales y senos (3 niveles), nervios ópticos, páncreas, pituitaria, próstata (lóbulos sin inyectar), recto, glándula salivar, nervio ciático, vesículas seminales, músculo esquelético, piel (inguinal), médula espinal (cervical), bazo, estómago, testículos, timo, lóbulos tiroides (y paratiroides), lengua, tráquea, uréter (bilateral) y vejiga urinaria.

Se empleó formalina al 10% en tampón neutro para la fijación del tejido y la preservación, salvo para el epididimo, los ojos, nervios ópticos y testículos, que fueron fijados en líquido de Zenker (animales sometidos a eutanasia solamente). Para todos los animales sometidos a eutanasia, se prepararon y tiñeron 3 frotis de médula ósea femoral. Los frotis se conservaron pero no se evaluaron.

Histopatología: Los tejidos se introdujeron en cera de parafina, se seccionaron (las cavidades nasales y senos, el esternón y el sitio de inyección de la vena de la cola se descalcificaron antes de seccionarlos) y se tiñeron con hematoxilina y eosina, y se examinaron histopatológicamente como sigue:

Grupos 1, 4 y 5: Los tejidos recogidos bajo preservación de tejidos (salvo identificación animal y recto)

Grupo 2 y Grupo 3: Los tejidos que muestran conclusiones relacionadas con el tratamiento, todas las lesiones brutas y tejidos diana recogidos a continuación:

Las muestras de tejidos diana incluyendo el cerebro, el corazón, los riñones, el hígado, los nódulos linfáticos, el sitio de inyección (próstata), la próstata (lóbulos no inyectados), el bazo, los lóbulos tiroides (y paratiroides), el uréter y la vejiga urinaria fueron procesadas y examinadas para todos los animales del estudio principal en todos los grupos de dosis. Los nervios ópticos, las glándulas paratiroides y la glándula mamaria fueron solamente examinados histopatológicamente si estaban presentes en las secciones rutinarias de los ojos, la tiroides y la piel, respectivamente.

Análisis estadísticos

Los datos numéricos obtenidos durante la realización del estudio se sometieron al cálculo de las medias de los grupos y las desviaciones estándar. Para cada parámetro de interés, las varianzas de los grupos se compararon utilizando el test de Levene al nivel de significancia de 0,05. Cuando se concluyó que las diferencias entre las varianzas de los grupos no eran significativas, se realizó un análisis simple de la varianza (ANOVA) de los parámetros. Si el ANOVA indicaba diferencias significativas entre las medias (p < 0.05), entonces se utilizaba el test

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“t” de Dunnett para realizar las comparaciones medias del grupo entre el grupo de control y cada uno de los grupos de tratamiento.

Siempre que el test de Levene indicaba varianzas de los grupos heterogéneas (p < 0,05), se utilizó el test de Kruskal-Wallis no paramétrico para comparar todos los grupos considerados. Si el test de Kruskal-Wallis era significativo (p <0,05), entonces la significancia de las diferencias entre el grupo de control y cada uno de los grupos de tratamiento se evaluaba utilizando el test de Dunn.

Para la comparación de cada pareja de grupos de interés, la significancia se registró a los niveles de 0,05, 0,01 y 0,001.

Resultados y discusión

1.: Análisis de la formulación de la dosis

Los resultados de las evaluaciones del pH, la osmolaridad y densidad de las formulaciones de la dosis utilizados en el estudio se indican en la Tabla 10.

2.: Mortalidad Estudio de la MTD

Tabla 10: pH, osmolaridad y densidad de la formulación de la dosis

Grupo nº: Nivel de dosis (g) Vía pH Osmolaridad (mOsm/kg) Densidad (g/cm3)

1: 0 IP 7.39 300 1,0037

2
2: IP 7.38 299 1,0030

3: 10 IP 7.36 298 1,0041

4: 25 IP 7.36 295 1,0049

5: 25 IV 7.36 301 0,9999

6: 10 IV/IP 7.35/7.35 308/304 0,9941/1,0043

7: 20 IV/IP 7.35/7.34 307/302 1,0052/1,0002

8: 40 rv/ip 7.35/7.32 305/297 1,0048/1,0040

9: 50 IV 7.37 308 1,0057

El Día 2, el animal 8101 (40 g, IP) fue encontrado muerto. Antes de la muerte, no se produjeron signos clínicos relacionados con el tratamiento. En la necropsia, se observaron puntos oscuros en el estómago y una zona oscura e hinchazón en el lugar de la inyección (próstata). No se determinó ninguna causa clara de la muerte.

Estudio principal

El Día 2, los animales 4005 y 4013 (25 g, IP) fueron encontrados muertos. Antes de la muerte no se produjeron signos clínicos relacionados con el tratamiento en el animal 4013. En el animal 4005 se encontraron manchas en la piel (en el hocico), piel azul, un descenso de la actividad, debilidad, reducción del tono muscular, descarga de líquido transparente (periorbital), ojos pálidos, dificultad para respirar, se tumbaba de lado y estaba frío al tacto.

En la necropsia del animal 4005, entre las conclusiones macroscópicas se incluyeron: una zona oscura en el sitio de la inyección (próstata); puntos oscuros en los testículos; líquido blanco transparente en la cavidad abdominal, incluyendo material blanco junto al hígado. En el animal 4013, se apreciaron lesiones en la grasa y el yeyuno, incluyendo decoloración. Se apreciaron adherencias en el hígado, engrosamiento del páncreas, múltiples zonas oscuras en el estómago y el timo, y puntos oscuros en la grasa abdominal, adyacente al epididimo. La causa de la muerte en ambos casos fue incierta, aunque se ha dado por hecho que la gravedad de la inflamación prostática observada histopatológicamente con su proximidad a los riñones y las alteraciones degenerativas sistémicas concurrentes contribuyeron a la muerte de estos animales.

3. Observaciones clínicas

Estudio de la MTD

Los efectos relacionados con el tratamiento se observaron en animales tratados a todos los niveles de dosis MTD IP (10 a 40 g). Se observaron manchas rojas en la piel de 2/3 de los animales de todos los grupos en uno o más sitios, incluyendo el hocico, la mandíbula, las patas delanteras, la zona periorbital y cervical ventral/dorsal entre los Días 1 y 4. La decoloración de la piel azul (sitio quirúrgico, abdominal, urogenital o inguinal) se apreció a los 20 y 40 g en 1/3 de los animales de cada grupo, incluyendo hinchazón urogenital en el animal 8002 (40 g). A pesar de que estas observaciones pueden estar relacionadas con el procedimiento quirúrgico, la incidencia y gravedad aumentó a 40 g.

En los animales tratados intravenosamente, los signos clínicos relacionados con el tratamiento se limitaron a manchas rojas en la piel (hocico y/o periorbital), que se apreciaron con mayor incidencia en los animales tratados con 50 g. Hasta 5/5 de los animales de alta dosis se observaron con estos signos en comparación con 1/3 observados con estos signos a <50 g durante los Días 1 a 4.

Estudio principal

Terminación del Día 2

Se observaron manchas rojas en la piel (hocico, periorbital y/o cráneo) en algunos animales de todos los niveles de dosis IP incluyendo 3/7 de los animales de control, 1/7 de los animales de 2 g, 5/7 de los animales de 10 g y 3/7 de los animales de 25 g. En el animal 4014 (25 g) se observó un flujo rojizo en ambos ojos y el animal 4015 mostraba una actividad reducida y estaba frío al tacto antes de la necropsia el Día 2.

4.: Consumo de alimentos

No se produjo ningún efecto sobre el consumo de alimentos.

5.: Oftalmología

No se produjo ninguna conclusión oftalmológica.

6.: Hematología

En los animales IP retirados el Día 2, se apreció un incremento dos o más veces superior de algunos de los parámetros de los glóbulos blancos relacionado con la dosis. Los recuentos de glóbulos blancos (WBC), neutrófilos, monocitos y basófilos aumentaron en todos los grupos tratados, alcanzando significancia estadística a 10 y/o 25 g. También se observaron incrementos estadísticamente significativos en la concentración de hemoglobina corpuscular media (MCHC) a 25 g y en el volumen de plaquetas medio (MPV) a todos los niveles de dosis. Se apreciaron disminuciones en los reticulocitos relativos y absolutos en todos los niveles de dosis. Se apreció un incremento ligero aunque relacionado con la dosis en el tiempo de tromboplastina parcial activado en todos los niveles de la dosis IP, alcanzando significancia estadística a 25 g.

Se observaron cambios similares en los animales tratados intravenosamente con 25 g de MPP5. Aumentaron los recuentos de WBC, neutrófilos y basófilos. La MCHC, MPV y el índice de distribución de glóbulos rojos (RDW) también aumentaron y los reticulocitos relativos y absolutos descendieron. En los animales retirados tras 14 días de observación, se apreciaron aumentos en el RDW y MPV solamente. Después de 28 días de observación, no se apreciaron diferencias en los parámetros hematológicos. Los cambios observados en los animales retirados tras un día de observación se consideraron relacionados con el artículo del ensayo y fueron correlacionados histopatológicamente. Los resultados mostrados tras el período de observación de 15 días y de 28 días demuestran la recuperación con respecto a estos cambios. Otras diferencias menores se consideraron incidentales y no relacionadas con el tratamiento.

7. Química sérica

El Día 2, se observaron aumentos relacionados con la dosis, alcanzando significancia estadística a 25 g IP, en la concentración media de aspartato aminotransferasa y la alanina aminotransferasa. Estos se consideraron cambios marcados a 25 g. Los incrementos en la concentración de bilirrubina directa, urea, creatinina y triglicéridos también se observaron a 25 g IP. Se apreciaron descensos en la concentración de glucosa a 25 g. La concentración de albúmina se redujo a >10 g con una reducción asociada del ratio de albúmina/globulina y un descenso de la concentración de proteína total a 25 g solamente.

En los animales tratados con 25 g IV, se apreció un ligero aumento de la concentración de urea y de calcio. Un ligero aumento de la concentración de globulina también se apreció con el correspondiente descenso del ratio de albúmina/globulina (A/G). Los cambios en la globulina (y por consiguiente en el ratio A/G) se consideraron posiblemente relacionados con la inflamación en el sitio de la inyección.

El Día 15 se apreciaron reducciones estadísticamente significativas en la concentración de triglicéridos a todos los niveles de dosis incluyendo los animales tratados por vía IV. Estos se consideraron sin significancia toxicológica y posiblemente relacionados con alteraciones menores del metabolismo de lípidos.

El Día 29 se apreció un incremento de la concentración de alanina aminofosfotasa y un descenso de la concentración de bilirrubina indirecta a 25 g IP solamente. Estos cambios pueden estar relacionados con los cambios secundarios descritos histopatológicamente.

No hubo otros cambios toxicológicamente significativos.

8.: Urinálisis

No se produjeron efectos aparentes sobre los parámetros del urinálisis.

9.: Toxicocinética

Por lo general, las concentraciones en plasma de MPP5 eran similares entre animales individuales de cada grupo en cada punto del tiempo. Se esperaba cierta variabilidad en los valores de concentración en plasma, dado que los niveles de dosis no estaban normalizados de acuerdo con el peso corporal o prostático. La MPP5 no era cuantificable en las muestras recogidas de los animales de control ni en las muestras recogidas antes de la dosis.

Por lo general, en los grupos del ensayo, las concentraciones plasmáticas de MPP5 aumentaron a niveles de dosis crecientes del artículo del ensayo administradas intraprostáticamente, sin concentraciones detectables en ninguna muestra recogida de los animales de 2 g. La MPP5 resultaba detectable hasta 24 horas en los animales tratados con 10 Mg, 8 horas en los animales tratados con 25 g y 48 horas en el Grupo 5 (25 Mg, intravenosa). En todos, se obtuvieron tres perfiles compuestos que se tuvieron en cuenta para una posterior evaluación.

Se podría estimar una fase terminal para el perfil compuesto IV, donde la semivida terminal estimada era de 12,8 horas. Para los restantes perfiles no se podría estimar una fase terminal con confianza. Por tanto, todos los parámetros extraídos de k (t1/2, AUC0-tlast y % extrapolado) no se comunicaron. Para el perfil IV, el porcentaje de AUC0-tlast extrapolado de AUC0-tlast fue inferior al 6%, lo que indica que este perfil estaba bien caracterizado con los datos experimentales.

Tras la dosis intraprostática, la tmax observada se produjo 4 horas después de la dosis en todos los casos, con niveles máximos de 2,95 y 3,51 ng/mL a 10 y 25 g, respectivamente. La AUC0-tlast observada se redujo a la dosis más elevada (48,5 frente a 22,4 ng-h/mL). Este resultado estaba influido, no obstante, por el tlast menor observado a 25 g IP (8 horas frente a 24 horas a 10 g IP). Tras la dosis IV, la Cmax se podría volver a extrapolar hasta las 0 horas con un valor de 81,3 ng/mL. El valor máximo observado (en el momento de la primera muestra) fue de 74,3 ng/mL. La eliminación sistémica (CL) y el volumen de distribución (Vz) se calcularon como 46,3 mL/h y 841 mL, respectivamente.

La linearidad de la dosis tras la dosis intraprostática se evaluó en los niveles de dosis de 10 a 25 Mg utilizando la concentración plasmática máxima media normalizada de la dosis y los parámetros de exposición del área bajo la curva (Cmax and AUC0-tlast, respectivamente). Los dos parámetros de exposición normalizados descendieron de 10 g a 25 g. Esto podría ser indicativo de la absorción limitada de la MPP5 en la circulación sistémica de la próstata.

Basándose en las áreas (AUC0-tlast) observadas en las dosis medias a elevadas tras la administración intraprostática, la biodisponibilidad porcentual se determinó comparando estas áreas (normalizadas para el nivel de dosis) con el área normalizada de la dosis obtenida tras la administración intravenosa. Las biodisponibilidades estimadas fueron de 23,7 y 4,38%.

10. Pesos de los órganos

Inyección intraprostática

Los cambios en los pesos de los órganos absolutos y relativos (peso del órgano con respecto al peso corporal) que ocasionalmente alcanzaron significancia estadística se apreciaron en la próstata de todos los días de sacrificio y en el bazo en el Día 2 de sacrificio. Los pesos prostáticos oscilaron entre un 26% y un 45% más en los animales de 10 g y 25 g el Día 2 en comparación con los controles. Los pesos prostáticos eran de un 16% a un 24% inferiores en comparación con los controles en los animales tratados el Día 15 y de un 19% a un 21% inferiores a >10 g el Día 10 29. Estos cambios eran coherentes con las conclusiones microscópicas obtenidas. Los pesos del bazo eran aproximadamente un 36% inferiores a 25 g el Día 2 en comparación con los controles. Esto se consideró un cambio secundario y se recuperó para el Día 15.

Inyección intravenosa

El Día 2, los animales de 25 g IV tenían unos pesos del hígado y el bazo aproximadamente un 21% superiores que los controles sin correlación histológica y se recuperaron para el Día 15.

11. Patología bruta

Estudio de la MTD

Se identificaron cambios en el sitio de la inyección prostática en todos los niveles de dosis IP. Las alteraciones incluyeron una zona/decoloración oscura, manchas y agrandamiento/hinchazón. Los animales sustituidos el Día 1 (nº 6001, 8001) o encontrados muertos (No. 8101) el Día 2 tras la inyección IP presentaban algunos de los cambios en el sitio de la inyección prostática anteriormente descritos. No se determinó una causa específica de la muerte. La inyección intravenosa (IV) en la vena de la cola estuvo asociada con costras en la cola de los animales de los Grupos 8 y 9. Otros cambios se consideraron esporádicos, relacionados con el procedimiento o agónicos y no relacionados con el tratamiento.

Estudio principal

Los cambios en el sitio de la inyección prostática se identificaron todos los días de sacrificio. Los cambios del Día 2 se caracterizaron por puntos/áreas/decoloración oscuros, adherencia y agrandamiento/hinchazón a todos los niveles de dosis. Las alteraciones de los Días 15 y 29 se describieron como área pálida, elevada, firme y/o pequeña en los animales 10 g. Las adherencias y áreas pálidas se apreciaron frecuentemente en el hígado y el bazo en los Días de sacrificio 15 y 29 a > 10 g y eran probablemente secundarios a las alteraciones del sitio de la inyección prostática El animal 4005 (25 g IP) encontrado muerto el Día 2 presentaba algunos de los cambios en el sitio de la inyección prostática anteriormente descritos. No se determinó una causa específica de la muerte.

La inyección intravenosa en la vena de la cola estuvo asociada con costras en la cola en todos los días de sacrificio. La ulceración estuvo presente los Días 15 y 29 con o sin pérdida de la punta de la cola. El agrandamiento hepático se apreció el Día 2 de sacrificio.

Otros cambios se consideraron esporádicos, relacionados con el procedimiento o agónicos y no relacionados con el tratamiento.

12. Histopatología

Inyección intraprostática

Los cambios microscópicos atribuidos a la MPP5 se observaron en el sitio de la inyección prostática a >2 g los Días 2, 15 y 29. Se observó una inflamación de mínima a aguda grave en todas las dosis el Día 2, por lo general, con un incremento de la gravedad dependiente de la dosis. La inflamación se caracterizó por fibrina, infiltrado celular mixto y necrosis acinar. Se observaron edemas y hemorragias en los animales tratados y de control, por lo que se consideraron parcialmente relacionados con el procedimiento. Se observó una inflamación de mínima a aguda crónica y/o fibrosis a todas las dosis los Días 15 y 29, por lo general, con un aumento de la gravedad dependiente de la dosis. La fibrosis, el infiltrado mononuclear y la necrosis acinar caracterizaron la inflamación. Estos cambios estuvieron con frecuencia acompañados por la dilatación/atrofia acinar concurrente. Una fibrosis mínima y dilatación/atrofia acinar se observaron con poca frecuencia en los animales de control el Día 29 y, por tanto, se consideraron principalmente relacionadas con el tratamiento. También se observaron cambios agudos y crónicos en el lóbulo prostático adyacente, por lo general, con una gravedad e incidencia inferiores del cambio. La inflamación aguda, el edema y la hemorragia estaban correlacionados con unos pesos prostáticos más elevados el Día 2 y la inflamación crónica, fibrosis y dilatación/atrofia acinar con los pesos prostáticos inferiores los Días 15 y 29, y generalmente estaban correlacionados con las conclusiones macroscópicas. Estas alteraciones indican un efecto irritante de la MPP5 en el sitio de la inyección prostática.

Numerosas observaciones microscópicas en otros tejidos se consideraron secundarias a la inflamación del sitio de la inyección prostática, sea por la expansión hacia los órganos pélvicos adyacentes y por toda la cavidad abdominal o por cambios degenerativos y/o reactivos sistémicos. La inflamación aguda y crónica con o sin hemorragia y fibrosis de superficies capsulares o serosales, respectivamente, se observaron en la grasa, el hígado, el intestino grueso y delgado, el páncreas, el bazo, el estómago, las vesículas seminales, el epididimo, los testículos y la vejiga urinaria. Los cambios reactivos y/o degenerativos incluyeron: hiperplasia mieloide de la médula ósea; aumento de la hematopoyesis extramedular en el bazo; atrofia linfoide y/o hiperplasia en los nódulos linfáticos, el bazo y el timo; infiltrado mononuclear hepático, necrosis de células individuales y figuras mitóticas aumentadas; y atrofia testicular (con oligo/aspermia del epididimo concurrente). La atrofia linfoide esplénica no explicaría los bajos pesos del bazo observados en los machos de 25 g el Día 2, por lo que se consideró secundaria.

No se identificó una causa específica para la muerte de dos machos (25 g) encontrados muertos el Día 2. Sin embargo, se ha dado por hecho que la gravedad de la inflamación prostática con su proximidad a los riñones y las alteraciones degenerativas sistémicas concurrentes pueden haber contribuido a la muerte de estos animales.

Otros cambios fueron esporádicos, incidentales, agónicos o se esperaban en esta edad y raza de rata, y por tanto no relacionados directamente con el tratamiento.

5

10

15

20

25

30

35

40

Inyección intravenosa

Los cambios microscópicos atribuidos a la MPP5 se observaron en el sitio de la inyección de la vena de la cola los Días 2, 15 y 29. Una inflamación de mínima a aguda marcada de la dermis y subdermis el Día 2 se caracterizó por fibrina, hemorragia, necrosis e infiltrado celular mixto, con o sin ulceración epidérmica y formación de costras en la mayoría de los animales. Un animal presentaba una necrosis moderada extendida a los tejidos adyacentes y a los nódulos linfáticos regionales. Una reducida incidencia y gravedad de los cambios los Días 15 y 29 sugirió una recuperación progresiva. La inflamación crónica caracterizada por fibrosis e infiltrado mononuclear se observó con o sin ulceración epidérmica y formación de costras e infrecuente necrosis e inflamación del hueso adyacente. Por lo general, las conclusiones microscópicas se correlacionaron con las alteraciones macroscópicas. Estas alteraciones indican un efecto irritante de la MPP5, particularmente en el tejido perivascular en el sitio de la inyección.

Una baja incidencia de los cambios en otros tejidos se consideró secundaria a los cambios inflamatorios en el sitio de la inyección observados el Día 2 y, por lo general, se recuperaron para los Días 15 y 29. Estos incluían: Necrosis e inflamación en el bazo; neutrófilo perivascular, infiltrado celular mixto o mononuclear en el epididimo, vesículas seminales, testículos e hígado; hiperplasia mieloide de la médula ósea; edema del nódulo linfático; atrofia linfoide en los nódulos linfáticos, el bazo y el hígado, y; atrofia testicular observada el Día 29. Los aumentos de peso del hígado y el bazo del Día 2 no tenían ninguna correlación microscópica.

5. Conclusión

Referencias

Dunn, O.J. 1964, Multiple Comparisons using Rank Sums, Technometrics, 6, 241-256.

SAS Institute Inc., 1999.SAS/STAT® User's Guide, Version 8, Cary, NC: SAS Institute Inc., 3884 pp.

EJEMPLO 7: TOXICIDAD AGUDA DE LA MPP5 EN MONOS

Este ejemplo muestra los resultados preliminares de un estudio que indica que la administración intraprostática de una MPP con una etiqueta de histidina que comprende un sitio de clivaje de PSA (MPP5) provoca un daño dependiente de la dosis en la próstata. El objetivo de este estudio consistía en evaluar la potencial toxicidad localizada de una única inyección intraprostática de MPP5 en macacos cangrejeros macho sexualmente maduros durante un período de dos semanas.

Descripción general del diseño experimental

Descripción general:

Se asignó un total de 16 macacos cangrejeros (Macaca, fascicularis) a los grupos de tratamiento mostrados en la Tabla 11 más abajo. Los animales tenían aproximadamente de 3,6 a 11,7 años y pesaban aproximadamente entre 2,8 y 7,9 kg. Los animales fueron importados de China, Vietnam, Indonesia y Mauricio.

Tabla 11:

Grupo nº: Número de machos Nivel de dosis g/g de próstata1) Número sacrificado: Día 3 Día 15

1: 4 0 (control) 2 2

2: 4 1 2 2

3: 4 5 2 2

4
4: 25 2 2

1 El peso de la próstata se calculará de una relación anteriormente establecida entre el peso de la próstata y el peso corporal. Se inyectará la mitad de la dosis en cada lóbulo de la próstata.

5

10

15

20

25

30

35

40

A todos los animales se les administró una dosis bajo anestesia general vía inyección intraprostática perianal. El primer día de la dosis se designó Día 1. Los animales fueron evaluados para comprobar los cambios en los signos clínicos (dos veces al día), el consumo de alimentos (una vez al día), el peso corporal (los Días -1, 3, 8, y 15), electrocardiogramas (antes del estudio y los Días 2 y 14), y el estado oftálmico (antes del estudio y el Día 14). Los índices de patología clínica (química sérica [incluyendo proteína C-reactiva], hematología y coagulación) se determinaron antes del estudio y los Días 3 y 14. Las muestras de sangre se recogieron para el análisis toxicocinético, los anticuerpos contra el artículo del ensayo y el antígeno específico para la próstata (PSA), en diversos puntos de tiempo tras la administración de la dosis. Ocho animales fueron sometidos a eutanasia los Días 3 y 15, como se indica en la Tabla 11. A su retirada, se realizó una necropsia completa de todos los animales y se recogieron tejidos (incluyendo tejidos periprostáticos seleccionados), que fueron conservados, procesados y examinados microscópicamente. Este estudio evaluó la toxicidad localizada aguda de la MPP5.

El artículo del ensayo era MPP5, lote nº PTIC-MF-PAL-DS-001 y el artículo de control era PBS-EDTA. Una solución del artículo de ensayo madre, en la que la concentración del ingrediente activo era de 3,2 mg/mL, se filtró a través de un filtro PVDF de 0,22 micrones adecuado, antes de la preparación de la solución de la dosis en el día de la preparación. Las diluciones de la solución del artículo del ensayo madre filtradas con el vehículo de control se realizaron el día de la dosis para obtener una solución de la dosis a concentraciones apropiadas para conseguir las dosis previstas.

Los animales fueron alojados tal y como se especifica en la Ley sobre el bienestar de los animales [USDA Animal Welfare Act (9 CFR, Partes 1, 2 y 3)] y como se describe en la Guía para el cuidado y el uso de animales de laboratorio [Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (ILAR publication, 1996, National Academy Press)].

Inicialmente a los animales se les asignaron números Provantis que reflejaban el origen del mono, como se muestra en la tabla más abajo. A los animales que se les asignaron números Provantis 6001-6008 eran de origen chino. A los animales que se les asignaron números Provantis 7001-7004 eran de origen indonesio. Los animales a los que se les asignaron números Provantis 8001-8003 procedían de Mauricio. El animal al que se le asignó el número Provantis 9001 era de origen vietnamita.

Debido a la gran variedad de orígenes y pesos corporales de los animales, estos fueron asignados aleatoriamente a grupos de tratamiento de acuerdo con la siguiente tabla.

Grupo nº: SetA SetB

Chino/ Vietnamita: Indonesio Mauriciano Chino/ Vietnamita Indonesio/ Mauriciano

1
1
1
1
1

2: 1 1 1 1

3: 1 1 1 1

4: 1 1 1 1

Administración del artículo del ensayo y de control, asignaciones por grupos y niveles de dosis:

Grupo nº: Número de machos Nivel de dosis (g/g próstata1) Volumen de dosis (L/g próstata1) Solución de dosis Cone. (ug/mL)

1: 4 0 (control) 50 0

2: 4 1 50 20

3: 4 5 50 100

4
4: 25 50 500

1 El peso de la próstata se calculó de una relación anteriormente establecida entre el peso de la próstata y el peso corporal.

2 La mitad de la dosis se inyectó en cada lóbulo de la próstata, es decir, aproximadamente 25 l/g de próstata por lóbulo.

La dosis se realizó como sigue. La vía de administración fue la inyección de un bolo intraprostático perianal y la frecuencia fue una sola vez. Los monos fueron sedados inicialmente con una inyección intramuscular de quetamina y se colocó un catéter intravenoso temporal para la administración de sedantes y/o anestésicos durante los procedimientos quirúrgicos. Se realizó una pequeña incisión en la piel en la región perianal por debajo del ano y se diseccionaron los tejidos musculares y subcutáneos para permitir la visualización e identificación de la glándula prostática. Los artículos del ensayo y de control se administraron basándose en el peso de la glándula prostática. El peso aproximado de la glándula prostática se calculó por el peso corporal del animal y una relación previamente establecida entre el peso corporal y el peso de la glándula prostática (peso de la próstata (g) = 0,07294 +'(-0,2309 x

5

10

15

20

25

30

35

kg) + (0,06296 x kg2), donde kg es el peso corporal). Los artículos del ensayo y de control se administraron en volúmenes aproximadamente iguales en los lóbulos izquierdo y derecho de la glándula prostática.

La vía perianal fue seleccionada por ser el medio más preciso para administrar el artículo del ensayo directamente en la glándula prostática. El artículo del ensayo también se administrará locamente en la próstata en humanos.

Observaciones junto a la jaula: Se realizaban dos veces al día (por la mañana y por la tarde), comenzando al menos siete días antes del día de la dosis y continuando hasta el último día de recogida de muestras. Cada animal fue observado para determinar los cambios en el aspecto general y el comportamiento.

El consumo de alimentos era una vez al día, como parte de las observaciones rutinarias junto a la jaula, comenzando al menos siete días antes de la dosis y continuando hasta el último día de recogida de muestras (salvo por lo que se indica debajo). Se observó el número de galletas que quedaba de la alimentación del día anterior. Las excepciones a este procedimiento fueron los días de ayuno para los procedimientos del estudio.

Las mediciones del peso corporal se realizaron antes de la primera dosis (Día -1) y los días 3, 8 y 15, de acuerdo con el siguiente procedimiento. Se retiraron los alimentos antes de la medición de los pesos corporales.

Los electrocardiogramas se realizaron antes del estudio, el Día 2 y el Día 14 utilizando electrodos: I, II, HI, aVR, aVL y aVF. Los monos fueron temporalmente retenidos para el procedimiento fuera de sus jaulas en sillas para primates, pero no fueron sedados.

Los exámenes oftálmicos se realizaron mediante un preestudio veterinario (en las tres semanas previas al Día 1) y el Día 14. Bajo una sedación ligera con quetamina, se utilizó un oftalmoscopio directo para examinar las cámaras anterior o posterior del ojo. Se pusieron unas gotas de una solución midriática (normalmente tropicamida al 1%) en cada ojo, para facilitar el examen.

Las muestras de sangre para la evaluación de los parámetros de la química sérica, hematología y coagulación se tomaron de todos los animales durante la Semana -1 y los Días 3 (antes de la necropsia) y 14 (antes de los exámenes oftálmicos). Los animales estuvieron en ayunas durante al menos 8 horas (pero no más de 16 horas, sin justificación apropiada), antes de tomar las muestras de sangre para la química sérica.

La orina se recogió para el urinálisis mediante un preestudio de recogida con un recipiente para la jaula y en la mañana siguiente a la dosis (Día 2, aproximadamente 24 horas después de la dosis) y en los animales retirados mediante cistocentesis en cada necropsia (Días 3 y 15).

a) Procedimientos de recogida para la química sérica

Método de recogida: Venipuntura: cualquier vena disponible, preferiblemente femoral

Tabla 12:

Parámetros de la química sérica

Sodio: Calcio

Potasio: Fósforo

Cloro: Nitrógeno de urea (BUN)

Dióxido de carbono: Creatinina

Bilirrubina total: Proteína total

Fosfatasa alcalina (ALP): Albúmina

Lactato deshidrogenasa (LDH): Globulina

Aspartato aminotransferasa (AST): Ratio de albúmina/globulina

Alanina aminotransferasa (ALT): Glucosa

Gamma-glutamiltransferasa (GGT): Colesterol

Proteína C-reactiva (CRP): Triglicéridos

b) Hematología

Se recogieron muestras de sangre mediante venipuntura de cualquier vena disponible, preferiblemente femoral. El volumen de recogida 5 fue de 1 ml y el anticoagulante empleado fue EDTA. Parámetros analizados:

5

10

15

20

25

30

Tabla 13:

Parámetros hematológicos

Recuento (RBC): de glóbulos rojos 1 Hemoglobina corpuscular media (MCH)

Parámetros hematológicos

Recuento de glóbulos blancos (WBC): Volumen corpuscular medio (MCV)

Concentración de hemoglobina: Concentración de hemoglobina corpuscular media (MCHC)

Hematocrito: Recuentos de plaquetas

Recuentos de reticulocitos: Morfología de las células sanguíneas*'

* Incluye los glóbulos blancos totales, neutrófilos polisegmentados, neutrófilos en banda, linfocitos, monocitos,

basófilos eosinófilos y otros recuentos de células apropiados. ** El frotis de sangre de los animales será examinado en cada punto de tiempo (incluyendo el preestudio).

c) Parámetros de coagulación

Se recogieron muestras mediante venipuntura de cualquier vena disponible, preferiblemente femoral. El volumen de recogida fue de 1,8 mL y el anticoagulante fue citrato sódico. Las muestras fueron procesadas para obtener el plasma y se analizaron los siguientes parámetros: tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT), tiempo de protrombina (PT) y fibrinógeno.

d) Urinálisis

Las muestras fueron recogidas por el método de recogida en el recipiente la jaula (antes del estudio y aproximadamente 24 horas después de la dosis) y mediante cistocentesis, obtenidas en la necropsia. El volumen de recogida era de hasta 5 mL. Las muestras fueron procesadas de acuerdo con procedimientos estándar conocidos en el campo.

Se analizaron los siguientes parámetros:

Parámetros del urinálisis

Color/carácter: Cetonas

PH: Bilirrubina

Gravedad específica: Sangre oculta

Proteína: Microscopías

Glucosa

F. Análisis realizado de:

1. Muestras toxicocinéticas

Se recogieron muestras mediante venipuntura de cualquier vena disponible, preferiblemente femoral. Las muestras se tomaron antes de la dosis y 1, 2, 4, 8 24 y 48 horas después de la dosis. El volumen de recogida fue de 2 mL y no se utilizó ningún anticoagulante. Las muestras fueron procesadas para obtener el suero.

Los sueros se dividieron en dos alícuotas de un volumen aproximadamente igual. Cada muestra fue etiquetada con el número de animal, el grupo de dosis, el día de recogida, la fecha, la hora de recogida nominal, el número del estudio y el número de alícuota. Las muestras se almacenaron aproximadamente a 70ºC bajo cero y se analizaron para determinar la concentración de MPP5 mediante un ensayo ELISA.

2. Muestras de anticuerpos

Se analizaron muestras de todos los animales/grupos disponibles. Se recogieron muestras mediante venipuntura de cualquier vena disponible, preferiblemente femoral, antes de la dosis y el Día 14. El volumen recogido fue de 2 mL. No se utilizó ningún anticoagulante. Las muestras fueron procesadas para obtener el suero. Las muestras fueron almacenas aproximadamente a 70ºC bajo cero.

Análisis del antígeno específico para la próstata

Se analizaron muestras de todos los animales/grupos disponibles. Se recogieron muestras mediante venipuntura de cualquier vena disponible, preferiblemente femoral, antes de la dosis y los Días 2, 3 y 10. El volumen recogido fue de 2 mL. No se utilizó ningún anticoagulante. Las muestras fueron procesadas para obtener el suero y se almacenaron aproximadamente a 70ºC bajo cero.

Procedimientos terminales y patología anatómica

Terminación: Los animales fueron sometidos a eutanasia mediante exsanguinación bajo una profunda anestesia inducida con quetamina y Beuthanasia®-D o equivalente. Las raciones de comida se retiraron la noche antes del día de sacrificio. Los animales fueron sacrificados de acuerdo con el siguiente programa:

Grupo nº: Día 3. Set B. Nº de machos Día 15. Set A. Nº de machos

1: 2 2

2
2
2

3: 2 2

4: 2 2

Peso corporal final: El peso corporal terminal se obtuvo en la necropsia para todos los sacrificios programados y no programados. Este peso corporal se utilizó para calcular los ratios de peso órgano/cuerpo y órgano/cerebro.

10 Necroscopia bruta: Se realizó una necropsia bruta completa a todos los animales encontrados muertos o sacrificados durante el estudio (tanto sacrificios programados como no programados). La necropsia incluyó el examen de: el cadáver y el sistema musculoesquelético, todas las superficies y orificios exteriores, la cavidad craneal y la superficie exterior del cerebro, el cuello con los órganos y tejidos asociados, las cavidades torácica, abdominal y pélvica, con sus órganos y tejidos asociados.

15 Muestras de orina: La orina (disponible hasta un máximo de 5 mL) se recogió de la vejiga en la necropsia y se analizó como se describe en la sección de Patología clínica del presente protocolo.

Pesos de los órganos: Los siguientes órganos (cuando estaban presentes) fueron pesados antes de la fijación. Las parejas de órganos se pesaron juntas a menos que presentasen anomalías graves, en cuyo caso se pesaron por separado. La pituitaria se pesó después de la fijación.

Órganos pesados

Adrenales: Cerebro

Epididimo: Corazón

Riñones: Hígado

Pulmones: Pituitaria (después de la fijación)

Próstata (sin vesículas seminales): Bazo

Testículos: Timo

Tiroides con paratiroides

20

Los ratios de peso órgano/cuerpo se calcularon (utilizando el peso corporal final obtenido antes de la necropsia), así como los ratios de peso órgano/cerebro.

Recogida y conservación de tejidos: Los siguientes tejidos y órganos (o parte de los mismos) fueron recogidos y conservados en formalina al 10% en tampón neutro (salvo los ojos, que se conservaron en fijador de Davidson para 25 una fijación óptima).

Tejidos recogidos

Cardiovascular

Urogenital

Aorta

Riñones

Corazón

Vejiga urinaria

Digestivo

Testículos

Glándula salivar (mandibular)

Epididimo

Lengua

Próstata

Esófago

Tejidos Penprostat©

Estómago

Músculo esfínter anal

Intestino delgado

Vejiga adyacente a la próstata

Duodeno

Uretra prostática

Yeyuno

Vesículas seminales

Íleo

Uréteres

Intestino grueso

Conducto deferente

Ciego

Endocrino

Colon: Adrenales

Recto: Pituitaria

Páncreas: Tiroides/paratiroides1

Hígado: Musculoesquelético

Vesícula biliar: Piel

Respiratorio: Óseo (cabeza femoral)

Tráquea: Hueso (séptima costilla)

Musculoesquelético (psoas y diafragma)

Linfoide hematopoyético: Nervioso/Sentidos

Médula ósea (esternón): Ojos con nervio óptico

Timo: Nervio ciático

Cerebro

Nódulos linfáticos: Médula espinal (torácica)

Otro

Marca del número de animal

Lesiones brutas

5

10

15

20

25

30

35

40

La ausencia ocasional de la glándula paratiroide de la sección del tejido rutinaria no exigirá realizar un nuevo corte de la sección.

Histopatología: Para todos los animales sometidos a necropsia, los tejidos recogidos en la tabla anterior (salvo las marcas) fueron introducidos en parafina, seccionados, teñidos con hematoxilina y eosina, y examinados por un patólogo veterinario certificado por el Colegio Estadounidense de Patólogos Veterinarios (ACVP).

Análisis estadísticos

Las medias de los grupos y los valores de las desviaciones estándar se calcularon para todos los datos numéricos obtenidos por Sierra, incluyendo los pesos corporales, los parámetros de patologías clínicas (excluyendo los datos no numéricos) y los datos del peso de los órganos.

Otros análisis estadísticos se realizaron con el sistema SAS®, Versión 8.1. Las diferencias significativas entre los grupos se evaluarán mediante el uso de un análisis de la varianza (ANOVA), seguido de un test de comparaciones múltiples. Los supuestos que permiten el uso de un ANOVA de los parámetros se verificarán utilizando el test de Shapiro-Wilkes para comprobar la normalidad de los datos y el test de Levene para comprobar la homogenicidad de la varianza, con un nivel de significancia de p < 0,001 necesario en ambos test para rechazar los supuestos. Si ambos supuestos se cumplen, se aplicará un ANOVA de factor único, siendo la agrupación de los animales el factor, utilizando un nivel de significancia de p < 0,05. Si el ANOVA de los parámetros es significativo a p < 0,05, se utilizará el test de Dunnett para identificar diferencias estadísticamente significativas entre el grupo de control y cada uno de los grupos tratados con el artículo de ensayo a un nivel de significancia de 0,05. Si no se cumple alguno de los supuestos paramétricos, entonces se utilizará el procedimiento de ANOVA no paramétrico de Kruskal-Wallis para evaluar las diferencias entre los grupos (p < 0,05). Se aplicará el test de comparación múltiple de Dunn si este ANOVA es significativo, utilizando una vez más un nivel de significancia de p < 0,05.

Resultados preliminares

Próstata: Todos los animales tratados tenían lesiones en la próstata (véase la FIG. 32C-H y 33 C-H). Los animales del Grupo 1 (control) tenían una inflamación mínima, hemorragia y fibrosis en el Día 3 y fibrosis en el Día 15 coherente con la reacción a una inyección y la curación. Había importantes lesiones graves en los Grupos 3 y 4 (FIG. 32E-32H, FIG. 33 E-H) y 33F). No existía ninguna diferencia en el alcance o la gravedad de las lesiones entre los Grupos 3 (5 g/g de próstata) y 4 (25 g/g de próstata). Hubo lesiones menos graves significativas en el Grupo 2 (1 g/g de próstata). (FIG. 32C, 32D, 33C, 33D).

En el Día 3, la reacción primaria al artículo del ensayo fue la necrosis coagulativa de grandes partes de la próstata, con una hemorragia extensa y la inflamación de células mixtas. La inflamación fue principalmente neutrófila con cifras menos abultadas de eosinófilos, linfocitos y macrófagos. En algunas zonas se produjo una necrosis licuefactiva. La necrosis coagulativa fue leve en el Grupo 2 y moderada a marcada en los Grupos 3 y 4. El Día 3 en el Grupo 2 se produjo una extensa reparación con marcada hiperplasia regenerativa del epitelio de la glándula que progresó a metaplasia escamosa, en los márgenes de las zonas de la necrosis coagulativa, y una activación leve a marcada y proliferación de células intersticiales. El Día 3 en los Grupos 3 y 4 la reparación comenzó a ponerse de manifiesto por una activación leve y la proliferación de células intersticiales.

El Día 15 en el Grupo 2 la necrosis y la hemorragia se habían resuelto. No se indicó una cavitación de la próstata. Las lesiones presentaban fibrosis con una hiperplasia regenerativa en curso entre mínima y leve, y metaplasia escamosa de las glándulas. La inflamación fue principalmente en macrófagos y linfocitos con cifras menos abultadas de leucocitos polimorfonucleares. En un animal, se trataba principalmente de eosinófilos.

El Día 15 en los Grupos 3 y 4 había una necrosis coagulativa en curso y hemorragia con necrosis licuefactiva más grave, así como cavitación de la próstata e inflamación en curso de las células mixtas. La reparación en estos grupos consistió en una fibrosis moderada a marcada y fibroplastia del intersticio en los márgenes de las lesiones necróticas, con la hiperplasia regenerativa progresando a metaplasia escamosa de las glándulas. La inflamación se produjo principalmente en los neutrófilos en zonas con necrosis en curso aunque tuvo un porcentaje relativamente superior de linfocitos y macrófagos en los márgenes de las lesiones de las zonas de fibrosis.

Tejidos periprostáticos:

Las vesículas seminales en 5/6 de los animales tratados el Día 3 presentaban una mineralización de mínima a moderada de la secreción en el conducto glandular. Esto se considera en ocasiones una conclusión de fondo, aunque no en este grado ni con la frecuencia observada aquí. Por tanto es probable que esto sea secundario a los cambios en las próstatas. El Día 15, el único animal afectado era uno de control.

Las uretras prostáticas presentaban algunos infiltrados celulares inflamatorios, probablemente secundarios a los cambios en las próstatas.

EJEMPLO 8: ACTIVACIÓN DE LAS MPPS POR EL TEJIDO PROSTÁTICO

Se examinó la capacidad de los extractos de las próstatas de diversos animales para activar una MPP de acuerdo con la presente invención. Se realizó un estudio in vitro en el que se incubaron extractos de tejido prostático de rata, perro, mono y humano con MPP5 para determinar la activación porcentual de la MPP.

El protocolo experimental fue el siguiente. Se obtuvo tejido prostático fresco de una rata Sprague Dawley y de un único perro beagle. Los tejidos prostáticos congelados se obtuvieron de un único macaco cangrejero y de un único humano. El tejido prostático humano se obtuvo como material de investigación archivado de un estudio clínico aprobado por el IRB de la Universidad Johns Hopkins. Para este análisis, las próstatas fueron seccionadas (piezas de unos 100-500 mg) y suspendidas sin suero. Los medios eran RPMI 1640 para el cultivo de células a una concentración de igual volumen de medio por volumen de tejido. Las muestras de tejido se incubaron en este medio a 37ºC durante 2 horas. Tras la centrifugación, el supernatante se congeló a 80ºC bajo cero.

Ensayo de hemolisis: Las muestras fueron descongeladas a 37ºC, centrifugadas y los supernatantes recogidos. La concentración de proteína de cada supernatante se determinó utilizando el ensayo de Bradford. Las muestras se diluyeron en la misma concentración que la proteína de inicio. Las alícuotas del supernatante de muestras de mono y humano se obtuvieron para la determinación del PSA utilizando una metodología de ELISA estándar (Hybritech®, Beckman Coulter). Se preparó una solución de 2% de glóbulos rojos humanos (RBC) frescos suspendidos en solución salina balanceada de Hanks (HBSS) libre de fenol rojo cada día. Los glóbulos rojos fueron peletizados, resuspendidos en tres volúmenes de HBSS para eliminar el exceso de suero y resuspendidos para producir una solución al 50% en HBSS libre de fenol rojo. Para preparar las muestras de ensayo, una muestra de RBC al 50% se removió con suavidad para suspender los RBC. Las alícuotas de RBC se añadieron a 230 L de HBSS libre de fenol rojo para producir una solución al 4% (v/v). A esta suspensión se añadió una alícuota de 240 L del medio RPMI acondicionado para la sección de la próstata y, posteriormente, una alícuota de 10 L de MPP5 de la solución madre de 100 g/mL, de forma que la MPP5 total añadida por ensayo fue de 1 g y el volumen final del ensayo fue de 500 L. Esta solución de RBC/MPP5/tejido se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras fueron posteriormente centrifugadas para peletizar los RBC no lisados y se obtuvo una alícuota de 100 pL de supernatante de cada muestra, que fue inmediatamente medido espectrofotométricamente a 540 nm para comprobar la liberación de hemoglobina debido a la lisis de RBC. Los controles incluyeron RBC falsamente tratados (control negativo) y RBC lisados con 1% Triton-xlOO (control positivo). Al objeto de comparar el alcance de la hidrolisis, las diluciones en serie de cada muestra de medio acondicionado para el tejido prostático se sometieron a ensayo. Para este estudio se utilizaron diluciones del extracto de 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, y 1:32. Todas las muestras se sometieron a ensayo por triplicado para determinar la hemolisis.

Los resultados indicaron que el tejido prostático humano era más activo en el clivaje de la MPP5, mientras que los tejidos prostáticos de la rata y el mono producían una respuesta menor y el tejido prostático del perro no mostró ninguna actividad hacia la MPP5 (Figura 36). A pesar de que la rata carece del gen del PSA, se ha demostrado que posee una calicreína S3 homóloga a la PSA humana (Onozawa et al, 2001). Esta proteína similar al PSA, identificada en la próstata ventral de la rata, muestra una homología de la secuencia de aminoácidos y nucleótidos del 64 y 49% respectivamente con el PSA humano. Por otra parte, la calicreína S3 de rata y el PSA humano tienen puntos isoeléctricos y pesos moleculares similares. Por tanto, es probable que la MPP5 se active en el tejido prostático de rata con esta calicreína S3 similar al PSA.

La falta de activación por parte de la próstata de perro es coherente con la observación de que el perro no posee el gen del PSA.

5

15

25

35

45

EJEMPLO 9: ACTIVACIÓN DE LA MPP5 POR PLASMA/SUERO

La capacidad del suero de humano, mono, perro, rata o ratón para clivar la MPP5 se determinó como sigue.

La MPP5 (1,073 mg/mL) se descongeló en hielo al 4ºC, se dividió en partes alícuotas y se volvió a congelar a 80ºC bajo cero. Se realizaron dos ensayos para cada condición. Se incubaron 5 g de MPP5 en 20 mM de tampón HEPES (pH 7.4) que contenían 150 mM de NaCl y 25 L de suero de humano, mono, perro, rata o ratón, a 37ºC durante 10 minutos en un volumen total de 250L. En los experimentos de control, se añadieron 25 g de quimiotripsina a la mezcla de reacción antes de la adición de suero (control positivo). En otros experimentos de control el suero fue sustituido por un volumen igual de tampón (control negativo). La reacción se detuvo añadiendo 5 L de lOOmM PMSF en alcohol isopropílico seguida de un enfriamiento en hielo. Una alícuota de 15 L de la mezcla de la reacción detenida se añadió a una cantidad igual de 2 x el tampón con la muestra de BioRad que contenía 0,5% de (β-mercaptoetanol y se calentó a 95°C durante 5 minutos para desnaturalizar todas las proteínas y bloquear las interacciones proteína-proteína. Una muestra de 5 L se sometió a electroforesis en geles de Bis-Tris al 4-12% prefabricados (Invitrogen) utilizando un buffer de ejecución XT MOPS (BioRad Laboratories) a 100 V durante 60 minutos. Las proteínas de los geles se transportaron a nitrocelulosa (BioRad Laboratories) y la membrana se bloqueó con leche no grasa (5% en esta solución salina de tris con 0,1% Tween 20 (TBST) durante una hora a temperatura ambiente. La MPP5 se detectó mediante la incubación de las membranas en un anti-MPP5 de rata policlonal purificado a una dilución de 1:250.000 en TBST durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con TBST, el blot se incubó en anticuerpo de cabra contra rata unido a HRP (Jackson ImmunoResearch) a una dilución de 1:20.000 en TBST. La unión del anticuerpo con la membrana se detectó utilizando quimioluminiscencia de acuerdo con el fabricante del kit (Cell Signaling) y se registró en tiempo real utilizando un Alpha Innotech FluorChem SP con funciones de autoexposición a quimioluminiscencia para evitar la saturación, utilizando una cámara CCD de 4 megapíxeles. Los blots fueron cuantificados densitométricamente utilizando un programa basado en vóxel (ImageQuant software; Alpha Innotech, San Leandro, CA). Se determinó el porcentaje de la proteína clivada restante para cada ruta, dividiendo la densidad de la banda clivada por la suma de las bandas intacta y clivada, tras la corrección para el fondo. El porcentaje clivado se comparó después con no suero y suero más controles de quimiotripsina.

La estimación del porcentaje de clivaje de la MPP5 se realizó mediante electroforesis y cuantificación densitométrica de la prueba de Western-blot. El porcentaje clivado se comparó después con la MPP5 solamente (negativo) y los controles de quimiotripsina de MPPS+ (positivo) para determinar si la MPP5 es clivada por enzimas séricas. En estas condiciones experimentales, el clivaje de la MPP5 por suero de humano, mono, perro, rata o ratón no fue detectable. La Tabla 14 muestra el porcentaje de MPP5 que es clivado tras incubación con diversos sueros. La Figura 37 muestra pruebas de Western-blot tras la incubación durante 10 minutos en ausencia o presencia de diversos sueros. El panel A muestra la MPP5 incubada con 25 L de suero de hombres (H) (rutas 2-5) o macaco cangrejero (Mk) (rutas 6-7) en 250 L de volumen del ensayo. La ruta 3 contiene MPP5, suero humano y quimiotripsina, pero no fue incubada. La ruta 8 es un marcador del peso molecular. (B) MPP5 incubada con 25 L de suero de ratón (Mu) (rutas 2-5), perro (D) (rutas 6-7) o rata (R) (rutas 8-9) en 250 L del volumen del ensayo. La ruta 3 contiene MPP5, suero humano y quimiotripsina, pero no fue incubada. La ruta 10 es un marcador del peso molecular.

Tabla 14: Comparación entre especies del porcentaje de clivaje de MPP5 en suero

Tampón: Humano Mono Perro Rata Ratón

Porcentaje clivado: 1,45±1,08 0,90±0,31 1,78±1,51 1,20±1,0 1,87±0,32 1,33±0,10

Estos resultados sugieren que la MPP5 no está activada en el suero humano normal y sugieren también que la MPP5 no se activaría en caso de fuga en la sangre tras la inyección intraprostática incluso en hombres con unos niveles extraordinariamente elevados de PSA en suero. Estos resultados son coherentes con los datos publicados que demuestran que el PSA es enzimáticamente inactivado en la sangre por los inhibidores de la proteasa en suero, principalmente α1-antiquimiotripsina y α2-macroglobulina (Lilja et al, 1991; Otto et al., 1998).

EJEMPLO 10: ACTIVACIÓN DE LA MPP5 POR PARTE DE PROTEASAS NO PSA

Se realizó un estudio in vitro para determinar la sensibilidad de la MPP5 a las proteasas distintas al PSA que el profármaco podría potencialmente encontrarse si quedase expuesto involuntariamente a tejidos fuera de la próstata. Específicamente, varias proteasas comunes entre las que se incluyen PSA, furina, tripsina, quimiotripsina, trombina, MMP-7, proteasa de cisteína, catepsina B y las proteasas de serina hK 1, hK2, y uPA fueron evaluadas para comprobar su potencial para clivar MPP5.

Estos ensayos se realizaron como sigue. La proaerolisina natural (wt PA; 0,84 mg/mL) y MPPS a 1,073 mg/mL se utilizaron para ensayos que prueban todas las proteasas salvo para el ensayo #2 con furina, en el que se utilizó la MPP5 del lote # N-PT1C-MF-PAL-BX; a 1 mg/ml.

Para medir la activación mediante clivaje de PSA, se incubaron 5 g de proaerolisina natural o MPP5 en 20 mM de tampón HEPES (pH 7.4), que contenía 150 mM NaCl. Se añadieron diversas cantidades de PSA (0-10 g de PSA de acuerdo con una escala logarítmica) y se incubaron a 37 °C durante 60 minutos en un volumen total de 250 pL. La reacción se detuvo añadiendo 5 L de 100 mM PMSF en alcohol isopropílico seguida de un enfriamiento en hielo. Una alícuota de 15 L de la mezcla de la reacción detenida se añadió a una cantidad igual de 2 x el tampón con la muestra de BioRad que contenía 0,5% de p-mercaptoetanol y se calentó a 95°C durante 5 minutos. La muestra se sometió a electroforesis en geles de Tris-HCI al 10% prefabricados utilizando un buffer de ejecución XT MOPS (BioRad Laboratories) a 200 V durante 30 minutos. Las proteínas se detectaron mediante tinción de plata.

Para medir la activación mediante clivaje de furina en el estudio #1, 5 g de PA natural o MPP5 se incubaron en 20 mM de tampón HEPES (pH 7.4) que contenía 150 mM de NaCl y diversas cantidades de furina (0-3,2 ng de furina de acuerdo con una escala logarítmica) a 37 °C durante 10 minutos en un volumen total de 250 L. La reacción se detuvo mediante la adición de 5 L de 100 mM de PMSF en 5 alcohol isopropílico mediante enfriamiento en hielo. Una alícuota de 15 L de la mezcla de la reacción detenida se añadió a una cantidad igual de 2 x el tampón con la muestra de BioRad que contenía 0,5% de p-mercaptoetanol y se calentó a 95°C durante 5 minutos. La muestra se sometió a electroféresis en geles de Tris-HCI al 10% prefabricados utilizando un buffer de ejecución XT MOPS (BioRad Laboratories) a 200 V durante 30 minutos. Las proteínas se detectaron mediante tinción de plata.

Para medir la activación mediante clivaje de furina en el estudio #2, 5 g de PA natural o MPP5 se incubaron en 20 mM de tampón HEPES (pH 7.4) que contenía 150 mM de NaCl, 1 mM de CaCl y de 0 a 3 unidades de furina a 37ºC durante 60 minutos en un volumen total de 250 L. Cabe señalar que en el experimento anterior (furina, estudio # 1), el tiempo de incubación fue de 10 minutos a la misma concentración enzimática. La reacción se detuvo añadiendo 2,5 L de 100 mM PMSF en etanol seguida de un enfriamiento en hielo. Una alícuota de 15 L de la mezcla de la reacción detenida se añadió a una cantidad igual de 2 x el tampón con la muestra de BioRad que contenía 0,5% de p-mercaptoetanol y se calentó a 95°C durante 5 minutos. La muestra se sometió a electroféresis en geles de Novex Bis-Tris Nupage al 10% prefabricados (Invitrogen) utilizando un buffer de ejecución 1 x MOPS-SDS a 200 V durante 50 minutos. Las proteínas se detectaron mediante tinción de plata.

Para medir la activación mediante quimiotripsina, 5 g de PA natural o MPP5 se incubaron en 20 mM de tampón HEPES (pH 7.4) que contenía 150 mM de NaCl y diversas cantidades de quimiotripsina (0-500 g de quimiotripsina de acuerdo con una escala logarítmica) a 37 °C durante 10 minutos en un volumen total de 250 L. La reacción se detuvo mediante la adición de 5 L de 100 mM de PMSF en alcohol isopropílico seguida de enfriamiento en hielo. Una alícuota de 15 L de la mezcla de la reacción detenida se añadió a una cantidad igual de 2 x el tampón con la muestra de BioRad que contenía 0,5% de p-mercaptoetanol y se calentó a 95°C durante 5 minutos. La muestra se sometió a electroféresis en geles de Tris-HCI al 10% prefabricados utilizando un buffer de ejecución XT MOPS (BioRad Laboratories) a 200 V durante 30 minutos. Las proteínas se detectaron mediante tinción de plata.

Para medir la activación de MPP5 mediante trombina en el estudio #1, 5 g de proteína relacionada con aerolisina 30 (PA natural o MPP5) se incubaron en 20 mM de tampón HEPES (pH 7.4) que contenía 150 mM de NaCl y diversas cantidades de trombina (0-12 g de 0,23 unidades/g de trombina de acuerdo con una escala logarítmica) a 37 °C durante 10 minutos en un volumen total de 250 L. La reacción se detuvo mediante la adición de 5 L de lOOmM PMSF en alcohol isopropílico seguida de enfriamiento en hielo. Una alícuota de 15 L de la mezcla de la reacción detenida se añadió a una cantidad igual de 2 x el tampón con la muestra de BioRad que contenía 0,5% de β-mercaptoetanol y se calentó a 95°C durante 5 minutos. La muestra se sometió a electroforesis en geles de Tris-HCI al 10% prefabricados utilizando un buffer de ejecución XT MOPS (BioRad Laboratories) a 200 V durante 30 minutos. Las proteínas se detectaron mediante tinción de plata.

Para medir la activación de MPP5 mediante trombina en el estudio #2, se realizaron dos diluciones de trombina, 1/66 y 10 1/25, en el tampón de dilución de trombina proporcionado con el kit de trombina (Novagen) utilizado en estos experimentos. Se prepararon dos mezclas de reacción que contenían 10 g de MPP5 (N-PTIC-MF-PAL-BX) en 1x tampón de clivaje proporcionado con el kit de trombina. Dos mezclas de la reacción que contenían la proaerolisina natural con una etiqueta His (PA-EndHis) se prepararon del mismo modo. La trombina se añadió a una de las mezclas PA-EndHis a 0,15 unidades y a una de las mezclas de MPP5 a 0,4 unidades. El volumen de incubación total fue de 50 l en cada caso. Las mezclas de reacción se incubaron a temperatura ambiente durante 6,5 horas y esto estuvo seguido de la inhibición de la proteolisis mediante la adición de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (Sigma) hasta una concentración final de 1 mM. Las muestras se almacenaron durante una noche en hielo a 4ºC. Entonces se prepararon en un tampón de la muestra de 1x LDS (Invitrogen) y se calentaron a 70°C durante 10 minutos, antes de cargarse en un gel Bis-Tris NuPAGE al 10% (Invitrogen) bajo condiciones no reductoras a 200 V de voltaje constante durante 50 minutos en un tampón de corrido de 1x MOPS-SDS. Las proteínas se detectaron mediante tinción de plata.

Para medir la activación mediante tripsina, 5 g de proteína relacionada con la aerolisina (wt PA o MPP5) se incubaron en 20 mM de tampón HEPES (pH 7.4) que contenía 150 mM de NaCl y diversas cantidades de tripsina de tipo I (0-500 g de tripsina de acuerdo con una escala logarítmica) a 37 °C durante 10 minutos en un volumen total de 250 L. La reacción se detuvo mediante la adición de 5 L de 100 mM de PMSF en alcohol isopropílico seguida de enfriamiento en hielo. Una alícuota de 15 L de la mezcla de la reacción detenida se añadió a una cantidad igual de 2 x el tampón con la muestra de BioRad que contenía 0,5% de p-mercaptoetanol y se calentó a 95°C durante 5 minutos. La muestra se sometió a electroforesis en geles de Tris-HCI al 10% prefabricados utilizando un buffer de ejecución XT MOPS (BioRad Laboratories) a 200 V durante 30 minutos. Las proteínas se detectaron mediante tinción de plata.

Para medir la activación mediante uPA, 5 g de PA y MPP5 se incubaron por separado en 20 mM de tampón HEPES (pH 7.4) que contenía 150 mM de NaCl y 10-0,16 g de uPa a 37°C durante 4 minutos en un volumen total de 250 L. La reacción se detuvo mediante la adición de 5 L de 100 mM de PMSF en alcohol isopropílico seguida de enfriamiento en hielo. Una alícuota de 15 L de la mezcla de la reacción detenida se preparó en 1x tampón de la muestra (Invitrogen) que contenía 0,5% 2-mercaptoetanol y se calentó a 95°C durante 5 minutos. La muestra (100 ng) se sometió a electroforesis en geles Novex Bis-Tris NuPAGE al 10% prefabricados (Invitrogen) utilizando 1 x tampón de corrido de MOPS-SDS bajo condiciones de reducción a 200V durante 50 minutos. Las proteínas se detectaron mediante tinción de plata.

Para medir la activación mediante catepsina B, 5 g de PA y MPP5 se incubaron por separado en 20 mM de tampón HEPES (pH 7.4) que contenía 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 5 mM de L-cisteína y 24-0,375 unidades de catepsina B a 37°C durante 4 horas en un volumen total de 250 L. La reacción se detuvo mediante la adición de leupeptina a una concentración final de 2 M (método Sigma) seguida de enfriamiento en hielo. Una alícuota de 15 L de la mezcla de la reacción detenida se preparó en 1x tampón de la muestra (Invitrogen) que contenía 0,5% 2mercaptoetanol y se calentó a 95°C durante 5 minutos. La muestra (100 g) se sometió a electroforesis en geles Novex Bis-Tris NuPAGE al 10% prefabricados (Invitrogen) utilizando 1 x tampón de corrido de MOPS-SDS bajo condiciones de reducción a 200V durante 50 minutos. Las proteínas se detectaron mediante tinción de plata.

Para medir la activación mediante MMP-7, 5 g de PA y MPP5 se incubaron por separado en 20 mM de tampón HEPES (pH 7.4) que contenía 150 mM de NaCl, 10 mM de CaCl2 y 1,5-0,0234 g de MMP-7y 10-0,0234 a 37°C durante 3 horas en un volumen total de 250 L. La reacción se detuvo mediante la adición de 8,4 pL de 31 mM de 1,10-fenantroIina monohidrato (1 M final) en etanol seguida de enfriamiento en hielo. A 15 Una alícuota de 15 L de la mezcla de la reacción detenida se preparó en 1x tampón de la muestra (Invitrogen) que contenía 0,5% de 2mercaptoetanol y se calentó a 95°C durante 5 minutos. La muestra (100 ng) se sometió a electroforesis en geles Novex Bis-Tris NuPAGE al 10% prefabricados (Invitrogen) utilizando 1 x tampón de corrido de MOPS-SDS bajo condiciones de reducción a 200V durante 50 minutos. Las proteínas se detectaron mediante tinción de plata.

Para medir la activación mediante hKI, 5 g de hKl se activaron mediante 0,05 g de termolisina en un volumen final de 50 l de tampón de TCN (50 mM Tris, 10 mM CaC12, 0,15 M NaCI, pH 7.5), se incubaron a 37°C durante 1 hora y se inhibieron con 2,5 pi 200 mM 1,10-fenantroIina monohidrato en etanol al 95% (método de R&D Systems). Un g de PA y PSA-PAH 1 se incubaron por separado en 20 mM de tampón HEPES (pH 7.4) que contenía 150 mM de NaCI, 1 mM de EDTA, y 1-0,015625 g de hKI activado a 37°C durante 4 horas en un volumen total de 50 L. La reacción se detuvo mediante la adición de PMSF en alcohol isopropílico hasta una concentración final de 2 mM, seguida de enfriamiento en hielo. Una alícuota de 5 L de la mezcla de la reacción detenida se preparó en 1x tampón de la muestra (Invitrogen) que contenía 0,5% 2-mercaptoetanol y se calentó a 95°C durante 5 minutos. La muestra (100 g) se sometió a electroforesis en geles Novex Bis-Tris NuPAGE al 10% prefabricados (Invitrogen) utilizando 1 x tampón de corrido de MOPS-SDS bajo condiciones de reducción a 200V durante 50 minutos. Las proteínas se detectaron mediante tinción de plata.

Para medir la activación mediante hK2, 1 g de PA y MPP5 se incubaron por separado en 20 mM de tampón HEPES (pH 7.4) que contenía 150 mM de NaCl y 0,25-0,0039 g de hK2 a 37°C durante 1 hora en un volumen total de 50 L. La reacción se detuvo mediante la adición de PMSF en alcohol isopropílico hasta una concentración final de 2 mM, seguida de enfriamiento en hielo. Una alícuota de 10 L de la mezcla de la reacción detenida se preparó en 1x tampón de la muestra (Invitrogen) que contenía 0,5% 2-mercaptoetanol y se calentó a 95°C durante 5 minutos. La muestra (100 g) se sometió a electroforesis en geles Novex Bis-Tris NuPAGE al 10% prefabricados (Invitrogen) utilizando 1 x tampón de corrido de MOPS-SDS bajo condiciones de reducción a 200V durante 50 minutos. Las proteínas se detectaron mediante tinción de plata.

Los resultados de este estudio indicaron que los perfiles de sensibilidad entre MPP5 y proaerolisina (PA) son muy diferentes, ya que la proaerolisina natural (PA) es más sensible al rango de proteasas (salvo PSA) que la MPP5 (Tabla 15).

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Tabla 15: Resultados del estudio de sensibilidad a la proteasa in vitro

Nombre de la proteasa: Cantidad necesaria para un clivaje del 50% de las MPPS Cantidad necesaria para un clivaje del 50% de la proaerolisina natural Actividad específica para la MPP5 Actividad específica para la proaerolisina

Furina: > 3,2ng 1,2 ng 0,24 nM/g/min 9,69 nM/g/min

Tripsina: 813ng 9,5ng 5.700 nM/g /min 489.000 nM/g /min

Quimiotripsina: 31g 3,0 ng 150 nM/g /min 1550 nM/g /min

Trombina: > 12 g >12g <0,00000078 nM/g /min < 0,00000078 nM/g /min

MMP-7: Inactiva Inactiva 0 0

Catepsina B: 170 unidades 51,6 unidades 1,2 fmol/g /min 3,9 fmol/g /min

hKl: Inactiva 2,63 g 0 15,3 fmol/g min

hK2: Inactiva 0,1 g 0 1,61 pmol/g /min

Antígenoespecífico para la próstata (PSA), también denominado hK3: 12,2g 49,7g 0,0635 nM/g /min 0,0156nM/g/min

uPA: 173g 7,79 g 1,1 fmol/g/min 25,8 fmol/g/min

Nota: Las unidades comunicadas reflejan las registradas en los datos brutos.

EJEMPLO 11: BIODISTRIBUCIÓN DE MPP5 EN RATAS

Al objeto de establecer la biodistribución de MPP5 en la próstata y la potencial distribución en los tejidos circundantes tras una única dosis de administración intraprostática, se realizó un estudio de autorradiografía de cuerpo entero cuantitativo radiomarcado utilizando 125I-MPP5 en ratas macho Sprague-Dawley. La concentración de radioactividad (± S.D.) en la formulación de la dosis fue de 1,6 x 109 ± 44,02x 106 dpm/g (730.94 C/g). Basándose en la desviación estándar y el coeficiente de variación en torno al valor de concentración medio, la formulación de la dosis se consideró homogénea. La dosis media de 125I-MPP5 formulada, administrada mediante inyección en la glándula prostática, fue de 8,73 g/animal (5,86 Ci/animal en un volumen de 10 L).

Se tomaron muestras de alícuotas por duplicado de sangre (2 x 50 L) para el análisis de la radioactividad. La sangre se centrifugó a 3500 rpm y 4°C durante aproximadamente 10 minutos (en el plazo de 60 minutos desde la recogida) y se tomaron muestras de alícuotas por duplicado de plasma (2 x 50 L) para el análisis de la radioactividad. Las alícuotas ponderadas por duplicado de sangre completa se solubilizaron (Soluene-350) y decoloraron con peróxido de hidrógeno (30% w/v) antes de mezclarlas con un líquido de escintilación líquida para la medición de la radioactividad. Las alícuotas duplicadas de plasma se mezclaron directamente con el líquido de escintilación para la medición de la radioactividad.

Para la autorradioluminografía de cuerpo entero cuantitativa, los animales se ultracongelaron en una mezcla de hexano y hielo seco durante 20 minutos. Los animales se colocaron después, tumbados sobre el lado derecho, en un medio de CMC al 2%, utilizando un marco de congelación de acuerdo con los Procedimientos Operativos Estándar, al objeto de recoger secciones sagitales del cuerpo entero. Se realizaron 12 agujeros en cada bloque de CMC congelado al objeto de incorporar 10 soluciones estándar l25I y las dos soluciones para el control de calidad. La sangre con 14C o 125I fue insertada en cuatro agujeros perforados de cada bloque de CMC, que se utilizaron, cuando resultó necesario, como puntos de referencia para la identificación de estructuras que presentan un bajo nivel de radioactividad o bajo contraste. El bloque de cada espécimen animal se seccionó utilizando el criomicrótomo Leica CM 3600. 30 Se recogieron m secciones y se identificó el número de animal, punto del tiempo, número de sección, fecha de sección y posición de la cuchilla.

Los resultados indicaron que tras la administración de una única dosis intraprostática, la concentración de la radioactividad en la sangre y el plasma era baja, lo que sugiere una escasa absorción aparente tras la administración intraprostática. La máxima concentración de radioactividad (9,445 g Eq/g) se obtuvo en el primer punto del tiempo de muestreo (3 horas) desde el sitio de inyección prostático ventral derecho. También se observaron altos niveles de radioactividad en otros lóbulos de la próstata (lóbulos dorsal izquierdo y derecho, y ventral izquierdo), pero se redujeron con el paso del tiempo hasta el punto de muestreo final de 96 horas. En este punto de tiempo final, la concentración de radioactividad en la próstata fue baja para todas las áreas de la próstata salvo por el sitio de inyección de la próstata ventral derecho (0,268 g Eq/g). Aparte de la próstata, solamente la vejiga y la tiroides mostraron concentraciones de radioactividad superiores que la sangre o el plasma. Los niveles de radioactividad del tiroides (125I) aumentaron con el tiempo de 12 a 48 horas después de la dosis y permanecieron elevados hasta el punto de tiempo final, a las 96 horas después del tratamiento. La captura de 125I en el tiroides puede ser indicativo de una distribución libre de 125I en tiroides. Se obserbaron bajas concentraciones de radioactividad en la glándula adrenal (≤0,034 g Eq/g), el riñón (≤0,032 g Eq/g), el hígado (≤0,045 g Eq/g), el pulmón (≤0,041 g Eq/g) y el páncreas (≤0,022 g Eq/g). El cerebro mostró la concentración de radioactividad más baja (≤0,003 g Eq/g). Unos niveles extremadamente bajos de radioactividad se apreciaron en todos los demás órganos principales en todo momento, lo que sugiere que no se produjo una distribución sistémica significativa. Los niveles en tejidos frente al plasma aumentaron con el tiempo, lo que sugiere que la MPP5 fue eliminada más rápida del plasma que de los tejidos. Por tanto, este estudio de biodistribución sugiere que las MPP continúan en gran medida en el sitio de administración local, con solo una toxicidad y distribución periféricas limitadas a las células cercanas.

EJEMPLO 12: TOXICOCINÉTICA DE LAS MPP EN MONOS

La toxicocinética de la MPP5 también se estableció tras la administración intraprostática en machos sexualmente maduros de macacos cangrejeros tal y como se describe en el Ejemplo 7. A cuatro monos de cada grupo se les administró una dosis intraprostática con salino de control o 0,35, 4,14, o 25,79 g de MPP5/g de tejido prostático utilizando 2 x 25 L inyecciones (25 L/lóbulo). Las muestras de sangre se obtuvieron de todos los monos (16) antes de la dosis y 1, 2, 4, 8, 24, y 48 horas después de la dosis. Los resultados preliminares de este estudio también se describen en el Ejemplo 7. Lo siguiente representa los resultados toxicocinéticos finalizados de este estudio.

Las muestras del estudio se analizaron en busca de MPP5 utilizando un método ELISA validado. El límite inferior de cuantificación (LLOQ) del método ELISA fue de 5 ng/mL utilizando 50 L de suero en análisis duplicados. Se detectaron niveles sistémicos no apreciables de MPP5 tras la administración intraprostática. Un animal del Grupo 2 presentó concentraciones superiores al LLOQ (5 ng/mL) en todos los puntos de tiempo. Esto se consideró inusual en comparación con los animales del mismo grupo de dosis y todas las muestras de este animal se repitieron en un ensayo posterior para la confirmación. Todos los resultados originales se confirmados en el análisis repetido. Dado que la muestra previa a la dosis también era superior al LLOQ, se determinó que las concentraciones observadas en este animal se debían probablemente a la interferencia de la matriz y no estaban relacionadas con el tratamiento.

EJEMPLO 13: EVALUACIÓN DE LA MORFOLOGÍA DE LA PRÓSTATA DE LOS MONOS TRATADOS CON MPP5

Se realizaron otros análisis de secciones de la próstata de los monos recogidas en el estudio descrito en los Ejemplos 7 y 12. Se realizó una tinción con hematoxilina y eosina (H&E) para examinar la morfología de la próstata tratada, la tinción inmunohistoquímica para el PSA se realizó para examinar la distribución de PSA, y la tinción de MPPS se realizó al objeto de examinar la distribución de MPPS. A continuación se describen los protocolos utilizados.

Materiales y reactivos: 96 cortes transversales (6 por mono) de las secciones de la próstata de los monos tratadas con MPP5 y con el control fueron almacenados en un recipiente sellado a temperatura ambiente. Las secciones del tejido prostático de los monos a los que se le había administrado intraprostáticamente una dosis con el vehículo o 0.35, 4,1 o 25 g de MPP5/gramo de próstata se prepararon y tiñeron con H&E. Las secciones también fueron teñidas inmunohistoquímicamente para PSA y MPP5 de acuerdo con métodos conocidos en el campo.

Análisis de imágenes: Las secciones histológicas de la próstata de los monos fueron evaluadas utilizando un objetivo de 1,25 X. Se utilizó el paquete de software Metamorph™ (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) para perfilar el área total de la glándula prostática y el área total de la lesión inducida por la MPP5. Este software proporciona el área total como un número de píxeles. Se colocó un cuadrado de 1 x 1 cm en cada corte transversal como estándar para determinar el número de píxeles/cm2. El área de daños de cada dosis de MPP5 se determinó posteriormente y se convirtió a cm2 de daños. El área porcentual de daños se determinó por el ratio de área lesionada/área total de la prósta multiplicado por 100.

El análisis de la próstata del mono de control (normal) demostró que la próstata del macaco cangrejero es similar a la próstata humana en términos de morfología glandular, y la distribución de PSA se limita a las células epiteliales columnares que revisten los conductos. La glándula prostática del mono, como en el humano, rodea la uretra. Por tanto, la próstata del mono representa el mejor modelo animal disponible para estudiar la activación y toxicidad de la toxina de la proteína activada por PSA. MPP5, cuando se inyecta intraprostáticamente.

La caracterización morfológica del tejido prostático y la distribución de PSA y MPP5 en las próstatas de este estudio demostraron una respuesta a la dosis en el área/porcentaje de daños de la próstata desde dosis de 0,35 a 4,14 g/g de próstata; no obstante, no se produjo ningún incremento significativo de 4,14 a 25,79 g/g de próstata (Tabla 15). El área de daños calculados más grande se observó en monos que recibían una dosis de 4,14 g/g de próstata, en la que una única inyección de 25 L por lóbulo dañó aproximadamente el 50% de la glándula total. Los resultados

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sugieren que el daño máximo puede estar limitado por la distribución total del volumen de la inyección de 25 L por lóbulo de la próstata.

En las zonas tratadas donde la MPP5 indujo un infarto significativo del tejido glandular normal, la tinción de PSA se redujo de forma marcada, mientras que, en las zonas adyacentes no lesionadas de la próstata, la tinción de PSA fue normal en términos de distribución y grado. Estos resultados sugieren que el hecho de que la MPP5 mate células epiteliales columnares dentro de la glándula elimina la producción de PSA. Los resultados también demostraron que la distribución de MPP5 se solapó con el área del infarto en los niveles de dosis medio y alto, tal y como se muestra en la Figura 38. En un plazo de 15 días después de la dosis, no se observó ningún resto de MPP5 en un nivel de dosis medio. Por otra parte, la MPP5 no pareció penetrar en la cápsula prostática en ninguna de las secciones evaluadas en este estudio.

Tabla 15: Área y porcentaje de daños prostáticos 1 de la MPP5

Dosis: 0,35 g/g de próstata 4,14 g/g de próstata 25,79 g/g de próstata

Área (cm2): Porcentaje Área (cm2) Porcentaje Área (cm2) Porcentaje

0,33: 20,2 0,78 46,6 0,57 63,4

0,36: 30,2 0,87 47,9 0,32 23,2

0,20: 13,8 0,89 54,9 0,51 41,0

0,46: 36,8 1,23 56,6 0,47 51,0

Media (± desviación estándar): 0,33 ±0,11 25,3 ±5,9 0,94 ± 0,20 51,5 ±2,9 0,47 ±0,11 44,7 ±9,8

1 Daño (área/porcentaje de la glándula total) tras la inyección de 25 pL por lóbulo

En las áreas tratadas donde la MPP5 indujo un infarto significativo del tejido glandular normal, la tinción con PSA se redujo de forma marcada. En las áreas no lesionadas adyacentes, la tinción con PSA fue normal por lo que respecta a la distribución y el grado. Estos resultados sugieren que el hecho de que la MPP5 mate células epiteliales columnares dentro de la glándula elimina la producción de PSA. No obstante, la MPP5 no altera la producción de PSA en las zonas no lesionadas ni selecciona las células epiteliales que producen niveles más bajos de PSA. No se observó ninguna tinción de PSA en el manguito muscular que rodea la uretra. Esta falta de PSA presente en el tejido uretral puede explicar en parte la falta de cualquier lesión importante en la uretra. De este modo, una inyección de pequeño volumen (25 L) de MPP5 en un único lóbulo de la próstata puede producir un infarto importante de un área importante de tejido glandular que produce PSA en la próstata del mono normal, sin ocasionar lesiones significativas en las estructuras no productoras de PSA (como la uretra).

EJEMPLO 14: TOXICIDAD DE LAS MPP5 EN PERROS

Se realizó un estudio toxicológico piloto en perros beagle machos al objeto de establecer la potencial toxicidad intraprostática directa y la MTD tras una única dosis intraprostática de MPP5. La MPP5 se administró a perros beagle machos (1/grupo) a través de una inyección intraprostática (lóbulo izquierdo) de 0, 50, 107, 200, o 400 g en un volumen de dosis de 100 L (basándose en el peso prostático, estas dosis fueron equivalentes a 0, 22, 24.4, 40, y 72.2 g/g de próstata, respectivamente). Los animales se observaron durante una semana después de la dosis. No se produjo mortalidad ni efectos relacionados con el tratamiento sobre las observaciones clínicas, el peso corporal, el consumo de alimentos ni la patología clínica. No se produjo ningún efecto aparente relacionado con la MPP5 sobre el peso prostático. Los cambios patológicos brutos se identificaron en el lóbulo izquierdo de la próstata y en la grasa abdominal adyacente y consistían en zonas oscuras de la próstata que se extendían hacia el parenquima prostático. Las adherencias y/o áreas oscuras en la grasa abdominal estuvieron asociadas con los efectos relacionados con la MPP5 observados dentro de la próstata. En el perro tratado con 400 g, las áreas oscuras eran más numerosas y el lóbulo izquierdo de la próstata se agrandó. Los aumentos de la gravedad de estos cambios patológicos se consideraron atribuibles al efecto farmacológico previsto de la MPP5. No parecía existir ninguna toxicidad extraprostática significativa. En general, los cambios macroscópicos aparentes relacionados con el tratamiento se observaron en la próstata, con efectos asociados limitados sobre el tejido graso abdominal adyacente

o circundante, con un incremento de la gravedad en el nivel de 400 g.

La próstata del perro mantiene similitudes estructurales con la próstata humana, incluyendo una estructura de dos lóbulos, la naturaleza de los conductos acinares y la existencia de abundante estroma (Wientjes et al, 2005). A pesar de que el hombre posee una fracción más elevada de tejido estromal que la glándula prostática del perro, no se sabe con certeza hasta qué punto la arquitectura de las particiones fibrosas, y la sangre y los patrones de drenaje linfático, difieren en la próstata del perro y la del hombre. No obstante, el perro ha demostrado anteriormente ser un modelo útil para estudiar los efectos de la inyección intraprostática (Rosser et al, 2004). No obstante, en el caso de la MPP5, los perros beagle no parecieron abiertamente sensibles a los efectos citolíticos de este compuesto. Esto se atribuye probablemente a una falta de expresión de PSA en perros (u otras enzimas no específicas capaces del clivaje de MPP5). El modelo canino demuestra que en ausencia de PSA, la MPP5 no se activa a dosis extremadamente elevadas, lo que demuestra la seguridad del profármaco no activado. Por lo contrario, se sabe que las ratas y los primates no humanos expresan una calicreína similar al PSA y PSA, respectivamente, por lo que han demostrado ser sensibles incluso a concentraciones bajas de MPP5. Por tanto, a pesar de que la próstata del perro es anatómicamente similar a la próstata humana, no parece mostrar una relación funcional con la glándula humana en términos de activación de MPP5 y, por tanto, el perro ya no se utilizó más como modelo toxicológico para la MPP5. No obstante, el estudio del perro sirvió para demostrar que la MPP5 parece ser farmacológicamente inactiva cuando no se somete a clivación con PSA, ofreciendo la garantía de que la MPP5 no produciría una toxicidad significativa si se encontrase en tejidos no productores de PSA.

EJEMPLO 15: TOXICIDAD DE LAS MPP5 EN MONOS

Al objeto de establecer la toxicidad de la MPP5 en una especie no roedora productora de PSA endógena, se realizó un estudio de toxicidad intraprostática en macacos cangrejeros macho (4/grupo) a los que se les inyectaron 0,35, 4,14, o 25,79 ng de MPP5/g de tejido prostático, tal y como se describe en el Ejemplo 7. Se administraron dos inyecciones perineales, una en cada lóbulo de la próstata (25 L/lóbulo) Los resultados preliminares de este estudio se muestran en el Ejemplo 7. A continuación se recoge una descripción de los resultados finalizados.

Tras una administración intraprostática directa y un período de observación de 2 o 14 días, la toxicidad asociada con la MPP5 se limitó a la próstata, con escasos daños en los tejidos circundantes u otros efectos sistémicos manifiestos. Los resultados del análisis de sangre indicaron que los macacos cangrejeros macho expresan niveles detectables de PSA y que la administración intraprostática de MPP5 libera cantidades significativas de PSA en la sangre/el suero. Los niveles de PSA regresaron prácticamente a los niveles de partida 10 días después del tratamiento. No se observó ningún efecto relacionado con el tratamiento a ningún nivel de dosis sobre las evaluaciones de los signos clínicos, el peso corporal, la condición oftálmica, el urinálisis o electrocardiograma. Las valoraciones de la química sérica y hematología revelaron una respuesta inflamatoria y celular transitoria. Las respuestas inmunológicas de fase aguda transitorias se observaron en todos los grupos del Estudio en el Día 3 y se atribuyeron a la inflamación asociada con el procedimiento quirúrgico y la inflamación localizada en la próstata. Los aumentos de las proteínas C-reactivas (CRP) observados el Día 3 estaban generalmente relacionados con la dosis y eran coherentes con el grado de inflamación de las células mixtas y de necrosis de la próstata observadas microscópicamente.

Los cambios patológicos brutos y microscópicos se observaron en las glándulas prostáticas a todos los niveles de dosis de MPP5 el Día 3. Estos cambios se caracterizaron por necrosis, hemorragia e infiltrados de células mixtas, y fueron más severos en animales que recibieron MPP5 a las dosis media y elevada. Los monos del grupo de dosis baja también presentaron cambios histológicos el Día 3 que fueron coherentes con la reparación, incluyendo la hiperplasia regenerativa y la metaplasia escamosa en los tejidos epiteliales y fibroplastia en tejidos intersticiales (mesenquimales). La reparación en los grupos de dosis media y alta fue mínima o inexistente el Día 3; para el Día 15 la necrosis se había resuelto y la reparación estaba en marcha en el grupo de dosis baja. En los grupos de dosis media y alta, la necrosis estaba en marcha el Día 15 y los cambios coherentes con la reparación se limitaron a los márgenes de las lesiones necróticas. Por lo contrario, no se produjeron cambios en los tejidos periprostáticos o sistémicos atribuibles a la MPP5 en el Día 3 ni en el Día 15.

EJEMPLO 16: RESPUESTA INMUNOLÓGICA A LA MPP5 EN MONOS

También se evaluó el potencial de respuesta inmunológica a la MPP5. Los animales fueron tratados con MPP5 como se describe en el Ejemplo 7. El potencial de respuesta inmunológica a la MPP5 se determinó como sigue.

Los grupos de monos recibieron la administración de diversas dosis de MPP5 directamente en la próstata de acuerdo con la siguiente tabla. Se tomaron muestras de suero (aproximadamente 0,5 mL) de los animales antes del día de la inyección y también el día 14 después de la inyección. El suero se almacenó a 70ºC bajo cero hasta el ensayo. La respuesta de la inmunoglobulina se midió mediante un ensayo ELISA como se ha descrito por separado. Brevemente, la proaerolisina (0,5 g/mL en solución salina fosfatada) se unió a una placa de EIA mediante revestimiento durante una noche a 4ºC. La unión no específica se inhibió mediante un revestimiento con BSA al 5% (Sigma) a temperatura ambiente. Se utilizó una serie de diluciones de factor 10 (1:100 – 1: 1.000.000) de suero de mono normal agrupado por cuadriplicado para formar una curva de comparación para la determinación del título en muestras de suero de los animales tomadas en diversos momentos tras la administración de MPP5. Las muestras de suero de los monos tratados con MPP5 se sometieron a diluciones de factor 10 (1:100 - 1:1.000.000) para proporcionar concentraciones con el suero normal. La IgG de cabra anti-rata conjugada con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch) se unió al anticuerpo que estaba ligado al pozo revestido con proaerolisina. El color se desarrolló mediante la adición de sustrato de peroxidasa OPD de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La absorbancia a 490 nm se midió en un lector de microplacas de Molecular Dynamics VERSAmax. El título se definió como la dilución por encima de la que la lectura de absorbancia era inferior que la del suero agrupado normal + 2 desviaciones estándar para la misma dilución.

Antes de la administración de MPP5, todos los monos salvo uno de los animales de control del vehículo no presentaban ningún título detectable. El animal de control parece haber estado expuesto a un inmunogen antes del estudio, dado que la aparición de un pequeño título se confirmó en la muestra del día 14 y se reconfirmó mediante un segundo ensayo. Uno de los dos animales que recibió 1 g/g de MPP5 presentó un título. De igual modo, uno de los dos animales que recibieron 5 g/g de MPP5 presentaron un título. Los dos animales que recibieron 25 g/g de MPP5 presentaron un título.

Los títulos para cada animal en las muestras de sangre previa y posterior a la administración se recogen en la Tabla

5 16.

Tabla 16: Títulos de anticuerpos en monos tras la administración de MPP5

Grupo: Mono Dosis (|jg/g Vía de Título de anticuerpos

de próstata): administración Día 1 Día 14

1: 6001 0 IP 1:1000* 1:1000'

1: 8001 0 IP < 1: 100 < 1:100

2: 6003 1 IP < 1:100 1:10,000

2: 7002 1 IP < 1:100 • < 1:100

3: 6005 5 IP < 1:100 1:10.000

3: 8002 5 IP < 1:100 1:100

4: 6007 25 IP < 1:100 1:10.000

4: 8003 25 IP < 1:100 1:10.000

* Este animal presentaba el mismo pequeño título antes de la administración.

La Figura 39 demuestra el título de anticuerpos en monos tras la administración de MPP5. Ninguno de los títulos fue superior a 104. Esto sugiere que la administración intraprostática de MPP5 no provoca una fuerte respuesta

10 inmunológica. No obstante, 4 de 6 animales tratados presentaron un título por encima del suero agrupado.

Los títulos de anticuerpos se observaron en uno de los dos monos tratados con 0,35 o 4,14 g/g de próstata y en los dos animales que recibieron 25,79 g/g de próstata presentaron un título. Así, la administración de MPP5 indujo una respuesta inmunológica de bajo título, aunque detectable, en algunos monos.

Basándose en las conclusiones de los Ejemplos 11, 12 y 15, no se produjo ninguna indicación de toxicidad

15 extraprostática en ningún nivel de dosis; por tanto, el NOAEL sistémico fue la máxima dosis de MPP5 testada, 25,79 g/g de próstata (basándose en el peso prostático real). Los efectos observados en la próstata fueron tanto dependientes de la dosis como previstos, basándose en el mecanismo de acción conocido de la MPP5. Los efectos en la próstata se observaron a todos los niveles de dosis, incluyendo la dosis mínima testada, de 0,35 g/g de próstata, que dañó aproximadamente el 25% de la próstata. Por tanto, el nivel más bajo con efecto adverso

20 observado (LOAEL) para los efectos prostáticos locales fue de 0,35 g/g de próstata en este estudio.

Los ejemplos anteriores describen la investigación del metabolismo del fármaco y la toxicocinética de la MPP5 tras la administración intravenosa o intraprostática en ratones albinos macho y tras la inyección intraprostática en primates no humanos. Un resumen de los estudios no clínicos del metabolismo del fármaco y la farmacocinética (DMPK) realizados con MPP5 se presenta en la Tabla 17.

25 Tabla 17: Lista de estudios no clínicos del metabolismo del fármaco y farmacocinéticos realizados con la MPP5

Título del estudio: Resultados

Un estudio de la toxicidad aguda de la inyección de un bolo intravenoso o intraprostático de MPP5 en ratón albino (con un período de observación de 1, 14 o 28 Días) [Ejemplo 6]: Datos toxicocinéticos proporcionados tras una única inyección intraprostática (2, 10, or 25 g) o intravenosa (25 g).La MPP5 no fue detectable tras la inyección intraprostática de 2 g. Cmax aumentó con el incremento de la dosis a 10 y 25 g; no obstante, la AUC a 10 g fue el doble que a 25 g. Tras la inyección IV, tmax fue 0 (inmediato).

Distribución del tejido de radioactividad en ratas macho Sprague-Dawley tras una única inyección de 1251-MPP5 en la glándula prostática (Ejemplo 11]: Se demostró que la MPP5 tenía una limitada distribución/biodisponibilidad sistémica tras la administración intraprostática y una distribución no homogénea en toda la próstata.

MPP5: Un estudio de dos: Demostró la inexistencia de exposición sistémica tras la inyección

semanas sobre la toxicidad: intraprostática (1, 5, o 25 g/g de próstata). Todas las concentraciones

aguda intraprostática en: en suero estuvieron por debajo del LLOQ (5.00 ng/mL), con excepción

machos sexualmente maduros: de un animal de baja dosis que presentaba concentraciones superiores

de macaco cangrejero: al LLOQ en todos los puntos de tiempo, incluso antes de la dosis.

imagen1

EJEMPLO 17: SELECCIÓN DE LA DOSIS Y MÉTODO DE ADMINISTRACIÓN DE LA MPP5 EN ENSAYOS CLÍNICOS PARA LA HPB

Un ejemplo de base lógica para la selección de una dosis inicial para los ensayos clínicos de la MPP5 en la HPB se describe a continuación. También se describe un ejemplo de método de administración de la MPP5.

Basándose en la expresión de PSA y en las similitudes fisiológicas entre la próstata del macaco cangrejero y la próstata humana, los estudios de una única dosis en monos descritos en el presente se seleccionan como base para calcular una dosis inicial intraprostática segura en humanos. El perro no fue sensible a los efectos de la MPP5 en comparación con las ratas y los monos; de este modo, el perro no se considera un modelo apropiado para el cálculo de la dosis inicial segura de la MPP5. Los datos de los estudios con ratas descritos en el presente sugieren que, a pesar del hecho de que la rata no tiene el gen que codifica el PSA, la MPP5 es igualmente activada por una calicreína S3 similar al PSA, identificada en la próstata ventral de la rata (Onozawa et al, 2001).

La dosis de inicio de MPPS en un ensayo clínico de la HPB se selecciona del rango de 0,03 g/g a 0,25 g/g de próstata. Una potencial dosis de inicio se fija a 0,03 g/g de próstata, basándose en la aplicación de un criterio de seguridad de factor 10 a la dosis más baja testada en el estudio de una única dosis en monos (0,35 g/g de próstata). En los monos que recibieron la dosis de 0,35 g/g de próstata, no se observó ninguna toxicidad sistémica, mientras que se advirtieron cambios locales en la glándula prostática. A pesar de que las tres dosis presentaron una ablación local del tejido prostático, las dosis media y superior demostraron las alteraciones más marcadas y la inexistencia de cicatrización 14 días después de la inyección. Se concluyó que la dosis más baja (0,35 g/g de tejido prostático) ofrecía la útil combinación terapéutica de no presentar efectos sistémicos, ni en análisis histológicos ni en análisis de laboratorio, y tener un efecto prostático local limitado aunque claramente observable con una ablación de la próstata aproximadamente del 25%. Esta se consideró una dosis segura en el mono. Utilizando estos datos, se aplica un criterio de seguridad de factor 10 como mínimo y se selecciona una dosis de inicio de 0,03 g de MPPS por gramo de próstata humana, para el primer cohorte del ensayo de la HPB.

Un ejemplo de un método de administración de la MPP5 en los ensayos de la HPB es la habitual vía de administración transuretral, con solamente 4 inyecciones por dosis (dos inyecciones en cada lóbulo lateral). Para orientarse durante la inyección, por ejemplo, se pueden utilizar ultrasonidos transrectales, siendo el volumen total a administrar en el ensayo de la HPB de 50 L/gramo de próstata. Para reducir el reflujo durante la inyección, por ejemplo, se puede utilizar una formulación viscosa o gel.

A pesar de que la invención ha sido descrita con referencia a determinadas realizaciones específicas, diversas modificaciones de la misma resultarán evidentes para las personas con conocimientos en el campo, sin apartarse del ámbito de aplicación de la invención, definido en las reivindicaciones adjuntas al presente.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Protox Therapeutics Incorporated BUCKLEY, James Thomas

<120> Método para tratar o prevenir la hiperplasia prostática benigna utilizando proteínas formadoras de poros

<130> 1436-104PCT 5 <140> PCT/CA2006/000971

<141> 2006-06-14

<150> 60/690,269

<151> 2005-06-14

<160> 74 10 <170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

<210> 1

<211> 1410

<212> ADN

<213> Aeromonas hydrophila 15 <220>

<221> CDS

<222> (1)...(1410)

imagen2

<210> 3

<211> 1410

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<221> CDS

<222> (1)…..(1410)

10

<223> Proaerolisina con una secuencia de PSA sustituida para el sitio de furina.

imagen2

<210> 7

<211> 470

<212> Secuencia artificial

<220>

<223> Proaerolisina con una secuencia de PSA sustituida para el sitio de furina

imagen3

imagen2

<210> 8 5 <211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Sitio de clivaje de PSA

imagen2

<210> 9

<211> 1410

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proaerolisina con una secuencia de PSA sustituida para el sitio de furina

imagen2

<210> 10

<211> 470 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

10

imagen2

<210> 10

<211> 470 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

10

imagen2

<210> 11

<211> 6 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de PSA

10

imagen2

<210> 12

<211> 6

<212>: ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<210> 13

<211> 470

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 81

<220>

<210> 14

<211> 7 83

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de PSA

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 21

<211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 23

<211> 10

<212>: PRT 20 <213> Secuencia artificial

20

imagen2

imagen4

imagen2

imagen3

imagen2

<220>

<223> Secuencia de la variante de LHRH

25 <221> SITIO

<222> (1)…(1)

<223> Glu es un piroglutamato

<221> SITIO 30 <222> (6)…(6)

<223> Lys es un D-Lys

imagen2

<210> 24 35 <211> 397

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 40 <223> Péptido de proaerolisina de la variante

<221> SITIO

<222> (1)…(1)

<223> piroglutamato

<221> SITIO

<222> (6)…..(6)

<223> D-Lys

imagen2

<210> 25

<211> 397

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<230> Péptido de proaerolisina de la variante.

10 <221> SITIO

<222> (1)…(1)

<223> piroglutamato

<221> SITIO 15 <222> (6)….(6)

<223> D-Lys <210> 26

imagen2

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 26 Gctgccaatc aacatcatca ttaacggcag cgc

<210> 27

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 27 gcgctgccgt taatgatgat gttgattggc agc

<210>28

<211> 39

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 28 Gccaatcaac atcatcatca tcatcattaa cggcagcgc

5 <210> 29

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> Cebador

<400> 29 gccaatcaac atcatcatca tcatcattaa cggcagcgc

15

<210> 30

<211> 1762

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20

<220>

<223> Proaerolisina con una secuencia de PSA sustituida para el sitio de furina y una etiqueta de histidina.

imagen5

<210> 31 30 <211> 476

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

imagen2

<210> 32

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

imagen2

<210> 33

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

imagen2

<210> 34

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

imagen2

<210> 35

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

imagen2

<210> 36

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

imagen2

<210> 37

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400> 37 Ala Phe Arg

<210> 38

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400> 38 Ala Gln Arg 1

<210> 39

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400> 39 Ala Lys Arg 1

<210> 40

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400> 40 Ala Arg Lys 1

<210> 41

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400> 41 Ala His Arg 1

<210> 42

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400> 42 Gln Lys Arg Arg 1

<210> 43

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400> 43 Lys Ser Arg Arg 1

<210> 44

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de hk2

<400> 44 Ala Lys Arg Arg 1

<210> 45

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400> 45 Lys Lys Arg Arg 1

<210> 46

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400> 46 His Lys Arg Arg 1

<210> 47

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400> 47 Lys Ala Phe Arg 1

<210> 48

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400> 48 Lys Ala Gln Arg 1

<210> 49

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400> 49 Lys Ala Lys Arg 1

<210> 50

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400>50 Lys Ala Arg Lys 1

<210> 51

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400>51 Lys Ala His Arg 1

<210> 52

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2 <400>52 Lys Arg Arg Leu 1

<210> 53

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400>53 Ser Arg Arg Leu 1

<210> 54

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400>54 Ala Arg Arg Leu 1

<210> 55

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400>55 Ala Arg Arg Ser 1

<210> 56

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400>56 His Arg Arg Ala 1

<210> 57

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400>57 Gln Arg Arg Leu 1

<210> 58

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400>58 Ala Phe Arg Leu 1

<210> 59

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400>59 Ala Gln Arg Leu 1

<210> 60

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400>60 Ala Lys Arg Leu 1

<210> 61

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400>61 Ala Arg Lys Leu 1

<210> 62

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400>62 Ala His Arg Leu 1

<210> 63

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400>63 His Ala Gln Lys Arg Arg Leu 1 5

<210> 64

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400>64 Gly Gly Lys Ser Arg Arg Leu 1 5

<210> 65

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

<400>65 His Glu Gln Lys Arg Arg Leu 1 5

<210> 66

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

imagen2

<210> 67

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

imagen2

<210> 68

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

imagen2

<210> 69

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

imagen2

<210> 70

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

imagen2

<210> 71

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

imagen2

<210> 72

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sitio de clivaje de HK2

imagen2

<210> 73

<211> 1542

<212> ADN

<213> Clostridium septicum

<400> 73

imagen2

<210> 74

<211> 443

<212> PRT

<213> Clostridium septicum

imagen2

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Una proteína formadora de poros modificada para utilizarla en el tratamiento de la hiperplasia prostática benigna (HPB), obteniendo dicha proteína formadora de poros modificada de una proteína de proaerolisina formadora de poros naturalmente presente y que comprende una o más modificaciones selectivas para la próstata seleccionadas de una secuencia de activación clivable por una proteasa específica para la próstata, y uno o más dominios diana específicos para la próstata capaces de dirigirse selectivamente a las células prostáticas, donde dicha proteína formadora de poros modificada es capaz de matar selectivamente las células prostáticas.
2.

La proteína formadora de poros modificada de acuerdo con la reivindicación 1, cuando dicha proteína formadora de poros modificada se vaya a utilizar en combinación con uno ó más tratamientos para la hiperplasia protática benigna.
3.

La proteína formadora de poros modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, cuando la proteína formadora de poros naturalmente presente sea la proaerolisina de Aeromonas hydrophila.
4.

La proteína formadora de poros modificada, de acuerdo con la reivindicación 3, cuando la proteína formadora de poros modificada comprenda la secuencia de aminoácidos recogida en la SEC. ID. Nº 31.
5.

La proteína formadora de poros modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, cuando dicha proteína formadora de poros modificada comprenda una secuencia de activación que se pueda someter a clivaje con una proteasa específica para la próstata.
6.

La proteína formadora de poros modificada de acuerdo con la reivindicación 5, cuando dicha proteína formadora de poros modificada comprenda un dominio diana específico para la próstata.
7.

La proteína formadora de poros modificada de acuerdo con la reivindicación 6, cuando dicha proteína formadora de poros comprenda una secuencia de activación que se pueda someter a clivaje con una proteasa específica de la próstata, y uno o más dominios diana específicos para la próstata.
8.

La proteína formadora de poros de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, cuando dicha secuencia de activación que se puede someter a clivaje con una proteasa específica para la próstata sustituya funcionalmente una secuencia de activación natural de la mencionada proteína formadora de poros naturalmente presente.
9.

La proteína formadora de poros modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, cuando dicha proteasa específica para la próstata sea un antígeno específico para la próstata (PSA), un antígeno prostático específico de membrana (PSMA) o una calicreína glandular humana 2 (hK2).
10.

La proteína formadora de poros modificada de acuerdo con la reivindicación 9, cuando dicha proteasa específica para la próstata sea un antígeno específico para la próstata (PSA).
11.

La proteína formadora de poros modificada de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, cuando dicho dominio diana específico para la próstata sea la hormona que libera a la hormona luteinizante (LHRH) o un anticuerpo para el antígeno prostático específico de membrana.
12.

La proteína formadora de poros modificada de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, cuando la mencionada proteína formadora de poros modificada comprenda también una o más mutaciones en un dominio de unión de dicha proteína formadora de poros naturalmente presente.
13.

La proteína formadora de poros modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, cuando dicha proteína formadora de poros modificada comprenda también una etiqueta de afinidad.
14.

La proteína formadora de poros modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, cuando dicha proteína formadora de poros modificada esté formulada para la administración intraprostática.
15.

La proteína formadora de poros modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, cuando dicha proteína formadora de poros modificada esté formulada para la administración intravenosa.
16.

La proteína formadora de poros modificada de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, cuando la mencionada proteína formadora de poros modificada comprenda también una o más mutaciones en un dominio de unión del lóbulo grande de la proaerolisina.
17.

La proteína formadora de poros modificada, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, cuando la 5 proteína formadora de poros modificada comprenda la secuencia de aminoácidos recogida en la SEC. ID. Nº 4.
18. La proteína formadora de poros modificada de acuerdo con la reivindicación 17, cuando dicha mutación o más mutaciones se seleccionen de una mutación en la posición Y162, una mutación en la posición W324, una mutación en la posición R323, una mutación en la posición R336, y una mutación en la posición W127.
19.

La proteína formadora de poros modificada de acuerdo con la reivindicación 8, cuando al menos una mutación 10 es R336A.
20. El uso de la proteína formadora de poros modificada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 anteriores en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la hiperplasia prostática benigna (HPB).