KR101365538B1

KR101365538B1 - 변형된 포어 형성 단백질을 이용하여 양성 전립선 비대를치료하거나 예방하는 방법

Info

Publication number: KR101365538B1
Application number: KR1020087001038A
Authority: KR
Inventors: 제임스 토마스 버클리
Original assignee: 프로톡스 테라페유틱 인코포레이티드
Priority date: 2005-06-14
Filing date: 2006-06-14
Publication date: 2014-02-21
Also published as: JP2008546650A; AU2006257664A1; NZ564954A; CN101238145A; IL188143A; DK1891093T3; IL188143A0; CA2611839C; JP5220594B2; KR20080042067A; CA2611839A1; ATE502954T1; US8916161B2; CN101238145B; US20100233191A1; ES2366380T3; DE602006020867D1; US9950029B2; ZA200710813B; AU2006257664B2

Abstract

본 발명은 변형된 포어 형성 단백질 (MPP)를 이용하여 BPH를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 MPP는 세포막에 포어 또는 채널을 형성시켜 세포를 사멸시키는 자연 발생 세포독성 단백질 (nPP)로부터 유래된다. MPP는 nPP의 변형에 의해 생성되어, 정상적인 전립선 세포에서 선택적으로 활성화될 수 있다. 이러한 변형은 활성화 서열로의 전립선 특이적 프로테아제 절단 부위의 첨가 및/또는 전립선 세포의 선택적 표적화를 가능케 하는 전립선 특이적 표적화 도메인의 첨가를 포함한다. 이러한 MPP는 정상적인 전립선 세포를 생체 내에서 선택적으로 표적화하고 사멸시킬 수 있다. MPP는 BPH의 치료를 위해 단독으로 또는 기타 요법과 함께 사용될 수 있다.

Description

변형된 포어 형성 단백질을 이용하여 양성 전립선 비대를 치료하거나 예방하는 방법{METHOD OF TREATING OR PREVENTING BENIGN PROSTATIC HYPERPLASIA USING MODIFIED PORE-FORMING PROTEINS}

본 발명은 전립선비대의 분야 및 특히 전립선 비대(benign prostatic hyperplasia: BPH)의 치료를 위한 변형된 포어 형성 단백질의 사용에 관한 것이다.

많은 세포용해성 단백질은 [Lesieur et al. MoI. Membr. Biol. 14:45064, 1997]에 기재되어 있다. 이 천연발생 세포독성 단백질은 포유류의 단백질 예를 들어 퍼포린, 및 세균의 단백질 예를 들어 에어로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila)에 의해 생성되는 에어로라이신(aerolysin), 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 의해 생성되는 α-헤몰리신(hemolysin), 클로스트리듐 셉티컴(Clostridium septicum)에 의해 생성되는 알파 독소(alpha toxin), 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis)에 의해 생성되는 δ-독소, 탄저병(anthrax) 보호성 항원, 비브리오 콜레라 VCC 독소, 스태필로코쿠스 류코시딘(Staphylococcus leucocidins), 래티포러스 설퍼레우스(Laetiporus sulphureus) 로부터의 LSL 독소, 클로스트리듐 퍼프린젠(Clostridium perfringens)으로부터의 엡실론 독소, 및 자포동물 종(Cnidaria spp .)에 의해 생성되는 하이드랄리신(hydralysins)을 포함한다.

이 세포독성 단백질들 중 몇몇, 예를 들어 프로에어로라이신 및 알파 독소는 불활성 전독소(protoxin)로서 합성된다. 이 전독소는 구별된 기능들을 포함하는데 이들은 전독소의 세포와의 결합을 가능하게 하는 결합 도메인, 독소 도메인 및 단백질 분해 효소 분열 부위를 포함하는 N-말단 또는 C-말단 억제 펩티드 도메인을 포함한다. 단백질 분해 효소 분열 부위에서의 억제 펩티드 영역의 분열은 전독소의 활성화를 야기하며, 원형질막에서의 세포독소의 올리고머화를 이끌고, 빠른 세포용해성 세포 사멸을 이끄는 포어를 생성한다[Rossjohn et al. J. Struct. Biol. 121:92-100, 1998]. 포어 형성은 물리적으로 세포 막을 방해하고, 비-증식 세포(다시 말해 G₀ 정지상태)를 포함하는, 세포 주기의 모든 단계에서 세포의 사멸의 결과를 야기한다. 이 세포독소는 이들이 치사시킬 수 있는 세포의 타입에 특이적이지 않으며, 이들의 결합 영역이 대부분의 세포에서 발견되는 분자들을 표적하기 때문이고, 이들은 일반적으로 세포 특이적이지 않은 단백질 분해 효소에 의해 활성화된다.

세포용해성 포어 형성 단백질 또는 이 단백질들의 변형된 버전은 암의 치료를 위한 잠재적 치료학으로서 제안되었다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,777,078호는 세포를 용해(lyse)시키기 위해, 단백질 분해를 포함하는, 다수의 조건에 의한 세포의 표면에서 활성되는 포어 형성 작용제를 기재하고 있다. 이 포어 형성 작용제는 동물에서 병리 조건과 관련되는 원하지 않는 세포들을 파괴하기 위해 일반적으로 사용될 수 있다. 이러한 세포들은 제한되지는 않지만 종양 세포, 바이러스에 만성적으로 감염된 세포, 또는 부적당하게 조절되거나 발현되는 경우에 질병 상태를 야기하는 세포, 예를 들어 면역 시스템의 세포를 포함한다. WO 98/020135은 선택성 독성을 위해 변형된 녹농균( Pseudomonas ) 외독소 전단백질(proprotein)에 관련된 조성물 및 방법을 기재하고 있다. 외독소는 변형되어 전단백질에서 단백질 분해 효소 민감성 서열의 삽입에 의해 바람직한 단백질 분해 효소에 의해 활성화된다. 한 예에서, 외독소는 프로스테이트 전립선 암 세포를 표적하고 죽이는 목적을 위해 전립선 특이적 항원(prostate specific antigen: PSA) 분열 부위를 삽입하기 위해 변형된다.

미국 특허 출원 제 2004/0235095호는 전립선 및 다른 암의 치료를 위한 변형된 세포용해성 포어 형성 단백질의 사용을 기재하고 있다. 세포용해성 단백질은 전립선 특이적 표적 도메인 및/또는 전립선 특이적 분열 부위를 포함하도록 변형될 수 있고, 전립선 암 세포를 선택적으로 표적하고 죽이도록 사용될 수 있다.

암은 종양 덩어리를 형성하기 위해 증식하는 정상 세포로부터의 비 정상적, 또는 종양(neoplastic) 세포의 수의 증가, 이 종양성 종양(neoplastic tumor) 세포에 의한 인접 조직의 침입, 및 혈관계 및 림프계를 통해 부위 림프절로 및 대사로 불리는 프로세스를 통해 먼 부위에 점진적으로 퍼지는 악성 세포의 생성에 의해 특징된다. 암성(cancerous) 상태에서, 세포는 정상 세포가 성장하지 않을 조건 하에 서 증식된다. 정상 세포와 같이 않게, 일반적으로, 암 세포는 복제를 계속하며, 이들은 분화를 하지 않거나 성숙하게 되지 않고, 이들은 신체 내 근원 조직으로부터 다른 위치로 퍼지는 능력이 있다. 암 세포의 이 특성들은 일반적으로 정상 세포에서의 그것과 비교하여, 이 세포들 내 유전자 발현의 상대적 패턴에서의 변화로부터의 결과이다. 암의 치료를 위한 치료법을 개발하기 위한 많은 노력은 정상 세포와 암세포 사이의 유전자 발현에서의 차이를 고려하는데 초점을 맞추고 있고, 암 세포에 특이적인 분자 마커를 사용하여 암 세포를 표적하는데 초점을 맞추고 있다.

대조적으로는, 전립선 비대(benign prostatic hyperplasia : BPH)는 나이에 따른 전립선 성장의 자연적 진행의 결과로서 전립선의 비대로부터 기인하는 암성 질환은 아니다. 전립선의 비대는 증가된 전립선 세포 증식의 결과일 수 있거나, 전립선 세포 크기에서의 증가의 결과일 수 있다. 이 진행성 전립선 성장은 최근까지 삶에 문제를 일으키지 않았다. 건강 국제 기구(National Institute of Health : NIH)는 60대에 60%의 미국 남성이 BPH의 몇몇 증상을 가지고 있고 그 질환은 70대 및 80대에 90% 초과의 남성에 영향을 주는 것으로 평가하였다. 50대 이상의 세계적으로 약 115 백만 남성은 BPH의 다양한 정도를 가진다. 노령화에 기인하여, 보급은 다음 20년을 넘어 실질적으로 증가될 것이 기대된다. 심각한 BPH는 여러 문제 예를 들어 요로감염, 방광 및 콩팥 손상, 방광돌을 포함하고, 실금 및 대부분 심각한 육안적 혈뇨 및 폐쇄요로병증에 기인하는 신부전을 일으킬 수 있다.

BPH를 치료하는데 현재 유용한 여러 전략이 있다. 이들은 대기요법(watchful waiting), 의학적 치료 예를 들어 알파 블록커 치료 및 피나스테라이 드(finasteride) 치료, 풍선 확장술 및 여러 수술적 방법 예를 들어 전립선의 경요도 절제(TUIP), 전립선의 요도 절제(TURP), 및 오픈 전립샘제제술(prostatectomy)을 포함한다. 치료들이 임의의 부정적 결과 없는 것은 거의 없고, 이는 특히 BPH를 위한 치료에서 특히 그렇고, 이용가능한 치료의 이점 및 결점 사이에 정확한 균형적 역할이 있다. 현재 BPH를 위한 치료에 뒤따르는 해로운 점은 발기불능(약 4% 내지 40% 범위의 여러 수술 과정 때문에, 발기불능의 발생률은 또한 몇몇 의학적 치료 후에 또한 증가된다), 실금(총 요실금의 1%에 다다르는, 수술 후 스트레스 실금 약 3%), 및 재치료의 필요성을 포함한다. 공개된 데이터의 통합된 분석은 수술 중 발생될 수 있는 사망의 평균 확률(수술의 90 일 내 사망)이 TURP에 대해 1.5%였다는 것이다. 개수술에 대해서, 2.4% 였고, 풍선 확장술에 대해서는 3.5% 였다.

현재, 가장 공통적으로 사용되는 호르몬 치료는 피나스테라이드(finasteride)의 구강 투여이다. 메르크 & 코 인크, 화이트하우스 스테이션, N.J.(Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J.)로부터 Proscar™로 사용되는 피나스테라이드(Finasteride)는 합성 4-아자스테로이드 화합물, 스테로이드 타입 II 5α-환원효소의 특정 억제제 및 안드로겐 테스토스테론을 5α-디하이드로테스토스테론(DHT)으로 전환시키는 세포내 효소이다. 피나스테라이드(Finasteride)는 비대된 전립선의 수축을 돕고 전립선 비대 질환에 기인된 증가된 PSA를 줄인다. 그러나, 피나스테라이드(finasteride)는 요구되지 않는 부작용을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 이는 발기부전 또는 줄어든 성욕, 사정 후 문제들 및 유방 확대 및/또는 압통을 포함한다. 두타스테리드(Dutasteride(Duagen))은 BPH의 치료를 위한 또 다른 약이고, 이는 타입 I 및 II 5α-환원효소 둘 모두를 차단하는 능력이 있다. 성적 부작용은 피나스테라이드의 것들과 유사하다.

알파-1 아드레날린 수용체 차단제는 또한 전립선 비대의 임상적 치료를 위해 현재 사용된다. 예들은 탐설라신(tamsulasin) 히드로클로라이드, 테라조신 히드로클로라이드, 알푸조신 히드로클로라이드 및 독사조신 메실레이트를 포함한다. 알파-1 아드레날린 수용체 차단제의 투여에 따르는 BPH의 증상에 감소 및 오줌 흐름 속도에 개선은 방광목 및 전립선에서 알파-1 아드레날린 수용체의 차단에 의해 생성되는 부드러운 근육의 이완에 관련된다.

추가적으로, 식물 스테롤 및 추출물은 또한 전립선의 치료를 위해 사용되어 오고 있다.

미국 특허 출원 제 20040081659호는 BPH를 치료하는데 유용한 접합을 기재하고 있고 있으며, 이는 1) PSA에 의해 선택적으로 및 단백질분해적으로 분열되는 아미노산 서열을 가진 올리고펩티드와 화학적으로 연결된 2) 빈카 알카로이드 세포독성 작용제를 포함한다. 이론역학적으로, 알카로이드 세포독성의 활성은 접합물에서 낮고, 연결이 PSA에 의해 갈라지는 경우에 증가된다.

유럽 특허 출원 0652014는 항-PSA 항체의 생성을 유도하기 위한 면역원성 캐리어에 연결되어 있는 PSA(prostate-specific antigen)의 투여를 포함하는 BPH를 위한 치료를 기재하고 있다. 항-PSA 항체는 또한 사용될 수 있다. 면역원성 캐리어는 테타너스 독소, 디프테리아(diphtheria) 독소 또는 콜레라 독소 사슬 B일 수 있다.

미국 특허 제 6,379,669호는 특정 기관을 표적하는 방법을 기재하고 있으며 이는 치료제를 이의 항체 또는 단편에 커플링함에 의한다. 이 커플링된 치료제(또는 면역접합물)는 전립선 암, BPH, 또는 전립선염을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 포함되는 면역접합물은 여러 바이오활성 작용제에 연결되는 PSA에 대한 항체이다. 바이오활성 작용제는 세균 독소를 포함할 수 있다. 유사하게는, 미국 특허 출원 제 20020001588호에서, 항체 및 여러 바이오활성 치료제의 화학적 결합은 추가로 연구되었다.

이 배경 정보는 출원인에 의해 믿어지는 알려진 정보를 본 발명과 관련되어 있을 가능성이 있는 것으로 하는 목적을 위해 제공된다. 임의의 이전 정보가 본 발명에 대항하는 종래 기술을 구성한다는 것으로 해석되어서도 아니 되며, 어떠한 허가도 필요적으로 의도되지 않는다.

본 발명은 BPH의 치료를 위한 변형된 포어 형성 단백질의 사용에 관한 것이다. MPP는 천연발생 포어 형성 단백질(naturally-occurring pore-forming proteins : nPP)로부터 얻어지는데 이 것들은 막으로 삽입하고 표적 세포의 세포 막에서 포어 또는 채널을 형성함에 의해 세포들을 사멸시키고, 세포사를 일으킨다. 하나의 구체예에서, MPP는 세포 막에 가역적으로 삽입하고, 따라서 방관자(bystander) 세포는 영향을 받지 않는다. MPP는 전립선-선택성 변형을 포함하며, 다른 조직으로부터의 세포에 비해 보통의 전립선 세포들을 선택적으로 표적하는 MPP의 능력을 야기한다. MPP는 생체 내에서 정상적 전립선 세포들을 선택적으로 죽이는 능력이 있고, 생체 내에서 정상적 전립선의 중량 및 부피를 줄이는 능력이 있다. 따라서, 본 발명에 따른 MPP는 단독으로 사용될 수 있거나, BPH의 치료를 위한 다른 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 이는 국소적 또는 전이적 전립선 암을 치료하기 위한 변형된 세포용해성 단백질의 사용을 기재하고 있는, 미국 특허 출원 제 20040235095호에 기재되어 있는 분자들에 대조된다.

정의

달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 이 발명에 속하는 당업자에 의해 공통적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다.

기술 및 과정은 당 분야에서의 통상적 방법 및 여러 일반적 참조 문헌들(참조, 일반적으로 [Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 및 Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York: Plenum Press (1983) for fluorescence techniques])에 따라 일반적으로 수행된다. 표준 기술은 화학적 합성, 화학적 검사, 및 생물학적 검사를 위해 사용된다. 본 문헌을 통해 사용되는 바와 같이, 하기 용어들은 달리 지시되지 않는다면 하기 의미들을 가지는 것으로 이해되어야 한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 수치 값으로부터의 +/-10% 편차를 지칭한다. 이러한 편차는 특이적으로 참조되거나 혹은 그렇지 않던간에, 본원에 제공되는 임의의 주어진 값에 항상 포함됨이 이해되어야 한다.

전체 또는 부분에 관련하여, 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "전립선 특이적"은 전체/부분 또는 전체/부분의 특성은 다른 세포 타입에 비교하여 전립선 세포에 선택성이 있음을 가리킨다. 예를 들어, 전립선 특이성 전체/부분은 전립선 세포에 의해 선택적으로 발현될 수 있고, 전립선 세포와 선택적으로 회합될 수 있으며, 전립선 세포에 의해 선택적으로 활성될 수 있고, 전립선 세포에 선택적으로 결합되는 능력이 있는 것 등이다.

본원에서 사용되는 용어 "전립선 특이적 활성화 서열"은 전립선 특이적 단백질 분해 효소에 의해 선택적으로 분열되거나 가수분해되는, 하나 이상의 전립선 특이적 단백질 분해 효소 분열 부위를 통합시키는 아미노산 잔기의 서열을 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "전립선 특이적 표적 도메인"은 펩티드 리간드, 독소, 또는 항체와 같은 분자를 지칭하며, 다른 세포 타입에 결합하는 능력에 비교되는 경우에 전립선 세포에 선택적으로 결합하는 능력이 있다.

본원에서 사용되는 용어 "유전자"는 코팅 서열의 상부 또는 하부에 위치될 수 있는, 회합된 조절 영역 예를 들어 프로모터, 작동자, 종료자 등과 함께, 개개의 단백질 또는 RNA를 암호화하는 핵산의 분절(또한 "코딩 서열" 또는 "코딩 영역"으로 지칭됨)을 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "선택적으로 혼성화함"은 감지가능하게 또는 제 2 핵산에 특이적이게 결합하는 핵산의 능력을 지칭한다. 이의 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 단편은 비특이성 핵산에 감지가능한 결합의 상당한 양을 줄이는 혼성화 및 세척 조건 하에서 표적 핵산 가닥에 선택적으로 혼성된다. 매우 엄중한 조건들은 본원에서 논의되고 당 분야에 알려진 바와 같은 선택적 혼성화 조건을 얻기 위해 사용될 수 있다. 전형적으로, 혼성화 및 세척 조건들은 통상적 혼성화 과정에 따라 매우 엄격함으로 수행된다. 세척 조건들은 전형적으로 약 5-30 분 후 세척 용액의 변화와 함께 1-3 x SSC, 0.1-1% SDS, 50-70℃.

용어 "대응하다"는 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 부분과 동일함을 가리킨다. 대조적으로, 용어 "보완적"은 본원에서 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 폴리뉴클레오티드 서열의 보완적 가닥의 전부 또는 부분과 동일함을 가리키기 위해 사용된다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열 "TATAC"은 참조 서열 "TATAC"에 대응하고, 참조 서열 "GTATA"에 보완적이다.

하기 용어들은 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 둘 이상의 폴리펩티드들 사이의 서열 관계를 기재하기 위해 본원에서 사용된다: "참조 서열", "비교 윈도우", "서열 동일성", "백분율 서열 동일성", 및 "실질적 동일성". "참조 서열"은 서열 비교를 위해 기초로서 사용되는 정의된 서열이다; 참조 서열은 더 큰 서열의 부분 집합, 예를 들어, 전체 길이 cDNA, 유전자 또는 단백질 서열의 분절일 수 있거나, 완전한 cDNA, 유전자 또는 단백질 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 참조 폴리뉴클레오티드 서열은 20 이상의 뉴클레오티드 길이이고, 종종 50 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 참조 폴리펩티드 서열은 일반적으로 7 이상의 아미노산 길이 및 종종 17 이상의 아미노산 길이이다.

본원에서 사용되는 "비교 윈도우(window of comparison)"는 15 이상의 연속적 뉴클레오티드 위치 또는 5 이상의 연속적 아미노산 위치의 참조 서열의 개념적 분절을 지칭하며, 이를 넘어, 후보 서열은 참조 서열에 비교될 수 있고, 여기서 비교 윈도우에서 후보 서열의 부분은 두 서열의 최적의 배열을 위해 참조 서열(이는 첨가 또는 결실을 포함하지 않음)에 비교하여 20 퍼센트 또는 그 이하의 추가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 본 발명은 참조 또는 후보 서열의 전체 길이까지 및 이를 포함하는, 비교 윈도우를 위한 여러 길이를 고려한다. 비교 윈도우를 배열하기 위한 서열의 최적 배열은 스미스 및 워터만(Smith and Waterman)의 국소 상동성 연산법(local homology algorithm)([Adv. Appl. Math. (1981) 2:482]), 니들만 및 운쉬(Needleman and Wunsch)의 상동성 배열 연산법([J. MoI. Biol. (1970) 48:443)]), 피어슨 및 립만(Pearson and Lipman)의 유사성 방법의 서치([(Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) (1988) 85:2444)]), 이 연산법들의 컴퓨터화된 수행(예를 들어 Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 573 Science Dr., Madison, WI에서의 GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA), 공공적으로 상용되는 컴퓨터 소프트웨어 예를 들어 ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR)을 사용하여 또는 검사에 의해 수행될 수 있다. 최고의 배열(즉, 비교 윈도우에 대한 동일성의 높은 백분율을 야기하는)은 그 다음에 선택된다.

용어 "서열 동일성"은 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 비교 윈도우에 대해 동일함(다시 말해, 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산 기초)을 의미한다.

참조 서열에 대하여 본원에서 사용되는 용어 "백분율(%) 서열 동일성"은 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존성 치환을 고려함 없이 필요하다면, 최대 백분율 서열 동일성을 달성하기 위해 서열 및 도입 갭의 최적 배열 후 비교 윈도우에 대한 참조 폴리펩티드 서열에서의 잔기와 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다.

본원에서 사용되는 용어 "실질적 동일성"은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 특징을 가리키며, 여기서 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 비교 윈도우에 대한 참조 서열에 비교되는 적어도 50% 서열 동일성을 가지는 서열을 포함한다. 비교 윈도우에 대한 참조 서열에 비교되는 적어도 60% 서열 동일성, 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 또한 참조 서열과 실질적으로 동일성을 가진 것으로 간주된다.

본원에서 사용되는 용어 "기능적 결실"은 돌연변이, 부분적 또는 전체 결실, 삽입, 또는 유전자의 부분이 비기능적으로 서열 되는 유전자 서열에 대해 만들어진 다른 변이를 지칭한다. 예를 들어, 프로에어로라이신(PA) 결합 도메인의 기능적 결실은 세포 막에 결합하고 농축하는 PA의 능력에서의 감소를 야기한다. 이 기능적 결실은 프로에어로라이신으로 또 다른 기능적 결합 도메인을 삽입함에 의해 상반될 수 있다, 예를 들어 전립선 특이적 표적 도메인, 예를 들어, LHRH 펩티드. 기능적 결실의 이러한 상반은 "기능적 대체"로 본원에서 지칭된다. 또 다른 예에서, 본래의 PA 퓨린 절단 부위의 기능적 결실은 야생형 PA 분자에 비교되는 경우에 퓨린에 의해 절단되고 활성화되는 PA의 능력에서의 감소를 야기한다.

본원에서 상호 교환적으로 사용되는 용어 "치료" 및 "처리"는 환자의 상태를 개선하는 의도로 수행되는 개재를 지칭한다. 개선은 객관적 또는 주관적일 수 있고, 질병 또는 치료되는 장애와 관련된 증상을 개선하거나, 이의 진행을 막거나, 병리학을 바꾸는 것과 관련된다. 따라서, 용어 치료 및 처리는 넓은 개념으로 사용되고, 여러 단계에서 질병 또는 장애의 억제(예방), 완화, 감소, 및 치료를 포함한다. 환자의 상태의 악화를 막는 것은 또한 상기 용어에 의해 포함된다. 치료/처리가 필요한 환자는 따라서 질병 또는 장애를 가지고 있을뿐만 아니라 상기 질병 또는 장애가 되기 쉽거나 이들이 진행될 위험이 있는 환자 및 상기 질병 또는 장애가 예방되어야 하는 환자를 포함한다.

용어 "개선"은 일시적 및 긴 기간에서의 치료되는 질병 또는 장애의 하나 이상의 증상, 징후, 및 특징에 있어서의 완화, 예방, 감소 또는 개선을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "피검체" 또는 "환자"는 치료가 필요한 동물을 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "동물"은 인간 및 비 인간 동물을 지칭하며, 제한 없이 포유류, 새 및 어류를 포함한다.

하나 이상의 추가 치료제 또는 추가 치료와 "조합하여" 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드의 투여는 동시에 투여 및 연속 투여를 포함하는 것으로 의도된다. 연속 투여는 여러 순서로 그리고 여러 경로를 통해 피검체에 본 발명의 화합물 및 추가 처리 또는 치료제의 투여를 포함한다.

용어 "항원" 및 "항원성 물질"은 상호 교환적으로 본원에서 사용되어 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 능력이 있는, 전체 세포 및 조직을 포함하는 분자, 분자들, 분자의 부분 또는 부분들, 또는 분자들의 조합을 지칭한다. 항원성 물질은 단일 에피토프 또는 항원성 결정기를 포함할 수 있거나, 이는 다수의 에피토프 또는 항원성 결정기를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "면역 반응"은 항원 또는 항원성 물질에 대한 동물에서의 면역 시스템의 반응성에서의 바뀜을 지칭하고, 항체 생산, 세포-매개된 면역의 유도, 보완적 활성화 및/또는 면역 내성의 발달을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "억제"는 감소, 줄임, 느리게 함 또는 예방을 의미한다.

"결합 쌍"은 서로에 대해 친밀성을 가지는 두 부분(예를 들어, 화학적 또는 생물학적)을 지칭한다. 결합 쌍의 예는 동종-이합체, 이종-이합체, 항원/항체, 렉틴/아비딘, 표적 폴리뉴클레오티드/프로브, 올리고뉴클레오티드, 항체/안티-항체, 수용체/리간드, 효소/리간드 등을 포함한다. "결합 쌍의 한 원(member)"은 쌍의 한 부분 예를 들어 항원 또는 리간드를 지칭한다.

"분리된 폴리뉴클레오티드"는 유전체의 폴리뉴클레오티드, cDNA, 또는 합성 기원 또는 이의 몇몇 조합을 지칭하며, 이의 기원에 의해 "분리된 폴리뉴클레오티드"는 (1) "분리된 폴리뉴클레오티드"가 자연에서 발견되는 세포와 회합되지 않거나 (2) 자연적으로 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다.

용어 "폴리펩티드"는 일반적 용어로서 본원에서 사용되며, 야생형 (천연 발생) 단백질 서열, 천연발생 단백질 서열의 단편, 야생형 단백질 서열의 변형, 야생형 단백질 서열의 유도체, 또는 야생형 단백질 서열의 유사체일 수 있는, 20 이상의 아미노산 길이의 아미노산 서열을 지칭한다. 따라서, 본원에서 정의된 바와 같이, 본래의 단백질 서열 및 본래의 단백질 서열의 단편, 변형, 유도체 및 유사체는 폴리펩티드 속의 종으로 간주된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "분리된 폴리펩티드"는 본래 정상적으로는 회합되는 이의 기원에 의해 다른 폴리펩티드와 회합되지 않고/거나 정상적으로는 발생되는 세포로부터 분리되고/거나 동일 세포 공급원으로부터 다른 폴리펩티드가 결여되고/거나 다른 종으로부터 세포에 의해 발현되고/거나 자연적으로 발생되지 않는 폴리펩티드를 지칭한다.

목적에 적용되는 본원에서 사용되는 "천연발생" 또는 "본래의"는 목적이 자연적으로 발생될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 자연적으로 공급원으로부터 분리될 수 있고, 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체(바이러스를 포함)에서 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 천연발생된 것이다.

"작동가능하게 연결된"은 기재된 성분들이 이들의 의도된 방법으로 기능하도록 하는 관계에 있는 근접 부위를 지칭한다. 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 대조군 서열은 상기 코딩 서열의 발현이 대조군 서열과 양립되는 조건 하에서 달성되는 이러한 방법으로 라이게이션된다.

"대조군 서열"은 폴리뉴클레오티드 서열로서, 코딩 및 비 코딩 서열의 발현에 영향을 줌에 필요하며, 이에 라이게이션된다. 이러한 대조군 서열의 특성은 호스트 유기체에 따라 다양하다; 원핵 생물에서, 이러한 대조군 서열은 일반적으로 프로모터, 리보좀 결합 부위, 및 전사 말단 서열; 진핵 생물에서, 일반적으로 이러한 대조군 서열은 프로모터 및 전사 말단 서열을 포함한다. 용어 "대조군 서열"은 존재가 발현에 영향을 줄 수 있는 성분들을 최소한 포함하는 것으로 의도되고, 또한 존재가 이로운 추가 성분들, 예를 들어 리더 서열 및 퓨전 파트너 서열을 포함할 수 있다.

"폴리뉴클레오티드"는 10개 이상의 염기 길이의 뉴클레오티드의 폴리머 형태, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 또는 변형된 형태의 다른 타입의 뉴클레오티드를 지칭한다. 용어는 DNA 또는 RNA의 단일 및 이중 가닥 형태를 포함한다.

"폴리펩티드 단편"은 폴리펩티드로서 아미노 말단 및/또는 카르복시-말단 결실을 가지나, 잔여 아미노산 서열은 일반적으로 예를 들어 전체 길이 cDNA 서열로부터 유래 되는 천연발생 서열에서의 대응되는 위치와 동일하다. 단편은 전형적으로 5, 6, 8 또는 10 이상의 아미노산 길이이다. 하나의 구체예에서, 단편은 14 아미노산 길이 이상이다. 또 다른 구체예에서, 단편은 20 이상의 아미노산 길이이다. 또 다른 구체예에서, 단편은 50 이상의 아미노산 길이이다. 또 다른 구체예에서, 단편은 70 이상의 아미노산 길이이다.

용어 "표지" 또는 "표지된"은 예를 들어 방사선 표지된 아미노산의 통합 또는 마크된 아비딘(avidin)에 의해 감지될 수 있는 바이오티닐 부분의 폴리펩티드에 부착(예를 들어, 선택적 또는 색측정법에 의해 감지될 수 있는 효소적 활성화 또는 형광성 마커를 함유하는 스트렙타비딘)에 의해 감지될 수 있는 마커의 통합을 지칭한다. 표지 폴리펩티드 및 글리코 단백질의 여러 방법은 당 분야에 알려져 있고 사용될 수 있다. 폴리펩티드를 위한 표지의 예들은 제한되는 것은 아니지만, 하기 것들을 포함한다: 방사성동위원소(예를 들어, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ¹²⁵I, ¹³¹I), 형광성 라벨 (예를 들어, FITC, 로다민(rhodamine), 란타니드(lanthanide), 인(phosphor)), 효소적 표지(enzymatic labels) (또는 리포터 유전자) (예를 들어, 호스라디쉬 과산화효소, β-갈락토시다아제(galactosidase), β-락타마아제(latamase), 루시페라아제(luciferase), 알카리 포스파타아제(alkaline phosphatase)), 케미루미네센트(chemiluminescent), 바이오티닐 기(biotinyl groups), 제 2 리포터에 의해 인식되는 미리 정해진 폴리펩티드 에피토프(예를 들어, 루신 지퍼 쌍 (leucine zipper pair) 서열, 제 2 항체를 위한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그. 몇몇 구체예에서, 라벨은 여러 길이의 스페이서 암(arms)에 의해 부착되어 잠재적 구조적 간섭을 줄인다.

천연발생 아미노산은 아래게 기재된 통상적 3-문자 또는 1-문자 약어에 의해 구별되며, 이들은 펩티드 분야에서 일반적으로 받아들여지고, 생물학 명명법에서 IUPAC-IUB에 의해 추천된다.

아미노산 코드

이름	3-문자 코드	1-문자 코드	이름	3-문자 코드	1-문자 코드
알라닌(Alanine)	Ala	A	루신(Leucine)	Leu	L
알기닌(Arginine)	Arg	R	라이신(Lysine)	Lys	K
아스파라긴(Asparagine)	Asn	N	메티오닌(Methionine)	Met	M
아스팔탐산(Aspartic acid)	Asp	D	페닐아라닌(Phenylalanine)	Phe	F
시스테인(Cysteine)	Cys	C	프롤린(Proline)	Pro	P
글루타민산(Glutamic acid)	Glu	E	세린(Serine)	Ser	S
글루타민(Glutamine)	Gln	Q	쓰레오닌(Threonine)	Thr	T
글라이신(Glycine)	Gly	G	트립토판(Tryptophan)	Trp	W
히스티딘(Histidine)	His	H	티로신(Tyrosine)	Tyr	Y
이소루신(Isoleucine)	Ile	I	발린(Valine)	Val	V

본원에 기재된 펩티드 서열은 일반적으로 허용되는 관용에 따라 기재되어 있으며, 이로써 N-말단 아미노산은 왼쪽 및 C-말단 아미노산은 오른쪽에 있다. 비교에 의해, L-아미노산은 윗첨자(upper case letter)에 의해 D-아미노산은 아래 첨자(lower case letters)에 의해 표현된다.

변형된 포어 형성 단백질( MPP )

본 발명의 변형된 포어 형성 단백질(MPP)은 천연발생 포어 형성 단백질(nPP)로부터 얻어지고, 변형되어 하나 이상의 전립선-선택성 변형을 포함하여, 그로써 이들은 다른 정상 조직으로부터의 세포에 대해 선택적으로 정상적 전립선 세포를 사멸시킬 수 있는 능력이 있다. 다른 정상적 조직으로부터의 세포에 대해 정상적 전립선 세포를 선택적으로 사멸시킴에 의해 의도되는 것은 MPP는 다른 타입의 정상적 세포 예를 들어, 폐, 비장 또는 혈 세포보다 더욱 효과적으로 정상적 전립선 세포를 사멸시키는 능력이 있다는 것이다. 적합한 MPP는 미국 특허 출원 제 20040235095호에 기재되어 있는 것을 포함한다.

1. 천연발생 포어 형성 단백질( nPP )

본 발명의 MPP가 얻어질 수 있는 적합한 mPP는 여러 균체 독소를 포함하고, 이들은 세포사를 유도하는 표적 세포의 막에서 포어 또는 채널을 형성하는 것이 가능하다. 적합한 균체 독소는 전독소로서 생산되는 것들 및 계속적으로 단백질분해 분열에 의해 활성화되는 것들뿐만 아니라, 활성화 형태로 생산되고 추가 공정을 요구하지 않는 것들을 포함한다. 하나의 구체예에서, 결과적으로 빠른 세포용해성 세포사를 유도하는, nPP는 표적 세포의 세포 막에서 포어 및 채널을 형성하기 위해 활성화 서열에서 단백질 분해 효소 분열에 의해 활성화되는 전독소로서 합성되는 큰 세포독성 단백질이다. 본 발명에 따른 적합한 nPP는 하기 특징들을 가진다: 단백질 분해 효소 분열을 통한 억제 도메인의 제거에 의해 활성화되는 포어 형성 활성화, 및 하나 이상의 결합 도메인을 통해 세포막에 존재하는 수용체에 결합하는 능력. 다수의 nPP는 클로닝되고, 생산된 재조합된 형태이다(참조, 예를 들어, [Imagawa et al., FEMS. Microbiol. Lett. 17:287-92, 1994; Meza et al. FEMS Microbiol. Lett. 145:333-9, 1996]).

하나의 구체예에서, MPP는 에어로라이신 또는 에어로라이신-관련된 폴리펩티드와 같은 nPP로부터 얻어진다. 예들은 제한되는 것은 아니지만, 에어로라이신 동종 예를 들어 에어로모나스( Aeromonas ) 히드로필라 ( hydrophila ), 에어로모나스 트로타( trota ) 및 에어로모나스 살모니시다(salmonicida)부터의 프로에어로라이신 및 클로스트리듐 셉티컴( septicum )부터의 알파 독소([Ballard et al., Infect. Immun. 63:340-4, 1995; Gordon et al. J. Biol. Chem. 274:27274-80, 1999; Genbank Accession No. S75954]), 뿐만 아니라 하기 폴리펩티드: 바실러스 안트라시스 보호성 항원(Bacillus anthracis protective antigen), 비브리오 클로렐라( Vibrio cholerae) VCC 독소, 클로스트리듐 페르프린젠(perfringens)으로부터의 엡실론(epsilon) 독소, 및 바실러스 투린지엔시스 델타(Bacillus thuringiensis delta) 독소 (Genbank Accession No. DOOl 17)이다.

상기 기재된 에어로모나스 종으로부터의 프로에어로라이신(PA) 폴리펩티드는 특성 규명되어 있다. 이 폴리펩티드들은 이들 사이에 80% 초과의 쌍방식(pairwise) 서열 동일성을 보여준다([Parker et al, Progress in Biophysics & Molecular Biology 88 (2005) 91-142]). 이 PA 폴리펩티드의 각각은 약 470 아미노산 잔기를 가진 약 52 kDa 전독소이다. A. 히드로필라(hydrophila)로부터의 야생형 PA를 위한 cDNA 서열은 SEQ ID NO:1 (도 7)에 도시되어 있고, 이 야생형 PA의 대응하는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2 (도 8)에 도시되어 있다. 여러 자연적으로 발생하는 nPP를 위한 뉴클레오티드 및 단백질 서열은 당 분야에 알려져 있다. 비 제한적 예들은 하기 표에 목록되어 있다.

예시적인 nPP 및 대응하는 GenBank™ 일련 번호(Accession Numbers)

nPP	뉴클레오티드 서열(GenBank^TM 접근번호)	아미노산 서열(GenBank^TM 접근번호)
아에로모나스 하이드로필라 아에로라이신(Aeromonas hydrophila aerolysin)	Buckley AerA, not corrected: M16495	Buckley AerA corrected P09167
아에로모나스 프로아에로라이신(A. sobria proaerolysin¹)	Y00559	CAA68642
아에로모나스 소르비아 헤모라이신(A. sobria hemolysin²)	X65046	CAA46182
아에로모나스 트로타 프로아에로라이신(A. trota proaerolysin³)	AF064068	AAC26217
아에로모나스 살모니시다 헤모라이신(A. salmonicida hemolysin⁴)	X65048	CAA46184

¹Husslein et al, MoI. Microbiol. 2 (4), 507-517 (1988)

²Hirono et al, Microb. Pathog. 13 (6), 433-446 (1992)

³Kahn et al, Appl. Environ. Microbiol. 64 (7), 2473-2478 (1998)

⁴Hirono et al, Microb. Pathog. 15 (4), 269-282 (1993)

A. 히드로필라 PA 단백질은 결합 도메인을 포함하고(SEQ ID NO: 2의 약 아미노산 1-83), 이는 폴리펩티드의 소엽(lobe)으로서 알려져 있고, 본원에서는 소엽 결합 부위(small lobe binding domain : SBD)로서 지칭되고, PA 활성화를 위해 활성화 서열에서 단백질 분해 효소 분열에 의해 제거되는 C-말단 억제 펩티드(CIP) 도메인(SEQ ID NO: 2의 약 아미노산 427-470)으로 지칭된다. CIP 도메인을 제거하기 위한 활성화 서열에서 절단은 퓨린 및 트립신을 포함하는 다수의 편재하는 단백질 분해 효소에 의해 수행될 수 있다. SEQ ID NO: 2의 약 84-426으로부터의 아미노산 잔기는 PA 폴리펩티드의 거대엽으로서 알려져 있고, 거대엽 결합 도메인(large lobe binding domain : LBD)으로서 본원에서 지칭되는, 제 2 결합 도메인을 포함하는, 독소 도메인 및 다른 기능성 도메인을 함유한다. 야생형 A. 히드로필라 PA를 위한 cDNA 서열은 SEQ ID NO: 1에서 볼 수 있다.

C. 셉티컴으로부터의 알파 독소는 중요한 서열 동일성에 기초된 프로에어로라이신의 동종 및 다른 유사종으로 간주된다(Parker et al, supra). 알파 독소는 C-말단 억제 펩티드(CIP) 도메인을 제거하기 위해 활성화 서열에서 단백질 분해 효소 분열에 의해 활성화되는 46,450 Da 전독소로서 분비되고, 이는 또한 글리코실-포스파티딜리노시톨(glycosyl-phosphatidylinositol(GPI)-앵커링된 단백질에 결합된다. 알파 독소는 그러나, 소엽의 PA에 대응하는 영역을 가지지 않는다. 이 폴리펩티드의 활성화는 퓨린 절단 부위에서 단백질 분해 효소 절단에 의해 발생된다([Gordon et al., Infect. Immun. 65:4130-4, 1997]). 클로스트리듐 셉티컴 알파 독소 핵산 서열의 예는 GenBank™ 일련 번호 S75954(SEQ ID NO:73, 도 40)이고, 클로스트리듐 셉티컴 알파 독소 단백질 서열의 예는 GenBank™ 일련 번호 AAB32892 (SEQ ID NO:74, 도 41)이다. 서열 상동성에 기초하여, 알파 독소는 GPI-앵커링된 단백질에 결합하기 위해 유사한 구조 및 유사한 능력을 가진 것으로 생각된다.

바실러스 투린지엔시스 델타-독소의 활성화 서열은 특정 곤충의 중창(midgut)에서 단백질 분해 효소에 의해 분열되어 활성화 내독소를 생성한다([Miranda et al., Insect Biochem. MoI. Biol. 31 : 1155-63, 2001]). 이 내독소의 구조는 분해되고 세 개의 도메인으로 구성됨을 보여준다, 채널-형성 도메인, 결합 도메인, 및 안정화 도메인.

하나의 구체예에서, 본 발명에 따른 MPP는 프로에어로라이신 폴리펩티드로부터 얻어진다. 추가 구체예에서, MPP는 A. 히드로필라로부터 프로에어로라이신 폴리펩티드로부터 얻어진다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, MPP는 알파 독소 폴리펩티드로부터 얻어진다.

또 다른 구체예에서, MPP는 활성화를 위해 단백질 분해 효소 분열을 요구하지 않는 nPP로부터 얻어지고, 따라서 활성화 서열을 가지지 않는다. nPP는 변형되어 전립선 특이적 단백질 분해 효소 분열 부위를 nPP로 삽입할 수 있으며, 전립선 세포를 사멸시키기 위해 선택적으로 활성화될 수 있는 MPP를 야기한다. 이러한 nPP의 예는 스태필로코쿠스(Staphylococcus) 아우레우스(aureus) 알파-헤몰리신이다. 이 nPP의 경우에, 활성화 서열은 당 분야에 알려진 포어 형성 도메인의 중심에 삽입될 수 있다([Panchal et al, (1996) Nat. Biotech. 14:852-856]).

본 발명은 nPP의 생물학적 활성화 단편으로부터 얻어지는 MPP를 추가로 포함한다. nPP의 생물학적 활성화 단편은 포어를 형성하고 세포를 사멸시킬 수 있는 것들이다. 적합한 단편은 활성화되어 CIP 도메인의 제거에 의해 표적 세포에 포어를 형성할 수 있는 것들을 포함한다. 예를 들어, PA의 경우에, 적합한 단편은 단백질의 결합 도메인뿐만 아니라 CIP 도메인 및 활성화 서열을 포함하는 것일 것이다. 따라서, 본 발명의 하나의 구체예에서, MPP는 결합 도메인, CIP 도메인 및 활성화 서열을 포함하는 프로에어로라이신의 단편으로부터 얻어진다. 또 다른 구체예에서, MPP는 단지 도메인 부분을 제외한, 결합 도메인, 활성화 서열을 포함하는 프로에어로라이신의 단편으로부터 얻어진다.

2. 전립선 특이적 변형

본 발명에 따라, 선택된 nPP는 변형되어 하나 이상의 전립선 특이적 변형의 포함함에 의해 MPP를 형성한다. 본 발명에 의해 고려되는 전립선 특이적 변형은 전립선 특이적 활성화 서열의 통합 및/또는 하나 이상의 결합 도메인의 기능적 결실(기능적 교체를 포함), 및/또는 전립선 특이적 표적 도메인의 첨가를 포함한다.

하나의 구체예에서, 본 발명에 따른 MPP는 전립선 세포에서 MPP의 선택적 활성화를 허용하는 전립선 특이적 활성화 서열을 포함한다. 전립선 특이적 활성화 서열은 nPP의 천연발생 활성화 서열의 변형에 의해 생성될 수 있거나, 이는 자연적으로 발생하는 활성화 서열을 가지지 않는 nPP에 전립선 특이성 활성화 서열의 첨가에 의해 생성될 수 있다. 또 다른 구체예에서, MPP는 전립선 특이적 활성화 서열 및 하나 이상의 전립선 특이적 표적 도메인을 포함한다. 또 다른 구체예에서, MPP는 전립선 특이적 활성화 서열 및 SBD로의 변형을 포함한다. 또 다른 구체예에서, MPP는 전립선 특이적 활성화 서열 및 LBD로의 변형을 포함한다.

하나의 구체예에서, 본 발명에 따른 MPP는 전립선 세포에서 MPP의 선택적 활성화를 허용하는 하나 이상의 전립선 특이적 표적 도메인을 포함한다. 또 다른 구체예에서, MPP는 하나 이상의 전립선 특이적 표적 도메인 및 SBD로의 변형을 포함한다. 또 다른 구체예에서, MPP는 전립선 특이적 표적 도메인 및 LBD로의 변형을 포함한다.

또 다른 구체예에서, MPP는 전립선 특이적 활성화 서열, 하나 이상의 전립선 특이적 표적 도메인 및 LBD로의 변형을 포함한다. 또 다른 구체예에서, MPP는 전립선 특이적 활성화 서열, 하나 이상의 전립선 특이적 표적 도메인, 및 SBD로의 변형을 포함한다.

하나의 구체에에서, MPP는 전립선 특이적 활성화 서열 및 자연적 결합 도메인으로의 하나 이상의 변형을 포함한다. 또 다른 구체예에서, MPP는 전립선 특이적 표적 도메인 및 자연적 결합 도메인으로의 하나 이상의 변형을 포함한다. 또 다른 구체예에서, MPP는 전립선 특이적 활성화 서열, 전립선 특이적 표적 도메인, 및 자연적 결합 도메인으로의 하나 이상의 변형을 포함한다.

프로에어로라이신으로 될 수 있는 전립선 특이적 변형의 조합의 대표적, 비 제한적 예는 도 4, 5, 및 6에 도시되어 있다.

활성화 서열의 변형

상기 기재된 바와 같이, nPP는 변형되어 전립선 특이적 활성화 서열을 통합할 수 있으며, 천연발생 활성화 서열의 변형에 의하고, 전립선 특이적 활성화 서열을 제공하거나, 전립선 특이적 활성화 서열은 천연발생 활성화 서열을 가지지 않는 nPP에 첨가될 수 있다. 본 발명에 따른 전립선 특이적 활성화 서열은 하나 이상의 전립선 특이적 단백질 분해 효소 분열 부위를 통합하는 아미노산의 서열이다. 전립선 특이적 단백질 분해 효소 분열 부위는 인식되고 전립선 특이적 단백질 분해 효소에 의해 선택적으로 및 효과적으로 가수분해되는(분열되는) 아미노산의 서열이다. 하나의 구체예에서, 전립선 특이적 단백질 분해 효소는 다른 세포 타입에서보다 전립선 세포에서 더 높은 수준으로 발현되는 단백질 분해 효소이다. 전립선 특이적 단백질 분해 효소의 예는 제한되지 않지만, PSA(전립선 특이적 항원), PSMA(전립선 특이적 막 항원), 및 HK2 (인간 샘 칼리크레인(human glandular kallikrein) 2) 분열 서열을 포함한다. 이 전립선 특이적 단백질 분해 효소에 의해 인식되는 분열 부위의 여러 예들은 당 분야에 알려져 있고, 추가적으로 아래에 기재될 것이다.

전립선 특이적 단백질 분해 효소 활성화 서열을 제공하기 위한 천연발생 활성화 서열로의 변형은 당 분야에 알려진 방법으로 달성될 수 있다. 천연발생 활성화 서열의 변형은 자연적 활성화 서열의 기능적 결실을 야기한다. 기능적 결실은 변이, 부분적 또는 전체적 결실, 삽입 또는 불활성이 되는 천연발생 활성화 서열로 만드는 여러 변이에 의해 달성될 수 있다. 하나의 예에서, nPP의 자연적으로-발생되는 활성화 서열은 전립선 특이적 활성화 서열의 삽입에 의한 기능적 결실이다. 또 다른 구체예에서, 천연발생 활성화 서열의 기능적 결실은 전립선 특이적 활성화 서열을 생성하는 자연적 활성화 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 변이를 통해 달성된다. 대안적 구체예에서, nPP의 자연적 발생 활성화 서열은 활성화 서열의 자연적 단백질 분해 효소 분열 부위를 전립선 특이적 단백질 분해 효소 분열 부위로 대치함에 의해 기능적으로 결실된다.

하나의 구체예에서, 하나 이상의 전립선 특이적 단백질 분해 효소 분열 부위는 기능적으로 MPP의 자연적 단백질 분해 효소 분열 부위를 대체한다. 예를 들어, 전립선 특이적 단백질 분해 효소 분열 부위는 PA의 자연적 퓨린 절단 부위를 기능적으로 대체할 수 있다(참조 도 4B). 이 대체는 효소적 활성화 전립선 특이적 단백질 분해 효소, 예를 들어 PSA, PSMA, 또는 HK2의 존재에서 세포용해적으로 활성되는 MPP를 야기한다. 적합한 PSA, PSMA, 또는 HK2 분열 부위는 당 분야에 알려져 있고 아래에 기재되어 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 MPP는 nPP의 자연적 단백질 분해 효소를 삭제 및 전립선 특이적 활성화 서열을 삽입함에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어 PA의 퓨린 절단 부위(SEQ ID NO: 2의 아미노산 427-432)는 삭제될 수 있고, 전립선 특이적 단백질 분해 효소 분열 부위, 예를 들어 PSA 분열 부위는 삽입될 수 있다(참조 도 4B).

추가 구체예에서, nPP의 자연적 단백질 분해 효소 분열 부위는 돌연변이되어 더 이상 기능적이지 않고 전립선 특이적 활성화 서열은 돌연 변이된 단백질 분해 효소 분열 부위 내에 삽입되거나, 자연적 단백질 분해 효소 분열 부위의 N- 또는 C- 말단에 첨가된다. 예를 들어, PA의 퓨린 절단 부위는 돌연변이 될 수 있고, 전립선 특이적 단백질 분해 효소 분열 부위, 예를 들어 PSA 분열 부위는 돌연변이된 퓨린 부위의 N- 또는 C-말단 내 또는 그곳에 첨가될 수 있다(참조 도 4C).

또 다른 구체예에서, 전립선 특이적 활성화 서열은 자연적 발생 활성화 서열을 가지지 않는 nPP에 첨가된다. 예를 들어, 이는 세포를 사멸시키도록 활성되기 위해 단백질 분해 효소 분열을 요구하지 않는, 스태필로코쿠스 아우레우스 α-헤몰리신은 하나 이상의 전립선 특이적 단백질 분해 효소 분열 부위를 포함하도록 조작될 수 있고, 이로써, 전립선 세포를 사멸하도록 선택적으로 활성화될 수 있게 된다.

전립선 특이적 분열 부위

상기 기재된 바와 같이, 여러 전립선 특이적 단백질 분해 효소 및 이들이 인식하는 단백질 분해 효소 분열 부위는 당 분야에 알려져 있다. 예들은 제한되지 않지만, PSA, PSMA 및 HK2를 포함한다.

하나의 구체예에서, MPP는 PSA 특이적 분열 부위를 포함하는 전립선 특이적 활성화 서열을 포함하도록 변형된다. PSA 특이적 분열 부위는 인식되고 전립선 특이성 항원(PSA)에 의해 선택적으로 그리고 효과적으로 가수분해(분열)되는 아미노산의 서열이다. PSA는 특이적 펩티드 서열을 인식하고 가수분해하는 능력을 가진 세린 단백질 분해 효소이다. 이는 효소적 활성화 형태로 전립선 세포에 의해 분비되고, 순환계에 진입 후 불활성화된다. 혈액뿐만 아니라 전립선과는 다른 정상적 조직이 효소적 활성 PSA를 함유하지 않기 때문에, PSA의 단백질 분해 활성화는 전립선에서 MPP를 활성화하기 위해 사용될 수 있다. 여러 PSA 특이적 분열 부위는 당 분야에 알려져 있다. 예들은 제한되지 않지만, SEQ ID NO: 5, 8, 11, 및 14-21에서 볼 수 있으며, 이들은 미국 특허 제 5,866,679, 5,948,750, 5,998,362, 6,265,540, 6,368,598, 및 6,391,305호에 기재되어 있다. 하나의 구체예에서, MPP는 SEQ ID NO: 5에서 볼 수 있는 PSA 분열 부위를 포함하는 활성화 서열을 가진다.

추가적 PSA 특이적 분열 부위는 알려져 있고, 인간 정낭 단백질 세메노겔린(세메노겔린) I 및 II의 PSA 분열 맵 및 셀룰로오스 막 기재 분석에 기초되며(참조 표 3 및 [Denmeade et al., Cancer Res., 57:4924-30, 1997]), 본 발명에 따른 변형된 MPP를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 MPP는 표 3에 도시된 바와 같이 PSA-분열 부위 중 하나를 포함하도록 변형될 수 있으며, 당 분야에 알려진 바와 같이, 프로에어로라이신의 야생형 퓨린 단백질 분해 효소 활성화 부위를 대체시킬 수 있다(SEQ ID NO: 2의 아미노산 427-432).

하나의 구체예에서, MPP는 PSA 분열 부위를 함유하는 활성화 서열을 포함하는 SEQ ID NO: 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 및 24 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 가진다.

PSA 기질 (PSA 분열 부위) 및 PSA 가수분해의 동역학*

PSA 기질 (서열번호)	Km (mM)	Kcat (s-1)	Kcat/Km (s-1M-1)
KGISSQY (15)	160	0.043	270
SRKSQQY (16)	90	0.023	260
ATKSKQH (17)	1310	0.0091	6.9
KGLSSQC (18)	300	0.0017	5.6
LGGSSQL (19)	900	0.0037	4.1
EHSSKLQ (20)	1165	0.012	10.6
HSSKLQ (5)	470	0.011	23.6
SKLQ (21)	813	0.020	24.6

* 펩티드는 형광적으로 표지시켰다(아미노메틸 코우마린(coumarin)). 분석을 50 mM 트리스, 0.1 M NaCl, pH 7.8에서 수행하였다.

또 다른 구체예에서, MPP는 PSMA 특이적 분열 부위를 포함하는 전립선 특이적 활성화 서열을 포함한다. 적합한 PSMA 특이적 분열 부위의 예들은 당 분야에 알려져 있고, 예를 들어 국제 특허 WO 02/43773에서 발견될 수 있다. 일반적 용어에서, PSMA 분열 부위는 적어도 디펩티드 X₁X₂를 포함한다. 디펩티드는 위치 X₁에서 아미노산 Glu 또는 Asp를 함유한다. X₂는 Glu, Asp, Gln, 또는 Asn일 수 있다. 트리펩티드 X₁X₂X₃는 또한 접합하며, X₁ 및 X₂는 상기 정의되어 있고, X₃는 Glu, Asp, Gln 또는 Asn이다. 테트라펩티드 X₁X₂X₃X₄는 또한 적합하며, X₁ _-3는 상기 정의되어 있고, X₄는 Glu, Asp, Gln 또는 Asn이다. 펜타펩티드 X₁X₂X₃X₄X₅는 또한 적합하며, X₁ _-4는 상기 정의되어 있고, X₅는 Glu, Asp, Gln 또는 Asn이다. 헥사펩티드 X₁X₂X₃X₄X₅X₆는 또한 적합하며, X₁ _-5는 상기 정의되어 있고, X6는 Glu, Asp, Gln 또는 Asn이다. 더 긴 서열 길이의 추가 펩티드는 유사한 방법으로 구조될 수 있다. 일반적으로 펩티드는 하기 서열이다: X₁...X_n, 여기서 n은 2 내지 30, 2 내지 20, 2 내지 15, 또는 2 내지 6이고, 여기서 X₁은 Glu, Asp, Gln 또는 Asn이다. 한 구체예에서, X₁은 Glu 또는 Asp이며, 및 X₂-X_n는 독립적으로 Glu, Asp, Gln 및 Asn으로부터 선택된다. 다른 가능한 펩티드 서열은 상기와 같으나, X₂-X_n _- ₁는 독립적으로 Glu, 및 Asp으로부터 선택되고, X_n는 독립적으로 Glu, Asp, Gln 및 Asn으로부터 독립적으로 선택되는 것에 차이가 있다. PSMA 분열 부위의 예들은 Asp-Glu, Asp-Asp, Asp-Asn, Asp-Gln, Glu-Glu-Glu, Glu-Asp-Glu, Asp-Glu-Glu, Glu-Glu-Asp, Glu-Asp-Asp, Asp-Glu-Asp, Asp-Asp-Glu, Asp-Asp-Asp, Glu-Glu-Gln, Glu-Asp-Gin, Asp-Glu-Gln, Glu-Glu-Asn, Glu-Asp-Asn, Asp-Glu-Asn, Asp-Asp-Gin, 및 Asp-Asp-Asn이다.

추가적 구체예에서, MPP는 HK2 특이적 분열 부위를 포함하는 전립선 특이적 활성화 서열을 포함한다. HK2 특이적 분열 부위의 예들은 당 분야에 알려져 있고, 예를 들어 국제 공개 WO01/09165에 기재되어 있다. HK2에 의해 인식되는 분열 부위는 적어도 아미노산 서열 X₄X₃X₂X₁에 의해 측면에 위치된다. 이 아미노산 서열은 위치 X₁에서 아미노산 아르기닌, 히스티딘 또는 리신을 함유한다. X₂은 아르기닌, 페닐알라닌, 리신, 또는 히스티딘일 수 있다. X₃는 리신, 세린, 알라닌, 히스티딘 또는 글루타민일 수 있다. X₄는 0 내지 20의 추가 아미노산일 수 있고, 둘 이상의 추가 아미노산일 수 있다. 한 구체예에서, HK2 분열 부위는 인식된 세메노겔린 분해 부위의 N-말단으로의 4 내지 24 번째 아미노산인 야생형 세메노겔린 I 또는 세메노겔린 II 서열에서 20 아미노산과 실질적으로 동일한 X₄를 위한 서열을 포함한다. 아미노산 서열은 추가로 X_-1을 포함할 수 있고, 이는 X₁의 카르복시 말단에 연결되어 아미노산 서열 X₄X₃X₂X₁X_-1을 만든다. X_-1은 추가 10 아미노산까지이고, 여러 아미노산을 포함할 수 있다. X₁은 X₁의 카르복시 말단에 연결되어 있는 류신, 알라닌 또는 세린을 가질 수 있다. X_-1은 L- 또는 D- 아미노산을 포함할 수 있다. HK2 분열 부위는 X₁의 카르복시 말단에 위치된다.

HK2 분열 부위의 예들은 표 4에 기재되어 있다(기호 ][는 HK2 분열 부위를 가리킨다):

예시적 HK2 분열 부위

Lys-Arg-Arg ][	서열번호: 32	Ser-Arg-Arg ][ Leu	서열번호: 53
Ser-Arg-Arg ][	서열번호: 33	Ala-Arg-Arg ][ Leu	서열번호: 54
Ala-Arg-Arg ][	서열번호: 34	Ala-Arg-Arg ][ Ser	서열번호: 55
His-Arg-Arg ][	서열번호: 35	His-Arg-Arg ][ Ala	서열번호: 56
Gln-Arg-Arg ][	서열번호: 36	Gln-Arg-Arg ][ Leu	서열번호: 57
Ala-Phe-Arg ][	서열번호: 37	Ala-Phe-Arg ][ Leu	서열번호: 58
Ala-Gln-Arg ][	서열번호: 38	Ala-Gln-Arg ][ Leu	서열번호: 59
Ala-Lys-Arg ][	서열번호: 39	Ala-Lys-Arg ][ Leu	서열번호: 60
Ala-Arg-Lys ][	서열번호: 40	Ala-Arg-Lys ][ Leu	서열번호: 61
Ala-His-Arg ][	서열번호: 41	Ala-His-Arg ][ Leu	서열번호: 62
Gln-Lys-Arg-Arg ][	서열번호: 42	His-Ala-Gln-Lys-Arg-Arg ][ Leu	서열번호: 63
Lys-Ser-Arg-Arg ][	서열번호: 43	Gly-Gly-Lys-Ser-Arg-Arg ][ Leu	서열번호: 64
Ala-Lys-Arg-Arg ][	서열번호: 44	His-Glu-Gln-Lys-Arg-Arg ][ Leu	서열번호: 65
Lys-Lys-Arg-Arg ][	서열번호: 45	His-Glu-Ala-Lys-Arg-Arg ][ Leu	서열번호: 66
His-Lys-Arg-Arg ][	서열번호: 46	Gly-Gly-Gln-Lys-Arg-Arg ][ Leu	서열번호: 67
Lys-Ala-Phe-Arg ][	서열번호: 47	His-Glu-Gln-Lys-Arg-Arg ][ Ala	서열번호: 68
Lys-Ala-Gln-Arg ][	서열번호: 48	Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg ][ Leu	서열번호: 69
Lys-Ala-Lys-Arg ][	서열번호: 49	His-Glu-Gln-Lys-Arg-Arg ][Ser	서열번호: 70
Lys-Ala-Arg-Lys ][	서열번호: 50	Gly-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg ][ Leu	서열번호: 71
Lys-Ala-His-Arg ][	서열번호: 51	Gly-Gly-His-Lys-Arg-Arg ][ Leu	서열번호: 72
Lys-Arg-Arg ][ Leu	서열번호: 52

전립선 특이적 표적 도메인의 첨가

본 발명의 한 구체예에서, MPP는 하나 이상의 전립선 특이적 표적 도메인을 포함하여 전립선 세포의 선택적 표적을 가능하게 한다. 전립선 특이적 표적 도메인은 전립선 세포에 MPP를 향하게 하는 능력이 있으며, MPP는 활성화될 수 있고, 계속적으로 전립선 세포를 사멸시킬 수 있다. 표적 도메인은 MPP의 N- 또는 C-말단 그 둘 모두에 위치될 수 있다. 대안적으로는, 표적 도메인은 MPP의 포어 형성 활성화에 방해를 하지 않는 한, MPP의 또 다른 영역에 위치될 수 있다.

적합한 전립선 특이적 표적 도메인의 예들은 제한되지는 않지만, 펩티드 리간드, 독소, 또는 항체와 같은 분자들을 포함하며, 이들은 다른 세포 타입을 위한 것보다 전립선 세포를 위해 더 높은 특이성을 가진다. 한 구체예에서, 전립선 조직 특이성 결합 도메인은 다른 세포 타입에서보다 전립선 조직 또는 세포에서 더 낮은 K_D를 가진다(다시 말해, 다른 정상적 세포에 비교하여, 전립선 조직에 대한 선택적 결합), 예를 들어 10-폴드 이상 더 낮은 K_D, 예를 들어 20-, 50-, 75-, 100- 또는 200-폴드 조차 더 낮은 K_D. 이러한 분자들은 전립선에 대한 MPP를 표적하기 위해 사용될 수 있다. 예들은 제한되지는 않지만, PSA, PSMA, HK2, 프스타신(prostasin), 및 헵신(hepsin)과 같은 상대적으로 전립선 특이적인 단백질을 인식하는 항체들; 자연적 및 합성적 황체형성 호르몬 분비 호르몬(LHRH)과 같은 전립선 특이적 수용체를 가지는 리간드; 및 엔도텔린(endothelin)(인지체(cognate) 엔도텔린 수용체에 결합)를 포함한다.

본 발명의 한 구체예에서, 전립선 특이적 표적 도메인의 첨가는 nPP의 자연적 결합 도메인의 기능적 결실을 야기한다. 또 다른 구체예에서, 프로에어로라이신의 자연적 비특이성 GPI-앵커링된 단백질 결합 도메인은 기능적으로 결실되고 전립선 특이적 표적 도메인과 대체된다. 기능적으로 결실된 자연적 결합 도메인을 가지는 프로에어로라이신으로부터 얻어진 MPP의 특이적 예들은 도 4D 및 5B에 묘사되어 있다. 자연적 프로에어로라이신 결합 도메인을 기능적으로 치환하는 전립선 특이적 표적 도메인을 포함하는 프로에어로라이신으로부터 얻어지는 MPP의 예들은 도 4E, 5 A, 5C 및 5D 및 6A-6D에 묘사되어 있다.

하나 이상의 전립선 조직 특이성 결합 도메인은 MPP의 하나 이상의 아미노산에 연결될 수 있지만, 이상적으로, 세포막에 포어를 형성하는 능력을 크게 방해하지 않거나, 적용될 수 있는 경우에, PSA와 같은 전립선 특이성 단백질 분해 효소에 의해 활성화되는 MPP의 능력을 크게 방해하지 않는다. MPP에 단백질 또는 펩티드를 접합하는 방법은 당 분야에 알려져 있고, 예를 들어 MPP에 전립선-조직 특이적 결합 도메인을 연결하는 것을 돕기 위해, 단백질의 N-말단 아미노산을 변화시켜 전립선-조직 특이적 결합 도메인을 부착시키기 전에 시스 또는 다른 아미노산으로 변형되도록 하는 것을 포함한다.

한 구체예에서, 전립선 조직 특이적 결합 도메인은 프로에어로라이신으로부터 얻어지는 MPP의 N- 및/또는 C- 말단에 연결 또는 삽입된다(예를 들어, 도 4E 및 5C 참조). 몇몇 예에서, 프로에어로라이신의 자연적 결합 도메인은 결실되어(즉, SEQ ID NO: 2 또는 4의 아미노산 1-83), N-말단으로의 전립선 조직 특이적 결합 도메인의 부착 또는 결합은 SEQ ID NO: 2 또는 4의 아미노산 84에의 부착을 야기한다(예를 들어, 도 5C 및 6C 참조). 다른 구체예에서, 더 작은 결실 또는 점 돌연변이는 프로에어로라이신의 자연적 결합 도메인에 도입되어, N-말단으로의 전립선 조직 특이적 결합 도메인의 부착 또는 연결이 SEQ ID NO: 2 또는 4의 아미노산 1(또는 아미노산이 자연적 프로에어로라이신 결합 도메인의 N-말단에 따른 N-말단이던지 간에)에 부착을 야기한다(예를 들어, 참조 도 4E 및 5D).

전립선 특이적 표적 도메인으로서의 항체

한 구체예에서, 전립선 특이적 표적 도메인은 결과적으로 MPP를 전립선 세포에 표적하도록 하는, 전립선 세포와 회합하는 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편이다. 전립선 특이적 표적 도메인에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 전립선 세포와 회합하는 항원은 이의 발현은 전립선 세포에서 증가되는 LHRH 수용체 및 PSMA 및 PSA를 포함한다. 항체는 당 분야에 알려진 유전자 융합 방법을 사용하여 MPP의 N- 또는 C-말단에 부착될 수 있다(예를 들어 참조 [Debinski and Pastan, Clin. Cancer Res. 1 :1015-22, 1995]). 대안적으로는, 항체는 공유 가교 결합에 의해 MPP에 부착될 수 있다(예를 들어 참조 [Woo et al., Arch. Pharm. Res. 22(5):459-63, 1999 및 Debinski and Pastan, Clin. Cancer Res. 1(9):1015- 22, 1995]). 가교는 예를 들어 동종양기능성(homobifunctional)-리신-반응성 가교제를 사용함에 의해 비 특이적일 수 있거나, 항체에서 아미노기 및 MPP에 위치되어 있는 시스테인 잔기와 반응하는 가교제를 사용함에 의해 특이적일 수 있다. 한 구체예에서, 프로에어로라이신 아미노산 예를 들어 아미노산 SEQ ID NO: 2의 Cys19, Cys75, Cys159, 및/또는 Cysl64는 변형된 프로에어로라이신 분자에 항체를 가교하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체는 변형되도록 nPP의 자연적 결합 도메인을 대체시킬 수 있거나, 항체는 자연적 결합 도메인에 변이를 이미 가지는 MPP에 첨가될 수 있다. 이러한 MPP는 특이성을 증가시키기 위해 전립선 특이적 활성화 서열을 또한 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 항체는 PA의 독소 도메인에 융합된 PSMA에 단일 사슬 항체이다.

적합한 항체는 무손상 항체뿐만 아니라 항체 단편, 예를 들어 (i) VL, VH, CL 및 CHl 도메인으로 구성되는 Fab 단편; (ii) VH 및 CHl 도메인으로 구성되는 Fd 단편; (iii) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편, (iv) VH 도메인으로 구성되는 dAb 단편([Ward et al., Nature 341 :544-6, 1989]); (v) 분리된 상보성 결정 부위(isolated complementarity determining region : CDR); 및 (vi) 힌지 영역에서 이황화 결합에 의해 연결된 두 Fab 단편들을 포함하는 이가(bivalent) 단편인 F(ab')2 단편을 포함한다. 적합한 항체는 합성적 링커를 통해 연결되어 있는 Fv 단편의 두 도메인을 야기하는 재조합 방법에 의해 제조되는([Bird et al. Science 242:423-6, 1988; and Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-83, 1988]) 단일 사슬 Fv 항체 및 카멜라이즈된 항체(camelized antibodies)(예를 들어 참조 [Tanha et al., J. Biol. Chem. 276:24774-80, 2001])를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 항체 단편은 이의 표적 항원, 예를 들어 F(ab')2 단편과 같은 이가 단편을 가교하는 능력이 있다. 대안적으로는, 이의 표적 항원(Fab 단편)을 그 자체로 가교하지 않는 항체 단편은 항체 단편을 가교하도록 하는 2차 항체와 결합하여 사용되며, 이로써 표적 항원을 가교할 수 있다. 항체는 전체 항체를 위해 기재되어 있고 당 분야에 알려져 있는 동일한 방법에서 활용되는 스크린된 단편 및 통상적 기술을 사용하여 단편화할 될 수 있다. 항체는 표적 항원을 특이적으로 결합시키는 나노바디, 및 이중특이성(bispecific) 및 화학적 분자들을 포함하도록 추가로 의도된다.

항체에 대해 사용되는 경우에, "특이적으로 결합"은 특정 항원과 특이적으로 면역반응하는 개개의 항체의 능력을 지칭한다. 결합은 항체 분자와 항원의 항원적 결정기 사이의 무작위적이지 않은 결합 반응이다. 요구되는 결합 특이성은 전형적으로 특이적 및 관련되지 않은 항원을 다른 방법으로 결합시키고, 그래서 두 상이한 항원, 특히 두 항원이 독특한 에피토프를 가지는 항원들 사이를 구별하는 항원의 능력에 참조 포인트로부터 결정된다. 특별한 에피토프에 특이적으로 결합되는 항체는 "특이적 항체"로 지칭된다.

전립선 특이적 표적 도메인으로서의 작은 펩티드 리간드

한 구체예에서, 전립선 특이적 표적 도메인은 전립선 세포의 막에서 발현된 이의 인지체 전립선 특이적 수용체에 결합하는 작은 펩티드 리간드이다. 예는 제한되는 것은 아니지만, LHRH 수용체에 높은 친밀성을 가지고 결합하는 자연적 및 합성적 황체형성 호르몬 분비 호르몬(LHRH) 작용제 펩티드(예를 들어 참조 Genbank Accession No. CAA25526 및 SEQ ID NOS: 22 및 23) 및 PSMA에 선택적으로 결합할 수 있는 펩티드이다. LHRH 수용체는 전립선 세포 및 단지 몇몇의 다른 세포에 의해 표시된다. 이 다른 방법의 발현은 결합 특이성을 제공한다.

작은 펩티드 리간드는 MPP에 이들의 부착을 용이하게 하기 위해 당 분야에 알려져 있는 방법으로 변형될 수 있다. 예를 들어, LHRH의 특정 잔기, 예를 들어 6번째 위치에서의 Gly (Gly6)는 수용체 결합 친밀도를 악화시킴 없이 치환될 수 있다([Janaky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:972-6, 1992; Nechushtan et al., J. Biol. Chem., 272: 11597- 603, 1997]). 그래서, MPP(여기서 자연적 결합 도메인은 기능적으로 결실된다)는 생산될 수 있으며, 정화된 LHRH D-Lys6(이 리신의 엡실로 아민에서)에 공유 결합된다.

LHRH D-Lys6 (SEQ ID NO: 23)는 nPP 내 여러 위치에서 부착될 수 있어 전립선 특이적 표적 도메인을 가지는 MPP를 제공한다. 상기 기재된 바와 같이, 작은 펩티드 리간드의 부착은 포어를 형성하기 위해 막으로 삽입되는 독소의 능력을 크게 방해하지 않을 것이다. 예를 들어, D-Lys6 유사체의 엡실론 아민은 예를 들어 디카르복실산 링커를 통하는 것과 같은 당 분야에 알려진 방법을 사용하여 MPP의 아미노 말단에 커플링될 수 있다. 활성화 서열의 분열에 의한 MPP의 활성화는 C-말단 억제 부분의 방출을 일으킬 것이며, 한편 독소는 LHRH 수용체에 결합되어 있다.

대안적으로는 또는 추가적으로, 작은 펩티드 리간드는 MPP의 C-말단에 직접 결합될 수 있다. 예를 들어, LHRH의 D-Lys6 유사체의 엡실론 아민은 MPP의 C-말단에 Cys의 첨가에 의해 MPP의 C-말단 카르복실에 직접 커플링될 수 있고, 그 다음에 LHRH의 D-Lys6의 엡실론 아민에 이 Cys를 가교시킨다. 이 커플링은 LHRH 펩티드가 C-말단 억제 도메인에 부착되어 있는 MPP를 생성할 것이다. 활성화 서열의 분열에 의한 MPP의 활성화는 MPP를 자유롭게 할 것이고 LHRH 수용체에 결합된 억제 단편을 남길 것이다. 추가적으로, 재조합 융합 단백질은 생산될 수 있고, 여기서 변형된 LHRH 펩티드는 MPP의 N- 및 C- 말단에 융합된다.

작은 펩티드 리간드는 이황화 결합을 통해 MPP에 부착될 수 있음이 또한 고려된다. 예를 들어, 시스테인 잔기는 LHRH 펩티드 및 이황화 결합을 통한 MPP에 부착되는 펩티드의 6 번째 위치로 도입된다. 펩티드가 이황화 결합을 형성하는 시스테인은 자연적인 nPP 서열에 존재할 수 있거나 nPP는 변이되어 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, PA로부터 얻어지는 MPP는 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 아미노산 215 및/또는 300에서 도입되는 시스테인 잔기를 가질 수 있으며, 여기서 아미노산 215 및/또는 300은 시스테인으로 변이된다.

또 다른 구체예에서, 재조합 단백질은 생성되며, 여기서 LHRH 펩티드는 MPP의 아미노 말단으로 융합된다.

대안적으로 또는 추가적으로, MPP는 하나 이상의 전립선 특이적 표적 도메인을 MPP의 다른 아미노산에 결합 또는 연결함에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 프로에어로라이신으로부터 얻어지는 MPP에 대해, SEQ ID NO: 2 또는 4의 아미노산 215 또는 300과 같은 아미노산(예를 들어, 참조 도 5A, 5D, 6B 및 6D)은 하나 이상의 전립선 특이적 표적 도메인을 부착하기 위해 사용될 수 있다. 몇몇 실시예에서, Cys 아미노산은 그 위치에서 자연적 아미노산을 대체한다. 예를 들어, 하기 변화는 SEQ ID NO: 2 또는 4로 만들어질 수 있다: Tyr215Cys 또는 Ala300Cys. 대안적으로, nPP의 자연적 서열에 존재하는 시스테인 잔기는 활용될 수 있다. 프로에어로라이신으로부터 얻어지는 MPP에 대해, 아미노산 예를 들어 SEQ ID NO: 2의 아미노산 Cysl9, Cys75, Cys159, 및/또는 Cys164는 이 목적에 적합하다.

한 구체예에서 MPP는 프로에어로라이신으로부터 얻어지고, SEQ ID NO:24 및 25으로부터 선택되는 서열을 가지며, 이는 전립선 특이적 표적 도메인으로서 LHRH를 포함한다.

MPP 의 자연적 결합 도메인으로의 변형

본 발명에 따른 MPP는 당 분야에 알려져 있듯이, 하나 이상의 결합 도메인을 포함하는 nPP로부터 얻어진다. 본 발명의 내용에서, nPP이 하나의 결합 도메인을 포함하는 경우에, "거대엽 결합 도메인"으로 간주 된다. 본 발명에 따른 MPP는 적용될 수 있다면, 하나 이상의 결합 도메인으로의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 에어로모나스( Aeromonas ) 종으로부터의 자연적 프로에어로라이신은 소엽 결합 도메인과 거대엽 결합 도메인인 두 결합 도메인을 포함한다. 대조적으로, 클로스트리듐 셉티컴으로부터의 자연적 알파 독소는 단지 거대엽 결합 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 결합 도메인의 변형은 결합 도메인의 기능적 결실을 포함한다. MPP에서의 기능적으로 결실된 결합 도메인은 세포 표면 수용체에 결합하는 완화된 능력을 가지는, 그러나 아직까지 포어 형성 능력은 남아 있는 MPP를 야기한다. 기능적 결실은 MPP의 하나 이상의 결합 도메인을 삭제하거나 변이시킴에 의해 만들어질 수 있다. 한 구체예에서, 전체 결합 도메인 또는 이의 부분은 삭제될 수 있다. 추가적 구체예에서, 결합 도메인으로의 이종 서열의 삽입은 결합 도메인을 기능적으로 삭제하기 위해 또한 사용될 수 있다. 이 이종 서열의 추가는 MPP에 추가적 기능성을 수여할 수 있다(다시 말해, 결합 도메인의 기능적 대체). 예를 들어, 이종 서열의 추가는 본원에서 기재된 전립선 특이적 표적 도메인으로서 기능할 수 있는 영역의 첨가를 야기할 수 있다. 추가적 또 다른 구체예에서, nPP의 자연적 결합 도메인의 아미노산 서열에 점 돌연변이는 또한 이의 수용체에 결합하는 결합 도메인의 능력을 줄이게 될 수 있다. 이 변형에 대한 추가적 상한 설명은 아래에 기재되어 있다.

결합 도메인이 결여된 MPP는 이들의 세포용해성 활성을 보유하지만, 세포 막에서의 독소의 농도를 보장하기 위해 높은 용량으로 투여될 필요가 있을 수 있다. 결합 도메인에서의 기능적 결실을 가진 MPP는 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 이 방법들은 [Sambrook et al., supra]에 기재된 재조합 DNA 기술의 사용을 포함한다. 대안적으로는 결합 도메인의 기능적 결실은 또한 결과적으로 함께 화학적으로 연결될 수 있게 되는, MPP의 단편을 생성하기 위한 단백질 분해와 같은, 당 분야에 알려진 방법에 따른 단백질 그 자체의 직접적 변형에 의해 달성될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, MPP는 이의 소엽 결합 도메인(small lobe binding domain : SBD)의 기능적 결실에 의해 변형된다. SBD의 예시적인 기능적 결실은 하기와 같은 A. 히드로필라 ( hydrophila ) 프로에어로라이신 폴리펩티드에서 만들어질 수 있다. SEQ ID NO:2의 아미노산 1-83에 대응하는 전체 SBD는 삭제될 수 있거나, 이 영역의 부분은 삭제될 수 있다, 예를 들어 SEQ ID NO:2의 아미노산 45-66. 대안적으로는, 점 돌연변이는 하기 W45A, I47E, M57A,Y61A, K66Q(아미노산 수는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID N0:4를 참조)와 같이 그리고 [Mackenzie et al. J. Biol. Chem. 274: 22604-22609, 1999]에 기재된 바와 같이 만들어질 수 있다. 결합 도메인에 하나 이상의 변이를 가진 MPP의 실시예를 나타내는 개략도는 도 4D에 도시되어 있으며, 여기서 *는 하나 이상의 변이 또는 결실을 나타낸다.

본 발명의 한 구체예에서, nPP는 이의 거대엽 결합 도메인(LBD)의 기능적 결실에 의해 변형된다. MPP를 제공하도록 만들어질 수 있는 (SEQ ID NO:2의 대략적 아미노산 잔기 84-426에 함유되어 있는) 프로에어로라이신의 LBD의 예시적인 기능적 결실은 하기와 같다. 프로에어로라이신의 전체 LBD는 삭제될 수 있다. 대안적으로는, 본 발명의 한 구체예에서, 프로에어로라이신으로부터 얻어지는 MPP는 아미노산 잔기 Y162, W324, R323, R336, 및/또는 W127로의 LBD에서 하나 이상의 점 돌연변이를 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 프로에어로라이신으로부터 얻어지는 MPP는 위치 W127 및/또는 R336에서 하나 이상의 점 돌연변이를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 프로에어로라이신으로부터 얻어지는 MPP는 점 돌연변이 Y162A 및/또는 W324A를 포함한다. 추가 구체예에서, 프로에어로라이신으로부터 얻어지는 MPP는 점 돌연변이 R336A, R336C, 및/또는 W127T을 포함한다. 또 다른 구체예에서, MPP는 GPI-단백질 리간드와 직접적으로 상호작용하는 다른 잔기로의 변이를 포함한다.

알파 독소로부터 얻어지는 MPP의 LBD로의 예시적 변이들은 아래 기재되어 있고, 알파 독소의 수용체 결합 도메인에서의 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하며, 이들은 SEQ ID NO: 33에서 보여지는 자연적 알파 독소의 서열의 아미노산 잔기 53, 54, 62, 84-102, 259-274 및 309-315을 포함한다. 본 발명의 한 구체예에서, 알파 독소로부터 얻어지는 MPP는 하나 이상의 하기 잔기들로의 변이를 포함한다: W85, Y128, R292, Y293, 및 R305.

MPP 의 추가 변이

본 발명은 전립선 세포를 선택적으로 표적하는 MPP의 능력에 영향을 주지 않는 MPP의 추가 변이를 고려한다. 이러한 변형은 아미노산 치환, 삽입 또는 결실, MPP의 항원성을 줄이는 변형, 및 안정성을 높이거나 약동학을 개선하는 변형을 포함한다. 한 구체예에서, MPP에 대한 추가 변형은 MPP로부터의 단지 작은 수의 아미노산에 의해 차이가 있는 폴리펩티드를 야기한다. 이러한 변형은 (예를 들어 1-3 또는 그 이상의 아미노산의) 결실, (예를 들어 1-3 또는 그 이상의 잔기)의 삽입, 또는 치환을 포함하고, 이들은 정상적 전립선 세포를 죽이고 선택적으로 표적하는 MPP의 능력을 방해하지 않는다. 한 구체예에서, MPP에 대한 추가 변형은 MPP에 대한 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 그 이상의 서열 동일성을 보유하고, 정상적 전립선 세포를 선택적으로 표적하고 사멸시키는 MPP의 능력을 유지하는 폴리펩티드를 야기한다.

MPP는 치환에 의해 변형될 수 있고, 이로써 아미노산 서열에서의 하나 이상의 잔기는 제거되고 상이한 잔기는 그의 위치에 삽입된다. 한 구체예에서, 치환은 보존성 치환(conservative substitution)이다. 보존성 치환은 하나 이상의 아미노산(예를 들어 2, 5 또는 10 잔기)이 유사한 생물학적 특성을 가지는 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 전형적으로는, 보존성 치환들은 결과적으로 얻어지는 폴리펩티드의 활동에 영향이 거의 없다. 예를 들어, 이상적으로는, 하나 이상의 보존성 치환을 포함하는 MPP는 대응하는 nPP의 활동을 유지한다. 단백질에서의 본래의 아미노산을 위해 치환될 수 있는 그리고 보존성 치환으로서 간주되는 아미노산의 예들은 Ala을 위해 Ser; Arg를 위해 Lys; Asn를 위해 Gln 또는 His; Asp를 위해 Glu; Cys를 위해 Ser; Gln를 위해 Asn; Glu를 위해 Asp; Gly를 위해 Pro; His를 위한 Asn 또는 Gln; Ile를 위한 Leu 또는 Val; Leu를 위한 lle 또는 Val; Lys를 위한 Arg 또는 Gln; Met를 위한 Leu 또는 Ile; Phe를 위한 Met, Leu 또는 Tyr; Ser을 위한 Thr; Thr을 위한 Ser; Trp를 위한 Tyr; Tyr을 위한 Trp 또는 Phe; 및 Val을 위한 Ile 또는 Leu을 포함한다.

MPP는 예를 들어 부위-정해진 돌연변이 유발(site-directed mu태그enesis) 또는 PCR과 같은 표준 방법을 사용하여, 그 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 조직함에 의해 하나 이상의 보존성 치환을 포함하도록 변형될 수 있다. 보존성 치환에 대한 추가 정보는 [Ben-Bassat et al., (J. Bacteriol. 169:751-7, 1987)], [O'Regan et al., (Gene 77:237-51, 1989)], [Sahin-Toth et al., (단백질 Sci. 3:240-7, 1994)], [Hochuli et al., (Bio/Technology 6:1321-5, 1988)], WO 00/67796 (Curd et al.) 및 유전학 및 분자 생물학의 기본적 참고서에서 찾을 수 있다.

또 다른 구체예에서, 치환은 허용 치환(permissive substitution)이다. 허용 치환은 비 보전적 아미노산 치환이지만 MPP 활동을 크게 바꾸지 않는다. 예는 프로에어로라이신 폴리펩티드에서 SEQ ID NO: 2 또는 4의 위치 300에서 Ala를 위한 Cys의 치환이다.

한 구체예에서, MPP는 단일 잔기의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하도록 변형된다. 또 다른 구체예에서, MPP는 1개의 아미노산 치환을 포함하도록 변형된다. 또 다른 구체예에서, MPP는 약 2 내지 약 10 아미노산 치환을 포함하도록 변형된다. 추가 구체예에서, MPP는 약 3 내지 약 5 아미노산 치환을 포함하도록 변형된다.

프로에어로라이신으로부터 유도되는 MPP에 대한 추가 변형의 비 제한적 예들은 표 5에 목록화 되어 있다.

자연적 프로에어로라이신 폴리펩티드로부터 얻어지는 MPP의 예시적인 단일 변이

H107N	G202C	G251C	T284C	H341N
K22C	H121N	W203C	E252C	V285C
W127T	T253S	V293C	K361C	N459C
C164S	D216C	T253C	K294C	K369Q
Q254C	K294Q	W371L	D372N	I445C
Y135A	R220Q	E296C	K299C	K349C
Y135F	K171C	K238C	W373L	A418C
K22C	A300C	S256C	K309C	H332N
H186N	P248C	E258C	I416C	Q263C
K198C	L249C	I259C	G417C
K114C	C159S	V201C	V250C

펩티도미네틱(Peptidomimetic) 및 오가노미메틱(organomimetic) 구체예들은 또한 고려되며, 이로써 이러한 펩티도- 및 오가노미테틱의 화학적 성분들의 3차원적 배열은 폴리펩티드 주쇄 및 폴리펩티드에서의 성분 아미노산 측쇄의 3차원 배열을 모방하여, 전립선 세포를 용해시키는 능력을 가지는 MPP의 이러한 펩티도- 및 오가노미테틱을 야기한다. 컴퓨터 모델링 적용을 위해, 파마코포어(pharmacophore)는 생물학 활동을 위한 구조적 요구사항의 이상적, 3차원적 정의이다. 펩티도- 및 오가노미테틱은 (컴퓨터 보조된 약 고안 또는 CADD를 사용하여) 현재의 컴퓨터 모델링 소프트웨어와 각 파마코포어를 맞추도록 고안될 수 있다. CADD에서 사용되는 기술을 위한 기재를 위해 참조 [Walters, "Computer-Assisted Modeling of Drugs", in Klegerman & Groves, eds., 1993, Pharmaceutical Biotechnology, Interpharm Press: Buffalo Grove, 111., pp. 165-174 및 Principles of Pharmacology (ed. Munson, 1995), chapter 102].

MPP로 만들어질 수 있는 다른 변형은 예를 들어, MPP의 카르복실산 기에 대한 변형을 포함하며, 카르복실-말단이던지 또는 측쇄이던지, 여기서 이 기들은 약제학적으로 허용되는 양이온의 염의 형태 또는 C₁-C₁₆ 에스테르를 형성하도록 에스테르화되거나, 화학식 NR₁R₂(여기서, R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 H 또는 C₁-C₁₆ 알킬)의 아미드로 전환되거나, 5- 또는 6- 원 고리와 같은 헤테로사이클릭 고리를 형성하도록 통합된다. 폴리펩티드의 아미노기는 아미노 말단이던지 또는 측쇄이던지, 약제학적으로 허용되는 산 부가 염, 예를 들어 HCl, HBr, 아세트산, 벤조산, 톨루엔 설폰산, 말레산, 타르타르산 및 다른 유기 염의 형태일 수 있거나, C₁-C₁₆ 알킬 또는 디알킬 아미노로 변형될 수 있거나 아미드로 추가로 전환될 수 있다.

다른 변형은 잘 인식된 기술을 사용하여 폴리펩티드 측쇄의 하이드록실 기의 C₁-C₁₆ 알콕시로의 또는 C₁-C₁₆ 에스테르로의 전환을 포함한다. 폴리펩티드 측쇄의 페닐 및 페놀 고리는 하나 이상의 할로겐 원소, 예를 들어 F, Cl, Br 또는 I로 치환될 수 있거나, C₁-C₁₆ 알킬, C₁-C₁₆ 알콕시, 이의 카르복실산 및 에스테르, 또는 이러한 카르복실산의 아미드로 치환될 수 있다. 폴리펩티드 측쇄의 메틸렌 기는 동종 C₂-C₄ 알킬렌으로 연장될 수 있다. 티올은 아세타미드 기와 같은 다수의 잘 인식된 보호 기 중 임의의 하나에 의해 보호될 수 있다. 당업자는 증가된 안정성에 기인하는 구조에 대한 입체형태 압박(conformational constraint)을 선택하고 제공하도록 본원에 기재된 폴리펩티드에 사이클릭 구조를 도입하는 방법을 또한 인식할 것이다. 예를 들어, 카르복실-말단 또는 아미노-말단 시스테인 잔기는 폴리펩티드에 첨가될 수 있어, 그래서 산화되는 경우에, 폴리펩티드는 디설피드 결합을 함유하고, 사이클릭 펩티드를 생성한다. 다른 펩티드 사이클화 방법은 티오에테르 및 카르복실- 및 아미노-말단 아미드 및 에스테르의 형성을 포함한다.

본 발명은 또한 MPP에 대한 추가 변형을 고려하며, 여기서 MPP는 표면, 예를 들어 비드에 연결되거나 고정된다. 비드는 또한 전립선 세포에 대한 표적화를 향상시키기 위해 전립선-특이적 리간드를 포함할 수 있다. 고정됨은 표면, 예를 들어 고체 표면에 결합함을 칭한다. 고체 표면은 고분자, 예를 들어 폴리스티렌 또는 폴리프로필렌일 수 있다. 고체 표면은 비드의 형태일 수 있다. 하나의 구체예에서, 표면은 고정된 MPP를 포함하며, 다른 구체예에서, 하나 이상의 전립선-특이적 결합 리간드, 예를 들어 LHRH 펩티드, PSMA 항체, 및 PSMA 단일 사슬 항체를 추가로 포함한다. 또다른 구체예에서, MPP는 비드가 전립선 세포 표적에 도달하자마자 비드로부터 유리된다. 고체 표면 상에 펩티드를 고정시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, WO 94/29436호 및 미국특허 제5,858,358호에서 확인될 수 있다.

본 발명은 MPP가 피검체에 투여될 때 분자의 약물동역학 성질을 개선시키도록 의도된 추가 변형을 포함할 수 있음을 추가로 고려한다. 면역원성을 감소시키고/거나 치료학적 단백질의 반감기를 개선시키기 위한 여러 변형은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, MMP는 당업계에 공지된 표준 방법에 따라 글리코실화, 이성질체화, 또는 탈글리코실화로 처리될 수 있다. 유사하게는, MPP는 비-천연 발생 공유적 변형에 의해, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 부분의 첨가(페그화) 또는 지질화에 의해 변형될 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 MPP는 이의 약물동역학 프로필을 개선시키기 위해 폴리에틸렌 글리콜(페그화된, PEGylated)에 컨쥬게이팅된다. 컨쥬게이션은 당업자에게 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다[예를 들어, Deckert et al., Int.J.Cancer 87: 382-390, 2000; Knight et al., Platelets 15: 409-418, 2004; Leong et al., Cytokine 16: 106-119, 2001; 및 Yang et al., Protein Eng. 16:761-770, 2003]. 일 구체예에서, 항원성 에피토프는 동정되고 돌연변이 유발에 의해 개조될 수 있다. 항원성 에피토프를 동정하는 방법은 이러한 항원성 에피토프를 돌연변이시키는 방법으로서 당업계에 공지되어 있다[예를 들어, Sette et al., Biologicals 29: 271-276].

MPP 를 제조하는 방법

본 발명에 따른 MPP는 당업계에 공지된 많은 표준 방법에 의해 제조될 수 있다. MPP에 대한 변형은 예를 들어, 재조합 DNA 기술을 사용하여 MPP를 엔코딩하는 핵산을 공학적 처리하므로써 제조될 수 있다. 대안적으로, MPP에 대한 변형은 화학적 변형 및/또는 제한된 단백질 가수분해를 사용하여 MPP 폴리펩티드 자체를 변형시키므로써 이루어질 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같은 이러한 방법의 조합은 또한 본 발명에 따른 MPP를 제조하는데 사용될 수 있다.

재조합 방법을 사용한 MPP 의 제조

당업계에 공지된 바와 같이, 단백질의 유전공학은 일반적으로 단백질을 엔코딩하는 핵산이 먼저 분리되고 클로닝됨을 요구한다. 다양한 nPP에 대한 서열은 본원에 기술된 바와 같이 유전자은행(GenBank)로부터 입수가능하다. 따라서, 이러한 단백질을 엔코팅하는 핵산 서열의 분리 및 클로닝은 표준 기술을 사용하여 달성될 수 있다[예를 들어, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, NY (1997 및 업데이트); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold-Spring Harbor Press, NY (2001)]. 예를 들어, 핵산 서열은 표준 기술에 의해 mRNA를 추출한 후 mRNA 주형으로부터 cDNA를 (예를 들어, RT-PCR에 의해) 합성하므로써, 적절한 유기체, 예를 들어 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila)로부터 직접 수득될 수 있다. 대안적으로, nPP를 엔코딩하는 핵산 서열은 표준 과정에 의해 적절한 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리(library)로부터 수득될 수 있다. 분리된 cDNA 또는 게놈 DNA는 이후 적절한 벡터에 삽입된다. 당업자는 사용되는 정확한 벡터가 본 발명에서 중요하지 않은 것으로 이해될 것이다. 적절한 벡터의 예는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 박테리오파지, 바쿨로바이러스, 레트로바이러스 또는 DNA 바이러스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 벡터는 클로닝 벡터일 수 있거나 발현 벡터일 수 있다.

nPP를 엔코딩하는 핵산 서열이 수득되자마자, 하나 이상의 결합 도메인 또는 활성 서열의 돌연변이는 당업계에서 널리 공지된 시험관내 사이트-지향된 돌연변이 유발에 의해 특이적이고 사전에 선택된 위치에 도입될 수 있다. 돌연변이는 코딩 서열을 구성하는 하나 이상의 적절한 뉴클레오티드의 결실, 삽입, 치환, 역전, 또는 이의 조합에 의해 도입될 수 있다. 이는 예를 들어 프라이머가 하나 이상의 뉴클레오티드 불일치, 삽입 또는 결실을 도입하도록 고안하기 위한 PCR 계열 기술에 의해 달성될 수 있다. 돌연변이의 존재는 여러 표준 기술에 의해, 예를 들어 제한 분석에 의해 또는 DNA 염기순서분석(DNA sequencing)에 의해 입증될 수 있다.

요망되는 경우, 적절한 돌연변이 또는 돌연변이들을 도입한 후에, MPP를 엔코딩하는 핵산 서열은 적절한 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 적절한 발현 벡터의 예로는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 박테리오파지, 바쿨로바이러스, 및 레트로바이러스, 및 DNA 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

당업자는 발현 벡터가 MPP-엔코딩 서열의 효과적인 전사를 위해 요구되는 조절 요소, 예를 들어 전사 요소를 추가로 포함할 수 있다. 벡터로 도입될 수 있는 조절 요소의 예로는 프로모터, 인핸서, 종료자, 및 폴리아데닐화 신호를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 그러므로, 본 발명은 유전공학적으로 처리된 MPP를 엔코딩하는 핵산 서열에 유효하게 연결된 조절 요소를 포함하는 벡터를 제공한다. 당업자는 적절한 조절 요소의 선택이 유전공학적으로 처리된 MPP를 발현시키기 위해 선택된 숙주 세포에 따르며, 이러한 조절 요소가 박테리아, 균류, 바이러스, 포유류 또는 곤충 유전자를 포함하는 다양한 소스로부터 유도될 수 있는 것으로 이해될 것이다.

예를 들어, 테스토스테론 및 다른 안드로겐에 반응적인 전립선-특이적 프로모터는 전립선 세포에서 유전자 발현을 촉진시키기 위해 사용될 수 있다. 이의 예로는 프로바신 프로모터; 전립선 특이적 항원 (PSA) 프로모터; 전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 프로모터; 및 인간 샘 칼리크레인 2 (HK2) 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 정황에서, 발현 벡터는 발현된 MPP의 정제를 촉진시키는 이종기원 핵산 서열을 부가적으로 함유할 수 있다. 이러한 이종기원 핵산 서열의 예로는 친화성 태그, 예를 들어 금속-친화성 태그, 히스티딘 태그, 아비딘/스트렙타비딘 엔코딩 서열, 글루타티온-S-전이효소(GST) 엔코딩 서열, 및 바이오틴 엔코딩 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 핵산의 발현에 대응하는 아미노산은 당업계에 공지된 방법에 따라 사용하기 전에 발현된 MPP로부터 제거될 수 있다. 대안적으로는, 이종기원 핵산 서열의 발현에 대응하는 아미노산은 MPP 상에 유지될 수 있으며, 단 이는 전립선 세포를 표적화하고 사멸시키는 MPP의 능력을 방해하지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, MPP는 히스티딘 태그된 단백질로서 발현된다. 다른 구체예에서, 히스티딘 태그는 MPP의 카르복실 말단에 위치된다.

발현 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법 중 하나에 의해 적절한 숙주 세포 또는 조직에 도입될 수 있다. 이러한 방법들은 문헌(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, NY (1997년 및 업데이트); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold-Spring Harbor Press, NY (2001))에 일반적으로 기술되어 있으며, 예를 들어, 안정적이거나 임시적인 트랜스팩션(transfection), 리포펙션(lipofection), 전기천공, 및 재조합 바이러스 벡터로의 감염을 포함한다. 당업자는 MPP의 발현을 위한 적절한 숙주 세포의 선택이 선택된 벡터에 따르는 것으로 이해될 것이다. 숙주 세포의 예로는 박테리아, 효모, 곤충, 식물 및 포유동물 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 특이적인 요망되는 방식으로 유전자 산물을 변형시키고 가공하는 숙주 세포가 선택될 수 있다. 단백질 산물의 이러한 변형(예를 들어, 글리코실화) 및 가공(예를 들어, 분할)은 단백질의 기능에 대해 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 산물의 전사후 가공 및 변형을 위한 특징 및 특이적 메카니즘을 갖는다. 발현된 외래 단백질의 보정 변형 및 가공을 확보할 수 있는 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 이 때문에, 적절한 1차 전사의 가공을 위해, 및 유전자 산물의 글리코실화 및 포스포릴화와 같은 전사후 변형을 위한 세포 기구를 갖는 진핵생물 숙주가 사용될 수 있다. 이러한 포유류 숙주세포는 CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

단백질을 클로닝시키고 발현시키는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 재조합 단백질의 발현을 위한 기술 및 시스템에 대한 상세한 설명은 예를 들어 문헌(Current Protocols in Protein Science (Coligan, J.E., et al., Wiley & Sons, New, York))에 기술되어 있다. 분자생물학 분야의 기술자는 광범위한 발현 시스템이 재조합 단백질을 제공하기 위해 이용될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 사용되는 정확한 숙주 세포는 본 발명에서 중요하지 않다. 따라서, 본 발명은 MPP가 원핵생물 숙주(예를 들어, E. coli , A. salmonicida 또는 B. subtilis) 또는 진핵생물 숙주(예를 들어, Saccharomyces 또는 Pichia; 포유동물 세포, 예를 들어 COS, NIH 3T3, CHO, BHK, 293 또는 HeLa 세포; 또는 곤충 세포)에서 생산될 수 있는 것으로 고려된다.

MPP는 당업계에 공지된 표준 기술에 의해 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 요망되는 경우, 아미노산 서열의 단백질로의 공학적 변경은 본래 단백질 또는 이의 원핵생물 단편을 사용하여 표준 펩티드 서열분석 기술에 의해 결정될 수 있다.

돌연변이를 천연 발생 포어 형성 단백질에 도입하는 직접적인 방법에 대한 대안으로서, 포어 형성 유전자를 발현시키는 클로닝된 유전자는 당업계에 공지된 기술에 의해 랜덤 돌연변유발시킬 수 있다. 이후 이에 따라 생성된 단백질의 돌연변이 형태의 발현 및 스크리닝은 본 발명에 따라 MPP를 동정하고 분리할 수 있다.

본 발명에 따른 MPP는 또한 단편 또는 융합 단백질로서 제조될 수 있다. 융합 단백질은 정상 전립선 세포를 선택적으로 표적화하고 사멸시키는 MPP의 능력을 억제하지 않는 다른 아미노산 서열에 연결된 MPP를 포함하는 것이다. 일 구체예에서, 다른 아미노산 서열은 5, 5, 7, 8, 9, 10, 20, 30 또는 50개 이하의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다.

융합 단백질을 제조하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 미국특허번호 제6,057,133호에는 인간 인터루킨-3 (hIL-3) 변이체 또는 제 2 콜로니 자극 인자, 사이토카인, 림포카인, 인터루킨, 조혈성장인자 또는 IL-3 변이체에 기능적으로 연결된 돌연변이 단백질로 이루어진 융합 단백질을 제조하기 위한 방법을 기술하고 있다. 데이비스 등(Davis et al.)의 미국특허번호 제6,072,041호에는치료 단백질에 공유 결합된 트랜스사이토틱(transcytotic) 수용체에 대해 지향된 단일 사슬 Fv 분자를 포함하는 융합 단백질의 발생을 기술하고 있다.

다른 아미노산 서열, 예를 들어 전립선 특이적 표적 도메인(예를 들어, LHRH 또는 항체)에 연결된 MPP(또는 이의 변이체, 단편 등)를 포함하는 융합 단백질을 생성시키기 위한 유사한 방법이 사용될 수 있다. 링커 영역은 단백질의 두 부분을 서로 이격시키고, 이들 사이에 유연성을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 링커 영역은 대개 길이가 1 내지 500개 아미노산, 예를 들어 30개 미만 아미노산인 폴리펩티드이다. 일반적으로 두개의 분자를 결합하는 링커는 (1) 두개의 분자를 서로 독립적으로 폴딩하거나 작용할 수 있고, (2) 두개의 단백질의 작용성 도메인을 방해할 수 있는 정렬된 2차 구조를 발달시키려는 경향을 갖지 않고, (3) 작용성 단백질 도메인과 상호작용할 수 있는 최소의 소수성 또는 하전된 특징을 갖고/거나 (4) 두개 영역의 입체적 분리를 제공할 수 있도록 고안될 수 있다. 통상적으로, 가요성 단백질 영역에서 표면 아미노산은 Gly, Asn 및 Ser를 포함한다. 다른 천연 아미노산, 예를 들어 Thr 및 Ala는 또한 링커 서열에 사용될 수 있다. 추가적인 아미노산은 융합의 구조를 촉진시키는 링커 서열에서 독특한 제한 사이트를 제공하기 위해 링커에 포함될 수 있다. 다른 부분은 또한 요망되는 경우 포함될 수 있다. 이들은 결합 영역, 예를 들어 아비딘 또는 에피토프, 또는 태그, 예를 들어 폴리히스티딘 태그를 포함할 수 있으며, 이는 융합 단백질의 정제 및 가공을 위해 유용할 수 있다. 또한, 검출가능한 마커는 융합 단백질에 부착되어, 신체 또는 세포를 통해 융합 단백질의 통행이 편리하게 모니터링될 수 있도록 할 수 있다. 이러한 마커는 방사성 핵종, 효소, 형광발색단 등을 포함한다.

다른 단백질(또는 이의 변이체, 단편 등)의 핵산 서열과 MPP의 핵산 서열의 융합은 중간 벡터의 사용에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로는, 하나의 유전자는 다른 하나의 유전자를 함유하는 벡터에서 직접적으로 클로닝될 수 있다. 링커 및 접합기(adapter)는 핵산 서열을 결합시키고, 손실(lost) 서열을 대체하기 위해 사용될 수 있으며, 여기서 제한 사이트는 고려되는 영역에 대해 내재적이다. 하나의 폴리펩티드, 펩티드 링커, 및 다른 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전 물질(DNA)은 원핵 세포 또는 진핵 세포, 예를 들어 박테리아, 효모, 곤충 세포 또는 포유류 세포를 변형시키는데 사용되는 적절한 발현 벡터에 삽입된다. 변형된 유기체는 성장하고, 단백질은 표준 기술, 예를 들어 검출가능한 마커, 예를 들어 폴리히스티딘 태그가 사용되는 경우 니켈-킬레이트 친화력 크로마토그래피를 사용하여 분리된다. 그러므로, 얻어진 산물은 신규한 단백질, 융합 단백질이며, 이는 임의적으로 링커를 통해 제 2 단백질에 결합된 MPP를 갖는다. 융합 단백질이 발현된 것을 확인하기 위하여, 정제된 단백질은 예를 들어 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동을 수행하고, 입증된 방법을 사용하여 니트로셀룰로오스 막 필터 상으로 옮길 수 있다. 단백질 산물은 개개 성분들, 예를 들어 폴리히스티딘 태그 및/또는 MPP에 대해 지시된 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 동정될 수 있다.

본 발명에 따른 MPP가 융합된 유전자의 발현에 의해 생산되는 경우, 펩티드 결합은 MPP와 전립선-특이적 표적화 도메인 사이의 링커로서 제공된다. 예를 들어, 항체 및 포어 형성 단백질 독소(toxin)의 단일 사슬 Fv 단편의 재조합 융합 단백질은 당해 분야에서 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다[예를 들어, Huston et al., Meth. Enzymol. 203: 46-88, 1991].

당업자는 DNA가 엔코딩된 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 수많은 방법으로 변경될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, PCR은 MPP를 엔코딩하는 DNA 서열에서 변이체를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. MPP를 엔코딩하는 DNS 서열에서 이러한 변이체는 단백질을 발현시키기 위해 사용되는 숙주 세포에서 바람직한 코돈을 최적화하기 위해 사용될 수 있거나 발현을 촉진시키는 다른 서열 변화를 함유할 수 있다.

MPP 를 제조하는 다른 방법

상술된 전립선-특이적 표적화 도메인 및 임의적 링커는 공유 결합, 또는 비공유결합, 또는 둘모두를 통해 본 발명의 MPP에 첨가될 수 있다. 비공유 상호작용은 루신-지퍼 또는 항체-단백질 G 상호작용에서 수반되는 상호작용과 같은 이온성, 소수성, 또는 친수성일 수 있다[Derrick et al., Nature 359: 752, 1992]. 부가적인 비공유 상호작용의 예로는 하기 결합 쌍을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 항원 또는 합텐(hapten)과 항체; 항체와 안티-항체; 수용체와 리간드; 효소 또는 효소 단편과 기질, 기질 유사체 또는 리간드; 바이오틴 또는 렉틴과 아비딘 또는 스트렙타비딘; 렉틴과 탄수화물; 루신 지퍼 모티프의 쌍(예를 들어, 미국특허번호 제5,643,731호), 및 당업계에 공지된 다양한 동종이합체 및 이종이합체. 당업계에 공지된 바와 같이, MPP는 결합 쌍 중 하나의 부재를 포함하도록 변형될 수 있으며, 전립선-특이적 표적화 도메인은 결합 쌍 중 다른 하나의 부재를 포함하도록 변형될 수 있다.

공유 결합은 디설파이드 결합의 형태를 가질 수 있다. 성분들 중 하나를 엔코딩하는 DNA는 독특한 시스테인 코돈을 함유하도록 공학처리될 수 있다. 대안적으로는, 천연 발생 시스테인 잔기로 이루어질 수 있다. 제 2 성분은 제 1 성분의 시스테인과 반응적인 설프히드릴기와 유도체화될 수 있다. 대안적으로는, 설프히드릴기는 자체적으로 또는 시스테인 잔기의 일부로서, 고체상 폴리펩티드 기술을 사용하여 도입될 수 있다. 예를 들어, 펩티드에 설프히드릴기의 도입은 히스키(Hiskey; 펩티드 3: 134, 1991)에 의해 기술되었다.

단백질은 설프히드릴기를 첨가하기 위해 표준 기술에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 트라우트 제제(Traut's reagent)(2-이미노티올란-HCl)(Pierece Chemicals, Rockford, III)은 1차 아민, 예를 들어 라이신 잔기 또는 N-말단 아민 상에 설프히드릴 기를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 트라우트 제제로 변형된 단백질 또는 펩티드는 이후 단백질 또는 펩티드와 반응할 수 있으며, 이는 제제, 예를 들어 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 또는 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC)로 변형된 것이다[Pierce Chemicals, Rockford, III].

각 성분 상에 교정 설프히드릴 기가 존재하자마자, 두개의 성분들은 정제되고, 각 성분 상의 황 기들은 감소되며; 성분들은 혼합되고; 디설파이드 결합 형성은 실온에서 완전하게 처리될 수 있다. 커플링 반응의 효능을 개선시키기 위하여, 성분들 중 하나의 시스테인 잔기, 예를 들어 시스테인-MPP는 반응 혼합물에 첨가하기 전에 당업계에 공지된 방법을 사용하여 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조)산 (DTNB) 또는 2,2'-디티오피리딘으로 활성화될 수 있다. 반응 후에, 혼합물은 포스페이트 완충된 염수에 대해 투석되어 비컨쥬게이팅된 분자를 제거한다. 세파덱스 크로마토그래피 등이 이후 수행되어 크기 기준으로 이의 조성 부분으로부터 본 발명의 화합물을 분리한다.

성분들은 또한 문헌(Maiti et al., Int.J.Cancer Suppl. 3: 17-22, 1988)에 기술된 바와 같이, 중합체, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜 (mPEG)을 사용하여 결합될 수 있다.

전립선-특이적 표적화 도메인 및 nPP 또는 MPP는 또한 당업계에 공지된 바와 같은 표준 컨쥬게이션 화학물질, 예를 들어 카르보디이미드-매개된 커플링(예를 들어, DCC, EDC 또는 활성화된 EDC)의 사용, 및 엡실론 아미노기를 가교를 위한 티올로 전환시키는 2-이미노티올란 및 가교제로서 말레이미도벤조일-n-히드록시숙신이미딜 에스테르(MBS)의 사용을 통해 컨쥬게이트될 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 다른 컨쥬게이션 방법은 전립선-특이적 표적화 도메인 및 nPP 또는 MPP를 결합하기 위해 사용될 수 있다.

MPP 의 대규모 스케일 제조

MPP의 제조는 또한 당업계에 공지된 표준 기술, 예를 들어 재조합 단백질의 생산을 위한 대규모 스케일 발효, 및 초미세여과, 이온교환 크로마토그래피, 재조합 단백질의 정제를 위한 고정된 금속 이온 친화력 크로마토그래피를 사용하여 대규모 스케일, 예를 들어 생산 목적으로 수행될 수 있다.

MPP 를 시험하는 방법

본 발명에 따른 MPP는 이러한 포어 형성 활성을 유지시키고 전립선 세포를 선택적으로 사멸시킨다. 전립선 세포를 선택적으로 사멸시키는 MPP의 능력은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 시험될 수 있다. 후보 MPP를 시험하는 대표적인 방법은 하기 및 본원에 포함된 실시예에 제공되었다. 당업자는 후보 MPP를 시험하는 다른 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 또한 본 발명에 따라 MPP를 시험하는데 적절한 것으로 이해될 것이다.

시험관내 방법

전립선-특이적 활성 서열을 함유하는 본 발명에 따른 MPP는 당업계에 공지된 방법에 따른 적절한 전립선-특이적 프로테아제에 의해 분할되는 이의 능력에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, MPP는 다양한 농도의 적절한 프로테아제와 함께 인큐베이션될 수 있고, 인큐베이션 산물은 SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동될 수 있고, MPP의 분할은 겔 상에서 폴리펩티드의 크기를 시험하므로써 평가될 수 있다.

프로테아제와 인큐베이션된 MPP가 포어 형성 활성을 유지하는 경우, 이에 따라 프로테아제와 인큐베이션한 후 세포를 사멸시키는 능력을 측정하기 위하여, 반응 산물은 당업계에 공지된 용혈 검정법으로 시험될 수 있다. 적절한 검정법의 예는 문헌(Howard, S.P., and Buckley, J.T. 1985. Activation of the hole-forming toxin aerolysin by extracellular processing. J. Bacteriol. 163: 336-340)에 기술되어 있다.

본 발명에 따른 MPP는 당업계에 공지된 바와 같이 전립선 세포를 사멸시키는 이의 능력에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, 전립선 세포를 사멸하는 MPP의 능력은 적절한 전립선 세포주를 사용하여 시험관내에서 검정될 수 있다. 일반적으로, 선택된 시험 세포주의 세포는 적합한 밀도로 성장되고, 후보 MPP가 첨가된다. 적합한 인큐베이션 시간(예를 들어, 약 48 내지 72 시간) 후에, 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율을 결정하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 래사주린(resazurin) 환원 시험(Field & Lancaster (1993) Am. Biotechnol. Lab. 11:48-50; O'Brien et al., (2000) Eur. J. Biochem. 267: 5421-5426 및 미국특허번호 제5,501,959), 설포로다민(sulforhodamine) 검정법(Rubinstein et al., (1990) J. Natl. Cancer Inst. 82: 113-118) 또는 중성 적색 염료 시험(Kitano et al., (1991) Euro. J. Clin. Investg. 21: 53-58; West et al., (1992) J. Investigative Derm. 99: 95-100) 또는 트립판 블루 검정법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 수많은 상업적으로 입수가능한 키트는 또한 예를 들어 셀타이터 96(CellTiter 96^®일 수용액 세포 증식 검정(AQueous One Solution Cell Proliferation Assay)(Promega)를 사용할 수 있다. 세포독성은 처리된 배양물에서의 세포 생존률과 하나 이상의 대조군 배양물, 예를 들어 처리되지 않은 배양물 및/또는 대조군 화합물(통상적으로 공지된 치료제)로 미리 처리된 배양물, 또는 다른 적합한 대조군에서의 세포 생존율을 비교하므로써 결정된다. 정상 전립선 세포를 사멸시키는데 효과적인 것으로 여겨지는 MPP는 세포 생존률을 예를 들어, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 또는 50% 이상 감소시킬 수 있다.

전립선-특이적 표적화 도메인을 포함하는 MPP는 전립선 세포를 선택적으로 표적화하기 위한 이의 능력에 대해 예를 들어, 다른 조직으로부터의 세포를 사멸시키는 MPP의 능력과 정상 전립선 세포를 사멸시키는 MPP의 능력을 비교하므로써 평가될 수 있다. 대안적으로는, 당업계에 공지된 흐름 유세포 분석법은 전립선-특이적 표적화 도메인을 포함하는 MPP가 전립선 세포를 선택적으로 표적화할 수 있는 경우를 결정하는데 사용될 수 있다. 또다른 예로서, 전립선-특이적 표적화 도메인에 대한 결합 리간드는 인공 지질 막에 도입될 수 있으며, 채널을 형성시키기 위한 MPP의 능력은 당업자에게 익숙한 방법을 사용하여 측정될 수 있다.

전립선 세포를 명확하게 용해하기 위한 이의 능력에 대해 본 발명에 따른 MPP를 시험하기 위해 사용될 수 있는 검정법은 예를 들어, 실시예 2 및 3에 기술되어 있다. 예를 들어, PSA 분할 사이트를 갖는 MPP는 비-PSA 생성 세포를 용해시키는 이의 능력과 비교하여 PSA-생성 세포를 명확하게 용해하기 위한 이의 능력에 대해 평가될 수 있다. PSA-생성 세포(예를 들어 전립선 세포)와 접촉하는 경우에 본 발명에 따른 MPP는 비-PSA 생성 세포를 사멸시키는데 요구되는 것보다 낮은 농도, 예를 들어 적어도 2배, 5배, 10배, 또는 100배 낮은 농도로 세포의 용해 및 사멸을 증진시킨다.

후보 MPP를 시험하는데 적절한 다양한 전립선 세포주는 당업계에 공지되어 있으며, 많은 전립선 세포주는 상업적으로 입수가능하다(예를 들어, American Type Culture Collection, Manassas, VA로부터). 시험관내 시험을 위한 적절한 전립선 세포주의 예로는 PNT1A, PNT2, BPH-1, DuK50, NRP152, PS-1 세포주를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

필요한 경우, 비-전립선 세포에 대한 MPP의 독성도는 초기에 표준 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 인간 원시 섬유모세포를 시험관내에서 MPP로 감염시키고, 이후 표준 생존력 검정법, 예를 들어 상술된 검정법, 또는 트립판-블루 배제 검정법을 사용하여 이의 생존력에 대해 치료 후 상이한 시점에서 시험한다. 세포는 또한 예를 들어 티미딘 도입 검정법을 사용하여 DNA를 합성하기 위한 이의 능력, 및 예를 들어 유세포분리기(fluorocytometer cell sorter, FACS)와 결합된 표준 세포 분류 검정법을 사용하여 세포 주기 동역학의 변화에 대해 평가될 수 있다.

혈장 또는 혈청에서 본 발명에 따른 MPP의 활성도는 또한 당업계에 공지된 바와 같이 시험될 수 있다. 예를 들어, MPP는 적절한 시간 동안 혈청과 함께 인큐베이션될 수 있으며, 이후 MPP의 활성 정도를 예를 들어 전기영동 및 활성화된 MPP에 대응하는 전기영동된 밴드의 농도계측식(densitometric) 분석법을 사용하여 측정된다.

생체내 방법

본 발명에 따른 MPP의 독성도는 당업계에 공지된 방법에 따라 생체내에서 시험될 수 있다. 예를 들어, MPP의 전체 전신 독성도는 실시예 4에 기술된 일회 정맥내 주사 후에 100%의 마우스를 사멸시키는 용량(즉, LD₁₀₀)을 측정하므로써 시험될 수 있다. MPP의 전신 또는 전립선내 투여로 인한 독성도는 예를 들어 개, 랫트 또는 원숭이에 MPP를 투여하므로써 생체내에서 평가될 수 있다.

BPH의 치료를 위한 적합성을 나타내는 전립선의 크기를 감소시키기 위한 본 발명에 따른 MPP의 능력은 당업계에 공지된 동물 모델을 사용하여 생체내에서 시험될 수 있다. 예를 들어, MPP의 생체내 활성은 개, 또는 비-인간 영장류, 예를 들어 키노몰구스 원숭이, 침팬지 및 비비(baboo)를 사용하여 시험될 수 있다. MPP는 예를 들어, 항문주위 전립선내 주사로 투여될 수 있다. 투여 후 전립선 부피의 변화는 예를 들어, 자기공명영상법 또는 전립선 조직의 사후 시험 및/또는 전립선 중량의 결정에 의해 평가될 수 있다.

상술된 바와 같이, 동물 모델에서 전립선의 크기를 감소시키거나 전립선의 추가 성장을 감쇄시킬 수 있는 MPP는 BPH의 치료에 대해 적절한 것으로 여겨진다. 전립선 크기의 감소는 전립선 중량 또는 부피의 감소시킴을 칭하며, 전립선의 추가 성장의 감쇄는 시험 화합물의 투여 후 동물에서 전립선 중량 또는 부피의 최소한의 증가 또는 전혀 증가되지 않는 상황을 칭한다. 일 구체예에서, 동물에 투여되는 경우, 본 발명의 의해 고려되는 MPP는 전립선 크기를 예를 들어 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 감소시킬 수 있다.

MPP 항원성의 측정 및 감소

치료학적 단백질은 피검체에 투여될 때 어느 수준의 항체 반응을 유도하며, 이는 몇몇 경우에서 잠재적으로 심각한 부작용을 초래할 수 있다. 그러므로, 필요한 경우, MPP의 항원성은 당해 분야에 공지되고 하기에 기술된 바와 같이 평가될 수 있다. 또한, 잠재적 항원성을 감소시키는 방법이 기술되어 있다.

본원에 기술된 MPP에 대한 항체 반응의 동역학 및 크기는 예를 들어 면역성 마우스에서 측정될 수 있고, 면역성 인간에서 사용될 수 있는 투약 방법의 개발을 촉진시키는데 사용될 수 있다. 면역성 마우스, 예를 들어 균주 C57-BL6은 MPP의 정맥내 용량으로 투여된다. 마우스는 여러 간격으로 희생시키고(예를 들어, 단일 투약 후, 다중 투약 후), 혈청을 수득하였다. ELISA-계열 검정법은 안티-MPP 항체의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따라 MPP의 항원성을 감소시키기 위하여, MPP의 본래 결합 도메인은 기능적으로 삭제되고 예를 들어 상술된 바와 같이 전립선-특이적 표적 도메인으로 대체된다. 이러한 MPP의 항원성은 상술된 방법을 사용하여 본래 결합 도메인의 부분이 결여된 MPP의 여러 스케줄로 노출시킨 후에 결정될 수 있다. MPP로 연속 처리하는데 사용될 수 있는 다른 방법은 비-중첩 항원성을 지닌 다른 nPP로부터 유도된 순차적으로 투여된 대체 MPP을 사용하는 것이다. 예를 들어, 프로에어로라이신으로부터 유도된 MPP는 대안적으로는 클로스트리듐 셉티컴(Clostridium septicum) 알파 독소 또는 바실러스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) 델타-독소와 함께 사용될 수 있다. 이러한 모든 MPP는 전립선 세포를 표적화하지만, 동일한 항체에 의해 인식되거나 무력화되지 않을 것이다. 또다른 예로는 인간 조직, 예를 들어, 세포용해 인간 T 세포에 의해 생성된 인간 퍼포린으로부터 유래된 MPP를 사용하는 것이다. 이러한 MPP는 투여될 수 있지만, 단백질이 인간 기원이기 대문에 항체 반응을 생성시키지 못한다.

약제 조성물

본 발명은 MPP, 및 하나 이상의 비독성 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 및/또는 어쥬번트(adjuvant)를 포함하는 약제 조성물을 제공한다. 요망되는 경우, 다른 활성 성분이 이러한 조성물에 포함될 수 있다. 상술된 바와 같이, 이러한 조성물은 BPH의 치료에 사용된다.

약제 조성물은 약 1% 내지 약 95%의 본 발명의 MPP를 포함할 수 있다. 단일 투약 형태로 투여하기 위해 제형화된 조성물은 예를 들어 약 20% 내지 약 90%의 본 발명의 MPP를 포함할 수 있으며, 단일 투약 형태를 갖지 않는 조성물은 예를 들어 약 5% 내지 약 20%의 본 발명의 MPP를 포함할 수 있다. 최종 제형에서 MPP의 농도는 0.01 ㎍/ml로 낮을 수 있다. 예를 들어, 최종 제형에서의 농도는 약 0.01 ㎍/ml 내지 약 1,000 ㎍/ml일 수 있다. 하나의 구체예에서, 최종 제형에서의 농도는 약 0.01 ㎍/ml 내지 약 100 ㎍/ml이다. 비제한적인 단위 투약 형태의 예로는 당의정, 정제, 앰플, 바이얼, 좌약 및 캡슐을 포함한다. 비제한적인 단위 투약 형태의 예로는 당의정, 정제, 앰플, 바이얼, 좌약 및 캡슐을 포함한다.

이러한 조성물은 액상 용액, 현탁액, 에멀젼제, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제형, 또는 분말일 수 있다. 고체 조성물(예를 들어, 분말, 환약, 정제 또는 캡슐 형태)에 대해, 통상적인 비-독성 고체 담체로는 예를 들어, 약제학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 나트륨 사카린, 셀룰로오스, 마그네슘 카르보네이트, 또는 마그네슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 좌약으로서, 통상적인 결합제 및 담체, 예를 들어 트리글리세라이드로 제형화될 수 있다.

동물에 투여하기 위하여, 약제 조성물은 다양한 경로로 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, 이러한 조성물은 경구, 국소, 직장 또는 비경구 투여를 위해, 또는 흡입 또는 분무에 의해 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 전립선에 직접 주사 또는 주입이 또한 고려된다. 대류 향상된 전달, 단백질 독소에 대한 표준 투여 기술이 또한 본 발명에 의해 고려된다.

MPP는 약제학적으로 허용되는 비히클로 전달될 수 있다. 이상적으로는, 이러한 비히클은 안정성 및/또는 전달 성질을 향상시킬 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 적절한 비히클, 예를 들어 인공 막 비히클(리포좀, 노이좀, 나노좀 등을 포함), 마이크로입자 또는 마이크로캡슐을 지닌 MPP의 제형, 또는 약제학적으로 허용되는 폴리머를 포함하는 콜로이드성 제형으로서 제공된다. 이러한 비히클/폴리머의 사용은 MPP의 지연된 방출을 달성하는데 유익할 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, MPP 제형은 생체내의 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민을 안정화시키기 위한 첨가제, 또는 당업계에 공지된 단백질 치료제를 위한 다른 안정화제를 포함할 수 있다.

경구 용도를 위한 약제 조성물은 예를 들어, 정제, 트로치(troche), 로젠지(lozenge), 수성 또는 오일성 현탁액, 분산성 분말 또는 미립자, 에멀젼 경질 또는 연질 캡슐, 또는 시럽 또는 엘릭시르(elixir)로서 제형화될 수 있다. 이러한 조성물은 약제 조성물의 제조를 위해 당업계에 공지된 표준 방법에 따라 제조될 수 있고, 약제학적으로 안락하고 맛있는 제조물을 제공하기 위하여 감미제, 착향제, 착색제, 및 방부제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 제제를 함유할 수 있다. 정제는 불활성 희석제, 예를 들어 칼슘 카르보네이트, 나트륨 카르보네이트, 락토오스, 칼슘 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트; 미립자제 및 붕해제, 예를 들어 옥수수 전분, 또는 알긴산; 결합제, 예를 들어 젤라틴 또는 아카시아, 및 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 탈크를 포함하는 적절한 비-독성 약제학적으로 허용되는 부형제를 지닌 배합물 중에 활성 성분을 함유한다.

이러한 정제는 코팅되지 않을 수 있거나 위장계에서 붕해 및 흡수를 지연시켜 장시간에 걸쳐 지연된 작용을 제공하기 위하여 공지된 기술에 의해 코팅될 수 있다. 예를 들어, 시간 지연 물질, 예를 들어 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트가 사용될 수 있다.

경구 용도를 위한 약제 조성물은 또한 활성 성분이 불활성 고체 희석제, 예를 들어 칼슘 카르보네이트, 칼슘 포스페이트 또는 카올린과 혼합된 경질 젤라틴 캡슐로서, 또는 활성 성분이 물 또는 오일 매질, 예를 들어 땅콩유, 액체 파라핀 또는 올리브유와 혼합된 연질 젤라틴 캡슐로서 이루어질 수 있다.

수성 현탁액으로서 제형화된 약제 조성물은 하나 이상의 적절한 부형제, 예를 들어 현탁제, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필-β-시클로덱스트린, 검 트래거캔스 및 검 아카시아; 분산제 또는 습윤제, 예를 들어 천연 발생 포스파티드, 예를 들어 레시틴, 또는 알킬렌 옥사이드와 지방산의 축한 생성물, 예를 들어 폴리옥시에티엔 스테아레이트, 또는 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알코올의 축합 생성물, 예를 들어 헵타-데카에틸렌옥시세탄올, 또는 에틸렌 옥사이드와, 지방산 및 헥시톨로부터 유도된 부분 에스테르의 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에티렌 소르비톨 모노스테아레이트, 또는 에틸렌 옥사이드와, 비장산 및 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분 에스테르의 축합 생성물, 예를 들어 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레이트를 지닌 배합물 중에 활성 화합물(들)을 함유한다. 이러한 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 방부제, 예를 들어 에틸, 또는 n-프로필 p-히드록시-벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 착향제 또는 하나 이상의 감미제, 예를 들어 수크로오스 또는 사카린을 함유할 수 있다.

약제 조성물은 식물성 오일, 예를 들어 아라키스 오일, 올리브유, 참깨유 또는 코코넛 오일, 또는 미네랄 오일, 예를 들어 액상 파라핀에 활성 화합물(들)을 현탁시키므로써 오일성 현탁액으로서 제형화될 수 있다. 오일성 현탁액은 증점제, 예를 들어 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알코올을 함유할 수 있다. 감미제, 예를 들어 상술된 감미제, 및/또는 착향제는 맛좋은 경구 제조물을 제공하기 위하여 첨가될 수 있다. 이러한 조성물은 항산화제, 예를 들어 아스코르브산의 첨가에 의해 보존될 수 있다.

이러한 약제 조성물은 분산성 분말 또는 미립자로서 제형화될 수 있으며, 이는 이후 물의 첨가에 의해 수성 현탁액을 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 분산성 분말 또는 미립자는 하나 이상의 분산제 또는 습윤제, 현탁제 및/또는 방부제를 지닌 배합물에 활성 성분을 제공한다. 적절한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제는 이미 상술된 것에 의해 예시될 수 있다. 부가적인 부형제, 예를 들어 습윤제, 착향제 및 착색제가 또한 이러한 조성물에 포함될 수 있다.

본 발명의 약제 조성물은 또한 수중유 에멀젼으로서 제형화될 수 있다. 오일상은 식물성 오일, 예를 들어 올리브유 또는 아라키스 오일, 또는 미네랄 오일, 예를 들어 액상 파라핀일 수 있거나, 이러한 오일의 혼합물일 수 있다. 이러한 조성물에 포함시키기 위한 적절한 에멀젼제는 천연 발생 검, 예를 들어 검 아카시아 또는 검 트래거캔스; 천연 발생 포스파티드, 예를 들어 대두, 레시틴; 또는 지방산과 헥시톨, 무수물로부터 유도된 에스테르 또는 부분 에스테르, 예를 들어 소르비탄 모노올레이트, 및 상기 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 소르비탄 모노올레이트를 포함한다. 이러한 에멀젼은 또한 임의적으로 감미제 및 착향제를 함유할 수 있다.

약제 조성물은 활성 성분(들)과 하나 이상의 감미제, 예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨 또는 수크로오스와 조합하므로써 시럽 또는 엘릭시르로서 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 또한 임의적으로 하나 이상의 완화제, 방부제, 착향제 및/또는 착색제를 함유할 수 있다.

이러한 약제 조성물은 당해 분야에 공지된 방법에 따라, 및 하나 이상의 상술된 바와 같은 분산제 또는 습윤제 및/또는 현탁제를 사용하여 멸균 주사가능한 수성 또는 유성 현탁액으로서 제형화될 수 있다. 이러한 멸균 주사가능한 제조물은 비독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매, 예를 들어 용매로서 1,3-부탄디올 중 멸균 가능한 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매는 물, 링거 용액, 락테이트화된 링거 용액 및 등장성 나트륨 클로라이드 용액을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 예로는 멸균된 고정된 오일을 포함하며, 이는 용매 또는 현탁 매질, 및 예를 들어 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하는 다양한 부드러운 고정유로서 통상적으로 사용된다. 지방산, 예를 들어 올레산은 또한 주사가능한 제조물에 사용될 수 있다.

다른 약제 조성물 및 약제 조성물을 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌["Remington: The Science and Practice of Pharmacy" ("Remingtons Pharmaceutical Sciences"); Gennaro, A,, Lippincott, Williams & Wilkins, Philidelphia, PA(2000)]에 기술되어 있다.

상기에 기술된 본 발명의 약제 조성물은 의도된 목적을 달성하기 위해 유효량의 하나 이상의 본 발명의 MPP를 포함한다. 따라서, 용어 "치료학적으로 유효량"은 BPH의 증상 또는 특징을 완화시키는 MPP의 양을 의미한다. 화합물의 치료학적 유효량의 결정은 당업자의 능력내에 있다. 예를 들어, 치료학적 유효량은 세포 배양 검정법 또는 동물 모델, 예를 들어 본원에서 기술된 동물 모델에서 초기에 추정될 수 있다. 동물 모델은 또한 적절한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 정보는 이후 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 인간을 포함한 다른 동물에 유용한 투약 및 투여 경로를 결정하는데 사용될 수 있다.

치료학적 효능 및 독성은 또한 표준 약제학적 과정에 의해 결정될 수 있으며, 예를 들어 중간정도의 유효량, 또는 ED₅₀ (즉, 집단 중 50%에 치료학적으로 효과적인 용량) 및 중간정도의 치사용량, 또는 LD₅₀ (즉, 집단 중 50%를 치사시키는 용량)의 결정에 의해 결정될 수 있다. 치료학적 효과와 독성 효과의 용량 비율은 "치료학적 지수"로서 공지되어 있으며, 이는 비율 LD₅₀/ED₅₀으로서 표시될 수 있다. 세포 배양 검정법 및 동물 연구로부터 얻어진 데이타는 인간 또는 동물 용도를 위한 복용량 범위를 명확히하는데 사용될 수 있다. 이러한 조성물에 함유된 복용량은 대개 ED₅₀을 포함하고 거의 독성이 없거나 전혀 독성이 없는 농도의 범위내에 존재한다. 복용량은 사용되는 복용형태, 피검체의 민감성, 및 투여 경로 등에 따라 이러한 범위내에서 변경된다.

피검체에 투여되는 정확한 복용량은 치료를 요구하는 피검체와 관련된 인자에 비추어 의사에 의해 결정될 수 있다. 복용량 및 투여는 충분한 수준의 MPP를 제공하고/거나 요망되는 효과를 유지하기 위해 조절된다. 적절한 복용량을 결정할 때 고려될 수 있는 인자는 질병 상태의 중증도, 피검체의 일반적인 건강, 나이, 체중 및 피검체의 성별, 식이요법, 투여 시간 및 횟수, 약물 조합, 반응 민감성, 및 치료법에 대한 내성/반응을 포함한다. 투여 요법은 상기 인자, 및 특정 제형의 반감기 및 제거 속도와 같은 인자에 따라 의사에 의해 디자인될 수 있다.

약제학적 유효량의 본 발명의 MPP는 통상적인 방법에 따라 비경구, 경구, 직장, 국소, 경피 투여 등을 위한 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화될 수 있다. 제형은 하나 이상의 희석제, 충진제, 에멀젼제, 방부제, 완충제, 부형제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 약체, 분말, 에밀젼, 좌제, 리포좀, 경피성 패치 및 정제와 같은 형태에 제공될 수 있다. 임의의 다수의 바이오폴리머(생물학적 계열 시스템), 리포좀을 사용하는 시스템, 폴리머 전달 시스템을 포함하는 느리거나 연장된 방출 전달 시스템은 또한 MPP의 연속적이거나 장기간 소스를 제공하기 위해 본원에 기술된 조성물과 함께 사용될 수 있다. 이러한 방출 시스템은 예를 들어, 경구, 국소 및 비경구 용도를 위한 제형으로 적용가능하다. 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분의 생물학적 활성이 효능을 방해하지 않고 숙주 또는 환자에게 독성적이 않는 담체 매질을 의미한다. 당업자는 본 발명의 화합물을 적절한 방식으로, 및 입증된 절차, 예를 들어 레밍톤에 기술된 절차에 따라 제형화될 수 있다[The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton Pa., 19th ed., 1995].

하나의 구체예에서, MPP는 예를 들어 안정성 또는 주기적인 반감기를 증가시키거나 면역원성을 감소시키기 위해 수용성 폴리어에 컨쥬게이팅된다. 임상적으로 허용되는 수용성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌 글리콜, 프로피온알데히드, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리프로필렌 글리콜 호모폴리머(PPG), 폴리옥시에틸화된 폴리올(POG) (예를 들어, 글리세롤) 및 다른 폴리옥시에틸화된 폴리올, 폴리옥시에틸화된 소르비톨, 또는 폴리옥시에틸화된 글루코즈, 및 다른 탄수화물 폴리머를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 수용성 폴리머, 예를 들어 PEG에 폴리펩티드를 컨쥬게이션시키기 위한 방법은 예를 들어 미국특허공개번호 20050106148호 및 본원에 인용된 참고문헌에 기술되어 있다.

양성 전립선 증식증(BPH)의 치료를 위한 MPP 의 용도

본 발명에 따른 MPP는 다른 정상 조직으로부터의 세포에 비해 정상 전립선 세포를 선택적으로 사멸시킨다. 따라서, 본 발명에 따른 MPP는 BPH의 치료 또는 예방에 유용하다.

하나의 구체예에서, BPH의 치료는 BPH를 지닌 피검체에서 전립선의 크기를 감소시킴을 의미한다. 전립선의 크기는 예를 들어 면적측정, 장형 타원 부피 측정(HWL), 및 타원체 부피 측정 기술을 포함하는 당업계에 공지된 방법에 의해 이의 부피에 관하여 측정될 수 있다. 전립선 크기는 또한 디지탈 직장 시험, 또는 직장 초음파 또는 세포검사에 의해 직접적으로 측정될 수 있거나, 혈액 PSA의 수준의 변화 또는 혈액에서 유리 및 전체 PSA의 비율의 변화를 측정하므로써 간접적으로 측정될 수 있다.

하나의 구체예에서, MPP의 투여는 피검체의 전립선의 부피를 감소시킨다. 예를 들어, 기술된 방법은 전립선 부피를 예를 들어 적어도 10%, 적어도 20%, 또는 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 감소시킬 수 있다.

또 다른 구체예에서, BPH의 치료는 BPH의 하나 이상의 증상의 중증 정도를 감소시킴을 의미한다. BPH의 증상은 배뇨 변화 또는 문제, 예를 들어 머뭇거리거나 약한 줄기, 급하고 누설되거나 똑똑 떨어지거나, 특히 밤에 보다 많은 횟수의 배뇨를 포함한다. 이러한 증상들은 또한 하부 비뇨기계 증상(LUTS)로서 공지되어 있다. LUTS는 미국비뇨기과 협회(AUA) 증상 지수, 마드젠-이버젠 계수 시스템(Madsen-Iversen Scoring System), 또는 보야스키 시스템(Boyarsky System)을 사용하여 당해 업계에서 공지된 바에 따라 측정될 수 있다.

다른 구체예에서, BPH의 치료는 전립선의 지속적인 성장의 방지 또는 억제를 의미하며, 상술된 바와 같이 이의 부피의 증가 속도 또는 혈액 PSA의 증가 속도를 감소시키거나 BPH의 증상을 감소시키므로써 측정될 수 있다.

조합 치료

본 발명에 따른 MPP는 단독으로 또는 하나 이상의 BPH에 대한 추가 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. BPH에 대한 추가 치료제는 약물, 예를 들어 α-1-아드레날린 수용체 길항제 및 5-α 환원효소 억제제의 투여, 생약요법, 외과수술, 및 최소한의 침해 기술을 포함한다.

α-1-아드레날린 수용체 길항제의 예로는 알푸조신/프라조신, 탐술로신, 테라조신, 및 독사조신이 있다. 5-α 환원효소 억제제의 예로는 피나스테라이드 및 두타스테라이드가 있다.

생약요법의 예로는 톱니종려나무 열매(Saw palmetto) 베리/분재 (Serenoa repens), 아프리카 플럼 나무껍질 (Pygeum africanum), 남아프리카 스타 풀(star grass)/베타-시토스테롤 (Hipoxis rooperi), 퍼플 콘 꽃 (Echinacea purpurea), 호박씨 (Cucurbita pepo), 호밀 (Secale cereale), 및 쐐기풀 (Urtica dioica)을 포함한다.

외과 수술의 예로는 전립선의 경요도절제술 (TURP), 경요도 니들 절제술 (TUNA), 전립선의 경요도 절재 (TUIP), 경요도 마이크로파 열수술 (TUMT), 레이저 전립샘절제술, 풍선확장술, 전기적 증기 및 개환 전립샘절제술이 있다.

MPP에 대한 전신 면역 반응을 감소시키기 위해 필요한 경우, 면역억제 치료제는 MPP와 조합하여 투여될 수 있다. 면역억제 치료제의 예로는 전신 또는 국소 코르티코스테로이드[Suga et al., Ann. Thorac. Surg. 73:1092-7, 2002], 시클로스포린 A[Fang et al., Hum. Gene Ther. 6:1039-44, 1995], 시클로포스파미드[Smith et al., Gene Ther. 3:496-502, 1996], 데옥시스페르구알린[Kaplan et al., Hum. Gene Ther. 8:1095-1104, 1997] 및 T 및/또는 B 세포에 대한 항체(예를 들어, 안티-CD40 리간드, 안티 CD4 항체, 안티-CD20 항체(Rituxmab))[Manning et al., Hum. Gene Ther. 9:477-85, 1998]을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 제제는 MPP의 투여전, 동안 또는 이후에 투여될 수 있다. 본 발명의 MPP는 상술된 치료법과 별도로, 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.

MPP 의 투여

본 발명에 따른 치료학적 유효량의 MPP, 또는 MPP를 엔코딩하는 핵산은 BPH를 지닌 피검체에 당업계에서 공지된 방법을 사용하여 국소적으로 또는 전신으로 투여될 수 있다.

하나의 구체예에서, MPP는 BPH를 지닌 피검체에서 전립선으로 주사된다(전립선내로). 예를 들어 근접치료의 다중 주사 방법과유사한 투여 방법이 사용될 수 있으며, 여기서 조성물 또는 제형 및 적절한 투약형태로 개조되어 다중 분취액의 정제된 펩티드는 니들을 사용하여 회음부를 통해 주사될 수 있다.

부가적으로, 또한 대안적으로는, MPP는 BPH를 지닌 피검체에 전신적으로, 예를 들어 정맥내로, 근육내로, 피하로, 또는 경구로 투여될 수 있다.

MPP의 치료학적 유효량은 요망되는 생물학적 효과를 달성하기에 충분한 양, 예를 들어 전립선의 크기(즉, 부피 및/또는 중량)를 감소시키거나 전립선의 추가 성장을 감소시키거나 BPH의 증상을 감소시키기에 효과적인 양을 의미한다. 하나의 구체예에서, 이는 피검체에서 BPH의 징후 또는 증상을 감소시키기에 충분한 양이다. 특정 구체예에서, 이는 전립선의 부피를 적어도 10%, 20%, 30%, 40, 또는 50%로 감소시키기에 충분한 양이다. 또다른 구체예에서, 이는 전립선의 부피 또는 중량이 추가로 증가함을 방해하는데 충분한 양이다. 유효량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 투약-반응 커브로부터 외삽될 수 있다.

유효량의 MPP는 예를 들어 매일, 치료 과정동안 단일 용량으로, 또는 여러번의 용량으로 투여될 수 있다. 그러나, 유효량의 MPP는 치료될 피검체, 치료된 질환의 중증도 및 타입, 및 투여 방식에 따를 것이다. 하나의 구체예에서, MPP의 치료학적 유효량은 전립선 중량 당 약 0.01 내지 50 ㎍으로 변경될 수 있고, 이는 전립선내로 투여된다. 다른 구체예에서, MPP는 치료학적 유효량은 전립선 중량 당 약 0.02 내지 40 ㎍으로 변경될 수 있고, 이는 전립선내로 투여된다. 또다른 구체예에서, MPP의 치료학적 유효량은 전립선 중량 당 약 0.02 내지 35 ㎍으로 변경될 수 있고, 이는 전립선내로 투여된다. 또다른 구체예에서, MPP는 치료학적 유효량은 전립선 중량 당 약 0.03 내지 25 ㎍으로 변경될 수 있고, 이는 전립선내로 투여된다. 또다른 구체예에서, MPP는 치료학적 유효량은 전립선 중량 당 약 0.04 내지 20 ㎍으로 변경될 수 있고, 이는 전립선내로 투여된다. 또다른 구체예에서, MPP는 치료학적 유효량은 전립선 중량 당 약 0.04 내지 10 ㎍으로 변경될 수 있고, 이는 전립선내로 투여된다.

하나의 구체예에서, 70 kg 사람에 대한 MPP의 전립선내로 유효한 정맥내 용량은 약 1 mg 내지 약 10 mg의 MPP이다. 다른 구체예에서, 유효한 정맥내 용량은 약 1 mg 내지 약 5 mg이다. 또다른 구체예에서, 유효한 정맥내 용량은 약 1 mg 내지 약 3 mg이다. 또다른 구체예에서, 유효한 정맥내 용량은 약 2.8 mg이다. 하나의 구체예에서, 70 kg 사람에 대한 MPP의 유효한 정맥내 용량은 약 10 mg 내지 약 100 mg의 MPP이다. 다른 구체예에서, 70 kg 사람에 대한 MPP의 유효한 정맥내 용량은 약 10 mg 내지 약 50 mg의 MPP이다. 또다른 구체예에서, 70 kg 사람에 대한 MPP의 유효한 정맥내 용량은 약 10 mg 내지 약 30 mg의 MPP이다. 또다른 구체예에서, 70 kg 사람에 대한 MPP의 유효한 정맥내 용량은 약 28 mg이다.

MPP 의 생체내 발현

BPH를 치료하기 위한 MPP의 투여에 대체물로서(또는 부가적으로), BPH의 장기간 또는 전신 치료는 생체내에서 MPP를 엔코딩하는 핵산을 발현시키므로써 달성될 수 있다.

MPP 를 엔코딩하는 핵산

본 발명은 BPH를 치료하기 위한 MPP를 엔코딩하는 핵산 또는 DNA 분자의 용도를 고려한다. 이러한 DNA 분자는 본원에 기술된 표준 분자 생물학 실험 기술 및 서열 정보를 통해 수득될 수 있다.

적절한 DNA 분자 및 뉴클레오티드는 엄격한 조건하에서 기술된 DNA 서열로 하이브리드화되는 DNA 분자 및 뉴클레오티드, 또는 이의 분절을 포함하며, 단 이는 기능성 MPP를 엔코딩한다. 특히 엄격한 수준으로 얻어진 하이브리드화 조건은 하이브리드화 방법 및 조성물의 특성, 및 사용되는 하이브리드화 DNA의 길이에 따라 변한다. 일반적으로, 하이브리드화의 온도 및 하이브리드화 완충액의 이온 강도(특히, Na⁺ 농도)는 하이드리드화 엄격성을 결정한다. 특정 수준의 엄격성을 달성하기 위해 요구되는 하이브리드화 조건과 관련한 계산은 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, Chapters 9 and 11]에 기술되어 있다. [³²P]-dCTP로 라벨링된 표적 프로브와의 하이브리드화는 일반적으로 6배의 SSC와 같은 높은 이온 강도의 용액 중에서 융점 T_m 미만의 약 5 내지 25℃의 온도에서 수행된다. 엄격한 조건의 예로는 pH 7.0 내지 8.3 및 적어도 약 30℃의 온도에서 짧은 프로브(예를 들어 10 내지 50 뉴클레오티드)에 대해 적어도 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도(또는 다른 염)의 염 농도이다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가로 달성될 수 있다. 예를 들어 25 내지 30℃에서 5배의 SSPE (750 mM NaCl, 50 mM Na 포스페이트, 5 mM EDTA, pH 7.4)의 조건은 대립유전자-특이적 프로브 하이브리드화에 대해 적합하다.

유전자 코드의 퇴화는 엔코딩된 단백질의 아미노산 서열을 유지시키는 동안 DNA의 뉴클레오티드 서열에서 추가로 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 아미노산 Ala는 뉴클레오티드 코돈 트리플릿트 GCT, GCG, GCC, 및 GCA에 의해 엔코딩된다. 따라서, 뉴클레오티드 서열은 엔코딩된 단백질의 아미노산 조성 또는 단백질의 특징에 영향을 미치지 않으면서 변경될 수 있다. 유전자 코드의 퇴화를 기초로 하여, 변형체 DNA 분자는 상술된 바와 같이 표준 DNA 돌연변이 기술을 사용하여 기준 DNA 분자로부터 유도될 수 있거나, DNA 서열의 합성에 의해 유도될 수 있다. 유전자 코드의 퇴화를 기초로 하여 서열 변형체에 의하여 기술된 엄격한 조건하에서 DNA 서열로 하이브리드화하지 않는 DNA 서열은 본 명세서에서 포함된다.

본 발명은 세포 또는 조직내에서 MPP, 예를 들어 변형된 프로에어롤리신 폴리펩티드를 발현시키는 방법을 제공한다. 하나의 예에서, 세포 또는 조직의 감염은 시험관내에서 이루어진다. 이러한 예에서, 세포 또는 조직(예를 들어, 이식 조직)은 피검체로부터 제거되고 이후 고려되는 단백질을 엔코딩하는 cDNA를 함유하는 발현 벡터로 감염된다. 감염된 세포는 기능성 단백질을 생산할 것이고, 피검체에 다시 도입될 수 있다. 또다른 예에서, 고려되는 단백질을 엔코딩하는 핵산은 피검체에 직접적으로(예를 들어, 정맥내, 또는 전립선내) 투여하고, 감염은 생체내에서 발생한다.

인간 세포 감염을 대해 요구되는 과학적 및 의학적 수술은 현재 관례이다. 공여체 세포로 유전자를 이동시키기 위한 일반적인 전력은 미국특허번호 제5,529,774호에 기술되어 있다. 일반적으로, 치료학적으로 요망되는 효과를 갖는 단백질을 엔코딩하는 유전자는 바이러스 발현 벡터로 클로닝되고, 이후 이러한 벡터는 표적 유기체에 도입된다. 바이러스는 세포를 감염시키고, 생체내에서 단백질 서열을 생산하고, 여기서 이의 요망되는 치료학적 효과를 갖는다(Zabner et al. Cell 75:207-16, 1993).

DNA 또는 단백질 성분은 특정 세포 또는 조직, 예를 들어 전립선내로 필수적으로 도입될 수 있다. 그러나, 일부 경우에서, 예를 들어 혈관내 (i.v.) 또는 경구 투여에 의해 피검체의 모든 세포를 치료하기에 더욱 치료학적으로 효과적이고 간단하거나 벡터를 더욱 광범위하게 살포할 수 있다.

MPP를 엔코딩하는 핵산 서열은 적절한 촉진제의 조절하에 존재한다. 사용될 수 있는 적절한 촉진제는 유전자의 본래 촉진제, 레트로바이러스 LTR 촉진제, 또는 아데노바이러스 촉진제, 예를 들어 아데노바이러스 메이저 레이트(major late) 촉진제; CMV 촉진제; RSV 촉진제; 유발성 촉진제, 예를 들어 MMTV 촉진제, 메탈로티오네인 촉진제, 열쇼크 촉진제; 알부민 촉진제; 히스톤 촉진제; (x-액틴 촉진제; TK 촉진제; B19 파르보바이러스 촉진제; 및 ApoAI 촉진제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 하나의 예에서, 이러한 촉진제는 전립선-특이적 촉진제, 예를 들어 프로바신 촉진제이다. 그러나, 이러한 설명은 특이적 외부 유전자 또는 촉진제로 제한되지 않는다.

재조합 핵산은 재조합 핵산을 적절한 세포에 도달시킬 수 있는 공지된 방법에 의해 피검체에 투여될 수 있다. 이러한 방법은 주사, 주입, 증착, 삽입 또는 국소 투여를 포함한다. 주사는 진피내, 또는 피하적일 수 있다. 재조합 핵산은 하기에 추가로 기술되는 바와 같이, 바이러스 벡터의 일부로서, 예를 들어 아비폭스 바이러스, 재조합 백시니아 바이러스, 복제-결핍 아데노바이러스 균주 또는 폴리오바이러스의 일부로서, 또는 비-감염 형태로서, 예를 들어 노출된 DNA 또는 리포좀 캡슐화된 DNA의 형태로서 전달될 수 있다.

아데노바이러스 벡터는 필수적으로 완전한 아데노바이러스 게놈을 포함한다[Shenk et al., Curr. Top. Micobiol. Immunol. 111: 1-39, 1984]. 대안적으로는, 아데노바이러스 벡터는 변형된 아데노바이러스 벡터이며, 여기서 아데노바이러스 게놈의 적어도 일부는 삭제된다. 하나의 예에서, 벡터는 아데노바이러스 5' ITR; 아데노바이러스 3' ITR; 아데노바이러스 결합 신호; 치료제를 엔코딩하는 DNA 서열; 및 치료제를 엔코딩하는 DNA 서열을 발현시키기 위한 촉진제를 포함한다. 이러한 벡터는 아데노바이러스 E1 및 E3 DNA 성ㄹ의 적어도 대부분이 부재이지만, 필수적으로 모든 E2 및 E4 DNA 서열이 부재이고, 아데노바이러스 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열은 아데노바이러스 메이저 레이트 촉진제에 의해 전사된다. 다른 예에서, 이러한 벡터는 문헌[미국특허번호 제4,797,368(Carter et al.) 및 McLaughlin et al., J. Virol. 62:1963-73, 1988]에 기술된 바와 같은 아데노-관련 바이러스(AAV) 및 AAV 타입 4(Chiorini et al., J. Virol. 71: 6823-33, 1977) 및 AAV 타입 5(Chiorini et al., J. Virol. 73:1309-19, 1999)이다.

이러한 벡터는 셔틀 플라스미드를 사용한 표준 기술에 따라 구조화될 수 있으며, 이는 5' 말단에서 개시하고, 아데노바이러스 5' ITR, 아데노바이러스 결합 신호, 및 E1a 향상제 서열; 촉진제(아데노바이러스 촉진제 또는 외부 촉진제일 수 있음); 세부분의 리더 서열, 다중 클로닝 사이트(본원에서 기술된 바와 같이 존재할 수 있음); 폴리 A 신호; 및 아데노바이러스 게놈의 분절에 상응하는 DNA 분절을 함유한다. DNA 분절은 변형되거나 돌연변이화된 아데노바이러스와 균일 재조합을 위한 기재로서 제공되고, 염기 3329 내지 염기 6246에 비해 길지 않는 아데노바이러스 5' 게놈의 분절을 포함할 수 있다. 이러한 플라스미드는 또한 선택가능한 마커 및 복제의 시발점을 포함할 수 있다. 복제 시발점은 박테리아의 복제 시발점일 수 있다. 치료제를 엔코딩하는 요망되는 DNA 서열은 플라스미드의 다발성 클로닝 사이트로 삽입될 수 있다.

본원에 기술된 방법을 수행하는데 사용될 수 있는 벡터의 예로는 WO 95/27512(Woo et al.,); WO 02/127303(Walsh et al.,); 미국특허번호 6,221,349(Couto et al.); 미국특허번호 6,093,392(High et al.)에 기술된 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

임상 시험

당업자는 시험관내에서 및 동물 모델에서 BPH의 치료를 위한 MPP의 효능을 증명한 후에 MPP는 BPH의 치료에서 이의 효능을 추가로 평가하고 치료제 용도에 대한 규제 승인을 얻기 위해 임상 시험에서 시험될 것이다. 당업계에 공지된 바와 같이, 임상 시험은 시험의 시기를 통해 진행하며, 이는 시기 I, II, III 및 IV로서 식별된다.

먼저 MPP는 시기 I 시험에서 평가될 것이다. 통상적으로 시기 I 시험은 투여의 최선 모드(예를 들어, 환약 또는 주사에 의함), 투여 횟수, 및 화합물에 대한 독성을 결정하기 위해 사용된다. 시기 I 연구는 환자의 신체에서 잠재적 치료효과를 평가하기 위하여 종종 실험실 시험, 예를 들어, 혈액 시험 및 생체검사를 포함한다. 시기 I 시험에 대해, BPH를 지니 소그룹의 환자는 특정 용량의 MPP로 처리된다. 시험하는 동안에, 이러한 용량은 화합물과 관련된 최대 내성화된 용량(MTD) 및 용량-제한 독성도(DLT)를 결정하기 위해 그룹마다 증가된다. 이러한 공정은 이후 시기 II 시험에서 사용하기 위한 적합한 용량을 결정한다.

시기 II 시험은 MPP의 효능 및 안정성을 추가로 평가하기 위하여 수행될 수 있다. 시기 II 시험에서, MPP는 시기 I 시험에서 효과적인 것으로 확인된 복용량을 사용하여 BPH를 지닌 환자의 군에 투여된다.

시기 III 시험은 MPP가 표준, 또는 가장 넓게 허용되는 치료법과 비교되는 정도를 결정하는데 촛점을 맞춘다. 시기 III 시험에서, 환자는 두개 이상의 "팔(arms)" 중 하나에 무작위적으로 할당된다. 두개의 팔을 지닌 시험에서, 예를 들어 하나의 팔은 표준 치료법(대조군)을 수용할 것이고, 다른 팔은 MPP 치료법(실험군)을 수용할 것이다.

시기 IV 시험은 MPP의 장기간 안정성 및 효능을 추가로 평가하기 위해 사용된다. 시기 IV 시험은 시기 I, II 및 III 시험 보다 덜 일반적이고, 표준 용도를 위해 MPP가 승인된 후에 수행된다.

임상 시험에 대한 환자의 적임

참여하는 적임 기준은 일반적인 기준(예를 들어, 나이, 성별, 질환의 타입)에서 특별한 기준(예를 들어 종래 치료 타입 및 수, 질병 특성, 혈액 세포 계수, 유기체 기능)의 범위이다. 하나의 구체예에서, 적합한 환자는 BPH로 진단되었다. 적임 기준은 또한 시험 시기로 변경될 수 있다. 임상 시험에 대해 적합한 환자는 또한 비뇨기과 장애의 객관적인 측정, 및 BPH의 구강 치료에 대한 반응의 실패의 객관적 측정을 기초로 하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 시기 I 및 II 시험에서, 이러한 기준은 종종 비정상 장기 기능 또는 다른 인자로 인해 실험 치료법으로부터 위험할 수 있는 환자를 배제한다. 시기 II 및 III 시험에서 부가적인 기준은 종종 질병 타입 및 단계, 및 종래 치료법의 수 및 타입과 관련하여 포함된다.

시기 I 시험은 대개 다른 치료법 선택이 효과적이지 않는 15명 내지 30명의 참가자를 포함한다. 시기 II 시험은 통상적으로 이미 약물 치료법 또는 수술이 이루어졌지만 치료법이 효과적이지 않은 100명 이하의 참가자를 포함한다. 시기 II 시험의 참여는 종종 이루어진 종래 치료법을 기초로 하여 제한된다. 시기 III 시험은 대개 수백명 내지 수천명의 참가자를 포함한다. 이러한 많은 수의 참여자는 필수적으로 MPP와 표준 치료법의 효능간의 실제 차이가 있는지 여부를 결정하기 위한 것이다. 시기 III은 질병 연속체를 커버하기 위하여 BPH로 새로이 진단된 환자 내지 큰 질환을 갖는 환자를 포함할 수 있다.

당업자는 임상 시험이 치료가 더욱 좁게 규정된 집단 상에서 효과적인 것인 지의 여부를 결정하기 위해 너무 다양한 연구 집단을 만들지 않으면서 가능한한 포함되도록 고안될 것으로 이해될 것이다. 보다 다양한 집단이 시험에 포함될수록, 결과는 특히 시기 III 시험에서 일반적인 집단에 더욱 적용가능할 것이다. 임상 시기 중 각 시기에서 적합한 참가자의 선택은 당업자내에 존재하는 것으로 고려된다.

치료전에 환자의 평가

연구를 시작하기 전에, 당업게에 공지된 몇몇 측정은 먼저 환자를 분류하는데 사용될 수 있다. 환자는 먼저 예를 들어 패밀리 프랙티스 노트북 웹사이트(Family Practice Notebook website)에서 확인되는 양성 증식증 증상 지수를 사용하여 평가될 수 있다. 환자는 또한 이러한 질병의 타입 및/또는 단계에 따라 및/또는 전립선 크기에 의해 분류될 수 있다.

임상 시험에서 MPP 의 투여

MPP는 통상적으로 주사에 의해 시험 참가자에게 투여된다. 한가지 구체예에서, MPP는 전립선내 주사에 의해 투여된다.

MPP의 용량의 범위가 시험될 수 있다. 임상전 시험으롭터 정보를 제공받는 경우, 당업자는 임사 시험에서 사용하기 위한 MPP의 적절한 복용량을 용이하게 결정할 수 있다. 하나의 구체예에서, 용량 범위는 약 0.01 ㎍/g 전립선 내지 약 50 ㎍/g 전립선이다. 하나의 구체예에서, 용량 범위는 약 0.02 ㎍/g 전립선 내지 약 40 ㎍/g 전립선이다. 하나의 구체예에서, 용량 범위는 약 0.02 ㎍/g 전립선 내지 약 35 ㎍/g 전립선이다. 하나의 구체예에서, 용량 범위는 약 0.03 ㎍/g 전립선 내지 약 25 ㎍/g 전립선이다. 하나의 구체예에서, 용량 범위는 약 0.04 ㎍/g 전립선 내지 약 20 ㎍/g 전립선이다. 하나의 구체예에서, 용량 범위는 약 0.04 ㎍/g 전립선 내지 약 10 ㎍/g 전립선이다. 하나의 구체예에서, 용량 범위는 약 0.1 ㎍/g 전립선 내지 약 5 ㎍/g 전립선이다. 하나의 구체예에서, 용량 범위는 약 0.5 ㎍/g 전립선 내지 약 2 ㎍/g 전립선이다. 하나의 구체예에서, 용량 범위는 약 0.5 ㎍/g 전립선 내지 약 2 ㎍/g 전립선이다.

약물 동역학 모니터링

시기 I 기준을 충족시키기 위하여, MOO의 분포가 예를 들어 샘플, 예를 들어 통상적인 간격으로 수집된 혈액 또는 소변의 화학적 분석에 의해 모니터링된다. 예를 들어, 샘플은 주입 개시 후에 약 72 시간까지 통상적인 간격으로 수집될 수 있다. 분석이 즉시 수행되지 않는 경우에, 샘플은 수집 후에 드라이 아이스 상에 위치시킬 수 있고, 이후 냉동고로 옮겨 분석이 수행될 때까지 -70℃에서 저장된다. 샘플은 분석을 위해 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 제조될 수 있고, MPP의 양은 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 결정될 수 있다. 약력동역학 데이타는 전문적인 임상 약력동역학자와 협력하여 산출하고 분석하고, 예를 들어, 제거, 반감기 및 최대 혈장 농도를 결정하는데 사용된다.

환자 성과의 모니터링

임상 시험의 종료점은 평가시에 화합물의 효능을 나타내는 측정가능한 성과이다. 이러한 종료점은 시험의 개시 전에 수립되고, 임상 시험의 타입 및 시기에 따라 변할 것이다. 이러한 종료점의 예로는 예를 들어 전립선 부피의 감소, 혈액 PSA 수준의 감소, 개선된 비뇨기 하나 이상의 계통 증상, 개선된 소변 흐름, 및 급성 요축적을 포함한다. 다른 종료점은 독성도 및 삶의 질을 포함한다.

약제학적 키트

본 발명은 부가적으로 BPH의 치료에 사용하기 위한 하나 이상의 MPP, 또는 하나 이상의 MPP를 포함하는 약제 조성물을 함유하는 치료학적 키트 또는 팩(pack)을 제공한다. 이러한 MPP는 단위 투약 형태로 키트에 제공된다. 키트 중 개개의 성분들은 별도의 용기에 포장될 수 있으며, 이와 관련하여 적용가능한 경우, 약제 또는 생물학적 제품의 사용 또는 판매를 조절하는 정부 기관에 의해 규정된 형태로 통지될 수 있으며, 이러한 통지는 인간 또는 동물 투여를 위한 제작, 용도 또는 판매 기관에 의한 승인에 반영된다. 이러한 키트는 임의적으로 본 발명의 MPP와 조합하여 사용하기 위해 하나 이상의 다른 치료제를 추가로 함유할 수 있다. 이러한 키트는 MPP 및/또는 부가적인 치료제에 대한 사용 방법 및 투약 요법을 약솔하는 설명서 또는 지시서를 함유할 수 있다.

이러한 키트의 성분들이 하나 이상의 액상 용액에 제공되는 경우, 액상 용액은 수용액, 예를 들어 멸균 수용액일 수 있다. 이러한 경우, 용기는 흡입기, 시린지, 피펫, 안약, 또는 기타 등등의 기구일 수 있으며, 이로부터 조성물이 환자에거 투여되거나 환자에게 적용되고, 키트의 다른 성분들과 혼합될 수 있다.

키트의 성분들은 또한 건조되거나 동결건조된 형태로 제공될 수 있으며, 부가적으로 동결건조된 성분들의 재구성을 위한 적합한 용매를 함유할 수 있다. 용기의 수 또는 타입에 상관없이, 본 발명의 키트는 도한 환자에게 조성물의 투여를 보조하기 위한 기기를 포함할 수 있다. 이러한 기기는 흡입기, 시린지, 피펫, 핀셋, 계량 스푼, 안약, 또는 유사한 의학적으로 승인된 전달 비히클일 수 있다.

본 발명은 특정 실시예와 관련하여 기술된다. 하기 실시예는 본 발명의 구체예를 기술하기 위해 의도된 것으로, 임의의 방법으로 본 발명을 제한하기 위해 의도되지 않은 것으로 이해될 것이다.

본 발명의 특징들은 하기 상세한 설명에서 더욱 분명하게 될 것이며, 여기서 첨부된 도면이 참조 된다.

도 1은 프로에어로라이신 도메인의 개략도를 보여주며(크기에 맞게 도시되지 않음), 퓨린에 의한 활성화의 결과를 보여준다.

도 2는 용혈 분석의 결과를 보여주는 막대 그래프를 묘사하며, 여기서 MPP1은 인간 혈장 또는 효소적 활성 PSA(10,000 ng/ml)로 스파이크된 인간 혈장으로 예비배양된다.

도 3은 프로에어로라이신의 그것에 대한 본 발명의 구체예에 따른 여러 MPP의 시험관 내 독성을 비교하는 그래프를 묘사한다. MPP는 프로에어로라이신으로부터 얻어지며, 본래의 퓨린 부위의 위치에서 PSA 절단 부위를 포함한다.

도 4A-4E는 어떻게 프로에어로라이신 단백질이 본 발명의 구체예에 따라 프로에어로라이신으로부터 얻어지는 여러 상이한 MPP를 생성하기 위해 바뀔 수 있는지를 보여주는 (크기에 맞게 도시되지 않은) 개략도이다. "*" 기호는 하나 이상의 점 돌연변이, 및/또는 하나 이상의 결실을 나타내며, 이들은 프로에어로라이신 결 합 도메인 기능을 줄인다(다시 말해, 세포막 내에서 농축되는 능력).

도 4A는 야생형 프로에어로라이신의 개략도를 나타낸다. 도 4B는 전립선 특이적 단백질 분해 효소 분열 부위를 포함하도록 변형된 활성 서열을 가지는, 프로에어로라이신으로부터 얻어지는 MPP의 개략도를 나타낸다. 도 4C는 하나 이상의 전립선 특이적 단백질 분해 효소 분열 부위를 포함하도록 변형된 활성 서열을 가지는, 프로에어로라이신으로부터 얻어지는 MPP의 개략도를 나타낸다. 도 4D는 전립선 특이적 단백질 분해 효소 분열 부위를 포함하도록 변형된 활성 서열을 가지고, 기능적으로 결실된 본래의 결합 도메인을 가지는, 프로에어로라이신으로부터 얻어지는 MPP의 개략도를 나타낸다. 상기 기능적으로 결실된 본래의 결합 도메인은 하나 이상의 점 돌연변이 또는 하나 이상의 결실에 의해 생성된다. 도 4E는 전립선 특이적 단백질 분해 효소 분열 부위를 포함하도록 변형된 활성 서열을 가지고, 기능적으로 대체된 본래의 결합 도메인을 가지는, 프로에어로라이신으로부터 얻어지는 MPP의 개략도를 나타낸다. 상기 기능적으로 결실된 본래의 결합 도메인은 도 4D에 대한 기재와 같이 생성된다. 하나 이상의 전립선 특이적 표적 도메인은 이 구체예에서 MPP의 N-말단에 또는 MPP의 독소 도메인의 C-말단에 부착될 수 있다.

도 5A는 전립선 특이적 단백질 분해 효소 분열 부위를 포함하도록 변형된 활성 서열을 가지고, 기능적으로 대체된 본래의 결합 도메인을 가지는, 프로에어로라이신으로부터 얻어지는 MPP의 개략도를 나타낸다. 상기 본래의 결합 도메인은 하나 이상의 점 돌연변이 또는 하나 이상의 결실에 의해 변형된다. 하나 이상의 전립선 특이적 표적 도메인은 Y215C, 또는 A300C에서 MPP에 부착되거나 되지 않을 수 있다. 도 5B는 전립선 특이적 단백질 분해 효소 분열 부위를 포함하도록 변형된 활성 서열을 가지고, 기능적으로 결실된 본래의 결합 도메인을 가지는, 프로에어로라이신으로부터 얻어지는 MPP의 개략도를 나타낸다. 상기 본래의 결합 도메인은 프로에어로라이신의 본래의 결합 도메인 중 하나의 결실에 의해 기능적으로 결실된다. 도 5C는 전립선 특이적 단백질 분해 효소 분열 부위를 포함하도록 변형된 활성 서열을 가지고, 기능적으로 대체된 본래의 결합 도메인을 가지는, 프로에어로라이신으로부터 얻어지는 MPP의 개략도를 나타낸다. 하나 이상의 전립선 특이적 표적 도메인은 본 구체예에서 MPP의 독신 도메인의 N-말단 또는 MPP의 독신 도메인의 C-말단에 부착될 수 있다. MPP의 본래의 결합 도메인 중 하나는 도 5B에서 기재된 바와 같이 결실된다. 도 5D는 전립선 특이적 단백질 분해 효소 분열 부위를 포함하도록 변형된 활성 서열을 가지고, 기능적으로 대체된 본래의 결합 도메인을 가지는, 프로에어로라이신으로부터 얻어지는 MPP의 개략도를 나타낸다. 하나 이상의 전립선 특이적 표적 도메인은 Y215C, 또는 A300C에서 MPP에 부착될 수 있다. MPP의 본래의 결합 도메인 중 하나는 도 5B에 기재된 바와 같이 결실된다.

도 6A는 기능적으로 대체된 본래의 결합 도메인을 가지는, 프로에어로라이신으로부터 얻어지는 본 발명의 하나의 구체예에 따른 MPP의 개략도를 나타낸다. MPP는 하나 이상의 전립선 특이적 표적 도메인을 추가로 포함한다. MPPP의 본래의 결합 도메인은 하나 이상의 아미노산 잔기의 돌연변이 또는 결실에 의해 기능적으로 결실된다. 도 6B는 기능적으로 대체된 본래의 결합 도메인을 가지는, 프로에어로라이신으로부터 얻어지는 본 발명의 하나의 구체예에 따른 MPP의 개략도를 나타 낸다. MPP는 Y215C 또는 A300C에 프로에어로라이신에 부착된 하나 이상의 전립선 특이적 표적 도메인을 추가로 포함한다. MPPP의 본래의 결합 도메인은 하나 이상의 아미노산 잔기의 돌연변이 또는 결실에 의해 기능적으로 결실된다. 도 6C는 기능적으로 대체된 본래의 결합 도메인을 가지는, 프로에어로라이신으로부터 얻어지는 본 발명의 하나의 구체예에 따른 MPP의 개략도를 나타낸다. MPP는 하나 이상의 전립선 특이적 표적 도메인을 추가로 포함한다. 상기 본래의 결합 도메인은 프로에어로라이신의 본래의 결합 도메인 중 하나의 결실에 의해 기능적으로 결실된다. 도 6D는 기능적으로 대체된 본래의 결합 도메인을 가지는 프로에어로라이신으로부터 얻어지는 본 발명의 또 다른 구체예에 따라 MPP의 개략도를 나타낸다. MPP는 Y215C 또는 A300C에서 프로에어로라이신에 부착된 하나 이상의 전립선 특이적 표적 도메인을 추가로 포함한다. 상기 본래의 결합 도메인은 프로에어로라이신의 본래의 결합 도메인 중 하나의 결실에 의해 기능적으로 결실된다.

도 7는 야생형의 프로에어로라이신 cDNA 서열(SEQ ID NO:1)을 묘사한다.

도 8는 야생형 프로에어로라이신 아미노산 서열(SEQ ID NO:2)을 묘사한다.

도 9는 본 발명의 하나의 구체예에 따른 MPP의 cDNA 서열(SEQ ID NO:3)(MPPl)을 묘사하며, 여기서 프로에어로라이신의 퓨린 부위는 PSA 절단 부위로 대체된다.

도 10는 본 발명의 하나의 구체예에 따른 MPP의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:4)(MPPl)을 묘사하며, 여기서 프로에어로라이신의 퓨린 부위는 PSA 절단 부위로 대체된다.

도 11은 인간 세메노겔린 I 및 II 단백질에서 PSA 분열 부위의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:5)을 묘사한다.

도 12는 본 발명의 하나의 구체예에 따른 MPP의 cDNA 서열 (SEQ ID NO:6)을 묘사하며, 프로에어로라이신의 퓨린 부위는 PSA 절단 부위로 대체된다.

도 13은 본 발명의 하나의 구체예에 따른 MPP의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:7)(MPP2)를 묘사하며, 여기서 프로에어로라이신의 퓨린 부위는 PSA 절단 부위로 대체된다.

도 14는 PSA 분열 부위(SEQ ID NO:8)의 예를 묘사한다.

도 15는 본 발명의 하나의 구체예에 따른 MPP의 cDNA 서열 (SEQ ID NO:9)(MPP3)를 묘사하며, 여기서 프로에어로라이신의 퓨린 부위는 PSA 절단 부위로 대체된다.

도 16은 본 발명의 하나의 구체예에 따른 MPP의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 10)(MPP3)를 묘사하며, 여기서 프로에어로라이신의 퓨린 부위는 PSA 절단 부위로 대체된다.

도 17은 PSA 분열 부위(SEQ ID NO:11)의 제 2 예를 묘사한다.

도 18은 본 발명의 하나의 구체예에 따른 MPP의 cDNA 서열 (SEQ ID NO: 12)(MPP4)를 묘사하며, 여기서 프로에어로라이신의 퓨린 부위는 PSA 절단 부위로 대체된다.

도 19는 본 발명의 하나의 구체예에 따른 MPP의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 13)(MPP4)을 묘사하며, 여기서 프로에어로라이신의 퓨린 부위는 PSA 절단 부위로 대체된다.

도 20-27은 본 발명에 따른 대안적 PSA 분열 부위의 아미노산 서열을 묘사한다(SEQ ID NO: 14-21, 각각).

도 28은 본래의 황체형성 호르몬 분비 호르몬(LHRH) 아미노산 서열(SEQ ID NO:22)을 묘사한다.

도 29는 변형된 황체형성 호르몬 분비 호르몬(LHRH) 아미노산 서열(SEQ ID NO:23)을 묘사한다.

도 30은 본 발명의 하나의 구체예에 따른 MPP의 아미노산 서열(SEQ ID NO:24)(MPP6)을 묘사하며, 여기서 프로에어로라이신의 본래의 결합 부위는 변형된다.

도 31은 본 발명의 하나의 구체예에 따른 MPP의 아미노산 서열(MPP7)을 묘사하며, 여기서 프로에어로라이신의 퓨린 부위는 유지되고, 프로라에롤리신의 본래의 결합 도메인은 결실되고 SEQ ID NO:23(SEQ ID NO:25)으로 대체된다.

도 32는 3일 동안 치료 후 원숭이의 전립선에서 본 발명의 하나의 구체예에 따른 MPP(MPP5)의 효과를 묘사한다. A 및 B는 비히클 단독으로 처리된 대조군 원숭이의 전립선을 묘사하고; C 및 D는 1 μg의 MPP로 처리된 원숭이의 전립선을 묘사하며; E 및 F는 5μg의 MPP로 처리된 원숭이의 전립선을 묘사하며; G 및 H은 25μg의 MPP로 처리된 원숭이의 전립선을 묘사한다.

도 33은 15일 동안 처리된 원숭이의 전립선에서 본 발명의 하나의 구체예에 따른 MPP(MPP5)의 효과를 묘사한다. A 및 B는 비히클 단독으로 처리된 대조군 원 숭이의 전립선을 묘사한다. C 및 D는 1μg의 MPP로 처리된 원숭이의 전립선을 묘사하며; E 및 F는 5μg의 MPP로 처리된 원숭이의 전립선을 묘사한다. 그리고 G 및 H는 25μg의 MPP로 처리된 원숭이의 전립선을 묘사한다.

도 34는 MPP5의 뉴글레오타이드 서열(SEQ ID NO:30)을 묘사한다. ATG 출발 코돈 및 TAA 정지 코돈은 밑줄 및 굵게 되어 있다. HindIII 및 EcoRI 제한 부위는 굵은 텍스트이다. PSA 제한 부위는 밑줄되어 있고, 6 His 태그는 굵게 이탤릭체 되어 있다.

도 35는 MPP5의 아미노산 서열을 (SEQ ID NO:31) 묘사한다. 상기 아미노산 서열은 도 34에서 도시된 핵산 서열로부터 얻어진다. 아미노산 427-432 (PSA 제한 부위)는 밑줄 및 굵게 되어 있다. 6 His 태그는 굵은 텍스트이다.

도 36는 세척된 적혈구 세포의 가수 분해 정도에 의해 검사된 전립선 조직 단편을 지니는 배지에서 MPP5의 활성화를 묘사한다.

도 37는 MPP5를 분열(cleave)하기 위한 여려 종들로부터의 혈청의 능력을 묘사한다.

도 38는 원숭이 전립선에서 MPP5의 효과를 묘사한다.

도 39는 원숭이에서 MPP5의 투여에 대한 체액 반응을 묘사한다.

도 40는 야생형 클로스트리듐 셉티컴(septicum) 알파 독소의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:73)을 묘사한다.

도 41는 야생형 클로스트리듐 셉티컴(septicum) 알파 독소의 아미노산 서열(SEQ ID NO:74)을 묘사한다.

실시예 1:

본 실시예는 표 6에 나타낸 바와 같이 본 발명의 구체예에 따라 MPP를 생성시키기 위해 사용되는 방법을 기술한 것이며, 이는 PSA에 의해 활성화된다. 이러한 MPP는 프로에어로라이신으로부터 유도된다. 당업자는 유사한 방법이 PSA 또는 임의의 다른 전립선-특이적 프로테아제에 의해 활성화되는 다른 MPP를 생성시키는데 사용될 수 있다. 이러한 단백질은 프로에어로라이신의 푸린 서열을 전립선-특이적 프로테아제 분할 사이트, 예를 들어 PSA-특이적 분할 서열로 치환하여 생성될 수 있다.

PSA에 의해 분할된 프로테아제 분할 사이트를 함유한 활성 서열을 지닌 MPP와 야생형 프로에어로라이신의 비교

MPP (서열번호)	(서열번호:)를 만드는 변화	Comparison to wt Proaerolysin ADSKVRRARSVDGAGQGLRLEIPLD (서열번호 2의 aa 424-448)
MPP1 (3 & 4)	HSSKLQ (5)로 변화된 KVRRAR (aa 427-432 of SEQ ID NO: 2)	ADSHSSKLQSVDGAGQGLRLEIPLD) (서열번호 4의 aa 424-448)
MPP2 (6 & 7)	HSSKLQSA (8)로 변화된 KVRRARSV (aa 427-434 of SEQ ID NO: 2)	ADSHSSKLQSADGAGQGRLEIPLD (서열번호 7의 aa 424-448)
MPP3 (9 & 10)	QFYSSN (11)로 변화된 KVRRAR (aa 427-432 of SEQ ID NO: 2)	ADSQFYSSNSVDGAGQGLRLEIPLD (서열번호 10의 aa 424-448)
MPP4 (12 & 13)	GISSFQS (14)로 변화된 KVRRAR (aa 427-432 of SEQ ID NO: 2)	ADSGISSFQSSVDGAGQGLRLEIPLD (서열번호 13의 aa 424-448)

표 6에 나타난 MPP는 프로에어로라이신 서열(야생형 PA는 서열번호 1 및 2)를 포함하며, 여기서 6개의 아미노산 푸린 인식 사이트(서열번호 2의 아미노산 427-432)는 PSA 분할 사이트로 대체되었다. 예를 들어 MPP1(서열번호 3 및 4)은 프로에어로라이신 서열을 포함하며, 여기서 푸린 분할 사이트는 PSA 기재 HSSKLQ(서열번호: 5)에 의해 대체되었다.

재조합 PCR은 전술된 방법(Vallette et al., Nucl. Acids Res. 17:723-33, 1988)을 사용하여 에어로라이신의 푸린 사이트(서열번호 2의 아미노산 427-432)를 PSA-특이적 분할 사이트(서열번호 5, 8, 11 또는 14)로 치환하는데 사용되었다. 간단히 말해서, 재조합 PCR은 0.2 mM 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP), 0.5 μM 포워드 및 리버스 프라이머, 0.1 ㎍ 주형 DNA 및 pfu 반응 완충액[20 mM 트리스-HCl(pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0.1% 트리톤 X-100, 및 0.1 mg/ml BSA] 중 2.5 유닛 클로닝된 pfu 폴리머라제를 함유한 최종 부피 50 ㎕에서 수행되었다.

프로에어로라이신 삽입을 위한 스크리닝 변형된 세포fmf Taq 폴리머라제를 사용하여 PCR로 수행하였다. 칵테일을 0.2 mM dNTP, 0.5 μM 포워드 및 리버스 프라이머 및 5 유닛의 Taq 폴리머라제를 함유한 PCR 반응 완충액[50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 및 10 mM 트리스-HCl (pH 9.0)]에서 제조하였다. 10 ㎕ 샘플의 이러한 칵테일을 0.2 ml 튜브에 분취하고, 변형된 세포를 멸균 이쑤시게를 사용하여 첨가하였다.

최종 PCR 생성물을 적절한 제한효소를 사용하여 절단한 다음, 증폭을 위해 클로닝 벡터 pTZ18u(BioRad)에 라이게이션시켰다. 간략히 정리하면, 37℃에서 90분간 모든 DNA㎍당 약 1유닛의 제한효소를 함유하는 파마시아(Pharmacia) 원-포-올(One-Phor-All) 완충용액[1mM Tris-아세테이트(pH 7.5), 10mM Mg-아세테이트, 및 50mM K-아세테이트] 중에서 제한효소 절단을 수행하였다. 그 결과 얻어진 삽입체, 및 pTZ18u 벡터 DNA를 대략 5:1의 비율로 함께 섞고 45℃에서 15분간 가열하였다. 이어서, 상기 샘플을 원-포-올 완충용액 중에서 희석시키고, 한 가닥 상보적 부착단(cohesive-end) 라이게이션의 경우에는 ATP를 최종 농도 1mM로 첨가하였으며, 양 가닥 상보적 부착단(blunt-end)의 경우에는 상기 ATP를 최종농도 0.5mM로 첨가하였다. 그런 다음, T4 DNA 리가아제 11유닛을 각 샘플에 첨가하고 상기 샘플을 부드럽게 섞었다. 라이게이션을 13℃에서 4시간(한 가닥 상보적 부착단 라이게이션) 또는 16시간(양 가닥 상보적 부차단 라이게이션) 동안 수행하였다.

정확한 치환이 이루어졌는지 확인하기 위해 DNA 서열분석을 실시하였다. 상기 삽입체를 이어서 클로닝 벡터로부터 분리해내고 E. coli에서의 발현을 위한 숙주 범위가 넓은 플라스미드 pMMB66HE(Furste et al., Gene 48:119-131, 1986)에 서브클로닝하였다. DH5α 세포를 이전에 기술한 CaCl₂ 세척 방법(Cohen et al., Proc . Nat. Acad . Sci. USA 69:2110-4, 1972)을 이용하여 DNA 수용가능(competent) 세포로 만들었다. 대수증식기(Log-phase)의 세포(OD_6O0=0.4-0.7)를 원심분리에 의해 수확하고 100mM의 찬 MgCl₂ 1/4 부피중에서 세척하였다. 상기 세포를 다시 펠렛화하고, 100mM의 찬 CaCl₂ 2부피 중에서 재현탁시켰다. 그런 다음 상기 세포를 얼음상에서 대략 45분간 인큐베이션하였다. 그런 다음 상기 세포를 원심분리하고 100mM의 찬 CaCl₂ 1/10부피 중에서 재현탁시켰다. 글리세롤를 최종 농도 15%로 첨가하기 전에 추가 45분간 인큐베이션을 지속하였다. DNA 수용가능 세포를 사용하기 전까지 -7O℃에 저장하였다.

재조합 플라스미드의 DNA 수용가능 E. coli 세포로의 형질변형을 이노우에(Inoue)등의 방법에 따라 실행하였다(Gene 96: 23-8, 1990). DNA 수용가능 세포(200㎕ 앨리쿼트)를 얼음에서 1시간 동안 0.5-10ng의 DNA와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 42℃에서 4분간 상기 세포에 열충격을 가하였다. 상기 세포를 재빨리 얼음으로 다시 옮기고 5분간 두었다. 이어서, 500㎕의 LB 배지를 각 샘플에 부가하고 상기 세포를 37℃에서 1시간 동안 유순한 교반과 함께 인큐베이션하였다. 앨리쿼트(150㎕)를 50㎍/㎖ 앰피실린을 함유하는 LB 한천 상에 도포(plating)하였다. 이러한 플레이트들을 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

재조합 pMMB66HE 클론을 하라야마(Harayama) 등의 필터-메이팅 기술(MoI. Gen. Genet. 180:47-56, 1980)을 이용한 접합으로 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida) 종 CB3(참조: Buckley, Biochem. Cell. Biol. 68:221-4, 1990) 내로 도입하였다. 프로테아제-결함 A. 살모니시다 종의 사용은 활성화된 에어로라이신(aerolysin)에 의해 오염되지 아니한 MPP의 생산을 초래하였으며 또한 단백질의 대량 생산을 야기하였다. 상기 MPP를 이전에 기술하 바와 같은 수산화인회석(hydroxyapatite) 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다(Buckley, Biochem. Cell. Biol. 68:221-4, 1990). 상기 방법은 각 회분(batch) 마다 동일한 MPP가 제조되게 하였다.

실시예 2: MPPl 은 특이적으로 시험관내에서 PSA -생산 세포를 용해시킨다

본 실시예는 실시예 1에 기술된 본 발명의 구체예에 따른 상기 MPP의 특이성을 측정하는데 사용된 방법을 설명한다. 상기 방법은 PSA-특이적 절단 부위를 함유하는 MPP의 특이성를 시험하는데 사용될 수 있다.

MPPl을 PSA-생산 LNCaP 세포(American Type Culture Collection, Manassas, Va.) 및 PSA-비생산 TSU 세포(Dr. T. Itzumi, Teikyo University, Japan)에 대하여 시험하였다. 세포를 10^-12 M 내지 10^-6M MPPl 존재하에 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포의 수를 세고 트리판 블루를 차단하는 능력에 기초하여 생존가능 세포의 백분율을 점수화하였다. 세포의 50%를 사멸시키는데 요구되는 농도(IC₅₀)를 LNCaP 및 TSU 세포주에 대한 MPP1에 관하여 측정하였다.

PSA-생산 세포에 대한 MPPl의 LD₅₀은 10^-10M 이었다. 대조적으로, PSA-비생산 TSU 세포에 대한 경우, LD₅₀은 약 5 x 10^-8M 이었다. 이러한 결과는 MPP1가 PSA에 의해 특이적으로 활성성화된다는 것을 입증하는데, 이는 PSA-생산 사람 세포주에 대한 독성 대비 PSA-비생산 사람 세포주에 대한 독성에서 확인된 500배 독성차이에 의해 뒷받침된다.

실시예 3: MPPl 는 PSA 를 함유하는 혈액 내에서 활성화되지 아니한다

PSA 절단 부위를 함유하는 MPP는 혈액 내에서 활성화되어서는 않되는데, 그 이유는 PSA가 알파-1-항키모트립신 및 알파-2-거대글로불린(macroglobulin)과 같은 혈청 프로테아제 억제자의 과도한 존재로 인하여 혈액 내에서 효소적으로 불활성화되기 때문이다.

사람 혈청 내의 그 외 다른 혈청 프로테아제 및 PSA에 의한 MPPl의 비특이적 활성화를 시험하기 위해, 민감한 용혈 분석을 다음과 같이 실행하였다. 적혈구 세포(RBCs, 2% v/v)를 MPPl ± PSA를 함유하는 혈장 또는 완충용액에 첨가하였다. 용혈의 정도를 상등액으로 방출되는 헤모글로빈 양을 측정함으로써 분석하였다. 0.1% 트리톤(Triton)을 첨가한 결과 수초 이내에 100% 용혈이 초래되었으며 이를 양성 대조군으로 이용하였다. 가수분해 양을 540nm에서의 샘플 흡광도 대 트리톤 처리된 샘플 흡광도 비로 나타내었다. 수용성 완충용액 중에서만 적혈구(RBC)의 첨가 전에 1시간 동안 PSA와 함께 사전-인큐베이션시킨 MPPl(10^-8M)은 약 45%의 용혈을 초래하였다(도 2).

MPPl이 사람 혈장 내에서 활성화되는지 여부를 확인하기 위해, MPPl(10^-8M)을 50%의 사람 혈장내에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 관련 실험에서, 과량의 PSA(10,000 ng/㎖)를 제일 먼저 상기 사람 혈장에 첨가하고 이를 수 시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 MPPl을 함유하는 혈장 ± PSA를 사람 적혈구(2% v/v) 내에서 인큐베이션하였다. 사람 혈장, 또는 PSA를 고농도로 첨가한 사람 혈장에 MPPl의 첨가는 측정가능한 정도의 용혈을 초래하지 아니하였다(즉, 트리톤 대조군의 ＜ 1%, 도 2). 이러한 결과는 MPPl가, 심지어 혈액이 측정가능한 정도의 PSA를 함유하더라도, 혈액 내에서 임의의 현저한 활성화 없이 전신적으로 투여될 수 있다는 것을 입증한다.

실시예 4: MPPl , MPP2 , 및 MPP3 의 시험관내 및 생체내 독성

본 실시예는 MPP의 시험관내 및 생체내 독성을 확인하기 위하여 이용되는 방법을 설명한다.

시험관내 독성을 확인하기 위해, 세포 생존도 검정을 다음과 같이 실행하였다. EL4 생쥐 T-세포 임파종 세포(ATCC TIB-39)를 MTS/PMS Cell Titer 96(Promega) 내 웰(well) 당 세포수 10⁵개로 배양하였다. MPPl, MPP2 및 MPP3를 도 3에 도시된 바와 같이 1 x 10^-13M - 1 x 10^-7M로 첨가하고 상기 세포를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 MTS/PMS 키트 제조업자의 지침에 따라, 플레이트 판독기 상의 플레이트를 판독함으로써 세포 생존도를 측정하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, MPP는 야생형 프로에어로라이신 보다 독성이 덜 한데, 각각의 LC₅₀은 4X10^-9(MPPl), 1XlO^-9(MPP2), 및 1XlO^-7(MPP3)이며, 대조적으로 야생형의 LC₅₀은 1.5XlO^-10이다.

생체내 독성을 확인하기 위해, 생쥐에게 정맥주사로 MPP를 투여하였다. 야생형 프로에어로라이신(서열번호: 2)은 생쥐에 매우 유독하였다; 1회 투여량 1㎍이 1시간 이내에 죽음을 초래하였으며 일회(single) IV 주입 후 24시간 경과 시점에서의 LD₁₀₀(즉, 24시간이내에 동물의 100%를 죽게 만드는 투여량)은 0.1㎍이었다. 대조적으로, 주입 후 24시간 경과 시점에서의 MPPl(서열번호: 4)의 LD₁₀₀은 25배 더 높았다(즉, 총 투여량 2.5㎍).

실시예 5: MPP5 의 제조(히스티딘-표지화된 MPP )

본 발명 히스티딘-표지화된 MPP(MPP5)를 다음과 같이 제조하였다. MPP를 엔코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드 삽입체를 정제 및 산출의 용이성이 개선되도록 하기 위해 변형시켰다. 전사시, 2차 루프 구조를 형성하며, 단백질 생산의 감소가 초래되는, 리보솜 결합 부위 및 ATG 개시 코돈을 함유한, 35개의 뉴클레오티드로 이루어진 가닥(Burr et al., J. Bacteriol. 183: 5956-63, 2001)을 루프 형성이 방지되도록 변형시켰는데, 이때 ATG 개시 코돈으로부터 상류 방향으로 23개 뉴클레오티드는 그대로 남겨 두었다(Diep et al., MoI. Microbiol. 30: 341-52, 1998). 이것은 CB3의 배양 상등액 내로 방출될 수 있는 MPP 양의 증가를 가져왔다(Burr et al, J. Bacteriol. 183: 5956-63, 2001). 새로운 상류 서열을 지니는 컨스트럭트는 γl23 프로모터 컨스트럭트로 지정된다. MPPl 컨스트럭트를 KpnⅠ및 EcoRⅠ로 절단함으로써 상기 변형을 수행하고, 이어서 그 결과 얻어진 단편을 γl23-aerＡ::pTZ18U의 Kpnl/EcoRI 부위 내로 라이게이션시켰다. 그 결과 얻어진 컨스트럭트를 γl23-MPPl::pTZ18U로 명명하였다.

His 표지의 부가를 2-단계 퀵체인지(QuikChange)(Stratagene) 프로토콜을 이용하여 수행하였다. 제 1단계에서, 3개의 His 잔기를 하기 2개의 프라이머(3 CAT 코돈은 잉여 His 잔기를 엔코딩함)를 이용하여 합성함으로써 γ123-MPPl DNA의 말단에 부가시켰다:

EndHisl(센스): 5'-GCT GCC AAT CAA CAT CAT CAT TAA CGG CAG CGC-3'(서열번호:26);

EndHisl(안티센스): 5'-GCG CTG CCG TTA ATG ATG ATG TTG ATT GGC AGC-3'(서열번호:27).

상기 프라이머들을 상기 퀵체인지 키트를 위한 스트라타진사에 의해 제안된 프로토콜에 따라 사용하였다. 3개 His 잔기에 관한 DNA의 부가가 서열분석에 의해 확증되면, 제2의 퀵체인지 반응을 실행하여 마지막 3개 His 잔기에 관한 뉴클레오티드를 부가시킨다. 이 단계에서, 하기 프라이머들을 사용하였다:

EndHis2(센스): 5'-GCC AAT CAA CAT CAT CAT CAT CAT CAT TAA CGG CAG CGC-3'(서열번호:28);

EndHis2(안티센스): 5'-GCC AAT CAA CAT CAT CAT CAT CAT CAT TAA CGG CAGCGC-3'(서열번호:29).

두번째 라운드의 PCR 후, 클론을 스크리닝하고, 6개 His 잔기가 올바른 해독틀 내의 γ123 -MPPl 말단에 정확하게 삽입되었는지 여부 및 상기 γl23-MPPl 서열에 그 외의 다른 변형이 형성되지 않았는지 여부를 확증하기 위해 서열분석하였다. 그 결과 얻어진 플라스미드를 γl23-MPP5::pTZ18U로 명명하고, γl23-PSAH6 삽입 지역을 서열분석하였다(도 34 참조).

γl23-MPP5의 핵산 서열은 상기 MPPl 컨스트럭트의 ATG 개시 코돈 앞에 존재하는 지역 내의 핵산 서열과는 다른데, γl23 프로모터가 정상적인 aerA 상류 서열을 대체한다. 상기 서열은 또한 TAA 정지 코돈 바로 앞에 존재하는 추가 CAT 반복체를 포함한다. γl23-MPP5의 개방 해독틀이 아미노산 서열로 번역되었을 때, MPPl 아미노산 서열과 비교하여 발견된 유일한 차이는 단백질 C-말단에 6개의 히스티딘 잔기의 부가였다.

γ l23 - MPP5 의 pMMB208 발현 벡터로의 클로닝

γl23 프로모터 및 His-표지의 부가의 결과로 생성된 γl23-MPP5를 플라스미드 pMMB208 내로 클로닝하였다. 이 플라스미드는 클로람페니콜 내성을 부여하기 때문에 선택되었으며, IPTG 유도성 택(tac) 프로모터를 내포하며, 교차접합(transconjugation)에 의해 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida)내로 도입될 수 있다. 그리하여 상기 γl23-PSA PAH6 삽입체를 pMMB208 플라스미드의 HindⅢ 및 EcoRⅠ 부위 내로 클로닝하였다. 그 결과 얻어진 플라스미드(γl23-MPP5::208)를 MPP5 생산을 위해 A. 살모니시다(salmonicida) 종 CB3와 교차접합시켰다.

GLP MPP5를 정제하기 위해, 최초 pΗ가 6.90 ± 0.15 및 온도가 27℃로 설정된 30L의 멸균된 제한 배지에 대략 1% v/v의 쉐이크(shake) 플라스크 접종원을 접종하였다. 발효가 진행되는 동안 멸균된 산/알칼리의 자동 첨가에 의해 배지의 pΗ를 6.90 ± 0.15로 유지하였다. 용기내에서 용존산소농도(Dissolved Oxygen Tension, DOT)가 내내 > 20%로 유지되도록 발효기(Fermenter) RPM 및 SLM을 조정하였다. 세포 밀도가 600nm에서 흡광도(OD) 0.3-0.6에 도달되었을 때, 이소프로필 티오갈락토피라노시드(IPTG)를 첨가하여 MPP5의 발현을 유도하였다. 수 시간의 유도가 진행된 후, 발현된 단백질은 배지내로 분비되었으며, 이를 회수하였다. MPP5를 함유하는 상등액을 60 SP CUNO 필터를 사용하여 수집하였다. 세포를 분리하고 난 다음, 30,000 NMWC TFF 막을 사용하여 상등액을 농축시켰다. 농축된 상등액을 2단계 크로마토그래피로 정제하여 허용되는 수준의 순도로 단백질을 생산하였다; 니켈 킬레이트 크로마토그래피를 실행한 다음, 이어서 이온 교환 크로마토그래피를 실행한다. 이온 교환 크로마토그래피 단계로부터의 MPP5 함유 분획을 취합(pooling)하고 그 결과 얻어진 산물을 초원심분리로 대략 1mg/㎖로 농축시키고, 이어서 제형화 완충용액을 이용하여 투석여과시켰다. 정제된 MPP5를 공인된 생물 안전 캐비넷 내에서 0.22μm 앱솔루트 필터(absolute filter)를 이용하여 여과시켜 정제하고, 필요시 까지 -7O℃에 저장하였다. 이 과정을 통해 정제된 MPP5의 최종 수율은 대략 100mg/L이었다.

실시예 6: 알비노 래트에서 MPP5 의 급속 전립선내 또는 정맥내 볼루스 주입 독성 연구

본 실시예는 래트에 대한 히스티딘-표지된 MPP(MPP5)의 전립선내 투여가 전립선 중량을 감소시킬 수 있었음을 보여주는 초기 연구 결과를 제시한다.

결과의 요약

본 연구의 목적은 수컷 래트에 대한 단 1회 전립선내 주입 또는 정맥내 볼루스 주입 후에 MPP(MPP5)의 최대내성용량(maximum tolerated dose, MTD)을 확인하고 이의 잠재 독성 및 약물독성동태(toxicokinetics)을 조사하는 것인데, 관찰 기간은 1일, 14일, 또는 28일이었다. MPP5는 히스티딘 표지된 프로에어로라이신 분자인데, PSA 절단 부위를 포함한다.

연구 설계는 표 7 및 8에 상세히 기재되어 있다:

연구 기획 - MTD 연구

군	처리	투여 수준 (ug)	투여 용량 (uL)		수컷 수
군	처리		IP	IV	IP	IV
6	MPP5	10	20	500	3	3
7	MPP5	20	20	500	3	3
8	MPP5	40	20	500	3	3
9	MPP5	50	-	500	-	3

IP-전립선내(전립선내), IV-정맥내(정맥내), 48시간의 관찰기간 경과 후 동물을 절명시켰음

주된 및 독성동력학적 연구 기획

군	처리	투여 수준 (ug)	루트	주요 연구 말단의 희생물 군 마다 수컷들 2일 15일 29일			TK 연구 동물들
1	대조군	0	IP	7	7	6	9
2	MPP5	2	IP	7	7	6	9
3	MPP5	10	IP	7	7	6	9
4	MPP5	25	IP	7	7	6	9
5	MPP5	25	IV	7	7	6	9

IP-전립선내(20㎕), IV-정맥내(0.05 ㎖), TK-약물독성동태

다음 항목들을 평가하였다: 임상 징후, 체중, 사료 섭취, 검안, 혈액검사, 혈청화학검사, 소변검사, 약물독성동태시험, 부검시의 현미경 관찰, 장기 중량 및 조직병리학. 체중, 체중 증가, 사료 섭취, 검안 또는 소변검사 파라미터에서 영향은 없었다. 40㎍를 전립선내로 투여한 MTD 동물 한 마리가 2일째에 죽었음을 발견하였다. 죽기 전에 처치-관련 임상 징후는 없었다. 위 및 암부(dark area)에서 어두운 병소(dark foci)가 관찰되었으며, 주입 부위(전립선)에서는 부종(swelling)이 주목할만한 증상으로 나타났다. 25㎍를 전립선내로 투여한 주요 연구를 위한 동물 2마리가 2일째에 목숨을 잃었음을 발견하였다. 죽기 전에, 1마리의 동물에서는 주목할 만한 처치-관련 임상 징후가 관찰되지는 아니하였으나, 다른 1마리에서는 붉게 물든 털(red fur staining)(주둥이), 푸르죽죽한 피부, 활동 감소, 쇄약, 근긴장 감소, 깨끗한 액체 방출(안와주위(periorbital)), 창백한 눈, 힘든 숨쉬기, 모로 눕기(lying on side) 및 접촉에 대한 냉담(cold to touch)이 두드러지게 나타났다. 동물 한 마리에 대한 현미경 관찰에 따른 발견은 다음을 포함한다: 주입 부위(전립선)에서의 암부; 간 부근의 연한 물체를 포함한, 정소 내 연한 빛깔의, 맑은 액체. 나머지 동물 한 마리에서, 변색을 포함한, 병변(lesions)이 지방 및 빈 창자내에서 관찰되었다. 간내 유착부위(adhesions), 췌장의 비후, 위 및 흉선 내 다수 암부, 및 에피디미드(epididymides)에 인접한 복부 지방내에서 어두운 병소가 관찰되었다. 사망의 특이적 원인은 이들 2마리 수컷 래트에서 확인되지는 아니하였으나, 신장에 근접하여 발생한 극심한 전립선 염증 및 동시발생적 전신 퇴행적(degenerative) 변화가 상기 동물들의 죽음에 기여한 것으로 추정되었다.

MTD IP 투여 레벨로 처치된 동물에서 처치-관련 임상 징후가 관찰되었다. 붉게 물든 털이, 1일과 4일 사이에, 몇몇 동물의 주둥이, 턱, 앞발, 안와주위, 및 복면(ventral)/척추(dosal) 신경(cervical)을 포함하는 하나 이상의 부위에서 관찰되었다. 푸르죽죽한 피부 변색(수술 부위, 복부, 비뇨생식기 또는 사타구니 부위)이 20 및 40㎍로 투여한 동물들에서 1/3마리꼴로 관찰되었는데, 40㎍를 투여한 동물 한마리에서는 비뇨생식기의 부종이 관찰되었다. 정맥내로 투여된 MTD 동물에서, 붉게 물든 털(주둥이 및/또는 안와주위)의 발생율은 50㎍로 처치된 동물에서 더 높게 나타났다.

일반적으로 처치된 동물에서 발생율이 더 높았으나, 주요 연구를 위한 동물에 있어서 대조군을 포함하는 모든 IP 투여량 레벨에서 붉게 물든 털(주둥이)이 우세하게 관찰되었다. 이러한 임상 징후는 처치와 관련이 있을 가능성이 있는 것으로 생각되었다. 붉게 물든 털(주둥이)이 또한 모든 주요 연구 IV 동물에서 관찰되었다. 추가 임상 징후가 주입 부위에서(꼬리) 두드러지게 나타났으며, 피부 딱지 및/또는 발적 또는 그 외 다른 변색을 포함하였다. 또한, 2마리의 동물이 병변으로 인한 꼬리 절단이 요구되었으며 자해가 의심되었다. 이들 후자 변형은 시험 품목 제형의 잠재적 자극원을 제안하였는데, 이는 조직병리학적 시험 수행후 보다 더 뒷받침되었다.

투여량-관련 증가가 2일째에 주요 연구 IP 동물의 몇몇 백혈구 파라미터에서 관찰되었다. WBC, 호중구, 단핵구 및 호염구 숫자가 10 및/또는 25㎍로 처치된 모든 그룹에서 증가되었다. 증가는 25㎍로 처치된 MCHC 및 MPV의 모든 투여량 레벨에서 또한 관찰되었다. 감소는 백분율(percent)로 기록되었으며 모든 투여량 레벨의 절대 망상적혈구에서 기록되었다. 대단치는 않으나, 활성화된 일부 트롬보플라스틴 시간에서의 투여량-관련 증가가 모든 IP 투여량 레벨에서 두드러지게 나타났다. 유사한 변형이 정맥내로 25㎍을 처치한 동물에서 관찰되었다. WBC, 호중구 및 호염구 숫자가 증가되었다. MCHC, MPV 및 적혈구 분포면적(red cell distribution width, RDW)이 또한 증가되었으며, 백분율과 절대 망상적혈구는 감소되었다. 관찰 14일 경과 후에 절명시킨 동물에서, 증가는 RDW 및 MPV에서만 관찰되었고, 28일 후, 혈액학 파라미터에서 두드러진 차이는 나타나지 아니하였다. 관찰 1일 경과 후 절명시킨 동물에서 두드러지게 나타난 변형은 시험 품목과 관련되어 있는 것으로 생각되었다. 15일 및 28일 관찰 기간 경과후 드러난 결과는 이러한 변형으로부터의 회복을 입증한다.

아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 및 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 평균 농도에서의 투여량 관련 증가가 2일째에 관찰되었으며 25㎍로 투여시 두드러지게 나타난 것으로 생각되었다. 직접 빌리루빈, 우레아, 크레아티닌 및 트리글리세리드 농도에서의 증가가 또한 25㎍ IP 투여시 두드러지게 나타났다. 감소는 25㎍ 투여시 글루코오스 농도에서 관찰되었으며, 알부민 대 글로불린 비에서 동반 감소 및 총 단백질 농도의 감소(25㎍에서만)와 함께 알부민 농도는 10㎍이상(≥10㎍) 감소되었다. 25㎍ IV 처치된 동물에서, 우레아 및 칼슘 농도에서 약간의 증가가 관찰되었으며, 알부민 대 글로불린 비에서 대응되는 감소와 함께 글로불린 농도에서의 약간의 증가가 또한 두드러지게 나타났다. 이러한 변형들은 주입 부위에서 관찰된 염증과 관련이 있는 것으로 생각되었다. 29일째에, 알라닌 아미노포스파타아제 농도에서의 증가 및 직접 빌리루빈 농도에서의 감소가 25㎍ IP 투여에서만 두드러지게 나타났다.

정맥내 투여의 경우, 복합물(composite) 최종 반감기가 12.8시간으로 측정되었다. C_max는 81.3ng/㎖의 값을 가진 시간 0시에 역외삽될 수 있다. 관찰된 피크 값(첫번째 샘플링 시간에서)은 74.3ng/㎖이었다. 전신 제거(CL) 및 분포 부피(Vz)는 각각 46.3㎖/h와 841㎖로 측정되었다. 전립선내 투여 후, 모든 케이스의 경우에 있어서, 관찰된 t_max가 투여 4시간 경과시 발생하였음을 확인하였는데, 피크 레벨은 10㎍ 및 25㎍에서 각각 2.95와 3.51ng/㎖이었다. 관찰된 AUC₀ _- _tlast는 상이한 t_last가 관찰되었기 때문에, 높은 투여량에서 감소되는 것으로 생각된다. 전립선내 경로에 대한 투여량 직선성을 C_max 및 AUC₀ _- _tlast를 이용하여 평가하였다. 두 투여량 표준화 노출 파라미터는 10㎍로부터 25㎍까지 감소되었으며 대응하여 평가된 생체이용율(bioavailability)은 23.7 및 4.38%이었는데, 이는 투여량 수준이 증가함에 따라 전립선으로부터 전신 순환으로 제한적인 MPP5의 흡수가 일어났음을 확인시켜 주었다.

MTD 단계 동안, 수컷 래트에 40㎍ MPP5의 단일 IP 투여는 특이적인 사망 원인이 규명되지 않은 사망과 관련이 있었다. 수컷 래트에 MPP5의 단일 IV 투여는 최대 투여량 50㎍까지 허용되었다.

주요 연구 단계 진행 동안, 수컷 래트에 MPP5의 단일 IP 주입은 25㎍ 투여시 2마리 래트에서 사망을 초래하였으며, 주입 부위 변형, 육안으로 관찰되며 현미경으로 관찰되는 장기(organ) 중량 변화(≥2㎍)를 초래하였다. 상기 2마리의 수컷의 사망의 원인은 확실하게 규명할 수 없지만, 극심한 전립선 염증 및 연관된 변형이 상기 동물의 노후화/사망에 기여하였을 것으로 추정되었다. 변형과 관련된 그 외 다른 시험 품목은 회복기간의 2, 15, 및/또는 29일째에 관찰되었다. 그 외 다른 조직에서의 육안으로 관찰되고, 현미경으로 관찰되는 장기 중량 변화는 전립선 주입 부위 변형에 별로 중요치 않은 것으로 생각되었다.

수컷 래트에 MPP5의 IV 주입은, 25㎍ 이상(≥25㎍) 투여시, 꼬리 정맥 주입 부위에서의 육안으로 관찰되고/되거나 현미경으로 관찰되는 변화를 초래하였다. 이러한 변형은 25㎍ 투여시의 점진적 회복과 함께 회복기의 2, 15 및 29일째에 관찰되었으며, 시험 품목의 자극원 효과에 대한 지표가 되었다. 그 외 다른 조직에서의 육안으로 관찰되며 현미경으로 관찰되는 변형은 주입 부위 변형에 별로 중요치 않은 것으로 생각되었다. 2일째에 간 및 비장 장기 중량 변화는 현미경적으로 관찰되는 상관관계 없이 나타났으며 15일째에 회복되었다.

결론적으로, 투여량 수준의 40㎍까지 단일 전립선내 주입 또는 투여량 수준의 50㎍까지 정맥내 주입에 의한 MPP5의 투여는 명확한 사망 원인 없이 25㎍ 및 40㎍ IP 투여시 사망을 초래하였으나, 신장에 근접하여 발생한 전립선 염증과 관련된 시험 품목의 정도 및 동시발생적인 전신 퇴화(degeneration)가 죽음에 이르게 한 주요 기여 요인인 것으로 생각되었다. 대부분의 경우, 가역적 변화가 임상 징후(≥2㎍), 혈액검사 및 임상 생화학검사 파라미터(≥10㎍)에서 관찰되었다. 병리학적 변화가 투여량과 관련된 방식으로 모든 투여량 레벨에서 지속되었으나, 정맥내로 처치된 동물에서 퇴화의 증거를 나타내었다. 결론적으로, 농도를 증가시킬 때 전립선내 또는 정맥내 경로 둘 모두에서 NOEL(아무런 악영향도 감지할 수 없는 최대농도, no-observable-effect-level)은 측정되지 아니하였다.

실험 절차

3.1. 시험 시스템

총 180마리의 수컷 스프레이그 다우리(Sprague Dawley)(Crl: CD^® SD) IGS BR) 래트(라투스 노르베기쿠스, Rattus norvegicus)를 사용하였다. 처치 개시시에, 실험동물은 12 내지 15주령이었으며 체중은 399 내지 495g이었다.

3.2 수의학적 처치

4일 및 7일째에, 자해가 의심되어, 동물 5010 및 5004 각각을 대상으로 꼬리 절단을 수행하였다. 이러한 동물들을 정맥내로 처치하면서, 절단된 조직을 병리학적 평가를 위해 중성으로 완충된 10% 포르말린에 보관하였다.

처치에 앞서, 모든 동물들의 체중을 측정하였으며 컴퓨터-기반 무작위화(randomization) 절차를 이용하여 상기 동물들을 무작위적으로 임의의 처치 그룹에 할당하였다. 체중을 이용한 계층화(stratification)를 파라미터로 하여 무작위화하였다. 허약한 동물은 그룹에 할당하지 아니하였다. 연구 디자인은 표 9(MTD) 및 표 7(Main)에 상세히 기재되어 있다.

MTD 연구

군	처리	투여 수준 (ug)	투여 용량 (uL)		수컷의 수
			IP	IV	IP	IV
6	MPP5	10	20	500	3	3
7	MPP5	20	20	500	3	3
8	MPP5	40	20	500	3	3
9	MPP5	50	-	500	-	5

IP - 전립선내, IV - 정맥내

상기 MTD 연구에 할당된 동물을 48시간 관찰 기간 경과 후 절명시켰다. 1일째에, IP 투여량 섭생으로 할당된 동물 6001 및 8001을 기술적 오류로 인하여(상기 동물들에 할당된 투여량이 10배 과투여되었음) 각각 여분의 동물 6101 및 8101으로 대체하였다. 동일한 날짜가 경과한 후, 투여후 대략 4시간 경과하였을 때 동물 8001(400㎍)이 죽었음을 발견하였으며, 동물 6001(100㎍)은 악화된 상태로 인하여 1일째가 종료될 무렵에 안락사시켰다. 상기 동물들은 세밀한 외부 및 내부 조사를 포함한 검시를 받도록 하였다; 그러나, 조직병리학 검사를 위하여 조직을 보관하지는 아니하였다. 죽기 전에, 동물 6001이 나타낸 임상 징후는 쇄약, 근긴장 감소, 부분적으로 폐쇄된 눈, 접촉에 대한 불감, 활동 감소 및 비정상적인 걸음걸이를 포함한다. 동물 8001이 나타낸 임상 징후는 모로 눕기, 힘든 숨쉬기, 호흡율 감소, 푸르죽죽한 피부, 창백한 눈, 접촉에 대한 불감, 활동 감소, 쇠약 및 근긴장 감소를 포함한다. 동물 6001에 대한 총제적인 조사결과 투여 부위(전립선)에서의 단 하나의 암부만이 확인되었다. 동물 8001의 경우, 좌우 양즉의 어두운 변색이 하악 림프절에서 두드러지게 나타났으며 주입 부위(전립선)에서 부종이 두드러지게 나타났다. 이러한 사망은 아마도 MPP5 고투여와 관련이 있는 것으로 생각되며 본 연구에서는 MTD에 대한 추가 참고자료를 제공하기 위하여 기록되었다.

13일째에(MTD 연구), 40㎍이하(≤ 40㎍)에서 보여진 제한된 관찰결과로 인하여 정맥내 경로를 통한 MPP5 독성에 대해 더 탐구하기 위하여, 정맥내 경로를 통해 50㎍의 투여량 수준으로 추가 동물에 투여하였다.

투여를 시작하기에 앞서, 동물 1025는 부정교합때문에 본 연구에 사용하기가 부적합한 것으로 간주되었으며, 여분의 동물로 대체되었는데, 상기 동물은 동물 1125이었다. 그룹으로 할당되지 아니한 모든 동물을 연구로부터 해방시켰으며 이들의 성향을 기록하였다.

3.3. 시험 및 전달매체 대조군 품목

시험 품목은 3.2mg/㎖의 농도의 MPP5(제품 번호 PTIC-MF-PAL-DS-001)이었다. 시험 품목은 동결시 무색 고체이었으며, 직사광에 노출되지 않게, -2O℃에 저장되었다. 전달매체 대조군으로 인산 완충된 염수-EDTA(pH 7.4)를 사용하였다.

3.4. 투여 제형의 제조

투여 제형(Dose formulations)을 사용 날짜에 따라 제조하였다. 각 날짜에, 3.2mg/㎖의 MPP 표준용액으로부터 적당한 양을 재서 덜어내고 적당한 양의 PBS, 1mM EDTA로 희석하였다.

3.5 시험/대조군 품목의 투여

MTD 연구

3마리의 래트로 이루어진 그룹을 대상으로 단 하루에 섹션 3.2 및 표 9에 기재된 바와 같이 전립선내 또는 정맥내로 투여하고, 투여후 48시간 까지 임상 징후 및 잠재적 독성에 대해 관찰하였다. 정맥내 투여한 경우, 시험 품목을 투여 부피 0.5㎖로 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주입에 의해 투여하였다.

전립선내 그룹의 경우, 투여량 투여에 앞서, 동물들을 이소플루란(isoflurane)을 이용하여 마취시켰다. 적어도 수술 1시간 전에 그리고 수술 후 2일째까지, 벤자딘(Benzathine) 페니실린 G 및 프로카인(Procaine) 페니실린 G(0.1㎖)의 항생제 근육 주사를 상기 동물들에게 놓았다. 또한 수술 당일 동물들에게 버프레노파인(Buprenorphine)(0.05 mg/㎏)을 피하 주입하였다.

외과용 메스 칼날을 이용하여, 페니스에서 0.5cm로 시작하여 대략 2cm의 정중선 절제를 실행하였다. 배를 동일한 길이로 절개하였다. 전립선의 두 복엽(vental lobes)을 고정시키고 20㎕의 제형화된 MPP5 또는 PBS/EDTA(pH 7.4)를 적당한 주사기를 이용하여 우측 복엽에 주입하였다. 봉합 전에, 상기 부위를 따뜻한(대략 37℃) 0.9% 염화나트륨 주사(U.S.P)로 자극하였다. 적당한 봉합 재료를 이용하여 상기 부위를 층별로 봉합하였다.

정맥내 경로로 할당된 동물의 경우, 시험 품목을 0.5㎖의 투여량 부피로 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 투여하였다.

주요 연구

MTD 단계에서 정립된 절차에 따라 동물에게 투여하였다. 정맥내 경로로 할당된 동물의 경우, 시험 품목을 0.05㎖의 투여량 부피로 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 투여하였다. 처치 완료 후, 1, 14 또는 28일의 회복기 동안 주요 연구 동물을 투여하지 않은 상태로 유지하였다.

3.6. 관찰

임상 관찰: 모든 동물에 대하여 연구기간 내내 사망 및 악화된 건강 징후 및/또는 처치에 대한 반응을 1일 2회(도착일 및 부검일에 1번) 관찰하였다. 또한, 상세한 검사를 처치 개시 전에 그리고 처치 및 회복기간 내내 매일 1회 이상 실시하였다(주요 연구 및 MTD 연구를 위한 동물).

체중: 모든 동물을 대상으로 개개의 체중을 무작위로 선정된 날짜에 처치 및 회복기간 내내 주 2회 측정하였다(주요 연구를 위한 동물). 또한, 일정이 정해진 부검 전에 각각의 주요 연구/회복 동물의 체중(금식시)을 측정하였다. 투여 전에 그리고 최종 절명 전에 MTD 연구 동물의 체중을 측정하였다.

사료 섭취량: 주요 연구를 위한 동물을 대상으로 개개의 사료 섭취량을 처치전 기간의 마지막 주에 개시하여 처치 및 회복기간 내내 주단위로 측정하였다.

검안: 처치 개시전에 한번(모든 동물) 및 부검 전에 다시 한번(주요 연구 동물), 안저(funduscopic)(간접 검안) 및 생체현미경(세극등) 검사를 공인된 자격을 구비한 숙달된 검안사에 의해 시행하였다.

실험실 조사: 혈액학 및 혈청화학검사 검사를 위한 혈액 샘플 채취를 2, 15 및 29일 부검시에 모든 주요 연구 동물을 대상으로 시행하였다. 혈액 샘플 채취에 앞서 밤새 동물이 공복이 되도록 하였다. 이소플루란 마취 하에 복부 대동맥으로부터 혈액 샘플을 수집하였다.

소변 샘플을 대략 16시간 수집 기간 동안 대사 우리에 풀어 놓은 주요 연구 동물로부터 부검 전 2, 15 및 29일에 수집하였는데, 상기 동물에게 사료를 공급하지 않았다.

다음의 혈액검사 파라미터를 검사하였다: 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간, 혈액 세포 형태, 적혈구 지수(MCV, MCH, MCHC 및 RDW); 헤마토크리트 헤모글로빈, 평균 혈소판 부피 혈소판 수 프로트롬빈 시간, 적혈구 수, 망상 적혈구 수(절대 수치 및 백분율), 백혈구 수(총 미분, 절대 미분 및 백분율 미분).

다음의 혈청화학검사 파라미터를 검사하였다: A/G 비(계산됨) 알라닌 아미노트랜스퍼라아제, 알부민, 알카라인 포스파타아제, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제, 혈액 우레아 질소, 칼슘 클로라이드 콜레스테롤 크레아티닌, 글로불린(계산됨), 글루코오스, 무기 인산 칼륨, 나트륨, 총 빌리루빈, 총 단백질, 트리글리세리드.

다음의 소변검사 파라미터를 검사하였다: 빌리루빈, 혈액 색 및 모양, 크레아티닌, 글루코오스, 케톤, 원심분리로 침전된 아질산염에 대한 현미경소견, pH, 단백질, 요비중(specific gravity), 우로빌리노겐 부피.

면역원성 평가(14일 및 28일 주요 연구 한정)

혈액 샘플을 사전-투여(바셀린)한 주요 연구 래트 각각으로부터 목 정맥 및 최종 희생시 (임상 병리에 관한 혈액 샘플 채취에 따른) 이소플루란 마취 후 복부 대동맥을 통해 수집하였다. 샘플을 혈청 분리 튜브에 넣고, 수회 인버팅하고, 20 내지 30분 동안 실온에서 응고되도록 한 다음, 약 4℃에서 10분간 약 1200g로 원심분리하였다.

3.7 독성동태시험

연구 1일째에, 대안적으로 혈액 샘플(~0.5㎖)을 사전-투여시, 15분 및 30분 그리고 투여-후 1, 2, 4, 8, 24 및 48시간의 시점 당 3마리의 독성동태 연구용 래트로부터 목 정맥에 대한 정맥천자로 K3 EDTA 튜브에 수집하였다. 혈액 샘플을 즉시 젖은 얼음 위로 옮기고 대략 2700rpm으로 10분간 냉각 원심분리(대략 2 내지 8℃)로 분리하기 전까지 두었다. 혈장을 분리하고, 제2의 튜브에 옮기고, 상기 튜브를 드라이아이스 위에 두었다. 혈장 샘플을 대략 -20℃에서 저장하고 MPP5 수준을 분석하였다.

혈장 샘플을 항체 샌드위치 원리에 기초한 효소결합 면역흡수 분석법(ELISA)으로 분석하였다. 고체 상을 만들기 위해 MPP5에 특이적인 포획된 항체(생쥐 항-에어로라이신 단일클론항체)를 96-웰 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅시켰는데, 상기 항체는 규격 및 품질 관리 샘플 내에 존재하는 분석대상물을 포획하였다. 분석대상물 분자의 서로 다른 에피토프에 결합하는 2차 항체(토끼 항-에어로라이신 다클론항체)를 이후 항체-분석대상물-항체 샌드위치를 완성시키기 위해 부가하였다. 토끼 IgG의 불변 지역에 결합하는 검출 항체 효소 접합체(염소 항-토끼 IgG, 호스라디쉬 퍼옥시다아제 접합체)를 이후 부가하였다. 포획된 접합체를 테트라메틸벤지딘 기질을 사용하여 시각화하고 스펙트라맥스(SpectraMAX) 플레이트 판독기를 사용하여 450nm에서 측정하였다.

전립선내 투여 경로의 경우, 혈장 농도 데이타에 관한 비구획 독성동태 분석을 실행하였다. 실제적으로, 독성동태 분석은 t_max, C_max, AUC, k, 및 t1/2에 대한 평가를 포함하였다. t_max 및 C_max는 관찰된 값이다. 가능한 경우, AUC 파라미터를 표준 컴퓨터 소프트웨어 프로그램 윈논린(WinNonlin)(Version 3.2)를 이용한 사다리꼴 공식(trapezoidal rule) 방법(Gibaldi and Perrier, 1982)에 의해 계산하였다. k를 농도 대 시간 곡선의 명백한 최종 단계에서의 선택된 시점에 대한 직선 회귀 분석에 의해 결정하였다. 명백한 최종 반감기를 다음 방정식에 따라 계산하였다: t1/2=ln2/k.

정맥내 투여 경로의 경우, 혈장 농도 데이타에 관한 비구획 독성동태 분석을 실행하였다. 실제적으로, 독성동태 분석은 t_max, C_max, AUC, k, t1/2, Vz 및 CL에 대한 평가를 포함하였다. C_max는 시간 0시에 역-외삽될 것이다. AUC 파라미터를 표준 컴퓨터 소프트웨어 프로그램 윈논린(Version 3.2)를 이용한 사다리꼴 공식 방법(Gibaldi and Perrier, 1982)에 의해 계산하였다. k를 농도 대 시간 곡선의 명백한 최종 단계에서의 선택된 시점에 대한 직선 회귀 분석에 의해 결정하였다. 명백한 최종 반감기를 다음 방정식에 따라 계산하였다: t1/2=ln2/k. 클리어런스(CL)를 투여량(Dose)/AUC에 기하여 계산하였고 명백한 분포 부피(Vz)를 CL/k에 따라 계산하였다.

3.8. 최종 절차

육안 병리소견: 연구가 진행되는 동안 사망한 것으로 밝혀진 MTD 연구 동물을 조직 보존없이 부검하였다. 연구가 진행되는 동안 사망한 것으로 밝혀진 모든 주요 연구 및 회수 동물을 부검하였으며 조직 샘플을 보존시켰다.

처치 기간 및 회복 기간 종료시에, 모든 생존 동물은 복부 대동맥으로부터 피가 채혈되었으며 이후 이소플루란 마취 및 실험실 조사를 위한 혈액 샘플 수집을 실행하였다. 자가분해성 변화를 막기 위해, 모든 주요 연구 동물에 대한 마취 후 가능한 빨리 시체에 대한 완전한 육안 병리 검사를 실행하였다.

장기 중량: 일정에 따른 부검시 안락사시킨 주요 연구 동물 각각의 경우, 다음 장기들을 지방 없이 절개해 내고 중량을 측정하였다: 부신, 뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 정소, 뇌하수체, 전립선, 비장, 흉선, 갑상선 엽(부갑상선과 함께). 짝지워진 장기의 중량을 같이 측정하였으며 체중 대비 장기의 중량비를 계산하였다.

조직 보존: 주요 연구 동물 각각에 대한 부검의 완료시, 다음의 조직 및 장기들을 보존시켰다: 비정상, 동물 식별, 부신, 대동맥(흉부), 골 및 골수(흉골(sternum)), 뇌 (대뇌, 소뇌, 중뇌 및 연수), 맹장, 대장, 십이지장, 부고환, 식도, 눈, 눈물샘(Harderian glands), 심장(대동맥 부위 포함), 회장, 주입 부위(전립선) 그룹 1 내지 4 , 주입 부위(꼬리 정맥) 그룹 5, 빈 창자, 신장, 눈물샘(lacrimal glands), 간(2엽 샘플), 폐(2엽 샘플), 림프절(하악 및 장간막), 젖샘(사타구니), 비강 및 비동(3층), 시신경, 췌장, 뇌하수체, 전립선(주입되지 ㅇ아않은 엽), 직장, 침샘, 좌골신경(sciatic nerve), 정낭(정낭), 골격근, 피부(사타구니), 척수(경부), 비장, 위, 정소, 흉선, 갑상선 엽(및 부갑상선), 혀, 장기(trachea), 수뇨관(좌우양측), 방광.

중성으로 완충된 10% 포르말린을 젠커(Zenker) 용액에 고정시킨(안락사시킨 동물에 한정) 부고환, 눈, 시신경 및 정소를 제외한 조직의 고정 및 보존을 위해 사용하였다. 안락사시킨 모든 동물의 경우, 3 대퇴부 골수 표본(smears)을 마련하고 이를 염색시켰다. 상기 표본을 보존하였으나 평가하지는 않았다.

조직검사: 조직을 파라핀 왁스에 깊숙이 넣고, 절단하고(비강 및 비공, 흉골 및 꼬리 정맥 주입 부위는 절단에 앞서 석회질이 제거되었다), 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고 다음과 같이 조직병리학적으로 검사하였다:

그룹 1, 4 및 5: 조직 보존이 행해진 조직을 목록화하였다(동물 식별 및 직장 제외),

그룹 2 및 그룹 3: 처치-관련 징후를 나타내는 조직, 모든 거대 병변 및 표적 조직을 아래와 같이 목록화하였다:

모든 투여 그룹 내의 모든 주요 연구 동물의 뇌, 심장, 신장, 간, 림프절, 주입 부위(전립선), 전립선(주입되지 않은 엽), 비장, 갑상선 엽(및 부갑상선), 수뇨관 및 방광을 포함한, 표적 조직의 조직 샘플을 가공하고 검사하였다. 시신경, 부갑상선 및 젖샘을 눈, 갑상선 및 피부 각각의 루틴한 절편이 존재하는 경우 조직병리학적으로만 검사하였다.

통계적 분석

연구를 수행하는 동안 획득한 수치 데이터를 이용하여 그룹 평균 및 표준 편차를 계산하였다. 관심있는 각 파라미터에 대하여, 그룹 분산을 0.05 유의 수준으로 레빈 검정(Levene's test)을 이용하여 비교하였다. 그룹 분산 간의 편차가 유의하지 아니하였을 경우, 파라미터 원-웨이 분산분석법(analysis of variance, ANOVA)을 실행하였다. ANOVA(p < 0.05)에 의해 평균들 중에서 유의한 편차가 나타났다면, 이후 던네트(Dunnett) "t" 검정을 이용하여 대조군 그룹과 각각의 처치 그룹 간 그룹 평균 비교를 실행하였다.

레빈의 검정이 이형 그룹 분산을 나타내는 경우에는 언제나(p < 0.05), 비-매개변수 크루스칼-월리스(Kruskal-Wallis) 검정을 이용하여 고려된 모든 그룹을 비교하였다. 상기 크루스칼-월리스 검정이 유의하였다면(p < 0.05), 이후 대조군 그룹과 각각의 처치 그룹 간의 편차의 유의도를 둔(Dunn) 검정을 이용하여 평가하였다.

관심있는 각 쌍의 그룹 비교의 경우, 유의도를 0.05, 0.01 및 0.001 수준에서 기록하였다.

결과 및 고찰

1. 투여 제형 분석

연구에 사용된 투여 제형의 pH, 삼투압 및 밀도 평가 결과가 표 10에 기재되어 있다.

투여 제형의 pH, 삼투압 및 밀도

군	투여 수준 (ug)	루트	pH	삼투성 (mOsm/kg)	밀도 (g/cm³)
1	0	IP	7.39	300	1.0037
2	2	IP	7.38	299	1.0030
3	10	IP	7.36	298	1.0041
4	25	IP	7.36	295	1.0049
5	25	IV	7.36	301	0.9999
6	10	IV/IP	7.35/7.35	308/304	0.9941/1.0043
7	20	IV/IP	7.35/7.34	307/302	1.0052/1.0002
8	40	IV/IP	7.35/7.32	305/297	1.0048/1.0040
9	50	IV	7.37	308	1.0057

2. 사망율

MTD 연구

2일째에, 동물 8101(40㎍, IP)이 죽었음을 발견하였다. 죽기 전에, 처치-관련 임상 징후는 없었다. 부검시, 어두운 병소가 위에서 관찰되었으며 암부 및 부종이 주입 부위(전립선)에서 두드러지게 나타났다. 죽음의 명확한 원인이 확인되지는 않았다.

주요 연구

2일째에, 동물 4005 및 4013(25 ㎍, IP)이 죽었음을 발견하였다. 죽기 전에, 동물 4013에 두드러지게 나타난 처치-관련 임상 징후는 없었다. 동물 4005의 경우, 붉게 물든 털(주둥이), 푸르죽죽한 피부, 활동력 감소, 쇠약, 근긴장 감소, 깨끗한 액체 분비물(안와주위), 창백한 눈, 힘든 숨쉬기, 모로 눕기 및 접촉에 대한 냉담이 두드러지게 나타났다.

동물 4005에 대한 부검시, 현미경적 발견은 다음을 포함한다: 주입 부위(전립선)에 암부; 정소내 어우둔 병소; 간 주위에 연한색 물질을 포함한, 복강내 연한 빛깔의, 맑은 액체. 동물 4013의 경우, 변색을 포함한, 병변이 지방 및 빈 창자에서 관찰되었다. 유착이 간에서 관찰되었으며, 췌장 비후, 위 및 흉선 내 다수의 암부, 및 부고환에 인접한 복부 지방내 어두운 병소가 발견되었다. 2 케이스에서 사망의 원인은 확실하지 않았으나, 신장 근처에서 조직병리학적으로 관찰된 극심한 전립성 염증 및 동시발생한 전신 퇴행적 변화가 이들 동물의 사망에 기여한 것으로 추정되었다.

3. 임상 관찰

MTD 연구

처치-관련 영향이 MTD IP 투여량 레벨(10 내지 40㎍)로 처치된 모든 동물에서 관찰되었다. 1일째와 4일째 사이에 모든 그룹의 2/3마리에서 붉게 물든 털이 관찰되었는데, 주둥이, 턱, 앞발, 안와주위, 및 복면의/척추 신경을 포함하는 하나 이상의 부위에서 관찰되었다. 푸르죽죽한 피부 변색(수술 부위, 복부, 비뇨생식기 또는 사타구니 부위)이 각각 20 및 40㎍으로 처치한 그룹의 1/3마리에서 두드러지게 나타났으며, 동물 8002(40 ㎍)에서 비뇨생기기 부종을 포함한다. 이러한 관찰이 수술 절차와 관련이 있을 수 있지만, 발생률 및 극심도는 40㎍ 처치시 증가하였다.

정맥내로 처치된 동물에서, 처치-관련 임상 징후는 붉게 물든 털(주둥이 및/또한 안와주위)에 한정되었는데, 50㎍로 처치된 동물에서 발생률의 증가가 두드러졌다. 고 투여량으로 처치한 동물의 5/5까지 이러한 징후가 관찰되었으며, 이에 비하여 1일 내지 4일 동안 50㎍미만(<50㎍)으로 처치된 동물의 1/3에서 이러한 징후가 관찰되었다.

주요 연구

2일째 절명

붉게 물든 털(주둥이, 안와주위, 및/또한 두개)이 3/7마리(대조군), 1/7마리(2㎍ 처치), 5/7마리(10㎍ 처치) 및 3/7마리(25㎍ 처치)를 포함한 몇몇 동물의 모든 IP 투여량 레벨에서 두드러지게 나타났다. 동물 4014(25㎍)의 양쪽 눈에서 선홍색 분비물이 관찰되었고 동물 4015은 활동력이 감소되었고 2일째 부검 전에 접촉에 냉담하였다.

4. 사료 섭취

사료 섭취에는 영향이 없었다.

5. 검안

안과학적으로 발견된 것은 없었다.

6. 혈액검사

2일째에 절명시킨 IP 동물의 경우, 일부 백혈구 파라미터에서 투여량과 관련된 증가가 2배 또는 이를 초과하여 관찰되었다. 백혈구(WBC), 호중구, 단핵구 및 호염구 숫자가 처치된 모든 그룹에서 증가되었는데, 10 및/또는 25㎍에서 통계적 유의성이 얻어졌다. 또한 평균 혈구 헤모글로빈 농도(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC)의 통계적으로 유의한 증가는 25㎍으로 처치한 동물에서 얻어졌고 평균 혈소판 용적(MPV)의 통계적으로 유의한 증가는 모든 투여량 레벨에서 얻어졌다. 백분율 및 절대 망상적혈구에 있어서 감소가 모든 투여량 레벨에서 기록되었다. 대단치는 않지만, 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간에 있어서 투여량-관련 증가가 모든 IP 투여량 레벨에서 두드러지게 나타났는데, 통계적 유의성은 25㎍에서 얻어졌다.

유사한 변형이 25㎍ MPP5를 정맥내로 처치한 동물에서 관찰되었다. WBC, 호중구 및 호염구 숫자가 증가되었다. MCHC, MPV 및 적혈구분포면적(RDW)가 또한 증가되었으며 백분율 및 절대 망상적혈구는 감소되었다. 14일 관찰후 절명시킨 동물에서, 감소는 RDW 및 MPV에서만 관찰되었다. 28일 관찰후, 혈액검사 파라미터에서 두드러지게 나타난 차이점은 없었다. 1일 관찰후 절명시킨 동물에서 두드러지게 나타난 변화는 시험 품목과 관련이 있으며 조직병리학적으로 상관관계가 있는 것으로 생각되었다. 15일 및 28일 관찰 기간 경과후 드러난 결과는 이러한 변화로부터 회복이 발생하였음을 입증하는 증거를 제시한다. 기타 중요하지 않은 차이점들은 우연히 발생한 것이고 처치와 관련이 없는 것으로 생각되었다.

7. 혈청화학검사

2일째에, 투여량 관련 증가(25㎍ IP에서 통계학적 유의성이 얻어짐)가 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 및 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 평균농도에서 관찰되었다. 이것은 25㎍로 처치한 동물에서 눈에 띄게 나타난 변화인 것으로 생각되었다. 직접 빌리루빈, 우레아, 크레아티닌 및 트리글리세리드 농도에서의 증가가 또한 25㎍ IP에서 두드러지게 나타났다. 글루코오스 농도에서의 감소가 25㎍에서 관찰되었다. 알부민 농도는 알부민 대 글로불린 비에서의 관련된 감소와 함께 >10 ㎍에서 감소되었고 총 단백질 농도는 25㎍에서만 감소되었다.

25㎍ IV로 처치된 동물에서, 우레아 및 칼슘 농도에서의 미미한 감소가 관찰되었다. 글로불린 농도에서의 미미한 감소가 또한 알부민 대 글로불린(A/G) 비에서의 대응된 감소와 함께 두드러지게 나타났다. 글로불린에서의 (그리고 결과적으로 A/G 비에서) 변형은 아마도 주입 부위에서의 염증과 관련되어 있는 것으로 생각되었다.

15일째에, 트리글리세리드 농도에서의 통계적으로 유의한 감소가 IV 처치된 동물을 포함한 모든 투여량 레벨에서 관찰되었다. 이러한 감소는 독성학적으로 유의성은 없으며 지질 대사에서의 미미한 변형과 아마도 관련되어 있는 것으로 생각되었다.

29일째에, 알라닌 아미노포스파타아제 농도에서의 증가 및 직접 빌리루빈 농도에서의 감소가 25㎍ IP에서만 관찰되었다. 이러한 변형은 조직병리학적으로 설명된 별로 중요치 않은 변형과 관련이 있을 것이다.

기타 독성학적으로 유의한 변형은 없었다.

8. 소변분석

소변검사 파라미터와 관련한 유의한 영향은 없었다.

9. 독성동태시험

MPP5 혈장 농도는 일반적으로 각 시점에서의 각 그룹에 속한 개개 동물들 사이에서 유사하였다. 투여량 레벨에 따라 예상되었던 혈장 농도 수치에서의 일부 변화가 예상되었고 체중 또는 전립선 중량에 따라 표준화시키지 않았다. MPP5는 대조군 동물로부터 수집된 샘플 내에서 또는 사전 투여 수집된 샘플로부터 정량될 수 없었다.

시험 그룹에서, MPP5의 혈장 농도는 전립선내로 투여된 시험 품목의 투여량 레벨이 증가됨에 따라 일반적으로 증가하였는데, 상기 MPP5는 2㎍이 처치된 동물로부터 수집된 임의의 샘플에서는 검출할 수 없는 농도로 존재하였다. MPP5는 10㎍으로 처치된 동물에서 24시간, 25㎍으로 처치된 동물에서 8시간 및 그룹 5(25㎍, 정맥내)에서 48시간까지 검출할 수 있었다. 모든 동물에서, 3개의 복합(composite) 프로파일이 획득되었으며 추가 평가에 고려되었다.

복합 IV 프로파일의 경우 최종 단계(terminal phase)가 평가될 수 있는데, 상기 최종 단계의 반감기는 12.8시간으로 평가되었다. 나머지 프로파일의 경우, 최종 단계의 신뢰도를 평가할 수 없었다. 따라서, k로부터 나온 모든 파라미터(t1/2, AUC_0-inf 및 % 외삽)는 기록되지 않았다. IV 프로파일의 경우, AUC₀ _- _tlast 로부터 외삽된 AUC₀ _- _inf 의 비율은 6% 또는 그 미만이었는데, 이는 상기 프로파일이 실험 데이터로부터 특성규명이 잘 되었다는 것을 나타낸다.

전립선내로 투여 후, 관찰된 tmax는 모든 케이스에서 투여후 4시간에서 발생하였는데, peak levels of at 10와 25㎍에서의 최고치레벨은 각각 2.95와3.51ng/㎖이었다. 관찰된 AUC₀ _- _tlast 더 높은 투여량에서 감소하였다(48.5 대 22.4ng·h/㎖). 그러나, 상기 결과는 25㎍ IP에서 관찰된 보다 짧은 t_last(10㎍ IP에서 8시간 대 24시간)에 의해 편향되었다. IV 투여후 Cmax는 81.3ng/㎖의 수치를 갖는 시간 0시로 역외삽될 수 있었다. 관찰된 최고 수치(첫번째 샘플링 시간에서)는 74.3ng/㎖이었다. 전신 제거(CL) 및 분포 부피(Vz)은 각각 46.3 ㎖/h와 841㎖로 평가되었다.

전립선내 투여후, 투여량 표준화된 평균 최고 혈장 농도 및 파라미터(각각, C_max 및 AUC_0-tlast) 아래의 면적(area)을 이용하여 투여량 직선성(dose linearity)을 10 내지 25㎍ 투여 레벨에서 평가하였다. 투여량 표준화된 노출 파라미터는 10㎍으로부터 25㎍까지 감소되었다. 이것은 전립선으로부터 전신순환으로 MPP5의 제한적 흡수에 대한 지표가 될 수 있었다.

전립선내 투여후 중간 내지 고 투여량에서 관찰된 면적(AUC₀ _- _tlast)에 근거하여, 이러한 면적들을(투여량 레벨에 표준화시킴) 정맥내 투여후 획득된 투여량 표준화된 면적과 비교함으로써 생체이용율이 결정되었다. 평가된 생체이용율은 23.7%와 4.38%이었다.

10. 장기 중량

전립선내 주입

우연히 통계적 유의성을 얻은, 절대 및 상대 장기 중량에서의 변화(체중에 대한 장기 중량)가 모든 희생일의 전립선 및 2일째 희생일의 비장에서 두드러지게 나타났다. 전립선 중량은 대조군과 비교하여 2일째에 10㎍와 25㎍로 처치한 동물에서 26%에서 46%까지 더 높게 측정되었다. 전립선 중량은 15일째에 처치된 동물 중의 대조군과 비교하여 16% 내지 24% 더 적었으며 29일째에 >10 ㎍ 처치된 동물에서 19%에서 21%까지 더 적었다. 이러한 변화는 관찰된 현미경적 발견과 일치하였다. 비장 중량은 대조군과 비료하여 2일째에 25㎍로 처치된 동물에서 36% 더 적었다. 이것은 별로 중요치 않은 변화로 고려되었으며 15일까지 회복되었다.

정맥내 주입

2일째에, 25㎍ IV로 처치된 동물은 조직학적 상관관계 없이 대조군과 비교하여 간 및 비장 중량에서 대략 21% 더 높았으며, 15일까지 회복되었다.

11. 육안병리소견( Gross Pathology )

MTD 연구

전립선 주입 부위 변화가 모든 IP 투여량 레벨에서 획인되었다. 변화는 어두운 변색/부분, 반점형성, 및 확장/부종을 포함하였다. 1일째에 대체된 동물(번호 6001, 8001) 또는 IP 주입후 2일째에 사망한 것으로 확인된 동물(번호 8101)은 상기 기재한 바와 같은 전립선 주입 부위 변화들 중 일부를 지녔다. 특이적인 사망 원인은 확인되지 않았다. 꼬리 정맥내로 정맥내(IV) 주입은 그룹 8 및 9 동물 꼬리의 딱지와 관련이 있었다. 그 외 다른 변화는 우발적이거나, 절차와 관련이 있거나 죽음과 관련이 있지만 처치와 관련성이 없는 것으로 생각되었다.

주요 연구

전립선 주입 부위 변화는 모든 희생일에 확인되었다. 2일째 변화는 모든 투여량 레벨에서 어두운 변색/부분/병소, 유착, 및 확장/부종에 의해 특징지워졌다. 15일 및 29일째의 변화는 >10㎍으로 처치된 동물에서 도드라져 있고(raised), 단단(firm)하고/하거나 작은(small), 연하고(pale) 부분으로 설명되었다. 유착 및 연한 부분은 >10㎍ 처치한, 15일 및 29일째에 절명시킨 동물의 간 및 비장에서 빈번하게 나타났으며 전립선 주입 부위 변화에 별로 중요치 않은 변화일 것으로 생각되었다. 2일째에 죽은 것으로 발견된 동물 4005(25㎍, IP)은 상기 기재한 것과 같은 전립선 주입 부위 변화 중 일부를 지녔다. 특이적인 사망 원인은 확인되지 않았다.

꼬리 정맥내의 정맥내 주입은 모든 희생일의 딱지와 연관되어 있었다. 궤양은 꼬리 첨단의 손실과 함께 또는 손실없이 15일 및 29일째에 존재하였다. 간 확장은 2일째 희생 동물에서 두드러지게 나타났다.

그 외 다른 변화는 우발적이거나, 절차와 관련이 있거나 죽음과 관련이 있지만 처치와 관련성이 없는 것으로 생각되었다.

12. 조직검사

전립선내 주입

MPP5로 인한 현미경적 변화가 2, 15 및 29일째에 >2㎍ 처치된 동물의 전립선 주입 부위에서 관찰되었다. 극심도에 있어서 투여량-의존성 증가와 함께, 일반적으로, 극심한 급성 염증이 2일째의 모든 투여량에서 최소로 관찰되었다. 염증은 피브린, 혼재된 세포 침윤 및 선포 괴사(acinar necrosis)에 의해 특징지워졌다. 부종(Edema) 및 출혈(출혈)이 처치 및 대조 동물에서 관찰되었으며, 따라서 부분적으로 절차와 관련이 있는 것으로 생각되었다. 일반적으로, 극심도에 있어서 투여량-의존성 증가와 함께, 확인된 만성 염증 및/또는 섬유증이 15일 및 29일째에 모든 투여량에서 최소로 관찰되었다. 섬유증, 단핵구 침윤 및 선포 괴사가 상기 염증의 특성인 것으로 규명되었다. 이러한 변화는 동시발생적 선포 위축/팽창에 의해 빈번하게 수반되었다. 최소 섬유증 및 선포 위축/팽창은 29일째 대조군에서 드물게 관찰되었으며, 따라서 주로 처치와 관련이 있는 것으로 생각되었다. 급성 및 만성 변화가 또한 인접 전립선 엽에서 관찰되었는데, 일반적으로, 변화의 발생율 및 극심도는 더 낮다. 급성 염증, 부종 및 출혈은 2일째의 더 무거운 전립선 중량과 상관관계가 있었고 만성 염증, 섬유증 및 선포 위축/팽창은 15일 및 29일째의 더 가벼운 전립선과 상관관계가 있었고 일반적으로 현미경적 발견과 상관관계가 있었다. 이러한 변화는 선포 위축/팽창에서 MPP5의 자극 효과를 나타낸다.

그 외 다른 조직에서 수많은 현미경적 관찰이 인접 골반 장기 및 복강 도처의 확장에 의해서 또는 전신 역행적(reactive) 및/또는 퇴행적인 변화에 의한 전립선 주입 부위 염증에 별로 중요치 않은 것으로 생각되었다. 각각 캡슐모양 표면 또는 장막표면(serosal surfaces)의 출혈 및 섬유증을 수반하거나 수반하지 않는, 급성 및 만성 염증이 지방, 간, 대장 및 소장, 췌장, 비장, 위, 정낭, 부고환, 고환 및 방광에서 관찰되었다. 역행적 및/또한 퇴행적 변화는 다음을 포함하였다: 골수 골수성 과형성(hyperplasia); 비장에서의 증가된 골수외 조혈현상(extramedullar hematopoiesis); 림프절, 비장 및 흉선에서의 림프구 위축 및/또는 과형성; 간 단핵구 침습, 단일 세포 괴사 및 증가된 유사분열 특징, 및; 고환기능퇴화(동시발생적 부고환 퇴화(oligo)/무정자증을 수반함). 비장 림프구성 위축은 2일째에 25㎍로 처치한 수컷에서 두드러지게 나타난 적은 비장 중량에 대해 설명할 수 있었으며, 따라서 별로 중요치 않은 것으로 생각되었다.

2일째에 죽은 것으로 발견된 2마리 수컷(25 ㎍)의 경우, 특이적인 죽음의 원인이 확인되지 않았다. 그러나, 신장 인접한 전립선 염증의 극심함 및 동시발생적 전신 퇴행적 변화가 이러한 동물의 죽음에 기여했을 것으로 추정되었다.

그 외의 변화는 우발적이고, 지엽적이고, 고민되거나 래트의 연령 및 혈통에서 예상되었으나 처치와 직접적인 관련이 없었다.

정맥내 주입

MPP5에 기인한 현미경적 변화가 2일, 15일 및 29일째에 꼬리 정맥 주입 부위에서 관찰되었다. 2일째에 최소로 확인된 피부 및 피하조직의 급성 염증은, 대다수의 동물에서 표피 궤양 및 크러스터 형성을 수반하거나 수반하지 아니하면서, 섬유증(fibrin), 출혈, 괴사 및 혼재된 세포 침습에 의해 특징지워졌다. 동물 한마리는 인접 조직 및 국부적인 림프절로 퍼진 제한적(moderate) 괴사를 나타내었다.

15일 및 29일째에 변화 발생 및 극심도의 감소는 점진적인 회복을 시사하였다. 섬유증 및 단핵구 침습에 의해 특징지워지는 만성 염증이 표피 궤양 및 크러스터 형성 및 인접 뼈의 드문 괴사 및 염증을 수반하거나 수반하지 아니하면서 관찰되었다. 현미경적 발견은 일반적으로 육안으로 확인되는 변화와 상관관계가 있었다. 이러한 변화들은, 특히, 주입 부위의 혈관주위 조직 내에서의 MPP5의 자극 효과에 대해 제시한다.

그 외 조직에서의 변화의 낮은 발생은 2일째에 관찰된 주입 부위 염증성 변화에 부수적인 것으로 고려되었으며, 15일 및 29일째에 회복되었다. 이러한 변화는 다음을 포함하였다: 비장에서의 괴사 및 염증; 부고환, 정낭, 고환 및 간 내의 혈관주위 호중구, 단핵구성 또는 혼재된 세포 침습; 골수 골수성 과형성; 림프절 부종; 림프절, 비장 및 흉선에서 림프구 위축; 및 29일째에 관찰된 고환 위축. 2일째에 증가된 간 및 비장 중량은 현미경적으로 상관관계가 없었다.

5. 결론

결론적으로, 40㎍까지 투여 레벨로 1회 전립선내 주입 또는 50㎍까지 투여 레벨로 정맥내 주입에 의한 MPP5의 투여는 결과적으로 죽음에 대한 명확한 이유 없이 25㎍ 및 40㎍ IP 에서 죽음을 초래하였는데, 그러나, 시험 품목과 관련된 전립선 염증 및 신장에 인접하여 발생한 염증 및 동시발생적 전신 퇴화의 정도는 상기 죽음에 잠재적인 기여 인자인 것으로 생각되었다. 대부분의 가역적 변형이 임상 징후(>2 ㎍), 혈액검사 및 임상 생화학 파라미터(>10㎍)에서 관찰되었다. 병리학적 변형은 투여량과 관련된 방식으로 모든 투여량 레벨에서 지속되었으나, 정맥내로 처치된 동물에서 복귀(regression)의 증거를 제시하였다. 결론적으로, 최대무작용량(no-observable-effect-level, NOEL)은 전립선내 또는 정맥내 경로에서 측정되지 않았다.

참고문헌

Dunn, OJ. 1964, Multiple Comparisons using Rank Sums, Technometrics, 6, 241-256.

SAS Institute Inc., 1999. SAS/STAT^® User's Guide, Version 8, Cary, NC: SAS Institute Inc., 3884 pp.

실시예 7: 원숭이에서 MPP5 의 급성 독성

본 실시예는 PSA 절단 부위(MPP5)를 포함하는 히스티딘-표지된 MPP의 전립선내 투여가 결국 전립선에 대한 투여량-의존적 손상을 초래한다는 것을 보여주는 초기 연구 결과를 제시한다. 본 연구의 목적은 성적으로 성숙한 수컷 필리핀 원숭이(cynomolgus monkeys)를 대상으로 2주 이상의 기간 동안 MPP5의 1회 전립선내 주입함으로써 MPP5의 국소 잠재 독성을 평가하기 위한 것이었다.

실험 디자인 개관

일반적인 설명:

총 16마리의 수컷 필리핀 원숭이(마카카 파스시쿠라리스, Macaca fascicularis)를 하기 표 11에 기재된 바와 같은 처치 그룹으로 할당하였다. 동물들의 연령은 대략 3.6 내지 11.7년이었으며 체중이 대략 2.8 내지 7.9㎏이었다. 동물들을 중국, 베트남, 인도네시아 및 모리셔스에서 수입하였다.

군	수컷의 수	투여량 수준 (ug/전립선 g¹)	희생된 수 3일 15일
1	4	0(대조군)	2	2
2	4	1	2	2
3	4	5	2	2
4	4	25	2	2

¹전립선 중량은 이전에 확립된 전립선 중량과 체중 사이의 관계에 의거하여 평가될 것이다. 투여량의 절반은 전립선의 각 엽으로 주입될 것이다.

모든 동물들을 일반적인 마취하에서 항문주위 전립선내 주입을 통해 1회 투여하였다. 투여 첫날을 1일으로 지정하였다. 상기 동물들을 대상으로 임상 징후(1일 2회), 사료 섭취(1일 1회), 체중(1일, 3일, 8일, 및 15일), 심전도검사(예비분석 및 2일 및 14일), 및 눈 상태(예비분석 및 14일)에 있어서의 변화를 평가하였다. 임상 병리 지표(혈청화학검사[C-반응성 단백질 포함], 혈액학 및 응고)를 예비분석 및 3일 및 4일째에 측정하였다. 1회분 투여후 다양한 시점에서의 시험 품목 및 전립선 특이적 항원(PSA)에 대한 항체, 독성동태분석을 위하여 혈액을 수집하였다. 8마리의 동물을 표 11에 기재된 바와 같이 3일 및 15일에 안락사시켰다. 절명시에, 완전한 부검을 모든 동물에 대하여 실행하였고, 조직을 수집하고(선별된 전립선 주위 조직을 포함), 보존시키고, 가공처리하고 현미경적으로 분석하였다. 이 연구는 MPP5의 급성 국소 독성을 평가하였다.

시험 품목은 MPP5(제품 번호. PTIC-MF-PAL-DS-001)이었고 대조 품목은 PBS-EDTA이었다. 시험 품목의 표준 용액(활성 성분의 농도가 3.2mg/㎖임)을 제조 당일 투여 용액 제조 전에 적당한 0.22미크론 PVDF 필터를 통해 여과시켰다. 의도된 투여량을 획득할 목적으로 적절한 농도의 투여 용액을 생산하기 위하여 투여 당일에 대조군 운반물(vehicle)과 함께 여과된 표준 시험 품목 용액의 희석을 실행하였다.

동물을 USDA 동물 복지법(9 CFR, Parts 1, 2 및 3)에 명기된 바와 같이, 그리고 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 지침(ILAR publication, 1996, National Academy Press)에 기술된 대로 사육하였다.

동물들을 처음에 아래 표에 기재된 바와 같이 원숭이의 기원을 반영한 프로반티스(Provantis) 번호를 할당하였다. 프로반티스 번호 6001-6008로 할당된 동물들은 중국 기원의 원숭이였다. 프로반티스 번호 7001-7004로 할당된 동물들은 인도네시아 기원의 원숭이였다. 프로반티스 번호 8001-8003으로 할당된 동물들은 모리셔스(Mauritius) 기원의 원숭이였다. 프로반티스 번호 9001로 할당된 동물은 베트남 기원의 원숭이였다.

광범위한 동물 기원 및 체중 때문에, 동물들을 무작위적으로 하기 표에 따라 처치 그룹으로 할당하였다.

군	A 세트		B 세트
군	중국/베트남	인도네시아/모리셔스	중국/베트남	인도네시아/모리 셔스
1	1	1	1	1
2	1	1	1	1
3	1	1	1	1
4	1	1	1	1

시험 및 대조 품목 투여, 그룹 할당 및 투여 레벨:

군	수컷 수	투여량 수준 (ug/전립선 g¹)	투여량 체적 (uL/전립선 g²)	투여 용액 농도(ug/mL)
1	4	0 (대조군)	50	0
2	4	1	50	20
3	4	5	50	100
4	4	25	50	500

¹전립선 중량은 이전에 확립된 전립선 중량과 체중 사이의 관계에 의거하여 평가되었다.

²투여량의 절반이 전립선의 각 엽에(즉, 엽 당 대략 25 ㎕/g 전립선) 주입되었다.

다음과 같이 투여를 실시하였다. 주입 경로는 항문주위 전립선내 볼루스 주입이었으며 빈도는 1회였다. 케타민의 근육내 주입으로 원숭이들을 진정시켰으며 수술 절차가 진행되는 중간에 진정제 및/또는 마취제 투여를 위해 일시적 정맥내 카테터를 설치하였다. 작은 피부 절개를 항문 아래의 항문주위 지역내에 실행하였고 전립샘의 가시화 및 확인이 가능하도록 근육 및 피하조직을 무딘 절개(blunt dissection)하였다. 시험 및 대조 품목을 체중에 기준하여 전립샘에 투여하였다. 전립샘의 대략적인 중량을 동물의 체중, 및 체중과 전립샘 중량 사이의 이미 확립된 관계(전립선 중량(g) = 0.07294 + (-0.2309 x ㎏) + (0.06296 x ㎏²), 여기서 ㎏는 체중)에 근거하여 평가하였다. 시험 및 대조 품목을 대략 동일한 부피로 전립샘의 좌엽 및 우엽 각각에 투여하였다.

항문주위 경로를 선택하였는데, 이는 전립샘에 직접적으로 시험 품목을 투여하는 가장 정밀한 수단이기 때문이다. 시험 품목은 또한 사람의 전립선에 국소적으로 투여될 것이다.

우리 측면 관찰: 이러한 관찰은 1일 2회(오전 및 오후) 실행하였는데, 투여 개시일의 적어도 7일전에 시작하여 샘플 수집 마지막 날까지 지속하였다. 각각의 동물을 일반적인 모습 및 행동에서의 변화에 대해 관찰하였다.

정기적인 우리 측면 관찰의 일부로서, 사료 공급(food consumption)을 1일 1회하였으며, 투여 개시일의 적어도 7일전에 시작하여 샘플 수집 마지막 날까지 지속하였다(하기에 특별히 언급한 경우를 제외). 전일 급식으로부터 남아 있는 비스킷의 숫자를 관찰하였다. 연구 절차의 금식일 동안에 상기 과정의 예외가 있었다.

체중 측정을 다음 절차에 따라 최초 투여 전(-1일), 3일, 8일 및 15일에 실행하였다. 체중을 측정하기 전에 사료를 주지않았다.

다음의 리드(Leads)를 이용하여 심전도검사 결과를 기록하였는데, 예비분석, 2일 및 14일째의 측정결과를 기록하였다: I, II, III, aVR, aVL 및 aVF. 원숭이들은 일지적으로 원숭이 의자에서 우리 밖의 절차를 위해 일시적으로 구속되었으나, 진정시키지 않았다.

수의사에 의한 예비분석(1일로부터 3주 이내)을 실행하고 14일째에 안 검사를 실행하였다. 케타민과 함께 빛 진정하에서, 눈의 전방 및 후방을 시험하기 위해 직상검안경(direct ophthalmoscope)을 사용하였다. 산동용액(mydriatic solution)(일반적으로 1% 트로피카미드) 몇 방울을 각각의 눈에 한 방울씩 떨어뜨려 시험을 용이하게 하였다.

혈청화학검사, 혈액검사 및 응고 파라미터 평가를 위한 혈액 샘플을 일주전(-1 week) 및 3일(부검 전) 및 14일(안 검사 전)에 모든 동물로부터 수집하였다. 혈청화학검사를 위한 혈액 수집 진에 동물들을 8시간 이상 금식시켰다(적절한 정당사유 없이, 16시간 이상 금식시키지는 아니함).

우리 변기 수집으로 소변검사를 위한 소변을 수집하였으며, 예비분석을 위해, 투여 후 아침(2일째, 투여 후 대략 24시간) 및 각각의 부검시(3일 및 15일) 시스토센테시스(cystocentesis)에 의해 절명시킨 동물에서 수집하였다.

a) 혈청화학검사를 위한 수집 절차

수집방법: 정맥천자 - 임의의 가용 정맥, 바람직하게는 대퇴부의 정맥

혈청 화학 파라미터
나트륨	칼슘
칼륨	인
염소	요소질소(BUN)
이산화탄소	크레아틴
총 빌리루빈*	총 단백질
알카라인 포스파타제(ALP)	알부민
락테이트 디하이드로제나제(LDH)	글로불린
아스파르트산 아미노트랜스퍼라제(AST)	알부민/글로불린 비율
알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)	글루코즈
구아민-글루타밀트랜스퍼라제(GGT)	콜레스테롤
C-반응 단백질(CRP)	트리글리세라이드

* 전체 빌리루빈에서의 관심 시험 조항 관련 증가가 발생하는 경우, 직접 및 간접 빌리루빈 농도가 결정될 것이다.

b) 혈액학

임의의 이용가능한 정맥, 바람직하게는 대퇴부 정맥에서의 정맥천자에 의해 혈액 샘플을 수득하였다. 수득량은 1 ml였고, 사용된 항응고제는 EDTA였다.

분석된 파라미터:

혈액학 파라미터
적혈구 수	평균 혈구 내 헤모글로빈량(MCV)
백혈구 수*	평균 적혈구 용적(MCV)
헤모글로빈 농도	평균 혈구 내 헤모글로빈 농도(MCHC)
헤마토크릿	혈소판 수
망상적혈구 수	혈액 세포 형태**

* 적절한 경우 전체 백혈구 세포, 다중분절 중성구, 띠중성구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구, 및 기타 세포수를 포함함.

** 모든 동물로부터의 혈액 도말표본은 각각의 시점에서 시험될 것이다 (예비 연구를 포함함).

c) 응고 파라미터

임의의 정맥, 바람직하게는 대퇴부 정맥에서의 정맥천자에 의해 샘플을 수득하였다. 수득량은 1.8 ml였고, 항응고제는 구연산 나트륨이었다. 샘플을 혈장으로 처리하고, 다음과 같은 파라미터를 분석하였다: 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (APTT), 프로트롬빈 시간 (PT), 및 피브리노겐.

d) 요검사

카게판 (cagepan) 수득 방법 (예비연구 및 투여 약 24시간 후) 및 시스토센테시스 (cystocentesis)에 의해 샘플을 수득하고; 부검에서 수득하였다. 수득량은 5 mL까지 가능하였다. 샘플을 당 분야에 공지된 표준 방법에 따라 처리하였다.

하기 파라미터를 분석하였다:

요검사 파라미터
색/특징	케톤
pH	빌리루빈
특이적 인력	육안으로 보이지 않는 혈액
단백질	현미경학
글루코즈

F. 하기와 같이 분석을 수행함:

1. 독성약동학 샘플

임의의 가능한 정맥, 바람직하게는 대퇴부 정맥에서의 정맥천자에 의해 샘플을 수득하였다. 샘플을 투여전, 및 투여 1, 2, 4, 8, 24 및 48시간 후에 수득하였다. 수득량은 2 mL였고, 항응고제는 사용하지 않았다. 샘플을 혈청으로 처리하였다.

혈청을 대략 동일한 부피의 두개의 분취량으로 나누었다. 각각의 샘플을 동물수, 투여 그룹, 수득일, 날짜, 명목 수득 시간, 연구 번호 및 분취량 번호로 표지하였다. 샘플을 약 -70℃에서 보관하고, ELISA에 의해 MPP5 농도를 분석하였다.

2. 항체 샘플

모든 이용가능한 그룹/동물로부터의 샘플을 시험하였다. 투여전 및 14일째에 임의의 이용가능한 정맥, 바람직하게는 대퇴부 정맥에서의 정맥천자에 의해 샘플을 수득하였다. 수득량은 2 mL였다. 항응고제는 사용하지 않았다. 샘플을 혈청으로 처리하였다. 샘플을 -70℃에서 보관하였다.

전립선 특이적 항원 분석

모든 이용가능한 그룹/동물로부터의 샘플을 시험하였다. 투여전 및 2, 3 및 10일째에 임의의 이용가능한 정맥, 바람직하게는 대퇴부 정맥에서의 정맥천자에 의해 샘플을 수득하였다. 수득량은 2 mL였다. 항응고제는 사용하지 않았다. 샘플을 혈청으로 처리하고, 약 -70℃에서 보관하였다.

희생 처리 및 해부병리학

희생: 케타민 및 부타나시아^®-D 또는 동등물로 유도된 깊은 마취하에서 실혈로 동물을 희생시켰다. 희생 전날에 밤새 금식시켰다.

군	3일, B세트, 수컷의 수	15일, 세트A, 수컷의 수
1	2	2
2	2	2
3	2	2
4	2	2

최종 체중: 모든 계획되고 계획되지 않은 희생에 대한 부검에서 최종 체중을 수득하였다. 이러한 체중을 기관/신체 및 기관/뇌 중량비를 계산하기 위해 사용하였다.

전체 부검: 완전한 전체 부검을 연구 동안 사망하거나 희생 (계획되거나 계획되지 않은 희생 둘 모두)된 모든 동물에서 수행하였다. 부검은 하기 검사를 포함하였다: 사체 및 근골격계, 모든 외부면 및 구멍, 뇌의 두개강 및 바깥면, 기관 및 조직과 관련된 목, 기관 및 조직과 관련된 흉강, 복강 및 골반강.

소변 샘플: 부검에서 방광으로부터 소변 (최대 5 mL까지 이용가능함)을 수득하고, 본 프로토콜의 임상병리학 섹션에 기술된 바와 같이 분석하였다.

기관 중량: 다음의 기관 (존재시)을 고정전에 칭량하였다. 쌍을 이룬 기관은 큰 비정상이 존재하지 않는 경우 함께 칭량하였고, 이경우 이들은 별개로 칭량된다. 고정 후에 뇌하수체를 칭량하였다.

무게가 측정된 기관들
부신	뇌
부고환	심장
신장	간
폐	뇌하수체(고정 후)
전립선(정낭 없이)	비장
고환	흉선
부갑상선을 포함하는 갑상선

기관/체중 비 뿐만 아니라 기관/뇌 중량비를 계산 (부검 전에 수득된 최종 체중을 이용함)하였다.

조직 수거 및 보존: 하기 조직 및 기관 (또는 이의 일부)를 수득하고, 중성 완충된 10% 포르말린 (최적 고정을 위해 데이비슨(Davidson) 고정액에서 고정된 안구는 제외함)에 보존하였다.

수득된 조직들
심혈관rP	비뇨생식기
대동맥	신장
심장	방광
소화기	고환
침샘(하악)	부고환
혀	전립선
식도	전립선 주위 조직들
위	항문 괄약근
소장	전립선 인접 방광
십이지장	전립선의 요도
공장	정낭
회장	수뇨관
대장	수정관
맹장	내분비계
결장	부신
직장	뇌하수체
췌장	갑상선/부갑상선a
간	피부/근골격계
담낭	피부
호흡기	골격(대퇴부 머리)
기관	골격(7번째 늑골)
폐	골격근(요근 및 횡격막)
림프구양/조혈	신경/특수감각계
골수(흉골)	시신경을 지닌 안구
흉선	죄골 신경
비장	뇌
림프절	척수(흉부)
서혜부	기타
장간막	동물수 문신
	큰 병변

^a 통상적인 조직 절제로부터 부갑상선이 존재하지 않는 것은 다시 절제할 필요는 없다.

조직병리학: 부검된 모든 동물에 대해, 상기 표에 기술된 조직 (문신 제외)를 파라핀에 엠베딩시키고, 절단하고, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색시키고, ACVP에 의해 공인된 수의병리학자가 검사하였다.

통계 분석

그룹 평균 및 표준 편차값을 체중, 임상병리 파라미터 (비수치 데이터를 제외함), 및 기관 중량 데이터를 포함하는 시에라(Sierra)에서 수득된 모든 수치 데이터에 대해 계산하였다.

추가 통계 분석을 SAS^®시스템, 버전 8.1으로 수행하였다. 유의한 그룹간 차이를 분산분석 (ANOVA) 후, 다중비교 시험을 이용하여 평가하였다. 지표 ANOVA의 이용을 허용하는 가정이 데이터의 정규성에 대해 샤피로-윌케스 (Shapiro-Wilkes) 시험 및 등분산성에 대해 레벤 (Levene) 시험을 이용하여 검증될 것이고, 상기 가정을 각하하기 위해 상기 시험중 어느 시험에 대해 p ≤ 0.001 수준의 유의성이 요구된다. 둘 모두의 가정이 적합한 경우, 단일-인자 ANOVA가 p ≤ 0.05 수준의 유의성을 이용하여, 상기 인자에 따라 동물을 그룹화하는데 적용될 것이다. 지표 ANOVA가 p ≤ 0.05에서 유의한 경우, 던넷 (Dunnett) 시험이 0.05 수준의 유의성에서 대조군과 각각의 시험 항목 처리된 그룹 사이의 통계적으로 유의한 차이를 확인하기 위해 사용될 것이다. 상기 파라미터 가정중 어느 것도 만족스럽지 않은 경우, 크루스칼-월리스 (Kruskal-Wallis) 비-파라미터 ANOVA 절차가 그룹간 차이를 평가하기 위해 사용될 것이다 (p ≤ 0.05). 상기 ANOVA가 유의한 경우, 다시 p ≤ 0.05의 유의 수준을 이용하여 던 (Dunn) 다중비교 시험이 적용될 것이다.

예비 결과

전립선: 모든 처리된 동물은 이들의 전립선에 병변을 지녔다 (도 32 C-H 및 33 C-H 참조). 그룹 1 (대조군) 동물은 주사에 대한 반응, 및 치유와 일치하는, 3일째에 최소 염증, 출혈 및 섬유증, 15일째에 섬유증을 지녔다. 그룹 3 및 4에서 유의한 중증 병변이 존재하였다 (도 32E-32H, 도 33 E-H) 및 33F). 그룹 3 (5 μg/g 전립선)과 4 (25 μg/g 전립선) 사이에 병변의 크기 또는 중증도의 차이가 없었다. 그룹 2 (1 μg/g 전립선)에서 현저하게 덜 중증인 병변이 존재하였다 (도 32C, 32D, 33C, 33D).

3일째에, 시험 항목에 대한 일차 반응은 광범위한 출혈, 및 혼합 세포 염증을 지닌 전립선의 광범위한 부분의 응고성 괴사였다. 염증은 주로 호중성이었고, 호산구, 림프구 및 대식구의 수는 적었다. 몇몇 영역에 액화 괴사가 존재하였다. 응고성 괴사는 그룹 2에서 경증이었고, 그룹 3 및 4에서 명백하게 중등증이었다.

그룹 2에서 3일째에, 응고성 괴사 영역의 주변에서 편평상피화생으로 진행되고, 간질세포의 현저한 활성화 및 증식에 대해 경증인, 선 내피세포의 명백한 재생성 이상증식으로 광범위한 회복이 진행중이었다. 그룹 3 및 4에서 3일째에, 간질 세포의 경증 활성화 및 증식에 의해 회복이 명시되기 시작했다.

그룹 2에서 15일째에, 괴사 및 출혈이 해소되었다. 전립선의 공동형성이 인지되지 않았다. 병변은 최소 내지 약간의 선의 진행성 재생 증식 및 편평상피화생으로 섬유를 형성하였다. 염증은 주로 대식구 및 림프구였고, 다형핵 백혈구의 수는 적었다. 한 동물에서, 이들은 주로 호산구였다.

그룹 3 및 4에서 15일째에, 전립선의 보다 중증의 액화 괴사 및 공동형성을 지니는 진행성 응고성 괴사 및 출혈, 및 진행성 혼합 세포 염증이 존재하였다. 이들 그룹에서의 회복은 선의 편평상피회생으로 진행하는 재생 증식과 함께, 괴사성 병변의 가장자리에서 중등증 내지 명백한 간질의 섬유화 및 섬유증식으로 구성된다. 염증은 주로 진행성 괴사를 지닌 영역에서 호중성이었으나, 섬유화의 영역 내의 병변의 가장자리에서는 비교적 높은 백분율의 림프구 및 대식구를 지녔다.

전립선주변 조직:

3일 째에 처리된 동물의 정낭의 5/6이 최소 내지 중등증의 선강 내에서의 분비물의 무기질침착을 지녔다. 이는 종종 배경 연구결과에서 관찰되나, 본원에서와 같은 범위 또는 빈도로 관찰되지 않는다. 따라서, 이는 전립선에서의 변화에서 부차적인 듯하다. 15일째에, 감염된 동물은 대조군뿐이었다.

전립선 요도는 약간의 염증성 세포 침윤물을 지녔으나, 이는 전립선에서의 변화에 부차적인 듯하다.

실시예 8 : 전립선 조직에 의한 MPP5 의 활성화

본 발명에 따른 MPP를 활성화시키기는 다양한 동물로부터의 전립선 추출물의 능력을 검사하였다. MPP의 활성화 백분율을 결정하기 위해 고양이, 개, 원숭이 및 인간 전립선 조직의 추출물을 MPP5와 함께 인큐베이션키는 시험관내 연구를 수행하였다.

실험 프로토콜은 다음과 같다. 스프라그 돌리 (Sprague Dawley) 래트 및 한 마리의 비글견으로부터 신선한 전립선 조직을 수득하였다. 한 마리의 시노몰구스 (Cynomolgus) 원숭이 및 한명의 인간으로부터 동결된 전립선 조직을 수득하였다. 존스 홉킨스대 IRB 승인 임상 연구로부터의 수집 연구 물질로서 인간 전립선 조직을 수득하였다. 이러한 분석에서, 전립선을 절단 (~ 100-500 mg 단편)하고, 조직 부피당 동등한 부피의 배지의 농도로 혈청을 포함하지 않는 RPMI 1640 세포 배지에 현탁시켰다. 조직 샘플을 2시간 동안 37℃에서 상기 배지에서 인큐베이션시켰다. 원심분리후, 상층액을 -80℃에서 동결시켰다.

용혈 분석: 샘플을 37℃에서 해동시키고, 원심분리시키고, 상층액을 수득하였다. 각각의 상층액의 단백질 농도를 브래드포드 검정을 이용하여 결정하였다. 샘플을 동일한 시작 단백질 농도로 희석시켰다. 원숭이 및 인간 샘플로부터의 상층액의 분취량을 표준 ELISA^®(Hybritech^® Beckman Coulter) 방법을 이용하는 PSA 결정을 위해 수득하였다. 페놀레드를 포함하지 않는 행크스완충염용액 (HBSS)에 현탁된 2%의 신선한 인간 적혈구 세포 (RBC) 용액을 매일 제조하였다. 적혈구 세포를 펠렛화시키고, 3배의 HBSS에 재현탁시켜, 과량의 혈청을 제거하고, 재현탁시켜, 페놀레드를 함유하는 않는 HBSS 중의 50% 용액을 생성시켰다. 시험 샘플을 제조하기 위해, 50%의 RBC 샘플을 약하게 볼텍스시켜 RBC를 현탁시켰다. RBC의 분취량을 230 μL의 페놀레드를 포함하지 않는 HBSS에 첨가하여 4% (v/v) 용액을 생성시켰다. 이러한 현탁액에 240 μL의 전립선 절단물을 지닌 RPMI 배지의 분취량을 첨가한후, 100 μg/mL의 스톡으로부터의 MPP5의 10 μL 분취량을 첨가하여, 분석당 첨가된 전체 MPP5는 1 μg이었고, 분석 최종 부피는 500 μL였다. 이러한 RBC/MPP5/조직 용액을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이후, 샘플을 원심분리시켜 비용해 RBC를 펠렛화시키고, 각각의 샘플로부터의 상층액의 100 μL의 분취량을 수득하고, 즉시 RBC 용해에 기인된 헤모글로빈 방출에 대해 540 nm에서 분광광도분석으로 측정하였다. 대조군은 섐(sham) 처리된 RBF (음성 대조군) 및 1% 트리톤-xlOO으로 용해된 RBC (양성 대조군)을 포함하였다. 가수분해 범위를 비교하기 위해, 전립선 조직을 지니는 배지의 각각의 샘플의 연속 희석물을 분석하였다. 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 및 1:32의 추출물의 희석을 본 연구에 이용하였다. 모든 샘플을 삼중으로 용혈에 대해 분석하였다.

결과는 인간 전립선 조직이 MPP5 분해에서 가장 활성인 반면, 래트 및 원숭이 전립선 조직은 보다 낮은 반응을 생성시켰고, 개 전립선 조직은 MPP5에 대한 임의의 활성을 나타내지 않았음을 나타낸다 (도 36). 래트는 PSA 유전자가 결핍되어 있지만, 인간 PSA에 대한 S3 칼리크레인 동족체를 지니는 것으로 밝혀졌다 (Onozawa et al, 2001). 래트 복부 전립선에서 확인된 이러한 PSA 유사 단백질은 인간 PSA와 각각 64% 및 49%의 누클레오티드 및 아미노산 서열 상동성을 나타낸다. 더욱이, 래트 S3 칼리크레인 및 인간 PSA는 유사한 등전점 및 분자량을 지닌다. 따라서, MPP5는 이러한 PSA-유사 S3 칼리크레인에 의해 래트 전립선 조직에서 활성화되는 듯하다.

개 전립선에 의한 활성화 결핍은 개가 PSA 유전자를 지니지 않는다는 관찰과 일치한다.

실시예 9: 혈장/혈청에 의한 MPP5 의 활성화

MPP5를 분해시키는 인간, 원숭이, 개, 래트 또는 마우스의 능력을 다음과 같이 결정하였다.

MPP5 (1.073 mg/mL)를 얼음상에서 4℃에서 해동시키고, 분취시키고, -80℃에서 재동결시켰다. 각각의 조건에 대해 2회의 분석을 수행하였다. 5 μg MPP5를 150 mM NaCl 및 25 μL의 인간, 원숭이, 개, 래트 또는 마우스 혈청을 함유하는 20 mM HEPES 완충용액 (pH 7.4) 중에서 25OuL의 전체 부피로 10분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 대조군 실험에서, 25 μg의 키모트립신을 반응 혼합물에 첨가한 후, 혈청을 첨가하였다 (양성 대조군). 기타 대조군 실험에서, 혈청을 동등한 부피의 완충용액으로 대체하였다 (음성 대조군). 5uL의 이소프로필 알코올중 10OmM PMSF를 첨가하여 반응을 중지시킨후, 얼음 상에서 냉각시켰다. 중지된 반응 혼합물의 15 μL 분취량을 0.5% β-머캅토에탄올을 함유하는 동등한 부피의 2x 바이오래드 샘플 로딩 완충용액에 첨가하고, 5분 동안 95℃에서 가열하여 모든 단백질을 변성시켜 단백질-단백질 상호작용을 차단시켰다. 5 μL의 샘플을 XT MOPS 런닝 완충용액 (BioRad Laboratories)을 이용하여 미리 형성된 4-12% Bis-Tris 겔 (Invitrogen) 상에서 60분 동안 100V로 전기영동시켰다. 겔 속의 단백질을 니트로셀룰로오스 (BioRad Laboratories)로 트랜스블로팅 (transblotting)시키고, 상기 막을 비지방 밀크 (0.1% Tween 20 (TBST)를 지니는 트리스 완충된 염수중 5%)로 실온에서 1시간 동안 블로킹시켰다. 상기 막을 실온에서 1시간 동안 TBST중에 1:250,000으로 희석된 정제된 폴리클로날 래트 한-MPP5에서 인큐베이팅시킴으로써 MPP5를 검출하였다. TBST로 3회 세척후, 블롯을 TBST중에 1:20,000으로 희석된 HRP-결합된 염소 항-래트 항체 (Jackson ImmunoResearch)에서 인큐베이션시켰다. 상기 막에 대한 항체 결합을 키트 제조업체 (Cell Signaling)에 따른 화학발광을 이용하여 검출하고, 4 메가픽셀 CCD 카메라를 이용하는 포화를 피하기 위해 화학발광 자동노출 세팅을 지닌 알파 이노텍 플루오르켐 SP (Alpha Innotech FluorChem SP)를 이용하여 실시간으로 기록하였다. 복셀 (voxel) 기재 프로그램 (ImageQuant software; Alpha Innotech, San Leandro, CA)을 이용하여 블롯을 농도계측적으로 정량하였다. 백그라운드 교정후 분해된 밴드의 밀도를 본래의 완전한 밴드 및 분해된 밴드의 합으로 나눔으로써 각각에 레인에 대해 잔류하는 분해된 단백질의 백분율을 결정하였다. 이후, 분해 백분율을 비혈청 및 혈청이 첨가된 키모트립신 대조군과 비교하였다.

MPP5의 분해 백분율 측정을 전기영동 및 웨스턴 블롯의 농도계측 정량으로 수행하였다. 이후, MPP5가 혈청 효소에 의해 분해되었는지의 여부를 결정하기 위해 분해된 백분율을 MPP5 단독 (음성) 및 MPP5 + 키모트립신 (양성) 대조군과 비교하였다. 이러한 실험 조건하에서, 인간, 원숭이, 개, 고양이 또는 마우스 혈청에 의한 MPP5의 분해는 검출되지 않았다. 표 14는 다양한 혈청을 이용한 인큐베이션 후에 분해된 MPP5의 백분율을 나타낸다. 도 37은 다양한 혈청의 부재 또는 존재하에서 10분 동안 인큐베이션 후의 MPP5의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 패널 A는 250 μL 분석 부피 중의 인간 남성 (H) (레인 2-5) 또는 시노몰구스 원숭이 (Mk) (레인 6-7)로부터의 25 μL의 혈청과 함께 인큐베이션된 MPP5를 나타낸다. 레인 3은 MPP5, 인간 혈청 및 키모트립신을 함유하나, 인큐베이션시키지 않았다. 레인 8은 분자량 마커이다. (B) 250 μL 분석 부피 중의 마우스 (Mu) (레인 2-5), 개 (D) (레인 6-7) 또는 래트 (R) (레인 8-9)로부터의 25 μL의 혈청과 함께 인큐베이션된 MPP5. 레인 3은 MPP5, 인간 혈청 및 키모트립신을 함유하나, 인큐베이션시키지 않았다. 레인 10은 분자량 마커이다.

혈청 내 MMP5의 분열 퍼센트의 종 비교

	완충액	인간	원숭이	개	랫트	마우스
분해 백분율	1.45+1.08	0.90+0.31	1.78+1.51	1.20+1.0	1.87+0.32	1.33+0.10

이러한 결과는 MPP5가 정상적인 인간 혈청에서는 활성화되지 않는다는 것을 암시하고, 또한 MPP5가 특별히 높은 수준의 혈청 PSA를 지니는 남성에서 전립선내 주사 후에 혈액으로의 누출의 경우에서도 활성화되지 않는다는 것을 암시한다. 이러한 결과는 PSA가 혈청 프로테아제 억제제, 주로 α1-항키모트립신 및 α2-마크로글로불린에 의해 혈액 내에서 효소적으로 불활성화되는 것을 입증하는 공개된 데이터 (Lilja et al ., 1991; Otto et al, 1998)와 일치한다.

실시예 10: 비- PSA 프로테아제에 의한 MPP5 의 활성화

전립선 외부의 조직에 우연적으로 노출되는 경우 프로드러그가 잠재적으로 조우할 수 있는 비-PSA 프로테아제에 대한 MPP5의 민감성을 결정하기 위해 시험관내 연구를 수행하였다. 특히, PSA, 퓨린, 트립신, 키모트립신, 트롬빈, MMP-7, 시스테인 프로테아제 카텝신 B, 및 세린 프로테아제 hK1, hK2, 및 uPA를 포함하는 여러 통상적인 프로테아제를 MPP5를 분해시키는 이들의 잠재성에 대해 평가하였다.

분석을 하기와 같이 수행하였다. 1 mg/ml의 Lot # N-PTIC-MF-PAL-BX의 MPP5가 사용된 퓨린을 이용하는 분석 #2를 제외하고는 모든 프로테아제를 시험하는 분석에 대해 1.073 mg/mL의 천연 프로에어로라이신 (wt PA; 0.84 mg/mL) 및 MPP5를 사용하였다.

PSA 분해에 의한 활성화를 측정하기 위해, 5 μg의 천연 프로에어로라이신 또는 MPP5를 150 mM NaCl을 함유하는 20 mM HEPES 완충용액 (pH 7.4)에서 인큐베이션시켰다. 다양한 양의 PSA (대수 규모에 따라 0-10 μg PSA)를 첨가하고, 전체 250 μL의 부피로 60분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 5 μL의 이소프로필 알코올 중의 100 mM PMSF를 첨가하여 반응을 중지시킨 후, 얼음 상에서 냉각시켰다.

중지된 반응 혼합물의 15 μL 분취량을 0.5% β-머캅토에탄올을 함유하는 동등한 양의 2x 바이오래드 샘플 로딩 완충용액에 첨가하고, 5분 동안 95℃에서 가열하였다. 샘플을 XT MOPS 런닝 완충용액 (BioRad Laboratories)을 이용하여 미리 형성된 10% 트리스-HCl 겔 상에서 30분 동안 200V로 전기영동시켰다. 은 염색법으로 단백질을 검출하였다.

연구 #1에서 퓨린 절단에 의한 활성화를 측정하기 위해, 5μg의 천연 PA 또는 MPP5를 150 mM NaCl 및 다양한 양의 퓨린 (대수 규모에 따라 0-3.2 ng의 퓨린)을 함유하는 20 mM HEPES 완충용액 (pH 7.4)에서 전체 250 μL의 부피로 10분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 5 μL의 이소프로필 알코올 중의 100 mM PMSF를 첨가하여 반응을 중지시킨 후, 얼음 상에서 냉각시켰다. 중지된 반응 혼합물의 15 μL 분취량을 0.5% β-머캅토에탄올을 함유하는 동등한 양의 2x 바이오래드 샘플 로딩 완충용액에 첨가하고, 5분 동안 95℃에서 가열하였다. XT MOPS 런닝 완충용액 (BioRad Laboratories)를 이용하여 미리 형성된 10% 트리스-HCl 겔 상에서 30분 동안 200V로 샘플을 전기영동시켰다. 은 염색으로 단백질을 검출하였다.

연구 #2에서 퓨린 절단에 의한 활성화를 측정하기 위해, 5μg의 천연 PA 또는 MPP5를 150 mM NaCl, 1 mM CaCl₂ 및 0 내지 3 유닛의 퓨린을 함유하는 20 mM HEPES 완충용액 (pH 7.4)에서 전체 250 μL의 부피로 60분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 이전의 실험 (퓨린, 연구 # 1)에서, 인큐베이션 시간은 동일한 효소 농도에서 10분이었음을 주의하라. 2.5 μL의 에탄올 중의 100 mM PMSF를 첨가하여 반응을 중지시킨 후, 얼음 상에서 냉각시켰다. 중지된 반응 혼합물의 15 μL 분취량을 0.5% β-머캅토에탄올을 함유하는 동등한 양의 2x 바이오래드 샘플 로딩 완충용액에 첨가하고, 5분 동안 95℃에서 가열하였다. 1 x MOPS-SDS 런닝 완충용액을 이용하여 미리 형성된 10% 노벡스 (Novex) 비스-트리스 뉴파지 (Nupage) 겔 (Invitrogen) 상에서 50분 동안 200V로 샘플을 전기영동시켰다. 은 염색으로 단백질을 검출하였다.

키모트립신에 의한 활성화를 측정하기 위해, 5μg의 천연 PA 또는 MPP5를 150 mM NaCl 및 다양한 양의 키모트립신 (대수 규모에 따라 0-500 ng 키모트립신)을 함유하는 20 mM HEPES 완충용액 (pH 7.4)에서 전체 250 μL의 부피로 10분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 5 μL의 이소프로필 알코올 중의 100 mM PMSF를 첨가하여 반응을 중지시킨 후, 얼음 상에서 냉각시켰다. 중지된 반응 혼합물의 15 μL 분취량을 0.5% β-머캅토에탄올을 함유하는 동등한 양의 2x 바이오래드 샘플 로딩 완충용액에 첨가하고, 5분 동안 95℃에서 가열하였다. XT MOPS 런닝 완충용액 (BioRad Laboratories)를 이용하여 미리 형성된 10% 트리스-HCl 겔 상에서 30분 동안 200V로 샘플을 전기영동시켰다. 은 염색으로 단백질을 검출하였다.

연구 #1에서 트롬빈에 의한 MPP5의 활성화를 측정하기 위해, 5μg의 에어로라이신 관련 단백질 (천연 PA 또는 MPP5)을 150 mM NaCl 및 다양한 양의 트롬빈 (대수 규모에 따라 0-12 μg의 0.23 유닛/μg의 트롬빈)을 함유하는 20 mM HEPES 완충용액 (pH 7.4)에서 전체 250 μL의 부피로 10분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 5 μL의 이소프로필 알코올 중의 100 mM PMSF를 첨가하여 반응을 중지시킨 후, 얼음 상에서 냉각시켰다. 중지된 반응 혼합물의 15 μL 분취량을 0.5% β-머캅토에탄올을 함유하는 동등한 양의 2x 바이오래드 샘플 로딩 완충용액에 첨가하고, 5분 동안 95℃에서 가열하였다. XT MOPS 런닝 완충용액 (BioRad Laboratories)를 이용하여 미리 형성된 10% 트리스-HCl 겔 상에서 30분 동안 200V로 샘플을 전기영동시켰다. 은 염색으로 단백질을 검출하였다.

연구 #2에서 트롬빈에 의한 MPP5의 활성화를 측정하기 위해, 본 실험에서 사용된 트롬빈 키트 (Novagen)에 제공된 트롬빈 희석 완충용액 중에서 두개의 트롬빈 희석액 1/66 및 1/25를 제조하였다. 트롬빈 키트에 제공된 1x 분해 완충용액 중의 10 μg의 MPP5 (N-PTIC-MF-PAL-BX)를 함유하는 두개의 반응 혼합물을 제조하였다. His 태그와 함께 천연 프로에어로라이신을 함유하는 두개의 반응 혼합물을 동일한 방식으로 제조하였다. 트롬빈을 0.15 유닛의 PA-EndHis 혼합물중 하나 및 0.4 유닛의 MPP5 혼합물중 하나에 첨가하였다. 전체 인큐베이션 부피는 각각의 경우에서 50 μl였다. 반응 혼합물을 6.5시간 동안 실온에서 인큐베이션시키고, 페닐메틸 설포닐 플루오라이드 (Sigma)를 1 mM의 최종 농도로 첨가하여 단백질 분해를 억제시켰다. 샘플을 얼음 상에서 4℃로 밤새 보관하였다. 이후, 이들을 1x LDS 샘플 완충용액 (Invitrogen)에서 제조하고, 10분 동안 70℃에서 가열하고, 로딩시키고, 1x MOPS-SDS 런닝 완충용액 중에서 50분 동안 200V의 정전압에서 비환원 조건하에서 10% 비스-트리스 NuPAGE 겔 (Invitrogen) 상에서 영동시켰다. 은 염색으로 단백질을 검출하였다.

트립신에 의한 활성화를 측정하기 위해, 5μg의 에어로라이신 관련 단백질 (야생형 PA 또는 MPP5)을 150 mM NaCl 및 다양한 양의 타입 Ⅰ 트립신 (대수 규모에 따라 0-500 ng의 트립신)을 함유하는 20 mM HEPES 완충용액 (pH 7.4)에서 전체 250 μL의 부피로 10분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 5 μL의 이소프로필 알코올 중의 100 mM PMSF를 첨가하여 반응을 중지시킨 후, 얼음 상에서 냉각시켰다. 중지된 반응 혼합물의 15 μL 분취량을 0.5% β-머캅토에탄올을 함유하는 동등한 양의 2x 바이오래드 샘플 로딩 완충용액에 첨가하고, 5분 동안 95℃에서 가열하였다. XT MOPS 런닝 완충용액 (BioRad Laboratories)를 이용하여 미리 형성된 10% 트리스-HCl 겔 상에서 30분 동안 200V로 샘플을 전기영동시켰다. 은 염색으로 단백질을 검출하였다.

uPA에 의한 활성화를 측정하기 위해, 5μg의 PA 또는 MPP5를 150 mM NaCl 및 10-0.16 μg의 uPA를 함유하는 20 mM HEPES 완충용액 (pH 7.4)에서 전체 250 μL의 부피로 4시간 동안 37℃에서 별개로 인큐베이션시켰다. 5 μL의 이소프로필 알코올 중의 100 mM PMSF를 첨가하여 반응을 중지시킨 후, 얼음 상에서 냉각시켰다. 중지된 반응 혼합물의 15 μL 분취량을 0.5% 2-머캅토에탄올을 함유하는 1x 샘플 완충용액 (Invitrogen) 중에서 제조하고, 5분 동안 95℃에서 가열하였다. 환원 조건하에서 1 x MOPS-SDS 런닝 완충용액을 이용하여 미리 형성된 10% 노벡스 비스-트리스 NuPAGE 겔 (Invitrogen) 상에서 50분 동안 200V로 샘플을 전기영동시켰다. 은 염색으로 단백질을 검출하였다.

카텝신 B에 의한 활성화를 측정하기 위해, 5μg의 PA 또는 MPP5를 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM L-시스테인 및 24-0.375 유닛의 카텝신 B를 함유하는 20 mM HEPES 완충용액 (pH 7.4)에서 전체 250 μL의 부피로 4시간 동안 37℃에서 별개로 인큐베이션시켰다. 류펩틴 (leupeptin)을 2 μM의 최종 농도로 첨가하여 반응을 중지(Sigma 방법)시킨 후, 얼음 상에서 냉각시켰다. 중지된 반응 혼합물의 15 μL 분취량을 0.5% 2-머캅토에탄올을 함유하는 1x 샘플 완충용액 (Invitrogen) 중에서 제조하고, 5분 동안 95℃에서 가열하였다. 환원 조건하에서 1 x MOPS-SDS 런닝 완충용액을 이용하여 미리 형성된 10% 노벡스 비스-트리스 NuPAGE 겔 (Invitrogen) 상에서 50분 동안 200V로 샘플을 전기영동시켰다. 은 염색으로 단백질을 검출하였다.

MMP-7에 의한 활성화를 측정하기 위해, 5μg의 PA 또는 MPP5를 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂ 및 1.5-0.0234 μg의 MMP-7을 함유하는 20 mM HEPES 완충용액 (pH 7.4)에서 전체 250 μL의 부피로 3시간 동안 37℃에서 별개로 인큐베이션시켰다. 8.4 μL의 에탄올 중의 31 mM 1,10-페난트롤린 모노히드레이트 (최종 1 μM)를 첨가하여 반응을 중지시킨 후, 얼음 상에서 냉각시켰다. 중지된 반응 혼합물의 15 μL 분취량을 0.5% 2-머캅토에탄올을 함유하는 1x 샘플 완충용액 (Invitrogen) 중에서 제조하고, 5분 동안 95℃에서 가열하였다. 환원 조건하에서 1 x MOPS-SDS 런닝 완충용액을 이용하여 미리 형성된 10% 노벡스 비스-트리스 NuPAGE 겔 (Invitrogen) 상에서 50분 동안 200V로 샘플을 전기영동시켰다. 은 염색으로 단백질을 검출하였다.

hK1에 의한 활성화를 측정하기 위해, 50 μl의 TCN 완충용액 (50 mM 트리스, 10 mM CaCl₂, 0.15 M NaCl, pH 7.5)의 최종 부피 중의 0.05 μg 써몰리신에 의해 5 μg의 hKl을 활성화시키고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션시키고, 2.5 μl의 95% 에탄올 중의 200 mM 1,10-메난트롤린 모노히드레이트로 억제시켰다 (R & D Systems 방법). 1 μg의 PA 및 PSA-PAH1을 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 및 1-0.015625 μg의 활성화된 hK1을 함유하는 20 mM HEPES 완충용액 (pH 7.4) 중에서 50 μL의 전체 부피로 4시간 동안 37℃에서 별개로 인큐베이션시켰다. 이소프로필 알코올 중의 PMSF를 2 mM의 최종 농도로 첨가하여 반응을 중지시킨 후, 얼음 상에서 냉각시켰다. 중지된 반응 혼합물의 5 μL 분취량을 0.5% 2-머캅토에탄올을 함유하는 1x 샘플 완충용액 (Invitrogen) 중에서 제조하고, 5분 동안 95℃에서 가열하였다. 환원 조건하에서 1 x MOPS-SDS 런닝 완충용액을 이용하여 미리 형성된 10% 노벡스 비스-트리스 NuPAGE 겔 (Invitrogen) 상에서 50분 동안 200V로 샘플을 전기영동시켰다. 은 염색으로 단백질을 검출하였다.

hK2에 의한 활성화를 측정하기 위해, 1μg의 PA 또는 MPP5를 150 mM NaCl 및 0.25-0.0039 μg의 hK2를 함유하는 20 mM HEPES 완충용액 (pH 7.4)에서 전체 50 μL의 부피로 1시간 동안 37℃에서 별개로 인큐베이션시켰다. 이소프로필 알코올 중의 PMSF를 2 mM의 최종 농도로 첨가하여 반응을 중지시킨 후, 얼음 상에서 냉각시켰다. 중지된 반응 혼합물의 10 μL 분취량을 0.5% 2-머캅토에탄올을 함유하는 1x 샘플 완충용액 (Invitrogen) 중에서 제조하고, 5분 동안 95℃에서 가열하였다. 환원 조건하에서 1 x MOPS-SDS 런닝 완충용액을 이용하여 미리 형성된 10% 노벡스 비스-트리스 NuPAGE 겔 (Invitrogen) 상에서 50분 동안 200V로 샘플을 전기영동시켰다. 은 염색으로 단백질을 검출하였다.

본 연구의 결과는 MPP5와 프로에어로라이신 (PA) 사이의 민감성 프로파일이, MPP5보다 프로테아제 (PSA 제외)의 범위에 대해 더욱 민감한 천연 프로에어로라이신 (PA)과 매우 상이함을 나타내었다 (표 15).

시험관 내 프로테아제 민감성 연구 결과

프로테아제 이름	MMP5의 50% 분열을 위해 요구되는 양	기존 프로아에로라이신의 50% 분열을 위해 요구되는 양	MPP5에 대한 특이적 활성	프로아에로라이신에 대한 특이적 활성
퓨린	> 3.2 ng	1.2 ng	0.24 nM/㎍/min	9.69 nM/㎍/min
트립신	813 ng	9.5 ng	5,700 nM/㎍/min	489,000 nM/㎍/min
키모트립신	31 ㎍	3.0 ㎍	150 nM/㎍/min	1550 nM/㎍/min
트롬빈	> 12 ㎍	> 12 ㎍	<0.00000078 nM/㎍/min	< 0.00000078 nM/㎍/min
MMP-7	비활성	비활성	0	0
카텝신 B	170 유닛	51.6 유닛	1.2 fmol/㎍/min	3.9 fmol/㎍/min
hK1	비활성	2.63 ㎍	0	15.3 fmol/㎍/min
hK2	비활성	0.1 ㎍	0	1.61 pmol/㎍/min
전립선 특이적 항원(PSA)인 hK3	12.2 ㎍	49.7 ㎍	0.0635 nM/㎍/min	0.0156 nM/㎍/min
uPA	173 ㎍	7.79 ㎍	1.1 fmol/㎍/min	25.8 fmol/㎍/min

주의: 보고된 유닛은 처리되지 않은 데이터에 기록된 유닛을 반영함.

실시예 11: 래트에서의 MPP5 의 체내분포

단일-용량의 전립선내 투여 후의 전립선 내의 MPP5의 체내분포 및 주위 조직으로의 잠재적 분포를 확립하기 위해, ¹²⁵I-MPP5를 이용하는 방사선 표지된 정량적 전신 자가방사선술 연구를 수컷 스프라그-돌리 래트에서 수행하였다. 투여 제형 내의 방사선활성 농도 (± S.D.)는 1.6 x 10⁹ ± 44.02x 106 dpm/g (730.94 μC/g)였다. 평균 농도값 주위의 표준 편차 및 분산계수에 기초하여, 투여 제형은 균일한 것으로 간주하였다. 전립선으로의 주사에 의해 투여된 제형화된 ¹²⁵I-MPP5의 평균 용량은 8.73 μg/동물 (10 μL 부피의 5.86 μCi/동물)이었다.

혈액의 이중 분취량 (2 x 50 μL)을 방사선활성 분석을 위해 샘플링하였다. 혈액을 약 10분 동안 3500 rpm 및 4℃에서 원심분리시키고 (수득후 60분 이내), 혈장의 이중 분취량 (2 x 50 μL)을 방사선활성 분석을 위해 샘플링하였다. 전체 혈액의 이중 칭량된 분취량을 용해 (솔루엔-350)시키고, 과산화수소 (30% w/v)로 탈색시키고, 방사선활성 측정을 위해 액체 신틸레이션액과 혼합시켰다. 혈장의 이중 분취량을 방사선활성 측정을 위해 액체 신틸레이션액과 직접 혼합시켰다.

정량적 전신 오토라디오루미노그래피(autoradioluminography)를 위해, 동물을 20분 동안 헥산 및 드라이아이스의 혼합물에서 강하게 동결시켰다. 이후, 동물을 시상 전신 절단물을 수득하기 위해 표준 운영 절차 (Standard Operating Procedure)에 따라 동결 프레임을 이용하여 2% CMC 배지 중에 우측면 상에 엠베딩 (embedding)시켰다. 10개의 ¹²⁵I 표준 용액 및 두개의 양질 대조군 용액을 넣기 위해 각각의 동결된 CMC 블록상에 12개의 구멍을 만들었다. ¹⁴C 또는 ¹²⁵I로 스파이킹된 혈액을 필요시 방사선활성 수준 또는 낮은 대비를 나타내는 구조의 확인을 위해 참조 도트로서 사용되는 각각의 CMC 블록의 네개의 천공된 구멍에 넣었다. 각각의 동물 표본 블록을 레이카 (Leica) CM 3600 냉동절편기를 이용하여 절단하였다. 30 μm의 절단물을 수득하고, 동물 번호, 시점, 절단 번호, 절단일 및 나이프 위치를 확인하였다.

결과는 단일 용량 전립선내 투여후, 혈액 및 혈장 내의 방사선활성의 농도가 낮음을 나타내었고, 이는 전립선내 투여 후의 덜 명백한 흡수를 암시한다. 우측 복부 전립선 주사 부위로부터 첫번째 샘플링 시점 (3 h)에서 방사선활성의 가장 높은 농도 (9.445 μg Eq/g)를 수득하였다. 전립선의 기타 로브 (좌측 복부, 및 우측 및 좌측 등 로브)에서 또한 높은 수준의 방사선활성이 관찰되었으나, 96h의 최종 샘플링 시점에 걸쳐 감소하였다. 이러한 최종 시점에서, 전립선 내의 방사선활성의 농도는 우측 복부 전립선 주사 부위 (0.268 μg Eq/g)를 제외하고 전립선의 모든 영역에서 낮았다. 전립선이 아니고는, 방광 및 갑상선 만이 혈액 또는 혈장보다 높은 방사선활성 농도를 나타내었다. 방사선활성 (¹²⁵I)의 갑상선 수준은 투여후 12 내지 48시간에 걸쳐 증가하였고, 처리후 96시간의 최종 시점까지 상승된 채로 유지되었다. 갑상선 내의 ¹²⁵I의 격리는 갑상선에 분포하는 유리 ¹²⁵I를 나타낼 수 있다. 부신 (≤0.034 μg Eq/g), 신장 (≤0.032 μg Eq/g), 간 (≤0.045 μg Eq/g), 폐 (≤0.041 μg Eq/g) 및 췌장 (≤0.022 μg Eq/g)에서는 낮은 농도의 방사선활성이 관찰되었다. 뇌는 가장 낮은 농도의 방사선활성 (≤0.003 μg Eq/g)을 나타내었다. 극도로 낮은 수준의 방사선이 모든 시점에서 모든 기타 주요 기관에서 확인되었고, 이는 유의한 전신 분포가 발생하지 않았음을 암시한다. 조직 대 혈장 수준은 시간에 걸쳐 증가하였고, 이는 MPP5가 조직보다 혈장으로부터 보다 빠르게 제거되었음을 암시한다. 따라서, 체내분포 연구는 MPP5가 국소 투여부위에 주로 잔류하고, 주위 세포에 대해 제한된 주위 분포 및 독성만을 지님을 암시한다.

실시예 12: 원숭이에서의 MPP5 의 독성약동학

실시예 7에 기술된 바와 같이 성적으로 성숙한 수컷 시노몰구스 원숭이에서의 전립선내 투여 후에 MPP5의 독성약동학을 또한 확립하였다. 그룹당 4마리의 원숭이에 2 x 25 μL의 주사 (25 μL/로브)를 이용하여 대조군 염수 또는 전립선 조직 g당 0.35, 4.14 또는 25.79 μg의 MPP5를 전립선 조직에 전립선내 투여하였다. 투여 전 및 투여 1, 2, 4, 8, 24 및 48시간 후에 모든 원숭이 (16)로부터 혈액 샘플을 수득하였다. 본 연구의 예비 결과를 또한 실시예 7에 기술하였다. 하기는 본 연구의 완료된 독성약동학 결과를 나타낸다.

유효한 ELISA 방법을 이용하여 MPP5에 대해 연구 샘플을 분석하였다. ELISA 방법의 정량화의 하한 (LLOQ)은 이중 분석에서 50 μL 혈청을 이용하여 5 ng/mL이었다. 전립선내 투여 후에 MPP5의 감지할수 있을 만한 전신 수준은 검출되지 않았다. 그룹 2의 1마리의 동물이 모든 시점 동안 LLOQ (5 ng/mL)를 초과하는 농도를 나타내었다. 이는 동일한 용량의 그룹으로부터의 동물에 비해 일반적이지 않은 것으로 간주하였고, 확인을 위해 이러한 동물로부터의 모든 샘플을 이후의 분석에서 반복하였다. 모든 본래의 결과를 반복 분석에서 확인하였다. 투여전 샘플이 또한 LLOQ을 초과함에 따라, 이러한 동물에서 관찰된 농도는 기질 간섭에 기인하는 듯 하고, 처리와는 관련되지 않는 것으로 결정하였다.

실시예 13: MPP5 처리된 원숭이의 전립선 형태의 평가

실시예 7 및 12에 기술된 본 연구에서 수득된 원숭이 전립선의 절단물의 추가 분석을 수행하였다. 처리된 전립선의 형태를 검사하기 위해 헤마톡실린 & 에오신 (H&E) 염색을 수행하고, PSA의 분포를 검사하기 위해 PSA에 대해 면역조직화학 염색을 수행하고, MPP5의 분포를 검사하기 위해 MPP5 염색을 수행하였다. 사용된 프로토콜은 하기에 기술된다.

재료 및 시약: 대조군 및 MPP5 처리된 원숭이 전립선으로부터의 절단물의 96 슬라이드 (원숭이당 6개)를 실온에서 밀봉된 용기에 보관하였다. 비히클 또는 전립선 그램당 0.35, 4.1 또는 25 μg의 MPP5가 전립선내 투여된 원숭이로부터의 전립선 조직의 절단물을 제조하고, H&E로 염색하였다. 당 분야에 공지된 방법에 따라 PSA 및 MPP5에 대해 절단물을 또한 면역조직학적으로 염색하였다.

영상 분석: 원숭이 전립선의 조직학적 절단물을 1.25 X 대물렌즈를 이용하여 평가하였다. 전립선의 전체 영역 및 MPP5에 의해 유발된 손상의 전체 영역의 윤곽을 나타내기 위해 메타모르프(Metamorph™) 소프트웨어 패키지 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하였다. 이러한 소프트웨어는 화소수로 전체 영역을 제공한다. Cm²당 화소수를 결정하기 위한 표준으로서 각각의 슬라이드 상에 1 x 1 cm의 정사각형을 두었다. 이후, MPP5의 각각의 용량으로부터의 손상 영역을 결정하였고, 손상 cm²로 전환시켰다. 손상된 영역/전체 전립선 영역의 비에 100을 곱함으로써 손상 영역 %를 결정하였다.

대조군 (정상) 원숭이 전립선의 분석은 시노몰구스 원숭이 전립선이 선 모양과 관련하여 인간 전립선과 유사하고, PSA의 분포가 관 안쪽의 원주상피세포에 제한된 것을 입증하였다. 인간과 같이 원숭이 전립선은 요도를 둘러싸고 있다. 따라서, 원숭이 전립선은 전립선내 투여시 PSA에 의해 활성화된 단백질 독소 MPP5의 활성화 및 독성을 연구하는데 있어서 최적으로 이용가능한 동물 모델을 의미한다.

본 연구에서의 전립선 조직의 형태 특성 및 전립선 내의 PSA 및 MPP5의 분포는 0.35 내지 4.14 μg/전립선 g의 용량으로부터 전립선 손상의 영역/백분율에서 용량 반응성을 나타내었으나; 4.14 내지 25.79 μg/전립선 g에서는 현저한 증가가 없었다 (표 16). 계산된 손상의 가장 큰 영역은 4.14 μg/전립선 g의 용량을 투여한 원숭이에서 관찰되었고, 로브 당 25 μL의 단일 주사는 전체 선의 약 50%를 손상시켰다. 상기 결과는 전립선의 로브당 25 μL의 주사 부피의 전체 분포에 의해 최대 손상이 제한될 수 있음을 암시한다.

MPP5가 정상 선 조직의 유의한 경색을 유도한 처리 영역에서, PSA 염색은 현저하게 감소한 반면, 인접한 전립선의 손상되지 않은 영역에서의 PSA 염색은 분포 및 정도에 있어서 정상이었다. 상기 결과는 선 내의 원주상피세포의 MPP5 사멸이 PSA 생성을 배제시켰음을 암시한다. 상기 결과는 또한 MPP5의 분포가 도 38에 나타난 바와 같이 중간 용량 및 고용량 수준에서 경색 영역과 중첩됨을 입증한다. 투여 15일 후, 중간 용량 수준에서 잔류하는 MPP5가 관찰되지 않았다. 또한, MPP5는 본 연구에서 평가된 임의의 절단물에서 전립선 캡슐을 통과하는 것으로 보이지 않았다.

MMP5에 의한 전립선 손상¹의 부위 및 백분율

투여량	0.35 ㎍/전립선 g		4.14 ㎍/전립선 g		25.79 ㎍/전립선 g
	부위(cm²)	퍼센트	부위(cm²)	퍼센트	부위(cm²)	퍼센트
	0.33	20.2	0.78	46.6	0.57	63.4
	0.36	30.2	0.87	47.9	0.32	23.2
	0.20	13.8	0.89	54.9	0.51	41.0
	0.46	36.8	1.23	56.6	0.47	51.0
평균 ± 표준 편차	0.33 ±0.11	25.3 ± 5.9	0.94 ± 0.20	51.5 ± 2.9	0.47 ± 0.11	44.7 ± 9.8

¹ 로브당 25 μL의 주사후 손상 (전체 선의 영역/백분율)

MPP5가 정상 선 조직의 유의한 경색을 유도한 처리 영역에서, PSA 염색은 현저하게 감소하였다. 인접한 비손상 영역에서, PSA 염색은 분포 및 정도에 있어서 정상이었다. 이러한 결과는 선 내의 원주상피세포의 MPP5 사멸이 PSA 생성을 배제시켰음을 암시한다. 그러나, MPP5는 비손상 영역에서 PSA 생성을 변화시키지 않았거나, 낮은 수준의 PSA를 생성하는 내피 세포를 선택하지 않았다. 요도를 둘러싸는 근육 띠에서 PSA 염색이 관찰되지 않았다. 이러한 요도 조직에서의 PSA의 결핍은 요도에 대한 임의의 유의한 손상이 없음을 부분적으로 설명할 수 있다. 따라서, 전립선의 단일 로브로의 MPP5의 소량 (25 μL) 주사는 비-PSA 생성 조직 (예를들어, 요도)에 대한 유의한 손상 없이 정상적인 원숭이 전립선 내의 PSA 생성 선 조직의 광범위한 영역의 유의한 경색을 생성할 수 있다.

실시예 14: 개에서의 MPP5 의 독성

MPP5의 단일한 전립선내 투여 후에 전립선내 독성 및 MTD에 관한 잠재성을 확립하기 위해 수컷 비글견에서 예비 독성학 연구를 수행하였다. 100 μL의 투여 부피의 0, 50, 107, 200 또는 400 μg (전립선 중량에 기초함, 이러한 용량은 각각 0, 22, 24.4, 40 및 72.2 μg/전립선 g과 동등함)의 전립선내 주사 (좌측 로브)를 통해 MPP5를 수컷 비글견 (1/그룹)에 투여하였다. 투여후 1주일 동안 동물을 관찰하였다. 임상적 관찰, 체중, 식이 섭취 또는 임상적 병변에 있어서 사망 또는 치료 관련 효과가 없었다. 전립선 중량에 있어서 명백한 MPP5 관련 효과가 없었다. 전립선의 좌측 로브 및 인접한 복부 지방에서 큰 병리학적 변화가 확인되었고, 이는 전립선 실질로 연장된 전립선의 어두운 영역을 포함한다. 복부 지방에서의 어두운 영역 및/또는 이에 대한 부착은 전립선 내에서 인지된 MPP5 관련 효과와 관련된다. 400 μg으로 처리된 개에서, 어두운 영역은 보다 수가 많았고, 전립선의 좌측 로브가 확대되어 있었다. 이러한 병리학적 변화의 중증도의 증가는 MPP5의 예상된 약리학적 효과에 기인하는 것으로 간주하였다. 임의의 유의한 전립선외 독성이 존재하지 않는 것으로 보였다. 종합적으로, 전립선에서 명백한 치료 관련 육안적 변화가 관찰되었고, 주위 또는 인접 복부 지방 조직에 대해서는 제한된 관련 효과가 관찰되었고, 400 μg의 수준에서 중증도가 증가하였다.

개 전립선은 2개의 로브 구조, 샘꽈리관의 특성 및 풍부한 기질의 존재를 포함하여 인간 전립선과 구조적으로 유사하다 (Wientjes et al ., 2005). 인간은 개 전립선 보다 높은 분량의 기질 조직을 지니지만, 섬유상 구획의 구성, 및 혈액 및 림프 배액 패턴, 인간과 개 전립선 사이의 차이의 정도는 공지되어 있지 않다. 그럼에도 불구하고, 개는 전립선내 주사의 효과를 연구하기 위한 유용한 모델로서 기존에 입증되었다 (Rosser et al ., 2004). 그러나, MPP5의 경우, 비글견은 상기 화합물의 세포독성 효과에 명백하게 민감한 것으로 보이지 않는다. 이는 개에서의 PSA 발현의 결핍 (또는 MPP5를 분해할 수 있는 기타 비특이적 효소)에 기인하는 듯 하다. 개 모델은 PSA의 부재시에 MPP5가 극도로 높은 용량에서 활성화되지 않음을 나타내며, 이는 비 활성화된 프로드러그의 안정성을 입증한다. 대조적으로, 래트 및 비인간 영장류는 각각 PSA 유사 칼리크레인 및 PSA를 발현하는 것으로 공지되어 있고, 낮은 농도의 MPP5에서도 민감한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 개 전립선은 인간 전립선과 해부학적으로 유사하지만, MPP5 활성화와 관련해서는 인간 선과 기능적 관련성을 나타내지 않는 듯 하며, 따라서, 개는 MPP5의 독물 모델로서 더이상 수행하지 않았다. 그러나, 개 연구는 PSA에 의해 분해되지 않는 경우 MPP5는 약리학적으로 비활성인 것을 입증하는 것을 제공하였고, 이는 비-PSA 생성 조직에서 발견되는 경우 MPP5가 유의한 독성을 발생시키지 않는다는 확신을 제공하였다.

실시예 15: 원숭이에서의 MPP5 의 독성

내인성 PSA-생성 비설치류 종에서의 MPP5의 독성을 확립하기 위해, 실시예 7에 기술된 바와 같이 전립선 조직 g당 0.35, 4.14 또는 25.79 μg의 MPP5로 주사된 수컷 시노몰구스 원숭이 (4/그룹)에서 전립선내 독성 연구를 수행하였다. 전립선의 각각의 로브에 대해 2회의 회음 주사를 투여하였다 (25 μL/로브). 본 연구의 예비 결과를 실시예 7에 나타내었다. 완료된 결과의 기술은 다음과 같다.

직접 전립선내 투여 및 2 또는 14일의 관찰 기관 후, MPP5와 관련된 독성을 전립선에 대해 확인하였고, 주위 조직에는 손상이 거의 없거나 기타 명백한 전신 효과가 없음을 확인하였다. 혈액 분석 결과는 수컷 시노몰구스 원숭이가 검출가능한 수준의 PSA를 발현하고, MPP5의 전립선내 투여가 혈액/혈청으로 유의한 양의 PSA를 방출함을 나타내었다. 처리 10일후 PSA 수준은 기저 수준 근처로 복귀하였다. 임상 증상, 체중, 안구 상태, 요검사 또는 심전도 (ECG) 평가에 있어서 임의의 용량 수준에서 처리 관련 효과가 관찰되지 않았다. 혈청 화학 및 혈액학적 평가는 일시적 세포 및 염증 반응을 나타내었다. 일시적 급성기 면역학적 반응이 연구 3일 째에 모든 그룹에서 관찰되었고, 이는 외과적 처치와 관련된 염증 및 전립선에 국한된 염증에 기인된 것이다. 연구 3일 째에 인지된 C-반응성 단백질 (CRP)에서의 증가는 일반적으로 용량 관련되었고, 현미경적으로 관찰된 전립선의 혼합 세포 염증 및 괴사의 범위와 일치하였다.

3일째에 모든 MPP5 용량 수준에서 전립선 내에 큰 현미경적 병리 변화가 관찰되었다. 이러한 변화는 괴사, 출혈 및 혼합 세포 침윤물을 특징으로 하였고, 중간 및 고용량으로 MPP5를 투여한 동물에서 보다 중증이었다. 저용량 그룹의 원숭이는 3일째에 내피 조직에서의 재생 증식 및 편평상피회생 및 간질 (중간엽) 조직에서의 섬유증식을 포함하는 회복과 일치하는 조직학적 변화를 나타내었다. 중간 및 고용량 그룹에서의 회복은 3일 째에 최소이거나 존재하지 않았다. 15일째까지, 저용량 그룹에서 괴사가 해결되었고, 회복이 진행중이었다. 중간 및 고용량 그룹에서, 15일째에서 괴사가 진행중이었고, 회복과 일치하는 변화는 괴사 병변의 가장자리에 제한되었다. 대조적으로, 3일 또는 15일째에 MPP5에 기인하는 전립선 주변 또는 전신 조직에서의 변화는 없었다.

실시예 16: 원숭이에서의 MPP5 에 대한 면역 반응

MPP5에 대한 잠재적 면역 반응을 또한 평가하였다. 실시예 7에 기술된 바와 같이 동물을 MPP5로 처리하였다. MPP5에 대한 잠재적 면역 반응을 하기와 같이 결정하였다.

원숭이 그룹에 하기 표에 따라 전립선으로 직접 다양한 용량의 MPP5를 투여하였다. 주사 하루전 및 주사 14일 후에 동물로부터 혈청 (약 0.5 mL)을 수득하였다. 검사시까지 혈청을 -70℃에서 보관하였다. 개별적으로 기술된 바와 같이 면역글로불린 반응을 ELISA로 측정하였다. 간단하게, 4℃에서 밤새 코팅시킴으로써 프로에어로라이신 (인산염 완충 염수 중의 0.5 μg/mL)을 EIA 플레이트에 결합시켰다. 실온에서 5% BSA (Sigma)로 코팅시킴으로써 비특이적 결합을 억제시켰다. 풀링된 정상적인 원숭이 혈청의 일련의 10배 희석 (1:100 - 1:1,000,000)을 4중으로 이용하여 MPP5 투여후 다양한 시점에서 수득된 동물로부터의 혈청에서의 역가 결정을 위한 비교 곡선을 만들었다. MPP5 처리된 원숭이로부터의 혈청의 샘플을 10배 희석 (1:100 - 1:1,000,000)시켜 정상적인 혈청을 이용한 농도를 제공하였다. 염소 항-래트 IgG (Jackson ImmunoResearch)에 컨쥬게이팅된 과산화효소를 프로에어로라이신 코팅된 웰에 결합된 항체에 결합시켰다. 제조업체의 지시에 따라 OPD 과산화효소 기질을 첨가하여 색을 발달시켰다. 몰레큘러 다이나믹스 베르사맥스 (Molecular Dynamics VERSAmax) 마이크로플레이트 판독기에서 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 역가를 흡광도 판독이 정상적인 풀링된 혈청 + 동일한 희석액에 대한 2개의 표준 편차의 흡광도 보다 적은 희석으로 정의하였다.

MPP5 투여 전에, 비히클 대조군 동물중 하나를 제외한 모든 원숭이는 검출가능한 역가를 지니지 않았다. 상기 대조군 동물은 소량의 역가의 출현이 14일째에 샘플에서 확인되고 재분석에 의해 재확인된 바에 따라 연구 전에 면역원성에 노출된 듯 하다. 1 μg/g MPP5이 투여된 두 마리의 동물중 하나는 역가를 나타내었다. 유사하게, 5 μg/g MPP5가 투여된 두 마리의 동물중 하나는 역가를 나타내었다. 25 μg/g MPP5가 투여된 둘 모두의 동물은 역가를 나타내었다.

투여전 채혈 및 투여후 채혈에서 각각의 동물에 대한 역가를 표 17에 나타내었다.

MPP5의 투여 후 원숭이에서 항체 적정 농도

군	원숭이	투여량 (㎍/전립선 g)	투여 루트	항체 적정 농도 1일 14일
1	6001	0	IP	1:1000*	1:1000*
1	8001	0	IP	＜1:100	＜1:100
2	6003	1	IP	＜1:100	1:10,000
2	7002	1	IP	＜1:100	＜1:100
3	6005	5	IP	＜1:100	1:10,000
3	8002	5	IP	＜1:100	1:100
4	6007	25	IP	＜1:100	1:10,000
4	8003	25	IP	＜1:100	1:10,000

* 이 동물은 투여 전에 동일한 약간의 역가를 나타내었음.

도 39는 MPP5의 투여 후의 원숭이에서의 항체 역가를 나타낸다. 어느 역가도 10⁴를 초과하지 않았다. 이는 MPP5의 전립선내 투여가 강한 면역 반응을 유발하지 않았음을 암시한다. 그러나, 처리된 6마리의 동물중 4마리는 풀링된 혈청을 초과하는 역가를 나타내었다.

전립선 g당 0.35 또는 4.14 μg으로 처리된 두 마리의 원숭이중 한 마리에서 항체 역가가 인지되었고, 전립선 g당 25.79 μg이 투여된 두 마리 모두의 동물은 역가를 나타내었다. 따라서, MPP5의 투여는 몇몇 원숭이에서 검출가능하나 낮은 역가의 면역 반응을 유도하였다.

실시예 11, 12 및 15에서의 발견에 기초하여, 임의의 용량 수준에서 전립선외 독성이 나타나지 않았고; 따라서 전신 NOAEL은 전립선 g당 25.79 μg (실제 전립선 중량을 기초함)이 처리된 가장 높은 MPP5 용량이었다. 전립선에서 관찰된 효과는 MPP5의 작용의 공지된 메커니즘에 기초하여 용량 의존적이었고, 예상되었다. 시험된 가장 낮은 용량인 전립선 g당 0.35 μg을 포함하여 모든 용량 수준에서 전립선 내의 효과가 관찰되었고, 전립선의 약 25%가 손상되었다. 따라서, 국소 전립선 효과에 대한 최저 관찰 유해영향 수준 (LOAEL)은 본 연구에서 전립선 g당 0.35 μg이었다.

기존의 실시예는 수컷 알비노 래트에서의 정맥내 또는 전립선내 투여 및 비인간 영장류에서의 전립선내 주사 후의 MPP5의 약물 물질대사 및 독성동역학의 연구가 기술되어 있다. MPP5를 이용하여 수행된 비임상 약물 물질대사 및 약동학 (DMPK)의 요약을 표 18에 나타내었다.

MMP5로 수행되는 비임상적 약물대사 및 약물동력학의 항목

연구 제목	결과
알비노(albino) 랫트에서 MMP5의 급성 전립선 내 또는 정맥 내 볼루스 주사 독성 연구(1, 14 또는 28 일 관찰기간) [실시예 6]	단일 전립선 내(2, 10 또는 25 ㎍) 또는 정맥 내 주사(25 ㎍) 후 제공된 독성약물학 데이터를 제공함. MMP5는 2 ㎍의 전립선 내 투여 후 검출되지 않았음. C_max는 10 및 25 ㎍에서 투여량이 증가함으로써 증가하였으나 10 ㎍의 AUC는 25 ㎍의 AUC의 두배였음. 정맥 내 주사 후, T_max는 0이었음(즉시).
전립선샘으로 ¹²⁵I-MMP5의 단일 주사 후 수컷 스프라그 돌리 랫트에서 방사성 활성의 조직분포 [실시예 11]	MPP5는 전립선 내 투여 후 제한된 전신 생체 이용가능성/분포 및 전립선을 통한 비균질 분포를 지님을 입증함.
MMP5: 성적으로 성숙한 수컷 시노몰구스(Cynomolgus) 원숭이들에서 2주의 전립선 내 급성 독성 연구 [실시예 7, 12, 13 및 15]	전립선 내 주사(1, 5 또는 25 ㎍/전립선 g) 후전신 노출의 없음을 입증함. 모든 혈청농도는 투여전을 포함하는 모든 시점에서 LLOG 이상의 농도를 가지는 1마리의 저용량 동물을 제외하고, LLOQ 이하였다.

실시예 17: BPH 에 대한 임상 연구에서 MPP5 의 투여의 용량 및 방법 선택

BPH에서 MPP5의 임상 연구에 대한 시작 용량을 선택하기 위한 예시적 근거를 하기에 기술하였다. MPP5를 투여하는 예시적 방법이 또한 기술되어 있다.

시노몰구스 원숭이 전립선 및 인간 전립선 사이의 PSA의 발현 및 생리학적 유사성에 기초하여, 인간에서의 안전한 전립선내 시작 용량을 평가하기 위한 근거로서 본원에 기술된 단일 용량 원숭이 연구를 선택하였다. 개는 래트 및 원숭이에 비해 MPP의 효과에 민감하지 않았고; 따라서 개는 MPP5의 안전한 시작 용량을 평가하기 위한 적절한 모델로 간주하지 않았다. 본원에 기술된 래트 연구로부터의 데이터는 래트가 PSA를 코딩하는 유전자를 지니지 않는다는 사실에도 불구하고 MPP5는 래트 복부 전립선에서 확인된 PSA-유사 S3 칼리크레인에 의해 활성화되는 것을 암시한다 (Onozawa et al ., 2001).

BPH 임상 연구에서의 MPP5의 시작 용량을 전립선 g당 0.03 μg 내지 0.25 μg의 범위로부터 선택하였다. 잠재적 시작 용량은 단일 용량 원숭이 연구에서 시험된 가장 낮은 용량 (0.35 μg/전립선 g)에 대한 10배의 안정성 인자의 적용에 기초하여 전립선 g당 0.03 μg으로 정하였다. 전립선 g당 0.35 μg이 투여된 원숭이에서, 전신적 독성이 관찰되지 않은 반면, 국소적 전립선 변화가 확인되었다. 모든 3회의 투여는 전립선 조직의 국소적 박리를 나타내었고, 중간 및 보다 높은 용량은 주사 14일 후에 가장 현저한 변화 및 치유 결핍을 나타내었다. 가장 낮은 용량 (0.35 μg/전립선 g)은 조직학적 또는 실험실 분석에 의해서 전신 연구 결과에서 치료적으로 유효한 조합을 지니지 않고, 전립선의 약 25%의 박리로 제한적이나 명백하게 관찰가능한 국소적 전립선 효과를 지니는 것으로 결론내렸다. 이는 원숭이에서 안전한 용량으로 간주하였다. 이러한 데이터를 이용하여, 10배 이상의 안정성 인자를 적용하고, BPH 시험의 첫번째 코호트에 대해 인간 전립선 그램당 0.03 μg의 MPP5의 시작 용량을 선택하였다.

BPH 시험에서의 MPP5의 투여의 예시적 방법은 용량당 단지 4회 (각각의 측면 로브로의 2회의 주사)의 주사를 이용한 일반적인 경요도 투여 경로이다. 주사 동안의 지침을 위해, 경직장 초음파를 이용할 수 있다. BPH 시험에서 투여되는 전체 부피는 전립선 g당 50 μL이다. 주사 동안의 역류를 감소시키기 위해, 예를들어 겔 또는 점성 제형을 이용할 수 있다.

본 발명은 특정 구체예를 참조로 하여 기술되었으나, 본원에 첨부된 청구의 범위에 기술된 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어남이 없이 이의 다양한 변형이 당업자에게 명백할 것이다.

본원에 참조로서 포함된 공개된 특허 출원 및 데이터베이스를 포함하는 모든 특허, 간행물의 기술은 각각의 개별적 특허, 간행물 및 데이터베이스 기재가 특별하고 개별적으로 본원에 참조로서 포함된다는 것이 기재된 경우와 동등한 범위로 전체 내용이 참조로서 특별히 본원에 참조로서 포함된다.

<110> Protox Therapeutics Incorporated BUCKLEY, James Thomas <120> Method of Treating or Preventing Benign Prostatic Hyperplasia Using Modified Pore-Forming Proteins <130> 7fpi-12-03 <150> 60/690,269 <151> 2005-06-14 <160> 74 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1410 <212> DNA <213> Aeromonas hydrophila <220> <221> CDS <222> (1)..(1410) <400> 1 gca gag ccc gtc tat cca gac cag ctt cgc ttg ttt tca ttg ggc caa 48 Ala Glu Pro Val Tyr Pro Asp Gln Leu Arg Leu Phe Ser Leu Gly Gln 1 5 10 15 ggg gtc tgt ggc gac aag tat cgc ccc gtc aat cga gaa gaa gcc caa 96 Gly Val Cys Gly Asp Lys Tyr Arg Pro Val Asn Arg Glu Glu Ala Gln 20 25 30 agc gtt aaa agc aat att gtc ggc atg atg ggg caa tgg caa ata agc 144 Ser Val Lys Ser Asn Ile Val Gly Met Met Gly Gln Trp Gln Ile Ser 35 40 45 ggg ctg gcc aac ggc tgg gtc att atg ggg ccg ggt tat aac ggt gaa 192 Gly Leu Ala Asn Gly Trp Val Ile Met Gly Pro Gly Tyr Asn Gly Glu 50 55 60 ata aaa cca ggg aca gcg tcc aat acc tgg tgt tat ccg acc aat cct 240 Ile Lys Pro Gly Thr Ala 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<400> 20 Glu His Ser Ser Lys Leu Gln 1 5 <210> 21 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ser Lys Leu Gln 1 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LHRH variant sequence. <220> <221> SITE <222> (1) <223> Glu is a pyroglutamate <220> <221> SITE <222> (6) <223> Lys is a D-Lys <400> 23 Glu His Trp Ser Tyr Lys Leu Arg Pro Gly 1 5 10 <210> 24 <211> 397 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant proaerolysin peptide. <220> <221> SITE <222> (1) <223> pyroglutamate <220> <221> SITE <222> (6) <223> D-Lys <400> 24 Glu His Trp Ser Tyr Lys Leu Arg Pro Gly Glu Ile Pro Thr Leu Ser 1 5 10 15 Ala Leu Asp Ile Pro Asp Gly Asp Glu Val Asp Val Gln Trp Arg Leu 20 25 30 Val His Asp Ser Ala Asn Phe Ile Lys Pro Thr Ser Tyr Leu Ala His 35 40 45 Tyr Leu Gly Tyr Ala Trp Val Gly Gly Asn His Ser Gln Tyr Val Gly 50 55 60 Glu Asp Met Asp Val Thr Arg Asp Gly Asp Gly Trp Val Ile Arg Gly 65 70 75 80 Asn Asn Asp Gly Gly Cys Asp Gly Tyr Arg Cys Gly Asp Lys Thr Ala 85 90 95 Ile Lys Val Ser Asn Phe Ala Tyr Asn Leu Asp Pro Asp Ser Phe Lys 100 105 110 His Gly Asp Val Thr Gln Ser Asp Arg Gln Leu Val Lys Thr Val Val 115 120 125 Gly Trp Ala Val Asn Asp Ser Asp Thr Pro Gln Ser Gly Tyr Asp Val 130 135 140 Thr Leu Arg Tyr Asp Thr Ala Thr Asn Trp Ser Lys Thr Asn Thr Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Ser Glu Lys Val Thr Thr Lys Asn Lys Phe Lys Trp Pro Leu 165 170 175 Val Gly Glu Thr Gln Leu Ser Ile Glu Ile Ala Ala Asn Gln Ser Trp 180 185 190 Ala Ser Gln Asn Gly Gly Ser Thr Thr Thr Ser Leu Ser Gln Ser Val 195 200 205 Arg Pro Thr Val Pro Ala Arg Ser Lys Ile Pro Val Lys Ile Glu Leu 210 215 220 Tyr Lys Ala Asp Ile Ser Tyr Pro Tyr Glu Phe Lys Ala Asp Val Ser 225 230 235 240 Tyr Asp Leu Thr Leu Ser Gly Phe Leu Arg Trp Gly Gly Asn Ala Trp 245 250 255 Tyr Thr His Pro Asp Asn Arg Pro Asn Trp Asn His Thr Phe Val Ile 260 265 270 Gly Pro Tyr Lys Asp Lys Ala Ser Ser Ile Arg Tyr Gln Trp Asp Lys 275 280 285 Arg Tyr Ile Pro Gly Glu Val Lys Trp Trp Asp Trp Asn Trp Thr Ile 290 295 300 Gln Gln Asn Gly Leu Ser Thr Met Gln Asn Asn Leu Ala Arg Val Leu 305 310 315 320 Arg Pro Val Arg Ala Gly Ile Thr Gly Asp Phe Ser Ala Glu Ser Gln 325 330 335 Phe Ala Gly Asn Ile Glu Ile Gly Ala Pro Val Pro Leu Ala Ala Asp 340 345 350 Ser His Ser Ser Lys Leu Gln Ser Val Asp Gly Ala Gly Gln Gly Leu 355 360 365 Arg Leu Glu Ile Pro Leu Asp Ala Gln Glu Leu Ser Gly Leu Gly Phe 370 375 380 Asn Asn Val Ser Leu Ser Val Thr Pro Ala Ala Asn Gln 385 390 395 <210> 25 <211> 397 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant proaerolysin peptide. <220> <221> SITE <222> (1) <223> pyroglutamate <220> <221> SITE <222> (6) <223> D-Lys <400> 25 Glu His Trp Ser Tyr Lys Leu Arg Pro Gly Glu Ile Pro Thr Leu Ser 1 5 10 15 Ala Leu Asp Ile Pro Asp Gly Asp Glu Val Asp Val Gln Trp Arg Leu 20 25 30 Val His Asp Ser Ala Asn Phe Ile Lys Pro Thr Ser Tyr Leu Ala His 35 40 45 Tyr Leu Gly Tyr Ala Trp Val Gly Gly Asn His Ser Gln Tyr Val Gly 50 55 60 Glu Asp Met Asp Val Thr Arg Asp Gly Asp Gly Trp Val Ile Arg Gly 65 70 75 80 Asn Asn Asp Gly Gly Cys Asp Gly Tyr Arg Cys Gly Asp Lys Thr Ala 85 90 95 Ile Lys Val Ser Asn Phe Ala Tyr Asn Leu Asp Pro Asp Ser Phe Lys 100 105 110 His Gly Asp Val Thr Gln Ser Asp Arg Gln Leu Val Lys Thr Val Val 115 120 125 Gly Trp Ala Val Asn Asp Ser Asp Thr Pro Gln Ser Gly Tyr Asp Val 130 135 140 Thr Leu Arg Tyr Asp Thr Ala Thr Asn Trp Ser Lys Thr Asn Thr Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Ser Glu Lys Val Thr Thr Lys Asn Lys Phe Lys Trp Pro Leu 165 170 175 Val Gly Glu Thr Gln Leu Ser Ile Glu Ile Ala Ala Asn Gln Ser Trp 180 185 190 Ala Ser Gln Asn Gly Gly Ser Thr Thr Thr Ser Leu Ser Gln Ser Val 195 200 205 Arg Pro Thr Val Pro Ala Arg Ser Lys Ile Pro Val Lys Ile Glu Leu 210 215 220 Tyr Lys Ala Asp Ile Ser Tyr Pro Tyr Glu Phe Lys Ala Asp Val Ser 225 230 235 240 Tyr Asp Leu Thr Leu Ser Gly Phe Leu Arg Trp Gly Gly Asn Ala Trp 245 250 255 Tyr Thr His Pro Asp Asn Arg Pro Asn Trp Asn His Thr Phe Val Ile 260 265 270 Gly Pro Tyr Lys Asp Lys Ala Ser Ser Ile Arg Tyr Gln Trp Asp Lys 275 280 285 Arg Tyr Ile Pro Gly Glu Val Lys Trp Trp Asp Trp Asn Trp Thr Ile 290 295 300 Gln Gln Asn Gly Leu Ser Thr Met Gln Asn Asn Leu Ala Arg Val Leu 305 310 315 320 Arg Pro Val Arg Ala Gly Ile Thr Gly Asp Phe Ser Ala Glu Ser Gln 325 330 335 Phe Ala Gly Asn Ile Glu Ile Gly Ala Pro Val Pro Leu Ala Ala Asp 340 345 350 Ser Lys Val Arg Arg Ala Arg Ser Val Asp Gly Ala Gly Gln Gly Leu 355 360 365 Arg Leu Glu Ile Pro Leu Asp Ala Gln Glu Leu Ser Gly Leu Gly Phe 370 375 380 Asn Asn Val Ser Leu Ser Val Thr Pro Ala Ala Asn Gln 385 390 395 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 gctgccaatc aacatcatca ttaacggcag cgc 33 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 gcgctgccgt taatgatgat gttgattggc agc 33 <210> 28 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 28 gccaatcaac atcatcatca tcatcattaa cggcagcgc 39 <210> 29 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 29 gccaatcaac atcatcatca tcatcattaa cggcagcgc 39 <210> 30 <211> 1762 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Proaerolysin with a PSA sequence substituted for the furin site, and a histidine tag. <400> 30 aagcttgcat gcctgcagaa gaaggagata tacatatgca aaaaataaaa ctaactggct 60 tgtcattaat catatccggc ctgctgatgg cacaggcgca agcggcagag cccgtctatc 120 cagaccagct tcgcttgttt tcattgggcc aaggggtctg tggcgacaag tatcgccccg 180 tcaatcgaga agaagcccaa agcgttaaaa gcaatattgt cggcatgatg gggcaatggc 240 aaataagcgg gctggccaac ggctgggtca ttatggggcc gggttataac ggtgaaataa 300 aaccagggac agcgtccaat acctggtgtt atccgaccaa tcctgttacc ggtgaaatac 360 cgacactgtc tgccctggat attccagatg gtgacgaagt cgatgtgcag tggcgactgg 420 tacatgacag tgcgaatttc atcaaaccaa ccagctatct ggcccattac ctcggttatg 480 cctgggtggg cggcaatcac agccaatatg tcggcgaaga catggatgtg acccgtgatg 540 gcgacggctg ggtgatccgt ggcaacaatg acggcggctg tgacggctat cgctgtggtg 600 acaagacggc catcaaggtc agcaacttcg cctataacct agatcccgac agcttcaagc 660 atggcgatgt cacccagtcc gaccgccagc tggtcaagac tgtggtgggc tgggcggtca 720 acgacagcga caccccccaa tccggctatg acgtcaccct gcgctacgac acagccacca 780 actggtccaa gaccaacacc tatggcctga gcgagaaggt gaccaccaag aacaagttca 840 agtggccact ggtgggggaa accgaactct ccatcgagat tgctgccaat cagtcctggg 900 cgtcccagaa cgggggctcg accaccacct ccctgtctca gtccgtgcga ccgactgtgc 960 cggcccgctc caagatcccg gtgaagatag agctctacaa ggccgacatc tcctatccct 1020 atgagttcaa ggccgatgtc agctatgacc tgaccctgag cggcttcctg cgctggggcg 1080 gcaacgcctg gtatacccac ccggacaacc gtccgaactg gaaccacacc ttcgtcatag 1140 gtccgtacaa ggacaaggcg agcagcattc ggtaccagtg ggacaagcgt tacatcccgg 1200 gtgaagtgaa gtggtgggac tggaactgga ccatacagca gaacggtctg tctaccatgc 1260 agaacaacct ggccagagtg ctgcgcccgg tgcgggcggg gatcaccggt gatttcagtg 1320 ccgagagcca gtttgccggc aacatagaga tcggtgctcc cgtgccgctc gcggctgaca 1380 gccattcctc caagctgcag agtgtggacg gcgctggtca aggcctgagg ctggagatcc 1440 cgctcgatgc gcaagagctc tccgggcttg gcttcaacaa cgtcagcctc agcgtgaccc 1500 ctgctgccaa tcaacatcat catcatcatc attaacggca gcgctaacaa catcatcatc 1560 atcatcatta acggcagcgc gttgtagtga tggaaccggg cctctggccc ggtttttgtt 1620 tgcactggtc gggcttgtta aaggcttgtg ctttccattt ccccacttat actggcgcca 1680 tcttgtcgga gtgccaaccg tcgaacgacg cgaggctgag accgttaatt cgggatccgt 1740 ggaacctgat ccccgggaat tc 1762 <210> 31 <211> 476 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Proaerolysin with a PSA sequence substituted for the furin site. <400> 31 Ala Glu Pro Val Tyr Pro Asp Gln Leu Arg Leu Phe Ser Leu Gly Gln 1 5 10 15 Gly Val Cys Gly Asp Lys Tyr Arg Pro Val Asn Arg Glu Glu Ala Gln 20 25 30 Ser Val Lys Ser Asn Ile Val Gly Met Met Gly Gln Trp Gln Ile Ser 35 40 45 Gly Leu Ala Asn Gly Trp Val Ile Met Gly Pro Gly Tyr Asn Gly Glu 50 55 60 Ile Lys Pro Gly Thr Ala Ser Asn Thr Trp Cys Tyr Pro Thr Asn Pro 65 70 75 80 Val Thr Gly Glu Ile Pro Thr Leu Ser Ala Leu Asp Ile Pro Asp Gly 85 90 95 Asp Glu Val Asp Val Gln Trp Arg Leu Val His Asp Ser Ala Asn Phe 100 105 110 Ile Lys Pro Thr Ser Tyr Leu Ala His Tyr Leu Gly Tyr Ala Trp Val 115 120 125 Gly Gly Asn His Ser Gln Tyr Val Gly Glu Asp Met Asp Val Thr Arg 130 135 140 Asp Gly Asp Gly Trp Val Ile Arg Gly Asn Asn Asp Gly Gly Cys Asp 145 150 155 160 Gly Tyr Arg Cys Gly Asp Lys Thr Ala Ile Lys Val Ser Asn Phe Ala 165 170 175 Tyr Asn Leu Asp Pro Asp Ser Phe Lys His Gly Asp Val Thr Gln Ser 180 185 190 Asp Arg Gln Leu Val Lys Thr Val Val Gly Trp Ala Val Asn Asp Ser 195 200 205 Asp Thr Pro Gln Ser Gly Tyr Asp Val Thr Leu Arg Tyr Asp Thr Ala 210 215 220 Thr Asn Trp Ser Lys Thr Asn Thr Tyr Gly Leu Ser Glu Lys Val Thr 225 230 235 240 Thr Lys Asn Lys Phe Lys Trp Pro Leu Val Gly Glu Thr Glu Leu Ser 245 250 255 Ile Glu Ile Ala Ala Asn Gln Ser Trp Ala Ser Gln Asn Gly Gly Ser 260 265 270 Thr Thr Thr Ser Leu Ser Gln Ser Val Arg Pro Thr Val Pro Ala Arg 275 280 285 Ser Lys Ile Pro Val Lys Ile Glu Leu Tyr Lys Ala Asp Ile Ser Tyr 290 295 300 Pro Tyr Glu Phe Lys Ala Asp Val Ser Tyr Asp Leu Thr Leu Ser Gly 305 310 315 320 Phe Leu Arg Trp Gly Gly Asn Ala Trp Tyr Thr His Pro Asp Asn Arg 325 330 335 Pro Asn Trp Asn His Thr Phe Val Ile Gly Pro Tyr Lys Asp Lys Ala 340 345 350 Ser Ser Ile Arg Tyr Gln Trp Asp Lys Arg Tyr Ile Pro Gly Glu Val 355 360 365 Lys Trp Trp Asp Trp Asn Trp Thr Ile Gln Gln Asn Gly Leu Ser Thr 370 375 380 Met Gln Asn Asn Leu Ala Arg Val Leu Arg Pro Val Arg Ala Gly Ile 385 390 395 400 Thr Gly Asp Phe Ser Ala Glu Ser Gln Phe Ala Gly Asn Ile Glu Ile 405 410 415 Gly Ala Pro Val Pro Leu Ala Ala Asp Ser His Ser Ser Lys Leu Gln 420 425 430 Ser Val Asp Gly Ala Gly Gln Gly Leu Arg Leu Glu Ile Pro Leu Asp 435 440 445 Ala Gln Glu Leu Ser Gly Leu Gly Phe Asn Asn Val Ser Leu Ser Val 450 455 460 Thr Pro Ala Ala Asn Gln His His His His His His 465 470 475 <210> 32 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 32 Lys Arg Arg 1 <210> 33 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 33 Ser Arg Arg 1 <210> 34 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 34 Ala Arg Arg 1 <210> 35 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 35 His Arg Arg 1 <210> 36 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 36 Gln Arg Arg 1 <210> 37 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 37 Ala Phe Arg 1 <210> 38 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 38 Ala Gln Arg 1 <210> 39 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 39 Ala Lys Arg 1 <210> 40 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 40 Ala Arg Lys 1 <210> 41 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 41 Ala His Arg 1 <210> 42 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 42 Gln Lys Arg Arg 1 <210> 43 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 43 Lys Ser Arg Arg 1 <210> 44 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 44 Ala Lys Arg Arg 1 <210> 45 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 45 Lys Lys Arg Arg 1 <210> 46 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 46 His Lys Arg Arg 1 <210> 47 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 47 Lys Ala Phe Arg 1 <210> 48 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 48 Lys Ala Gln Arg 1 <210> 49 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 49 Lys Ala Lys Arg 1 <210> 50 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 50 Lys Ala Arg Lys 1 <210> 51 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 51 Lys Ala His Arg 1 <210> 52 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 52 Lys Arg Arg Leu 1 <210> 53 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 53 Ser Arg Arg Leu 1 <210> 54 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 54 Ala Arg Arg Leu 1 <210> 55 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 55 Ala Arg Arg Ser 1 <210> 56 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 56 His Arg Arg Ala 1 <210> 57 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 57 Gln Arg Arg Leu 1 <210> 58 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 58 Ala Phe Arg Leu 1 <210> 59 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 59 Ala Gln Arg Leu 1 <210> 60 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 60 Ala Lys Arg Leu 1 <210> 61 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 61 Ala Arg Lys Leu 1 <210> 62 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 62 Ala His Arg Leu 1 <210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 63 His Ala Gln Lys Arg Arg Leu 1 5 <210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 64 Gly Gly Lys Ser Arg Arg Leu 1 5 <210> 65 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 65 His Glu Gln Lys Arg Arg Leu 1 5 <210> 66 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 66 His Glu Ala Lys Arg Arg Leu 1 5 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 67 Gly Gly Gln Lys Arg Arg Leu 1 5 <210> 68 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 68 His Glu Gln Lys Arg Arg Ala 1 5 <210> 69 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 69 Gly Gly Ala Lys Arg Arg Leu 1 5 <210> 70 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 70 His Glu Gln Lys Arg Arg Ser 1 5 <210> 71 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 71 Gly Gly Lys Lys Arg Arg Leu 1 5 <210> 72 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Cleavage Site <400> 72 Gly Gly His Lys Arg Arg Leu 1 5 <210> 73 <211> 1542 <212> DNA <213> Clostridium septicum <400> 73 tgttaataat atgttaatat tttgataaca tttattatat aataaattat ttattttaaa 60 attaaaggga gggatattta tgtcaaaaaa atcttttgct aaaaaagtaa tttgtacatc 120 tatgattgca attcagtgtg cggcagtagt accacatgta caagcttatg cacttacaaa 180 tcttgaagag gggggatatg caaatcataa taatgcttct tcaattaaaa tatttggata 240 tgaagacaat gaagatttaa aagctaaaat tattcaagat ccagagttta taagaaattg 300 ggcaaatgta gctcattcat taggatttgg atggtgcggt ggaacggcta atccaaacgt 360 tggacaaggt tttgaattta aaagagaagt tggggcaggt ggaaaagtat cttatttatt 420 atctgctaga tacaatccaa atgatcctta tgcaagtgga tatcgtgcaa aagatagact 480 ttctatgaaa atatcaaatg ttagatttgt tattgataat gattctataa aattaggtac 540 acctaaagtg aaaaaattag cacctttaaa ctctgctagt tttgatttaa taaatgaaag 600 taaaactgag tctaaattat caaaaacatt taattataca acttctaaaa cagtttctaa 660 aacagataac tttaaatttg gagaaaaaat aggagtaaaa acatcattta aagtaggtct 720 tgaagctata gctgacagta aagttgagac aagctttgaa tttaatgcag aacaaggttg 780 gtcaaataca aatagtacta ctgaaactaa acaagaaagt actacatata ctgcaacagt 840 ttctccacaa actaaaaaga gattattcct agatgtgtta ggatcacaaa ttgatattcc 900 ttatgaagga aaaatatata tggaatacga catagaatta atgggatttt taagatatac 960 aggaaatgct cgtgaagatc atactgaaga tagaccaaca gttaaactta aatttggtaa 1020 aaacggtatg agtgctgagg aacatcttaa agatttatat agtcataaga atattaatgg 1080 atattcagaa tgggattgga aatgggtaga tgagaaattt ggttatttat ttaaaaattc 1140 atacgatgct cttactagta gaaaattagg aggaataata aaaggctcat ttactaacat 1200 taatggaaca aaaatagtaa ttagagaagg taaagaaatt ccacttcctg ataagaagag 1260 aagaggaaaa cgttcagtag attctttaga tgctagatta caaaatgaag gtattagaat 1320 agaaaatatt gaaacacaag atgttccagg atttagacta aatagcataa catacaatga 1380 taaaaaattg atattaatta ataatatata attataattt attaaaatat gcttctctat 1440 actttatatt aatatttaaa gtataaaaac taacaaaatc tcacttagta ggtagaattg 1500 tataaaaaca aatctaccta ctattttttt attatttagt cg 1542 <210> 74 <211> 443 <212> PRT <213> Clostridium septicum <400> 74 Met Ser Lys Lys Ser Phe Ala Lys Lys Val Ile Cys Thr Ser Met Ile 1 5 10 15 Ala Ile Gln Cys Ala Ala Val Val Pro His Val Gln Ala Tyr Ala Leu 20 25 30 Thr Asn Leu Glu Glu Gly Gly Tyr Ala Asn His Asn Asn Ala Ser Ser 35 40 45 Ile Lys Ile Phe Gly Tyr Glu Asp Asn Glu Asp Leu Lys Ala Lys Ile 50 55 60 Ile Gln Asp Pro Glu Phe Ile Arg Asn Trp Ala Asn Val Ala His Ser 65 70 75 80 Leu Gly Phe Gly Trp Cys Gly Gly Thr Ala Asn Pro Asn Val Gly Gln 85 90 95 Gly Phe Glu Phe Lys Arg Glu Val Gly Ala Gly Gly Lys Val Ser Tyr 100 105 110 Leu Leu Ser Ala Arg Tyr Asn Pro Asn Asp Pro Tyr Ala Ser Gly Tyr 115 120 125 Arg Ala Lys Asp Arg Leu Ser Met Lys Ile Ser Asn Val Arg Phe Val 130 135 140 Ile Asp Asn Asp Ser Ile Lys Leu Gly Thr Pro Lys Val Lys Lys Leu 145 150 155 160 Ala Pro Leu Asn Ser Ala Ser Phe Asp Leu Ile Asn Glu Ser Lys Thr 165 170 175 Glu Ser Lys Leu Ser Lys Thr Phe Asn Tyr Thr Thr Ser Lys Thr Val 180 185 190 Ser Lys Thr Asp Asn Phe Lys Phe Gly Glu Lys Ile Gly Val Lys Thr 195 200 205 Ser Phe Lys Val Gly Leu Glu Ala Ile Ala Asp Ser Lys Val Glu Thr 210 215 220 Ser Phe Glu Phe Asn Ala Glu Gln Gly Trp Ser Asn Thr Asn Ser Thr 225 230 235 240 Thr Glu Thr Lys Gln Glu Ser Thr Thr Tyr Thr Ala Thr Val Ser Pro 245 250 255 Gln Thr Lys Lys Arg Leu Phe Leu Asp Val Leu Gly Ser Gln Ile Asp 260 265 270 Ile Pro Tyr Glu Gly Lys Ile Tyr Met Glu Tyr Asp Ile Glu Leu Met 275 280 285 Gly Phe Leu Arg Tyr Thr Gly Asn Ala Arg Glu Asp His Thr Glu Asp 290 295 300 Arg Pro Thr Val Lys Leu Lys Phe Gly Lys Asn Gly Met Ser Ala Glu 305 310 315 320 Glu His Leu Lys Asp Leu Tyr Ser His Lys Asn Ile Asn Gly Tyr Ser 325 330 335 Glu Trp Asp Trp Lys Trp Val Asp Glu Lys Phe Gly Tyr Leu Phe Lys 340 345 350 Asn Ser Tyr Asp Ala Leu Thr Ser Arg Lys Leu Gly Gly Ile Ile Lys 355 360 365 Gly Ser Phe Thr Asn Ile Asn Gly Thr Lys Ile Val Ile Arg Glu Gly 370 375 380 Lys Glu Ile Pro Leu Pro Asp Lys Lys Arg Arg Gly Lys Arg Ser Val 385 390 395 400 Asp Ser Leu Asp Ala Arg Leu Gln Asn Glu Gly Ile Arg Ile Glu Asn 405 410 415 Ile Glu Thr Gln Asp Val Pro Gly Phe Arg Leu Asn Ser Ile Thr Tyr 420 425 430 Asn Asp Lys Lys Leu Ile Leu Ile Asn Asn Ile 435 440

Claims

변형된 포어 형성 단백질을 포함하는 전립선 비대증(benign prostatic hyperplasia, BPH) 치료용 약학적 조성물로서,

상기 변형된 포어 형성 단백질은 천연 발생 포어 형성 단백질로부터 유래되고, 전립선 특이적 프로테아제에 의해 분해될 수 있는 활성화 서열 및 전립선 세포를 선택적으로 표적화할 수 있는 하나 이상의 전립선 특이적 표적 도메인으로부터 선택된 하나 이상의 전립선 선택성 변형을 포함하고, 전립선 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있는 것을 특징으로 하는, 전립선 비대증 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 변형된 포어 형성 단백질은 전립선 비대증에 대한 하나 이상의 기타 치료법과 조합되어 사용되는 것을 특징으로 하는 전립선 비대증 치료용 약학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 천연 발생 포어 형성 단백질은 아에로모나스 하이드로필라 아에로라이신(Aeromonas hydrophila aerolysin)인 것을 특징으로 하는 전립선 비대증 치료용 약학적 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 변형된 포어 형성 단백질은 서열번호 31로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선 비대증 치료용 약학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 변형된 포어 형성 단백질은 전립선 특이적 프로테아제에 의해 분해될 수 있는 활성화 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선 비대증 치료용 약학적 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 변형된 포어 형성 단백질은 전립선 특이적 표적 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선 비대증 치료용 약학적 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 변형된 포어 형성 단백질은 전립선 특이적 프로테아제에 의해 분해될 수 있는 활성화 서열, 및 하나 이상의 전립선 특이적 표적 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선 비대증 치료용 약학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 전립선 특이적 프로테아제에 의해 분해될 수 있는 활성화 서열은 상기 천연 발생 포어 형성 단백질의 천연 활성화 서열을 기능적으로 대체하는 것을 특징으로 하는 전립선 비대증 치료용 약학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 전립선 특이적 프로테아제는 전립선 특이적 항원 (PSA), 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), 또는 인간 샘 칼리크레인 2 (hK2)인 것을 특징으로 하는 전립선 비대증 치료용 약학적 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 전립선 특이적 프로테아제는 전립선 특이적 항원 (PSA)인 것을 특징으로 하는 전립선 비대증 치료용 약학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 전립선 특이적 표적 도메인은 황체형성호르몬 분비 호르몬, 또는 전립선 특이적 막 항원에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 전립선 비대증 치료용 약학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 변형된 포어 형성 단백질은 상기 천연 발생 포어 형성 단백질의 결합 도메인 내에 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선 비대증 치료용 약학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 변형된 포어 형성 단백질은 친화성 태그를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선 비대증 치료용 약학적 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 변형된 포어 형성 단백질은 전립선내 투여용으로 제형화된 것임을 특징으로 하는 전립선 비대증 치료용 약학적 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 변형된 포어 형성 단백질이 정맥내 투여용으로 제형화된 것임을 특징으로 하는 전립선 비대증 치료용 약학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 변형된 포어 형성 단백질은 프로에어로라이신의 거대엽(large lobe) 결합 도메인 내에 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선 비대증 치료용 약학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 변형된 포어 형성 단백질은 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열에 98% 또는 그 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 정상 전립선 세포에 선택적으로 표적화하고 사멸시키는 능력을 유지하며, 친화성 태그를 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선 비대증 치료용 약학적 조성물.
제 12항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이는 위치 Y162의 돌연변이, 위치 W324의 돌연변이, 위치 R323의 돌연변이, 위치 R336의 돌연변이, 및 위치 W127의 돌연변이로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 전립선 비대증 치료용 약학적 조성물.
제 18항에 있어서, 하나 이상의 돌연변이는 R336A인 것을 특징으로 하는 전립선 비대증 치료용 약학적 조성물.
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