CN101238145B - 修饰的成孔蛋白在制备治疗或预防良性前列腺增生的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种使用修饰的成孔蛋白(MPP)治疗BPH(良性前列腺增生)的方法。这些MPP衍生自天然存在的细胞毒蛋白(nPP)，所述天然存在的细胞毒蛋白通过在细胞膜中形成孔或通道而杀伤细胞，从而导致细胞死亡。MPP是通过nPP的修饰而产生的，其使得MPP能够在正常前列腺细胞上被选择性活化。所述修饰可包括将前列腺特异性蛋白酶切割位点添加至活化序列，和/或添加使得选择性靶向前列腺细胞的前列腺特异性靶向结构域。这些MPP能够在体内选择性地靶向和杀伤正常的前列腺细胞。MPP可以单独使用或与其他疗法结合用于治疗BPH。

Description

修饰的成孔蛋白在制备治疗或预防良性前列腺增生的药物中的应用

技术领域

本发明涉及良性前列腺肥大领域，且特别涉及修饰的成孔蛋白用于治疗良性前列腺增生(BPH)的用途。 

背景技术

许多溶细胞蛋白已有描述(Lesieur等，Mol.Membr.Biol.14：45064，1997)。这些天然存在的细胞毒蛋白包括哺乳动物蛋白(例如穿孔素)，和细菌蛋白，例如气单胞菌溶素(由嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)产生)、α-溶血素(由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)产生)、α-毒素(由败血梭状芽胞杆菌(Clostridium septicum)产生)、δ-毒素(由苏芸金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)产生)、炭疽保护性抗原、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)VCC毒素、葡萄球菌(Staphylococcus)杀白细胞素、硫磺菌(Laetiporus sulphureus)的LSL毒素、产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringens)的ε-毒素，以及刺胞动物(Cnidaria spp)产生的水螅溶素(hydralysin)。 

这些细胞毒蛋白中的某些，例如气单胞菌溶素原(proaerolysin)和α-毒素，作为无活性的毒素原合成。这些毒素原含有不连续的官能团，所述官能团包括使得毒素原与细胞结合的结合结构域、毒素结构域，以及或者是含有蛋白酶切割位点的N末端或C末端抑制性肽结构域。蛋白酶切割位点上的抑制性肽结构域的切割使得毒素原活化，导致质膜中的细胞毒素寡聚化，产生了导致快速的溶细胞性细胞死亡的孔(Rossjohn等，J.Struct.Biol.121：92-100，1998)。孔的形成物理上破坏细胞膜，且在细胞周期的所有阶段导致细胞死亡，包括非增殖性细胞(即G₀阻滞)。这些细胞毒素对它们能够杀伤的细胞类型而言是非特异性的，这是因为它们的结合结构域靶向存在于大多数细胞上的分子， 且它们通常由非细胞特异性的蛋白酶活化。 

溶细胞成孔蛋白或这些蛋白的修饰形式已被建议作为用于治疗癌症的潜在治疗剂。例如，美国专利第5,777,078号描述了在细胞表面受到多种条件(包括蛋白水解)活化而溶解细胞的成孔剂。这些成孔剂通常可用于破坏与动物的病理状况有关的非期望的细胞。这样的细胞包括，但不限于肿瘤细胞、病毒慢性感染的细胞，或当被不适当地调节或表达时而导致疾病状态的细胞，例如免疫系统的细胞。WO98/020135描述了与被修饰而具有选择性毒性的假单胞菌外毒素前蛋白有关的方法和组合物。通过在所述前蛋白中插入蛋白酶敏感性序列而使得此外毒素被修饰成由所需的蛋白酶活化。在一个实施例中，此外毒素被修饰成插入前列腺特异性抗原(PSA)切割位点，以用于靶向并杀伤前列腺癌细胞的目的。 

美国专利申请第2004/0235095号描述了修饰的溶细胞成孔蛋白用于治疗前列腺癌和其他癌症的用途。此溶细胞蛋白可被修饰成包括前列腺特异性切割位点，和/或前列腺特异性靶向结构域，并且可用于选择性靶向并杀伤前列腺癌细胞。 

癌症的特征为衍生自正常组织的异常细胞或赘生性细胞的数量增加，其增殖形成肿瘤块，这些赘生性肿瘤细胞侵犯邻近组织，并产生恶性细胞，所述恶性细胞最终通过血液或淋巴系统播散至区域淋巴结和通过所谓的转移的过程播散至远距离部位。在癌性的状态中，细胞在正常细胞不能生长的条件下增殖。与正常细胞不同的是，癌细胞通常持续增殖，它们不特化或变得成熟，且它们具有从机体内的起源组织向其他部位播散的能力。癌细胞的这些特征通常起因于与正常细胞内的基因表达模式相比这些细胞的基因表达相关模式的变化。开发用于治疗癌症的治疗剂的许多策略集中在利用正常细胞和癌细胞之间基因表达的差异，且使用癌细胞特异性分子标记物靶向癌细胞。 

相比较而言，良性前列腺增生(BPH，也称为良性前列腺肥大)为非癌性病症，其由前列腺生长随年龄自然进展的增大所造成。前列腺增大可以是前列腺细胞增殖增加或前列腺细胞大小增加的结果。这种进展性前列腺生长通常直到生命晚期才引起问题。国立卫生研究院(NIH)估计，60％的60多岁的美国男性具有一些BPH的症状，并且此病症影响超过90％的70多岁和80多岁的男性。世界上大约1亿1千5百万的50岁年龄以上组的男性具有不同程度的BPH。由于人口的老龄化，预期患病率在以后的20年内会显著增加。严重的BPH可引起严重的问题，例如尿路感染，膀胱和肾脏损坏，包括膀胱结石，尿失禁，且最严重的是梗阻性尿路病引起的肉眼血尿和肾衰竭。 

目前有几种用于治疗BPH的策略。这些包括观察等待，医学疗法，例如α阻断剂疗法和非那司提(finasteride)疗法，气囊扩张术和各种手术操作，例如经尿道前列腺切开术(TUIP)，经尿道前列腺切除术(TURP)，以及开放性前列腺切除术。很少有治疗方法不具有任何的不良后果，且特别是对于BPH的治疗方法来说更是如此，其中在可使用的治疗方法的益处和缺点之间具有微妙的平衡方案。在采用目前可使用的BPH治疗方法后的不良事件包括阳痿(对于各种手术操作来说，大约4％至40％，在一些内科治疗之后阳痿的发生率也增加)，尿失禁(手术后大约3％的压迫性尿失禁，总体的尿失禁接近1％)，以及需要复治。对于所公布的数据的综合分析估计，TURP的手术期间死亡率(手术操作的90天内死亡)的平均概率为1.5％。对于开放性手术来说，为2.4％，对于气囊扩张术来说，为3.5％。 

目前，最常用的激素疗法是口服施用非那司提。非那司提，可自Merck & Co.Inc.，Whitehouse Station，N.J.以商业名称Proscar^TM商购获得，其为一种合成的4-氮杂类固醇化合物，类固醇II型5α-还原酶的特异性抑制剂，以及将雄激素睾酮转化为5α-双氢睾酮(DHT)的胞内酶。非那司提有助于缩小增大的前列腺，并降低良性前列腺病症导致的PSA升高。然而，据知非那司提引起非期望的副作用，包括阳痿或性欲降 低，射精的问题，以及乳房增大，和/或乳房压痛。度他雄胺(Dutasteride，Duagen)是用于治疗BPH的另一种药物，它能够阻断I型和II型5α-还原酶。性副作用与非那司提的性副作用相似。 

目前，α-1肾上腺素受体阻断剂也用于良性前列腺增生的临床治疗。其实例包括盐酸坦索洛新、盐酸特拉唑嗪、盐酸阿夫唑嗪和甲磺酸多沙唑嗪。在施用α-1肾上腺素受体阻断剂之后，BPH的症状减轻和尿流率的改善与膀胱颈和前列腺中的α-1肾上腺素受体的阻断产生的平滑肌松弛有关。 

另外，植物甾醇和提取物也已用于治疗良性前列腺增生。 

美国专利申请第20040081659号描述了用于治疗BPH的偶联物，其包括：1)带有被PSA选择并蛋白水解切割的氨基酸序列的寡肽，2)长春花生物碱细胞毒素剂，1)与2)化学连接。理论上，此偶联物中生物碱的细胞毒活性低，并当连接键被PSA切割时增加。 

欧洲专利申请0652014描述了一种BPH的治疗方法，其包括：施用与免疫原性载体连接的PSA(前列腺特异性抗原)，以诱导抗PSA抗体的产生。也可以使用抗PSA抗体。所述免疫原性载体可为破伤风毒素、白喉毒素或霍乱毒素B链。 

美国专利第6,379,669号描述了一种将治疗剂与抗体或其片断偶联而靶向特异性器官的方法。这些偶联的治疗剂(或免疫偶联物)可用于治疗前列腺癌、BPH或前列腺炎。所包括的免疫偶联物为与不同生物活性剂连接的抗PSA的抗体。所述生物活性剂可以包括细菌毒素。相似地，在美国专利申请第20020001588号中，还探讨了抗体和不同的生物活性治疗剂的化学连接键。 

提供此背景技术信息的目的是为了公开申请人所相信与本发明可 能相关的信息。不是打算承认，而且也不应该解释为：任何先前的信息构成了抵触本发明的现有技术。 

发明概述 

本发明的目的是提供一种使用修饰的成孔蛋白治疗或预防良性前列腺增生的方法。 

根据本发明的一个方面，提供了一种用于减小受治疗者的前列腺大小的修饰的成孔蛋白，所述修饰的成孔蛋白衍生自天然存在的成孔蛋白，并且包括一个或多个前列腺选择性修饰，所述前列腺选择性修饰选自能够被前列腺特异性蛋白酶切割的活化序列；以及包括能够选择性靶向前列腺细胞的一个或多个前列腺特异性的靶向结构域，其中所述修饰的成孔蛋白能够选择性杀伤前列腺细胞。 

根据本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗良性前列腺增生(BPH)的修饰的成孔蛋白，所述修饰的成孔蛋白衍生自天然存在的成孔蛋白，并且包括一个或多个前列腺选择性修饰，所述前列腺选择性修饰选自能够被前列腺特异性蛋白酶切割的活化序列；以及包括能够选择性靶向前列腺细胞的一个或多个前列腺特异性靶向结构域，其中所述修饰的成孔蛋白能够选择性杀伤前列腺细胞。 

根据本发明的另一个方面，提供了修饰的成孔蛋白在制备用于减小受治疗者的前列腺大小的药剂中的用途，所述修饰的成孔蛋白衍生自天然存在的成孔蛋白，并且包括一个或多个前列腺选择性修饰，所述前列腺选择性修饰选自能够被前列腺特异性蛋白酶切割的活化序列；以及包括能够选择性靶向前列腺细胞的一个或多个前列腺特异性靶向结构域，其中所述修饰的成孔蛋白能够选择性杀伤前列腺细胞。 

根据本发明的另一个方面，提供了修饰的成孔蛋白在制备用于治疗良性前列腺增生(BPH)的药剂中的用途，所述修饰的成孔蛋白衍生 自天然存在的成孔蛋白，并且包括一个或多个前列腺选择性修饰，所述前列腺选择性修饰选自能够被前列腺特异性蛋白酶切割的活化序列；以及包括能够选择性靶向前列腺细胞的一个或多个前列腺特异性靶向结构域，其中所述修饰的成孔蛋白能够选择性杀伤前列腺细胞。 

根据本发明的另一个方面，提供了一种减小受治疗者的前列腺大小的方法，其包括给所述受治疗者施用有效量的修饰的成孔蛋白，所述修饰的成孔蛋白衍生自天然存在的成孔蛋白，并且包括一个或多个前列腺选择性修饰，所述前列腺选择性修饰选自能够被前列腺特异性蛋白酶切割的活化序列；以及包括能够选择性靶向前列腺细胞的一个或多个前列腺特异性靶向结构域，其中所述修饰的成孔蛋白能够选择性杀伤前列腺细胞。 

根据本发明的另一个方面，提供了一种治疗受治疗者的良性前列腺增生(BPH)的方法，其包括给所述受治疗者施用有效量的修饰的成孔蛋白，所述修饰的成孔蛋白衍生自天然存在的成孔蛋白，并且包括一个或多个前列腺选择性修饰，所述前列腺选择性修饰选自能够被前列腺特异性蛋白酶切割的活化序列；以及包括能够选择性靶向前列腺细胞的一个或多个前列腺特异性靶向结构域，其中所述修饰的成孔蛋白能够选择性杀伤前列腺细胞。 

根据本发明的另一个方面，提供了一种修饰的气单胞菌溶素原蛋白，其包括大叶结合结构域中的一个或多个突变和一个或多个前列腺特异性修饰，所述前列腺特异性修饰选自能够选择性靶向前列腺细胞的前列腺特异性靶向结构域和能够被前列腺特异性蛋白酶切割的活化序列，其中所述修饰的气单胞菌溶素原能够选择性杀伤前列腺细胞。 

附图说明

在下述参考附图的详细说明中，本发明的这些和其他特征将变得更加明显。 

图1描述了气单胞菌溶素原结构域的示意图(没有按比例画)，并显示了被弗林蛋白酶活化的结果。 

图2描述了显示溶血测定的结果的条形图，其中MPP1与人血浆或添加有酶活性的PSA的人血浆(10,000ng/ml)预温育。 

图3描述了根据本发明的实施方案将几种MPP的体外毒性与气单胞菌溶素原的体外毒性进行对比的曲线图。MPP衍生自气单胞菌溶素原，且包括置换天然弗林蛋白酶位点的PSA切割位点。 

图4A-4E为示意图(未按比例)，其显示了：根据本发明的实施方案，如何能将气单胞菌溶素原蛋白改变以产生衍生自气单胞菌溶素原的几种不同的MPP。“*”符号表示一个或多个点突变，和/或一个或多个缺失，它们降低气单胞菌溶素原结合结构域的功能(即在细胞膜中集中的能力)。 

图4A描述了野生型气单胞菌溶素原的示意图。图4B描述了一种衍生自气单胞菌溶素原的MPP的示意图，其带有被修饰成包括前列腺特异性蛋白酶切割位点的活化序列。图4C描述了一种衍生自气单胞菌溶素原的MPP的示意图，其带有被修饰成包括一个或多个前列腺特异性蛋白酶切割位点的活化序列。图4D描述了一种衍生自气单胞菌溶素原的MPP的示意图，其带有被修饰成包括前列腺特异性蛋白酶切割位点的活化序列和功能性缺失的天然结合结构域。此功能性缺失的天然结合结构域由一个或多个点突变或一个或多个缺失产生。图4E描述了一种衍生自气单胞菌溶素原的MPP的示意图，其带有被修饰成包括前列腺特异性蛋白酶切割位点的活化序列和功能性置换的天然结合结构域。此功能性缺失的天然结合结构域如图4D所述产生。在该实施方案中，在MPP的N末端或MPP的毒素结构域的C末端可以连接一个或多个前列腺特异性靶向结构域。 

图5A描述了一种衍生自气单胞菌溶素原的MPP的示意图，其带有被修饰成包括前列腺特异性蛋白酶切割位点的活化序列和功能性置换的天然结合结构域。此天然结合结构域由一个或多个点突变或一个或多个缺失修饰。一个或多个前列腺特异性靶向结构域可任选地在Y215C或A300C处与MPP连接。图5B描述了一种衍生自气单胞菌溶 素原的MPP的示意图，其带有被修饰成包括前列腺特异性蛋白酶切割位点的活化序列和功能性缺失的天然结合结构域。此天然结合结构域由气单胞菌溶素原的一个天然结合结构域缺失而功能性缺失。图5C描述了一种衍生自气单胞菌溶素原的MPP的示意图，其带有被修饰成包括前列腺特异性蛋白酶切割位点的活化序列和功能性置换的天然结合结构域。在该实施方案中，一个或多个前列腺特异性靶向结构域可与MPP的毒素结构域的N末端或MPP的毒素结构域的C末端连接。MPP的一个天然结合结构域如图5B所述缺失。图5D描述了一种衍生自气单胞菌溶素原的MPP的示意图，其带有被修饰成包括前列腺特异性蛋白酶切割位点的活化序列和功能性置换的天然结合结构域。一个或多个前列腺特异性靶向结构域可在Y215C或A300C处与MPP连接。MPP的一个天然结合结构域如图5B所述缺失。 

图6A描述了根据本发明的一个实施方案衍生自气单胞菌溶素原的MPP的示意图，其带有功能性置换的天然结合结构域。此MPP还包括一个或多个前列腺特异性靶向结构域。此MPP的天然结合结构域因一个或多个氨基酸残基的突变或缺失而功能性缺失。图6B描述了根据本发明的一个实施方案衍生自气单胞菌溶素原的MPP的示意图，其带有功能性置换的天然结合结构域。此MPP还包括在Y215C或A300C处与气单胞菌溶素原连接的一个或多个前列腺特异性靶向结构域。此MPP的天然结合结构域因一个或多个氨基酸残基的突变或缺失而功能性缺失。图6C描述了根据本发明的一个实施方案衍生自气单胞菌溶素原的MPP的示意图，其带有功能性置换的天然结合结构域。此MPP还包括一个或多个前列腺特异性靶向结构域。此天然结合结构域因气单胞菌溶素原的一个天然结合结构域缺失而功能性缺失。图6D描述了根据本发明的另一个实施方案衍生自气单胞菌溶素原的MPP的示意图，其带有功能性置换的天然结合结构域。此MPP还包括在Y215C或A300C处与气单胞菌溶素原连接的一个或多个前列腺特异性靶向结构域。此天然结合结构域因气单胞菌溶素原的一个天然结合结构域缺失而功能性缺失。 

图7描述了野生型气单胞菌溶素原的cDNA序列(SEQ ID NO：1)。 

图8描述了野生型气单胞菌溶素原的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。 

图9描述了根据本发明的一个实施方案的MPP(MPP1)的cDNA序列(SEQ ID NO：3)，其中气单胞菌溶素原的弗林蛋白酶位点被PSA切割位点置换。 

图10描述了根据本发明的一个实施方案的MPP(MPP1)的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)，其中气单胞菌溶素原的弗林蛋白酶位点被PSA切割位点置换。 

图11描述了见于人精液凝固蛋白I和蛋白II的PSA切割位点的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。 

图12描述了根据本发明的一个实施方案的MPP(MPP2)的cDNA序列(SEQ ID NO：6)，其中气单胞菌溶素原的弗林蛋白酶位点被PSA切割位点置换。 

图13描述了根据本发明的一个实施方案的MPP(MPP2)的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)，其中气单胞菌溶素原的弗林蛋白酶位点被PSA切割位点置换。 

图14描述了PSA切割位点的一个例子(SEQ ID NO：8)。 

图15描述了根据本发明的一个实施方案的MPP(MPP3)的cDNA序列(SEQ ID NO：9)，其中气单胞菌溶素原的弗林蛋白酶位点被PSA切割位点置换。 

图16描述了根据本发明的一个实施方案的MPP(MPP3)的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)，其中气单胞菌溶素原的弗林蛋白酶位点被PSA切割位点置换。 

图17描述了PSA切割位点的另一个例子(SEQ ID NO：11)。 

图18描述了根据本发明的一个实施方案的MPP(MPP4)的cDNA序列(SEQ ID NO：12)，其中气单胞菌溶素原的弗林蛋白酶位点被PSA切割位点置换。 

图19描述了根据本发明的一个实施方案的MPP(MPP4)的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)，其中气单胞菌溶素原的弗林蛋白酶位点被PSA切割位点置换。 

图20-27描述了根据本发明另外的PSA切割位点的氨基酸序列(分 别是SEQ ID NO：14-21)。 

图28描述了天然的促黄体激素释放激素(LHRH)的氨基酸序列(SEQ ID NO：22)。 

图29描述了修饰的促黄体激素释放激素(LHRH)的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)。 

图30描述了根据本发明的一个实施方案的MPP(MPP6)的氨基酸序列(SEQ ID NO：24)，其中气单胞菌溶素原的弗林蛋白酶位点被PSA切割位点置换，且气单胞菌溶素原的天然结合结构域被修饰。 

图31描述了根据本发明的一个实施方案的MPP(MPP7)的氨基酸序列(SEQ ID NO：25)，其中气单胞菌溶素原的弗林蛋白酶位点保留，且气单胞菌溶素原的天然结合结构域缺失并被SEQ ID NO：23置换。 

图32描述了根据本发明的一个实施方案的MPP(MPP5)在猴的前列腺中治疗3天后的作用。A和B描述了单独使用载体治疗的对照猴的前列腺，C和D描述了使用1μg的MPP治疗的猴的前列腺，E和F描述了使用5μg的MPP治疗的猴的前列腺，G和H描述了使用25μg的MPP治疗的猴的前列腺。 

图33描述了根据本发明的一个实施方案的MPP(MPP5)在猴的前列腺中治疗15天后的作用。A和B描述了单独使用载体治疗的对照猴的前列腺，C和D描述了使用1μg的MPP治疗的猴的前列腺，E和F描述了使用5μg的MPP治疗的猴的前列腺，G和H描述了使用25μg的MPP治疗的猴的前列腺。 

图34描述了MPP5的核苷酸序列(SEQ ID NO：30)。ATG起始密码子和TAA终止密码子加有下划线并用黑体表示。HindIII和EcoRI限制性位点为黑体文本。PSA切割位点加有下划线，且6His标签为黑体斜体文本。 

图35描述了MPP5的氨基酸序列(SEQ ID NO：31)。此氨基酸序列衍生自图34所示的核苷酸序列。427-432位氨基酸(PSA切割位点)加有下划线并用黑体表示。6His标签为黑体文本。 

图36描述了通过洗涤的红细胞的水解度测定的MPP5在前列腺组织片段的条件培养基中的活化。 

图37描述了多种物种的血清切割MPP5的能力。 

图38描述了MPP5对猴前列腺的作用。 

图39描述了在猴中对施用MPP5的体液反应。 

图40描述了野生型败血梭状芽胞杆菌α-毒素的核苷酸序列(SEQID NO：73)。 

图41描述了野生型败血梭状芽胞杆菌α-毒素的氨基酸序列(SEQID NO：74)。 

发明详述 

本发明涉及修饰的成孔蛋白用于治疗BPH的用途。所述MPP衍生自天然存在的成孔蛋白(nPP)，所述天然存在的成孔蛋白通过插入靶细胞的细胞膜中并在靶细胞的细胞膜中形成孔或通道而杀伤细胞，从而导致细胞死亡。在一个实施方案中，所述MPP不可逆地插入细胞膜中，且由此使得旁观细胞(bystander cell)不受影响。所述MPP包括前列腺选择性修饰，所述前列腺选择性修饰导致MPP具有相对于其他组织的细胞而选择性靶向正常前列腺细胞的能力。所述MPP在体内能够选择性杀伤正常前列腺细胞，并且在体内能够减小正常前列腺的重量或体积。因此，根据本发明，所述MPP可单独使用或与其他疗法结合使用用于治疗BPH。这与美国专利申请第20040235095号所述的分子大不相同，美国专利申请第20040235095号描述了修饰的溶细胞蛋白治疗局限性前列腺癌或转移性前列腺癌的用途。 

定义 

除非另有定义，本申请所使用的所有技术术语和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。 

技术和操作通常根据本领域和各种常见的参考文献的传统方法进行(通常参见Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，和Lakowicz，J.R.Principles of Fluorescence Spectroscopy，New York：Plenum Press(1983)for fluorescence techniques)。标准技术用于化学合成、化学分析，以及生物学测定。如贯穿公开内容所应用的，下述术语应理解为具有下述含义，除非另有指明。 

本申请所使用的术语“大约”是指正常值的+/-10％变化。应理解，在本申请所提供的任何给定值中总是包括这种变化，不管是否特别提及。 

本申请在提及实体(entity)或部分(moiety)时所使用的术语“前列腺特异性”是指实体/部分或实体/部分的性质与其他细胞类型相比时对于前列腺细胞的选择性。例如，前列腺特异性实体/部分可选择性地由前列腺细胞表达、选择性地与前列腺细胞相关、选择性地由前列腺细胞活化、能够选择性地结合前列腺细胞，等等。 

本申请所使用的术语“前列腺特异性活化序列”是指掺入一个或多个前列腺特异性蛋白酶切割位点的氨基酸残基的序列，其被前列腺特异性蛋白酶选择性切割或水解。 

本申请所使用的术语“前列腺特异性靶向结构域”是指诸如肽配体、毒素或抗体的分子，当与其结合其他细胞类型的能力相比时，能够选择性结合前列腺细胞。 

本申请所使用的术语“基因”是指编码各蛋白或RNA的核苷酸片段(也称为“编码序列”或“编码区”)，连同可位于所述编码序列的上游或下游的相关的调节区，例如启动子、操纵子、终止子等。 

本申请所使用的术语“选择性杂交”是指核苷酸可检测地和特异性地与另一核苷酸结合的能力。多核苷酸、寡核苷酸及其片段与靶核苷酸链在最小化可检测地结合非特异性核苷酸的可评估量的杂交和洗涤条件下选择性地杂交。高严紧性条件可用于获得如本领域已知和本申 请所述的选择性杂交条件。通常，根据传统的杂交方法在高严紧性条件下实施杂交和洗涤条件。洗涤条件通常为1-3×SSC，0.1-1％SDS，50-70℃，大约5-30分钟后更换洗涤液。 

术语“相应于”或“对应于”是指多核苷酸序列与参考多核苷酸序列的所有或一部分具有同一性。相比之下，本申请所使用的术语“互补于”是指多核苷酸序列与参考多核苷酸序列的互补链的所有或一部分具有同一性。为了描述起见，核苷酸序列“TATAC”对应于参考序列“TATAC”，并互补于参考序列“GTATA”。 

下列术语在本申请中用于描述在两个或更多多核苷酸或两个或更多多肽之间的序列关系：“参考序列”、“对比窗”、“序列同一性”、“序列同一性百分数”以及“显著同一性”。“参考序列”是用作序列对比基础的确定序列，参考序列可以为较大序列的亚组，例如作为全长cDNA、基因或蛋白质序列的片段，或可以包括完整的cDNA、基因或蛋白质序列。通常，参考多核苷酸序列为至少20个核苷酸长度，并且通常为至少50个核苷酸长度。参考多肽序列通常为至少7个氨基酸长度，并且通常为至少17个氨基酸长度。 

本申请所使用的“对比窗”是指至少15个连续核苷酸位置或至少5个连续氨基酸位置的参考序列的概念片段，候选序列可通过该片段与参考序列对比，且其中对于所述两个序列的最佳比对来说，经对比窗的候选序列的部分可包括相对于参考序列(不含有添加或缺失)20％或更少的添加或缺失(即间隔)。本发明考虑了用于对比窗的不同长度的参考序列或候选序列，以至包括全长的参考序列或候选序列。用于比对对比窗的序列的最佳比对可以使用下述方法来进行：Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.(1981)2：482)，Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J.Mol.Biol.(1970)48：443)，Pearson和Lipman的相似性检索方法(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)(1988)85：2444)，以及使用这些算法的计算机化实施方法(例如 Wisconsin Genetics Software Package Release7.0，Genetics ComputerGroup，573 Science Dr.，Madison，WI的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)、可公开获得的计算机软件例如ALIGN或Megalign(DNASTAR)进行，或通过目测进行。然后选择最佳比对(即导致经对比窗的最高同一性百分数)。 

术语“序列同一性”是指两个多核苷酸序列或多肽序列经过对比窗的同一性(即，基于核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸)。 

本申请所使用的关于参考序列的术语“序列同一性百分数(％)”被定义为候选序列中与参考多肽序列中的残基具有同一性的核苷酸或氨基酸残基的百分数，所述候选序列经对比窗在所述序列的最佳比对，和如有必要，引入间隔，以获得最大的序列同一性百分数，不考虑作为部分序列同一性的任何保守置换。 

本申请所使用的术语“显著同一性”表示多核苷酸或多肽序列的特征，其中所述多核苷酸或多肽包括经对比窗与参考序列相比具有至少50％序列同一性的序列。经对比窗与参考序列相比具有至少60％序列同一性、至少70％序列同一性、至少80％序列同一性或至少90％序列同一性的多核苷酸和多肽序列也被认为与参考序列具有显著同一性。 

本申请所使用的术语“功能性缺失”表示对基因序列做出的使得部分基因序列无功能的突变、部分或完全缺失、插入或其他改变。例如，气单胞菌溶素原(PA)结合结构域的功能性缺失导致PA结合细胞膜并在细胞膜上集中的能力降低。此功能性缺失可通过将诸如前列腺特异性靶向结构域(例如LHRH肽)的另一功能性结合结构域插入气单胞菌溶素原而逆转。本申请中这种功能性缺失的逆转被称为“功能性置换”。在另一个实施例中，天然PA弗林蛋白酶切割位点的功能性缺失导致与野生型PA分子相比PA被弗林蛋白酶切割和活化的能力降低。 

本申请可互换使用的术语“治疗”和“处置”是指为改善受治疗者的状况而进行的介入。所述改善可为主观的或客观的，并与缓解有关预防受治疗的疾病或病症的发展或改变其病理的症状相关。因此，术语“治疗”和“处置”以最广的含义使用，且包括在不同阶段预防(防止)、缓解、减轻和治愈疾病或病症。此术语还包括预防受治疗者的状况的恶化。因此，需要治疗/处置的受治疗者包括已患有疾病或病症的那些，具有发展所述疾病或病症的倾向或处于发展所述疾病或病症的风险的那些，以及要预防所述疾病或病症的那些。 

术语“缓解”包括受治疗的疾病或病症的一种或多种症状、体征和特征的临时和长期的阻断、预防、减轻或改善。 

本申请所使用的术语“受治疗者”或“患者”是指需要治疗的动物。 

本申请所使用的术语“动物”是指人类和非人类的动物，包括，但不限于哺乳类、禽类和鱼类。 

本发明蛋白质或多肽“联合”一种或多种其他治疗剂或另外的治疗而施用，意在包括同时(并行)施用和连续施用。连续施用意在包括根据不同顺序和通过不同途径将本发明的治疗剂或其他治疗和化合物施用于受治疗者。 

本申请可互换使用的术语“抗原”和“抗原物质”是指能够诱导动物的免疫反应的一个分子，多个分子，分子的一部分或多部分，或分子组合，以至包括整个细胞和组织。抗原物质可包括单个抗原表位或抗原决定簇，或可包括多个抗原表位或抗原决定簇。 

本申请所使用的术语“免疫反应”是指动物的免疫系统响应抗原或抗原物质的反应性的改变，并可涉及抗体产生、诱导细胞介导的免疫、补体活化和/或免疫耐受的发展。 

本申请所使用的术语“抑制”是指减小、减轻、减缓或预防。 

“结合对”是指相互具有亲和力的两个部分(如化学或生物化学的)。结合对的实例包括同型二聚体、异型二聚体、抗原/抗体、凝集素/亲和素、靶多核苷酸/探针、寡核苷酸、抗体/抗抗体、受体/配体、酶/配体，等等。“结合对的一个成员”是指所述对的一个部分，例如抗原或配体。 

“分离的多核苷酸”是指基因组、cDNA或合成起源的多核苷酸或它们的组合，其中就其起源来说，“分离的多核苷酸”(1)与“分离的多核苷酸”天然存在的细胞无关联，或(2)可操作性地与并非天然连接的多核苷酸连接。 

本申请所使用的术语“多肽”作为通用术语是指至少20个氨基酸长度的氨基酸序列，其可为野生型(天然存在的)蛋白质序列、野生型蛋白质序列的片段、野生型蛋白质序列的变异体、野生型蛋白质序列的衍生物，或野生型蛋白质序列的类似物。因此，如本申请所定义的，认为天然蛋白质序列和天然蛋白质序列的片段、变异体、衍生物和类似物为多肽上位概念的下位概念。 

本申请所使用的术语“分离的多肽”是指就其起源来说与正常情况下与之天然相关联的其他多肽无关联的多肽，和/或分离自正常情况下存在的细胞的多肽，和/或不含来自相同细胞来源的其他多肽的多肽，和/或由不同物种的细胞表达的多肽，和/或天然不存在的多肽。 

当本文所使用的“天然存在的”或“天然的”应用于对象时，是指对象可天然存在的事实。例如，可分离自天然来源并且未在实验室中进行有意人工修饰的存在于生物体(包括病毒)的多肽或多核苷酸序列为天然存在的。 

“可操作性连接”是指并列(juxtaposition)，其中所述组件(components)处于使得它们以所期望的方式行使功能的关系。“可操作性连接”至编码序列的对照序列以下述方式连接：在与对照序列相匹配的条件下获得编码序列的表达。 

“对照序列”是指必然影响它们所连接的编码序列和非编码序列的表达的多核苷酸序列。这些对照序列的性质根据宿主生物体而不同，在原核生物中，这些对照序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，这些对照序列通常包括启动子和转录终止序列。术语“对照序列”意在至少包括其存在可影响表达的组件，且还可包括其存在为有利的其他组件，例如，前导序列和融合的配偶体序列。 

“多核苷酸”是指至少10个碱基长度的核苷酸的多聚体形式，或核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰形式。此术语包括单链和双链形式的DNA或RNA。 

“多肽片段”是指具有氨基末端和/或羧基末端缺失，但其余氨基酸序列通常与所推导的天然存在的序列(例如全长的eDNA序列)中的相应位置同一的多肽。片段通常为至少5、6、8或10个氨基酸长度。在一个实施方案中，片段为至少14个氨基酸长度。在另一个实施方案中，片段为至少20个氨基酸长度。在又一个实施方案中，片段为至少50个氨基酸长度。在又一个实施方案中，片段为至少70个氨基酸长度。 

术语“标记”或“标记的”是指掺入可检测的标记物，例如掺入放射性标记的氨基酸或连接至可通过标记的亲和素(例如含有荧光标记物或可通过光学或比色方法检测酶活性的链亲和素)检测的多肽的生物素基部分。各种标记多肽和糖蛋白的方法为本领域已知且可以被使用。用于多肽的标记物的实例包括，但不限于下列：放射性同位素(例如 ³H、¹⁴C、³⁵S、¹²⁵I、¹³¹I)，荧光标记物(例如FITC、若丹明、稀土元素-磷光体)，酶标记物(或报道基因)  (例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶(latamase)、荧光素酶、碱性磷酸酶)，化学发光体，生物素基，二级报道基因识别的预先确定的多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标签被通过不同长度的间隔臂连接而减小潜在的空间位阻。 

天然存在的氨基酸完全通过下文指明的传统的3-字母或1-字母缩写形式识别，所述缩写形式通常为肽领域所接受，并为IUPAC-IUB的生物化学命名委员会所推荐： 

表1.氨基酸代码 

本申请所列出的肽序列根据通常接受的惯例书写，由此N末端氨基酸在左，C末端氨基酸在右。按照惯例，L氨基酸由大写字母表示，D氨基酸由小写字母表示。 

修饰的成孔蛋白(MPP) 

本发明的修饰的成孔蛋白(MPP)衍生自天然存在的成孔蛋白(nPP)，且被修饰成包括一个或多个前列腺选择性修饰，使得它们能够相对于来自其他正常组织的细胞选择性杀伤正常的前列腺细胞。相对于来自其他正常组织的细胞选择性杀伤正常的前列腺细胞是指，比起其他类型的正常细胞例如肺脏、脾脏或血液细胞，MPP能够更有效地杀伤正常的前列腺细胞。合适的MPP包括美国专利申请第20040235095号中所述的那些。 

1.天然存在的成孔蛋白(nPP) 

可衍生本发明的MPP的合适的mPP包括能够在靶细胞膜中形成孔或通道而导致细胞死亡的各种细菌毒素。合适的细菌毒素包括作为毒素原产生并接着由溶蛋白性切割活化的那些，以及以活性形式产生且不需要另外加工的那些。在一个实施方案中，所述nPP是作为毒素原合成的大细胞毒蛋白，其在活化序列处由蛋白酶切割活化，以在靶细胞的细胞膜中形成孔或通道，由此导致快速的溶细胞性细胞死亡。根据该实施方案的合适的nPP具有下列特征：通过蛋白酶切割去除抑制性结构域而活化的成孔活性，和通过一个或多个结合结构域结合存在于细胞膜上的受体的能力。已克隆了许多这样的nPP，并且制备了重组形式(见，例如，Imagawa等，FEMS.Microbiol.Lett.17：287-92，1994；Meza等，FEMS Microbiol.Lett.145：333-9，1996)。 

在一个实施方案中，MPP衍生自诸如气单胞菌溶素或气单胞菌溶素相关的多肽的nPP。其实例包括，但不限于气单胞菌溶素同系物，例如嗜水气单胞菌、易损气单胞菌(Aeromonas trota)和杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的气单胞菌溶素原，和败血梭状芽胞杆菌的α-毒素(Ballard等，Infect.Immun.63：340-4，1995；Gordon等，J.Biol.Chem.274：27274-80，1999；Genbank登录号S75954)，以及下述多肽：炭疽芽胞杆菌保护性抗原、霍乱弧菌VCC毒素、产气荚膜梭菌的ε-毒素和苏芸金芽胞杆菌的δ-毒素(Genbank登录号D00117)。 

上述的气单胞菌种的气单胞菌溶素原(PA)多肽已被表征。这些多肽之间表现出大于80％的序列配对同一性(Parker等，Progress inBiophysics & Molecular Biology 88(2005)91-142)。这些PA多肽中的每一种均为具有大约470个氨基酸残基的大约52kDa的毒素原。嗜水气单胞菌的野生型PA的cDNA序列示于SEQ ID NO：1(图7)，且此野生型PA的相应的氨基酸序列示于SEQ ID NO：2(图8)。许多天然存在的nPP的核苷酸序列和蛋白质序列为本领域已知。其非限制性实例列于下列表格中： 

表2：示例的nPP和相应的GenBank^TM登录号 

¹Husslein等，Mol.Microbiol.2(4)，507-517(1988) 

²Hirono等，Microb.Pathog.13(6)，433-446(1992) 

³Kahn等，Appl.EnViron.Microbiol.64(7)，2473-2478(1998) 

⁴Hirono等，Microb.Pathog.15(4)，269-282(1993) 

嗜水气单胞菌PA蛋白包括结合结构域(SEQ ID NO：2的大约1-83位氨基酸)和C末端抑制性肽(CIP)结构域(SEQ ID NO：2的大约427-470位氨基酸)，其中结合结构域据知为多肽的小片(small lobe)，且在本申请中被称为小片结合结构域(SBD)，C末端抑制性肽(CIP)结构域在活化序列处由蛋白酶切割去除而活化PA。在活化序列处切割 而去除CIP结构域可由多种普遍存在的蛋白酶(包括弗林蛋白酶和胰蛋白酶)进行。SEQ ID NO：2的大约84-426位氨基酸残基据知为PA多肽的大叶(large lobe)，且含有毒素结构域和其他功能性的结构域——包括第二结合结构域，其在本申请中被称为大叶结合结构域(LBD)。野生型嗜水气单胞菌PA的cDNA序列示于SEQ ID NO：1。 

基于显著的序列同一性和其他相似性，败血梭状芽胞杆菌的α-毒素被认为是气单胞菌溶素原的同系物(Parker等，见上文)。α-毒素作为46,450Da的毒素原(大约443个氨基酸)分泌，该毒素原在活化序列处由蛋白酶切割去除C末端抑制性肽(CIP)结构域而活化，并且α-毒素还结合糖基-磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白。然而，α-毒素不具有对应于PA的小片的区域。该多肽的活化通过在弗林蛋白酶切割位点处由蛋白酶切割而发生(Gordon等，Infect.Immun.65：4130-4，1997)。败血梭状芽胞杆菌α-毒素核苷酸序列的一个实例在GenBank^TM登录号S75954(SEQ ID NO：73，图40)中提供，败血梭状芽胞杆菌α-毒素蛋白质序列的一个实例在GenBank^TM登录号AAB32892(SEQ ID NO：74，图41)中提供。基于序列同源性，α-毒素被认为具有相似的结构和相似的结合GPI锚定蛋白的能力。 

苏芸金芽胞杆菌δ-毒素的活化序列由某些昆虫的中肠蛋白酶切割而产生活性的内毒素(Miranda等，Insect Biochem.Mol.Biol.31：1155-63，2001)。该内毒素的结构已经解决，并显示由三个结构域—通道形成结构域、结合结构域以及稳定结构域组成。 

在一个实施方案中，根据本发明的MPP衍生自气单胞菌溶素原多肽。在另一个实施方案中，MPP衍生自嗜水气单胞菌的气单胞菌溶素原多肽。在本发明的另一个实施方案中，MPP衍生自α-毒素多肽。 

在另一个实施方案中，MPP衍生自不需要蛋白酶切割活化的nPP，且因此不具有活化序列。这些nPP可被修饰成向所述nPP插入前列腺 特异性蛋白酶切割位点，以产生能够被选择性活化而杀伤前列腺细胞的MPP。这些nPP的实例包括金黄色葡萄球菌α-溶血素。对于所述nPP，如本领域已知，活化序列可被插入成孔结构域的中心(Panchal等，(1996)Nat.Biotech.14：852-856)。 

本发明还包括衍生自nPP的生物活性片段的MPP。nPP的生物活性片段为能够形成孔并杀伤细胞的那些。合适的片段包括能够在靶细胞中通过去除CIP结构域而被活化形成孔的那些。例如，对于PA，合适的片段为包括蛋白质的结合结构域和CIP结构域以及活化序列的片段。因此，在本发明的一个实施方案中，MPP衍生自包括结合结构域、CIP结构域以及活化序列的气单胞菌溶素原的片段。在另一个实施方案中，MPP衍生自包括结合结构域、活化序列，仅部分CIP结构域的气单胞菌溶素原的片段。 

2.前列腺特异性修饰 

根据本发明，所选的nPP被修饰形成包括一个或多个前列腺特异性修饰的MPP。本发明所考虑的前列腺特异性修饰包括掺入前列腺特异性活化序列，和/或一个或多个结合结构域的功能性缺失(包括功能性置换)，和/或添加前列腺特异性靶向结构域。 

在一个实施方案中，根据本发明的MPP包括使得前列腺细胞的MPP选择性活化的前列腺特异性活化序列。前列腺特异性活化序列可通过对nPP的天然存在的活化序列修饰而产生，或它可以通过向不具有天然存在的活化序列的nPP添加前列腺特异性活化序列而产生。在另一个实施方案中，MPP包括前列腺特异性活化序列和一个或多个前列腺特异性靶向结构域。在另一个实施方案中，MPP包括前列腺特异性活化序列和对SBD的修饰。在另一个实施方案中，MPP包括前列腺特异性活化序列和对LBD的修饰。 

在一个实施方案中，根据本发明的MPP包括使得前列腺细胞的 MPP选择性活化的一个或多个前列腺特异性靶向结构域。在另一个实施方案中，MPP包括一个或多个前列腺特异性靶向结构域和对SBD的修饰。在另一个实施方案中，MPP包括前列腺特异性靶向结构域和对LBD的修饰。 

在又一个实施方案中，MPP包括前列腺特异性活化序列、一个或多个前列腺特异性靶向结构域以及对LBD的修饰。在另一个实施方案中，MPP包括前列腺特异性活化序列、一个或多个前列腺特异性靶向结构域以及对SBD的修饰。 

在一个实施方案中，MPP包括前列腺特异性活化序列和对天然结合结构域的一个或多个修饰。在另一个实施方案中，MPP包括前列腺特异性靶向结构域和对天然结合结构域的一个或多个修饰。在又一个实施方案中，MPP包括前列腺特异性活化序列、前列腺特异性靶向结构域和对天然结合结构域的一个或多个修饰。 

可对气单胞菌溶素原进行的前列腺特异性修饰的组合的代表性非限制性实例示于图4、5和6。 

活化序列的修饰 

如上所述，nPP可通过对天然存在的活化序列修饰以提供前列腺特异性活化序列而被修饰成掺入前列腺特异性活化序列，或前列腺特异性活化序列可被添加至不具有天然存在的活化序列的nPP。根据本发明的前列腺特异性活化序列是掺入一个或多个前列腺特异性蛋白酶切割位点的氨基酸序列。前列腺特异性蛋白酶切割位点是被前列腺特异性蛋白酶识别并选择和有效水解(切割)的氨基酸序列。在一个实施方案中，前列腺特异性蛋白酶是较其他细胞类型在前列腺细胞中更高水平表达的蛋白酶。前列腺特异性蛋白酶的实例包括，但不限于：PSA(前列腺特异性抗原)，PSMA(前列腺特异性膜抗原)，以及HK2(人腺体激肽释放酶2)切割序列。由这些前列腺特异性蛋白酶识别的 切割位点的许多实例为本领域已知，并将在下文进一步描述。 

对天然存在的活化序列修饰而提供前列腺特异性蛋白酶活化序列可如本领域已知的来实现。天然存在的活化序列的修饰导致天然活化序列功能性缺失。功能性缺失可通过突变、部分或完全缺失、插入或对天然存在的活化序列做出的导致其失活的其他变化来实现。在一个实施方案中，nPP的天然存在的活化序列通过插入前列腺特异性活化序列而功能性缺失。在另一个实施方案中，天然存在的活化序列的功能性缺失通过产生前列腺特异性活化序列的天然活化序列的一个或多个氨基酸残基中的突变来实现。在一个备选实施方案中，nPP的天然存在的活化序列通过使用前列腺特异性蛋白酶切割位点取代活化序列的天然蛋白酶切割位点而功能性缺失。 

在一个实施方案中，一个或多个前列腺特异性蛋白酶切割位点功能性置换MPP的天然蛋白酶切割位点。例如，前列腺特异性蛋白酶切割位点可功能性置换PA的天然弗林蛋白酶切割位点(见图4B)。该置换产生了在具有酶活性的前列腺特异性蛋白酶(例如PSA、PSMA或HK2)存在下变得具有溶细胞活性的MPP。合适的PSA、PSMA或HK2切割位点为本领域已知，并在下文描述。 

在本发明的另一个实施方案中，根据本发明的MPP可通过缺失nPP的天然蛋白酶切割位点和插入前列腺特异性活化序列而产生。例如，可缺失PA的弗林蛋白酶切割位点(SEQ ID NO：2的427-432位氨基酸)，和插入前列腺特异性蛋白酶切割位点——例如PSA切割位点(见图4B)。 

在另一个实施方案中，nPP的天然蛋白酶切割位点被突变，使得它不再具有功能，且前列腺特异性活化序列被插入突变的蛋白酶切割位点内，或添加至天然的蛋白酶切割位点的N末端或C末端。例如，PA的弗林蛋白酶切割位点可被致突变，并且前列腺特异性蛋白酶切割 位点(例如PSA切割位点)可插入突变的弗林蛋白酶位点内或添加至突变的弗林蛋白酶位点的N末端或C末端(见图4C)。 

在又一个实施方案中，前列腺特异性活化序列被添加至不具有天然存在的活化序列的nPP。例如，不需要蛋白酶切割以活化而杀伤细胞的金黄色葡萄球菌α-溶血素，可被设计成包括一个或多个前列腺特异性蛋白酶切割位点，由此使得它能够被选择性活化而杀伤前列腺细胞。 

前列腺特异性切割位点 

如上所述，各种前列腺特异性蛋白酶及其识别的蛋白酶切割位点为本领域已知。其实例包括，但不限于PSA、PSMA以及HK2。 

在一个实施方案中，MPP被修饰成包括含有PSA特异性切割位点的前列腺特异性活化序列。PSA特异性切割位点为由前列腺特异性抗原(PSA)识别并选择和有效水解(切割)的氨基酸序列。PSA是具有识别和水解特异性肽序列能力的丝氨酸蛋白酶。它以酶活性形式由前列腺细胞分泌，并当进入循环时失活。由于血液或除前列腺以外的正常组织均不含有具有酶活性的PSA，因此PSA的蛋白水解活性可用于活化前列腺的MPP。各PSA特异性切割位点为本领域已知。其实例包括，但不限于SEQ ID NO：5、8、11和14-21所示的那些，以及美国专利第5,866,679、5,948,750、5,998,362、6,265,540、6,368,598和6,391,305所公开的那些。在一个实施方案中，MPP具有包括SEQ ID NO：5所示的PSA切割位点的活化序列。 

根据人精液凝固蛋白I和蛋白II的PSA切割图谱和基于纤维素膜的测定(见表3和Denmeade等，Cancer Res.，57：4924-30，1997)，其他的PSA特异性切割位点为已知，并可用于产生本发明的修饰的MPP。例如，本发明的MPP可被修饰成包括表3所示的PSA切割位点中的一个，如本领域已知，该PSA切割位点可取代气单胞菌溶素原的野生型弗林蛋白酶活化位点(SEQ ID NO：2的427-432位氨基酸)。 

在一个实施方案中，MPP具有SEQ ID NO：3、4、6、7、9、10、12、13和24的任一个的氨基酸序列，所述氨基酸序列包括含有PSA切割位点的活化序列。 

表3：PSA底物(PSA切割位点)和PSA水解的动力学^*

^*肽被荧光标记(氨甲基香豆素)。在50mM Tris，0.1M NaCl，pH7.8中进行测定。 

在另一个实施方案中，MPP包括含有PSMA特异性切割位点的前列腺特异性活化序列。合适的PSMA特异性切割位点的实例为本领域已知，且可见于例如国际公布第WO 02/43773号。一般来说，PSMA切割位点包括至少二肽X₁X₂。该二肽在X₁位置处含有氨基酸Glu或Asp。X₂可为Glu、Asp、Gln或Asn。三肽X₁X₂X₃也是合适的，其中X₁和X₂为如上所定义的，X₃为Glu、Asp、Gln或Asn。四肽X₁X₂X₃X₄ 也是合适的，其中X_1-3为如上所定义的，X₄为Glu、Asp、Gln或Asn。五肽X₁X₂X₃X₄X₅也是合适的，其中X_1-4为如上所定义的，X₅为Glu、Asp、Gln或Asn。六肽X₁X₂X₃X₄X₅X₆也是合适的，其中X_1-5为如上所定义的，X₆为Glu、Asp、Gln或Asn。更长序列长度的其他肽可以以相似方式构建。通常，所述肽具有下列序列：X₁…X_n，其中n为2至 30、2至20、2至15或2至6，其中X₁为Glu、Asp、Gln或Asn。在一个实施方案中，X₁为Glu或Asp，且X₂-X_n独立选自Glu、Asp、Gln和Asn。其他可能的肽序列如上所述，除了X₂-X_n-1独立选自Glu和Asp，以及X_n独立选自Glu、Asp、Gln和Asn。PSMA切割位点的实例为Asp-Glu、Asp-Asp、Asp-Asn、Asp-Gln、Glu-Glu-Glu、Glu-Asp-Glu、Asp-Glu-Glu、Glu-Glu-Asp、Glu-Asp-Asp、Asp-Glu-Asp、Asp-Asp-Glu、Asp-Asp-Asp、Glu-Glu-Gln、Glu-Asp-Gln、Asp-Glu-Gln、Glu-Glu-Asn、Glu-Asp-Asn、Asp-Glu-Asn、Asp-Asp-Gln，以及Asp-Asp-Asn。 

在另一个实施方案中，MPP包括含有HK2特异性切割位点的前列腺特异性活化序列。HK2特异性切割位点的实例也为本领域已知，且在例如国际公布第WO 01/09165号中有所描述。HK2识别的切割位点侧翼至少氨基酸序列X₄X₃X₂X₁。该氨基酸序列在X₁位置处含有氨基酸精氨酸、组氨酸或赖氨酸。X₂可为精氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸或组氨酸。X₃可为赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、组氨酸或谷氨酰胺。X₄可为0至20个其他的氨基酸，并可为至少两个其他的氨基酸。在一个实施方案中，HK2切割位点包括X₄的序列，该序列与野生型精液凝固蛋白I或精液凝固蛋白II序列的20个氨基酸基本同一，所述20个氨基酸为被识别的精液凝固蛋白切割位点的N末端侧的第4至第24个氨基酸。所述氨基酸序列可进一步包括X_-1，它与X₁的羧基端连接形成氨基酸序列X₄X₃X₂X₁X_-1。X_-1具有达10个的其他氨基酸，并可包括不同的氨基酸。X₁可具有与X₁的羧基端连接的亮氨酸、丙氨酸或丝氨酸。X_-1 可包括L或D氨基酸。HK2切割位点位于X₁的羧基端侧。 

HK2切割位点的实例示于表4(注意：符号)[表示HK2切割位点]]： 

表4：示例的HK2切割位点 

[0146] 前列腺特异性靶向结构域的添加 

在本发明的一个实施方案中，MPP包括一个或多个前列腺特异性靶向结构域，它们允许选择性靶向前列腺细胞。前列腺特异性靶向结构域能够引导MPP至前列腺细胞，在那里使MPP活化，并随后杀伤前列腺细胞。靶向结构域可以位于MPP的N末端或C末端，或者同时位于两者。可选地，靶向结构域可以位于MPP的其他区域，前提是其不影响MPP的成孔活性。 

合适的前列腺特异性靶向结构域的实例包括，但不限于诸如肽配体、毒素或者抗体这些对前列腺细胞比对其他细胞类型具有更高特异性的分子。在一个实施方案中，前列腺组织特异性结合结构域在前列腺组织或细胞中具有比在其他细胞类型中更低的K_D值(即与其他正常组织相比能够选择性地结合前列腺组织)，例如至少低10倍的K_D，至少低20倍、50倍、75倍、100倍或甚至低200倍的K_D。这些分子可用于将MPP靶向至前列腺。其实例包括，但不限于：识别具有相对前列腺特异性的蛋白质(诸如PSA、PSMA、HK2、prostasin和hepsin)的抗体；具有前列腺特异性受体的配体——诸如天然和人工合成的促黄体激素释放激素(LHRH)；以及内皮素(与同源的内皮素受体结合)。 

在本发明的一个实施方案中，前列腺特异性靶向结构域的添加导致nPP的天然结合结构域功能性缺失。在另一个实施方案中，气单胞菌溶素原的天然非特异性GPI锚定蛋白结合结构域功能性缺失，并置换为前列腺特异性靶向结构域。图4D和图5B描述了衍生自气单胞菌溶素原的MPP的具体实例，这些MPP具有功能性缺失的天然结合结构域。图4E、图5A、图5C和图5D以及图6A-6D显示了衍生自气单胞菌溶素原的MPP的实例，这些MPP包括能够功能性取代气单胞菌溶素原的天然结合结构域的前列腺特异性靶向结构域。 

一个或多个前列腺组织特异性结合结构域能够与MPP的一个或多个氨基酸连接，而且理想地不明显干扰在细胞膜中形成孔的能力，或 在适用的情况下，不明显干扰MPP被前列腺特异性的蛋白酶如PSA活化的能力。蛋白质或肽与MPP的接合方法为本领域已知，并包括，例如，在与前列腺组织特异性结合结构域连接之前改变蛋白质的N末端氨基酸修饰成Cys或其他氨基酸的，以有助于前列腺组织特异性结合结构域与MPP的连接。 

在一个实施方案中，前列腺组织特异性结合结构域连接至或是插入至衍生自气单胞菌溶素原的MPP的N末端和/或C末端(例如，见图4E和图5C)。在一些实施例中，气单胞菌溶素原的天然结合结构域缺失(即SEQ ID NO：2或4的1-83位的氨基酸)，使得前列腺组织特异性结合结构域与N末端的连接或相连导致连接至SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的84位氨基酸(例如，见图5C和图6C)。在其他的实施例中，向气单胞菌溶素原的天然结合结构域中引入较小的缺失或点突变，使得前列腺组织特异性结合结构域与N末端的连接或相连导致连接至SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的第1位氨基酸(或任何一个在气单胞菌溶素原天然结合结构域功能性缺失之后的N末端的氨基酸)(例如，见图4E和图5D)。 

作为前列腺特异性靶向结构域的抗体 

在一个实施方案中，前列腺特异性靶向结构域是一种特异性结合于与前列腺细胞相关的抗原的抗体或者抗体片段，由此将MPP靶向前列腺细胞。可以被所述前列腺特异性靶向结构域特异性结合的与前列腺细胞相关的抗原包括PSA、PSMA和LHRH受体，它们在前列腺细胞中的表达量升高。可以使用现有技术中公知的基因融合的方法将抗体与MPP的N末端或C末端相连(例如，参见Debinski和Pastan，Clin.Cancer Res.1：1015-22，1995)。可选地，可以通过共价交联将抗体与MPP相连(例如，参见Woo等，Arch.Pharm.Res.22(5)：459-63，1999；Debinski和Pastan，Clin.Cancer Res.1(9)：1015-22，1995)。交联可以是非特异性的，如利用同型双功能-赖氨酸反应性交联剂；或者，交联也可以是特异性的，如利用与抗体上的氨基和与位于MPP上的半胱氨 酸残基反应的交联剂。在一个实施方案中，气单胞菌溶素原的氨基酸诸如SEQ ID NO：2的Cys19、Cys75、Cys159和/或Cys164可用于将抗体与修饰的气单胞菌溶素原分子交联。例如，抗体可以取代待被修饰的nPP的天然结合结构域；或者抗体能够添加至天然结合结构域中已经具有突变的MPP。这样的MPP还可以包括增加其特异性的前列腺特异性活化序列。在一个实施方案中，抗体是与PA毒素结构域融合的PSMA的单链抗体。 

合适的抗体包括完整的抗体以及抗体片段，例如，诸如(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，Nature 341：544-6，1989)；(v)分离的互补决定区(CDR)；和(vi)F(ab′)2片段，其为包括两条在绞链区通过二硫桥键连接起来的Fab片段的二价片段。合适的抗体包括单链的Fv抗体和骆驼化抗体(例如，见Tanha等，J.Biol.Chem.276：24774-80，2001)，其中单链的Fv抗体是通过重组的方法使Fv片段的两个结构域通过合成的连接体(linker)连接来制备的(Bird等，Science 242：423-6，1988；和Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-83，1988)。 

在另一个实施方案中，抗体片段能够交联其靶抗原，例如，诸如F(ab′)2片段的二价片段。或者，本身不能跟其靶抗原交联的抗体片段(如Fab片段)可连同用以交联抗体片段的二级抗体一起使用，从而与靶抗原交联。可使用常规技术使抗体片段化，并如针对完整抗体所述的和本领域已知的相同方法筛选片段的实用性。抗体还意在包括特异性结合靶抗原的纳米抗体、双特异性分子和嵌合体分子。 

“特异性结合”，当用于提及抗体时，是指各抗体与特定抗原特异性地发生免疫反应的能力。抗体分子与抗原的抗原决定簇的结合是非随机的结合反应。合需的结合特异性一般是由抗体对特定的和无关的 抗原的不同结合能力的参考点来决定的，并因此区别两种不同的抗原，尤其是两种具有独特表位的抗原。特异性结合特定表位的抗体被称为“特异性抗体”。 

作为前列腺特异性靶向结构域的小肽配体 

在一个实施方案中，前列腺特异性靶向结构域是与表达于前列腺细胞膜上的关联(cognate)的前列腺特异性受体相结合的小肽配体。其实例包括，但不限于以高亲和力与LHRH受体结合的天然和合成的促黄体激素释放激素(LHRH)激动剂肽(例如，见Genbank登录号CAA25526和SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23)，和能够选择性地结合PSMA的肽。前列腺细胞以及仅少数其他细胞展示有LHRH受体。这种差异性表达提供了结合的特异性。 

可如本领域已知对小肽配体进行修饰，以促进其与MPP连接。例如，LHRH的某些残基，如第6位的Gly(Gly6)可以被取代而不影响受体结合亲和力(Janaky等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：972-6，1992；Nechushtan等，J.Biol.Chem.，272：11597-603，1997)。因此，MPP(其中天然结合结构域功能性缺失)可以通过与纯化的LHRH D-Lys6(该赖氨酸的ε-胺)共价偶联而产生。 

LHRH D-Lys6(SEQ ID NO：23)可以在nPP内的不同位置连接而提供具有前列腺特异性靶向结构域的MPP。如上所述，小肽配体的连接不会显著干扰毒素插入膜形成孔的能力。例如，可使用本领域已知的方法如通过二羧酸连接体将D-Lys6类似物的ε-胺与MPP的氨基末端偶联。通过活化序列的切割而引起的MPP的活化将导致C末端抑制性部分的释放，而毒素仍然与LHRH受体结合。 

可选地或另外，小肽配体可以直接与MPP的C末端偶联。例如，LHRH的D-Lys6类似物的ε-胺能够通过下述方式直接与MPP的C末端羧基偶联：在MPP的C末端添加Cys，然后使这个Cys与LHRH的 D-Lys6类似物的ε-胺交联。这种偶联将产生其中LHRH肽与C末端抑制性结构域相连的MPP。通过活化序列的切割引起的MPP的活化将释放出MPP，并且留下抑制性片段与LHRH受体结合。另外，可以制备其中修饰的LHRH肽与MPP的N末端和C末端两者融合的重组融合蛋白。 

还考虑了小肽配体可以通过二硫桥键与MPP连接。例如，向LHRH肽的第6位引入半胱氨酸残基，并且该肽通过二硫桥键与MPP连接。天然的nPP序列中可以存在肽与之形成二硫桥键的半胱氨酸，或者nPP可突变成包括半胱氨酸残基。在一个实施方案中，衍生自PA的MPP可以在例如SEQ ID NO：2的215和/或300位氨基酸处引入半胱氨酸残基，其中215和/或300位氨基酸突变成半胱氨酸。 

在另一个实施方案中，制备了其中LHRH肽与MPP的氨基末端融合的重组蛋白。 

可选地或另外，MPP可以通过一个或多个前列腺特异性靶向结构域与MPP的其他氨基酸的连接或相连而产生。例如，对于衍生自气单胞菌溶素原的MPP而言，诸如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的215或300位氨基酸的氨基酸(例如，见图5A、图5D、图6B和图6D)可以用于与一个或多个前列腺特异性靶向结构域连接。在一些实施例中，Cys氨基酸取代了原有位置的天然氨基酸。例如，可以对SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4做如下改变：Tyr215Cys或Ala300Cys。可选地，可以利用存在于nPP天然序列的半胱氨酸残基。对于衍生自气单胞菌溶素原的MPP而言，诸如SEQ ID NO：2的Cys19、Cys75、Cys159和/或Cys164氨基酸的氨基酸适用于此目的。 

在一个实施方案中，MPP衍生自气单胞菌溶素原，且具有选自SEQID NO：24和SEQ ID NO：25的序列，它们包括作为前列腺特异性靶向结构域的LHRH。 

MPP天然结合结构域的修饰 

本发明的MPP衍生自本领域已知的含有一个或多个结合结构域的nPP。在本发明的全文中，当nPP包括一个结合结构域时，则被认为是“大叶结合结构域”。根据适用范围，本发明的MPP可以包括一个或多个结合结构域的修饰。例如，气单胞菌种的天然的气单胞菌溶素原包括两个结合结构域：小片结合结构域和大叶结合结构域。相比之下，败血梭状芽胞杆菌的天然的α-毒素仅包括大叶结合结构域。在一个实施方案中，结合结构域的修饰包括结合结构域的功能性缺失。MPP中功能性缺失的结合结构域导致MPP与其细胞表面受体结合能力减退，但是仍然保留成孔能力。功能性缺失可以通过MPP的一个或多个结合结构域的缺失或突变而产生。在一个实施方案中，整个结合结构域或其部分可缺失。在另一个实施方案中，将异源序列插入至结合结构域，也可以用于使结合结构域功能性缺失。这些异源序列的添加可以赋予MPP其他的功能(即结合结构域的功能性置换)。例如，异源序列的添加可以导致添加作为本申请所述的前列腺特异性靶向结构域而起作用的区域。在又一个实施方案中，也可以对nPP天然结合结构域的氨基酸序列进行点突变，以降低结合结构域与其受体结合的能力。有关这些修饰的其他细节在下文描述。 

缺乏结合结构域的MPP保留其溶细胞活性，但是需要以较高剂量施用以确保细胞膜中毒素的浓度。可使用本领域已知的方法来制备具有结合结构域功能性缺失的MPP。这些方法包括如Sambrook等(如上文所述)所述的DNA重组技术的使用。可选地，还可以根据本领域已知的方法通过蛋白质自身的直接修饰实现结合结构域的功能性缺失，例如蛋白水解产生MPP片段，然后这些片段可以利用化学方法连接在一起。 

在本发明的一个实施方案中，MPP通过它的小片结合结构域(SBD)的功能性缺失而被修饰。示例的SBD的功能性缺失可以如下 文所述在嗜水气单胞菌的气单胞菌溶素原多肽中进行。整个SBD，即对应于SEQ ID NO：2的1-83位氨基酸可以缺失，或者该区域的部分如SEQ ID NO：2的45-66位氨基酸可以缺失。可选地，可以如下文所述在W45A、I47E、M57A、Y61A、K66Q(氨基酸编号涉及SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4)并如Mackenzie等，J.Biol.Chem.274：22604-22609，1999中所述进行点突变。描述在结合结构域中具有一个或多个突变的MPP的实例的示意图示于图4D，其中*表示一个或多个突变或缺失。 

在本发明的一个实施方案中，nPP通过其大叶结合结构域(LBD)的功能性缺失而被修饰。气单胞菌溶素原的LBD(含在SEQ ID NO：2的大约84-426位氨基酸残基中)的典型功能性缺失可以按下述方法来提供MPP。气单胞菌溶素原的整个LBD可以缺失。可选地，在本发明的一个实施方案中，衍生自气单胞菌溶素原的MPP的LBD区域包括氨基酸残基Y162、W324、R323、R336和/或W127的一个或多个点突变。在本发明的另一实施方案中，衍生自气单胞菌溶素原的MPP在W127和/或R336位置包括一个或多个点突变。在又一个实施方案中，衍生自气单胞菌溶素原的MPP包括点突变Y162A和/或W324A。在另一个实施方案中，衍生自气单胞菌溶素原的MPP包括点突变R336A、R336C和/或W127T。在另一个实施方案中，MPP包括与GPI蛋白配体直接相互作用的其他残基的突变。 

衍生自α-毒素的MPP的LBD的典型突变如下所述，并包括α-毒素受体结合结构域中的至少一个取代的氨基酸，所述α-毒素受体结合结构域包括SEQ ID NO：33所示的天然的α-毒素序列的53、54、62、84-102、259-274和309-315位氨基酸残基。在本发明的一个实施方案中，衍生自α-毒素的MPP包括如下一个或多个残基的突变：W85、Y128、R292、Y293和R305。 

MPP的进一步修饰 

本发明考虑了不影响MPP选择性靶向前列腺细胞的能力的MPP 的进一步修饰。这些修饰包括氨基酸的取代、插入或者缺失、减少MPP抗原性的修饰，以及增强MPP稳定性或改善MPP的药代动力学的修饰。在一个实施方案中，对MPP的进一步修饰产生仅少数氨基酸与MPP不同的多肽。这些修饰包括缺失(例如1-3或更多的氨基酸)、插入(例如1-3或更多的残基)或取代，它们不影响MPP选择性靶向并杀伤正常前列腺细胞的能力。在一个实施方案中，对MPP的进一步修饰产生下述多肽：即其保留与MPP具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或更高的序列同一性，并维持MPP选择性靶向并杀伤正常前列腺细胞的能力。 

MPP可以通过取代来进行修饰，借此，氨基酸序列中的至少一个残基被去除，且不同的残基在其位置插入。在一个实施方案中，取代为保守置换。保守置换是指用具有相似生化特性的氨基酸残基来取代一个或多个氨基酸(例如2、5或10个残基)。通常，保守置换对产生的多肽的活性几乎没有影响。例如，理想地，含有一个或多个保守置换的MPP保留对应的nPP的活性。用于取代蛋白质的初始氨基酸并被认为是保守置换的氨基酸的实例包括：Ser取代Ala；Lys取代Arg；Gln或His取代Asn；Glu取代Asp；Ser取代Cys；Asn取代Gln；Asp取代Glu；Pro取代Gly；Asn或Gln取代His；Leu或Val取代Ile；Ile或Val取代Leu；Arg或Gln取代Lys；Leu或Ile取代Met；Met、Leu或Tyr取代Phe；Thr取代Ser；Ser取代Thr；Tyr取代Trp；Trp或Phe取代Tyr；以及Ile或Leu取代Val。 

可使用例如标准方法如定点诱变或PCR对编码多肽的核苷酸序列进行操作来将MPP修饰成包括一个或多个保守置换。关于保守置换的其他信息除了其他处以外还可见于：Ben-Bassat等，(J.Bacteriol.169：751-7，1987)；O′Regan等，(Gene 77：237-51，1989)；Sahin-Toth等，(Protein Sci.3：240-7，1994)；Hochuli等，(Bio/Technology 6：1321-5，1988)；WO 00/67796(Curd等)以及遗传学和分子生物学标准教科书。 

在另一个实施方案中，这种取代是允许的取代。允许的取代是氨基酸的非保守置换，但是也不明显改变MPP活性。例如，在气单胞菌溶素原多肽序列SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的第300位用Cys取代Ala。 

在一个实施方案中，MPP被修饰成包括单个残基的一个或多个氨基酸取代。在另一个实施方案中，MPP被修饰成包括一个氨基酸取代。在另一个实施方案中，MPP被修饰成包括大约2个至大约10个氨基酸取代。在另一个实施方案中，MPP被修饰成包括大约3个至大约5个氨基酸取代。 

衍生自气单胞菌溶素原的MPP进一步修饰的非限制性实例列于表5。 

表5：衍生自天然气单胞菌溶素原多肽的MPP的示例的单个突变 

还考虑了拟肽(peptidomimetic)和拟有机物(organomimetic)的实施方案，由此所述拟肽和拟有机物的化学组分的三维排列模拟多肽 骨架和多肽的氨基酸侧链组件的三维排列，从而产生具有溶解前列腺细胞的能力的MPP的所述拟肽和拟有机物。对于计算机模型的应用，药效基团是理想化的，具有生物学活性需要的结构的三维空间定义。利用目前的计算机模型软件(使用计算机辅助的药物设计或CADD)来设计拟合各药效基团的拟肽和拟有机物，见Walters，″Computer-Assisted Modeling of Drugs″，in Klegerman & Groves，eds.，1993，Pharmaceutical Biotechnology，Interpharm Press：Buffalo Grove，Ill.，第165-174页和Principles of Pharmacology(ed.Munson，1995)，102章关于CADD使用技术的描述。 

对MPP所做的其他修饰包括，例如，对于MPP的无论位于羧基末端或侧链的羧酸基团的修饰，其中这些基团为药学上可接受的阳离子的盐形式，或被酯化形成C₁-C₁₆酯，或转化为式NR₁R₂的酰胺，其中R₁和R₂为各自独立的H或者C₁-C₁₆烷基，或组合形成杂环，诸如5元环或6元环。不管是氨基末端还是侧链的多肽的氨基，都可为药学上可接受的酸加成盐的形式，诸如HCl盐、HBr盐、乙酸盐、苯甲酸盐、甲苯磺酸盐、马来酸盐、酒石酸盐以及其他有机盐，或可以修饰成C₁-C₁₆烷基或二烷基氨基或进一步转化为酰胺。 

其他修饰包括使用公知技术将多肽侧链的羟基转化成C₁-C₁₆烷氧基或转化成C₁-C₁₆酯。多肽侧链的苯环和酚环可以用诸如F、Cl、Br或者I的一个或多个卤素原子来取代，或者用C₁-C₁₆烷基、C₁-C₁₆烷氧基、羧酸及其酯类，或这些羧酸的酰胺来取代。多肽侧链的亚甲基可以扩展至同系的C₂-C₄亚烷基。巯基可以用许多公知的保护基团中的任何一种来保护，如乙酰胺基团。本领域技术人员也会知道将环状结构引入本申请所述的多肽以选择和提供导致稳定性增强的对于结构的构象约束的方法。例如，可以将羧基末端或氨基末端半胱氨酸残基添加至多肽，使得当多肽被氧化时含有二硫键，从而产生环肽。其他肽环化的方法包括硫醚、羧基末端和氨基末端酰胺以及酯类的形成。 

本发明还考虑到对MPP进行进一步的修饰，其中将MPP连接或者固定至诸如珠的表面。所述珠还可包括增加对前列腺细胞靶向性的前列腺特异性配体。固定化的指的是结合至表面，如固体表面。固体表面可以是聚合物的，如聚苯乙烯或聚丙烯。固体表面可以是珠的形式。在一个实施方案中，表面包括固定化的MPP，而在其他实施方案中还包括一个或多个前列腺特异性结合配体，如LHRH肽、PSMA抗体以及PSMA单链抗体。在另一个实施方案中，一旦所述珠到达前列腺细胞靶，MPP就从所述珠上释放出来。在固体表面固定化肽的方法为本领域已知，并可见于WO 94/29436和美国专利第5,858,358号。 

本发明还考虑了MPP可以包括进一步的修饰，所述修饰的目的是当MPP施用于受治疗者时，改善分子的药代动力学特性。能够降低治疗蛋白的免疫原性和/或增加治疗蛋白质的半衰期的各种修饰为本领域已知。例如，根据本领域已知的标准方法，MMP可以经受糖基化、异构化或去糖基化。类似地，MPP可以通过非天然存在的共价修饰来修饰，如通过添加聚乙二醇部分(聚乙二醇化)或者脂化。在一个实施方案中，本发明的MPP能够与聚乙二醇结合(PEG化)以促进其药物代谢分布。可通过本领域技术人员已知的技术进行结合(参见，例如Deckert等，Int.J.Cancer 87：382-390，2000；Knight等，Platelets 15：409-418，2004；Leong等，Cytokine 16：106-119，2001；和Yang等，Protein Eng.16：761-770，2003)。在一个实施方案中，可以通过诱变来鉴定和改变抗原表位。如同使这些抗原表位突变的方法一样，鉴定抗原表位的方法也为本领域所已知(参见，例如Sette等，Biologicals29：271-276)。 

制备MPP的方法 

本发明的MPP可以通过许多本领域已知的标准方法来制备。可通过例如使用DNA重组技术对编码MPP的核苷酸改造而修饰MPP。或者，对MPP的修饰可以用化学修饰和/或限制性蛋白水解对MPP多肽自身进行修饰来实现。如同样为本领域所已知的，这些方法的组合也 可用于制备本发明的MPP。 

使用重组方法制备MPP 

如本领域已知的，蛋白质的基因工程一般需要首先将编码蛋白质的核苷酸进行分离和克隆。不同nPP的序列可以从如本申请所述的GenBank获得。分离和克隆编码这些蛋白质的核苷酸序列可以因此通过采用标准的技术来实现(参见，例如Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology，Wiley & Sons，NY(1997 and updates)；Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold-Spring Harbor Press，NY(2001))。例如，通过标准技术提取mRNA，然后从mRNA模板合成cDNA(例如通过RT-PCR)，可以直接从合适的生物体如嗜水气单胞菌获得核苷酸序列。或者，通过标准程序可以从适当的cDNA或基因组DNA文库获得编码nPP的核苷酸序列。然后将分离的cDNA或基因组DNA插入至合适的载体。本领域技术人员应当理解所用的精确载体对于本发明而言不是关键要素。合适载体的实例包括，但不限于：质粒、噬菌粒、粘粒、噬菌体、杆状病毒、逆转录病毒或者DNA病毒。载体可以是克隆载体，或可以是表达载体。 

一旦获得了编码nPP的核苷酸序列，就可通过本领域公知的体外定点诱变技术在特定的预选位置引入一个或多个结合结构域或活化序列的突变。可以通过一个或多个组成编码序列的合适核苷酸的缺失、插入、取代、倒位或其组合来引入突变。例如，这可通过将引物设计为引入一个或多个核苷酸的错配、插入或缺失等基于PCR的技术来实现。突变的存在可以通过多种标准技术，如限制酶切分析或DNA测序来证实。  

如果需要的话，在引入一个或多个合适的突变之后，可以将编码MPP的核酸序列插入至合适的表达载体。合适的表达载体的实例包括，但不限于：质粒、噬菌粒、粘粒、噬菌体、杆状病毒和逆转录病毒，以及DNA病毒。 

本领域技术人员应当理解，表达载体还可包括调控元件，如MPP编码序列有效转录所需的转录元件。可掺入载体的调控元件的实例包括，但不限于启动子、增强子、终止子和多聚腺苷酸化信号。因此，本发明提供了含有与编码基因工程MPP的核苷酸序列操作性连接的调控元件的载体。本领域技术人员应当理解对合适的调控元件的选择取决于所选用于表达基因工程MPP的宿主细胞，并且这些调控元件可来自多种来源，包括细菌、真菌、病毒、哺乳动物或昆虫基因。 

例如，对睾酮和其他雄激素起反应的前列腺特异性启动子，可用于启动前列腺细胞中的基因的表达。其实例包括，但不限于probasin启动子、前列腺特异性抗原(PSA)启动子、前列腺特异性膜抗原(PSMA)启动子，以及人腺体激肽释放酶2(HK2)启动子。 

在本发明中，表达载体还可以含有利于纯化表达的MPP的异源核苷酸序列。这些异源核苷酸序列的实例包括，但不限于：亲和标签如金属亲和标签、组氨酸标签、亲和素/链亲和素编码序列、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)编码序列以及生物素编码序列。根据本领域已知方法可以在使用前将对应于核苷酸表达的氨基酸从表达的MPP去除。或者，对应于异源核苷酸序列表达的氨基酸可以保留在MPP上，前提是它们不干扰MPP靶向和杀伤前列腺细胞的能力。 

在本发明的一个实施方案中，MPP作为具有组氨酸标签的蛋白质表达。在另一个实施方案中，组氨酸标签位于MPP的羧基末端。 

可以通过本领域已知的多种方法之一将表达载体引入至合适的宿主细胞或组织。这些方法通常可见于Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology，Wiley & Sons，NY(1997 and updates)；Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold-Spring Harbor Press，NY(2001)，并包括例如稳定或瞬时转染、脂质体转染、电穿孔以及使用重 组病毒载体的感染。本领域技术人员应理解，对用于MPP表达的合适宿主细胞的选择取决于所选载体。宿主细胞的实例包括，但是不限于细菌、酵母、昆虫、植物以及哺乳动物细胞。 

另外，可以选择调节插入序列的表达或以特定的所需方式修饰和加工基因产物的宿主细胞。蛋白质产物的这些修饰(如糖基化)和加工(如切割)对于蛋白质的功能是重要的。不同的宿主细胞具有用于蛋白质和基因产物翻译后加工以及修饰的特征性的和特定的机制。可选择适合的细胞系或宿主系统，以确保所表达的外源蛋白的正确修饰以及加工。为此，可使用具有对初级转录本进行适当加工以及翻译后修饰(如基因产物的糖基化以及磷酸化)的细胞机制(cell machinery)的真核宿主细胞。这些哺乳动物宿主细胞包括，但不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38。 

克隆以及表达蛋白质的方法为本领域所公知，重组蛋白表达的技术以及系统的详细说明可见于例如Current Protocols in Protein Science(Coligan，J.E.，等，Wiley & Sons，New York)。分子生物学领域的技术人员应理解，多种多样的表达系统可用于提供重组蛋白。所用的宿主细胞对本发明来说不是关键的。因此，本发明考虑到可以在原核宿主(如大肠杆菌(E.coli)，杀鲑气单胞菌或枯草芽胞杆菌)或真核宿主(如酵母菌或毕赤酵母菌(Pichia)；哺乳动物细胞，如COS、NIH 3T3、CHO、BHK、293或HeLa细胞；或昆虫细胞)中制备MPP。 

可根据本领域已知的标准技术从宿主细胞中纯化MPP。如果需要，可通过使用完整蛋白质或其蛋白水解片段的标准肽测序技术来测定设计入蛋白质的氨基酸序列的改变。 

作为将突变引入天然存在的成孔蛋白的定向方法的替代方法，可通过本领域已知的技术使得表达成孔蛋白的克隆基因经受随机诱变。接着表达和筛选由此产生的蛋白质突变体形式，使得能够鉴定和分离 本发明的MPP。 

本发明的MPP还可以制备成片段或融合蛋白。融合蛋白是包括与不抑制MPP选择性靶向和杀伤正常前列腺细胞能力的其他氨基酸序列相连的MPP的蛋白质。在一个实施方案中，其他氨基酸序列为不超过5、6、7、8、9、10、20、30或50个氨基酸残基的长度。 

制备融合蛋白的方法为本领域技术人员所公知。例如美国专利第6,057,133号公开了制备融合分子的方法，所述融合分子由人白细胞介素-3(hIL-3)变异体或突变体蛋白与另一集落刺激因子、细胞因子、淋巴因子、白细胞介素、造血生长因子或IL-3变异体功能性连接而构成。授予Davis等的美国专利第6,072,041号公开了包括单链Fv分子的融合蛋白的生成，其中所述单链Fv分子定向于与治疗蛋白共价连接的胞转受体(transcytotic receptor)。 

相似的方法可用于生成包括连接其他氨基酸序列如前列腺特异性靶向结构域(如LHRH或抗体)的MPP(或其变异体、片段等)的融合蛋白。连接区可用于使蛋白质的两个部分彼此隔开并提供它们之间的柔性。连接区通常是1-500个氨基酸长度的多肽，如小于30个氨基酸长度。一般而言，连接两分子的连接体可被设计成：(1)允许两分子能够彼此独自折叠和起作用，(2)不具有形成会干扰两个蛋白质的功能结构域的有序二级结构的偏向性，(3)具有最低的与蛋白质功能结构域相互作用的疏水性或带电特性，和/或(4)提供两个区域的空间上的分离。柔性蛋白区域的典型表面氨基酸包括Gly、Asn和Ser。其他的中性氨基酸(如Thr和Ala)也可用于连接序列。连接体还可包括提供连接序列中的独特性位点以利于构建融合体。根据需要，还可包括其他部分。这些可包括可用于纯化和加工融合蛋白的结合区，(如亲和素或表位)或标签(如多组氨酸标签)。另外，可将可检测的标记物与融合蛋白连接，这样可以方便地监测融合蛋白经过机体或细胞的运送(traffic)。这些标记物包括放射性核素、酶、荧光团等等。 

MPP核苷酸序列与其他蛋白质(或变异体，其片段)核苷酸序列的融合可以通过使用中间的载体来实现。或者，可以将一个基因直接克隆至含有其他基因的载体中。连接体和适体(adapter)可用于连接核苷酸序列和取代丢失序列(loss sequence)，其中限制性酶切位点在感兴趣的区域内。将编码一种多肽、肽连接体以及其他多肽的基因物质(DNA)插入至合适的表达载体用于转化原核或真核细胞，所述原核或真核细胞如细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。培养转化的生物体，并通过标准技术分离蛋白质，例如，如果使用了多组氨酸标签，则通过使用可检测标记物的如镍-螯合物亲和层析来分离蛋白质。因此，所产生的产物是一种新蛋白质——具有任选通过连接体与另一蛋白质连接的MPP的融合蛋白。为了确认融合蛋白被表达，纯化的蛋白质例如可进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，以及用已建立的方法转移至硝酸纤维素膜滤器上。通过蛋白质印记分析，使用针对各组分即多组氨酸标签和/或MPP的抗体来鉴定蛋白产物。 

如果本发明的MPP通过表达融合基因而产生，那么肽键就作为MPP与前列腺特异性靶向结构域的连接体起作用。例如，可根据本领域已知的方法，如Huston等，Meth.Enzymol.203：46-88，1991，来制备抗体的单链Fv片段与成孔蛋白毒素的重组融合蛋白。 

本领域普通技术人员应当理解，可以使用多种方法对DNA进行改变，而不影响所编码的蛋白质的生物学活性。例如，PCR可用于使编码MPP的DNA序列产生变异。这些编码MPP的DNA序列的变异，可用于优化用于表达蛋白质的宿主细胞中密码子的偏爱性，或可以含有其他有利于表达的序列改变。 

制备MPP的其他方法 

前列腺特异性靶向结构域和上文所述的任选的连接体可以通过共价键或非共价键或两者一起连接至本发明的MPP。非共价相互作用可 以是离子、疏水或者亲水的，诸如涉及亮氨酸拉链的相互作用或抗体-蛋白G相互作用(Derrick等，Nature 359：752，1992)。其他非共价相互作用的实例包括但不限于下列结合对：抗原或半抗原和抗体；抗体和抗-抗体；受体和配体；酶或酶片段和底物，底物类似物或配体；生物素或凝集素和亲和素或链亲和素；凝集素和碳水化合物；亮氨酸对拉链基序(见，例如美国专利第5,643,731号)，以及本领域已知的各种同型二聚体以及异型二聚体。如本领域已知，MPP可以被修饰成包括结合对的一个成员，且前列腺特异性靶向结构域可以被修饰成包括结合对的另一个成员。 

共价键可以采用二硫键的形式。编码这些组分之一的DNA序列可以被设计为含有唯一的半胱氨酸密码子。可选地，可以使用天然存在的半胱氨酸残基。第二组分可以使巯基与第一组分的半胱氨酸反应而衍生。可选地，巯基自身或作为半胱氨酸残基部分的巯基可以使用固相多肽技术引入。例如，Hiskey(Peptides 3：137，1981)所述的将巯基引入肽。 

蛋白质可以通过标准技术添加巯基来进行化学修饰。例如，Traut′s试剂(2-亚氨基硫醇(iminothiolane)-HCl)(Pierce Chemicals，Rockford，Ill.)可用于在伯胺诸如赖氨酸残基或N末端胺上引入巯基。然后用Traut′s试剂修饰过的蛋白质或肽可与用试剂诸如N-琥珀酰亚胺基(succinimidyl)3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)或琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)修饰过的蛋白质或肽发生反应(Pierce Chemicals，Rockford，Ill.)。 

一旦各组分存在恰当的巯基，则纯化这两个组分，还原各组分的硫基；将组分混合；并在室温下完成二硫键的形成。为了提高偶联反应的效率，可在如半胱氨酸-MPP的组分之一半胱氨酸残基添加至反应混合物之前，通过本领域已知的方法，使用5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲)酸(DTNB)或2，2′-二硫代吡啶对其进行活化。反应后，用磷酸盐缓 冲生理盐水将混合物进行透析，以去除未偶联的分子。然后，进行葡聚糖凝胶层析等来基于大小而分离本发明化合物与其组分。 

还可以使用Maiti等，Int.J.Cancer Suppl.3：17-22，1988所述的聚合体-单甲氧基聚乙二醇(mPEG)来连接组分。 

前列腺特异性靶向结构域与nPP或MPP也可以通过使用本领域已知的标准的偶联化学方法进行偶联，诸如碳化二亚胺介导的偶联(例如，DCC、EDC或活化的EDC)，以及使用2-亚氨基硫醇来将ε-氨基转化成用于交联的巯基，并使用m-马来酰亚胺苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺基酯(MBS)作为交联剂。本领域已知的各种其他的偶联方法可用于结合前列腺特异性靶向结构域与nPP或MPP。 

MPP的大量制备 

MPP的制备也可使用本领域已知的标准技术大量进行，以便用于例如生产的目的，其中所述标准技术诸如用于生产重组蛋白的大规模发酵过程，以及用于重组蛋白纯化的超滤法、离子交换层析法、固定化的金属离子亲和层析法。 

检测MPP的方法 

本发明的MPP保留其成孔活性并且选择性杀伤前列腺细胞。可使用本领域已知的标准方法检测MPP选择性杀伤前列腺细胞的能力。下文及本申请包括的实施例中提供了检测候选MPP的示例方法。本领域技术人员应当理解，检测候选MPP的其他方法为本领域已知且也适于检测本发明的MPP。 

体外方法 

含有前列腺特异性活化序列的本发明的MPP，可根据本领域已知的方法检测其被合适的前列腺特异性蛋白酶切割的能力。例如，将不同浓度的合适的蛋白酶与MPP一起温育，然后将温育产物在 SDS-PAGE凝胶上进行电泳，且通过检测凝胶上多肽的大小来评定MPP的切割。 

为了确定与蛋白酶温育的MPP是否保留成孔活性，以及由此在与蛋白酶温育后保留杀伤细胞的能力，可使用本领域已知的溶血测定来检测反应产物。合适的测定的实例在Howard，S.P.，and Buckley，J.T.1985.Activation of the hole-forming toxin aerolysin by extracellularprocessing.J.Bacteriol.163：336-340中有描述。 

可根据本领域已知的方法来检测本发明的MPP杀伤前列腺细胞的能力。例如，可以使用合适的前列腺细胞系在体外测定MPP杀伤前列腺细胞的能力。通常，将所选的检测细胞系的细胞培养至适当的密度，并添加候选MPP。在适当的培养时间后(例如，大约48-72小时)，评定细胞存活率。测定细胞存活率的方法为本领域所公知，并且其包括，但不限于刃天青还原试验(见Fields & Lancaster(1993)Am.Biotechnol.Lab.11：48-50；O’Brien等，(2000)Eur.J.Biochem.267：5421-5426以及美国专利第5,501,959号)，硫代若丹明分析法(Rubinstein等，(1990)J.Natl.Cancer Inst.82：113-118)，或者中性红染料试验(Kitano等，(1991)Euro.J.Clin.Investg.21：53-58；West等(1992)J.Investigative Derm.99：95-100)，或台盼蓝测定。也可以使用多种可商购获得的试剂盒，例如CellTiter 96

AQueous One Solution CellProliferation Assay(Promega)。将处理的培养物与一种或多种对照培养物进行细胞存活率对比来测定细胞毒性，所述对照培养物例如未处理的培养物，和/或使用对照化合物(通常是已知的治疗剂)预处理的培养物，或其他合适的对照。被认为有效杀伤正常前列腺细胞的MPP能够将细胞存活率减小，例如，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％或至少50％。 

可对包括前列腺特异性靶向结构域的MPP评定它们的选择性靶向前列腺细胞的能力，例如通过将MPP杀伤正常前列腺细胞的能力与其 杀伤其他组织细胞的能力进行比较。可选地，本领域已知的流式细胞计数方法，可以用于确定包括前列腺特异性靶向结构域的MPP是否能够选择性地靶向前列腺细胞。另外可选地，前列腺特异性靶向结构域的结合配体可以掺入人工脂膜，且可以使用本领域技术人员熟悉的方法来检测MPP形成通道的能力。 

可用于检测本发明的MPP的特异性溶解前列腺细胞的能力的测定方法在例如实施例2和3中描述。例如，可对具有PSA切割位点的MPP评定相对于其溶解不生成PSA的细胞能力的特异性溶解生成PSA的细胞的能力。本发明的MPP，在比杀伤不生成PSA的细胞所需更低的浓度下，例如低至少2倍、5倍、10倍或100倍的浓度，与生成PSA的细胞(诸如前列腺细胞)接触时，促进细胞的溶解和死亡。 

适合于检测候选MPP的多种前列腺细胞系为本领域已知且许多可商购获得(例如，来自美国模式培养物保藏所(American Type CultureCollection)，马纳萨斯，VA)。用于体外检测的合适的前列腺细胞系的实例包括，但不限于PNT1A、PNT2、BPH-1、DuK50、NRP152、PS-1细胞系。 

如有必要，MPP对非前列腺细胞的毒性也可以使用标准技术在体外进行最初评定。例如，在体外可以用MPP转染人初级成纤维细胞，然后在处理后不同时间点使用标准的成活力测定来检测它们的成活力，其中所述成活力测定诸如上述测定方法，或台盼蓝拒染法。还可以使用例如胸腺嘧啶核苷掺入法对细胞合成DNA的能力进行测定，和例如使用标准的细胞分类法结合荧光计数细胞分选仪(fluorocytometercell sorter)(FACS)来评定细胞的细胞周期动力学变化。 

还可如本领域已知检测本发明的MPP在血浆或血清中的活性。例如，将MPP与血清温育适当时间，然后用例如电泳和与活化的MPP相应的电泳条带的光密度分析来测定MPP的活化程度。 

体内方法 

本发明的MPP的毒性可根据本领域已知的方法在体内检测。例如，MPP的全部全身毒性可以如实施例4所述，通过测定单次静脉内注射后杀伤100％小鼠的剂量(即LD₁₀₀)来检测。由于全身或前列腺内施用MPP导致的毒性也可通过例如将MPP施用于狗、大鼠或者猴来进行体内评定。 

本发明的MPP减小前列腺大小而由此提示适用于治疗BPH的能力可使用本领域已知的动物模型在体内进行检测。例如，可以使用狗，或诸如食蟹猴、猩猩和狒狒的非人灵长类，检测MPP的体内活性。例如通过肛门周围前列腺内注射施用MPP。在施用后前列腺体积的变化可通过例如，磁共振成像或前列腺组织尸体剖检和/或前列腺重量测定来评估。 

如上所述，能够减小动物模型的前列腺大小，或减缓前列腺的进一步生长的MPP被认为适于治疗BPH。减小前列腺大小是指减小前列腺的重量或体积，以及减缓前列腺的进一步生长是指其中在动物中施用受试化合物之后前列腺的重量或体积增加最少或没有增加的情况。在一个实施方案中，当本发明所涉及的MPP施用于动物后，能够减小前列腺大小，例如，至少10％、20％、30％、40％或50％。 

MPP抗原性的测定以及减少 

当治疗蛋白施用于受治疗者时，可引起一定水平的抗体反应，其中在一些情况下可导致潜在的严重副作用。因此，如有必要，MPP的抗原性可如本领域已知和下文所述来进行评定。另外，描述了减少潜在抗原性的方法。 

本申请所述的MPP的抗体反应的动力学以及强度可在例如具有免疫能力的小鼠中测定，并可用于促进开发可用于具有免疫能力的人的 给药方案。对具有免疫能力的小鼠诸如C57-BL6系施用静脉剂量的MPP。在不同间期(例如单次给药后，多次给药后)将小鼠处死，并获得血清。通过基于ELISA的测定方法检测抗MPP抗体的存在。 

为了减少本发明的MPP的抗原性，MPP的天然结合结构域可功能性缺失并例如使用如上所述的前列腺特异性靶向结构域取代。这些MPP的抗原性可使用上述方法在暴露于缺失部分天然结合结构域的MPP的不同方案之后进行测定。可用于允许使用MPP持续治疗的另一种方法是使用依序施用的衍生自具有无重叠抗原性的其他nPP的可选MPP。例如，衍生自气单胞菌溶素原的MPP可以与衍生自败血梭状芽胞杆菌α-毒素或苏芸金芽胞杆菌δ-毒素的MPP交替使用。所有这些MPP可靶向前列腺细胞，但是不能被相同抗体识别或中和。另一个实施例是使用衍生自人组织的MPP，诸如溶细胞的人T细胞产生的人穿孔素。这些MPP可以被施用，并且因为所述蛋白质为人源性而不会产生抗体反应。 

药物组合物 

本发明提供了药物组合物，其包括MPP和一种或多种无毒性的药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或助剂。如果需要，所述组合物中可以包括其他活性组分。如上所述，所述组合物用于治疗BPH。 

药物组合物可以包括大约1％至大约95％的本发明的MPP。配制用于以单一剂量形式施用的组合物可包括，例如大约20％至大约90％的本发明的MPP；而非单一剂量形式的组合物可包括，例如大约5％至大约20％的本发明的MPP。最终制剂中的MPP浓度可以低至0.01μg/mL。例如，最终制剂中的浓度可在大约0.01μg/mL和大约1,000μg/mL之间。在一个实施方案中，最终制剂中的浓度在大约0.01μg/mL和大约100μg/mL之间。单位剂量形式的非限制性实例包括锭剂(dragees)、片剂、安瓿(ampoules)、小瓶(vials)、栓剂和胶囊剂。 

所述组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或散剂。对于固体组合物(如，散剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)而言，传统的无毒固体载体包括，例如药用级甘露糖、乳糖、淀粉、糖精钠、纤维素、碳酸镁或硬脂酸镁。所述组合物可以使用常规的粘合剂和载体(如甘油三酯)配制成栓剂。 

对于动物施用而言，所述药物组合物可配制用于多种途径施用。例如，所述组合物可配制用于口服、局部、直肠或胃肠外给药，或用于吸入或喷雾给药。这里所用的术语“胃肠外”包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射、鞘内注射、胸骨内注射或者输注技术。还考虑了向前列腺内直接注射或输注。本发明还考虑了蛋白毒素的标准给药方式-对流增强型递送。 

MPP可以与药学上可接受的载体一起给药。理想地，这类载体可增强稳定性和/或改善输送的特性。因此，本发明还提供了MPP与合适载体诸如人工膜泡(包括脂质体、囊泡体(noisome)、纳米体等)、微粒或微囊的制剂，或包括药学上可接受的聚合物的胶体制剂。使用这些载体/聚合物对实现MPP的持续释放是有益的。可选地，或另外，MPP制剂可包括稳定诸如人血清白蛋白的体内蛋白的添加剂，或本领域已知的用于蛋白质治疗剂的其它稳定剂。 

口服使用的药物组合物可配制成例如片剂、糖锭剂、锭剂、水性或油性悬浮液、可分散的散剂或颗粒剂、乳剂、硬胶囊或软胶囊、或糖浆剂或酏剂。所述组合物可以根据本领域已知的制备药物组合物的标准方法来制备，并可含有选自甜味剂、调味剂、着色剂以及防腐剂的组中的一种或多种试剂，以提供药学上美观和适口的制剂。片剂含有活性组分，所述活性组分与下述组分混合：合适的药学上可接受的无毒性赋形剂，其包括，例如惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；粒化剂及崩解剂，诸如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，诸如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬 脂酸或滑石。片剂可以不用包衣，或者通过已知技术进行包衣，以延缓其在胃肠道中的崩解和吸收，并由此提供在较长时间内的持续作用。例如，可使用诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的延时材料。 

口服使用的药物组合物还可以是其中活性组分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合的硬明胶胶囊，或者是其中活性组分与水或诸如花生油、液体石蜡或橄榄油的油性介质混合的软明胶胶囊。 

配制成水性悬浮液的药物组合物包括与一种或多种合适的赋形剂混合的活性化合物，其中所述赋形剂例如悬浮剂，诸如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基-β-环糊精、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂，诸如天然存在的磷脂，如卵磷脂，或烯化氧与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，如十七烷乙烯氧基十六醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的部分酯类的缩合产物，如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯类的缩合产物，如聚乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂，例如乙基或n-丙基、p-羟基-苯甲酸酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，或一种或多种甜味剂，诸如蔗糖或糖精。 

药物组合物可以通过将活性化合物悬浮于诸如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油的植物油或诸如液体石蜡的矿物油中而制备成油性悬浮液。油性悬浮液可含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或十六醇。可添加如上所述的甜味剂和/或调味剂，以提供适口的口服制剂。这些组合物可通过添加抗氧化剂例如抗坏血酸加以保护。 

所述药物组合物可以配制为可分散的散剂或颗粒剂，所述散剂或颗粒剂随后可通过加水用于制备水性悬浮液。这些可分散的散剂或颗 粒剂提供了与一种或多种分散剂或湿润剂、悬浮剂和/或防腐剂混合的活性组分。合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂由上文所提到的那些举例说明。在这些组合物中，还可以包括其他赋形剂，例如甜味剂、调味剂以及着色剂。 

本发明药物组合物还可以配制成水包油乳剂。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，或是如液体石蜡的矿物油，或可以是这些油的混合物。这些组合物中所包含的合适乳化剂包括天然存在的树胶，如阿拉伯树胶或黄蓍树胶；天然存在的磷脂，如大豆、卵磷脂；或衍生自脂肪酸和己糖醇、酐的酯类或部分酯类，例如脱水山梨糖醇单油酸酯，以及所述部分酯类与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。所述乳剂还可任选地含有甜味剂和调味剂。 

所述药物组合物可通过将活性组分与一种或多种甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖组合而配制成糖浆剂或酏剂。这些制剂还可任选地含有一种或多种缓和剂(demulcents)、防腐剂、调味剂和/或着色剂。 

所述药物组合物可根据本领域已知的方法并使用合适的如上所述的一种或多种分散剂或润湿剂和/或悬浮剂配制成无菌可注射水性悬浮液或油性悬浮液。无菌注射剂可以是溶于无毒性的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂的无菌的可注射溶液或悬浮液，例如溶于1，3-丁二醇的溶液。所用的可接受载体和溶剂包括，但不限于水、林格氏溶液、乳酸盐林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。其他实例包括常规用作溶剂或悬浮介质的无菌非挥发性油，和多种温和的非挥发性油，包括例如合成的单酸甘油酯或甘油二酯。诸如油酸的脂肪酸也可以用于注射剂的制备。 

其它药物组合物及制备药物组合物的方法为本领域已知，并在例如″Remington：The Science and Practice of Pharmacy″(先前为″Remingtons Pharmaceutical Sciences″)；Gennaro，A.，Lippincott， Williams & Wilkins，Philidelphia，PA(2000)中有所描述。 

上述本发明药物组合物包括一种或多种有效量的本发明MPP以实现预期目的。因此，术语“治疗有效剂量”是指改善BPH症状或特征的MPP的量。化合物的治疗有效剂量的测定在本领域技术人员的能力范围内。例如，治疗有效剂量最初可以使用细胞培养测定，或诸如本申请所述的那些动物模型来评定。动物模型也可用于测定合适的浓度范围和给药途径。然后，使用本领域普通技术人员已知的标准方法，可将这些信息用于确定在其他动物(包括人)中给药的有用剂量和途径。 

治疗效果和毒性还可通过标准药学方法如通过测定半数有效剂量或ED₅₀(即在群体的50％中治疗有效的剂量)和半数致死量或LD₅₀(即导致群体的50％死亡的剂量)来测定。治疗效果与毒性效应之间的剂量比被称为“治疗指数”，它可以表示为LD₅₀/ED₅₀的比值。从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制人或动物用的剂量范围。这些组合物中含有的剂量通常在包括ED₅₀和表现少许毒性或无毒性的浓度范围内。在这个范围内的剂量随所使用的剂型、受治疗者的敏感性以及给药途径等而变化。 

医生可根据需要治疗的受治疗者的有关因素来确定给药于受治疗者的精确剂量。将剂量和给药调整到提供足够水平的MPP和/或维持预期效应。确定合适的剂量时可考虑的因素包括疾病状态的严重性、受治疗者的一般健康状况、年龄、体重，以及受治疗者的性别、饮食、给药时间以及频率、药物联合、对治疗的反应敏感性和耐受性/反应。医生可以根据上述因素和诸如特定制剂的半衰期和清除率的因素来设计给药方案。 

根据常规方法，药物有效量的本发明的MPP可以与药学上可接受的载体一起配制，以用于胃肠外、口、鼻、直肠、局部以及经皮给药等。所述制剂还可包括一种或多种稀释剂、填充剂、乳化剂、防腐剂、 缓冲剂、赋形剂等，并且可以以如液体、散剂、乳剂、栓剂、脂质体、透皮贴剂和片剂的形式提供。缓释或延长释放递送系统，包括多种生物聚合物(基于生物学的系统)中的任何一种、应用脂质体的系统以及聚合物递送系统，也可与本申请所述的组合物一起使用，以提供MPP的持续或长期来源。这些缓释系统适用于例如口服、局部和胃肠外使用的制剂。术语“药学上可接受的载体”是指不影响活性组分的生物活性作用，并对宿主或患者没有毒性的载体介质。本领域技术人员可以根据适当的方法并按照可接受的操作来配制本发明的化合物，例如Remington The Science and Practice of Pharmacy，Gennaro，ed.，MackPublishing Co.，Easton Pa.，第19版，1995所揭示的。 

在一个实施方案中，MPP与水溶性聚合物偶联，例如，以增加稳定性或循环半衰期或减少免疫原性。临床上可接受的水溶性聚合物包括，但不限于聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇丙醛、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙二醇均聚物(PPG)、聚氧乙基化多元醇(POG)  (如丙三醇)和其他聚氧乙基化多元醇、聚氧乙基化山梨醇，或聚氧乙基化葡萄糖，和其他的碳水化合物聚合物。将多肽与水溶性聚合物如PEG偶联的方法，例如在美国专利公布号20050106148及其引用的参考文献中有所描述。 

MPP用于治疗良性前列腺增生(BPH)的用途 

相对于其他正常组织的细胞，本发明的MPP选择性杀伤正常前列腺细胞。因此，本发明的MPP可用于治疗或预防BPH。 

在一个实施方案中，BPH的治疗是指减小患有BPH的受治疗者的前列腺大小。前列腺的大小可通过本领域已知的方法包括如测面积法、扁长椭圆体积计算(HWL)以及椭圆体体积测量技术测定其体积来确定。前列腺大小还可以通过例如直肠指检或直肠超声或细胞检查来直接测量，或例如通过测量血液PSA水平的变化或血液游离PSA和总PSA的比例变化来间接测量。 

在一个实施方案中，MPP的给药减小受治疗者的前列腺体积。例如，所揭示的方法能够减小前列腺的体积，例如至少10％，至少20％，或至少30％，至少40％，或至少50％。 

在另一个实施方案中，BPH的治疗涉及降低BPH的一个或多个症状的严重程度。BPH的症状包括排尿变化或排尿问题，诸如尿流迟疑、中断或变弱、尿急和渗漏或滴沥，或尿频(特别是夜间)。这些症状也称为下尿路症状(LUTS)。LUTS可以如本领域已知使用美国泌尿学会(AUA)症状指数、Madsen-Iversen评分系统或Boyarsky系统来测定。 

在另一个实施方案中，BPH的治疗涉及预防或抑制前列腺的继续生长，并且可以如上所述通过体积增长率或血液PSA增长率的减少或BPH症状的减轻来测定。 

联合治疗 

本发明的MPP可以单独使用或联合一种或多种用于BPH的其他治疗方法。BPH的其他治疗方法包括施用诸如α-1-肾上腺素受体拮抗剂和5-α还原酶抑制剂的药物、植物药疗法、外科手术以及微创技术。 

α-1-肾上腺素受体拮抗剂的实例有阿夫唑嗪/哌唑嗪、坦索洛新、特拉唑嗪以及多沙唑嗪。5-α还原酶抑制剂的实例有非那司提和度他雄胺。 

植物药疗法的实例包括锯叶棕浆果/矮棕榈(Serenoa repens)，非洲李子树皮(Pygeum africanum)，南非星草/β-谷固醇(Hipoxis rooperi)，紫锥花(Echinacea purpurea)，南瓜籽(Cucurbita pepo)，黑麦(Secalecereale)，以及刺荨麻(Uritica dioica)。 

外科手术的实例包括经尿道前列腺切除术(TURP)、经尿道针刺消 融术(TUNA)、经尿道前列腺切开术(TUIP)、经尿道微波热疗(TUMT)、激光前列腺切除术、气囊扩张术、电汽化前列腺切除术和开放性前列腺切除术。 

如果需要减轻对MPP的全身免疫反应，可在使用MPP同时联合施用免疫抑制疗法。免疫抑制疗法的实例包括，但不限于全身或局部用皮质类固醇(Suga等，Ann.Thorac.Surg.73：1092-7，2002)、环孢霉素A(Fang等，Hum.Gene Ther.6：1039-44，1995)、环磷酰胺(Smith等，Gene Ther.3：496-502，1996)、脱氧精胍菌素(Kaplan等，Hum.Gene Ther.8：1095-1104，1997)以及T细胞和/或B细胞抗体[如抗-CD40配体、抗CD4抗体、抗-CD20抗体(利妥昔单抗)](Manning等，Hum.Gene Ther.9：477-85，1998)。可在MPP给药之前、给药期间或给药之后施用这些药剂。本发明的MPP可以与上述的治疗方法分开、依序或同时给药。 

MPP的给药 

可以使用本领域已知的方法将治疗有效量的本发明MPP或编码MPP的核苷酸局部或全身施用于患有BPH的受治疗者。 

在一个实施方案中，将MPP注射到患有BPH的受治疗者的前列腺内(前列腺内注射)。例如，可使用类似于近距离放疗的多次注射途径的给药途径，其中适于作为组合物或制剂并以合适剂型存在的多等份纯化的肽可以使用针通过会阴注射。 

此外，或可选地，MPP可以全身施用于患有BPH的受治疗者，例如通过静脉注射、肌肉注射、皮下注射或口服。 

MPP的治疗有效量是指足够产生所需的生物学效应的量，例如有效减小前列腺大小(即体积和/或重量)，或减缓前列腺的进一步生长，或减轻BPH的症状的量。在一个实施方案中，它是足够减轻受治疗者的BPH的体征或症状的量。在特定实施例中，它是有效减小前列腺体 积至少10％、20％、30％、40％或50％的量。在另一实施方案中，它是足够预防前列腺体积或重量进一步增加的量。有效剂量可以从来源于体外或动物模型试验系统的剂量效应曲线来外推。 

在治疗过程中，MPP的有效量可以单次剂量或多次剂量(例如每天)给药。然而，MPP的有效量取决于受治疗者、受治疗病症的严重性以及类型，以及给药方式。在一个实施方案中，对于前列腺内给药，MPP的治疗有效量为大约0.01μg/g前列腺重量至50μg/g前列腺重量。在另一个实施方案中，对于前列腺内给药，MPP的治疗有效量为大约0.02μg/g前列腺重量至40μg/g前列腺重量。在另一个实施方案中，对于前列腺内给药，MPP的治疗有效量为大约0.02μg/g前列腺重量至35μg/g前列腺重量。在另一个实施方案中，对于前列腺内给药，MPP的治疗有效量为大约0.03μg/g前列腺重量至25μg/g前列腺重量。在另一个实施方案中，对于前列腺内给药，MPP的治疗有效量为大约0.04μg/g前列腺重量至20μg/g前列腺重量。在另一个实施方案中，对于前列腺内给药，MPP的治疗有效量为大约0.04μg/g前列腺重量至10μg/g前列腺重量。 

在一个实施方案中，对于70kg的人，MPP的前列腺内有效静脉剂量为大约1mg至大约10mg MPP。在另一个实施方案中，MPP的有效静脉剂量为大约1mg至大约5mg。在另一个实施方案中，MPP的有效静脉剂量为大约1mg至大约3mg。在又一个实施方案中，MPP的有效静脉剂量为大约2.8mg。在一个实施方案中，对于70kg的人，MPP的有效前列腺内剂量为大约10mg至大约100mg MPP。在另一个实施方案中，对于70kg的人，MPP的有效前列腺内剂量为大约10mg至大约50mg MPP。在另一个实施方案中，对于70kg的人，MPP的有效前列腺内剂量为大约10mg至大约30mg MPP。在另一个实施方案中，对于70kg的人，MPP的有效前列腺内剂量为大约28mg。 

MPP的体内表达 

为替代MPP给药(或在此之外)来治疗BPH，可通过在体内表达编码MPP的核苷酸而实现BPH的长期或全身治疗。 

编码MPP的核苷酸 

本发明考虑到使用编码MPP的核苷酸或DNA分子来治疗BPH。这些DNA分子可以通过标准的分子生物学实验技术和本申请所揭示的序列信息来获得。 

合适的DNA分子和核苷酸包括在严紧性条件下与所揭示的DNA序列杂交的那些或其片段，前提是它们编码功能MPP。导致特定程度严紧性的杂交条件根据杂交方法的特性以及所使用的杂交DNA的组成和长度而不同。通常，杂交的温度和杂交缓冲剂的离子强度(特别是Na⁺浓度)决定杂交的严紧性。关于达到特定量的严紧性所需的杂交条件的计算在Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989，第9和11章)中有描述。使用标记有[³²P]-dCTP的靶探针的杂交通常在高离子强度溶液(如6倍的SSC)中以低于解链温度T_m约5-25℃的温度进行。严紧性条件的实例是：对于短探针(例如10-50个核苷酸)而言，在pH 7.0-8.3以及至少大约30℃的温度下，至少大约0.01M到1.0M的钠离子(或其他盐)的盐浓度。严紧性条件可以通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。例如，在25-30℃，5倍SSPE(750mM NaCl，50mM磷酸钠，5mM EDTA，pH7.4)的条件适于等位基因特异性探针杂交。 

遗传密码的简并性还允许DNA分子核苷酸序列内的变异，同时维持所编码蛋白质的氨基酸序列。例如，氨基酸Ala由核苷酸密码子三联体GCT、GCG、GCC和GCA编码。因此，可以改变核苷酸序列而不影响所编码蛋白质的氨基酸组成或该蛋白质的特征。根据遗传密码的简并性，使用上述的标准的DNA诱变技术或通过DNA序列合成可以从参考DNA分子获得变异体DNA分子。本公开内容还包括由于基于遗传密码简并性的序列变异而在严紧性条件下不与所揭示的DNA序列 杂交的DNA序列。 

本发明提供了表达MPP的方法，例如在细胞或组织内体内表达修饰的气单胞菌溶素原多肽。在一个实施例中，细胞或组织的转染在体外进行。在该实施例中，细胞或组织(诸如移植物)取自受治疗者，并用含有编码目标蛋白的cDNA的表达载体转染。转染的细胞产生功能蛋白，并且可以再导入受治疗者中。在另一个实施例中，将编码目标蛋白的核酸直接施用于(诸如静脉内或前列腺内)受治疗者，并在体内产生转染。 

目前，人细胞转染所需的科学和医学操作是常规方法。美国专利第5,529,774号公开了将基因转入供体细胞内的一般策略。通常，将编码具有所需治疗效果的蛋白质的基因克隆至病毒表达载体中，然后将该载体引入靶生物体。病毒感染细胞，并在体内产生蛋白质序列，其中所述蛋白质具有所需的治疗效果(Zabner等，Cell 75：207-16，1993)。 

只需将DNA或蛋白质元件导入某些细胞或组织，例如，前列腺即可。然而，在一些情况下，例如通过血管内(i.v.)或口服施用可更治疗有效和更简单地治疗所有受治疗者的细胞或更广泛地分散载体。 

编码MPP的核苷酸序列受合适的启动子的调控。可使用的合适的启动子包括，但不限于：基因天然启动子，逆转录病毒的LTR启动子或腺病毒启动子，如腺病毒主要晚期启动子；CMV启动子；RSV启动子；诱导型启动子，如MMTV启动子；金属硫蛋白启动子；热休克启动子；白蛋白启动子；组蛋白启动子；(x-肌动蛋白启动子；TK启动子；B19细小病毒启动子；以及ApoAI启动子。在一个实施例中，启动子是前列腺特异性启动子，如probasin启动子。然而，公开内容不限于特异性的外源基因或启动子。 

可通过使得重组核苷酸到达合适细胞的已知方法将重组的核苷酸 给药于受治疗者。这些方法包括注射、输注、沉积、移植或局部给药。注射可以是皮内或皮下注射。如下文进一步描述，重组核苷酸可以作为病毒载体的部分或作为诸如裸DNA或脂质体包被的DNA的非感染形式进行递送，所述病毒载体诸如禽痘病毒、重组痘苗病毒、复制缺陷腺病毒毒株或脊髓灰质炎病毒。 

腺病毒载体基本上包括全部的腺病毒基因组(Shenk等，Curr.Top.Microbiol.Immunol.111：1-39，1984)。可选地，腺病毒载体为其中至少一部分腺病毒基因组缺失的修饰的腺病毒载体。在一个实施例中，所述载体包括腺病毒5′ITR；腺病毒3′ITR；腺病毒壳体化信号；编码治疗剂的DNA序列；以及表达编码治疗剂的DNA序列的启动子。该载体没有腺病毒E1和E3 DNA序列的至少大部分，并且不一定全没有E2和E4 DNA序列，而且编码腺病毒蛋白的DNA序列由腺病毒的主要晚期启动子转录。在另一个实施例中，所述载体为诸如美国专利第4,797,368号(Carter等)和McLaughlin等(J.Virol.62：1963-73，1988)所述的腺相关病毒(AVV)，和4型AAV(Chiorini等，J.Virol.71：6823-33，1997)以及5型AAV(Chiorini等，J.Virol.73：1309-19，1999)。 

这种载体可以根据标准技术使用穿梭质粒来构建，所述穿梭质粒5，末端起始含有腺病毒5’ITR，腺病毒壳体化信号，以及Ela增强子序列，启动子(可以是腺病毒启动子或外源启动子)，三联前导序列，多克隆位点(可以是本申请所述)，多聚腺苷酸(poly A)信号，以及对应于腺病毒基因组片段的DNA片段。所述DNA片段作为与修饰或突变的腺病毒同源重组的底物，且可以包括例如腺病毒5’基因组不超过碱基3329到碱基6246的片段。所述质粒还可以包括可选择的标记物和复制起始区。所述复制起始区可以是细菌的复制起始区。编码治疗剂的所需DNA序列可以插入至质粒的多克隆位点。 

可用于实践本申请所述方法的载体的实例包括，但不限于下列文献中公开的那些：Woo等的WO 95/27512；Walsh等的WO 01/127303； Couto等的美国专利第6,221,349号；High等的美国专利第6,093,392号。 

临床试验 

本领域技术人员应当理解，在体外和动物模型中证实了MPP用于治疗BPH的有效性之后，应在临床试验中对MPP进行试验以进一步评价MPP在治疗BPH中的效果以及获得治疗用途的监管审批。如本领域已知，临床试验经过几期试验，它们分为I期、II期、III期和IV期。 

最初，在I期试验中评价MPP。通常，I期试验用于确定给药的最佳模式(例如通过丸剂或通过注射)、给药频率以及化合物的毒性。I期研究常常包括实验室检测，如验血和活检，以评价患者体内的潜在治疗效果。对于I期试验，小组的BPH患者用特定剂量的MPP来治疗。在试验期间，通常挨组增加剂量，以确定与所述化合物相关的最大耐受剂量(MTD)和剂量限制性毒性(DLT)。这个过程确定用于随后II期试验的合适剂量。 

II期试验用于进一步评价MPP的效果和安全性。在II期试验中，将MPP以I期试验中有效的剂量给药于多组BPH患者。 

III期试验集中于确定与标准或最广泛接受的治疗相比MPP的治疗效果如何。在III期试验中，随机将患者分入两个或更多“分组(arm)”之一中。在具有两个分组的试验中，例如一个分组接受标准治疗(对照组)，另外一个分组接受MPP治疗(研究组)。 

IV期试验用于进一步评价MPP的长期安全性和效果。IV期试验不如I、II、III期试验常见，且在MPP被批准用于标准用途之后进行。 

用于临床试验的患者的中选条件 

参与者的中选标准可以从一般(例如年龄、性别、疾病类型)到 具体(例如先前治疗的类型和数目、疾病特征、血细胞计数、器官机能)。在一个实施方案中，中选的患者已经被诊断为BPH。中选标准还可随着试验期不同而不同。临床试验的中选患者也可以根据尿路梗阻的客观测量，以及对口服治疗BPH无反应来选择。例如，在I期和II期试验中，所述标准常排除那些由于器官功能异常或其他因素而对研究性治疗有危险的患者。在II期和III期试验中，常包括有关疾病的类型和阶段以及先前治疗的数目和类型的其他标准。 

I期试验通常包括15-30名对其他治疗选择无效果的参与者。II期试验通常包括达100名已接受药物治疗或手术但是治疗没有效果的参与者。II期试验的参与者常常由于先前所接受的治疗而受限制。III期试验通常包括成百上千的参与者。为了确定MPP与标准治疗的效果是否存在真正差异，大量的参与者是必需的。III期包括从新诊断患有BPH的患者到患有广泛性疾病的患者，以覆盖疾病连续带(diseasecontinuum)。 

本领域技术人员应该理解，临床试验的设计应尽可能地全面，而不使受研究群体差异太大以致于不能确定治疗对较精细定义的群体是否有效。试验中包括的受研究群体差异越大，结果对于一般群体更为适用，尤其是在III期试验中。认为临床试验各期的合适的参与者的选择是在本领域工作者的普通技能范围之内。 

治疗前患者的评定 

在研究开始之前，可使用本领域已知的几种测定方法对患者进行初分类。例如，首先使用见于家庭医疗手册(Family Practice Notebook)网页上的良性增生症状指数来评定患者。也可以根据患者疾病的类型和/或其疾病的阶段和/或前列腺的大小对患者进行分类。 

临床试验中MPP的给药 

通常，通过注射将MPP给药于试验参与者。在一个实施方案中， 通过前列腺内注射进行MPP的给药。 

可对MPP的剂量范围进行试验。只要具有临床前试验的信息，熟练的医生就能容易地确定用于临床试验的MPP的合适剂量。在一个实施方案中，剂量范围为大约0.01μg/g前列腺至大约50μg/g前列腺。在一个实施方案中，剂量范围为大约0.02μg/g前列腺至大约40μg/g前列腺。在一个实施方案中，剂量范围为大约0.02μg/g前列腺至大约35μg/g前列腺。在一个实施方案中，剂量范围为大约0.03μg/g前列腺至大约25μg/g前列腺。在一个实施方案中，剂量范围为大约0.04μg/g前列腺至大约20μg/g前列腺。在一个实施方案中，剂量范围为大约0.04μg/g前列腺至大约10μg/g前列腺。在一个实施方案中，剂量范围为大约0.1μg/g前列腺至大约5μg/g前列腺。在一个实施方案中，剂量范围为大约0.2μg/g前列腺至大约3μg/g前列腺。在一个实施方案中，剂量范围为大约0.5μg/g前列腺至大约2μg/g前列腺。 

药物代谢动力学监测 

为了符合I期标准，例如，通过对定时采集的诸如血液或尿的样品进行化学分析来监测MPP的分布。例如，可以定时采集样品直到输注开始后大约72小时为止。 

如果不立即进行分析，可以将样品采集后置于干冰上，然后转到冰箱-70℃保存，直到可以进行分析。用于分析的样品可以使用本领域已知的标准技术来制备，并且所存在的MPP的量可以通过例如高效液相色谱方法(HPLC)来测定。 

药代动力学数据可以通过与临床药理学专家合作来获取和分析，并用于确定如清除率、半衰期以及最大血浆浓度。 

患者结果的监测 

临床试验的终点为表明所评估的化合物的效果的可检测结果。终 点在临床试验开始之前确定，并且根据临床试验的类型和时期而不同。终点的实例包括，例如前列腺体积减小，血PSA水平降低，泌尿道症状改善，尿流量改善，以及急性尿潴留减轻。其他终点包括毒性和生活质量。 

药物试剂盒 

本发明还提供了治疗试剂盒或试剂包，其含有用于治疗BPH的一种或多种MPP或包括一种或多种MPP的药物组合物。所述MPP可以以单位剂型在试剂盒中提供。试剂盒的各组分可以用单独的包装物包装，当适用时，与之相关的可以有由管理药物或生物制品的生产、使用或销售的政府机构规定的形式的通告，所述通告反映了用于人或动物给药的生产、使用或销售的政府机构的批准。所述试剂盒还可任选包括与本发明的MPP联合使用的一种或多种其他治疗剂。所述试剂盒可任选包括说明MPP和/或其他治疗剂的使用方法或给药方案的指导书或说明书。 

当试剂盒的组分以一种或多种液体溶液提供时，所述液体溶液可以是水溶液，例如无菌的水溶液。在这种情况下，包装物装置本身可以是吸入器、注射器、吸量管、眼滴管，或其他类似的器械，所述组合物可以从这些装置给药于患者或用于与试剂盒内的其他组分混合。 

所述试剂盒的组分还可以以干燥或冻干形式提供，并且所述试剂盒还可含有用于重溶冻干组分的合适的溶剂。不考虑包装物的数量或类型，本发明的试剂盒还可含有辅助组合物给药于患者的工具。这种工具可以是吸入器、注射器、吸量管、镊子、测量勺、眼滴管，或类似的医学上认可的递药工具。 

现在将参考具体实施例来描述本发明。应当理解，下述实施例意在描述本发明的实施方案而非意在以任何方式限制本发明。 

实施例 

实施例1：制备由PSA活化的MPP 

本实施例描述用来根据如表6内所示的本发明实施方案制备由PSA活化的MPP的方法。这些MPP衍生自气单胞菌溶素原。本领域技术人员应理解，可以使用相似的方法来制备由PSA或任何其它的前列腺特异性蛋白酶活化的其它MPP。此类蛋白质可以通过将气单胞菌溶素原的弗林蛋白酶序列取代为前列腺特异性蛋白酶切割位点如PSA特异性切割序列而产生。 

表6具有活化序列的MPP与野生型气单胞菌溶素原的比较，其中所述的活化序列含有由PSA切割的蛋白酶切割位点 

表6内所示的MPP包括气单胞菌溶素原序列(SEQ ID NO：1和2内所示的野生型PA)，其中弗林蛋白酶的6氨基酸识别位点(SEQ ID NO： 2的氨基酸427-432)由PSA切割位点替换。例如，MPP1(SEQ ID NO：3和4)包括其中弗林蛋白酶切割位点由PSA底物HSSKLQ(SEQ ID NO：5)替换的气单胞菌溶素原序列。 

使用如前所述的方法(Vallette等，Nucl.Acids Res.17：723-33，1988)，使用重组PCR来将气单胞菌溶素的弗林蛋白酶位点(SEQ ID NO：2的氨基酸427-432)取代成PSA特异性切割位点(SEQ ID NO：5、8、11或14)。简而言之，使用50μl终体积进行重组PCR，其中所述的终体积含有0.2mM脱氧核苷三磷酸(dNTP)、0.5μM正向引物和反向引物、0.1μg模板DNA和在pfu反应缓冲液[20mM Tris-HCl(pH 8.8)、10mMKCl、10mM(NH₄)₂SO₄、2mM MgSO₄、0.1％Triton X-100和0.1mg/mlBSA]的2.5单位克隆的pfu聚合酶。 

通过使用Taq聚合酶的PCR来筛选具有气单胞菌溶素原插入物的转化细胞。使用含有0.2mM dNTP、0.5μM正向引物和反向引物和5单位Taq聚合酶的PCR反应缓冲液[50mM KCl、1.5mM MgCl₂和10mM Tris-HCl(pH 9.0)]制备混合物。将这种混合物的10μl样品等分至0.2ml管内并且使用无菌牙签添加转化的细胞。 

PCR终产物使用适宜的限制酶切消化，随后连接至克隆载体pTZ18u(BioRad)用于扩增。简而言之，限制酶切消化在37℃在含有每μgDNA大约1单位限制酶的Pharmacia One-Phor-All缓冲液[10mMTris-乙酸盐(pH 7.5)、10mM乙酸镁和50mM乙酸钾]内进行90分钟。得到的插入物和pTZ18u载体DNA以大约5∶1的比率进行混合并在45℃加热15分钟。随后，将样品使用One-Phor All缓冲液稀释并且添加ATP至终浓度1mM用于粘端连接或至终浓度0.5mM用于平端连接。随后，将11单位的T4 DNA连接酶添加至每份样品内并且温和地混合样品。连接在13℃实施4小时(粘端连接)或16小时(平端连接)。 

进行DNA测序以确保产生正确的取代。插入物随后从克隆载体中 分离并亚克隆至广范宿主性质粒pMMB66HE(Furste等，Gene48：119-131，1986)用于在大肠杆菌中表达。使用前述的(Cohen等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 69：2110-4，1972)CaCl2洗涤法使大肠杆菌DH5α细胞变成感受态。通过离心收获对数期内的细胞(OD₆₀₀＝0.4-0.7)并在1/4体积的冰冷100mM MgCl₂内洗涤。使细胞再次沉淀(pelleted)并重悬于2体积的冰冷100mM CaCl₂。细胞随后在冰上温育大约45分钟。随后将细胞离心并重悬于1/10体积的100mM CaCl₂。继续温育额外的45分钟，随后添加甘油至15％终浓度。感受态细胞贮存在-70℃直至使用。 

将重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞根据Inoue等(Gene 96：23-8，1990)的方法进行。感受态细胞(200μl等分试样)与0.5-10ng的DNA在冰上温育1小时。随后使细胞在42℃热休克4分钟。将细胞迅速转移回到冰上5分钟。随后，将500μl的LB培养基添加至每份样品并将细胞在37℃温育1小时，同时温和地搅拌。将等分试样(150μl)涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上。这些平板在37℃温育过夜。 

使用Harayama等(Mol.Gen.Genet.180：47-56，1980)的滤膜接合技术，使重组pMMB66HE克隆通过接合而转移至杀鲑气单胞菌菌株CB3(见Buckley，Biochem.Cell.Biol.68：221-4，1990)。使用杀鲑气单胞菌的这种蛋白酶缺陷菌株导致产生不混杂已活化的气单胞菌溶素的MPP并导致大量蛋白质产生。MPP通过如前(Buckley，Biochem.Cell.Biol.68：221-4，1990)所述的羟基磷灰石层析法和离子交换层析法加以纯化。这种方法产生批次与批次之间相同的MPP制品。 

实施例2：MPP1在体外特异性裂解产生PSA的细胞 

本实施例描述用来测定根据如实施例1内所述的本发明实施方案的MPP特异性的方法。此类方法可以用来检验包含PSA特异性切割位点的MPP的特异性。 

检测MPP1对产生PSA的LNCaP细胞(美国模式培养物保藏所，马纳萨斯，Va.)和不产生PSA的TSU细胞(T.Itzumi博士，日本帝京大学)的对抗。细胞在10^-12M至10^-6M MPP1存在下温育24小时。随后，进行细胞计数并基于排出台盼蓝的能力评定活细胞百分数。测定MPP1相对于LNCaP和TSU系杀死50％细胞所需要的浓度(IC₅₀)。 

MPP1针对产生PSA的细胞的LD₅₀是10^-10M。相反，针对不产生PSA的TSU细胞的LD₅₀是大约5×10^-8M。如同对产生PSA的人细胞系与对不产生PSA的人细胞系的毒性相差500倍所证实的一样，该结果表明MPP1被PSA特异性地活化。 

实施例3：MPP1不在含有PSA的血液内活化 

包含PSA切割位点的MPP不应在血液内活化，原因是血液内因存在摩尔大为过量的血清蛋白酶抑制物如α-1-抗胰凝乳蛋白酶和α-2-巨球蛋白而使PSA受到酶灭活。 

为检验人血清内其它血清蛋白酶和PSA对MPP1的非特异性活化，敏感的溶血测定如下进行。添加血液红细胞(RBC，2％v/v)至含有MPP1±PSA的血浆或缓冲液。溶血的程度通过测量释放至上清液内的血红蛋白进行分析。添加0.1％Triton在数秒内引起100％溶血并且用作阳性对照。水解的量表述为540nm处样品吸光度与Triton处理的样品的吸光度的比率。在添加RBC前，MPP1(10^-8M)与PSA在含水缓冲液内单独预温育1小时，引起大约45％溶血(图2)。 

为确定MPP1是否在人血浆内被活化，将MPP1(10^-8M)在50％人血浆内温育1小时。在相关的实验中，首先添加过量的PSA(10,000ng/ml)至人血浆内并允许温育数小时。含有MPP1的血浆±PSA随后与人RBC(2％v/v)温育。添加MPP1的人血浆或添加高浓度PSA的人血浆未导致可察觉的溶血(即＜Triton对照的1％，图2)。这些结果表明MPP1 可以全身性施用而在血液内无任何显著活化，即便血液含有可测量的PSA。 

实施例4：MPP1、MPP2和MPP3的体外毒性和体内毒性 

本实施例描述用来测定MPP体外毒性和体内毒性的方法。 

为测定体外毒性，如下进行细胞生存力测定。EL4小鼠T-细胞淋巴瘤细胞(ATCC TIB-39)在MTS/PMS Cell Titer 96(Promega)内以每孔10⁵个细胞进行培养。如图3内所示，将MPP1、MPP2和MPP3以1×10^-13 M-1×10^-7M添加并与细胞在37℃温育4小时。随后根据MTS/PMS试剂盒的制造商的指导，通过在平板读数仪上对平板读数而测定细胞生存力。如图3内所示，MPP毒性比野生型气单胞菌溶素原低，其LCa₅₀ 是4×10^-9(MPP1)、1×10^-9(MPP2)和1×10^-7(MPP3)，相反，野生型的LC₅₀ 是1.5×10^-10。 

为测定体内毒性，将MPP静脉内施用至小鼠。野生型气单胞菌溶素原(SEQ ID NO：2)对小鼠的毒性高；1μg剂量在1小时内引起死亡并且在单次IV注射24小时后的LD₁₀₀(即在24小时内杀死100％动物的剂量)是0.1μg。与之相比，MPP1(SEQ ID NO：4)在注射24小时后的LD₁₀₀高25倍(即2.5μg总剂量)。 

实施例5：MPP5(组氨酸标记的MPP)的制备 

本发明组氨酸标记的MPP(MPP5)如下制备。对含有编码MPP1的基因的质粒插入物进行修饰以使纯化更简易并提高产量。对35个核苷酸的片段(stretch)进行修饰以防止环形成，并留出ATG起始密码子上游的23个核苷酸(Diep等，Mol.Microbiol.30：341-52，1998)，其中所述35个核苷酸的片段包括核糖体结合位点和ATG起始密码子，而且其在转录时形成导致蛋白质的产量减少的二级环结构(Burr等，J.Bacteriol.183：5956-63，2001)。这增加了可以释放至CB3的培养上清液内的MPP的量(Burr等，J.Bacteriol.183：5956-63，2001)。将具有 这种新上游序列的构建体命名为γ123启动子构建体。通过用KpnI和EcoRI消化MPP1构建体，随后连接所得片段至γ123-aerA::pTZ18U的KpnI/EcoRI位点而实现变化。所得构建体称作γ123-MPP1::pTZ18U。 

使用2步法QuikChange(Stratagene)方案完成添加His标签。在第一步骤内，3个His残基通过合成两种引物(3个CAT密码子编码额外的His残基)而添加到γ123-MPP1 DNA的末端： 

EndHis1(有义)：5’-GCT GCC AAT CAA CAT CAT CAT TAACGG CAG CGC-3’(SEQ ID NO：26) 

EndHis1(反义)5’-GCG CTG CCG TTA ATG ATG ATG TTG ATTGGC AGC-3’(SEQ ID：27) 

这些引物按照Stratagene对QuikChange试剂盒所建议的方案使用。一旦3个His残基的DNA的加入通过测序得到证实，则进行第二次QuikChange反应以便添加最后3个His残基的核苷酸。在该步骤内，所用的引物是： 

EndHis2(有义)5’-GCC AAT CAA CAT CAT CAT CAT CAT CATTAA CGG CAG CGC-3’(SEQ ID NO：28) 

EndHis2(反义)5’-GCC AAT CAA CAT CAT CAT CAT CAT CATTAA CGG CAG CGC-3’(SEQ ID NO：29)。 

在第二轮PCR后，筛选克隆并对其测序以证实6个His残基在γ123-MPP1末端以正确的可读框内正确插入，并对γ123-MPP1序列没有造成其它变化。得到的质粒命名为γ123-MPP5::pTZ18U，并对γ123-PSAH6插入区测序(见图34)。 

γ123-MPP5的核苷酸序列与MPP1构建体核苷酸序列在ATG起始密码子之前的区域内的差异是γ123启动子替换正常aerA上游序列。γ123-MPP5的核苷酸序列还具有紧邻TAA终止密码子之前的额外CAT重复序列。当γ123-MPP5的可读框翻译成氨基酸序列时，与MPP1氨基酸序列比较可见的仅存差异是在蛋白质的C末端添加了6个组氨酸 残基。 

γ123-MPP5克隆至pMMB208表达载体 

将通过添加γ123启动子和His标签产生的γ123-MPP5克隆至质粒pMMB208内。该质粒因其赋予氯霉素抗性而选择，它含有IPTG诱导型tac启动子并且可以通过转接作用转移至杀鲑气单胞菌内。因此，将γ123-PSA PAH6插入物克隆至pMMB208质粒的Hind III和EcoRI位点内。得到的质粒γ123-MPP5::208转接至杀鲑气单胞菌菌株CB3用于产生MPP5。 

为纯化GLP MPP5，用大约1％v/v摇瓶接种物接种初始pH设定为6.90±0.15及温度27℃的30L无菌确定成分培养基。培养基的pH通过发酵期间自动添加无菌的酸/碱而维持在6.90±0.15。调节发酵罐RPM和SLM以便在全部时间内维持容器内的溶氧浓度(DOT)≥20％。细胞密度达到600nm OD 0.3-0.6时，添加异丙基硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导MPP5表达。表达的蛋白质分泌至培养基并在诱导数小时后得以收获。使用60 SP CUNO滤器回收含有MPP5的上清液。细胞分离后，上清液使用30,000 NMWC TFF膜浓缩。浓缩的上清液使用两个层析步骤加以纯化产生可接受纯度蛋白质：镍螯合层析，随后阴离子交换层析。合并来自阴离子交换层析步骤中的含有MPP5的部分，并且将得到的材料通过超滤作用浓缩至大约1mg/mL并且随后透析滤过(diafiltered)至制剂缓冲液内。纯化的MPP5使用0.22μm绝对过滤器在鉴定的生物安全柜内无菌过滤并冷冻至-70℃直至需要时。使用该方法纯化的MPP5终产率是大约100mg/L。 

实施例6：在白化大鼠内MPP5的急性前列腺内或静脉内推注的毒性研究。 

本实施例显示表明对大鼠前列腺内施用组氨酸标记的MPP(MPP5)能够减少前列腺重量的研究的初步结果。 

结果简述 

本研究的目的旨在证实单次前列腺内注射或静脉内推注至雄性大鼠，随后观察1、14或28日时间后，MPP(MPP5)的最大耐受剂量(MTD)并旨在研究MPP(MPP5)的潜在毒性和毒性动力学。MPP5是包含PSA切割位点的组氨酸标记的气单胞菌溶素原分子。 

研究设计详述于表7和8内： 

表7：研究设计 

MTD研究 

IP-前列腺内，IV-静脉内，动物在48小时观察时间后被处死。 

表8：主要研究设计和毒物动力学研究设计 

IP-前列腺内(20μL)，IV-静脉内(0.05mL)、TK-毒物动力学 

评价如下项目：临床征兆、体重、食物消耗、眼科学、血液学、血清化学、尿分析、毒物动力学、尸体剖检的大体观察、器官重量和 组织病理学。体重、体重增加、食物消耗、眼科学或尿分析参数不受影响。在第2日发现一只使用40μg做前列腺内处理的MTD动物死亡。其在死亡之前不存在与处理相关的临床征兆。胃内见深色病灶并且在注射部位(前列腺)处有明显暗色区域和肿胀。在第2日发现两只使用25μg做前列腺内处理的主要研究动物死亡。在死亡之前，其中一只动物不存在处理相关性临床征兆，而另一只动物观察到绒毛染色(furstaining)(口鼻部)、蓝色皮肤、活动性降低、虚弱、下降的肌肉张力、清亮液体排出物(眶周)、苍白眼(pale eyes)、呼吸费力、侧卧和触感冰凉。其中一只动物的肉眼检查结果包括：在注射部位(前列腺)处的暗色区域；睾丸内的深色病灶；腹腔内苍白色的清亮流体，包括靠近肝脏的苍白色物质。在另一只动物中，脂肪和空肠内见损害，包括变色。肝脏内见粘连，胰脏增厚，胃和胸腺内有多个暗色区域并且在靠近附睾的腹部脂肪内有深色病灶。然而，没有确定这两只雄性大鼠的具体死因，据推测接近肾脏的前列腺炎症的严重性和并发的全身性退化改变导致这些动物死亡。 

在以全部MTD IP剂量水平处理的动物内均可见到处理相关性临床征兆。第1日和第4日间，在全部组的一些动物中的一个或多个部位(包括口鼻部、颚、前爪、眶周和腹侧/背侧的颈部)内见到了红色的绒毛染色。注意到在使用20μg和40μg时，分别具有1/3的动物出现蓝色皮肤变色(手术部位、腹部部位、泌尿生殖器部位或腹股沟部位)，其中包括使用40μg的一只动物内的泌尿生殖器肿胀。据记录，在静脉内处理的MTD动物内，使用50μg处理的动物中红色绒毛染色(口鼻部和/或眶周)的发生率更高。 

红色绒毛染色(口鼻部)主要在来自全部IP剂量水平的主要研究动物(包括对照)内见到，但是通常在处理的动物内具有更高的发生率。认为此临床征兆可能是处理相关的。红色的绒毛染色(口鼻部)还在全部IV的主要研究动物内观察到。在注射部位(尾部)记录到了其它的临床征兆，其包括皮肤结痂和/或发红或其它变色。此外，由于损害和怀疑其 自残，必须对两只动物进行断尾。这些稍后的变化提示了在组织病理学检查后得以进一步证实的检品制剂的潜在刺激性。 

第2天，在主要研究的IP动物中，观察到一些白细胞参数具有剂量相关性增加。在所有使用10μg和/或25μg处理的组中，WBC计数、嗜中性粒细胞计数、单核细胞计数和嗜碱性粒细胞计数均增加。在使用25μg的MCHC内以及在全部剂量水平的MPV内也见到了增加。在全部的剂量水平均记录到网织红细胞百分数和绝对值的减少。在活化的部分促凝血酶原激酶时间内记录到全部IP剂量水平均具有轻微而剂量相关性的增加。在使用25μg静脉内处理的动物中观察到相似的变化。WBC计数、嗜中性粒细胞计数和嗜碱性粒细胞计数增加。MCHC、MPV和红细胞分布宽度(RDW)也增加并且网织红细胞的百分数和绝对值减少。在14日观察后处死的动物内，仅见到RDW和MPV增加并且在28日后，在血液学参数方面没有记录到差异。认为在观察1日后处死的动物内所记录到的变化与检品相关。在15日和28日观察时间后所示的结果证实了从这些变化中的恢复。 

使用25μg时，在第2日见到平均天冬氨酸氨基转移酶浓度和平均丙氨酸氨基转移酶浓度的剂量相关性增加，并认为是明显的。在使用25μgIP时，也记录到直接胆红素、尿素、肌酸酐和三酰甘油浓度的增加。在25μg时见到葡萄糖浓度减少并且在≥10μg时白蛋白浓度减少，但是仅在25μg时才会使相关的白蛋白对球蛋白比率减少和使总蛋白浓度减少。在25μg IV处理的动物内，见尿素和钙浓度的轻微增加，并且还记录到球蛋白浓度的轻微增加，因而使得白蛋白对球蛋白的比率相应减少。认为这些变化与在注射部位处观察到的炎症相关。在第29日，只有25μgIP记录到了丙氨酸氨基磷酸酶浓度的增加和间接胆红素浓度的减少。 

对于静脉内施用，估计复合的消除半衰期为12.8小时。C_max可以反向外推出0小时时具有的值为81.3ng/mL。观察到的峰值(在首次采 样时间)是74.3ng/mL。全身清除率(CL)和分布容积(V_z)据估计分别为46.3mL/h和841mL。前列腺内施用后，对于所有的情况而言，所观察到的t_max均在给药4小时后出现，其中10μg的峰值是2.95ng/mL，25μg的峰值是3.51ng/mL。观察到的AUC_0-t最后似乎在较高剂量时减少，原因是所观察到的t_最后不同。使用C_max和AUC_0-t最后评估用于前列腺内途径的剂量线性。经剂量归一化的两种暴露参数均从10μg减少至25μg，并且估计的相应生物利用率是23.7％和4.38％，全部这些参数表示随剂量水平渐增，MPP5从前列腺被有限地吸收至全身循环内。 

在MTD相期间，MPP5在雄性大鼠内以40μg的单次IP剂量给药与具体死因不明的死亡有关。MPP5在雄性大鼠内单次IV给药的最大耐受剂量高达50μg。 

在主要研究相期间，MPP5在雄性大鼠内以25μg单次IP注射引起2只大鼠死亡，在≥2μg时引起前列腺注射部位大体变化、微观变化和器官重量变化。不能确定地找到两只雄性大鼠的死因，但是推测前列腺炎症的严重性和相关变化对这些动物的恶化/死亡有作用。另一个检品相关性变化在恢复期的第2、15和/或29日观察到。认为在其它组织内的大体变化、微观变化和器官重量变化继发于前列腺注射部位变化。 

MPP5在雄性大鼠内以≥25μg的剂量单次IV注射引起尾静脉注射部位的大体变化和/或微观变化。这些在25μg时所产生的变化于恢复期的第2、15和29日随进行性恢复而被观察到，并说明检品的刺激性效应。认为其它组织内的大体变化和微观变化继发于注射部位变化。第2日的肝脏和脾脏的器官重量变化没有微观的相关性并在第15日恢复。 

结论是：MPP5通过在多达40μg剂量水平上的单次前列腺内注射或在多达50μg剂量水平上的单次静脉内注射施用引起以25μg和40 μgIP的无清晰死因的死亡，然而，认为检品相关性前列腺炎症的程度和与肾脏接近和并发的全身性退化是死亡的促进性因素。≥10μg时可见可逆变化大多在临床征兆(≥2μg)、血液学和临床生物化学参数。病理学变化在全部剂量水平上以剂量相关性方式持续存在，但是在静脉内处理的动物内显示出衰退迹象。因此，未对前列腺内途径或静脉内途径确定不可观察的效应水平(NOEL)。 

实验方法 

3.1试验系统 

使用总共180只雄性Sprague Dawley(Crl：CD

(SD)IGS BR)大鼠(褐鼠)。在处理开始时，动物为12至15周龄并且体重范围是399g至495g。 

3.2兽医学处理 

在第4日和第7日，分别对动物5010和5004实施断尾，原因是怀疑其自残。当这些动物进行静脉内处理时，将切断的组织保留在中性缓冲的10％福尔马林内用于病理学评价。 

在处理之前，将全部动物称重并使用基于计算机的随机化方法将其随机分配到处理组内。使用体重作为参数，通过分层进行随机化。不将健康状况不良的动物分配到组内。研究设计详述于表9(MTD)和表7(主要)。 

表9： 

MTD研究 

IP-前列腺内，IV-静脉内 

分配到MTD研究的动物在48小时观察时间后处死。在第1日，分配到IP剂量方案的动物6001和8001因技术失误(给药超过分配给它们的剂量10倍)而分别由备用动物6101和8101替换。同一日稍后，发现动物8001(400μg)在给药大约4小时后死亡，并且动物6001(100μg)在第1日结束时因不良状态而进行安乐死。这些动物接受尸体剖检，包括详细的外部检查和内部检查，然而，未保留用于组织病理学检查的组织。在死亡之前，动物6001的临床征兆包括虚弱、下降的肌肉张力、部分闭眼、触感冰凉、减少的活动和异常步态。动物8001的临床征兆包括侧卧、呼吸费力、减少的呼吸频率、蓝色皮肤、苍白眼、触感冰凉、减少的活动、虚弱和下降的肌肉张力。对动物6001的大体检查显示在施用部位(前列腺)处仅有暗色区域。对动物8001而言，在下颌骨淋巴结内两侧具有深色变色并且在注射部位(前列腺)具有肿胀。认为这些死亡可能与高剂量MPP5施用相关并且加以报道以便为本研究内的MTD提供进一步参考。 

因为在≤40μg时所见到的观察结果有限，故在第13日(MTD研究)添加了以50μg的剂量水平经静脉内途径给药的额外动物，目的是进一步探测经过该途径的MPP5毒性。 

在开始给药之前，认为动物1025因错位咬合而不适合研究用途，并由备用动物替换，此备用动物变成动物1125。遣散来自该研究的仍未分配至组内的全部动物并且记录对它们的处置。 

3.3.检品和载体对照品 

检品是浓度3.2mg/mL的MPP5(批号PTIC-MF-PAL-DS-001)。该检品冷冻时是无色固体并且在-20℃避开直射光线进行贮存。载体对照是磷酸盐缓冲盐水-EDTA(pH 7.4)。 

3.4给药制剂的制备 

剂量制剂在使用当日制备。在每一日，量取适宜量的3.2mg/mLMPP5贮存液并将其用适宜量的PBS，1mM EDTA稀释。 

3.5施用检品/对照品 

MTD研究 

具有三只大鼠的组如3.2部分和表9内所述在单日内以前列腺内或静脉内方式给药，并观察临床征兆和潜在毒性直至给药后48小时。对于静脉内施用，检品以0.5mL的剂量体积经尾静脉静脉内注射施用。 

对于前列腺内组，在剂量施用前，使用异氟烷麻醉动物。在手术前至少1小时并在手术后多达2日，动物接受抗生素苄星青霉素G和普鲁卡因青霉素G(0.1mL)肌内注射。动物还在手术当日接受丁丙诺啡(0.05mg/kg)皮下注射。 

使用手术刀片，从阴茎颅侧0.5cm开始，行大约2cm的正中切口。将腹部切开同样长度。定位前列腺的两片腹叶并使用适宜的注射器将20μL配制的MPP5或PBS/EDTA pH 7.4注射至右侧腹叶。在缝合前，该部位用温热(大约37℃)的0.9％氯化钠注射液(U.S.P.)冲洗。使用适宜的缝合材料分层缝合该部位。 

对于分配至静脉内途径组的动物，经尾静脉，静脉内施用0.5mL剂量体积的检品。 

主要研究 

根据在MTD相期间建立的方法对动物剂量给药。对于分配至静脉内途径组的动物，经尾静脉，静脉内施用0.5mL剂量体积的检品。处理完成后，对主要研究动物在第1、14或28日恢复期内保持不剂量给药。 

3.6观察 

临床观察：在整个研究期间，每日均对全部动物观察两次(在抵达日和尸体剖检日，观察一次)死亡率和不良健康征兆和/或对处理的反应。此外，在处理开始前进行至少一次详细检查以及在整个处理和恢复期期间每日均进行详细检查(主要研究动物和MTD研究动物)。 

体重：在随机分配的当日对全部动物测量个体体重并在整个处理和恢复期期间每周测量两次个体体重(主要研究动物)。此外，在计划尸体剖检前对每只主要研究动物/恢复动物称重(禁食)。在剂量给药前和在终末期处死前对MTD研究动物称重。 

食物消耗：从预处理期的最后一周开始并在整个处理期和恢复期期间，对全部主要研究动物每周测量个体食物消耗。 

眼科学：眼底镜检查(间接的眼底检查法)和生物显微镜(裂隙灯)检查由委员会认为合格的兽医眼科医师在开始处理(全部动物)前进行一次并在尸体剖检(主要研究动物)前再进行一次。 

实验室研究：对全部主要研究动物在第2、15和29日尸体剖检时进行用于血液学和血清化学检验的血液采样。在血液采样前对动物禁食过夜。在异氟烷麻醉下从腹主动脉内收集血液样品。 

尿样品在尸体剖检前在第2、15和29日从置于代谢笼内的主要研究动物内收集大约16小时时间，在此期间对动物禁食。 

所检查的血液学参数是：活化的部分促凝血酶原激酶时间、血液细胞形态学、红细胞指数(MCV、MCH、MCHC和RDW)、红细胞比积、血红蛋白、平均血小板体积、血小板计数、凝血酶原时间、红细胞计数、网织红细胞计数(绝对值和百分数)、血液白细胞计数(总数、绝对值和百分数的微分)。 

所检查的血清化学参数是：(计算的)A/G比率、丙氨酸氨基转移酶、白蛋白、碱性磷酸酶、天冬氨酸氨基转移酶、血液尿素氮、氯化钙、胆固醇、肌酸酐、(计算的)球蛋白、葡萄糖、无机磷、钾、钠、总胆红素、总蛋白、三酰甘油。 

所检查的尿分析参数是：胆红素、血液颜色和外观、肌酸酐、葡萄糖、酮、显微镜检查亚硝酸盐的离心沉积物、pH、蛋白质、比重、尿胆素原、体积。 

免疫原性评估(仅在主要研究的第14日和第28日进行) 

给药前(基线)从每只主要研究大鼠的颈静脉中收集血液样品并在终末期处死时异氟烷麻醉后(随用于临床病理学的血液采样一起)自腹主动脉收集血液样品。样品放置在血清分离管内，颠倒数次，允许在室温凝固20分钟至30分钟，且随后在大约4℃下以大约1200g离心10分钟。 

3.7毒性动力学 

在研究第1日，在给药前，给药后15分钟和30分钟及1、2、4、8、24和48小时的每个时间点依次从每组的三只毒物动力学研究大鼠中，通过颈静脉穿刺收集血液样品(～0.5mL)至K3 EDTA管内。血液 样品立即置于湿冰(wet ice)上直至通过大约2700rpm冷冻(大约2℃至8℃)离心10分钟进行分离。将血浆分离，转移至第二个管内并置于干冰上。血浆样品贮存在大约-20℃并对MPP5的水平进行分析。 

通过基于抗体夹心原理的酶联免疫吸附测定(ELISA)分析血浆样品。对MPP5特异的捕获抗体(小鼠抗气单胞菌溶素单克隆抗体)包被在96孔微量滴定平板上以产生捕获标准物和质控样品内存在的分析物的固相。随后添加与分析物分子的不同表位结合的第二抗体(兔抗气单胞菌溶素多克隆抗体)以完成抗体-分析物-抗体夹心。随后添加与兔IgG抗体恒定区结合的检测抗体酶缀合物(山羊抗兔IgG，马辣根过氧化物酶缀合物)。捕获的缀合物使用四甲基联苯胺底物进行显像并使用SpectraMAX平板读数仪在450nm测量。 

对于前列腺内给药途径，根据血浆浓度数据进行无房室毒物动力学分析。作为惯例，毒物动力学分析包括评估t_max、C_max、AUC、k和t_1/2。t_max和C_max是观察值。如果可能，通过梯形法则(Gibaldi和Perrier，1982)，使用标准的计算机软件程序WinNonlin(3.2版本)计算AUC参数。通过浓度-时间曲线的表观终末期内所选时点的线性回归分析确定K。表观终末半衰期如下计算：t_1/2＝ln2/k。 

对于静脉内给药途径，根据血浆浓度数据进行无房室毒物动力学分析。作为惯例，毒物动力学分析包括评估t_max、C_max、AUC、k、t_1/2、V_z和CL。C_max将反向外推至时间0小时。通过梯形法则(Gibaldi和Perrier，1982)，使用标准的计算机软件程序WinNonlin(3.2版本)计算AUC参数。通过浓度-时间曲线的表观终末期内的所选时点的线性回归分析确定K。表观终末半衰期如下计算：t_1/2＝ln2/k。清除率(CL)由剂量/AUC计算并且分布的表观容积(V_z)计算为CL/k。 

3.8.处死方法 

大体病理学：使研究期间发现死亡的MTD研究动物接受尸体剖检 处理，不保存组织。使研究期间发现死亡的全部主要研究动物和恢复动物接受尸体剖检处理并且保留组织样品。 

在处理和恢复期结束时，全部存活的动物在异氟烷麻醉后从腹主动脉放血并且收集血液样品用于实验室研究。为了避免自体溶解变化，使全部的主要研究动物在安乐死后，尽可能快地进行尸体的完整大体病理学检查。 

器官重量：对于计划尸体剖检时进行安乐死的每只主要研究动物，切下不带脂肪的如下器官并称重：肾上腺、脑、心脏、肾脏、肝脏、肺脏、睾丸、垂体、前列腺、脾脏、胸腺、甲状腺叶(和甲状旁腺)。成对的器官一起称重并计算相对于体重的器官重量比率。 

组织保存：在每只主要研究动物的尸体剖检结束时，保留如下的组织和器官：异常物、动物标识、肾上腺、主动脉(胸廓)、骨和骨髓(胸骨)、脑(大脑、小脑、中脑和延髓)、盲肠、结肠、十二指肠、附睾、食管、眼、哈德氏腺、心脏(包括主动脉部分)、回肠、组1至4的注射部位(前列腺)、组5的注射部位(尾静脉)、空肠、肾脏、泪腺、肝脏(2片叶的样品)、肺脏(2片叶的样品)、(下颌骨和肠系膜)淋巴结、(腹股沟)乳腺、鼻腔和鼻窦(3个水平)、视神经、胰脏、垂体、前列腺(未注射的叶)、直肠、唾液腺、坐骨神经、精囊、骨骼肌、(腹股沟)皮肤、(颈部)脊髓、脾脏、胃、睾丸、胸腺、甲状腺叶(和甲状旁腺)、舌、气管、(双侧)输尿管、膀胱。 

中性缓冲的10％福尔马林用于组织固定和保存，除了在岑克尔固定液(zenker′s fluid)内固定(仅安乐死的动物)的附睾、眼、视神经和睾丸之外。对于全部安乐死的动物，制备并染色三张股骨骨髓涂片。保留涂片但不进行评价。 

组织病理学： 

将组织包埋在石蜡内、切片(鼻腔和鼻窦、胸骨和尾静脉注射部位在切片前进行脱钙)并用苏木精及伊红染色并做如下组织病理学检查： 

组1、4和5：列于组织保存下的组织(除了动物标识和直肠) 

组2和组3：显示处理相关性结果的组织，以下列出全部大体损害和靶组织： 

对于全部剂量组内的全部主要研究动物，将靶组织的组织样品进行加工并检查，其中所述的靶组织包括脑、心脏、肾脏、肝脏、淋巴结、注射部位(前列腺)、前列腺(未注射的叶)、脾脏、甲状腺叶(和甲状旁腺)、输尿管和膀胱。视神经、甲状旁腺和乳腺如果分别存在于眼、甲状腺和皮肤的常规切片内，则仅做组织病理学检查。 

统计分析： 

对研究进行期间所获得的数字数据计算组均值和标准差。对于每种目的参数，使用Levene氏检验在0.05显著性水平上比较组方差。当组方差间的差异未见显著时，则进行参数的单因素方差分析(ANOVA)。若ANOVA(p≤0.05)显示均值间差异显著，随后使用Dunnett′s″t″检验来进行对照组和每个处理组间的组均值比较。 

无论如何当Levene氏检验显示非均匀的组方差(p≤0.05)时，则使用无参数Kruskal-Wallis检验来比较所考虑的全部组。如果Kruskal-Wallis检验是显著的(p≤0.05)，随后使用Dunn氏检验评估对照组和每个处理组间差异的显著性。 

对于每一目的配对组比较，显著性在0.05、0.01和0.001水平上报道。 

结果和讨论 

1.剂量制剂分析 

在表10内显示对研究中所用的给药制剂的pH、摩尔渗透压浓度 和密度评估的结果。 

表10：剂量制剂的pH、摩尔渗透压浓度和密度 

2.死亡率 

MTD研究 

在第2日，发现动物8101(40μg、IP)死亡。其在死亡前，不存在处理相关的临床征兆。在尸体剖检时，在胃内见到深色病灶并且在注射部位(前列腺)记录到暗色区域和肿胀。未确定清晰死因。 

主要研究 

在第2日，发现动物4005和4013(25μg、IP)死亡。在死亡前，未记录到动物4013存在处理相关的临床征兆。对于动物4005而言，记录到绒毛染色(口鼻部)、蓝色皮肤、减少的活动、虚弱、下降的肌肉张力、清亮液体排出物(眶周)、苍白眼、呼吸费力、侧卧和触感冰凉。 

在对动物4005尸体剖检时，大体尸检结果包括：在注射部位(前列腺)的暗色区域、睾丸内深色病灶、腹腔内苍白色的清亮流体，包括毗邻肝脏的苍白色物质。对于动物4013，在脂肪和空肠内见到损害， 包括变色。肝脏内见粘连、胰脏增厚，胃和胸腺内的多个暗色区域和在腹部脂肪内毗邻附睾的深色病灶。然而，死因在两例动物内不确定，据推测组织病理学所观察到的接近肾脏的前列腺炎症的严重性和并发的全身性退化改变对这些动物死亡有作用。 

3.临床观察 

MTD研究 

在全部MTD IP剂量水平(10μg至40μg)处理的动物内均见到处理相关的效应。在第1日和第4日之间，在全部组的2/3动物中的一个或多个部位(包括口鼻部、颚、前爪、眶周和腹侧/背侧的颈部)内见到了红色绒毛染色。注意到在使用20μg和40μg时，分别具有1/3的动物出现蓝色皮肤变色(手术部位、腹部部位、泌尿生殖器部位或腹股沟部位)，其中包括在动物8002(40μg)内的泌尿生殖器肿胀。虽然这些观察可能与手术操作相关，但是使用40μg时其发生率和严重性增加。 

在静脉内处理的动物中，处理相关性临床征兆限于红色绒毛染色(口鼻部和/或眶周)，据记录在使用50μg处理的动物内具有更高的发生率。在第1日和第4日期间，与在＜50μg观察到的1/3动物具有这些征兆相比，多达5/5的给予高剂量的动物观察到具有这些征兆。 

主要研究 

第2日结束 

据记录，来自全部IP剂量水平的一些动物具有红色绒毛染色(口鼻部、眶周和/或颅)，其中这些动物包括3/7对照动物、使用2μg的1/7动物、使用10μg的5/7动物和使用25μg的3/7动物。观察到动物4014(25μg)具有来自双眼的红色排出物，并且动物4015在第2日尸体剖检前活动减少而且触感冰凉。 

4.食物消耗 

对食物消耗没有影响。 

5.眼科学 

无眼科学结果。 

6.血液学 

在第2日处死的IP动物内，观察到一些白细胞参数具有2倍或更高倍数的剂量相关性增加。全部处理组的血液白细胞(WBC)计数、嗜中性粒细胞计数、单核细胞计数和嗜碱性粒细胞计数均增加，并且在10μg和/或25μg时达到统计显著性。在25μg上的平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)及在全部剂量水平上的平均血小板体积(MPV)内也见到了统计学上显著的增加。记录到在全部剂量水平的网织红细胞百分数和绝对值减少。据记录，活化的部分促凝血酶原激酶时间在全部IP剂量水平上均具有轻微而剂量相关性的增加，并且在25μg上达到统计显著性。 

在用25μg MPP5静脉内处理的动物内观察到相似变化。WBC计数、嗜中性粒细胞计数和嗜碱性粒细胞计数增加。MCHC、MPV和红细胞分布宽度(RDW)也增加并且网织红细胞的百分数和绝对值减少。在观察14日后处死的动物内，仅见到RDW和MPV增加。在观察28日后，血液学参数方面不存在差异。在观察1日后处死的动物内记录到的变化被认为是检品相关性的并且与组织病理学相关。在15日和28日观察时间后所示的结果显示了从这些变化中恢复的迹象。认为其它微小差异是偶然的并且与处理不相关。 

7.血清化学 

在第2日，见到平均天冬氨酸氨基转移酶浓度和平均丙氨酸氨基转移酶浓度剂量相关性增加在25μgIP时达到统计显著性。认为这些是在25μg上的明显变化。在使用25μgIP时，也记录到直接胆红素浓度、尿素浓度、肌酸酐浓度和三酰甘油浓度的增加。在25μg时见到葡萄糖浓度减少。在≥10μg时白蛋白浓度减少，但是仅在25μg时才会使白蛋白对球蛋白的相关的比率减少和使总蛋白浓度减少。 

在25μg IV处理的动物内，见到尿素浓度和钙浓度的轻微增加。还记录到球蛋白浓度的轻微增加，伴随白蛋白/球蛋白(A/G)比率相应减少。认为球蛋白(及因此A/G比率)的变化可能与注射部位处的炎症相关。 

在第15日，在全部剂量水平上(包括IV处理动物)均见到了三酰甘油浓度的统计显著的减少。认为这些减少不是毒理学显著性的并且可能与脂代谢方面的微小变动相关。 

在第29日，仅在25μg IP时记录到丙氨酸氨基磷酸酶浓度的增加和间接胆红素浓度的减少。这些变化可能与组织病理学描述的继发变化相关。 

没有其它毒理学显著的变化。 

8.尿分析 

对尿分析参数没有明显影响。 

9.毒性动力学 

MPP5的血浆浓度通常在每组的单只动物之间在每一时点上是相似的。由于剂量水平没有根据体重或前列腺重进行归一化，因而预期到在血浆浓度值上的某些变动。在从对照动物中收集的样品内或在给药前所收集的样品内的MPP5是不可定量的。 

在试验组内，MPP5的血浆浓度通常随前列腺内所施用的检品的剂量水平增加而增加，在从给予2μg的动物中收集的任意样品中无可检测到的浓度的MPP5。直至24小时在10μg处理的动物内是可检测的，直至8小时在25μg处理的动物内是可检测MPP5的并且直至48小时在组5(25μg，静脉内)是可检测的。总之，获得三条复合曲线并考虑对 其做出进一步评价。 

可以对复合的IV曲线估计终末期，其中估计终末半衰期是12.8小时。对于其余曲线，不能可靠地估计终末期。因此，未报告衍生自k的全部参数(t_1/2、AUC_0-inf和％外推)。对于IV曲线，从AUC_0-t最后外推的AUC_0-inf的百分数小于6％，标示该曲线从实验数据中得以良好表征。 

在前列腺内给药后，对于所有的情况而言，所观察到的t_max在给药后4小时均出现，其中10μg和25μg的峰水平分别是2.95ng/mL和3.51ng/mL。观察到的AUC_0-t最后在较高剂量时减少(48.5对22.4ngh/mL)。然而，在25μgIP时观察到的较短t_最后(8小时对在10μgIP的24小时)使该结果偏倚。在IV给药后，C_max可以反向外推至时间0小时，得到81.3ng/mL的值。观察到的峰值(在首次采样时间)是74.3ng/mL。全身清除率(CL)和分布容积(V_z)据估计分别为46.3mL/h和841mL。 

前列腺内给药后的剂量线性用剂量归一化的平均血浆峰浓度和暴露参数曲线下的面积(分别是C_max和AUC_0-t最后)，在10μg至25μg剂量水平上进行评估。来自10μg至25μg的经剂量归一化的两种暴露参数减少。这可能表示MPP5从前列腺被有限地吸收至全身循环内。 

基于前列腺内施用后在中等剂量至高剂量观察到的面积(AUC_0-t最后 )，通过将这些面积(对剂量水平归一化)与静脉内施用后所获得的剂量归一化面积相比，测定生物利用率百分数。估计的生物利用率是23.7％和4.38％。 

10.器官重量 

前列腺内注射 

偶尔达到统计显著性的绝对器官重量和相对器官重量(器官重量对体重)的变化在全部处死日的前列腺内及在处死第2日的脾脏内被记 录到。与对照比较，使用10μg和25μg的动物内前列腺重量在第2日增加26％至45％。与对照比较，在以≥10μg处理的动物内前列腺重量在第15日降低16％至24％并且在第29日降低19％至21％。这些变化与观察到的微观结果一致。与对照比较，脾脏重量在25μg时在第2日降低大约36％。认为该变化是继发变化并且此变化在第15日恢复。 

静脉内注射 

与对照相比，以25μgIV的动物在第2日具有高大约21％的肝脏重量和脾脏重量，但是其没有组织学相关性，并在第15日恢复。 

11.大体病理学 

MTD研究 

在全部IP剂量水平上鉴定前列腺注射部位变化。变动包括深度变色/分布区、斑纹和肥大/肿胀。在第1日替换的动物(编号6001、8001)或IP注射后在第2日发现死亡的动物(编号8101)具有一些如上所述的前列腺注射部位变化。未确定具体死因。在尾静脉进行静脉内(IV)注射与组8和组9动物的尾部上的痂有关。认为其它变化是散在的、与操作相关的或者是末期的(agonal)而且不与处理相关的。 

主要研究 

前列腺注射部位变化在全部处死日进行鉴定。第2日变化以全部剂量水平上的深度变色/分布区/病灶、粘连和肥大/肿胀为特征。在以≥10μg处理的动物中，第15日和第29日的变化描述为苍白区、隆起、坚硬和/或细小。以≥10μg处理时，在第15和29处死日时往往在肝脏和脾脏上看到粘连和苍白区，并且所述粘连和苍白区可能继发于前列腺注射部位变化。在(25μgIP)第2日发现死亡的动物4005具有一些如上所述的前列腺注射部位变化。未确定具体死因。 

在尾静脉进行的静脉内注射与全部处死日时尾部上的痂有关。溃疡在第15日和第29日出现，其损伤尾稍或不损伤尾稍。在第2处死 日观察到肝脏增大。 

认为其它变化是散在的、与操作相关的或者是濒死的而且不与处理相关的。 

12.组织病理学 

前列腺内注射 

在前列腺注射部位以≥2μg施用时，第2、15和29日观察到归因于MPP5的微观变化。在第2日，全部剂量均观察到了细微至严重的急性炎症，所述急性炎症的严重性通常具有剂量依赖性的增加。炎症以血纤蛋白、混合的细胞浸润和腺泡坏死为特征。水肿和出血均在处理动物和对照动物中观察到，因此认为这具有部分的操作相关性。在第15日和第29日，全部剂量均观察到细微至明显的慢性炎症和/或纤维变性，所述慢性炎症和/或纤维变性的严重性通常具有剂量依赖性的增加。纤维变性、单核细胞浸润和腺泡坏死是炎症的特征。这些变化常常伴随并发的腺泡萎缩/腺泡扩张。在第29日，对照内罕见地观察到了细微的纤维变性和腺泡萎缩/腺泡扩张，并且由此认为这主要与处理相关。还在相邻的前列腺叶内观察到急性变化和慢性变化，所述急性变化和慢性变化通常具有较低的发生率和较弱的变化严重性。急性炎症、水肿和出血与第2日较高的前列腺重量相关，而慢性炎症、纤维变性和腺泡萎缩/腺泡扩张与第15日和第29日较低的前列腺重量相关，并且通常与大体尸检结果相关。这些变化显示MPP5在前列腺注射部位的刺激性效应。 

认为其它组织内的大量微观观察结果继发于前列腺注射部位炎症，或因其扩展至毗邻盆腔器官并遍及整个腹腔，或因其产生全身反应性变化和/或退化性变化。分别在脂肪、肝脏、大肠和小肠、胰脏、脾脏、胃、精囊、附睾、睾丸和膀胱内观察到具有或不具有囊表面或浆膜表面出血及纤维变性的急性炎症和慢性炎症。反应性变化和/或退化性变化包括：骨髓髓细胞样增生；脾脏内增加的髓外血细胞生成作 用；淋巴结、脾脏和胸腺的淋巴萎缩和/或增生；肝单核细胞浸润、单个细胞坏死和增加的有丝分裂象；以及睾丸萎缩(并发附睾过小(epididymis oligo)/无精)。脾淋巴萎缩可以用于解释所记录到的施用25μg的雄性大鼠在第2日内的低脾脏重量，并且因此认为其是继发性的。 

未对第2日发现死亡的两只雄性大鼠(25μg)确定具体死因。然而，推测接近肾脏的前列腺炎症的严重性和并发的全身性退化改变可能对这些动物死亡有作用。 

其它变化是散在的、偶然的、濒死的或是在该年龄和品种的大鼠内可预期的并且不直接与处理相关的。 

静脉内注射 

在第2、15和29日，在尾静脉注射部位观察到归因于MPP5的微观变化。在第2日观察到的细微至明显的真皮及皮下组织急性炎症以血纤蛋白、出血、坏死和混合的细胞浸润为特征，伴随大多数动物具有或不具有表皮溃疡和痂形成。其中一只动物具有扩展到临近组织和局部淋巴结的中等程度坏死。在第15日和第29日变化发生率和严重性的降低显示进行性恢复。观察到以纤维变性和单核细胞浸润为特征的慢性炎症，其产生或不产生表皮溃疡及痂形成以及附近骨罕见的坏死和炎症。微观结果通常与宏观变化相关。这些变化显示MPP5的刺激性效应，尤其在注射部位的血管周围组织内。 

认为其它组织内的低发生率的变化继发于在第2日观察到的注射部位炎性变化，并且这些变化通常在第15日和第29日恢复。这些变化包括：脾脏内的坏死和炎症；附睾、精囊、睾丸和肝脏内血管周围的嗜中性粒细胞浸润、单核细胞浸润或混合的细胞浸润；骨髓髓细胞样增生；淋巴结水肿；淋巴结、脾脏和胸腺内淋巴萎缩；以及在第29日观察到的睾丸萎缩。在第2日增加的肝脏重量和脾脏重量没有微观 相关性。 

结论 

总之，通过单次在多达40μg剂量水平上的前列腺内注射或单次在多达50μg剂量水平上的静脉内注射施用MPP5引起以25μg和40μgIP的无清晰死因的死亡率，然而，认为检品相关性的前列腺炎症的程度及与肾脏接近和并发的全身性退化是死亡的潜在促进性因素。可逆变化大多在临床征兆(≥2μg)、血液学和临床生物化学参数(≥10μg)内见到。病理学变化在全部剂量水平上以剂量相关性方式持续存在，但是在静脉内处理的动物内显示出衰退迹象。因此，未对前列腺内途径或静脉内途径确定不可观察的效应水平(NOEL)。 

参考文献 

Dunn，OJ.1964，Multiple Comparisons using Rank Sums，Technometrics，6，241-256。 

SAS Institute Inc.，1999.SAS/STATUser′s Guide，Version 8，Cary，NC：SAS Institute Inc.，第3884页。 

实施例7：MPP5在猴中的急性毒性 

本实施例显示研究的初步结果，其中所述的研究表明前列腺内施用包含PSA切割位点的组氨酸标记的MPP(MPP5)导致对前列腺的剂量依赖性损伤。本研究的目的是在性成熟雄性猕猴(食蟹猴)中经过两周时间评估单次前列腺内注射MPP5的潜在局部毒性。 

实验设计概述 

一般描述： 

将总共16只雄性猕猴(食蟹猴)分配到下表11内所示的处理组内。动物大约3.6岁至11.7岁并且重量是大约2.8kg至7.9kg。动物从中国、越南、印度尼西亚和毛里求斯进口。 

表11： 

¹前列腺重量将从先前建立的前列腺重量与体重之间的关系中估计。将一半剂量注射到前列腺的每一叶内。 

全部动物一旦全身麻醉即经肛周的前列腺内注射给药。剂量给药首日称为第1日。对动物评价临床征兆(每日两次)、食物消耗(每日一次)、体重(第1、3、8和15日)、心电图(研究前和第2和14日)和眼状况(研究前和第14日)的变化。研究前和在第3和14日测定临床病理学指数(血清化学[包括C反应蛋白]、血液学和血凝固)。在剂量施用后，在多个时间点收集用于毒性动力学分析的血液样品、对检品和前列腺特异性抗原(PSA)的抗体。如表11内所示在第3和15日使8只动物安乐死。在处死时，对全部动物进行全面尸体剖检并且收集、保留、处理和显微镜法检查组织(包括选择的前列腺周围组织)。本研究评价MPP5的急性局部毒性。 

检品是MPP5(批号PTIC-MF-PAL-DS-001)并且对照品是PBS-EDTA。活性成分浓度3.2mg/mL的检品贮存品在制备日于给药溶液制备前经合适的0.22微米PVDF滤器过滤。在给药日，用对照载体稀释过滤的检品贮存液以获得具有适合实现预期剂量的浓度的给药溶液。 

如USDA动物福利法案(9 CFR、第1、2和3部分)内规定及如Guidefor the Care and Use of Laboratory Animals(ILAR publication，1996，National Academy Press)内所述饲养动物。 

起初如下表内所示赋予动物反映猴来源的Provantis编号。赋予Provantis编号6001-6008的动物来自中国。赋予Provantis编号7001-7004的动物来自印度尼西亚。赋予Provantis编号8001-8003的动物来自毛里求斯。赋予Provantis编号9001的动物来自越南。 

因为动物来源及体重的广泛范围，根据下表将动物随机分配到处理组内。 

检品和对照品的施用、组分配和剂量水平： 

¹前列腺重量从先前建立的前列腺重量与体重之间的关系中估计。 

²将一半剂量注射到前列腺的每一叶内，即大约25μl/g前列腺/叶。 

如下实施给药。注射途径是肛周前列腺内推注并且频率是一次。最初以肌内注射氯胺酮对猴进行镇静并放置临时静脉内导管以在手术操作期间施用镇静药和/或麻醉药。在肛门下的肛周区取一个皮肤小切 口并钝性分离肌肉组织和皮下组织以允许露出(visualization)前列腺并对其进行确认。基于前列腺重量施用检品和对照品。前列腺的大致重量根据动物体重和先前建立的前列腺重量与体重之间的关系中估计(前列腺重量(g)＝0.07294+(-0.2309×kg)+(0.06296×kg²)，其中kg是体重)。检品和对照品以大约相等的体积施用至前列腺左叶和右叶中的每一叶内。 

选择肛周途径是因为这是直接施用检品至前列腺的最精确手段。检品还将局部地施用至人内的前列腺。 

笼旁观察：每日观察两次(上午和下午)，在给药日之前至少7日开始并持续直到样品收集的最后一日。对每只动物观察整体外观和行为的变化。 

作为日常笼旁观察的部分，每日一次投食，给药日之前至少7日开始并持续直到样品收集的最后一日(除下文说明之外)。观察从前一日饲喂留下的饼干数量。对于该方法而言，用于研究方法的禁食日例外。 

体重测量值在首次给药(第1日)前并在第3、8和15日根据如下方法获得。在测量体重前撤除食物。 

心电图使用导联：I、II、III、aVR、aVL和aVF在研究前、在第2日和第14日记录。为了进行该操作，将猴在笼外暂时禁锢在猴椅内，但不加以镇静。 

由兽医师在研究前(在3周内的第1日)并在第14日实施眼部检查。在用氯胺酮浅表镇静下，使用直接检眼镜来检查眼前房和眼后房。将几滴扩瞳药溶液(通常为1％托吡卡胺)滴入每只眼内以辅助检查。 

用于评价血清化学、血液学和血凝固参数的血液样品在第1周期 间并在第3日(在尸体剖检前)和第14日(在眼部检查前)从全部动物中收集。在用于血清化学的血液收集前将动物禁食至少8小时(但是不超过16小时，无合适的证明)。 

尿通过笼盘收集法在研究前和在给药后早晨(第2日、在给药后大约24小时)和在每次尸体剖检(第3和15日)时在处死的动物内通过膀胱穿刺收集用于尿分析。 

a)血清化学收集法 

收集方法：静脉穿刺-任何可用的静脉，优选股骨静脉。 

表12： 

^*如果出现总胆红素发生可疑检品相关性增加，则将测定直接胆红素浓度和间接胆红素浓度。 

b)血液学 

血液样品通过静脉穿刺任何可用的静脉(优选股骨静脉)而收集。收集体积为1ml并且所用的抗凝剂是EDTA。 

分析的参数： 

表13： 

^*包括总白细胞、分叶核嗜中性粒细胞、带状嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和根据需要的其它细胞计数。 

^**来自全部动物的血液涂片将在每个时间点(包括研究前)上进行检查。 

c)血凝固参数 

样品通过静脉穿刺任何可用的静脉(优选股骨静脉)而收集。收集体积为1.8ml并且所用抗凝剂是柠檬酸钠。将样品处理成血浆并分析如下参数：活化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和血纤蛋白原。 

d)尿分析 

样品通过笼盘收集法(在研究前和在给药后大约24小时)收集和在尸体剖检时通过膀胱穿刺获得。收集体积当可获得时多达5mL。样品根据本领域已知的标准方法处理。 

分析如下参数： 

[0541] F.所实施的分析： 

1.毒性动力学样品 

样品通过静脉穿刺任何可用的静脉(优选股骨静脉)而收集。样品在给药前并在给药后1、2、4、8、24和48小时采取。收集体积是2mL并且不使用抗凝剂。将样品处理成血清。 

血清分成大约等体积的两个等分试样。每一样品标上动物编号、剂量组、收集日、日期、标称的收集时间、研究编号和等分试样编号。样品贮存在大约-70℃并通过ELISA分析MPP5浓度。 

2.抗体样品 

检测来自全部可获得的组/动物的样品。样品通过静脉穿刺任何可用的静脉(优选股骨静脉)在给药前和在第14日进行收集。收集体积是2mL。未使用抗凝剂。将样品处理成血清。样品贮存在大约-70℃。 

前列腺特异性抗原分析 

检测来自全部可获得的组/动物的样品。样品通过静脉穿刺任何可用的静脉(优选股骨静脉)在给药前和在第2、3和10日进行收集。收集体积是2mL。未使用抗凝剂。将样品处理成血清并贮存在大约-70℃。 

处死方法和解剖病理学 

处死：动物在用氯胺酮和Beuthanasia

-D或等效物所诱导的深度麻醉下通过放血处死。在处死日前一夜撤除食物供应。根据以下计划处死动物： 

[0552] 终体重：在尸体剖检时获得全部计划处死动物和非计划处死动物的最终体重。使用该体重来计算器官/身体重量比和器官/脑重量比。 

大体尸体剖检：对研究期间发现死亡的或被处死(计划处死和非计划处死)的全部动物实施完整的大体尸体剖检。尸体剖检包括检查：躯体和肌与骨骼系统、全部外表面和孔洞、颅腔和脑的外表面、颈及附属器官和组织、胸腔、腹腔和盆腔及附属器官和组织。 

尿样品：尿(当可获得时最多5 mL)在尸体剖检从膀胱内收集并如本方法的临床病理学部分内所述进行分析。 

器官重量：如下器官(当存在时)在固定前进行称重。成对器官将在一起称重，除非存在明显异常，此时将对它们分别称重。垂体在固定后进行称重。 

(使用尸体剖检前获得的终体重)计算器官/体重比率，以及器官/脑重量比率。 

组织收集和保存：收集如下组织和器官(或其部分)并保存在中性缓冲液的10％福尔马林内(眼除外，其在用于最佳固定的Davidson氏 固定剂内保存)。 

^a甲状旁腺从常规组织切片中的偶然缺失不需要重新切片。 

组织病理学：对于全部的尸体剖检动物，将上表内所列的组织(除纹身以外)包埋在石蜡内、切片、用苏木精和伊红染色并由ACVP认证的兽医病理学家检查。 

统计分析 

对由Sierra获得的全部数字数据计算组均值和标准差，包括体重、临床病理学参数(排除非数字数据)和器官重量数据。 

用SAS

系统8.1版本进行进一步统计分析。显著组间差异将使用方差分析(ANOVA)，随后进行多重比较检验加以评价。允许使用参数ANOVA的假设将使用用于数据正态性的Shapiro-Wilkes检验和用于方差齐性的Levene氏检验进行验证，其中以任一检验所需要的p≤0.001显著性水平来排除该假设。如果两种假设均满足，则应用单因素ANOVA，以动物分组作为因子，使用p≤0.05显著性水平。如参数ANOVA在p≤0.05上是显著的，将使用Dunnett氏检验来在0.05显著性水平上确定对照组与每个检品处理组间的统计性显著差异。如果任一个参数假设不满足，则使用Kruskal-Wallis非参数ANOVA方法来评价组间差异(p≤0.05)。如果这个ANOVA是显著的(再利用显著性水平p≤0.05)，则应用Dunn氏多重比较检验。 

初步结果 

前列腺：全部处理的动物均在其前列腺内具有损害(见图32C-H和33C-H)。组1(对照)动物在第3日具有细微的炎症、出血和纤维变性并在第15日具有纤维变性，这与对注射的反应和痊愈相一致。组3和组4内存在明显的严重损害(图32E-32H、图33 E-H)和33F)。组3(5μg/g前列腺)和组4(25μg/g前列腺)间在损害的范围或严重性上没有差异。组2(1μg/g前列腺)内存在明显的、严重性较轻的损害(图32C、32D、33C、33D)。 

在第3日，对检品的主要反应是大部分的前列腺凝集性坏死，同 时具有广泛出血、混合的细胞炎症。炎症主要是嗜中性粒细胞性的，较少数目的炎症是嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞性的。在某些区域内，存在液化性坏死。凝集性坏死在组2内是轻微的而在组3和组4内是中度至明显的。 

第3日在组2内，广泛的修复正在发生，其中在凝集性坏死区域的边缘具有向鳞状化生进展的腺上皮的明显再生性增生，并且间质细胞具有轻微至明显的活化和增殖。第3日于组3和组4内，修复刚开始，由间质细胞的轻微活化和增殖所显示。 

第15日在组2内，坏死和出血已经消退。未观察到前列腺的空腔形成。损害已经形成纤维性组织，腺体继续进行细微至轻微的再生性增生和鳞状化生。炎症主要是巨噬细胞性的和淋巴细胞性的，较少数目的炎症是多形核白细胞性的。在一只动物内，这些炎症主要是嗜酸性粒细胞性的。 

在第15日在组3和组4内，存在继续进行的凝集性坏死和出血，其中具有更严重的液化性坏死和前列腺空腔形成，以及继续进行的混合细胞炎症。在这些组内的修复由坏死性损害边缘间质的中度至明显的纤维变性和纤维组织形成所组成，其中具有进展至鳞状化生的腺体再生性增生。炎症在继续发生坏死的区域内主要是嗜中性粒细胞性的，但是在纤维变性区域内的损害边缘具有相对较高的淋巴细胞和巨噬细胞百分数。 

前列腺周围组织： 

精囊：第3日，在5/6的处理动物中，精囊在腺体腔内具有细微至中度的分泌物矿化作用。该现象作为背景偶尔会见到，但是不至于到这种程度或不如此处那样频繁见到。因此，这可能继发于前列腺内的变化。在第15日，唯一受到影响的是对照动物。 

前列腺尿道具有一些炎性细胞浸润，其可能继发于前列腺内的变化。 

实施例8：MPP5由前列腺组织活化 

考查了来自多种动物的前列腺的提取物活化本发明MPP的能力。进行这样的体外研究，其中将大鼠、狗、猴和人的前列腺组织提取物与MPP5温育以测定MPP的活化百分数。 

实验方法如下。从Sprague Dawley大鼠和单只beagle狗中获得新鲜前列腺组织。冰冻的前列腺组织从单只猕猴和从单人中获得。人前列腺组织作为存档研究材料从约翰霍普金斯大学IRB批准的临床研究中获得。对于本分析，将前列腺切片(每片～100-500mg)并以每个组织体积对等体积培养基的浓度在无血清RPMI 1640细胞培养基内混悬。组织样品在该培养基内于37℃温育2小时。离心后，上清液在-80℃冷冻。 

溶血测定：样品在37℃融化，离心并收集上清液。使用Bradford测定法测定每份上清液的蛋白浓度。将样品稀释到相同的初始蛋白浓度。获得来自猴样品和人样品内的上清液的等分试样以便使用标准ELISA(Hybritech

，Beckman Coulter)法测定PSA。每日制备混悬于无酚红的Hanks缓冲盐溶液(HBSS)内的2％新鲜人血液红细胞(RBC)溶液。使血液红细胞沉淀，重悬于3体积的HBSS以除去多余血清并重悬以产生在无酚红HBSS内的50％溶液。为制备检测样品，温和地涡旋混合50％RBC样品以混悬RBC。将RBC的等分试样添加至230μL无酚红HBSS以产生4％(v/v)溶液。向该混悬液添加240μL前列腺切片条件RPMI培养基的等分试样，随后添加来自100μg/mL贮存液的10μLMPP5等分试样，以使每个试样内添加的总MPP5是1μg并且试样终体积是500μL。这种RBC/MPP5/组织溶液在室温下温育1小时。随后对样品离心以沉淀未裂解的RBC，并且获得来自每个样品内的上清液的100μL等分试样，并且立即对该试样以分光光度方式在540nm处测 量由于RBC裂解所致的血红蛋白释放。对照包括伪处理的RBC(阴性对照)和用1％Triton-x100裂解的RBC(阳性对照)。为了比较水解的程度，分析经前列腺组织调理的培养基的每种样品的连续稀释物。在本研究中，使用提取物1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16和1∶32的稀释物。全部样品一式三份对溶血进行分析。 

结果显示人前列腺组织对切割MPP5最具活性，与此同时大鼠前列腺组织和猴前列腺组织只产生较低的反应，而狗前列腺组织不对MPP5显示任何活性(图36)。虽然大鼠缺少PSA基因，但是已经证实大鼠拥有人PSA的S3激肽释放酶同系物(Onozawa等，2001)。在大鼠腹侧前列腺内鉴定的这种PSA样蛋白与人PSA分别显示64％的核苷酸序列同源性和49％的氨基酸序列同源性。此外，大鼠S3激肽释放酶与人PSA具有相似的等电点和分子量。因此MPP5在大鼠前列腺组织内有可能由这种PSA样S3激肽释放酶活化。 

狗前列腺缺乏活化能力与狗没有PSA基因的观察相一致。 

实施例9：MPP5由血浆/血清活化 

如下测定来自人、猴、狗、大鼠或小鼠的血清切割MPP5的能力。 

MPP5(1.073mg/mL)在4℃于冰上融化，等分和在-80℃再冷冻。对每种条件进行两次分析。将5μLMPP5在总体积250uL的、含有150mM NaCl和25μL人、猴、狗、大鼠或小鼠血清的20mM HEPES缓冲液(pH 7.4)内于37℃温育10分钟。在对照实验中，将25μg胰凝乳蛋白酶在添加血清(阳性对照)前添加至反应混合物内。在其它对照实验中，血清以等体积的缓冲液(阴性对照)替换。反应通过添加5μL的100mM PMSF异丙醇溶液，随后在冰上冷却而终止。将终止的反应混合物的15μL等分试样添加至含有0.5％β-巯基乙醇的等量2×BioRad加样缓冲液内，并在95℃加热5分钟以便使全部蛋白质变性并阻断蛋白质-蛋白质的相互作用。5μL样品在预制的4-12％Bis-Tris凝胶 (Invitrogen)上，使用XT MOPS电泳缓冲液(BioRad Laboratories)在100V下电泳60分钟。凝胶内的蛋白质转印至硝酸纤维素膜(BioRadLaboratories)并且该膜以脱脂乳(含有0.1％Tween20(TBST)的5％tris-缓冲盐水)在室温封闭1小时。MPP5通过将膜在纯化的大鼠多克隆抗MPP5的TBST溶液(稀释度为1∶250,000)内室温温育1小时进行检测。印迹物用TBST洗涤三次后，在HRP连接的山羊抗大鼠抗体(JacksonImmunoResearch)的TBST溶液(稀释度为1∶20,000)中温育。与膜结合的抗体根据试剂盒制造商(Cell Signaling)说明，使用化学发光法检测，并使用具有避免饱和作用的化学发光自动曝光设置的AlphaInnotech FluorChem SP，用4百万像素CCD照相机进行实时记录。使用基于voxel的程序(ImageQuant software；Alpha lnnotech，San Leandro，CA)，以密度测定方式定量印迹物。在对背景进行校正后，通过将已切割条带的密度除以完整条带密度及已切割条带密度的总和来测定每个泳道剩下的已切割蛋白质的百分数。切割百分数随后与无血清和加血清的胰凝乳蛋白酶对照进行比较。 

MPP5切割百分数的估计通过电泳和蛋白质印迹的密度测定定量完成。切割百分数随后与仅有MPP5(阴性)的对照和MPP5+胰凝乳蛋白酶(阳性)对照比较，以确定MPP5是否被血清酶切割。在这些实验条件下，检测不到人、猴、狗、大鼠或小鼠血清对MPP5的切割。表14显示与多种血清温育后被切割的MPP5的百分数。图37显示MPP5在多种血清存在或不存在下温育10分钟后的蛋白质印迹。图板A显示以250μL试样体积与来自男性(H)(泳道2-5)或猕猴(Mk)(泳道6-7)的25μL血清温育的MPP5。泳道3含有MPP5、人血清和胰凝乳蛋白酶，但未温育。泳道8是分子量标记物。(B)以250μL试样体积与来自小鼠(Mu)(泳道2-5)、狗(D)(泳道6-7)或大鼠(R)(泳道8-9)的25μL血清温育的MPP5。泳道3含有MPP5、人血清和胰凝乳蛋白酶，但未温育。泳道10是分子量标记物。 

表14：血清内MPP5的切割百分数的物种比较 

这些结果显示MPP5在正常人血清内不被活化，并且还显示在前列腺内注射后泄露至血液内时，MPP5将不会变成活化的，甚至在具有异乎寻常高水平的血清PSA的男性中也是如此。这些结果与公开的数据一致，其中所述的数据证实PSA在血液内通过血清蛋白酶抑制物(主要是α1-抗胰凝乳蛋白酶和α2-巨球蛋白)以酶方式灭活(Lilja等，1991；Otto等，1998)。 

实施例10：MPP5由非PSA蛋白酶活化 

进行体外研究以测定MPP5对于前体药物在与前列腺以外的组织无意接触时可能潜在遇到的非PSA蛋白酶的敏感性。具体而言，评估了数种常见蛋白酶切割MPP5的效力，这些蛋白酶包括PSA、弗林蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶、MMP-7、组织蛋白酶B(半胱氨酸蛋白酶)和丝氨酸蛋白酶hK1、hK2和uPA。 

如下实施分析。将天然气单胞菌溶素原(野生型PA；0.84mg/mL)和1.073mg/mL的MPP5用于检验全部蛋白酶的分析，其中使用弗林蛋白酶的分析#2例外，在分析#2中使用批号为#N-PTIC-MF-PAL-BX的1mg/ml的MPP5。 

为测量因PSA切割所致的活化，将5μg天然气单胞菌溶素原或MPP5在含有150mM NaCl的20mM HEPES缓冲液(pH 7.4)内温育。添加不同量的PSA(根据对数比例的0-10μg PSA)并以250μL总体积于37℃温育60分钟。反应通过添加5μL的100mM PMSF的异丙醇溶液，随后在冰上冷却而终止。将终止的反应混合物的15μL等分试样添加至含有0.5％β-巯基乙醇的等量2×BioRad加样缓冲液内并在95℃加 热5分钟。样品在预制的10％Tris-HCl凝胶上，使用XT MOPS电泳缓冲液(BioRad Laboratories)在200V下电泳30分钟。蛋白质通过银染法检测。 

为在研究#1内测量因弗林蛋白酶切割所致的活化，将5μg天然PA或MPP5在含有150mM NaCl和不同量的弗林蛋白酶(根据对数比例的0-3.2ng弗林蛋白酶)的20mM HEPES缓冲液(pH 7.4)内，以250μL总体积于37℃温育10分钟。反应通过添加5μL的100mM PMSF异丙醇溶液，随后在冰上冷却而终止。将终止的反应混合物的15μL等分试样添加至含有0.5％β-巯基乙醇的等量2×BioRad加样缓冲液内并在95℃加热5分钟。样品在预制的10％Tris-HCl凝胶上，使用XT MOPS电泳缓冲液(BioRad Laboratories)在200V下电泳30分钟。蛋白质通过银染法检测。 

为在研究#2内测量因弗林蛋白酶切割所致的活化，将5μg天然PA或MPP5在含有150mM NaCl、1mM CaCl₂和0至3单位弗林蛋白酶的20mM HEPES缓冲液(pH 7.4)内，以250μL总体积于37℃温育60分钟。注意在前一个实验(弗林蛋白酶，研究#1)中，相同酶浓度的温育时间是10分钟。反应通过添加2.5μL的100mM PMSF乙醇溶液，随后在冰上冷却而终止。将终止的反应混合物的15μL等分试样添加至含有0.5％β-巯基乙醇的等量2×BioRad加样缓冲液内并在95℃加热5分钟。样品在预制的10％Novex Bis-Tris Nupage凝胶(Invitrogen)上，使用1×MOPS-SDS电泳缓冲液在200V下电泳50分钟。蛋白质通过银染法检测。 

为测量因胰凝乳蛋白酶所致的活化，将5μg天然PA或MPP5在含有150mM NaCl和不同量的胰凝乳蛋白酶(根据对数比例的0-500ng胰凝乳蛋白酶)的20mM HEPES缓冲液(pH 7.4)内，以250μL总体积于37℃温育10分钟。反应通过添加5μL的100mM PMSF异丙醇溶液，随后在冰上冷却而终止。将终止的反应混合物的15μL等分试样添加至 含有0.5％β-巯基乙醇的等量2×BioRad加样缓冲液内并在95℃加热5分钟。样品在预制的10％Tris-HCl凝胶上，使用XT MOPS电泳缓冲液(BioRad Laboratories)在200V下电泳30分钟。蛋白质通过银染法检测。 

为在研究#1内测量因凝血酶所致MPP5的活化，将5μg气单胞菌溶素相关蛋白质(天然PA或MPP5)在含有150mM NaCl和不同量的凝血酶(根据对数比例，0-12μg的0.23单位/μg凝血酶)的20mM HEPES缓冲液(pH 7.4)内，以250μL总体积于37℃温育10分钟。反应通过添加5μL的100mM PMSF异丙醇溶液，随后在冰上冷却而终止。将终止的反应混合物的15μL等分试样添加至含有0.5％β-巯基乙醇的等量2×BioRad加样缓冲液内并在95℃加热5分钟。样品在预制的10％Tris-HCl凝胶上，使用XT MOPS电泳缓冲液(BioRad Laboratories)在200V下电泳30分钟。蛋白质通过银染法检测。 

为在研究#2内测量因凝血酶所致MPP5的活化，用这些实验内使用的凝血酶试剂盒(Novagen)所提供的凝血酶稀释缓冲液来制备两份凝血酶稀释物：1/66和1/25。用凝血酶试剂盒所提供的1×切割缓冲液来制备含有10μgMPP5(N-PTIC-MF-PAL-BX)的两份反应混合物。以相同方式制备含有带His标签的天然气单胞菌溶素原(PA-EndHis)的两份反应混合物。凝血酶以0.15单位添加至其中一份PA-EndHis混合物中并以0.4单位添加至其中一份MPP5混合物中。温育总体积在每一例子中是50μl。反应混合物在室温下温育6.5小时，并且随后通过添加苯甲基磺酰氟(Sigma)至终浓度1mM而抑制蛋白水解。样品在4℃在冰上贮存过夜。样品随后在1×LDS样品缓冲液(Invitrogen)内准备并在70℃加热10分钟，随后上样并在10％Bis-Tris NuPAGE凝胶(Invitrogen)上，在非还原条件下于200V恒定电压的1×MOPS-SDS电泳缓冲液内电泳50分钟。蛋白质通过银染法检测。 

为测量因胰蛋白酶所致的活化，将5μg气单胞菌溶素相关蛋白质 (野生型PA或MPP5)在含有150mM NaCl和不同量的I型胰蛋白酶(根据对数比例的0-500ng胰蛋白酶)的20mM HEPES缓冲液(pH 7.4)内，以250μL总体积于37℃温育10分钟。反应通过添加5μL的100mMPMSF异丙醇溶液，随后在冰上冷却而终止。将终止的反应混合物的15μL等分试样添加至含有0.5％β-巯基乙醇的等量2×BioRad加样缓冲液内并在95℃加热5分钟。样品在预制的10％Tris-HCl凝胶上，使用XT MOPS电泳缓冲液(BioRad Laboratories)在200V下电泳30分钟。蛋白质通过银染法检测。 

为测量因uPA所致的活化，将5μg PA和MPP5分别在含有150mMNaCl和10-0.16μguPA的20mM HEPES缓冲液(pH 7.4)内，以250μL总体积于37℃温育4小时。反应通过添加5μL的100mM PMSF异丙醇溶液，随后在冰上冷却而终止。将终止的反应混合物的15μL等分试样在含有0.5％2-巯基乙醇的1×样品缓冲液(Invitrogen)内准备并在95℃加热5分钟。样品(100ng)在预制的10％Novex Bis-Tris NuPAGE凝胶(Invitrogen)上，使用1×MOPS-SDS电泳缓冲液在还原条件下，于200V电泳50分钟。蛋白质通过银染法检测。 

为测量因组织蛋白酶B所致的活化，将5μg PA和MPP5分别在含有150mM NaCl、1mM EDTA、5mM L-半胱氨酸和24-0.375单位组织蛋白酶B的20mM HEPES缓冲液(pH 7.4)内，以250μL总体积于37℃温育4小时。反应通过添加亮抑蛋白酶肽至终浓度2μM(Sigma法)，随后在冰上冷却而终止。将终止的反应混合物的15μL等分试样在含有0.5％2-巯基乙醇的1×样品缓冲液(Invitrogen)内准备并在95℃加热5分钟。样品(100ng)在预制的10％Novex Bis-Tris NuPAGE凝胶(Invitrogen)上，使用1×MOPS-SDS电泳缓冲液在还原条件下，于200V电泳50分钟。蛋白质通过银染法检测。 

为测量因MMP-7所致的活化，将5μg PA和MPP5分别在含有150mM NaCl、10mM CaCl₂和1.5-0.0234μg MMP-7的20mM HEPES缓 冲液(pH 7.4)内，以250μL总体积于37℃温育3小时。反应通过添加8.4μL的31mM 1，10-菲咯啉一水合物的乙醇溶液(最终1μM)，随后在冰上冷却而终止。将终止的反应混合物的15μL等分试样在含有0.5％2-巯基乙醇的1×样品缓冲液(Invitrogen)内准备并在95℃加热5分钟。样品(100ng)在预制的10％Novex Bis-Tris NuPAGE凝胶(Invitrogen)上，使用1×MOPS-SDS电泳缓冲液在还原条件下，于200V电泳50分钟。蛋白质通过银染法检测。 

为测量因hK1所致的活化，5μghK1由在终体积50μl的TCN缓冲液(50mM Tri、10mM CaCl₂、0.15M NaCl、pH 7.5)内的0.05μg嗜热菌蛋白酶活化，在37℃温育1小时并用2.5μl的200mM 1，10-菲咯啉一水合物的95％乙醇抑制(R & D Systems法)。1μgPA和PSA-PAH1分别在含有150mM NaCl、1mM EDTA和1μg-0.015625μg活化的hK1的20mM HEPES缓冲液(pH 7.4)内，以50μL总体积于37℃温育4小时。反应通过添加PMSF的异丙醇溶液至终浓度2mM，随后在冰上冷却而终止。将终止的反应混合物的5μL等分试样在含有0.5％2-巯基乙醇的1×样品缓冲液(Invitrogen)内准备并在95℃加热5分钟。样品(100ng)在预制的10％Novex Bis-Tris NuPAGE凝胶(Invitrogen)上，使用1×MOPS-SDS电泳缓冲液在还原条件下，于200V电泳50分钟。蛋白质通过银染法检测。 

为测量因hK2所致的活化，1μgPA和MPP5分别在含有150mMNaCl和0.25-0.0039μg hK2的20mM HEPES缓冲液(pH 7.4)内，以50μL总体积于37℃温育1小时。反应通过添加PMSF的异丙醇溶液至终浓度2mM，随后在冰上冷却而终止。将终止的反应混合物的10μL等分试样在含有0.5％2-巯基乙醇的1×样品缓冲液(Invitrogen)内准备并在95℃加热5分钟。样品(100ng)在预制的10％Novex Bis-TrisNuPAGE凝胶(Invitrogen)上，使用1×MOPS-SDS电泳缓冲液在还原条件下，于200V电泳50分钟。蛋白质通过银染法检测。 

本研究的结果表明在MPP5与气单胞菌溶素原(PA)之间的敏感性曲线差异明显，其中天然气单胞菌溶素原(PA)比MPP5对多种蛋白酶(PSA例外)更敏感(表15)。 

表15：体外蛋白酶敏感性研究结果 

注意：报道的单位反映如原始数据内所记录的那些单位 

实施例11：MPP5在大鼠内的生物分布 

为了确定单次剂量前列腺内施用后MPP5在前列腺内的生物分布及其在周围组织的潜在分布，在雄性Sprague-Dawley大鼠中进行使用125I-MPP5的放射标记的定量性完整身体放射自显影法研究。给药制剂内的放射性活度浓度(±S.D.)是1.6×10⁹±44.02×106dpm/g(730.94μC/g)。基于平均浓度值附近的标准差和变异系数，认为给药制剂是均 匀的。通过注射而施用至前列腺内的所配制¹²⁵I-MPP5的平均剂量是8.73μg/动物(5.86μCi/动物/10μL体积)。 

取两等分试样的血液(2×50μL)用于放射性活度分析。血液在3500rpm和4℃离心大约10分钟(在采集的60分钟内)，并且取两等分试样的血浆(2×50μL)用于放射性活度分析。使已称重的两等分试样的全血增溶(Soluene-350)并用过氧化氢(30％w/v)脱色，随后与用于放射性活度测量的液体闪烁流体混合。将两等分试样的血浆直接与用于放射性活度测量的液体闪烁流体混合。 

对于定量性整体自放射发光照相技术，将动物在己烷与干冰的混合物内深度冷冻20分钟。随后根据标准操作方法使用冷冻支架将动物右侧卧地包埋在2％CMC介质内以便收集完整身体矢状切片。在每个冷冻的CMC块内打十二个孔以便引入10种¹²⁵I标准溶液和两种质控液。将添加¹⁴C或¹²⁵I的血液挤入每个CMC块内的4个钻孔内，所述的血液根据需要作为用于鉴定呈现低放射性活度水平或低反差的结构的参考点使用。每个动物标本块使用Leica CM 3600低温恒冷冰冻切片机(Leica CM 3600 cryomicrotome)切片。收集30μm切片并确定动物编号、时点、切片编号、切片日期和刀片位置。 

结果显示在单次剂量前列腺内施用后，血液和血浆内放射性活度的浓度低，表明前列腺内施用后微弱的表观吸收。放射性活度的最高浓度(9.445μg Eq/g)在首次采样时点(3h)从右腹侧前列腺注射部位中获得。高水平的放射性活度也在前列腺的其它叶(左腹侧叶、右背侧叶和左背侧叶)内观察到，但是随时间至终末采样时点96小时而减少。在所述终末时点上，前列腺内放射性活度的浓度在前列腺的全部区域内是低的，除了右腹侧前列腺注射部位(0.268μg Eq/g)以外。除了前列腺之外，仅膀胱和甲状腺显示比血液或血浆更高的放射性活度的浓度。甲状腺的放射性活度(¹²⁵I)水平在给药后12至48小时时间范围内增加并保持高水平直至在处理后96小时的最终时点。甲状腺内¹²⁵I的隔离可 能指示分布至甲状腺的游离¹²⁵I。在下列中观察到低浓度的放射性活度：肾上腺(≤0.034μg Eq/g)、肾脏(≤0.032μg Eq/g)、肝脏(≤0.045μgEq/g)、肺脏(≤0.041μg Eq/g)和胰脏(≤0.022μg Eq/g)。脑显示最低浓度的放射性活度(≤0.003μg Eq/g)。在所有的其它主要器官中，总是观察到极低水平的放射性活度，其表明没有出现明显的全身分布。组织水平对血浆水平随时间增加，表明MPP5从血浆中比从组织中更快地得到清除。因此，这项生物分布研究表明MPP5主要停留在施用的局部位置，其对周围的细胞仅有有限的周边分布和毒性。 

实施例12：MPP5在猴内的毒性动力学 

MPP5的毒性动力学也在前列腺内施用后，如实施例7内所述在性成熟的雄性猕猴内确定。每组4只猴使用2×25μL注射(25μL/叶)，以对照盐水或0.35、4.14或25.79μg MPP5/g前列腺组织进行前列腺内给药。血液样品在给药之前并在给药后1、2、4、8、24和48小时从全部猴(16只)内获得。本研究的初步结果还在实施例7内描述。如下代表本研究最终完成的毒性动力学结果。 

使用已验证的ELISA方法对研究样品分析MPP5。使用50μL血清重复分析，ELISA方法的最低定量限(LLOQ)是5ng/mL。在前列腺内施用后未检测到可评估的MPP5全身水平。组2内的一只动物在全部时间点均显示出高于LLOQ(5ng/mL)的浓度。与来自相同剂量组的动物相比，认为该动物是特殊的，并且来自该动物的全部样品在后续的分析内进行重复分析以便证实。全部原始结果在重复分析内得到证实。由于给药前的样品也超过LLOQ，因而确定在该只动物内所观察到的浓度可能归因于基质干扰并且与处理无关。 

实施例13：评价MPP5处理的猴的前列腺形态学 

对实施例7和12内所述的研究中收集的猴前列腺切片进行进一步分析。进行苏木精&伊红(H&E)染色以检查所处理前列腺的形态学，对PSA进行免疫组织化学染色以检查PSA的分布，并且进行MPP5染 色以便检查MPP5的分布。所用的方法描述如下。 

材料和试剂：来自对照和来自MPP5处理的猴前列腺中的96张(每只猴6张)切片贮存在室温密封的容器内。制备前列腺组织的切片并用H&E染色，其中所述的前列腺组织来自用载体或0.35、4.1或25μgMPP5/g前列腺经前列腺内给药的猴。切片还根据本领域内已知方法对PSA和MPP5进行免疫组织化学染色。 

图像分析：猴前列腺组织切片使用1.25×物镜评价。使用Metamorph^TM软件包(Molecular Device，Sunnyvale，CA)来画出前列腺总面积和MPP5诱导性损伤总面积的轮廓。该软件提供作为像素数的总面积。将1×1cm的正方形置于每张载玻片上作为测定每cm²像素数的标准。随后测定来自每个MPP5剂量的损伤面积并转换成损伤的Gm²。损伤面积百分数由受损面积/前列腺总面积的比率乘以100确定。 

对照(正常)猴前列腺的分析显示猕猴前列腺就腺的形态学而言与人前列腺相似，并且PSA的分布限于导管内层的柱状上皮细胞。象人一样，猴前列腺包围尿道。因此，猴前列腺代表了在前列腺内注射PSA活化的蛋白质毒素MPP5时，用于研究MPP5活化和毒性的可获得的最佳动物模型。 

来自本研究中前列腺组织的形态学表征以及前列腺内PSA和MPP5的分布显示在0.35μg/g前列腺至4.14μg/g前列腺的剂量时，前列腺损伤面积/百分数存在剂量-反应；然而，在4.14μg/g前列腺至25.79μg/g前列腺时，剂量-反应没有明显增加(表15)。在接受剂量4.14μg/g前列腺的猴内观察到了所计算的最大损伤面积，在所述的猴内每叶单次注射25μL损伤总腺体的大约50％。该结果表明最大损伤可能受限于前列腺每叶25μL注射体积的总分布。 

在MPP5诱导正常腺组织明显梗死的处理区域内，PSA染色明显 减弱，而在前列腺的邻近未受损区域内，PSA染色在分布和程度方面是正常的。这些结果表明MPP5对腺体内柱状上皮细胞的杀伤消除PSA产生。该结果还显示在中等剂量水平和高剂量水平上MPP5的分布与梗死区域重叠，如图38内所示。在给药后第15日，在中等剂量水平上没有观察到残余MPP5。此外，MPP5在本研究内已评价的任意切片内似乎未穿透前列腺包膜。 

表15：因MPP5所致前列腺损伤¹的面积和百分数 

¹在每叶注射25μL后的损伤(总腺体的面积/百分数) 

在MPP5诱导正常腺组织明显梗死的处理区域内，PSA染色明显减弱。在邻近未受损区域内，PSA染色在分布和程度方面是正常的。这些结果表明MPP5对腺体内柱状上皮细胞的杀伤消除PSA产生。然而，MPP5不改变未损害区域内的PSA产生，MPP5也不选择产生较低水平PSA的上皮细胞。在环绕尿道的肌肉套(cuff)内未观察到PSA染色。尿道组织内PSA的缺少可以部分地解释尿道没有任何明显的损伤。因此，小体积(25μL)注射MPP5至前列腺的单叶可以在猴正常前列腺内导致产生PSA的腺组织大面积明显梗死，而对不产生PSA的结构(例如尿道)没有明显损伤。 

实施例14：MPP5在狗内的毒性 

在雄性beagle狗内进行试验性质的毒理学研究，以便确定MPP5 单次前列腺内给药后的潜在的直接前列腺内毒性和MTD。MPP5经前列腺内注射(左叶)100μL剂量体积的0、50、107、200或400μg(基于前列腺重量，这些剂量分别等同于0、22、24.4、40和72.2μg/g前列腺)施用至雄性beagle狗(1只/组)。动物在给药后观察1周。不存在死亡或不存在对临床观察、体重、食物消耗或临床病理学的处理相关性影响。不存在对前列腺重量的明显MPP5相关性效应。大体病理学变化在前列腺左叶和邻近的腹部脂肪内确定，并由延伸至前列腺实质的前列腺暗色区域组成。腹部脂肪的粘连和/或在腹部脂肪内的暗色区域与前列腺内观察到的MPP5相关性效应有关。在用400μg处理的狗中，暗色区域数量更多并且前列腺左叶增大。认为这些病理学变化的严重性的增加对预期的MPP5药理学效应有作用。似乎不存在任何明显的前列腺外毒性。总而言之，在前列腺内观察到明显的处理相关性大体变化，其中在环绕的或邻近的腹部脂肪组织具有有限的相关性效应，在400μg水平上严重性增加。 

狗前列腺与人前列腺具有结构相似性，它们都包括2叶结构、本质上是腺泡导管和存在丰富的间质(Wienjes等，2005)。虽然人前列腺比狗前列腺具有更高比例的间质性组织，但是不知道人前列腺与狗前列腺之间纤维隔膜(fibrous partition)结构和血液及淋巴引流模式的差异达到何种程度。不过，以前已经证实狗可以作为研究前列腺内注射效应的有用模型(Rosser等，2004)。然而，在MPP5的例子中，beagle狗似乎没有清楚地显出对这种化合物的细胞溶解性效应敏感。其原因可能在于狗中缺乏PSA表达(或能够切割MPP5的其它非特异性酶)。狗模型显示在PSA不存在下，MPP5在极高的剂量上不活化，其证实了非活化前体药物的安全性。相反，已知大鼠和非人灵长类分别表达PSA样激肽释放酶和PSA，并且已经证实甚至对低浓度的MPP5敏感。因此，虽然狗前列腺在解剖上与人前列腺相似，但是狗前列腺似乎没有在MPP5活化方面显示与人前列腺的功能性相关，因而不再继续以狗作为MPP5的毒理学模型。然而，对狗的研究显示MPP5在不被PSA切割时似乎无药理学活性，这就为其提供了依据——即当MPP5在不 产生PSA的组织内存在时，它不会产生显著的毒性。 

实施例15：MPP5在猴内的毒性 

为明确MPP5在产生内源性PSA的非啮齿类物种内的毒性，前列腺内毒性研究如实施例7内所述在注射0.35、4.14或25.79μg MPP5/g前列腺组织的雄性猕猴(4只/组)内实施。施用两次会阴注射，对前列腺的每叶(25μL/叶)注射一次。本研究的初步结果在实施例7内显示。如下是最终结果的描述。 

在前列腺内直接施用并观察2日或14日时间后，与MPP5有关的毒性限于前列腺，同时周围的组织几乎没有损伤或具有其它明显的全身效果。血液分析的结果表明雄性猕猴表达可检测水平的PSA，并且MPP5的前列腺内施用释放显著量的PSA至血液/血清内。PSA水平在处理后10日返回至接近基线水平。在任何剂量水平均没有观察到对临床征兆、体重、眼状况、尿分析或心电图(ECG)评价的处理相关性效应。血清化学和血液学评估揭示短暂的细胞反应和炎症反应。在研究第3日，全部组均观察到短暂的急性期免疫学应答并且其归因于与手术方法有关的炎症和局限于前列腺的炎症。在研究第3日记录到的C反应蛋白(CRP)增加通常是剂量相关性的并且与混合的细胞炎症和显微镜观察到的前列腺坏死的程度相一致。 

大体病理变化和微观病理变化在全部MPP5剂量水平上于第3日在前列腺观察。这些变化以坏死、出血和混合的细胞浸润为特征，并且在接受中等剂量和高剂量MPP5的动物内更严重。低剂量组的猴还在第3日显示组织学变化，其中所述变化与修复一致，该修复包括上皮组织内的再生性增生和鳞状化生以及在间质(间质(mesenchymal))组织内的纤维组织形成。在中等剂量组和高剂量组内的修复在第3日是微弱至缺乏的。在第15日，低剂量组内的坏死已经消退并且修复继续进行。在中等剂量组和高剂量组内，坏死在第15日继续进行并且与修复相一致的变化限于坏死性损害的边缘。相反，在前列腺周围组织或 全身组织内在第3日或第15日没有可归因于MPP5的变化。 

实施例16：MMP5在猴内的免疫应答 

还对MPP5的潜在免疫应答进行了评价。动物如实施例7内所述用MPP5处理。对MPP5的潜在免疫应答如下测定。 

猴组根据下表接受MPP5的多种剂量直接施用至前列腺。在注射日前从动物中收集血清(大约0.5mL)并在注射后第14日再次收集。血清贮存在-70℃直至分析。免疫球蛋白反应如单独所述通过ELISA测量。简而言之，气单胞菌溶素原(0.5μg/mL的磷酸盐缓冲盐水)通过在4℃包被过夜而结合至EIA平板。非特异性结合通过用5％BSA(Sigma)在室温包被而抑制。将汇集的正常猴血清的连续十倍稀释物(1∶100-1∶1,000,000)分成一式四份使用，以形成用于在MPP5施用后于多个时间采集的动物血清内测定滴度的比较曲线。将来自MPP5处理的猴中的血清样品稀释十倍(1∶100-1∶1,000,000)以提供对应于正常血清的浓度。过氧化物酶缀合的山羊抗大鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)与结合至气单胞菌溶素原包被的孔的抗体结合。根据制造商的说明书，通过添加OPD过氧化物酶底物使颜色显现。在Molecular DynamicsVERSAmax微量平板读数仪上测量490nm处的吸光度。滴度被定义为以上的稀释度，其中吸光度读数小于在相同稀释度下的汇集的正常血清的吸光度读数+2个标准差。 

在MPP5施用前，除一只载体对照动物之外的全部猴均没有可检测的滴度。那只对照动物似乎在研究之前已经接触免疫原，因为低滴度的出现在第14日样品内得以证实并在再次分析中再次证实。接受1μg/g MPP5的两只动物中的一只动物显示滴度。类似地，接受5μg/gMPP5的两只动物中的一只动物显示滴度。接受25μg/g MPP5的两只动物均显示滴度。 

将每只动物在施用前和施用后所抽取的血液的滴度列于表16。 

表16：施用MPP5后猴内的抗体滴度 

^*该动物在施用前显示相同的微小滴度 

图39显示施用MPP5后猴内的抗体滴度。没有滴度高于10⁴。这表明前列腺内施用MPP5没有激发强烈的免疫应答。然而，6只已处理动物中的4只显示高于汇集血清的滴度。 

在用0.35μg/g前列腺或4.14μg/g前列腺处理的两只猴中处理的两只猴中，均观察到其中的一只猴具有抗体滴度，并且接受25.79μg/g前列腺的两只动物均显示滴度。因此，MPP5的施用在一些猴内诱导了可检测但滴度低的免疫应答。 

基于实施例11、12和15内的结果，任何剂量水平都不存在前列腺外毒性的迹象；因此，全身性无可见不良作用剂量水平(NOAEL)是已检测的最高MPP5剂量——即25.79μg/g前列腺(基于实际前列腺重量)。在前列腺内所观察到的效应既是剂量依赖的，又是基于MPP5的已知作用机制可预测的。在全部剂量水平上观察前列腺内的效应，其中所述剂量水平包括已检测的最低剂量0.35μg/g前列腺，该剂量损伤大约25％的前列腺。因此，对于局部前列腺效应的最低可观察不良作 用水平(LOAEL)在本研究中是0.35μg/g前列腺。 

前述实施例描述了MPP5在雄性白化大鼠中静脉内施用或前列腺内施用后以及在非人灵长类中前列腺内注射后的药物代谢和毒性动力学的研究。用MPP5实施的非临床性药物代谢和药物代谢动力学(DMPK)研究的总结示于表17。 

表17：用MPP5实施的非临床性药物代谢和药物代谢动力学研究列表 

实施例17：MPP5在临床试验中用于BPH的剂量选择和施用方法 

以下描述了MPP5在临床试验中用于BPH的起始剂量选择示例性原理。还描述了施用MPP5的示例性方法。 

基于PSA的表达以及猕猴前列腺与人前列腺间的生理相似性，选 择本文中所述的单剂量的猴研究作为估计在人前列腺内安全起始剂量的基础。与大鼠和猴相比，狗对MPP5的效应不敏感；因此，认为狗不是用于估计MPP5的安全起始剂量的适宜模型。来自本文中所述大鼠研究的数据表明尽管大鼠没有编码PSA的基因，但是MPP5可能由大鼠腹侧前列腺内所鉴定的PSA样S3激肽释放酶活化(Onozawa等，2001)。 

BPH临床试验内MPP5的起始剂量选自0.03μg/g前列腺至0.25μg/g前列腺的范围。基于单剂量猴研究内已检验的最低剂量(0.35μg/g前列腺)应用10倍的安全系数，将有效起始剂量设置在0.03μg/g前列腺。在接受0.35μg/g前列腺剂量的猴内，未观察到全身毒性，但是观察到了局部前列腺变化。虽然在注射14日后全部3种剂量均显示前列腺组织局部剥离，但是中等剂量和较高剂量显示的变化最明显而且缺乏痊愈。得出的结论是最低剂量(0.35μg/g前列腺组织)具有无全身性后果(通过组织学分析和实验室分析)和有限但清晰可观察的局部前列腺效应(前列腺剥离大约25％)的治疗可用组合。认为该剂量是猴内的安全剂量。使用这些数据，应用至少10倍的安全系数并选择用于BPH试验第一组群的起始剂量(每克人前列腺0.03μgMPP5)。 

BPH试验内施用MPP5的示例性方法是常见的经尿道施用途径，其中每种剂量仅进行4次注射(每个侧叶进行2次注射)。为了在注射期间进行引导，例如，可以使用经直肠超声法。BPH试验中待施用的总体积是50μL/g前列腺。为了减少注射期间的回流，例如，可以使用凝胶制剂或粘性制剂。 

虽然本发明已经参考某些具体实施方案进行描述，但是本发明的多种修改对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且不脱离如所附权利要求书内所描述的本发明的精神和范围。 

本说明书中所参考的全部专利、公布文本(包括已公开的专利申请) 和数据库条目的所有内容被明确地以引用方式并入本文，就如同上述单独专利、公布文本和数据库条目中的每一个都被明确地和单独地以引用方式并入本文一样。 

序列表

Claims (22)

1.一种修饰的成孔蛋白在制备用于治疗良性前列腺增生(BPH)的药剂中的用途，所述修饰的成孔蛋白来自天然存在的成孔蛋白，并且包括一个或多个前列腺选择性修饰，所述前列腺选择性修饰选自可由前列腺特异性蛋白酶切割的活化序列和一个或多个能够选择性靶向前列腺细胞的前列腺特异性靶向结构域，其中所述修饰的成孔蛋白能够选择性杀伤前列腺细胞。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述修饰的成孔蛋白与用于良性前列腺增生的一种或多种其他治疗联合使用。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述天然存在的成孔蛋白为气单胞菌溶素原或α-毒素。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述修饰的成孔蛋白包括可由前列腺特异性蛋白酶切割的活化序列。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述修饰的成孔蛋白包括前列腺特异性靶向结构域。

6.根据权利要求1所述的用途，其中所述修饰的成孔蛋白包括可由前列腺特异性蛋白酶切割的活化序列，和一个或多个前列腺特异性靶向结构域。

7.根据权利要求1所述的用途，其中所述可由前列腺特异性蛋白酶切割的活化序列功能性取代所述天然存在的成孔蛋白的天然活化序列。

8.根据权利要求1所述的用途，其中所述前列腺特异性蛋白酶是前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)或人腺体激肽释放酶2(hK2)。

9.根据权利要求1所述的用途，其中所述前列腺特异性蛋白酶是前列腺特异性抗原。

10.根据权利要求1所述的用途，其中所述前列腺特异性靶向结构域是促黄体激素释放激素，或前列腺特异性膜抗原的抗体。

11.根据权利要求1所述的用途，其中所述修饰的成孔蛋白还包括在所述天然存在的成孔蛋白的结合结构域中的一个或多个突变。

12.根据权利要求1所述的用途，其中所述修饰的成孔蛋白还包括亲和标签。

13.根据权利要求1所述的用途，其中所述修饰的成孔蛋白被配制成用于前列腺内给药的制剂。

14.根据权利要求1所述的用途，其中所述修饰的成孔蛋白被配制成用于静脉内给药的制剂。

15.根据权利要求1所述的用途，其中所述天然存在的成孔蛋白为嗜水气单胞菌的气单胞菌溶素原。

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述修饰的成孔蛋白包括可由前列腺特异性蛋白酶切割的活化序列。

17.根据权利要求15所述的用途，其中所述修饰的成孔蛋白还包括在气单胞菌溶素原的结合结构域中的一个或多个突变。

18.根据权利要求15所述的用途，其中所述修饰的成孔蛋白由SEQ ID NO：4中所列的氨基酸序列和亲和标签构成，并且其中蛋白具有1至10个保守性氨基酸的取代。

19.根据权利要求15所述的用途，其中所述修饰的成孔蛋白由SEQ ID NO：31中所列的氨基酸序列构成，并且其中蛋白具有1至10个保守性氨基酸的取代。

20.根据权利要求17所述的用途，其中所述一个或多个突变选自在对应于SEQ ID NO：2的Y162位置的突变、在对应于SEQ ID NO：2的W324位置的突变、在对应于SEQ ID NO：2的R323位置的突变、在对应于SEQ ID NO：2的R336位置的突变以及在对应于SEQ ID NO：2的W127位置的突变。

21.根据权利要求17所述的用途，其中至少一个突变对应于SEQID NO：2的R336A。

22.根据权利要求15所述的用途，其中所述修饰的成孔蛋白由SEQ ID NO：31中所列的氨基酸序列构成。

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