EA009124B1 - Антитела против il-20 и связывающие партнеры, а также способы их применения при воспалении - Google Patents

Антитела против il-20 и связывающие партнеры, а также способы их применения при воспалении Download PDF

Info

Publication number
EA009124B1
EA009124B1 EA200501506A EA200501506A EA009124B1 EA 009124 B1 EA009124 B1 EA 009124B1 EA 200501506 A EA200501506 A EA 200501506A EA 200501506 A EA200501506 A EA 200501506A EA 009124 B1 EA009124 B1 EA 009124B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
amino acid
acid residues
polypeptide
polypeptide consisting
Prior art date
Application number
EA200501506A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200501506A1 (ru
Inventor
Вэньфэн Сюй
Уэйн Киндсвогель
Ясмин А. Чандрасекер
Стейси Р. Диллон
Джойс М. Ленер
Энтони У. Сиадак
Паллавур В. Сивакумар
Маргарет Д. Мур
Original Assignee
Займоджинетикс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=33101289&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA009124(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Займоджинетикс, Инк. filed Critical Займоджинетикс, Инк.
Publication of EA200501506A1 publication Critical patent/EA200501506A1/ru
Publication of EA009124B1 publication Critical patent/EA009124B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к блокированию, ингибированию, снижению, антагонистическому действию или нейтрализации активности полипептидных молекул IL-20. IL-20 и IL-22 являются цитокинами, которые вовлечены в воспалительные процессы и заболевания человека. Настоящее изобретение включает антитела против IL-20 и против IL-22RA и связывающие партнеры, а также способы антагонистического воздействия в отношении IL-20 с применением таких антител и связывающих партнеров.

Description

Уровень техники, к которому относится изобретение
Цитокины представляют собой растворимые небольшие белки, которые опосредуют разнообразные биологические эффекты, включая регуляцию роста и дифференцировку многих типов клеток (см., например, Ага1 е! а1., Аппи. Ксу. ВюсНет. 59:783 (1990); Моктаии, Сигг. Θρίη. 1ттипо1. 3:311 (1991); Раи1 аиб 8ебег, Се11 76:241 (1994)). Белки, которые составляют группу цитокинов, включают интерлейкины, интерфероны, колоние-стимулирующие факторы, факторы некроза опухолей и другие регуляторные молекулы. Например, интерлейкин-17 человека представляет собой цитокин, который стимулирует экспрессию интерлейкина-6, внутриклеточной молекулы адгезии 1, интерлейкина-8, гранулоцит-макрофагколоние-стимулирующего фактора и экспрессию простагландина Е2, и играет роль в предпочтительном созревании СГО34+ гематопоэтических предшественников в нейтрофилы (Уао е! а1., 1. 1ттиио1. 155:5483 (1995); Рокмех е! а1., 1. Εχρ. Меб. 183:2593 (1996)).
Рецепторы, которые связывают цитокины, обычно состоят из одного или нескольких интегративных белков мембран, которые связывают цитокин с высоким сродством и передают сигнал связывания в клетку посредством цитоплазматических частей определенных субъединиц рецептора. Рецепторы цитокинов сгруппированы в несколько классов на основе сходства их внеклеточных лиганд-связывающих доменов. Например, рецепторные цепи, ответственные за связывание и/или передачу сигнала интерферонов, являются членами класса II семейства рецепторов цитокинов на основе характерных 200 остатков внеклеточного домена.
Продемонстрированная активность цитокинов и их рецепторов ίη у1уо иллюстрирует их клинические возможности и потребность в других цитокинах, рецепторах цитокинов, агонистах цитокинов и антагонистах цитокинов. Например, продемонстрированная ίη у1уо активность семейства провоспалительных цитокинов иллюстрирует их огромные клинические возможности и потребность в антагонистах провоспалительных молекул. Настоящее изобретение направлено на данные потребности посредством предложения антагонистов провоспалительных цитокинов Ш-20 и Ш-22. Такие антагонисты настоящего изобретения, которые могут блокировать, ингибировать, снижать, действовать антагонистически или нейтрализовать активность 1Б-22, Ш-20 или как Ш-20, так и Ш-22, включают растворимые рецепторы 1Ь22КА и нейтрализующие антитела против 1Б-22ВА. В изобретении дополнительно предлагается их применение при воспалительном заболевании, а также относящиеся к ним композиции и способы.
Подробное описание изобретения
1. Обзор.
По сравнению с другими изобретениями в настоящем изобретении предлагается новое применение растворимого рецептора, обозначаемого ДеуЮгИ или 1Б-22ВА. и нейтрализующих антител против цитокиновых рецепторов Ш-22-РА. В настоящем изобретении предлагаются также растворимые полипептидные фрагменты 1Б-22ВА и гибридные белки для применения при воспалительных и аутоиммунных заболеваниях человека. Антитела против Ш-22РА и растворимые рецепторы 1Б-22ВА настоящего изобретения, включая нейтрализующие антитела против Ш-22РА настоящего изобретения, могут быть применены для блокирования, ингибирования, снижения, антагонистического действия или нейтрализации активности либо Ш-22 или Ш-20, или как Ш-20, так и Ш-22 при лечении конкретных заболеваний человека, таких как псориаз, псориатический артрит, артрит, эндотоксемия, воспалительное заболевание кишечника (ΙΒΌ), колит и другие раскрытые здесь воспалительные состояния.
Иллюстративная нуклеотидная последовательность, которая кодирует ДсуЗог 11 (1Б-22РА), предлагается в 8ΕΟ ΙΌ N0:1; кодирующий пептид представлен в 8Ε0 ΙΌ N0:2. Ш-22РА представляет собой рецепторную субъединицу как для (Ш-20, так и для 1Б-22. 2су1ог11 (Ш-22РА) раскрыт в обычно принадлежащем США патенте № 5965704, в обычно принадлежащей \У1Р0 публикации \У0 02/12345 и обычно принадлежащей \У1Р0 публикации \У0 02/072607. Анализ клона кДНК человека, кодирующей 1Б-22КА (8Ε0 ГО N0:1), выявил открытую рамку считывания, кодирующую 574 аминокислоты (8Ε0 ГО N0:2), включающую внеклеточный лиганд-связывающий домен из приблизительно 211 аминокислотных остатков (остатки 18-228 8Ε0 ГО N0:2; 8Ε0 ГО N0:3), трансмембранный домен из приблизительно 23 аминокислотных остатков (остатки 229-251 8Ε0 ГО N0:2) и внутриклеточный домен из приблизительно 313 аминокислотных остатков (остатки с 252 до 574 8Ε0 ГО N0:2). Данные молекулы настоящего изобретения включают полипептиды, которые включают цитокин-связывающий домен, включающий аминокислотные остатки 18-228 8Ε0 ГО N0:2; 8Ε0 ГО N0:3. В одном осуществлении растворимый рецептор настоящего изобретения, растворимый ΙΕ-22Κ присоединен к константной области тяжелой цепи (пример представлен в 8Ε0 ГО N0:4). Специалисту в данной области должно быть понятно, что границы доменов являются приблизительными. Возможна делеция остатков концов доменов.
Как описано ниже, в настоящем изобретении предлагаются выделенные полипептиды, включающие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90% или более чем на 95%, например на 96, 97, 98 или более чем на 99% или более, идентична референтной аминокислотной последовательности 18-228 8Ε0 ГО N0:2, которая также представлена как 8Ε0 ГО N0:3, где выделенный пептид специфически связывается с антителом, которое специфически связывается с полипептидом, включающим аминокислотную последовательность 8Ε0 ГО N0:3. Примеры полипептидов включают полипептиды, включающие либо аминокислотные остатки 8Ε0
- 1 009124
ΙΌ N0:3, либо аминокислотные остатки 8Е0 ΙΌ N0:3. Более того, в настоящем изобретении предлагаются также выделенные полипептиды, как раскрыто выше, которые связывают ГБ-22 (например, полипептидная последовательность ГБ-22 человека, как показано в 8Е0 ΙΌ N0:6). Полинуклеотидная последовательность ГБ-22 человека представлена в 8Е0 ΙΌ N0:5. Полинуклеотидная последовательность ГБ-22 мыши представлена в 8ЕЦ ΙΌ N0:10 и соответствующий полипептид представлен в 8ЕЦ ΙΌ N0:11. В настоящем изобретении предлагаются также выделенные полипептиды, как раскрыто выше, которые связывают 1Б-20 (например, полипептидная последовательность 1Б-20 человека, как показано в 8ЕЦ ΙΌ N0:8; публикация №ΙΡ0 N0. №0 99/27103). Полинуклеотидная последовательность Ш-20 человека представлена в 8Е0 ΙΌ N0:7.
В настоящем изобретении предлагаются также выделенные полипептиды и эпитопы, включающие по меньшей мере 15 соседних аминокислотных остатков аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:3. Примеры пептидов включают полипептиды, которые либо включают, либо состоят из 8Е0 ΙΌ N0:3, ее антигенных эпитопов или ее связывающих фрагментов для функциональных ЕБ-20 или ΙΕ-22. Более того, в настоящем изобретении предлагаются также выделенные пептиды, как раскрыто выше, которые связываются, блокируют, ингибируют, снижают, проявляют антагонистическое действие или нейтрализуют активность ЕБ-22 или ЕБ-20.
Настоящее изобретение включает также варианты полипептидов ΙΕ-22ΚΑ, где аминокислотная последовательность варианта полипептида имеет идентичность с аминокислотными остатками 8Е0 ΙΌ N0:3, выбранную из группы, состоящей по меньшей мере из 70% идентичности, по меньшей мере 80% идентичности, по меньшей мере 90% идентичности, по меньшей мере 95% идентичности или выше, чем 95% идентичность, такая как 96, 97, 98% или выше чем 99% или более идентичность, и где любое различие между аминокислотной последовательностью варианта полипептида и соответствующей аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0:3 обусловлено одной или более консервативными аминокислотными заменами. Здесь описаны такие консервативные аминокислотные замены. Более того, в настоящем изобретении предлагаются также выделенные полипептиды, как раскрыто выше, которые связываются, блокируют, ингибируют, снижают, проявляют антагонистическое действие или нейтрализуют активность ΙΕ-22 или ΙΕ-20.
В настоящем изобретении дополнительно предлагаются антитела и фрагменты антител, которые специфически связываются с такими полипептидами. Примеры антител включают нейтрализующие антитела, поликлональные антитела, мышиные моноклональные гуманизированные антитела, антитела, происходящие из мышиных моноклональных антител, и человеческие моноклональные антитела. Примеры фрагментов антител включают Е(аЬ')2, Е(аЬ)2, ЕаЬ', ЕаЬ, Εν, 5сЕу и минимальные узнающие единицы. Нейтрализующие антитела предпочтительно связывают ΙΕ-22ΚΑ и таким образом блокируют, ингибируют, снижают, вызывают антагонистическое действие или нейтрализуют взаимодействие ΙΕ-20 и ΙΕ22 с ΙΕ-22ΚΑ настоящего изобретения. Это означает, что нейтрализующие антитела против ΙΕ-22ΚΑ настоящего изобретения могут либо связывать, блокировать, ингибировать, снижать, проявлять антагонистическое действие или нейтрализовать каждый из ΙΕ-20 или ΙΕ-22 по одиночке, либо связывать, блокировать, ингибировать, снижать, проявлять антагонистическое действие или нейтрализовать ΙΕ-20 и ΙΕ-22 вместе. Настоящее изобретение дополнительно включает композиции, включающие носитель и описанные здесь пептид, полипептид или антитело.
Кроме того, в настоящем изобретении предлагаются фармацевтические композиции, включающие фармацевтически приемлемый носитель и по меньшей мере один из таких экспрессионных векторов или рекомбинантных вирусов, включающих такие экспрессионные векторы. Настоящее изобретение дополнительно включает фармацевтические композиции, включающие фармацевтически приемлемый носитель и описанные здесь полипептид или антитело.
Настоящее изобретение охватывает также антиидиотипические антитела или фрагменты антиидиотипических антител, которые специфически связывают антитело или фрагмент антитела, которые специфически связывают полипептид, включающий аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:3 или ее фрагмент. Характерное антиидиотипическое антитело связывается с антителом, которое специфически связывает полипептид, состоящие из 8Е0 Ш N0:3.
В настоящем изобретении предлагаются также гибридные белки, включающие полипептид ΙΕ-22ΚΑ и иммуноглобулиновую часть. В таких гибридных белках иммуноглобулиновая часть может представлять собой константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, такую как Ес фрагмент человека. Настоящее изобретение дополнительно включает молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют такие гибридные белки.
В настоящем изобретении предлагаются также поликлональные и моноклональные антитела, которые связываются с полипептидами, включающими внеклеточный домен ΙΕ-22ΚΑ, такими как мономерные, гомодимерные, гетеродимерные и мультимерные рецепторы, включая растворимые рецепторы. Более того, такие антитела могут быть использованы как антагонисты связывания лигандов ΙΕ-22ΚΑ, ΙΕ-22 (8Е0 Ш N0:6) и Ш-20 (8Е0 ΙΌ N0:8), раздельно или совместно, с рецептором ΙΕ-22ΚΑ.
Более того, гиперэкспрессия или позитивная регуляция Ш-22 и Ш-20 была показана при псориатических поражениях человека и в образцах кожи с атрофическим дерматитом человека, что предполагает,
- 2 009124 что ББ-22 подобно ББ-20 также вовлечен в псориаз человека, атрофический дерматит или другие воспалительные заболевания кожи и эпителиальных тканей. Более того, как здесь описано, при гиперэкспрессии ББ-20 или ГБ-22 у трансгенных мышей проявлялось эпидермальное утолщение и вовлечение иммунных клеток, что указывает на фенотип псориаза; и, кроме того, при введении ББ-22 нормальным мышам проявлялось эпидермальное утолщение и вовлечение иммунных клеток, что указывает на фенотип псориаза, который исчезал под действием антагониста растворимого рецептора ББ-22КА2 (хсу1ог16; публикация \νΐΡΘ Νο. νθ 01/40467). Такие данные ίη νινο дополнительно предполагают, что провоспалительный ББ-22 вовлечен в псориаз, атрофический дерматит или другие воспалительные заболевания кожи и эпителиальных тканей. Как таковые, антагонисты активности ББ-22 и ББ-20, такие как растворимые рецепторы ББ-22КА и антитела к ним, включая моноклональные и нейтрализующие антитела против ББ22КА человека настоящего изобретения, пригодны для терапевтического лечения воспалительных заболеваний, особенно в качестве антагонистов как ББ-22, так и ББ-20, по одиночке и вместе, при лечении псориаза. Более того, антагонисты активности ББ-22, такие как растворимые рецепторы ББ-22КА и антитела к ним, включая моноклональные и нейтрализующие антитела против ББ-22КА человека настоящего изобретения, пригодны для терапевтического лечения других воспалительных заболеваний, например, для связывания, блокирования, ингибирования, снижения, антагонистического действия или нейтрализации ББ-22 и ББ-20 (по одиночке и вместе) при лечении атрофического дерматита, БВБ. колита, эндотоксемии, артрита, ревматоидного артрита и псориазного артрита, респираторного заболевания взрослых (АВЭ), септического шока, множественной органной недостаточности, воспалительного повреждения легких, таких как астма или бронхит, бактериальной пневмонии, псориаза, экземы, атрофического и контактного дерматита и воспалительного заболевания кишечника, такого как язвенный колит и болезнь Крона.
Данные и другие аспекты изобретения станут очевидными при ссылке на последующее подробное описание. Кроме того, ниже идентифицированы различные ссылки и они включены в качестве ссылки во всей своей полноте.
2. Определения.
В следующем описании часто применяется ряд терминов. Предлагается ряд определений для облегчения понимания изобретения.
Применяемые здесь нуклеиновая кислота и молекула нуклеиновой кислоты относятся к полинуклеотидам, таким как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновая кислота (РНК), олигонуклеотидам, фрагментам, получаемым с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и фрагментам, образуемым с помощью любого из лигирования, вырезания, действия эндонуклеазы и действия экзонуклеазы. Молекулы нуклеиновой кислоты могут состоять из мономеров, которые представляют собой естественно существующие нуклеотиды (такие как ДНК и РНК), или аналоги существующих в природе нуклеотидов (например, α-энантиомерные формы существующих в природе нуклеотидов), или сочетание обоих. Модифицированные нуклеотиды могут содержать изменения в сахарных частях и/или в частях пиримидиновых или пуриновых оснований. Модификации сахара включают, например, замену одной или более гидроксильных групп галогенами, алкильными группами, аминами и азидогруппами, или сахара могут быть функционализированы в виде простых или сложных эфиров. Более того, полная сахарная часть может быть заменена стерически и электронно сходными структурами, такими как азасахара и карбоциклические аналоги сахаров. Примеры модификаций в части основания включают алкилированные пурины и пиримидины, ацилированные пурины или пиримидины или другие хорошо известные гетероциклические заместители. Мономеры нуклеиновой кислоты могут быть соединены с помощью фосфодиэфирных связей или аналогов таких связей. Аналоги фосфодиэфирных связей включают фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанилотиоат, фосфоранилидат, фосфорамидат и тому подобное. Термин молекула нуклеиновой кислоты также включает так называемые пептиднуклеиновые кислоты, которые включают природные или модифицированные основания нуклеиновой кислоты, присоединенные к полиамидной основе. Нуклеиновые кислоты могут быть либо односпиральными, либо двуспиральными.
Термин комплемент молекулы нуклеиновой кислоты относится к молекуле нуклеиновой кислоты, имеющей комплементарную нуклеотидную последовательность и обратную ориентацию по сравнению с референтной нуклеотидной последовательностью. Например, последовательность 5' АТОСАСООО 3' комплементарна 5'СССОТОСАТ 3'.
Термин вырожденная нуклеотидная последовательность обозначает последовательность нуклеотидов, которая включает один или несколько вырожденных кодонов по сравнению с молекулой референтной нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид. Вырожденные кодоны содержат различные триплеты нуклеотидов, но кодируют тот же самый аминокислотный остаток (т.е. каждый из триплетов ОАИ и ОАС кодирует Акр).
Термин структурный ген относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется в матричную РНК (мРНК), которая затем транслируется в последовательность аминокислот, характерную для конкретного полипептида.
- 3 009124
Выделенная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая не интегрирована в геномную ДНК организма. Например, молекула ДНК, которая кодирует фактор роста, которая была выделена из геномной ДНК клетки, представляет собой выделенную молекулу ДНК. Другим примером выделенной молекулы нуклеиновой кислоты является химически синтезированная молекула нуклеиновой кислоты, которая не интегрирована в геном организма. Молекула нуклеиновой кислоты, которая была выделена из конкретного вида, является меньшей по сравнению с полной молекулой ДНК хромосомы кз того же вида.
Конструкт молекулы нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, односпиральной или двуспиральной, которая была модифицирована посредством вмешательства человека для включения сегментов нуклеиновой кислоты, объединенных и взаимно расположенных в порядке, не существующем в природе.
Линейная ДНК обозначает незамкнутые в круг молекулы ДНК, содержащие свободные 5' - и З'концы. Линейная ДНК может быть получена из замкнутых в круг молекул ДНК, таких как плазмиды, путем ферментативного гидролиза или физического разрушения.
Комплементарная ДНК (кДНК) представляет собой односпиральную молекулу ДНК, которая образуется из матрицы мРНК с помощью фермента обратной транскриптазы. Обычно для инициации обратной транскрипции применяют праймер, комплементарный частям мРНК. Специалисты в данной области также применяют термин кДНК для обозначения двуспиральной молекулы ДНК, состоящей из такой односпиральной молекулы ДНК и комплементарной ей цепи ДНК. Термин кДНК также относится к клону молекулы кДНК, синтезированной на матрице РНК.
Промотор представляет собой нуклеотидную последовательность, которая управляет транскрипцией структурного гена. Обычно промотор располагается в 5'-некодирующей области гена, проксимальной к сайту старта транскрипции структурного гена. Элементы последовательности в промоторах, которые принимают участие в инициации транскрипции, часто характеризуют с помощью консенсусных нуклеотидных последовательностей. Данные промоторные элементы включают сайты связывания РНКполимеразы, последовательности ТАТА, последовательности СААТ, специфичные для дифференцировки элементы (ΌδΕκ; МсСейее е! а1., Μοί. Εηάοοτίηοΐ. 7:551 (1993)), чувствительные к циклическому АМФ элементы (СКЕ), чувствительные к сыворотке элементы (БКЕк; Тге18шап, Бетшага ίη Сапсег Βίοί. 1:47 (1990)), глюкокортикоид-чувствительные элементы (СКЕ) и сайты связывания для других транскрипционных факторов, такие как СКЕ/АТЕ (О'Ке111у е! а1., 1. Βίοί. Сйет. 267:19938 (1992)), АР2 (Уе е! а1., 1. Βίοί. Сйет. 269:25728 (1994)), БР1, белок, связывающий цАМФ-чувствительный элемент (СКЕВ; ^οекеη, Сепе Ехрг. 3:253 (1993)) и октамерные факторы (смотри в целом ХУабюп е! а1., е4§; Μοίесиίа^ Βίο1οβ· οί 1йе Сепе, 41й еб. (Тйе Веп)ат1п/Ситт1пд5 РиЫЫшщ Сотрат·. 1пс. 1987), и Бетащге апб Ρονίδ^·».!. Βίοсйет. 1. 303:1 (1994)). Если промотор является индуцируемым промотором, то скорость транскрипции возрастает в ответ на индуцирующий агент. Напротив, скорость транскрипции не регулируется индуцирующим агентом, если промотор является конститутивным промотором. Известны также репрессируемые промоторы.
Базовый промотор содержит необходимые нуклеотидные последовательности для промоторной функции, включая блок ТАТА и старт транскрипции. При таком определении базовый промотор может иметь или может не иметь определяемой активности в отсутствие специфических последовательностей, которые могут увеличивать активность или придавать тканевую специфичность активности.
Регуляторный элемент представляет собой нуклеотидную последовательность, которая модулирует активность базового промотора. Например, регуляторный элемент может содержать нуклеотидную последовательность, которая связывается с клеточными факторами, обеспечивающими транскрипцию исключительно или предпочтительно в конкретных клетках, тканях и органеллах. Данные типы регуляторных элементов обычно ассоциированы с генами, которые экспрессируются специфичным для клетки, специфичным для ткани или специфичным для органеллы образом.
Энхансер представляет собой тип регуляторного элемента, который может увеличивать эффективность транскрипции независимо от расстояния или ориентации энхансера по отношению к сайту старта транскрипции.
Гетерологичная ДНК обозначает молекулу ДНК или популяцию молекул ДНК, которые не существуют в естественных условиях в данной клетке-хозяине. Молекулы ДНК, гетерологичные по отношению к конкретной клетке-хозяину, могут содержать ДНК, происходящую из вида клетки-хозяина (т.е. эндогенной ДНК), когда ДНК хозяина соединена с ДНК не хозяина (т.е. экзогенной ДНК). Например, молекула ДНК, содержащая нехозяйский сегмент ДНК, кодирующий полипептид, оперативно связанный с хозяйским сегментом ДНК, включающим промотор транскрипции, рассматривается как гетерологичная молекула ДНК. Наоборот, гетерологичная молекула ДНК может включать эндогенный ген, оперативно связанный с экзогенным промотором. В качестве другой иллюстрации молекула ДНК, включающая ген, происходящий от клетки дикого типа, рассматривается в качестве гетерологичной ДНК, если данная молекула ДНК введена в мутантную клетку, которая не содержит ген дикого типа.
- 4 009124
Полипептид представляет собой полимер из аминокислотных остатков, соединенных с помощью пептидных связей, продуцируемый естественным путем или полученный синтетически. Полипептиды из менее чем приблизительно 10 аминокислотных остатков обычно обозначают как пептиды.
Белок представляет собой макромолекулу, включающую одну или более полипептидных цепей. Белок также может включать не пептидные компоненты, такие как углеводные группы. Углеводы и другие непептидные заместители могут быть присоединены к белку клеткой, в которой белок продуцируется, и могут варьироваться в зависимости от типа клетки. Белки определяются здесь в соответствии с их аминокислотными базовыми структурами; заместители, такие как углеводные группы, обычно не описываются, но тем не менее могут присутствовать.
Пептид или полипептид, кодируемый нехозяйской молекулой ДНК, представляет собой гетерологичный пептид или полипептид.
Клонирующий вектор представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, такую как плазмида, космида или бактериофаг, которая обладает способностью к автономной репликации в клетке-хозяине. Клонирующие векторы обычно содержат один или небольшое количество сайтов рестрикции, узнаваемых эндонуклеазами, что обеспечивает вставку молекулы нуклеиновой кислоты определенным образом без утраты необходимой биологической функции вектора, а также нуклеотидных последовательностей, кодирующих маркерный ген, который является пригодным для применения для идентификации и отбора клеток, трансформированных клонирующим вектором. Маркерные гены обычно включают гены, которые обеспечивают устойчивость к тетрациклину или устойчивость к ампициллину.
Экспрессионный вектор представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую ген, который экспрессируется в клетке-хозяине. Обычно экспрессионный вектор включает промотор транскрипции, ген и терминатор транскрипции. Экспрессию гена обычно ставят под контроль промотора, и такой ген называют оперативно связанным с промотором. Сходным образом регуляторный элемент и базовый промотор являются оперативно связанными, если регуляторный элемент модулирует активность базового промотора.
Рекомбинантный хозяин представляет собой клетку, которая содержит гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты, такую как клонирующий вектор или экспрессионный вектор. В данном контексте примером рекомбинантного хозяина является клетка, которая продуцирует 1Ь-22КА с экспрессионного вектора. Напротив, 1Ь-22КА может быть продуцирован клеткой, которая является естественным источником 1Ь-22КА и не содержит экспрессионного вектора.
Интегрированные трансформанты являются рекомбинантными клетками-хозяевами, в которых гетерологичная ДНК была интегрирована в геномную ДНК клеток.
Гибридный белок представляет собой гибридный белок, экспрессируемый молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидные последовательности по меньшей мере двух генов. Например, гибридный белок может включать по меньшей мере часть полипептида 1Ь-22КА, соединенную с полипептидом, который связывается с аффинным матриксом. Такой гибридный белок служит средством для выделения больших количеств 1Ь-22КА с помощью аффинной хроматографии.
Термин рецептор обозначает ассоциированный с клеткой белок, который связывается с биологически активной молекулой, называемой лигандом. Данное взаимодействие опосредует действие лиганда на клетку. Рецепторы могут быть связанными с мембраной, цитозольными или ядерными; мономерными (например, рецептор тиреотропина, бета-адренергический рецептор) или мультимерными (например, рецептор ΡΌΟΓ, рецептор гормона роста, рецептор 1Ь-3, рецептор СМ-С8Г, рецептор С-С8Г, рецептор эритропоэтина и рецептор 1Ь-6). Связанные с мембраной рецепторы отличаются мультидоменной структурой, включающей внеклеточный лиганд-связывающий домен, и внутриклеточный эффекторный домен, который обычно участвует в проведении сигнала. В некоторых связанных с мембраной рецепторах внеклеточный лиганд-связывающий домен и внутриклеточный эффекторный домен расположены в разных полипептидах, которые составляют полный функциональный рецептор.
В целом связывание лиганда с рецептором приводит к конформационному изменению рецептора, которое вызывает взаимодействие между эффекторным доменом и другой молекулой (молекулами) в клетке, что в свою очередь ведет к изменению в метаболизме клетки. Метаболические события, которые часто связаны с лиганд-рецепторными взаимодействиями, включают транскрипцию генов, фосфорилирование, дефосфорилирование, увеличение образования циклического АМФ, мобилизацию клеточного кальция, мобилизацию мембранных липидов, клеточную адгезию, гидролиз инозитоловых липидов и гидролиз фосфолипидов.
Растворимый рецептор представляет собой рецепторный полипептид, который не связан с клеточной мембраной. Растворимые рецепторы наиболее часто являются лиганд-связывающими рецепторными полипептидами, у которых отсутствует трансмембранный и цитоплазматический домены и другая связь с клеточной мембраной, такая как через гликофосфоинозитол (§ρί). Растворимые рецепторы могут включать дополнительные аминокислотные остатки, такие как аффинные метки, которыми снабжают для очистки полипептида или для обеспечения сайтами для присоединения полипептида к субстрату или к последовательностям константных областей иммуноглобулинов. Многие рецепторы клеточной поверхности имеют существующие в природе растворимые копии, которые получаются путем гидролиза
- 5 009124 или транслируются с мРНК после альтернативного сплайсинга. Растворимые рецепторы могут быть мономерными, гомодимерными, гетеродимерными или мультимерными, причем мультимерные рецепторы обычно не включают больше 9 субъединиц, предпочтительно не включают больше 6 субъединиц и наиболее предпочтительно не включают больше 3 субъединиц. Говорят, что рецепторные полипептиды являются, по существу, свободными от трансмембранного и внутриклеточного полипептидных сегментов, когда у них отсутствуют существенные части данных сегментов, обеспечивающих заякоревание на мембране или передачу сигнала, соответственно. Растворимые рецепторы рецепторов цитокинов класса I и класса II обычно включают внеклеточный цитокин-связывающий домен, свободный от трансмембранного домена и внутриклеточного домена. Например, представители растворимых рецепторов включают растворимые рецепторы для СКГ2-4 (также известные как 1Ь-10КБ) (ОеиЬапк, N поступления Ζ17227), как показано в 8ЕЦ ΙΌ N0:44 и 8ЕЦ ΙΌ N0:45; растворимый рецептор для 1Ь-10КЛ (ОеиЬапк, N поступления И00672 и ЯМ 001553), как показано в 8ЕЦ ΙΌ N0:46; растворимый рецептор для ρΌΙΚ81 (также известный как 1Ь-20КБ) (ОеиЬапк, N поступления ΑΥ358305), как показано в 8ЕЦ ΙΌ N0:47; и растворимый рецептор для ΙΕ-22ΚΑ (патент США N0. 5965704), как показано в 8ЕЦ ΙΌ N0:3. Специалист в данной области может хорошо изобразить, какие последовательности из известных последовательностей цитокинов класса Ι и класса ΙΙ включают внеклеточный цитокин-связывающий домен, свободный от трансмембранного домена и внутриклеточного домена. Более того, специалист в данной области, применяя генетический код, может легко определить полинуклеотиды, которые кодируют такие растворимые рецепторные полипептиды.
Термин «секреторная сигнальная последовательность» обозначает последовательность ДНК, которая кодирует пептид («секреторный пептид»), который в качестве компонента более крупного полипептида направляет более крупный полипептид по секреторному пути клетки, в которой он синтезируется. Более крупный полипептид обычно расщепляется с удалением секреторного пептида при прохождении по секреторному пути.
«Выделенный полипептид» представляет собой полипептид, который по существу свободен от примеси клеточных компонентов, таких как углеводные, липидные или другие белковые загрязнения, связанные с полипептидом в природе. Обычно препарат выделенного полипептида содержит полипептид в высоко очищенной форме, т.е. по меньшей мере приблизительно 80% чистоты, по меньшей мере приблизительно 90% чистоты, по меньшей мере приблизительно 95% чистоты, более чем 95% чистоты, такой как чистый на 96, 97 или 98% или более, или чистый на более чем 99%. Одним способом показать, что конкретный препарат белка содержит выделенный полипептид, является появление единственной полосы после электрофореза препарата белка в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДДС-Ыа) и окраска геля кумасси ярко синим. Однако термин «выделенный» не исключает присутствия того же пептида в альтернативных физических формах, таких как димеры или альтернативно гликозилированные или дериватизированные формы.
Термины аминоконцевой и карбоксиконцевой применяются здесь для обозначения положений внутри полипептидов. Когда позволяет контекст, данные термины применяются со ссылкой на конкретную последовательность или часть полипептида для обозначения близости или относительного положения. Например, определенная последовательность, расположенная карбокситерминально по отношению к референтной последовательности в полипептиде, локализована проксимально по отношению к карбоксильному концу референтной последовательности, но не обязательно на карбоксильном конце полного полипептида.
Термин экспрессия относится к биосинтезу продукта гена. Например, в случае структурного гена экспрессия включает транскрипцию структурного гена в мРНК и трансляцию мРНК в один или более полипептидов.
Термин сплайсинговый вариант применяется здесь для обозначения альтернативных форм РНК, транскрибируемых с гена. Варианты сплайсинга появляются естественным образом благодаря использованию альтернативных сайтов сплайсинга в транскрибированной молекуле РНК или, что менее обычно, между раздельно транскрибированными молекулами РНК, и могут приводить к нескольким мРНК, транскрибированным с одного и того же гена. Сплайсинговые варианты могут кодировать полипептиды, содержащие измененную аминокислотную последовательность. Термин сплайсинговый вариант также применяется здесь для обозначения полипептида, кодируемого сплайсинговым вариантом мРНК, транскрибированной с гена.
Применяемый здесь термин иммуномодулятор включает цитокины, факторы роста стволовых клеток, лимфотоксины, костимулирующие молекулы, гематопоэтические факторы и тому подобное и синтетические аналоги данных молекул.
Термин пара комплемент/антикомплемент обозначает не идентичные части, которые образуют нековалентно ассоциированную, стабильную пару при подходящих условиях. Например, биотин и авидин (или стрептавидин) являются прототипными членами пары комплемент/антикомплемент. Другие иллюстративные пары комплемент/антикомплемент включают пары рецептор/лиганд, пары антитело/антиген (или гаптен или эпитоп), пары смысловой/антисмысловой полинуклеотид и тому подобное.
- 6 009124
Когда желательна последующая диссоциация пары комплемент/антикомплемент, пара комплемент/антикомплемент предпочтительно имеет сродство связывания менее 109 М-1.
Антиидиотипическое антитело представляет собой антитело, которое связывается с доменом вариабельной области иммуноглобулина. В настоящем контексте антиидиотипическое антитело связывается с вариабельной областью антитела против ΙΕ-22ΚΑ и таким образом антиидиотипическое антитело имитирует эпитоп ΙΕ-22ΚΑ.
Фрагмент антитела представляет собой часть антитела, такую как Р(аЬ')2, Р(аЬ)2, РаЬ', РаЬ и тому подобное. Независимо от структуры фрагмент антитела связывается с тем же антигеном, который узнается интактным антителом. Например, фрагмент моноклонального антитела против ΙΕ-22ΚΑ связывается с эпитопом 1Ь-22КА.
Термин фрагмент антитела также включает синтетический или сконструированный генетически полипептид, который связывается с конкретным антигеном, таким как полипептиды, которые состоят из вариабельной области легкой цепи, Ρν фрагментов, состоящих из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, рекомбинантных одноцепочечных полипептидных молекул, в которых вариабельные области легкой и тяжелой цепей соединены пептидным линкером (κοΡν белки), и единиц минимального распознавания, состоящих из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельную область.
Гибридное антитело представляет собой рекомбинантный белок, который содержит вариабельные домены и области, определяющие комплементарность, происходящие от антитела грызуна, тогда как остальная часть молекулы антитела происходит от антитела человека.
Гуманизированные антитела представляют собой рекомбинантные белки, в которых мышиные области, определяющие комплементарность моноклонального антитела, были перенесены из тяжелой и легкой вариабельных цепей иммуноглобулина мыши в вариабельный домен человека. Конструирование гуманизированных антител для терапевтического применения у человека, происходящих от антител мыши, таких как те, которые связываются с белком человека или нейтрализуют его, находится в компетенции специалистов в данной области.
Как применяется здесь, терапевтический агент представляет собой молекулу или атом, которые конъюгированы с частью антитела для получения конъюгата, который пригоден для терапии. Примеры терапевтических агентов включают лекарства, токсины, иммуномодуляторы, хелатирующие агенты, соединения бора, фотоактивные агенты или красители и радиоизотопы.
Выявляемая метка представляет собой молекулу или атом, которые могут быть конъюгированы с частью антитела для получения молекулы, пригодной для диагностики. Примеры выявляемых меток включают хелатирующие агенты, фотоактивные агенты, радиоизотопы, флуоресцентные агенты, парамагнитные ионы и другие маркерные части.
Термин аффинная метка применяется здесь для обозначения полипептидного сегмента, который может быть присоединен ко второму полипептиду для обеспечения очистки или выявления второго полипептида или обеспечения сайтов для присоединения второго полипептида к субстрату. В принципе, в качестве аффинной метки может быть применен любой пептид или белок, для которого имеется антитело или другой специфический связывающий агент. Аффинные метки включают полигистидиновый тракт, протеин Α (Νίΐκκοη е! а1., ЕМВО 1. 4:1075 (1985); Νίΐκκοη е! а1., Ме!йобк ЕихушоГ 198:3 (1991)), глутатион8-трансферазу (8шйй апб ΙοΗηκοη, Сеие 67:31 (1988)), С1и-С1и аффинную метку (Стиккепшеует е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8с1. ϋδΑ 82:7952 (1985)), вещество Р, пептид РЬАС (Ηορρ е! а1., Βίο^1ιηο1οβ.ν 6:1204 (1988)), стрептавидин-связывающий пептид или другой антигенный эпитоп или связывающий домен. См. в целом Ροτ6 е! а1., Рго!еш Ехртеккюи апб РипГса!юп 2:95 (1991). Молекулы ДНК, кодирующие аффинные метки, имеются в продаже из коммерческих источников, например, Рйатшааа Вю!есй, Р1кса!агау, N1).
Голое антитело представляет собой цельное антитело, в отличие от фрагмента антитела, которое не конъюгировано с терапевтическим агентом. Голые антитела включают и поликлональные, и моноклональные антитела, а также некоторые рекомбинантные антитела, такие как гибридные и гуманизированные.
Применяемый здесь термин компонент антитела включает и цельное антитело, и фрагмент антитела.
Иммуноконъюгат представляет собой конъюгат компонента антитела с терапевтическим агентом или выявляемой меткой.
Применяемый здесь термин гибридный белок антитела относится к рекомбинантной молекуле, которая включает компонент антитела и компонент полипептида 1Ь-22КА. Примеры гибридного белка антитела включают белок, который включает внеклеточный домен 1Ь-22КА и либо домен Рс, либо антигенсвязывающую область.
Полипептид-мишень или пептид-мишень представляет собой аминокислотную последовательность, которая включает по меньшей мере один эпитоп и которая экспрессируется на клетке-мишени, такой как опухолевая клетка или клетка, которая является носителем антигена инфекционного агента. Тклетки распознают пептидные эпитопы, презентируемые молекулой главного комплекса гистосовмести
- 7 009124 мости полипептиду-мишени или пептиду-мишени, и обычно лизируют клетку-мишень или рекрутируют другие иммунные клетки к клетке-мишени, тем самым убивая клетку-мишень.
Антигенный пептид представляет собой пептид, который обычно связывается молекулой главного комплекса гистосовместимости с образованием комплекса МНС-пептид, который узнается Т-клеткой, тем самым вызывая индукцию ответа цитотоксического лимфоцита после презентации Т-клетке. Таким образом, антигенные пептиды способны связываться с подходящей молекулой главного комплекса гистосовместимости и индуцировать ответ цитотоксических Т-клеток, а также лизис клеток или выделение конкретного цитокина против клетки-мишени, которая связывает или экспрессирует антиген. Антигенный пептид может быть связан в зависимости от ситуации молекулой главного комплекса гистосовместимости класса I или класса II на антиген-презентирующей клетке или на клетке-мишени.
У эукариот РНК-полимераза II катализирует транскрипцию структурного гена с получением мРНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть сконструирована так, чтобы она содержала матрицу РНКполимеразы II, в которой транскрипт РНК имеет последовательность, которая комплементарна таковой конкретной мРНК. Транскрипт РНК называют антисмысловой РНК и молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует антисмысловую РНК, называют антисмысловым геном. Молекулы антисмысловой РНК способны связываться с молекулами мРНК, что приводит к ингибированию трансляции мРНК.
Антисмысловой олигонуклеотид, специфичный для [Ь-22ЯА. или 'ΊΕ-22ΡΑ антисмысловой олигонуклеотид представляет собой олигонуклеотид, имеющий последовательность, (а) способную образовывать стабильный триплекс с частью гена Ш-22КА, или (Ь) способную образовывать стабильный дуплекс с частью транскрипта мРНК гена Ш-22КА.
Рибозим представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержит каталитический центр. Термин включает ферменты на основе РНК, самосплайсируемые РНК, саморасщепляющиеся РНК и молекулы нуклеиновой кислоты, которые осуществляют данные каталитические функции. Молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует рибозим, называют геном рибозима.
Внешняя направляющая последовательность представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая направляет эндогенный рибозим, КЫаке Р, к конкретным видам внутриклеточной мРНК, вызывая расщепление мРНК под действием КНаке Р. Молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует внешнюю направляющую последовательность, называют геном внешней направляющей последовательности.
Термин «вариант гена МА2КА» относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая представляет собой модификацию 8ЕР ГО N0:3. Такие варианты включают существующие в природе полиморфизмы генов №-22^А, а также синтетические гены, которые содержат консервативные замены аминокислот в аминокислотной последовательности 8ЕР ГО N0:3. Дополнительные варианты форм генов [^-ЗЗКΑ представляют собой молекулы нуклеиновой кислоты, которые содержат вставки или делеции в описанных здесь нуклеотидных последовательностях. Вариант гена МА2КА может быть идентифицирован, например, путем определения, будет ли ген гибридизоваться с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность 8ЕР ГО N0:1, или с ее комплементом в жестких условиях.
Альтернативно, варианты генов Ш-22КА могут быть идентифицированы путем сравнения последовательностей. Две аминокислотные последовательности имеют «100% идентичность аминокислотных последовательностей», если аминокислотные остатки двух аминокислотных последовательностей являются теми же самыми при выравнивании на максимальное соответствие. Сходно две нуклеотидные последовательности имеют «100% идентичность нуклеотидных последовательностей», если нуклеотидные остатки двух нуклеотидных последовательностей являются теми же самыми при выравнивании на максимальное соответствие. Сравнения последовательностей могут быть выполнены с применением стандартных компьютерных программ, таких как включенные в компьютерный комплект по биоинформатике ЬАЗЕКСЕНЕ, который производится ЭДАБТАК (Маб1коп, \У|ксопкш). Другие способы сравнения нуклеотидных или аминокислотных последовательностей с помощью определения оптимального выравнивания хорошо известны специалистам в данной области (см. например, РетикИ апб Ретикк1, Тйе ГОете! апб 1йе Де\у Вю1оду: Тоо1к Гог Сепопис апб Мо1еси1аг Кекеагсй (А8М Ргекк, Мс. 1997), \Уи е! а1. (ебк.), МГогтабоп БирегМдМуау апб Сотри1ет Эа1аЬакек оГ ДисЫс Ас1бк апб Рто!ешк, ίη МеШобк ίη Оепе Вю1есйпо1оду, радек 123-151 (СКС Ргекк, Шс. 1997), апб В1кйор (еб.). Ошбе !о Нитап Оепоте Сотрийпд, 2пб Ебйюп (Асабетю Ргекк, Мс. 1998)). Конкретные способы определения идентичности последовательностей описываются ниже.
Независимо от конкретного способа, применяемого для идентификации варианта гена ГО-22КА. или варианта полипептида ГО-22КА., вариант гена или полипептида, кодируемого вариантом гена, может быть функционально охарактеризован по его способности специфически связываться с антителом против Ш-22КА. Вариант гена МА2КА или вариант полипептида МА2КА может быть также функционально охарактеризован по его способности связываться со своим лигандом, Ш-22, с применением описанного здесь биологического или биохимического теста.
Термин «аллельный вариант» применяется здесь для обозначения любого из двух или более альтернативных форм гена, находящихся в том же самом локусе хромосомы. Аллельные варианты возникают
- 8 009124 естественным путем из-за мутации и могут быть результатом фенотипического полиморфизма в популяциях. Мутации генов могут быть молчащими (без изменений в кодируемом пептиде) или мутантные гены могут кодировать пептиды, имеющие измененную аминокислотную последовательность. Термин «аллельный вариант» используется здесь также для обозначения белка, кодируемого аллельным вариантом гена.
Термин «ортолог» обозначает полипептид или белок, полученный из вида, который является функциональной копией полипептида или белка другого вида. Различия последовательностей между ортологами являются результатом формирования вида.
«Паралоги» являются различными, но структурно сходными белками, продуцируемыми организмом. Паралоги, как считается, происходят путем дупликации генов. Например, α-глобин, β-глобин и миоглобин являются паралогами друг друга.
Настоящее изобретение включает функциональные фрагменты генов 1Б-22КА. В контексте данного изобретения «функциональный фрагмент» гена 1Б-22КА относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует часть полипептида 1Ь-22КА, которая является описанным здесь доменом или, по меньшей мере, специфически связывается с антителом против 1Б-22КА.
Из-за неточности стандартных аналитических методов молекулярные массы и длины полимеров понимаются как приблизительные величины. Когда такая величина выражается как «примерно» Х или «приблизительно» X, представленная величина Х должна рассматриваться с точностью ±10%.
3. Получение полинуклеотидов или генов 1Б-22КА.
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие ген 1Б-22КА человека, могут быть получены путем скрининга кДНК человека или геномной библиотеки с применением полинуклеотидных зондов на основе 8ΕΟ ΙΌ N0:1. Данные способы являются стандартными и хорошо установленными и могут осуществляться с применением наборов для клонирования, доступных из коммерческих источников. См., например, АикиЬе1 е( а1. (ебк.), 81юг1 РтоЛсо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 3гб Εάίΐίοη, 1оЬи \УПсу & 8оик 1995; \Уи е! а1., МеЛобк ίη Оеие Вю1ескио1оду, СКС Ргекк, 1ис. 1997; Άνίν аиб Ьейет, Ргос. Ναΐ'1 Асаб. 8с1. И8А 69:1408 (1972); Ниуп11 е( а1., СоикОисйид аиб 8сгеешпд с^NА ЫЬгапек ίη λ§ΐ10 аиб λ§111 ίη ΌΝΑ С1ошид: А Рго(осо1 Арртоаск Уо1. I, С1о\гег (еб.), раде 49 (1КЬ Ргекк, 1985); \Уи (1997) а! радек 47-52.
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие ген 1Ь-22КА человека, могут быть также получены с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами олигонуклеотидов, имеющими нуклеотидные последовательности, которые основываются на нуклеотидных последовательностях гена или кДНК Л-22КА. Общие способы скрининга библиотек с помощью ПЦР предлагаются, например, Уи е( а1., Ике о£ Ле Ро1утегаке С1ат Кеасйои (о 8стееи Р1аде ЫЬгапек. ίη МеЛобк ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 15: РСК Рго(осо1к: Ситтей Ме(Нобк аиб Аррксайоик, \У1Ше (еб.), Нитаиа Ргекк, 1ис., 1993. Более того, способы применения ПЦР для выделения родственных генов описываются, например, РтекЛи, Ике о£ Иедеиега1е 011доиис1еойбе Рптетк аиб Ле Ро1утегаке Сйаш Кеасйои (о С1оие Оеие ЕатПу МетЬегк, ίη МеЛобк ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 15: РСК Рго(осо1к: Ситгей МеЛобк аиб Аррксайоик, \У1Ше (еб.), Нитаиа Ргекк, 1ис., 1993. В качестве альтернативы, ген 1Б-22КА может быть получен путем синтеза молекул нуклеиновой кислоты с применением взаимного прайминга длинных олигонуклеотидов и описанных здесь нуклеотидных последовательностей (см., например, АикиЬе1 (1995)). Созданные способы с применением полимеразной цепной реакции обеспечивают способностью синтезировать молекулы ДНК длиной по меньшей мере две тысячи пар нуклеотидов (Абаид е( а1., Р1аи1 Мо1ес. Вю1. 21:1131 (1993), ВатЬо! е( а1., РСК МеЛобк аиб Аррксайоик 2:266 (1993), ИШои е( а1., Ике о£ Ле Ро1утегаке СЛат Кеаскои £ог Ле Кар1б Соикйискои о£ ЗуиЛейс Оеиек, ίη МеЛобк ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 15: РСК Рго(осо1к: Сштеи! МеЛобк аиб Аррксайоик, \У1Ше (еб.), радек 263-268, (Нитаиа Ргекк, 1ис., 1993), и Но1отасйик е( а1., РСК МеЛобк Арр1. 4:299 (1995)). Для обзора синтеза полинуклеотидов см., например, Ойск аиб Райетиак, Мо1еси1аг В1о1ескио1оду, Рпиар1ек аиб Аррйсайоик о£ КесотЬтаи! ^NΑ (А8М Ргекк 1994), Иакита е( а1., Аиии. Кет. Вюсйет. 53:323 (1984) и С11т1е е( а1., Ргос. №1'1 Асаб. 8ск И8А 87:633 (1990).
4. Получение вариантов генов 1Б-22КА.
В настоящем изобретении предлагается множество молекул нуклеиновой кислоты, включая молекулы ДНК и РНК, которые кодируют раскрытые здесь полипептиды 1Б-22КА. Специалисты в данной области должны легко признавать, что, учитывая вырожденность генетического кода, среди данных молекул полинуклеотидов возможны рассматриваемые вариации последовательностей. Более того, в настоящем изобретении также предлагаются выделенные, растворимые мономерные, гомодимерные, гетеродимерные и мультимерные рецепторные полипептиды, которые включают по меньшей мере одну субъединицу рецептора 1Ь-22КА, которая является, по существу, гомологичной рецепторному полипептиду с 8ΕΟ ΙΌ N0:3. Таким образом, в настоящем изобретении рассматриваются молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептид 1Ь-22КА, включая вырожденные нуклеотиды 8Ε0 ΙΌ N0:1 и их РНК эквиваленты.
В табл. 1 представлены однобуквенные коды для обозначения положений вырожденных нуклеотидов. «Идентификации» представляют собой нуклеотиды, обозначенные буквой кода. «Комплемент» ука
- 9 009124 зывает код для комплементарного(ных) нуклеотида(дов). Например, код Υ обозначает либо С, либо Т, и его комплемент К обозначает А или О, причем А комплементарен Т, а О комплементарен С.
Таблица 1
Нуклеотид Идентификация Комплемент Идентификация
А А Т Т
С С С С
(3 О с С
Т Т А А
К а|с Υ с|т
Υ с|т К А | 3
м а|с К сз | г
к е|т И а|с
3 с 1 (3 3 с|с
и а|т и А|Т
н а| с | т ц А I сз | т
в с|о|т V А I с 1 о
V А| с I (3 в с | сз | т
Ό А I (3 I т н А 1 с 1 т
N А|С|(3|Т N А|С|С|Т
Вырожденные кодоны, охватывающие все возможные кодоны для данной аминокислоты, представлены в табл. 2.
Таблица 2
Аминокислота Однобуквенный код Кодоны Вырожденный кодон
Суз С ТСС тст ТСУ
Зег 3 АСС АСТ ТСА ТСС ТСС ТСТ Μ3Ν
ТНг Т АСА АСС АСС АСТ АСЫ
Рго Р ССА ССС ССС ССТ ССЫ
А1а А ССА ССС ССС ССТ ССЫ
С1у (3 ССА ССС ССС ССТ ССЫ
Азп N ААС ААТ ΑΑΥ
Азр Ό САС САТ САУ
С1и Е САА САС САК
С1п 0 САА САС САК
ΗΪ3 н САС САТ САУ
Агд В АСА АСС ССА ССС ССС ССТ МСЫ
Ьуз К ААА ААС ААК
Меб м АТС А.ТС
Не I АТА АТС АТТ А.ТН
Ьеи ь СТА СТС СТС СТТ ТТА ТТС ΥΤΝ
Уа1 V СТА СТС СТС СТТ СТЫ
РНе В ТТС ТТТ ΤΤΥ
Туг Υ ТАС ТАТ ΤΑΥ
Тгр и ТСС ТСС
Тег ТАА ТАС ТСА ТКК
Азп|Азр в БАУ
С1и|С1п Ζ ЗАК
Апу X ΝΝΝ
- 10 009124
Специалист в данной области должен понимать, что некоторая двусмысленность заложена в определение вырожденного кодона, представителя всех возможных кодонов, кодирующих аминокислоту. Например, вырожденный кодон для серина (Α8Ν) может в некоторых условиях кодировать аргинин (АСК) и вырожденный кодон для аргинина (ΜΟΝ) может в некоторых условиях кодировать серин (АСУ). Сходные взаимоотношения существуют между кодонами, кодирующими фенилаланин и лейцин. Таким образом, некоторые полинуклеотиды, охватываемые вырожденной последовательностью, могут кодировать варианты аминокислотных последовательностей, но специалист в данной области может легко идентифицировать такие варианты последовательностей, справляясь с аминокислотными последовательностями 8ЕО ГБ N0:3. Варианты последовательностей могут быть легко протестированы на их функции, как здесь описано.
Различные виды могут выказывать «предпочтительное использование кодонов». В целом см. СгаиШаш е! а1., №с1. Ас1бк Кек. 8:1893 (1980), Наак е! а1. Сигг. ΒίοΙ. 6:315 (1996), Аат-НоЬкои е! а1., Сепе 13:355 (1981), Сгоуеап апб Е1егк, Сепе 18:199 (1982), Но1т, Шс. Ас1бк Кек. 14:3075 (1986), 1кетига, 1. Μο1. Βίο1. 158:573 (1982), 8йагр апб Ма!акк1, Сигг. Орш. Сепе!. Беу. 4:851 (1994), Капе, Сигг. Орш. Βίο1ес1то1. 6:494 (1995), и Макпбек, МюгоЬюГ Кеу. 60:512 (1996). Применяемый здесь термин «предпочтительное использование кодонов» или «предпочтительные кодоны» представляет собой термин уровня техники, относящегося к трансляции кодонов в белок, наиболее часто используемой в клетках определенного вида, таким образом, благоприятствуя одному или нескольким представителям возможных кодонов, кодирующих каждую аминокислоту (см. табл. 2). Например, аминокислота треонин (ТЬг) может кодироваться АСА, АСС, АСС или АСТ, но в клетках млекопитающих наиболее обычным используемым кодоном является АСС; у других видов, например, в клетках насекомых, дрожжей, вирусов или бактерий предпочтительными могут быть различные кодоны ТЬг. Предпочтительные кодоны для конкретного вида могут быть введены в полинуклеотиды настоящего изобретения с помощью различных способов, известных в данной области. Введение последовательностей предпочтительных кодонов в рекомбинантную ДНК может, например, увеличивать продукцию белка, делая трансляцию белка более эффективной в конкретном типе клеток или у конкретного вида. Следовательно, раскрытые здесь последовательности вырожденных кодонов служат в качестве матрицы для оптимизации экспрессии полинуклеотидов в различных типах клеток и видов, обычно применяемых в данной области техники и раскрытых здесь. Последовательности, содержащие предпочтительные кодоны, могут быть протестированы и оптимизированы для экспрессии у различных видов и протестированы на их функцию, как здесь описано.
кДНК, кодирующая ГБ-22КА, может быть выделена с помощью различных способов, таких как зондирование с полной или частичной кДНК человека или с одним или более наборами вырожденных зондов на основе раскрытых последовательностей. кДНК может быть также клонирована с применением полимеразной цепной реакции с праймерами, созданными из раскрытых здесь представителей последовательностей ГБ-22КА человека. Кроме того, библиотека кДНК может быть использована для трансформации или трансфекции клеток-хозяев и экспрессия интересующей кДНК может быть определена с помощью антитела к полипептиду ГБ-22КА.
Специалисты в данной области должны знать, что последовательность, раскрытая в 8ЕО 1Б N0:1, представляет собой единичный аллель ГБ-22КА человека и что предполагается существование аллельных вариантов и альтернативного сплайсинга. Аллельные варианты данной последовательности могут быть клонированы с помощью зондирования кДНК или геномных библиотек от различных индивидуумов в соответствии со стандартными процедурами. Раскрытые здесь аллельные варианты нуклеотидных последовательностей, включая те, которые содержат молчащие мутации и те, в которых мутации ведут к изменениям аминокислотной последовательности, входят в объем настоящего изобретения, также как и белки, которые представляют собой аллельные варианты раскрытых здесь аминокислотных последовательностей. Молекулы кДНК, полученные от мРНК после альтернативного сплайсинга, которые сохраняют свойства полипептида ГБ-22КА, включаются в объем настоящего изобретения, также как и полипептиды, кодируемые такими кДНК и мРНК. Аллельные варианты и варианты сплайсинга данных последовательностей могут быть клонированы путем зондирования кДНК или геномных библиотек от различных индивидуумов или тканей в соответствии со стандартными процедурами, известными в данной области.
Применяя обсуждаемые выше способы, специалист в данной области может получить множество полипептидов, которые включают растворимую рецепторную субъединицу ГБ-22КА, которая по существу гомологична 8Е0 1Б N0:1, или которая кодирует аминокислоты 8Е0 1Б N0:3, или ее аллельные варианты, и сохраняют лиганд-связывающие свойства рецептора ГБ-22КА дикого типа. Такие полипептиды могут также включать дополнительные полипептидные сегменты, как обычно раскрывается здесь.
В определенных осуществлениях изобретения выделенные молекулы нуклеиновой кислоты могут гибридизоваться в жестких условиях с молекулами нуклеиновой кислоты, включающими раскрытые здесь нуклеотидные последовательности. Например, такие молекулы нуклеиновой кислоты могут гибридизоваться в жестких условиях с молекулами нуклеиновой кислоты, включающими нуклеотидную последовательность 8Е0 1Б N0:1, или с молекулами нуклеиновой кислоты, включающими нуклеотидную последовательность, комплементарную 8Е0 ГБ N0:1, или ее фрагментами.
- 11 009124
В целом, жесткие условия выбирают так, чтобы температура была приблизительно 5°С, ниже чем температура точки плавления (Тт) для конкретной последовательности при определенной ионной силе и рН. Тт представляет собой температуру (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% последовательности-мишени полностью гибридизуется с подходящим зондом. После гибридизации молекулы нуклеиновой кислоты могут быть промыты для удаления непрогибридизованных молекул нуклеиновой кислоты в жестких условиях или в очень жестких условиях. См., например, 8ашЬтоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А БаЬота!огу Мапиа1, 8есопб Εάίΐίοη (Со1б 8рппд НагЬог Ргекк 1989); АикиЬе1 е! а1., (ебк.), Ситтеп1 Рто!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду (1ойп \УПеу апб 8опк, 1пс. 1987); Вегдег апб К1тте1 (ебк.), Сшбе Ю Мо1еси1аг С1ошпд Тесйшдиек, (Асабетю Ргекк, 1пс. 1987); апб ^е!тиг, Стй. Вес. ВюсНет. Мо1. Вю1. 26:227 (1990)). Компьютерная программа для анализа последовательности, такая как ОЬЮО 6.00 (Б8В; Бопд Баке, МЫ) и Рптег Ргет1ет 4.0 (Ртет1ет Вюкой 1п1етпа!юпа1; Ра1о А1!о, СА), а также сайты в Интернете являются доступными средствами анализа данной последовательности и расчета Тт на основе определенных для пользователей критериев. Также в возможностях специалиста в данной области адаптация гибридизации и условий промывания для применения с конкретным полинуклеотидным гибридом.
В настоящем изобретении также предлагаются выделенные полипептиды 1Б-22ВА, которые имеют по существу сходную идентичность последовательностей с полипептидами 8Εφ ΙΌ N0:3 или с другими ортологами. Термин «по существу сходная идентичность последовательностей» применяется здесь для обозначения полипептидов, имеющих по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или выше чем 95%, такую как 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с последовательностями, представленными в 8Εφ ΙΌ N0:3, или с их ортологами. Например, вариант и ортологичный рецептор 1Б-22ВА могут быть использованы для индукции иммунного ответа и выработки антител с перекрестной реакцией с 1Б-22К.А человека. Такие антитела могут быть гуманизированы и модифицированы, как здесь описано, и применяться терапевтически для лечения псориаза, псориазного артрита, 1ВО, колита, эндотоксемии, а также других описанных здесь терапевтических применений.
Настоящее изобретение также охватывает варианты молекул нуклеиновой кислоты, которые могут быть идентифицированы с помощью двух критериев: определения сходства между кодируемым полипептидом и аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ N0:3, и гибридизационным тестом. Такие варианты 1Б-22К.А включают молекулы нуклеиновой кислоты, (1) которые остаются гибридизованными с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность 8Εφ ΙΌ N0:1 (или с ее комплементом) при жестких условиях промывки, при которых жесткость промывки эквивалентна 0,5х2х 88С с 0,1% ДДС-Иа при 55-65°С и (2) которые кодируют полипептид, имеющий по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или выше чем 95%, такую как 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ N0:3. Альтернативно, варианты [Б-ЗЗВА могут быть охарактеризованы как молекулы нуклеиновой кислоты, (1) которые остаются гибридизованными с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность 8Εφ ΙΌ N0:1 (или с ее комплементом) при очень жестких условиях промывки, при которых жесткость промывки эквивалентна 0,1х-0,2х 88С с 0,1% ДДС-Иа при 50-65°С и (2) которые кодируют полипептид, имеющий по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или выше чем 95%, такую как 96, 97, 98 или 99% или выше идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью 8Εφ ΙΌ N0:3.
Процент идентичности последовательностей определяют общепринятыми способами. См., например, Айксйи1 е! а1., Ви11. Ма!й. Вю. 48:603 (1986), и НепкоГГ апб НепкоГГ, Ргос. №11. Асаб. 8ск И8А 89:10915 (1992). Вкратце, две аминокислотные последовательности выравниваются для оптимизации баллов выравнивания с применением штрафа 10 на внесение делеции в выравнивание, штрафа 1 на продолжение делеции и матрицы баллов Нешкой апб Нешкой (там же) как представлено в табл. 3 (аминокислоты указываются стандартным однобуквенным кодом). Затем рассчитывают процент идентичности как: ([общее число идентичных пар]/[длина более длинной последовательности плюс число пробелов, введенных в более длинную последовательность для того, чтобы выровнять две последовательности])(100).
- 12 009124
Таблица 3
А К N ϋ С 0 Е Θ И I ь к м Р Р 3 Т И Υ V
А 4
К -1 5
N -2 0 6
ϋ -2 -2 1 6
С 0 -3 -3 -3 9
0 -1 1 0 0 -3 5
Е -1 0 0 2 -4 2 5
<3 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6
Н -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8
I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4
ь -1 -2 -3 -4 -1 —2 -3 -4 -3 2 4
к -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5
м -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5
Р -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6
Р -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7
3 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4
т 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5
и -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11
Υ -2 -2 -2 -3 -2 -1 _2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7
V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4
Специалисты в данной области понимают, что существует много принятых алгоритмов для выравнивания двух аминокислотных последовательностей. Алгоритм поиска сходства ЕА8ТА Реагзоп и Ь1ршап является подходящим способом выравнивания белков для анализа степени идентичности родственной аминокислотной последовательности, раскрытой здесь, и аминокислотной последовательности предполагаемого варианта ГО-22КА. Алгоритм ЕА8ТА описан Реагзоп апб Ыршап, Ргос. №1'1 Асад. 8ст И8А 85:2444 (1988), и Реагзоп, МеШ. Еи/ушо!. 183:63 (1990). Вкратце, ЕА8ТА сначала характеризует сходство последовательностей путем идентификации областей, родственных запрашиваемой последовательности (например, 8ЕО ГО N0:2 или 8ЕО ГО N0:3) и тестируемой последовательности, которые имеют либо наивысшую степень идентичности (если переменная к!ир равна 1) или пары идентичности (если к!ир равна 2) без рассмотрения консервативных аминокислотных замен, вставок или делеций. Десять областей с наивысшей степенью идентичности затем переоценивают путем сравнения сходства всех парных аминокислот с применением матрицы замен аминокислот, и концы областей «отстригают» для включения только тех остатков, которые вносят вклад в наивысший балл. Если существует несколько областей с баллами, более высокими, чем величина «отсекания» (рассчитанная с помощью предварительно определенной формулы, основанной на длине последовательности и величины к!ир), затем отстриженные исходные области проверяют для определения того, могут ли области соединяться с образованием приближенного выравнивания с пробелами. Наконец, области двух аминокислотных последовательностей с наивысшими баллами выравнивают с применением модификации алгоритма ХеесПешап\\'ш1зс11-8е11етз (ХеесПешап апС АипзсК, I. Мо1. Бю1. 48:444 (1970); 8е11егз, 81АМ I. Арр1. Ма1й. 26:787 (1974)), что разрешает вставки и делеции аминокислот. Иллюстративными параметрами для анализа ЕА8ТА являются: к1ир=1, штраф=10 за открытие пробела, штраф=1 за увеличение пробела и матрица замен ВЕ08ЕМ62. Данные параметры могут быть введены в программу ЕА8ТА путем модификации файла матрицы баллов (8МАТЕ1Х), как объяснено в приложении 2 Реагзоп, Ме1й. Еп/ушо!. 183:63 (1990).
ЕА8ТА можно также использовать для определения идентичности последовательностей молекул нуклеиновой кислоты с применением отношения, как раскрыто выше. Для сравнения нуклеотидных последовательностей величина к!ир может варьировать между одним и шестью, предпочтительно от трех до шести, наиболее предпочтительно равна трем, с другими параметрами, указанными, как описано выше.
Настоящее изобретение включает молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид, имеющий консервативные замены аминокислот по сравнению с раскрытой здесь аминокислотной последовательностью. Например, могут быть получены варианты, которые содержат одну или более замен аминокислот в 8ЕО ГО N0:3, в которых алкиламинокислота заменена на алкиламинокислоту в аминокислотной последовательности ГО-22КА, ароматическая аминокислота заменена на ароматическую аминокислоту в аминокислотной последовательности ГО-22КА, содержащая серу аминокислота заменена на содержащую серу аминокислоту в аминокислотной последовательности 1Б-22КА, содержащая гидроксил аминокислота заменена на содержащую гидроксил аминокислоту в аминокислотной последовательности ГО-22КА, кислая аминокислота заменена на кислую аминокислоту в аминокислотной последовательности ГО-22КА, основная аминокислота заменена на основную аминокислоту в аминокислотной последова
- 13 009124 тельности 1Б-22КЛ или двухосновная монокарбоксильная аминокислота заменена на двухосновную монокарбоксильную аминокислоту в аминокислотной последовательности 1Ь-22КА. Среди обычных аминокислот, например, «консервативная замена аминокислот» иллюстрируется заменой аминокислот внутри каждой из последующих групп: (1) глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин, (2) фенилаланин, тирозин и триптофан, (3) серин и треонин, (4) аспартат и глутамат, (5) глутамин и аспарагин и (6) лизин, аргинин и гистидин. Таблица ВЕО8ИМ62 представляет собой матрицу замен аминокислот, полученную из приблизительно 2000 локальных множественных выравнивании сегментов последовательностей белков, представляющих высоко консервативные области более чем 500 групп родственных белков (Нешко££ апб Неп1ко££, Ргос. ΝαΙ'Ι Асаб. 8с1. И8А 89:10915 (1992)). Соответственно, частота замен ВЬО8иМ62 может быть использована для определения консервативных аминокислотных замен, которые могут быть введены в аминокислотные последовательности настоящего изобретения. Хотя возможно создать аминокислотные замены на основе только химических свойств (как обсуждалось выше), выражение «консервативная замена аминокислот» предпочтительно относится к замене, представленной величиной ВЬО8иМ62 более высокой, чем -1. Например, аминокислотная замена является консервативной, если замена характеризуется величиной ВЬО8иМ62 0, 1, 2 или 3. В соответствии с данной системой предпочтительные консервативные аминокислотные замены характеризуются величиной ВЕО8ИМ62 по меньшей мере 1 (например, 1, 2 или 3), в то время как более предпочтительные консервативные аминокислотные замены характеризуются величиной ВЕО8ИМ62 по меньшей мере 2 (например, 2 или 3). Конкретные варианты 1Б-22КА характеризуются как имеющие по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или выше чем 95%, такую как 96, 97, 98 или 99% или более высокую идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью (например, 8ЕО ΙΌ NО:3), где вариация в аминокислотной последовательности обусловлена одной или более консервативными аминокислотными заменами.
Консервативные замены аминокислот могут быть введены в ген 1Б-22ВА. например, путем замены нуклеотидов на нуклеотиды, представленные в 8ЕО ΙΌ NО:1. Такие «консервативные аминокислотные» варианты могут быть получены с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза, линкерсканирующего мутагенеза, мутагенеза, использующего полимеразную цепную реакцию и тому подобное (см., АикиЬе1 (1995); апб МсРйегкоп (еб.), Б1гес!еб Ми!адепек1к: А Ргасйса1 Арргоасй (1ЯБ Ргекк 1991)). Вариант полипептида 1Б-22КА может быть идентифицирован по способности специфически связываться с антителами против 1Б-22КА.
Белки настоящего изобретения могут также включать аминокислотные остатки, не существующие в природе. Аминокислоты, не существующие в природе, включают, не ограничиваясь этим, транс-3метилпролин, 2,4-метанопролин, цис-4-гидроксипролин, транс-4-гидроксипролин, Ν-метилглицин, аллотреонин, метилтреонин, гидроксиэтилцистеин, гидроксиэтилгомоцистеин, нитроглутамин, гомоглутамин, пипеколовую кислоту, тиазолидинкарбоновую кислоту, дегидропролин, 3- и 4-метилпролин, 3,3диметилпролин, трет-лейцин, норвалин, 2-азафенилаланин, 3-азафенилаланин, 4-азафенилаланин и 4фторфенилаланин. В данной области известно несколько способов введения не существующих в природе аминокислотных остатков в белки. Например, может быть применена система ш уйго, в которой бессмысленные мутации подавляются применением химически аминоацилированного супрессора тРНК. Способы синтеза аминокислот и аминоацилированных тРНК известны в данной области техники. Транскрипция и трансляция плазмид, содержащих бессмысленные мутации обычно осуществляется в бесклеточной системе, включающей экстракт Е. сой 830 и имеющиеся в продаже ферменты, а также другие реактивы. Белки очищают хроматографией. См., например, КоЬейкоп е! а1., 1. Ат. СИет. 8ос. 113:2722 (1991), Е11тап е! а1., Ме!Иобк Епхуто1. 202:301 (1991), Сйипд е! а1., 8с1епсе 259:806 (1993) и Сйипд е! а1., Ргос. N311 Асаб. 8с1. И8А 90:10145 (1993).
Во втором способе трансляцию осуществляют в ооцитах Хепорик путем микроинъекции мутантной мРНК и химически аминоацилированного супрессора тРНК (Тигса!й е! а1., 1. Вю1. СИет. 271:19991 (1996)). В третьем способе клетки Е. сой культивируют в отсутствие той природной аминокислоты, которая будет заменяться (например, фенилаланина) и в присутствии желаемой не существующей(их) в природе аминокислоты(от) (например, 2-азафенилаланина, 3-азафенилаланина, 4-азафенилаланина или 4фторфенилаланина). Не существующая в природе аминокислота вводится в белок на место ее природной пары. См., Ко1бе е! а1., Вюсйет. 33:7470 (1994). Существующие в природе аминокислотные остатки могут быть превращены в несуществующие в природе виды с помощью химической модификации ш уйго. Химическая модификация может сочетаться с сайт-направленным мутагенезом для дополнительного расширения диапазона замен (Аупп апб Влсйагбк, Рго!еш 8ст 2:395 (1993)).
Ограниченное число неконсервативных аминокислот, аминокислот, которые не кодируются генетическим кодом, несуществующих в природе аминокислот и неприродных аминокислот может быть заместителями аминокислотных остатков 1Й-22ВА.
Незаменимые аминокислоты в полипептидах настоящего изобретения могут быть идентифицированы в соответствии с процедурами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (Сипшпдйат апб Ае11к, 8с1епсе 244:1081 (1989), Вакк е! а1., Ргос. Νη1'1 Асаб. 8ст И8А 88:4498 (1991), СоотЬк апб Согеу, 8йе-Бйес!еб Ми!адепек1к апб Рго!еш Епщ
- 14 009124 пссппд. ίη Рго!етк: Апа1ук1к апб Оеыдп, Апде1е!Б (еб.), радек 259-311 (Лсабеш1с Ргекк, 1пс. 1998)). В последнем способе единичные мутации аланина вводятся в каждый остаток в молекуле и полученные мутантные молекулы тестируются на биологическую активность для идентификации аминокислотных остатков, которые являются критическими для активности молекулы. См. также Н11!оп е! а1., 1. ΒίοΙ. СБет. 271:4699 (1996).
Хотя может быть выполнен анализ последовательностей для дополнительного определения лигандсвязывающей области 1Б-22ЯЛ, аминокислоты, которые играют роль в связывающей активности 1Ь22КА (такой как связывание 1Б-22ВА с лигандом 1Б-22 или с антителом против 1Ь-22КА), могут быть также определены с помощью физического анализа структуры, что определяется с помощью таких способов, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, дифракция электронов или фотоаффинное промечивание, в сочетании с мутацией предполагаемого контактного сайта аминокислот. См., например, бе Уок е! а1., 8с1епсе 255:306 (1992), 8тйБ е! а1., 1. Мо1. ΒίοΙ. 224:899 (1992) и А1обауег е! а1., ΡΕΒ8 Ьей. 309:59 (1992).
Множественные замены аминокислот могут быть сделаны и протестированы с применением известных способов мутагенеза и скрининга, таких как раскрытые Ке1бБааг-О1коп апб 8аиег (8с1епсе 241:53 (1988)) или Во\\'1е апб 8аиег (Ргос. №11'1 Асаб. 8сг И8А 86:2152 (1989)). Кратко, данные авторы раскрывают способы одновременного рандомизирования двух или более положений в полипептиде, отбора на функционирующий полипептид, и затем секвенирования подвергнутых мутагенезу полипептидов для определения спектра позволяемых замен в каждом положении. Другие способы, которые могут быть использованы, включают Фаговый дисплей (например, Боутап е! а1., ВюсБет. 30:10832 (1991), Бабпег е! а1., патент США № 5223409, Нике, международная публикация № АО 92/06204 и область-направленный мутагенез (БегБукБйе е! а1., Оепе 46:145 (1986), и №г е! а1., ΌΝΑ 7:127, (1988)). Более того, 1Е-22КА, меченный биотином или ФИТЦ, может быть применен для экспрессионного клонирования лигандов 1Б22КА.
Варианты раскрытых нуклеотидных и полипептидных последовательностей 1Б-22ВА могут быть также созданы с помощью перестановки ДНК, как раскрыто 8!еттег, №11иге 370:389 (1994), 8!еттег, Ргос. №11'1 Асаб. 8сг И8А 91:10747 (1994) и в международной публикации № АО 97/20078. Кратко, варианты молекул ДНК создают с помощью гомологичной рекомбинации ш νίίΐΌ путем рандомизированной фрагментации родительской ДНК с последующей повторной сборкой с применением ПЦР, что ведет к рандомизированному введению точечных мутаций. Данный способ может быть модифицирован с помощью применения семейства родительских молекул ДНК, таких как аллельные варианты или молекулы ДНК от различных видов, для введения в процесс дополнительной вариабельности. Отбор или скрининг на желаемую активность с последующими дополнительными повторениями мутагенеза и тестирование дает быструю «эволюцию» последовательностей путем отбора желаемых мутаций при одновременном отборе против вредных изменений.
Раскрытые здесь способы мутагенеза могут сочетаться с высоко производительными, автоматизированными методами скрининга для определения активности клонированных, подвергнутых мутагенезу полипептидов в клетках-хозяевах. Подвергнутые мутагенезу молекулы ДНК, которые кодируют биологически активные полипептиды или полипептиды, которые связываются с антителами против ΙΕ-22ΚΑ, могут быть выделены из клеток-хозяев и быстро секвенированы с применением современного оборудования. Данные способы позволяют быстро определить важность индивидуальных аминокислотных остатков в интересующем пептиде и могут быть применены к полипептидами неизвестной структуры.
Настоящее изобретение также включает «функциональные фрагменты» полипептидов 1Б-22ВА и молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих такие функциональные фрагменты. Обычный анализ делеций молекул нуклеиновой кислоты может быть выполнен для получения функциональных фрагментов молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид 1Б-22ЯА. В качестве иллюстрации, молекулы ДНК, имеющие нуклеотидную последовательность 8ΕΟ ΙΌ N0:1, могут быть гидролизованы нуклеазой Ва131 для получения серий гнездовых делеций. Фрагменты затем вставляют в экспрессионные векторы в подходящую рамку считывания и экспрессируемые полипептиды выделяют и тестируют на способность связываться с антителами против 1Б-22ЯА. Одной альтернативой экзонуклеазному гидролизу является применение олигонуклеотид-направленного мутагенеза для введения делеций или стопкодонов для специфической продукции желаемого фрагмента. Альтернативно, конкретные фрагменты гена 1Б-22КА могут быть синтезированы с применением полимеразной цепной реакции.
Примером данного подхода являются исследования усечения одного или обоих концов интерферонов, суммированные НопкБегдег апб Όί Магсо, РБагтас. ТБег. 66:507 (1995). Более того, стандартные способы функционального анализа белков описаны, например, Тгеи!ег е! а1., Мо1ес. Оеп. Оепе!. 240:113 (1993), Соп!еп! е! а1., Ехргеккюп апб ргеБттагу бе1е!юп апа1ук1к оГ !Бе 42 кЭа 2-5А куп!Бе!аке шбисеб Бу Битап т!егГегоп, ш Вю1одка1 1п1егГегоп 8ук!етк, Ргосеебшдк оГ Ι8ΙΒ-ΤΝ0 Меебпд оп 1п1егГегоп 8ук!етк, Сап!е11 (еб.), радек 65-72 (№)БоГГ 1987), НегксБтап, ТБе ΕΟΡ Кесер!ог, ш Соп!го1 оГ Ашта1 Се11 РгоБГегаБоп, Уо1. 1, Воуп!оп е! а1., (ебк.) радек 169-199 (Асабетк Ргекк 1985), СоитаШеаи е! а1., 1. Вю1. СБет. 270:29270 (1995); Рикипада е! а1., 1. Вю1. СБет. 270:25291 (1995); УатадисЫ е! а1., ВюсБет. РБагтасо1. 50:1295 (1995), и Ме1ке1 е! а1., Р1ап! Мо1ес. Вю1. 30:1 (1996).
- 15 009124
Анализ раскрытых здесь конкретных последовательностей дает набор иллюстративных функциональных фрагментов, представленных в табл. 4. Нуклеотиды, кодирующие дополнительные функциональные варианты описанных здесь доменов 1Ь22-КА человека не показаны в табл. 4 и могут быть определены при ссылке на ВЕС) ΙΌ N0:1. Такие функциональные фрагменты включают, например, следующие нуклеотидные последовательности ВЕР ΙΌ N0:1: нуклеотиды 85-381, 206-717 и 85-717 ВЕР ΙΌ N0:1 и соответствующие кодируемые ими аминокислотные последовательности, как показано в ВЕР ΙΌ N0: 2 и 8ЕР ΙΌ N0:3, соответственно.
Таблица 4
Части 1Б-22КА Аминокислотные остатки (ЗЕ<2 ΙΌ N0:2) Нуклеотиды (ЗЕО Ιϋ N0:1)
Первый 1д домен 18-116 85-381
Второй 1д домен 125-228 206-717
Оба 1д домена 18-228 85-717
Настоящее изобретение также охватывает функциональные фрагменты гена ΙΕ-22ΚΑ, которые имеют аминокислотные замены по сравнению с раскрытой здесь аминокислотной последовательностью. Вариант гена ΙΕ-22ΚΑ может быть идентифицирован на основе структуры путем определения степени идентичности с раскрытыми нуклеотидной и аминокислотной последовательностями, как обсуждалось выше. Альтернативным подходом к идентификации варианта гена на основе структуры является определение того, способна ли молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая потенциальный вариант гена ΙΣ22КА, гибридизоваться с молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, такую как ВЕР ΙΌ N0:1.
Настоящее изобретение также включает применение функциональных фрагментов ΙΕ-22ΒΑ в виде полипептидов, антигенных эпитопов, несущих эпитоп частей полипептидов ΙΕ-22ΒΑ и молекул нуклеиновой кислоты, которые кодируют такие функциональные фрагменты, антигенные эпитопы, несущие эпитоп части полипептидов ГЬ-22ВА. Такие фрагменты применяют для создания полипептидов для применения в выработке антител и связывающих партнеров, которые связывают, блокируют, ингибируют, снижают, проявляют антагонистическое действие или нейтрализуют активность ГЬ-22 или как ΙΙ.-20, так и ΙΕ-22. «Функциональный» полипептид ТЬ-22ВА или его фрагмент, как здесь определено, характеризуется по его способности блокировать, ингибировать, снижать, проявлять антагонистическое действие или нейтрализовать воспалительную, пролиферативную или дифференцировочную активность ΙΕ-20 или ΙΣ22, благодаря его способности индуцировать или ингибировать специализированные клеточные функции или из-за его способности специфически связываться с антителом против ТЬ-22ВА, клеткой, ΙΕ-20 или ΙΕ-22. Как описывалось ранее, ТЬ-22ВА по структуре и доменам относится к классу ΙΙ рецепторов цитокинов, как здесь описано. Таким образом, настоящее изобретение дополнительно рассматривает применение гибридных белков, охватывающих (а) полипептидные молекулы, включающие один или более доменов, описанных выше; и (Ь) функциональные фрагменты, включающие один или более таких доменов. Другая часть полипептида гибридного белка может быть определена другим рецептором цитокинов класса ΙΙ, таким как ΙΣ-10Κ, ΙΕ-13Β., ΙΕ-20ΚΑ, ΙΕ-20ΒΒ, ΙΕ-10ΒΒ (СВЕ2-4), ΙΕ-22ΚΑ2, или к ненативному и/или к не относящемуся к ним секреторному сигнальному пептиду, который ускоряет секрецию гибридного белка.
В настоящем изобретении также предлагаются полипептидные фрагменты или пептиды, включающие несущую эпитоп часть описанного здесь полипептида ТЬ-22ВА. Такие фрагменты или пептиды могут включать «иммуногенный эпитоп», который представляет собой часть белка, которая вызывает ответ антитела при применении в качестве иммуногена полного белка. Иммуногенные несущие эпитоп пептиды могут быть идентифицированы с применением стандартных способов (см., например, Сеузеп е! а1., Ргос. №!'1 Асаб. 8с1. И8А 81:3998 (1983)).
Наоборот, полипептидные фрагменты или пептиды могут включать «антигенный эпитоп», который представляет собой область белковой молекулы, с которой может специфически связываться антитело. Определенные эпитопы состоят из линейных или прилегающих участков аминокислот и антигенность такого эпитопа не разрушается денатурирующими агентами. В данной области известно, что относительно короткие синтетические пептиды, которые могут имитировать эпитопы белка, могут быть использованы для стимуляции продукции антител против белка (смотри, например, 8и!с11йе е! а1., 8с1епсе 219:660 (1983)). Соответственно, антигенные несущие эпитоп пептиды, антигенные пептиды, эпитопы и полипептиды настоящего изобретения пригодны для выработки антител, которые связываются с описанными здесь полипептидами, а также для идентификации и скрининга моноклональных антител против Ш^ВА, которые являются нейтрализующими и которые могут связывать, блокировать, ингибировать, снижать, проявлять антагонистическое действие или нейтрализовать активность ΙΕ-22 и ΙΕ-20 (раздельно или совместно). Такие нейтрализующие моноклональные антитела настоящего изобретения могут связываться с антигенным эпитопом Ш^ВА. Ηορρ/^οοάδ профили гидрофильности могут быть использованы для определения областей, которые имеют наибольший антигенный потенциал в ВЕР ΙΌ N0:3 (Ηορρ
- 16 009124 е! а1., Ргос. №111. Асай. 8сЕ 78:3824-3828, 1981; Ηορρ, I. 1ттип. Мс111. 88:1-18, 1986 и Тпс.|тег е! а1., Рго!ет Епдтееппд 11:153-169, 1998). Профиль основывается на скользящем окне в шесть остатков. Скрытые остатки С, 8 и Т и экспонированные остатки Н, Υ и игнорировали. В 1Ь-22КА данные области могут быть определены специалистом в данной области. Более того, антигенные эпитопы 1Ь-22КА в 8ЕЦ ΙΌ N0:3, как предсказывается графиком Еппехоп-ХУоЕ. например, с применением программы ΌΝΑ8ΤΑΚ Рго!еап (ΌΝΑ8ΤΑΚ, 1пс., Май1коп, ^Ι), служат в качестве предпочтительных антигенных эпитопов и могут быть определены специалистом в данной области. Такие антигенные эпитопы включают (1) аминокислотные остатки с 1 (Рго) по 6 (Акр) 8ЕЦ ΙΌ N0 3; (2) аминокислотные остатки с 26 (8ег) по 32 (Рго) 8Е0 ΙΌ N0 3; (3) аминокислотные остатки с 41 (Ьук) по 47 (Акр) 8ЕЦ ΙΌ N0 3; (4) аминокислотные остатки с 49 (Уа1) по 62 (Сук) 8ЕЦ ΙΌ N0 3; (5) аминокислотные остатки с 41 (Ьук) по 62 (Сук) 8ЕЦ ΙΌ N0 3; (6) аминокислотные остатки с 84 (А1а) по 97 (8ег) 8ЕЦ ΙΌ N0 3; (7) аминокислотные остатки с 103 (ТЕг) по 108 (Акр) 8ЕЦ ΙΌ N0:3; (8) аминокислотные остатки с 130 (Агд) по 135 (Н1к) 8ЕЦ ΙΌ N0:3; (9) аминокислотные остатки с 164 (С1у) по 166 (Ьук) 8ЕЦ ΙΌ N0:3; (10) аминокислотные остатки с 175 (Туг) по 179 (С1и) 8ЕЦ ΙΌ N0:3; (11) аминокислотные остатки с 193 (Ьук) по 196 (А1а) 8ЕЦ ΙΌ N0:3; (12) аминокислотные остатки с 203 (Ьук) по 209 (ТЕг) 8ЕЦ ΙΌ N0:3. Дополнительные эпитопы включают следующие пептиды и потенциально создаются из нередуцированного полноразмерного 1Ь22-КА человека, расщепляемого СпВг: пептид 6 (8ЕЦ ΙΌ N0:56), пептид 7 (8ЕЦ ΙΌ N0:57); пептид 8 (8ЕЦ ΙΌ N0: 58); пептид 9 (8Е0 ΙΌ N0: 59); пептид 10 (8ЕЦ ΙΌ N0: 60) и пептид 11 (8ЕЦ ΙΌ N0:61). Цистеины образуют дисульфидные мостики, что ведет к возможной связи между пептидами 7 (8ЕЦ ΙΌ N0:57) и 10 (8ЕЦ ΙΌ N0:60). Конкретно, 8ЕЦ ΙΌ N0:56 соответствует аминокислотным остаткам с 1 (Рго) по 92 (Ме!) 8ЕЦ ΙΌ N0:3; 8ЕЦ ΙΌ N0:57 соответствует аминокислотным остаткам с 93 (ТЕг) по 120 (Ме!) 8ЕЦ ΙΌ N0:3, 8ЕЦ ΙΌ N0: 58 соответствует аминокислотным остаткам с 121 (Не) по 160 (Ме!) 8ЕЦ ΙΌ N0:3, 8ЕЦ ΙΌ N0:59 соответствует аминокислотным остаткам с 161 (Н1к) по 185 (Ме!) 8ЕЦ ΙΌ N0:3, 8ЕЦ ΙΌ N0:60 соответствует аминокислотным остаткам с 186 (Не) по 199 (Ме!) 8ЕЦ ΙΌ N0:3 и 8ЕЦ ΙΌ N0:61 соответствует аминокислотным остаткам с 200 (Сук) по 211 (ТЕг) 8ЕЦ ΙΌ N0:3. Кроме того, остатки 8ЕЦ ΙΌ N0:2 (и соответствующие остатки 8ЕЦ ΙΌ N0:3), которые важны для связывания лиганда с рецептором, включают Туг-60, и РЕе-164, Туг-93, Агд-112, Ьук-210 и СЕ1-211 8ЕЦ ΙΌ N0:2 (и соответствующие остатки 8ЕЦ ΙΌ N0:3). Более того, первичные остатки 8ЕЦ ΙΌ N0:2 (и соответствующие остатки 8ЕЦ ΙΌ N0:3), которые важны для прямого связывания лиганда с рецептором, включают Туг-60 и РЕе-164 8ЕЦ ΙΌ N0:2 (и соответствующие остатки 8ЕЦ ΙΌ N0:3), и вторичные остатки включают остатки Туг-93, Агд-112, Ьук210, и С1и-211 8ЕЦ ΙΌ N0:2 (и соответствующие остатки 8ЕЦ ΙΌ N0:3). В предпочтительных осуществлениях антигенные эпитопы, с которыми связываются антитела настоящего изобретения, должны содержать остатки 8ЕЦ ΙΌ N0:2 (и соответствующие остатки 8ЕЦ ΙΌ N0:3), которые важны для связывания лиганда с рецептором, например, с ГЬ-22ЯА и ГЬ-20 или ГЬ-22 (раздельно или совместно).
Антигенные несущие эпитоп пептиды и полипептиды могут содержать по меньшей мере от четырех до десяти аминокислот, по меньшей мере от десяти до пятнадцати аминокислот или от приблизительно 15 до приблизительно 30 аминокислот раскрытой здесь аминокислотной последовательности. Такие несущие эпитоп пептиды и полипептиды могут быть получены путем фрагментации полипептида ГЬ-22КА. или с помощью химического пептидного синтеза, как здесь описано. Более того, эпитопы могут быть отобраны с помощью фагового дисплея рандомизированных пептидных библиотек (см., например., Ьапе апй 8!ерЕеп, Сигг. 0рт. ТттипоЕ 5:268 (1993), и СоЕеке е! а1., Сигг. 0рт. Вю!есЕпо1. 7:616 (1996)). Стандартные способы идентификации эпитопов и получения антител из небольших пептидов, которые включают эпитоп, описаны, например, Мо1е, ЕрЕоре Марртд, т Ме!Еойк ш Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 10, Мапкоп (ей.), радек 105-116 (ТЕе Нитапа Ргекк, Ечс. 1992), РЕсе, РгойисЕоп апй СЕагас1епха1юп о£ 8уп1ЕеЕс Рерийе-Ьепуей АпЕЬоФек, ш Мопос1опа1 АпЕЬоФек: РгойисЕоп, ЕпдтееЕпд, апй СЕшса1 АррЕсаЕоп, Кгйег апй Ьайутап (ейк.), радек 60-84 (СатЬЕйде ЬшуегкЕу Ргекк 1995), и СоЕдап е! а1. (ейк.). Сиггеп! Рго!осо1к ш Iттипο1οду, радек 9.3.1-9.3.5 апй радек 9.4.1-9.4.11 ЦоЕп ^йеу & 8опк 1997).
Для любого полипептида ГЬ-22КА., включая варианты и гибридные белки, специалист в данной области может легко создать полностью вырожденную полинуклеотидную последовательность, кодирующую данный вариант, применяя информацию, представленную в табл. 1 и 2 выше. Более того, специалист в данной области может применять стандартную компьютерную программу для создания вариантов ГЬ-22ЯА на основе описанных здесь нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.
5. Получение полипептидов ГЬ-22ЯА.
Полипептиды настоящего изобретения, включая полноразмерные полипептиды; растворимые мономерные, гомодимерные, гетеродимерные и мультимерные рецепторы; полноразмерные рецепторы; фрагменты рецепторов (например, лиганд-связывающие фрагменты и антигенные эпитопы), функциональные фрагменты и гибридные белки, могут быть получены в рекомбинантных клетках-хозяевах следуя общепринятым способам. Для экспрессии гена ГЬ-22ЯА молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, должна быть оперативно связана с регуляторными последовательностями, которые контролируют транскрипционную экспрессию в экспрессионном векторе, и затем введена в клеткухозяина. Кроме транскрипционных регуляторных последовательностей, таких как промоторы и энхансе
- 17 009124 ры, экспрессионные векторы могут включать трансляционные регуляторные последовательности и маркерный ген, который подходит для отбора клеток, которые несут экспрессионный вектор.
Экспрессионные векторы, которые подходят для получения чужеродных белков в эукариотических клетках, обычно содержат: (1) элементы прокариотной ДНК, кодирующие бактериальный сайт начала репликации и маркер устойчивости к антибиотику для обеспечения роста и отбора экспрессионного вектора в бактериальном хозяине; (2) элементы эукариотной ДНК, которые кодируют инициацию транскрипции, такие как промотор; и (3) элементы ДНК, которые контролируют процессинг транскриптов, такие как последовательность терминации транскрипции/полиаденилирования. Как обсуждалось выше, экспрессионные векторы могут также включать нуклеотидные последовательности, кодирующие секреторную последовательность, которая направляет гетерологичный полипептид по секреторному пути клетки-хозяина. Например, экспрессионный вектор ББ-22ВА может включать ген ББ-22ВА и секреторную последовательность гена любого секретируемого белка.
Белки ББ-22ВА настоящего изобретения могут быть экспрессированы в клетках млекопитающих. Примеры подходящих клеток-хозяев млекопитающих включают клетки почек африканской зеленой мартышки (Уего; АТСС СВЬ 1587), клетки почек эмбриона человека (293-НЕК; АТСС СВЬ 1573), клетки почек детенышей хомячка (ВНК-21, ВНК-570; АТСС СВЬ 8544, АТСС СВЬ 10314), клетки почек собаки (МОСК; АТСС ССЬ 34), клетки яичников китайского хомячка (СНО-К1; АТСС ССБ61; СНО ΌΟ44 (СйакБп е1 а1., 8от. Се11. Мо1ес. СепеБ. 12:555, 1986), клетки гипофиза крыс (СН1; АТСС ССБ82), клетки НеЬа 83 (АТСС ССБ2.2), клетки гепатомы крыс (Н-4-ББ-Е; АТСС СВЬ 1548), трансформированные 8У40 клетки почек обезьян (СО8-1; АТСС СВЬ 1650) и клетки эмбрионов мышей (МН-3Т3; АТСС СВЬ 1658).
У хозяев-млекопитающих транскрипционный и трансляционный регуляторные сигналы могут происходить от вирусных источников млекопитающих, например, аденовируса, вируса папилломы быков, вируса обезьян или тому подобное, в которых регуляторные сигналы связаны с конкретным геном, который имеет высокий уровень экспрессии. Подходящие транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности можно также получать от генов млекопитающих, например, генов актина, коллагена, миозина и металлотионеина.
Последовательности, регулирующие транскрипцию, включают промоторную область, достаточную для управления инициацией синтеза ДНК. Подходящие эукариотные промоторы включают промотор гена металлотионеина мыши (Натег е1 а1., Б. Мо1ес. Арр1. СепеБ 1:273 (1982)), ТК промотор вируса герпеса (МсКшдйБ, Се11 31:355 (1982)), ранний промотор 8У40 (ВепоБкБ еБ а1., №-11иге 290:304 (1981)), промотор вируса саркомы Рауса (Согтап еБ а1., Ргос. Νη1'1 Асаб. 8сБ. И8А 79:6777 (1982)), цитомегаловирусный промотор (РоескБпд еБ а1., Сепе 45:101 (1980)), и вирусный промотор опухоли молочной железы мыши (см. обычно ЕБсйеνе^^у, «Ехргеккюп оБ ЕпдБпеегеб РгоБеБпк Бп Маттабап Се11 Си1Биге,» Бп РгоБеБп ЕпдБпеегБпд: РгБпсБр1ек апб РгасББсе, С1е1апб еБ а1. (ебк.), радек 163-181 (Бойп УПеу & 8опк, Бпс. 1996)).
Альтернативно, для контроля экспрессии гена ББ-22ВА в клетках млекопитающих может быть использован прокариотный промотор, такой как промотор РНК-полимеразы бактериофага Т3, если прокариотный промотор регулируется эукариотным промотором (2йои еБ а1., Мо1. Се11. Вю1. 10:4529 (1990), и КаиБтап еБ а1., №с1. АсБбк Век. 19:4485 (1991)).
В определенных осуществлениях последовательность ДНК, кодирующая растворимый рецепторный полипептид ББ-22ВА, или фрагмент полипептида ББ-22ВА оперативно связаны с другими генетическими элементами, требуемыми для их экспрессии, обычно включающими промотор и терминатор транскрипции в экспрессионном векторе. Вектор должен также обычно содержать один или более селектируемых маркеров и один или более сайтов старта репликации, хотя специалист в данной области должен знать, что в определенных системах селектируемые маркеры могут предлагаться в отдельных векторах и репликация экзогенной ДНК может обеспечиваться ее интеграцией в геном клетки-хозяина. Выбор промоторов, терминаторов, селектируемых маркеров, векторов и других элементов является рутинным делом для специалистов в данной области. Много таких элементов описано в литературе и доступно из коммерческих источников. Множественные компоненты комплекса растворимого рецептора могут быть котрансфицированы в индивидуальных экспрессионных векторах или могут содержаться в одном экспрессионном векторе. Такие способы экспрессии многокомпонентных комплексов белков хорошо известны в данной области.
Экспрессионный вектор может быть введен в клетки-хозяева с применением различных стандартных способов, включая трансфекцию с помощью фосфата кальция, опосредуемую липосомами трансфекцию, доставку, опосредуемую микроснарядом, электропорацию и тому подобное. Трансфицированные клетки могут быть отобраны и размножены для обеспечения рекомбинантными клетками-хозяевами, которые включают экспрессионный вектор, стабильно интегрированный в геном клетки-хозяина. Способы введения векторов в клетки эукариот и способы отбора таких стабильных трансформантов с применением доминантного селектируемого маркера описаны, например, АикиЬе1 (1995) и Миггау (еб.), Сепе ТгапкБег апб Ехргеккюп РгоБосо1к (Нитапа Ргекк 1991).
Например, один подходящий селектируемый маркер представляет собой ген, который обеспечивает устойчивость к антибиотику неомицину. В данном случае селекция осуществляется в присутствии лекарства неомицинового типа, такого как С-418 или тому подобного. Системы селекции могут также ис
- 18 009124 пользоваться для увеличения уровня экспрессии интересующего гена, процесса, обозначаемого как «амплификация». Амплификация осуществляется путем культивирования трансфектантов в присутствии низкого уровня селектирующего агента и последующего увеличения количества селектирующего агента для отбора клеток, которые продуцируют высокие уровни продуктов введенных генов. Подходящим селектируемым маркером амплификации является дигидрофолатредуктаза (БНГК), которая придает устойчивость к метотрексату. Могут применяться также другие гены устойчивости к лекарствам (например, устойчивости к гигромицину, множественной лекарственной устойчивости, пуромицинацетилтрансферазы). Альтернативно, маркеры, которые вводят измененный фенотип, такие как зеленый флуоресцентный белок или белки клеточной поверхности, такие как СБ4, СБ8, класс Ι МНС, щелочная фосфатаза плаценты, могут применяться для отделения трансфицированных клеток от нетрансфицированных клеток с помощью таких средств, как сортировка ГАС8 или технология разделения с помощью магнитных шариков.
Полипептиды ГЬ-22КА могут быть также получены с помощью культивирования клеток млекопитающих с применением вирусных систем доставки. Примеры вирусов для данной цели включают аденовирус, ретровирусы, вирус герпеса, вирус коровьей оспы и вирусы, связанные с аденовирусами (ААУ). Аденовирус, вирус с двуспиральной ДНК, является в настоящее время наиболее изученным вектором для переноса генов для доставки гетерологичной нуклеиновой кислоты (в качестве обзора см. Вескег е! а1., Ме!Н. Се11 ΒίοΙ. 43:161 (1994), и Боид1ак аиб Сипе1, 8с1еисе & Мебкше 4:44 (1997)). Преимущества аденовирусной системы включают аккомодацию относительно больших вставок ДНК, способность расти с высоким титром, способность инфицировать широкий диапазон клеточных типов млекопитающих и гибкость, которая позволяет применять ее с большим количеством доступных векторов, содержащих разные промоторы.
С помощью делеции части генома аденовируса могут быть аккомодированы относительно большие вставки гетерологичной ДНК (до 7 т.п.о.). Данные вставки могут быть включены в вирусную ДНК с помощью прямого лигирования или путем гомологичной рекомбинации с котрансфицированной плазмидой. Есть возможность делеции существенного гена Е1 из вирусного вектора, что ведет к отсутствию способности к репликации до тех пор, пока ген Е1 не будет предоставлен клеткой-хозяином. Инфицированные аденовирусным вектором клетки 293 человека (АТСС N0. СКЬ-1573, 45504, 45505), например, можно выращивать в виде прикрепленных клеток или в суспензионной культуре при относительно высокой плотности клеток с получением значительных количеств белка (смотри Сагшег е! а1., Су!о!есйио1. 15:145 (1994)).
ΙΕ-22ΚΑ может быть также экспрессирован в других высших эукариотических клетках, таких как клетки птиц, грибов, насекомых, дрожжей или растений. Бакуловирусная система является эффективным средством для введения клонированных генов ΙΕ-22ΚΑ в клетки насекомых. Подходящие экспрессионные векторы основываются на вирусе Аи!одгарйа са1йогшса множественного ядерного полиэдроза (АсМИРУ) и содержат хорошо известные промоторы, такие как промотор белка теплового шока (Нкр) 70 дрозофилы, промотор немедленного-раннего гена вируса Аи!одгарйа саШогшса ядерного полиэдроза (1е1) и отставленный ранний промотор 39К, бакуловирусный промотор р10 и промотор металлотионеина дрозофилы. При втором способе получения рекомбинантного бакуловируса применяют систему на основе транспозона, описанную Ьискоте (Ьискоте, е! а1., 1. У1го1. 67:4566 (1993)). Данную систему, в которой применяются векторы для переноса, продают в виде набора ВАС-Ю-ВАС (Ьйе Тесйио1од1ек, КоскуШе, МБ). В данной системе применяется вектор для переноса, РГА8ТВАС (Ьйе Тесйио1од1ек), содержащий транспозон Тп7 для переноса ДНК, кодирующей полипептид ГЕ-22КА, в бакуловирусный геном, поддерживаемый в Е. со11 в виде большой плазмиды, называемой «бакмидой». Смотри, НШ-Регкшк апб Роккее, 1. Сеп. У1го1. 71:971 (1990), Вопшпд, е! а1., 1. Сеп. Уйо1. 75:1551 (1994), и СНахепЬаПу апб Каророй, 1. Вю1. СНет. 270:1543 (1995). Кроме того, векторы для переноса могут включать в рамке считывания соединение с ДНК, кодирующей эпитоп метки на С- или №конце экспрессируемого полипептида ГО^КА, например, эпитоп метки С1и-С1и (Сгиккептеуег е! а1., Ргос.№1Г1 Асаб. 8ск 82:7952 (1985)). Применяя способ, известный в данной области техники, вектор для переноса, содержащий ген ГЕ-22КА, трансформируют в Е. сой и проводят скрининг бакмид на содержание прерванного гена ΕκΖ, указывающего на рекомбинантный бакуловирус. ДНК бакмиды, содержащую геном рекомбинантного бакуловируса, затем выделяют с применением обычных способов.
Иллюстративный вектор РГА8ТВАС может быть модифицирован в значительной степени. Например, полиэдриновый промотор может быть удален и заменен на промотор основного белка бакуловируса (также известный как Ргос, р6.9 или промотор МР), который экспрессируется при бакуловирусной инфекции раньше и, как показано, является выгодным для экспрессии секретируемых белков (см., например, НШ-Регкшк апб Роккее, 1. Сеп. Уио1. 71:971 (1990), Вопшпд, е! а1., 1. Сеп. Уио1. 75:1551 (1994), и С’11ахепЬа1к апб Каророй, 1. Вю1. СНет. 270:1543 (1995). В таких конструктах векторов для переноса может быть использован короткий или длинный вариант промотора основного белка. Более того, могут быть созданы векторы для переноса, которые заменяют природные секреторные сигнальные последовательности ГЕ-22КА на секреторные сигнальные последовательности, происходящие от белков насекомых. Например, секреторная сигнальная последовательность от экдистероидглюкозилтрансферазы (ЕСТ)
- 19 009124 медоносной пчелы ΜοΙίΙΙίη (ΙηνίίΓο^βη Согрогайоп; Саг1зЬай, СА) или бакуловируса др67 (РЫагМтдеп: 8ап О|едо. СА) может быть использована в конструктах для замены природной секреторной сигнальной последовательности ΙΕ-22ΚΑ.
Для трансфекции клеток-хозяев применяют рекомбинантный вирус или бакмиду. Подходящие клетки-хозяева насекомых включают клеточные линии, происходящие от ΙΡΕΒ-8£-21, клеточную линию яичников куколок 8ройор1ега Ггид1регйа, такую как 8Г9 (АТСС СКБ 1711), 8Г21АЕ, и 8Г21 (ШуЦгодеп Согрогайоп; 8ап П1едо, СА), а также клетки 8сЫпе1йег-2 дрозофилы и клеточную линию ΗΙΟΗ Е!УЕ0 (Ιηνί1годеп), происходящую от Тпс1юрЫз1а п (патент США N 5300435). Для выращивания и поддержания клеток могут быть использованы имеющиеся в продаже бессывороточные среды. Подходящими средами являются 8Г900 ΙΙ™ (Б1Ге ТесЫпо1од1ез) или Е8Е921™ (Ехргеззюп 8уз1етз) для клеток 8Г9; и Ехсе110405™ (ГЕН Вюзаепсез, Бепеха, К8) или Ехргезз ЕЫе0™ (Б1Ге ТесЫпо1од1ез) для клеток Т. ш. Когда применяют рекомбинантный вирус, клетки обычно выращивают от плотности при инокуляции приблизительно 2-5х105 клеток до плотности 1-2х106 клеток, во время которой добавляют маточный раствор рекомбинантного вируса при множественности заражения (Μ0Ι) от 0,1 до 10, более обычно приблизительно 3.
Принятые способы получения рекомбинантных белков в бакуловирусных системах предлагаются Вайеу е1 а1., «Машрц1а1юп оГ Васп1оу|гпз УеЫогз», ш МеЫойз ш Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1ите 7: Сепе ТгапзГег апй Ехргеззюп Рго!осо1з, Миггау (ей.), радез 147-168 (ТЫе Нитапа Ргезз, Ею. 1991), Ра1е1 е1 а1., «ТЫе ЬасЫоуйиз ехргеззюп зуз!ет,» т ЭХА С1ошпд 2: Ехргеззюп 8уз1етз, 2пй ЕйШоп, С1огег е1 а1. (ейз.), радез 205-244 (0хГогй БЫуегзйу Ргезз 1995), АизиЬе1 (1995) а! радез 16-37 Ю 16-57, КюЫагйзоп (ей.), Ваайоуйиз Ехргеззюп РгоЮсо1з (ТЫе Нитапа Ргезз, Шс. 1995), и Бискпоте, «!пзес1 Се11 Ехргеззюп ТесЫпо1оду», 1п Рго1ет Епдтеегтд: Ргтар1ез апй Ргасйсе, С1е1апй е1 а1. (ейз.), радез 183-218 ДоНп №11еу & 8опз, Шс. 1996).
Клетки грибов, включая клетки дрожжей, также могут быть использованы для экспрессии описанных здесь генов. Конкретные интересующие в данном отношении штаммы дрожжей включают 8ассЫаготусез се^еν^з^ае, РюЫа разЮпз и РюЫа теЫапоНса. Подходящие промоторы для экспрессии в дрожжах включают промоторы от САБ1 (галактозы), РСК (фосфоглицераткиназы), АЭН (алкогольдегидрогеназы), АОХ1 (алкогольоксидазы), ΗΙ84 (гистидинолдегидрогеназы) и тому подобное. Создано и легко доступно много клонирующих векторов дрожжей. Данные векторы включают векторы на основе У!р, такие как векторы У!р5, УКр векторы, такие как векторы УКр17, УЕр, такие как векторил УЕр13 и УСр, такой как УСр19. Способы трансформации клеток 8. сеге\аз1ае экзогенной ДНК и получения из них рекомбинантных пептидов раскрыты, например, в КатеазаЫ, патент США № 4599311, Катеазак е1 а1., патент США № 4931373, Вгаке, патент США № 4870008, №е1сЫ е1 а1., патент США № 5037743 и Миггау е1 а1., патент США № 4845075. Трансформированные клетки отбирают по фенотипу, определяемому по селектируемому маркеру, обычно устойчивости к лекарству или способности расти в отсутствие определенного компонента питательной среды (например, лейцина). Подходящей векторной системой для применения в 8асс11аготусез сегеу1з1ае является векторная система РОТ1, раскрытая Катеазак е1 а1. (патент США № 4931373), которая дает возможность отбирать трансформированные клетки по росту в средах, содержащих глюкозу. Дополнительные подходящие промоторы и терминаторы для применения в дрожжах включают происходящие от генов гликолитических ферментов (смотри, например, Катеазак, патент США № 4599311, Ктдзтап е1 а1., патент США № 4615974 и ВШег, патент США № 4977092) и гены алкогольдегидрогеназы. См. также патенты США № 4990446, 5063154, 5139936 и 4661454.
Системы трансформации для других дрожжей, включая Напзепи1а ро1утогрЫа, 8сЫхозасс11аготусез ротЬе, КШууеготусез 1асйз, КЫууеготусез ГгадШз, ИзШадо тауй1з, РюЫа разЮпз, РюЫа теШапойса, РюЫа дш11егтопйи и Сапй1йа тайоза, известны в данной области. См., например, С1еезоп е1 а1., 1. Сеп. МюгоЬю1. 132:3459 (1986), и Сгедд, патент США № 4882279. Могут быть также использованы клетки АзрегдШиз в соответствии со способами МсКЫдЫ е1 а1., патент США № 4935349. Способы трансформации Асгетопит сЫгузодепит раскрыты 8итто е1 а1., патент США № 5162228. Способы трансформации №игозрога раскрыты БатЬотейх, патент США № 4486533.
Например, применение в качестве хозяина РюЫа шеЫапоНса для продукции рекомбинантных белков раскрыто Каутопй, патент США № 5716808, Каутопй, патент США № 5736383, Каутопй е1 а1., Уеаз1 14:11-23 (1998), и в международных публикациях № №0 97/17450, №0 97/17451, №0 98/02536 и №0 98/02565. Молекулы ДНК для применения при трансформации Р. теЫапойса обычно должны быть получены в виде двуспиральных, круговых плазмид, которые предпочтительно линеаризуют перед трансформацией. Для получения полипептидов в Р. шеЫапокса промотор и терминатор в плазмиде могут быть таковыми от гена Р. теШапойса, такого как ген утилизации спирта Р. теГЫапойса (АИС1 или АиС2). Другие пригодные промоторы включают таковые от генов дигидроксиацетонсинтазы (ОНА8), формиатдегидрогеназы (ЕМЭ) и каталазы (САТ). Для облегчения интеграции ДНК в хромосому хозяина предпочтительно иметь полный экспрессионный сегмент плазмиды с примыкающими с обоих концов последовательностями ДНК хозяина. Подходящий селектируемый маркер для применения у РюЫа шеЫапоНса представляет собой ген АЭЕ2 Р. теШапойса, который кодирует фосфорибозил-5аминоимидазолкарбоксилазу (А!ВС; ЕС 4.1.1.21), и который позволяет клеткам-хозяевам айе2 расти в отсутствие аденина. Для широкомасштабных промышленных процессов, когда желательно свести к ми
- 20 009124 нимуму применение метанола, могут применяться клетки-хозяева с делецией обоих генов утилизации метанола (АИС1 и АИС2). Для продукции секретируемых белков клетки-хозяева могут быть дефицитными по генам протеаз вакуолей (РЕР4 и РКВ1). Электропорацию применяют для облегчения введения плазмиды, содержащей ДНК, кодирующей интересующий полипептид в клетках Р. теШаиойса. Клетки Р. теШаиойса могут быть трансформированы с помощью электропорации с применением экспоненциально угасающего, пульсирующего электрического поля, имеющего силу поля от 2,5 до 4,5 кВ/см, предпочтительно 3,75 кВ/см, и константу времени (!) от 1 до 40 мс, наиболее предпочтительно приблизительно 20 мс.
Экспрессионные векторы могут быть также введены в протопласты растений, интактные ткани растений или выделенные клетки растений. Способы введения экспрессионных векторов в ткань растения включают прямое инфицирование или сокультивирование ткани растения с АдгоЬас!ейит !ите!ас1еик, доставку, опосредуемую микроснарядом, инъекцию ДНК, электропорацию и тому подобное. См., например, ИогксН е! а1., 8с1еисе 227:1229 (1985), К1еш е! а1., Вю!есйио1оду 10:268 (1992), и М1к1 е!. а1., «Ргосебигек £от Шйобисшд Роге1ди ЭДА ш!о Р1аи!к», ш Ме!1обк ш Р1аи! Мо1еси1аг Вю1оду аиб Вю!есйио1оду, Сйск е! а1. (ебк.), радек 67-88 (СКС Ргекк, 1993).
Альтернативно, гены ГЬ-22КА могут быть экспрессированы в прокариотических клетках-хозяевах. Подходящие промоторы, которые могут использоваться для экспрессии полипептидов ГЬ-22КА в прокариотических хозяевах хорошо известны специалистам в данной области и включают промоторы, способные узнавать полимеразы Т4, Т3, 8р6 и Т7, промоторы РК и Рь бактериофага лямбда, !гр, гесА, теплового шока, 1асИУ5, !ас, [рр-1ас8рг, рйоА, и 1ас2 промоторы Е. сой, промоторы В. киЬййк, промоторы бактериофагов ВасШик, промоторы 8!тер!отусек, ш! промотор бактериофага лямбда, Ь1а промотор рВК322 и САТ промотор гена хлорамфениколацетилтрансферазы. Прокариотические промоторы рассмотрены Сйск, I. Шб. МютоЬюй 1:277 (1987), \Уа!кои е! а1., Мо1еси1аг Вю1оду о£ !1е Сеие, 4!1 Еб. (Вещатш Ситттк 1987) и АикиЬе1 е! а1. (1995).
Подходящие прокариотные хозяева включают Е. сой и ВасШик киЬШик. Подходящие штаммы Е. сой включают ВЬ21(ЭЕ3), ВЬ21(ПЕ3)рЬук8, ВЬ21(ПЕ3)рЬукЕ, ΌΗ1, ΌΗ4Ι, ΌΗ5, ΌΗ5Ι, ΌΗ5ΙΡ', ЭШЕМСЯ, ЭН10В, ЭШ0В/р3, ΌΗ118, С600, №101, 1М101, 1М105, 1М109, 1М110, К38, КК1, Υ1088, Υ1089, С8Ш8, ЕК1451 и ЕК1647 (см., например. Вго\уп (еб.). Мо1еси1аг Вю1оду ЬаЫах (Асабешю Ргекк 1991)). Подходящие штаммы ВасШик киЬШик включают ВК151, ΥΒ886, МП19, МП20 и В170 (см., например Ηа^бу, «ВасШик С1ошид Ме!1обк», ш ЭХА С1ошид: А Ртасйса1 Арртоасй, С1оует (еб.) (ШЬ Ргекк 1985)).
Когда экспрессируют полипептид ГЬ-22КЛ в бактериях, таких как Е. сой, полипептид может оставаться в цитоплазме, обычно в виде нерастворимых гранул, или может быть направлен в периплазматическое пространство с помощью бактериальной последовательности для секреции. В первом случае клетки лизируют и гранулы получают и денатурируют с применением, например, гуанидинизотиоцианата или мочевины. Денатурированный полипептид может быть затем заново уложен и димеризован с помощью разведения денатурирующего раствора, такого как с помощью диализа против раствора мочевины и сочетания восстановленного и окисленного глутатиона с последующим диализом против забуференного солевого раствора. В последнем случае полипептид может быть получен из периплазматического пространства в растворимой и функционирующей форме с помощью разрушения клеток (например, с помощью сонификации или осмотического шока) для высвобождения компонентов периплазматического пространства и получения белка, тем самым избегая необходимости денатурации и повторной укладки.
Способы экспрессии белков в прокариотических хозяевах хорошо известны специалистам в данной области (см., например, ^ййатк е! а1., «Ехртеккюи о£ £оте1ди рто!ешк ш Е. сой икшд р1акт1б уес!огк аиб рштйсайои о£ кресйтс ро1ус1оиа1 аийЬоб1ек», 1и ЭНА С1ошид 2: Ехртеккюи 8ук!етк, 2иб Ебйюи, С1оует е! а1. (ебк.), раде 15 (0х£отб Ишуеткйу Ргекк 1995), \Уагб е! а1., «Сеиейс Машри1а!юи аиб Ехртеккюи о£ АийЬоб1ек», 1и Моиос1оиа1 АийЬоб1ек: Рйис1р1ек аиб Аррйсайоик, раде 137 (ХУПеу-Ыкк, Шс. 1995), и Сеотдюи, «Ехртеккюи о£ Рто!ешк ш Вас!ейа», ш Рго!еш Еидшеейид: Рйиар1ек аиб Ргасйсе, С1е1аиб е! а1. (ебк.), раде 101 (1ойи ^йеу & 8оик, Шс. 1996)).
Стандартные способы введения экспрессионных векторов в клетки бактерий, дрожжей, насекомых и растений предлагаются, например, АикиЬе1 (1995).
Обычные способы экспрессии и получения чужеродных белков, продуцируемых клеточной системой млекопитающих предлагаются, например, Е!сйеуетту, «Ехртеккюи о£ Еидшеегеб Рто!ешк ш Матта11аи Се11 Си1!иге», ш Рго!еш Еидтеейид: Рйиар1ек аиб Ргасйсе, С1е1аиб е! а1. (ебк.), радек 163 (^йеу-Ыкк, Шс. 1996). Стандартные способы получения белка, продуцируемого бактериальной системой, предлагаются, например, СпккНаттег е! а1., «Рштйсайои о£ оует-ртобисеб рго!е1ик £тот Е. сой се11к», ш ЭКА С1оишд 2: Ехртеккюи 8ук!етк, 2иб Ебйюи, С1оует е! а1. (ебк.), радек 59-92 (0х£отб Итуегкйу Ргекк 1995) . Установленные способы для выделения рекомбинантных белков из бакуловирусной системы описаны Шсйагбкои (еб.), Васи1оу1гик Ехртеккюи Рго!осо1к (Т1е ^таиа Ргекк, Шс. 1995).
В качестве альтернативы, полипептиды настоящего изобретения могут быть синтезированы с помощью способов исключительно твердофазного синтеза, частичного твердофазного синтеза, конденсации фрагментов или классического синтеза в растворе. Данные способы синтеза хорошо известны специалистам в данной области (см., например, МетйДе1б, 1. Ат. С1ет. 8ос. 85:2149 (1963), 8!е\\'аг! е! а1.,
- 21 009124 «8ο1ί6 РНаке Рерйбе 8уп!йек1к» (2пб Ебйюп), (Р1егсе Сйет1са1 Со. 1984), Вауег апб Карр, СНет. Рер!. Рго!. 3:3 (1986), АШегкп е! а1., 8ο1ι6 РНаке Рерйбе 8уп!йек1к: А Ргасйса1 АрргаасН (1КЬ Ргекк 1989), Р1е1бк апб Ο’ο1ο\νχ1<. «δοΜ-Γ^^ Рерйбе 8уп!йек1к,» МеЙюбк т Еηζутο1οду АЫите 289 (Асабетк Ргекк 1997), и Ькуб-УйНатк е! а1., С11етка1 Арргоасйек !ο Ше 8уп!йек1к οΓ Рерббек апб Рго!етк (СКС Ргекк, 1пс. 1997)). Варианты в стратегиях общего химического синтеза, такие как «природное химическое лигирование» и «лигирование экспрессируемого белка» также являются стандартными (смотри, например, □азу^а е! а1., 8скпсе 266:776 (1994), Наскепд е! а1., Ргос. №1'1 Асаб. 8ск И8А 94:7845 (1997), □азу^о, МеЙюбк Еηζутο1. 287:34 (1997), Мшг е! а1, Ргос. №!'1 Асаб. 8ск И8А 95:6705 (1998), и 8еνе^^ηον апб Мшг, 1. Вю1. СНет. 273:16205 (1998)).
Пептиды и полипептиды настоящего изобретения включают по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь или по меньшей мере 15 смежных аминокислотных остатков 8ЕО Ш N0:3. В качестве иллюстрации, полипептиды могут включать по меньшей мере шесть, по меньшей мере девять или по меньшей мере 15 смежных аминокислотных остатков 8Е0 Ш N0:3. В определенных осуществлениях изобретения полипептиды включают 20, 30, 40, 50, 100 или более смежных остатков данных аминокислотных последовательностей. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие такие пептиды и полипептиды, пригодны для полимеразной цепной реакции в качестве праймеров и зондов.
Более того, полипептиды 1Б-22КА и их фрагменты могут быть экспрессированы в виде мономеров, гомодимеров, гетеродимеров или мультимеров в клетках высших эукариот. Такие клетки могут быть использованы для получения мономерных, гомодимерных, гетеродимерных и мультимерных рецепторных полипептидов 1Ь-22КА, которые включают по меньшей мере один полипептид 1Б-22КА («рецепторы, включающие 1Б-22КА» или «рецепторные полипептиды, включающие 1Б-22КА»), или они могут быть применены в качестве тестирующих клеток в системах для скрининга. В одном аспекте настоящего изобретения полипептид настоящего изобретения, включающий внеклеточный домен 1Ь-22КА, получают путем культивирования клетки и клетку используют для скрининга лигандов для рецептора, включая природный лиганд, 1Б-22, а также агонисты и антагонисты природного лиганда. Суммируя данный подход, кДНК или ген, кодирующий рецептор, соединяют с другими генетическими элементами, требуемыми для их экспрессии (например, промотором транскрипции), и полученный экспрессионный вектор вводят в клетку-хозяина. Клетки, которые экспрессируют ДНК и продуцируют функциональный рецептор, отбирают и применяют для множества систем скрининга. Каждый компонент мономерного, гомодимерного, гетеродимерного и мультимерного рецепторного комплекса может быть экспрессирован в одной и той же клетке. Более того, компоненты мономерного, гомодимерного, гетеродимерного и мультимерного рецепторного комплекса могут быть также гибридизованы с трансмембранным доменом или другой мембранной гибридной частью, чтобы позволить комплексу собраться и для возможности скрининга трансфектантов, как описано выше.
Для тестирования антагонистов полипептидов 1Б-20 и 1Б-22 и антител настоящего изобретения клетки млекопитающих, подходящие для использования для экспрессии рецепторов, включающих 1Ь22КА, или других рецепторов, известных как связывающие 1Б-20 или 1Б-22 (например, клетки экспрессирующие 1Б-22КА/СКР2-4; и 1Б-20КА, 1Б-20КВ, 1Ь-22КА/1Ь-20КВ, или 1Ь-20КА/1Ь-20КВ) и передающие опосредованный рецепторами сигнал, включают клетки, которые экспрессируют другие рецепторные субъединицы, которые могут формировать функциональный комплекс с 1Б-22КА (или 1Б-20КА). Данные субъединицы могут включать таковые семейства рецепторов интерферона или других рецепторов цитокинов класса II или класса I, например, СКР2-4 (СепЬапк, Νο. регистрации Ζ17227), 1Б-10К (СепЬапк, Νο. регистрации И00672 и NМ_001558), 1Б-22КА (обычно принадлежащие патенту США № 5965704), хсуГОг? (1Б-20КА) (обычно принадлежащие патенту США № 594551Ь), 1Ь-20КА/1Ь-20КВ (У1РО, № публикации УО 01/46232) и Ш-9К.
Предпочтительно также применять клетку от тех же видов, что и рецептор, предназначенный для экспрессии. В предпочтительном осуществлении клетка зависит от экзогенно добавляемого гематопоэтического ростового фактора для своей пролиферации. Предпочтительные клеточные линии данного типа представляют собой клеточную линию ТР-1 человека (номер АТСС СКЬ-2003) и клеточную линию АМЬ-193 (номер АТСС СКЬ-9589), которые являются зависимыми от СМ-С8Р клеточными линиями лейкоза человека и ВаР3 (Ра1асюк апб 8!е1пте!х, Се11 41:727-734, (1985)), которая является зависимой от 1Ь-3 клеточной линией пре-В мыши. Другие клеточные линии включают клетки ВНК, СО8-1 и СНО. Подходящие клетки-хозяева могут быть сконструированы для получения необходимых рецепторных субъединиц или другого клеточного компонента, необходимого для желаемого клеточного ответа, Данный подход является выгодным, потому что клеточные линии для экспрессии рецепторных субъединиц могут быть сконструированы от любых видов, обходя тем самым потенциальные ограничения, происходящие из-за видовой специфичности. Ортологи видов кДНК рецептора человека могут быть клонированы и использованы в клеточных линиях от тех же видов, такие как кДНК мыши в клеточной линии ВаР3. Клеточные линии, которые зависят от гематопоэтического фактора роста, такого как СМ-С8Р или 1Ь-3, могут быть сконструированы таким образом, что становятся зависимыми от другого цитокина, который действует через рецептор 1Б-22КА, такого как 1Б-22.
- 22 009124
Клетки, экспрессирующие функциональный рецептор, применяют в тестах скрининга. Разнообразные подходящие тесты известны в данной области. Данные тесты основываются на определении биологического ответа в клетке-мишени. Одним таким тестом является тест на клеточную пролиферацию. Клетки культивируют в присутствии или в отсутствие тестируемого соединения и пролиферацию клеток определяют с помощью, например, измерения включения меченного тритием тимидина или с помощью колориметрического теста, основанного на метаболическом разрушении бромида 3-(4,5-диметилтиазол2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ) (Μοктаη, I Iттипο1. Ме!Ь. 65: 55-63, (1983)). В альтернативном формате теста применяют клетки с дополнительной конструкцией для экспрессии репортерного гена. Репортерный ген присоединяют к промоторному элементу, который отвечает за путь, опосредованный рецептором, и в тесте определяют активацию транскрипции репортерного гена. Предпочтительным промоторным элементом в данном отношении является чувствительный элемент сыворотки или 8КЕ. См., например, 8На\у е! а1., Се11 56:563-572, (1989). Таким предпочтительным репортерным геном является ген люциферазы (бе Ае! е! а1., Μο1. Се11. Βίο1. 7:725, (1987)). Экспрессию гена люциферазы определяют по люминесценции с применением способов, известных в данной области (например, ЕаитдаПпег е! а1., I. Βίο1. СЬет. 269:29094-29101, (1994); δο^ώοΐΉ апб ^10^, Рготеда_№1ек 41:11, 1993). Наборы для определения активности люциферазы имеются в продаже у, например, Рготеда С.огр.. Маб№п. А1. Линии клеток-мишеней данного типа могут быть применены для скрининга библиотек химических соединений, кондиционных для клеток культуральных сред, грибковых бульонов, образцов почвы, образцов воды и тому подобное. Например, образцы банка кондиционных для клеток культуральных сред могут быть протестированы на клетках-мишенях для идентификации клеток, которые продуцируют лиганд. Позитивные клетки затем применяют для получения библиотеки кДНК в экспрессионном векторе млекопитающих, которую разделяют на пулы, трансфицируют в клетки-хозяева и экспрессируют. Образцы сред от трансфицированных клеток затем тестируют с последующим разделением на пулы, повторной трансфекцией, субкультивированием и повторным тестированием позитивных клеток для выделения клонированной кДНК, кодирующей лиганд.
Несколько клеточных линий, отвечающих на 1Б-20. известно в данной области или может быть создано, например, клеточная линия Βаί3/^IК81/су!οК11 (А1Р0, № публикации А0 02/072607). Более того, известно несколько клеточных линий, отвечающих на ГЬ-22 (^итοи!^е^ е! а1., I. Iттиηο1. 164:1814-1819, 2000; ^итοи!^е^, Ь. е! а1., Ргос. №!'1. Асаб. 8сг 97:10144-10149, 2000; Х1е М.Н. е! а1., I. Βίο1. СЬет. 275: 31335-31339, 2000; №!еп^ 8У е! а1., I. Βίο1. СЬет. 276:2725-2732, 2001), а также такие, которые экспрессируют ГЬ-22 рецепторную субъединицу 1Б-22КА. Например, следующие клетки отвечают на ГЬ-22: ТК10 (Х1е М.Н. е! а1., выше) (карцинома почки человека); 8А480 (АТСС № ССЬ-228) (аденокарцинома ободочной кишки человека); НерС2 (АТСС № НВ-8065) (гепатома человека); РС12 (АТСС №. СКЬ-1721) (клеточная модель нейронов мыши; феохромоцитома крысы); и МЕ813 (АТСС № СКЬ-1927) (линия мезангиальных клеток почек мыши). Кроме того, несколько клеточных линий, экспрессирующих 1Б-22КА (рецептор ГЬ-22), также являются кандидатами на клеточные линии, отвечающие на ГЬ-22: А549 (АТСС № ССЬ-185) (карцинома легких человека); С-361 (АТСС №. СКЬ-1424) (меланома человека); и Сак1-1 (АТСС № НТЕ-46) (карцинома почки человека). Кроме того, клеточные линии, отвечающие на ГЬ-22, могут быть созданы, например, описанная здесь клеточная линия Βаί3^/су!οК11/СКЕ2-4 (А1Р0, №. публикации А0 02/12345). Данные клетки могут быть использованы в тестах для оценки функционирования 1Б-22КА в качестве антагониста ГЬ-20 или ГЬ-22 или противовоспалительного фактора.
Дополнительный подход к скринингу, обеспечиваемый настоящим изобретением, включает применение гибридных рецепторных полипептидов. Данные гибридные полипептиды входят в два общих класса. В первом классе внутриклеточный домен 1Б-22КА соединен со связывающим лиганд доменом второго рецептора. Второй класс гибридных рецепторных полипептидов включает внеклеточный (связывающий лиганд) домен 1Б-22КА (8ЕО Ш N0:3) с внутриклеточным доменом второго рецептора, предпочтительно рецептора гематопоэтических цитокинов, и трансмембранный домен. Гибридные 1Б-22КА мономеры, гомодимеры, гетеродимеры и мультимеры рецепторов настоящего изобретения данного второго класса экспрессируются в клетках, известных как способные отвечать на сигналы, передаваемые вторым рецептором. Совместно эти два класса гибридных рецепторов дают возможность идентифицировать отвечающий клеточный тип для разработки теста для определения 1Б-22 или 1Б-20. Более того, такие клетки могут быть использованы в присутствии 1Б-22 или 1Б-20 для тестирования растворимых рецепторных антагонистов настоящего изобретения в конкурентном типе анализа. В таком анализе снижение пролиферации или активности в отношении передачи сигнала 1Б-22 или 1Б-20 в присутствии растворимого рецептора настоящего изобретения является демонстрацией антагонистической активности. Более того, анализы связывания растворимого рецептора 1Б-22КА, тесты на основе клеток могут быть также применены для оценки того, будет ли растворимый рецептор связывать, блокировать, ингибировать, снижать, проявлять антагонистическое действие или нейтрализовать активность 1Б-22 или 1Б-20.
6. Получение гибридных белков и конъюгатов 1Б-22КА.
Одним общим классом аналогов 1Б-22КА являются варианты, имеющие аминокислотную последовательность, которая является мутантным вариантом раскрытой здесь аминокислотной последовательности. Другой общий класс аналогов 1Б-22КА предлагается в виде антиидиотипических антител и их фраг
- 23 009124 ментов, как описано ниже. Более того, в качестве аналогов могут быть применены рекомбинантные антитела, включающие антиидиотипические вариабельные домены (см., например, МопГагб1ш е! а1., Ргос. Аккос. Ат. РйукШапк 108:420 (1996)). Так как вариабельные домены антиидиотипических антител против ГБ-22КА имитируют [^-22КΑ. данные домены могут обеспечить связывающую активность в отношении М-22КА. Способы получения антиидиотипических каталитических антител известны специалистам в данной области (см., например, 1огоп е! а1., Апп. N Υ Асаб. 8ск 672:216 (1992), РпЬои1е! е! а1., Арр1. Вюсйет. Вю!есйпо1. 47:229 (1994), и Ауа11е е! а1., Апп. N Υ Асаб. 8ск 864:118 (1998)).
Другой подход к идентификации аналогов ГР-22КА обеспечивается применением комбинаторных библиотек. Способы конструкции и скрининга фагового дисплея и других комбинаторных библиотек предлагаются, например, Кау е! а1., Рйаде Э|кр1ау оГ Рерйбек апб Рго!етк (Асабетю Ргекк 1996), Уегбте, патент США № 5783384, Кау е! а1., патент США № 5747334, и КаиГГтап е! а1., патент США № 5723323.
Полипептиды ГР-22КА имеют применение как ш у|уо, так и ш уйго. В качестве иллюстрации, растворимая форма ГР-22КА может быть добавлена к клеточной культуральной среде для ингибирования эффектов лиганда [^-22КΑ. продуцируемого культивируемыми клетками.
Гибридные белки ГР-22КА можно применять для экспрессии ГР-22КА в рекомбинантном хозяине и для выделения продуцируемого М-22КА. Как описано ниже, конкретные гибридные белки ГР-22КА также находят применение в диагностике и терапии. Один тип гибридного белка включает пептид, который управляет полипептидом ГР-22КА из рекомбинантной клетки-хозяина. Для направления полипептида Ш22КА по секреторному пути эукариотной клетки-хозяина в экспрессионном векторе М^КА предлагается секреторная сигнальная последовательность (также известная как сигнальный пептид, лидирующая последовательность, препро-последовательность или пре-последовательность). Тогда как секреторная сигнальная последовательность может происходить от [^-22КΑ. подходящая сигнальная последовательность может также происходить от другого секретируемого белка или синтезироваться бе поуо. Секреторную сигнальную последовательность оперативно связывают с последовательностью, кодирующей Ш22КА, так что две последовательности объединяются в правильной рамке считывания и располагаются для направления вновь синтезированного полипептида по секреторному пути клетки-хозяина. Секреторные сигнальные последовательности обычно располагаются на 5'-конце нуклеотидной последовательности, кодирующей интересующий полипептид, хотя секреторные сигнальные последовательности могут располагаться где угодно в интересующей нуклеотидной последовательности (см., например, ^Уе1сй е! а1., патент США № 5037743; Но11апб е! а1., патент США № 5143830).
Хотя секреторная сигнальная последовательность П-22КА или другого белка, продуцируемого клетками млекопитающих (например, сигнальная последовательность активатора плазминогена тканевого типа, как описано, например, в патенте США 5641655), пригодна для экспрессии [^-22КΑ в рекомбинантных хозяевах-млекопитающих, сигнальная последовательность дрожжей является предпочтительной для экспрессии в клетках дрожжей. Примерами подходящих сигнальных последовательностей дрожжей являются те, которые происходят от α-фактора феромона спаривания дрожжей (кодируемого геном МРа1), инвертазы (кодируемой геном 8ИС2) или кислой фосфатазы (кодируемой геном РН05). См., например, Котапок е! а1., «Ехргеккюп оГ С1опеб Оепек ш Υеак!,» т ЭДА С1ошпд 2: А Ргасйса1 Арргоасй, 2пб Ебйюп, С1оуег апб Натек (ебк.), радек 123-167 (ОхГогб Ишуегкйу Ргекк 1995).
Растворимые рецепторные полипептиды [^-22КΑ могут быть получены с помощью экспрессии укороченной ДНК, кодирующей внеклеточный домен, например, полипептида, который содержит 8ЕР ГО N0:3, или соответствующую область рецептора не от человека. Предпочтительно, чтобы внеклеточные домены полипептидов получали в форме, по существу, свободной от трансмембранного и внутриклеточного полипептидных сегментов. Для направления рецепторного домена на экспорт из клеткихозяина рецепторную ДНК соединяют со втором сегментом ДНК, кодирующим секреторный пептид, такой как !-РА секреторный пептид. Для облегчения очистки секретируемого рецепторного домена Сконцевое расширение, такое как полигистидиновая метка, вещество Р, пептид Р1ад™ (Норр е! а1., Вю!есйпо1оду 6:1204-1210, (1988); поставляемый Еак!тап Кобак Со., №\ν Науеп, СТ) или другой полипептид или белок, для которых доступны антитело или другой специфический связывающий агент, может быть соединено с рецепторным полипептидом. Более того, антигенные эпитопы М^КА из внеклеточных связывающих цитокины доменов также получают как описано выше.
В другом альтернативном подходе внеклеточный рецепторный домен Ш-22КА или другого рецепторного компонента класса I или II цитокинов может быть экспрессирован как гибрид с константными областями тяжелых цепей иммуноглобулина, обычно с Рс фрагментом, который содержит два домена константной области и шарнирную область, но не имеет вариабельной области (см. 81еб71е^кк1, АД е! а1., патенты США N 6018026 и 5750375). Растворимые полипептиды Ш-22КА настоящего изобретения включают такие гибриды. Один такой гибрид показан в 8ЕР ГО N0:4. Такие гибриды обычно секретируются в виде мультимерных молекул, где части Рс связаны друг с другом через дисульфидный мостик и два рецепторных полипептида расположены в тесном соседстве друг с другом. Гибриды данного типа могут быть использованы для аффинной очистки родственного лиганда из раствора, в качестве средства тестирования ш уйго, для блокирования, ингибирования или снижения сигналов ш уйго с помощью спе
- 24 009124 цифического титрования лиганда и в качестве антагонистов ίη νίνο путем введения их парентерально для связывания циркулирующего лиганда и удаления его из циркуляции. Для очистки лиганда химерный 1Ь22КА-1д добавляют к образцу, содержащему лиганд (например, к кондиционным для клеток культуральным средам или тканевым экстрактам), в условиях, которые облегчают рецептор-лигандное взаимодействие (обычно при приблизительно физиологических температуре, рН и ионной силе). Комплекс химералиганд затем разделяют с помощью смеси с применением протеина А, который иммобилизован на твердом носителе (например, нерастворимых шариках смолы). Лиганд затем элюируют с применением общепринятых химических способов, таких как градиент соли или рН. В альтернативном случае химера сама может быть связана с твердым носителем со связыванием и элюированием, выполняемыми как указано выше. Химеры могут быть использованы ίη νίνο для регуляции воспалительных ответов, включая ответы острой фазы, такие как амилоид А сыворотки (8АА), С-реактивный протеин (СКР) и тому подобное. Химеры с высоким связывающим сродством вводят парентерально (например, с помощью внутримышечной, подкожной или внутривенной инъекции). Циркулирующие молекулы связывают лиганд и исчезают из циркуляции с помощью нормальных физиологических процессов. Для применения в тестах химеры связывают с носителем через Ес область и применяют в формате ИФА.
Для содействия в выделении антитела против 6Б-22КА и связывающих партнеров настоящего изобретения может быть выгодно применена тестирующая система, которая использует связывающий лиганд рецептор (или антитело, один член пары комплемент/антикомплемент) или его связывающий фрагмент и имеющийся в продаже биосенсорный прибор (ЫЛсоге. РНагтааа Вюкепког, Р|5са1а\уау. N6). Такие рецептор, антитело, член пары комплемент/антикомплемент или фрагмент иммобилизуют на поверхности рецепторного чипа. Применение данного приспособления раскрыто КагНкоп, б. 1ттипо1. МеШобк 145:229-40, 1991 и Сиппшдйат апб ХУеШ, б. Мо1. Βίο1. 234:554-63, 1993. Рецептор, антитело, член или фрагмент ковалентно присоединяют, применяя аминные или сульфгидрильные химические группы, к декстрановым волокнам, которые присоединены к золотой пленке в проточной кювете. Тестируемый образец пропускают через кювету. Если лиганд, эпитоп или противоположный член пары комплемент/антикомплемент присутствует в образце, он должен связаться с иммобилизованным рецептором, антителом или членом, соответственно, вызывая изменение в показателе преломления среды, который определяют как изменение поверхностного плазменного резонанса золотой пленки. Данная система позволяет определить верхние и нижние границы, на основании которых может быть рассчитано связывающее сродство, и оценить стехиометрию связывания. Альтернативно, лиганд/рецепторное связывание может быть проанализировано с применением способа 8ЕББ1(ТМ) (С1рйегдеп, 1пс., Ра1о А11о, СА). Более того, способ В1АСОКЕ, описанный выше, может быть применен в экспериментах по конкуренции для определения, связываются ли различные моноклональные антитела с одними и теми же или различными эпитопами на полипептиде ЕБ-22КА, и могут ли в таком случае применяться с целью картирования эпитопов нейтрализующих антител настоящего изобретения, которые связывают, блокируют, снижают, проявляют антагонистическое действие или нейтрализуют 1Ь-22 или как 1Ь-20, так и 1Б-22.
Связывающие лиганд рецепторные полипептиды могут также применяться в других системах тестирования, известных в данной области. Такие системы включают скетчардовский анализ для определения связывающего сродства (см., 8са1сйатб, Апп. ΝΥ Асаб. 8сЕ 51: 660-72, 1949) и калориметрические тесты (Сипшпдйат е1 а1., 8аепсе 253:545-48, 1991; Сипшпдйат е1 а1., 8с1епсе 245:821-25, 1991).
В настоящем изобретении дополнительно предлагается множество других гибридных полипептидов и относящихся к ним мультимерных белков, включающих один или более гибридных полипептидов. Например, растворимый рецептор 6Б-22КА может быть получен в виде гибрида с димеризующимся белком, как раскрыто в патентах США № 5155027 и 5567584. Предпочтительные димеризующиеся белки в данном отношении включают домены константных областей иммуноглобулинов, например, 1§Су1, и легкая цепь к человека. Гибриды иммуноглобулин-растворимый 1Ь-22КА могут быть экспрессированы в клетках с генетическими конструктами для получения множества мультимерных аналогов рецептора 1Ь22КА. С растворимым рецептором 6Б-22КА могут быть соединены вспомогательные домены для направления его к конкретным клеткам, тканям или макромолекулам (например, коллагену или клеткам, экспрессирующим лиганды 6Б-22КА, 6Б-22 или 6Б-20). Полипептид 6Б-22КА может быть гибридизован с двумя или более частями, такими как аффинная метка для очистки и направляющий домен. Гибридные полипептиды могут также включать один или более сайтов расщепления, особенно между доменами. См., Тиап е1 а1., Соппесбге Тйкие КекеатсЬ 34:1-9,1996.
В бактериальных клетках часто желательно экспрессировать гетерологичный белок в виде гибридного белка для снижения токсичности, увеличения стабильности и повышения открываемости экспрессируемого белка. Например, 6Б-22КА может быть экспрессирован в виде гибридного белка, включающего полипептид глутатион-8-трансферазу. Гибридные белки с глутатион-8-трансферазой обычно растворимы и легко очищаются из лизатов Е. со11 на колонках иммобилизованного глутатиона. В сходных подходах гибридный белок 1Б-22КА, включающий полипептид белка, связывающего мальтозу, может быть выделен на колонках смолы с иммобилизованной амилозой, в то время как гибридный белок, включающий С-конец укороченного гена протеина А, может быть очищен с применением 1дС-Сефарозы. Уста
- 25 009124 новленные способы экспрессии гетерологичного полипептида в виде гибридного белка в бактериальной клетке описываются, например, ^1Шат§ е! а1., «Ехргеззюп οί Εοκί^ Рго!етз т Е. той Изтд Р1азт1б УесЮгз апб РипПса1юп οί 8ресб1с Рοίусίοηаί Αηί^Ьοб^ез,» т ЭХА Οοππ^ 2: А Ргасбса1 Арргоасй, 2пб Ебйюп, 61ο\όγ апб Натез (Ебз.), радез 15-58 (0χΕογ6 Итуегзбу Ргезз 1995). Кроме того, доступны имеющиеся в продаже экспрессионные системы. Например, в системе очистки белка РЮТ0ЮТ Ха (Рготеда Сο^ρο^аΙίοπ; Μаб^зοη. νΙ) предлагается способ выделения гибридного белка, включающего полипептид, который становится биотинилированным при экспрессии, с помощью смолы, которая включает авидин.
Пептидные метки, которые являются пригодными для выделения гетерологичных полипептидов, экспрессируемых либо прокариотными, либо эукариотическими клетками, включают полигистидиновые метки (которые обладают сродством к хелатирующей никель смоле), метки с-тус, кальмодулинсвязывающий белок (выделяемый с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным кальмодулином), вещество Р, метка ΡΥΙΡ8 (которая связывается с антителами против ΚΥΙΚ8), метка С1и-С1и и метка ЕЬАС (которая связывается с антителами против ЕЬАС). См., например, йтю е! а1., Агсй. ΒίοΗκιη. Β^ορйуз. 329:215 (1996), Μο^даη!^ е! а1., Β^ο!есйηο1. Арр1. ΒίοΟκιη. 23:67 (1996), и Хйепд е! а1., Сепе 186:55 (1997). Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие такие пептидные метки, имеются в продаже, например, у 81дта-А1бпсй Сο^ρο^аΐ^οη (8!. Ьсш8, МО).
Другая форма гибридного белка включает полипептид Ш-22ВА и константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, обычно Ес фрагмент, который содержит два или три домена константной области и шарнирную область, но лишен вариабельной области. В качестве иллюстрации Сйапд е! а1., патент США № 5723125, описывают гибридный белок, включающий интерферон человека и Ес фрагмент иммуноглобулина человека. С-конец интерферона соединен с ^концом Ес фрагмента с помощью пептидной линкерной части. Примером пептидного линкера является пептид, включающий в первую очередь инертную в отношении Т-клеток последовательность, которая иммунологически инертна. Иллюстративный пептидный линкер имеет аминокислотную последовательность: СС8СС 8СССС 8СССС 8 (8Еф ΙΌ N0:9). В данном гибридном белке иллюстративной частью Ес является γ4 цепь человека, которая является стабильной в растворе и не обладает или обладает низкой активностью в отношении активации комплемента. Соответственно, настоящее изобретение охватывает гибридный белок Ш-22КА, который включает часть Ш-22ВА и Ес фрагмент человека, где С-конец части I^-22ВΑ присоединен к №концу Ес фрагмента через пептидный линкер, такой как пептид, включающий аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:4. Частью Ш-22ВА может быть молекула Ш-22ВА или ее фрагмент. Например, гибридный белок может включать аминокислоту 8Еф ΙΌ N0:3 и Ес фрагмент (например, Ес фрагмент человека) (8ЕУ) ΙΌ N0: 4).
В другом варианте гибридный белок Ш-22КА включает последовательность ^С, часть I^-22ВΑ. ковалентно связанную с аминоконцом последовательности ^С, и сигнальный пептид, который ковалентно присоединен к аминоконцу части Ш-22КА, где последовательность ^С состоит из следующих элементов в следующем порядке: шарнирная область, домен СН2 и домен СН3. Соответственно, последовательность ^С лишена домена СН1. Часть I^-22ВΑ проявляет активность Ш-22ВА, как здесь описано, такую как способность связываться с лигандом Ш-22ВА. Данный общий подход для получения гибридных белков, которые включают части как антитела, так и не антитела, описан ^аВοсйе11е е! а1., европейский патент ЕР 742830 (ν0 95/21258).
Гибридные белки, включающие часть Ш-22ВА и часть Ес, могут быть использованы, например, как средство тестирования шуйго. Например, присутствие лиганда I^-22ВΑ в биологическом образце может быть определено с применением гибридного белка Ш^ВА-иммуноглобулин, в котором часть Ш-22ВА применяют для связывания лиганда, а макромолекулу, такую как протеин А или антитело против Ес, применяют для связывания гибридного белка с твердым носителем. Такие системы могут применяться для идентификации агонистов и антагонистов, которые мешают связыванию лигандов Ш-22ВА, например, Ш-22 или как Ш-20, так и Ш-22, со своим рецептором.
Другие примеры белков гибридов с антителами включают полипептиды, которые включают антиген-связывающий домен и фрагмент I^-22ВΑ. который содержит внеклеточный домен I^-22ВΑ. Такие молекулы могут применяться для направленной доставки к конкретным тканям для улучшения связывающей активности I^-22ВΑ.
В настоящем изобретении дополнительно предлагается множество других гибридных полипептидов. Например, часть или все домен(ы), представляющий(ие) биологическую функцию, могут быть обменены с I^-22ВΑ настоящего изобретения функционально эквивалентным(ыми) доменом(ами) от другого члена семейства рецепторов цитокинов. Гибридные полипептиды могут быть экспрессированы в рекомбинантных клетках-хозяевах для продукции множества гибридных аналогов I^-22ВΑ. Полипептид Ш^ВА может быть соединен с двумя или более частями или доменами, такими как аффинная метка, для очистки и направленной доставки домена. Гибридные полипептиды могут также включать одно или более сайтов расщепления, особенно между доменами. См., например, Тиап е! а1., «'οπικ^ίλΌ Т1ззие Везеагсй 34:1 (1996).
Гибридные белки могут быть получены с помощью способов, известных специалистам в данной области, путем получения каждого компонента гибридного белка и их химической конъюгации. Альтер
- 26 009124 нативно, полинуклеотид, кодирующий гибридный белок в подходящей рамке считывания, может быть создан с применением известных способов и экспрессирован с помощью описанных здесь способов. Обычные способы для ферментативного и химического расщепления гибридных белков описаны, например, АикиЬе1 (1995) стр. с 16-19 по 16-25.
Домены, связывающие I^-22ВЛ, могут быть дополнительно охарактеризованы с помощью физического анализа структуры, что определяется такими методами, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, дифракция электронов или фотоаффинное промечивание, в сочетании с мутацией аминокислот предполагаемого сайта контакта агонистов лиганда [^-22ВЛ. См., например, бе Уок е! а1., 8аепсе 255:306 (1992), 811111Ι1 е! а1., б. Мо1. Вю1. 224:899 (1992), и №1обауег е! а1., ЕЕВ8 Ьей. 309:59 (1992).
Настоящее изобретение охватывает также химически модифицированные композиции I^-22ВЛ, в которых полипептид I^-22ВЛ соединен с полимером. Примерами полипептидов [^-22ВЛ являются растворимые полипептиды, которые лишены функционального трансмембранного домена, так что полипептид состоит из аминокислотных остатков 8ЕО ΙΌ N0:3. Обычно полимер является водорастворимым, так что конъюгат I^-22ВЛ не осаждается в водной среде, такой как физиологическая среда. Примером подходящего полимера является такой, который модифицирован так, чтобы иметь одну реакционноспособную группу, такую как активный сложный эфир для ацилирования или альдегид для алкилирования. Таким способом может контролироваться степень полимеризации. Примером реакционноспособного альдегида является пропионовый альдегид полиэтиленгликоля или его моно-(С1-С10)-алкокси или арилоксипроизводные (см., например, Натк, е! а1., патент США № 5252714). Полимер может быть разветвленным или не разветвленным. Более того, для получения конъюгатов к-22 В А может быть применена смесь полимеров.
Конъюгаты [^-22ВЛ. применяемые в терапии, могут включать фармацевтически приемлемые водорастворимые полимерные части. Подходящие водорастворимые полимеры включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), монометокси-ПЭГ, моно-(С1-С10)-алкокси-ПЭГ, арилокси-ПЭГ, поли-(И-винилпирролидон)ПЭГ, трезилмонометокси-ПЭГ, пропиональдегид-ПЭГ, бис-сукцинимидилкарбонат-ПЭГ, гомополимеры пропиленгликоля, полипропиленоксид/этиленоксид сополимер, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт, декстран, целлюлозу или другие полимеры на основе углеводородов. Подходящий ПЭГ может иметь молекулярную массу от приблизительно 600 до приблизительно 60000, включая, например, 5000, 12000, 20000 и 25000. Конъюгат Е^ВА может также включать смесь таких водорастворимых полимеров.
Один пример конъюгата [^-22ВЛ включает часть Е^ВА и полиалкилоксидную часть, присоединенную к Жконцу части [^-22ВЛ. ПЭГ является одним из подходящих полиалкилоксидов. В качестве иллюстрации, [^-22ВЛ может быть модифицирован ПЭГ, процесс, известный как «ПЭГилирование». ПЭГилирование [^-22ВЛ может быть осуществлено с помощью любой из реакций ПЭГилирования, известных в данной области техники (см., например, европейский патент ЕР 0154316, Эе1дабо е! а1., Сй!юа1 Ве\зе\\'к ш ТБегареийс Эгид Сатег 8ук!етк 9:249 (1992), Эппсам апб 8ргеайсо, С1ш. РБагтасокше!. 27:290 (1994), и Егапак е! а1., Ш! б Нета!о1 68:1 (1998)). Например, ПЭГилирование может быть осуществлено с помощью реакции ацилирования или с помощью реакции алкилирования с реакционноспособной молекулой полиэтиленгликоля. При альтернативном подходе конъюгаты Е^ВА образуются путем конденсации активированного ПЭГ, в котором концевая гидрокси- или аминогруппа ПЭГ замещена активированным линкером (см., например, Кагак1е\\зс/ е! а1., патент США № 5382657).
ПЭГилирование с помощью ацилирования обычно требует взаимодействия активного эфирного производного ПЭГ с полипептидом [^-22ВЛ. Примером активированного эфира ПЭГ является ПЭГ, эстерифицированный до Жгидроксисукцинимида. Применяемый здесь термин «ацилирование» включает следующие типы связей между [^-22ВЛ и растворимым в воде полимером: амидные, карбаматные, уретановые и тому подобное. Способы получения ПЭГилированного к-22 В А с помощью ацилирования должны обычно включать стадии (а) взаимодействия полипептида Е^ВА с ПЭГ (таким как реакционноспособный сложный эфир альдегидного производного ПЭГ) в условиях, при которых одна или более групп ПЭГ присоединяется к [^-22ВЛ. и (Ь) получения продукта(ов) реакции. Обычно оптимальные условия реакции для реакций ацилирования должны определяться на основе известных параметров и желаемых результатов. Например, чем выше отношение ПЭГ:[^-22ВЛ. тем больше процент полиПЭГилированного продукта Е^ВА.
Продуктом ПЭГилирования с помощью ацилирования обычно является полиПЭГилированный продукт [^-22ВЛ. где ε-аминогруппы лизина ПЭГилированы через ацильную линкерную группу. Примером соединяющего линкера является амид. Обычно полученный в результате [^-22ВЛ должен быть, по меньшей мере, на 95% моно-, ди- или трипэгилирован, хотя в зависимости от условий реакции могут образовываться некоторые виды с более высокими степенями ПЭГилирования. ПЭГилированные виды могут быть отделены от неконъюгированных полипептидов [^-22ВЛ при применении стандартных способов очистки, таких как диализ, ультрафильтрация, ионообменная хроматография, аффинная хроматография и тому подобное.
- 27 009124
ПЭГилирование с помощью алкилирования обычно включает взаимодействие концевого альдегидного производного ПЭГ с 1Б-22КА в присутствии восстанавливающего агента. Группы ПЭГ могут быть присоединены к полипептиду через -СН2-NН-группу.
Более того, антитела против 1Б-22КА или фрагменты антител настоящего изобретения могут быть ПЭГилированы с применением известных в данной области и описанных здесь способов.
Создание производных через восстановительное алкилирование для получения моноПЭГилированного продукта имеет преимущества в отношении различной реактивности различных типов первичных аминогрупп, доступных для дериватизации. Обычно реакцию проводят при рН, который позволяет иметь преимущество в различиях рКа между ε-аминогруппами остатков лизина и α-аминогруппой Ν-концевого остатка белка. С помощью такой избирательной дериватизации контролируется присоединение растворимого в воде полимера, который содержит реакционноспособную группу, такую как альдегид, к белку. Конъюгация с полимером осуществляется преимущественно на Ν-конце белка без существенной модификации других реакционноспособным групп, таких как аминогруппы боковой цепи лизина. В настоящем изобретении предлагается по существу гомогенный препарат монополимерных конъюгатов 1Ь22КА.
Восстановительное алкилирование для получения по существу гомогенной популяции молекул монополимерных конъюгатов 1Б-22КА может включать стадии: (а) взаимодействия полипептида 1Б-22КА с реакционноспособньм ПЭГ в условиях восстановительного алкилирования при рН, который дает возможность избирательной модификации α-аминогруппы на аминоконце 1Б-22КА, и (Ь) получения продукта(ов) реакции. Восстанавливающий агент, применяемый для восстановительного алкилирования, должен быть стабильным в водном растворе и способным восстанавливать только основание Шиффа, образуемое в начале процесса восстановительного алкилирования. Примеры восстанавливающих агентов включают боргидрид натрия, цианоборгидрид натрия, диметиламинборан, триметиламинборан и пиридинборан.
Для по существу гомогенной популяции монополимерных конъюгатов 1Б-22КА условия реакции восстановительного алкилирования являются таковыми, что дают возможность избирательного присоединения водорастворимой полимерной части к Ν-концу 1Б-22КА. Такие условия реакции обычно предусматривают различия в рКа между аминогруппами лизина и α-аминогруппой на Ν-конце. рН также влияет на планируемое соотношение полимера к белку. В целом, если рН является более низким, больший избыток полимера по отношению к белку должен быть желательным из-за менее реакционноспособной Ν-концевой α-группы, больше полимера необходимо для достижения оптимальных условий. Если рН является более высоким, соотношение полимер:Ш-22КА может не быть таким высоким, потому что доступны более реакционноспособные группы. Обычно рН должен находиться в диапазоне от 3 до 9 или от 3 до 6. Данный способ может быть применен для создания включающих 1Б-22КА гомодимерных, гетеродимерных или мультимерных конъюгатов растворимого рецептора.
Другим рассматриваемым фактором является молекулярная масса водорастворимого полимера. Обычно чем выше молекулярная масса полимера, тем меньше количество молекул полимера, которое может быть присоединено к белку. Для реакций ПЭГилирования обычная молекулярная масса составляет от приблизительно 2 кДа до приблизительно 100 кДа, от приблизительно 5 кДа до приблизительно 50 кДа или от приблизительно 12 кДа до приблизительно 25 кДа. Молярное отношение водорастворимого полимера к 1Б-22КА обычно должно находиться в диапазоне от 1:1 до 100:1. Обычно молярное отношение водорастворимого полимера к 1Б-22КА должно составлять от 1:1 до 20:1 для ПЭГилирования и от 1:1 до 5:1 для моноПЭГилирования.
Общие способы получения конъюгатов, включающих части полипептида и водорастворимого полимера, известны в данной области. См., например, Кагак1е\у|с/ е! а1., патент США № 5382657, Сгееп\уа1б е! а1., патент США № 5738846, №еГог111 е! а1., С1т. РИагтасо1. ТИег. 59:636 (1996), МопкагкИ е! а1., Апа1. ВюсИет. 247:434 (1997)). Данный способ может применяться для создания включающих 1Б-22КА гомодимерных, гетеродимерных или мультимерных конъюгатов растворимого рецептора.
Настоящее изобретение охватывает композиции, включающие пептид или полипептид, такие как описанные здесь растворимый рецептор или антитело. Такие композиции могут дополнительно включать носитель. Носитель может быть традиционным органическим или неорганическим носителем. Примеры носителей включают воду, буферный раствор, спирт, пропиленгликоль, макроголь, кунжутное масло, кукурузное масло и тому подобное.
7. Выделение полипептидов 1Б-22КА.
Полипептиды настоящего изобретения могут быть очищены, по меньшей мере, приблизительно до 80% чистоты, по меньшей мере, приблизительно до 90% чистоты, по меньшей мере, приблизительно до 95% чистоты или выше чем 95%, такой как 96, 97, 98% или выше чем 99% чистоты по отношению к загрязняющим макромолекулам, особенно другим белкам и нуклеиновым кислотам, и свободны от инфекционных и пирогенных агентов. Полипептиды настоящего изобретения могут также быть очищены до фармацевтически чистого состояния, которое составляет больше, чем 99,9% чистоты. В определенных
- 28 009124 препаратах очищенный полипептид является, по существу, свободным от других полипептидов, особенно от других полипептидов животного происхождения.
Фракционирование и/или другие общепринятые способы очистки могут быть использованы для получения препаратов очищенного ББ-22ВА из природных источников (например, тканевых источников человека), синтетических полипептидов ББ-22ВА и рекомбинантных полипептидов ББ-22ВА, а также гибридных полипептидов ББ-22ВА, очищенных из рекомбинантных клеток-хозяев. В целом для фракционирования образцов может быть использовано осаждение сульфатом аммония и кислая или хаотропная экстракция. Примеры стадий очистки могут включать гидроксиапатит, исключение по размеру, РРЬС и высокоэффективную жидкостную хроматографию с обращенной фазой. Подходящие хроматографические среды включают дериватизированные декстраны, агарозу, целлюлозу, полиакриламид, специальные кремнеземы и тому подобное. Подходят производные РЕБ, ПЕЛЕ, ЦАЕ и О. Примеры хроматографических сред включают те среды, которые дериватизированы фенильными, бутильными или октильными группами, такие как Рйепу1-8ерйагоке РР (Рйагтааа), Тоуореаг1 ЬиБу1 650 (Токо Наак, МопБдотегууШе, РА), ОсБу1-8ерйагоке (РйагтасБа) и тому подобное; или полиакриловые смолы, такие как АтЬегсйгот СС 71 (Токо Наак) и тому подобное. Подходящие твердые носители включают стеклянные шарики, смолы на основе кремнезема, целлюлозные смолы, агарозные шарики, шарики поперечно сшитой агарозы, полистироловые шарики, поперечно сшитые полиакриламидные смолы и тому подобное, которые нерастворимы в тех условиях, в которых они применяются. Данные носители могут быть модифицированы реакционноспособными группами, которые позволяют присоединение белков с помощью аминогрупп, карбоксильных групп, сульфгидрильных групп, гидроксильных групп и/или углеводных частей.
Примеры химических способов присоединения включают активацию цианогенбромидом, активацию Ν-гидроксисукцинимидом, активацию эпоксидом, сульфгидрильную активацию, гидразидную активацию и карбоксильные и аминопроизводные для химических способов присоединения с помощью карбодиимида. Данные и другие твердые среды хорошо известны и широко используются в данной области и доступны из коммерческих источников. Выбор конкретного способа выделения и очистки полипептида является делом обычной техники и определяется частично свойствами выбранного носителя. См., например. МББпББу СйготаБодгарйу: РгшсБр1ек & МеБйобк (РйагтасБа ЬКВ ВБоБесйпо1оду 1988), и Эоопап, РгоБеш РииББсаБюп РгоБосо1к (Тйе Нитапа Ргекк 1996).
Специалистами в данной области могут быть разработаны дополнительные варианты выделения и очистки ББ-22ВА. Например, антитела против ББ-22ВА, полученные как описано ниже, могут быть использованы для выделения больших количеств белка с помощью иммуноаффинной очистки.
Полипептиды настоящего изобретения могут быть также выделены с использованием их конкретных свойств. Например, хроматография с адсорбцией иммобилизованных ионов металла (БМАС) может быть применена для очистки белков, обогащенных гистидином, включая те, которые включают полигистидиновые метки. Кратко, гель сначала нагружают двухвалентными ионами металла для образования хелатов (8и1ко^ккБ, Тгепбк Бп ВБосйет. 3:1 (1985)). Белки, обогащенные гистидином будут адсорбироваться данным матриксом с различным сродством в зависимости от применяемого иона металла, и будут элюироваться путем конкурентной элюции, понижения рН или применения сильных хелатирующих агентов. Другие способы очистки включают очистку гликозилированных белков с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным лектином и ионообменной хроматографии (М. ОеиБксйег, (еб.), МеБй. Епхуто1. 182:529 (1990)). В дополнительных осуществлениях изобретения может быть сконструирован гибрид интересующего полипептида и аффинной метки (например, связывающего мальтозу белка, домена иммуноглобулина) для облегчения очистки. Более того, лиганд-связывающие свойства внеклеточного домена ББ-22ВА могут быть использованы для очистки, например, содержащих ББ-22ВА растворимых рецепторов; например, с помощью применения аффинной хроматографии, при которой лиганд БЬ22 связан с колонкой и содержащий ББ-22ВА рецептор связан и затем элюируется с применением стандартных хроматографических способов.
Полипептиды ББ-22ВА или их фрагменты могут быть также получены с помощью химического синтеза, как описано выше. Полипептиды ББ-22ВА могут быть мономерами или мультимерами; гликозилированными или не гликозилированными; ПЭГилированными или не ПЭГилированными; и могут включать или не включать инициирующий остаток аминокислоты метионина.
8. Получение антител против белков ББ-22ВА.
Антитела против ББ-22ВА могут быть получены, например, с применением в качестве антигена продукта ББ-22ВА экспрессионного вектора, или ББ-22ВА, выделенного из природного источника. Особенно пригодные антитела против ББ-22ВА «связываются специфически» с ББ-22ВА. Антитела рассматриваются как специфически связывающиеся, если антитела проявляют по меньшей мере одно из следующих двух свойств: (1) антитела связываются с ББ-22ВА с пороговым уровнем связывающей активности, и (2) антитела не имеют существенных перекрестных реакций с полипептидами, относящимися к БЬ22ВА.
В отношении первой характеристики, антитела специфически связываются, если они связываются с полипептидом, пептидом или эпитопом ББ-22ВА со связывающим сродством (Ка) 106 М-1 или более, предпочтительно 107 М-1 или более, более предпочтительно 108 М-1 или более и наиболее предпочтитель- 29 009124 но 109 М-1 или более. Связывающее сродство антитела может быть легко определено специалистом в данной области, например, с помощью скетчардовского анализа (8са!сБагб, Апп. ΝΥ Асаб. 8а. 51:660 (1949)). В отношении второй характеристики, антитела не имеют существенных перекрестных реакций с родственными полипептидными молекулами, например, если они определяют 1Ь-22ЯА, но не известные в настоящее время полипептиды при применении стандартного анализа путем Вестерн-блоттинга. Примеры известных родственных полипептидов включают известные рецепторы цитокинов.
Антитела против 1Б-22КА могут быть получены с применением антигенных пептидов или полипептидов, несущих эпитоп 1Б-22КА. Антигенные несущие эпитоп пептиды или полипептиды настоящего изобретения содержат последовательность по меньшей мере из девяти или между 15 и приблизительно 30 аминокислотами, содержащимися в 8Εβ ΙΌ N0:3 или другой раскрытой здесь аминокислотной последовательности. Однако пептиды или полипептиды, включающие более крупную часть аминокислотной последовательности изобретения, содержащие от 30 до 50 аминокислот, или любой длины до и включая полную аминокислотную последовательность полипептида изобретения, также пригодны для индукции антител, которые связываются с 1Б-22КА. Желательно, чтобы аминокислотная последовательность несущего эпитоп пептида выбиралась с обеспечением существенной растворимости в водных растворителях (т.е. последовательность включала относительно гидрофильные остатки, в то время как гидрофобных остатков обычно избегали). Более того, аминокислотные последовательности, содержащие остатки пролина, также могут быть желательными для выработки антител.
В качестве иллюстрации потенциальные антигенные сайты в 1Б-22КА были идентифицированы с применением способа 1ашекоп-Ао1£, 1ашекоп апб Ао1Г, САВ1О8 4:181, (1988), выполняемого с помощью программы ΡΚΌΤΕΑN (версия 3.14) ^Α8ΕКСΕNΕ (^NΑ8ΤΑК; Маб1коп, ΑΙ). В данном анализе применяли параметры по умолчанию.
Способ .Гатекоп-АоК предсказывает потенциальные антигенные детерминанты с помощью объединения шести главных подпрограмм для предсказания структуры белка. Кратко, сначала был применен способ Норр-Аообк, Норр е! а1., Ргос. №11'1 Асаб. 8сЕ И8А 78:3824 (1981), для идентификации аминокислотных последовательностей, представляющих области наибольшей локальной гидрофильности (параметр: в среднем семь остатков). На второй стадии был применен способ Етш1, Ειηίπί е! а1., 1. У1го1оду 55:836 (1985), для расчета вероятностей поверхностей (параметр: порог выбора поверхностей (0,6) = 1). На третьей стадии был применен способ Кагр1ик-8сБи1!/, Кагр1ик апб 8сБи1!/, №!игМккепксБаГ!еп 72:212 (1985), для предсказания гибкости каркаса цепи (параметр: порог гибкости (0,2) = 1). На четвертой и пятой стадиях анализа предсказания вторичной структуры применяли к данным, используя способы СБоиРактап, СБои, «Ргебюйоп оГ Рго!еш 8!гис!ига1 С1аккек Ггош Атшо Ааб Сотрокйюп», ш Ргебю!юп оГ Рго!еш 8!гис!иге апб (Не Ргтар1ек оГ Рго!еш Соп£огта!юп, Рактап (еб.), радек 549-586 (Р1епит Ргекк 1990), апб Сагшег-КоБкоп, Сагшег е! а1., 1. Мо1. Вю1. 120:97 (1978) (параметры СБои-Рактап: таблица конформаций = 64 белка; порог α области=103; порог β области = 105; параметры Сагшег-КоЬкоп: константы выбора = 0). В шестой подпрограмме параметры гибкости и факторы гидрофобности/доступности растворителю объединяли для определения величины контура поверхности, обозначаемой как «антигенный индекс». Наконец, к антигенному индексу применяли функцию расширения пика, которая расширяет главные пики поверхности путем добавления 20, 40, 60 или 80% от величины соответствующего пика для расчета дополнительной свободной энергии, возникающей из-за подвижности областей поверхности по отношению к внутренним областям. Данный расчет, однако, не применялся к любому главному пику, расположенному в области спирали, так как области спирали имеют тенденцию к меньшей гибкости.
Результаты данного анализа показали, что следующие аминокислотные последовательности 8Εβ ΙΌ NО:3 должны дать подходящие антигенные пептиды: профили гидрофильности Норр/Аообк могут быть использованы для определения областей, которые имеют наибольший антигенный потенциал в 8Εβ ΙΌ NО:3 (Норр е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8сЕ 78:3824-3828, 1981; Норр, 1. Iтшиη. Ме!Б. 88:1-18, 1986 и Тпс.|иег е! а1., Рго!еш Εηд^ηее^^ηд 11:153-169, 1998). Профиль основывается на скользящем окне в шесть остатков. Внутренние остатки С, 8 и Т и экспонируемые остатки Н, Υ и А игнорировались. Более того, антигенные эпитопы ГЬ-22КА в 8Εβ ΙΌ NО:3, как предсказано графиком 1атекоп-Ао1Г, например, с применением программы ^NΑ8ΤΑК Рго!еап (^NΑ8ΤΑК. Шс., Маб1коп, АТ), служат в качестве предпочтительных антигенных эпитопов и могут быть определены специалистом в данной области. Такие антигенные эпитопы включают (1) аминокислотные остатки с 1 (Рго) по 6 (Акр) 8Εβ ΙΌ NО 3; (2) аминокислотные остатки с 26 (8ег) по 32 (Рго) 8Εβ ΙΌ NО 3; (3) аминокислотные остатки с 41 (Ьук) по 47 (Акр) 8Εβ ΙΌ NО 3; (4) аминокислотные остатки с 49 (Уа1) по 62 (Сук) 8Εβ ΙΌ NО 3; (5) аминокислотные остатки с 41 (Ьук) по 62 (Сук) 8ΕΟ ΙΌ NО 3; (6) аминокислотные остатки с 84 (А1а) по 97 (8ег) 8Εβ ΙΌ NО 3; (7) аминокислотные остатки с 103 (ТНг) по 108 (Акр) 8Εβ ΙΌ NО:3; (8) аминокислотные остатки с 130 (Агд) по 135 (Н1к) 8ΕΟ ΙΌ NО:3; (9) аминокислотные остатки с 164 (С1у) по 166 (Ьук) 8Εβ ΙΌ NО:3; (10) аминокислотные остатки с 175 (Туг) по 179 (С1и) 8Εβ ΙΌ NО:3; (11) аминокислотные остатки с 193 (Ьук) по 196 (А1а) 8ΕΟ ΙΌ NО:3; (12) аминокислотные остатки с 203 (Ьук) по 209 (ТНг) 8Εβ ΙΌ NО:3. Настоящее изобретение относится к применению любого антигенного пептида с 1 до 12 для получения антител против ГЬ-22КА или в качестве набора для скрининга или идентификации нейтрализации моноклональных антител настоящего изобретения. Настоящее изобретение охватывает также полипептиды, включающие по
- 30 009124 меньшей мере один антигенный пептид с 1 по 10. Настоящее изобретение охватывает применение любых описанных здесь антигенных пептидов или эпигонов для создания антител против 1Ь-22КА, а также для идентификации и скрининга моноклональных антител против 1Ь-22КА, которые являются нейтрализующими и которые могут связывать, блокировать, ингибировать, снижать, проявлять антагонистическое действие или нейтрализовать активность 1Ь-22 и 1Ь-20 (раздельно или совместно).
Более того, подходящие антигены включают также полипептиды 1Ь-22КА, включающие связывающий цитокины или внеклеточный домен 1Ь-22КА, раскрытый выше, в сочетании с другим внеклеточным доменом класса I или II цитокинов, таким как тот, который образует растворимые гетеродимерные или мультимерные полипептиды ЕЕ-22КА, такие как растворимые ГЕ-22КА/СКР2-4, ГЬ22КА/хсуЮг1Е [Е-22КА/хсу1ог7 и тому подобное.
Поликлональные антитела к рекомбинантному белку ЕЕ-22КА или к ЕЕ-22КА, выделенному из природных источников, могут быть получены с применением способов, хорошо известных специалистам в данной области. См., например, Огееи е( а1., «Ргобисйои о£ Ро1ус1оиа1 Аийкега», ίη [ттиηοсНет^са1 Рго!осо1к (Маикои, еб.), радек 1-5 (Нитаиа Ргекк 1992), и ХУПНатк е( а1., «Ехргеккюи о£ £оге1ди рго!ешк ίη Ε. сой икшд р1акт1б уесЮгк аиб рипДсайои о£ кресШс ро1ус1оиа1 аийЬоб1ек», ίη ^NΑ С1ошид 2: Ехргеккюи 8ук!етк, 2иб Ебйюи, С1огег е( а1. (ебк.), раде 15 (0х£огб ишуегкйу Ргекк 1995). Иммуногенность полипептида ЕЕ-22КА может быть увеличена путем применения адъюванта, такого как квасцы (гидроксид алюминия) или полный или неполный адъювант Фрейнда. Полипептиды, пригодные для иммунизации, также включают гибридные полипептиды, такие как гибриды ЕЕ-22КА или его части с иммуноглобулиновым полипептидом или связывающим мальтозу белком. Полипептидный иммуноген может быть полноразмерной молекулой или ее частью. Если полипептидная часть является «гаптеноподобной», такую часть может быть выгодно для иммунизации присоединить или связать с макромолекулярным носителем (таким как гемоцианин моллюска фиссуреллии (КЕН), бычий сывороточный альбумин (БСА) или столбнячный анатоксин).
Хотя поликлональные антитела обычно вырабатываются у животных, таких как лошади, коровы, собаки, цыплята, крысы, мыши, кролики, морские свинки, козы или овцы, антитело против ЕЕ-22КА настоящего изобретения может также происходить от антитела не человекообразных приматов. Обычные способы выработки диагностически и терапевтически пригодных антител у бабуинов могут быть найдены, например, у Оо1беиЬегд е( а1., международная патентная публикация № ХУ0 91/11465, и у Ьоктаи е( а1., Л!. 1. Саисег 46:310 (1990).
Альтернативно, могут быть созданы моноклональные антитела против ЕЕ-22КА. Моноклональные антитела к специфическим антигенам у грызунов могут быть получены с помощью способов, известных специалистам в данной области (см., например, КоЫег е( а1., МШге 256:495 (1975), Сойдаи е( а1. (ебк.), СиггеШ Рго(осо1к ίη Iттииο1οду, Уо1. 1, радек 2.5.1-2.6.7 (Йо1т ХУПеу & 8оик 1991) [Сойдаи], Рюкк1еу е( а1., Ргобисйои о£ тоиос1оиа1 аийЬоЛек адашк! рго!ешк ехргеккеб ίη Е. сой ίη ^NΑ С1ошид 2: Ехргеккюи 8ук!етк, 2иб Ебйюи, С1огег е( а1. (ебк.), раде 93 (0х£огб ишуегкйу Ргекк 1995)).
Кратко, моноклональные антитела могут быть получены путем введения мышам композиции, включающей продукт гена ЕЕ-22КА, подтверждения наличия продукции антител с помощью взятия образца сыворотки, удаления селезенки для получения β-лимфоцитов, слияния β-лимфоцитов с клетками миеломы для получения гибридом, клонирования гибридом, выбора позитивных клонов, которые продуцируют антитела к антигену, культивирования клонов, которые продуцируют антитела к антигену, и выделения антител из гибридомных культур.
Кроме того, антитело против ЕЕ-22КА настоящего изобретения может происходить от моноклонального антитела человека. Моноклональные антитела человека получают от трансгенных мышей, которые созданы для продукции специфических антител человека в ответ на нагрузку антигеном. В данном способе элементы локуса тяжелой и легкой цепей человека вводят линиям мышей, происходящим от линий эмбриональных стволовых клеток, которые содержат направленные разрывы эндогенных локусов тяжелой цепи и легкой цепи. Трансгенные мыши могут синтезировать антитела человека, специфичные в отношении антигенов человека, и мыши могут использоваться для получения гибридом, секретирующих антитела человека. Способы получения антител человека от трансгенных мышей описаны, например, Огееи е! а1., №11иге Оеие!:. 7:13 (1994), ЬоиЬегд е! а1., №1иге 368: 56 (1994), и Тау1ог е! а1., Л!. Iттии. 6:579 (1994).
Моноклональные антитела могут быть выделены и очищены из гибридомных культур с помощью множества хорошо известных способов. Такие способы выделения включают аффинную хроматографию на протеин-А Сефарозе, исключающую по размеру хроматографию и ионообменную хроматографию (смотри, например, Сойдаи а! радек 2.7.1-2.7.12 аиб радек 2.9.1-2.9.3; Ватек е! а1., «Ршгйсайои о£ Iттииод1оЬийи О ЦдО),» ίη МеЛобк ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 10, радек 79-104 (Тйе Нитаиа Ргекк, Лс. 1992)).
Для практических целей может быть желательно получение фрагментов антител против ЕЕ-22КА. Такие фрагменты антител могут быть получены, например, с помощью протеолитического гидролиза антитела. Фрагменты антител могут быть получены с помощью гидролиза полного антитела пепсином или папаином путем традиционных способов. В качестве иллюстрации, фрагменты антител могут быть получены с помощью ферментативного расщепления антител пепсином с получением 58 фрагментов,
- 31 009124 обозначаемых Г(аЬ')2. Данный фрагмент может быть дополнительно расщеплен с применением восстанавливающего тиол агента с получением одновалентных 3,58 фрагментов ГаЬ'. Необязательно, реакция расщепления может осуществляться с применением блокирующей группы для сульфгидрильных групп, которые получаются в результате расщепления дисульфидных связей. В качестве альтернативы, ферментативное расщепление с применением пепсина непосредственно дает два одновалентных ГаЬ фрагмента и Гс фрагмент. Данные способы описаны, например, Со1бепЬегд, патент США № 4331647, №копоГГ е! а1., АгсН Вюсйет. Вюрйук. 89:230 (1960), Ройег, Вюсйет. 1. 73:119 (1959), Ебе1тап е! а1., ш МеЙюбк ш Епхуто1оду Уо1. 1, раде 422 (Асабетю Ргекк 1967), и Сойдап а! радек 2.8.1-2.8.10 апб 2.10.-2.10.4.
Другие способы расщепления антител, такие как разделение тяжелых цепей с образованием одновалентных фрагментов легкая цепь-тяжелая цепь, дополнительное расщепление фрагментов или другие ферментативные, химические или генетические способы также могут быть применены, до тех пор, пока фрагменты связываются с антигеном, который узнается интактным антителом.
Например, фрагменты Γν включают связанные цепи УН и Уъ. Данная связь может быть нековалентной, как описано ШЬаг е! а1., Ргос. №11'1 Асаб. 8с1. И8А 69:2659 (1972). Альтернативно, вариабельные цепи могут быть соединены межмолекулярным дисульфидным мостиком или перекрестно сшиты с помощью химических соединений, таких как глутаровый альдегид (см., например, 8аηб1ш. Сгй. Кеу. Вю!есй. 12:437 (1992)).
Фрагменты Γν могут включать цепи УН и Уъ, которые связаны пептидным линкером. Данные одноцепочечные антиген-связывающие белки (ксГу) получают как конструкт структурного гена, включающий последовательности ДНК, кодирующие домены УН и Уъ, которые соединены олигонуклеотидом. Структурный ген вставляют в экспрессионный вектор, который затем вводят в клетку-хозяина, такую как Е. сой. Рекомбинантные клетки-хозяева синтезируют одну полипептидную цепь с линкерным пептидом, соединяющим два У домена. Способы получения ксГук описаны, например. \У1Ш1о\у е! а1., Ме!Нобк: А Сотрашоп !о Ме!Нобк ш Епхуто1оду 2:97 (1991) (см. также Вйб е! а1.. 8аепсе 242:423 (1988), Ьабпег е! а1., патент США № 4946778, Раск е! а1., Вю/Тес11по1оду 11:1271 (1993), и 8аибйи, выше).
В качестве иллюстрации, ксГу может быть получен путем экспозиции лимфоцитов с полипептидом ГБ-22КА ш у11го и отбора библиотек представленных антител в фаге или сходных векторах (например, с помощью применения иммобилизованного или меченого белка или пептида ГБ-22КА). Гены, кодирующие полипептиды, обладающие потенциалом доменов, связывающих полипептид ГБ-22КА, могут быть получены путем скрининга рандомизированных пептидных библиотек, представленных в фаге (фаговый дисплей) или в бактериях, таких как Е. сой. Нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды, могут быть получены несколькими способами, такими как рандомизированный мутагенез и рандомизированный полинуклеотидный синтез. Данные библиотеки рандомизированных представленных пептидов могут быть использованы для скрининга пептидов, которые взаимодействуют с известной мишенью, которой может быть белок или полипептид, такой как лиганд или рецептор, биологическая или синтетическая макромолекула, или органические или неорганические вещества. Способы создания и скрининга таких библиотек рандомизированных представленных пептидов известны в данной области (Ьабпег е! а1., патент США № 5223409, Ьабпег е! а1., патент США № 4946778, Ьабпег е! а1., патент США № 5403484, Ьабпег е! а1., патент США № 5571698, и Кау е! а1., РНаде Б1кр1ау оГ Рерйбек апб Рго!етк (Асабетю Ргекк, Шс. 1996)) и библиотеки рандомизированных представленных пептидов и наборы для скрининга таких библиотек имеются в продаже, например, у СЬ0ХТЕСН ЬаЬога!опек, Шс. (Ра1о А1!о, СА) , Шуйгодеп Ью. (8ап Б1едо, СА), №\ν Епд1апб Вю1аЬк, Шс. (Веуег1у, МА), и Рйагтааа ЬКВ Вю1ес11по1оду Шс. (Р1кса!аетау, N1). Для идентификации белков, которые связываются с ГБ-22КА, может быть проведен скрининг библиотек рандомизированных представленных пептидов с применением раскрытых здесь последовательностей ГБ-22КА.
Другая форма фрагмента антитела представляет собой пептид, кодирующий одну область, определяющую комплементарность (СБК). Пептиды СБК (минимальные единицы узнавания) могут быть получены путем конструирования генов, кодирующих СБК интересующего антитела. Такие гены получают, например, при применении полимеразной цепной реакции для синтеза вариабельной области из РНК продуцирующих антитела клеток (см., например, Ьатск е! а1., МеЙюбк: А Сотрашоп !о Ме!Нобк т Епхуто1оду 2:106 (1991), Соипепау-Ьиск, Сепейс Матри1айоп оГ Мопос1опа1 АпйЬоб1ек, т Мопос1опа1 АпйЬоб1ек: Ргобисйоп, Епдтееппд апб Сйшса1 Аррйсайоп, К1йег е! а1. (ебк.), раде 166 (СатЬпбде Ишуегкйу Ргекк 1995), и \Уагб е! а1., Сепейс Матри1а!юп апб Ехргеккюп оГ АпйЬоб1ек, ш Мопос1опа1 АпйЬоб1ек: Рппс1р1ек апб Аррйсайопк, Вйсй е! а1., (ебк.), раде 137 (Уйеу-Ыкк, Шс. 1995)).
Альтернативно, антитело против ГБ-22КА может происходить от моноклонального гуманизированного антитела. Моноклональные гуманизированные антитела получают с помощью переноса мышиных определяющих комплементарность областей от вариабельных областей тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина мыши в вариабельный домен человека. Затем в рамке считывания обычными остатками антител человека заменяют таковые мыши. Применение компонентов антител, происходящих от моноклональных гуманизированных антител, устраняет потенциальные проблемы, связанные с иммуногенностью константных областей мыши. Общие способы клонирования вариабельных доменов иммуноглобулинов мыши описаны, например, 0г1апб1 е! а1., Ргос.№11'1 Асаб. 8ск И8А 86:3833 (1989). Способы полу
- 32 009124 чения моноклональных гуманизированных антител, описаны, например, 1опек е! а1., №!иге 321:522 (1986), Сайег е! а1., Ргос. №!'1 Асаб. 8сг И8А 89:4285 (1992), 8апбИи, Сгй. Кеу. Вю!есИ. 12:437 (1992), 8тдег е! а1., 1. 1ттип. 150:2844 (1993), 8ибИй (еб.), АпйЬобу Епдтеейпд Рго!осо1к (Нитапа Ргекк, 1пс. 1995), Ке11еу, Епдтеейпд ТИегареийс Ап!1Ьоб1ек, ш Рго!еш Епдтеейпд: Ргшс1р1ек апб Ргасйсе, С1е1апб е! а1. (ебк.), радек 399-434 (1оИп Айеу & 8опк, 1пс. 1996), и Оиееп е! а1. патент США № 5693762 (1997).
Более того, антитела против 1Й-22КА или фрагменты антител настоящего изобретения могут быть ПЭГилированы с применением способов, известных в данной области техники, и описанных здесь.
Поликлональные антиидиотипические антитела могут быть получены путем иммунизации животных антителами против 1Й-22КА или фрагментами антител с применением стандартных способов. См., например, Сгееп е! а1., Ргобисйоп о£ Ро1ус1опа1 Апйкега, ш Ме!йобк 1п Мо1еси1аг Вю1оду: 1ттипосИеш1са1 Рго!осо1к, Мапкоп (еб.), радек 1-12 (Нитапа Ргекк 1992). Также см. Сойдап а! радек 2.4.1-2.4.7. Альтернативно, моноклональные антиидиотипические антитела могут быть получены с применением антител против 1Й-22КА или фрагментов антител в качестве иммуногенов с помощью описанных выше способов. В качестве другой альтернативы, гуманизированные антиидиотипические антитела или антиидиотипические антитела нечеловекообразных приматов могут быть получены с помощью описанных выше способов. Способы получения антиидиотипических антител описаны, например, 1гбе, патент США № 5208146, Огеепе, е!. а1., патент США № 5637677, и Уаййакау1 апб МтосИа, 1. Оеп. Уйо1. 77: 1875 (1996).
Антитело против 1Й-22КА может быть конъюгировано с определяемой меткой с образованием иммуноконъюгата против 1Й-22КА. Подходящие определяемые метки включают, например, радиоизотоп, флуоресцентную метку, хемилюминесцентную метку и ферментативную метку, биолюминесцентную метку или коллоидное золото. Способы создания и определения таких иммуноконъюгатов с определяемой меткой хорошо известны специалистам в данной области и описаны более подробно ниже.
Определяемой меткой может быть радиоизотоп, который определяется авторадиографией. Изото3 125 131 35 пы, которые особенно пригодны для цели настоящего изобретения, представляют собой 3Н, 125Ι, 131Ι, 358 и 14С.
Иммуноконъюгаты против 1Й-22КА можно также метить иммунофлуоресцентным соединением. Присутствие флуоресцентно-меченного антитела определяют с помощью экспозиции иммуноконъюгата со светом подходящей длины волны и определения полученной флуоресценции. Флуоресцентномеченные соединения включают изотиоцианат флуоресцеина, родамин, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин, о-фтальдегид и флуоресцамин.
Альтернативно, иммуноконъюгаты против 1Й-22КА могут быть промечены определяемой меткой путем конъюгации компонента антитела с хемилюминесцентным соединением. Присутствие иммуноконъюгата с хемилюминесцентной меткой определяют с помощью определения наличия люминесценции, которая возникает в ходе химической реакции. Примеры хемилюминесцентных соединений-меток включат люминол, изолюминол, сложный эфир ароматического акридиния, имидазол, соль акридиния и сложный эфир щавелевой кислоты.
Сходно, для промечивания иммуноконъюгатов против 1Й-22КА настоящего изобретения может быть применено биолюминесцентное соединение. Биолюминесценция представляет собой тип хемилюминесценции, найденный в биологических системах, в которых каталитический белок увеличивает эффективность хемилюминесцентной реакции. Присутствие биолюминесцентного белка определяют путем определения люминесценции. Биолюминесцентные соединения, которые пригодны для мечения, включают люциферин, люциферазу и акворин.
Альтернативно, иммуноконъюгаты против 1Й-22КА могут быть промечены определяемой меткой путем соединения компонента антитела против 1Й-22КА с ферментом. Когда конъюгат анти-1Ь-22КАфермент инкубируют в присутствии подходящего субстрата, ферментная часть взаимодействует с субстратом с получением химической части, которая может быть определена, например, спектрофотометрическим, флуорометрическим или визуальным способами. Примеры ферментов, которые могут быть использованы для полиспецифических иммуноконъюгатов с определяемой меткой включают βгалактозидазу, глюкозоксидазу, пероксидазу и щелочную фосфатазу.
Специалисты в данной области должны знать другие подходящие метки, которые могут быть применены в соответствии с настоящим изобретением. Связывание маркерных частей с антителами против 1Й-22КА может быть осуществлено с применением стандартных способов, известных в данной области. Типичная в данном отношении методология описана Кеппебу е! а1., Сйп. СЫт. Ас!а 70:1 (1976), 8сИигк е! а1., Сйп. СИ1т. Ас!а 81:1 (1977), 8И1И е! а1., 1п!'1 1. Сапсег 46:1101 (1990), 8!ет е! а1., Сапсег Кек. 50:1330 (1990), и Сойдап, выше.
Более того, удобство и многосторонность иммунохимического определения может быть усилена применением антител против 1Й-22КА, которые конъюгированы с авидином, стрептавидином и биотином (см., например, АйсИек е! а1.(ебк.), Ау1бт-Вюйп ТесИпо1оду, Ме!Иобк 1п Еп/утобду, Уо1. 184 (Асабетю Ргекк 1990), и Вауег е! а1., 1ттипосИет1са1 Аррйсайопк о£ Ау1бт-Вю!т ТесИпо1оду, т Ме!Иобк 1п Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 10, Мапкоп (еб.), радек 149-162 (ТИе Нитапа Ргекк, 1пс. 1992).
Способы выполнения иммуноанализов хорошо установлены. См., например, Соок апб 8ей, Мопос1опа1 АпйЬоб1ек ш Б1адпокйс 1ттипоаккаук, ш Мопос1опа1 АпйЬоб1ек: Ргобисйоп, Епдтеейпд, апб Сйш
- 33 009124 са1 АррЕсаЕоп, Яй!ег апй Ьайутап (ейк.), радек 180-208, (СатЬпйде ип1уегкйу Ргекк, 1995), Реггу, ТЕе Яо1е о£ Мопос1опа1 Ап!1Ьой1ек т 1Не Айуапсетеп! о£ Iттипοаккау ТесЕпо1оду, ш Мопос1опа1 АпЕЬой1ек: Ргшс1р1ек апй Арр1юа!юпк, В1гсЕ апй Ьеппох (ейк.), радек 107-120 (^11еу-Ыкк, Ичс. 1995), и П1атапй1к, Ιπтипоаккау (Асайепис Ргекк, Ичс. 1996).
Настоящее изобретение также охватывает наборы для выполнения иммунологического диагностического теста на экспрессию гена ΙΕ-22ΚΛ. Такие наборы включают по меньшей мере один контейнер, включающий антитело против ГЬ-22ЯА или фрагмент антитела. Набор может также включать второй контейнер, включающий один или более реагентов, способных быть индикаторами присутствия антитела против ΙΕ-22ΚΛ или фрагментов антитела. Примеры таких индикаторных реагентов включают определяемые метки, такие как радиоактивная метка, флуоресцентная метка, хемилюминесцентная метка, ферментативная метка, биолюминесцентная метка, коллоидное золото и тому подобное. Набор может также включать средства для сообщения пользователю о том, что антитела против ГЕ-22КА. или фрагменты антител применяются для определения белка ΙΕ-22ΚΛ. Например, в написанных инструкциях может заявляться, что приложенное антитело или фрагмент антитела может быть применен для определения ГЪ22ЯА. Печатный материал может помещаться прямо в контейнер или печатный материал может предлагаться в форме упакованного вкладыша.
9. Применение антител против ΙΕ-22ΚΛ как антагонистов связывания [Е-22РА с ΙΕ-22 или как с ΙΕ20, так и с Ш-22.
Альтернативные способы создания или отбора пригодных здесь антител включают экспозицию лимфоцитов с растворимыми рецепторными полипептидами ΙΕ-22ΚΛ или их фрагментами, такими как антигенные эпитопы, ш У1!го и отбор библиотек представленных антител в фаге или сходных векторах (например, с помощью применения иммобилизованных или меченых растворимых рецепторных полипептидов ΙΕ-22ΚΛ или их фрагментов, таких как антигенные эпитопы). Гены, кодирующие полипептиды, обладающие потенциалом связывающих доменов, такие как растворимые рецепторные полипептиды Ш22ЯА или их фрагменты, такие как антигенные эпитопы, могут быть получены путем скрининга рандомизированных пептидных библиотек, представленных в фаге (фаговый дисплей) или в бактериях, таких как Е. со11. Нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды, могут быть получены несколькими способами, такими как рандомизированный мутагенез и рандомизированный полинуклеотидный синтез. Данные библиотеки рандомизированных представленных пептидов могут быть использованы для скрининга пептидов, которые взаимодействуют с известной мишенью, которой может быть белок или полипептид, такой как лиганд или рецептор, биологическая или синтетическая макромолекула, или органические или неорганические вещества. Способы создания и скрининга таких библиотек рандомизированных представленных пептидов известны в данной области (Ьайпег е! а1., патент США № 5223409; Ьайпег е! а1., патент США № 4946778; Ьайпег е! а1., патент США № 5403484 и Ьайпег е! а1., патент США № 5571698) и библиотеки рандомизированных представленных пептидов и наборы для скрининга таких библиотек имеются в продаже, например, у С1оп!есЕ (Ра1о А1!о, СА), Iпν^!^οдеп Ичс. (8ап П1едо, СА), №\ν Епд1апй Вю1аЬк, Ичс. (Веуег1у, МА), и РЕагтааа ЬКВ Вю!есЬпо1оду Ичс. (Р1кса!а^ау, N1). Для идентификации белков, которые связываются с рецепторными полипептидами, включающими ΙΕ-22ΚΛ, может быть проведен скрининг библиотек рандомизированных представленных пептидов с применением растворимых рецепторных полипептидов Ш^ЯА или их фрагментов, таких как раскрытые здесь полипептидные последовательности антигенных эпитопов. Данные «связывающие полипептиды», которые взаимодействуют с растворимыми рецепторными полипептидами, включающими Ш^ЯА, могут быть применены для промечивания клеток; для выделения гомологичных полипептидов с помощью аффинной очистки; они могут быть прямо или опосредованно конъюгированы с лекарствами, токсинами, радионуклидами и тому подобное. Данные связывающие пептиды могут быть также применены в аналитических способах, таких как способы скрининга экспрессионных библиотек и нейтрализующей активности, например, в отношении связывания, блокирования, ингибирования, снижения, антагонистического действия или нейтрализации взаимодействия между лигандом ΙΕ-22-ЯА и рецептором, или связывания вируса с рецептором. Связывающие полипептиды могут быть также применены в диагностических тестах для определения циркулирующих уровней растворимых рецепторных полипептидов, включающих №22ЯА; для определения или количественной оценки растворимых или нерастворимых рецепторов, включающих Ш^ЯА, в качестве маркера основной патологии или заболевания. Данные связывающие полипептиды могут также действовать в качестве «антагонистов» для блокирования или ингибирования связывания растворимого или связанного с мембраной мономерного рецептора Ш^ЯА или гомодимерного, гетеродимерного или мультимерного полипептидов Ш^ЯА (например, с лигандом) и передачи сигнала ш У1!го и ш угуо. Кроме того, данные связывающие полипептиды служат в качестве антител против мономерного рецептора Ш^ЯА или гомодимерных, гетеродимерных или мультимерных полипептидов и пригодны для ингибирования активности Ш-22 или как №-20, так и №-22, а также рецепторной активности или связывания белка. Антитела, выработанные к природным рецепторным комплексам настоящего изобретения, и антитела, связывающие эпитоп №-22ЯА, а также нейтрализующие моноклональные антитела против №-22ЯА могут быть предпочтительными осуществлениями, так как они могут действовать против №-22ЯА более специфично и могут ингибировать №-22 или как №-20, так и №-22. Более
- 34 009124 того, антагонистическая и связывающая активность антител настоящего изобретения может быть протестирована по пролиферативной активности 1Ь-20 или 1Ь-22, улавливанию сигнала, люциферазной активности или путем связывающего анализа в присутствие 1Ь-20 или 1Ь-22, соответственно, и растворимых рецепторов, включающих 1Ь-22КА, и в других описанных здесь биологических или биохимических тестах.
Антитела против растворимых рецепторных полипептидов 1Ь-22КА (например, антитела против 8Е0 ΙΌ N0:3) или их фрагментов, таких как антигенные эпитопы, могут быть применены для ингибирования воспалительных эффектов 1Ь-20, 1Ь-22 или как 1Ь-20, так и 1Ь-22 ш νίνο, для терапевтического использования против псориаза, атопического дерматита, воспалительных состояний кожи, эндотоксемии, артрита, астмы, ΙΒΌ, колита, псориазного артрита, ревматоидного артрита или других индуцируемых 1Ь20 и 1Ь-22 воспалительных состояний; для промечивания клеток, которые экспрессируют рецепторы 1Ь22КА; для выделения растворимых рецепторных полипептидов, включающих 1Ь-22КА, с помощью аффинной очистки; для диагностических тестов для определения циркулирующих уровней растворимых рецепторных полипептидов, включающих 1Б-22КА; для определения или количественной оценки растворимых рецепторов, включающих 1Ь-22КА, в качестве маркера основной патологии или заболевания; в аналитических способах, применяющих ЕАС8; для скрининга экспрессионных библиотек; для создания антиидиотипических антител, которые могут действовать в качестве агонистов 1Ь-22 или 1Ь-20; и в качестве нейтрализующих антител или в качестве антагонистов для связывания, блокирования, ингибирования, снижения, антагонистического действия или нейтрализации активности 1Ь-22 и/или 1Ь-20 (либо раздельно, либо совместно) ш νί!Γο и ш νίνο. Подходящие прямые маркеры или метки включают радионуклиды, ферменты, субстраты, кофакторы, биотин, ингибиторы, флуоресцентные маркеры, хемилюминесцентные маркеры, магнитные частицы и тому подобное; непрямые маркеры или метки могут характеризоваться применением биотина-авидина или других пар комплемент/антикомплемент в качестве промежуточных этапов. Описанные здесь антитела могут быть также прямо или опосредованно конъюгированы с лекарствами, токсинами, радионуклидами и тому подобное, и данные конъюгаты используются для диагностического или терапевтического применения ш νίνο. Более того, антитела против растворимых рецепторных полипептидов, включающих 1Ь-22КА, или их фрагментов могут быть применены для определения ш νί!Γο денатурированных или неденатурированных рецепторных полипептидов, включающих 1Б-22КА, или их фрагментов в тестах, например, с помощью Вестерн-блоттинга или других тестов, известных в данной области техники.
Антитела против растворимого рецептора 1Ь-22РА или растворимых гомодимерных, гетеродимерных или мультимерных рецепторных полипептидов 1Ь-22КА пригодны для промечивания клеток, которые экспрессируют соответствующие рецепторы, и для определения уровней экспрессии, для аффинной очистки, в диагностических тестах для определения циркулирующих уровней рецепторных полипептидов, для аналитических методов, применяющих сортировку флуоресцентно-активированных клеток. Более того, двухвалентные антитела и антиидиотипические антитела могут быть использованы в качестве агонистов для имитации эффекта лиганда 1Ь-22КА, 1Ь-22 или 1Ь-20.
Описанные здесь антитела могут быть также прямо или опосредованно конъюгированы с лекарствами, токсинами, радионуклидами и тому подобное, и данные конъюгаты используются для диагностического или терапевтического применения ш νίνο. Например, антитела или связывающие полипептиды, которые узнают растворимый рецептор 1Ь-22КА или растворимые гомодимерные, гетеродимерные или мультимерные рецепторные полипептиды 1Ь-22КА, могут быть применены для идентификации или лечения тканей или органов, которые экспрессируют соответствующую антикомплементарную молекулу (т.е. растворимый или связанный с мембраной рецептор, включающий 1Ь-22КА). Более конкретно, антитела против растворимых рецепторных полипептидов, включающих 1Ь-22КА, или их биологически активных фрагментов или частей, могут быть соединены с определяемыми или цитотоксическими молекулами и доставлены млекопитающему, обладающему клетками, тканями или органами, которые экспрессируют рецептор, включающий 1Ь-22КА, такими как экспрессирующие 1Ь-22КА типы рака.
Подходящие определяемые молекулы могут быть прямо или опосредованно присоединены к полипептидам, которые связываются с рецепторными полипептидами, включающими 1Ь-22КА, такими как «связывающие полипептиды» (включая раскрытые выше связывающие пептиды), антитела или их биологически активные фрагменты или части. Подходящие определяемые молекулы включают радионуклиды, ферменты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, флуоресцентные маркеры, хемилюминесцентные маркеры, магнитные частицы и тому подобное. Подходящие цитотоксические молекулы могут быть прямо или опосредованно присоединены к полипептиду или антителу и включают бактериальные или растительные токсины (например, дифтерийный токсин, экзотоксин Ркеибοтοηак, рицин, абрин и тому подобное), а также терапевтические радионуклиды, такие как иод-131, рений-188 или иттрий-90 (либо прямо присоединенные к полипептиду или антителу, либо опосредованно присоединенные, например, посредством хелатирующей части). Связывающие полипептиды или антитела могут быть также конъюгированы с токсическими лекарствами, такими как адриамицин. Для опосредованного присоединения определяемой или цитотоксической молекулы определяемая или цитотоксическая молекула может быть конъюгирована с членом пары комплемент/антикомплемент, в которой другой член связан с частью свя
- 35 009124 зывающего полипептида или антитела. Примером пары комплемент/антикомплемент для данных целей является биотин/стрептавидин.
В другом осуществлении гибридные белки связывающий полипептид-токсин или гибридные белки антитело-токсин могут быть применены для направленного ингибирования или разрушения клеток или тканей (например, для действия на раковые клетки или ткани). Альтернативно, если связывающий полипептид имеет множественные функциональные домены (т.е. активационный домен или лигандсвязывающий домен плюс направляющий домен), для направления определяемой молекулы, цитотоксической молекулы или комплементарной молекулы к интересующему типу клеток или ткани может подходить гибридный белок, включающий только направляющий домен. В примерах, когда гибридный белок, включающий только один домен, включает комплементарную молекулу, антикомплементарная молекула может быть конъюгирозана с определяемой или цитотоксической молекулой. Такие доменкомплементарные молекулы гибридных белков, таким образом, представляют собой общий направляющий носитель для специфической доставки к клетке/ткани общих конъюгатов определяемый антикомплемент/цитотоксическая молекула.
В другом осуществлении гибридные белки связывающий Ш^ВА полипептид-цитокин или антитело-цитокин могут быть применены для усиления уничтожения тканей-мишеней ш νίνο (например, рака селезенки, поджелудочной железы, крови, лимфоидной системы, ободочной кишки и костного мозга), если связывающий пептид-цитокин или антитело против рецептора Ш-22ВА направлены на клетки с избыточной пролиферацией (см., обычно Η ο писк е! а1., Β1οο6 89:4437-47, 1997). Описанные гибридные белки способны доставлять цитокин к желаемому месту действия, обеспечивая тем самым увеличенную местную концентрацию цитокина. Подходящие антитела против мономерных, гомодимерных, гетеродимерных или мультимерных I^-22ВΑ направлены на нежелательную клетку или ткань (например, опухоль или лейкоз) и цитокин гибрида опосредует облегченный направленный лизис клетки эффекторными клетками. Подходящие цитокины для данной цели включают, например, интерлейкин-2 и гранулоцитмакрофаг-колоние-стимулирующий фактор (СМ-С8Е).
Альтернативно, описанные здесь связывающие рецептор I^-22ВΑ полипептиды или гибридные белки антитела могут быть применены для усиления уничтожения тканей-мишеней ш νίνο с помощью прямой стимуляции апоптозного пути, модулируемого рецептором I^-22ВΑ. что ведет к клеточной смерти усиленно пролиферирующих клеток, экспрессирующих рецепторы, включающие I^-22ВΑ.
10. Терапевтическое применение полипептидов, обладающих активностью I^-22ВΑ или антител против Ш^ВА.
Аминокислотные последовательности, обладающие активностью растворимого I^-22ВΑ. могут быть применены для модуляции иммунной системы с помощью связывания лигандов I^-22ВΑ - ΙΕ-20 и ΙΕ-22 (либо по одиночке, либо совместно), и таким образом предотвращая связывание лиганда I^-22ВΑ с эндогенным рецептором I^-22ВΑ. Антагонисты I^-22ВΑ. такие как антитела против I^-22ВΑ. могут быть также применены для модуляции иммунной системы с помощью ингибирования связывания лиганда I^-22ВΑ с эндогенным рецептором I^-22ВΑ. Соответственно, настоящее изобретение включает применение белков, полипептидов и пептидов, обладающих активностью Ш^ВА (таких как растворимые полипептиды I^-22ВΑ. фрагменты полипептидов Ш-22ВА, аналоги I^-22ВΑ (например, антиидиотипические антитела против Ш^ВА), и гибридные белки I^-22ВΑ). у субъекта, у которого отсутствует адекватное количество данного полипептида, или который продуцирует избыток лиганда Ш-22ВА. Антагонисты Ш-22ВА (например, антитела против I^-22ВΑ) также могут быть применены для лечения субъекта, который продуцирует избыток либо лиганда Ш^ВА, либо I^-22ВΑ. Подходящие субъекты включают млекопитающих, таких как человек. Например, такие полипептиды Ш-22ВА и антитела против ΙΕ22ВА пригодны для связывания, блокирования, ингибирования, снижения, антагонистического действия или нейтрализации ΙΕ-20 и ΙΕ-22 (либо по одиночке, либо совместно) при лечении псориаза, атрофического дерматита, воспалительных состояний кожи, псориазного артрита, артрита, эндотоксемии, астмы, воспалительного заболевания кишечника (ΙΒΌ), колита и других раскрытых здесь воспалительных состояний.
Более того, авторы показали, что рецептор Ш-22ВА связывает лиганд, называемый индуцируемый Т-клетками фактор (Ш-22) (8Еф ΙΌ N0:6; ^итοи!^е^, Ь. е! а1., Ргос. №1'1. Асаб. 8сЕ 97:10144-10149, 2000; последовательность Ш-22 мыши показана у ^итοи!^е^ е! а1., ί. Тттипск 164:1814-1819, 2000). Более того, обычно принадлежащий заявителям ζ€γΐοτ11 (Ш-22ВА) (патент США № 5965704) и рецептор СВЕ2-4 также связывают Ш-22 как гетеродимер (см. публикацию \νΙΒ0 ν0 00/24758; ^итοиί^е^ е! а1., ί. ТттитоЕ 164:1814-1819, 2000; 8репсег, 8.Ό. е! а1., 1. Ехр. Меб. 187:571-578, 1998; С1ЬЬз, У.С. апб Репшса Сепе 186:97-101, 1997 (кДНК СВР2-4); Х1е, М.Н. е! а1., 1. Βίο1. Сйет. 275:31335-31339, 2000; и Κο^ώω, 8.У. е! а1., 1. Βίο1. Сйет. 276: 2725-2732, 2001). Более того, рецептор ΙΕ-10β может быть вовлечен в качестве рецептора Ш-22 и считается, что это синоним СВЕ2-4 (^итοиί^е^, Ь. е! а1., Ргос. №1'1. Асаб. 8сЕ 97:1014410149, 2000; Ыи Υ. е! а1., 1 Iттиηο1. 152; 1821-1829, 1994 (кДНК Ш-10В.). Более того, авторы показали, что рецептор Ш-22ВА связывает лиганд, называемый Ш-20 (8Еф ΙΌ N0: 8; публикация νΨ0 № ν0 99/27103). В предпочтительных осуществлениях растворимая рецепторная форма Ш-22ВА (8Еф ΙΌ N0:3) представляет собой мономер, гомодимер, гетеродимер или мультимер, который связывается, бло
- 36 009124 кирует, ингибирует, снижает, проявляет антагонистическое действие или нейтрализует Ш-22 и Ш-20 ш У1уо. Антитела и связывающие полипептиды к таким мономерам, гомодимерам, гетеродимерам или мультимерам Ш-22КА также служат в качестве антагонистов активности [^-22КΑ и антагонистов как Ш20, так и Ш-22 (по одиночке или вместе), как здесь описано.
Кроме того, авторы описали здесь и продемонстрировали на основе тестов по нейтрализации, что как поликлональные, так и моноклональные нейтрализующие антитела против Ш-22 связываются, блокируют, ингибируют, снижают, проявляют антагонистическое действие или нейтрализуют активность Ш-22 и Ш-20 в клетке.
Ш-22, как было показано, индуцируется в присутствии Ш-9 и, как полагается, вовлечен в стимуляцию иммунных ответов типа Тй1, и воспалительный Ш-9 стимулирует пролиферацию, активацию, дифференцировку и/или индукцию иммунной функции с помощью различных путей и вовлечен в развитие астмы, мастоцитоз и другие заболевания, а также активирует 8ТАТ путь. Антагонисты функций Ш-22 или Ш-9 могут иметь удачное применение против таких заболеваний человека. В настоящем изобретении предлагаются такие новые антагонисты Ш-22.
П-22, как было показано, вовлечен в позитивную регуляцию продукции соединений острой фазы, таких как сывороточный амилоид А (8АА), а1-антихимотрипсин и гаптоглобин, и что экспрессия Ш-22 растет при введении липополисахарида (ЬР8) ш у1уо, что предполагает, что Ш-22 вовлечен в воспалительный ответ (Питоийег, Ь. е! а1., Ргос. №Р1. Асаб. 8сг 97:10144-10149, 2000). Продукция белков острой фазы, таких как 8АА, рассматривается как механизм кратковременного выживания, когда воспаление является благотворным; однако, поддержание белков острой фазы в течение более длительных периодов вносит вклад в хроническое воспаление и может быть вредным для здоровья человека. В качестве обзора смотри ИЫаг, С.М. апб ^ййейеаб, А.8., Еиг. I. Вюсйет. 265:501-523, 1999, и Ваитапп Н. апб 6аи1б1е, I. Iттиηо1оду Тобау 15:74-80, 1994. Более того, белок острой фазы 8АА вовлечен в патогенез нескольких хронических воспалительных заболеваний, вовлечен в атеросклероз и ревматоидный артрит и является предшественником амилоидного белка А, отлагаемого при амилоидозе (ИЫаг, С.М. апб ^ййейеаб, выше). Таким образом, Ш-22 действует как провоспалительная молекула и индуцирует продукцию 8АА, антагонисты могут использоваться для лечения воспалительного заболевания и других заболеваний, связанных с белками, отвечающими на острую фазу, индуцируемыми Ш-22. Такие антагонисты предлагаются в настоящем изобретении. Например, способ снижения индуцируемого Ш-22 или индуцируемого Ш-9 воспаления включает введение млекопитающему с воспалением количества композиции растворимого рецептора, включающего Ш-22КА, достаточного для снижения воспаления. Более того, способ подавления иммунного ответа у млекопитающего с воспалением может включать: (1) определение уровня амилоидного белка А в сыворотке; (2) введение композиции, включающей растворимый цитокиновый рецепторный полипептид Ш-22КА, как здесь описано, в приемлемом фармацевтическом носителе; (3) определение уровня амилоидного белка А в сыворотке после введения; (4) сравнение уровня амилоидного белка А в сыворотке на стадии (1) с уровнем амилоидного белка А в сыворотке на стадии (3); где отсутствие увеличения или снижение уровня амилоидного белка А в сыворотке является показателем подавления воспалительного ответа. Описанные здесь экспериментальные доказательства показывают, что антагонисты Ш-22, такие как растворимые рецепторы и антитела, действительно снижают уровни 8АА в моделях воспалительных заболеваний ш у1уо, демонстрируя, что связывание, блокирование, ингибирование, снижение, антагонистическое действие или нейтрализация Ш-22 вызывает противовоспалительные эффекты.
Свидетельства указывают, что Ш-20 и его рецепторы играют роль в развитии псориаза. Данное мультигенное заболевание кожи характеризуется усиленной пролиферацией кератиноцитов, измененной дифференцировкой кератиноцитов и инфильтрацией кожи иммунными клетками. Первые данные, доказывающие роль Ш-20 при псориазе, заключаются в том, что наблюдаемый гиперкератоз и утолщение эпидермиса у трансгенных мышей похож на изменения при псориазе человека. Сниженное количество тонофиламентов, как полагают, связанное с дефектной кератинизацией, является выдающейся характеристикой псориаза человека. Внутримитохондриальные включения были найдены как при индуцированных химически, так и существующих в природе гиперпластических состояниях кожи у мышей. Причина включений и их эффекты на функцию митохондрий, если они есть, не известны. П-20 трансгенные мыши проявляют много характерных черт, наблюдаемых при псориазе человека.
Более того, мРНК рецептора Ш-20 (как мРНК Ш-20КА так и Ш-20КВ) существенно позитивно регулируется в псориазной коже человека по сравнению с нормальной кожей, что дополнительно предполагает роль Ш-20 в псориазе. Субъединицы рецептора Ш-20 экспрессируются как в кератиноцитах по всему эпидермису, так и экспрессируются также в подклассе иммунных и эндотелиальных клеток. Авторы предполагают, что увеличенная экспрессия активированного рецептора Ш-20 может изменять взаимодействия между эндотелиальными клетками, иммунными клетками и кератиноцитами, что ведет к дисрегуляции пролиферации и дифференцировки кератиноцитов. Кроме того, описанные здесь данные по нокаутным мышам, у которых выбит рецептор Ш-22КА, показывают, что Ш-22КА необходим для индуцируемых Ш-20 воспалительных эффектов в коже трансгенных животных. Данные результаты доказывают, что эффективная блокада активности Ш-22КА, например, путем нокаута гена Ш-22КА или
- 37 009124 сходно путем нейтрализующего моноклонального антитела против ГБ-22КА настоящего изобретения, должна сходно снижать индуцированное ГБ-20 действие на кожу, а также индуцированное 1Б-22 действие на кожу, например, при псориазе, ΙΒΌ, колите или других воспалительных заболеваниях, индуцируемых 1Б-20 и/или 1Б-22, включая ΙΒΌ, артрит, астму, псориатический артрит, колит, воспалительные состояния кожи и атопический дерматит.
Более того, 1Б-20 стимулирует передачу сигнала в клеточной линии НаСаТ кератиноцитов человека, подтверждая прямое действие данного нового лиганда на кожу. Кроме того, белки 1Ш-1Ц, ЕСБ и ΤΝΕα, известные как активные в кератиноцитах и вовлеченные в пролиферативные и провоспалительные сигналы в коже, увеличивают ответ на 1Б-20. В клетках, как НаСаТ, так и ВНК, экспрессирующих рецептор 1Б-20, 1Б-20 передает сигнал через 8ТАТ3.
Как указано в обсуждении выше и в примерах ниже, 1Б-20 вовлечен в патологию псориаза. В настоящем изобретении предлагается, в частности, способ лечения псориаза путем введения агентов, которые связывают, блокируют, ингибируют, снижают, проявляют антагонистическое действие или нейтрализуют 1Б-20. Антагонисты 1Б-20 могут представлять собой либо растворимый рецептор, который связывается с 1Б-20, такой как растворимый ГБ-22КА, либо антитела, одноцепочечные антитела или фрагменты антител, которые связываются либо с 1Б-20, либо с рецептором 1Б-20, например, антитела против ГБ22КА. Антагонисты должны, таким образом, предотвращать активацию рецептора 1Б-20. Более того, так как 1Б-20 и ГБ-22 используют ГБ-22КА как общий рецептор, антагонисты, такие как растворимый ГБ22КА, или антитела, одноцепочечные антитела или фрагменты антител, которые связываются с рецептором ГБ-22КА, могут быть применены для одновременного связывания, блокирования, ингибирования, снижения, антагонистического действия или нейтрализации активности ГБ-22 или как ГБ-20, так и ГБ-22.
Псориаз представляет собой одно из наиболее распространенных кожных заболеваний, поражающих от 1 до 2 процентов населения мира. Это хроническое воспалительное состояние кожи, характеризующееся эритематозными, резко ограниченными узелками и круглыми бляшками, покрытыми серебристыми слюдяными чешуйками. Повреждения кожи при псориазе в разной степени сопровождаются зудом. В травмированных зонах часто развиваются псориатические повреждения. Кроме того, другие внешние факторы, включая инфекции, стресс и лекарства, например, литий, бета-блокаторы и противомалярийные препараты, могут усугублять псориаз.
Наиболее частый вариант псориаза называют псориазом бляшечного типа. Больные с псориазом бляшечного типа обычно имеют медленно растущие бляшки, которые остаются в основном неизмененными в течение длительного периода времени. Наиболее обычными областями развития бляшечного псориаза являются локти, колени, ягодичная щель и кожа головы. Вовлечение имеет тенденцию быть симметричным. Противоположный псориаз поражает области опрелостей, включая подмышечную впадину, пах, область под молочными железами и пупок, и он также имеет тенденцию поражать кожу головы, ладони и ступни. Индивидуальные повреждения представляют собой резко ограниченные бляшки, но они могут быть увлаженными в зависимости от их локализации. Псориаз бляшечного типа обычно развивается медленно и имеет безболезненное течение. Он редко спонтанно ослабевает.
Сопровождаемый сыпью псориаз (псориаз с крапинками) является наиболее общим для детей и молодых взрослых. Он развивается остро у индивидуумов без псориаза или у больных хроническим бляшечным псориазом. У больных имеется много маленьких эритематозных, чешуйчатых узелков, часто после инфекции верхних дыхательных путей бета-гемолитическими стрептококками. У больных с псориазом могут также развиться гнойничковые поражения. Они могут быть локализованы на ладонях и ступнях или могут быть генерализованными и связанными с лихорадкой, недомоганием, диареей и артралгиями.
Приблизительно у половины всех больных псориазом наблюдается вовлечение поражения ногтей рук, проявляющиеся как точечные вмятины, утолщение ногтей или подногтевой гиперкератоз. Приблизительно у от 5 до 10% больных псориаз связан с болезненностью суставов и это наиболее часто обнаруживается у больных с вовлечением поражения ногтей рук. Хотя некоторые имеют сопутствующее наличие классического ревматоидного артрита, у многих наблюдается заболевание суставов, которое попадает в один из пяти типов связанных с псориазом: (1) заболевание, ограниченное одним или несколькими небольшими суставами (70% случаев); (2) серонегативное заболевание, подобное ревматоидному артриту; (3) с вовлечением дистальных межфаланговых суставов; (4) тяжелый деструктивный артрит с развитием «калечащего артрита»; и (5) заболевание, ограниченное позвоночником.
Псориаз можно лечить путем введения агентов, которые связываются, блокируют, ингибируют, снижают, проявляют антагонистическое действие или нейтрализуют ГБ-22, ГБ-20 или как ГБ-20, так и ГБ22. Предпочтительными агонистами являются либо растворимый рецептор ГБ-20 и ГБ-22, такой как ГБ22КА (8ЕЦ ГО N0:3) либо антитела, фрагменты антител или одноцепочечные антитела, которые связываются с рецептором ГБ-22КА, такие как нейтрализующие антитела настоящего изобретения. Такие антагонисты могут быть введены одни или в сочетании с другими установленными лекарствами, такими как смазывающие агенты, кератолитики, местные кортикостероиды, местные производные витамина Ό, антралин, системные антиметаболиты, такие как метотрексат, терапия псораленом-ультрафиолетовым светом (РИУА), этретинат, изотретиноин, циклоспорин и местное производное витамина Ό3 кальципотриол.
- 38 009124
Более того, такие антагонисты можно вводить индивидууму подкожно, внутривенно или трансдермально с применением крема или трансдермального пластыря, который содержит антагонист. При подкожном введении антагонист может быть введен в одну или более псориатических бляшек. При трансдермальном введении антагонисты могут быть введены прямо на бляшки с применением крема, мази, бальзама или раствора, содержащего антагонист.
Антагонисты ГБ-20 или ГБ-22 могут быть введены больному, страдающему астмой, бронхитом или кистозным фиброзом или другим воспалительным заболеванием легких, для лечения заболевания. Антагонисты могут быть введены с помощью любого подходящего способа, включая внутривенный, подкожный, бронхиальный лаваж и применение средства для ингаляции, содержащего антагонист.
Анализ тканевого распределения мРНК, соответствующей кДНК [^-22ВЛ. показал, что уровень мРНК наиболее высок в плаценте и селезенке, и лиганд, с которым связывается [^-22ВЛ (ΙΕ-22), вовлечен в индукцию воспалительного ответа, включая индукцию ответа острой фазы (ЭитоиЕег, Ь. е! а1., Ргос. №!'1. Асаб. 8сг 97:10144-10149, 2000). Таким образом, конкретные осуществления настоящего изобретения направлены на применение растворимого [^-22ВЛ и антител против ΙΙ-22ВА в качестве антагонистов при воспалительных и иммунных заболеваниях или состояниях, таких как псориаз, псориатический артрит, атопический дерматит, воспалительные состояния кожи, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника (ГВЭ), болезнь Крона, дивертикулез, астма, панкреатит, диабет типа Ι (ИЗСД), рак поджелудочной железы, панкреатит, болезнь Грейвса, рак кишечника и ободочной кишки, аутоиммунное заболевание, сепсис, трансплантация органов или костного мозга; воспаление, обусловленное эндотоксемией, травмой, хирургическим вмешательством или инфекцией; амилоидоз; спленомегалия; реакция трансплантата против хозяина; и где желательно ингибирование воспаления, иммуносупрессия, снижение пролиферации гематопоэтических, иммунных, воспалительных или лимфоидных клеток, макрофагов, Т-клеток (включая клетки ТЫ и ТЬ2), подавление иммунного ответа на патоген или антиген, или другие примеры, где желательно ингибирование цитокинов ΙΕ-22 или ΙΕ-20.
Более того, антитела или связывающие полипептиды, которые связывают описанные здесь полипептиды [^-22ВЛ. и сами полипептиды [^-22ВЛ пригодны для:
1) блокирования, ингибирования, снижения, антагонистического действия или нейтрализации сигнализации через рецепторы ΙΕ-20 или ΙΕ-22 при лечении острого воспаления, воспаления в результате травмы, повреждения ткани, хирургического вмешательства, сепсиса или инфекции, и хронических воспалительных заболеваний, таких как астма, воспалительное заболевание кишечника (ГВЭ), хронический колит, спленомегалия, ревматоидный артрит, рецидивирующие эпизоды острого воспаления (например, туберкулез) и при лечении амилоидоза и атеросклероза, болезни Кастельмана, астмы и других заболеваний, связанных с индукцией ответа острой фазы.
2) Блокирования, ингибирования, снижения, антагонистического действия или нейтрализации сигнализации через рецепторы ΙΕ-20 или ΙΕ-22 при лечении аутоиммунных заболеваний, таких как ИЗСД, множественный склероз (М8), системная красная волчанка (8ЬЕ), астенический бульбарный паралич, ревматоидный артрит и ГВЭ для предотвращения или ингибирования сигнализации в иммунных клетках (например, лимфоцитах, моноцитах, лейкоцитах) через Ш^ВА (НидЕек С. е! а1., б. Тштипо1. 153: 33193325, 1994). Альтернативно, антитела, такие как моноклональные антитела (МаЬ), против рецепторов, включающих [^-22ВЛ. могут быть также применены в качестве антагонистов для снижения количества нежелательных иммунных клеток для лечения аутоиммунного заболевания. Астму, аллергию и другое атопическое заболевание можно лечить МаЬ против, например, растворимых рецепторов [^-22ВЛ. для ингибирования иммунного ответа или снижения количества провоцирующих заболевание клеток. Блокирование, ингибирование, снижение или антагонистическое действие на сигнализацию через [^-22ВЛ с применением полипептидов и антител настоящего изобретения может также быть выгодным при болезнях поджелудочной железы, почек, гипофиза и нервных клеток. Может быть выгодным лечение ИЗСД, ИНЗСД, панкреатита и карциномы поджелудочной железы. Е^ВА может служить в качестве мишени для лечения рака с помощью МаЬ, когда действующее в качестве антагониста МаЬ ингибирует рост рака и осуществляет опосредованное иммунной системой направленное уничтожение клеток. (НоШдег Р, апб НоодепЬоот, Н: №!иге Вю1ес11. 16: 1015-1016, 1998). МаЬ к растворимому Е^ВА могут также применяться для лечения нефропатий, таких как гломерулосклероз, мембранозная нейропатия, амилоидоз (который среди других тканей действует также на почки), почечный артериосклероз, гломерулонефрит различного происхождения, фибропролиферативные заболевания почки, а также дисфункция почек, связанная с 8ЬЕ, ИЗСД, диабетом типа ΙΙ (ИНЗСД), опухолями почек и другими заболеваниями.
3) Агонистического действия, усиления, увеличения или инициации проведения сигнала через рецепторы ΙΕ-20 или ΙΕ-22 при лечении аутоиммунных заболеваний, таких как ИЗСД, М8, 8ЬЕ, астенический бульбарный паралич, ревматоидный артрит и ГВЭ. Нейтрализующие и моноклональные антитела против [^-22ВЛ могут стимулировать дифференцировку лимфоцитов или других иммунных клеток, изменять пролиферацию или изменять продукцию цитокинов или белков клеточной поверхности, что облегчает течение аутоиммунных процессов. Конкретно, модуляция Т-хелперного клеточного ответа для смены паттерна секреции цитокинов может сдвинуть аутоиммунный ответ в сторону улучшения течения заболевания (8ιηί11ι БА. е! а1., б. Iтшиηο1. 160:4841-4849, 1998). Сходно, агонистические моноклональные
- 39 009124 антитела против растворимого 1Й-22КА, против растворимых гетеродимеров и мультимеров 1Ь22КА/СКР2-4 могут быть использованы для передачи сигнала, истощения и сдвига ответа иммунных клеток, вовлеченных в развитие астмы, аллергии и атопического заболевания. Сигнализация через 1Ь22КА может также улучшить течение заболеваний поджелудочной железы, почки, гипофиза и нервных клеток. Может быть выгодным лечение ИЗСД, ИНЗСД, панкреатита и карциномы поджелудочной железы. 1Й-22КА может служить в качестве мишени для лечения с помощью МаЬ рака поджелудочной железы, когда сигнализация через МаЬ ингибирует рост рака и осуществляет опосредованное иммунной системой направленное уничтожение клеток (Тий, А.Ь. е! а1., 1. Iттиηο1. 161: 3175-3185, 1998). Сходно, карциному клеток почек можно лечить моноклональными антителами против растворимых рецепторов, включающих 1Й-22КА, настоящего изобретения.
Описанные здесь растворимые полипептиды 1Й-22КА могут быть применены для связывания, блокирования, ингибирования, снижения, антагонистического действия или нейтрализации активности 1Б-22 или 1Й-20, либо по одиночке, либо совместно, при лечении аутоиммунного заболевания, атопического заболевания, ИНЗСД, панкреатита и дисфункции почек, как описано выше. Растворимая форма 1Й-22КА может быть применена для стимуляции ответа антитела, опосредованного ТН клетками, и/или для стимуляции продукции 1Ь-4 или других цитокинов лимфоцитами или другими иммунными клетками.
Растворимые рецепторы, включающие 1Й-22КА, настоящего изобретения пригодны в качестве антагонистов цитокинов 1Й-20 или 1Й-22. Такие антагонистические эффекты могут быть достигнуты путем прямой нейтрализации или связывания 1Б-20 или 1Й-22. В дополнение к применению в качестве антагонистов, растворимые рецепторы настоящего изобретения могут связывать 1Й-22 и действовать в качестве белков-носителей для цитокинов 1Й-20 или 1Й-22 для транспортировки лиганда к различным тканям, органам и клеткам в организме. Как таковые, растворимые рецепторы настоящего изобретения могут быть гибридизованы или соединены с молекулами, полипептидами или химическими частями, которые направляют комплекс растворимый рецептор-лиганд к конкретному месту, такому как ткань, конкретная иммунная клетка или опухоль. Например, при острой инфекции или некоторых типах рака преимущества могут быть достигнуты в результате индукции воспаления и местного ответа белков острой фазы под действием 1Й-22. Таким образом, растворимые рецепторы настоящего изобретения могут быть применены для специфической направленности действия 1Й-20 или №22. См., СйБтап, Ό. СуЮкте 5: 95-106, 1993; и Ρе^ηаηбеζ-Вοΐ^аη, К. Ехр. Орт. 1птек1. Эгидк 9:497-513, 2000.
Более того, растворимые рецепторы настоящего изобретения могут быть применены для стабилизации №20 или №22, для увеличения биодоступности, длительности терапевтического действия и/или для эффективности лиганда с помощью стабилизации лиганда, предохраняющей от деградации или клиренса, или с помощью направления лиганда к месту действия в организме. Например, существующий в природе комплекс №6, растворимый 1Й-6К стабилизирует №6 и может передавать сигнал через рецептор др130. Смотри, ^ктая Ό. выше, и Ρе^ηаηбеζ-Вοΐ^аη, К. выше. Более того, №22КА может быть объединен с соответствующим лигандом, таким как №22, с образованием комплекса лиганд/растворимый рецептор. Такие комплексы могут быть применены для стимуляции ответов у клеток, презентирующих рецепторные субъединицы-партнеры, такие как, например, рО1К81 (Й-20КВ) или СКР2-4 (№10КВ). Клеточная специфичность комплексов №22КА/лиганд может отличаться от таковой, обнаруживаемой для одного вводимого лиганда. Далее, комплексы могут иметь отличные фармакокинетические свойства, такие как влияющие на полупериод жизни, отношение доза/эффект и органную или тканевую специфичность. Комплексы №22КА/№22 или №22КА/№20, таким образом, могут обладать активностью агонистов в отношении усиления иммунного ответа или стимуляции мезангиальных клеток или стимуляции клеток печени. Альтернативно, только ткани, экспрессирующие сигнальную субъединицу, образующую гетеродимеры с комплексом, могут быть подвержены действию, аналогичному с ответом на комплексы 1Й6/1Й6К (Н1го!а Н. е! а1., Ргос. №!'1. Асаб. 8с1. 92:4862-4866, 1995; Нкам, Т. ш Т1ютакοη. А. (Еб.) ТНе СуЮкте ΗаηбЬοοк, 3гб Еб., р. 208-209). Комплексы растворимый рецептор/цитокин для 1Ь12 и СNТΡ проявляют сходную активность.
Более того, воспаление представляет собой защитный ответ организма для отражения атаки инвазирующего агента. Воспаление представляет собой каскад событий, который вовлекает многие клеточные и гуморальные медиаторы. С одной стороны, подавление воспалительных ответов может вести к подрыву иммунной системы хозяина; однако, если его оставить не контролируемым, воспаление может вести к серьезным осложнениям, включая хронические воспалительные заболевания (например, псориаз, артрит, ревматоидный артрит, множественный склероз, воспалительное заболевание кишечника и тому подобное), септический шок и множественную органную недостаточность. Важно, что при данных разнообразных патологических состояниях используются общие медиаторы воспаления. Суммарно, болезни, которые характеризуются воспалением, вносят существенный вклад в заболеваемость и смертность человека. Следовательно, ясно, что противовоспалительные белки, такие как 1Й-22КА и антитела против №22КА могут обладать значительным терапевтическим потенциалом в отношении широкого круга заболеваний человека и животных от астмы и аллергии до аутоиммунных процессов и септического шока.
1. Артрит.
- 40 009124
Артрит, включая остеоартрит, ревматоидный артрит, суставы с артритом в результате повреждения и тому подобное, являются обычными воспалительными состояниями, которые должно быть выгодно лечить с применением противовоспалительных белков, таких как полипептиды 1Б-22НА настоящего изобретения. Например, ревматоидный артрит (НА) является системным заболеванием, которое поражает целый организм и является одним из наиболее обычных форм артрита. Он характеризуется воспалением мембраны, выстилающей сустав, что вызывает боль, неподвижность, гипертермию, покраснение и набухание. Клетки воспаления секретируют ферменты, которые могут гидролизовать кость и хрящ. В результате ревматоидного артрита воспаленная выстилка сустава, синовиальная оболочка, может вторгаться и повреждать кость и хрящ, что ведет среди других физиологических эффектов к повреждению сустава и тяжелой боли. Пораженный сустав может потерять свою форму и вправление, что ведет к боли и потере подвижности.
Ревматоидный артрит (НА) представляет собой заболевание, опосредованное иммунной системой, характеризующееся, в частности, воспалением и последующим повреждением ткани, ведущим к тяжелой нетрудоспособности и повышенной смертности. Разнообразные цитокины продуцируются местно в ревматоидных суставах. Многочисленные исследования показали, что 1Ь-1 и ТОТ-альфа, два прототипных провоспалительных цитокина, играют важную роль в механизмах, вовлеченных в воспаление синовиальной оболочки и в прогрессивной деструкции сустава. Действительно, введение ингибиторов Т№-альфа и 1Б-1 больным с НА приводило к существенному улучшению клинических и биологических признаков воспаления и к снижению радиологических признаков разрушения кости и деструкции хряща. Однако, несмотря на данные обнадеживающие результаты, существенный процент больных не отвечал на данные агенты, что предполагает, что другие медиаторы также вовлечены в патофизиологию артрита (ОаЬау, ЕхреП. 0рт. Бю1. ТНег. 2 (2) : 135-149, 2002). Одним из таких медиаторов может быть 1Б-20 или 1Б-22. и, как таковая, молекула, которая связывает или ингибирует активность 1Б-22 или 1Б-20, такая как полипептиды 1Б-22НА или антитела против 1Б-22НА, или связывающие партнеры, может служить в качестве ценного терапевтического агента для снижения воспаления при ревматоидном артрите и других типах артрита.
Существует несколько животных моделей ревматоидного артрита, известных в данной области. Например, в модели индуцированного коллагеном артрита (С1А) у мышей развивается хронический воспалительный артрит, который очень сходен с ревматоидным артритом человека. Так как С1А проявляет сходные с НА иммунологические и патофизиологические черты, это делает его идеальной моделью для скрининга потенциальных противовоспалительных соединений, предназначенных человеку. Модель С1А представляет собой хорошо известную модель у мышей, развитие которой зависит как от иммунного ответа, так и от воспалительного ответа. Иммунный ответ включает взаимодействие В-клеток и СЭ4+ Тклеток в ответ на коллаген, который дается как антиген, и ведет к продукции антител против коллагена. Воспалительная фаза является результатом тканевых ответов на медиаторы воспаления, возникающих вследствие способности некоторых из данных антител перекрестно реагировать с нативным коллагеном мыши и активировать каскад комплемента. Преимуществом применения модели С1А является то, что основные механизмы ее патогенеза известны. Относящиеся к Т-клеткам и В-клеткам эпитопы коллагена типа II идентифицированы и различные иммунологические (например, гиперчувствительность отставленного типа и антитело против коллагена) и воспалительные (например, цитокины, хемокины и ферменты, вызывающие деградацию матрикса) параметры, относящиеся к опосредуемому иммунной системой артриту, определены и могут, таким образом, быть использованы для оценки эффективности тестируемого соединения в модели С1А (Аоо1еу, Сигг. 0рт. Нйеит. 3:407-20, 1999; А1Шатз е! а1., 1ттипо1. 89: 9784-788, 1992; Муегз е! а1., ЬИе 8с1. 61:1861-78, 1997; и Аапд е! а1., 1ттипо1. 92:8955-959, 1995).
Введение растворимых полипептидов, включающих 1Б-22НА2, (/су!ог16), таких как хсуЮг16-Рс4 или другие растворимые и гибридные белки 1Б-22НА2, мышам данной модели С1А применяли для оценки применения 1Б-22НА2 в качестве антагониста 1Б-22, используемого для облегчения симптомов и изменения хода заболевания. Более того, результаты, демонстрирующие ингибирование 1Б-22 под действием 1Б-22НА2, подтверждают концепцию о том, что другие антагонисты 1Б-22, такие как 1Б-22НА или антитела к нему, также могут быть использованы для облегчения симптомов и изменения хода заболевания. Так как лиганд 1Б-22НА2, 1Б-22, индуцирует продукцию 8АА, который вовлечен в патогенез ревматоидного артрита, и 1Б-22НА2, как показано, способен ингибировать активность 1Б-22 и 8АА ш уйго и ш У1уо, системное и местное введение полипептидов, включающих 1Б-22НА2, таких как хсуЮг16-Бс4 или другие растворимые рецепторы 1Б-22 (например, 1Б-22НА; 8ЕО Ш N0:3), и антител против 1Б-22НА, а также гибридных белков может потенциально подавлять воспалительный ответ при НА. Введение 10 мкг хсу1ог16-Бс (три раза в неделю в течение 4 недель) существенно снижало масштаб заболевания (размер лапы, инцидент воспаления или заболевания). Другие потенциальные терапевтические агенты включают полипептиды 1Б-22НА, антитела против 1Б-22НА или антитела против 1Б-22, или связывающие партнеры и тому подобное.
В одной группе показано, что антитело против 1Б-22 мыши может снижать симптомы в мышиной модели С1А по сравнению с контрольными мышами, таким образом, концептуально демонстрируя, что растворимые полипептиды 1Б-22НА и нейтрализующие антитела против 1Б-22НА могут оказывать благо
- 41 009124 творное действие при лечении заболевания человека. Введение одного моноклонального антитела крысы, специфичного в отношении ГЬ-22 мыши (Р3/1) снижало симптомы артрита у животных при профилактическом введении или при введении после развития у модели С1А-индуцированного артрита (публикация А1Р0 02/068476; опубликованная 9 сентября 2002). Следовательно, растворимые полипептиды 1Ь22КА и антитела против 1Б-22КА настоящего изобретения, включая нейтрализующие антитела против 1Б-22КА человека настоящего изобретения, могут быть применены для нейтрализации 1Ь-22 и 1Ь-20 при лечении конкретных заболеваний человека, таких как псориаз, псориатический артрит, артрит, эндотоксемия, воспалительное заболевание кишечника (ΙΒΌ), колит и другие раскрытые здесь воспалительные состояния.
2. Эндотоксемия.
Эндотоксемия представляет собой тяжелое состояние, обычно возникающее при инфицировании такими агентами, как бактерии и другие агенты инфекционных заболеваний, сепсисе, синдроме токсического шока или у иммунодефицитных больных, подвергнутых влиянию оппортунистических инфекций и тому подобное. Терапевтически пригодные противовоспалительные белки, такие как полипептиды 1Ь22КА и антитела настоящего изобретения, могли бы оказать помощь в предотвращении и лечении эндотоксемии у человека и животных. Полипептиды 1Б-22КА, антитела против 1Ь-22КА или антитела против 1Ь-22 или партнеры связывания могли бы служить в качестве ценных терапевтических агентов для снижения воспаления и патологического действия эндотоксемии.
Индуцированная липополисахаридом (ЕР8) эндотоксемия вовлекает множество провоспалительных медиаторов, которые вызывают патологическое действие при инфекционных заболеваниях, и индуцированная ЕР8 эндотоксемия у грызунов является широко применяемой и принятой моделью для изучения фармакологического действия потенциальных провоспалительных или иммуномодулирующих агентов. ЬР8, продуцируемый грамотрицательными бактериями, является главной причиной патогенеза септического шока (С1аикпег е! а1., Ьапсе! 338:732, (1991). Подобное шоку состояние может быть действительно индуцировано экспериментально путем однократной инъекции ЬР8 животным. Молекулы, продуцируемые клетками, отвечающими на ЬР8, могут влиять на патогены прямо или опосредованно. Хотя данные биологические ответы защищают хозяина от вторжения патогенов, они могут также наносить ущерб. Так, массированная стимуляция врожденного иммунитета, происходящая в результате тяжелой грамотрицательной бактериальной инфекции, ведет к избыточной продукции цитокинов и других молекул и развитию фатального синдрома, синдрома септического шока, который характеризуется лихорадкой, гипотензией, рассеянной внутрисосудистой коагуляцией и множественной недостаточностью органов (Битйги е! а1. Се11 103:1071-1083, 2000).
Данные токсические эффекты ЕР8 по большей части связаны с активацией макрофагов, ведущей к высвобождению множества медиаторов воспаления. Среди данных медиаторов ведущую роль, повидимому, играет Т№, на что указывает предотвращение токсичности ЬР8 при введении нейтрализующих антител против ЮТ (Ееи11ег е! а1., 8аепсе 229:869, 1985). Хорошо установлено, что введение 1 мкг ЬР8 Е. ^1ί мышам линии С57В1/6 обычно приводит к значительному повышению в кровяном русле 1Ь-6, Т№-альфа, 1Ь-1 и белков острой фазы (например, 8АА) приблизительно через 2 часа после введения. Токсичность ЕР8, по-видимому, опосредуемая данными цитокинами в виде пассивной иммунизации против данных медиаторов, может приводить к пониженной смертности Шение!· е! а1., 8аепсе 229:869, 1985). Потенциальные стратегии с иммуноинтервенцией для профилактики и/или лечения септического шока включают тАЬ против ЮТ, антагонист рецептора 1Ь-1, Ь1Е, 1Ь-10 и С-С8Е.
Введение полипептидов, включающих растворимый 1Б-22КА2, таких как Ζсу!ο^16-Ес4 или других растворимых и гибридных белков 1Б-22КА, в данной индуцированной ЕР8 модели применяли для оценки применимости 1Ь-22КА2 для облегчения симптомов и изменения хода индуцированного ЬР8 заболевания. Более того, результаты, показывающие ингибирование 1Ь-22 под действием 1Б-22КА2, служат доказательством в пользу концепции о том, что другие антагонисты 1Ь-22, такие как 1Ь-22КА или антитела к ним, также могут быть применены для облегчения симптомов в индуцированной ЬР8 модели и изменения хода заболевания. Модель показала индукцию 1Ь-22 при инъекции ЬР8 и потенциальное лечение заболевания полипептидами 1Б-22КА2. Поскольку ЕР8 индуцирует продукцию провоспалительных 1Ь-22, 8АА или других провоспалительных факторов, возможно вносящих вклад в патологию эндотоксемии, нейтрализация активности 1Ь-22, 8АА или других провоспалительных факторов антагонистическим полипептидом 1Б-22КА2 может быть применена для снижения симптомов эндотоксемии, таких как наблюдаемые при эндотоксическом шоке. Другие потенциальные терапевтические агенты включают полипептиды 1Б-22КА, антитела против 1Б-22КА или антитела против 1Ь-22, или связывающие партнеры и тому подобное.
3. Воспалительное заболевание кишечника, ΙΒΌ.
В Соединенных Штатах приблизительно 500000 человек страдают от воспалительного заболевания кишечника (ΙΒΌ), которое может затрагивать либо ободочную кишку и прямую кишку (язвенный колит), или и тонкий, и толстый кишечник (болезнь Крона). Патогенез данных заболеваний не ясен, но он включает хроническое воспаление вовлеченных тканей. Полипептиды 1Ь-22КА, антитела против 1Ь-22КА или антитела против ГЬ-22 или связывающие партнеры могли бы служить в качестве полезных терапевтиче
- 42 009124 ских агентов для снижения воспаления и патологических эффектов при БВЬ и родственных заболеваниях.
Язвенный колит (ИС) представляет собой воспалительное заболевание толстого кишечника, обычно называемого ободочной кишкой, характеризуемое воспалением и изъязвлением слизистой или глубокого слоя, выстилающего ободочную кишку. Данное воспаление вызывает частое опустошение ободочной кишки, приводящее к диарее. Симптомы включают разжижение стула и связанные спазмы живота, лихорадку и потерю веса. Хотя действительная причина ИС не известна, последние исследования позволяют предполагать, что естественные защитные силы организма работают против белков организма, которые организм воспринимает как чужеродные (аутоиммунная реакция). Возможно, поскольку они похожи на бактериальные белки в кишечнике, данные белки могут либо провоцировать, либо стимулировать воспалительный процесс, который начинает разрушать выстилку ободочной кишки. По мере разрушения выстилки ободочной кишки язвы образуют секретируемую слизь, гной и кровь. Заболевание обычно начинается в ректальной области и может последовательно распространяться вдоль всего толстого кишечника. Повторные эпизоды воспаления ведут к утолщению стенки кишечника и прямой кишки за счет рубцовой ткани. При тяжелом заболевании может происходить отмирание ткани ободочной кишки или сепсис. Симптомы язвенного колита варьируются в зависимости от тяжести, и их наступление может быть постепенным или неожиданным. Атаки могут быть спровоцированы многими факторами, включая респираторные инфекции или стресс.
Хотя в настоящее время отсутствует способ лечения ИС, попытки лечения сфокусированы на подавлении аномального воспалительного процесса в выстилке ободочной кишки. Для лечения заболевания пригодны медикаменты, включающие кортикостероиды, иммуносупрессоры (например, азатиоприн, меркаптопурин и метотрексат) и аминосалицилаты. Однако долговременное применение иммуносупрессорных агентов, таких как кортикостероиды и азатиоприн, могут вызывать тяжелые побочные эффекты, включая истончение костей, катаракту, инфекции и действие на печень и костный мозг. У больных, у которых существующая терапия оказывается неэффективной, показано хирургическое вмешательство. Хирургия включает удаление всей ободочной кишки и прямой кишки.
Существует несколько животных моделей, которые частично имитируют хронический язвенный колит. Наиболее широко применяемой моделью является модель индуцированного 2,4,6тринитробенесульфокислотой/этанолом СТ№8) колита, который индуцирует хроническое воспаление и изъязвление в ободочной кишке. При введении ТNВ8 в ободочную кишку чувствительных мышей посредством внутриректальной инсталляции он индуцирует опосредуемый Т-клетками иммунный ответ в слизистой ободочной кишки, что в данном случае ведет к обширному воспалению слизистой, отличающемуся сильной инфильтрацией Т-клеток и макрофагов вдоль всей стенки толстой кишки. Более того, данная гистопатологическая картина сопровождается клинической картиной прогрессивной потери веса (похудания), кровянистой диареи, выпадения прямой кишки и утолщения стенки толстого кишечника ЩеигаБй еБ а1. БпБегп. Веν. Бттипо1. 19:51-62, 2000).
В другой модели колита применяют натрий сульфат декстрана (Ό88), который индуцирует острый колит, проявляющийся кровянистой диареей, потерей веса, укорочением ободочной кишки и изъязвлением слизистой с инфильтрацией нейтрофилами. Индуцированный Ό88 колит гистологически характеризуется инфильтрацией клетками воспаления в собственной пластине слизистой оболочки при лимфоидной гиперплазии, фокальном повреждении крипт и эпителиальном повреждении. Данные изменения, как полагают, развиваются благодаря токсическому действию Ό88 на эпителий и путем фагоцитоза клеток собственной пластины слизистой оболочки и образования ΙΝΒ-альфа и БР№гамма. Несмотря на широкое применение, некоторые аспекты, касающиеся механизмов действия Ό88 в отношении применимости к заболеванию человека, остаются нерешенными. Ό88 рассматривают как не зависимую от Т-клеток модель, поскольку она реализуется у животных с недостаточностью Т-клеток, таких как мыши 8СБИ.
Введение полипептидов, включающих растворимый БЬ^ВА!, таких как /суБог16-Рс4, или других растворимых ББ-22ВА или гибридных белков в данные модели ТNВ8 или Ό88 может быть применено для оценки применимости ББ-22ВА для облегчения симптомов и изменения течения желудочнокишечного заболевания. Более того, результаты, показывающие ингибирование БЬ-22 под действием БЬ22ВА2, служат доказательством в пользу концепции о том, что другие антагонисты БЬ-22, такие как БЬ22ВА или антитела к ним, также могут быть применены для облегчения симптомов в моделях колита/БВИ и изменения течения заболевания.
Авторы наблюдали повышенную экспрессию БЬ-22 в тканях ободочной кишки И88-мышей с помощью ОТ-ПЦР, и синергичное действие БЬ-22 и БЬ-1-бета на линии клеток кишечника. Это указывает на то, что БЬ-22 может играть роль в воспалительном ответе при колите, и нейтрализация активности БЬ-22 посредством введения полипептидов ББ-22ВА2 представляет собой потенциальный терапевтический подход к БВИ. Другие потенциальные терапевтические агенты включают полипептиды ББ-22ВА, антитела против ББ-22ВА или антитела против БЬ-22 или связывающие партнеры и тому подобное.
4. Псориаз.
Псориаз представляет собой хроническое состояние кожи, которым страдают более семи миллионов американцев. Псориаз возникает тогда, когда новые клетки кожи растут аномально, что приводит к
- 43 009124 воспаленным, набухшим и шершавым пятнам кожи, где старая кожа не была достаточно быстро слущена. Бляшечный псориаз, наиболее обычная форма, характеризуется воспаленными пятнами кожи (повреждениями), покрытыми серебристо-белыми чешуйками. Псориаз может быть ограничен несколькими бляшками или вовлекает области кожи от умеренного до распространенного количества, обнаруживаясь чаще всего на коже головы, коленях, локтях и туловище. Хотя он хорошо виден, псориаз не является заразным заболеванием. Патогенез заболевания включает хроническое воспаление затронутых тканей. Полипептиды I^-22КА, антитела против I^-22КА или антитела против ΙΕ-22 и ΙΕ-20 или связывающие партнеры могли бы служить в качестве ценных терапевтических агентов для снижения воспаления и патологических эффектов при псориазе, других воспалительных заболеваниях кожи, аллергиях кожи и слизистой и родственных заболеваниях.
Псориаз представляет собой опосредуемое Т-клетками воспалительное заболевание кожи, которое может вызывать значительный дискомфорт. Он представляет собой заболевание, для которого нет лечения и которое затрагивает людей всех возрастов. Псориаз поражает приблизительно два процента популяции европейцев и североамериканцев. Хотя индивидуумы с мягким псориазом обычно могут контролировать свою болезнь с помощью местных агентов, для более одного миллиона больных во всем мире необходима ультрафиолетовая или системная иммуносупрессорная терапия. К сожалению, неудобство и риски ультрафиолетового облучения и токсичность многих терапевтических агентов ограничивают их долговременное применение. Более того, у больных обычно имеют место рецидивы псориаза и в некоторых случаях синдром отмены вскоре после отмены иммуносупрессорной терапии.
ΙΕ-20 представляет собой новый гомолог ЕС-10, который, как было показано, вызывает неонатальную летальность при аномалиях кожи, включая абберантную дифференцировку эпидермиса у ΙΕ-20 трансгенных мышей (В1итЬегд Η. е! а1., Се11 104:9-19, 2001). Рецептор ΙΕ-20 резко увеличивается в псориазной коже. Поскольку ΙΕ-22 имеет общую субъединицу рецептора (хсу!ог11) с рецептором ΙΕ-20, и трансгенные ΙΕ-22 мыши обладают сходным фенотипом, возможно, что ΙΕ-22 также участвует в воспалительных заболеваниях кожи, таких как псориаз. Введение полипептида ГЕ-22КА или антагонистичного антитела против ГЕ-22КА подкожно или местно потенциально может снижать воспаление и симптомы. Другие потенциальные терапевтические агенты включают полипептиды ГЕ-22КА, полипептиды растворимого рецептора хсу!ог11/СКР2-4 или антитела против ΙΕ-22 или связывающие партнеры и тому подобное.
Более того, была показана гиперэкспрессия ΙΕ-22 и ΙΕ-20 при псориатических повреждениях у человека, что предполагает, что ΙΕ-22, как и ΙΕ-20, также участвует в псориазе у человека. Более того, как здесь описано, гиперэкспрессия ΙΕ-20 или ΙΕ-22 у трансгенных мышей вызывала, как было показано, утолщение эпидермиса и включение клеточного иммунитета, что указывает на псориатический фенотип; и дополнительная инъекция ΙΕ-22 нормальным мышам вызывала утолщение эпидермиса и включение клеточного иммунитета, указывающие на псориатический фенотип, которые блокировались антагонистом растворимого рецептора ^-22^2 (хсу!ог-16; публикация ^ΙΓ0 № \¥0 01/40467). Подобные данные 1и у1уо дополнительно позволяют предполагать, что провоспалительный ΙΕ-22 участвует в псориазе. Если это так, то антагонисты активности ΙΕ-22 и ΙΕ-20, такие как растворимые рецепторы ГЕ-22КА и антитела против них, включая моноклональные и нейтрализующие антитела настоящего изобретения против ГЕ-22КА человека, пригодны для терапевтического лечения воспалительных заболеваний, в частности в качестве антагонистов и ΙΕ-22, и ΙΕ-20 по отдельности или совместно при лечении псориаза. Более того, антагонисты активности ΙΕ-22, такие как растворимые рецепторы ГЕ-22КА и антитела против них, включая моноклональные и нейтрализующие антитела настоящего изобретения против ГЕ-22КА человека, пригодны для терапевтического лечения других воспалительных заболеваний, например, в качестве агентов, которые связываются, блокируют, ингибируют, снижают, оказывают антагонистическое действие или нейтрализуют ΙΕ-22 и ΙΕ-20 при лечении атопического дерматита, ШО, колита, эндотоксемии, артрита, ревматоидного артрита и псориазного артрита, респираторного заболевания взрослых (АКО), септического шока, множественной органной недостаточности, воспалительного повреждения легких, такого как астма или бронхит, бактериальной пневмонии, псориаза, экземы, атопического и контактного дерматита и воспалительного заболевания кишечника, такого как язвенный колит и болезнь Крона.
Более того, антитела против Ш^КА и растворимые рецепторы Ш^КА настоящего изобретения могут быть применены для профилактики и лечения потери веса, связанной с рядом описанных здесь воспалительных заболеваний, а также с раком (например, химиотерапия и кахексия) и инфекционными заболеваниями. Например, тяжелая потеря веса является ключевым маркером, связанным с моделями сепсиса, М8, КА и моделями опухолей. Кроме того, потеря веса является ключевым параметром для многих заболеваний человека, включая рак, инфекционное заболевание и воспалительное заболевание. Потеря веса была продемонстрирована у мышей, инфицированных описанным здесь аденовирусом ΙΕ22. Антитела против ΙΕ-22 и антагонисты ΙΕ-22, такие как растворимые рецепторы Ш^КА и антитела к ним настоящего изобретения, а также рецепторы хсу!ог16 (I^-22КА2) могут быть протестированы на их способность предотвращать и лечить потерю веса у мышей, инфицированных описанным здесь аденовирусом ΙΕ-22. Способы определения режима профилактического и терапевтического лечения для таких
- 44 009124 антагонистов ΙΕ-22 известны в данной области техники и могут быть определены с применением описанных здесь способов.
Полипептиды растворимого рецептора I^-22ВΑ и антитела к ним могут быть также использованы в диагностических системах для определения циркулирующих уровней лиганда ΙΕ-22 или ΙΕ-20 и для определения ΙΕ-22, связанного с острой фазой воспалительного ответа. В относящемуся к этому осуществлении антитела или другие агенты, которые специфически связываются с растворимыми рецепторами Ш22ВА настоящего изобретения могут быть использованы для определения циркулирующих рецепторных полипептидов; наоборот, сами растворимые рецепторы Ш^ВА могут быть применены для определения циркулирующего или локально действующего полипептидов ΙΕ-22 или ΙΕ-20. Увеличенные или сниженные уровни лигандов или полипептидов рецепторов могут быть показателями патологических состояний, включая воспаление и рак. ΙΕ-22, как известно, индуцирует острую фазу воспалительного ответа. Более того, определение белков острой фазы или таких молекул, как ΙΕ-20 или ΙΕ-22, может быть показателем хронического воспалительного состояния при определенных заболеваниях (например, псориазе, ревматоидном артрите, колите, ΙΒΌ). Определение таких состояний способствует диагностике заболеваний, а также помогает врачу в выборе подходящего лечения.
Введение нейтрализующих антител против ΙΕ-22 или ΙΕ-20 ш и!его может быть использовано для демонстрации эффективности моделей заболеваний ш νίνο путем снижения или устранения фенотипа кожи, выявляемого у трансгенных ΙΕ-22 детенышей, которые гиперэкспрессируют ΙΕ-22, или у трансгенных ΙΕ-20 детенышей, которые гиперэкспрессируют ΙΕ-20. В данной области техники существуют прецеденты в отношении обработки нейтрализующими моноклональными антителами (тАЬ) ш и!его. В одном случае оказывалось существенное влияние на развитие подкласса В-1 В-клеток при обработке беременных самок мышей тАЬ, специфичными в отношении специфичной для Β-клеток молекулы, СЭ19 (например, Кгор Ι. е! а1., Еиг. ί. Iттиηο1. 26(1): 238-42, 1996). Кгар е! а1. вводили мышам с определенного момента беременности внутрибрюшинно 500 мкг тАЬ крысы против СЭ19 мыши (или крысиные контрольные АЬ соответствующего изотипа) в ЗФР, начиная с 9 дня беременности с последующими инъекциями каждый следующий день до рождения. Детенышам также вводили один раз 500 мкг данных антител на 10 день жизни. В другом случае Тапака е! а1. нашли, что обработка моноклональным антителом против бета-цепи рецептора ΙΕ-2 ш и!его полностью препятствует развитию Тйу-1+ дендритных эпидермальных клеток. Две различных субъединицы рецептора ΙΕ-2, т.е. альфа-цепь (9Е-2В альфа) и бета-цепь (9Е-2В бета) экспрессируются почти исключительно совместным образом в процессе онтогенеза фетального тимуса. Блокирование ΙΕ-2Η бета, компонент передачи сигнала с ΙΕ-2Η путем введения нейтрализующих тАЬ против Ш^В. бета приводило к полному и селективному исчезновению Тйу-1+ дендритных эпидермальных клеток кожи. Развитие каких-либо других подтипов Т-клеток не страдало. Это указывает на то, что ΙΕ-2 играет решающую роль в развитии фетальных У гамма 5+ клеток и их потомков (см., Тапака е! а1., Ш! Iттиηο1. 4(4):487-9, 1992). Кроме того, 8сйайетапп С.С. е! а1. с применением системы ш и!его показали, что для нормального развития сердечно-сосудистой системы мыши требуется РЭСЕ-А. Несколько линий доказательств предполагает, что цепь А фактора роста тромбоцитов (РЭСЕ-А) требуется для нормального эмбрионального развития сердечно-сосудистой системы. Выведение нейтрализующих антител против РЭСЕ-А в децидуальную часть матки ш и!его приводило к селективному нарушению лиганд-рецепторных взаимодействий РЭСЕ-А ш νίνο в течение периода в 18-24 часа и позволяло оценить, требуется ли РЭСЕ-А для развития сердечнососудистой системы и когда он требуется (см., 8сйа!!етапп С.С. е! а1., Эеу. Βίο1. 176 (1):133-42 1996). Данные результаты, а также другие, описанные в данной области техники, доказывают, что нейтрализующие тАЬ могут проявлять сильные эффекты ш и!его. Сходно могут быть представлены данные, демонстрирующие эффективность нейтрализации ΙΕ-20 или ΙΕ-22 моноклональными антителами ш νίνο в моделях заболеваний в плане снижения или устранения фенотипа кожи, выявляемого у трансгенных ΙΕ-20 и ΙΕ-22 детенышей, которые гиперэкспрессируют ΙΕ20 и ΙΕ-22, соответственно. Данные трансгенные мыши рождаются с блестящим видом кожи, обусловленным, по меньшей мере, частично утолщением эпидермиса, как здесь описано. ΙΕ-20 ТС детеныши, экспрессирующие довольно низкие уровни трансгенного цитокина, могут выздоравливать и действительно выживать для размножения, но ΙΕ-22 ТС мыши умирают вскоре после рождения, обычно до 5 дней жизни.
Например, нейтрализующие антитела против ΙΕ-20 включают антитела, такие как моноклональные антитела, которые могут связывать антигенные эпитопы ΙΕ-20 и нейтрализовать активность ΙΕ-20. Соответственно, антигенные несущие эпитоп пептиды и полипептиды ΙΕ-20 пригодны для выработки антител, которые связываются с описанными здесь полипептидами ΙΕ-20, а также для идентификации и скрининга моноклональных антител против ΙΕ-20, которые являются нейтрализующими и которые могут связывать, блокировать, ингибировать, снижать, проявлять антагонистическое действие или нейтрализовать активность ΙΕ-20. Такие нейтрализующие моноклональные антитела настоящего изобретения могут связываться с антигенным эпитопом ΙΕ-20. Такие эпитопы в 8Еф ΙΌ N0:8, как предсказывается графиком ^атезοη-Vο1ί, например, с применением программы ЭНА8ТАВ Рго!еап (^NΑ8ТΑВ. Шс., Μаб^зοη, νΙ), служат в качестве предпочтительных антигенных эпитопов и могут быть определены специалистом в
- 45 009124 данной области. Такие антигенные эпитопы включают аминокислотные остатки с 42 (Не) по 102 (Акр) 8ЕО ГБ N0: 8;
аминокислотные остатки с 42 (Не) по 60 (Не) 8ЕЦ ГБ N0: 8; аминокислотные остатки с 42 (Г1е) по 69 (О1и) 8ЕЦ ГБ N0:8; аминокислотные остатки с 42 (Г1е) по 81 (Сук) 8ЕЦ ГБ N0:8; аминокислотные остатки с 42 (Г1е) по 96 (Бук) 8ЕЦ ГБ N0:8; аминокислотные остатки с 42 (Г1е) по 102 (Акр) 8ЕЦ ГБ N0:8; аминокислотные остатки с 60 (Г1е) по 69 (О1и) 8ЕЦ ГБ N0:8; аминокислотные остатки с 60 (Г1е) по 81 (Сук) 8ЕЦ ГБ N0:8; аминокислотные остатки с 60 (Г1е) по 96 (Бук) 8ЕЦ ГБ N0 8; аминокислотные остатки с 60 (Г1е) по 102 (Акр) 8ЕЦ ГБ N0 8; аминокислотные остатки с 69 (О1и) по 81 (Сук) 8ЕЦ ГБ N0 8; аминокислотные остатки с 69 (О1и) по 96 (Бук) 8ЕЦ ГБ N0 8; аминокислотные остатки с 69 (О1и) по 102 (Акр) 8ЕЦ ГБ N0 8; аминокислотные остатки с 81 (Сук) по 96 (Бук) 8ЕЦ ГБ N0 8;
аминокислотные остатки с 81 (Сук) по 102 (Акр) 8ЕЦ ГБ N0: 8; и аминокислотные остатки с 96 (Бук) по 102 (Акр) 8ЕЦ ГБ N0:8.
В дополнение к другим описанным здесь моделям заболеваний активность антител против ГБ-22КА в отношении тканевого воспаления, возникшего из-за псориатических повреждений у человека, может быть измерена ш νί\Ό с применением мышиной модели тяжелого комбинированного иммунодефицита (8СГБ). Разработано несколько мышиных моделей (обозначаемых в совокупности как ксенотрансплантатные модели), в которых клетки человека имплантируют иммунодефицитным мышам; смотри, например, СаБап А.К., Боид1ак Е., Беик. Кек. 18:513-22, 1994 и Е1аге11, Б.Б, Нета!о1одюа1 0псо1оду 14:67-82, 1996. Как и в ш νί\Ό ксенотрансплантатных моделях псориаза, ткань псориазной кожи человека имплантируют мышиной модели 8СГБ, и нагружают подходящим антагонистом. Более того, для оценки антагонистов ГБ-20 и ГБ-22 в данной области техники могут быть использованы другие псориатические животные модели, такие как трансплантаты псориазной кожи человека, имплантированные мышиной модели АОК129 и нагруженные подходящим антагонистом (например, см. Воутап О. е1 а1., ί. Ехр. Меб. 0п1те риЬ1юа!юп #20031482, 2004, включенная здесь в качестве ссылки). Антитела против ГБ-22КА, которые связывают, блокируют, ингибируют, снижают, проявляют антагонистическое действие или нейтрализуют активность ГБ-22 или как ГБ-20, так и ГБ-22, являются предпочтительными антагонистами, однако антитела против ГБ-20 и ГБ-22 (по отдельности или в сочетании), растворимый ГБ-22КА, а также другие антагонисты ГБ-20 и ГБ-22 могут быть применены в данной модели. Сходно ткани или клетки, происходящие от колита, ГВБ, артрита или других воспалительных повреждений человека, могут быть применены в модели 8СГБ для оценки противовоспалительных свойств описанных здесь антагонистов ГБ-20 и ГБ22.
Способы лечения, созданные для прекращения, задержки или снижения воспаления с применением антител против ГБ-22КА или их производных, агонистов, конъюгатов или вариантов, могут быть протестированы с помощью введения антител против ГБ-22КА или растворимых соединений ГБ-22КА мышам 8СГБ, являющихся носителями воспалительной ткани человека (например, поврежденной псориазом и тому подобное), или другим описанным здесь моделям. Эффективность лечения измеряется и оценивается статистически в виде увеличенного со временем противовоспалительного эффекта у подвергаемой лечению популяции с применением способов, хорошо известных в данной области техники. Некоторые примеры способов включают, но не ограничиваются этим, измерение, например, в псориазной модели толщины эпидермиса, числа воспалительных клеток в верхней дерме и степени паракератоза. Такие способы известны в данной области техники и описываются здесь. Например, смотри 2е1д1ег, М. е1 а1. БаЬ [пх'ек! 81:1253, 2001; 2о11пег, Т.М. е! а1. I. С1т. НкекГ 109:671, 2002; Υатаηака, N. е! а1. М1сгоЬю1. Гттипо1. 45:507, 2001; Каускаибкип, 8. Р. е! а1. Вг. I. Бегта!о1. 144:931, 2001; Воекпске, ^. Н. е! а1. Агск. Бегта!о1. Кек. 291:104, 1999; Воекпске, ^. Н. е! а1. I. НкекГ Бегта!о1. 116:596, 2001; №ско1оГЕ В. I. е! а1. Ат. I. Ра1ко1. 146:580, 1995; Воекпске, ^. Н. е! а1. I. Си!ап. Ра!йо1. 24:1, 1997; 8ида1, I., М. е! а1. I. Бегта!о1. 8ск 17:85, 1998; и УШабкеп Б.8. е! а1. I. С1т. Г^ек!. 112:1571, 2003. Развитие воспаления во времени можно также прослеживать с применением хорошо известных способов, таких как проточная цитометрия (или ПЦР), для количественной оценки числа воспалительных или поврежденных клеток, присутствующих в образце, баллов (потери веса, диареи, ректального кровотечения, длины ободочной кишки) для ГВБ, баллов заболевания лап и баллов воспаления в модели СГА КА. Например, терапевтические стратегии, подходящие для тестирования в такой модели, включают прямое лечение с применением антител против ГБ-22КА, других антагонистов ГБ-20 и ГБ-22 (раздельно или совместно) или относящихся к этому конъюгатов или антагонистов, основанное на нарушении взаимодействия антител против ГБ22КА со своими лигандами ГБ-20 и ГБ-22, или терапию на основе клеток с применением антител против ГБ-22КА или их производных, агонистов, конъюгатов или вариантов.
Более того, псориаз представляет собой хроническое воспалительное заболевание кожи, которое связано с гиперплазией эпидермальных кератиноцитов и инфильтрацией мононуклеарными клетками,
- 46 009124 включая С 04+ Т-клетки памяти, нейтрофилы и макрофаги (СЫпзШрЫегз, Ιώ. АгсЫ. А11егду Iттиπο1., 110:199, 1996). В настоящее время считается, что антигены окружающей среды играют существенную роль в инициации и вносят вклад в патологию заболевания. Однако именно потеря толерантности к собственным антигенам, как полагается, опосредует патологию псориаза. Дендритные клетки и СЭ4+ Тклетки, как считается, играют важную роль в презентации и узнавании антигена, что опосредует иммунный ответ, ведущий к патологии. Авторы недавно разработали модель псориаза на основе модели переноса СО4+СО45КВ (ЭауепроП е1 а1., ЕНетеР IттиποрЫа^тасο1., 2:653-672). Мышам вводят антитела против ΙΕ-20, ΙΕ-22 или ΙΕ20Ε и/или ΙΕ22Ε, такие как антитела против Ш^КА настоящего изобретения, или растворимый Ш^КА. Ингибирование заболевания в баллах (повреждения кожи, воспалительные цитокины) указывает на эффективность антагонистов ΙΕ-20 или ΙΕ-22 при псориазе, например, антител против Ш^КА или растворимых рецепторов !Е-22КА или других антагонистов, таких как антитела против ΙΕ-20 и/или ΙΕ-22 или их рецепторов.
Атопический дерматит
Как ΙΕ-20, так и ΙΕ-22 позитивно регулируются в образцах больных атопическим дерматитом человека (АО). АО представляет собой обычное хроническое воспалительное заболевание, которое характеризуется повышенной активностью цитокинов Т-клеток хелперов подкласса 2 (Т12). Хотя точная этиология АО не известна, в его развитие вовлечено множество факторов, включая повышенную активность иммунных ответов Т1 2, аутоиммунную реакцию, инфекцию, аллергены и генетическую предрасположенность. Ключевые черты заболевания включают ксероз (сухость кожи), зуд (зуд кожи), конъюнктивит, воспалительные повреждения кожи, инфекцию 81арЫу1ососсиз аигеиз, повышение эозинофилов крови, повышение сывороточных !§Е и ШС1 и хронический дерматит с инфильтрацией Т-клетками, тучными клетками, макрофагами и эозинофилами. Колонизация или инфицирование 8. аигеиз, как оказалось, вызывает обострение АО и переводит данное заболевание кожи в хроническую форму.
АО часто выявляется у больных с астмой и аллергическим ринитом и часто является первоначальной манифестацией аллергического заболевания. Приблизительно 20% популяции в западных странах страдает от данных аллергических заболеваний, и случаи АО в развивающихся странах растут по неизвестным причинам. АО обычно начинается в детстве и может часто сохраняться до юности и взрослого возраста. В настоящее время способы лечения АО включают местные кортикостероиды, пероральный циклоспорин А, нестероидные иммуносупрессанты, такие как такролимус (ЕК506 в форме мази), и интерферон-гамма. Несмотря на различия способов лечения АО, многие симптомы у больных не улучшаются, или они имеют побочные реакции на лекарства, что требует поиска других, более эффективных терапевтических агентов. Растворимые полипептиды Ш^КА и антитела против Ш-ЗЗЕА настоящего изобретения, включая нейтрализующие антитела против Ш-ЗЗЕА человека настоящего изобретения, могут быть использованы для нейтрализации ΙΕ-22 и ΙΕ-20 при лечении конкретных заболеваний человека, таких как атопический дерматит, воспалительные состояния кожи и другие раскрытые здесь воспалительные состояния.
Для фармацевтического применения растворимый Ш^КА или антитела против Ш-ЗЗЕА настоящего изобретения может быть получена композиция для парентерального, в частности, внутривенного или подкожного введения согласно традиционным способам. Внутривенное введение может осуществляться болюсной инъекцией, контролируемым высвобождением, например, с применением мининасосов или другой подходящей техники, или инфузией на протяжении обычного периода от одного до нескольких часов. В целом фармацевтические составы должны включать гематопоэтический белок в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, таким как солевой раствор, забуференный солевой раствор, 5% декстроза в воде или тому подобное. Составы могут дополнительно включать один или более наполнителей, консервантов, солюбилизаторов, забуферивающих агентов, альбумин для предотвращения потери белка на поверхности сосудов и т.д. При применении такой сочетанной терапии цитокины могут объединяться в один состав или могут вводиться в отдельных составах. Способы приготовления составов хорошо известны в данной области и раскрыты, например, в КеттдЮп'з РЫагтасеиДса1 8с1епсез, Сеппаго, ей., Маск РиЬйзЫпд Со., ЕазЮп РА, 1990, включенной здесь в качестве ссылки. Терапевтические дозы должны обычно находиться в диапазоне от 0,1 до 100 мг/кг массы больного в день, предпочтительно 0,5-20 мг/кг в день, с точной дозой, определяемой лечащим врачом в соответствии с принятыми стандартами, принимая во внимание природу и тяжесть подлежащего лечению состояния, особенности больного и т.д. Определение дозы находится в компетенции специалиста в данной области. Обычно белки должны вводиться на протяжении периода до 28 дней после химиотерапии или трансплантации костного мозга или до достижения количества тромбоцитов >20000/мм3, предпочтительно >50000/мм3. Более обычно белки следует вводить на протяжении одной недели или менее, часто на протяжении периода от одного до трех дней. В целом терапевтически эффективное количество растворимого Ш^КА или антител против Ш-ЗЗЕА настоящего изобретения представляет собой количество, достаточное для индукции клинически значимого увеличения пролиферации и/или дифференцировки лимфоидных или предшественников миелоидных клеток, которое обычно проявляется в увеличении уровня зрелых клеток в кровяном русле (например, тромбоцитов или нейтрофилов). Лечение связанных с тромбоцитами заболеваний должно таким образом продолжаться до достижения количества тромбоцитов уровня по меньшей мере
- 47 009124
20000/мм3, предпочтительно 50000/мм3. Растворимый Ш-22КА или антитела против Ш-22КА настоящего изобретения можно также вводить в сочетании с другими цитокинами, такими как Ш-Л, -6 и -11; фактор стволовых клеток; эритропоэтин; О-С8Р и ОМ-С8Р. В схемах сочетанной терапии ежедневные дозы других цитокинов обычно должны составлять: ЕРО, 150 Е/кг; ОМ-С8Р, 5-15 1д/кг; ^-3, 1-5 1д/кг; и О-С8Р, 125 1д/кг. Сочетанная терапия с ЕРО, например, показана для больных с анемией с низким уровнем ЕРО.
В целом, дозировка вводимого растворимого I^-22КΑ (или аналога Ш-22КА или гибридного белка) или антител против Ш-22КА обычно варьируется в зависимости от таких факторов, как возраст больного, масса, рост, пол, общее медицинское состояние и предшествующий анамнез. Обычно желательно обеспечить реципиента дозой растворимого Ш-22КА или антител против [^-22КΑ. которая находится в диапазоне от приблизительно 1 пг/кг до 10 мг/кг (количество агента/массу тела больного), хотя в зависимости от обстоятельств можно также вводить более низкую или более высокую дозу.
Введение растворимого Ш-22КА или антител против Ш-22КА субъекту может быть внутривенным, внутриартериальным, внутрибрюшинным, внутримышечным, подкожным, внутриплевральным, внутриоболочечным, посредством перфузии через местный катетер или прямой инъекцией в повреждение. При введении терапевтических белков путем инъекции введение может осуществляться путем непрерывной инфузии или в виде одного или множества болюсов.
Дополнительные пути введения включают пероральный, через мембрану слизистой, легочный и трансдермальный. Пероральная доставка пригодна для полиэфирных микросфер, зеиновых микросфер, протеиноидных микросфер, полицианоакрилатных микросфер и систем на основе липидов (см., например, Э|Ваке апб Могге1, 0га1 ИеНуегу оГ М1сгоепсарки1а!еб Рго!ешк, в Рго!еш ИеНуегу: Рйукюа1 8ук!етк, 8апбегк апб Непбгеп (ебк.), радек 255-288 (Р1епит Ргекк 1997)). Простота интраназальной доставки иллюстрируется таким же способом введения инсулина (смотри, например, НшсйсПГГе апб Шит, Ебу. Эгид ЭеПу. Кеу. 35:199 (1999)). Сухие или жидкие частицы, включающие [^-22КΑ. могут быть получены и доставлены ингаляцией с помощью агентов для рассеивания сухого порошка, генераторов жидкого аэрозоля или небулайзеров (например, Ре!Й апб СотЬоМ, ТШТЕСН 16:343 (1998); Ра!!оп е! а1., Ебу. Эгид Эе1ίν. Кеу. 35:235 (1999)). Данный подход иллюстрируется системой управления диабетом АЕКХ, которая представляет собой управляемый вручную электронный ингалятор, который доставляет аэрозольный инсулин в легкие. Исследования показали, что белки с размером 48000 кДа доставляются через кожу в терапевтических концентрациях с помощью низкочастотного ультразвука, что иллюстрирует возможность трансдермального введения (Мйгадойу е! а1., 8с1епсе 269:850 (1995)). Трансдермальная доставка с применением электропорации обеспечивает другой способ введения молекулы, обладающей I^-22КΑсвязывающей активностью (Ро!!к е!. а1., Рйагт. Вю!есйпо1. 10:213 (1997)).
Фармацевтическая композиция, включающая растворимый [^-22КΑ или антитело против [^-22КΑ. может быть составлена в соответствии с известными способами получения фармацевтически пригодных композиций, в которых терапевтические белки соединяются в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Композицию называют фармацевтически приемлемым носителем, если ее введение может быть перенесено больным-реципиентом. Одним из примеров фармацевтически приемлемого носителя является стерильный забуференный фосфатом солевой раствор. Другие пригодные носители хорошо известны специалистам в данной области. Смотри, например, Оеппаго (еб.). Кеттд!оп'к Рйагтасеийса1 8с1епсек, 19(11 Ебйюп (Маск РиЬНкЫпд Сотрапу 1995).
В целях терапии молекулы растворимого [^-22КΑ или антитела против [^-22КΑ и фармацевтически приемлемый носитель вводят больному в терапевтически эффективном количестве. Сочетание терапевтической молекулы настоящего изобретения и фармацевтически приемлемого носителя, как говорят, вводят в терапевтически эффективном количестве, если вводимое количество является физиологически значимым. Агент является физиологически значимым, если его присутствие приводит к выявляемому изменению в физиологии больного-реципиента. Например, агент, применяемый для лечения воспаления, является физиологически значимым, если его присутствие смягчает воспалительный ответ.
Терапевтическая композиция, включающая [^-22КΑ (или аналог [^-22КΑ. или гибридный белок) или нейтрализующее антитело против [^-22КΑ. может быть составлена в жидкой форме, в форме аэрозоля или в твердой форме. Жидкие формы представлены растворами для инъекции или пероральными суспензиями. Иллюстративные твердые формы включают капсулы, таблетки и формы с контролируемым высвобождением. Примером последней формы являются осмотические мининасосы и имплантаты (Вгетег е! а1., Рйагт. Вю!есйпо1. 10:239 (1997); Канабе, Ттр1ап!8 т Эгид ИеНуегу, т Эгид ИеНуегу 8ук!етк, Капабе апб НоШпдег (ебк.), радек 95-123 (СКС Ргекк 1995); Вгетег е! а1., Рго!ет ИеНуегу νίΐΐι Гкюп Ритрк, т Рго!ет ИеНуегу: Рйукюа1 8ук!етк, 8апбегк апб Непбгеп (ебк.), радек 239-254 (Р1епит Ргекк 1997); Υеνеу е! а1., ИеНуегу о£ Рго!е1п8 Егот а Соп(го11еб Ке1еаке Ицас^Ые Iтр1аη! т Рго!ет ИеНуегу: Рйукюа1 8ук!етк, 8апбегк апб Непбгеп (ебк.), радек 93-117 (Р1епит Ргекк 1997)).
Один из способов доставки терапевтических полипептидов субъекту внутривенно, внутрибрюшинно, внутриоболочечно, внутримышечно, подкожно или посредством перорального введения, ингаляции или интраназального введения обеспечивается липосомами. Липосомы представляют собой микроскопические везикулы, которые состоят из одного или более липидных бислоев, окружающих водные компартменты (см. в целом Ваккег-ХУонбепЬегд е! а1., Еиг. I. С1т. МюгоЬюк Мес!. И1к. 12 (8ирр1. 1):861 (1993),
- 48 009124
К1т, Бгидк 46:618 (1993), и Капабе, 8йе-8ресШс Бгид Бейуегу Иктд Ырокотек ак Сатек, т Бгид Бейуегу 8ук!етк, Капабе апб НоШпдег (ебк.), радек 3-24 (СКС Ргекк 1995)). Липосомы сходны по составу с клеточными мембранами, и в результате липосомы могут вводиться безопасно и являются биодеградируемыми. В зависимости от способа получения липосомы могут быть однослойными или многослойными и липосомы могут варьироваться по размеру с диаметром, варьирующим от 0,02 мкм до более чем 10 мкм. В липосомы может быть инкапсулировано множество агентов: гидрофобные агенты распределяются в бислоях, а гидрофильные агенты распределяются во внутреннем(их) водном(ых) пространстве(ах) (см., например, МасИу е! а1., Ырокотек 1п Се11 Вю1оду апб РИагтасо1оду (1оИп ЫЬЬеу 1987), и Ок!го е! а1., Атепсап 1. Нокр. РИагт. 46:1576 (1989)). Более того, можно контролировать терапевтическую доступность инкапсулированного агента с помощью варьирования размера липосомы, количества двойных слоев, состава липидов, а также заряда и поверхностных характеристик липосом.
Липосомы могут адсорбироваться практически любым типом клеток и затем медленно высвобождать инкапсулированный агент. Альтернативно, адсорбированная липосома может быть подвергнута эндоцитозу клетками, которые являются фагоцитарными. Эндоцитоз сопровождается внутрилизосомной деградацией липидов липосомы и высвобождением инкапсулированных агентов (8сИегрИоГ е! а1., Апп. Ν.Υ. Асаб. 8с1. 446:368 (1985)). После внутривенного введения небольшие липосомы (от 0,1 до 1,0 мкм) обычно захватываются клетками ретикуло-эндотелиальной системы, локализованными главным образом в печени и селезенке, тогда как липосомы крупнее 3,0 мкм отлагаются в легких. Данный предпочтительный захват более мелких липосом клетками ретикуло-эндотелиальной системы был использован для доставки химиотерапевтических агентов в макрофаги и опухоли печени.
Ретикуло-эндотелиальную систему можно обойти несколькими способами, включая насыщение большими дозами липосомных частиц или избирательной инактивацией макрофагов с помощью фармакологических средств (С1ааккеп е! а1., ВюсЫт. ВюрИук. Ас!а 802:428 (1984)). Кроме того, было показано, что включение дериватизированных гликолипидом или полиэтиленгликолем фосфолипидов в мембраны липосомы приводит к значительному снижению захвата ретикуло-эндотелиальной системой (А11еп е! а1., ВюсЫт. ВюрИук. Ас!а 1068:133 (1991); А11еп е! а1., ВюсЫт. ВюрИук. Ас!а 1150:9 (1993)).
Могут быть также получены липосомы, направленные на конкретные клетки или органы, путем варьирования состава фосфолипидов или вставки рецепторов или лигандов в липосомы. Например, липосомы, полученные при высоком содержании неионного поверхностно-активного вещества, были использованы для направленной доставки в печень (Науакага е! а1., японский патент 04-244018; Ка!о е! а1., Вю1. РИагт. Ви11. 16:960 (1993)). Данные составы получали смешиванием фосфатидилхолина сои, αтокоферола и этоксилированного гидрированного касторового масла (НСО-60) в метаноле, концентрированнием смеси в вакууме и последующим воссозданием смеси с помощью воды. Липосомный состав дипальмитоилфосфатидилхолина (БРРС) с дериватизированной стерилглюкозидной смесью (8О) сои и холестерина (СИ), как было показано, направленно доставляется в печень (81ιίιπίζι.ι е! а1., Вю1. РИагт. Ви11. 20:881 (1997)).
Альтернативно, различные лиганды с направленной доставкой, такие как антитела, фрагменты антител, углеводы, витамины и транспортные белки, могут связываться с поверхностью липосомы. Например, липосомы могут модифицироваться производными галактозиллипидов разветвленного типа для направленной доставки к асиалогликопротеиновым (галактоза) рецепторам, которые экспрессируются исключительно на поверхности печеночных клеток (Ка!о апб 8ид1уата, Сгй. Кеу. ТИег. Бгид Сатег 8ук!. 14:287 (1997); МигайакЫ е! а1., Вю1. РИагт. Ви11. 20:259 (1997)). Сходно, Аи е! а1., Нера!о1оду 27:772 (1998) показали, что промечивание липосом асиалофетуином ведет к более короткому полупериоду жизни в плазме и существенно увеличивает захват меченной асиалофетуином липосомы гепатоцитами. С другой стороны, аккумуляция в печени липосом, включающих производные галактозиллипидов разветвленного типа, может тормозиться при предварительном введении асиалофетуина (МигайакЫ е! а1., Вю1. РИагт. Ви11. 20:259 (1997)). Липосомы с полиаконитилированным альбумином сыворотки человека обеспечивают другой подход к направленной доставке липосом к печеночным клеткам (Катрк е! а1., Ргос. Ν3!'1 Асаб. 8с1. И8А 94:11681 (1997)). Более того, ОеИо, е! а1., патент США № 4603044, описывают направленную на гепатоциты систему доставки липосомных везикул, которая обладает специфичностью к гепатобилиарным рецепторам, связанным со специализированными метаболическими клетками печени.
В более общем подходе к направленной доставке к тканям, клетки-мишени предварительно промечивают биотинилированными антителами, специфичными для лиганда, экспрессируемого клеткоймишенью (Нагакут е! а1., Абу. Бгид Бейу. Кеу. 32:99 (1998)). После удаления из плазмы свободного антитела вводят липосомы, конъюгированные со стрептавидином. При другом подходе антитела, направляющие доставку, прямо присоединяют к липосомам (Нагакут е! а1., Абу. Бгид Бейу. Кеу. 32:99 (1998)).
Полипептиды и антитела могут быть инкапсулированы в липосомы с применением стандартных способов микроинкапсулирования белков (см., например, Апбегкоп е! а1., 1пГес1. 1ттип. 31:1099 (1981), Апбегкоп е! а1., Сапсег Кек. 50:1853 (1990), и СоИеп е! а1., ВюсЫт. ВюрИук. Ас!а 1063:95 (1991), АМпд е! а1. «Ргерагайоп апб Ике оГ Ырокотек ш 1ттипо1одюа1 8!иб1ек», ш Ырокоте ТесИпоОду, 2пб Ебйюп, Уо1. III, бгедойабй (еб.), раде 317 (СКС Ргекк 1993), АаккеГ е! а1., Ме111. Еπζуто1. 149:124 (1987)). Как указывалось выше, терапевтически применимые липосомы могут содержать множество компонентов. Напри
- 49 009124 мер, липосомы могут включать липидные производные полиэтиленгликоля (А11еп е! а1., ВюсШш. ВюрБук. Аска 1150:9 (1993)).
Деградируемые полимерные микросферы созданы для поддержания высоких системных уровней терапевтических белков. Микросферы получают из деградируемых полимеров, таких как поли(лактидсо-гликолид) (РБС), полиангидриды, поли(орто-эфиры), не биодеградируемые полимеры этилвинилацетата, в которых белки захватываются в полимер (СотЬо1х апб Рейй, Вюсоп)ида!е СБет. 6:332 (1995); Канабе, Ко1е оГ Ро1утегк ш Эгид Эекуегу, ш Эгид Эейуегу 8ук!етк, Капабе апб НоШпдег (ебк.), радек 51-93 (СКС Ргекк 1995); Коккок апб МакШеМс/, ЭедгабаЫе Соп!го11еб Ке1еаке 8ук!етк ИкеГи1 Гог Рго!ет Эе11уегу, т Рго!ет Эейуегу: РБукюа1 8ук!етк, 8апбегк апб Непбгеп (ебк.), радек 45-92 (Р1епит Ргекк 1997); Вайлк е! а1., 8с1епсе 281:1161 (1998); Ри!пеу апб Вигке, №Ииге Вю!есБпо1оду 16:153 (1998); РиШеу, Сигг. Орт. СБет. Вю1. 2:548 (1998)). Наносферы, покрытые полиэтиленгликолем (ПЭГ), также могут служить носителями для внутривенного введения терапевтических белков (см., например, СгеГ е! а1., РБагт. Вю!есБпо1. 10:167 (1997)).
Настоящее изобретение также охватывает химически модифицированные полипептиды, обладающие ГЬ-22КА связывающей активность, такие как мономерные, гомодимерные, гетеродимерные или мультимерные растворимые рецепторы £Б-22КА и антагонисты М-З/КА, например, антитела против £Б22КА или связывающие полипептиды, или нейтрализующие антитела против (Б-22КА, где полипептид соединен с полимером, как обсуждалось выше.
Специалистом в данной области могут быть разработаны другие лекарственные формы, как показано, например, Апке1 апб РороуюБ, РЬагтасен11са1 Эокаде Рогтк апб Эгид ЭеНуегу 8ук!етк, 5'1' Εб^к^οη (Беа & РеБ1дег 1990), Сеппаго (еб.), Кеттд!оп'к РБагтасеи!юа1 8с1епсек, 19411 Εб^к^οη (Маск РиБНкШпд Сошрапу 1995), и Капабе апб НоШпдег, Эгид ЭеНуегу 8ук!ешк (СКС Ргекк 1996).
В качестве иллюстрации фармацевтические композиции могут быть применены в виде набора, включающего контейнер, который включает полипептид с внеклеточным доменом кБ-22КА, например, такие как мономерные, гомодимерные, гетеродимерные или мультимерные растворимые рецепторы (Б22КА или антагонист £Б-22КА (например, антитело или фрагмент антитела, который связывает полипептид £Б-22КА или нейтрализующее антитело против £Б-22КА). Терапевтические полипептиды могут предлагаться в форме раствора для инъекций для одной или множества доз или в виде стерильного порошка, который надо воссоздать перед введением. Альтернативно, такой набор может включать распылитель сухого порошка, генератор жидкого аэрозоля или небулайзер для введения терапевтического полипептида. Такой набор может дополнительно включать письменную информацию на показания и применение фармацевтической композиции. Более того, такая информация может включать утверждение о том, что композиция £Б-22КА противопоказана больным с известной гиперчувствительностью к ΙΕ22КА.
Фармацевтическая композиция, включающая антитела против £Б-22КА или связывающие партнеры (или фрагменты антител против кБ-22КА, гибридные антитела, гуманизированные антитела и тому подобное), или растворимый рецептор £Б-22КА могут быть представлены в жидкой форме, в форме аэрозоля или в твердой форме. Жидкие формы иллюстрируются растворами для инъекций, аэрозолями, каплями, местными растворами и пероральными суспензиями. Примеры твердых форм включают капсулы, таблетки и формы с контролируемым высвобождением. Последняя форма иллюстрируется осмотическими мининасосами и имплантатами (Вгетег е! а1., РБагт. Вю!есБпо1. 10:239 (1997); Капабе, Iшр1аη!к ш Эгид Эе11уегу, ш Эгид Эейуегу 8ук!ешк, Капабе апб НоШпдег (ебк.), радек 95-123 (СКС Ргекк 1995); Вгетег е! а1., Рго!ет Эейуегу \νί(1ι ШГикюп Ришрк, ш Рго!ет ЭеНуегу: РБукюа1 8ук!ешк, 8апбегк апб Непбгеп (ебк.), радек 239-254 (Р1епиш Ргекк 1997); Υе^еу е! а1., Эе11уегу оГ Рго!етк Ггош а Соп1го11еб Ке1еаке Iη^ескаБ1е Iшр1аη!, ш Рго!ет Эейуегу: РБукюа1 8ук!ешк, 8апбегк апб Непбгеп (ебк.), радек 93-117 (Р1епит Ргекк 1997)). Другие твердые формы включают кремы, пасты, другие местные составы и тому подобное.
Один из способов доставки терапевтических полипептидов субъекту внутривенно, внутрибрюшинно, внутриоболочечно, внутримышечно, подкожно или посредством перорального введения, ингаляции или интраназального введения обеспечивается липосомами. Липосомы представляют собой микроскопические везикулы, которые состоят из одного или более липидных бислоев, окружающих водные компартменты (смотри в целом Ваккег-АоибепБегд е! а1., Ειιγ. Б С1ш. МюгоБю1. ШГесГ Э1к. 12 (8ирр1. 1): 861 (1993), К1ш, Эгндк 46:618 (1993), и Капабе, 8йе-8ресШс Эгид Эейуегу Икшд Б1рокошек ак Сатек, ш Эгид Эейуегу 8ук!ешк, Капабе апб НоШпдег (ебк.), радек 3-24 (СКС Ргекк 1995)). Липосомы сходны по составу с клеточными мембранами, и в результате липосомы могут вводиться безопасно и являются биодеградируемыми. В зависимости от способа получения липосомы могут быть однослойными или многослойными и липосомы могут варьироваться по размеру с диаметрами, варьирующими от 0,02 мкм до более чем 10 мкм. В липосомы может быть инкапсулировано множество агентов: гидрофобные агенты распределяются в бислоях, а гидрофильные агенты распределяются во внутреннем(их) водном(ых) пространстве(ах) (см., например, МасБу е! а1., Б1рокошек Ш Се11 Вю1оду Апб РБагтасо1оду Ло11п Б1ББеу 1987), и Ок!го е! а1., Ашепсап Б Нокр. РБагт. 46:1576 (1989)). Более того, можно контролировать терапевтическую доступность инкапсулированного агента с помощью варьирования размера липосомы, количества двойных слоев, состава липидов, а также заряда и поверхностных характеристик липосом.
- 50 009124
Липосомы могут адсорбироваться практически любым типом клеток и затем медленно высвобождать инкапсулированный агент. Альтернативно, адсорбированная липосома может быть подвергнута эндоцитозу клетками, которые являются фагоцитарными. Эндоцитоз сопровождается внутрилизосомной деградацией липидов липосомы и высвобождением инкапсулированных агентов (ЗскегркоГ е! а1., Апп. КУ. Асаб. 8с1. 446:368 (1985)). После внутривенного введения небольшие липосомы (от 0,1 до 1,0 мкм) обычно захватываются клетками ретикуло-эндотелиальной системы, локализованными главным образом в печени и селезенке, тогда как липосомы крупнее 3,0 мкм отлагаются в легких. Данный предпочтительный захват более мелких липосом клетками ретикуло-эндотелиальной системы был использован для доставки химиотерапевтических агентов в макрофаги и опухоли печени.
Ретикуло-эндотелиальную систему можно обойти несколькими способами, включая насыщение большими дозами липосомных частиц или избирательной инактивацией макрофагов с помощью фармакологических средств (С1ааккеп е! а1., ВюсЫт. Вюркук. Ас!а 802:428 (1984)). Кроме того, было показано, что включение дериватизированных гликолипидом или полиэтиленгликолем фосфолипидов в мембраны липосомы приводит к значительному снижению захвата ретикуло-эндотелиальной системой (А11еп е! а1., ВюсЫт. Вюркук. Ас!а 1068:133 (1991); А11еп е! а1., ВюсЫт. Вюркук. Ас!а 1150:9 (1993)).
Могут быть также получены липосомы, направленные на конкретные клетки или органы, путем варьирования состава фосфолипидов или вставки рецепторов или лигандов в липосомы. Например, липосомы, полученные при высоком содержании неионного поверхностно-активного вещества, были использованы для направленной доставки в печень (Науакага е! а1., японский патент 04-244018; Ка!о е! а1., Вю1. Ркагт. Ви11. 16:960 (1993)). Данные составы получали смешиванием фосфатидилхолина сои, αтокоферола и этоксилированного гидрированного касторового масла (НСО-60) в метаноле, концентрированием смеси в вакууме и последующим воссозданием смеси с помощью воды. Липосомный состав дипальмитоилфосфатидилхолина (ЭРРС) с дериватизированной стерилглюкозидной смесью (8С) сои и холестерина (СЕ), как показано, направленно доставляется в печень (81ιίιηίζι.ι е! а1., Вю1. Ркагт. Ви11. 20:881 (1997)).
Альтернативно, различные лиганды с направленной доставкой, такие как антитела, фрагменты антител, углеводы, витамины и транспортные белки, могут связываться с поверхностью липосомы. Например, липосомы могут модифицироваться производными галактозиллипидов разветвленного типа для направленной доставки к асиалогликопротеиновым (галактоза) рецепторам, которые экспрессируются исключительно на поверхности печеночных клеток (Ка!о апб Зидхуата, Сп1. Вет. Ткег. Эгид Сатег 8ук!. 14:287 (1997); МигакакЫ е! а1., Вю1. Ркагт. Ви11. 20:259 (1997)). Сходно XVи е! а1., Нера!о1оду 27:772 (1998) показали, что промечивание липосом асиалофетуином ведет к более короткому полупериоду жизни в плазме и существенно увеличивает захват гепатоцитами меченной асиалофетуином липосомы. С другой стороны, аккумуляция в печени липосом, включающих производные галактозиллипидов разветвленного типа, может ингибироваться при предварительном введении асиалофетуина (МигакакЫ е! а1., Вю1. Ркагт. Ви11. 20:259 (1997)). Липосомы с полиаконитилированным альбумином сыворотки человека обеспечивают другой подход к направленной доставке липосом к печеночным клеткам (Катрк е! а1., Ргос. №Г1 Асаб. 8ск ИЗА 94:11681 (1997)). Более того, Секо, е! а1., патент США №. 4603044, описывают направленную на гепатоциты систему доставки липосомных везикул, которая обладает специфичностью к гепатобилиарным рецепторам, связанным со специализированными метаболическими клетками печени.
В более общем подходе к направленной доставке к тканям, клетки-мишени предварительно промечивают биотинилированными антителами, специфичными для лиганда, экспрессируемого клеткоймишенью (Наткут е! а1., Абу. Эгид Эеку. Веу. 32:99 (1998)). После удаления из плазмы свободного антитела вводят липосомы, конъюгированные со стрептавидином. При другом подходе антитела, направляющие доставку, прямо присоединяют к липосомам (Наткут е! а1., Абу. Эгид Эеку. Веу. 32:99 (1998)).
Нейтрализующие антитела против к^ВА и связывающие партнеры с ΙΕ-22 или ΙΕ-20 связывающей активностью, или растворимый рецептор Е^ВА могут быть инкапсулированы в липосомы с применением стандартных способов микроинкапсулирования белков (см., например, Апбегкоп е! а1., Шес!. Iтшиη. 31:1099 (1981), Апбегкоп е! а1., Сапсег Век. 50:1853 (1990), и Сокеп е! а1., ВюсЫт. Вюркук. Ас!а 1063:95 (1991), АМпд е! а1. «Ргерагакоп апб Ике оГ Ырокотек ш Iшшиηο1οд^са1 8!иб1ек», т Ырокоте Тескпо1оду, 2пб Ебкюп, Уо1. ΙΙΙ, 6гедопаб1к (еб.), раде 317 (СВС Ргекк 1993), νη^Γ е! а1., Ме!к. Εηζутο1. 149:124 (1987)). Как указывалось выше, терапевтически применимые липосомы могут содержать множество компонентов. Например, липосомы могут включать липидные производные полиэтиленгликоля (А11еп е! а1., ВюсЫт. Вюркук. Ас!а 1150:9 (1993)).
Деградируемые полимерные микросферы созданы для поддержания высоких системных уровней терапевтических белков. Микросферы получают из деградируемых полимеров, таких как поли(лактидсо-гликолид) (РЬС), полиангидриды, поли(орто-эфиры), небиодеградируемые полимеры этилвинилацетата, в которых белки захватываются в полимер (СотЬоЫ апб Ре!!й, Вюсоп)ида!е Скет. 6:332 (1995); Вапабе, Во1е оГ Ро1утегк ш Эгид Эекуегу, т Эгид Эекуегу 8ук!етк, Вапабе апб НоШпдег (ебк.), радек 51-93 (СВС Ргекк 1995); Воккок апб МакЫе^^, ЭедгабаЫе Соп!го11еб Ве1еаке 8ук!етк ИкеГи1 Гог Рго!ет Эекуегу, т Рго!ет Эекуегу: Ркукюа1 8ук!етк, Запбегк апб Непбгеп (ебк.), радек 45-92 (Р1епит Ргекк 1997);
- 51 009124
Вайик е! а1., 8с1епсе 281:1161 (1998); Ри1пеу апй Вигке, №Ииге Вю1есЬпо1оду 16:153 (1998); Ри1пеу, Сигг. 0рш. СЕет. Вю1. 2:548 (1998)). Наносферы, покрытые полиэтиленгликолем (ПЭГ), также могут служить носителями для внутривенного введения терапевтических белков (см., например, СгеГ е! а1., РЕагт. Вю!есЕпо1. 10:167 (1997) ).
Настоящее изобретение также охватывает химически модифицированные антитело против №-22ЯА или связывающий партнер, например, антитела анти-анти-№-22ЯА или растворимый рецептор №-22ЯА, соединенные с полимером, как обсуждалось выше.
Специалистом в данной области могут быть разработаны другие лекарственные формы, как показано, например, Апке1 апй РороуюЕ, РЕагтасеийса1 Эокаде Гогтк апй Эгид ОеНгегу 8ук!етк, 5|Е Еййюп (Ьеа & ГеЫдег 1990), Сеппаго (ей.), Яеттд!оп'к РЕагтасеи!юа1 8с1епсек, 19!Е Еййюп (Маск РиЬЕкЫпд Сотрапу 1995), и Яапайе апй НоШпдег, Эгид ОеНуегу 8ук!етк (СЯС Ргекк 1996).
Настоящее изобретение охватывает композиции антител против №-22 и способы, а также терапевтическое применение, включающие описанные здесь антитело, пептид или полипептид. Такие композиции могут дополнительно включать носитель. Носитель может представлять собой общепринятый органический или неорганический носитель. Примеры носителей включают воду, буферный раствор, спирт, пропиленгликоль, макроголь, кунжутное масло, кукурузное масло и тому подобное.
11. Получение трансгенных мышей.
При псориатических поражениях человека была показана гиперэкспрессия как №-20, так и №-22, что предполагает, что как №-20, так и №-22 вовлечены в псориаз человека. Более того, как здесь описано, гиперэкспрессия №-20 и №-22 у трансгенных мышей проявлялась утолщением эпидермиса и вовлечением иммунных клеток, указывающих на псориатический фенотип; и, в дополнение, введение нормальным мышам №-22 выявило утолщение эпидермиса и вовлечение иммунных клеток, указывающих на псориатический фенотип, который устранялся с помощью растворимого рецепторного антагониста хсу1ог16 (№22ЯА2). Такие данные ш у1уо дополнительно предполагают, что провоспалительный №-22 вовлечен в псориаз. Как таковые, антагонисты активности №-22, такие как нейтрализующие и моноклональные антитела против №-22ЯА человека настоящего изобретения, а также растворимые рецепторы П-22ЯА, пригодны для терапевтического лечения воспалительных заболеваний, особенно в качестве антагонистов ΙΕ22 и №-20 при лечении псориаза. Более того, агенты, которые связываются, блокируют, ингибируют, снижают, оказывают антагонистическое действие или нейтрализуют активность №-22 или и №-20, и ΙΕ22, такие как нейтрализующие и моноклональные антитела против №-22ЯА человека настоящего изобретения, а также растворимые рецепторы П-22ЯА, пригодны для терапевтического лечения других воспалительных заболеваний, например, в качестве антагонистов №-22 или и №-20, и №-22 при лечении атопического дерматита, ΙβΌ, колита, эндотоксемии, артрита, ревматоидного артрита и псориазного артрита, респираторного заболевания взрослых (АЯО), септического шока, множественной органной недостаточности, воспалительного повреждения легких, такого как астма или бронхит, бактериальной пневмонии, псориаза, экземы, атопического и контактного дерматита и воспалительного заболевания кишечника, такого как язвенный колит и болезнь Крона, и тому подобное.
В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается способ получения антитела к полипептиду, включающий инокуляцию животного полипептидом, выбранным из группы, состоящей из полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 42 (Не) по 102 (Акр) 8ЕЦ ΙΌ N0: 8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 42 (Не) по 60 (Не) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 42 (Не) по 69 (С1и) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 42 (Не) по 81 (Сук) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 42 (Не) по 96 (Ьук) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 42 (Не) по 102 (Акр) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 60 (Не) по 69 (С1и) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 60 (Не) по 81 (Сук) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 60 (Не) по 96 (Ьук) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 60 (Не) по 102 (Акр) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 69 (С1и) по 81 (Сук) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 69 (С1и) по 96 (Ьук) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 69 (С1и) по 102 (Акр) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 81 (Сук) по 96 (Ьук) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 81 (Сук) по 102 (Акр) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; и полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 96 (Ьук) по 102 (Акр) 8ЕЦ ΙΌ N0:8, где полипептид вызывает иммунный ответ у животного с выработкой антитела; и выделение антитела из животного; где антитело специфически связывается с полипептидом №-20 (8ЕЦ ΙΌ N0:8).
В одном осуществлении предлагается способ, как описано выше, в котором полученное данным способом антитело ингибирует провоспалительную активность №-20 (8ЕЦ ΙΌ N0:8). В другом осуществлении предлагается способ, как описано выше, в котором антитело снижает провоспалительную активность №-20 (8ЕЦ ΙΌ N0:8). В еще одном осуществлении предлагается способ, как описано выше, в котором антитело нейтрализует взаимодействие №-20 (8ЕЦ ΙΌ N0:8) с №-22ЯА (8ЕЦ ΙΌ N0:2). Конкретно,
- 52 009124 нейтрализацию с помощью антитела измеряют путем демонстрации нейтрализации 1Ь-20 (8ЕО Ш NО:8) в тесте нейтрализации ш νί!Γο на основе клеток.
Во втором аспекте в настоящем изобретении предлагается антитело, полученное способом, как раскрыто выше, которое связывает полипептид 8Е0 Ш NО:8. В одном осуществлении предлагается антитело, как описано выше, где антитело выбрано из группы, состоящей из (а) поликлонального антитела, (Ь) моноклонального антитела мыши, (с) гуманизированного антитела, происходящего от (Ь), (б) фрагмента антитела и (е) моноклонального антитела человека. В одном осуществлении антитело дополнительно включает радионуклид, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу или токсин. В другом осуществлении антитело дополнительно включает ПЭГилирование.
В третьем аспекте в настоящем изобретении предлагается антитело или фрагмент антитела, который связывает полипептид, включающий последовательность аминокислотных остатков, как показано в 8ЕО Ш NО:8; и снижает провоспалительную активность 1Ь-20 (8ЕО Ш NО:8). В одном осуществлении предлагается антитело или фрагмент антитела, который снижает провоспалительную активность либо №20 (8ЕО Ш NО:8), либо №22 (8ЕО Ш NО:6). В одном осуществлении предлагается антитело, как описано выше, где антитело выбрано из группы, состоящей из (а) поликлонального антитела, (Ь) моноклонального антитела мыши, (с) гуманизированного антитела, происходящего от (Ь), (б) фрагмента антитела и (е) моноклонального антитела человека. В одном осуществлении антитело дополнительно включает радионуклид, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу или токсин. В другом осуществлении антитело дополнительно включает ПЭГилирование.
В четвертом аспекте в настоящем изобретении предлагается способ снижения или ингибирования индуцируемой №20 пролиферации или дифференцировки гематопоэтических клеток и предшественников гематопоэтических клеток, включающий культивирование клеток костного мозга или периферической крови с композицией, включающей количество антитела, как описано выше, достаточное для снижения пролиферации или дифференцировки гематопоэтических клеток в костном мозге или клеток периферической крови по сравнению с клетками костного мозга или периферической крови, культивируемыми в отсутствие антитела. В одном осуществлении гематопоэтические клетки и предшественники гематопоэтических клеток представляют собой лимфоидные клетки. В еще одном осуществлении лимфоидные клетки представляют собой макрофаги или Т-клетки.
В пятом аспекте в настоящем изобретении предлагается способ снижения индуцируемого №20 воспаления, включающий введение млекопитающему с воспалением количества композиции антитела, как описано выше, достаточное для снижения воспаления.
В шестом аспекте в настоящем изобретении предлагается способ подавления воспалительного ответа у млекопитающего с воспалением, включающий (1) определение уровня сывороточного амилоидного белка А; (2) введение композиции, включающей антитело по п.3 в приемлемом фармацевтическом носителе; (3) определение уровня сывороточного амилоидного белка А после введения; (4) сравнение уровня сывороточного амилоидного белка А со стадии (1) с уровнем сывороточного амилоидного белка А со стадии (3), где отсутствие увеличения или снижение уровня сывороточного амилоидного белка А является показателем подавления воспалительного ответа.
В седьмом аспекте в настоящем изобретении предлагается способ подавления воспалительного ответа у млекопитающего с воспалением, включающий (1) определение уровня сывороточного амилоидного белка А; (2) введение композиции, включающей антитело по п.5 в приемлемом фармацевтическом носителе; (3) определение уровня сывороточного амилоидного белка А после введения; (4) сравнение уровня сывороточного амилоидного белка А со стадии (1) с уровнем сывороточного амилоидного белка А со стадии (3), где отсутствие увеличения или снижение уровня сывороточного амилоидного белка А является показателем подавления воспалительного ответа.
В восьмом аспекте в настоящем изобретении предлагается способ подавления воспалительного ответа у млекопитающего с воспалением, включающий (1) определение уровня сывороточного амилоидного белка А; (2) введение композиции, включающей антитело по п.16 в приемлемом фармацевтическом носителе; (3) определение уровня сывороточного амилоидного белка А после введения; (4) сравнение уровня сывороточного амилоидного белка А со стадии (1) с уровнем сывороточного амилоидного белка А со стадии (3), где отсутствие увеличения или снижение уровня сывороточного амилоидного белка А является показателем подавления воспалительного ответа.
В девятом аспекте в настоящем изобретении предлагается способ лечения млекопитающего, страдающего воспалительным заболеванием, в котором играет роль №20, включающий введение антагониста №20 млекопитающему так, чтобы воспаление снижалось, где антагонист включает антитело, фрагмент антитела или связывающий полипептид, который специфически связывается с полипептидом или фрагментом полипептида №22КА (8ЕО Ш NО:3) или представляет собой полипептид или фрагмент полипептида №22КА (8ЕО Ш NО:3); и где воспалительная активность №20 (8ЕО Ш NО:8) снижается. В одном осуществлении болезнь представляет собой хроническое воспалительное заболевание. В другом осуществлении хроническое воспалительное заболевание выбрано из воспалительного заболевания ки
- 53 009124 шечника, язвенного колита, болезни Крона, артрита, атопического дерматита или псориаза. В еще одном осуществлении болезнь представляет собой острое воспалительное заболевание. В другом осуществлении острое воспалительное заболевание выбрано из эндотоксемии, сепсиса, синдрома токсического шока или инфекционного заболевания. В еще одном осуществлении предлагается способ, как описано выше, где антитело дополнительно включает радионуклид, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу, лекарство или токсин.
В десятом аспекте в настоящем изобретении предлагается антитело, включающее моноклональное антитело, которое связывается с эпитопом ГЬ-20 человека (8ЕЦ ΙΌ N0:8), выбранное из группы, состоящей из полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 42 (Не) по 102 (Акр) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 42 (Не) по 60 (Не) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 42 (Не) по 69 (С1и) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 42 (Не) по 81 (Сук) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 42 (Не) по 96 (Ьук) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 42 (Не) по 102 (Акр) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 60 (Не) по 69 (С1и) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 60 (Не) по 81 (Сук) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 60 (Не) по 96 (Ьук) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 60 (Не) по 102 (Акр) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 69 (С1и) по 81 (Сук) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 69 (С1и) по 96 (Ьук) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 69 (С1и) по 102 (Акр) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 81 (Сук) по 96 (Ьук) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 81 (Сук) по 102 (Акр) 8ЕЦ ΙΌ N0:8; и полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 96 (Ьук) по 102 (Акр) 8ЕЦ ΙΌ N0:8.
В другом осуществлении предлагается антитело, как описано выше, где антитело снижает или нейтрализует активность ГЬ-20 человека (8ЕЦ ΙΌ N0:8). В еще одном осуществлении антитело выбрано из группы, состоящей из (а) моноклонального антитела мыши, (Ь) гуманизированного антитела, происходящего от (а), (с) фрагмента антитела и (б) моноклонального антитела человека. В другом осуществлении антитело дополнительно включает ПЭГилирование.
В одиннадцатом аспекте предлагается способ лечения патологического состояния субъекта, связанного с активностью ГЬ-20, включающий введение эффективного количества антитела, как описано выше, леча тем самым указанное патологическое состояние. В одном осуществлении патологическое состояние представляет собой хроническое воспалительное состояние. В другом осуществлении хроническое воспалительное состояние выбрано из воспалительного заболевания кишечника, язвенного колита, болезни Крона, артрита, атопического дерматита или псориаза. В еще одном осуществлении патологическое состояние представляет собой острое воспалительное заболевание. В другом осуществлении острое воспалительное состояние выбрано из эндотоксемии, сепсиса, синдрома токсического шока или инфекционного заболевания.
Изобретение далее иллюстрируется следующими неограничивающими примерами.
Пример 1. Очистка полипептида ГО-22КА2-Гс4 из трансфицированных клеток ВНК 570.
Если это не указано иначе, все операции проводили при 4°С. Для очистки полипептида £Ь-22КА2 (зрелого растворимого полипептида рецептора, состоящего из остатков с 23 по 231 8ЕЦ ΙΌ N0:13; полинуклеотиды показаны в 8ЕЦ ΙΌ N0:12), содержащего С-концевое сочленение с Гс4 человека (8ЕЦ ΙΌ N0:14), обозначенного ^-22^2-^4, применяли следующую процедуру. Приблизительно 16500 мл культуральной среды от клеток ВНК 570, трансфицированных ]Ь-22КА2-Гс4, фильтровали через 0,2 мкм стерилизующий фильтр, после чего добавляли раствор ингибиторов протеаз до конечной концентрации 0,001 мМ леупептина (Βοей^^ηде^-Маиηйе^т, ^ха^ро^к, Ш), 0,001 мМ пепстатина (ВоейппдегМаппНепп) и 0,4 мМ РеГаЬ1ос (Воейг1пдег-Маппйе1т). Наполняли колонку Рогок рго!ет А50 (объем слоя 20 мл. АррНеб Вюкук!етк) и промывали 400 мл ЗФР (С1Ьсо/ВКЬ). Полученную культуральную среду пропускали через колонку со скоростью 15 мл/мин с последующей промывкой 800 мл ЗФР (ВКЪ/С1Ьсо). [Ь-22КА2-Гс4 элюировали с колонки 0,1М глицином рН 3,0, и 5-мл фракции собирали прямо в 0,5 мл 2М трис рН 7,8 для доведения конечного рН во фракциях до 7,4.
Эффективность колонки оценивали с помощью Вестерн-блоттинга восстанавливающих гелей 8Ό8 РАСЕ исходной среды и не задерживаемой фракции. Вестерн-блоттинг с применением антитела НКР (АтегкНат) против ЦС человека выявил иммунореактивный белок 60000 Да в исходной среде и его отсутствие в не задерживаемой фракции, что предполагает полный захват.
Элюируемые фракции белка А50 оценивали с помощью восстанавливающего геля 8Ό8 РАСЕ. Данный гель показал наличие интенсивно окрашиваемой кумасси полосы 60000 Да во фракциях с 3 по 11. Фракции с 3 по 11 были объединены.
Объединенный элюат белок А50 концентрировали с 44 мл до 4 мл с помощью 30000 Да центрифужного концентратора ИНгаГгее Вютах (объем 15 мл, МННроге). Колонку для гельфилътрации
- 54 009124
8ерйасгу1 8-300 (объемом 175 мл; Рйагташа) промывали 350 мл ЗФР (ВКЬ/О1Ьсо). На колонку наносили концентрированный пул со скоростью 1,5 мл/мин с последующей промывкой 225 мл ЗФР (ВКЬ/О1Ьсо). Элюированные пики собирали в 2-мл фракции.
Элюированные фракции оценивали с помощью восстанавливающих и невосстанавливающих окрашиваемых серебром (Оеио Тес1шо1оду) 8Э8-РАОЕ гелей. Окрашенные серебром восстанавливающие 8Ό8 РАОЕ гели выявили интенсивно окрашиваемую полосу 60000 Да во фракциях 14-31, тогда как окрашенные серебром невосстанавливающие 8Ό8 РАОЕ гели выявили интенсивно окрашиваемую полосу 160000 Да во фракциях 14-31. Во фракциях 1-13 обнаружено много полос разного размера. Фракции 1431 объединяли, концентрировали до 22 мл с помощью 30000 Да центрифужного концентратора и1!га£гее Вюшах (объем 15 мл, М1Шроге). Данный концентрат фильтровали через 0,2 мкм стерилизующий фильтр Асгоб1кс (Ра11 Согрогайои).
Концентрацию белка в концентрированных объединенных фракциях оценивали с помощью ВСА анализа (Р1егсе, КоскГогб, Л), и материал разделяли на аликвоты и хранили при -80°С согласно стандартным процедурам заявителей. Концентрация объединенных фракций составляла 1,50 мг/мл.
Пример 2. Создание клеток ВаР3, экспрессирующих рецептор СКР2-4 (клеток ВаР3/СКР2-4) и клеток ВаР3, экспрессирующих рецептор СКР2-4 вместе с рецептором Л-22КА (клеток ВаР3/СКР2-4/I^22КА).
Клетки ВаР3, экспрессирующие полноразмерный рецептор СРК2-4, были созданы с применением 30 мкг экспрессионного вектора СРК2-4, описанного ниже. Клетки ВаР3, экспрессирующие рецептор СРК2-4, были названы ВаР3/СРК2-4. Данные клетки применяли в качестве контроля, и они были дополнительно трансфицированы полноразмерным рецептором Л-22КА (Патент США № 5965704) и использованы для скрининга активности Λ-22, как описано ниже.
A. Создание клеток ВаР3, экспрессирующих рецептор СКР2-4.
Полноразмерную последовательность кДНК СКР2-4 (ОеиЬаик Ассеккюи № Ζ17227) выделяли из библиотеки кДНК линии клеток Эанб! и затем клонировали в экспрессионный вектор рΖР7Р. ВаР3, зависимую от интерлейкина-3 (Λ-3) прелимфоидную линию клеток, берущую начало от костного мозга мыши (Ра1асюк аиб 8!сшшс!7, Се11 41: 727-734, 1985; МаШеу-Ргего! е! а1., Мо1. Се11. Вю1. 6: 4133-4135, 1986), поддерживали в полной среде (среда КРМI (1КН Вюкаеисе Лс., Ьеиеха, К8) с добавлением 10% инактивированной нагреванием сыворотки плодов телят, 2 нг/мл Л-3 мыши (ιηΛ-.Χ) (К & Ό, Мхииеаройк, М№), 2 мМ Ь-д1и!аМах-1™ (О1Ьсо ВКЬ), 1 мМ пирувата натрия (О1Ьсо ВКЬ) и антибиотиков Р8N (ОШС0 ВКЬ)). Перед электропорацией получали СКР2-4/рΖР7Р и очищали с помощью набора О|адеи Мах1 Ргер (0|аде1'1) в соответствии с указаниями производителя. Для электропорации клетки ВаР3 промывали один раз в бессывороточной среде КРМI и затем ресуспендировали в бессывороточной среде КРМI при плотности клеток 107 клеток/мл. Один мл ресуспендированных клеток ВаР3 смешивали с 30 мкг плазмидной ДНК СКР2-4/рΖР7Р и переносили в отдельные одноразовые камеры для электропорации (ОШС0 ВКЬ). После 15-минутной инкубации при комнатной температуре клетки подвергали двум последовательным шоковым воздействиям (800 1Раб/300 в.; 1180 1Раб/300 в.), обеспечиваемым прибором для электропорации (СЕЬЬ-Р0КАТ0К™; ОШС0 ВКЬ). После 5-минутного периода восстановления клетки, подвергнутые электропорации, переносили в 50 мл полной среды, и помещали в инкубатор на 15-24 ч (37°С, 5% СО2). Клетки затем осаждали и ресуспендировали в 50 мл полной среды, содержащей 2 мкг/мл пуромицина, во флаконе Т-162 для выделения устойчивого к пуромицину пула. Пулы трансфицированных клеток ВаР3, называемых здесь далее ВаР3/СКР2-4 клетками, анализировали на способность к проведению сигнала, как описано ниже. Более того, данные клетки дополнительно трансфицировали рецептором Ш22КА, как описано ниже.
B. Создание клеток ВаР3, экспрессирующих рецепторы СКР2-4 и Л-22КА.
Клетки ВаР3/СКР2-4, экспрессирующие полноразмерный рецептор Л^КА, получали, как описано выше, с применением 30 мкг экспрессионного вектора £Ь-22КА. После выявления трансфектанты подвергали отбору с применением 200 мкг/мл зеоцина и 2 мкг/мл пуромицина. Клетки ВаР3/СКР2-4, экспрессирующие рецептор Л^КА, обозначали как клетки ВаР3/СКР2-4ЛЬ-22КА. Данные клетки применяли для скрининга активности Λ-22, а также описанной здесь активности в качестве антагониста Ш22КА2.
Пример 3. Скрининг антагонистической активности Λ-22 с применением клеток ВаР3/СКР2-4/I^22КА с помощью теста пролиферации с аламаром синим.
А. Скрининг активности Λ-22 с применением клеток ВаР3/СКР2-4/I^-22КΑ с помощью теста пролиферации с аламаром синим.
Для тестирования наличия пролиферативной активности применяли очищенный £Ь-22-СЕЕ (пример 4), как описано ниже. Для антагонистического противодействия пролиферативному ответу на Λ-22 в данном тесте применяли очищенный I^-22КΑ2-Рс4 (пример 1), как описано ниже.
Клетки ВаР3/СКР2-4ЛЬ-22КА осаждали центрифугированием и промывали в полной среде (среда КРМI (ДКН Вюкс1еисе Лс., Ьеиеха, К8) с добавкой 10% инактивированной нагреванием сыворотки плодов телят, 2 нг/мл К-3 мыши (тШ-3) (К & Ό, Мшиеаройк, М№), 2 мМ Ь-д1и1аМах-1™ (О1Ьсо ВКЬ), 1 мМ пирувата натрия (О1Ьсо ВКЬ) и антибиотиков Р8N (ОШС0 ВКЬ)), но без тШ-3 (здесь далее обозначае
- 55 009124 мой как «среда без т1Ъ-3»). Клетки осаждали центрифугированием и промывали 3 раза для обеспечения удаления т[Ь-3. После этого клетки подсчитывали в гематоцитометре. Клетки высевали в 96-луночном планшете в количестве 5000 клеток на лунку в объеме 100 мкл на лунку с применением среды без т1Ь-3.
Пролиферацию клеток ΒаЕ3/СВЕЗ-4/I^-ЗЗВΑ оценивали с помощью белка ΙΕ-22-СЕЕ, разбавленного средой без ιηΙΕ-3 до концентрации 50, 10, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,13, 0,06 нг/мл. 100 мкл разбавленного белка добавляли к клеткам ΒаЕ3/СВЕЗ-4/I^-ЗЗВΑ. Суммарный объем тестирования равнялся 200 мкл. Планшеты для тестирования инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 3 дней, и в это время добавляли аламар синий (Асситеб, СЫсадο, Ш) в количестве 20 мкл/лунку. Планшеты вновь инкубировали при 37°С, 5% С02 в течение 24 ч. Аламар синий дает флуорометрический показатель, основанный на количестве живых клеток, и таким образом является прямым показателем пролиферации клеток по сравнению с отрицательным контролем. Планшеты вновь инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 24 ч. Планшеты считывали на планшетном ридере Етах™ (Μο1еси1а^ Эсисез 8иηηуνа1е, С А) с применением программы 8οйΜаx™ Рго при длинах волн 544 (возбуждение) и 590 (эмиссия). Результаты подтвердили зависимый от дозы пролиферативный ответ клеток ΒаЕ3/СВЕЗ-4/I^-ЗЗВΑ на Ш-22-СЕЕ. Измеренный ответ приблизительно в 15 раз превышал фон при высокой концентрации 50 нг/мл и снижался до 2-кратной индукции при низкой концентрации 0,06 нг/мл. Клетки дикого типа ΒπΕ3 и клетки ΒаЕ3/СВЕ2-4 не пролиферировали в ответ на ΙΕ-22-СЕЕ, что свидетельствует о том, что ΙΕ-22 специфичен в отношении гетеродимерного рецептора СВЕЗЧ/Ш-ЗЗВА. Для определения способности Ш-ЗЗВАЗ проявлять антагонистическую по отношению к ΙΕ-22 активность описанный выше тест повторяли с применением очищенного растворимого I^-22ВΑ2/Ес4. При сочетании ΙΕ-22 с Ш-ЗЗВАЗ в концентрации 10 мкг/мл ответ на ΙΕ-22 при всех концентрациях был снижен до фонового. Блокада пролиферативных эффектов ΙΕ-22 в присутствии растворимого Ш^ВАТ показывает, что он является сильным антагонистом лиганда ΙΕ-22. Данный анализ может быть применен для тестирования других описанных здесь антагонистов активности ΙΕ-22, таких как антитела против Ш-ЗЗВА.
Пример 4. Очистка ΙΕ-22-СЕЕ из клеток ΒΗΚ 570.
Если это не указано иначе, все операции производили при 4°С. Для очистки полипептида ΙΕ-22, содержащего С-концевую метку С1иС1и (ЕЕ) (8Еф ΙΌ N0: 15; или 8Еф ΙΌ N0: 16) применяли следующую процедуру. Культуральную среду от клеток ΒΗΚ, экспрессирующих ΙΕ-22-СЕЕ, концентрировали с помощью спирального картриджа Атзтоп 810Υ3 на РгоЕ1их А30. К концентрированной культуральной среде добавляли раствор протеазных ингибиторов до конечной концентрации 2,5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, 81дта Сйет1са1 Οο. 8!. Εουΐ3, МО), 0,003 мМ леупептина (Βοей^^ηде^Маппйет, Iηб^аηаρο1^з, Ш), 0,001 мМ пепстатина (Βοейπηде^-Μаηηйе^т) и 0,4 мМ РеίаЬ1οс (Βοей^^ηде^Маппйет). Отбирали образцы для анализа, и основную часть замораживали при -80°С до начала очистки. Общую концентрацию целевого белка в концентрированной культуральной среде определяли посредством 8Э8-РАСЕ и Вестерн-блоттинга с антителом против ЕЕ, конъюгированным с ИВР.
Приблизительно 100-мл колонку анти-ЕЕ-Сефарозы С (полученной, как описано ниже) получали в стеклянной колонке ^а!егз АР-5, 5 х 10 см. Колонку упаковывали потоком и уравновешивали на Βίοίΐ^ 8ргш! (Рег8ерЦуе Β^ο8уз!етз, Егатшдйат, МА) забуференным фосфатом солевым раствором (ЗФР) рН 7,4. Концентрированную культуральную среду оттаивали, стерильно фильтровали через фильтр 0,2 мкм, рН доводили до 7,4, после чего наносили на колонку в течение ночи при скорости тока приблизительно 1 мл/мин. Колонку промывали 10 объемами колонки (СУ) забуференного фосфатом солевого раствора (ЗФР, рН 7,4), после чего содержимое элюировали 200 мл ЗФР (рН 6,0), содержащим 0,5 мг/мл пептида ЕЕ (Апазрес, 8ап .^зе, СА) при скорости 5 мл/минуту. Примененный пептид ЕЕ имеет последовательность ΕΥΜРΜΕ (8Еф ΙΌ N0:15). Колонку промывали 10 СУ ЗФР, затем элюировали 5 СУ 0.2М глицина, рН 3,0. рН элюированной глицином колонки доводили до 7,0 2 СУ 5х ЗФР, после чего уравновешивали ЗФР (рН 7,4). На протяжении всей элюирующей хроматографии собирали фракции по 5 мл и отслеживали поглощение при 280 и 215 нм; сохраняли и анализировали также не задерживаемые и промывочные объемы. Пиковые фракции элюции ЕЕ-полипептида анализировали на предмет целевого белка посредством окраски серебром 8Ό8 РАСЕ и Вестерн-блоттинга с помощью антитела против ЕЕ, конъюгированного с ЧВР. Фракции элюции интересующего полипептида объединяли и концентрировали из 60 мл до 5,0 мл с помощью концентратора вращения с границей пропускания мембраной молекулярной массы 10000 дальтон (Μ^11^ρο^е, Βебίο^б, МА) в соответствии с указаниями производителя.
Для отделения ΙΕ-22-СЕЕ от других соочищаемых белков концентрированные объединенные фракции элюции полипептида подвергали Р0В08 Ηφ-50 (сильная анионообменная смола от Рег8ерЦуе Βίο8уз!етз, Егатшдйат, МА) при рН 8,0. Колонку 1,0х6,0 см набивали и упаковывали потоком на Βίοίΐ^ 8ргт!. Колонку нагружали противоионом, после чего уравновешивали 20 мМ Трис рН 8,0 (Трис (гидроксиметиламинометан)). Образец разбавляли 1:13 (для снижения ионной силы ЗФР), после чего наносили на колонку Βοιτ^ Ηφ со скоростью 5 мл/минуту. Колонку промывали 10 СУ 20 мМ Трис рН 8,0, после чего элюировали 40 СУ градиента 20 мМ Трис/1М хлорида натрия (№1С1) при скорости 10 мл/мин. На протяжении всей хроматографии собирали фракции 1,5 мл и отслеживали поглощение при 280 и 215 нм. Фракции элюции пика анализировали посредством окрашивания серебром 8Ό8 РАСЕ. Интересующие фракции объединяли и концентрировали до 1,5-2 мл с помощью концентратора вращения с границей
- 56 009124 пропускания мембраной молекулярной массы 10000 Да (МБШроге, ВебБогб, МА) в соответствии с указаниями производителя.
Для отделения полипептида БЬ-22-СЕЕ от пептида ЕЕ и любых загрязняющих соочищаемых белков объединенные концентрированные фракции подвергали хроматографии исключения по размеру на колонке 1,5х90 см Сефадекса 8200 (РЙагтасБа, РБксаБа^ау, N1), уравновешенной и загружаемой ЗФР при скорости тока 1,0 мл/мин с применением ВБоСаб 8ргБпБ. На протяжении всей хроматографии собирали фракции 1,5 мл и отслеживали поглощение при 280 и 215 нм. Фракции пика характеризовали посредством окрашивания серебром 8Ό8 РАСЕ, и объединяли лишь наиболее чистые фракции.
Данный материал представлял очищенный полипептид БЬ-22-СЕЕ.
Данный очищенный материал, наконец, наносили на 4 мл колонку АсББС1еап ЕБох (8Бегодепе) для удаления оставшихся эндотоксинов. Образец пропускали через уравновешенную ЗФР колонку самотеком четыре раза, после чего колонку промывали один раз 3 мл ЗФР, которые объединяли с «очищенным» образцом. Материал затем подвергали стерильному фильтрованию на фильтре 0,2 мкм и хранили при -80°С до аликвотирования.
При Вестерн-блоттинге, окрашивании 8Ό8 РАСЕ кумасси синим и серебром полипептид БЬ-22-СЕЕ был единственной главной полосой. Концентрацию белка очищенного материала определяли с помощью анализа ВСА (РБегсе, ВоскБогб, БЬ), и белок аликвотировали и хранили при -80°С в соответствии со стандартными процедурами.
Для получения анти-ЕЕ Сефарозы 100 мл объема слоя протеин С-Сефарозы (РйагтасБа, РБксаБа^ау, N1) промывали три раза 100 мл ЗФР, содержащего 0,02% азида натрия с применением фильтровальной единицы №11депе на 500 мл 0,45 микрон. Гель промывали 6,0 объемами 200 мМ триэтаноламина, рН 8,2 (ТЕА, 8Бдта, 8Б. ЬоиБк, МО) и добавляли равный объем раствора антитела против ЕЕ, содержащий 900 мг антитела. После инкубации в течение ночи при 4°С несвязанное антитело удаляли промывкой смолы 5 объемами 200 мМ ТЕА, как описано выше. Смолу ресуспендировали в 2 объемах ТЕА, переносили в подходящий контейнер, и к гелю протеин С-Сефарозы добавляли диметилпимилимидат-2НС1 (РБегсе, ВоскБогб, БЬ), растворенный в ТЕА, до конечной концентрации 36 мг/мл. Гель покачивали при комнатной температуре в течение 45 мин, и жидкость удаляли с помощью фильтровальной единицы, как описано выше. Неспецифичные сайты на геле затем блокировали инкубацией в течение 10 мин при комнатной температуре с 5 объемами 20 мМ этаноламина в 200 мМ ТЕА. После этого гель промывали 5 объемами ЗФР, содержащего 0,02% азида натрия, и хранили в данном растворе при 4°С.
Пример 5. Действие полипептида БЬ-22 Бп νί\Ό.
Мышей (самки линии С57ВЬ/6^ в возрасте 8 недель, Сйаг1ек РЬег ЬаЬк, КБпдкБоп, ΝΥ) делили на три группы. Ранее с помощью стандартных способов был получен аденовирус, экспрессирующий полипептид БЬ-22 (8ЕЦ Ю ΝΟ: 6). В день 0 первой (п=8) и второй (п=8) группам через хвостовую вену вводили исходный или БЬ-22 аденовирус, соответственно, причем каждая мышь получала дозу ~1х10п частиц в объеме ~0,1 мл. Третья группа (п=8) не получала лечения. На 12 день мышей взвешивали, и у них брали кровь. Образцы анализировали в соответствии с полным анализом крови (СВС) и химией сыворотки. Было обнаружено статистически значимое увеличение количества нейтрофилов и тромбоцитов в образцах крови в группе с введением БЬ-22 аденовируса по сравнению с группой, получавшей исходный аденовирус. Также количество лимфоцитов и эритроцитов было значительно снижено в группе с введением БЬ-22 аденовируса по сравнению с группой, получавшей исходный аденовирус. Кроме того, мыши, получавшие БЬ-22 аденовирус, теряли в весе, тогда как мыши, получавшие исходный аденовирус, прибавляли в весе. Также уровень БЬ-22 в сыворотке был повышен, а уровень глюкозы понижен на 3 день. Таким образом, БЬ-22 адено-мыши проявляли ответ острой фазы, который мог быть также вызван другими провоспалительными цитокинами, такими как Т№-альфа, БЬ-1бета и цитокинами др130. Ответ острой фазы представляет собой набор немедленных воспалительных ответов, инициируемый молекулами, узнающими паттерн. Белки острой фазы обеспечивают повышенную защиту от микроорганизмов и модифицируют воспалительные ответы, влияя на перемещение клеток и высвобождение медиаторов. Например, 8АА обладает значительным активирующим действием на лейкоциты, включая индукцию хемотаксиса, повышение адгезии лейкоцитов к клеткам эндотелия и увеличение фагоцитоза. Выявление факторов, которые инициируют и меняют величину и длительность ответа острой фазы, представляет собой важный этап в разработке новых терапевтических средств для инфекционных и воспалительных заболеваний.
Результаты позволяют предполагать, что БЬ-22 влияет на гематопоэз, т.е. образование клеток крови Бп νί\Ό. По существу БЬ-22 мог бы обладать биологической активностью, влияющей на различные стволовые клетки крови, повышая или снижая тем самым определенные линии некоторых дифференцированных клеток крови. Например, БЬ-22, видимо, снижает лимфоциты, что, вероятно, обусловлено ингибированием коммитированных клеток-предшественников, которые дают начало лимфоидным клеткам. БЬ-22 также снижает эритроцитов, что подтверждает мнение о том, что БЬ-22 мог бы играть роль в анемии, инфекции, воспалении и/или иммунных заболеваниях за счет влияния на клетки крови, участвующие в данных процессах. Антагонисты БЬ-22, такие как антитела или растворимый БЬ-22ВА2, могли бы быть применены в качестве терапевтических агентов при данных заболеваниях.
- 57 009124
Более того, данные эксперименты с применением ΙΕ-22 аденовируса у мышей позволяют предполагать, что избыточная экспрессия ΙΕ-22 повышает уровень нейтрофилов и тромбоцитов 1и у1уо. Возможно, существуют другие факторы (такие как цитокины и модифицирующие гены), участвующие в ответах на ΙΕ-22 в целостном организме животного. Тем не менее, эти данные четко указывают на участие ΙΕ-22 в гематопоезе. Таким образом, ΙΕ-22 и его рецепторы являются подходящими реагентами/мишенями для диагностики и лечения множества заболеваний, таких как воспаление, иммунные заболевания, инфекция, анемия, гематопоэтические и другие типы рака и тому подобное.
Пример 6. Экспрессирующие ΙΕ-22 трансгенные мыши.
A. Создание трансгенных мышей, экспрессирующих ΙΕ-22 мыши.
Фрагменты ДНК из трансгенного вектора, содержащего 5'- и 3'-фланкирующие последовательности промотора ЕцЬСК, специфичного для лимфоидной ткани, ΙΕ-22 мыши (8Е0 ΙΌ N0:10; полипептид показан в 8Е0 ΙΌ N0:11), интрон ΙΙ инсулина крысы, кДНК ΙΕ-22 и поли-А последовательность гормона роста человека, получали стандартными способами и применяли для микроинъекции в оплодотворенные ооциты мыши В6С3Г1 (Тасошс, Сегтаи!о^и, ΠΥ) с применением стандартного протокола микроинъекций. См. Иодт В. е! а1., Машри1а!шд !1е Мойке ЕтЬгуо. А ЬаЬога!огу Маииа1, Со1б 8рпид ИагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, 1994.
Среди 154 детенышей было идентифицировано двадцать пять мышей, трансгенных в отношении ΙΕ22 со специфичным для лимфоидной ткани промотором ЕцЬСК. Одиннадцать из трансгенных детенышей погибли в течение нескольких часов после рождения, девять трансгенных детенышей с блестящей внешностью были забиты в день рождения, а двое выращены до взрослого состояния. У одного взрослого животного уровень экспрессии был низким. От забитых детенышей были получены и гистологически исследованы ткани, как описано ниже.
Блестящая внешность новорожденных, по-видимому, была связана с отвердением кожи, как если бы их высушивали, что приводило к снижению правильного кормления. Их движения в целом стали жесткими.
B. Генотипический и экспрессионный анализ трансгенных мышей.
От трансгенной линии ΙΕ-22 мышей под контролем промотора ЕцЬск, описанной выше, новорожденные детеныши были обследованы на предмет аномалий в первый день (день рождения) и забиты для сбора тканей. Всем детенышам были прикреплены на ухо индивидуальные номера, и были отмечены те, которые отличались фенотипом блестящей кожи на момент забоя. Из двенадцати детенышей шесть обладали фенотипом блестящей кожи, причем двое были отмечены, как «тяжелые» фенотипы. Тяжелые фенотипы были определены как маленькие детеныши с низкой подвижностью, кожа которых была особенно блестящей и очень сухой. Кожу собирали с левого бока каждого детеныша и замораживали в Т1ккие-Тек заключающей среде.
Генотипирование подтвердило, что блестящая кожа является хорошим показателем трансгенного статуса, хотя данных по экспрессии не собирали. Из блоков замороженной кожи на криостате делали срезы 7 мкм и окрашивали для выявления СЭ3, СЭ4, СЭ8, макрофагов мыши, В-клеток, СЭ80 и МНС класса ΙΙ. Протокол окрашивания включал связывание имеющихся в продаже антител с тканью, выявление с помощью меченого пероксидазой вторичного антитела и хромогенной реакции с ЭАВ для визуализации окрашивания.
Было обнаружено, что у трансгенных животных повышено содержание МНС класса ΙΙ и СЭ80, которые окрашиваются на антиген-презентирующих клетках и дендритных клетках, соответственно. Маркер макрофагов также выявил большее количество клеток у тяжелых и не тяжелых трансгенных животных по сравнению с животными дикого типа, хотя распределение данных клеток было приурочено преимущественно к наружной дерме. Животные, отнесенные к тяжелому фенотипу, имели наиболее выраженную окраску всех трех данных маркеров с сильным повышением интенсивности окрашивания клеток и их количества по сравнению с диким типом. Данное отклонение может быть обусловлено различиями в уровне экспрессии ΙΕ-22 у данных трансгенных исходных детенышей. Позитивные в отношении МНС класса ΙΙ клетки локализовались в нижнем дермисе в виде неорганизованных открытых скоплений, тогда как СО80-позитивные клетки находились предпочтительно ниже дермиса, либо внутри, либо непосредственно над мышечным/жировым слоем. Данные две популяции клеток, по-видимому, не перекрываются. Все другие маркеры окрашивались одинаково у всех животных. Окраска толуидиновым синим тучных клеток показала слабое отличие или отсутствие отличий между животными дикого типа и трансгенными животными.
C. Микроскопическая оценка тканей от трансгенных мышей: ΙΕ-22 ТС с промотором ЕиЬск имеет гистологию неонатальной летальности.
В день рождения детеныши из пометов, содержащих трансгены ΙΕ-22, были гуманно умерщвлены, и все тело было фиксировано погружением в 10% забуференный формалин. Для последующего исследования использовали шесть трансгенных и два нетрансгенных детеныша. Было отмечено, что четыре из шести трансгенных животных имеют блестящую кожу в момент эвтаназии. Фиксированные ткани разрезали на 5 срезов (продольные срезы головы и поперечные срезы верхней и нижней части грудной клетки
- 58 009124 и верхней и нижней части брюшного отдела). Из фиксированных тканей получали срезы 5 мкм (микротом Линд 2065 Зирегси!, Ьеюа М1сгокук1етк, Ае121аг, Германия) и окрашивали Н&Е. Окрашенные ткани оценивались с помощью световой микроскопии (№^п ЕсИрке Е600, №^п 1пс., МеМ11е, N7) группой специалистов (АСУР), имеющих сертификат ветеринарного патолога.
При микроскопическом исследовании было обнаружено, что эпидермис двух трансгенных детенышей был толще, чем эпидермис других шести мышей, включая контрольных. Не было отмечено других аномалий в коже и других тканях всех мышей. Репрезентативные участки кожи соответствующих областей груди и брюшного отдела обследовали с помощью 40х объектива и цифрового фотоаппарата (^рег Зс1епййс, 1пс., Зап ^^едο, СА), присоединенного к микроскопу. Толщину эпидермиса затем определяли с помощью гистоморфометрической программы (Зсюп Опаде £ογ А^пбονк (N111 Гтаде), Зсюп С/яр., Егебег1ск, МБ, ν. Β4.0.2). Результаты, представленные в табл. 5, были следующими:
Таблица 5
Генотип/фенотип Средняя толщина кожи груди (мкм) Средняя толщина кожи брюшного отдела (мкм)
Нетрансгенные/нормальные 5,2 5,4
Трансгенные/неблестящие 5,0 6,7
Трансгенные/блестящие 8,2 7,4
Трансгенные/все 7,1 7,1
Для определения статистической значимости количество мышей было недостаточным; однако, у трансгенных животных, в особенности у животных с блестящей кожей имелась тенденция к более толстому эпидермису по сравнению с неблестящими трансгенными и нетрансгенными контрольными животными. Возможно, блестящие трансгенные животные имеют более высокий уровень экспрессии 1Ь-22 по сравнению с неблестящими трансгенными животными; уровень экспрессии у данных мышей не был, однако, определен. Это позволяет предполагать участие 1Ь-22 в псориазе, псориазном артрите или других воспалительных состояниях кожи или других воспалительных заболеваниях.
Пример 7. Действие полипептида Ш-22 ш νίνο.
А. Мыши, инфицированные аденовирусом Ш-22, проявляют индукцию ЗАА.
Мышей (самки линии С57Β^/6N в возрасте 8 недель; СЬаг1ек КШег ЬаЬк, КтдкЮп, N7) делили на три группы. Ранее с помощью стандартных способов был получен аденовирус, экспрессирующий полипептид 1Ь-22 (ЗЕР ΙΌ N0:6). В день 0 первой (п=8) и второй (п=8) группам через хвостовую вену вводили исходный или ΙΕ-22 аденовирус, соответственно, причем каждая мышь получала дозу ~1х10п частиц в объеме ~0,1 мл. Третья группа (п=8) не получала лечения. На 12 день мышей взвешивали, и у них брали кровь. На 20 день исследования мышей забивали, фиксировали массу тела, и кровь и ткани собирали для анализа.
Все образцы крови анализировали в соответствии с полным анализом крови (СВС) и химией сыворотки. На 12 и 20 дни было выявлено статистически значимое повышение количества нейтрофилов и тромбоцитов в образцах крови в группе, получавшей аденовирус Ш-22, по сравнению с группой, получавшей исходный аденовирус. Также было значительно снижено количество лимфоцитов в группе, получавшей аденовирус ΙΕ-22, по сравнению с группой, получавшей исходный аденовирус, на 12 день, но на 20 день наблюдался противоположный эффект. Кроме того, получавшие аденовирус Ш-22 мыши теряли в весе, тогда как получавшие исходный аденовирус мыши прибавляли в весе. В образцах сыворотки от группы, получавшей аденовирус Ш-22, глюкоза была значительно снижена в обеих временных точках по сравнению с группой, получавшей исходный аденовирус. В обеих временных точках был также значительно снижен сывороточный альбумин. На 20 день был значительно снижен азот мочевины сыворотки. Уровень сывороточного глобулина был значительно увеличен в группе, получавшей аденовирус Ш22, по сравнению с группой, получавшей исходный аденовирус, в обеих временных точках. Микроскопически наблюдаемым гистоморфологическим изменением, приписываемым Ш-22, была регенерация трубочек в почках. Хотя это и не является необычным для мышей, в данной группе животных возрастала ее частота и тяжесть. Нефропатия характеризуется как многоочаговые области базофилии эпителиальных клеток корковых трубочек.
Для подтверждения результатов и получения дополнительных примеров был проведен дополнительный эксперимент, идентичный по дизайну описанному выше. В данном исследовании массу тела измеряли через каждые три дня, кровь отбирали у мышей через 3 дня после инъекции аденовируса, и мышей забивали для получения образцов крови и тканей на 10 день (п=4 на группу) и 20 день (п=4 на группу). Вновь было обнаружено увеличенное количество нейтрофилов и тромбоцитов в образцах крови в группе, получавшей Ш-22 аденовирус, по сравнению с группой, получавшей исходный аденовирус. Данный эффект был очевиден для нейтрофилов к 3 дню, но количество тромбоцитов не отличалось существенно до 10 дня. Также количество лимфоцитов было значительно снижено в группе, получавшей
- 59 009124
ΙΕ-22 аденовирус, по сравнению с группой, получавшей исходный аденовирус, на 3 и 10 дни, но оно было увеличено на 20 день, как и в предшествующем исследовании. Сходным образом мыши, получавшие ΙΕ-22 аденовирус, теряли в весе на протяжении эксперимента, тогда как мыши, получавшие контрольный вирус, и необработанные мыши прибавляли в весе. Химические параметры сыворотки соответствовали предшествующему исследованию. В данном исследовании были также подтверждены гистологические данные о регенерации канальцев в почках, связанной с введением ΙΕ-22 аденовируса. Это соответствовало дополнительным данным об умеренной протеинурии у мышей, получавших ΙΕ-22 аденовирус (день 20).
Результаты позволяют предполагать, что ΙΕ-22 влияет на гематопоэз, т.е. образование клеток крови 1п νί\Ό. По существу, ΙΕ-22 мог бы обладать биологической активностью, оказывающей влияние на различные стволовые клетки крови, что приводило бы к повышению или снижению конкретных дифференцированных клеток крови определенных линий. Например, ΙΕ-22, по-видимому, снижает лимфоциты, что, вероятно, обусловлено ингибированием коммитированных клеток-предшественников, дающих начало лимфоидным клеткам, что подтверждает мнение о том, что ΙΕ-22 мог бы играть роль в анемии, инфекции, воспалении и/или иммунных заболеваниях, влияя на клетки крови, участвующие в данных процессах. Антагонисты ΙΕ-22, такие как антитела или его растворимый рецептор Ш^ЗКАЗ, могли бы быть применены в качестве терапевтических агентов при данных заболеваниях.
Более того, данные эксперименты с применением ΙΕ-22 аденовируса у мышей позволяют предполагать, что избыточная экспрессия ΙΕ-22 повышает уровень нейтрофилов и тромбоцитов 1п νί\Ό. Возможно, что существуют другие факторы (такие как цитокины и модифицирующие гены), участвующие в ответах на ΙΕ-22 в целостном организме животного. Тем не менее, данные результаты явно свидетельствуют об участии ΙΕ-22 в гематопоезе. Таким образом, ΙΕ-22, антитела против ΙΕ-22, растворимые рецепторы ΙΕ22 КА (например, 8ЕЦ ΙΌ N0:3) и антитела против !Б-22КА являются подходящими реагентами/мишенями для диагностики и лечения разнообразных заболеваний, таких как воспаление, иммунные заболевания, инфекция, анемия, гематопоэтические и другие типы рака и тому подобного.
Связь экспрессии Ш-22 с потерей веса, появлением белка 8АА острой фазы и метаболическими изменениями, о которых свидетельствуют снижение уровня глюкозы, альбумина и азота мочевины в сыворотке, позволяет предполагать, что Ш-22 является цитокином, который действует на ранней стадии при некоторых воспалительных ответах. Мыши, получавшие Ш-22 аденовирус, могут отражать состояние хронического воспаления, такого, какое наблюдается при !ВЭ, язвенном колите, артрите, псориазе, псориазном артрите, астме и тому подобном. Некоторые нежелательные воспалительные процессы могли бы быть ингибированы с помощью применения антагониста ΙΕ-22, такого как антитела против ΙΕ-22, и его рецепторы, такие как растворимые рецепторы Ш-22КА (например, 8ЕЦ ΙΌ N0:3), и антитела против Ш22КА и тому подобного.
B. Ш-22 является провоспалительным цитокином: уровень 8АА в сыворотке у мышей адено-!Е-22.
Для определения уровня 8АА у мышей адено-Ш^ был применен ИФА с использованием набора и протокола Моизе 8АА Iттиποаззау (Вюзоигсе Е'Иегпаиопак СайГогша, И8А). В планшеты для тестирования, предварительно покрытые антителом против 8АА мыши, вносили разбавленные стандарты и анализируемые образцы вместе с НКР-антителом против 8АА мыши. Планшеты инкубировали в течение одного часа при 37°С и затем промывали согласно указаниям к набору. Планшеты проявляли в течение 15 минут при комнатной температуре с применением ТМВ и проявление останавливали 2М Н2804. Считывали поглощение при 450 нм с помощью 8рес1готах 190 (Мо1еси1аг □еу1сез, СайГогша, США). Полученные данные анализировали с помощью 8ойтах Рго (Мо1еси1аг □еу1сез, СайГогша, США) и Ехсе1 (Мюгозой Согр., №азЫпд1оп, США).
Мыши, инфицированные ΙΕ-22-аденовирусом, имели значительно повышенный уровень т8АА, более чем 10-кратный, по сравнению с контролем с исходным аденовирусом.
C. Анализ мышей, инфицированных ΙΕ-22-аденовирусом, с помощью проточной цитометрии.
Для анализа влияния экспрессии Ш-22 1п νί\Ό аденозирусом авторы выделяли периферическую кровь, селезенку и костный мозг из инфицированных ΙΕ-22-аденовирусом мышей линии С57ВБ/6Н на 10 и 20 дни после инфицирования. Приблизительно 100 мкл крови собирали в гепаринизированные пробирки, после чего удаляли эритроциты посредством гипотонического лизиса (клетки лизировали в 4,5 мл дН2О в течение ~5 с перед добавлением 1,5 мл 3,6% №1С1). Селезенки разрушали между двух матовых стеклянных пластин, и выделенные клетки пропускали через мембрану Ку£ех (клеточное сито) и осаждали. Костный мозг получали разрушением одного бедра в ступке с пестиком и пропусканием клеток через клеточное сито (Еа1соп). Клетки ресуспендировали в буфере для промывки ЕАС8 (№В=НВ88/1% БСА/10 мМ 1ерез), подсчитывали в трипановом синем, и 1х106 жизнеспособных клеток каждого типа аликвотировали в 5-мл полистироловые пробирки. Клетки промывали и осаждали, после чего инкубировали в течение 20 мин на льду со смесями флуоресцентно-меченых (ПТС РЕ и СуСЫготе) моноклональных антител (РЫагМтдеп, 8ап О1едо, СА), узнающих различные маркеры клеточной поверхности, применяемые для идентификации конкретных типов иммунных клеток. Данные маркеры включают следующие (перечислены в группах из 3, тестированных заявителями». Для окрашивания крови: СЭ3, Сг1 и В220; для окрашивания селезенки: СО62Й, СЭ44 и СО3; СО21, СЭ23 и В220; !дО, !дМ и В220; СО11Ь, Сг1 и
- 60 009124
СБ8; для окрашивания костного мозга: СБ11Ь, Ог1, СБ3; ΙμΙλ 1дМ и В220. Клетки промывали 1,5 мл АВ и осаждали, после чего ресуспендировали в 0,4 мл АВ и анализировали на ЕАСЗсап с применением программы Се11С)иез! (Вес1оп [Хсктзоп, Моип1ат У1е\у, СА).
Авторы обнаружили, что фракция нейтрофилов в крови мышей, обработанных 1Ь-22-адено, была увеличена 4-13-кратно на 10 день и 2-3-кратно на 20 день. На 10 день данная разница приводила к одновременному снижению доли лимфоцитов и моноцитов в крови. В костном мозге авторы обнаружили ~1,5-кратное снижение общего количества В-клеток, тогда как процент зрелых рециркулирующих Вклеток возрастал, а общее количество незрелых В-клеток слегка снижалось на 10 день. На 20 день многие из данных различий не были заметны, хотя авторы действительно обнаружили небольшое увеличение доли зрелых рециркулирующих В-клеток. В селезенке общее количество В-клеток слегка снижалось (1,5-2-кратно) в оба дня тестирования, в то время как фракция В-клеток периферийной зоны (СБ21+СП23-В220+) возрастала до 2-кратного размера, а количество фолликулярных В-клеток (СБ21+СП23+В220+) снижалось 2-кратно. Считается, что В-клетки периферийной зоны являются первой линией обороны от патогенов, поскольку они более чувствительны к митогенам В-клеток (например, ЬР8), чем более обычные фолликулярные В-клетки, и когда они встречают свой соответствующий антиген, они очень быстро дифференцируются в секретирующие антиген клетки. Возможно, что 1Ь-22 либо повышает превращение В-клеток фолликулярной зоны в В-клетки периферийной зоны, либо избирательно подавляет менее зрелые фолликулярные клетки. Изменения в количестве В-клеток, обнаруживаемых в костном мозге, могут отражать ускоренную дифференцировку пре/про и/или незрелых В-клеток или повышенный приток рециркулирующих В-клеток из крови/селезенки и, возможно, одновременное увеличение выхода незрелых В-клеток на периферию. Действительное количество зрелых ВМ В-клеток не возрастает, так что ГО-22, возможно, не увеличивает их пролиферацию. Альтернативно, ГО-22 может блокировать, снижать или ингибировать дифференцировку незрелых В-клеток и тем самым увеличивать относительную представленность зрелых В-клеток.
Ό. ГО-22ВА2-Ес4 нейтрализует активность ГО-22 1п у1уо: ИФА 8АА показывает, что индуцированная ГО-22 экспрессия 8АА подавляется введением ГО-22ВА2-Ес4.
Для оценки того, может ли ГО-22ВА2 ингибировать индукцию 8АА под действием ГО-22, мышей (самки линии С3Н/НЕ1 в возрасте 8 недель; Даскзоп ЬаЬз, Ваг НагЬог, МЕ) делили на пять групп по три животных в каждой и обрабатывали в/б введением белков, как показано в таблице 6 ниже.
Таблица 6
Группа № 1Б-22 1Б-22КА2
Группа 1: - -
Группа 2: - 100 мкг
Группа 3: 3 мкг -
Группа 4: 3 мкг 20 мкг
Группа 5: 3 мкг 100 мкг
Инъекции ГО-22ВА2 производили за 15 мин до инъекций ГО-22. Обе инъекции белков осуществляли внутрибрюшинным путем. Образцы крови получали от каждой мыши до введения и затем через 2 и 6 ч после введения. Из каждого образца получали сыворотку для измерения 8АА и ГО-22.
ИФА проводили, как описано ранее, для определения 8АА у мышей, получавших ГО-22 и растворимый рецептор ГО-22, ГО-22ВА2-Ес4, описанный здесь. У мышей, получавших 3 мкг ГО-22 в сочетании с ГО-22ВА2-Ес4 в концентрации 20-100 мкг, было обнаружено снижение уровня 8АА, индуцированного одним ГО-22, до базального уровня, что показало, что ГО-22ВА2 ингибирует активность ГО-22 в индукции 8АА 1п у1уо.
Пример 8. Экспрессия ГО-22 при мышиной модели воспалительного заболевания кишечника.
Воспалительное заболевание кишечника (1ВБ) представляет собой многофакторное заболевание, подразделяемое на два типа, язвенный колит (ИС) и болезнь Крона (СБ). Этиология данных заболеваний в настоящее время неизвестна, а клинические проявления различны. ИС ограничивается ободочной кишкой, и симптомы включают кровянистую диарею, потерю в весе и боли в животе. Макроскопические особенности ИС включают пятнистые язвы и укороченную ободочную кишку. Напротив, болезнь Крона может также затрагивать другие части кишечника. Симптомы включают диарею (которая реже по сравнению с наблюдаемой при ИС бывает кровянистой), слабую лихорадку и боль. Макроскопические особенности включают фиброзный и стенозированный кишечник со стриктурами, глубокими язвами, бороздами и фистулами.
Существует несколько животных моделей, которые имитируют данные заболевания человека. Обычно применяемыми тремя моделями колита для скрининга новых лекарств являются индуцированная 2,4,6-тринитробензолсульфокислотой (ТКВ8) крысиная модель, мышиная модель с переносом Тклеток и индуцированная натрия сульфатдекстраном, или Ό88 мышиная модель. Модель Ό88 была разработана на основе модели д-ра 8. МигФу с применением балловой системы показателей активности за- 61 009124 болевания (8.Ν.8. Миййу, Тгеа!теп! οΓ Цех!гап 8и1Га!е 8οб^ит-Iηбисеб Миппе СоННк Ьу Iη!^асο1οη^с Сус1οкρο^^η, Ц1дек!йе Шкеакек апб 8с1епсек, Αο1. 38, Νο. 9 (8ер!етЬег 1993), рр.1722-1734).
В настоящем исследовании острый колит развивался, когда в воду для питья мышей добавляли Ό88 в течение 6 дней. Животные проявляли потерю в весе и кровянистую диарею, имитируя состояние больных иС. Механизм повреждающего действия Ό88 не вполне охарактеризован, но полагают, что агент индуцирует неспецифический воспалительный иммунный ответ и имитирует действие факторов окружающей среды на кишечник. Возможно, что образуется Н28, который мог бы быть токсичным для клеток. Кроме того, происходят изменения в люминальной бактериальной флоре. В ободочной кишке были обнаружены активированные моноциты, макрофаги и тучные клетки. Медиаторы всех трех животных моделей включают воспалительные простагландины, метаболиты лейкотриенов и цитокины.
A. Способ.
Колит вызывали потреблением Ό88 у самок мышей 8у1кк УеЬк!ег от СНаг1ек Кйег ^аЬο^а!ο^^ек. В начале исследования мыши были в возрасте 10 и 11 недель. Мышам давали 4% Ό88 в питьевой воде на протяжении 6 дней (мыши с обработкой) или просто нормальную воду для питья (контрольные мыши). Применяли балловый клинический показатель активности заболевания (ЦА1), который включает сочетание измерений, включая качество стула, скрытую кровь и потерю веса. ΌΛΙ получали ежедневно для каждой мыши, начиная со дня после введения Ό88. Через 6 дней Ό88 удаляли из воды для питья мышей с обработкой. Всех мышей отслеживали с помощью клинической балловой оценки ΌΛΙ до забоя на 2, 7 или 10 дни после начала исследования. В каждый из дней 2 и 7 забивали четыре обработанных Ό88 и одну контрольные мыши. На 10 день забивали четыре обработанных Ό88 и две контрольные мыши. У всех животных после забоя измеряли длину ободочной кишки. Срезы ободочной кишки фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине для гистологического анализа или замораживали для экстракции мРНК.
B. Гистологическая балловая оценка и балловый показатель активности заболевания (ЭА1).
Гистологические балловые показатели получали в соответствии со способом в ссылке 1. В общем виде срезы ободочной кишки оценивались вслепую патологом по количеству крипт, гиперпластическому эпителию, искривлению крипт и воспалению.
Ежедневно каждую мышь ранжировали в соответствии с клинической количественной оценкой на основе потери веса, консистенции стула и кишечного кровотечения. Более высокие показатели обусловливались большими величинами потери веса, диареи и кровоточивости. Ежедневный количественный показатель для каждой мыши представлял собой средний уровень, полученный на основе трех результатов/наблюдений.
C. Результаты.
Длина ободочной кишки у обработанных Ό88 мышей была несколько меньше на 7 и 10 дни по сравнению с необработанным контролем, но результаты, возможно, не были достоверными (не поддающимися контролю при применении статистических методов). Клинические показатели ЭА1 отражали рост симптомов заболевания у обработанных Ό88 мышей сходно с наблюдавшимся в последних исследованиях с применением данной модели. Скрытая кровь была наибольшей на приблизительно 4 и 5 дни, тогда как жидкий стул преобладал на 6 и 7 дни. Гистопатологические результаты показывают, что показатели заболевания отличались от контроля во все дни забоя, особенно на 7 (пик) и 10 дни. Показатели гистопатологического скрининга составляли: контроли=0,5, 2 день обработки мышей Ό88=8,8, 7 день обработки мышей Ό88=21, 10 день обработки мышей Ό88=18. Клинические и гистопатологические количественные показатели показывают, что у обработанных Ό88 мышей имелось значительное заболевание ободочной кишки по сравнению с необработанным контролем. Замороженные образцы ткани использовали позднее для определений мРНК, как описано ниже.
Ό. Тканевая экспрессия РНК 1Й-22 в образцах ободочной кишки мышей с ΙΕΌ с помощью ОТ-ПЦР.
Для определения относительной экспрессии РНК №22 мыши (8ЕО Ш NО:10; 8ЕО ΙΌ NО:11) в модели болезни воспаленного кишечника собирали дистальные отделы ободочной кишки обработанных Ό88 мышей и моментально замораживали в жидком азоте. В данном эксперименте мышей обрабатывали Ό88, и образцы получали на 2, 7 и 10 дни после обработки. Собирали также образцы от нормальных необработанных мышей. РНК выделяли из образцов с помощью стандартного набора К№аку М1б1ргер™ (Р1адеп, Уа1епаа, СА) в соответствии с указаниями производителя.
Для реакций ОТ-ПЦР применяли 8ирегкспр! Опе-8!ер КТ-РСК 8ук!ет \\Й11 Р1айпит Тад. (Ь1Ге Тес11ηο1οд^ек. СаййегкЬигд, МО). Каждые 25 мкл реакционной смеси состояли из следующего: 12,5 мкл 2х буфера реакции, 0,5 мкл (20 пмоль/мкл) ΖС39,289 (8ЕО ΙΌ NО:17), 0,5 мкл (20 пмоль/мкл) ΖС39,290 (8ЕО ΙΌ NО:18), 0,4 мкл смеси ОТ/Тад-полимеразы, 10 мкл лишенной РНКазной активности воды, 1,0 мкл суммарной РНК (100 нг/мкл). Амплификацию производили следующим образом: один цикл при 50° в течение 30 мин, затем 35 циклов, состоящих из 94°, 30 с; 58°, 30 с; 72°, 60 с; после чего заканчивали конечным наращиванием при 72° в течение 7 мин. От 8 до 10 мкл продукта реакции ПЦР подвергали стандартному электрофорезу в агарозном геле с применением 2% агарозного геля. кДНК с правильным предсказанным размером фрагмента наблюдали следующим образом.
- 62 009124
Имелась слабая полоса в обоих образцах на 2 день. Два из трех образцов на 7 день дали интенсивную полосу, а третий образец на 7 день дал очень интенсивную полосу. Три образца на 10 день дали интенсивную полосу. Наконец, два «нормальных» контрольных образца не давали никаких полос. Данные результаты позволяют предполагать, что при определенных типах воспалительного ответа в ободочной кишке, включая ассоциированные с ΙΚΙ), иС и СО, может происходить повышение ΙΙ.-22. Данные суммированы ниже в табл. 7, где относительную экспрессию рассчитывали следующим образом: 0=отсутствие полосы, 1=слабая полоса, 2=интенсивная полоса, 3=очень интенсивная полоса.
Таблица 7
Ткань Относительная экспрессия (0-3)
Нормальная ободочная кишка 0
Нормальная ободочная кишка 0
2 День после обработки 1
2 День после обработки 1
7 День после обработки 3
7 День после обработки 2
7 День после обработки 2
10 День после обработки 2
10 День после обработки 2
10 День после обработки 2
Пример 9. 1Б-22КА2 снижает уровень II ,-6 и 8АА в мышиной модели индуцированного коллагеном артрита (С1А).
А. Мышиная модель индуцированного коллагеном артрита (С1А).
Десятинедельных самцов мышей линии ΟΗΛΊ.Ι разделяли на 3 группы по 13 мышей/группу. На 21 день животные получали подкожную инъекцию 50-100 мкл коллагена типа II кур 1 мг/мл, составленного в полном адъюванте Фрейнда (полученного СИопбгех, Кебтопб, АА), и три недели спустя на 0 день они получали инъекцию 100 мкл (25 мкг) ЙР8 из Е. сой 0111:В4, полученного в форме 250 мкл/мл из лиофилизованной аликвоты (81§та, 8!. йошк, МО). I^-22КА2 вводили в виде внутрибрюшинной инъекции 3 раза в неделю в течение 4 недель, с 0 по 25 день. Первые две группы получали либо 100, либо 10 мкг II,22КА2 на дозу для животного, а третья группа получала контрольный растворитель, ЗФР (Ь1Ге ТесИпо1о§1ек, КоскуШе, МО). Животные начинали проявлять симптомы артрита после инъекции ЙР8, причем у большинства животных воспаление развивалось в пределах 2-3 недель. Степень заболевания оценивали в каждой лапе с помощью штангенциркуля для измерения толщины лапы и путем присвоения клинического показателя (0-3) каждой лапе: 0=Нормальная, 0,5=Воспаленный(е) палец (пальцы), 1=Воспаление лапы, 2=Умеренное воспаление лапы и 3=Тяжелое воспаление лапы, как подробно описано ниже.
Отслеживание заболевания
Животные могут начать проявлять признаки воспаления лапы вскоре после второй инъекции коллагена, а некоторые животные могут начать проявлять признаки воспаления пальцев даже до второй инъекции коллагена. У большинства животных артрит развивается в течение 2-3 недель после повторной инъекции, но для некоторых требуется более продолжительный период времени. Наступление заболевания в данной модели обычно происходит в 95-100% случаев, и обычно в исследовании с применением 40 животных обнаруживаются 0-2 нечувствительных субъекта (выявляемых после 6 недель наблюдения). Следует отметить, что в начале воспаления может иметь место наличие обычно преходящего варьирующего слабого воспаления лапы или пальцев. По этой причине животное не рассматривается как имеющее установленное заболевание до тех пор, пока не разовьется значительное, стойкое опухание лапы.
Всех животных обследовали ежедневно для оценки состояния заболевания их лап, что осуществлялось посредством присвоения качественного клинического показателя каждой лапе. Ежедневно у каждого животного определяли показатели для 4 лап в соответствии с состоянием клинического заболевания. Для определения клинического показателя лапу можно рассматривать как имеющую 3 зоны, пальцы, собственно лапу (кисть или стопу) и запястье или голеностопный сустав. Отмечали степень тяжести воспаления в отношении данных зон, включая обследование всех пальцев на предмет любого опухания суставов, облома когтей или покраснения, отметку любого случая отека или красноты каждой лапы и отметку любой утраты тонкого анатомического разграничения сухожилий или костей и оценку запястья или лодыжки на предмет любого отека или покраснения и отметку распространения воспаления проксимально вверх вдоль лапы. Показатели лапы 1, 2 или 3 основывались прежде всего на общем впечатлении о тяжести и, во-вторых, на том, как много вовлечено зон. Шкала, примененная для клинической оценки, показана ниже.
- 63 009124
Клинический показатель
0=нормальный;
0,5=вовлечены один или более пальцев, но воспалены лишь пальцы;
1=легкое воспаление, включающее лапу (зона 1), и которое может включать палец или пальцы;
2=умеренное воспаление в лапе и может включать некоторые пальцы и/или запястье/голеностопный сустав (2 зоны);
3=тяжелое воспаление в лапе, запястье/голенсстопном суставе и некоторых или всех пальцах (3 зоны).
Установленное заболевание определяют как качественный показатель воспаления лапы с рангом 2 или более, которое продолжается в течение ночи (два дня подряд). Когда имеется установленное заболевание, записывается дата, которая обозначается как первый день животного с «установленным заболеванием».
Для отслеживания уровня антител против коллагена в сыворотке собирали кровь на протяжении эксперимента. Животных забивали на 21 день, и собирали кровь для получения сыворотки и СВС. Одну пораженную лапу от каждого животного помещали в 10% N8? для гистологии и одну замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С для анализа мРНК. Кроме того, помещали 1/2 селезенки, 1/2 тимуса, 1/2 лимфатического узла брыжейки, одну дольку печени и левую почку в КNА1а!е^ для анализа РНК и 1/2 селезенки, 1/2 тимуса, 1/2 лимфатического узла брыжейки, оставшуюся печень и правую почку в 10% NВР для гистологии. Сыворотку собирали и замораживали при -80°С для анализа иммуноглобулинов и цитокинов.
Не было обнаружено статистически значимых различий между группами при анализе показателей лап и данных измерений, хотя имеется предположение, что одна группа, получавшая ГБ-22КА2, могла иметь задержку в наступлении прогрессии воспаления лапы. Не было значимых различий между группами в изменениях массы тела, параметрах СВС или уровне антител против коллагена. Данные предварительные результаты указывают на то, что ГБ-22КА2 не оказывает неблагоприятного действия на массу тела, красные или белые клетки крови или образование антител, но может быть способным к подавлению воспаления. Полным ходом развиваются дополнительные исследования по дозировке, механизму действия и эффективности (например, пример 10).
B. Данные ИФА по антиколлагену на мышиной модели СГА.
Образцы сыворотки собирали на 0, 7, 14, 21 и 28 дни по отношению к дате стимуляции ЬР8 (0 день) при мышиной модели индуцированного коллагеном артрита (пример 9А выше). Образцы сыворотки подвергали скринингу с помощью ИФА на титр антител против коллагена. Не было обнаружено значительного действия обработки ГБ-22КА2 в группах, получавших 100 мкг или 10 мкг, на уровень антител против коллагена по сравнению с контролем ЗФР. Ниже приведено описание способов и материалов ИФА для антиколлагена.
Применявшимися для ИФА для антиколлагена реагентами были 96-луночный планшет для микротитрования Мах1когр (NυNС, Косйек!ег, NΥ), коллаген типа ГГ кур (Сйопбгех, Кебтопб, ^А), 8ирег В1оск (Р1егсе, КоскТогб, ГЬ), антитела козы против ГдО+А+М (Н+Ь) мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (НКР) (2утеб, 8ои111 8ап Ргапсйсо, СА) и о-фенилендиаминдигидрохлоридный субстрат (Р1егсе, КоскТогб, ГЬ). Применявшимися во всех анализах буферами были разбавляющий буфер ИФА В (ЗФР+0,1% БСА+0,05% Твин (81дта, 8!. Ьошк, МО)), промывающий буфер ИФА С (ЗФР+0,05% Твин) и буфер проявления ШуоБ (0,063М цитрат натрия, 0,037М лимонная кислота), Н202 (81дта) и 1н. Н2804 (У№К, Тик^Ша, №А).
Приблизительно 100 мкл периферической крови собирали ретроорбитальным кровопусканием в сепараторные пробирки для сыворотки (Вес!оп Бюкткоп). Сыворотку собирали центрифугированием (2-3 мин, 16000хд, 4-6°С) и хранили при -20°С до проведения анализа. Для определения уровня Гд антитела против коллагена планшеты N^N0 покрывали 10 мкг/мл коллагеном типа ГГ кур (Сйопбгех, Кебтопб \УА) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали ИФА С, блокировали (5 мин, комнатная температура) с помощью 8ирег В1оск (Р1егсе, КоскТогб, ГЬ) и промывали ИФА С. Разбавленные образцы сыворотки (разбавленные в 5-кратном ИФА В от 1:5000 до 1:625000) вносили в планшеты ИФА в трех параллелях, и планшеты инкубировали в течение ночи при 4°С. После инкубации планшеты промывали ИФА С, и добавляли меченые пероксидазой антитела козы против Рс Гд мыши (2утеб, 1:2000 в ИФА В). Планшеты инкубировали (комнатная температура, 90 мин), вновь споласкивали ИФА С, и активность НКР проявляли с помощью о-фенилендиаминдигидрохлоридного субстрата (10 мл №уоБ + 1 таблетка 0РБ + 10 мкл Н202, Р1егсе). Реакцию останавливали с помощью 1н. Н2804. Измерения относительной оптической плотности образцов сыворотки при разведении 1:25000 производили при 490 нм с применением 8рес1га МАХ 190, и результаты анализировали с помощью программы 8ойМах Рго (Мо1еси1аг Бе\зсек Согрогайоп, Ра1о А1!о, СА).
C. Анализ ГЬ-6 и 8АА в мышиной модели С1А.
Образцы сыворотки 0 дня получали от мышей линии СГА (пример 9А выше) через 4 ч после внутрибрюшинного введения 25 мкг ЬР8. Образцы подвергали скринингу на концентрацию ГЬ-6 и сыворо
- 64 009124 точного амилоида А (8АА) с применением имеющихся в продаже наборов ИФА, полученных от В1окоигсе Iη!е^ηаΐ^οηа1 (СатагШо, СА) в соответствии с инструкциями производителя.
Уровень №-6 составлял 9651±1563 пг/мл, 10865±1478 пг/мл и 15006±2099 пг/мл в группах мышей, получавших 100 мкг №-22ЯА2, 10 мкг I^-22ЯΑ2 и ЗФР контроль, соответственно. Концентрация №-6 в группе мышей СЧА, экспонированных с дозой 100 мкг №-22ЯА2, была значительно снижена по сравнению с контрольными мышами, получавшими ЗФР, с р=0,0351. Статистическая значимость была рассчитана с применением РЬ8О Фишера при доверительном интервале 5% (АВАСИ8 Сопсер!к, ШС, Вегке1еу, СА).
Кроме того, концентрация 8АА равнялась 381±40 мкг/мл, 348+37 мкг/мл и 490±50 мкг/мл в группах мышей, подвергнутых действию 100 мкг I^-22ЯΑ2, 10 мкг I^-22ЯΑ2 и контрольного ЗФР, соответственно. Концентрация 8АА в группе мышей СЧА, экспонированных с дозой 10 мкг I^-22ЯΑ2, была значительно снижена по сравнению с контрольными мышами, получавшими ЗФР при р=0,0257. Статистическая значимость была рассчитана с применением РЬ8О Фишера при доверительном интервале 5% (АВАСИ8 Сопсер!к, ШС, Вегке1еу, СА).
Пример 10. тАВ против №-22ЯА или тАВ против №-22 снижают тяжесть заболевания в мышиной модели СЧА.
Индуцированный коллагеном артрит (СЧА) представляет собой мышиную модель ревматоидного артрита, которая в значительной мере отражает заболевание, наблюдаемое у человека. (Мооге, МеЛойк Мо1. Вю1. 225: 175-179, 2003: ^акктап, 8сапй. Ч. ^типок, 56:12-34, 2002). Мышей иммунизируют 2 дозами коллагена, эмульгированного в СГА, в основание хвоста. Это приводит к отеку лап, который возрастает со временем и может быть оценен как визуально, так и измерен с помощью штангенциркуля. Более того, антитела сыворотки против коллагена хорошо коррелируют с тяжестью заболевания. На основании данных, показывающих, что №-20 и №-22 вызывают воспаление, группам иммунизированных коллагеном мышей вводят тАВ против №-22ЯА и против №-22, и оценивают действие на показатели заболевания. Снижение показателей лап и толщины лап после введения тАВ против №-22ЯА или тАВ против №-22 позволяет предполагать, что №-20 и №-22 способствуют иммунному ответу в модели аутоиммунной реакции и, блокируя, ингибируя, снижая, оказывая антагонистическое действие или нейтрализуя их действие, могут подавлять аутоиммунные заболевания. Ингибирование Т№а сыворотки и антител против коллагена также позволяет предполагать, что блокирование №-22ЯА может оказывать благоприятное действие при аутоиммунном заболевании.
Таким образом, для определения того, оказывают ли тАВ против №-22ЯА или тАВ против №-22 влияние на аутоиммунную реакцию, их тестируют в мышиной модели ревматоидного артрита - при индуцированном коллагеном артрите (СЧА). Конкретно, мыши линии ЭВА1Ч получали инъекции коллагена для индукции сходного с ревматоидным артрита. Инокуляция в 0 день представляет собой подкожную инъекцию гомогената, состоящего из полного адъюванта Фрейнда (СГА) и коллагена типа ΙΙ (50-100 мкл, полученного в виде 2 мг/мл коллагена). Инъекцию производят рядом с основанием хвоста. На 21 день производят вторую инокуляцию, причем единственное отличие состоит в том, что гомогенат получают с применением неполного адъюванта Фрейнда (ЧГА) вместо СГА. Показатели и толщину лап измеряют ежедневно. Группы мышей получают ЗФР, 20-200 мкг контрольного моноклонального антитела соответствующего изотипа или 20-200 мкг тАВ против №-22ЯА или тАВ против №-22 в/б 2х или 3х/неделю в течение 1-4 недель, начиная со второй инъекции коллагена. Мышей отслеживали ежедневно до 30 дня. Мышей забивали на 30 день, отбирали сыворотку для анализа антител против коллагена и анализа цитокина сыворотки (ТОТа).
Ингибирование показателей лап, толщины лап, сывороточного ТК’Га и антител сыворотки против коллагена при введении тАВ против №-22ЯА или №-22 позволяет предполагать, что блокирование №22ЯА может связывать, блокировать, ингибировать, снижать, оказывать противоположное действие или нейтрализовывать №-22 и ингибировать наступление иммунного ответа в модели аутоиммунной реакции и может подавлять аутоиммунные заболевания.
Пример 11. Экспрессия рецептора №-22, №-22ЯА, в мышиной модели Ό88.
Для измерения уровня экспрессии №-22ЯА мыши в ободочной кишке мышей с индуцированной Ό88 ЧВО (пример 8) проводили количественную ОТ-ПЦР. РНК выделяли из ободочной кишки нормальных мышей и из дистальных отделов ободочной кишки обработанных Ό88 мышей на 2, 7 и 10 дни. ОТПЦР проводили с применением аппарата и протоколов АррНей Вюкук!етк 7700 ТацМап. Вкратце, для дизайна праймеров против последовательности №-22ЯА мыши (2С39776 (8ЕЦ ΙΌ N0:19) и ΖΟ39777 (8ЕЦ ΙΌ N0:20)) применяли программу Рптег Ехргекк и меченый ГАМ/ТАМЯА зонд ТацМап (2С38752 (8ЕЦ ΙΌ N0:21)) в соответствии с указаниями АррНей Вюкук!етк. В каждую реакционную смесь добавляли 25 нг РНК вместе с РЕ/Арр11ей Вюкук!етк ТацМап ΕΖ ЯТ-РСЯ Соге Яеадеп!к и указанными выше праймерами и зондом. Реакции ОТ-ПЦР проводили в двух параллелях при следующих условиях: 50°С в течение 2 мин, 60°С в течение 1 мин, 95°С в течение 5 мин, 40 циклов из 94°С в течение 20 с и 60°С в течение 1 мин. Величины экспрессии сравнивали со стандартной кривой известного количества молекул синтетического транскрипта РНК №-22ЯА мыши, и экспрессию выражали в виде абсолютного
- 65 009124 количества молекул ГО^КА на реакцию. Предварительные данные позволяют предполагать, что экспрессия №-22^А мыши может быть слегка снижена в дистальных отделах ободочной кишки на 7 и 10 дни после индуцированной Б88 КБ по сравнению с уровнем экспрессии в ободочной: кишке нормальных мышей.
Пример 12. ΙΕ-22 и провоспалительные показатели при модели умеренной эндотоксемии: мышиная модель индуцированной ЬР8 эндотоксемии А. Мышиная модель индуцированной ЬР8 эндотоксемии.
Определение провоспалительных цитокинов и температуры тела в мышиной модели индуцированной ЬР8 эндотоксемии.
Для проверки действия I^-22ΚΑ2 (I^-22ΚΑ2) на мышиной ЬР8 модели умеренной эндотоксемии был спланирован эксперимент ш νί\Ό. Для исходной оценки модели авторы измеряли провоспалительные цитокины и температуру тела с целью сбора референтных данных для модели.
Вкратце, шестимесячным самкам мышей линии Ва1Ь/с (СКЪ) вводили 25 мкг ЬР8 (81дта) в стерильном ЗФР внутрибрюшинно (в/б). Образцы сыворотки отбирали через 0, 1, 4, 8, 16, 24, 48 и 72 ч в группе из 8 мышей в каждый временной интервал. Образцы сыворотки анализировали на уровень воспалительных цитокинов. Измеряли уровень ГОЧЬ, ΙΕ-6, ТХГа, ΙΗ-10 и сывороточного амилоидного белка А (8АА) с применением имеющихся в продаже наборов ИФА, приобретенных у Вюкоитсе (СатагШо, СА).
Уровень ЮТа достигал максимума 4000 пг/мл, а уровень ΙΗ-10 составлял 341 пг/мл через 1 ч после инъекции ЬР8. Через 4 ч после инъекции ЬР8 ΙΕ-6, Ш-ЧЬ и ΙΗ-10 равнялись 6100 пг/мл, 299 пг/мл и 229 пг/мл, соответственно. Уровень 8АА в сыворотке составлял 0,405 мг/мл к 4 ч после инъекции ЬР8. Концентрация 8АА в сыворотке продолжала возрастать до 3,9 мг/мл к 24 ч после инъекции ЬР8, однако уровень 8АА выше от 1 до 2 мг/мл в сыворотке трудно измерить точно или воспроизводимо с помощью имеющегося набора ИФА из-за взаимодействий между 8АА и другими компонентами сыворотки. Данные результаты показали, что провоспалительные цитокины в дополнение к ΙΕ-22 (пример 11В) действительно образуются в данной модели. Таким образом были установлены следующие критерии в качестве биологических показателей ЬР8 модели умеренной эндотоксемии: уровень 'ТЫГа в сыворотке через 1 ч после ЬР8, уровень ГО-6 в сыворотке через 4 ч после ЬР8 и уровень 8АА в сыворотке через 4 и 8 ч после ЬР8.
В отдельной группе животных отслеживали температуру тела посредством хирургически имплантированных телеметрических устройств на протяжении 72 ч эксперимента. Температура тела у мышей падала максимально на 2°С с 37,07 до 34,98°С через 30 мин после инъекции ЬР8.
Инъекция 100 мкг гибридного белка ^-^ЗНАЗ-ГС за 30 мин до инъекции ЬР8 значительно снижала приблизительно на 50% индукцию 8АА во временные интервалы 4 и 8 ч, тогда как 10 мкг I^-22ΚΑ2-ΓС не оказывали заметного действия. Нет значительного изменения уровня Т№-альфа и ΙΕ-6. Инъекция ΙΕ22КА2-Гс снижала количество нейтрофилов в кровяном русле в момент времени 1 ч. Это показывает, что введение I^-22ΚΑ2-ΓС может нейтрализовывать активность ΙΕ-22 в отношении индукции 8АА.
B. Определение активности ΙΕ-22 в сыворотке мышей из мышиной модели индуцированной ЬР8 эндотоксемии с применением клеток ΒаΓ3/СΚΓ2-4/I^-22ΚΑ в тесте пролиферации с аламаром синим.
Описанные здесь клетки ΒаΓ3/СΚΓ2-4/I^-22ΚΑ осаждали и промывали ЗФР 2 раза для обеспечения удаления 111^-3, затем осаждали центрифугированием третий раз и ресуспендировали в полной среде (ΚРМI 1640, 10% ЗФР, 1% С1и!аМАХ, 1% пируват натрия), но без ιιιΙΕ-3 (далее здесь обозначаемой как «среда без пйЕ-3»). Затем клетки подсчитывали в гемоцитометре. Клетки высевали в 96-луночный планшет при 5000 клеток на лунку в объеме 100 мкл на лунку с применением среды без ιιιΙΕ-3.
Сыворотку от мышей с индуцированной ЬР8 эндотоксемией из эксперимента, описанного выше в примере 11 А, разбавляли до 2% средой без ιιιΙΕ-3 в верхнем ряду планшета и затем разбавляли последовательно 1:2 в остальных расположенных ниже рядах 96-луночного планшета, оставляя объем 100 мкл в каждой лунке. Содержимое затем добавляли к 100 мкл клеток с получением конечной концентрации сыворотки 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,063, 0,031, 0,016 и 0,018% в суммарном объеме тестирования 200 мкл. Планшеты для тестирования инкубировали при 37°С, 5% С02 в течение 4 дней, во время которых добавляли аламар синий (Асситеб, СЫсадо, ГО) в количестве 20 мкл/лунку. Планшеты снова инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 16 ч. Аламар синий обеспечивает флуориметрическое считывание на основе количества живых клеток и, таким образом, является прямым измерением пролиферации клеток по сравнению с отрицательным контролем. Планшеты считывали на \Уа11ас У1с!ог 2 1420 Ми1!11аЬе1 Соип!ег (ХУаПас, Тигки, Финляндия) при длинах волны 530 (возбуждение) и 590 (эмиссия).
Результаты показали отсутствие заметной пролиферации выше фонового уровня через интервалы времени 0, 1, 3 и 16 ч. Образцы сыворотки с интервалом времени 4 ч показали от 4-кратного до более чем 10-кратного увеличение пролиферации над фоновым уровнем, что указывает на наличие ΙΕ-22 в данных образцах.
C. Мышиная модель индуцированной ЬР8 эндотоксемии: эксперимент для оценки действия ΙΕ22КА2.
- 66 009124
Тестировали способность обработки Ш-22КА2 влиять на провоспалительные показатели, индуцированные однократной дозой 25 мкг ЬР8 у мышей. Все образцы анализировали на предмет 8АА, Ш-22 и количество нейтрофилов в кровяном русле. Подгруппы из каждой группы анализировали в отношении уровня отдельных цитокинов (образцы через 1 ч подвергали скринингу на ТЫЕ-альфа, образцы через 4 ч анализировали на Ш-6). Животных забивали через указанные в табл. 8 ниже интервалы времени, и цельную кровь и сыворотку собирали и аликвотировали для анализа.
Самки мышей линии С57В^/6N (СКЬ) получали однократную в/б дозу Ш-22КА2, как описано в табл. 8, ниже. Контрольными мышами были С57В^/6N (СКШ). Через 30 мин они получали еще одну в/б инъекцию 25 мкг ЬР8 (81дта) в 100 мкл для инициации каскада эндотоксемии. Мышей каждой группы забивали в соответствующие периоды времени, как указано в табл. 8, собирали 50 мкл цельной крови для измерения общего количества нейтрофилов в кровяном русле, а остальное осаждали центрифугированием для получения сыворотки и аликвотировали для различных описанных здесь анализов.
Таблица 8
Группа Νθ Обработка ЬРЗ Забой Образцы
А 8 100 мкг 1Ъ~ 22ВА2 в/б 25 мкг в/б 30 мин после бх 1 час Аликвоты сыворотки Кровь для СВС
В 8 10 мкг 1Ь- 22НА2 в/б 25 мкг в/б 30 мин после бх 1 час Аликвоты сыворотки Кровь для СВС
С 8 200 мкл ЗФР в/б 25 мкг в/б 30 мин после бх 1 час Аликвоты сыворотки Кровь для СВС
Ώ 8 100 мкг 1Ь- 22КА2 в/б 25 мкг в/б 30 мин после Ьх 4 часа Аликвоты сыворотки Кровь для СВС
Е 8 10 мкг 1Ъ- 22ВА2 в/б 25 мкг в/б 30 мин после бх 4 часа Аликвоты сыворотки Кровь для СВС
Р 8 200 мкл ЗФР в/б 25 мкг в/б 30 мин после бх 4 часа Аликвоты сыворотки Кровь для СВС
а 8 100 мкг 1Ь- 22КА2 в/б 25 мкг в/б 30 мин после бх 8 часов Аликвоты сыворотки Кровь для СВС
н 8 10 мкг 1Ъ- 22КА2 в/б 25 мкг в/б 30 мин после бх 8 часов Аликвоты сыворотки Кровь для СВС
σ 8 200 мкл ЗФР в/б 25 мкг в/б 30 мин после бх 8 часов Аликвоты сыворотки Кровь для СВС
к 5 контроль Нет Перед ЬР5 Аликвоты сыворотки Кровь для СВС
Ό. Ш-22КА2-Гс4 нейтрализует индукцию 8АА ш у1уо: ИФА 8АА показывает, что экспрессия 8АА, индуцированная ЬР8 в мышиной модели индуцированной ЬР8 эндотоксемии, подавляется инъекцией Ш22КА2-Рс4.
Для оценки того, может ли Ш-22КА2 ингибировать индукцию 8АА в мышиной модели индуцированной ЬР8 эндотоксемии, мышам вводили Ш-22КА2 за 30 мин до инъекции ЬР8, как показано в табл. 8 в примере 11 С выше.
- 67 009124
Для определения уровня 8АА в образцах через 4 и 8 ч проводили ИФА с применением набора Мойке 8АА Iшшиηοаккау (Вю8оигсе Iη!е^ηа!^οηа1, СаНГогша) в соответствии с указаниями производителя. В момент времени 4 ч мыши, обработанные 100 мкг или 10 мкг I^-22ΚЛ2, показали зависимое от дозы статистически значимое снижение уровня 8АА по сравнению с мышами, получавшими инъекцию ЗФР. В момент времени 8 ч мыши, обработанные 100 мкг, продолжали показывать статистически значимое снижение уровня 8АА по сравнению с мышами, получавшими инъекцию ЗФР. Это указывает на то, что присутствие П .-22К.А2 способно ингибировать индукцию 8АА под действием ЕР8 ш νί\Ό.
Пример 13. Действие полипептида ΙΙ.-22 на кожу шνί\Ό.
А. Индуцированный П ,-22 акантоз.
Мышей (самки линии С3Н/НЕ6 в возрасте 8 недель; басккоп ЬаЬк, Ваг НагЬог, МЕ) делили на три группы из шести животных и одну группу из 4. Посредством непрерывной инфузии с помощью осмотических мининасосов вводили произведенный ВНК 11,-22 человека, что давало местную и устойчивую концентрацию в сыворотке, пропорциональные концентрации ΙΕ-22, содержавшегося в насосе. Осмотические мининасосы Аке! (модель 2002; Ака согрога!юп Ра1о А1!о, СА) заполняли в стерильных условиях белком Ш-22 (А601Р, 0,22 мл), разбавленным забуференным фосфатом солевым раствором (рН 7,0) до концентрации в насосе 2 мг/мл для группы 1 мышей, 0,2 мг/мл для группы 2 мышей, 0,02 мг/мл для группы 3 мышей и 0 мг/мл (только разбавитель) для группы 4 мышей. Насосы имплантировали подкожно мышам посредством 1-см надреза в коже спины, и кожу накрывали стерильными покрытиями для ран. Данные насосы разработаны для выделения своего содержимого со скоростью 0,5 мкл в час на протяжении периода 14 дней. Используя данную номинальную скорость инфузии, были вычислены уровни доз, которые составляли 24, 2,4, 0,24 и 0 мкг/день для групп 1-4, соответственно.
В конце 14-дневного периода животных забивали, и от каждой мыши брали образец кожи окружающей насос области размером приблизительно 1 квадратный см. Кожу фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине. Фиксированные формалином образцы кожи заключали в парафин в соответствии с обычной методикой, резали с получением 5 мкм срезов и окрашивали гематоксилином и эозином. Ткани микроскопически оценивались слепым способом сертифицированным советом АСУР ветеринарным патологом. Отмечались гистологические изменения, и тяжесть акантоза (т.е. утолщения эпидермиса) оценивалась субъективно с применением следующей системы баллов: 0-норма, 1-минимальный акантоз, 2-слабый акантоз, 3-умеренный акантоз и 4-тяжелый акантоз. Кроме того, с кожи в отобранных группах делали снимки с помощью цифрового фотоаппарата Соо18пар (Ворег 8с1ешГ1с, Шс., 8ап Эхедо, СА), и толщину эпидермиса измеряли с применением гистоморфометрической программы (8сюп Инаде' Гог \\'шс1о\ук, ν. 4.02, 8сюп Согр., Ргебепск, МО).
Введение ΙΙ.-22 в дозе 2,4 и 24 мкг/день приводило к утолщению эпидермиса, о чем свидетельствует средний балл акантоза (смотри к), значительно превышающий таковой, наблюдаемый в коже контрольной группы. Более того, в эпидермисе обработанных П.-22 животных имелись инфильтраты одноядерных клеток. Данные инфильтраты не наблюдались у контролей, обработанных растворителем.
Акантозные показатели толщины эпидермиса и измерения толщины кожи (в формальных единицах пикселей) в группах показаны в табл. 9 ниже и составляют:
Таблица 9
Группа № п= Насос Средний акантоз Измеренная толщина
1 б 24 мкг 1Ь-22/день 3,0 Не опр.
2 б 2,4 мкг 1Ь-22/день 2,4 67,5
3 б 0,24 мкг 1Ь-22/день 2,2 Не опр.
4 4 Инфузия ЗФР 1,8 45,6
В. Действие Н .-221В/А2 на индуцированный П.-22 акантоз.
Мышей (самки линии С3Н/НЕ6 в возрасте 8 недель; басккоп ЬаЬк, Ваг НагЬог, МЕ) делили на восемь групп из восьми животных в каждой. ΙΡ-22 вводили посредством непрерывной инфузии с помощью осмотических мининасосов, как описано в примере 12А. Осмотические мининасосы Аке! (модель 2001; Ака согрога!юп Ра1о А1!о, СА) заполняли в стерильных условиях белком ΙΡ-22 (А#601Р, 0,22 мл), разбавленным забуференным фосфатом солевым раствором (рН 7,0) до концентрации в насосе 0,22 мг/мл для групп 1-2 мышей, 0,45 мг/мл для групп 3-4 мышей, 0,9 мг/мл для групп 5-6 мышей или 0 мг/мл (только разбавитель) для групп 7-8 мышей. Данные насосы разработаны для выделения своего содержимого со скоростью 0,5 мкл в час на протяжении периода 14 дней. Используя данную номинальную скорость инфузии, были вычислены уровни доз, которые составляли 10 мкг/день для групп 1-2, 5 мкг/день для групп 3-4, 2,5 мкг/день для групп 5-6 и 0 мкг/день для групп 7-8. В каждой паре групп при данном уровне дозы ΙΡ-22 одной группе вводили три раза (1, 3 и 5 дни) 0,1 мг белка I^-22ΚЛ2 Рс человека (описанного здесь) внутрибрюшинным путем. Другой группе таким же образом вводили растворитель (ЗФР).
- 68 009124
На 8 день исследования животных забивали, и от каждой мыши брали образец кожи окружающей насос области размером приблизительно 1 квадратный см. Кожу фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине. Фиксированные формалином образцы кожи заключали в парафин, подвергали обычной проводке, резали с получением 5 мкм срезов и окрашивали гематоксилином и эозином. Ткани микроскопически оценивались слепым способом сертифицированным советом АСУР ветеринарным патологом. В данном исследовании оценка производилась иначе, чем в предшествующем примере. Определяли количество слоев в эпидермисе от базального слоя до зернистого слоя. На основании результатов срезы оценивали следующим образом: 0-норма (2-3 слоя), 1-слабое утолщение (3-4 слоя), 2-умеренное утолщение (4-6 слоев) и 3-сильное утолщение (>6 слоев).
Введение БЬ-22 в дозе 2,5, 5, 10 мкг/день приводило к утолщению эпидермиса (см. табл. 10). Более того, в эпидермисе обработанных БЬ-22 животных имелись инфильтраты одноядерных клеток. Данные инфильтраты не наблюдались у контролей, обработанных растворителем. Одновременное введение 100 мкг БЬ-22ВА2 (3 инъекции) снижало показатель толщины эпидермиса у мышей, обработанных 5 мкг БЬ22/день.
Акантозные показатели толщины эпидермиса в группах показаны в табл. 10 ниже и составляют: Таблица 10
Группа № п= Насос Инъекция Средний акантоз
1 8 2,5 мкг 1Ь-22/день 100 мкл растворителя (3 инъекции) 1,1
2 8 2,5 мкг 1Ь-22/день 100 мкг 1Б-22КА2 (3 инъекции) 0,8
3 8 5 мкг 1Ь-22/день 100 мкл растворителя (3 инъекции) 2,0
4 8 5 мкг 1Ь-22/день 100 мкг 1Ь-22РА2 (3 инъекции) 0,6
5 8 10 мкг 1Ь-22/день 100 мкл растворителя (3 инъекции) 2,0
б 8 10 мкг 1Ь-22/день 100 мкг 1Б-22КА2 (3 инъекции) 1,9
7 8 Растворитель 100 мкл растворителя (3 инъекции) 0,0
8 8 Растворитель 100 мкг 1Ц-22КА2 (3 инъекции) 0,0
Утолщение эпидермиса и иммунные инфильтраты наблюдались также и в коже человека с псориазом. Фенотип кожи, наблюдавшийся при подкожной инъекции БЬ-22, дополнительно указывает на потенциальную роль БЬ-22 в патогенезе псориаза. Тот факт, что БЬ-22ВА2-Тс может нейтрализовывать индуцированный БЬ-22 фенотип кожи, позволяет допускать потенциальное применение других БЬ-22 антагонистов, таких как нейтрализующее антитело против БЬ-22 или растворимый рецептор, для лечения псориаза и других индуцируемых БЬ-22 воспалительных заболеваний.
С. Действие растворимых рецепторов БЬ-22ВА и антител против БЬ-22ВА на индуцированный БЬ-22 или БЬ-20 акантоз.
Активность растворимых рецепторов БЬ-22ВА или антитела против ББ-22ВА в ингибировании активности БЬ-22 или БЬ-20 т νι\Ό оценивают сходным образом с применением гистологического конечного результата акантоза, вызванного подкожной инфузией белка БЬ-22 или БЬ-20. В примере данной модели мышам линии С3Н/НЕ1 имплантируют подкожно осмотические мининасосы, как описано в примерах 12(А) и 12(В) выше. Во время экспозиции с БЬ-22 или БЬ-20 мышей обрабатывают инъекцией очищенного моноклонального антитела против БЬ-22 или сходной инъекцией растворителя в качестве контроля. В конце периода инфузии БЬ-22 кожу в области, окружающей насос, следует взять в качестве образца для гистологического анализа. Ожидается, что сходно с антагонистом растворимого рецептора БЬ-22 БЬ22ВА2, антагонист БЬ-22 или БЬ-20 растворимых рецепторов БЬ-22ВА или антитела против БЬ-22ВА настоящего изобретения должны снижать утолщение эпидермиса и инфильтрацию иммунных клеток, вызванные БЬ-22 или БЬ-20, и, следовательно, быть пригодными в качестве антагонистов БЬ-22 или БЬ-20 для терапии псориаза и других индуцированных БЬ-22 или БЬ-20 воспалительных заболеваний.
- 69 009124
Пример 14. ΙΕ-22 увеличивается в образцах кожи человека с псориазом.
Образцы РНК.
Получали образцы нормальной кожи, а также кожи от больных псориазом. Последние включали пораженную кожу из стабильного псориаза бляшкового типа и соседнюю непораженную кожу. РНК выделяли из образцов кожи человека с помощью традиционных способов. Целостность и качество образцов РНК тестировали на АдПеп! 2100 Β^οаηа1уζе^ (АдПеп! Тесйηο1οд^ез, ^аИЬгопп Германия).
Праймеры и зонды для количественной ОТ-ПЦР.
Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени с применением ΆΒΙ РВ18М 7700 8едиепсе Ое!ес!юп 8уз!ет (РЕ АррПеП Β^οзуз!ешз, Щс., Еοз!е^ СПу, СА) была описана ранее (см. Ηώά, С.А. е! а1., Οеηοте Везеагсй 6:986-994, 1996; Ο^Ьзοη, и.Е.М. е! а1., Οеηοте Везеагсй 6:995-1001, 1996; 8ипбагезап, 8. е! а1., Еп^ск^^у 139:4756-4764, 1998. Данный способ включает применение специфичного для гена зонда, содержащего и репортерный, и гасящий флуоресцентные красители. Когда зонд является интактным, эмиссия репортерного красителя сводится на нет из-за близкого соседства гасящего красителя. При удлинении при ПЦР с применением дополнительных специфичных для гена прямого и обратного праймеров зонд расщепляется от 5'- к 3'-концу благодаря нуклеолитической активности ДНК-полимеразы гТ!й, которая высвобождает репортерный краситель из зонда, что приводит к увеличению флуоресцентной эмиссии.
Примененные для анализа экспрессии ΙΕ-22 с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени праймеры и зонды были сконструированы с применением программы для дизайна праймеров Рпшег Ехргезз™ (РЕ АррПеП Β^οзуз!ешз, Еοз!е^ СПу, СА). Для исключения амплификации геномной ДНК были сконструированы такие праймеры для ΙΕ-22 человека, которые перекрывают интрон-экзонное соединение. В реакции ПЦР (ниже) были применены прямой праймер 7С42459 (8ЕЦ Ш N0:22) и обратный праймер 7С42458 (8ЕЦ Ш N0:23) в концентрации 800 нМ для синтеза продукта размером 72 п.н. Соответствующий зонд ΙΕ-22, 7С42460 (8ЕЦ Ш N0:24) синтезировали и метили самостоятельно в ΖушοΟепе!1сз. Зонд ΙΕ-22 метили по 5'-концу репортерным флуоресцентным красителем (6-карбоксифлуоресцеином) (ЕАМ) (РЕ АррПеП Β^οзуз!ешз) и по 3'-концу гасящим флуоресцентным красителем (6карбокситетраметилродамином) (ТАМВА) (РЕ АррНеб Β^οзуз!ешз).
С. Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени.
Относительный уровень мРНК ΙΕ-22 определяли путем анализа суммарных образцов РНК с применением набора ТацМап ΒΖ ВТ-РСВ СЕге Веадеп!з (РЕ АррПеб Β^οзуз!ешз). Для получения стандартной кривой, применяемой для количественного определения, готовили транскрипт ΙΕ-22 до обрыва. Кривая состояла из 10-кратных последовательных разведений, варьирующих от 1е8 до 1е3 общего количества копий полной матрицы для ΙΕ-22, причем каждую точку стандартной кривой анализировали в трех параллелях. Образцы суммарной РНК из кожи также анализировали в трех параллелях на предмет уровня транскрипта ΙΕ-22 и уровня ПОИ8 в качестве эндогенного контроля. Каждый образец РНК в суммарном объеме 25 мкл подвергали реакции ОТ-ПЦР на ТацМап Е/ (РЕ АррПеб Β^οзуз!ешз) при содержании: приблизительно 25 нг суммарной РНК в воде, обработанной ОЕРС (свободной от ДНКазы/РНКазы); подходящих праймеров (приблизительно 800 нМ /С 42459 (8ЕЦ Ш N0:22) и /С 42458 (8ЕЦ Ш N0:23); соответствующего зонда (приблизительно 100 нМ /С 42460 (8ЕЦ Ш N0:24); 1Х ТацМап Е/ буфера; 3 мМ ацетата марганца; 300 мкМ каждого из б-СТР, б-АТР, и б-СТР и 600 мкМ б-ИТР; гТ!й ДНКполимеразы (0,1 Е/мкл); и АтрЕгазе Е\С (0,01 Е/мкл). Температурные условия цикла ПЦР были следующими: исходная стадия обработки Ц№С из одного цикла при 50°С в течение 2 мин; последующая стадия обратной транскрипции (ОТ) из одного цикла при 60°С в течение 30 мин; последующая стадия дезактивации Ц№С из одного цикла при 95°С в течение 5 мин; последующие 40 циклов амплификации при 94°С в течение 20 с и 60°С в течение 1 мин.
Относительный уровень РНК ΙΕ-22 определяли с помощью способа стандартной кривой, как описано производителем, РЕ Β^οзуз!ешз (Изег Βώ^Ν #2: ΆΒI Рпзт 7700 8едиепсе Ое!ес!юп 8уз!ет, В.е1а!ще Циап!1!а!юп οί Оепе Ехргеззюп, ПесетЬе!· 11, 1997). Для нормализации уровня ΙΕ-22 применяли измерение 11СЕ8, Данные показаны в табл. 11 ниже.
Таблица 11
Образец кожи 1Ь-22
Нормальный 0
Непораженный 0
Пораженный 1149
мРНК ΙΕ-22 не определялась в образцах кожи от нормальных пациентов или из непораженных областей. Напротив, было резкое увеличение матрицы ΙΕ-22 в пораженной коже от больных псориазом. Данные результаты подтверждают сильную связь ΙΕ-22 с заболеванием псориазом у человека.
В псориатических повреждения человека была показана избыточная экспрессия ΙΕ-22, что позволяет предполагать участие ΙΕ-22 в псориазе человека. Более того, как описано здесь, гиперэкспрессия ΙΕ-22
- 70 009124 у трансгенных мышей сопровождалась утолщением эпидермиса и вовлечением иммунных клеток, что указывало на псориатический фенотип, и, кроме того, введение Ш-22 нормальным мышам сопровождалось утолщением эпидермиса и вовлечением иммунных клеток, что указывало на псориатический фенотип, который блокировался антагонистичным растворимым рецептором Ш-22КА2. Подобные данные 1и У1уо дополнительно позволяют предполагать, что провоспалительный ΙΕ-22 вовлечен в псориаз. Если это так, то антагонисты активности ΙΕ-22, такие как моноклональные антитела настоящего изобретения против ΙΕ-22 человека, а также растворимые рецепторы и антитела к ним, пригодны для терапевтического лечения воспалительных заболеваний, в частности в качестве антагонистов ΙΕ-22 при лечении псориаза. Более того, антагонисты активности ΙΕ-22, такие как моноклональные антитела настоящего изобретения против ΙΕ-22 человека, а также растворимые рецепторы и антитела к ним, пригодны для терапевтического лечения других воспалительных заболеваний, например, в качестве антагонистов ΙΕ-22 при лечении атопического дерматита, ШО, колита, эндотоксемии, артрита, ревматоидного артрита и псориазного артрита, респираторного заболевания взрослых (АКО), септического шока, множественной органной недостаточности, воспалительного повреждения легких, такого как астма или бронхит, бактериальной пневмонии, псориаза, экземы, атопического и контактного дерматита и воспалительного заболевания кишечника, такого как язвенный колит и болезнь Крона.
Пример 15. ΙΕ-22 увеличивается в образцах кожи атопического дерматита человека.
Получали образцы нормальной кожи (и=4), а также кожи от больных атопическим дерматитом (и=4). РНК выделяли из образцов кожи человека с помощью традиционных способов. Целостность и качество образцов РНК тестировали на АдПеи! 2100 В1оаиа1ухег (Адйеи! ТесЬио1о§1ек, ^а1бЬгоии Германия).
Праймеры и зонды для количественной ОТ-ПЦР.
Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени с применением АΒI РКШМ 7700 8едиеисе Ое!ес!юи 8ук!ет (РЕ Аррйеб Вюкук!етк, Шс., Рок!ег Сйу, СА) была описана ранее (см. ^б, С.А. е! а1., Сеиоте Кекеагсй 6:986-994, 1996; С1Ькои, и.Е.М. е! а1., Сеиоте Кекеагсй 6:995-1001, 1996; 8иибагекаи, 8. е! а1., Еибосйио1оду 139:4756-4764, 1998). Данный способ включает применение специфичного для гена зонда, содержащего и репортерный, и гасящий флуоресцентные красители. Когда зонд является интактным, эмиссия репортерного красителя сводится на нет из-за близкого соседства гасящего красителя. При удлинении при ПЦР с применением дополнительных специфичных для гена прямого и обратного праймеров зонд расщепляется от 5'- к 3'-концу благодаря нуклеолитической активности ДНК-полимер азы гТ!1, которая высвобождает репортерный краситель из зонда, что приводит к увеличению флуоресцентной эмиссии.
Примененные для анализа экспрессии ΙΕ-22 с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени праймеры и зонды были сконструированы с применением программы для дизайна праймеров Рйтег Ехргекк™ (РЕ Аррйеб Вюкук!етк, Рок!ег Сйу, СА). Для исключения амплификации геномной ДНК были сконструированы такие праймеры для ΙΕ-22 человека, которые перекрывают интрон-экзонное соединение. В реакции ПЦР (ниже) были применены прямой праймер 2С42459 (8ЕО ГО N0:22) и обратный праймер 2С42458 (8Е0 ГО N0:23) в концентрации 800 нМ для синтеза продукта размером 72 п.н. Соответствующий зонд Ш-22, Ζί.'42460 (8Е0 ГО N0:24) синтезировали и метили самостоятельно в ΖутоСеиейск. Зонд Ш-22 метили по 5'-концу репортерным флуоресцентным красителем (6-карбоксифлуоресцеином) (РАМ) (РЕ Аррйеб Вюкук!етк) и по 3'-концу гасящим флуоресцентным красителем (6карбокситетраметилродамином) (ТАМКА) (РЕ Аррйеб Вюкук!етк).
С. Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени.
Относительный уровень мРНК Ш-22 определяли путем анализа суммарных образцов РНК с применением набора Тас.|Маг1 ΕΖ КТ-РСК Соге Кеадеи!к (РЕ Аррйеб Вюкук!етк). Для получения стандартной кривой, применяемой для количественного определения, готовили транскрипт Ш-22 до обрыва. Кривая состояла из 10-кратных последовательных разведений, варьирующих от 1е8 до 1е3 общего количества копий полной матрицы для Ш-22, причем каждую точку стандартной кривой анализировали в трех параллелях. Образцы суммарной РНК из кожи также анализировали в трех параллелях на предмет уровня транскрипта Ш-22 и уровня ЙСИ8 в качестве эндогенного контроля. Каждый образец РНК в суммарном объеме 25 мкл подвергали реакции ОТ-ПЦР на Тас.|Маг1 ΕΖ (РЕ Аррйеб Вюкук!етк) при содержании: приблизительно 25 нг суммарной РНК в воде, обработанной ОЕРС (свободной от ДНКазы/РНКазы); подходящих праймеров (приблизительно 800 нМ ΖС 42459 (8Е0 ГО N0:22) и ΖС 42458 (8Е0 ГО N0:23); соответствующего зонда (приблизительно 100 нМ ΖС 42460 (8Е0 ГО N0:24); 1х Тас.|Маг1 ΕΖ буфера; 3 мМ ацетата марганца; 300 мкМ каждого из б-СТР, б-АТР, и б-СТР и 600 мкМ б-ИТР; гТ!1 ДНКполимеразы (0,1 Е/мкл); и АтрЕгаке υNС (0,01 Е/мкл). Температурные условия цикла ПЦР были следующими: исходная стадия обработки НИС из одного цикла при 50°С в течение 2 мин; последующая стадия обратной транскрипции (ОТ) из одного цикла при 60° С в течение 60 мин; последующая стадия дезактивации υΉΌ из одного цикла при 95° С в течение 5 мин; последующие 40 циклов амплификации при 94°С в течение 20 с и 60°С в течение 1 мин.
Относительный уровень РНК Ш-22 определяли с помощью способа стандартной кривой, как описано производителем, РЕ Вюкук!етк (Икег Вийейи #2: АΒI Рйкт 7700 8едиеисе Ое!ес!юи 8ук!ет, Ке1айуе
- 71 009124
ОиапШа1юп ο£ Сепе Ехргеккюп, БесетЬег 11, 1997). Для нормализации уровня Ш-22 применяли измерение ЬСиЗ.
мРНК ΙΕ-22 не определялась в образцах кожи от нормальных пациентов. Напротив, было резкое увеличение матрицы Ш-22 в 3 из 4 образцах кожи от больных атоническим дерматитом (приблизительно 400-2300 копий). Данные результаты подтверждают сильную связь Ш-22 с атопическим дерматитом человека.
В коже человека с атопическим дерматитом была показана избыточная экспрессия Ш-22, что позволяет предполагать участие Ш-22 в атопическом дерматите человека. Более того, как описано здесь, гиперэкспрессия Ш-22 у трансгенных мышей сопровождалась утолщением эпидермиса и вовлечением иммунных клеток, что указывало на фенотип атопического дерматита, и, кроме того, введение Ш-22 нормальным мышам сопровождалось утолщением эпидермиса и вовлечением иммунных клеток, что указывало на фенотип атопического дерматита, который блокировался антагонистичным растворимым рецептором ΙΕ-22Κ.Λ2. Подобные данные ΐπ νίνο дополнительно позволяют предполагать, что провоспалительный ΙΕ-22 вовлечен в атопический дерматит. Если это так, то антагонисты активности ΙΕ-22, такие как моноклональные антитела настоящего изобретения против ΙΕ-22 человека, а также растворимые рецепторы и антитела к ним, пригодны для терапевтического лечения воспалительных заболеваний, в частности в качестве антагонистов ΙΕ-22 при лечении атопического дерматита. Более того, антагонисты активности ΙΕ-22, такие как моноклональные антитела настоящего изобретения против ΙΕ-22 человека, а также растворимые рецепторы и антитела к ним, пригодны для терапевтического лечения других воспалительных заболеваний, например, в качестве антагонистов ΙΕ-22 при лечении атопического дерматита, ΙΒΩ, колита, эндотоксемии, артрита, ревматоидного артрита и псориазного артрита, респираторного заболевания взрослых (АКБ), септического шока, множественной органной недостаточности, воспалительного повреждения легких, такого как астма или бронхит, бактериальной пневмонии, атопического дерматита, экземы, атопического и контактного дерматита и воспалительного заболевания кишечника, такого как язвенный колит и болезнь Крона.
Пример 16. Поликлональные антитела против ΙΕ-22 человека.
Поликлональные антитела против ΙΕ-22 получали путем иммунизации 2 самок Новозеландских белых кроликов очищенным зрелым рекомбинантным полипептидом ΙΕ-22 человека (аминокислотные остатки с 22 (А1а) по 167 (Не) ЗЕф ΙΩ №: 6), продуцированного клетками Е1НК (ΙΕ-22-ЕНК). Каждый кролик получал исходную внутрибрюшинную (в/б) инъекцию 200 мкг очищенного белка в полном адъюванте Фрейнда с последующими бустерными в/б инъекциями 100 мкг пептида в неполном адъюванте Фрейнда через каждые три недели. Через семь-десять дней после введения второй бустерной инъекции (всего 3 инъекции) у животных брали кровь и получали сыворотку. После этого животных поддерживали и брали у них кровь каждые три недели.
Специфичные в отношении ΙΕ-22 человека поликлональные антитела подвергали аффинной очистке из сыворотки кролика с применением колонки С№г-сефарозы 4В (РЬагтааа БЕВ), которую получали с применением 10 мг специфического антигена очищенного рекомбинантного белка человека ΙΕ-22ВНК на грамм СNΒ^-сефарозы с последующим 20х диализом в ЗФР в течение ночи. Специфичные в отношении ΙΕ-22 человека антитела характеризовали с помощью ИФА с применением 500 нг/мл очищенного рекомбинантного белка человека ΙΕ-22-ВНК в качестве мишени для антител. Нижняя граница определения (ЕЪБ) аффинно-очищенного антитела против ΙΕ-22 человека на его специфичном очищенном рекомбинантном антигене ^-22^411 человека составляет 280 пг/мл.
Специфичные в отношении ΙΕ-22 человека поликлональные антитела дополнительно характеризовали по их способности блокировать стимулирующую пролиферацию клеток активность («тест нейтрализации») очищенного рекомбинантного I^-22-ΒНК человека на клетках ΒаЕ3/СКЕ2-4/I^-22КА (пример 2 и пример 5). Для ингибирования пролиферации клеток было достаточно 50х молярного избытка специфичных в отношении ΙΕ-22 человека поликлональных антител.
Пример 17. Моноклональные антитела против ΙΕ-22 человека.
Моноклональные антитела получали иммунизацией 4 самок крыс линии Зргадие-Бает1еу (СЬаг1ек Е|уег ^аЬο^а!ο^^ек, АНттдФп, МА), очищенным зрелым рекомбинантным полипептидом Ш-22 человека (аминокислотные остатки с 22 (А1а) по 167 (Не) ЗЕф ΙΩ N0:6), продуцированного клетками Β№( (Ш-22ΒΠΚ). Каждая крыса получала исходную внутрибрюшинную (в/б) инъекцию 100 мкг очищенного рекомбинантного белка ΙΕ-22 человека в полном адъюванте Фрейнда (Р1егсе, Кοскίο^б, Ш) с последующими бустерными в/б инъекциями 50 мкг очищенного рекомбинантного белка в неполном адъюванте Фрейнда через каждые две недели. Через семь-десять дней после введения третьей бустерной инъекции у животных брали кровь и получали сыворотку.
Специфичные в отношении ΙΕ-22 человека образцы сыворотки крысы характеризовали с помощью ИФА с применением 500 нг/мл биотинилированного I^-22-ΒНК человека и 500 нг/мл биотинилированного Ш-22 мыши, биотинилированных тиI^-22-Е.сο1^ (К+Б Зук!етк, Μ^ππеарο1^к, МЩ мишеней антител. Три образца сыворотки крыс имели титр в отношении специфичной для антител мишени, биотинилированного ^-22^411 человека, при разведении 1: 1Е5 и в отношении специфичной для антител мишени, биотинилированного тиI^-22-Е.сο1^, при разведении 1:1Е4.
- 72 009124
Спленоциты и клетки лимфатических узлов собирали от 2 крыс с высоким титром и сливали с миеломными клетками 8Р2/0 (мыши) с применением ПЭГ 1500 в двух отдельных процедурах слияния (соотношение слияния 4:1, спленоциты к миелоидным клеткам, АпИБоб1ек А ЬаБога!огу Мапиа1, Ε. Наг1о\у апб Ό. Ьапе, Со1б 8рппд НагБог Ргекк). Через 10 дней роста после слияния гибридомные пулы, продуцирующие специфичное антитело выявляли с помощью ИФА с применением биотинилированного рекомбинантного белка ΙΕ-22-ВНК человека и биотинилированного рекомбинантного белка шиI^-22-Ε.сο1^ в качестве разных мишеней для антител. Гибридомные пулы, позитивные в отношении обоих протоколов ИФА, дополнительно анализировали на их способность блокировать или снижать стимулирующую пролиферацию клеток (тест нейтрализации) активность очищенного рекомбинантного шиI^-22-Ε.сο1^ на клетки ВаР3/СКР2-4ЛЬ-22КА (пример 2 и пример 3).
Гибридомные пулы, дающие положительные результаты только в ИФА или в ИФА и «тесте нейтрализации», клонировали по меньшей мере два раза путем предельного разведения.
Моноклональные антитела, очищенные из среды культуры ткани, характеризовали по их пригодности для количественного определения рекомбинантного и природного ΙΕ-22 человека с помощью ИФА в образцах сыворотки мыши и человека. Два отобранных антитела обеспечивали количественный анализ с нижней границей определения приблизительно 1 нг/мл рекомбинантного БиI^-22-Ε.сο1^ в 100% сыворотке человека.
Моноклональные антитела, очищенные из среды культуры ткани, характеризовали по их способности блокировать или снижать стимулирующую пролиферацию клеток активность (тест нейтрализации) очищенного рекомбинантного БиI^-22-Ε.сο1^ или шиI^-22-Ε.сο1^ на клетках ВаР3/СКР2-4ЛЬ-22КА (пример 2 и пример 3). Данным способом было идентифицировано шесть «нейтрализующих» моноклональных антител. Гибридомы, экспрессирующие описанные выше нейтрализующие моноклональные антитела в отношении ΙΕ-22 человека, были депонированы патентным депозитарием Американской коллекции типов тканевых культур (АТСС; Мапаккак УА) в качестве исходных депозитов в соответствии с Будапештским Договором и получили следующие регистрационные № АТСС: клон 266.16.1.4.4.1 (АТСС обозначение патентного депозита РТА-5035); клон 266.5.1.2.2.3 (АТСС обозначение патентного депозита РТА-5033) ; клон 267.17.1.1.4.1 (АТСС обозначение патентного депозита РТА-5038); клон 267.4.1.1.4.1 (АТСС обозначение патентного депозита РТА-5037); клон 266.12.6.1.3.2.1 (АТСС обозначение патентного депозита РТА-5034); клон 266.19.1.10.5.2 (АТСС обозначение патентного депозита РТА-5036); и клон 267.9.1.1.4.1 (АТСС обозначение патентного депозита РТА-5353).
Пример 18. Моноклональные антитела против I^-22КΑ.
Моноклональные антитела получали иммунизацией 4 крыс линии ЬеМк (Коск1апб IшшиηοсБет^са1к, СПБейкуШе, РА) расщепленным и очищенным рекомбинантным гибридным белком, шиШ^КА-Рс (8ΕΟ ΙΌ NО:4). Каждая крыса получала исходную внутрибрюшинную (в/б) инъекцию 100 мкг очищенного рекомбинантного гибридного белка в полном адъюванте Фрейнда (Р1егсе, КоскГогб, Ш) с последующими бустерными в/б инъекциями 50 мкг очищенного рекомбинантного белка в неполном адъюванте Фрейнда через каждые две недели в течение четырех недель. После первых четырех недель иммунизации бустерные в/б инъекции 50 мкг расщепленного очищенного рекомбинантного белка в сочетании с белком-носителем гемоцианином моллюска фиссуреллии (КЕН, Р1егсе, КоскГогб, Ш) в неполном адъюванте Фрейнда вводили через каждые две недели в течение четырех недель. Через семь-десять дней после введения четвертой бустерной инъекции у животных брали кровь и получали сыворотку.
Специфичные в отношении шц[Е-22КА образцы сыворотки крысы характеризовали с помощью ИФА с применением 500 нг/мл очищенного рекомбинантного гибридного белка ши[Е-22КА-Рс в качестве специфичной для антител мишени и неродственного гибридного белка в качестве неспецифичной для антител мишени.
Спленоциты получали от одной крысы с высоким титром и сливали с миеломными клетками 8Р2/0 (мышь) с помощью оптимизированного протокола опосредуемого ПЭГ слияния (Коск1апб IтшиηοсБет^са1к). Через 12 дней роста после слияния продуцирующие специфичные антитела пулы гибридомы идентифицировали с помощью ИФА с применением 500 нг/мл каждого из очищенных рекомбинантных гибридных белков ши[Е-22КА-Рс-Ву в качестве специфической мишени для антитела и неродственного гибридного белка в качестве неспецифической мишени для антитела. Гибридомные пулы, позитивные в отношении специфичной для антител мишени, дополнительно анализировали на их способность блокировать или снижать стимулирующую пролиферацию клеток (тест нейтрализации) активность очищенного рекомбинантного шиI^-22-Ε.сο1^ на клетки ВаР3/СКР2-4ЛЕ-22КА (пример 2 и пример 3) и способность к связыванию с клетками ΒаΡ3/СКΡ2-4/I^-22КΑ (пример 2 и пример 3) в качестве мишени антител с помощью анализа РАС8.
Гибридомные пулы, давшие специфичный позитивный результат в тесте ИФА и позитивные результаты в РАС8 или тесте нейтрализации, клонировали по меньшей мере дважды путем предельного разведения.
Моноклональные антитела в среде культуры ткани характеризовали по их способности блокировать или снижать пролиферацию клеток ВаР3/СКР2-4ЛЕ-22КА (пример 2 и пример 3), растущих в присутствии очищенных рекомбинантных белков шиI^-22-Ε.сο1^ или ΙιιιΙΕ-22-ВНК. Было идентифицировано че
- 73 009124 тырнадцать «нейтрализующих» моноклональных антител, и девять моноклональных антител были клонированы.
Гибридомы, экспрессирующие описанные выше нейтрализующие моноклональные антитела против II ,-221К\ мыши, были депонированы патентным депозитарием Американской коллекции типов тканевых культур (АТСС; Мапаккак УА) в качестве оригинальных депозитов в соответствии с Будапештским Договором и получили следующие регистрационные № АТСС: клон К2.1.1С11.1 (АТСС обозначение патентного депозита [####]); клон К2.1.5Г4.1 (АТСС обозначение патентного депозита [####]); клон К2.1.5Н8.1 (АТСС обозначение патентного депозита [####]); клон К2.1.12С7.1 (АТСС обозначение патентного депозита [####]); клон К2.1.13С8.1 (АТСС обозначение патентного депозита РТА-5037); клон К2.1.15Е2.1 (АТСС обозначение патентного депозита [####]); клон К2.1.16С11.1 (АТСС обозначение патентного депозита [####]); клон К2.1.18С8.1 (АТСС обозначение патентного депозита [####]) и клон К2.1.21С8.2 (АТСС обозначение патентного депозита [####]).
Пример 19. Аффинность связывания двух МАЬ крысы против МкЛЬ-ЗЗКА.
Антитело козы, специфичное в отношении ШС-Гс гамма крысы (,1асккоп), иммобилизировали на чипе СМ5 В1асоге. Анализ оптимизировали в отношении связывания каждого тАЬ поверхностью захвата антитела против Ш крысы, после чего против тАЬ, вносили ряды концентрации II ,-221К\ для определения ассоциации (Ка) и диссоциации (Кб). При предварительном тестировании наблюдалось неспецифическое связывание между гибридным белком и поверхностью захвата чипа. Была получена пробирка, содержащая П.-221КЛ с отщепленной тромбином Гс4 меткой, которую затем анализировали для выявления фоновых эффектов. После каждого раунда поверхность восстанавливали для антикрысиного антитела посредством двух инъекций 20 мМ НС1. Получали данные для каждого тАЬ, и для оценки кинетики связывания антитела, против с белком П,-221К\ применяли программу (В^еуаШайоп коП\\'аге уегкюп 3.2, РИагтас1а ВГАсоге, иррка1а, Швеция), как показано в табл. 12 ниже.
Таблица 12
Клон К2.1.5Е4.1** Клон К2.1.15Е2.1* *
ка (М-1сек-1) 1,49Е+06 ка (М-1сек-1) 1,76Е+06
кД (сек-1) 1,70Е-04 кд. (сек-1) 2,55Е-04
КА (М-1) 8,76Е+09 КА (М-1) 6,66Е+09
КБ (М) 1,14Е-10 КВ (М) 1,504Е-10
СИ12 2,08 СЬ12 1,5
** Константы скорости ассоциации (Ка) и диссоциации (Кб) для каждого МАВ против I^-22КА были рассчитаны, и величины попадают в расчетные границы. СИ12 относится к сумме квадратов разницы между кривыми связывания и оценочными сглаженными кривыми. Чем ближе к 0, тем более доверительными являются данные.
Как показано в табл. 12, оба МАЬ против I^-22КА сильно связываются с белком I^-22КА, о чем свидетельствует связывание в пикомолярной концентрации с I^-22КА (отщепленная тромбином Гс4 метка). Данные результаты находятся в хорошем доверительном интервале, основанном на низких величинах СИ12, и показывают, что клон К2.1.5Г4.1 тАЬ обладает несколько более высоким сродством к рецептору I^-22КА.
Пример 20. Иммуногистохимический анализ экспрессии белка ГС-22 т у1уо в образцах тканей.
A. Резюме.
Иммуногистохимический (ГНС) анализ экспрессии и локализации белка П.-22 осуществляли с применением моноклонального антитела против П.-22 (анти-ЫЬ-22) (МаЬ 266.19.1.10.5.2) в следующих образцах тканей: множества нормальных и опухолевых тканей человека; образцах панкреатита, легочных и почечных заболеваний человека; образцах кожи псориаза человека; ΓΝ8 П.-22 ТС (экспрессируемого с промотора инсулина крысы) и поджелудочной железы мышей АТ; образцах кожи тиI^-22-Еи^СК ТС и мышей АТ и образцах ободочной кишки мыши 1)88 (АТ и П.-22 КО). Более того, сравнивали характер окрашивания анти-ИI^-22 моноклональным антителом МАВ 266.19.1.10.5.2 (пример 17) и поликлональным антителом (анти-ЫЪ-22 кролика) (пример 16).
Тестированные моноклональные антитела крысы МАВ 266.16.1.4.4.1 и МАВ 266.19.1.10.5.2 (пример 17) против П.-22 человека дали окрашивание большинства ВНК/I^-22 человека (>50%), а также некоторых клеток ВНК/I^-22 мыши (1-5%) и были использованы для исследования распределения в тканях и экспрессии II ,-22 в образцах как больных людей, так и животных моделей, и применены для сравнения с характером окрашивания поликлональным антителом кролика для подтверждения результатов.
B. Материалы и способы.
Из фиксированных формалином и заключенных в парафин клеток и тканей от человека и мышиных животных моделей получали срезы 5 мкм. Клетки включали клетки ВНК, экспрессирующие П.-22 либо человека, либо мыши, и клетки дикого типа в качестве положительного контроля и отрицательного контроля, соответственно. Ткани человека включали МиШ-йккие соп!го1 кйбе (\оппа1Сг1с1™; Вютеба, Гок!ег
- 74 009124
Сйу, СА) с 50 срезами различных нормальных тканей человека (например, мозга, гипофиза, надпочечников, молочной железы, почек, сердца, желудка, тонкого кишечника, толстого кишечника, печени плодов, печени, кожи, поджелудочной железы, легких, миндалевидной железы, яичников, семенников, предстательной железы, матки, плаценты, щитовидной железы и селезенки); Мы111-11ззие соп!го1 зНйе (ТитогСпй™; Вютейа, Еоз1ег Сйу, СА) с 50 срезами различных опухолей человека (например, аденокарциномы легкого, аденокарциномы печени, аденокарциномы почки, аденокарциномы ободочной кишки, аденокарциномы молочной железы, аденокарциномы щитовидной железы, аденокарциномы желудка, аденокарциномы предстательной железы, аденокарциномы поджелудочной железы, аденокарциномы яичников, лимфомы, меланомы, саркомы Юинга (етешдз), эпителиоидной саркомы, саркомы МЕН, рабдосаркомы, карциноида, недифференцированной карциномы, мезотелиомы, тератомы и семиномы); карциному легкого от СΗТN (Соорегайоп Нитап Т1ззие Не1теогк, Скуек-тй, 0Ыо); нормальную поджелудочную железу, поджелудочную железу с хроническим панкреатитом, легкое с хроническим периваскулярным воспалением, почки с многоочаговым гломерулосклерозом, мезангиальным пролиферативным гломерулонефритом или склеротизирующим клубочки интерстициальным фиброзом от КЭШ (№1Ропа1 Э|зеазе КезеагсЫ Iπΐе^сЫаπде, РЫ11айе1рЫа, РА); и образцы псориазной кожи человека. Ткани мыши включали ободочную кишку от животной модели воспалительного заболевания кишечника (описанной здесь модели Ό88, самки мышей линии 8те1зз №еЬз!ег) и от ΙΕ-20 №Т и животной модели колита К0 (мыши Ό88, дикого типа и самки мышей с нокаутом Ю-20 (ΙΕ-20)), получавших либо растворитель, либо 4% Ό88 в питьевой воде в течение 7 дней; и образцы кожи от трансгенных (ТС) животных моделей, включая контрольных и ТС животных ιηΙΕ-22-ЕиЕСК ТС и 111^-22-^8. Один срез на блок/предметное стекло окрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е) для гистологической оценки, а последующий срез окрашивали иммуногистохимически на экспрессию и локализацию белка !Б-22.
Для иммуногистохимии срезы клеток и тканей помещали на предметные стекла для микроскопии СЫешМаГе™ СарШагу Сар Р1из (ВюТек, №шоозк1, УегшоШ), сушили в печи при 60°С в течение 60 мин и депарафинировали при стандартных условиях, включающих 3х5 мин в ксилоле, 4 мин в 100% ЕЮН, 3 минуты в 100% ЕЮН, и 2 мин в 95% ЕЮН. Срезы ткани затем подвергали 20-минутному индуцируемому ферментом процессу восстановления эпитопов при 37°С с пепсином (№оМагкегз Егетоп! СА) с последующей стадией блокировки авидин/биотина в соответствии с указаниями производителя (2утей, 8ои111 8ап Егапазсо, СА). Для окрашивания применяли иммуногистохимический протокол ТесЫМа!е 500™ Аи1ота1ей Iшшиποзΐа^πе^ апй Iшшиποре^οx^йазе ДР) с системой детекции авидин-биотиновым комплексом (Уейапа Вю1ек 8уз1етз, Тисзоп, А2). В ТесЫМа!е 500™ Аи1ота1ей Iшшиποзίа^πе^ использовался принцип капиллярного действия, и в протоколе № использовался тип иммуноокраски, обозначаемый как «сэндвичный» способ. Срезы предварительно блокировали 5% нормальной сывороткой козы (Уес!ог, ВигБшдате СА) в ЗФР в течение 10 мин с последующей промывкой 1х буфером 1 (81дпе1, Эейкат МА) и затем инкубировали с первичным антителом против Ю-22 (МАВ 266.19.1.10.5.2) (пример 17), очищенным РА8 в концентрации 2,04 мг/мл), разбавленным 1:800, в течение 30 мин при комнатной температуре с последующей промывкой 5х буфером 1. Первичное антитело разбавляли буфером разбавления антител ТескМа1е 500™ (Уеп!апа). В качестве вторичных связывающих антител применяли биотинилированные ΙβΟ козы против крысы (УеСог), разбавленные 1:200, плюс 5% нормальная сыворотка козы и 2,5% нежирное сухое молоко в ЗФР в течение 25 мин при комнатной температуре с последующей промывкой 1х буфером 1 и 1х буфером 2&3 (81дпе1). Срезы ткани затем подвергали блокированию 3х7 мин 3% перекисью водорода (НР) (Уеп!апа), после чего промывали 3х буфером 2&3. Иммунопероксидазное промечивание проводили с применением набора пероксидов ЭАВ (УеШапа), инкубируя с авидинбистиновым комплексом (АВС) в течение 30 минут с последующей промывкой 5х буфером 2&3 и диаминобензидином (ЭАВ) в течение 4х4 мин и последующей промывкой 2х буфером 2&3 и 1х промывкой водой (81дпе1, Са!. №.2340). Ткани затем подкрашивали метиловым зеленым (Оако, Сак№. 81962) в течение 10 мин с последующей промывкой 2х буфером 2&3 и 3х промывкой водой. Контроль включал неиммунную первичную сыворотку с применением изотипного контроля первичного антитела крысы (2утей) вместо первичного антитела.
Иммуноокрашивание наблюдали с помощью микроскопа 01утриз ВН-2, и изображения фиксировали с помощью цифрового фотоаппарата Сοο18NΑΡ НО (Корег 8аепййс, Тисзоп, А2).
С. Результаты.
Линии клеток положительного и отрицательного контроля: МАВ 266.19.1.10.5.2, моноклональное антитело против ЫЕ-22, дало положительное окрашивание и клеток ВНК, экспрессирующих ΙΕ-22 человека (+++), и клеток ВНК, экспрессирующих ΙΕ-22 мыши (+), а клетки ВНК дикого типа не окрашивались (-). Все положительные и отрицательные линии клеток ВНК, окрашенные изотипичным негативным контролем крысы вместо первичного антитела, показали отсутствие окрашивания (-), что указывало на то, что антитело специфично к лиганду ΙΕ-22. Антитело обладало перекрестной иммунореактивностью и к человеческому, и к мышиному ΙΕ-22.
Ткани человека. Исследовали мультинормальную и опухолевую сетку человека; образцы заболеваний поджелудочной железы, легких и почек; и образцы псориазной кожи человека. Данные ткани человека включали 1) мозг, гипофиз, надпочечники, молочную железу, почки, сердце, желудок, тонкий ки
- 75 009124 шечник, толстый кишечник, печень плодов, печень, кожу, поджелудочную железу, легкие, миндалевидную железу, яичники, семенники, предстательную железу, матку, плаценту, щитовидную железу и селезенку на мультитканевых контрольных стеклах (ХогтаЮпб™) /нормальные ткани человека; 2) аденокарциному легкого, аденокарциному печени, аденокарциному почки, аденокарциному щитовидной железы, аденокарциному желудка, аденокарциному предстательной железы, аденокарциному поджелудочной железы, аденокарциному яичников, лимфому, меланому, саркому Юинга, эпителиоидную саркому, саркому МРН, рабдосаркому, карциноид, недифференцированную карциному, мезотелиому, тератому и семиному на мультитканевых контрольных стеклах (Титог Опб™)/аномальные ткани человека/опухоли; 3) нормальную поджелудочную железу, поджелудочную железу с хроническим панкреатитом, легкое с хроническим периваскулярным воспалением, карциному легкого, почки с многоочаговым гломерулосклерозом, почки с мезангиальным пролиферативным гломерулонефритом, почки со склеротизирующим клубочки интерстициальным фиброзом от СНТ'Ы и/или ΝΩΠΕ
Ткани мыши. Исследовали поджелудочную железу мышей ΕΝ8 ЕЬ-22 ТО и УТ. По всем островкам поджелудочной железы ΕΝ8 ЕЬ-22 ТО выявлялись рассеянные клетки с сильным положительным окрашиванием (+++) МАВ 266.19.1.10.5.2, а поджелудочная железа УТ не окрашивалась (-).
Сравнение поликлональных и моноклональных антител. Поликлональное антитело против IБ-22 (пример 16), как было показано, является чувствительным, тогда как моноклональное антитело МАВ 266.19.1.10.5.2 является специфичным.
Поликлональное антитело давало положительное окрашивание клеток ВНК, экспрессирующих ΣΕ22 человека (+++), клеток ВНК, экспрессирующих ЕЬ-22 мыши (+), образцов различных тканей человека и мыши (+) и островков мышей ΕΝ8 ιηΛ-ΣΣ ТО (+++). Больший процент островков трансгенных животных (по сравнению с диким типом) содержал положительное окрашивание. Окрашивание в трансгенных островках обычно распределялось по всему островку (+++), тогда как окрашивание в островках дикого типа обычно ограничивалось периферией островка (+). Однако данное антитело обеспечивало также неспецифическое окрашивание клеток УТ ВНК отрицательного контроля (+).
МАВ 266.19.1.10.5.2 обеспечивало положительное окрашивание клеток ВНК, экспрессирующих Ш22 человека (+++), клеток ВНК, экспрессирующих Ш-22 мыши (+) и островков мышей ΕΝ8 тШ-22 ТО (+++). Окрашивание в трансгенных островках обычно распределялось по всему островку (+++), тогда как окрашивание в островках дикого типа было отрицательным (-).
Пример 21. ЕЬ-20 увеличен в образцах псориазной кожи человека.
A. Образцы РНК.
Получали образцы нормальной кожи, а также кожи от больных псориазом. Последние включали вовлеченную кожу из псориаза и соседнюю невовлеченную кожу. РНК выделяли из образцов кожи человека с помощью традиционных способов. Целостность и качество образцов РНК тестировали на Адйеи! 2100 Вшаийу/ег (Адйеи! ТесНηο1οд^ек. Уа1бЬгоии Германия).
B. Праймеры и зонды для количественной ОТ-ПЦР.
Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени с применением АЫ РЮ8М 7700 8едиеисе Пе!ес!1ои 8ук!ет (РЕ Аррйеб Вюкуйетк, Лс., Рок!ег Сйу, СА) была описана ранее (см. Не1б, С.А. е! а1., Оеиоте Кекеагсй 6:986-994, 1996; ОЛкои, и.Е.М. е! а1., Оеиоте Кекеагсй 6:995-1001, 1996; 8иибагекаи, 8. е! а1., Еибосгшо1оду 139:4756-4764, 1998. Данный способ включает применение специфичного для гена зонда, содержащего и репортерный, и гасящий флуоресцентные красители. Когда зонд является интактным, эмиссия репортерного красителя сводится на нет из-за близкого соседства гасящего красителя. При удлинении при ПЦР с применением дополнительных специфичных для гена прямого и обратного праймеров зонд расщепляется от 5'- к 3'-концу благодаря нуклеолитической активности ДНК-полимеразы гТ11, которая высвобождает репортерный краситель из зонда, что приводит к увеличению флуоресцентной эмиссии.
Примененные для анализа экспрессии ^-20 с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени праймеры и зонды были сконструированы с применением программы для дизайна праймеров Рптег Ехргекк™ (РЕ Аррйеб Вюкуйетк, Рок!ег Сйу, СА). В реакции ПЦР (ниже) были применены прямой праймер ΖС40541 (8ЕО ГО N0: 25) и обратный праймер ΖС 40542 (8ЕО ГО N0: 26) в концентрации 800 нМ для синтеза продукта размером 71 п.н. Соответствующий ГО-20 зонд ТацМаи®, ΖС 40544 (8Е0 ГО N0: 27) синтезировали и метили в РЕ Аррйеб В1окук!етк. Зонд ГО-20 метили по 5'-концу репортерным флуоресцентным красителем (6-карбоксифлуоресцеином) (РАМ) (РЕ Аррйеб В1окук!етк) и по 3'-концу гасящим флуоресцентным красителем (6-карбокситетраметилродамином) (ТАМКА) (РЕ Аррйеб Вюкук!етк).
C. Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени.
Относительный уровень мРНК ГО-20 определяли путем анализа суммарных образцов РНК с применением набора Тас|Маи ΕΖ КТ-РСК Соге Кеадеи!к (РЕ Аррйеб В1окук!етк). Для получения стандартной кривой, применяемой для количественного определения, готовили транскрипт ГО-20 до обрыва. Кривая состояла из 10-кратных последовательных разведений, варьирующих от приблизительно 1е8 до 1е3 общего количества копий полной матрицы для ГО-20, причем каждую точку стандартной кривой анализировали в трех параллелях. Образцы суммарной РНК из кожи также анализировали в трех параллелях на
- 76 009124 предмет уровня транскрипта ГЬ-20 и уровня ΗΟϋ8 в качестве эндогенного контроля. Каждый образец РНК в суммарном объеме 25 мкл подвергали реакции ОТ-ПЦР на Тас|\1ап ΕΖ (РЕ АррНеб Вюкук!етк) при содержании: приблизительно 25 нг суммарной РНК в воде, обработанной ПЕРС (свободной от ДНКазы/РНКазы); подходящих праймеров (приблизительно 800 нМ Ζϋ40541 (8ЕР ГП N0: 25) и Ζϋ40542 (8ЕР ГП N0: 26); соответствующего зонда (приблизительно 100 нМ Ζϋ40544 (8ЕР ГП N0: 27); 1х Тас]\1ап ΕΖ буфера; 3 мМ ацетата марганца; 300 мкМ каждого из б-СТР, б-АТР, и б-ОТР и 600 мкМ биТР; гТ!к ДНК-полимеразы (0,1 Е/мкл); и АтрЕгаке (0,01 Е/мкл).
Температурные условия цикла ПЦР были следующими: исходная стадия обработки υNО из одного цикла при 50°С в течение 2 мин; последующая стадия обратной транскрипции (ОТ) из одного цикла при 60°С в течение 30 мин; последующая стадия дезактивации υNО из одного цикла при 95°С в течение 5 мин; последующие 40 циклов амплификации при 94°С в течение 20 с и 60°С в течение 1 мин.
Относительный уровень РНК ГЬ-20 определяли с помощью способа стандартной кривой, как описано производителем, РЕ Вюкук!етк (икег Ви11е!т #2: АВГ Рпкт 7700 8ес]непсе Пе!ес!юп 8ук!ет, Ке1а!гуе (ЭнапШаИоп оТ Оепе Ехргеккюп, ПесетЬег 11, 1997). Для нормализации уровня П.-20 применяли измерение йОи8. Данные показаны в табл. 13 ниже.
Таблица 13
Образец кожи ΙΣ-20
Нормальный 2903
Непораженный 7233
Пораженный 27695
Хотя мРНК П.-20 выявлялась в образцах кожи от нормальных больных и невовлеченных областей, в вовлеченной коже больных псориазом матрица ГЬ-20 была увеличена. Субъединицы рецептора ГЬ-20, включая ГЬ-20КА, ГЬ-22КА (ГЬ-22КА) и ГТ-20КВ экспрессировались в нормальной коже и коже с заболеванием. Эти данные подтверждают сильную связь ГЬ-20 с псориазом человека.
В псориатических повреждениях человека была показана повышенная экспрессия ГЬ-20, что позволяет предполагать участие ГЬ-20 в псориазе человека. Более того, как описано здесь, гиперэкспрессия ГЬ20 у трансгенных мышей сопровождалась утолщением эпидермиса и вовлечением иммунных клеток, указывающих на псориатический фенотип. Подобные данные т νι\Ό дополнительно позволяют предполагать, что ГЬ-20 вовлечен в псориаз. Если это так, то антагонисты активности ГЬ-20, такие как моноклональные антитела настоящего изобретения против ГЬ-20КА человека, а также растворимые рецепторы и антитела к ним и нейтрализующие и моноклональные антитела против II ,-20 пригодны терапевтически в качестве антагонистов ГЬ-20 при лечении воспалительных заболеваний, таких как псориаз, а также при других показаниях, раскрытых здесь.
Пример 22. ГЬ-20 увеличен в образцах кожи атопического дерматита человека.
A. Образцы РНК.
Получали образцы нормальной кожи, а также кожи от больных атопическим дерматитом. РНК выделяли из образцов кожи человека с помощью традиционных способов. Целостность и качество образцов РНК тестировали на АдИеп! 2100 ВюапаК/ег (АдИеп! Тесйпо1од1ек, ^а1бЬгопп Германия).
B. Праймеры и зонды для количественной ОТ-ПЦР.
Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени с применением АВГ РКГ8М 7700 8ес]непсе Пе!ес!юп 8ук!ет (РЕ АррНеб Вюкук!етк, Гпс., Рок!ег С1!у, СА) была описана ранее (см. Не1б, С.А. е! а1., Оепоте Кекеагск 6:986-994, 1996; О1Ькоп, и.Е.М. е! а1., Оепоте Кекеагск 6:995-1001, 1996; 8ипбагекап, 8. е! а1., Епбосппо1оду 139:4756-4764, 1998. Данный способ включает применение специфичного для гена зонда, содержащего и репортерный, и гасящий флуоресцентные красители. Когда зонд является интактным, эмиссия репортерного красителя сводится на нет из-за близкого соседства гасящего красителя. При удлинении при ПЦР с применением дополнительных специфичных для гена прямого и обратного праймеров зонд расщепляется от 5'- к 3'-концу благодаря нуклеолитической активности ДНК-полимеразы гТ!к, которая высвобождает репортерный краситель из зонда, что приводит к увеличению флуоресцентной эмиссии.
Примененные для анализа экспрессии ГЬ-20 с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени праймеры и зонды были сконструированы с применением программы для дизайна праймеров Рптег Ехргекк™ (РЕ АррНеб Вюкук!етк, Рок!ег СИу, СА). В реакции ПЦР (ниже) были применены прямой праймер ΖС40541 (8ЕР ГП N0: 25) и обратный праймер ΖС 40542 (8ЕР ГП N0: 26) в концентрации 800 нМ для синтеза продукта размером 71 п.н. Соответствующий ГЬ-20 зонд Тас|\1ап®, ΖС 40544 (8ЕР ГП N0:27) синтезировали и метили в РЕ АррНеб Вюкук!етк. Зонд ГЬ-20 метили по 5'-концу репортерным флуоресцентным красителем (6-карбоксифлуоресцеином) (РАМ) (РЕ АррНеб Вюкук!етк) и по 3'-концу гасящим флуоресцентным красителем (6-карбокситетраметилродамином) (ТАМКА) (РЕ АррНеб Вюкук!етк).
C. Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени.
- 77 009124
Относительный уровень мРНК 1Ь-20 определяли путем анализа суммарных образцов РНК с применением набора ТадМап ΞΖ КТ-РСК Соге Кеадеп!к (РЕ Аррйеб Вюкук!етк). Для получения стандартной кривой, применяемой для количественного определения, готовили транскрипт 1Ь-20 до обрыва. Кривая состояла из 10-кратных последовательных разведений, варьирующих от приблизительно 1е8 до 1е3 общего количества копий полной матрицы для 1Ь-20, причем каждую точку стандартной кривой анализировали в трех параллелях. Образцы суммарной РНК из кожи также анализировали в трех параллелях на предмет уровня транскрипта 1Ь-20 и уровня ЙСИ8 в качестве внутреннего контроля. Каждый образец РНК в суммарном объеме 25 мкл подвергали реакции ОТ-ПЦР на ТадМап ΞΖ (РЕ АррНеб В1окук!етк) при содержании: приблизительно 25 нг суммарной РНК в воде, обработанной ПЕРС (свободной от ДНКазы/РНКазы); подходящих праймеров (приблизительно 800 нМ ΖС40541 (8ЕО ΙΌ NО:25) и ΖС40542 (8ЕО ΙΌ NО:26); соответствующего зонда (приблизительно 100 нМ ΖС40544 (8ЕО ΙΌ NО:27); 1х ТадМап ЕΖ буфера; 3 мМ ацетата марганца; 300 мкМ каждого из б-СТР, б-АТР, и б-СТР и 600 мкМ б-ИТР; гТ(Н ДНК-полимеразы (0,1 Е/мкл); и АтрЕгаке υNС (0,01 Е/мкл).
Температурные условия цикла ПЦР были следующими:
исходная стадия обработки ϋΝΌ из одного цикла при 50°С в течение 2 мин; последующая стадия обратной транскрипции (ОТ) из одного цикла при 60°С в течение 30 мин; последующая стадия дезактивации Е'\С> из одного цикла при 95°С в течение 5 мин;
последующие 40 циклов амплификации при 94°С в течение 20 с и 60°С в течение 1 мин.
Относительный уровень РНК №20 определяли с помощью способа стандартной кривой, как описано производителем, РЕ В1окук!етк (Икег Ви11ейп #2: АВ Рпкт 7700 8едиепсе Пе!ес!юп 8ук!ет, Ке1а!гое ОнапШаЕоп оГ Сепе Ехргеккюп, ОесетЬег 11, 1997). Для нормализации уровня №20 применяли измерение ЙСИ8.
мРНК №20 выявлялась на низком уровне (приблизительно 800 копий) в образцах кожи. Напротив, уровень матрицы №20 в коже больных атопическим дерматитом был увеличен (приблизительно 8600 копий). Субъединицы рецептора №20, включая №20КА, №22КА и №20КВ экспрессируются в нормальной коже человека и коже с заболеванием. Эти данные подтверждают сильную связь №20 с заболеванием атопическим дерматитом человека.
В коже атопического дерматита человека была показана повышенная экспрессия №20, что позволяет предполагать участие №20 в атопическом дерматите человека. Более того, как описано здесь, гиперэкспрессия №20 у трансгенных мышей сопровождалась утолщением эпидермиса и вовлечением иммунных клеток, указывающих на фенотип атопического дерматита. Подобные данные ш νίνο дополнительно позволяют предполагать, что №20 вовлечен в атопический дерматит. Если это так, то антагонисты активности №20, такие как моноклональные антитела настоящего изобретения против №22КА человека, а также растворимые рецепторы и антитела к ним и нейтрализующие и моноклональные антитела против №20 пригодны терапевтически в качестве антагонистов №20 при лечении воспалительных заболеваний, таких как атопический псориаз, а также при других показаниях, раскрытых здесь.
Пример 23. Увеличение №8 под действием №20.
Нормальные человеческие кератиноциты эпидермиса новорожденных (Р1НЕК) (от С1опейск) пассажа 2 высевали и выращивали до конфлуентности в 12-луночных планшетах для культуры ткани. КСМ (среду роста кератиноцитов) приобретали в С1опейск. Когда клетки достигали конфлуентности, их промывали средой КСМ без ростовых факторов=КВМ (базальной средой кератиноцитов). Клетки в КВМ лишали сыворотки в течение 72 часов перед добавлением тестируемых соединений. В качестве положительных контролей применяли тромбин в концентрации 1 МЕ/мл и трипсин в концентрации 25 нМ. Добавляли 1 мл среды/лунку. В качестве отрицательного контроля использовали только КВМ.
№20 готовили в среде КВМ и добавляли в различных концентрациях, от 2,5 мкг/мл до 618 нг/мл в первом эксперименте и от 2,5 мкг/мл до 3 нг/мл во втором эксперименте.
Клетки инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 48 ч. Супернатанты удаляли и замораживали при -80°С на несколько дней перед анализом уровня №8 и СМ-С8Р. Набор ИФА для №8 человека # Ό8050 (КапбО 8ук!етк, №.) и набор ИФА для СМ-С8Р человека # Н8СМО (КапбО 8ук!етк, №.) применяли для определения продукции цитокинов в соответствии с указаниями производителя.
Результаты показали, что экспрессия №8 и СМ-С8Р индуцируется под действием №20.
Пример 24. Увеличение воспалительных цитокинов под действием №20.
Клетки линии НаСаТ кератиноцитов человека выращивали при 37°С до нескольких дней после достижения конфлуентности во флаконах для культуры ткани Т-75. В этот момент нормальную ростовую среду (ПМЕМ+10% РВ8) удаляли и заменяли бессывороточной средой. Клетки затем инкубировали в течение двух дней при 37°С. После этого ПМЕМ удаляли, и четыре флакона клеток на обработку обрабатывали при одном из следующих условий в течение четырех часов при 37°С: рекомбинантным человеческим (гН) №1 альфа в концентрации 5 нг/мл, гН №1 альфа в концентрации 20 нг/мл, гН №1 альфа в концентрации 5 нг/мл + №20 в концентрации 1 мкг/мл, №20 в концентрации 1 мкг/мл или гН №10 в концентрации 10 нг/мл.
После обработки цитокинами среду удаляли, и клетки лизировали с помощью раствора гуанидинтиоцианата. Суммарную РНК выделяли из клеточного лизата центрифугированием в течение ночи в гра
- 78 009124 диенте хлорида цезия. На следующий день осадок РНК ресуспендировали в растворе ТЕ/8Э8 и осаждали этанолом. Затем РНК измеряли с помощью спектрофотометра, после чего обрабатывали ДНКазой согласно разделу Υ.Β. Скп&сй'з А!1аз™ сЭНА Е.хргеззюп Аггауз Изег Мапиа1 (уегзюп РТ3140-1/РВ9Х390, публикация 11/5/99). Качество РНК в образцах проверяли расчетами чистоты, основанными на спектрометрических показателях, и посредством визуализации на агарозном геле. Геномное загрязнение образцов РНК исключалось с помощью анализа ПЦР гена бета-актина.
Следовали протоколам СЕпВсй чипов А!1аз™ для обогащения полиА+, синтеза зонда и гибридизации (см. выше плюс А11аз Риге ВВА ЬаЬейпд 8уз!ет Изег Мапиа1, РТ3З31 -1/РВ96157, публикация 6/22/99). Вкратце, полиА+ РНК выделяли из 50 мг суммарной РНК с помощью покрытых стрептавидином магнитных шариков (СЕп^сй, Раοίο А1Ю, СА) и сепаратора магнитных частиц. ПолиА+ РНК затем метили альфа32Р-бАТР посредством ОТ-ПЦР. В реакции применяли СЭ8 праймеры СЕп^сй, специфичные к 268 генам чипа цитокинов/рецепторов человека А!1аз™ (Са!. #7744-1). Меченый зонд выделяли с помощью колоночной хроматографии и измеряли в сцинтилляционной жидкости.
Чипы А1аз™ предварительно гибридизовали с С^песй Εxρ^еззΗуЬ плюс 100 мг/мл ДНК спермы лосося в течение по меньшей мере 30 мин при 68°С при постоянном перемешивании. Мембраны затем гибридизовали с 1,9х106 имп/мин/мл (общее количество 1,14х107 имп/мин) в течение ночи при 68°С при постоянном перемешивании. На следующий день мембраны промывали в течение тридцати минут х4 в 2х 88С, 1% 8Ό8 при 68°С плюс в течение 30 мин х1 в 0,1х 88С, 0,5% 8Ό8 при 68°С с последующей заключительной промывкой при комнатной температуре в течение пяти минут в 2х 88С. Мембраны чипов затем помещали в пластиковые мешочки ΚοΠπΡ запаивали и экспонировали с экраном формирователя изображения фосфора в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день фосфорные экраны сканировали на формирователь изображения фосфора и анализировали с помощью программы Οοπ!есй'з А^^аде™ 1.0.
Гены, стимулируемые ΙΕ-20:
1. Фактор некроза опухолей (ТЗЕ| увеличивался 1,9-2,4-кратно под действием ΙΕ-20.
2. Факторы роста плаценты 1 и 2 (РЬСЕ) увеличивались 1,9-2,0-кратно под действием ΙΕ-20.
3. Рецептор фактора свертывания крови ΙΙ увеличивался 2,0-2,5-кратно под действием ΙΕ-20.
4. Рецептор кальцитонина увеличивался 2,2-2,3-кратно под действием ΙΕ-20.
5. Индуцируемый Т№Е связывающий гиалуронат белок Т8С-6 увеличивался 2,1-2,2-кратно под действием ΙΕ-20.
6. Предшественник рецептора-1 фактора роста эндотелия сосудов (УЕСЕ), тирозинпротеинкиназный рецептор (ЕЬТ-1) (8ЕЬТ) увеличивался 2,1-2,7-кратно под действием ΙΕ-20.
7. МВР-8 (кальцийсвязывающий белок в макрофагах, родственный МЩ) увеличивался 2,9-4,1кратно под действием ΙΕ-20.
8. МВР-14 (кальцийсвязывающий белок в макрофагах, родственный МЩ) увеличивался 3,0-3,8кратно под действием ΙΕ-20.
9. Релаксин Н2 увеличивался 3,14-кратно под действием ΙΕ-20.
10. Рецептор ΙΙΙ 300 кДа трансформирующего фактора роста бета (ТСЕв) увеличивался 2,4-3,6кратно под действием ΙΕ-20.
Гены, проявляющие синергизм при обработке ΙΕ-20 + ΙΕ-1:
1. Морфогенный белок кости 2а увеличивался 1,8-кратно при обработке одним ΙΕ-20, 2,5-кратно при обработке одним ЕЪ-1 и 8,2-кратно при совместной обработке ΙΕ-20 и ΙΣ-1.
2. МВР-8 увеличивался 2,9-кратно при обработке одним ΙΕ-20, 10,7-кратно при обработке одним ΙΕ1 и 18,0-кратно при совместной обработке ΙΕ-20 и ΙΣ-1.
3. Белок эритроидной дифференцировки (ЕРЕ) увеличивался 1,9-кратно при обработке одним ΙΕ-20, 9,7-кратно при обработке одним ЕЪ-1 и 19,0-кратно при совместной обработке ΙΕ-20 и ΙΣ-1.
4. МВР-14 (кальцийсвязывающий белок в макрофагах, родственный МШ) увеличивался 3,0-кратно при обработке одним ΙΕ-20, 12,2-кратно при обработке одним ЕЪ-1 и 20,3-кратно при совместной обработке ΙΕ-20 и ΙΣ-1.
5. Гепаринсвязывающий ЕСЕ-подобный фактор роста увеличивался 2,0-кратно при обработке одним ΙΕ-20, 14-кратно при обработке одним ЕЪ-1 и 25,0-кратно при совместной обработке ΙΕ-20 и ΙΣ-1.
6. Бета-тромбоглобулиноподобный белок увеличивался 1,5-кратно при обработке одним ΙΕ-20, 15кратно при обработке одним ΙΕ-1 и 27-кратно при совместной обработке ΙΕ-20 и Ш-Е
7. Нейротропный фактор из мозга (ΒΌΚΡ) увеличивался 1,7-кратно при обработке одним ΙΕ-20, 25кратно при обработке одним ЕЪ-1 и 48-кратно при совместной обработке ΙΕ-20 и ΙΣ-1.
8. Фактор хемотаксиса и активации моноцитов МСАЕ увеличивался 1,3-кратно при обработке одним ΙΕ-20, 32-кратно при обработке одним ЕЪ-1 и 56-кратно при совместной обработке ΙΕ-20 и ΙΣ-1.
Пример 25. ΙΕ-20 трансгенный фенотип.
ΙΕ-20 и человека, и мыши были гиперэкспрессированы у трансгенных мышей с применением множества промоторов. Исходно в попытке добиться повышения уровня белка в кровяном русле был применен управляющий экспрессией ΙΕ-20 человека специфичный для печени промотор альбумина мыши. Последующие исследования проводили с применением промотора кератина 14 (Κ14), который в первую
- 79 009124 очередь направляет экспрессию в эпидермис и другие типы слоистого чешуйчатого эпителия; промотора металлотионеина-1 мыши, который обеспечивает характер широкой экспрессии; и промотор ЕцБСК, который управляет экспрессией в клетках лимфоидного ряда. Во всех четырех случаях были получены сходные результаты, возможно благодаря тому, что все данные промоторы обеспечивали повышение уровня ГБ-20 в кровяном русле.
Во всех случаях трансгенные мышата, экспрессирующие трансген ГБ-20, были меньше мышат нетрансгенных пометов, имели блестящий облик с плотной, морщинистой кожей и погибали в первые несколько дней после рождения. В желудках мышат было молоко, что указывает на то, что они были способны к сосанию. У данных мышей были раздутые конечности, хвост, области ноздрей и рта, и они с трудом передвигались. Кроме того, мыши были слабыми, лишены видимой жировой ткани, и у них было замедленное развитие ушей и пальцев. Низкий уровень экспрессии в печени (менее 100 молекул мРНК/клетку) был достаточным и для неонатальной летальности, и для аномалий кожи. Трансгенные мыши без видимого фенотипа либо не экспрессировали трансген, либо не экспрессировали его на выявляемом уровне, либо были мозаиками.
Гистологический анализ кожи ГБ-20 трансгенных мышей показал утолщенный эпидермис, гиперкератоз и компактный роговой слой по сравнению с нетрансгенными пометами. Иногда наблюдались сероклеточные струпья (струпья). Электронно-микроскопический (ЕМ) анализ кожи трансгенных мышей выявил внутримитохондриальные липоидные включения, пятнистые кератогиалиновые гранулы и сравнительно редкие тонофиламенты, сходные с наблюдаемыми в псориазной коже человека и мышиных моделях заболевания кожи. Кроме того, у многих трансгенных мышей были апоптотические лимфоциты тимуса. С помощью гистопатологического анализа не было выявлено других аномалий. Данные гистологические и ЕМ результаты подтверждают и расширяют наблюдаемые значительные повреждения кожи.
Пример 26. Конструирование экспрессионного вектора для экспрессии растворимого человеческого ГБ-22НА-тиРс.
Получали гибрид растворимого рецептора 1Б-22НА человека-тиРс (обозначаемый как 1Б-22НАС(тС2а), содержащий внеклеточный домен ГБ-22НА, слитый с областью Рс тяжелой цепи гамма 2а мыши (тС2а). Экспрессионную плазмиду, содержащую ГБ-22НА-С(тС2а), конструировали посредством гомологичной рекомбинации с применением двух отдельных фрагментов ДНК и экспрессионного вектора р2МР40. Фрагменты полинуклеотидной последовательности 1Б-22НА (8ЕЦ ГО N0: 1), и т62а 8ЕЦ ГО N0:39 получали посредством амплификации с помощью ПЦР с применением следующих праймеров: (а) праймеров ГБ-22НА 2С45593 (8Ер ГО N0:28) и 2С45592 (8 ЕС) ГО N0:29); и (Ь) праймеров т62а 2С45591 (8ЕС) ГО N0:30) и 2С45594 (8ЕС) ГО N0:31).
Первый фрагмент содержал кодирующую область внеклеточного домена ГБ-22НА, которую получали с применением полинуклеотида ГБ-22НА (например, 8ЕЦ ГО N0:1) в качестве матрицы. Первый фрагмент включал 5'-перекрытие с частичной последовательностью вектора р2МР40, сегмент ГБ-22НА и 3'-перекрытие, содержащее линкерную последовательность и частичную последовательность тС2а. Условия ПЦР: 1 цикл, 94°С, 5 мин; 35 циклов, 94°С, 1 мин и затем 55°С, 2 мин; затем 72°С, 3 мин; 1 цикл, 72°С, 10 мин.
Второй фрагмент включал 5'-перекрытие с линкерной последовательностью и частичную последовательность ГБ-22НА, сегмент тС2а и 3'-перекрытие, содержащее частичную последовательность вектора р2МР40. Область Рс тяжелой цепи гамма 2а мыши (т62а) (8ЕЦ ГО N0: 39) получали из клона кДНК тяжелой цепи гамма 2а Гд мыши. тС2а содержит шарнир, домены СН2 и СН3 константной области тяжелой цепи иммуноглобулина гамма 2а мыши. Условия ПЦР: 1 цикл, 94°С, 5 мин; 35 циклов, 94°С, 1 мин и затем 55°С, 2 мин; затем 72°С, 3 мин; 1 цикл, 72°С, 10 мин.
Реакционные смеси ПЦР разгоняли на 1% агарозном геле, и полосы, соответствующие размерам вставок, экстрагировали из геля с помощью набора для экстракции из геля рГАдшск™ (Ц|адеп).
Плазмиду р2МР40, которую разрезали с помощью ВдШ, использовали в трехсторонней рекомбинации с обоими вставочными фрагментами ПЦР. Плазмида р2МР40 представляет собой экспрессионный вектор для млекопитающих, содержащий экспрессионную кассету, включающую промотор МР8У и множественные сайты рестрикции для вставки кодирующих последовательностей; старт репликации Е.сой; единицу экспрессии, содержащую селектируемый маркер млекопитающего, включающую промотор 8У40, энхансер и старт репликации, ген ОНРН и терминатор 8У40; и последовательности ИНА3 и СЕN-ΑΚ8, необходимые для селекции и репликации в 8. сегеу1з1ае. Плазмиду р2МР40 конструировали из р2МР21 (депонированной в Американской коллекции типов культур, 10801 Ишуегзйу Вои1еуагб, Мапаззаз, УА 20110-2209, и обозначенной № РТА-5266) путем добавления нескольких сайтов для ферментов рестрикции для полилинкера.
100 мкл клеток компетентных дрожжей (8. сегеу1з1ае) независимо объединяли с 10 мкл вставочной ДНК и 100 нг разрезанного вектора р2МР40, и смесь переносили в 0,2-см кювету для электропорации. Смесь дрожжи/ДНК подвергали действию электроимпульсов с применением источника тока (ВюНаб БаЬога!опез, Негси1ез, СА) с установками 0,75 квт (5 квт/см), х> ом, и 25 мкф. В кювету добавляли 600 мкл 1,2М сорбита, и дрожжи высевали в 100- и 300-мкл аликвотах в два планшета ИНА-0 и инкубирова
- 80 009124 ли при 30°С. Через приблизительно 72 ч трансформанты дрожжей Ига+ из единственного планшета ресуспендировали в 1 мл Н2О и быстро центрифугировали для осаждения дрожжевых клеток. Осадок клеток ресуспендировали в 0,5 мл лизирующего буфера (2% тритон Х-100, 1% ДДС-№, 100 мМ №С1, 10 мМ трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА). 500 мкл лизированной смеси вносили в пробирку (ЕррепйогГ), содержащую 250 мкл промытых кислотой стеклянных шариков и 300 мкл смеси фенола-хлороформа, перемешивали в течение 3 мин и осаждали в течение 5 мин на центрифуге (ЕррепйогГ) при максимальной скорости. 300 мкл водной фазы переносили в новую пробирку, и ДНК осаждали 600 мкл этанола (Е!0Н) и 30 мкл 3М ацетата натрия с последующим центрифугированием в течение 30 мин при максимальной скорости. Пробирку декантировали, и осадок промывали 1 мл 70% этанола. Пробирку декантировали, и осадок ДНК ресуспендировали в 30 мкл ТЕ.
Трансформацию электрокомпетентных клеток-хозяев Е.со11 (ЭН128) проводили с применением 5 мкл препарата дрожжевой ДНК и 50 мкл клеток. Клетки подвергали действию электроимпульсов при 2,0 кв, 25 мкф и 400 ом. После электропорации добавляли 1 мл 80С (2% Вас!о™ триптон фйсо, Ое1го11, МЦ 0,5% дрожжевой экстракт фгГсо), 10 мМ №С1, 2,5 мМ КС1, 10 мМ МдС12, 10 мМ Мд804, 20 мМ глюкоза), и затем клетки высевали в аликвотах 50 мкл и 200 мкл в два планшета ЬВ АМР (ЬВ Ьго!Е (Ьеппох), 1,8% Вас!о™ Адаг фйсо), 100 мг/л ампициллин).
Вставки трех клонов конструкта подвергали анализу последовательности, и был отобран один клон каждого конструкта, содержащий правильную последовательность. В большем масштабе плазмидную ДНК выделяли с применением имеющегося в продаже набора (^IΑСЕN Р1акт1й Меда Кй, Р1адеп, Уа1епс1а, СА) в соответствии с инструкциями производителя.
Пример 27. Экспрессия и очистка полипептида растворимого человеческого №-22ЯА-тиГс.
Каждый из трех рядов конструкта I^-22ЯΑ-С(тС2а) (пример 22) в количестве 200 мкг гидролизовали 200 единицами Руи Ι при 37°С в течение трех часов и затем осаждали ЧРА и центрифугированием в 1,5-мл центрифужной пробирке. Супернатант сливали с осадка, и осадок промывали 1 мл 70% этанола и оставляли инкубироваться в течение 5 мин при комнатной температуре. Пробирку центрифугировали на микрофуге в течение 10 мин при 14000 об/мин, и супернатант сливали с осадка. Осадок затем ресуспендировали в 750 мкл среды РГ-СН0 в стерильных условиях и оставляли инкубироваться при 60°С в течение 30 мин. Клетки 5Е6 АРГОХВ11 осаждали центрифугированием в каждой из трех пробирок и ресуспендировали раствором ДНК-среда. Смеси ДНК/клетки помещали в 0,4-см кювету с отверстием и электропорировали при применении следующих параметров: 950 мкф, высокая емкость, и 300 в. Содержимое кювет затем удаляли, объединяли и разбавляли до 25 мл средой РГ-СН0 и помещали в 125-мл флакон для перемешивания. Флакон помещали в инкубатор на встряхивателе при 37°С, 6% С02, и встряхивали при 120 об/мин.
Линию клеток подвергали селекции на питательные добавки с последующей стадией амплификации до 100 нМ метотрексата (МТХ), затем 500 нМ МТХ и, наконец, 1 мкМ МТХ. Стадия амплификации сопровождалась сортировкой клеток СЭ8. Сортировка клеток СЭ8 производилась взятием стабильного амплифицированного пула 1 мкМ МТХ и окрашиванием приблизительно 5Е6 клеток моноклональным МТС антителом против СЭ8 (ВО РЕагМшдеп, са!# 30324Х) с применением рекомендованной производителем концентрации. Окрашенные клетки обрабатывали и сортировали на проточном цитометре ГАС8 Уап!аде (ВО). Верхние 5% клеток собирали и выращивали. Экспрессия была подтверждена Вестернблоттингом, и линию клеток наращивали с последующей очисткой белка с помощью стандартных способов.
Пример 28. Нейтрализация Ьи№-22ЯА сывороткой от мышей, иммунизированных ЕиI^-22ЯΑтЭ2а.
A. Анализ нейтрализации на основе клеток для тестирования ингибирования №-20 и/или №-22.
Для оценки нейтрализующего потенциала антител против №-22ЯА за счет антагонизма с №-22 на рецепторе №-22ЯА/№-20РВ применяли зависимую от фактора линию ВаГ3 пре-В-клеток, котрансфицированных №-22ЯА и №-20ВВ ()30^81) (клетки ВАГ/№-22ЯА/№-20РВ; пример 38). Сходным образом, для оценки нейтрализующего потенциала антител против №-22ЯА за счет антагонизма с №-22 на рецепторе №-22ЯА/№10ЯВ применяли ВаГ3, котрансфицированные №-22ЯА и №-10ВВ (СЯГ2-4) (клетки ВАГ/№-22ЯА/СЯГ2-4; пример 2). Пролиферацию в присутствии №-20 или №22 экспрессирующей соответствующий рецептор клеточной линии и ингибирование такой пролиферации в присутствии антагонистических антител оценивали с помощью теста аламара синего, как описано в примере 3. Ингибирование пролиферации данных клеток указывает на нейтрализующую активность в данном тесте.
B. Антисыворотка против №-22ЯА нейтрализует и №-20, и №-22 в основанном на клетках тесте нейтрализации.
С применением теста, описанного в примере 28А, сыворотку от мышей с нокаутом №-22ЯА, иммунизированных Еи№-22ЯА-тиС2а (пример 30(А) (1)) добавляли в последовательных разведениях 1, 0,5, 0,25, 0,13, 0,06, 0,03, 0,02, и 0%. Планшеты для анализа инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 4 дней, после чего добавляли аламар синий (Асситей, СЫсадо, №) в количестве 20 мкл/лунку. Планшеты вновь инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 16 ч. Аламар синий дает флуориметрический показатель, основанный на количестве живых клеток, и, таким образом, обеспечивает прямое измерение про
- 81 009124 лиферации клеток по сравнению с отрицательным контролем. Планшеты считывали на Уа11ас У1с!ог 2 1420 Ми1!11аЬе1 Соип!ег (Уа11ас, Тигки, Гт1апб) при длинах волн 530 (возбуждение) и 590 (испускание). Результаты показали, что сыворотка от всех семи иммунизированных животных могла нейтрализовывать сигналы и 1111^-22, и 1ШШ-20 через ΗиI^-22ΚΑ. Например, при 1% концентрации сыворотка от пяти животных (16517, 16518, 16519, 16520 и 16527) полностью нейтрализовывала пролиферацию, индуцированную 1υΙΕ-22, при ингибировании пролиферации, снижающемся зависимым от дозы образом при более низких концентрациях. Более того, при концентрации 1% сыворотка от двух других животных (16471 и 16701) ингибировала приблизительно 90% пролиферации, индуцированной ΕπΙΕ-22, при ингибировании пролиферации, снижающемся зависимым от дозы образом при более низких концентрациях. Сходным образом, при концентрациях 1 и 0,5% сыворотка от пяти животных (16517, 16518, 16519, 16520 и 16527) полностью нейтрализовывала пролиферацию, индуцированную ΕπΙΕ-20, при ингибировании пролиферации, снижающемся зависимым от дозы образом при более низких концентрациях. Более того, при концентрации 1% сыворотка от животного 16701 полностью нейтрализовывала пролиферацию, индуцированную ΕπΙΕ-20, при ингибировании пролиферации, снижающемся зависимым от дозы образом при более низких концентрациях. При концентрации 1% сыворотка от животного 16471 нейтрализовала приблизительно 95% пролиферации, индуцированной ΕπΙΕ-20, при ингибировании пролиферации, снижающемся зависимым от дозы образом при более низких концентрациях. Таким образом, сыворотка от всех семи животных была способна нейтрализовать пролиферацию, индуцированную либо ΙΕ-20, либо ΙΕ-22 через рецептор ΗиI^-22ΚΑ. Данные результаты дополнительно показали, что антитела против I^-22ΚΑ действительно могут антагонистически противодействовать активности провоспалительных лигандов, ΙΕ-20 и ΙΕ-22, при низких концентрациях.
Данные результаты послужили дополнительным доказательством того, что эффективная блокада активности I^-22ΚΑ посредством связывания, блокирования, ингибирования, подавления, антагонистического действия или нейтрализации активности ΙΕ-20 или ΙΕ-22 (раздельно или совместно), например, с помощью нейтрализующего моноклонального антитела настоящего изобретения против I^-22ΚΑ могла бы быть полезной для снижения действия ΙΕ-20 и ΙΕ-22 (раздельно или совместно) ш νί\Ό и может снижать индуцированное ΙΕ-20 и/или ΙΕ-22 воспаление, такое, какое наблюдается при действии ΙΕ-20 на кожу, а также при действии ΙΕ-22 на кожу, например, при псориазе, КБ, колите или других воспалительных заболеваниях, индуцируемых ΙΕ-20 и/или ΙΕ-22, включая КБ, артрит, астму, псориатический артрит, колит, воспалительные состояния кожи и атопический дерматит.
Пример 29. Получение клеток Р815/ЫЕ-22КА и иммунизация мышей.
А. Получение клеток Р815/ЫЕ-22КА и инъекция мышам для выработки антител против ЫЕ-22КА.
Клетки УТ Р815 (АТСС № ТШ-64) трансфицировали плазмидным вектором, содержащим последовательность кДНК ЫЕ-22КА (например, 8ЕЦ ΙΌ N0:1) и селектируемый маркер устойчивости к пуромицину, с помощью реактива Гидепе согласно протоколу производителя (КосНе, Iηб^аηаρο1^к, Ш). Клетки высевали при селекции пуромицином через 48 ч после трансфекции. Устойчивые к пуромицину трансфектанты клонировали предельным разведением и подвергали скринингу на уровень экспрессии ЫЕ22КА на их клеточной поверхности с помощью проточной цитометрии при использовании биотинилированного ΙΕ-22 человека (НиШ^-биотин). Вкратце, клетки инкубировали с 5 мкг/мл НиГО-22-биотин в течение 30 мин на льду и затем промывали. Связывание ΗиI^-22-биотин с клетками определяли с применением меченого РЕ стрептавидина при 1:500. Клетки анализировали на проточном цитометре Гасксап с применением программы Се11с.|иек1 (Вес!оп Бюкткоп, 8ап 1оке, СА).
Отобранный клон клеток Р815ЛЕ-22КА выращивали и затем собирали для инъекции. Клетки собирали, промывали три раза ЗФР, подсчитывали, ресуспендировали в концентрации 1х108 клеток на миллилитр и облучали 10000 рад. После этого суспензию клеток переносили в 1-мл шприц и инъецировали внутрибрюшинно мышам линии БВА/2. Мышам вводили поддерживающую инъекцию идентичным образом через 3 недели, и сыворотку подвергали скринингу на связывание с трансфицированной ЫЕ-22КА линией клеток. Вкратце, сыворотку разводили 1:100 буфером Гаск (НВ88, 2% БСА, 0,02% NаNз) и затем инкубировали с Гс-блокированными клетками почки человека 293, гиперэкспрессирующими ЫЕ-22КА. Связывание антител против I^-22ΚΑ с клетками определяли затем с применением конъюгированного с флуоресцеином ЦС козы против мыши, разбавленным до 1:200 (8ои!Негп Вю!есН, В1гттдНат, АБ). Клетки анализировали, как описано ранее. Мышам вновь вводили поддерживающую инъекцию еще три раза, и сыворотку подвергали скринингу, как описано. На основе связывания сыворотки с трансфектантами ЫЕ-22КА были отобраны две мыши для гибридомного слияния с применением стандартных в данной области техники способов для получения моноклональных антител (пример 25).
Приведенный выше способ применяют также для получения клеток Р815, экспрессирующих гетеродимерные рецепторы I^-22ΚΑ, такие как I^-22ΚΑ/СΚΓ2-4 (Р815ЛБ-22КА/СКГ2-4 клетки), ГО22КА/рШК81 ^^ЛБ^КА/рБШ^ клетки) или 11.-221^/(40-4/144 К81 (Р815ЛБ-22КА/СКР24/)30^81 клетки), например, для иммунизации мышей для выработки моноклональных антител против ХЕ-22КА и включающих ХЕ-22КА гетеродимерных рецепторов.
Пример 30. Получение тАЬ мыши против I^-22ΚΑ (ГО-22КА) человека.
А. Иммунизация для выработки антител против I^-22ΚΑ.
- 82 009124 (1) Применение растворимого БЬ-22ВА-тиРс.
Мышей с нокаутом ББ-22ВА (пример 26) в возрасте от шести до двенадцати недель иммунизировали внутрибрюшинной инъекцией 25-50 мкг белка растворимого человеческого БЬ-22ВА-тиРс (пример 23), смешанного 1:1 (об./об.) с адъювантом Риби (8Бдта) по двухнедельной схеме. Через семь-десять дней после третьей иммунизации брали образцы крови посредством ретроорбитального кровопускания, получали сыворотку и оценивали ее способность ингибировать связывание БЬ-22 или обоих БЬ-20 и БЬ-22 с БЬ-22ВА в тестах нейтрализации (например, описанных здесь) и окрашивать трансфицированные БЬ22ВА клетки 293 по сравнению с нетрансфицированными в тесте окрашивания РАС8. Мышей продолжали иммунизировать и продолжали отбор образцов крови и ее оценку, как описано выше до тех пор, пока титры нейтрализации не достигали плато. В это время мышам с наивысшими титрами нейтрализации инъецировали внутрисосудисто 25-50 мкг белка растворимого БЬ-22ВА-РС в ЗФР. Через три дня у данных мышей забирали селезенку и лимфатические узлы и использовали для образования гибридомы, например, с применением клеток мышиной миеломы (Р3-Х63-Ад8.653.3.12.11) или других подходящих линий клеток с использованием стандартных способов, известных в данной области (например, см. Кеагпеу, Б.Р. еБ а1., Б. БшшипоБ 123:1548-50, 1979; и Ьапе, В.О. Б Бттипо1 МеБйобк 81:223-8, 1985).
(2) Применение трансфектантов Р815, которые экспрессируют рецептор БЬ-22ВА.
Самок мышей линии ПВА/2 в возрасте от шести до десяти недель иммунизировали внутрибрюшинной инъекцией 1х105 живых трансфицированных клеток Р815, например, клетками Р815/БЬ-22ВА, клетками Р815/Б 4-22^/0^2-4, Р8 Ь/П.^ВА/рПП^ 1 или Р815/Б^-22ВЛ/СВР2-4/р^БВ81 (пример 24) (например, 0,5 мл при плотности клеток 2х105 клеток/мл). Перед инъекцией клетки поддерживались в фазе экспоненциального роста. Для инъекции клетки собирали, промывали три раза ЗФР и затем ресуспендировали в ЗФР до плотности 2х105 клеток/мл. В данной модели у мышей развивается асцитная опухоль в пределах 2-3 недель, которая прогрессирует до смерти через 4-6 недель, если не был выработан иммунный ответ на трансфицированный антиген-мишень. Через три недели мышей с явным абдоминальным вздутием (указывающим на асцит) повторно иммунизировали, как описано выше, с 2-3-недельными интервалами. Через семь-десять дней после второй иммунизации отбирали образцы крови посредством ретроорбитального кровопускания, получали сыворотку и оценивали ее способность ингибировать связывание БЬ-22 или обоих БЬ-20 и БЬ-22 с БЬ-22ВА в тестах нейтрализации (например, описанных здесь) и окрашивать трансфицированные БЬ-22ВА клетки 293 по сравнению с нетрансфицированными в тесте окрашивания РАС8. Мышей продолжали иммунизировать и продолжали отбор образцов крови и ее оценку, как описано выше до тех пор, пока титры нейтрализации не достигали плато. В это время мышам с наивысшими титрами нейтрализации инъецировали внутрибрюшинно 1х105 живых трансфицированных клеток Р815. Через четыре дня у данных мышей забирали селезенку и лимфатические узлы и использовали для образования гибридомы, например, с применением клеток мышиной миеломы (Р3-Х63Ад8.653.3.12.11) или других подходящих для данной области техники линий клеток с использованием стандартных способов, известных в данной области техники (например, смотри Кеагпеу, Б.Р. еБ а1., выше; и Ьапе, В.О. выше).
Альтернатива описанной выше схемы иммунизации живыми, трансфицированными клетками Р815 включает внутрибрюшинную инъекцию 1-5х106 облученных трансфицированных клеток каждые 2-3 недели. При данном подходе у животных не развивается асцит, вызывающий гибель. Вместо этого у животных отслеживают нейтрализующий иммунный ответ против БЬ-22ВА в сыворотке, как описано выше, начиная с кровопускания после второй иммунизации. После достижения титрами нейтрализации максимального уровня мышам с наивысшими титрами вводили прегибридизационную внутрибрюшинную инъекцию 5х106 облученных клеток, и через четыре дня у данных мышей забирали селезенку и лимфатические узлы и использовали для образования гибридомы, например, с применением клеток мышиной миеломы (Р3-Х63-Ад8.653.3.12.11) или других подходящих для данной области техники линий клеток с использованием стандартных способов, известных в данной области техники (например, смотри Кеагпеу, Б.Р. еБ а1., выше; и Ьапе, В.О. выше).
В. Скрининг гибридомных гибридов на антитела, которые связывают БЬ-22ВА и ингибируют связывание БЬ-22 с БЬ-22ВА.
Два разных первичных скрининга проводили с супернатантами гибридом через 8-10 дней после слияния. Для первого анализа антитела в супернатантах тестировали на их способность связываться с привязанным к планшету белком растворимого человеческого БЬ-22ВА-тиРс с помощью ИФА с применением конъюгированных с НВР козьих реагентов второй стадии против легкой цепи каппа и лямбда мыши для выявления связанных мышиных антител. Для демонстрации специфичности в отношении части БЬ-22ВА белка БЬ-22ВА-тиРс положительные супернатанты из исходного тестирования оценивали на неродственный белок, слитый с той же самой областью Рс мыши (тС2а). Антитело в данных супернатантах, которое связывалось с БЬ-22ВА-тиРс, но не с неродственным содержащим тиРс гибридным белком, рассматривалось как специфичное в отношении БЬ-22ВА. Для второго анализа антитела во всех гибридомных супернатантах оценивали с помощью ИФА на их способность ингибировать связывание биотинилированного БЬ-22 человека с присоединенным к планшету БЬ-22ВА-тиРс.
- 83 009124
Все супернатанты, содержащие антитела, которые специфически связывались с Ш-22КА, независимо от того, ингибировали ли они связывание ΙΕ-22 с Ш-22КА или нет в тесте ИФА, затем тестировали на их способность ингибировать связывание (и сопровождающее про-пролиферативное действие) ΙΕ-20 или Ш-22 с трансфицированными Ш-22КА/Ш-20КВ и Ш-22КА/СКЕ2-4 клетками ВаГ3, соответственно. Все супернатанты, которые были положительными в тесте нейтрализации при анализе либо ингибирования Ш-22, либо ингибирования и Ш-20, и Ш-22, были затем подвергнуты оценке на их способность окрашивать трансфицированные Ш-22КА клетки ВаГ3 по сравнению с нетрансфицированными с помощью анализа РАС8. Данный анализ был разработан для подтверждения того, что ингибирование связывания ΙΕ22 с Ш-22КА/СКЕ2-4 или связывания Ш-20 с Ш-22КА/Ш-20КВ было действительно обусловлено антителом, которое специфически связывает рецептор Ш-22КА. Кроме того, поскольку анализ РАС8 проводили с реагентом второй стадии против ^С, положительные результаты специфического РАС8 указывают на то, что нейтрализующее антитело, по-видимому, относилось к классу ^С.
С помощью данных средств была выявлена базовая лунка, которая связывала Ш-22КА, связанный с планшетом ИФА, ингибировала связывание Ш-22 с Ш-22КА в тесте ингибирования на основе ИФА, блокировала взаимодействие Ш-20 и Ш-22 с трансфицированными Ш-22КА/Ш-20КВ и Ш-22КА/СКЕ2-4 клетками ВаГ3 (пример 28), соответственно, и была сильно положительной при окрашивании трансфицированных и Ш-22КА/Ш-20КВ, и Ш-22КА/СКР2-4 клеток ВаГ3 реагентом второй стадии против ΙβΟ мыши.
Ό. Клонирование гибридом, продуцирующих специфическое антитело против Ш-22КА.
Гибридому, продуцирующую тАЬ против Ш-22КА, которое перекрестно нейтрализовывало связывание Ш-20 и Ш-22 с соответствующим образом трансфицированными клетками ВаГ3, клонировали с помощью стандартного подхода разведения с низкой плотностью (менее 1 клетки на лунку). Приблизительно через 5-7 дней после посева клоны подвергали скринингу с помощью ИФА на планшетах со связанным человеческим Ш-22КА-тиРс с последующим повторным тестированием положительных лунок с помощью ИФА на неродственном содержащем тиРс гибридном белке, как описано выше. Дополнительное подтверждение активности специфического антитела отобранных клонов, супернатанты которых связывались с Ш-22КА-тиРс, но не с неродственным содержащим тиРс гибридным белком, получали повторением и тестов нейтрализации, и анализом РАС8. Все отобранные позитивные на антитело против Ш-22КА клоны клонировали, как минимум, два раза для получения уверенности в клональности и для достижения стабильности продукции антитела. Дополнительные раунды клонирования проводили и осуществляли скрининг, как описано выше, до тех пор, пока предпочтительно по меньшей мере 95% полученных клонов не были положительными в продукции нейтрализующего антитела против Ш-22КА.
Е. Биохимическая характеристика молекулы, узнаваемой шАЬ против Ш-22КА.
Биохимическое подтверждение того, что молекула-мишень, Ш-22КА, узнаваемая предполагаемыми шАЬк против Ш-22КА, действительно представляет собой Ш-22КА, получали с помощью стандартной иммунопреципитации с последующим анализом 8Ό 8-РАСЕ или процедурами Вестерн-блоттинга, причем в обоих случаях применяли растворимые мембранные препараты из трансфицированных Ш-22КА против нетрансфицированных клеток ВаГ3. Более того, применены растворимые мембранные препараты нетрансфицированных линий клеток, которые экспрессируют Ш-22КА, для того чтобы показать, что тАЬ узнают цепь нативного рецептора, как и трансфицированного. Альтернативно тАЬ тестируют на их способность специфически иммунопреципитировать или взаимодействовать при Вестерн-блоттинге с растворимым белком Ш-22КА-тиРс.
Пример 31. Нейтрализация йиЬ22КА сывороткой от мышей, получавших инъекцию клеток Р815, трансфицированных ЬиЬ22КА.
С применением теста нейтрализации на основе клеток, описанного в примере 28, добавляли сыворотку мышей, инъецированных живыми трансфицированными 1иШ-22КА клетками Р815 (пример 30.А.2) в виде последовательных разведений в концентрации 1, 0,5, 0,25, 0,13, 0,06, 0,03, 0,02 и 0%. Планшеты для тестирования инкубировали при 37°С, 5% С02 в течение 4 дней, после чего добавляли аламар синий (Асситеб, СЫсадо, Ш) в количестве 20 мкл/лунку. Планшеты снова инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 16 ч. Результаты показали, что сыворотка от четырех животных может нейтрализовать сигналы и от ЬиШ-22, и от НиШ-20 через 1иШ-22КА.
При 1% концентрации сыворотка от шести животных (7125, 7127, 7128, 7118, 7124 и 7117) нейтрализовала от 50 до 80% пролиферации, индуцированной ЬиШ-22, при ингибировании пролиферации, снижающемся зависимым от дозы образом при более низких концентрациях. Более того, при концентрации 1% сыворотка от четырех животных (7125, 7127, 7118 и 7117) нейтрализовала от 40 до 70% пролиферации, индуцированной ЬиШ-20, при ингибировании пролиферации, снижающемся зависимым от дозы образом при более низких концентрациях. Данные результаты дополнительно показали, что антитела против Ш-22КА действительно могут антагонистически противодействовать активности провоспалительных лигандов, Ш-20 и Ш-22, при низких концентрациях.
Данные результаты послужили дополнительным доказательством того, что эффективная блокада активности Ш-22КА посредством связывания, блокирования, ингибирования, подавления, антагонистического действия или нейтрализации активности Ш-20 или Ш-22 (раздельно или совместно), например, с
- 84 009124 помощью нейтрализующего моноклонального антитела настоящего изобретения против I^-22КΑ могла бы быть полезной для снижения действия Ш-20 и Ш-22 (раздельно или совместно) ш у1уо и может снижать индуцированное Ш-20 и/или Ш-22 воспаление, такое, какое наблюдается при действии Ш-20 на кожу, а также при действии Ш-22 на кожу, например, при псориазе, ΚΏ, колите или других воспалительных заболеваниях, индуцируемых Ш-20 и/или Ш-22, включая ΚΏ, артрит, астму, псориатический артрит, колит, воспалительные состояния кожи и атопический дерматит.
Пример 32. Фенотип мышей с нокаутом Ш-22КА.
А. Получение мышей с генетическими модификациями.
1. Получение трансгенных мышей, экспрессирующих Ш-20 мыши, с неонатальным блеском.
a) Конструкт для экспрессии Ш-20 мыши с промотора К14.
Для исследования биологической функции Ш-20 ш у1уо был создан трансгенный конструкт, в котором Ш-20 мыши управлялся промотором К14 человека (см. также пример 21). Были созданы олигонуклеотиды для получения ПЦР-фрагмента, содержащего консенсусную последовательность Кохак и область, кодирующую Ш-20 мыши. Данные олигонуклеотиды были сконструированы с наличием сайта ΕΌ на 5'-конце и сайта АкД на 3'-конце для облегчения клонирования в рК8К14, стандартный трансгенный вектор, содержащий промотор, специфичный для кератиноцитов и эпителиальных клеток человека.
Реакции ПЦР проводили с приблизительно 200 нг матрицы Ш-20 мыши (8ЕЦ ГО N0:33), и олигонуклеотиды были сконструированы для амплификации полноразмерного Ш-20 (8ЕЦ ГО N0:34). Условия ПЦР определяли с применением способов, известных в данной области техники. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в агарозном геле и очищали с помощью набора для экстракции геля 01а0шск'™ (01адеп). Выделенный фрагмент ДНК правильного размера гидролизовали с помощью ΕΌ и АкД (Воейппдег-Маппйет), осаждали этанолом и лигировали в рК8К14, предварительно гидролизованную Р^ и Акск Плазмида рК8К14, сконструированная для экспрессии интересующего гена в кератиноцитах и эпителии трансгенных мышей, содержит экспрессионную кассету с примыкающим специфичным для кератина человека промотором К14 размером приблизительно 3 т.п.н.
Приблизительно один микролитр реакционной смеси лигирования электропорировали в компетентные клетки ЭН10В Е1ес!гоМах™ (ОГОС0 ВКЬ, ОаййегкЬигд, МО) в соответствии с указаниями производителя и высевали на планшеты ЬВ, содержащие 100 мкг/мл ампициллина, и инкубировали в течение ночи. Колонии собирали и выращивали в среде ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Из собранных колоний получали миниколичество ДНК и подвергали скринингу на вставку Ш-20 мыши путем совместного рестрикционного гидролиза Р^ и АкД и последующего электрофореза в агарозном геле. Конструкты ТО с правильными вставками кДНК были подтверждены с помощью секвенирующего анализа. Было проведено получение максипрепаратов правильных рК8К14-Ш-20 мыши.
b) Получение и характеристика трансгенных мышей К14 Ш-20.
Фрагмент ШО длиной приблизительно 4 т.п.н. выделяли из трансгенного (ТО) вектора, содержащего 5'- и 3'-примыкающие последовательности специфичного для кератина промотора К14, Ш-20 мыши (8ЕЦ ГО N0:33; полипептид показан в 8ЕЦ ГО N0:34), интрон Оогтоп, кДНК Ш-20 и последовательность сигнала полиА гормона роста человека. Его использовали для микроинъекции в оплодотворенные ооциты мыши В6С3Г1 (Тасошс, Оеппап!о^п, ΚΥ). Микроинъекцию и получение трансгенных мышей производили, как описано в Нодап, В. е! а1. Машри1айпд !йе Мойке ЕтЬгуо, 2пб еб., Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, ΚΥ, 1994.
Для количественной оценки экспрессии ТО РНК применяли Тас.|Мап™ реакцию ОТ-ПЦР с применением праймеров ПЦР, специфичных для части сигнала трансгена гормона роста человека ро1уА.
Все конструкты ТО, экспрессирующие Ш-20, проявляли высокую степень паранатальной смертности, и родившиеся ТО мышата обычно проявляли блестящий фенотип. Блестящий облик новорожденных мышат, по-видимому, связан с жесткостью коки, как если бы они были осушены, что приводило к снижению подходящего выхаживания. Их движения становятся в целом неуклюжими. Гистопатологически у блестящих мышат утолщен эпидермис, а кератиновый слой сжат. Большинство данных исходных мышат погибало в первые 5 дней, а выжившие и отлученные от груди мышата обычно не экспрессировали трансген (по анализу транскрипта) или они были химерами (по слабой передаче трансгена потомству).
Была создана одна линия, экспрессирующая Ш-20 мыши под управлением промотора К14. Уровень экспрессии в коже и тимусе был низким, и все новорожденные родились с блестящим фенотипом. В целом данная линия давала 20% ТО помета, что указывает на гибель 50-60% трансгенных мышат ш и!его. (При спаривании гемизигот 50% потомства должно быть ТО.)
2. Получение мышей с нарушенной экспрессией Ш-22КА; мыши с нокаутом Ш-22КА.
а) Получение нокаутного (К0) конструкта для Ш-22КА мыши.
Для дальнейшего изучения биологической функции Ш-22КА ш у1уо была создана нокаутная (К0) линия мышей для подавления экспрессии Ш-22КА. Во-первых, для скрининга геномной библиотеки ВАС мышей линии 129/812 были применены зонды кДНК Ш-22КА мыши. Клоны, содержащие геномный локус Ш-22КА, были идентифицированы и охарактеризованы. Полинуклеотид Ш-22КА мыши показан в 8ЕЦ ГО N0:41, а полипептид - в 8ЕЦ ГО N0:42.
- 85 009124
Для создания нокаутного конструкта для выключения ΙΕ-22ΗΛ был сконструирован нокаутный вектор с применением способа ЕТ клонирования (2Ьапд е! а1. 1998. А пеп Мдю ίο г ^NА епдшееппд иктд ^есοтЬ^па!^οп т Е. той. №11. Сепе!. Υο1. 20:123-8). Вкратце, вектор К0 содержит 5'-плечо размером 1,8 т.п.н. (короткое плечо), маркер селекции IКЕЗ-^асΖ/ΜС1ηеο и 3'-плечо размером 10 т.п.н. (длинное плечо) гена Ш^КА. В векторе К0 экзоны 2, 3 и 4, а также интроны 2 и 3 геномной последовательности №22КА были заменены маркером селекции IКЕЗ-^асΖ/Μс1ηеο, в результате чего в результате гомологичной рекомбинации в клетках ЕЗ возникла делеция размером приблизительно 4,4 т.п.н.
После линеризации вектора К0 ферментом рестрикции Ртей его электропорировали в ЕЗ клетки 129/Зу.й Селекцию случаев гомологичной рекомбинации, а также идентификацию рекомбинантных клонов ЕЗ проводили, как описано в ^Ьейго^ Е. I. е! а1. Те^а!οса^с^ηοтак апб ЕтЬг^цп1с З!ет Се11к: А РгасНса1 АрргоасЬ, 2пб еб., Шй Ргекк Ытйеб, 0х£Ъгб, 1987.
Ь) Получение и анализ мышей с нарушенной экспрессией ЙЕ-22КА.
Положительные клоны ЕЗ, в которых произошла делеция экзонов 2-4 и интронов 2-3 геномного локуса 1Е-22КА, размножали. Их инъецировали в бластоцисты мышей линии С57Β1/6^. После краткого повторного размножения инъецированных бластоцистов их вводили псевдобеременным приемным матерям для получения химер. Инъекцию бластоциста, размножение химер и последующую передачу половым путем мутантного Ш^КА проводили, как описано в КοЬе^ιкοη, Е. I. е! а1. Те^а!οса^с^пοтак апб Ет0Γνοι№ З!ет Се11к: А Ргасйса1 АрргоасЬ, 2пб еб., ЖЬ Ргекк Ытйеб, 0х£Ъгб, 1987.
Мутантных К0 мышей идентифицировали с помощью стратегии генотипирования ПЦР. В множественной реакции ПЦР применяли три праймера ПЦР, ΖС22901 (ЗЕЦ ΙΌ N0:35), ΖС45039 ((ЗЕЦ ΙΌ N0:36), ΖС38573 (ЗЕЦ ΙΌ N0:37), для выявления аллеля дикого типа и мутантного аллеля. Аллель дикого типа (АТ) дает фрагмент ДНК длиной 229 п.н., тогда как мутантный аллель дает фрагмент длиной 371 п. н.
Спаривание гемизиготных мышей обеспечивает нормальное соотношение гомозиготных (НОМ), гетерозиготных (Не!) и потомков дикого типа (АТ), а также нормальное соотношение полов. Обследование мышей с помощью РЬукюЗсгееп (определение массы тела, массы тканей, полный анализ крови (СВС), клиническая химия, общее обследование и гистопатология) не выявило явных различий между НОМ, Не! и АТ животными.
B. ЙЙ-22КА был необходим для индукции ЗАА под действием йй-22: ИФА ЗАА показала отсутствие экспрессии ЗАА, индуцированной йй-22, у мышей с нокаутом ЙЙ-22КА.
Для оценки того, имеется ли необходимость в Ш^КА для индукции ЗАА у мышей, инъецированных ΙΕ-22, Ш^КА КО мышам инъецировали 5 мкг ΙΕ-22, и через 6 часов отбирали кровь.
ИФА для определения уровня ЗАА в образцах сыворотки проводили с применением набора Μοике ЗАА Iттиηοаккау (Β^οω^ ^Шта^па^ Сай&гша) в соответствии с указаниями производителя при разведении сыворотки 1:1000. У четырех из пяти мышей дикого типа уровень ЗАА был повышен в ответ на инъекцию ΙΕ-22, тогда как у четырех из пяти НОМ Ш^КА К0 мышей наблюдался базальный уровень ЗАА. У обеих тестированных групп Не! Ш^КА К0 мышей наблюдался повышенный уровень ЗАА, но ниже, чем уровень ЗАА у АТ мышей с повышенным уровнем ЗАА. Это указывает на то, что ΙΕ22КА необходим для индукции ЗАА под действием ΙΕ-22.
Данные результаты служат доказательством того, что эффективное блокирование активности ΙΕ22КА, например, с помощью нокаута гена Ш^КА или сходным образом с помощью нейтрализующего моноклонального антитела настоящего изобретения против Ш^КА могло бы сходным образом снижать индуцированное ΙΕ-22 воспаление, например, при псориазе, ΙΒΌ, колите, эндотоксемии или других воспалительных заболеваниях, индуцируемых ΙΕ-22.
C. Ш^КА был необходим для индуцированного ΙΕ-22 утолщения эпителия: Введение чистого белка ΙΕ-22 с помощью осмотического мининасоса, имплантированного подкожно, не вызывает утолщения эпидермиса у Ш^КА К0 мышей
Для оценки того, имеется ли необходимость в Ш^КА для индукции ΙΕ-22 утолщения кожи, ΙΕ-22 вводили подкожно Ш^КА НОМ и АТ КО мышам с помощью осмотических мининасосов. Насосы выделяли ΙΕ-22 со скоростью 18,4 мкл в день в течение 7 дней. Четыре НОМ и 6 АТ Ш^КА КО мышей получали белок ΙΕ-22, и 3 НОМ и 1 АТ получали ЗФР.
Образцы сыворотки от обработанных ΙΕ-22 мышей анализировали в тесте пролиферации ΒιΡ3 для подтверждения присутствия ΙΕ-22. Для пролиферации клеток ΒιΡ3, трансфицированных 1Е-22КА и СКЕ2-4, требовалось присутствие либо ΙΕ-22, либо ΙΕ-3 мыши. Данные клетки осаждали и промывали полной средой без т[Е-3 (среда КРΜI (ГКН Β^οкс^еηсе Мс., йепеха, КЗ) с добавкой 10% инактивированной нагреванием сыворотки плодов телят, 2 мМ й-д1и!аМах-1™ (6ί№ο ΒΗΕ), 1 мМ пирувата натрия (6ί№ο ΒΗΕ), и антибиотиков РЗN (СШС0 ΒΗΕ)) (далее здесь обозначаемой как «среда без 1МЙ-3»). Клетки осаждали центрифугированием и промывали 3 раза для обеспечения удаления т1Е-3. Клетки затем подсчитывали в гематоцитометре и высевали в 96-луночный планшет в количестве 5000 клеток на лунку в конечном объеме 200 мкл на лунку с применением среды без 1МЙ-3. Сыворотка мышей находилась в лунках при концентрации 1, 0,5, 0,25 и 0,125%. Планшеты для тестирования инкубировали при 37°С, 5% С02 в течение 3 дней, после чего добавляли аламар синий (Асситеб, СЬ^садο, Ш) в количестве
- 86 009124 мкл/лунку. Планшеты вновь инкубировали при 37°С, 5% С02 в течение 24 ч. Аламар синий дает флуориметрический показатель, основанный на количестве живых клеток, и, таким образом, обеспечивает прямое измерение пролиферации клеток по сравнению с отрицательным контролем. Планшеты вновь инкубировали при 37°С, 5% С02 в течение 24 ч. Планшеты считывали на Vа11ас У1с!ог 2 1420 Ми1!11аЬе1 Соип!ег (Vа11ас, Тигки, Финляндия) при длинах волн 530 (возбуждение) и 590 (испускание). Результаты показали отсутствие активности Ш-22 у животных, инъецированных ЗФР, тогда как у 1 из 1 животных Не!, 2 из 4 животных НОМ и 3 из 6 животных ν-Т выявлялась определимая активность Ш-22. Пролиферация, индуцированная данной сывороткой, блокировалась в присутствии 1 мкг/мл П ,-22ВР, что указывало на то, что она была специфична для Ш-22.
Образцы кожи от обработанных и необработанных ΙΡ-22 I^-22ВЛ НОМ и Не! нокаутных (К0) и νΓ контрольных мышей фиксировали погружением в 10% забуференный формалин. Ткани обрезали и заключали в парафин, обрабатывали обычным способом, получали срезы толщиной 5 мкм (1нпд 2065 8ирегси! ш^с^ο!οте, Ьеюа М1сгокук!етк, Vе!ζ1а^, Германия) и окрашивали Н&Е. Окрашенные ткани оценивались с помощью светового микроскопа (ХИеоп Есйрке Е600, №коп Шс., МеМ11е, NΥ) сертифицированным советом АСУР ветеринарным патологом.
Каждый образец кожи оценивали по тяжести воспаления в ткани, примыкающей к месту имплантации насоса в гиподермисе по шкале от 0 (отсутствие) до 4 (тяжелое), по степени утолщения эпидермиса (акантоза) по шкале от 0 (отсутствие) до 3 (диффузное) и по количеству эпителиальных слоев, подсчитанных в наиболее утолщенной части эпидермиса. Не было обнаружено разницы между мышами НОМ и мышами νΊζ получавшими ЗФР. Результаты данных двух групп были объединены в группу ЗФР. Среднее и стандартное отклонение определяли для каждой группы обработки и представлены в табл. 14 ниже.
Таблица 14
Обработка Контроль ЗФР НОМ КО: Ш-22 ЧТ: Ш-22
Количество мышей 4 4 6
Толщина эпителия 3,5+1,0 3,2±0,5 5,9±2,3
Степень акантоза 0,5±1,0 0,2±0,5 1,9±1,3
Воспаление 1,5±1,0 1,2±1,0 2,0±1,0
Результаты показали тенденцию к повышению толщины эпителия и акантоза у νΐ' мышей, обработанных ΙΡ-22, и меньшие толщину эпителия и акантоз у П ,-22ША НОМ мышей после экспозиции с Ш-22.
Данные результаты служат доказательством того, что эффективное блокирование активности П,22ВЛ, например, с помощью нокаута гена I^-22ВЛ или сходным образом с помощью нейтрализующего моноклонального антитела настоящего изобретения против П ,-22ША могло бы сходным образом снижать индуцированное Ш-22 действие на кожу, например, при псориазе, ПИ), колите или других воспалительных заболеваниях, индуцируемых Ш-22.
Ό. Ш-22ΚЛ был необходим для индуцированного Ш-20 блеска кожи новорожденных мышат: скрещивание трансгенных мышей, экспрессирующих Ш-20 мыши, с Ш-22ША К0 мышами дает трансгенных мышат, которые не блестят.
Для оценки того, был ли Ш-22ΚЛ необходим для индуцированного Ш-20 блеска кожи у новорожденных ТО мышат, трансген К14 тиШ-20 скрещивали с линией Ш-22ΚЛ К0, и новорожденных обследовали на блестящий фенотип.
Родилось шестьдесят девять мышат с менделевским расщеплением генотипа. Все ТО на фоне Не! КО были блестящими, тогда как ни один из не-ТО и ТО на фоне НОМ КО не был блестящим.
Для оценки присутствия Ш-20 в сыворотке мышей проводили тест пролиферации с аламаром синим с применением клеток ВаР3, экспрессирующих Ш-20ΚЛ и Ш-20КВ. Данные клетки обычно пролиферируют в ответ на либо Ш-20, либо Ш3 мыши. Процедура была такой же, что и описанная в разделе С выше. Результаты теста показали, что у всех мышей ТО имелась сопоставимая активность Ш-20 и на том же уровне, что Ш-20 ТО на фоне С57В16Х. Отсутствие какого-либо блестящего неонатального фенотипа указывает на то, что блестящий неонатальный фенотип зависел от наличия Ш-22ΚЛ. Тест пролиферации показал, что у всех ТО мышей была сопоставимая активность Ш-20, соответствующая уровню у Ш-20 ТО на фоне 625731,2^. Отсутствие какого-либо блестящего неонатального фенотипа указывает на то, что блестящий неонатальный фенотип зависел от наличия Ш-22ША.
На третий день после рождения мышат из пометов, содержащих К14 тиШ-20 ТО на фоне Ш-22ΚЛ К0, гуманно умерщвляли, и все тело фиксировали погружением в 10% забуференный формалин. Фиксированные ткани разрезали на поперечные срезы грудной клетки и брюшного отдела, заключали в парафин, обрабатывали обычным способом, получали срезы толщиной 5 мкм (1нпд 2065 8ирегси! т1сго!оте, Ьеюа М1сгокук!етк, Vе!ζ1а^, Германия) и окрашивали Н&Е. Окрашенные ткани оценивались с помощью
- 87 009124 светового микроскопа (№коп Εс1^рке Ε600, №коп Шс., Ме1у111е, ΝΥ) слепым способом сертифицированным советом АСУР ветеринарным патологом. Отмечались аномалии тканей и подсчитывалось количество эпителиальных слоев в эпидермисе спинной передней части грудной клетки.
Ткани от трех Ш-20 ТС на фоне НОМ Ш-22КА КО (Ш-20 ТС/Ш-22КА КО НОМ) и трех не-ТС на фоне Ш-22КА НОМ КО (не-ТС/Ш-22КА КО НОМ) мышей были исследованы микроскопические и было обнаружено, что они не содержат аномалий. Также исследовали ткани от двух Ш-20 ТС на фоне Не! Ш22КА КО (Ш-20 ТС/Ш-22КА КО Не!) мышей. Количество эпителиальных слоев в эпидермисе было сходным у всех животных. Однако эпидермис двух Ш-20 ТС/Ш-22КА КО Не! мышей был гиперэозинофильным по сравнению с другими животными и проявлял утрату зернистости в зернистом слое. Не было обнаружено других аномалий в коже или других тканях каких-либо мышей.
Данные результаты служат доказательством того, что эффективное блокирование активности Ш22КА, например, с помощью нокаута гена Ш-22КА или сходным образом с помощью нейтрализующего моноклонального антитела настоящего изобретения против Ш-22КА могло бы сходным образом снижать индуцированное Ш-20 действие на кожу, а также индуцированное Ш-22 действие на кожу, например, при псориазе, ПИ), колите, и/или других воспалительных заболеваниях, индуцируемых Ш-20 и или Ш-22, включая ПИ), артрит, астму, псориатический артрит, колит, воспалительные состояния кожи и атопический дерматит.
Пример 33. Гистоморфометрический анализ изображения мышей с нокаутом Ш-22КА.
Была создана линия к14 Ш-20 трансгенных (ТС) мышей, и новорожденные ТС проявляли блестящий фенотип. Трансген экспрессировался под промотором к14, который направляет экспрессию в образующие кератин клетки кожи. Была также создана линия Ш-22КА нокаутных (КО) мышей, и у мышей в отсутствие провоцирующих воздействий не наблюдалось существенных отклонений. Две линии скрещивали друг с другом с получением новорожденных со следующими четырьмя разными генотипами: (1) ТС/-НОМ: экспрессирующими трансген к14 Ш-20 т на фоне без экспрессии Ш-22КА; (2) ТС/-Не!: экспрессирующими трансген к14 Ш-20 т на фоне некоторой экспрессии Ш-22КА с одной копии гена Ш22КА; (3) АТ/НОМ: неэкспрессирующими трансген к14 Ш-20 т на фоне без экспрессии Ш-22КА; и (4) АТ/Не!: неэкспрессирующими трансген к14 Ш-20 т на фоне некоторой экспрессии Ш-22КА с одной копии гена Ш-22КА. Тридцать четыре новорожденных мышат с данными различными генотипами забивали на 3 день, приблизительно через 48 ч после рождения (табл. 15):
Таблица 15
ТС/-НОМ* (Группа 1) ТС/-Ней* (Группа 2) МТ/НОМ* (Группа 3) МТ/НеЕ* (Группа 4)
Всего п=10 п=10 п=9 N=5
ТС=трансгенные; АТ=дикого типа; НОМ=гомозиготные;
Не!=гетерозиготные и п=количество мышат.
Тело каждого мышонка разрезали поперек на три части (переднюю часть грудной клетки, заднюю часть грудной клетки и брюшной отдел, а голову отбрасывали. Образцы тканей толщиной 4,0-5,0 мм фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, обрабатывали в парафиновых блоках и окрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е) для обычного гистологического обследования и гистоморфометрического анализа изображения. Для гистоморфометрического анализа изображения был выбран эпидермис спинной области спины каждого образца ткани с применением микроскопа О1утрик ВН-2, видеокамеры (Эа^е-МИ, М1сБ1дап Сйу, ΙΝ) и программы ВюОиап! Тгие Со1ог \\тс1о\\к 98 (К&М Вюте!пск, Шс. ШкБуШе, ΤN 37209) при следующих установках: параметр: увеличение, 10Х, Ζ отключен с установкой 0; настройка: длина (рм); измерение: ручное и дополнительный режим. Толщину (рм) эпидермиса и рогового слоя или ороговевшего слоя каждого образца кожи индивидуально измеряли 10 раз при приблизительно 0,1 мм интервале между каждым измерением в каждом 10х микроскопическом поле, и с помощью расчета Εсxе1 получали среднюю величину, ст. от. и ст.ош.ср. Все срезы рандомизировали и измеряли слепым способом. После измерения срезы раскрывали, и результаты выстраивали в соответствии с группой обработки. Конечные результаты по группам обработки классифицировали следующим образом: 1. Средняя толщина эпидермиса (рм) в передней части грудной клетки, задней части грудной клетки и брюшного отдела с последующей подклассификацией в виде (а) средней толщины эпидермиса в передней части грудной клетки; (Б) средней толщины эпидермиса в задней части грудной клетки; и (с) средней толщины эпидермиса в брюшном отделе. 2. Средняя толщина рогового слоя (рм) в передней части грудной клетки, задней части грудной клетки и брюшного отдела с подклассификацией в виде (а) средней толщины рогового слоя в передней части грудной клетки; (Б) средней толщины рогового слоя в задней части грудной клетки; и (с) средней толщины рогового слоя в брюшном отделе. 3. Средняя толщина эпидермиса плюс рогового слоя в передней части грудной клетки, задней части грудной клетки и брюшном отделе. Полученные данные анализировали с помощью программы СгарБРаб Тп81а! (СгарБРаб 8о£!Ааге, Шс., 8ап О1едо, СА. 92121). Для определения статистической значимости различий между средними величинами группы 1 и группы 4 применяли односторонний дисперсионный анализ (ΑNОУΑ). Для
- 88 009124 определения статистической значимости различий между средними величинами двух групп применяли тест множественных сравнений Таки-Крамера (*Р<0,05; **Р<0,01; ***Р<0,001; ****Р<0,0001). Наблюдения с Р<0,05 рассматривали как значимые.
(1) Результаты гистоморфометрии.
(а) Средняя толщина эпидермиса (мкм) в передней части грудной клетки, задней части грудной клетки и брюшном отделе.
Толщина эпидермиса была значительно увеличена у П.-ЗС) трансгенных мышат, лишенных одной копии гена ТЬ-22ВА (ΊΌ/-Η^), по сравнению с ΙΕ-20 трансгенными мышатами, неэкспрессирующими ГЬ22ВА (ТС/-ΗОΜ, Р=0,001***) и по сравнению с контрольными однопометными животными (ШТЛ0М, Р=0,001*** и νΊΤΗ^, Р=0,001***), соответственно (табл. 16). ТС/Ле! мышата проявляли увеличенную толщину некератинизированного эпидермиса, возможно, из-за гипертрофии кератиноцитов. Данное увеличение может включать все три некератинизированных слоя (базальный, шиповидный и зернистый), но чаще всего страдает слой шиповидных клеток. Толщина эпидермиса ΊС/-Ηе! мышат была увеличена на 25%, и шиповидный слой становился преобладающим. В то же время эпидермис ΊС/-ΗОΜ мышат был слегка толще по сравнению с контролями (ШТЛ0М и ШТЛе1), и статистический анализ показал отсутствие значимого различия между группами (Р>0,05). Сравнивали также толщину эпидермиса в передней части грудной клетки, задней части грудной клетки и брюшном отделе. Обычно тонкий эпидермис брюшного отдела толще, чем в задней части грудной клетки, а в задней части грудной клетки толще, чем в передней части грудной клетки (табл. 16).
Таблица 16
ТС/-НОМ ТО/-НеС ΝΤ/ΗΟΜ ΝΤ/НеС
(N=28) (N=30) (N=27) (N=15)
Среднее 32,58±1,25 41,05±2,04 31,31±1,08 30,83±1,43
Результаты представляют собой средние величины ± ст.ош.ср.
N=количество измеренных срезов.
Увеличение толщины чешуйчатого эпителия кожи в передней части грудной клетки ΊС/-Ηе! мышат сопровождается гипертрофией клеток эпидермиса (кератиноцитов); однако статистически значимых различий по сравнению с другими группами, ТС/Л0М, ШТЛ0М и ШТЛе! не было (Р=0,1565, табл. 17). По-видимому, это является результатом либо гистологического артефакта, либо того, что не было выраженного действия в тонкой коже передней части грудной клетки. Следует отметить: гистологическую процедуру или получение срезов передней части грудной клетки можно было бы признать непригодными для гистоморфометрического анализа для получения статистически значимых результатов.
Таблица17
ТО/-НОМ (N=10) ТО/-НеС (N=10) ΝΤ/ΗΟΜ (N=9) МТ/НеС (N=5)
Среднее 29,18+2,24 33,20±2,24 27,28+0,62 29,38±1,77
Результаты представляют собой средние величины ± ст.ош.ср. N количество измеренных срезов.
ГЬ-20 (ТС/-) с одной копией гена ТЬ-22ВА Ле1) показали повышенную среднюю величину толщины эпидермиса по сравнению с ТС/Л0М (Р<0,05*), ШТЛ0М (Р<0,001***) и ШТЛе! (Р<0,01*), соответственно (табл. 18). Статистический анализ показал очень высокую значимость различий между группами (Р<0,0001****). Эпидермис ТС/Ле! был увеличен приблизительно на 29% по сравнению с ШТЛеТ Фенотип мышат ΙΕ-20 (ТС/-) с отсутствием ТЬ-22ВА (НОМ) частично напоминал таковой мышат, лишенных одной копии гена ТЬ-22ВА ^е!), ассоциированный с утолщением эпидермиса по сравнению с контрольными животными того же помета (ШТЛ0М и ШТ/ΗГе!), однако статистических различий по сравнению с контролями обнаружено не было (Р>0,05). Эпидермис ТС/Л0М был увеличен приблизительно на 14% по сравнению с таковым ШТЛ0М. В отличие от мышат ΙΕ-20 ТС/-, мышата с недостаточностью рецептора ТЬ-22ВАш (ШТЛ0М и ШТ/ГГе!) показали относительно меньшую толщину эпидермиса. Примечательно, что результат гистоморфометрии толщины эпидермиса в задней части грудной клетки постоянно коррелировал со средней толщиной эпидермиса в передней части грудной клетки, задней части грудной клетки и брюшном отделе (табл. 15), что указывало на то, что гистологическая процедура и получение срезов задней части грудной клетки обеспечивали наилучшее качество для гистоморфометрического анализа изображения.
Таблица 18
ТО/-НОМ (N=10) ТО/-НеС (N=10) ΝΤ/ΗΟΜ (N=9) ЮТ/НеС (N=5)
Среднее 35,91±1,37 43,79+2,35 30,83±1,86 30,94±2,83
Результаты представляют собой средние величины ± ст.ош.ср. N=количество измеренных срезов.
- 89 009124
Результаты средней толщины эпидермиса брюшного отдела (табл. 19) были сходны с таковыми для задней части грудной клетки (табл. 18) за исключением того, что ТС/-НОМ не отличались от контрольных животных того же помета (АТ/НОМ и АТ/Не!, Р>0,05). Были некоторые различия между срезами ткани, а также два среза были утрачены, т.е. не содержали эпидермиса, покрывающего область спины в группе ТС/-НОМ.
Таблица 19
ТС/-НОМ (N=8) ТС/-НеС (N=10) МТ/НОМ (N=9) МТ/НеС (N=5)
Среднее 32,35±1,44 46,33+3,10 35,81±1,90 32,16+2,97
Результаты представляют собой средние величины ± ст.ош.ср.
N=количество измеренных срезов.
(Ь) Средняя толщина (мкм) рогового слоя в передней части грудной клетки, задней части грудной клетки и брюшном отделе.
Несмотря на увеличенную толщину эпидермиса у ГР-20 трансгенных мышат (ТС/-) на фоне, либо не экспрессирующем I^-22КΛ (НОМ), либо экспрессирующем одну копию гена (Не!), преобладающее снижение толщины рогового слоя или ороговевшего слоя наблюдалось в коже ТС/-НОМ и ТС/-Не! по сравнению с контрольными животными того же помета (АТ/НОМ и АТ/Не!), и статистический анализ показал чрезвычайно высокую значимость различий между группами (Р<0,0001****, табл. 20). У мышат ТС/Не! показано снижение количества кератина на поверхности эпидермиса приблизительно на 36, 50 и 49% по сравнению с ТС/-НОМ (Р<0,01**), АТ/НОМ (Р<0,001***) и АТ/Не! (Р<0,001***) , соответственно. У мышат ТС/-НОМ показано приблизительно на 22% значимое снижение толщины рогового слоя по сравнению с их контролем (АТ/НОМ, Р<0,05*) и лишь 17% снижение по сравнению с АТ/Не!, которое оказалось статистически недостоверным (Р>0,05). Толщина рогового слоя у контрольных мышат, АТ/НОМ и АТ/Не!, была приблизительно одинаковой. По-видимому, роговой слой в задней части грудной клетки толще такового в брюшном отделе и толще такового в передней части грудной клетки.
Таблица 20
ТС/-НОМ (N=8) ТС/-НеС (N=10) МТ/НОМ (N=9) МТ/НеС (N=5)
Среднее 33,26±2,69 21,41±1,27 42,54±2,01 40,31±3,82
Результаты представляют собой средние величины ± ст.ош.ср. Ν количество измеренных срезов.
Средняя толщина рогового слоя в передней части грудной клетки (табл. 21) напоминает таковую в передней части грудной клетки, в задней части грудной клетки и брюшном отделе (табл. 20), но значительное снижение рогового слоя было обнаружено лишь у ТС/-Не! по сравнению с ТС/-НОМ (Р<0,05*) и по сравнению с АТ/НОМ (Р<0,01**), соответственно. Стандартное отклонение и стандартная ошибка среднего были высокими, что могло быть связано с плохими срезами, утратой образцов кожи, природой строения эпидермиса или отсутствием существенного влияния в передней части грудной клетки. Следует отметить: гистологическую процедуру или получение срезов передней части грудной клетки можно было бы признать непригодными для гистоморфометрического анализа для получения качественных результатов.
Таблица 21
ТС/-НОМ (N=28) ТС/-НеС (N=30) МТ/НОМ (N=26) МТ/НеС (N=14)
Среднее 34,96+3,53 18,14+3,99 40,47+4,38 32,96+8,11
Результаты представляют собой средние величины ± ст.ош.ср.
N=количество измеренных срезов.
Данные о средней толщине рогового слоя в задней части грудной клетки (табл. 22) сходны с таковыми для передней части грудной клетки, задней части грудной клетки и брюшного отдела за тремя исключениями: (1) Не обнаружено статистически значимых различий между ТС/-НОМ и ТС/-Не! и между ТС/-НОМ и АТ/-НОМ (Р>0,05); (2) Между ТС/-НОМ и АТ/Не! выявлено значимое различие (Р<0,01**); (3) Роговой слой у АТ/Не! был значительно утолщен, что могло бы быть следствием артефакта обработки ткани, например, набухания или расширения кератина при его помещении в гипотонический раствор или оставления в водяной бане в течение слишком длительного времени.
Таблица 22
ТС/-НОМ (N=10) ТО/-НеС (N=10) МТ/НОМ (N=8) МТ/НеС (N=4)
Среднее 35,64+3,4 24,22+1,54 44,35±3,51 53,77+7,21
- 90 009124
Результаты представляют собой средние величины ± ст.ош.ср. N=количество измеренных срезов.
Статистические различия были обнаружены лишь между ТО/-Н0М и ^Т/Н0М и между ТО/-Не! и \\Ί '.Ι ЮМк Р<0,05* и Р<0,001***, соответственно (табл. 23). У мышат ТО/- наблюдалось снижение толщины рогового слоя в брюшном отделе по сравнению с их контрольными животными того же помета (№Т/Н0М и №Т/Не!).
Таблица 23
ТС/-НОМ (N=8) ТС/-Нее (N=10) МТ/НОМ (N=9) мт/нее (N==4)
Среднее 28,84+4,36 21,86±1,30 42,45±3,15 33,25±3,96
Результаты представляют собой средние величины ± ст.ош.ср. N=количество измеренных срезов.
(с) Средняя толщина (мкм) эпидермиса плюс рогового слоя в передней части грудной клетки, задней части грудной клетки и брюшном отделе.
У мышат ТО/-Не! выявлено значительное увеличение толщины эпидермиса и значительное снижение толщины рогового слоя по сравнению с контрольными животными того же помета (^Т/Н0М и ^Т/Не!), а мышата ТО/-Н0М дали сходный результат, но с минимальным эффектом (табл. 24).
Таблица 24
ТС/-НОМ (N=10) ТС/-нее (N=10) МТ/НОМ (N=9) мт/нее (N=4)
Роговой 32,58 41,05 31,31 3 0,83
слой Эпидермис 33,26 21,41 42,54 40,31
Результаты представляют собой средние величины. N=количество мышат.
(б) Сигнализация ГС-20 через и ГЬ-20КА, и ГЬ-22КА. Эпидермис представляет собой постоянно обновляемый эпителий, зависимый от баланса между пролиферацией, дифференцировкой и гибелью клеток для гомеостаза. В нормальном эпидермисе митотически активный базальный слой дает начало терминально дифференцированным кератиноцитам, которые мигрируют наружу и в конечном итоге ссыпаются с поверхности кожи в виде безъядерных чешуек, кератина или ороговевшего слоя, локализованного в роговом слое. Хотя в поддержании гомеостаза эпидермиса участвуют, как известно, многие белки, координация данных событий на уровне молекул малопонятна. ГЬ-20 является новым взаимодействующим с рецептором белком, и его сигналы через рецепторы либо ГЬ-20КА, либо ГЬ-22КА (ГЬ-22КА), экспрессируемые в слое кожи, связаны с пролиферацией кератиноцитов. Новорожденные трансгенные ГЬ-20 мышата проявляют фенотип аномально утолщенной и блестящей кожи. Недостаточность ГЬ-22КАт (НОМ) у мышей выявила отсутствие ответа на обработку ГЬ-22, тогда как мыши дикого типа с геном ГЬ-22КА, обработанные ГЬ-22, показали значительное увеличение толщины эпидермиса (Р<0,001***, см. результаты гистоморфометрического анализа изображений у ГЬ-22КАт К0/ГЬ-22, РГО 59.2). Для исследования того, оказывало ли отсутствие ГЬ-22КА влияние на блестящий фенотип, наблюдаемый у новорожденных К14 ГЬ-20т ТО, трансгенных мышей, эктопически экспрессирующих ГЬ-20, скрещивали с мышами с гомозиготной (НОМ) или гетерозиготной (Не!) недостаточностью ГЬ-22КА. Количественный анализ изображений толщины эпидермиса был проведен ранее в задней части грудной клетки нескольких мышат данного исследования (т.е. 19 мышат, 1 срез на мышонка, всего 19 срезов), но не было получено статистически значимого результата из-за ограниченного количества исследованных животных и дисперсии внутри групп. Целью настоящего исследования явилась гистоморфометрическая количественная оценка большего количества образцов кожи в передней части грудной клетки, задней части грудной клетки и брюшном отделе от каждого мышонка из того же исследования (т.е. 34 мышонка, 3 среза на мышонка, всего 102 среза) для изучения биологии ГЬ-20 и получения надежных количественных результатов. Для эффективного анализа изображения авторы обеспечили то, чтобы ориентация кожи в парафиновом блоке была одинаковой и образцы кожи измерялись от одних и тех же соответствующих участков у всех отдельных мышат и в группах. Производили два типа измерений: (1) толщину эпидермиса мерили 10 раз на 10х поле микроскопа в каждом образце кожи, каждый с верхней стороны от позвоночника, для исследования роли ГЬ-20 в опосредовании пролиферации и дифференцировки кератиноцитов; (2) толщину ороговевшего слоя или рогового слоя измеряли таким же образом для установления связи с обликом блестящей кожи у новорожденных ГЬ-20 ТО.
Гистоморфометрический анализ изображения толщины эпидермиса показал, что новорожденные ТО/-Не!, экспрессирующие трансген к14 ГЬ-20т на фоне некоторой экспрессии ГЬ-22КА с одной копии гена ГЬ-22КА, обнаруживают утолщенный эпидермис, а новорожденные ТО/-Н0М, экспрессирующие трансген к14 ГЬ-20т на фоне отсутствия экспрессии ГЬ-22КА, не имеют существенного изменения. Толщина эпидермиса значительно возрастала у ГЬ-20 трансгенных мышат, лишенных одной копии гена ГЬ
- 91 009124
22КА (ТО/-Не!) по сравнению с Ш-20 трансгенными мышатами, лишенными обеих копий генов Ш-22КА (ТО/-Н0М, Р=0,001***) и по сравнению с контрольными животными того же помета (УТ/Н0М, Р=0,001*** и УТ/Не!, Р=0,001***). Мышата ТО/-Не! проявляли увеличенную толщину некератинизированного эпидермиса главным образом благодаря гипертрофии кератиноцитов в шиловидном слое. Толщина эпидермиса мышат ТО/-Не! увеличивалась приблизительно на 25%, в то время как эпидермис мышат ТО/-Н0М был лишь слегка толще, с увеличением на 4-5%, по сравнению с контролями (УТ/Н0М и УТ/Не!), и статистический анализ показал отсутствие значимого различия между ТО/-Н0М и его контролем УТ/Н0М (Р>0,05).
Результаты гистоморфометрии рогового слоя показали, что, несмотря на утолщение эпидермиса у новорожденных ТО/-Не!, в коже ТО/-Н0М и ТО/-Не! наблюдается преимущественное снижение толщины кератинового или ороговевшего слоя по сравнению с контрольными животными того же помета (УТ/Н0М и УТ/Не!), и статистический анализ показал очень высокую значимость различия между группами (Р<0,0001****). Мышата ТО/-Не! показали снижение количества кератина на поверхности эпидермиса приблизительно на 36, 50 и 49% по сравнению с ТО/-Н0М (Р<0,01**), УТ/Н0М Р<0,001***) и УТ/Не! Р<0,001***), соответственно. Мышата ТО/-Н0М показали приблизительно 22% значимое снижение толщины рогового слоя по сравнению со своим контролем (УТ/Н0М Р<0,05*) и лишь 17% снижение по сравнению с УТ/Не! (Р>0,05). Толщина рогового слоя у контрольных мышат, УТ/Н0М и УТ/Не!, была приблизительно одинаковой. Снижение средней толщины рогового слоя у новорожденных ТО/-Н0М и ТО/-Не!, по-видимому, соответствует всем имеющимся данным, согласно которым при высоком уровне новорожденные Ш-20 (ТО)/Ш-22КА (Не!), видимо, имеют сниженный блеск (например, с меньшим количеством кератина), названный сиянием, в то время как новорожденные Ш-20 (ТО)/Ш22КА (НОМ) не блестят (например, с большим количеством кератина). Гистологически кератин в роговом слое мышат ТО/-, по-видимому, был более компактен, чем у мышат УТ. Взятые вместе утолщенный эпидермис, связанный с гипертрофированными кератиноцитами, и тонкий роговой слой у Ш-20 трансгенных новорожденных могли бы объяснить, почему они проявляют фенотип блестящей кожи.
Повышенная гипертрофия и нарушенная терминальная дифференцировка кератиноцитов наблюдались у Ш-20 трансгенных новорожденных с направленным нокаутом одной копии гена Ш-22КА (Не!). Кожа проявляла гипертрофию кератиноцитов, но не полную дифференцировку, утрату кератина или рогового слоя. Ш-20 трансгенные новорожденные с разрушением двух копий генов Ш-22КА (НОМ) проявляли фенотип, напоминающий кожу ТО/-Не!, но показали меньший или минимальный эффект (фиг.1215). По-видимому, отсутствие Ш-22КА (НОМ) оказывает частичное влияние на блестящий фенотип, наблюдаемый у новорожденных К14 Ш-20т ТО, и отсутствие Ш-22КА (Не!) не влияет или оказывает минимальное действие на блестящий фенотип. Другими словами, сигнализация Ш-20, нового, взаимодействующего с рецептором белка, который сигнализирует либо через Ш-20КА, либо через Ш-22КА рецептор (I^-22КΑ). возможно, не блокируется недостаточной экспрессией одной копии гена Ш-22КА (Не!), но частично блокируется недостаточной экспрессией двух копий гена Ш-22КА (НОМ).
Данные результаты служат доказательством того, что эффективное блокирование активности Ш22КА, например, посредством нокаута гена Ш-22КА или сходным образом посредством нейтрализующего моноклонального антитела настоящего изобретения против I^-22КΑ. могло бы сходным образом снижать индуцированные Ш-20 эффекты в коже, а также индуцированные Ш-20 эффекты в коже, например, при псориазе, ΈθΌ, колите или других воспалительных заболеваниях, вызванных Ш-20 и/или Ш-22.
Пример 34. Действие Ш-22 у мышей с нокаутом Ш-22КА.
Тридцать шесть мышей, включая 23 Ш-22КА К0 (НОМ) и 13 контролей (УТ), обрабатывали либо Ш-22, либо ЗФР, вводимых подкожно с помощью имплантированного мининасоса с трубкой или только мининасоса (табл. 25):
Таблица 25
НОМ/ЗФР (Группа 1) НОМ/1Б-22 (Группа 2) ИТ/ЗФР (Группа 3) ДОТ/ГЬ-22 (Группа 4)
Самцы п=3 П=10 п=3 п=8
Самки п=0 п=10 п=0 п=2
Всего п=3 п=20 п=3 П=10
Образец кожи, 1,5-2,5 см длиной и 4,0-5,0 мм толщиной, из места расположения насоса каждого животного получали для обычного гистологического обследования и гистоморфометрического анализа изображения. Все образцы ткани фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, обрабатывали в парафиновых блоках. Шесть сегментных срезов толщиной 5 мкм с промежутком 10 мкм между соседними срезами с эпителием, покрывающим всю поверхность, из каждого образца кожи от животного окрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е). Гистоморфометрический анализ изображения образцов кожи проводили с применением ми<роскопа 01утрик ВН-2, видеокамеры (Ладе-МТ!, МкЫдаи С1!у, Ш) и программы ВюРиаи! Тгие Со1ог \\'1пс1о\\'к 98 (К&М Вюте!пс8, Шс. ^кИуШе, ТN 37209) при следующих
- 92 009124 установках: параметр: увеличение, 10х, Ζ отключен с установкой 0; настройка: длина (мкм); измерение: ручное и дополнительный режим. Толщину (мкм) эпидермиса измеряли 5 раз в каждом 10х поле микроскопа из в общей сложности 4 полей, отобранных из центральных 0,4 см каждого среза кожи (например, одно 10х поле микроскопа=0,1 см, а четыре 10х поля микроскопа=0,4 см). Всего измеряли 6 срезов от каждого животного, и с помощью расчета Есхе1 получали среднюю величину, ст.от. и ст.ош.ср. Все срезы рандомизировали и измеряли слепым способом. После измерения срезы раскрывали, и результаты выстраивали в соответствии с группой обработки. Конечные результаты по группам обработки классифицировали следующим образом: 1. Толщина эпидермиса от НОМ и УТ самцов и самок мышей. 2. Толщина эпидермиса от НОМ и УТ самцов мышей. Полученные данные анализировали с помощью программы ОгарНРаб (СгарНРаб Зойуаге, Ыс., 8ап Охедо, СА. 92121). Для определения статистической значимости различий между средними величинами группы 1 и группы 4 применяли односторонний дисперсионный анализ (ΑNОУΑ). Для определения статистической значимости различий между средними величинами двух групп применяли тест множественных сравнений Таки-Крамера и непарный Т-тест. Наблюдения с Р<0,05 рассматривали как значимые.
ΙΙΙ. Результаты гистоморфометрии.
(1) Толщина эпидермиса (мкм) от НОМ и УТ самцов и самок мышей.
Толщина эпидермиса значительно увеличивалась в коже УТ мышей, обработанных ГЬ-22 (УТ/ГЬ22) по сравнению с УТ/ЗФР контролями (Р=0,0001). Кожа мышей I^-22КΑт КО, обработанных ΙΤ-22 (НОМЛТ-22) показала повышенную среднюю величину толщины эпидермиса по сравнению с контролями НОМ/ЗФР, однако статистический анализ не выявил значимого различия между двумя группами (Р>0,05). Преимущественное снижение толщины эпидермиса наблюдалось у мышей I^-22КΑ КО по сравнению с мышами УТ (например, 11ОМ1. ΙΙ.-22 против УТЛТ-22: Р<0,001) (табл. 26).
Таблица 26
НОМ/ЗФР (N=3) НОМ/1Ь-22 (N=19) ΝΤ/3ΦΡ (N=3) ΝΤ/ΙΏ-22 (N=10)
Среднее 14,15±0,19 19,01+1,03 23,34+5,49 43,08±1,85
Результаты представляют собой средние величины ± ст.ош.ср. N=количество животных.
(2) Толщина эпидермиса (мкм) от НОМ и УТ самцов мышей.
Толщина эпидермиса в коже УТ самцов мышей, обработанных ΙΤ-22 (УТЛТ-22) увеличивалась приблизительно в 2 раза по сравнению с контрольными самцами УТ/ЗФР (Р=0,0001), однако эпидермис самцов мышей I^-22КΑт КО, обработанных ΙΤ-22 (НОМ.. ΙΓ-22), показал лишь слабое увеличение по сравнению с контрольными самцами НОМ/ЗФР (Р>0,05). Следует отметить, что мыши I^-22КΑт КО проявляли значительное снижение толщины эпидермиса при сравнении с их контролем, самцами мышей УТ (например, НОМ/ЗФР против УТ/ЗФР: Р<0,05; 11ОМ.. ΙΙ.-22 против УТЛЬ-22: Р<0,001) (табл. 27).
Таблица 27
НОМ/ЗФР (N=3) НОМ/1Б-22 (N=9) ΝΤ/3ΦΡ (N=3) МТ/1Ь-22 (N=8)
Среднее 14,15+0,19 15,86±0,75 23,34±5,49 41,41+1,71
Результаты представляют собой средние величины ± ст.ош.ср.
(3) Толщина эпидермиса (мкм) от НОМ и УТ мышей, самцов по сравнению с самками.
Было обнаружено, что эпидермис самок мышей толще такового самцов мышей (например, НОМ/ΙΤ22/самцы против НОМЛТ-22/самок: Р<0,01; УТ/I^-22/самцы против УТЛТ-22/самок: Р<0,05) (табл. 28).
Таблица 28
НОМ/1Ь-22 (самцы, N=9) ΗΟΜ/ΙΣ-22 (самки, N=10) ΝΤ/ΙΣ-22 (самцы, N=8) ИТ/1Б-22 (самки, N=2)
Среднее 15,86 + 0,75 21,85±1,3 41,41+1,71 49,75±4,82
Результаты представляют собой средние величины ± ст.ош.ср.
(4) Толщина эпидермиса (мкм) от мышей НОМ, насос ΙΤ-22 по сравнению с насосом с трубкой.
Эпидермис от мышей I^-22КΑт КО (НОМ) с насосом ΙΤ-22 и трубкой был значительно толще такового мышей I^-22КΑт КО (НОМ) с одним насосом (Р<0,0001, по непарному Т-тесту) (табл. 29).
- 93 009124
Таблица 29
НОМ те/1Ь-22 насос (М=8 и Г=2, N=10) НОМ ю/1Ь-22 насос с трубкой (М=2 и Е=8, N=10)
Среднее 15,85+0,65 23,30+1,36
Результаты представляют собой средние величины ± ст.ош.ср. М: самцы; Ε: самки; N общее количество животных.
ТУ. Обсуждение.
В целом целью данного исследования является характеристика эпидермальных эффектов в обработанной ΙΕ-22 коже от мышей ΙΙ ,-22КАт К0 и №Т и соотнесение этих данных с клиническими показаниями. Для определения толщины эпидермиса в окрашенных Н&Е срезах кожи был произведен количественный анализ изображений. Образцы кожи от каждого животного были измерены гистоморфометрически 120 раз (т.е. 20 раз/каждый срез х 6 сегментных срезов от каждой мыши=120 измерений), и с помощью расчетов в Ехсе1 получали среднюю толщину эпидермиса. Гистоморфометрическое исследование показало, что ΙΕ-22 вызывает значительное увеличение толщины эпидермиса, особенно у мышей №Т в присутствии рецептора Ш^КА (Р<0,0001 по ΑN0УΑ, что рассматривается как очень значимое), и показало минимальное действие или его отсутствие на мышей Ш^КАт К0 (НОМ) с отсутствующим рецептором Ш^КА (Р>0,05). Толщина эпидермиса у обработанных ΙΕ-22 мышей №Т увеличивалась приблизительно на 43% по сравнению с мышами, обработанными ЗФР (например, №Т/ЗФР, Р<0,001), тогда как обработанные ΙΕ-22 мыши И.-22КАт К0 (НОМ) показали лишь 26% увеличение толщины эпидермиса по сравнению с контролем (НОМ/ЗФР, Р>0,05). В целом биологические эффекты ΙΕ-22 на кожу мышей позволяют предполагать, что данный фактор мог бы участвовать в регуляции роста и пролиферации эпидермиса.
Пример 35. Фармакокинетика моноклонального антитела против ΙΕ-20 человека (клон # 262.7.1.3.2.4).
Тестируемое моноклональное антитело, шАЬ против ΙΕ-20 человека (клон # 262.7.1.3.2.4) получали в аликвотах 3х3 мл в концентрации 1,08 мг/мл (измеренной по поглощению в УФ при 280 нм) и хранили при -80°С до использования. Растворителем служил 1х ЗФР (50 мМ №Р04, 109 мМ \аС1), рН 7,3. шАЬ оттаивали при комнатной температуре перед применением, и аликвоты 1 и 2 применяли в полученном виде для групп с в/в и п/к дозой 100 мкг, соответственно. Половину аликвоты 3 разбавляли 1:2 в 1х ЗФР для группы с п/к дозой 50 мкг, а вторую половину аликвоты 3 разбавляли 1:10 в 1х ЗФР для группы с п/к дозой 10 мкг. Самки мышей линии 8СГО (п=96) были получены от СЫаг1ез Кгуег БаЬз. Животных проверяли на состояние здоровья по прибытии и размещали группами (3 животных на клетку). Мыши были в возрасте 12 недель и имели среднюю массу тела 22 г в начале исследования.
A. Протокол введения дозы.
Самок мышей линии 8СГО (п=24/группу дозирования) случайным образом разделяли на четыре группы дозирования (см. табл. 30). Группе 1 вводили шАЬ против 1шП.-20 посредством в/в инъекции приблизительно 93 мкл в хвостовую вену, а группам 2,3 и 4 шАЬ вводили посредством п/к инъекции приблизительно 93 мкл в загривок на шее.
B. Сбор образцов.
Перед сбором крови мышей полностью анестезировали галотаном или изофлураном. Образцы крови собирали посредством пункции сердца во все временные точки, за исключением временной точки 168 ч (собирали с помощью кровопускания глаза, и у тех же животных вновь брали кровь во временную точку 504 час посредством пункции сердца). Кровь собирали в пробирки для отделения сыворотки и давали свернуться в течение 15 мин. Образцы затем центрифугировали в течение 3 мин при 14000 об/мин. После центрифугирования аликвоты 125-150 мкл помещали в меченые эпендорфовские пробирки и немедленно помещали на хранение при -80°С до анализа (табл. 30).
Таблица 30
- 94 009124 *Одни и те же животные были использованы для временных точек 168 и 504 ч.
С. Количественное определение концентрации тАЬ против ЕиI^-20 с помощью ИФА.
Был разработан и применен иммуноферментный анализ (ИФА) для анализа образцов сыворотки животных, получавших дозу тАЬ против ΙΤ-20 267.7.1.3.2.4 в фармакокинетических исследованиях. Данный анализ был разработан для извлечения выгоды применения имеющегося в продаже вторичного антитела и колориметрического определения с использованием ТМВ. Разведения, применяемые для стандартной кривой, модифицировали для улучшения определения линейной части стандартной кривой. Стандартная кривая в диапазоне от 100 нг/мл до 0,231 нг/мл при 2-кратных разведениях обеспечивала количественное определение образцов сыворотки мыши. Образцы ОС разводили до 1:100, 1:1000 и 1:10000 в 10% сыворотке мышей линии 8СП) и обратно рассчитывали из стандартной кривой.
1). Фармакокинетический анализ.
Данные о концентрации в сыворотке против времени загружали в программу А1п\оп11п РтоГеккюпа1 4.0 (РЕагыдЕ!, Ыс.; Сагу, NС) для фармакокинетического анализа. Для определения фармакокинетических параметров применяли некомпартментный анализ, основанный на средних данных для каждой временной точки.
Е. Результаты.
Средние концентрации тАЬ против ΙΤ-20 человека в сыворотке после введения 100 мкг в/в и 100, 50 и 10 мкг п/к показаны в табл. 31.
Таблица 31
Время (час) 100 мкг в/в Конц. (мкг/мл) 10 мкг п/к Конц. (мкг/мл) 50 мкг п/к Конц. (мкг/мл) 100 мкг п/к Конц. (мкг/мл)
0,25 196 (12) ЬТЕ 0,101 (0,065) 0,481 (0,485)
1 154 (18) 0,356 (0,146) 1,61 (0,52) 3,48 (1,72)
4 118 (20) 2,42 (0,53) 10,4 (3,4) 19,7 (4,7)
8 112 (20) 3,41 (0,30) 18,9 (3,6) 40,2 (6,4)
24 103 (13) 4,95 (0,05) 26,3 (0,7) 50,1 (6,2)
72 101 (16) 4,27 (0,79) 21,0 (3,4) 43,4 (2,7)
168 45,6 (15,4) 2,92 (0,53) 19,6 (2,7) 37,6 (3,4)
336 36,4 (16,6) 3,60 (0,31) 23,5 (3,5) 34,4 (5,8)
504 28,8 (3,8) 2,74 (0,39) 20,5 (3,6) 25,7 (2,1)
ЬТЯ: ниже пределов регистрации.
После в/в введения зависимость концентрации тАЬ от времени показала двухэкспоненциальное снижение. После п/к введения тАЬ, видимо, имеет медленную фазу всасывания с ограниченным всасыванием удалением. Фармакокинетические параметры сыворотки, основанные на средних значениях в каждой временной точке, показаны в табл. 32:
Таблица 32
Параметр Единицы 100 мкг в/в 10 мкг п/к 50 мкг п/к 100 мкг п/к
Со (В /в ) ; Стах (п/к) мкг/мл 212 4,95 26,3 50,1
Ттах час Ν/Α 24 24 24
ттоо 509 ΝΟ ΝΏ 612
ΐ-1/2, λζ
АИС (о-с) час-мкг/мл 27059 1730 10845 18110
АиС (о-беск.) час-мкг/мл 48269 ΝΌ ΝΌ 41561
лис (% экстраполяции) О, о 43,9 ΝΌ ΝΟ 56,4
ν33 (в/в) ; νζ/Ρ (п/к) мл 1,34 ΝΌ ΝΌ 2,12
С1 (в/в); С1/Е (п/к) мл/час 0,002 ΝΏ ΝΌ 0,002
Р (биодоступность) о, Ό Ν/Α ΝΌ № 86,1
N0: неизмеримо из-за отсутствия данных конечной фазы элиминации в профиле концентрации против времени.
- 95 009124
После в/в введения тАЬ показал очень медленный клиренс (С1=0,002 мл/ч) и длительный период полужизни элиминации (Б1/2д2«21 день). тАЬ показало стационарный объем распределения (Укк=1,3 мл, что меньше объема крови у мыши («1,7 мл), что позволяет предполагать, что тАЬ не выходил в значительной мере за пределы компартмента кровяного русла. Обратно рассчитанная максимальная концентрация (С0) была выше ожидаемой на основании инъецированной дозы и объема крови у мыши. Таким образом, наряду с низким Укк это позволяет предполагать, что тАЬ в значительной мере может быть приурочен к сывороточной фракции крови.
После п/к введения величины Стах увеличивались пропорционально дозе. При п/к дозе 100 мкг тАЬ имел ί1/2,λζ приблизительно 25 дней при клиренсе и кажущемся объеме распределения, сходными с таковыми при в/в введении дозы. Биодоступность составляла 86%. При двух более низких п/к дозах большинство фармакокинетических параметров не могло быть установлено из-за отсутствия измеримой терминальной фазы элиминации, даже хотя образцы получали не через 504 ч. Поглощение тАЬ после п/к введения дозы, по-видимому, достигает стационарного состояния с элиминацией на протяжении исследования.
Пример 36. Антагонисты БЬ-20 и БЬ-22 в модели СО4'СЬ45ВВй| (ΟΌ25-) колита и псориаза.
A. Резюме.
Перенос СП4+СП45КВЫ или СЬ4+СЬ25- Т-клеток сингенным мышам линии 8СЮ приводит к колиту у мышей. Совместный перенос регуляторных Т-клеток (ΟΌ4+ΟΌ25+ или С^4+С^45ΚВ1ο) ингибирует данный колит. После переноса СЬ4+СЬ25- Т-клеток мышам в случае, если мышам дополнительно инъецировали энтеротоксин В стафилококков (8ЕВ), у мышей развивается не только колит, но и псориаз. Антитела против БЬ-22ВА, БЬ-20, БЬ-22, БЬ20В и/или БЬ22В или растворимые рецепторы БЬ-22ВА вводят с 0-21 дня после переноса клеток и отслеживают симптомы колита и псориаза.
Ингибирование показателя псориаза или колита (гистология) указывает на то, что БЬ-21 может ингибировать данные аутоиммунные заболевания.
B. Дизайн исследования.
Из мышей линии В10.Э2 выделяли селезенку и паховые лимфатические узлы. С помощью системы МйБепуБ Веаб ΟΌ25+ клетки отсортировывали посредством положительной селекции. Клетки окрашивают с помощью 0025-РЕ (ВО РйагтБпдеп) в разведении 1:100 и инкубируют в течение 15 мин. Избыток антитела отмывают, и клетки инкубируют с 10 мкл анти-РЕ шариков/106 клеток в течение 20 мин. Клетки промывают ЗФР и пропускают через колонку Ь8 (МПБепуБ ВюБесй). Клетки, которые проходят через колонку (СО25-), сохраняют для последующего анализа. К данным СЬ25- клеткам добавляют (1:100) смесь, обогащенную 0Ό4 (8Бет Се11 Бесйпо1одБек) и инкубируют в течение 15 мин. Клетки промывают ЗФР. К клеткам на 15 мин добавляют разведение 1:10 антибиотинового тетрамера и затем магнитный коллоид (60 мкл/106 клеток) на 15 мин (все от 8Бет Се11 Тесйпо1одБек). Клетки пропускают через колонку отрицательной селекции (0,5'', 8Бет Се11 Тесйпо1одБек). Прошедшие клетки являются СЬ4+СЬ25- клетками. Чистоту анализируют с помощью проточной цитометрии. 0,4х106 клеток инъецируют в/в наивным мышам линии СВ-17 8СЮ в суммарном объеме 200 цл. На следующий день (б1) мышам инъецируют в/б 10 цг 8ЕВ. Симптомы псориаза и колита появляются через 2-5 недель. Мышей оценивают на заболевание псориазом по следующим критериям. 0-отсутствие повреждений, 1-легкие повреждения на шее, 2тяжелые повреждения на шее и спине (туловище), 3-очень тяжелые повреждения на шее, спине и животе мышей. Измеряют также толщину уха в качестве показателя тяжести заболевания. Группам мышей инъецируют в/б ЗФР, 100 цг контрольного антитела или 10-100 цг антител против БЬ-22ВА, БЬ-20, БЬ-22, БЬ20В или БЬ-22В или растворимый БЬ-22ВА с 1-30 дня при различных режимах введения дозы (3х/неделю или 2х/неделю).
C. Результаты и заключение.
Ингибирование симптомов псориаза и колита у обработанных антителом мышей указывает на то, что ингибирование функции БЬ-20 и/или БЬ-22 может тормозить аутоиммунные симптомы в данной модели псориаза и колита.
Пример 37. Антагонисты БЬ-20 и БЬ-22 в 8СШ-йи трансплантантной модели псориаза.
Псориазная кожа человека, пересаженная на мышей линии 8СШ, может сохранять свои клинические, светомикроскопические и иммуногистохимические псориатические особенности в течение нескольких недель. Данная модель обеспечивает систему оценки медикаментов, предназначенных для восстановления поврежденной ткани до нормального фенотипа. После успешного приживления человеческой кожи можно вводить на протяжении нескольких недель антитела против БЬ-22ВА, БЬ-20, БЬ-22, БЬ20В и/или растворимые рецепторы БЬ-20 или БЬ-22, и для оценки действия данных антагонистов на псориаз может быть проанализирована толщина эпидермиса.
В. Дизайн исследования.
Из кожи здоровых взрослых добровольцев и поврежденной псориазом кожи получают с помощью 6-мм компостера биоптаты полной толщины, состоящие из всего эпидермиса и нескольких мм дермиса. От каждого донора получают от четырех до шести биоптатов. Один компостерный биоптат от каждого донора трансплантируют на спинную поверхность реципиентной мыши линии 8С.ЧЬ (СВ-17, Тасошс).
- 96 009124
Животных содержат в свободной от патогенов среде. Обработку начинают после успешного приживления (2-3 недели после трансплантации) следующим образом: один биоптат для отрицательного контроля (ЗФР или изотипичное тАЬ), один биоптат для положительного контроля (циклоспорин А) и 2-3 биоптата для обработки тАЬ против ГБ-22НА человека, против ГБ-20 человека, против ГБ-22 человека или растворимыми рецепторами ГБ-20 или ГБ-22 (внутрибрюшинная инъекция, три раза в неделю на протяжении 2-4 недель по схеме понедельник-среда-пятница).
С. Количественный анализ.
Клинические обследования и оценки должны производиться регулярно на протяжении всех экспериментов и должны записываться. Тяжесть псориатических повреждений оценивают по чешуйчатости, отвердению и эритеме слепым способом. Параметры могут быть подсчитаны с применением трехточечной шкалы: 0=полное отсутствие вовлечения кожи; 1 = слабое вовлечение; 2 = умеренное вовлечение; 3 = тяжелое вовлечение. В конце периода введения дозы каждое животное умерщвляют, и ткани собирают для гистологии и ГНС. (1) Часть ткани фиксируют в 10% формалине и окрашивают гематоксилином и эозином. Эпидермальную площадь измеряют как функцию изменений толщины эпидермиса на единицу длины с применением программы МН Гтаде. Измеряют множественные области из каждого трансплантата для обеспечения большой величины п и средней площади эпидермиса. (2) Количество воспалительных мононуклеарных клеток на поле с большим увеличением (0,103х0,135 мм) в верхнем дермисе; (3) степень паракератоза оценивают по условной шкале от 0 до 3, где 0 означает отсутствие паракератоза, 1 означает паракератоз в менее одной трети среза, 2 означает паракератоз в более чем одной трети, но менее чем в двух третях среза, и 3 означает паракератоз в более чем двух третях среза. (4) Остальная часть ткани должна быть окрашена на К167 (маркер пролиферирующих кератиноцитов) для оценки количества К167 циклирующих кератиноцитов на миллиметр длины среза. Сниженная тяжесть псориаза, измеренная по толщине эпидермиса, указывает на то, что нейтрализация функции ГБ-20 и ГБ-22 может быть эффективной в данной модели псориаза. Для количественной оценки сниженной тяжести псориаза авторы измеряли толщину эпидермиса, количество воспалительных клеток в верхнем дермисе, количество К167 циклирующих кератиноцитов и уровень паракератоза. Значительное снижение всех четырех параметров в обработанных группах по сравнению с контрольными мышами указывает на потенциальное терапевтическое применение антагонистов ГБ-20, ГБ-22.
Пример 38. Скрининг антагонистической активности в отношении ГБ-20 с применением клеток ВаЕ3/[Б-22КА/[Б-20КВ с помощью теста пролиферации с аламаром синим.
Зависимую от фактора пре-В линию клеток ВаР3 трансфицировали совместно ГБ-22НА и ГБ-20КВ (см. способ в примере 3) и обрабатывали ГБ-20 в различных концентрациях. Пролиферацию оценивали с помощью теста с аламаром синим, как описано в примере 3. ГБ-20 стимулировал пролиферацию дозозависимым образом при концентрациях, ожидаемых для цитокина, что показало связывание ГБ-20 и активацию гетеродимерного рецептора ГБ-22НА/ГБ-20КВ при концентрациях, ожидаемых для цитокина. Негативные контроли, содержащие нетрансфицированные ВаР3, не пролиферировали.
Для определения того, способны ли антитела против ГБ-22НА антагонистически противодействовать активности ГБ-20, проводили описанный выше тест с применением антител против ГБ-22НА в качестве антагониста активности ГБ-20. Когда ГБ-20 сочетают с таким антагонистом, ответ на ГБ-20 падает до фонового уровня. То, что присутствие антагониста снимает или снижает пролиферативное действие ГБ20, показывает, что он является антагонистом лиганда ГБ-20. Данный анализ может быть применен для тестирования других описанных здесь антагонистов активности ГБ-20, таких как антагонистические полипептиды, включающие растворимый рецептор ГБ-22НА.
Пример 39. Нейтрализация активности ГБ-20 и ГБ-22 моноклональным антителом против 1шБ22НА.
С помощью описанного в примере 28 теста нейтрализации на основе клеток очищенное моноклональное антитело мыши против ЬиГБ-22НА (пример 30(Ό)) добавляли в виде последовательного разведения, например, при 10, 5, 2,5, 1,25 мкг/мл, 625, 313, 156 и 78 нг/мл. Планшеты для тестирования инкубировали при 37°С, 5% С02 в течение 4 дней, после чего добавляли аламар синий (Асситеб, СЫсадо, ГБ) в количестве 20 мкл/лунку. Планшеты вновь инкубировали при 37°С, 5% С02 в течение 16 ч. Результаты показали, что очищенное моноклональное антитело против БиГБ-22НА может нейтрализовать сигнализацию и ЬиГБ-20, и ЬиГБ-22 через БиГБ-22НА. В концентрации 10 мкг/мл антитело полностью нейтрализовывало пролиферацию, индуцированную ЬиГБ-22 или ЬиГБ-20, при ингибировании пролиферации, снижающемся зависимым от дозы образом при более низких концентрациях. Мышиное тАЬ того же изотипа отрицательного контроля, тестированное при описанных выше концентрациях, не обеспечило ингибирования пролиферации любого цитокина. Данные результаты дополнительно демонстрируют, что моноклональные антитела против ГБ-22НА действительно могли бы антагонистически противодействовать активности провоспалительных лигандов, ГБ-20 и ГБ-22, при низких концентрациях.
Данные результаты служат дополнительным доказательством того, что эффективная блокада активности ГБ-22НА, например, с помощью нейтрализующего моноклонального антитела настоящего изобретения против ГБ-22НА, могла бы быть полезной для блокирования, ингибирования, снижения, антагонистического действия или нейтрализации эффектов ГБ-20 и ГБ-22 (раздельно или совместно) ш у1уо и может снижать индуцированное ГБ-20 и/или ГБ-22 воспаление, такое как наблюдаемое при индуцирован
- 97 009124 ных ΙΕ-20 кожных эффектах, а также индуцированных ΙΕ-22 кожных эффектах, например, при псориазе, ΚΏ, колите или других воспалительных заболеваниях, индуцированных ΙΕ-20 и ΙΕ-22, включая ШЭ, артрит, астму, псориатический артрит, колит, воспалительные состояния кожи и атонический дерматит.
Пример 40. Обработка беременных ΙΕ-20 и ΙΕ-22 трансгенных мышей нейтрализующим моноклональным антителом против Ш-22КА Для тестирования нейтрализующей активности ш у1уо моноклонального антитела (шАЬ) крысы против Ш-22КА мыши беременным ΙΕ-20 трансгенным (Тд) и ΙΕ-22 Тд мышам инъецируют внутрибрюшинно тАЬ против Ш-22КА мыши. Новорожденных мышат оценивают на наличие или отсутствие фенотипа «блестящей» кожи, который обычно характерен для данных линий мышей.
Конкретно, самцов ΙΕ-20 Тд (которых получают с помощью кератина-14) или ΙΕ-22 Тд (с применением промотора инсулина) мышей скрещивают с самками линии С57Β^/6N в эструсе, и скрещенных самок идентифицируют по наличию влагалищной пробки на следующий день. Каждую беременную самку отсаживают в отдельную клетку и отслеживают ежедневно. Группы обработки включают по меньшей мере 4 беременных самки в каждой для обеспечения статистически значимого анализа и Тд, и не-Тд мышат. На основе предшествующего опыта с данными Тд мышами помет обычно варьирует от приблизительно 6 до 8 мышат на помет, из которых от 2 до 3 являются Тд+.
Через семь-девять дней после скрещивания мышей (эмбриональный возраст 7-9, е7-9) самкам инъецируют внутрибрюшинно 250-500 мкг шАЬ крысы против Ш-22КА мыши (изотип ^С2а крысы) в объеме 200-250 мкл ЗФР. Для неглубокой инъекции под углом применяют короткие иглы во избежание прямой инъекции в матку. Беременных самок инъецируют данным образом 3 дня в неделю (понедельник, среда и пятница) на протяжении 2 недель (до родов) для успешного достижения развивающихся эмбрионов. Контрольные группы (не менее чем из 4 беременных самок в каждой) включают следующие: изотипный контроль шАЬ ^С2а крысы, шАЬ против ΙΕ-22 человека/мыши (изотип ^С1 крысы) и изотипный контроль шАЬ ^С1 крысы. В качестве контроля нейтрализации ΙΕ-20 мыши беременным самкам инъецируют либо растворимый гибридный белок I^-20К-Рс4, который может связывать и нейтрализовывать ΙΕ-20 и человека, и мыши, или контрольный белок Рс4.
С 1 по 2 день после рождения мышат тщательно отслеживают на проявление фенотипа блестящей кожи. На 2 день мышат умерщвляют и берут часть хвоста для выделения ДНК для определения генотипа (Тд или не-Тд) каждого мышонка. Образцы кожи отбирают для гистологического анализа для оценки того, имеют ли мышата утолщенные слои клеток эпидермиса, которые обычно характерны для данных Тд мышей. Собирают также кровь из кровяного русла мышат (и из глаза матерей на следующий день после родов) для количественного определения с помощью ИФА уровня шАЬ против Ш-22КА в сыворотке каждой мыши. Поскольку данные шАЬ являются сильными ингибиторами ΙΕ-20 и/или ΙΕ-22 ш У1уо, Тд мышата имеют нормальную кожу (т.е. без утолщения эпидермиса или «блестящего» вида).
Пример 41. Антагонисты ΙΕ-20 и ΙΕ-22 в модели псориаза в органной культуре.
Кожа псориазной бляшки человека может поддерживаться в органной культуре, и аномальные гистологические особенности поврежденной кожи поддерживаются в отсутствие экзогенных факторов роста. Могут быть введены антитела против Ш-22КА, ΙΕ-20, ΙΕ-22, Ш-20Е и/или Ш-22Е или растворимые рецепторы ΙΕ-20 или ΙΕ-22, и гистологические особенности поврежденной псориазом кожи могут быть улучшены.
B. Дизайн исследования.
Биоптаты 2-мм компостера полной толщины, состоящие из всего эпидермиса и нескольких мм дермиса, получают либо от здоровых взрослых добровольцев, либо из поврежденной псориазом кожи. Сразу после биопсии ткань погружают в культуральную среду, состоящую из базальной среды кератиноцитов (КВМ) (С1оиейск Шс, ХУаПюгкуШе, МО). В культуральную среду добавляют СаС12 для доведения конечной концентрации Са2+ до 1,4 мМ (Уагаш е! а1., 1993, 1994). Биоптаты затем инкубируют в лунках 96луночной чашки, содержащих 200 мкл КВМ с добавкой Са2+ в присутствии или в отсутствие дополнительной обработки антителами против ΙΕ-20, ΙΕ-22, Ш-22КА человека или растворимыми рецепторами ΙΕ-20 или Ш-22. Культуры инкубируют при 37°С в атмосфере 95% воздуха и 5% С02 в течение 8 дней.
C. Количественный анализ.
В конце периода инкубации ткань фиксируют в 10% забуференном формалине и обследуют гистологически после окраски гематоксилином и эозином. Вид псориазной ткани, экспонированной с антителами или растворимыми рецепторами, мог больше напоминать таковой нормальных тканей, включая следующие наблюдения: исходно дезорганизованные, неправильной формы базальные эпителиальные клетки приобретали более колончатый вид с восстановленной полярностью; эпидермальные сетчатые гребешки подвергаются регрессии при снижении областей проникновения эпителиальных клеток в дермальное пространство; и общая дегенерация эпидермальных слоев была меньше. Модель органной культуры обеспечивает быстрый и чувствительный способ определения того, обладает ли конкретное соединение потенциалом антигиперпролиферативного агента. Аномальная гистологическая особенность может быть улучшена в присутствии антагониста Ш-20, Ш-22, что предполагает эффективность такого агента в лечении псориаза.
- 98 009124
Пример 42. Картирование областей связывания тК^КА (2Су!оК11т) с нейтрализующими тАЬ К2.1.5Г4.1 и К2.1.15Е2.1
А. Эпитопы на Н.-22КА мыши, с которыми связываются нейтрализующие моноклональные антитела.
Описанные ниже эксперименты были предназначены для идентификации области или областей в аминокислотной последовательности белка растворимого рецептора П.-221КА (8ЕР ΙΌ N0:62), являющихся важными для активности рецептора или для связывания антагонистичного или нейтрализующего антитела. Белок ^-22^-^ мыши, который предварительно расщепляли тромбином для удаления Гс, затем расщепляли до остатков метионина с С-конца в последовательности инкубацией с цианогенбромидом (СНВг). Полученные СЫВг пептиды фракционировали, и фракции тестировали на связывающую активность, определяемую с помощью ИФА, и реактивность с помощью Вестерн-блоттинга с применением моноклональных антител с нейтрализующими свойствами, клоны К2.1.5Г4.1 и К2.1.15Е2.1.
После расщепления СЫВг из невосстановленного полноразмерного тК^КА потенциально были получены следующие пептиды (табл. 33). При невосстанавливающих условиях цистеины связаны дисульфидными связями, что может давать внутреннюю связь в пептиде 1 и связь между пептидами 3 и 5. Остатки, выделенные жирным шрифтом, потенциально участвуют в связывании лиганда, что соответствует остаткам П.-221КА человека, потенциально участвующим в связывании лиганда, в 81/С) ΙΌ N0:2 или 81/0 ΙΌ N0:3, как описано в примере 42В. Конкретно, 81/С) ΙΌ N0: 48 соответствует аминокислотным остаткам с 16 (Н1к) по 83 (Ме!) 81/0 ΙΌ N0:42; 81:0 ΙΌ N0:49 соответствует аминокислотным остаткам с 84 (С1и) по 109 (Ме!) 81/С) ΙΌ N0: 42, 81/С) ΙΌ N0:50 соответствует аминокислотным остаткам с 110 (ТНг) по 137 (Ме!) 81/С) ΙΌ N0:42, 81/С) ΙΌ N0:51 соответствует аминокислотным остаткам с 138 (Ьеи) по 177 (Ме!) 81/С) ΙΌ N0:42 и 81/С) ΙΌ N0:52 соответствует аминокислотным остаткам с 163 (Н1к) по 208 (Рго) 8ЕО ΙΌ N0:42 или с 163 (Н1к) по 212 (Агд) 81%) ΙΌ N0:62.
Таблица 33
Номер пептида От До Последовательность
СИВг пептид 1 1 68 НТТУБТЗСЬЬОНУКРОЗЗЫРЕЫ1ЬТМОСОРАЗТЗ ΌΤνΥ3νΕУККУОЕНКИЬАКАОС0Н1ТОКРСЫЬТМ (ЗЕф Ю N0: 48)
Невосстановленный: цистеины в пептиде 1 связаны
СЫВг пептид 2 69 94 ΕΤΚΝΗΤΕΡΥΥΑΚνΤΑν3ΑΟΟΡΡνΤΚΜ (ЗЕО Ю N0:49)
СИВг пептид 3 95 122 ТОКРЗЗЬ0НТТ1КРРОУТС1РКУРЗЮМ (ЗЕО Ю N0: 50)
Невосстановленный: пептиды 3-5 связаны
СИВг пептид 4 123 162 ЬУНРТЬТРУЬЗЕООН0ЬТЬЕЕ1РНБЬРУКЬЕЬНУ ΝΗΤΥ0Μ (ЗЕО Ю N0: 51)
СИВг пептид 5 163 212 НЬЕСК0РЕУЕРЬОЬТРОТЕРЬО31Т1ЬТР1ЬЗКЕ ЗАРУУСКУКТЬРЬУРЕ (ЗЕО Ю N0: 52)
1. Расщепление и выделение пептидных фракций 50 мкг тЬЬ-22КА лиофилизовали и восста- навливали в 180 мкл муравьиной кислоты (70%).
Добавляли 1 мкл 5М СNΒ^, растворенного в ацетонитриле. Образец перемешивали и оставляли взаимодействовать в течение 18 ч при комнатной температуре в темноте. 150 мкл реакционной смеси фракционировали с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой, снабженной аналитической колонкой Ζο^Ьаx 8В300-С8. Пики разделяли с помощью градиента, начиная с 25% ацетонитрила (0,085% ТФУ) и 75% воды (0,1% ТФУ) и кончая 95% ацетонитрила (0,085% ТФУ) и 5% воды (0,1% ТФУ). УФ-анализ показал три основных и два минорных пика, каждый из которых был собран. Каждую фракцию делили пополам; одна часть была предназначена для ИФА, а другую часть лиофилизовали и восстанавливали в 150 мкл забуференного фосфатом солевого раствора (ЗФР). УФ-анализ фракций ЗФР подтвердил выявление всех пиков, собранных с аналитической колонки. Фракции ЗФР подвергали анализу с помощью Вестернблоттинга.
2. ИФА.
Фракции ВЭЖХ, содержащие пептидные последовательности !Ь-22КА, расщепленного СNΒ^, разбавляли до установленной равной концентрации буфером для ВЭЖХ (90% ацетонитрил, 10% Н20, 0,09% трифторуксусная кислота). Образцы вносили в девяностошести-луночный планшет для микротитрования в 4 лунки каждый в количестве 100 мкл/лунку и давали высохнуть в течение ночи при комнатной температуре в вытяжном шкафу. Планшеты промывали буфером С для ИФА (ЗФР, 0,05% твин-20) и затем блокировали буфером В для ИФА (ЗФР, 0,1% БСА, 0,05% твин-20) в течение 2 ч при 37°С. Два моноклональных антитела (тАЬ) против Ш^КА (клон К2.1.5Г4.1 и клон К2.1.15Е2.1) разбавляли до 2 мкг/мл в
- 99 009124
ИФА В. Каждое тАЬ добавляли к образцу каждой пептидной последовательности в количестве 100 мкл/лунку, и планшеты инкубировали в течение 60 мин при 37°С. Планшеты промывали для удаления несвязанного антитела, и вторичное антитело (козье против Ι§Θ крысы, конъюгированное с пероксидазой хрена (^аскзοη)) разбавляли до 1 мкг/мл в буфере В для ИФА и добавляли во все лунки в количестве 100 мкл/лунку. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Лунки промывали буфером С для ИФА и затем инкубировали с ТМВ1 Сοшροηеη! 11ВР Мкго^ей 8иЬз!га!е (ΒίοΡχ) в течение 5 мин. Реакцию останавливали добавлением 450 нм 8к)р Веадеп! ίοτ ΊΜΒ Мкго^ей (ΒίοΡχ), и планшеты считывали при поглощении 450 нм в планшетном ридере Эупа!есй ЕМ8А (Μοίесиίа^ Оеук'ез).
Результаты показывают, что шАЬ В2.1.5Е4.1 взаимодействует с фракцией № 4 ВЭЖХ реакционной смеси ιιιΙΙ.-ЗЗВА СNΒ^, которая также образует полосу в экспериментах с Вестерн-блоттингом.
3. Вестерн-блоттинг.
Фракции ВЭЖХ, содержащие пептидные последовательности ΙΕ-ЗЗВА, расщепленного СNΒ^, лиофилизовали в течение ночи при комнатной температуре и восстанавливали в ЗФР. После этого образцы смешивали с невосстанавливающим буфером для образца (Iην^!^οβеη) и кипятили в течение 10 мин. Образцы наносили и подвергали электрофорезу с помощью 8Э8-РАОЕ на гелях 4-12% Β^з-Ί^^з (Iην^!^οβеη) с применением 1х Мез-808 Виниту ΒιιΓΕγ (Ιην^ίгοдеη) и переносили на нитроцеллюлозу (0,2 цм; ΒΐοВаб) в буфере переноса с 20% метанола, все при комнатной температуре. Фильтрам давали высохнуть в течение ночи при комнатной температуре. Фильтры блокировали 10% нежирным сухим молоком в буфере А (50 мМ трис, рН 7,4, 5 мМ ЭДТА, 0,05% керх-В СА-630, 150 мМ \аС’1, 0,25% желатин) в течение 30 минут при комнатной температуре. Моноклональное антитело (тАЬ) против ΙΙ,-ЗЗВА (клон В2.1.5Е4.1) разбавляли до 2 мкг/мл в буфере А, содержащем 2,5% нежирного сухого молока. Отпечатки инкубировали в данном первичном антителе в течение 1 ч при комнатной температуре. После инкубации отпечатки промывали три раза в буфере А и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с разведенным 1:5000 вторичным антителом (козьим против Ι§Θ крысы-пероксидаза хрена; ^аскзοη, Ιικ.) в буфере А с 2,5% нежирного сухого молока. Отпечатки затем промывали, окрашивали хемилюминесцентным субстратом (Ειιιιιί-ΕίΰΙιΙ Шез!егп Β1οΙΐίιι^ 8иЬз!га!е; ВссЬе) и экспонировали с применением люминесцентного блока формирования изображения (МаппКенп Βοей^^ηβе^ ^иш^-Iшаβе^).
При применении 30-минутной экспозиции невосстанавливающий гель показал очень сильные полосы для фракций № 4 и № 5 наряду со слабой полосой для фракции № 3. Фракция № 4 также была позитивной в тесте ИФА.
\-концевое секвенирование активной фракции № 4.
Из пяти ΒΆΒΐ' пептидных фракций, собранных с аналитической колонки с обращенной фазой, фракция № 4 показала активность в ИФА и была также положительной при Вестерн-блоттинге. Для идентификации пептидов, находящихся в активной фракции № 4, образец был подвергнут деградации по Эдману с применением хорошо известных способов. В активной фракции было идентифицировано три \-конца, которые соответствовали пептидам 2 (8ЕР ΙΙ) N0:49), 3 (8ЕР ΙΙ) N0:50) и 5 (8ЕР ΙΙ) N0:52). Данные результаты показывают, что антитела связываются с пептидами 2 (8ЕТ) ΙΙ) N0:49), 3 (8ЕТ) ΙΙ) N0:50) и 5 (8Ер ΙΏ N0:52).
Таблица 34
Деградация по Эдману Ν-концевая последовательность Идентификация пептида
Первая последовательность, полученная из фракции № 4 Полученная ΟΝΒγ последовательность т1Ь-22КА НЬЕОК ΟΒΕΥΕ ГЬОЬТ РБТЕГ НЬЕОК СЖЕУЕ ГЬОЬТ ΡϋΤΕΓ ЬО31Т 1ЬТР1 ЬЗКЕЗ АРУУС КУКТЬ РЬУРН (ЗЕ<Э Ю N0:53) ΟΝΒγ пептид 5 (ЗЕ<2 Ю N0:52)
Вторая последовательность, полученная из фракции № 4 Полученная ΟΝΒγ последовательность т1Ь-22КА ΕΤΚ.ΝΗ ΤΕΡΥΥ АКУТА УЗАСЮ ΕΤΚΝΗ ΤΕΡΥΥ АКУТА УЗАОО РРУТК М (ЗЕ<2 ΙΏ N0:54) ΟΝΒγ пептид 2 (ЗЕО Ю N0:49)
Третья последовательность, полученная из фракции № 4 Полученная ΟΝΒγ последовательность т1Ь-22ВА ΤΏΚΡ3 ХЬОНТ ΧΙΧΡΧ ΌΧΧΧΙ ΤΏΚΡ3 ЗЪОНТ ΤΙΚΡΡ ОУТС1 РКУКЗ юм (ЗЕО Ιϋ N0:55) ΟΝΒγ пептид 3 (ЗЕО ΙΟ N0:50)
- 100 009124
Обсуждение
Из смеси пептидов расщепленного СЧВг шТО^КА было выделено пять фракций. Из них только фракция № 4 была активна в ИФА и положительна при Вестерн-блоттинге. Деградация по Эдману идентифицировала три Оконца, соответствующих СЧВг пептидам 2 (8Е^ ΣΌ N0:49), 3 (8Е^ ΣΌ N0:50) и 5 (8Е^ ΣΌ N0:52), во фракции № 4. Внутри данных областей в связывании лиганда потенциально участвуют шесть остатков. Этими остатками являются Υ93, К112, К210 и Е211 8Е^ ΣΌ N0:42, которые также соответствуют Υ78, К97, К195 и Е196 8Е^ ΣΌ N0:62. Остатки Υ60 и Ε164 8Е^ ГО N0:42 также участвуют в связывании лиганда.
В. Эпитопы на ГО-22КА человека, с которыми связываются нейтрализующие моноклональные антитела.
Описанные ниже эксперименты предназначены для идентификации области или областей во внеклеточном домене аминокислотной последовательности белка ГО-22КА человека (8Е^ ГО N0:2), важных для активности рецептора или для связывания антагониста или нейтрализующего антитела. Белок растворимого рецептора ГО-22КА человека (например, включающий 8Е^ ГО N0:3, такой как ГО-22КА-РС, расщепленный тромбином для удаления Рс) затем расщепляют до остатков метионина с С-конца в последовательности инкубацией с цианогенбромидом (СЧВг) или другим известным в данной области агентом, который расдепляет белок человека на определенные фрагменты. Полученные СЧВг пептиды фракционируют, и полученные фракции тестируют на связывающую активность, определяемую с помощью ИФА, и реактивность с помощью Вестерн-блоттинга с применением моноклональных антител с нейтрализующими свойствами.
Предсказывается, что четыре цистеина связаны дисульфидной связью с паттерном Сук71-Сук79 и Сук204-Сук217 8Е^ ГО N0:2. После расщепления СЧВг из невосстановленного полнораэмерного ГО22КА человека потенциально образуются следующие пептиды: пептид 6 (8Е^ ГО N0:56), пептид 7 (8Е^ ГО N0:57); пептид 8 (8Е^ ГО N0:58); пептид 9 (8Е^ ГО N0:59); пептид 10 (8Е^ ГО N0:60); и пептид 11 (8Е^ ГО N0:61) (табл. 35). Цистеины связаны дисульфидной связью, что ведет к возможной связи между пептидами 7 (8Е^ ГО N0:57) и 10 (8Е^ ГО N0:60). Конкретно, 8Е^ ГО N0:56 соответствует аминокислотным остаткам с 1 (Рго) по 92 (Ме!) 8Е^ ГО N0:3; 8Е^ ГО N0:57 соответствует аминокислотным остаткам с 93 (Тйг) по 120 (Ме!) 8Е^ ГО N0:3, 8Е^ ГО N0: 58 соответствует аминокислотным остаткам с 121 (Не) по 160 (Ме!) 8Е^ ГО N0:3, 8Е^ ГО N0:59 соответствует аминокислотным остаткам с 161 (Н1к) по 185 (Ме!) 8Е^ ГО N0:3, 8Е^ ГО N0:60 соответствует аминокислотным остаткам с 186 (Не) по 199 (Ме!) 8Е^ ГО N0:3 и 8Е^ ГО N0:61 соответствует аминокислотным остаткам с 200 (Сук) по 211 (Тйг) 8Ш ГО N0:3.
Таблица 35
Номер пептида от ДО Последовательность
СЫВг пептид 6 1 92 Рго СЬи Азр Рго Зег Азр Ьеи Ьеи СЬп НЬз УаЬ Ьуз РЬе ΘΙη Зег Зег Азп РЬе СЬи Азп Не Ьеи ТЬг Тгр Азр Зег СЬу Рго СЬи СЬу ТЬг Рго Азр ТЬг УаЬ Туг Зег 11е СЬи Туг Ьуз ТЬг Туг СЬу 01и Агд Азр Тгр УаЬ АЬа Ьуз Ьуз СЬу Суз СЬп Агд 1Ье ТЬг Агд Ьуз Зег Суз Азп Ьеи ТЬг УаЬ СЬи ТЬг СЬу Азп Ьеи ТЬг СЬи Ьеи Туг Туг АЬа Агд УаЬ ТЬг АЬа УаЬ Зег АЬа СЬу СЬу Агд Зег АЬа ТЬг Ьуз Мер (ЗЕО Ю N0: 56)
СЫВг пептид 7 93 120 ТЬг Азр Агд РЬе Зег Зег Ьеи СЬп НЬз ТЬг ТЬг Ьеи Ьуз Рго Рго Азр УаЬ ТЬг Суз ЬЬе Зег Ьуз УаЬ Агд Зег ЬЬе СЬп МеЬ (ЗЕО Ю N0:57)
СЫВг пептид 8 121 160 ЬЬе УаЬ НЬз Рго ТЬг Рго ТЬг Рго ЬЬе Агд АЬа СЬу Азр СЬу НЬз Агд Ьеи ТЬг Ьеи СЬи Азр ЬЬе РЬе НЬз Азр Ьеи РЬе Туг НЬз Ьеи СЬи Ьеи СЬп УаЬ Азп Агд ТЬг Туг СЬп МеЬ (ЗЕО Ιϋ N0: 58)
СЫВг пептид 9 161 185 НЬз Ьеи СЬу СЬу Ьуз СЬп Агд СЬи Туг СЬи РЬе РЬе СЬу Ьеи ТЬг Рго Азр ТЬг СЬи РЬе Ьеи СЬу ТЬг ЬЬе Мер (ЗЕО Ιϋ N0: 59)
СЫВг пептид 10 186 199 ЬЬе Суз УаЬ Рго ТЬг Тгр АЬа Ьуз СЬи Зег АЬа Рго Туг МеЬ (ЗЕО Ю N0: 60)
СЫВг пептид 11 200 211 Суз Агд УаЬ Ьуз ТЬг Ьеи Рго Азр Агд ТЬг Тгр ТЬг (ЗЕО Ю N0: 61)
- 101 009124
4. Расщепление СХВг и выделение пептидных фракций. Вестерн-блоттинг и ИФА, и Ν-концевое секвенирование.
Приблизительно 50 мкг Ш^КА человека лиофилизуют и восстанавливают, фракционируют, собирают и анализируют с помощью Вестерн-блоттинга и ИФА, как описано в примере 42А, для идентификации фракций, содержащих моноклональные антитела против Ш^КА, и фракций, которые связывают ГБ-22КА, как показывают ИФА и Вестерн-блоттинг. С'ХВг пептидные фракции, которые собирают с аналитической колонки с обращенной фазой, затем тестируют на активность в ИФА и подтверждают как положительные с помощью Вестерн-блоттинга. Для положительных фракций пептиды идентифицируют посредством деградации по Эдману с помощью хорошо известных способов.
Обсуждение
САВг пептид мыши № 5 (8Еф ГО NО: 52) соответствует С'ХВг пептидам человека № 9 и № 10 (8Еф ГО NО:59 и 8ЕБ ГО NО:60); СХВг пептид мыши № 2 (8Еф ГО NО:49) соответствует С'ХВг человека № 6 (8Еф ГО NО:56); и С'ХВг пептид мыши № 3 (8Еф ГО NО:50) соответствует СХВг человека № 7 (8Еф ГО NО: 57). Из фракций, которые были выделены из смеси расщепленных С'ХВг пептидов ГВ-22КА человека, шесть остатков внутри возможных областей потенциально участвуют в связывании лиганда: Остатки 8ЕЦ ГО NО:2 (и соответствующие остатки 8Еф ГО NО:3), которые важны для лиганд-рецепторного связывания, включают Туг-60 и РИе-164, Туг-93, Агд-112, Ьук-210 и С1и-211 8ЕЦ ГО NО:2 (и соответствующие остатки 8ЕЦ ГО NО:3). Более того, первичные остатки 8ЕЦ ГО NО:2 (и соответствующие остатки 8ЕЦ ГО NО:3), которые важны для прямого лиганд-рецепторного связывания, включают Туг-60 и РИе-164 8ЕЦ ГО NО:2 (и соответствующие остатки 8ЕЦ ГО NО:3), а вторичные остатки включают остатки Туг-93, Агд-112, Ьук-210, и С1и-211 8ЕЦ ГО NО:2 (и соответствующие остатки 8ЕЦ ГО NО:3).
Из вышеизложенного должно быть ясно, что хотя конкретные осуществления изобретения были описаны здесь с целью иллюстрации, могут быть сделаны различные модификации без отклонения от духа и объема изобретения. Соответственно, изобретение ограничивается лишь прилагаемой формулой изобретения.

Claims (39)

  1. (1) определение уровня амилоидного белка А в сыворотке;
    (1) определение уровня амилоидного белка А в сыворотке;
    (1) определение уровня амилоидного белка А в сыворотке;
    1. Способ получения антител против полипептида, в котором предусмотрена инокуляция животному полипептида, выбранным из группы, состоящей из:
    a) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 42 (Не) по 102 (Акр) 8ЕЦ ГО NО:8;
    b) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 42 (Не) по 60 (Не) 8ЕЦ ГО NО:8;
    c) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 42 (Не) по 69 (С1и) 8ЕЦ ГО NО:8; б) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 42 (Не) по 81 (Сук) 8ЕЦ ГО NО:8; е) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 42 (Не) по 96 (Ьук) 8ЕЦ ГО NО:8; Г) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 42 (Не) по 102 (Акр) 8ЕЦ ГО NО:8; д) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 60 (Не) по 69 (С1и) 8ЕЦ ГО NО:8; И) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 60 (Не) по 81 (Сук) 8ЕЦ ГО NО:8; ί) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 60 (Не) по 96 (Ьук) 8ЕЦ ГО NО:8;
    _)) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 60 (Не) по 102 (Акр) 8ЕЦ ГО NО:8;
    k) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 69 (С1и) по 81 (Сук) 8ЕЦ ГО NО:8;
    l) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 69 (С1и) по 96 (Ьук) 8ЕЦ ГО NО:8; т) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 69 (С1и) по 102 (Акр) 8ЕЦ ГО NО:8;
    п) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 81 (Сук) по 96 (Ьук) 8ЕЦ ГО NО:8;
    о) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 81 (Сук) по 102 (Акр) 8ЕЦ ГО NО:8 и
    р) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 96 (Ьук) по 102 (Акр) 8ЕЦ ГО NО:8, где полипептид вызывает иммунный ответ у животного с продукцией антител; и выделение антител у животного; и где антитела специфически связываются с полипептидом ГЬ-20 (8Еф ГО NО: 8).
  2. (2) введение композиции, содержащей антитело по п.16 в приемлемом фармацевтическом носителе;
    (2) введение композиции, содержащей антитело по п.5 в приемлемом фармацевтическом носителе;
    (2) введение композиции, содержащей антитело по п.3 в приемлемом фармацевтическом носителе;
    2. Способ по п.1, где антитело снижает провоспалительную активность ГЬ-20 (8Еф ГО NО:8).
  3. (3) определение уровня амилоидного белка А в сыворотке после введения;
    (3) определение уровня амилоидного белка А в сыворотке после введения;
    (3) определение уровня амилоидного белка А в сыворотке после введения;
    3. Способ по п.1, где антитело, полученное способом, нейтрализует взаимодействие ЕЬ-20 (8Еф ГО №:8) с ЕЬ-22КА (8ЕО ГО ΝΘ:2).
  4. (4) сравнение уровня амилоидного белка А в сыворотке, определенного на стадии (1), с уровнем амилоидного белка А в сыворотке, определенного на стадии (3), где отсутствие увеличения или снижение уровня сывороточного амилоидного белка А является показателем подавления воспалительного ответа.
    (4) сравнение уровня амилоидного белка А в сыворотке, определенного на стадии (1) с уровнем амилоидного белка А в сыворотке, определенного на стадии (3), где отсутствие увеличения или снижение уровня амилоидного белка А в сыворотке является показателем подавления воспалительного ответа.
    (4) сравнение уровня амилоидного белка А в сыворотке, определенного на стадии (1), с уровнем амилоидного белка А в сыворотке, определенного на стадии (3), где отсутствие увеличения или снижение уровня амилоидного белка А в сыворотке является показателем подавления воспалительного ответа.
    4. Способ по п.3, где нейтрализацию антителом измеряют по нейтрализации ЕЬ-20 (8Еф ГО NО:8) в 1п У1!го клеточном тесте по нейтрализации.
  5. 5. Способ по п.1, где антитело снижает провоспалительную активность как ]Ь-20 (8Еф ГО NО:8), так и ГО-22 (8ЕО ГО МО:6).
  6. 6. Антитело, полученное способом по п.1, где антитело связывается с полипептидом 8ЕЦ ГО NО:8 и где антитело дополнительно содержит водорастворимый полимер.
  7. 7. Антитело по п.2, где антитело представляет собой (а) поликлональное антитело, (Ь) моноклональное антитело мыши, (с) гуманизированное антитело, полученное из (Ь), (б) фрагмент антитела, или (е) моноклональное антитело человека.
    - 102 009124
  8. 8. Антитело по п.2, где антитело дополнительно содержит радионуклид, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу или токсин.
  9. 9. Антитело по п.7, где антитело дополнительно содержит полиэтиленгликоль.
  10. 10. Антитело или фрагмент антитела, которые связываются с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:8, и снижают провоспалительную активность ΙΌ-20 (8Е0 ГО N0:8), где антитело дополнительно содержит водоростворимый полимер.
  11. 11. Антитело или фрагмент антитела по п.10, где антитело или фрагмент антитела снижает провоспалительную активность либо ΙΌ-20 (8Е0 ГО N0:8), либо ΙΌ-22 (8Е0 ГО N0:6).
  12. 12. Антитело или фрагмент антитела по п.10, где антитело или фрагмент антитела представляет собой (а) поликлональное антитело, (Ь) моноклональное антитело мыши, (с) гуманизированное антитело, полученное из (Ь), (б) фрагмент антитела или (е) моноклональное антитело человека.
  13. 13. Антитело или фрагмент антитела по п.10, где антитело или фрагменты антитела дополнительно содержит радионуклид, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу, лекарство или токсин.
  14. 14. Антитело по п.10, где антитело или фрагменты антитела содержит полиэтиленгликоль.
  15. 15. Способ снижения или ингибирования индуцируемой ΙΌ-20 пролиферации или дифференциации гематопоетических клеток и предшественников гематопоетических клеток, в котором предусмотрено культивирование клеток костного мозга или периферической крови с композицией, содержащей количество антитела по п.3, достаточное для снижения пролиферации или дифференциации гематопоетических клеток в костном мозге или клеток периферической крови по сравнению с клетками костного мозга или периферической крови, культивируемыми в отсутствие антитела.
  16. 16. Способ по п.15, где гематопоетические клетки и предшественники гематопоэтических клеток представляют собой лимфоидные клетки.
  17. 17. Способ по п.16, где лимфоидные клетки представляют собой макрофаги или Т-клетки.
  18. 18. Способ снижения индуцируемого ΙΌ-20 воспаления у млекопитающего, в котором предусмотрено введение млекопитающему количества композиции, содержащей антитело по п.3, при котором происходит снижение воспаления.
  19. 19. Способ снижения индуцируемого ΙΌ-20 воспаления у млекопитающего, в котором предусмотрено введение млекопитающему количества композиции, содержащей антитело или фрагмента антитела по п.10, при котором происходит снижение воспаления.
  20. 20. Способ подавления воспалительного ответа у млекопитающего с воспалением, в котором предусмотрено:
  21. 21. Способ подавления воспалительного ответа у млекопитающего с воспалением, в котором предусмотрено:
  22. 22. Способ подавления воспалительного ответа у млекопитающего с воспалением, в котором предусмотрено:
  23. 23. Способ лечения млекопитающего, страдающего воспалительным заболеванием, в котором играет роль ΙΌ-20, в котором предусмотрено введение антагониста млекопитающему,
    - 103 009124 где антагонист содержит антитело, фрагмент антитела или связывающий полипептид, который специфически связывается с полипептидом или фрагментом полипептида Ш-22КА (ЗЕЦ ΙΌ N0:3) или представляет собой полипептид или фрагмент полипептида Ш-22КА (ЗЕЦ ΙΌ N0:3); и где воспалительная активность Ш-20 (ЗЕЦ ΙΌ N0:8) снижается.
  24. 24. Способ по п.23, где заболевание представляет собой хроническое воспалительное заболевание.
  25. 25. Способ по п.24, где хроническое воспалительное заболевание включает воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит, болезнь Крона, артрит, атопический дерматит или псориаз.
  26. 26. Способ по п.23, где болезнь представляет собой острое воспалительное заболевание.
  27. 27. Способ по п.26, где острое воспалительное заболевание включает эндотоксемию, сепсис, синдром токсического шока или инфекционное заболевание.
  28. 28. Способ по п.23, где антитело дополнительно содержит радионуклид, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу, лекарство или токсин.
  29. 29. Антитело, содержащее моноклональное антитело, которое связывается с антигенным эпитопом ΙΕ-20 человека (ЗЕЦ ΙΌ N0:8), выбранным из группы, состоящей из:
    a) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 42 (Не) по 102 (Акр) ЗЕЦ ΙΌ N0:8;
    b) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 42 (Не) по 60 (Не) ЗЕЦ ΙΌ N0:8;
    c) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 42 (Не) по 69 (С1и) ЗЕЦ ΙΌ N0:8;
    б) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 42 (Не) по 81 (Сук) ЗЕЦ Ш N0:8;
    е) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 42 (Не) по 96 (Ьук) ЗЕЦ Ш N0:8;
    ί) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 42 (Не) по 102 (Акр) ЗЕЦ ΙΌ N0:8;
    д) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 60 (Не) по 69 (С1и) ЗЕЦ ΙΌ N0:8;
    Ь) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 60 (Не) по 81 (Сук) ЗЕЦ Ш N0:8; ί) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 60 (Не) по 96 (Ьук) ЗЕЦ ΙΌ N0:8; _)) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 60 (Не) по 102 (Акр) ЗЕЦ ΙΌ N0:8;
    k) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 69 (С1и) по 81 (Сук) ЗЕЦ ΙΌ N0:8;
    l) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 69 (С1и) по 96 (Ьук) ЗЕЦ Ш N0:8;
    т) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 69 (С1и) по 102 (Акр) ЗЕЦ ΙΌ N0:8;
    п) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 81 (Сук) по 96 (Ьук) ЗЕЦ Ш N0:8;
    о) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 81 (Сук) по 102 (Акр) ЗЕЦ ΙΌ N0:8 и
    р) полипептида, состоящего из аминокислотных остатков с 96 (Ьук) по 102 (Акр) ЗЕЦ ΙΌ N0:8, где антитело снижает или нейтрализует активность Ш-20 человека (ЗЕЦ ΙΌ N0:8).
  30. 30. Антитело по п.29, где антитело снижает или нейтрализует активность Ш-20 человека (ЗЕЦ ΙΌ N0:8).
  31. 31. Антитело по п.29, где антитело выбрано из группы, состоящей из (а) моноклонального антитела мыши, (Ь) гуманизированного антитела, полученного из (а), (с) фрагмента антитела и (б) моноклонального антитела человека.
  32. 32. Антитело по п.30, где антитело дополнительно содержит полиэтиленгликоль.
  33. 33. Антитело по п.30, где антитело выбрано из группы, состоящей из (а) моноклонального антитела мыши, (Ь) гуманизированного антитела, полученного из (а), (с) фрагмента антитела и (б) моноклонального антитела человека.
  34. 34. Антитело по п.33, где антитело дополнительно содержит полиэтиленгликоль.
  35. 35. Способ лечения патологического состояния у индивидуума, связанного с активностью Ш-20, в котором предусмотрено введение эффективного количества антитела по п.29, которое оказывает лечебное воздействие на указанное патологическое состояние.
  36. 36. Способ по п.35, где указанное патологическое состояние представляет собой хроническое воспалительное состояние.
  37. 37. Способ по п.36, где указанное хроническое воспалительное состояние включает воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит, болезнь Крона, артрит, атопический дерматит или псориаз.
  38. 38. Способ по п.36, где указанное патологическое состояние представляет собой острое воспалительное состояние.
  39. 39. Способ по п.38, где указанное острое воспалительное состояние включает эндотоксемию, сепсис, синдром токсического шока или инфекционное заболевание.
EA200501506A 2003-03-24 2004-03-24 Антитела против il-20 и связывающие партнеры, а также способы их применения при воспалении EA009124B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US45748103P 2003-03-24 2003-03-24
US52329503P 2003-11-17 2003-11-17
PCT/US2004/008955 WO2004085475A2 (en) 2003-03-24 2004-03-24 Anti-il-20 antibodies and binding partners and methods of using in inflammation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200501506A1 EA200501506A1 (ru) 2006-06-30
EA009124B1 true EA009124B1 (ru) 2007-10-26

Family

ID=33101289

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200501506A EA009124B1 (ru) 2003-03-24 2004-03-24 Антитела против il-20 и связывающие партнеры, а также способы их применения при воспалении
EA200501505A EA009026B1 (ru) 2003-03-24 2004-03-24 Антитела против il-22ra, их партнеры по связыванию и способы их применения при воспалениях

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200501505A EA009026B1 (ru) 2003-03-24 2004-03-24 Антитела против il-22ra, их партнеры по связыванию и способы их применения при воспалениях

Country Status (16)

Country Link
US (6) US20040209330A1 (ru)
EP (2) EP1606317B1 (ru)
JP (2) JP2007525438A (ru)
KR (3) KR20050116392A (ru)
CN (2) CN102690350A (ru)
AT (1) ATE475673T1 (ru)
AU (2) AU2004223837C1 (ru)
BR (2) BRPI0408683A (ru)
CA (2) CA2519089C (ru)
DE (1) DE602004028347D1 (ru)
DK (1) DK1606317T3 (ru)
EA (2) EA009124B1 (ru)
ES (1) ES2347657T3 (ru)
MX (2) MXPA05010136A (ru)
NO (1) NO20054892L (ru)
WO (2) WO2004085476A2 (ru)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5965704A (en) * 1997-08-05 1999-10-12 Zymogenetics, Inc. Class two cytokine receptor-11
US6610286B2 (en) 1999-12-23 2003-08-26 Zymogenetics, Inc. Method for treating inflammation using soluble receptors to interleukin-20
AU2001290524A1 (en) 2000-08-08 2002-02-18 Zymogenetics Inc. Soluble zcytor 11 cytokine receptors
ATE333888T1 (de) 2000-09-15 2006-08-15 Zymogenetics Inc Verwendung eines polypeptids, welches die extrazelluläre domäne von il-20ra und il-20rb enthält, zur behandlung von entzündungen
JP4532902B2 (ja) 2001-12-17 2010-08-25 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド 子宮頸部癌の治療方法
WO2004085476A2 (en) * 2003-03-24 2004-10-07 Zymogenetics, Inc. Anti-il-22ra antibodies and binding partners and methods of using in inflammation
ES2334140T3 (es) 2003-11-21 2010-03-05 Zymogenetics, Inc. Anticuerpos anti-il-20 y componentes de union y procedimiento de uso en antiinflamacion.
AU2005296064A1 (en) * 2004-10-04 2006-04-27 Trinity Biosystems, Inc. Methods and compositions for needleless delivery of macromolecules
EP1812476B1 (en) * 2004-10-22 2010-07-21 ZymoGenetics, Inc. Anti-il-22ra antibodies and binding partners and methods of using in inflammation
CN100515491C (zh) * 2005-01-04 2009-07-22 健能隆医药技术（上海）有限公司 白介素-22的医药用途
EP1856156A2 (en) * 2005-02-08 2007-11-21 ZymoGenetics, Inc. Anti-il-20, anti-il-22 and anti-il-22ra antibodies and binding partners and methods of using in inflammation
CN105859886A (zh) * 2005-12-02 2016-08-17 健泰科生物技术公司 牵涉与il-22和il-22r结合的抗体的组合物和方法
CA2631952A1 (en) * 2005-12-05 2007-06-14 Trinity Biosystems, Inc. Methods and compositions for needleless delivery of antibodies
US20070148131A1 (en) * 2005-12-05 2007-06-28 Trinity Biosystems, Inc. Methods and compositions for needleless delivery of binding partners
EP1969008A4 (en) * 2005-12-22 2009-08-12 Dhy & Co Ltd ANTIBODIES TO INTERLEUKIN-22 BINDING PROTEIN AND ITS APPLICATIONS IN THE TREATMENT OF METABOLISM DISORDERS
US20090305978A1 (en) * 2006-03-16 2009-12-10 Trinity Biosystems, Inc. Methods for increasing the size of animals using needleless delivery constructs
JP5624276B2 (ja) 2006-03-31 2014-11-12 中外製薬株式会社 抗体の血中動態を制御する方法
AR061317A1 (es) 2006-06-08 2008-08-20 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agentes para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias
US20090092660A1 (en) * 2006-08-09 2009-04-09 Trinity Biosystems, Inc. Methods and compositions for needleless delivery of particles
KR102225009B1 (ko) 2007-09-26 2021-03-08 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항체 정상영역 개변체
JP5334319B2 (ja) 2007-09-26 2013-11-06 中外製薬株式会社 Ｃｄｒのアミノ酸置換により抗体の等電点を改変する方法
TWI441649B (zh) 2007-12-05 2014-06-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Use of anti-NR10 monoclonal antibody with neutralizing activity against NR10 in the manufacture of prophylactic or therapeutic agents for pruritus
BRPI0821110B8 (pt) 2007-12-05 2021-05-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd anticorpo de neutralização de anti-nr10/il31ra, composição farmacêutica compreendendo o referido anticorpo e uso do mesmo
KR20220162801A (ko) 2008-04-11 2022-12-08 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
EP2297203A1 (en) * 2008-06-30 2011-03-23 Novo Nordisk A/S Anti-human interleukin-20 antibodies
JP2010210772A (ja) * 2009-03-13 2010-09-24 Dainippon Screen Mfg Co Ltd 液晶表示装置の製造方法
EP2409990A4 (en) 2009-03-19 2013-01-23 Chugai Pharmaceutical Co Ltd VARIANT OF A CONSTANT ANTIBODY REGION
EP2409991B1 (en) 2009-03-19 2017-05-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
US8454956B2 (en) 2009-08-31 2013-06-04 National Cheng Kung University Methods for treating rheumatoid arthritis and osteoporosis with anti-IL-20 antibodies
EP2647706B1 (en) 2010-11-30 2023-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
HUE039849T2 (hu) 2011-03-16 2019-02-28 Argenx Bvba CD70 elleni ellenanyagok
CN104302780B (zh) * 2011-08-05 2017-04-12 艾克斯-马赛大学 纤维变性易感性il22ra2基因及其用途
US8597647B1 (en) * 2012-05-22 2013-12-03 National Cheng Kung University Humanized anti-IL-20 antibody and uses thereof
WO2014006230A1 (en) * 2012-07-06 2014-01-09 Novo Nordisk A/S Il-20 epitopes and il-20 ligands
US9221904B2 (en) 2012-07-19 2015-12-29 National Cheng Kung University Treatment of osteoarthritis using IL-20 antagonists
US8852588B2 (en) 2012-08-07 2014-10-07 National Cheng Kung University Treating allergic airway disorders using anti-IL-20 receptor antibodies
US8603470B1 (en) 2012-08-07 2013-12-10 National Cheng Kung University Use of IL-20 antagonists for treating liver diseases
WO2014033252A1 (en) * 2012-08-31 2014-03-06 arGEN-X BV Method for producing antibody molecules having inter-species, intra-target cross-reactivity
US10391168B1 (en) 2014-08-22 2019-08-27 University Of Bern Anti-CD70 combination therapy
RU2683020C2 (ru) * 2014-11-11 2019-03-26 Петр Иванович Никитин Субстанция и способ для модуляции активности агента в организме
BR112017022101A2 (pt) 2015-04-14 2018-07-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha composição farmacêutica para prevenção e/ou tratamento de dermatite atópica contendo antagonista de il-31 como ingrediente ativo
CN105601739B (zh) * 2016-02-22 2019-01-18 王晨辉 一种人源化抗白介素22基因工程抗体及其应用
EP3464357A1 (en) 2016-05-24 2019-04-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of pulmonary bacterial infections
GB201612337D0 (en) 2016-07-15 2016-08-31 Argen-X N V Ant-il-22r antibodies
JOP20190155A1 (ar) 2016-12-21 2019-06-23 Novartis Ag مترافقات عقار جسم مضاد لإزالة خلايا جذعية مكونة للدم
WO2020210816A1 (en) * 2019-04-12 2020-10-15 Methodist Hospital Research Institute Therapeutic particles that enable antigen presenting cells to attack cancer cells
KR102517872B1 (ko) * 2019-06-12 2023-04-05 (주)아큐레시스바이오 암의 예방 또는 치료용 조성물
AR120512A1 (es) 2019-11-20 2022-02-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulaciones que contienen anticuerpos

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999027103A1 (en) * 1997-11-26 1999-06-03 Zymogenetics, Inc. Mammalian cytokine-like polypeptide-10
WO2001046261A1 (en) * 1999-12-23 2001-06-28 Zymogenetics, Inc. Method for treating inflammation
WO2002070001A2 (en) * 2001-02-28 2002-09-12 Eli Lilly And Company Use of lp82 to treat hematopoietic disorders
WO2002072607A2 (en) * 2001-03-09 2002-09-19 Zymogenetics, Inc. Soluble heterodimeric cytokine receptor

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3654090A (en) * 1968-09-24 1972-04-04 Organon Method for the determination of antigens and antibodies
US4331647A (en) * 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
NZ212437A (en) * 1985-06-17 1992-06-25 Mark Philip Best Site-directed antibody conjugates, and their preparation
WO1989004838A1 (en) * 1987-11-25 1989-06-01 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US5567584A (en) * 1988-01-22 1996-10-22 Zymogenetics, Inc. Methods of using biologically active dimerized polypeptide fusions to detect PDGF
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5436155A (en) * 1991-12-31 1995-07-25 Arch Development Corporation Isolated DNA encoding a somatostatin receptor
US5789192A (en) * 1992-12-10 1998-08-04 Schering Corporation Mammalian receptors for interleukin-10 (IL-10)
ATE203274T1 (de) 1994-02-01 2001-08-15 Nasa Fusionierte proteine die antikörper-teile und nicht-antikörper-teile enthalten
JP3713074B2 (ja) * 1995-08-30 2005-11-02 栄研化学株式会社 血清アミロイドａを認識するモノクローナル抗体
US5843697A (en) 1996-07-17 1998-12-01 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Cells expressing IL-10 receptor and the CRFB4 gene product, an IL-10 receptor accessory protein
US5985614A (en) * 1996-08-30 1999-11-16 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides encoding interleukin-19
US5945511A (en) * 1997-02-20 1999-08-31 Zymogenetics, Inc. Class II cytokine receptor
US6133426A (en) * 1997-02-21 2000-10-17 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US6486301B1 (en) * 1997-07-16 2002-11-26 Human Genome Sciences, Inc. Interleukin-20
WO1999003982A1 (en) 1997-07-16 1999-01-28 Human Genome Sciences, Inc. Interleukin-20
KR100236609B1 (ko) * 1997-08-01 2000-02-01 박호군 클로로하이드로실란 유도체 및 이의 제조방법
US5965704A (en) * 1997-08-05 1999-10-12 Zymogenetics, Inc. Class two cytokine receptor-11
US6020163A (en) * 1997-08-06 2000-02-01 Zymogenetics, Inc. Lipocalin homolog
US6551799B2 (en) * 1999-12-07 2003-04-22 Genentech, Inc. Interleukin-22 polypeptides, nucleic acids encoding the same and methods for the treatment of pancreatic disorders
US6576743B1 (en) * 1997-11-26 2003-06-10 Zymogenetics, Inc. Mammalian cytokine-like polypeptide-10
EP1047781B1 (en) 1998-01-23 2004-07-28 Immunex Corporation Il-18 receptors
EP1062332A2 (en) 1998-03-09 2000-12-27 Schering Corporation Human receptor proteins; related reagents and methods
ES2312205T3 (es) 1998-03-10 2009-02-16 Genentech, Inc. Nuevo polipeptido y acidos nucleicos que lo codifican.
US6197582B1 (en) * 1998-03-18 2001-03-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Development of human monoclonal antibodies and uses thereof
US6982320B2 (en) 1998-03-19 2006-01-03 Human Genome Sciences, Inc. Cytokine receptor common gamma chain like
WO1999061630A2 (en) 1998-05-26 1999-12-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Chimeric molecules comprising an extracellular ligand binding domain of a receptor and an ige fc or constant region, and their use in an assay system
CA2339043A1 (en) 1998-09-01 2000-03-09 Genentech, Inc. Further pro polypeptides and sequences thereof
US6274710B1 (en) * 1998-10-26 2001-08-14 Ludwig Institute For Cancer Research Antibodies which specifically bind T Cell inducible factors (TIFs)
US6331613B1 (en) 1998-10-26 2001-12-18 Ludwig Institue For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules which encode T cell inducible factors (TIFS), the proteins encoded, and uses thereof
WO2000039161A1 (en) 1998-12-31 2000-07-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Class ii cytokine receptor-like proteins and nucleic acids encoding them
CA2367965C (en) 1999-04-28 2015-12-01 Kenneth Jacobs Human gil-19/ae289 proteins and polynucleotides encoding same
CA2373231A1 (en) 1999-05-19 2000-11-23 Incyte Genomics, Inc. Extracellular signaling molecules
AU5047600A (en) 1999-05-27 2000-12-18 Schering Corporation Mammalian interleukin-10 homologs: il-d110 and il-d210
CA2372511C (en) 1999-06-15 2011-11-22 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU2883700A (en) 1999-06-23 2001-01-09 Genentech Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
CA2378519C (en) 1999-07-07 2011-01-25 Zymogenetics, Inc. Human cytokine receptor
JP3951035B2 (ja) 1999-09-01 2007-08-01 ジェネンテック・インコーポレーテッド 分泌及び膜貫通ポリペプチドとそれをコードしている核酸
AU1919201A (en) 1999-11-18 2001-05-30 Schering Corporation Mammalian receptor proteins; related reagents and methods
AU2253301A (en) 1999-12-03 2001-06-12 Zymogenetics Inc. Human cytokine receptor
EP1242600B1 (en) 1999-12-23 2010-03-03 ZymoGenetics, Inc. Cytokine zcyto18
US6610286B2 (en) * 1999-12-23 2003-08-26 Zymogenetics, Inc. Method for treating inflammation using soluble receptors to interleukin-20
UA84830C2 (ru) 1999-12-23 2008-12-10 Займодженетікс, Інк. Растворимый рецептор интерлейкина-20
NZ523122A (en) 2000-06-22 2004-06-25 Smithkline Beecham Corp Polypeptides and polynucleotides and methods of identifying agonists and antagonists in relation to treatment of diseases
JP2002015498A (ja) * 2000-06-29 2002-01-18 Fujitsu Ltd センス電流の設定方法
AU2001290524A1 (en) * 2000-08-08 2002-02-18 Zymogenetics Inc. Soluble zcytor 11 cytokine receptors
MXPA03002049A (es) 2000-09-08 2003-07-24 Schering Corp Genes de mamiferos: reactivos y metodos relacionados.
ATE333888T1 (de) * 2000-09-15 2006-08-15 Zymogenetics Inc Verwendung eines polypeptids, welches die extrazelluläre domäne von il-20ra und il-20rb enthält, zur behandlung von entzündungen
US7268223B2 (en) 2000-09-22 2007-09-11 Wyeth Isolated nucleic acid molecules which encode a soluble IL-TIF receptor or binding protein which binds to IL-TIF/IL-22, and uses thereof
US20030022827A1 (en) * 2000-09-25 2003-01-30 Bertram Weiss Three new members of the cytokine receptor family class 2
US7176180B2 (en) 2001-01-12 2007-02-13 Wyeth Type 2 cytokine receptor and nucleic acids encoding same
WO2002058724A2 (en) 2001-01-26 2002-08-01 Eli Lilly And Company Use of lp82 to treat body weight disorders
CA2438238A1 (en) 2001-02-23 2002-09-06 Genetics Institute, Llc. Composition comprising il-22 inhibitors and use thereof for treating inflammatory disorders
CA2439636A1 (en) * 2001-03-02 2002-09-12 Zymogenetics, Inc. Mouse cytokine receptor
WO2002077174A2 (en) 2001-03-27 2002-10-03 Zymogenetics, Inc. Human cytokine receptor
US7589180B2 (en) * 2001-05-11 2009-09-15 Abbott Laboratories Inc. Specific binding proteins and uses thereof
WO2003035096A1 (en) 2001-10-22 2003-05-01 Eli Lilly And Company Soluble proteins that inhibit cytokine signal transduction pathways
DE10154579A1 (de) 2001-11-07 2003-05-28 Medigene Ag Topikale Verwendung von Cytokinen und Chemokinen zur Behandlung von viralen oder mykotischen Hauterkrankungen oder Tumorerkrankungen
JP4532902B2 (ja) 2001-12-17 2010-08-25 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド 子宮頸部癌の治療方法
US20040236075A1 (en) * 2002-07-24 2004-11-25 Laure Dumoutier Novel glass II cytokine receptors, and uses thereof
CN1845937A (zh) * 2003-03-24 2006-10-11 津莫吉尼蒂克斯公司 抗il－20抗体和结合伴侣以及在炎症中的使用方法
WO2004085476A2 (en) * 2003-03-24 2004-10-07 Zymogenetics, Inc. Anti-il-22ra antibodies and binding partners and methods of using in inflammation
ES2334140T3 (es) * 2003-11-21 2010-03-05 Zymogenetics, Inc. Anticuerpos anti-il-20 y componentes de union y procedimiento de uso en antiinflamacion.
EP1812476B1 (en) * 2004-10-22 2010-07-21 ZymoGenetics, Inc. Anti-il-22ra antibodies and binding partners and methods of using in inflammation

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999027103A1 (en) * 1997-11-26 1999-06-03 Zymogenetics, Inc. Mammalian cytokine-like polypeptide-10
WO2001046261A1 (en) * 1999-12-23 2001-06-28 Zymogenetics, Inc. Method for treating inflammation
WO2002070001A2 (en) * 2001-02-28 2002-09-12 Eli Lilly And Company Use of lp82 to treat hematopoietic disorders
WO2002072607A2 (en) * 2001-03-09 2002-09-19 Zymogenetics, Inc. Soluble heterodimeric cytokine receptor

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLUMBERG HAL ET AL.: "Interleukin 20: Discovery, receptor identification, and role in epidermal function" CELL, vol. 104, no. 1, 12 January 2001 (2001-01-12), pages 9-19, XP002311902 ISSN: 0092-8674 *
KOTENKO SERGEI V: "The family of IL-10-related cytokines and their receptors: Related, but to what extent?" CYTOKINE AND GROWTH FACTOR REVIEWS, OXFORD, GB, vol. 13, no. 3, June 2002 (2002-06), pages 223-240, XP002307631 ISSN: 1359-6101 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2004223837B2 (en) 2011-04-21
JP2007525438A (ja) 2007-09-06
CN103864934A (zh) 2014-06-18
DE602004028347D1 (de) 2010-09-09
US20040209330A1 (en) 2004-10-21
ES2347657T3 (es) 2010-11-03
NO20054892D0 (no) 2005-10-21
JP2007525437A (ja) 2007-09-06
AU2004223836A2 (en) 2004-10-07
WO2004085475A2 (en) 2004-10-07
EA200501506A1 (ru) 2006-06-30
AU2004223837C1 (en) 2012-03-15
BRPI0408683A (pt) 2006-03-28
AU2004223837A1 (en) 2004-10-07
EP1606316A2 (en) 2005-12-21
EP1606317A2 (en) 2005-12-21
KR20050116392A (ko) 2005-12-12
AU2004223836A1 (en) 2004-10-07
KR20050116390A (ko) 2005-12-12
EA009026B1 (ru) 2007-10-26
US20080233115A1 (en) 2008-09-25
CN102690350A (zh) 2012-09-26
US20100111948A1 (en) 2010-05-06
KR20110091598A (ko) 2011-08-11
US8163286B2 (en) 2012-04-24
DK1606317T3 (da) 2010-10-25
MXPA05010136A (es) 2005-11-16
EA200501505A1 (ru) 2006-06-30
WO2004085475A3 (en) 2005-07-14
CA2519089C (en) 2014-12-23
WO2004085476A2 (en) 2004-10-07
EP1606317B1 (en) 2010-07-28
CA2519089A1 (en) 2004-10-07
AU2004223837A2 (en) 2004-10-07
CA2519057A1 (en) 2004-10-07
US20060134756A1 (en) 2006-06-22
US20120207761A1 (en) 2012-08-16
ATE475673T1 (de) 2010-08-15
MXPA05010134A (es) 2005-11-16
WO2004085476A3 (en) 2005-03-31
US20090074661A1 (en) 2009-03-19
BRPI0408705A (pt) 2006-03-07
NO20054892L (no) 2005-12-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA009124B1 (ru) Антитела против il-20 и связывающие партнеры, а также способы их применения при воспалении
ES2334140T3 (es) Anticuerpos anti-il-20 y componentes de union y procedimiento de uso en antiinflamacion.
EA015706B1 (ru) Моноклональное антитело или его фрагмент, связывающиеся с полипептидом il-22ra, гуманизированное антитело, полученное из указанного антитела, гибридомы, продуцирующие антитело, и применение указанного антитела
ES2307594T3 (es) Agentes de union selectivos a antigenos de la proteina de union a osteoprotegerina.
ES2391334T3 (es) Anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a la IL-1beta
JP4504023B2 (ja) 抗ｉｌ−ｔｉｆ抗体および炎症において使用する方法
ES2353637T3 (es) Moléculas denominadas ldcam.
UA125382C2 (uk) Антитіла проти людського vista та їх застосування
EA010594B1 (ru) Слитые белки taci-иммуноглобулина
EA015351B1 (ru) Антагонисты il-17a и il-17f и способы их применения
CN107683289A (zh) IL13RAα2结合剂和其在癌症治疗中的用途
JP2001526532A (ja) オステオプロテゲリン結合性蛋白および受容体
EA019636B1 (ru) Связывающие белки, включающие антитела, производные антител и фрагменты антител, которые специфически связываются с cd154, и их применения
HU230399B1 (hu) Egy tumornekrózis-faktorral rokon apoptózis-indukáló ligandum receptorára specifikus antitest és alkalmazásai
Körner et al. Unimpaired autoreactive T-cell traffic within the central nervous system during tumor necrosis factor receptor-mediated inhibition of experimental autoimmune encephalomyelitis.
JP5368400B2 (ja) Ｋｉｍ−１アンタゴニストおよび免疫系を調節するための使用
JP2009183289A (ja) ヒトサイトカイン受容体
Ågren et al. The ADP-ribosylating CTA1-DD adjuvant enhances T cell-dependent and independent responses by direct action on B cells involving anti-apoptotic Bcl-2-and germinal center-promoting effects
JP2008532931A (ja) 抗ｉｌ−２０、抗ｉｌ−２２および抗ｉｌ−２２ｒａ抗体ならびに結合パートナー、ならびに炎症における使用法
CN110461879A (zh) 抗因子d抗体及其用途
JP2000502569A (ja) Ｏｂタンパク質レセプター及び関連組成物と関連方法
JP2008516985A (ja) 可溶性ｚｃｙｔｏｒ２１、抗ｚｃｙｔｏｒ２１抗体及び結合パートナー、並びに炎症における使用方法
JP4897690B2 (ja) 補体関連障害の予防および処置のためのＣＲＩｇポリペプチド
CN1798768B (zh) 抗il-22ra抗体和结合伴侣及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU