EA015706B1 - Моноклональное антитело или его фрагмент, связывающиеся с полипептидом il-22ra, гуманизированное антитело, полученное из указанного антитела, гибридомы, продуцирующие антитело, и применение указанного антитела - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к антителам против IL-22RA и их антигенсвязывающим фрагментам, а также к способам антагонистического воздействия на IL-22 или IL-20 и IL-22 с использованием таких антител и их фрагментов.

Description

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США № 60/621553, поданной 22 октября 2004 г., которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.

Уровень техники

Цитокины являются растворимыми низкомолекулярными белками, которые опосредуют различные биологические процессы, в том числе регуляцию роста и дифференцировку большого числа типов клеток (см., например, публикации Ага1 е! а1., Аппи. Реу. Вюсйет. 59:783 (1990); Мовтапп, Сигг. Θρίη. 1ттипо1. 3:311 (1991); Раи1 апб 8ебег, Се11 76:241 (1994)). Белки, составляющие группу цитокинов, включают интерлейкины, интерфероны, колониестимулирующие факторы, факторы некроза опухолей и другие регуляторные молекулы. Например, интерлейкин-17 человека является цитокином, который стимулирует экспрессию интерлейкина-6, молекул внутриклеточной адгезии 1, интерлейкина-8, колониестимулирующего фактора гранулоцитарных макрофагов и экспрессию простагландина Е2, а также участвует в селективном созревании гемопоэтических СО34+ клеток-предшественников в нейтрофилы (Уао е! а1., 1. 1ттипо1. 155:5483 (1995); Εοδδοζ е! а1., 1. Εχρ. Меб. 183:2593 (1996)).

Рецепторы, связывающие цитокины, обычно состоят из одного или нескольких интегральных белков мембраны, которые связывают цитокин с высоким сродством и передают сигнал связывания клетке через цитоплазматические части определенных субъединиц рецептора. Рецепторы цитокинов распределены в несколько классов на основании сходства их внеклеточных лигандсвязывающих доменов. Например, рецепторы, участвующие в связывании и/или передаче сигнала интерферонов, относятся к семейству рецепторов цитокинов класса II на основании характерного внеклеточного домена, состоящего из 200 остатков.

Продемонстрированная ш νί\Ό активность цитокинов и их рецепторов указывает на возможность клинического применения указанных веществ и потребность в других цитокинах, рецепторах цитокинов, агонистах цитокинов и антагонистах цитокинов. Например, показанная ш у|уо активность семейства провоспалительных цитокинов свидетельствуют об их большом клиническом потенциале и необходимости в антагонистах провоспалительных молекул. Целью настоящего изобретения является удовлетворение потребности в антагонистах провоспалительных цитокинов Ш-20 и Ш-22. Антагонисты по настоящему изобретению, способные блокировать, ингибировать, ослаблять, оказывать антагонистическое действие или нейтрализовать активность 1Б-22. 1Б-20 или 1Б-20 и 1Б-22 вместе, включают растворимые рецепторы Ш-22К.А и нейтрализующие антитела против Ш-22К.А. Настоящее изобретение также относится к применению указанных веществ при лечении воспалительных заболеваний, а также к композициям и способам их получения.

Подробное описание изобретения

1. Краткий обзор.

Наряду с другими изобретениями настоящее изобретение относится к новому применению растворимого рецептора, обозначенного 2су1ог11 или 1Е-22ВА, и нейтрализующих антител к рецепторам цитокинов Ш-22К.А. Настоящее изобретение относится также к фрагментам растворимого полипептида Ш-22К.А и слитым белкам, к их применению при лечении воспалительных и аутоиммунных заболеваний человека. Антитела против Ш-22К.А и растворимые рецепторы 1Б-22ВА по настоящему изобретению, в том числе нейтрализующие антитела против Ш-22К.А по настоящему изобретению, могут быть использованы для блокирования, ингибирования, ослабления, антагонистического воздействия или нейтрализации активности Ш-22 или 1Б-20 либо одновременно 1Б-20 и 1Б-22 при лечении специфических заболеваний человека, таких как псориаз, псориатический артрит, артрит, эндотоксемия, воспалительное заболевание кишечника (ΙΒΌ), колит и другие воспалительные состояния, раскрытые в настоящем описании изобретения.

Иллюстративная нуклеотидная последовательность, кодирующая 2су1ог11 (1Ь-22ВА), показана в 8ЕС Ш N0: 1; кодируемый полипептид показан в 8ЕС Ш N0: 2. Ш-22К.А является субъединицей рецептора как Ш-20, так и Ш-22. 2су(ог 11 (Ш-22К.А) описан в патенте США № 5965704, публикации \У1Р0 XV 0 02/12345 и публикации \У1Р0 XV0 02/072607, находящихся в свободном доступе. Анализ клона кДНК человека, кодирующей 1Б-22ВА (8ЕС ΙΌ N0: 1), позволил выявить открытую рамку считывания, кодирующую 574 аминокислоты (8ЕС ΙΌ N0: 2), которая содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, состоящий примерно из 211 аминокислотных остатков (остатки 18-228 8ЕС ΙΌ N0: 2; 8ЕС ΙΌ N0: 3), трансмембранный домен, состоящий примерно из 23 аминокислотных остатков (остатки 229-251 8ЕС ΙΌ N0: 2), и внутриклеточный домен, состоящий примерно из 313 аминокислотных остатков (остатки 252-574 8ЕС ΙΌ N0: 2). Таким образом, молекулы по настоящему изобретению включают полипептиды, содержащие цитокинсвязывающий домен с аминокислотными остатками 18-228 8ЕС ΙΌ N0: 2; 8ЕС Ш N0: 3. В одном из вариантов осуществления изобретения растворимый рецептор Ш-22К. по настоящему изобретению слит с константной областью тяжелой цепи (характерная последовательность представлена в 8ЕС ΙΌ N0: 4). Специалистам в данной области должно быть понятно, что границы указанных доменов являются приблизительными. Возможна делеция остатков у концов доменов.

Как будет описано ниже, настоящее изобретение относится к выделенным полипептидам, содер

- 1 015706 жащим аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 70%, по крайней мере на 80%, по крайней мере на 90% или более чем на 95%, в частности на 96, 97, 98, 99% или более идентична эталонной аминокислотной последовательности, состоящей из 18-228 остатков 8ЕО ГО N0: 2, которая также показана как 8Е0 ГО N0: 3, где выделенный полипептид специфически связывается с антителом, которое специфически связывается с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 3. Иллюстративными полипептидами являются полипептиды, содержащие аминокислотные остатки 8Е0 ГО N0: 2 или аминокислотные остатки 8Е0 ГО N0: 3. Кроме того, настоящее изобретение относится к вышеописанным выделенным полипептидам, которые связывают 1Ь-22 (например, полипептидная последовательность 1Ь-22 человека, показанная в 8Е0 ГО N0: 6). Полинуклеотидная последовательность 1Ь-22 человека представлена в 8Е0 ГО N0: 5. Полинуклеотидная последовательность 1Ь-22 мыши представлена в 8Е0 ГО N0: 10, и соответствующий полипептид представлен в 8Е0 ГО N0: 11. Настоящее изобретение относится также к вышеописанным выделенным полипептидам, связывающим 1Ь-20 (например, полипептидная последовательность 1Ь-20 человека, представленная в 8Е0 ГО N0: 8; публикация \У1Р0 № \У0 99/27103). Полинуклеотидная последовательность 1Ь-20 человека представлена в 8ЕО ГО N0: 7.

Настоящее изобретение относится также к выделенным полипептидам и антигенным детерминантам, содержащим по крайней мере 15 последовательных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 3. Иллюстративными полипептидами являются полипептиды, которые содержат 8Е0 ГО N0: 3, ее антигенную детерминанту или функциональные фрагменты, связывающие ГЕ20 или ГЬ-22. Кроме того, настоящее изобретение относится к вышеописанным выделенным полипептидам, которые связывают, блокируют, ингибируют, ослабляют, оказывают антагонистическое действие или нейтрализуют активность ГЬ-22 или ГЬ-20.

Настоящее изобретение относится также к вариантным полипептидам ГЬ-22КА, в которых аминокислотная последовательность идентична аминокислотным остаткам 8Е0 ГО N0: 3, выбранным из группы аминокислотных остатков, обладающих по крайней мере 70% идентичностью, по крайней мере 80% идентичностью, по крайней мере 90% идентичностью, по крайней мере 95% идентичностью или более чем 95% идентичностью, в частности, 96, 97, 98, 99% или более высокой идентичностью, при этом любое различие между аминокислотной последовательностью вариантного полипептида и соответствующей аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0: 3 представляет собой одну или несколько замен консервативных аминокислот. Такие замены консервативных аминокислот рассмотрены в настоящем описании изобретения. Кроме того, настоящее изобретение относится к вышеописанным выделенным полипептидам, которые связывают, блокируют, ингибируют, ослабляют, оказывают антагонистическое действие или нейтрализуют активность ГЬ-22 или ГЬ-20.

Настоящее изобретение также относится к антителам и фрагментам антител, которые специфически связываются с такими полипептидами. Характерные антитела включают нейтрализующие антитела, поликлональные антитела, моноклональные антитела мыши, гуманизированные антитела, выделенные из моноклональных антител мыши, и моноклональные антитела человека. Иллюстративные фрагменты антител включают Т(аЬ')₂, Т(аЬ)₂, ТаЬ', ТаЬ, Τν, зсТу и минимальные распознающие единицы. Нейтрализующие антитела предпочтительно связывают ГЬ-22КА и, таким образом, блокируют, ингибируют, ослабляют, антагонистически воздействуют или нейтрализуют взаимодействия ГЬ-20 и ГЬ-22 с ГЬ-22КА; в объем настоящего изобретения входят также нейтрализующие антитела против ГЬ-22КА, которые блокируют, ингибируют, ослабляют, оказывают антагонистическое действие или нейтрализуют связывание ГЬ20 или ГЬ-22 с ГЬ-22КА. То есть нейтрализующие антитела против ГЬ-22КА по настоящему изобретению могут связывать, блокировать, ингибировать, ослаблять, оказывать антагонистическое действие или нейтрализовать ГЬ-20 или ГЬ-22, либо одновременно связывать, блокировать, ингибировать, ослаблять, оказывать антагонистическое действие или нейтрализовать ГЬ-20 и ГЬ-22. Настоящее изобретение, кроме того, относится к композициям, содержащим носитель и пептид, полипептид или антитело, раскрытые в настоящем описании изобретения.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим фармацевтически приемлемый носитель и по крайней мере один экспрессирующий вектор или рекомбинантный вирус, содержащий такой экспрессирующий вектор. Настоящее изобретение далее относится к фармацевтическим композициям, содержащим фармацевтически приемлемый носитель и полипептид или антитело, раскрытые в настоящем описании изобретения.

Настоящее изобретение также относится к антиидиотипическим антителам или фрагментам антиидиотипических антител, специфически связывающим антитело или фрагмент антитела, которые специфически связывают полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:3 или ее фрагмент. Характерное антиидиотипическое антитело связывается с антителом, которое специфически связывает полипептид с последовательностью 8Е0 ГО N0: 3.

Настоящее изобретение относится также к слитым белкам, содержащим полипептид ГЬ-22КА и часть молекулы иммуноглобулина. В таких слитых белках часть молекулы иммуноглобулина может быть константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина, такой как Тс-фрагмент человека. Настоящее изобретение, кроме того, относится к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим

- 2 015706 такие слитые белки.

Настоящее изобретение также относится к поликлональным и моноклональным антителам, которые связываются с полипептидами, содержащими внеклеточный домен 1Б-22ЕА, такими как мономерные, гомодимерные, гетеродимерные и мультимерные рецепторы, включающие растворимые рецепторы. Кроме того, такие антитела можно использовать для антагонистического воздействия на связывание лигандов 1Б-22ЕА, 1Б-22 (8ЕО ГО N0: 6) и ГО-20 (8Е0 ГО N0: 8) отдельно или вместе с рецептором 1Ь22ЕА.

Кроме того, в образцах кожи человека, пораженной псориазом и атопическим дерматитом, была выявлена сверхэкспрессия или повышенная активность 1Ь-22 и 1Ь-20, из чего следует, что ГО-22, подобно ГО-20, также вовлечен в патогенез псориаза, атопического дерматита и других воспалительных заболеваний кожи и эпителиальных тканей человека. Как описано в настоящем изобретении, сверхэкспрессия ГО20 или 1Ь-22 у трансгенных мышей вызывала утолщение эпидермиса и появление иммунокомпетентных клеток, характерных для псориатического фенотипа; и, кроме того, введение инъекции ГО-22 здоровым мышам вызывало утолщение эпидермиса и появление иммунокомпетентных клеток, характерных для псориатического фенотипа, при этом указанные симптомы были устранены антагонистом растворимого рецептора ГО-22ЕА2 (хсу1ог16; публикация \У1Р0 № \У0 01/40467). Данные, полученные ίη νίνο, позволяют предположить, что провоспалительный цитокин ГО-22 участвует в развитии псориаза, атопического дерматита и других воспалительных заболеваний кожи и эпителиальных тканей. Таким образом, антагонисты активности ГО-22 и ГО-20, такие как растворимые рецепторы 1Б-22ЕА, и антитела к ним, в том числе моноклональные и нейтрализующие антитела против 1Б-22ЕА человека по настоящему изобретению, можно использовать для терапевтического лечения воспалительных заболеваний, в частности, в качестве антагонистов ГО-22 и ГО-20, отдельно или совместно, при лечении псориаза. Кроме того, антагонисты активности ГО-22, такие как растворимые рецепторы 1Б-22ЕА, и антитела к ним, в том числе моноклональные и нейтрализующие антитела против 1Б-22ЕА человека по настоящему изобретению, можно использовать для терапевтического лечения других воспалительных заболеваний, например для связывания, блокирования, ингибирования, ослабления, антагонистического воздействия или нейтрализации ГО-22 и ГО-20 (отдельно или вместе) при лечении атопического дерматита, ΙΒΌ, колита, эндотоксемии, артрита, ревматоидного артрита и псориатического артрита, острого респираторного заболевания (ЛЕЭ), септического шока, нарушения функции многих органов, воспалительного поражения легких, такого как астма или бронхит, бактериальной пневмонии, псориаза, экземы, атопического и контактного дерматитов, воспалительного заболевания кишечника, такого как неспецифический язвенный колит и болезнь Крона.

Вышеуказанные и другие объекты настоящего изобретения станут очевидными из нижеследующего подробного описания изобретения. Кроме того, ниже приведены разные публикации, описание которых включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки в полном объеме.

2. Определения терминов.

В нижеследующем описании изобретения широко использованы разные термины. Ниже приведены определения использованных терминов для лучшего понимания настоящего изобретения.

В используемом здесь значении термин нуклеиновая кислота или молекула нуклеиновой кислоты означает полинуклеотиды, такие как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновая кислота (РНК), олигонуклеотиды, фрагменты, полученные при помощи полимеразной цепной реакции (РСЕ), и фрагменты, полученные в результате лигирования, расщепления, воздействия эндонуклеазы и экзонуклеазы. Молекулы нуклеиновой кислоты могут состоять из мономеров, являющихся природными нуклеотидами (такими как ДНК и РНК), или аналогами природных нуклеотидов (например, αэнантиомерные формы природных нуклеотидов), или их комбинации. У модифицированных нуклеотидов может быть изменена сахаридная часть и/или пиримидиновые или пуриновые основания. Модификации сахара включают, например, замену одной или нескольких гидроксильных групп галогенами, алкильными группами, аминами и азидогруппами, или же сахара могут обладать функциональной активностью в виде простых или сложных эфиров. Кроме того, вся сахаридная часть может быть заменена структурами, подобными в стерическом и электронном отношении, такими как азасахара и карбоциклические аналоги сахара. Примеры модификации оснований включают алкилированные пурины и пиримидины, ацилированные пурины или пиримидины или другие хорошо известные гетероциклические заместители. Мономеры нуклеиновой кислоты могут быть связаны сложными фосфодиэфирными связями или аналогами таких связей. Аналоги сложных фосфодизфирных связей включают фосфортиоат, фосфордитиоат, фосфорселеноат, фосфордиселеноат, фосфоранилотиоат, фосфоранилидат, фосфорамидат и тому подобные. Под термином молекула нуклеиновой кислоты также понимают так называемые пептидные нуклеиновые кислоты, которые включают природные или модифицированные основания нуклеиновой кислоты, присоединенные к полиамидному остову. Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными.

Термин комплемент молекулы нуклеиновой кислоты означает молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую комплементарную нуклеотидную последовательность с обратной ориентацией по сравнению с эталонной нуклеотидной последовательностью. Например, последовательность 5' АТССАСССС 3' ком- 3 015706 плементарна последовательности 5' ССССТССАТ 3'.

Под термином вырожденная нуклеотидная последовательность понимают, что последовательность нуклеотидов включает один или несколько вырожденных кодонов по сравнению с молекулой эталонной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Вырожденные кодоны содержат разные триплеты нуклеотидов, но кодируют один и тот же аминокислотный остаток (то есть оба триплета САИ и САС кодируют Акр).

Термин структурный ген означает молекулу нуклеиновой кислоты, транскрибированную в матричной РНК (мРНК), которая затем транслируется в аминокислотную последовательность, характерную для определенного полипептида.

Термин выделенная молекула нуклеиновой кислоты означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая не является интегрированной в геномную ДНК организма. Например, молекула ДНК, кодирующая фактор роста, которая была выделена из геномной ДНК клетки, является выделенной молекулой ДНК. Другим примером выделенной молекулы нуклеиновой кислоты является химически синтезированная молекула нуклеиновой кислоты, не интегрированная в геном организма. Молекула нуклеиновой кислоты, выделенная из определенного вида, меньше полноразмерной молекулы ДНК хромосомы указанного вида.

Термин конструкция молекулы нуклеиновой кислоты означает молекулу одноцепочечной или двухцепочечной нуклеиновой кислоты, которая была модифицирована в результате вмешательства человека и содержит сегменты нуклеиновой кислоты, объединенные и расположенные в порядке, не существующем в природе.

Термин линейная ДНК означает молекулы некольцевой ДНК со свободными 5'- и З'-концами. Линейная ДНК может быть получена из молекул замкнутой кольцевой ДНК, таких как плазмиды, путем ферментативного расщепления или физического разрыва.

Термин комплементарная ДНК (кДНК) означает молекулу одноцепочечной ДНК, полученную из матрицы мРНК при помощи фермента обратной транскриптазы. Для инициации обратной транскрипции обычно используют праймер, комплементарный частям мРНК. Специалисты в данной области используют также термин кДНК для обозначения молекулы двухцепочечной ДНК, состоящей из такой молекулы одноцепочечной ДНК и цепи, комплементарной ДНК. Термин кДНК означает также клон молекулы кДНК, синтезированной из матрицы РНК.

Термин промотор означает нуклеотидную последовательность, которая направляет транскрипцию структурного гена. Промотор обычно расположен в 5'-концевой некодирующей области гена, рядом с сайтом инициации транскрипции структурного гена. Элементы последовательности в промоторах, которые инициируют транскрипцию, часто имеют консенсусные нуклеотидные последовательности. Указанные элементы промотора включают сайты связывания РНК-полимеразы, последовательности ТАТА, последовательности СААТ, элементы, специфичные для дифференцировки (Ό8Ε; МсСейее е! а1., Мо1. Епбосппо1. 7:551 (1993)), элементы, чувствительные к циклическому АМР (СНЕ), элементы, чувствительные к сыворотке (8КЕ; Тгейтап. Зешшагк ίη Сапсег Βίο1. 1:47 (1990)), элементы, чувствительные к глюкокортикоидам (СНЕ), и сайты связывания других факторов транскрипции, таких как СКЕ/АТЕ (О'КеШу е! а1., 1. Βΐοΐ. Сйет. 267:19938 (1992)), АР2 (Уе е! а1., 1. Βΐοΐ. Сйет. 269:25728 (1994)), 8Р1, сАМФзависимый связывающий белок, (СКЕВ; Ьоекеп, Сепе Ехрг.3:253 (1993)) и октамерные факторы (см. публикации \Уа150п е! а1., ебк., Мо1еси1аг Вю1оду о£ !йе Сепе, 4'¹' еб. (Тйе Вещатш/Ситттдк РиЫйЫпд Сотрапу, 1пс. 1987) и Ьетахдге апб Коиккеаи, Вюсйет. 1. 303:1 (1994)). Если промотор является индуцибельным промотором, тогда скорость транскрипции увеличивается под воздействием индуцирующего агента. В отличие от этого скорость транскрипции не регулируется индуцирующим агентом, если промотор является конститутивным промотором. Кроме того, известны репрессируемые промоторы.

Термин основной промотор означает незаменимые нуклеотидные последовательности, необходимые для функционирования промотора, включая блок ТАТА и сайт инициации транскрипции. В соответствии с данным определением основной промотор может обладать обнаруживаемой активностью в отсутствие специфических последовательностей, которые могут усиливать активность или сообщать тканеспецифическую активность, или может ею не обладать.

Термин регуляторный элемент означает нуклеотидную последовательность, которая модулирует активность основного промотора. Например, регуляторный элемент может содержать нуклеотидную последовательность, которая связывается с факторами клетки, делая возможной транскрипцию исключительно или предпочтительно в определенных клетках, тканях или органеллах. Указанные типы регуляторных элементов обычно связаны с генами, экспрессируемыми клеточно-специфическим, тканеспецифическим или органелласпецифическим образом.

Термин энхансер означает определенный тип регуляторного элемента, способного увеличивать эффективность транскрипции независимо от расстояния или ориентации данного энхансера относительно сайта инициации транскрипции.

Термин гетерологичная ДНК означает молекулу ДНК или популяцию молекул ДНК, которые в естественных условиях отсутствуют в данной клетке-хозяине. Молекулы ДНК, гетерологичные определенной клетке-хозяину, могут содержать ДНК, выделенную из вида, к которому относится данная клет

- 4 015706 ка-хозяин (т.е. эндогенная ДНК), а также ДНК хозяина может быть объединена с ДНК, отсутствующей у хозяина (т.е. экзогенная ДНК). Например, молекула ДНК, содержащая отсутствующий у хозяина сегмент ДНК, кодирующий полипептид, функционально связанный с сегментом ДНК хозяина, содержащим промотор транскрипции, считается молекулой гетерологичной ДНК. И наоборот, молекула гетерологичной ДНК может включать эндогенный ген, функционально связанный с экзогенным промотором. В качестве еще одного примера можно указать, что молекула ДНК, содержащая ген, выделенный из клетки дикого типа, считается гетерологичной ДНК, если данная молекула ДНК введена в мутантную клетку, в которой отсутствует ген дикого типа.

Термин полипептид означает полимер аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями, который может быть получен природным или синтетическим путем. Полипептиды, содержащие менее примерно 10 аминокислотных остатков, обычно называют пептиды.

Термин белок означает макромолекулу, содержащую одну или несколько полипептидных цепей. Белок также может содержать непептидные компоненты, такие как углеводные группы. Углеводы и другие непептидные заместители могут быть введены в белок клеткой, продуцирующей данный белок, и могут отличаться в зависимости от типа клетки. Белки определены в настоящем описании изобретения на основании структур аминокислотного остова; заместители, такие как углеводные группы, обычно не указаны, но тем не менее они могут присутствовать.

Пептид или полипептид, кодируемый молекулой ДНК, отсутствующей у хозяина, является гетерологичным пептидом или полипептидом.

Термин клонирующий вектор означает молекулу нуклеиновой кислоты, такую как плазмида, космида или бактериофаг, которая способна автономно реплицироваться в клетке-хозяине. Клонирующие векторы обычно содержат один или несколько сайтов узнавания рестрикцинной эндонуклеазы, которые позволяют вводить молекулы нуклеиновой кислоты с возможностью определения без утраты главной биологической функции вектора, а также нуклеотидные последовательности, кодирующие ген-маркер, используемый для идентификации и отбора клеток, трансформированных указанным клонирующим вектором. Гены-маркеры обычно включают гены, обеспечивающие устойчивость к тетрациклину или ампициллину.

Термин экспрессирующий вектор означает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую ген, экспрессируемый в клетке-хозяине. Экспрессирующий вектор обычно включает промотор транскрипции, ген и терминатор транскрипции. Экспрессия гена обычно контролируется промотором, при этом считается, что такой ген функционально связан с промотором. Регуляторный элемент и основной промотор функционально связаны, если регуляторный элемент модулирует активность основного промотора.

Термин рекомбинантный хозяин означает клетку, содержащую молекулу гетерологичной нуклеиновой кислоты, такую как клонирующий вектор или экспрессирующий вектор. В настоящем описании изобретения примером рекомбинантного хозяина является клетка, продуцирующая 1Б-22ВА из экспрессирующего вектора. В отличие от этого, 1Б-22КА. может продуцироваться клеткой, которая является природным источником 1Б-22КА. и не содержит экспрессирующего вектора.

Термин интегрирующие трансформанты означает рекомбинантные клетки-хозяева, в которых гетерологичная ДНК интегрирована в геномную ДНК клеток.

Термин слитый белок означает гибридный белок, экспрессируемый молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидные последовательности по крайней мере двух генов. Например, слитый белок может содержать по крайней мере часть полипептида 1Ь-22КА, слитую с полипептидом, связывающимся с аффинной матрицей. Такой слитый белок можно использовать для выделения больших количеств 1Ь-22КА, используя аффинную хроматографию.

Термин рецептор означает клеточный белок, который связывается с биоактивной молекулой, именуемой лигандом. Указанное взаимодействие опосредует воздействие лиганда на клетку. Рецепторы могут быть мембраносвязанными, цитозольными или ядерными; мономерными (например, рецептор тиреостимулирующего гормона, β-адренергический рецептор) или мультимерными (например, рецептор РБСР, рецептор гормона роста, рецептор 1Ь-3, рецептор СМ-С8Р, рецептор С-С8Р, рецептор эритропоэтина и рецептор 1Ь-6). Мембраносвязанные рецепторы отличаются мультидоменной структурой, включающей внеклеточный лигандсвязывающий домен и внутриклеточный эффекторный домен, который обычно участвует в передаче сигналов. В некоторых мембраносвязанных рецепторах внеклеточный лигандсвязывающий домен и внутриклеточный эффекторный домен расположены в разных полипептидах, образующих полноразмерный функциональный рецептор.

Связывание лиганда с рецептором обычно вызывает конформационное изменение рецептора, определяющее взаимодействие между эффекторным доменом и другой молекулой в клетке, что в свою очередь ведет к изменению метаболизма клетки. Метаболические явления, которые часто обусловлены взаимодействиями рецептора с лигандом, включают транскрипцию гена, фосфорилирование, дефосфорилирование, увеличение продукции циклического АМР, активацию клеточного кальция, активацию липидов мембраны, адгезию клеток, гидролиз липидов инозита и гидролиз фосфолипидов.

Термин растворимый рецептор означает рецепторный полипептид, не связанный с клеточной мембраной. Растворимые рецепторы наиболее часто являются рецепторными полипептидами лигандсвя

- 5 015706 зывающего рецептора, в которых отсутствуют трансмембранные и цитоплазматические домены и другие связи с клеточной мембраной, например, через гликофосфоинозит (§ρί). Растворимые рецепторы могут содержать дополнительные аминокислотные остатки, такие как аффинные метки, которые облегчают очистку полипептида или предоставляют сайты для присоединения полипептида к субстрату, или последовательности константной области иммуноглобулина. Многие рецепторы на поверхности клетки имеют природные растворимые аналоги, образованные в результате протеолиза или транслированные из альтернативно сплайсированных мРНК. Растворимые рецепторы могут быть мономерными, гомодимерными, гетеродимерными или мультимерными, причем мультимерные рецепторы обычно содержат не более 9 субъединиц, предпочтительно не более 6 субъединиц и, наиболее предпочтительно, не более 3 субъединиц. Считается, что полипептиды рецепторов, по существу, не содержат трансмембранных и внутриклеточных полипептидных сегментов, когда в них отсутствуют значительные части указанных сегментов, предназначенных соответственно для связывания с мембраной или передачи сигналов. Растворимые рецепторы рецепторов цитокинов класса I и класса II обычно содержат внеклеточный домен связывания цитокина, в котором отсутствует трансмембранный домен и внутриклеточный домен. Например, характерные растворимые рецепторы включают растворимый рецептор СКЕ2-4 (иначе называемый 1Ь-10КБ) (номер доступа в банке генов СепЬаик Ζ17227), представленные в 8ЕО Ш N0: 44 и 8Е0 Ш N0: 45; растворимый рецептор 1Ь-10КЛ (номера доступа в банке генов СепЬаик И00672 и ΝΜ_001558), представленный в 8Е0 Ш N0: 46; растворимый рецептор ρΌΙΚ81 (иначе называемый 1Б-20КВ) (номер доступа в банке генов СепЬаик ΑΥ358305), представленный в 8Е0 ΙΌ N0: 47; и растворимый рецептор 1Б-22КЛ (патент США № 5965704), представленный в 8Е0 ΙΌ N0: 3. Специалисту в данной области известно, какие последовательности известного цитокина класса I или класса II содержат внеклеточный домен связывания цитокина в отсутствие трансмембранного домена и внутриклеточного домена. Кроме того, специалист в данной области, используя генетический код, может легко определить полинуклеотиды, кодирующие полипептиды таких растворимых рецепторов.

Термин секреторная сигнальная последовательность означает последовательность ДНК, кодирующую пептид (секреторный пептид), который, являясь компонентом более крупного полипептида, направляет этот крупный полипептид по секреторному пути клетки, в которой он синтезирован. Крупный полипептид обычно расщепляется и теряет секреторный пептид во время движения по секреторному пути.

Термин выделенный полипептид означает полипептид, который, по существу, свободен от клеточных компонентов, таких как углевод, липид или другие белковые примеси, связанных с этим полипептидом в естественных условиях. Препарат выделенного полипептида обычно содержит полипептид в высокоочищенной форме, т.е. чистота составляет по крайней мере примерно 80%, по крайней мере примерно 90%, по крайней мере примерно 95%, более чем 95%, в частности 96, 97, 98 или более чем 99%. Одним из способов определения того, что данный белковый препарат содержит выделенный полипептид, является наличие одной полосы при исследовании белкового препарата электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (8Ό8) и окрашивании геля кумассии бриллиантовым голубым. Однако термин выделенный не исключает наличия того же полипептида в альтернативных физических формах, таких как димеры, или альтернативно в гликозилированных или производных формах.

Термины аминоконцевой и карбоксиконцевой использованы в настоящем описании изобретения для обозначения положений в полипептидах. Там, где это возможно, указанные термины использованы со ссылкой на определенную последовательность или часть полипептида для обозначения близости или относительного положения. Например, определенная последовательность, находящаяся в карбоксиконцевом положении относительно эталонной последовательности в полипептиде, расположена вблизи карбоксильного конца эталонной последовательности, но не обязательно у карбоксильного конца всего полипептида.

Термин экспрессия означает биосинтез генного продукта. Например, в случае структурного гена экспрессия включает транскрипцию структурного гена в мРНК и трансляцию мРНК в один или несколько полипептидов.

Термин сплайсированный вариант означает в настоящем описании изобретения альтернативные формы РНК, транскрибированной из гена. Сплайсированные варианты возникают естественным путем в результате использования альтернативных сайтов сплайсинга в молекуле транскрибированной РНК или реже в молекулах отдельно транскрибированной РНК и могут вызывать образование нескольких мРНК, транскрибированных из одного и того же гена. Сплайсированные варианты могут кодировать полипептиды с измененной аминокислотной последовательностью. Термин сплайсированный вариант использован в настоящем описании изобретения также для обозначения полипептида, кодированного сплайсированным вариантом мРНК, транскрибированной из гена.

В используемом здесь значении термин иммуномодулятор означает цитокины, факторы роста стволовых клеток, лимфотоксины, костимулирующие молекулы, гемопоэтические факторы и тому подобные, а также синтетические аналоги указанных молекул.

Термин пара комплемент-антикомплемент означает неидентичные части молекулы, которые образуют нековалентно связанную устойчивую пару в соответствующих условиях. Например, биотин и

- 6 015706 авидин (или стрептавидин) являются прототипами пары комплемент-антикомплемент. Другие характерные пары комплемент-антикомплемент включают пары рецептор-лиганд, пары антитело-антиген (гаптен или антигенная детерминанта), пары смысловой-антисмысловой полинуклеотиды и тому подобные. Если желательна последующая диссоциация пары комплемент-антикомплемент, то сродство связывания такой пары комплемент-антикомплемент предпочтительно должно быть меньше 10⁹ М^-1.

Термин антиидиотипическое антитело означает антитело, которое связывается с доменом вариабельной области иммуноглобулина. В настоящем описании изобретения антиидиотипическое антитело связывается с вариабельной областью антитела против 1Ь-22К.А, и, таким образом, антиидиотипическое антитело имитирует антигенную детерминанту 1Ь-22К.Л.

Термин фрагмент антитела означает такой фрагмент антитела, как Е(аЬ')₂, Е(аЬ)₂, ЕаЬ', ЕаЬ и тому подобные. Независимо от структуры фрагмент антитела связывается с антигеном, узнаваемым интактным антителом. Например, фрагмент моноклонального антитела против 1Ь-22КА. связывается с антигенной детерминантой 1Ь-22К.Л.

Термин фрагмент антитела означает также синтетический или генетически созданный полипептид, связывающийся со специфическим антигеном, в частности полипептиды, содержащие вариабельную область легкой цепи, Εν-фрагменты, состоящие из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, молекулы рекомбинантного одноцепочечного полипептида, в которых вариабельные области легкой и тяжелой цепей связаны пептидным линкером (белки δοΕν). и минимальные узнающие единицы, состоящие из аминокислотных остатков, имитирующих гипервариабельный участок.

Термин химерное антитело означает рекомбинантный белок, содержащий вариабельные области и гипервариабельные участки, антитела грызуна, в то время как остальная часть молекулы антитела является частью антитела человека.

Термин гуманизированные антитела означает рекомбинантные белки, в которых гипервариабельные участки моноклонального антитела мыши были перенесены из тяжелой и легкой цепей вариабельной области иммуноглобулина мыши в вариабельную область человека. Специалисту в данной области известны способы создания гуманизированных антител для терапевтического лечения человека, выделяемые из антител мыши, в частности антител, которые связываются или нейтрализуют белок человека.

В используемом здесь значении термин терапевтический агент означает молекулу или атом, конъюгированный с антителом и образующий конъюгат, который можно использовать в терапии. Примеры терапевтических агентов включают лекарственные средства, токсины, иммуномодуляторы, хелаторы, соединения бора, фотоактивные агенты или красители и радиоизотопы.

Термин визуализируемая метка означает молекулу или атом, который может быть конъюгирован с антителом с образованием молекулы, подходящей для диагностики. Примеры визуализируемых меток включают хелаторы, фотоактивные агенты, радиоизотопы, флуоресцентные вещества, парамагнитные ионы и другие маркеры.

Термин аффинная метка в используемом здесь значении означает сегмент полипептида, который может быть присоединен ко второму полипептиду для очистки или обнаружения второго полипептида или для создания сайтов присоединения второго полипептида к субстрату. В частности, любой пептид или белок, для которого существует антитело или другой специфический связывающий агент, может быть использован в качестве аффинной метки. Аффинные метки включают полигистидин, белок А (N1188ои е! а1., ЕМВО 1. 4:1075 (1985); Νί188οη е! а1., Ме!йоб8 Епхуто1. 198:3 (1991), глутатион-8-трансферазу (8шйй аиб 1ойи8ои, Сеие 67:31 (1988), аффинную метку С1и-С1и (Сги88еишеуег е! а1., Ргос. №И. Аеаб. δει. И8А 82:7952 (1985)), вещество Р, пептид ЕЬАС (Норр е! а1., Вю!есйио1о§у 6:1204 (1988)), стрептавидинсвязывающий пептид, другую антигенную детерминанту или связывающую область. См. публикацию Еогб е! а1., Рго!еш Ехрге88юи аиб Рипйса!юи 2:95 (1991). Молекулы ДНК, кодирующие аффинные метки, можно приобрести у коммерческих поставщиков (например, в компании Рйагшааа Вю!есй, Р18са!агау, N1).

Термин голое антитело означает полноразмерное антитело, в отличие от фрагмента антитела, которое не конъюгировано с терапевтическим агентом. Голые антитела включают как поликлональные, так и моноклональные антитела, а также определенные рекомбинантные антитела, такие как химерные и гуманизированные антитела.

В используемом здесь значении термин компонент антитела означает как полноразмерное антитело, так и фрагмент антитела.

Термин иммуноконъюгат означает конъюгат компонента антитела с терапевтическим агентом или визуализируемой меткой.

В используемом здесь значении термин антитело-слитый белок означает рекомбинантную молекулу, которая содержит компонент антитела и компонент полипептида 1Ь-22К.А. Примером антителослитого белка является белок, содержащий внеклеточный домен 1Ь-22К.А и Ес-область или антигенсвязывающую область.

Термин полипептид-мишень или пептид-мишень означает аминокислотную последовательность, которая содержит по крайней мере одну антигенную детерминанту и экспрессирована на клеткемишени, такой как опухолевая клетка или клетка, содержащая антиген инфекционного агента. Т-клетки

- 7 015706 распознают пептидные детерминанты, презентируемые молекулой главного комплекса гистосовместимости полипептиду-мишени, или пептиду-мишени, и обычно лизируют клетку-мишень или рекрутируют другие иммунокомпетентные клетки к месту локализации клетки-мишени, уничтожая, таким образом, эту клетку-мишень.

Термин антигенный пептид означает пептид, который связывается с молекулой главного комплекса гистосовместимости с образованием комплекса МНС-пептид, распознаваемого Т-клеткой, индуцируя реакцию цитотоксического лимфоцита в ответ на презентацию Т-клетке. Таким образом, антигенные пептиды способны связываться с соответствующей молекулой главного комплекса гистосовместимости и индуцировать цитотоксический Т-клеточный ответ, такой как лизис клетки или высвобождение специфических цитокинов против клетки-мишени, которая связывает или экспрессирует данный антиген. Антигенный пептид может быть связан с молекулой главного комплекса гистосовместимости класса I или класса II на антиген-презентирующей клетке или на клетке-мишени.

В эукариотических клетках РНК-полимераза II катализирует транскрипцию структурного гена с образованием мРНК. Может быть создана молекула нуклеиновой кислоты, содержащая матрицу РНКполимеразы II, в которой транскрипт РНК имеет последовательность, комплементарную последовательности специфической мРНК. Транскрипт РНК именуется антисмысловой РНК, и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антисмысловую РНК, именуется антисмысловым геном. Молекулы антисмысловой РНК способны связываться с молекулами мРНК, ингибируя трансляцию мРНК.

Термин антисмысловой олигонуклеотид, специфичный к кЬ-22КА или антисмысловой олигонуклеотид Ш-22КА означает олигонуклеотид, имеющий последовательность, (а) способную образовывать устойчивый триплекс с частью гена ГЕ-22КА, или (Ь) способную образовывать устойчивый дуплекс с частью транскрипта мРНК гена ГЕ-22КА.

Термин рибозим означает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую каталитический центр. Определение данного термина охватывает ферменты РНК, самосплайсирующиеся РНК, саморасщепляющиеся РНК и молекулы нуклеиновой кислоты, выполняющие указанные каталитические функции. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая рибозим, именуется геном рибозима.

Термин внешняя направляющая последовательность означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая направляет эндогенный рибозим, РНКазу Р, к определенной внутриклеточной мРНК, в результате чего РНКаза Р расщепляет данную мРНК. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая внешнюю направляющую последовательность, именуется геном внешней направляющей последовательности.

Термин вариантный ген ГЕ-22КА означает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептид, в котором аминокислотная последовательность является модификацией 8ЕО Ш N0: 3. Такие варианты включают природные полиморфизмы генов ЕЕ-22КА, а также синтетические гены, содержащие замены консервативных аминокислот в аминокислотной последовательности 8Е0 Ш N0: 3. Дополнительные вариантные формы генов ЕЕ-22КА представляют собой молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие инсерции или делеции нуклеотидных последовательностей, раскрытых в настоящем описании изобретения. Вариантный ген ЕЕ-22КА можно идентифицировать, например, путем определения способности указанного гена гибридизироваться с молекулой нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью 8Е0 Ш N0: 1 или с ее комплементом в жестких условиях.

Альтернативно вариантные гены ЕЕ-22КА можно идентифицировать путем сравнения последовательностей. Две аминокислотные последовательности имеют 100% идентичность аминокислотных последовательностей, если аминокислотные остатки двух аминокислотных последовательностей являются одинаковыми при выравнивании для поиска максимального соответствия. Аналогичным образом две нуклеотидные последовательности имеют 100% идентичность нуклеотидных последовательностей, если нуклеотидные остатки двух нуклеотидных последовательностей являются одинаковыми при выравнивании для поиска на максимальное соответствие. Сравнение последовательностей можно произвести при помощи стандартного программного обеспечения, например компьютерных программ по биоинформатике ΕΑ8ΕΚΟΕΝΕ, созданного ΌΝΑ8ΤΑΚ. (Мабкоп, ХУБсопкт). Специалистам в данной области хорошо известны другие методы сравнения двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей путем определения оптимального соответствия (см., например, публикации РетикИ апб Региккк Т1зе (п!сгпе! апб Изе №\ν Вю1оду: Тоо1к кот Оепот1с апб Мо1еси1аг Векеатсй (А8М Ргекк, Ле. 1997), \Уи е! а1. (ебк.), 'Тпкоттабоп 8ирег11щ11\уау апб Сотри1ег Ба1аЬакек ок ШсШс Ас1бк апб РгоШпк, т МеЛобк т Оепе Вю1ес11по1оду. радек 123-151 (СРС Ргекк, Ечс. 1997), апб Вкйор (еб.), Ошбе Ю Нитап Оепоте Сотрибпд, 2пб Ебйюп (Асабетю Ргекк, Лс. 1998)). Ниже описаны конкретные методы определения идентичности последовательностей.

Независимо от конкретного метода, используемого для идентификации вариантного гена кЬ-22КА или вариантного полипептида !Е-22КА, вариантный ген или полипептид, кодированный вариантным геном, может характеризоваться в функциональном отношении способностью специфически связываться с антителом против кЕ-22ВА. Вариантный ген [Е-22РА или вариантный полипептид [Е-22РА может также характеризоваться в функциональном отношении способностью связываться с его лигандом, №-22, определяемой в результате выполнения биологического или биохимического анализа, раскрытого в настоящем описании изобретения.

- 8 015706

Термин аллельный вариант использован в настоящем описании изобретения для обозначения любых двух или более альтернативных форм гена, занимающих один и тот же хромосомный локус. Аллельные варианты возникают естественным путем в результате мутации и могут вызвать фенотипический полиморфизм в популяциях. Генные мутации могут быть молчащими (без изменения кодированного полипептида) или могут кодировать полипептиды с измененной аминокислотной последовательностью. Термин аллельный вариант использован также в настоящем описании изобретения для обозначения белка, кодированного аллельным вариантом гена.

Термин ортолог означает полипептид или белок, полученный из одного вида, который является функциональным аналогом полипептида или белка из другого вида. Различия последовательностей в ортологах являются результатом видообразования.

Термин паралоги означает отличающиеся, но структурно родственные белки, создаваемые организмом. Считается, что паралоги возникают в результате дупликации генов. Например, α-глобин, βглобин и миоглобин являются паралогами.

В объем настоящего изобретения входят функциональные фрагменты генов 1Ь-22КА. В соответствии с настоящим изобретением термин функциональный фрагмент гена 1Ь-22КА означает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую часть полипептида 1Ь-22КЛ, которая представляет собой домен по настоящему изобретению или по крайней мере специфически связывается с антителом против 1Ь-22КА.

Из-за неточности стандартных аналитических методов молекулярные массы и длины полимеров имеют приблизительные значения. Когда такое значение определено как около X или примерно X, должно быть понятно, что указанное значение X представлено с точностью до ±10%.

3. Получение полинуклеотидов или генов 1Ь-22КА.

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие ген 1Ь-22КЛ человека, можно получить путем скрининга библиотеки кДНК или геномной библиотеки человека при помощи полинуклеотидных зондов на основе 8ΕΟ ΙΌ N0: 1. Эти методы являются стандартными и хорошо известными и могут быть осуществлены с использованием наборов для клонирования, предоставляемых коммерческими поставщиками. См., например, публикации АизиЬе1 е! а1. (ебз.), 8йог1 Рго1осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 3^гб Εάίΐίοη, Ιοίιη ^Неу & 8опз 1995; \Уи е! а1., Ме1йобз ίη Сепе В1о1есйпо1оду, СКС Ргезз, 1пс. 1997; Άνίν апб Ьсбег, Ргос. N1'1 Асаб. 8с1. И8Л 69:1408 (1972); Ниупй е1 а1., аоб Зсгаеш^ с^NΑ Ь1Ьгаг1ез ίη λ§ΐ10 аоб λ§111, ίη ΌΝΑ С1ошпд: А Ргасбса1 Арргоасй Уо1. I, С1отег (еб.), раде 49 (1КЙ Ргезз, 1985); \Уи (1997) а1 радез 47-52.

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие ген 1Ь-22КА человека, можно также получить при помощи полимеразной цепной реакции (РСК) с использованием олигонуклеотидных праймеров, в которых нуклеотидные последовательности созданы на основе нуклеотидной последовательности гена или кДНК 1Ь-22КА. Общие методы скрининга библиотек при помощи РСК описаны, например, в публикации Уи е1 а1., Изе оГ 1йе Ро1утегазе Сйаш КеасГ^ 1о 8сгссп Рйаде Ь1Ьгаг1ез, ίη Ме1йобз ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 15: РСК Рго1осо1з: Сштей Ме1йобз аоб Аррбсабога, \Уйбе (еб.), Нитам Ргезз, 1пс., 1993. Кроме того, методы применения РСК для выделения родственных генов описаны, например, в публикации Ргсз1оп, Изе оГ Ведений Ο1^дοηис1еο1^бе Рптегз аоб 1йе Ро1утегазе Сйаш ВсасНои 1о С1опс Сене Еатбу МетЬегз, ίη Ме1йобз ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 15: РСК Рго1осо1з: Сиггей Ме1йобз аоб Арр^абощ, ^ййе (еб.), Нитам Ргезз, 1пс., 1993. В качестве альтернативы ген 1Ь-22КА можно получить, синтезируя молекулы нуклеиновой кислоты с использованием взаимостимулирующих длинноцепочечных олигонуклеотидов и нуклеотидных последовательностей, раскрытых в настоящем описании изобретения (см., например, АизиЬе1 (1995)). Существующие методы на основе полимеразной цепной реакции позволяют синтезировать молекулы ДНК длиной по крайней мере две тысячи пар оснований. (Абавд е1 а1., Р1ай Мо1ес. Вю1. 27:1131 (1993), ВатЬо! е1 а1., РСК Ме1йобз ааб АррИсабоаз 2:266 (1993), ЭШоп е1 а1., Изе оГ 1йе Ро1утегазе Сйаш Кеас1^οη Гог 1йе Кар1б Сопз1гисйоп оГ 8уййебс Сспсз, ίη Ме1йобз ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 15: РСК Рго1осо1з: Сиггей Ме1йобз апб Аррбсабом, ^ййе (еб.), радез 263-268, (Нитам Ргезз, 1пс. 1993), апб Но1о\уасйик е1 а1., РСК Ме1йобз Арр1. 4:299 (1995)). Для ознакомления с синтезом полинуклеотидов см., например, публикации Сйск аг1б Раз1етак, Мо1еси1аг В^ο1есйηο1οду, Рппс1р1сз аг1б Аррбсабом оГ КесотЫмй ^NΑ (А8М Ргезз 1994), Йакига е1 а1., Аппи. Кет. Вюсйет. 53:323 (1984) и Сбт1е е1 а1., Ргос. N811 Асаб. 8οΐ. И8А 87:633 (1990).

4. Получение вариантов гена 1Ь-22КА.

Настоящее изобретение относится к целому ряду молекул нуклеиновых кислот, включая молекулы ДНК и РНК, кодирующие полипептиды 1Ь-22КА, раскрытые в настоящем описании изобретения. Специалистам в данной области известно, что с учетом вырожденности генетического кода возможно значительное изменение последовательностей в указанных полинуклеотидных молекулах. Кроме того, настоящее изобретение также относится к выделенным полипептидам растворимых мономерных, гомодимерных, гетеродимерных и мультимерных рецепторов, содержащих по крайней мере одну субъединицу рецептора 1Е-22КА, которая, по существу, гомологична полипептиду рецептора с последовательностью 8ΕΟ ΙΌ N0: 3. Таким образом, настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим полипептид 1Е-22КА, которые содержат вырожденные нуклеотиды 8Ε0 ΙΌ N0: 1 и их экви

- 9 015706 валенты РНК.

В табл. 1 приведены однобуквенные коды, служащие для обозначения положений вырожденных нуклеотидов. В графе Обозначение указаны нуклеотиды, обозначенные буквой кода. В графе Комплемент указан код для комплементарных нуклеотидов. Например, код Υ означает С или Т, и его комплемент В означает А или О, при этом А комплементарен Т, и О комплементарен С.

Таблица 1

Нуклеотид	Обозначение	Комплемент	Обозначение
А	А	т	Т
с	С	б	С
с	С	с	С
т	т	А	А
к	А/С	Υ	с/т
У	С/Т	в	А/С
м	А/С	к	С/Т
к	С/Т	м	А/С
5	С/С	Ξ	С/С
И	А/Т	И	А/Т
н	А/С/Т	с	А/С/Т
в	С/С/Т	V	А/С/С
V	А/С/6	в	С/С/Т
ϋ	А/С/Т	н	А/С/Т
N	А/С/С/Т	N	А/С/С/Т

В табл. 2 приведены вырожденные кодоны, включающие все возможные кодоны для данной аминокислоты.

Таблица 2

Амино- кислота	Однобуквенный код	Кодоны	Вырожденный кодон
Суз	с	ТСС ТЕТ	ΤΕΥ
Зег	3	А6С АСТ ТСА ТСС ТСЕ ТСТ	ИЗЫ
ТНг	т	АСА АСС АСЕ АСТ	АСЫ
Рго	Р	ССА ССС ССС ССТ	ССЫ

А1а	, А	ЕСА ССС ССС ЕСТ	ССЫ
61у	е	ССА ССС СЕС ССТ	ССЫ
АбП	N	ААС ААТ	ΑΑΥ
Аэр	ϋ	САС САТ	САУ
С1и	Е	САА САС	САК
С1п	о.	САД САС	САК
Ηίδ	н	САС САТ	САТ
Агд	к	АСА АСС ССА ССС ССС ССТ	МСЫ
Ьуэ	к	ААА ААС	ААК
МеД	м	АТС	АТС
Не	I	АТА АТС АТТ	АТН
Ьеи	ь	СТА СТС СТС СТТ ТТА ТТС	ΥΤΝ
Уа1	V	СТА СТС ЕТС СТТ	СТЫ
РЬе	г	ТТС ттт	ΤΤΥ
Туг	Υ	ТАС ТАТ	ΤΑΥ
Тгр	и	ТСС	ТСС
Тег		Τ21Λ ТАС ТСА	ТКК
Азп/Азр	в		ΚΑΥ
С1и/61п	Ζ		ЗАК
Ап у	X		ЫЫЫ

- 10 015706

Специалисту в данной области понятно, что определение вырожденного кодона содержит некоторую неопределенность, характерную для всех возможных кодонов, кодирующих аминокислоту. Например, вырожденный кодон для серина (^8Ν) в некоторых случаях может кодировать аргинин (ЛОВ), и вырожденный кодон для аргинина (ΜΟΝ) в некоторых случаях может кодировать серии (АСУ). Аналогичная взаимосвязь существует между кодонами, кодирующими фенилаланин и лейцин. Таким образом, некоторые полинуклеотиды, определяемые вырожденной последовательностью, могут кодировать вариантные аминокислотные последовательности, но специалист в данной области легко идентифицирует такие вариантные последовательности, обратившись к аминокислотным последовательностям, представленным 8ЕО ГО N0: 3. Вариантные последовательности можно легко проанализировать в отношении функциональности описанными ниже методами.

Различные виды могут отличаться использованием предпочтительных кодонов. В частности, см. публикации СгапИат е! а1., Νιιοί Ае1бк Век. 5:1893 (1980), Наак е! а1. Сшт. ΒίοΙ. 6:315 (1996), \Уат-НоЬкоп е! а1., Сепе 13:355 (1981), Сгоуеап апб Иегк, Сепе 18:199 (1982), Но1т, Νοο. Аек1к Век. 14:3075 (1986), 1кетига, I. Μοί. Βίο1. 158:573 (1982), 811агр апб Ма!акк1, Сигг. Ορίη. Сепе!. Эеу. 4:851 (1994), Капе, Сигг. 0рш. Вю!ее1по1 6:494 (1995), апб Макпбек, М1егоЬю1. Веу. 60:512 (1996). В значении, принятом в настоящем описании изобретения, термин использование предпочтительных кодонов или предпочтительные кодоны означает кодоны трансляции белка, которые наиболее часто используются в клетках определенного вида, которые оказывают предпочтение одному или нескольким кодонам из всех возможных кодонов, кодирующих каждую аминокислоту. (см. табл. 2). Например, аминокислота треонин (Тйг) может быть кодирована кодонами АСА, АСС, АСС или АСТ, но в клетках млекопитающих АСС является наиболее часто используемым кодоном; в других видах, например в клетках насекомых, дрожжах, вирусах или бактериях, предпочтительными могут быть другие кодоны Т1п. Предпочтительные кодоны для определенного вида могут быть введены в полинуклеотиды по настоящему изобретению разными методами, известными в данной области. Введение последовательностей предпочтительных кодонов в рекомбинантную ДНК может, например, усиливать продукцию белка, делая трансляцию белка более эффективной в определенном типе клеток или виде. Поэтому последовательности вырожденных кодонов, раскрытые в настоящем описании изобретения, служат в качестве матрицы для оптимизации экспрессии полинуклеотидов в разных типах клеток и видах, обычно используемых в данной области и раскрытых в настоящем описании изобретения. Последовательности, содержащие предпочтительные кодоны, можно исследовать и оптимизировать для экспрессии в разных видах, а также испытать в отношении функциональности методами, раскрытыми в настоящем описании изобретения.

кДНК, кодирующую 1Ь-22ВА, можно выделить различными методами, такими как зондирование непроцессированной или процессированной кДНК человека, либо с помощью одного или нескольких наборов вырожденных зондов на основе рассмотренных последовательностей. кДНК можно также клонировать при помощи полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, созданных на основании характерных последовательностей 1Ь-22ВА человека, раскрытых в настоящем описании изобретения. Кроме того, для трансформации или трансфекции клеток-хозяев можно использовать библиотеку кДНК, и экспрессию представляющей интерес кДНК можно определить с помощью антитела к полипептиду 1Ь-22ВА.

Специалистам в данной области должно быть известно, что последовательность, показанная в 8ЕО ГО N0: 1, представляет одну аллель 1Ь-22ВА человека, при этом возможна аллельная вариация и альтернативный сплайсинг. Аллельные варианты указанной последовательности могут быть клонированы путем зондирования библиотек кДНК или геномных библиотек разных субъектов стандартными методами. В объем настоящего изобретения входят аллельные варианты нуклеотидных последовательностей, раскрытые в настоящем описании изобретения, в том числе аллельные варианты, содержащие молчащие мутации, и аллельные варианты, в которых мутации вызывают изменения аминокислотной последовательности, а также белки, которые являются аллельными вариантами аминокислотных последовательностей, раскрытых в настоящем описании изобретения. В объем настоящего изобретения входят также молекулы кДНК, образованные из альтернативно сплайсированных мРНК, которые сохраняют свойства полипептида 1Ь-22ВА, а также полипептиды, кодированные такими кДНК и мРНК. Аллельные варианты и сплайсированные варианты указанных последовательностей могут быть клонированы путем зондирования библиотек кДНК или геномных библиотек разных субъектов или тканей стандартными методами, известными в данной области.

При помощи вышеописанных методов специалист в данной области может получить разные полипептиды, включающие субъединицу растворимого рецептора 1Ь-22ВА, которая, по существу, гомологична 8Е0 ГО N0: 1, или кодирует аминокислоты 8Е0 ГО N0: 3, или ее аллельные варианты, и сохраняющие лигандсвязывающие свойства рецептора 1Ь-22ВА дикого типа. Такие полипептиды могут также включать дополнительные полипептидные сегменты, раскрытые в настоящем описании изобретения.

В определенных вариантах осуществления изобретения выделенные молекулы нуклеиновой кислоты могут гибридизироваться в жестких условиях с молекулами нуклеиновой кислоты, содержащими нуклеотидные последовательности, раскрытые в настоящем описании изобретения. Например, такие молекулы нуклеиновой кислоты могут гибридизироваться в жестких условиях с молекулами нуклеиновой

- 11 015706 кислоты, содержащими нуклеотидную последовательность 8ЕО Ш N0: 1, или с молекулами нуклеиновой кислоты, содержащими нуклеотидную последовательность, комплементарную 8Е0 Ш N0: 1 или ее фрагментам.

Как правило, жесткие условия выбраны из температуры, которая примерно на 5°С ниже точки плавления (Т_т) конкретной последовательности при определенной ионной силе и значении рН. Т_т означает температуру (при определенной ионной силе и значении рН), при которой 50% последовательностимишени гибридизируется с максимально совмещенным зондом. После гибридизации молекулы нуклеиновой кислоты могут быть промыты для удаления молекул нуклеиновой кислоты, которые не гибридизировали в жестких условиях или в очень жестких условиях. См., например, публикации 8ашЬтоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошид: А БаЬогаЮгу Мапиа1, 8есоиб Εάίίίοη (Со1б 8ртшд НагЬог Ргс55 1989); Аи8иЬе1 е! а1., (еб§.), Ситтеи! Рто!осок ίη Мо1еси1аг Вю1оду (.Гойи \УПеу аиб 8ои§, 1ис. 1987); Вегдег аиб К1тте1 (еб§.), Сшбе 1о Мо1еси1аг С1оишд Тесйшдиек, (Асабетю Ргекк, 1ис. 1987); аиб \Ае1тиг. Сгй. Реу. Вюсйет. Мо1. Вю1. 26:227 (1990)). Анализ последовательности и вычисление Т_т на основании определяемых пользователем критериев можно произвести при помощи программного обеспечения для анализа последовательностей, такого как 0БЮ0 6.0 (Б8Р; Бонд Баке, М№) и Рптег Ргет1ег 4.0 (Ргет1ег Еюкой Ги1егиайоиа1; Ра1о Айо, СА), а также на сайтах в Интернете. Специалист в данной области может адаптировать условия гибридизации и промывки для определенного полинуклеотидного гибрида.

Настоящее изобретение также относится к выделенным полипептидам ГБ-22КА, в которых подобные последовательности, по существу, идентичны полипептидам 8Е0 Ш N0: 3 или их ортологам. Термин идентичность, по существу, подобных последовательностей в значении, использованном в настоящем описании изобретения, означает полипептиды, которые по крайней мере на 70%, по крайней мере на 80%, по крайней мере на 90%, по крайней мере на 95% или более чем на 95%, в частности на 96, 97, 98%, или более идентичны последовательностям, показанным в 8Е0 Ш N0: 3, или их ортологам. Например, варианты и ортологи рецепторов ББ-22КА можно использовать для индукции иммунной реакции и создания перекрестно реактивных антител к ББ-22КА. человека. Такие антитела могут быть гуманизированы и модифицированы в соответствии с настоящим описанием изобретения, и использованы для лечения псориаза, псориатического артрита, БВО, колита, эндотоксемии и в других терапевтических применениях, раскрытых в настоящем описании изобретения.

Настоящее изобретение также относится к молекулам вариантной нуклеиновой кислоты ББ-22КА, которые могут быть идентифицированы на основании двух критериев: определение сходства кодированного полипептида с аминокислотной последовательностью 8Е0 Ш N0: 3 и выполнение анализа методом гибридизации. Такие варианты ББ-22КА включают молекулы нуклеиновой кислоты, которые (1) остаются гибридизированными с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность 8Е0 Ш N0: 1 (или ее комплемент) в жестких условиях промывки, в которых жесткость промывки эквивалентна 0,5-2-кратному объему 88С с 0,1% 8Ό8 при 55-65°С, и (2) кодируют полипептид, который по крайней мере на 70%, по крайней мере на 80%, по крайней мере на 90%, по крайней мере на 95% или более чем на 95%, в частности на 96, 97, 98 или 99% идентичен аминокислотной последовательности 8Е0 Ш N0: 3. Альтернативно варианты ББ-22КА можно охарактеризовать как молекулы нуклеиновой кислоты, которые (1) остаются гибридизированными с молекулой нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью 8Е0 Ш N0: 1 (или комплементарной ей последовательностью) в очень жестких условиях промывки, в которых жесткость промывки эквивалентна 0,1-02-кратному объему 88С с 0,1% 8Ό8 при 50-65°С, и (2) кодируют полипептид, который по крайней мере на 70%, по крайней мере на 80%, по крайней мере на 90%, по крайней мере на 95% или более чем на 95%, в частности на 96, 97, 98, 99% или более идентичен аминокислотной последовательности 8Е0 Ш N0: 3.

Процентную идентичность последовательностей определяют стандартными методами. См., например, публикации Ай§сйи1 е! а1., Ви11. Ма!й. Вю. 48:603 (1986) и НешкоГГ аиб НешкоГГ Ргос. №И. Асаб. 8сБ И8А 89:10915 (1992). Две аминокислотные последовательности подвергают сравнительному анализу для оптимизации оценок соответствия с использованием штрафа за пропуск, равному 10, штрафа за удлинение пропуска, равному 1, и матрицы для подсчета баллов ВЕ08иМ62, описанной в публикации НешкоГГ аиб НешкоГГ (см. выше), в соответствии с табл. 3 (аминокислоты обозначены стандартными однобуквенными кодами). Процентную идентичность затем высчитывают следующим образом:

([общее число идентичных пар]/[длина более длинной последовательности + число пробелов, введенных в более длинную последовательность для совмещения двух последовательностей])(100).

- 12 015706

Таблица 3

	А	к	N	О	С	0	Е	<3	н	I	ъ	к	М	Е	Р	3	Т	те	Υ	V
А	4
К	-1	5
N	-2	0	6
Ό	-2	-2	1	6
С	0	-3	-3	-3	9
0	-1	1	0	0	-3	5
Е	-1	0	0	2	-4	2	5
а	0	-2	0	-1	-3	-2	-2	б
н	-2	0	1	-1	-3	0	0	-2	8
I	-1	-3	-3	-3	-1	-3	-3		-3	4
ь	-1	-2	-3	-4	-1	-2	-3	-4	-3	2	4
к	-1	2	0	-1	-3	1	1	-2	-1	-3	-2	5
м	-1	-1	-2	-3	-1	0	-2	-3	-2	1	2	“1	5
Р	-2	-3	-3	-3	-2	-3	-3	-3	-1	0	0	-3	0	6
Р	-1	-2	-2	-1	-3	-1	-1	-2	“2	-3	-3	-1	-2	-4	7
3	1	-1	1	0	-1	0	0	0	-1	-2	-2	0	-1	-2	-1	4
т	0	-1	0	-1	-1	-1	-1	-2	-2	-1	-1	-1	-1	-2	-1	1	5
те	-3	-3	-4	-4	-2	-2	-3	-2	-2	-3	-2	-3	-1	1	-4	-3	-2	11
Υ	-2	-2	-2	-3	-2	-1	-2	-3	2	-1	-1	-2	-1	3	-3	-2	-2	2	7
V	0	-3	-3	-3	-1	-2	-2	-3	-3	3	1	-2	1	-1	-2	-2	0	-3	-1	4

Специалистам в данной области известно, что существует много алгоритмов для осуществления сравнительного анализа двух аминокислотных последовательностей. Алгоритм поиска сходства ЕА8ТА Пирсона и Липмана является приемлемым методом сравнения белков для исследования степени идентичности аминокислотной последовательности по настоящему изобретению и аминокислотной последовательности предполагаемого варианта 1Ь-22КА. Алгоритм ЕА8ТА описан в публикациях Реагзои аиб Ыртаи, Ргос. ЫаЦ Аеаб. 8с1. И8А 85:2444 (1988) и Реагзои, Ме111. Епхуто1. 183:63 (1990). С помощью алгоритма ЕА8ТА сначала исследуют сходство последовательностей путем идентификации общих областей для запрашиваемой последовательности (например, 8ЕО Ш N0: 2 или 8Е0 Ш N0: 3) и испытуемой последовательности, которые могут характеризоваться наибольшей плотностью идентичных пар (если переменная кШр равна 1) или несколькими идентичными парами (если кШр=2) без учета замен, инсерций или делеций консервативных аминокислот. Затем производят повторную оценку десяти областей с наибольшей плотностью идентичных пар, сравнивая сходство всех парных аминокислот при помощи матрицы замещения аминокислот, и отсекают концы указанных областей так, чтобы они включали только те остатки, которые способствуют получению наивысшей оценки. Если имеется несколько областей, оценки которых выше значения отсечения (вычисленного по заранее выведенной формуле на основании длины последовательности и значения к1ир), тогда исследуют отсеченные исходные области для определения возможности соединения указанных областей с образованием приблизительно совмещенных последовательностей с пробелами. И наконец, области двух аминокислотных последовательностей, получивших наивысшую оценку, совмещают при помощи модифицированного алгоритма НидлманаВанша-Селлерса (№еб1етаи апб ^иизсй, 1. Мо1. Вю1. 48:444 (1970); 8е11егз, 81АМ 1. Арр1. МаШ. 26:787 (1974)), который позволяет учитывать инсерций и делеций аминокислот. Иллюстративные параметры для выполнения анализа с помощью алгоритма ЕА8ТА включают: к1ир=1. штраф за пропуск=10, штраф за удлинение пропуска=1 и матрица замещения=ВЬ08иМ62. Указанные параметры могут быть введены в программу ЕА8ТА путем внесения изменений в файл с матрицей оценки (8МАТК1Х) в соответствии с описанием, приведенным в приложении 2 публикации Реагзои, Ме111. Еихушо1. 183:63 (1990).

С помощью программы ЕА8ТА можно также определить идентичность последовательностей в молекулах нуклеиновых кислот, используя вышеуказанное соотношение. Для сравнения нуклеотидных последовательностей значение кШр может находиться в пределах от одного до шести, предпочтительно от трех до шести, наиболее предпочтительно указанное соотношение равно трем, при этом другие значения задают в соответствии с приведенным выше описанием.

Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептид, содержащий замену консервативных аминокислот по сравнению с аминокислотной последовательностью по настоящему изобретению. Например, могут быть получены варианты, содержащие одну или несколько замен аминокислот 8Е0 Ш N0: 3, в которых алкиламинокислота в аминокислотной последовательности 1Е-22ВА заменена другой алкиламинокислотой, ароматическая аминокислота в аминокислотной последовательности 1Е-22ВА заменена другой ароматической аминокислотой, серосодержащая аминокислота в аминокислотной последовательности 1Е-22ВА заменена другой серосодержащей аминокислотой, гидроксисодержащая аминокислота в аминокислотной последовательности 1Е-22ВА заменена другой гидроксисодержащей аминокислотой, кислая аминокислота в аминокислотной последовательно

- 13 015706 сти 1Б-22РЛ заменена другой кислой аминокислотой, основная аминокислота в аминокислотной последовательности 1Б-22РЛ заменена другой основной аминокислотой, или двухосновная монокарбоновая аминокислота в аминокислотной последовательности 1Ь-22К.А заменена другой двухосновной монокарбоновой аминокислотой. Например, замену консервативной аминокислоты можно проиллюстрировать заменой аминокислот, выбранных из нижеследующих групп: (1) глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин, (2) фенилаланин, тирозин и триптофан, (3) серин и треонин, (4) аспартат и глутамат, (5) глутамин и аспарагин и (6) лизин, аргинин и гистидин. В табл. ВЬО8иМ62 приведена матрица замещения аминокислот, созданная на основе примерно 2000 локальных множественных выравниваний сегментов белковых последовательностей, представляющих высококонсервативные области для более 500 групп родственных белков (НсшкоГГ апб НсшкоГГ, Ргос. Νη1'1 Леаб. 8с1. И8А 89:10915 (1992)). Частоту замещений в матрице ВЬО8ИМ62 можно использовать для определения замен консервативных аминокислот, которые могут быть введены в аминокислотные последовательности по настоящему изобретению. Хотя замены аминокислот можно определить, основываясь только на химических свойствах (описанных выше), термин замена консервативных аминокислот предпочтительно означает замену, выраженную значением ВЬО8ИМ62 выше -1. Например, заменяемая аминокислота является консервативной, если указанная замена характеризуется значением ВЬО8иМ62, равным 0, 1, 2 или 3. В соответствии с данной системой предпочтительные замены консервативных аминокислот характеризуются значением ВЬО8иМ62, равным по крайней мере 1 (например 1, 2 или 3), в то время как более предпочтительные замены консервативных аминокислот характеризуются значением ВЬО8иМ62, равным по крайней мере 2 (например, 2 или 3). Конкретные варианты 1Ь-22К.Л характеризуются по крайней мере 70%, по крайней мере 80%, по крайней мере 90%, по крайней мере 95% или более чем 95%, в частности 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с соответствующей аминокислотной последовательностью (например, 8ЕЦ Ш NО: 3), причем изменение аминокислотной последовательности вызвано одной или несколькими заменами консервативных аминокислот.

Замены консервативных аминокислот в гене 1Ь-22К.Л могут быть произведены, например, путем замены нуклеотидов, указанных в 8ЕЦ Ш NО: 1, другими нуклеотидами. Такие варианты консервативных аминокислот могут быть получены в результате сайтнаправленного мутагенеза с использованием олигонуклеотидов, мутагенеза со сканированием линкера, мутагенеза при помощи полимеразной цепной реакции и тому подобных (см. публикации ЛихиЬс1 (1995); и МсРйсгхоп (еб.), Ойссйб МсЕщспсхБ: А Ртасйса1 Арртоасй (1ВЬ Ргехх 1991)). Вариантный полипептид 1Б-22ВА можно идентифицировать по способности специфически связывать антитела против 1Ь-22КА..

Белки по настоящему изобретению могут также включать синтезированные неприродные аминокислотные остатки. Такие аминокислоты включают, не ограничиваясь ими, транс-3-метилпролин, 2,4метанопролин, цис-4-гидроксипролин, транс-4-гидроксипролин, Ν-метилглицин, аллотреонин, метилтреонин, гидроксиэтилцистеин, гидроксиэтилгомоцистеин, нитроглутамин, гомоглутамин, пипеколиновую кислоту, тиазолидинкарбоновую кислоту, дегидропролин, 3- и 4-метилпролин, 3,3-диметилпролин, трет-лейцин, норвалин, 2-азафенилаланин, 3-азафенилаланин, 4-азафенилаланин и 4-фторфенилаланин. В данной области известно несколько методов введения в белки неприродных аминокислотных остатков. Например, можно использовать систему ίη уйто, в которой нонсенс-мутации подавляются при помощи химически аминоацилированных супрессорных кРНК. В данной области известны методы синтеза аминокислот и аминоацилирования тРНК. Транскрипцию и трансляцию плазмид, содержащих нонсенсмутации, обычно выполняют в бесклеточной системе, включающей экстракт 830 Е.сой, коммерчески доступные ферменты и другие реагенты. Белки очищают хроматографией. См., например, публикации ВоЬсйхоп с! а1., I. Ат. Сйст. 8ос. 113:2722 (1991), Е11тап с! а1., Мсбюбх Епхуток 202:301 (1991), Сйипд е! а1., 8с1спсс 259:806 (1993) и Сйип§ е! а1., Ргос. №1'1 Асаб. 8ск И8А 90:10145 (1993).

В соответствии со вторым методом трансляцию выполняют в ооцитах Хспорих путем микроинъекции мутированной мРНК и химически аминоацилированных супрессорных тРНК (Титсай с! а1., 1. Вю1. С11ст. 271:19991 (1996)). В соответствии с третьим методом клетки Е.сой культивируют в отсутствие природной аминокислоты, подлежащей замене (например, фенилаланин), и в присутствии требуемой, неприродной аминокислоты (например, 2-азафенилаланин, 3-азафенилаланин, 4-азафенилаланин или 4фторфенилаланин). Неприродную аминокислоту вводят в белок вместо природного аналога. См. публикацию Ко1бс с! а1., Вюсйст. 33:7470 (1994). Природные аминокислотные остатки можно превратить в неприродные аналоги путем химической модификации ш уйго. Химическая модификация может быть объединена с сайтнаправленным мутагенезом для дальнейшего расширения диапазона замещений (\Уупп апб Ктсйатбк, Рго1сш 8с1. 2:395 (1993)).

Аминокислотные остатки 1Б-22КА. могут быть заменены ограниченным числом неконсервативных аминокислот, аминокислот, не кодированных данным генетическим кодом, неприродных аминокислот и синтезированных аминокислот.

Незаменимые аминокислоты в полипептидах по настоящему изобретению могут быть идентифицированы методами, известными в данной области, такими как сайтнаправленный мутагенез или мутагенез со сканированием аланина (Сипшпдйат апб ХУсИх, 8с1спсс 244:1081 (1989), Вахх с! а1., Ргос. Ν;·ι1'1 Асаб. 8с1. И8А 88:4498 (1991), СоотЬх апб Согсу, 8йс-01гсс1сб Ми1адспс818 апб Рто1ст Епдтссппд, т Рго

- 14 015706

1ешк: Апа1ук1к апб Эсбдп. Апде1ей1 (еб.), радек 259-311 (Асабешк Ргекк, 1пс. 1998)). В соответствии с последним методом единичные мутации аланина вводят в положении каждого остатка в молекуле и полученные мутантные молекулы анализируют в отношении биологической активности для идентификации аминокислотных остатков, влияющих на активность молекулы. См. также публикации Ηίΐΐοη е! а1., 1. Βίο1. Сйеш. 271:4699 (1996).

Несмотря на возможность использования анализа последовательности для дальнейшего определения лигандсвязывающей области 1Б-22РЛ. аминокислоты, определяющие активность связывания 1Ь22К.Л (такую как связывание 1Б-22РЛ с лигандом 1Ь-22 или антителом против 1Б-22РЛ). можно также определить путем физического анализа структуры, выполняемого такими методами как спектроскопия ядерного магнитного резонанса, кристаллография, дифракция электронов или фотоаффинное мечение в сочетании с мутацией аминокислот предполагаемого сайта контактирования. См., например, публикации бе νοκ е! а1., 8с1епсе 255:306 (1992), 8шйй е! а1., 1. Μο1. Βίο1. 224:899 (1992) и \У1обауег е! а1., ΡΕΒ8 Ьей. 309:59 (1992).

Несколько аминокислот можно заменить и исследовать указанные замены при помощи известных методов мутагенеза и скрининга, аналогичных описанным в публикациях К.е^бйаа^-Ο1кοη апб 8аиег (8с1епсе 241:53 (1988)) или Βο\\^ апб 8аиег (Ргос. Ыа!'1 Асаб. 8сг ϋδΆ 86:2152 (1989)). Вышеуказанные авторы описывают методы одновременной рандомизации двух или более положений в полипептиде, выбора функционального полипептида и последующего секвенирования подвергнутых мутагенезу полипептидов для определения спектра допустимых замен в каждом положении. Другие приемлемые методы включают фаговый дисплей (см., например, публикацию Ρο\νιη;·ιι·ι е! а1., Вюсйеш. 30:108 32 (1991), патент США № 5223409 (Ьабпег е! а1.), международную публикацию № \¥О 92/06204 (Нике)) и областьнаправленный мутагенез (ОегЬукЫге е! а1., Сепе 46:145 (1986) и №г е! а1., ΌΝΆ 7:127 (1988)). Кроме того, для клонирования с целью экспрессии лигандов 1Ь-22КА. можно использовать 1Ь-22КА, меченный биотином или Е1ТС.

Варианты раскрытых нуклеотидных и полипептидных последовательностей 1Ь-22КА могут быть также созданы методом перестановки ДНК, описанным в публикациях 8!ешшег, №Шге 370:389 (1994), 8!ешшег, Ргос. №1'1 Асаб. 8сг И8А 91:10747 (1994) и в международной публикации № \¥О 97/20078. Вариантные молекулы ДНК получают методом гомологичной рекомбинации ш νίΐτο путем произвольной фрагментации родительской ДНК с последующим выполнением вторичной сборки при помощи РСК, что позволяет ввести произвольные точечные мутации. Указанный метод может быть модифицирован в результате использования семейства молекул родительской ДНК, таких как аллельные варианты или молекулы ДНК из разных видов, для введения дополнительной изменчивости в данный процесс. Отбор или скрининг требуемой активности с последующим выполнением дополнительных итераций мутагенеза и анализа обеспечивает быструю эволюцию последовательностей в результате отбора требуемых мутаций при одновременном выявлении вредных изменений.

Методы мутагенеза, раскрытые в настоящем описании изобретения, могут быть объединены с высокопроизводительными, автоматизированными методами скрининга для обнаружения активности клонированных, подвергнутых мутагенезу полипептидов в клетках-хозяевах. Молекулы подвергнутой мутагенезу ДНК, кодирующие биологически активные полипептиды или полипептиды, связывающиеся с антителами против 1Ь-22К.А, могут быть выделены из клеток-хозяев и быстро секвенированы при помощи современного оборудования. Указанные методы делают возможным быстрое определение значения отдельных аминокислотных остатков в представляющем интерес полипептиде и могут быть применены для исследования полипептидов с неизвестной структурой.

Настоящее изобретение относится также к функциональным фрагментам полипептидов 1Ь-22КА и молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим такие функциональные фрагменты. Обычные анализы делеций в молекулах нуклеиновых кислот могут быть выполнены для получения функциональных фрагментов молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид 1Ь-22КА. В качестве иллюстрации можно отметить, что молекулы ДНК, имеющие нуклеотидную последовательность 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1, могут быть расщеплены нуклеазой Ва131 для получения ряда вложенных делеций. Полученные фрагменты затем вводят в соответствующую рамку считывания экспрессирующих векторов, и экспрессированные полипептиды выделяют и испытывают в отношении способности связывать антитела против 1Ь-22КА. Альтернативой расщеплению экзонуклеазой является сайтнаправленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов для введения делеций или терминирующих кодонов для специфического продуцирования требуемого фрагмента. Альтернативно можно синтезировать определенные фрагменты гена 1Ь-22КА при помощи полимеразной цепной реакции.

Раскрытый выше общий подход, подтвержденный исследованиями по усечению одного или обоих концов интерферонов, суммирован в публикации Ηοπδ^^Γ апб Όί Магто, Рйагшас. Тйег. 66:507 (1995). Кроме того, стандартные методы функционального анализа белков описаны, например, в публикациях Тгеи!ег е! а1., Μο^. Сеп. Сепе!. 240:113 (1993), ^пеп! е! а1., Ехргеккюп апб ргейш1пагу бе1е!юп апа1ук1к οί !йе 42 кЭа 2-5А куп!йе!аке шбисеб Ьу йишап ш!егГегоп, ш Β^ο1οд^са1 йИегГегоп 8ук!ешк, Ргосеебшдк οί Ι8ΙΚ.-ΤΝΟ Меебпд οη 1п!егГегоп 8ук!ешк, Сап!е11 (еб.), радек 65-72 (Νί)1ιοΓΓ 1987), Негксйшап, Тйе ЕСЕ КесерФг, ш СогИгсИ οί Ашша1 Се11 Рго1йега!юп, Υο1. 1, Βοуη!οη е! а1., (ебк.) радек 169-199 (Асабешк Ргекк

- 15 015706

1985), СоитаШеаи е! а1., I. Вю1. Скет. 270:29270 (1995); Рикипада е! а1., I. Вю1. Скет. 270:25291 (1995); УатадисЫ е! а1., Вюскет. Ркагтасо1. 50:1295 (1995), апб Ме18е1 е! а1., Р1ап! Мо1ес. ΒίοΙ. 30:1 (1996).

Анализ конкретных последовательностей, раскрытых в настоящем описании изобретения, позволяет получить ряд иллюстративных функциональных фрагментов, представленных в табл. 4. Нуклеотиды, кодирующие дополнительные функциональные вариантные домены 1Ь-22КА. человека, раскрытые в настоящем описании изобретения, но не показанные в табл. 4, можно определить, обратившись к 8ЕО ГО N0: 1. Такие функциональные фрагменты включают, например, нижеследующие нуклеотидные последовательности 8Е0 ГО N0: 1: нуклеотиды 85-381, 206-717 и 85-717 8ЕЦ ГО N0: 1 и кодированные ими соответствующие аминокислотные последовательности, показанные соответственно в 8Е0 ГО N0: 2 и 8Е0 ГО N0: 3.

Таблица 4

Признак ΙΣ-22ΚΑ	Аминокислотные остатки (5Е<2 Ю N0:2)	Нуклеотиды (ЗЕ<Э Ιϋ N0:1)
Первый домен 1д	18-116	85-381
Второй домен 1д	125-228	206-717
Оба домена 1д	18-228	85-717

Настоящее изобретение относится также к функциональным фрагментам гена 1Ь-22КА., содержащим замены аминокислот, по сравнению с аминокислотной последовательностью, раскрытой в настоящем описании изобретения. Вариантный ген 1Ь-22КА может быть идентифицирован по структуре путем определения степени идентичности с рассмотренными выше нуклеотидными и аминокислотными последовательностями. Альтернативным методом идентификации вариантного гена по структуре является определение способности молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей потенциальный вариантный ген 1Ь-22ВА, гибридизировать с молекулой нуклеиновой кислоты, включающей такую нуклеотидную последовательность как 8Е0 ГО N0: 1.

Настоящее изобретение также относится к применению функциональных фрагментов полипептидов 1Ь-22ВА, антигенных детерминант, несущих антигенную детерминанту сегментов полипептидов 1Ь22КА и молекул нуклеиновых кислот, кодирующих такие функциональные фрагменты, антигенные детерминанты, несущие антигенную детерминанту сегменты полипептидов 1Ь-22ВА. Такие фрагменты используют для создания полипептидов, применяемых для получения антител и связывающих партнеров, которые связывают, блокируют, ингибируют, ослабляют, оказывают антагонистическое действие или нейтрализуют активность 1Ь-22 или 1Ь-20 и 1Ь-22 вместе. Функциональный полипептид 1Ь-22ВА или его фрагмент по настоящему изобретению характеризуется способностью блокировать, ингибировать, ослаблять, оказывать антагонистическое действие или нейтрализовать воспалительную, пролиферативную или дифференцирующую активность 1Ь-20 или 1Ь-22 благодаря способности индуцировать или ингибировать функции специализированных клеток или благодаря способности специфически связываться с антителом против 1Ь-22ВА, клеткой, 1Ь-20 или 1Ь-22. Как было описано выше, 1Ь-22ВА имеет структуру рецептора цитокина класса II и домены, раскрытые в настоящем описании изобретения. Таким образом, настоящее изобретение, кроме того, относится к применению слитых белков, включающих: (а) молекулы полипептида, содержащие один или несколько вышеописанных доменов, и (Ь) функциональные фрагменты, содержащие один или несколько указанных доменов. Другая полипептидная часть слитого белка может быть образована другим рецептором цитокина класса II, таким как 1Ь-10В, 1Ь-13В, 1Ь20КА, [к-20ВВ. [Ь-ЮЕВ (СКР2-4), [к-22ВА2 или ненативным и/или неродственным секреторным сигнальным пептидом, который облегчает секрецию слитого белка.

Настоящее изобретение также относится к фрагментам полипептидов или пептидам, содержащим сегмент полипептида ГО^КА, несущий антигенную детерминанту, раскрытую в настоящем описании изобретения. Такие фрагменты или пептиды могут содержать иммуногенную антигенную детерминанту, которая является частью белка, вызывающей образование антител, при использовании в качестве иммуногена полноразмерного белка. Иммуногенные пептиды, несущие антигенную детерминанту, могут быть идентифицированы стандартными методами (см., например, публикацию Сеукеп е! а1., Ргос. N<11'1 Асаб. 8οΐ И8А 81:3998 (1983)).

В отличие от этого фрагменты полипептидов или пептиды могут содержать антигенную детерминанту, являющуюся областью молекулы белка, с которой может специфически связываться антитело. Определенные антигенные детерминанты состоят из линейного или смежного фрагмента аминокислот, и антигенность такой антигенной детерминанты не может быть уничтожена денатурирующими агентами. В данной области известно, что относительно короткие синтетические пептиды, способные имитировать антигенные детерминанты белка, можно использовать для стимуляции продукции антител против данного белка (см., например, публикацию 8и1с1Ше е! а1., 8аепсе 219:660 (1983)). Соответственно пептиды, несущие антигенную детерминанту, антигенные пептиды, антигенные детерминанты и полипептиды по

- 16 015706 настоящему изобретению можно использовать для получения антител, связывающихся с полипептидами по настоящему изобретению, а также для идентификации и скрининга моноклональных антител против ГЬ-22КА, которые обладают нейтрализующими свойствами и могут связывать, блокировать, ингибировать, ослаблять, оказывать антагонистическое действие или нейтрализовать активность ГЬ-22 и ГЬ-20 (отдельно или вместе). Такие нейтрализующие моноклональные антитела по настоящему изобретению могут связываться с антигенной детерминантой ГЬ-22КА. Для определения областей, обладающих наибольшим антигенным потенциалом в 8ЕЦ ГО N0: 3, можно использовать профили гидрофильности Хоппа-Вудса (Норр е! а1., Ргос. №11. Асаб. 8а. 78:3824-3828, 1981; Норр, 1. Гттип. Ме1й. 88:1-18, 1986 апб Тицшег е! а1., Рто!еш Епдтеебпд 11:153-169, 1998). Указанный профиль создан на основе скользящего окна из шести остатков. Скрытые остатки С, 8 и Т и открытые остатки Н, Υ и во внимание не принимались. Специалист в данной области может определить указанные области в ГЬ-22КА. Кроме того, антигенные детерминанты ГЬ-22КА в 8ЕЦ ГО N0: 3, прогнозируемые на основании графика ДжеймсонаВульфа, например, при помощи программы Рго1еап 0НЛ8ТАК. (0НА8ТАК.. Гпс., Маб1зоп, ^Г), служат в качестве предпочтительных антигенных детерминант и могут быть определены специалистом в данной области. Такие антигенные детерминанты включают (1) аминокислотные остатки 1 (Рго) - 6 (Азр) 8ЕЦ ГО N0: 3; (2) аминокислотные остатки 26 (8ег) - 32 (Рго) 8ЕЦ ГО N0: 3; (3) аминокислотные остатки 41 (Ьуз) 47 (Азр) 8ЕЦ ГО N0: 3; (4) аминокислотные остатки 49 (Уа1) - 62 (Суз) 8ЕЦ ГО N0: 3; (5) аминокислотные остатки 41 (Ьуз) - 62 (Суз) 8ЕЦ ГО N0: 3; (6) аминокислотные остатки 84 (А1а) - 97 (8ег) 8ЕЦ ГО N0: 3; (7) аминокислотные остатки 103 (Т1г) - 108 (Азр) 8ЕЦ ГО N0: 3; (8) аминокислотные остатки 130 (Агд) 135 (Н1з) 8ЕЦ ГО N0: 3; (9) аминокислотные остатки 164 (С1у) - 166 (Ьуз) 8ЕЦ ГО N0: 3; (10) аминокислотные остатки 175 (Туг) - 179 (С1и) 8ЕЦ ГО N0: 3; (11) аминокислотные остатки 193 (Ьуз) - 196 (А1а) 8ЕЦ ГО N0: 3; (12) аминокислотные остатки 203 (Ьуз) - 209 (Т1г) 8ЕЦ ГО N0: 3. Дополнительные антигенные детерминанты включают нижеследующие пептиды, потенциально получаемые из невосстановленного непроцессированного ГЬ-22КА человека, расщепленного СпВг: пептид 6 (8ЕЦ ГО N0: 56), пептид 7 (8ЕС) ГО N0: 57), пептид 8 (8ЕС) ГО N0: 58), пептид 9 (8ЕО ГО N0: 59), пептид 10 (8ЕО ГО N0: 60) и пептид 11 (8ЕЦ ГО N0: 61). Цистеины связаны дисульфидными связями с образованием возможной связи между пептидами 7 (8ЕЦ ГО N0: 57) и 10 (8ЕЦ ГО N0: 60). В частности, 8ЕЦ ГО N0: 56 соответствует аминокислотным остаткам 1 (Рго) - 92 (Ме!) 8ЕЦ ГО N0: 3; 8ЕЦ ГО N0: 57 соответствует аминокислотным остаткам 93 (Тбт) - 120 (Ме!) 8ЕЦ ГО N0: 3; 8ЕЦ ГО N0: 58 соответствует аминокислотным остаткам 121 (Г1е) - 160 (Ме!) 8ЕЦ ГО N0: 3; 8ЕЦ ГО N0: 59 соответствует аминокислотным остаткам 161 (Н1з) - 185 (Ме!) 8ЕЦ ГО N0: 3; 8ЕЦ ГО N0: 60 соответствует аминокислотным остаткам 186 (Г1е) - 199 (Ме!) 8ЕЦ ГО N0: 3 и 8ЕЦ ГО N0: 61 соответствует аминокислотным остаткам 200 (Суз) - 211 (Тбт) 8ЕЦ ГО N0: 3. Кроме того, остатки 8ЕЦ ГО N0: 2 (и соответствующие остатки 8ЕЦ ГО N0: 3), имеющие важное значение для связывания лиганда с рецептором, включают Туг-60 и Рбе-164, Туг-93, Агд-112, Ьуз-210 и С1и-211 8ЕЦ ГО N0: 2 (и соответствующие остатки 8ЕЦ ГО N0: 3). Первичные остатки 8ЕЦ ГО N0: 2 (и соответствующие остатки 8ЕЦ ГО N0: 3), имеющие важное значение для направления связывания лиганда с рецептором, включают Туг-60 и Рбе-164 8ЕЦ ГО N0: 2 (и соответствующие остатки 8ЕЦ ГО N0: 3), и вторичные остатки включают остатки Туг-93, Агд-112, Ьуз-210 и С1и-211 8ЕЦ ГО N0: 2 (и соответствующие остатки 8ЕЦ ГО N0: 3). В предпочтительных вариантах осуществления изобретения антигенные детерминанты, с которыми связываются нейтрализующие антитела по настоящему изобретению, содержат остатки 8ЕЦ ГО N0: 2 (и соответствующие остатки 8ЕЦ ГО N0: 3), которые имеют важное значение для связывания лиганда с рецептором, например с ГЬ-22КА и ГЬ-20 или ГЬ-22 (отдельно или вместе).

Несущие антигенную детерминанту пептиды и полипептиды могут содержать по крайней мере 4-10 аминокислот, по крайней мере 10-15 аминокислот или примерно 15-30 аминокислот в аминокислотной последовательности по настоящему изобретению. Такие несущие антигенную детерминанту пептиды и полипептиды могут быть получены путем фрагментации полипептида ГЬ-22КА или химического синтеза пептидов, раскрытого в настоящем описании изобретения. Кроме того, антигенные детерминанты могут быть отобраны с помощью фагового дисплея неспецифических пептидных библиотек (см., например, публикации Ьапе апб 8!ер1еп, Сигг. 0рш. Гттипо1. 5:268 (1993) и Сойезе е! а1., Сигг. 0рт. Вю1ес1то1. 7:616 (1996)). Стандартные методы идентификации антигенных детерминант и получения антител из низкомолекулярных пептидов, несущих антигенную детерминанту, описаны, например, в публикациях Мо1е, Ерйоре Марршд, ш Ме!1обз ш Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 10, Мапзоп (еб.), радез 105-116 (Т1е Нитапа Ргезз, Гпс. 1992), Рпсе, Ргобисбоп апб СНагайеп/айоп о! 8уп1бебс Рерббе-ЭеШеб АпбЬоб1ез, т Мопос1опа1 АпбЬоб1ез: Ргобисбоп, Епдшееппд, апб С11шса1 Аррбсабоп, Ктбет апб Ьабутап (ебз.), радез 60-84 (СатЬпбде ЬпЕегзбу Ргезз 1995), апб Собдап е! а1. (ебз.), Сиггеп! Рго!осо1з т Гттипо1оду, радез 9.3.1-9.3.5 апб радез 9.4.1-9.4.11 ЦоЬп А'11е\ & 8опз 1997).

Для любого полипептида ГЬ-22КА, включая варианты и слитые белки, специалист в данной области может легко создать полностью вырожденную полинуклеотидную последовательность, кодирующую данный вариант, используя информацию, приведенную выше в табл. 1 и 2. Кроме того, специалисты в данной области могут использовать стандартное программное обеспечение для создания вариантов ГЬ22КА на основе нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, раскрытых в настоящем описа

- 17 015706 нии изобретения.

5. Получение полипептидов 1Б-22ЕА.

Полипептиды по настоящему изобретению, включая полноразмерные полипептиды; растворимые мономерные, гомодимерные, гетеродимерные и мультимерные рецепторы; полноразмерные рецепторы; фрагменты рецепторов (например, лигандсвязывающие фрагменты и антигенные детерминанты), функциональные фрагменты и слитые белки, могут быть получены в рекомбинантных клетках-хозяевах стандартными методами. Для экспрессии гена 1Б-22ЕА молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая данный полипептид, должна быть функционально связана с регуляторными последовательностями, контролирующими транскрипцию в экспрессирующем векторе, и затем введена в клетку-хозяина. Помимо последовательностей, регулирующих транскрипцию, таких как промоторы и энхансеры, экспрессирующие векторы могут содержать последовательности, регулирующие трансляцию, и ген-маркер, подходящий для селекции клеток, содержащих экспрессирующий вектор.

Экспрессирующие векторы, которые подходят для получения чужеродного белка в эукариотических клетках, обычно содержат (1) элементы прокариотической ДНК, кодирующие бактериальный ориджин репликации и маркер устойчивости к антибиотикам, обеспечивающие рост и отбор экспрессирущего вектора в бактериальном хозяине; (2) элементы эукариотической ДНК, контролирующие инициацию транскрипции, такие как промотор; и (3) элементы ДНК, контролирующие процессинг транскриптов, такие как последовательность терминации транскрипции/полиаденилирования. Как было указано выше, экспрессирующие векторы могут также включать нуклеотидные последовательности, кодирующие секреторную последовательность, которая направляет гетерологичный полипептид в секреторный путь клетки-хозяина. Например, экспрессирующий вектор 1Б-22ЕА может включать ген 1Б-22ЕА и секреторную последовательность, выделенную из любого секретированного гена.

Белки 1Б-22ЕА по настоящему изобретению могут быть экспрессированы в клетках млекопитающих. Примеры приемлемых клеток-хозяев млекопитающих включают клетки почки африканской зеленой мартышки (Уего; АТСС СЕБ 1587), эмбриональные клетки почки человека (293-НЕК; АТСС СЕБ 1573), клетки почки детеныша хомячка (ВНК-21, ВНК-570; АТСС СЕБ 8544, АТСС СЕБ 10314), клетки почки собаки (МОСК, АТСС ССБ34), клетки яичника китайского хомячка (СНО-К1; АТСС ССБ61; СНО ΌΟ44 (Сйакт е! а1., 8от. Се11. Мо1ес. Сепе!. 12:555, 1986), гипофизарные клетки крысы (СН1; АТСС ССБ82), клетки НеБа 83 (АТСС ССБ22), клетки гематомы крысы (Н-4-ΙΙ-Ε; АТСС СЕБ 1548), 8У40трансформированные клетки почки обезьяны (С08-1; АТСС СЕБ 1650) и эмбриональные клетки мыши (МН-3Т3; АТСС СЕБ 1658).

Сигнальные последовательности, регулирующие транскрипцию и трансляцию, в случае млекопитающего хозяина могут быть выделены из вирусов млекопитающих, таких как, например, аденовирус, вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус обезьян или тому подобные, в которых регуляторные сигнальные последовательности связаны с определенным геном, характеризующимся высоким уровнем экспрессии. Приемлемые последовательности, регулирующие транскрипцию и трансляцию, могут быть также получены из генов млекопитающих, таких как, например, гены актина, коллагена, миозина и металлотионеина.

Последовательности, регулирующие транскрипцию, включают промоторную область, достаточную для инициации синтеза РНК. Приемлемые эукариотические промоторы включают промотор гена металлотионеина I мыши (Натег е! а1., 1. Мо1ес. Арр1. Сепе!. 1:273 (1982)), промотор ТК вируса герпеса (МсКшдй!, Се11 31:355 (1982)), ранний промотор 8У40 (ВепоШ е! а1., №11иге 290:304 (1981), промотор вируса саркомы Рауса (Согтап е! а1., Ргос. №11'1 Асай. 8сБ И8А 79:6777 (1982)), промотор цитомегаловируса (Боесктд е! а1., Сепе 45:101 (1980)) и промотор вируса опухоли молочной железы мыши (см. публикацию Ε!сйеνе^^у, Ехргеккюп оГ Епдтеегей Рго!етк ш Маттайап Се11 Си1!иге, ш Рго!еш Епдтееппд: Ргшс1р1е8 апй Ргасйсе, С1е1апй е! а1. (ейк.), радек 163-181 (1ойп ^йеу & 8опк, 1пс. 1996)).

Альтернативно для контроля экспрессии гена 1Б-22ЕА в клетках млекопитающего может быть использован прокариотический промотор, такой как промотор РНК-полимеразы бактериофага Т3, если прокариотический промотор регулируется эукариотическим промотором (Укон е! а1., Мо1. Се11. Вю1. 10:4529 (1990), апй КаиГтап е! а1., №с1. Ас1йк Кек. 19:4485 (1991)).

В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность ДНК, кодирующая полипептид растворимого рецептора 1Б-22ЕА или фрагмент полипептида 1Б-22ЕА, функционально связана с другими генетическими элементами в экспрессирующем векторе, необходимыми для его экспрессии, включая промотор и терминатор транскрипции. Указанный вектор также обычно содержит один или несколько селектируемых маркеров и один или несколько точек начала репликации, хотя специалистам в данной области должно быть известно, что в некоторых системах селектируемые маркеры могут находиться в отдельных векторах и репликация экзогенной ДНК может быть обеспечена встраиванием в геном клетки-хозяина. Выбор промоторов, терминаторов, селектируемых маркеров, векторов и других элементов является обычной процедурой, известной специалисту в данной области. Многие такие элементы описаны в научной литературе и могут быть приобретены у коммерческих поставщиков. Многие компоненты комплекса растворимого рецептора могут быть одновременно трансфецированы в отдельные экспрессирующие векторы или могут находиться в одном экспрессирующем векторе. Такие методы

- 18 015706 экспрессии нескольких компонентов белковых комплексов хорошо известны в данной области.

Экспрессирующий вектор может быть введен в клетки-хозяева различными стандартными методами, включая трансфекцию с использованием фосфата кальция, трансфекцию, опосредуемую липосомами, доставку микровпрыскиванием, электропорацию и тому подобные. Трансфецированные клетки могут быть отобраны и увеличены в количестве с образованием рекомбинантных клеток-хозяев, содержащих экспрессирующий вектор, стабильно интегрированный в геном клетки-хозяина. Методы введения векторов в эукариотические клетки и методы отбора таких устойчивых трансформантов при помощи доминантного селектируемого маркера описаны, например, в публикациях АизиЬе1 (1995) и Миггау (ей.), Сепе ТгапзГег апй Ехргезз1оп Рго1осо1з (Нитапа Ргезз 1991).

Например, одним из приемлемых селектируемых маркеров является ген, придающий устойчивость к антибиотику неомицину. В данном случае отбор производят в присутствии лекарственного средства типа неомицина, такого как С-418 или тому подобного. Системы отбора могут быть также использованы для увеличения уровня экспрессии представляющего интерес гена, определяемого как амплификация. В процессе амплификации трансфектанты культивируют в присутствии небольшого количества селектирующего агента и затем увеличивают количество селектирующего агента для отбора клеток, продуцирующих продукты введенных генов на высоких уровнях. Приемлемым амплифицируемым селектируемым маркером является дигидрофолат-редуктаза (ЭНЕК), придающая устойчивость к метотрексату. Могут быть также использованы гены, придающие устойчивость к другим лекарственным средствам (например, устойчивость к гигромицину, множественную лекарственную устойчивость, устойчивость к пуромицин-ацетилтранферазе). Альтернативно маркеры, определяющие измененный фенотип, такие как зеленый флуоресцентный белок или поверхностные белки, такие как СЭ4. СЭ8. МНС класса I, плацентарная щелочная фосфатаза, могут быть использованы для отделения трансфецированных клеток от нетрансфецированных клеток такими методами как сортировка при помощи БАС8 или разделение магнитными шариками.

Полипептиды К-22 К А также могут быть продуцированы культивируемыми клетками млекопитающих с использованием вирусной системы доставки. Характерные вирусы, подходящие для указанной цели, включают аденовирус, ретровирусы, вирус герпеса, вирус коровьей оспы и аденоассоциированный вирус (ААУ). Аденовирус, вирус двухцепочечной ДНК, является в настоящее время наиболее изученным вектором переноса гена, используемым для доставки гетерологичной нуклеиновой кислоты (для ознакомления в данным вопросом см. публикации Вескег е! а1., Ме111. Се11 Вю1. 43:161 (1994) и Эоидаз апй Сийе1, 8с1епсе & Мейюше 4:44 (1997)). Преимуществом аденовирусной системы является введение относительно больших ДНК-вставок, способность роста до высокого титра, способность инфицировать целый ряд клеток млекопитающих и гибкость, позволяющая использовать данную систему с большим числом существующих векторов, содержащих разные промоторы.

Удаляя части генома аденовируса, можно создавать более длинные вставки (до 7 т.п.о.) гетерологичной ДНК. Указанные вставки могут быть введены в вирусную ДНК путем прямого лигирования или гомологичной рекомбинации котрансфецированной плазмидой. Одним вариантом является удаление незаменимого гена Е1 из вирусного вектора, что делает невозможной репликацию, если ген Е1 не будет предоставлен клеткой-хозяином. Клетки 293 человека, инфицированные аденовирусным вектором (АТСС №№ СКБ-1573, 45504, 45505), например, можно выращивать в виде клеток, прикрепленных к субстрату или в суспензионной культуре с относительно высокой плотностью клеток для продуцирования белка в значительных количествах (см. публикацию Сат1ег е! а1., СуЮ1ес11по1. 15:145 (1994)).

ГЕ-22КА можно также экспрессировать в других высших эукариотических клетках, таких как клетки птиц, грибов, насекомых, дрожжей или растений. Бакуловирусная система является эффективным средством введения клонированных генов ГЕ-22КА в клетки насекомых. Приемлемые экспрессирующие векторы созданы на основе вируса множественного ядерного полиэдроза Аи1одгарйа сайГогшса (АсМ№У) и содержат хорошо известные промоторы, такие как промотор 70 белка теплового шока дрозофилы (йзр), промотор предраннего гена вируса ядерного полиэдроза Аи1одгарйа сайГогшса (1е-1) и замедленный ранний промотор 39К, промотор бакуловируса р10 и промотор ЭгозорЫ1а те1а11о11иопет. Во втором методе создания рекомбинантного бакуловируса использована система на основе транспозона, описанная в публикации Ьискоте, е! а1., I. У1го1. 67:4566 (1993). Указанная система, в которой использованы переносящие векторы, продается в наборе ВАС-1о-ВАС (Ьйе Тесйно1од1ез, КоскуШе, ΜΌ). В указанной системе использован переносящий вектор, РЕА8ТВАС (Ьйе Тесйно1од1ез), содержащий транспозон Тп7, служащий для переноса ДНК, кодирующей полипептид ГЕ-22КА, в геном бакуловируса, находящегося в Е.со11 в виде большой плазмиды, именуемой бакмид. См. публикации НШ-Регкшз апй Роззее, I. Сеп. У1го1. 71:971 (1990), Вопшпд, е! а1., I. Сеп. У1го1. 75:1551, и СНахепЬаПс апй Каророй, I. Вю1. С1ет. 270:1543 (1995). Кроме того, переносящие векторы могут содержать внутрирамочное слияние с ДНК, кодирующей метку антигенной детерминанты у С- и №конца экспрессированного полипептида ГЕ-22КА, например, метку антигенной детерминанты С1и-С1и (Сгиззептеуег е! а1., Ргос. N<11'1 Асай. 8а. 82: 7952 (1985)). Переносящий вектор, содержащий ген ГЕ-22КА, вводят в Е.соН методом, известным в данной области, и отбирают бакмиды, содержащие поврежденный ген ΕκΖ, свидетельствующий о наличии рекомбинантного бакуловируса. ДНК бакмида, содержащую геном рекомбинантного бакуловиру

- 19 015706 са, затем выделяют стандартными методами.

Иллюстративный вектор РЕА8ТВАС может быть модифицирован в значительной степени. Например, промотор полигедрина может быть удален и заменен промотором основного белка бакуловируса (известного так же, как промотор Рсог, р6.9 или МР), который предварительно экспрессируют, инфицируя бакуловирус, при этом было установлено его преимущество для экспрессии секретируемых белков (см., например, публикации НШ-Регктк апб Роккее, б. Сеп. У1го1. 71:971 (1990), ВопЫпд, е! а1., б. Сеп. У1го1. 75:1551 (1994) и СйахепЬа1к апб Каророй, б. Вю1. Сйет. 270:1543 (1995). В таких переносящих векторах может быть использован короткий или длинный вариант промотора основного белка. Кроме того, могут быть созданы переносящие векторы, заменяющие секреторные сигнальные последовательности нативного 1Й-22КА секреторными сигнальными последовательностями, выделенными из белков насекомых. Например, секреторная сигнальная последовательность, выделенная из экдистероидной глюкозилтрансферазы (ЕСТ), мелиттина медоносной пчелы (1пуйгодеп Согрогайоп; Саг1кЬаб, СА) или бакуловируса др67 (РйагМшдеп; 8ап И1едо, СА), может быть использована в конструкциях для замены секреторной сигнальной последовательности нативного 1Й-22КА.

Для трансфекции клеток-хозяев используют рекомбинантный вирус или бакмид. Приемлемые клетки-хозяева насекомых включают линии клеток, выделенных из 1РЙВ-8Г-21, линию клеток яичника куколки 8робор!ега £гид1регба, такую как 8Г9 (АТСС СКЬ 1711), 8!21АЕ и 8Г21 (1пуйгодеп Согрогайоп; 8ап И1едо, СА), а также клетки Шнейдера-2 дрозофилы и линию клеток Н1СН ЕШЕО (1пуйгодеп), выделенных из ТпсйорЫДа ш (патент США № 5300435). Для выращивания и сохранения клеток можно использовать коммерчески доступную бессывороточную среду. Приемлемыми средами являются среды 81900 II™ (ЬгГе Тесйпо1од1ек) или Е8Е 921™ (Ехргеккюп 8ук!етк) для клеток 8Г9; и Ех-се110405™ (6КН Вюкаепсек, Ьепеха, К8) или Ехргекк ИуеО™ (ЫГе Тесйпо1од1ек) для клеток Т. ш. При использовании рекомбинантного вируса клетки обычно выращивают при плотности инокуляции, равной примерно 2-5х10⁵ клеток, до плотности, равной 1-2х10⁶ клеток, после достижении которой добавляют рекомбинантные вирусы при множественности инфицирования (МО1) от 0,1 до 10, обычно около 3.

Существующие методы получения рекомбинантных белков в бакуловирусных системах описаны в пуликациях Вайеу е! а1., Машри1а!юп оГ Васи1оу1гик Уес!огк, ш Ме!йобк ш Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1ите 7: Сепе ТгапкГег апб Ехргеккюп Рго!осо1к, Миггау (еб.), радек 147-168 (Тйе Нитапа Ргекк, 1пс. 1991), Ьу Ра!е1 е! а1., Тйе Ьаси1оуйик ехргеккюп кук!ет, т ΩΝΛ С1оЫпд 2: Ехргеккюп 8ук!етк, 2пб Ебйюп, С1оуег е! а1. (ебк.), радек 205-244 (ОхГогб ИЫуегкйу Ргекк 1995), Ьу АикиЬе1 (1995) а! радек 16-37 !о 16-57, Ьу йбсйагбкоп (еб.), Васи1оу1гик Ехргеккюп Рго!осо1к (Тйе Нитапа Ргекк, 1пс. 1995), апб Ьу Ьискпок, 1пкес! Се11 Ехргеккюп Тесйпо1оду, ш Рго!ет Епдтееппд: Рппс1р1ек апб Ргасйсе, С1е1апб е! а1. (ебк.), радек 183-218 (бойп ^йеу & 8опк, 1пс. 1996).

Клетки грибов, включая дрожжевые клетки, также можно использовать для экспрессии генов по настоящему изобретению. Виды дрожжей, представляющие особый интерес в данной связи, включают 8ассйаготусек сегеу1к1ае, РюЫа рак!опк и РюЫа те!йапойса. Приемлемые промоторы для экспрессии в дрожжах включают промоторы из САЬ1 (галактозы), РСК (фосфоглицерат-киназы), АИН (алькогольдегидрогеназы), АОХ1 (алкогольоксидазы), Н184 (гистидинолдегидрогеназы) и тому подобные. Создано множество векторов для клонирования в дрожжах, которые можно легко приобрести. Указанные векторы включают векторы на основе У1р, такие как У1р5, векторы УКр, такие как УКр17, векторы УЕр, такие как УЕр13, и векторы УСр, такие как УСр19. Методы трансформации клеток 8. сегеу1к1ае экзогенной ДНК и продуцирования ими рекомбинантных полипептидов описаны, например, в патенте США № 4599311 (б<а\\'акак|). патенте США № 4931373 (Кахгакак1 е! а1.), патенте США № 4870008 (Вгаке), патенте США № 5037743 (^е1сй е! а1.) и патенте США № 4845075 (Миггау е! а1.). Трансформированные клетки отбирают на основании фенотипа, определяемого селектируемым маркером, устойчивости к лекарственным средствам или способности расти при отсутствии определенного питательного вещества (например, лейцина). Приемлемой векторной системой для использования в 8ассйаготусек сегеу1к1ае является векторная система РОТ1, описанная в патенте США № 4931373 (Кахгакак1 е! а1.), которая позволяет отбирать трансформированные клетки с учетом роста в средах, содержащих глюкозу. Дополнительные приемлемые промоторы и терминаторы, предназначенные для использования в дрожжах, включают указанные элементы, выделяемые из генов гликолитических ферментов (см., например, патент США № 4599311 (Какакак1), патент США № 4615974 (Кшдктап е! а1.) и патент США № 4977092 (Вй!ег)) и генов алкогольдегидрогеназы. См. также патенты США №№ 4990446, 5063154, 5139936 и 4661454.

В данной области известны трансформирующие системы для других дрожжей, включающих Напкепи1а ро1утогрйа, БсЫхокассйаготусек ротЬе, К1иууеготусек 1асйк, К1иууеготусек ГгадШк, ИкШадо тауббк, РюЫа рак!опк, РюЫа те!йапойса, РюЫа диШегтопби и Сапб1ба та1!ока. См., например, публикацию С1еекоп е! а1., б. Сеп. М1сгоЬю1. 132:3459 (1986) и патент США № 4882279 (Сгедд). Клетки АкрегдШик могут быть использованы в соответствии с методами, описанными в патенте США № 4935349 (МсКЫдй! е! а1.). Методы трансформации АсгетоЫит сЫукодепит описаны в патенте США № 5162228 (8итшо е! а1.). Методы трансформации №игокрога описаны в патенте США № 4486533 (ЬатЬокй/).

Например, использование РюЫа те!йапойса в качестве хозяина для продуцирования рекомбинант

- 20 015706 ных белков описано в патенте США № 5716808 (Ваутоиб), патенте США № 5736383 (Ваутоиб), в публикации Ваутоиб е! а1., Уеак! 14:11-23 (1998) и в международных публикациях №№ \¥О 97/17450, \УО 97/17451, \УО 98/02536 и \УО 98/02565. Молекулы ДНК, используемые для трансформации Р. теШаиойса, могут быть получены в виде двухцепочечных кольцевых плазмид, которые предпочтительно линеаризуют до трансформации. Промотор и терминатор, используемые в плазмиде для продуцирования полипептида в Р. теЛаиойса, могут быть выделены из гена Р. те!Ьаηο1^са, такого как ген утилизации спирта Р. теШаиойса (АИС1 или АИС2). Другими приемлемыми промоторами являются промоторы, выделенные из генов дигидроксиацетонсинтазы (ΟΝΆδ), формиатдегидрогеназы (ЕМЭ) и каталазы (САТ). Для облегчения введения ДНК в хромосому хозяина желательно иметь полный экспрессирующий сегмент плазмиды, фланкированный с обоих концов последовательностями ДНК хозяина. Приемлемым селектирующим маркером для использования в Р1сЫа теШаиоНса является ген АЭЕ2 Р. те!Ьаио1юа, который кодирует фосфорибозил-5-аминоимидазолкарбоксилазу (А1ВС; ЕС 4.1.1.21) и позволяет клеткамхозяевам абе2 расти при отсутствии аденина. Для крупномасштабного промышленного производства, где желательно свести к минимуму использование метанола, можно использовать клетки-хозяева, в которых отсутствуют оба гена утилизации метанола (АИС1 и АИС2). Для продукции секретируемых белков в клетках-хозяевах могут отсутствовать гены вакуолярной протеазы (РЕР4 и РВВ1). Для облегчения введения плазмиды, содержащей ДНК, кодирующую представляющий интерес полипептид, в клетки Р. те111агюНса используют электропорацию. Клетки Р. теШаиойса могут быть трансформированы электропорацией с использованием экспоненциально затухающего импульсного электрического поля силой 2,54,5 кВ/см, предпочтительно около 3,75 кВ/см, и постоянной времени (!), равной 1-40 мс, наиболее предпочтительно примерно 20 мс.

Экспрессирующие векторы могут быть также введены в протопласты растений, интактные растительные ткани или выделенные растительные клетки. Методы введения экспрессирующих векторов в растительную ткань включают прямое инфицирование или одновременное культивирование растительной ткани с АдгоЬас!егшт !итеГас1еи8, доставку микровпрыскиванием, инъекцию ДНК, электропорацию и т.п. См., например, публикации Ног8с1 е! а1., 8аеисе 227:1229 (1985), К1еш е! а1., Вю1ес1то1оду 10:268 (1992) и М1к1 е! а1., Ргосебигек Гог 1и1гобистд Еоге1ди ΩΝΛ т!о Р1аи!8, т Ме11юб8 ш Р1аи! Мо1еси1аг В1о1оду аиб Вюйскио^ду, С11ск е! а1. (еб8.), раде8 67-88 (СВС Рге88, 1993).

Альтернативно гены 1Ь-22ВА могут быть экспрессированы в прокариотических клетках-хозяевах. Приемлемые промоторы, которые могут быть использованы для экспрессии полипептидов 1Ь-22ВА в прокариотических хозяевах, хорошо известны специалистам в данной области и включают промоторы, способные узнавать полимеразы Т4, Т3, 8р6 и Т7, промоторы Р_В и Р_ъ λ-бактериофага, промоторы 1гр, гесА, 1асИУ5, !ас, 1рр-1ас8рг, р1оА, 1ас2 и промоторы белков теплового шока Е.со11, промоторы В. 8иЬ!1118, промоторы бактериофагов ВасШи8, промоторы 81гер!отусе8, промотор 1и! λ-бактериофага, промотор Ь1а рВВ322 и промотор САТ гена хлорамфениколацетилтрансферазы. Прокариотические промоторы рассмотрены в публикациях С1юк, I. 1иб. М1сгоЪю1. 1:277 (1987), ^а!8ои е! а1., Мо1еси1аг Вю1оду оГ Не Сеие, 4¹¹' Еб. (Вещатш Ситтшз, 1987) и Аи8иЬе1 е! а1. (1995).

Приемлемые прокариотические хозяева включают Е.со11 и ВасШи8 8иЬ!11и8. Приемлемые штаммы Е.со11 включают ВЬ21(ПЕ3), ВЬ21(ПЕ3)рЬу88, ВЬ21(ПЕ3)рЬу8Е, ΌΗ1, ΌΗ4Ι, ΌΗ5, ΌΗ5Ι, ΌΗ5ΙΕ', ПН51МСВ, ОН10В, ПН10В/р3, ΌΗ118, С600, НВ101, 1М101, 1М105, 1М109, 1М110, К38, ВВ1, Υ1088, Υ1089, С8Н18, ЕВ 1451 и ЕВ 1647 (см., например, публикацию Вго^и (еб.), Мо1еси1аг Вю1оду ЬаЬГах (Асабешю Рге88 1991)). Приемлемые штаммы ВасШи8 8иЫ11и8 включают ВВ151, ΥВ886, М1119, М1120 и В170 (см., например, публикацию Нагбу, ВасШи8 С1ошид Ме!1об8, 1и ^NА С1ошид: А Ргасбса1 Арргоаск, С1о\^гег (еб.) (ШЬ Рге88 1985)).

При экспрессии полипептида 1Ь-22ВА в бактериях, таких как Е.со11, полипептид может оставаться в цитоплазме, обычно в виде нерастворимых гранул, или может быть направлен секреторной последовательностью бактерии в периплазматическое пространство. В первом случае клетки лизируют, гранулы выделяют и денатурируют, используя, например, гуанидинизотиоцианат или мочевину. Денатурированный полипептид затем может быть подвергнут вторичной укладке цепи и димеризован путем разведения в денатурате, например, при помощи диализа против раствора мочевины и комбинации восстановленного и окисленного глутатиона с последующим диализом против забуференного физиологического раствора. Во втором случае полипептид может быть выделен из периплазматического пространства в растворимой и функциональной форме в результате разрушения клеток (например, методом ультразвуковой обработки или осмотического шока) для высвобождения содержимого периплазматического пространства и выделения белка, при этом устраняется необходимость в денатурации и вторичной укладке цепи.

Специалистам в данной области хорошо известны методы экспрессии белков в прокариотических хозяевах (см., например, публикации ХУПНапъ е! а1., Ехрге88юи оГ Гоге1ди рго!еш8 ш Е. со11 И81ид р1а8т1б νес!ο^8 аиб ригШсабои оГ 8рес1Пс ро1ус1оиа1 аибЬоб1е8, ш ^NА С1ошид 2: Ехрге88юи 8у8!ет8, 2иб ЕбШои, С1о\^гег е! а1. (еб8.), раде 15 (ОхГогб иш\'ег8Пу Рге88 1995), \Уагб е! а1., Сеиебс Машри1а!юи аиб Ехрге88юи оГ Аи!1Ьоб1е8, ш Моиос1оиа1 Аи!1Ьоб1е8: Ргтс1р1е8 аиб Арр1юа!юи8, раде 137 (^11еу-Ь188, 1ис. 1995), аиб Сеогдюи, Ехрге88юи оГ Рго!ет8 т Вас!епа, т Рго!ет Еидтеегтд: Рпис1р1е8 аиб Ргасбсе, С1е1аиб е! а1.

- 21 015706 (ебв.), раде 101 (1оНп \νίΚ\· & 8опв, Шс. 1996)).

Стандартные методы введения экспрессирующих векторов в бактериальные, дрожжевые, растительные клетки и клетки насекомых описаны, например, в публикации Ли5иЬе1 (1995).

Общие методы экспрессии и выделения чужеродного белка, продуцированного в системе клеток млекопитающего, описаны, например, в публикации ЕюНеуеггу, Е.хреввюп о£ Епдтеегеб Рго!етв ш Маттайап Се11 СиИиге, ш Рго1ет Епдтееппд: Рппар1ев апб Ргасйсе, С1е1апб е! а1. (ебв.), радев 163 ^йеу-Ывв, Ьс. 1996). Стандартные методы выделения белка, продуцируемого бактериальной системой, описаны, например, в публикации СпввНаттег е! а1., РшгйсаЬюп о£ оуег-ргобисеб рго!етв £гот Е.сой се11в, ш ЭХА С1ошпд 2: Ехргеввюп 8ув!етв, 2^пб Ебйюп, О1оуег е! а1., (ебв.), радев 59-92 (0х£огб Ищуегвйу Ргевв 1995). Существующие методы выделения рекомбинантных белков из бакуловирусной системы описаны в публикации КюНагбвоп (еб.), Васи1оуиив Ехргеввюп Рго!осо1в (ТНе Нитапа Ргевв, Шс. 1995).

В качестве альтернативы полипептиды по настоящему изобретению могут быть синтезированы методами полного твердофазного синтеза, неполного твердофазного синтеза, конденсации фрагментов или классического синтеза в жидкой фазе. Указанные методы синтеза хорошо известны специалистам в данной области (см., например, публикации Метйе1б, I. Ат. СНет. 8ос. 55:2149 (1963), 8!еуаг! е! а1., 8ойб РНаве Рерйбе 8уп!11ев1в (2пб Ебйюп), (Р1егсе СНетюа1 Со. 1984), Вауег апб Карр, СНет. Рер!. Рго!. 3:3 (1986), АШейоп е! а1., 8ойб РНаве Рерйбе 8уп!11ев1в: А РгасНса1 АрргоасН ДКЬ Ргевв 1989), Ие1бв апб Со1оу1ск, 8ойб-РНаве Рерйбе 8упШев1в, Ме!Нобв т Епхуто1оду Уо1ите 289 (Асабетю Ргевв 1997), апб Ыоуб^бйатв е! а1, СНет1са1 АрргоасНев !о !Не 8упШев1в о£ РерБбев апб Рго!етв (СКС Ргевв, Шс. 1997)). Изменения, вносимые в общие методы химического синтеза, такие как химическое лигирование нативного белка и лигирование экспрессированного белка, также являются стандартными (см., например, публикации Эа\Увоп е! а1., 8с1епсе 266:776 (1994), Наскепд е! а1., Ргос. №1!'1 Асаб. 8с1. И8А 94:7845 (1997), Эаувоп, Ме!1юбв Епхуто1. 287:34 (1997), Мшг е! а1., Ргос. №1!'1 Асаб. 8а. И8А 95:6705 (1998) и 8еуеппоу апб Мшг, I. Вю1. СНет. 273:16205 (1998)).

Пептиды и полипептиды по настоящему изобретению включают по крайней мере 6, по крайней мере 9 или по крайней мере 15 последовательных аминокислотных остатков 8ЕО ΙΌ N0: 3. В качестве иллюстрации можно отметить, что полипептиды могут включать по крайней мере 6, по крайней мере 9 или по крайней мере 15 последовательных аминокислотных остатков 8ЕО ΙΌ N0: 3. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептиды содержат 20, 30, 40, 50, 100 или более последовательных остатков указанных аминокислотных последовательностей. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие такие пептиды и полипептиды, могут использоваться в качестве праймеров и зондов при осуществлении полимеразной цепной реакции.

Кроме того, полипептиды Ш^КА и их фрагменты могут быть экспрессированы в высших эукариотических клетках в виде мономеров, гомодимеров, гетеродимеров или многомеров. Такие клетки могут быть использованы для продукции полипептидов мономерных, гомодимерных, гетеродимерных и мультимерных рецепторов Ш^КА, включающих по крайней мере один полипептид Ш^КА (рецепторы, содержащие Ш^КА или полипептиды рецепторов, содержащих Ш^КА), или могут быть использованы в качестве анализируемых клеток в системах скрининга. В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения полипептид по настоящему изобретению, содержащий внеклеточный домен ГЬ22КА, получают в культивируемой клетке и указанную клетку используют для скрининга лигандов для данного рецептора, включая природный лиганд, ΙΕ-22, а также агонисты и антагонисты природного лиганда. В кратком изложении этот способ предусматривает объединение кДНК или гена, кодирующего рецептор, с другими генетическими элементами, необходимыми для экспрессии (например, с промотором транскрипции), и введение полученного экспрессирующего вектора в клетку-хозяина. Клетки, экспрессирующие ДНК и продуцирующие функциональный рецептор, отбирают и используют в различных системах скрининга. Каждый компонент комплекса мономерного, гомодимерного, гетеродимерного и мультимерного рецептора может быть экспрессирован в одной и той же клетке. Кроме того, компоненты комплекса мономерного, гомодимерного, гетеродимерного и мультимерного рецептора могут быть также слиты с трансмембранным доменом или другой мембраносвязанной частью для сборки комплекса и скрининга трансфектантов в соответствии с приведенным выше описанием.

Для анализа полипептидов, являющихся антагонистами ΙΕ-20 и ΙΕ-22, и антител по настоящему изобретению используют клетки млекопитающих, подходящие для экспрессии рецепторов, включая ΙΕ22КА, или другие рецепторы, связывающие, как известно, ΙΕ-20 или ΙΕ-22 (например, клетки, экспрессирующие Ш^КА/СКЕГМ и Ш^КА, Ш^КВ, I^22КА/I^-20КΒ или I^-20КА/I^-20КΒ), и трансдукции опосредуемого рецептором сигнала, которые включают клетки, экспрессирующие субъединицы других рецепторов, способные образовывать функциональный комплекс с ЕЙ-22КА (или ЕЙ-20КА). Указанные субъединицы могут относиться к семейству рецепторов интерферона или других рецепторам цитокина класса ΙΙ или класса Ι, например СКЕ2-4 (номер доступа в банке генов ОепЬапк Ζ17227), Ш-10К (номера доступа в банке генов ОепЬапк И00672 и ИМ_001558), Ш^КА (совместный патент США № 5965704), хсу!ог7 (Ш^КА) (совместный патент США № 5945511), I^-20КА/I^-20КΒ (публикация ν№0 № ν0 01/46232) и ЕЙ-9К. Кроме того, желательно использовать клетку того же вида, что и экспрессируемый рецептор. В предпочтительном варианте осуществления изобретения рост клетки зависит от экзогенно

- 22 015706 подаваемого гемопоэтического фактора роста, необходимого для ее пролиферации. Предпочтительными линиями клеток указанного типа являются линия клеток ТЕ-1 человека (номер АТСС СВЬ-2003) и линия клеток АМЬ-193 (номер АТСС СВЬ-9589), которые представляют собой СМ-С8Е-зависимые линии лейкозных клеток человека, и клетки ВаГ3 (Ра1ас1ок апб 81етте1х. Се11 41:727-734, (1985)), которые представляют собой 1Ь-3-зависимую линию пре-В-клеток мыши. Другие линии клеток включают клетки ВНК, С08-1 и СНО. Приемлемые клетки-хозяева могут быть созданы для продукции необходимых субъединиц рецепторов или других клеточных компонентов, необходимых для требуемой реакции клетки. Преимуществом данного способа является возможность создания линий клеток, экспрессирующих субъединицы рецепторов из любого вида, что позволяет преодолеть возможные ограничения, возникающие в связи со специфичностью видов. Ортологи кДНК рецептора человека могут быть клонированы и использованы в линиях клеток того же вида, например, кДНК мыши в линии клеток ВаР3. Таким образом, могут быть созданы линии клеток, ранее зависящие от гемопоэтического фактора роста, такого как СМС8Р или 1Ь-3, которые теперь будут зависеть от другого цитокина, воздействующего через рецептор 1Ь22ВА, такого как 1Ь-22.

Клетки, экспрессирующие функциональный рецептор, используют при осуществлении анализов методом скрининга. В данной области известны разные подходящие анализы. Указанные анализы основаны на обнаружении биологической реакции в клетке-мишени. Одним из таких анализов является анализ пролиферации клеток. Клетки культивируют в присутствии или отсутствии испытуемого соединения и обнаруживают пролиферацию клеток, измеряя, например, внедрение меченного тритием тимидина, или выполняют колориметрический анализ, основанный на метаболическом разрушении бромида 3-(4,5диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ) (Моктап, 1. 1ттипо1. Ме!1. 65:55-63, (1983)). В альтернативном анализе используют клетки, созданные для экспрессии гена-репортера. Ген-репортер связывают с промоторным элементом, реагирующим на путь, связанный с рецептором, и визуализируют активацию транскрипции гена-репортера. Предпочтительным промоторным элементом в данной связи является элемент, реагирующий на сыворотку, или 8ВЕ. См., например, публикацию 81ιη\ν е! а1., Се11 56:563572 (1989). Предпочтительным геном-репортером является ген люциферазы (бе \¥е1 е! а1., Мо1. Се11. Вю1. 7:725, (1987)). Экспрессию гена люциферазы обнаруживают люминесцентными методами, известными в данной области (см., например, публикации Ваитдайпег е! а1., I. Вю1. С1ет. 269:29094-29101, (1994); 8с11епЬогп апб СойГт, Рготеда №1ек 41:11, 1993). Наборы для анализа активности люциферазы можно приобрести коммерческим путем, например, от компании Рготеда Согр Маб1коп, VI. Линии клетокмишеней данного типа можно использовать для скрининга библиотек химических веществ, кондиционированных культуральных сред, грибных бульонов, образцов почвы, проб воды и тому подобных. Например, банк образцов кондиционированных сред можно подвергнуть анализу с использованием клеткимишени для идентификации клеток, продуцирующих лиганд. Положительные клетки затем используют для создания библиотеки кДНК в экспрессирующем векторе млекопитающего, который делят на пулы, трансфецируют в клетки-хозяева и экспрессируют. Образцы сред от трансфецированных клеток затем анализируют, выполняя последующее деление пулов, повторную трансфекцию, субкультивирование и повторный анализ положительных клеток для выделения клонированной кДНК, кодирующей данный лиганд.

В данной области известно несколько линий клеток, чувствительных к 1Ь-20, или такие линии клеток могут быть созданы, как, например, линия клеток Ва£3/О1В81/су!оВ11 (публикация XVIР0 № Χν0 02/072607). Кроме того, известно несколько линий клеток, чувствительных к 1Ь-22 (Эитопйег е! а1., 1. 1ттипо1. 164:1814-1819, 2000; Эитоибег Ь. е! а1., Ргос. №Г1. Асаб. 8с1. 97:10144-10149, 2000; Х1е М.Н. е! а1., I. Вю1 С1ет. 275:31335-31339, 2000; Ко!епко 8.У. е! а1., I. Вю1. С1ет. 276:2725-2532, 2001), и линий клеток, экспрессирующих субъединицу 1Ь-22ВА рецептора 1Ь-22. Например, нижеследующие клетки реагируют на 1Ь-22: ТК-10 (Х1е М.Н. е! а1., см. выше) (карцинома почки человека); 8ν480 (АТСС № ССЬ-228) (аденокарцинома ободочной кишки человека); НерС2 (АТСС № НВ-8065 (гепатома человека); РС12 (АТСС № СВЬ-1721 (модель нейронов мыши; феохромоцитома крыс) и МЕ813 (АТСС № СВЬ1927) (линия клеток мезангия). Некоторые линии клеток, экспрессирующих 1Ь-22ВА (рецептор 1Ь-22), также являются предполагаемыми линиями клеток, чувствительными к 1Ь-22: А549 (АТСС № ССЬ-185) (карцинома легкого человека); С-361 (АТСС № СРЬ-1424) (меланома человека) и Сак1-1 (АТСС № НТВ46) (карцинома почки человека). Кроме того, могут быть созданы линии клеток, чувствительных к 1Ь-22, например, линия клеток Ва£3/су!оВ11/СВГ2-4, раскрытая в настоящем описании изобретения (публикация VIРΟ № ν0 02/12345). Указанные клетки могут быть использованы при выполнении анализов по оценке функциональной активности 1Ь-22ВА в качестве антагониста 1Ь-20 или 1Ь-22 или противовоспалительного фактора.

Дополнительный способ скрининга по настоящему изобретению включает использование гибридных полипептидов рецепторов. Указанные гибридные полипептиды образуют два общих класса. В первом классе гибридных полипептидов внутриклеточный домен 1Ь-22ВА присоединен к лигандсвязывающему домену второго рецептора. Второй класс гибридных полипептидов включает внеклеточный (лигандсвязывающий) домен 1Ь-22ВА (8ЕО ΙΌ N0: 3) с внутриклеточным доменом второго рецептора, предпочтительно рецептора гемопоэтического цитокина, и трансмембранный домен. Гибридные моно

- 23 015706 меры, гомодимеры, гетеродимеры и многомеры Ш-22ВА рецепторов по настоящему изобретению второго класса экспрессированы в клетках, которые, как известно, способны реагировать на сигналы, передаваемые вторым рецептором. Два указанных класса гибридных рецепторов, вместе взятые, позволяют идентифицировать тип реагирующей клетки при выполнении анализа по обнаружению 1Ь-22 или 1Ь-20. Кроме того, такие клетки можно использовать в присутствии 1Ь-22 или 1Ь-20 для анализа антагонистов растворимых рецепторов по настоящему изобретению при выполнении анализа конкурентного связывания. При выполнении такого анализа уменьшение пролиферации или ослабление передачи сигнала 1Ь-22 или 1Ь-20 в присутствии растворимого рецептора по настоящему изобретению свидетельствует о наличии антагонистической активности. Кроме того, клеточные анализы связывания растворимого рецептора Ш-22ВА можно использовать для оценки способности растворимого рецептора связывать, блокировать, ингибировать, ослаблять, оказывать антагонистическое действие или нейтрализовать активность 1Ь-22 или 1Ь-20.

6. Получение слитых белков и конъюгатов Ш-22ВА.

Одним общим классом аналогов Ш-22ВА являются варианты, в которых аминокислотная последовательность представляет собой мутацию аминокислотной последовательности, раскрытой в настоящем описании изобретения. Другой общий класс аналогов Ш-22ВА образуют антиидиотипические антитела и их фрагменты, описанные ниже. Кроме того, в качестве аналогов могут быть использованы рекомбинантные антитела, включающие вариабельные области антиидиотипических антител (см., например, публикацию Μοηίατάίπί е! а1., Ргос. Аззос. Ат. РЕузШапз 108:420 (1996)). Так как вариабельные области антиидиотипических антител 1Ь-22ВА имитируют 1Ь-22ВА, то указанные домены обеспечивают связывающую активность Ш-22ВА. Специалистам в данной области известны методы получения антиидиотипических каталитических антител (см., например, публикации 1огоп е! а1., Апп. N Υ Асаб. 8с1 672:216 (1992), Ег1Ьои1е! е! а1., Арр1. ВюсНет. Вю!есйпо1. 47:229 (1994) и Ауа11е е! а1., Апп. N Υ Асаб. 8сг 864:118 (1998)).

Другим методом идентификации аналогов 1Ь-22ВА является использование комбинаторных библиотек. Методы создания и скрининга библиотек фагового дисплея и других комбинаторных библиотек описаны, например, в публикации Кау е! а1., РНаде Э|зр1ау оГ Рерббез апб Рго!етз (Асабетю Ргезз 1996), в патенте США № 5783384 (Уегбше), патенте США № 5747334 (Кау е! а1.) и в патенте США № 5723323 (КаиГГтап е! а1.).

Полипептиды Ш-22ВА находят применение как ш у1уо, так и ш νίΙΐΌ. В качестве иллюстрации можно отметить, что растворимую форму Ш-22ВА можно добавлять в среду для культивирования клеток для ингибирования действия лиганда 1Ь-22ВА, продуцируемого культивируемыми клетками.

Слитые белки Ш-22КА могут быть использованы для экспрессии Ш-22ВА в рекомбинантном хозяине и для выделения продуцированного Ш-22ВА. Как описано ниже, определенные слитые белки Ш22ВА находят также применение в диагностике и терапии. Один тип слитого белка включает пептид, который направляет полипептид Ш-22ВА из рекомбинантной клетки-хозяина. Для введения полипептида Ш-22ВА в секреторный путь эукариотической клетки-хозяина в экспрессирующем векторе Ш-22ВА предусмотрена секреторная сигнальная последовательность (известная также как сигнальный пептид, лидерная последовательность, препропоследовательность или препоследовательность).

Секреторная сигнальная последовательность может быть выделена из Ш-22ВА, к тому же приемлемая сигнальная последовательность может быть также выделена из другого секретированного белка или синтезирована бе поуо. Секреторная сигнальная последовательность функционально связана с последовательностью, кодирующей Ш-22КА, так, что две последовательности соединены в правильной рамке считывания и расположены с возможностью направления вновь синтезированного полипептида в секреторный путь клетки-хозяина. Секреторные сигнальные последовательности обычно располагаются у 5'конца нуклеотидной последовательности, кодирующей представляющий интерес полипептид, хотя определенные секреторные сигнальные последовательности могут быть расположены в другом месте представляющей интерес нуклеотидной последовательности (см., например, патент США № 5037743 (\Уе1с11 е! а1.), патент США № 5143830 (Но11апб е! а1.).

Несмотря на то, что секреторная сигнальная последовательность Ш-22КА или другого белка, продуцированного клетками млекопитающего (например, сигнальная последовательность активатора тканевого плазминогена, описанная в патенте США № 5641655), можно использовать для экспрессии Ш-22КА в рекомбинантных клетках-хозяевах млекопитающего, для экспрессии в дрожжевых клетках предпочтительна сигнальная последовательность дрожжей. Примерами приемлемых сигнальных последовательностей дрожжей являются последовательности, выделенные из α-фактора конъюгационного феромона дрожжей (кодированного геном ΜΡα1), инвертазы (кодированной геном 8ИС2) или кислой фосфатазы (кодированной геном РНО5). См., например, публикацию Вотапоз е! а1. Ехргеззюп оГ С1опеб Сепез ш Υеа8!, 1п ΩΝΛ С1ошпд 2: А Ргас!юа1 АрргоасЕ, 2^пб Еббюп, С1оуег апб Натез (ебз.), радез 123-167 (ОхГогб Ишуегзйу Ргезз 1995).

Полипептиды растворимого рецептора Ш-22ВА могут быть получены в результате экспрессии процессированной ДНК, кодирующей внеклеточный домен, например, полипептида, содержащего 8ЕО Ш

- 24 015706

N0: 3, или соответствующую область рецептора отличного от человеческого. Полипептиды внеклеточного домена предпочтительно получают в форме, в которой отсутствуют трансмембранные и внутриклеточные полипептидные сегменты. Для того чтобы направить экспорт домена рецептора из клеткихозяина, ДНК рецептора связывают с сегментом второй ДНК, кодирующим секреторный пептид, такой как секреторный пептид 1-РА. Для облегчения очистки домена секретированного рецептора С-концевой удлиняющий сегмент, такой как полигистидиновая метка, вещество Р, пептид Р1ад™ (Норр е! а1., Вю1ес1нзо1оду 6:1204-1210, (1988), может быть приобретен в компании Еак!тап Кобак Со., №\ν Науеп, СТ), другой полипептид или белок, для которого существует антитело или другой специфически связывающий агент, может быть слит с полипептидом рецептора. Кроме того, в соответствии с приведенным выше описанием могут быть получены антигенные детерминанты кБ-22КА из внеклеточных цитокинсвязывающих доменов.

В соответствии с альтернативным способом внеклеточный домен рецептора ГБ-22КА или другой рецептор цитокина класса I или II может быть экспрессирован в виде слитого белка с константными областями тяжелой цепи иммуноглобулина, обычно Рс-фрагмента, содержащего два домена константной области и шарнирную область, но не имеющего вариабельной области (см. патенты США №№ 6018026 и 5750375 (Ыеб/1е\\'кк| А.2. е! а1.)). Полипептиды растворимого рецептора Ш^КА по настоящему изобретению включают такие слитые конструкции. Один такой слитый белок показан в 8ЕЦ Ш N0: 4. Такие слитые молекулы обычно секретируются в виде мультимерных молекул, в которых Рс-фрагменты связаны друг с другом дисульфидными связями и два полипептида рецептора расположены в непосредственной близости друг от друга. Слитые белки подобного типа могут быть использованы для аффинной очистки родственного лиганда от раствора в качестве инструмента при выполнении анализа ίπ νίΐΐΌ, для блокирования, ингибирования или ослабления сигналов ш νίϋΌ путем специфического титрования лиганда и в качестве антагонистов ш νί\Ό при парентеральном введении для связывания циркулирующего в крови лиганда и выведения его из кровотока. Для очистки лиганда в образец, содержащий указанный лиганд, добавляют химеру Ш^КАПд (например, в кондиционированную культуральную среду или экстракты ткани) в условиях, облегчающих связывание рецептора с лигандом (обычно при значениях температуры, рН и ионной силы, близких к физиологическим показателям). Комплекс химера-лиганд затем разделяют при помощи смеси, содержащей белок А, которую иммобилизуют на твердом носителе (например, на нерастворимых полимерных шариках). Затем лиганд элюируют стандартными химическими методами, например, в градиенте соли или рН. В альтернативном способе сама химера может быть связана с твердым носителем, при этом связывание и элюирование выполняют в соответствии с приведенным выше описанием. Химеры могут быть использованы ш νί\Ό для регулирования воспалительных реакций, включая острые реакции, такие как реакции на сывороточный амилоидный белок А (8АА), Среактивный белок (СКР) и т.п. Химеры с высоким сродством связывания вводят парентерально (например, в виде внутримышечной, подкожной или внутривенной инъекции). Циркулирующие в крови молекулы связывают лиганд и выводят из кровотока в результате обычных физиологических процессов. Химеры, используемые при выполнении анализов, связывают с носителем при помощи Рс-области и используют в формате анализа методом ЕЫ8А.

Для выделения антитела против Гк-22КА и связывающих партнеров по настоящему изобретению можно использовать систему, в которой использован лигандсвязывающий рецептор (или антитело, один член пары комплемент/антикомплемент), или его связывающий фрагмент и коммерчески доступный биосенсорный прибор (В^соге, Рйагтааа Вюкепког, Р1кса1а^ау, N1). Такой рецептор, антитело, член пары комплемент/антикомплемент или фрагмент иммобилизуют на поверхности рецепторного чипа. Применение вышеуказанного устройства описано в публикациях Каг1ккоп, 1. Iттиπо1. МеЛобк 145:22940, 1991 и Сипшпдйат апб ^е11к, 1. Мо1. Вю1. 234:554-63, 1993. Рецептор, антитело, член пары или фрагмент ковалентно связывают, используя амин или сульфогидрил, с декстрановыми волокнами, прикрепленными к золотой пленке в проточной ячейке. Испытуемый образец пропускают через указанную ячейку. При наличии в образце лиганда, антигенной детерминанты или противоположного члена пары комплемент/антикомплемент указанный образец будет связываться с иммобилизованным рецептором, антителом или членом пары, вызывая изменение показателя преломления среды, который визуализируется в виде изменения резонанса поверхностного плазмона золотой пленки. Данная система позволяет определить частоту появления и исчезновения изменений, на основании которых можно вычислить сродство связывания и оценить стехиометрию связывания. Альтернативно для анализа связывания лиганда с рецептором можно использовать технологию ЖБИДТМ) (Шркегдеп, Лс., Ра1о А1!о, СА). Кроме того, вышеописанную технологию ВIАС0КΕ можно использовать в экспериментах по конкурентному связыванию для определения способности разных моноклональных антител связываться с одинаковыми или разными антигенными детерминантами в полипептиде Гк-22КА и для картирования антигенных детерминант нейтрализующих антител по настоящему изобретению, которые связывают, блокируют, ингибируют, ослабляют, оказывают антагонистическое действие или нейтрализуют ГБ-22 или как ГБ-20, так и Ш-22.

Полипептиды лигандсвязывающего рецептора можно также использовать в других системах анализа, известных в данной области. Такие системы включают анализ Скатчарда для определения сродства

- 25 015706 связывания (см. публикацию 8са!сйагй, Апп. ΝΥ Асай. 8с1 51:660-72, 1949) и калориметрические анализы (Сипшпдйат е! а1., 8с1епсе 253:545-48, 1991; Сипшпдйат е! а1., 8с1епсе 245:821-25, 1991).

Настоящее изобретение также относится к целому ряду других полипептидных слитых молекул и родственных мультимерных белков, включающих один или несколько полипептидных слитых молекул. Например, растворимый рецептор 1Б-22ВА может быть получен в виде слитого белка с димеризующим белком, описанным в патентах США №№ 5155027 и 5567584. Предпочтительные димеризующие белки включают домены константной области иммуноглобулина, например ГдСу1, и легкую κ-цепь человека. Слитые белки иммуноглобулина и растворимого ГБ-22ЕА могут быть экспрессированы в генетически созданных клетках для продуцирования целого ряда мультимерных аналогов рецептора ГБ-22ЕА. Вспомогательные домены могут быть слиты с растворимым рецептором 1Б-22ВА для направленной доставки в определенные клетки, ткани или макромолекулы (например, коллаген или клетки, экспрессирующие лиганды 1Б-22ВА. ГБ-22 или ГБ-20). Полипептид 1Б-22ВА может быть слит с двумя или более частями молекулы, такими как аффинная метка для очистки и домен, обеспечивающий направленную доставку. Полипептидные слитые молекулы могут также включать один или несколько сайтов расщепления, в частности, между доменами. См. публикацию Тиап е! а1., Соппесйте Т1ккие Еекеагсй 34:1-9, 1996.

В бактериальных клетках зачастую желательно экспрессировать гетерологичный белок в виде слитого белка для уменьшения токсичности, повышения устойчивости и увеличения выхода экспрессированного белка. Например, ГБ-22ЕА можно экспрессировать в виде слитого белка, содержащего полипептид глутатион-8-трансферазы. Белки, слитые с глутатион-8-трансферазой, обычно являются растворимыми и могут быть легко очищены от лизатов Е. сой на колонках с иммобилизованным глутатионом. В соответствии с аналогичными методами слитый белок ГБ-22ЕА, содержащий полипептид мальтозасвязывающего белка, может быть выделен при помощи колонки с амилозной смолой, в то время как слитый белок, содержащий С-конец процессированного гена белка А, может быть очищен при помощи ГдСсефарозы. Существующие методы экспрессии гетерологичного полипептида в качестве слитого белка в бактериальной клетке описаны, например, в публикациях ^ййатк е! а1. Ехргеккюп оГ Роге1дп Рго!ешк т Е.сой Икшд Р1акт1й Уес!огк апй РшГйсайоп оГ 8ресШс Ро1ус1опа1 Ап!1Ьой1ек, ш ^NА С1ошпд 2: А Ргасйса1 Арргоасй, 2^пй Еййюп, С1о\^гег апй Натек (Ейк.), радек 15-58 (0хГогй Ипгуегкйу Ргекк 1995). Кроме того, существуют коммерчески доступные экспрессирующие системы. Например, система очистки белка РГОР0ЮТ Ха (Рготеда Согрогайоп; Майкоп, XVI) позволяет выделить слитый белок, содержащий полипептид, биотинилируемый во время экспрессии со смолой, содержащей авидин.

Пептидные метки, которые можно использовать для выделения гетерологичных полипептидов, экспрессируемых прокариотическими или эукариотическими клетками, включают полигистидиновые метки (обладающие сродством к смоле, образующей хелат с никелем), метки с-тус, кальмодулинсвязывающий белок (выделяемый при помощи аффинной хроматографии с использованием кальмодулина), вещество Р, метку ΕΥΚ^ (которая связывается с антителами против ΕΥΚ^), метку С1и-С1и и метку РБАС (которая связывается с антителами против РБАС). См., например, публикации Био е! а1., Агсй. Вюсйет. Вюрйук. 329:215 (1996), Могдапй е! а1., Вю!есйпо1. Арр1. Вюсйет. 23:67 (1996) и 2йепд е! а1., Сепе 186:55 (1997). Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие такие пептидные метки, можно приобрести, например, в корпорации 81дта-А1йпсй (8!. Бошк, МО).

Другая форма слитого белка включает полипептид ГБ-22ЕА и константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, обычно Рс-фрагмент, содержащий два или три домена константной области и шарнирную область, но не имеющий вариабельной области. В качестве примера можно привести патент США № 5723125 (Сйапд е! а1.), в котором описан слитый белок, содержащий интерферон человека и Рсфрагмент иммуноглобулина человека. С-конец интерферона связан с Ν-концом Рс-фрагмента пептидным линкером. Примером пептидного линкера является пептид, включающий, главным образом, последовательность, инертную к Т-клеткам, которая является иммунологически инертной. Характерный пептидный линкер имеет аминокислотную последовательность СС8СС 8СССС 8СССС 8 (8ЕО ГО N0:9). В данном слитом белке иллюстративный Рс-фрагмент является у4-цепью человека, которая устойчива в растворе и обладает небольшой или вообще не обладает комплемент-активирующей активностью. Таким образом, в объем настоящего изобретения входит слитый белок ГБ-22ЕА, который содержит часть ГБ22ЕА и Рс-фрагмент человека, при этом С-конец части ГБ-22ЕА присоединен к Ν-концу Рс-фрагмента при помощи пептидного линкера, такого как пептид, включающий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 4. Часть ГБ-22ЕА может представлять собой молекулу ГБ-22ЕА или ее фрагмент. Например, слитый белок может включать аминокислоту 8Е0 ГО N0: 3 и Рс-фрагмент (например, Рс-фрагмент человека) (8ЕО ГО N0: 4).

В другом варианте слитый белок ГБ-22ЕА включает последовательность ГдС, часть ГБ-22ЕА, ковалентно связанную с аминоконцом последовательности ГдС, и сигнальный пептид, ковалентно связанный с аминоконцом части ГБ-22ЕА, при этом последовательность ГдС состоит из нижеследующих элементов, расположенных в следующем порядке: шарнирная область, СН2-домен и СН3-домен. Таким образом, в последовательности ГдС отсутствует СН₁-домен. Часть ГБ-22ЕА обладает активностью ГБ-22ЕА, такой как способность связываться с лигандом ГБ-22ЕА. Общий способ получения слитых белков, включаю

- 26 015706 щих как антитело, так и часть, не являющуюся антителом, описан в европейском патенте № 742830 (ЬаКоске11е е! а1.) (№0 95/21258).

Слитые белки, содержащие часть ГЬ-22К.А и Рс-фрагмент, могут быть использованы, например, в качестве инструмента для осуществления анализов ш уйго. Например, наличие лиганда Ш-22КА в биологическом образце может быть обнаружено при помощи слитого белка Ш^КА-иммуноглобулин, в котором часть ГЬ-22К.А служит для связывания лиганда, и макромолекула, такая как белок А или антитело против Рс-фрагмента, служит для связывания слитого белка с твердым носителем. Такие системы могут быть использованы для идентификации агонистов и антагонистов, препятствующих связыванию лигандов ГЬ-22К.Л, например Ш-22 или Ш-20 и Ш-22, с их рецептором.

Другими примерами белков, слитых с антителом, являются полипептиды, содержащие антигенсвязывающий домен и фрагмент Ш-22КА, содержащий внеклеточный домен Ш-22КА. Такие молекулы могут быть использованы для направленной доставки к определенным тканям благодаря связывающей активности Ш-22КА.

Настоящее изобретение дополнительно относится к целому ряду других полипептидных гибридов. Например, часть доменов или все домены, определяющие биологическую функцию, могут быть заменены в Ш-22КА по настоящему изобретению функционально эквивалентными доменами другого члена семейства рецепторов цитокинов. Полипептидные гибриды могут быть экспрессированы в рекомбинантных клетках-хозяевах для продукции целого ряд слитых аналогов Ш-22КА. Полипептид Ш-22КА может быть слит с двумя или более частями или доменами, такими как аффинная метка, для очистки и направленного воздействия на домен. Полипептидные слитые молекулы могут также содержать один или несколько сайтов расщепления, в частности, между доменами. См., например, публикацию Тиап е! а1., Соппесбге Т1ккие Кекеагск 34:1 (1996).

Слитые белки могут быть созданы методами, известными специалистам в данной области, получая каждый компонент слитого белка и химически конъюгируя указанные компоненты. Альтернативно полинуклеотид, кодирующий оба компонента слитого белка в соответствующей рамке считывания, может быть создан известными методами и экспрессирован методами, описанными в настоящем описании изобретения. Общие методы ферментативного и химического расщепления слитых белков описаны, например, в публикации АикиЬе1 (1995) стр. от 16-19 до 16-25.

Связывающие домены ГЕ-22КА могут быть затем исследованы путем физического анализа структуры, осуществляемого такими методами, как спектроскопия ядерного магнитного резонанса, кристаллография, дифракция электронов или фотоаффинное мечение, в сочетании с мутацией аминокислот предполагаемого сайта контактирования агонистов лиганда Ш-22КА. См., например, публикации бе Уок е! а1., 8с1епсе 255:306 (1992), 8тйй е! а1., I. Мо1. Вю1. 224:899 (1992) и №1обауег е! а1., РЕВ8 Ье!!. 309:59 (1992).

Настоящее изобретение также относится к химически модифицированным композициям Ш-22КА, в которых полипептид ГЕ-22КА связан с полимером. Иллюстративные полипептиды Ш-22КА являются растворимыми полипептидами, в которых отсутствует функциональный трансмембранный домен, такой как полипептид, включающий аминокислотные остатки 8Е0 ГО N0: 3. Указанный полимер обычно является водорастворимым, поэтому конъюгат ГЕ-22КА не осаждается в водной среде, такой как физиологическая среда. Примером приемлемого полимера является полимер, модифицированный с образованием одной реакционноспособной группы, такой как активный сложный эфир, используемой для ацилирования, или альдегид, используемый для алкилирования. Подобным образом можно контролировать степень полимеризации. Примером реакционноспособного альдегида является пропиональдегид полиэтиленгликоля или его моно(С1-С10)алкоксильные или арилоксипроизводные (см., например, патент США № 5252714 (Натк е! а1.)). Полимер может иметь разветвленную или неразветвленную цепь. Кроме того, для получения конъюгатов Ш-22КА может быть использована смесь полимеров.

Конъюгаты Ш-22КА, используемые в лечебных целях, могут включать фармацевтически приемлемые водорастворимые полимерные части молекулы. Приемлемые водорастворимые полимеры включают полиэтиленгликоль (РЕС), монометокси-РЕС, моно(С1-С10)алкокси-РЕС, арилокси-РЕС, поли(М винилпирролидон)-РЕС, трезилмонометокси-РЕС, пропиональдегид РЕС, бис-сукцинимидилкарбонат РЕС, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры полипропиленоксида и этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт, декстран, целлюлозу или другие углеводородные полимеры. Приемлемый РЕС может иметь молекулярную массу от около 600 до около 60000, в том числе, например, 5000, 12000, 20000 и 25000. Конъюгат Ш-22КА может также включать смесь таких водорастворимых полимеров.

Один пример конъюгата Ш-22КА включает часть Ш-22КА и полиалкилоксидную часть, присоединенную к Мконцу части Ш-22КА. РЕС является одним приемлемым полиалкилоксидом. В качестве иллюстрации можно отметить, что Ш-22КА может быть модифицирован РЕС, причем указанный процесс известен как полиэтиленгликолирование. Полиэтиленгликолирование Ш-22КА можно осуществлять, выполняя любые реакции полиэтиленгликолирования, известные в данной области (см., например, европейский патент № 0154316, публикации Бе1дабо е! а1., СгФса1 Кеу1е^к ш Ткегареибс Бгид Сатег 8ук!етк 9:249 (1992), Бипсап апб 8ргеайсо, С1т. Ркагтасокше!. 27:290 (1994) и Ргапсщ е! а1., Ш!. I. Нета!о1. 68:1 (1998)). Например, полиэтиленгликолирование можно выполнить, осуществляя реакцию ацилирования

- 27 015706 или реакцию алкилирования с использованием реакционноспособной молекулы полиэтиленгликоля. В соответствии с альтернативным методом конъюгаты 1Б-22ВА получают путем конденсации активированного РЕС, в котором концевая гидроксильная или аминогруппа заменена активированным линкером (см., например, патент США № 5382657 (КагаМеххлсх е! а1.)).

Полиэтиленгликолирование путем ацилирования обычно требует взаимодействия активного сложноэфирного производного РЕС с полипептидом 1Б-22ВА. Примером активированного сложного эфира РЕС является РЕС, этерифицированный с образованием №гидроксисукцинимида. В используемом здесь значении термин ацилирование означает нижеследующие типы связей между Ш-22К.А и водорастворимым полимером: амидные, карбаматные, уретановые и т.п. Методы получения полиэтиленгликолированного Ш-22КА путем ацилирования обычно включают стадии: (а) взаимодействия полипептида 1Б22КА с РЕС (таким как реакционноспособный сложный эфир альдегидного производного РЕС) в условиях, обеспечивающих присоединение одной или нескольких групп РЕС к Ш-22КА, и (Ь) получения продуктов реакции. Оптимальные условия реакции для ацилирования должны быть определены на основании известных параметров и требуемых результатов. Например, чем больше соотношение РЕС:Ш22КА, тем выше процентный выход продукта полиэтиленгликолированного 1Б-22ВА.

Продукт полиэтиленгликолирования, полученный путем ацилирования, обычно является продуктом полиэтиленгликолированного Ш-22КА, в котором ε-аминогруппы лизина соединены с полиэтиленгликолем при помощи ацильной связующей группы. Примером связующей группы является амид. Полученный 1Б-22ВА обычно моно-, ди- или триполиэтиленгликолирован по крайней мере на 95%, хотя в зависимости от условий реакции могут быть получены некоторые продукты с более высокими степенями полиэтиленгликолирования. Полиэтиленгликолированные продукты могут быть отделены от неконъюгированных полипептидов 1Б-22ВА при помощи стандартных методов очистки, таких как диализ, ультрафильтрация, ионообменная хроматография, аффинная хроматография и т.п.

Полиэтиленгликолирование путем алкилирования обычно включает осуществление взаимодействия конечного альдегидного производного РЕС с Ш-22КА в присутствии восстановителя. Группы РЕС могут быть присоединены к полипептиду при помощи группы -СН₂-ИН.

Кроме того, антитела против Ш-22КА. или фрагменты антител по настоящему изобретению могут быть полиэтиленгликолированы методами, известными в данной области и раскрытыми в настоящем описании изобретения.

Преимуществом получения производного путем восстановительного алкилирования с образованием монополиэтиленгликолированного продукта является возможность использования дифференциальной реакционной способности первичных аминогрупп разных типов, подходящих для получения производного. Указанное взаимодействие обычно осуществляют при значении рН, позволяющем использовать разность рКа между ε-аминогруппами остатков лизина и α-аминогруппами ^концевого остатка белка. Благодаря такому избирательному получению производного можно контролировать присоединение к белку водорастворимого полимера, содержащего такую реакционноспособную группу как альдегид. Конъюгирование с полимером происходит главным образом у №конца белка без существенной модификации других реакционноспособных групп, таких как аминогруппы боковой цепи лизина. Настоящее изобретение относится к получению, по существу, гомогенной популяции конъюгатов Ш-22КА. с монополимером.

Восстановительное алкилирование с целью получения, по существу, гомогенной популяции конъюгатов Ш-22КА с монополимером может включать стадии: (а) взаимодействия полипептида 1Б-22ВА с реакционноспособным РЕС в условиях восстановительного алкилирования при значении рН, пригодном для избирательной модификации α-аминогруппы у аминоконца 1Б-22ВЛ, и (Ь) получения одного или нескольких продуктов реакции. Восстановитель, используемый для осуществления восстановительного алкилирования, должен быть устойчивым в водном растворе и способным восстанавливать только основание Шиффа, образовавшееся на начальной стадии восстановительного алкилирования. Примеры восстановителей включают борогидрид натрия, цианоборогидрид натрия, диметиламиноборан, триметиламиноборан и пиридинборан.

Для получения, по существу, гомогенной популяции конъюгатов Ш^КА с монополимером условия реакции восстановительного алкилирования должны обеспечивать избирательное присоединение водорастворимого полимера к Оконцу ГБ-22ВА. Такие условия реакции обычно создают разность рКА между аминогруппами лизина и α-аминогруппой у №конца. Значение рН также влияет на используемое отношение полимера к белку. Как правило, при более низком значении рН желательно использовать больший избыток полимера по отношению к белку, так как чем менее реакционноспособной является N концевая α-группа, тем большее количество полимера необходимо для достижения оптимальных условий. При более высоком значении рН отношение полимер:ГВ-22КА не должно быть таким высоким благодаря наличию большего числа реакционноспособных групп. Значение рН обычно находится в пределах 3-9 или 3-6. Указанный метод может быть использован для получения конъюгатов ГВ-22КАсодержащих гомодимерных, гетеродимерных или мультимерных растворимых рецепторов.

Другим учитываемым фактором является молекулярная масса водорастворимого полимера. Как

- 28 015706 правило, чем выше молекулярная масса полимера, тем меньше число молекул полимера, которые могут быть присоединены к белку. Для осуществления реакций полиэтиленгликолирования характерная молекулярная масса составляет от около 2 до около 100 кДа, от около 5 до около 50 кДа или от около 12 до около 25 кДа. Молярное отношение водорастворимого полимера к 1Б-22КА обычно находится в пределах от 1:1 до 100:1. Молярное отношение водорастворимого полимера к 1Б-22КА обычно составляет от 1:1 до 20:1 для полиэтиленгликолирования или от 1:1 до 5:1 для монополиэтиленгликолирования.

В данной области хорошо известны стандартные методы получения конъюгатов, включающих полипептид и водорастворимый полимер. См., например, патент США № 5382657 (1<агаз1е\у|с/ е! а1.), патент США № 5738846 (Сгеепта1б е1 а1.) и публикации МеГоПй е! а1., С1ш. Рйагтасо1. Тйег. 59:636 (1996), Мог1кагзй е! а1., Αηа1. Вюсйет. 247:434 (1997)). Указанный метод может быть использован для получения конъюгатов 1Т-22КА-содержащих гомодимерных, гетеродимерных или мультимерных растворимых рецепторов.

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим пептид или полипептид, такой как растворимый рецептор или антитело, раскрытые в настоящем описании изобретения. Такие композиции могут далее содержать носитель. Носитель может быть обычным органическим или неорганическим носителем. Примеры носителей включают воду, буферный раствор, спирт, пропиленгликоль, макроголь, кунжутное масло, кукурузное масло и т. п.

7. Выделение полипептидов Ш-22КА.

Полипептиды по настоящему изобретению могут быть очищены по крайней мере до 80% чистоты, по крайней мере до 90% чистоты, по крайней мере до 95% чистоты или более чем до 95% чистоты, в частности до 96, 97, 98 и более чем до 99% чистоты в отношении загрязняющих макромолекул, особенно других белков и нуклеиновых кислот, и инфекционных и пирогенных агентов. Полипептиды по настоящему изобретению могут быть также очищены до фармацевтически чистого состояния, которое предполагает степень чистоты более 99,9%. В некоторых препаратах очищенный полипептид, по существу, не содержит других полипептидов, в частности других полипептидов животного происхождения.

Для получения препаратов Ш-22КА, очищенных от природных примесей (таких как ткани человека), синтетических полипептидов Ш-22КА, рекомбинантных полипептидов Ш-22КА и слитых полипептидов Ш-22КА, очищенных от рекомбинантных клеток-хозяев, могут быть использованы методы фракционирования и/или стандартные методы очистки. Для фракционирования образцов можно использовать осаждение сульфатом аммония и хаотропную экстракцию. Характерные стадии очистки могут включать использование гидроксиапатита, вытеснительную хроматографию, ТРЬС и высокоэффективную жидкостную хроматографию с обращенной фазой. Приемлемые хроматографические среды включают производные декстраны, арагозу, целлюлозу, полиакриламид, специальные кремнеземы и т.п. Производные РЕ1, ЭЕАЕ, ОАЕ и О также являются приемлемыми средами. Характерные хроматографические среды включают среды, являющиеся производными фенильных, бутильных или октильных групп, такие как фенилсефароза ТТ (Рйагтааа), бутил 650 Тоуореаг1 (Тозо Нааз, МойдотегутШе, РА), октилсефароза (Рйагтааа) и т.п., или полиакриловые смолы, такие как амберхром СС 71 (Тозо Нааз) и т.п. Приемлемые твердые носители включают стеклянные бусы, смолы на основе кремнезема, целлюлозные смолы, агарозные гранулы, перекрестносшитые агарозные гранулы, полистирольные гранулы, перекрестносшитые полиакриламидные смолы и тому подобные, которые не растворяются в условиях предполагаемого применения. Указанные носители могут быть модифицированы реакционноспособными группами, позволяющими присоединять белки при помощи аминогрупп, карбоксильных групп, сульфгидрильных групп, гидроксильных групп и/или углеводородных частей.

Примеры химических методов связывания включают активацию цианированным бромидом, активацию №гидроксисукцинимидом, активацию эпоксидом, активацию сульфогидрилом, активацию гидразидом и использование карбоксильных и аминопроизводных для связывания карбодиимидом. Вышеуказанные и другие твердые среды хорошо известны, широко используются в данной области и могут быть приобретены у коммерческих поставщиков. Выбор конкретного метода выделения и очистки полипептида является обычной практикой и частично определяется свойствами выбранного носителя. См., например, публикации АГПт1у Сйготайдгарйу: Ргтар1ез & Ме!йобз (Рйагтааа ЬКВ В^οΐесйηο1οду 1988) и Ооомп, Рго1ет Риπйсаΐ^οη Рго!осо1з (Тйе Нитам Ргезз 1996).

Специалисты в данной области могут внести дополнительные изменения в методы выделения и очистки Ш-22КА. Например, для выделения больших количеств белка методом иммуноаффинной очистки могут быть использованы антитела против 1Ь-22КА, полученные в соответствии с приведенным ниже описанием.

Полипептиды по настоящему изобретению также могут быть выделены благодаря определенным свойствам. Например, адсорбционная хроматография на иммобилизованных ионах металлов (1МАС) может быть использована для очистки белков с высоким содержанием гистидина, в том числе белков, содержащих полигистидиновые метки. Для осуществления вышеуказанной очистки в гель сначала вводят ионы двухвалентного металла с образованием хелата (8и1ко\\'зкг Тгсп6з ίη Вюсйет. 3:1 (1985)). Белки с высоким содержанием гистидина адсорбируются указанной матрицей с разным сродством связывания в зависимости от использованных ионов металла и могут быть элюированы методом конкурентного

- 29 015706 элюирования, уменьшения значения рН или использования сильных хелатообразователей. Другие методы очистки включают очистку гликозилированных белков при помощи аффинной хроматографии на лектине и ионообменной хроматографии (М. Пси!хсйсг, (еб.), Мс111. Епхуто1. 182:529 (1990)). В соответствии с дополнительными вариантами осуществления изобретения для облегчения очистки может быть создан гибрид представляющего интерес полипептида и аффинной метки (например, мальтозасвязывающий белок, домен иммуноглобулина). Кроме того, для очистки могут быть использованы лигандсвязывающие свойства внеклеточного домена 1Б-22КА, например, 1Ь-22КА-содержащих растворимых рецепторов; в частности, при осуществлении аффинной хроматографии, в которой лиганд 1Б-22 иммобилизуют на колонке, при этом 1Ь-22КА-содержащий рецептор связывается с данным лигандом и затем элюируется стандартными хроматографическими методами.

Полипептиды 1Б-22КА или их фрагменты могут быть также получены вышеописанным методом химического синтеза. Полипептиды 1Б-22КА могут быть мономерами или многомерами, гликозилированными или негликозилированными, связанными или не связанными с полиэтиленгликолем и могут включать или не включать первоначальный аминокислотный остаток метионина.

8. Получение антител к белкам 1Б-22КА.

Антитела к 1Б-22КА можно получить, например, используя продукт экспрессирующего вектора 1Ь22КА или 1Б-22КА, выделенный из природного источника, такого как антиген. Особенно эффективные антитела против 1Б-22КА специфически связываются с 1Б-22КА. Считается, что антитела специфически связываются, если указанные антитела обладают по крайней мере одним из двух нижеследующих свойств: (1) антитела связываются с 1Б-22КА на пороговом уровне активности связывания, и (2) антитела, по существу, не взаимодействуют с полипептидами, родственными 1Б-22КА.

С учетом первой характеристики антитела специфически связываются в том случае, если они связываются с полипептидом, пептидом или антигенной детерминантой 1Б-22КА со сродством связывания (К_а) 10⁶ М^-1 или выше, предпочтительно 10⁷ М^-1 или выше, более предпочтительно 10⁸ М^-1 или выше и наиболее предпочтительно 10⁹ М^-1 или выше. Специалист в данной области может легко определить сродство связывания антитела, например, при помощи анализа Скатчарда (8са!сйагб, Апп. ΝΥ Асаб. 8сЕ 51:660 (1949)). С учетом второй характеристики антитела, по существу, не взаимодействуют с родственными молекулами полипептида, например, при обнаружении 1Б-22КА, а не известных в настоящее время полипептидов, что можно определить при помощи стандартного анализа методом вестерн-блоттинга. Примеры известных родственных полипептидов включают известные рецепторы цитокинов.

Антитела против 1Б-22КА могут быть получены с использованием пептидов и полипептидов, несущих антигенную детерминанту 1Б-22КА. Пептиды и полипептиды по настоящему изобретению, несущие антигенную детерминанту, включают последовательность, состоящую по крайней мере из 9 или от 15 до около 30 аминокислот 8ЕО Ш NО: 3 и другой аминокислотной последовательности, раскрытой в настоящем описании изобретения. Однако пептиды или полипептиды, включающие более длинный фрагмент аминокислотной последовательности по настоящему изобретению, содержащий 30-50 аминокислот, или полную аминокислотную последовательность полипептида по настоящему изобретению, также могут быть использованы для индукции антител, связывающихся с 1Б-22КА. Желательно выбрать аминокислотную последовательность пептида, несущего антигенную детерминанту, которая хорошо растворяется в водных растворителях (т.е. данная последовательность включает относительно гидрофильные остатки при отсутствии гирофобных остатков). Кроме того, для получения антител может быть желательно также использовать аминокислотные последовательности, содержащие остатки пролина.

В качестве иллюстрации можно указать, что потенциальные антигенсвязывающие сайты в 1Б-22КА были идентифицированы методом Джеймсона-Вульфа Датсхоп апб ^о1Г, САВ1О8 4:181 (1988), с использованием программы РКОТЕАЫ (версия 3.14) ΕΛΞΕΡΟΕΝΕ (ΌΝΛδΤΛΚ.; Маб1хоп, XVI). При осуществлении данного анализа были использованы параметры по умолчанию.

Метод Джеймсона-Вульфа позволяет прогнозировать вероятные антигенные детерминанты в результате объединения шести основных подпрограмм для прогнозирования структуры белка. Для идентификации аминокислотных последовательностей, представляющих области с наибольшей локальной гидрофильностью, сначала был использован метод Хоппа-Вудса (Норр с! а1., Ргос. №11'1 Асаб. 8сЕ И8А 78:3824 (1981)) (параметр, в среднем семь остатков). На втором этапе был использован метод Эмини (Ет1ш с! а1., 1. У1го1о§у 55:836 (1985)) для вычисления вероятности воспроизведения поверхности (параметр: порог принятия решения о воспроизведении поверхности (0,6)=1). На третьем этапе был использован метод Карплуса-Шульца (Кагр1их апб 8сйи1!7, Ма!штоххспхсйайсп 72:212 (1985)) для прогнозирования гибкости цепи остова (параметр: порог гибкости (0,2)=1). На четвертом и пятом этапах анализа вторичные прогнозы относительно структуры были применены к данным с использованием методов ЧоуФасмана (Сйои, Ргсбюйоп оГ Рго!сш 81гис!ига1. С1аххсх Ггот Атто Ас1б Сотрохйюп, ш Ргсбюйоп оГ Рго!сш 81гис!игс апб Фе Ргтс1р1сх оГ Рго!сш СопГогтаЕоп. Еахтап (еб.), радех 549-586 (Р1спит Ргсхх 1990)) и Гарньера-Робсона (Оаттог с! а1., 1. Мо1. Вю1. 120:97 (1978)) (параметры метода Чоу-Фасмана: таблица структур=64 белка; пороговое значение а-области=103; пороговое значение в-области=105; параметры метода Гарньера-Робсона: константы принятия α и β решения=0). В шестой подпрограмме были объеди

- 30 015706 нены параметры гибкости и факторы доступности гидрофобности/растворителя для определения значения контура поверхности, получившего название антигенного индекса. И наконец, к антигенному индексу была применена функция расширения пика, которая расширяет основные пики поверхности, добавляя 20, 40, 60 или 80% значения соответствующего пика для объяснения дополнительной свободной энергии, выделяемой вследствие подвижности поверхностных областей относительно внутренних областей. Указанное вычисление, однако, не производилось в отношении любого основного пика, расположенного в спиральной области, так как спиральные области являются менее гибкими.

Результаты данного анализа показали, что приемлемые антигенные пептиды могут быть получены при использовании следующих аминокислотных последовательностей 8Е0 ГО N0: 3: профили гидрофильности Хоппа/Вудса можно использовать для определения областей, обладающих наибольшим антигенным потенциалом в 8Е0 ГО N0: 3 (Норр е! а1., Ргос. ИаЙ. Асай. 8с1. 78:3824-3828, 1981; Норр, I. Еитип. Ме!Ь. 88:1-18, 1986 апй Тпс.|шег е! а1., Рго!ет Епдшеегтд 11: 153-169, 1998). Указанный профиль создан на основе скользящего окна из шести остатков. Скрытые остатки С, 8 и Т и открытые остатки Н, Υ и V во внимание не принимались. Кроме того, антигенные детерминанты ГЬ-22КА в 8Е0 ГО N0: 3, прогнозированные на основании графика Джеймсона-Вульфа, например, при помощи программы Рго!еап 0НА8ТАК. (^NΑ8ТΑК, Ечс., Май1зоп, VI), служат в качестве предпочтительных антигенных детерминант и могут быть определены специалистом в данной области. Такие антигенные детерминанты включают (1) аминокислотные остатки 1 (Рго) - 6 (Азр) 8Е0 ГО N0: 3; (2) аминокислотные остатки 26 (8ег) 32 (Рго) 8Е0 ГО N0: 3; (3) аминокислотные остатки 41 (Ьуз) - 47 (Азр) 8Е0 ГО N0: 3; (4) аминокислотные остатки 49 (Уа1) - 62 (Суз) 8Е0 ГО N0: 3; (5) аминокислотные остатки 41 (Ьуз) - 62 (Суз) 8Е0 ГО N0: 3; (6) аминокислотные остатки 84 (А1а) - 97 (8ег) 8Е0 ГО N0: 3; (7) аминокислотные остатки 103 (ТЬг) 108 (Азр) 8Е0 ГО N0: 3; (8) аминокислотные остатки 130 (Агд) - 135 (Н1з) 8Е0 ГО N0: 3; (9) аминокислотные остатки 164 (С1у) - 166 (Ьуз) 8Е0 ГО N0: 3; (10) аминокислотные остатки 175 (Туг) - 179 (С1и) 8Е0 ГО N0: 3; (11) аминокислотные остатки 193 (Ьуз) - 196 (А1а) 8Е0 ГО N0: 3; (12) аминокислотные остатки 203 (Ьуз) - 209 (ТЬг) 8Е0 ГО N0: 3. Настоящее изобретение относится к использованию любого из антигенных пептидов 1-12 для создания антител к ГЬ-22КА и в качестве инструмента для скрининга или идентификации нейтрализующих моноклональных антител по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится также к полипептидам, включающим по крайней мере один из антигенных пептидов 1-10. Настоящее изобретение относится к использованию любых антигенных пептидов или антигенных детерминант, раскрытых в настоящем описании изобретения, для создания антител к ГЬ-22КА, а также для идентификации и скрининга моноклональных антител против ГЬ-22КА, которые обладают нейтрализующей активностью и могут связывать, блокировать, ингибировать, ослаблять, оказывать антагонистическое действие или нейтрализовать активность ГЬ-22 и ГЬ-20 (отдельно или вместе).

Кроме того, приемлемые антигены включают также полипептиды ГЬ-22КА, содержащие вышеуказанный цитокинсвязывающий или внеклеточный домен ГЬ-22КА в сочетании с внеклеточным доменом другого цитокина класса I или II, в частности, образующие растворимые гетеродимерные или мультимерные полипептиды ГО^КА, такие как растворимые полипептиды ^-22^^^^2-4, I^-22КΑ/ζсу!о^11, Ш^КА/хсуЮ!·? и т.п.

Поликлональные антитела к рекомбинантному белку ГБ-22КА или к ГЬ-22КА, выделенному из природных источников, могут быть получены методами, хорошо известными специалистам в данной области. См., например, публикации Сгееп е! а1., Ргойисйоп оГ Ро1ус1опа1 АпЬзега, ίπ IттииосЬет^са1 Рго!осо1з (Мапзоп, ей.), радез 1-5 (Нитана Ргезз 1992), апй V^11^атз е! а1., Ехргеззюп оГ Гоге1дп рго!етз ш Е. сой изшд р1азт1й уес!огз апй рипйсайоп оГ зресШс ро1ус1опа1 апйЬоФез, т ЭХА С1ошпд 2: Ехргеззюп 8уз!етз, 2пй ЕйШоп, С1оуег е! а1. (ейз.), раде 15 (0хГогй Ишуегзйу Ргезз 1995). Иммуногенность полипептида ГЬ-22КА можно повысить при использовании адъюванта, такого как квасцы (гидроксид алюминия), полный или неполный адъювант Фрейнда. Пригодные для иммунизации полипептиды включают также слитые полипептиды, такие как гибриды ГБ-22КА или его части с полипептидом иммуноглобулина или мальтозасвязывающим белком. Иммуноген полипептида может представлять собой непроцессированную молекулу или ее часть. Если часть полипептида является гаптеноподобной, такая часть может быть успешно присоединена или связана с макромолекулярным носителем (таким как гемоцианин лимфы улитки (КЬМ), бычий сывороточный альбумин (В8А) или столбнячный токсин) для иммунизации.

Несмотря на то, что поликлональные антитела обычно индуцируют в организме животных, таких как лошади, коровы, собаки, цыплята, крысы, мыши, кролики, морские свинки, козы или овцы, антитело против ГБ-22КА по настоящему изобретению может быть также получено из антитела человекообразных обезьян. Общие методы индукции диагностически и терапевтически пригодных антител у павианов описаны, например, в международной публикации патента № ν0 91/11465 (Со1йепЬегд е! а1.) и в публикации Ьозтап е! а1., Ш!. I. Сапсег 46:310 (1990).

Альтернативно могут быть созданы моноклональные антитела против ГБ-22КА. Моноклональные антитела грызунов к специфическим антигенам могут быть получены методами, известными специалистам в данной области (см., например, публикации КоЬ1ег е! а1., №11иге 256:495 (1975), СоЬдап е! а1. (ейз.), Сиггеп! Рго!осо1з ш ^типо^ду, Уо1. I, радез 2.5.1-2.6.7 СоЬп ΧνίΕν & 8опз 1991) [Сойдап], Р1скз1еу е! а1., Ргойис!юп оГ топос1опа1 апйЬойгез адашз! рго!ешз ехргеззей ш Е. со11, т ЬНА С1ошпд 2: Ехргеззюп

- 31 015706

8уз!етз, 2пб Ебйюп, С1огег е! а1. (ебз.), раде 93 (0хГогб ИпАегзйу Ргезз 1995)).

Моноклональные антитела могут быть получены путем инъекции мышам композиции, содержащей генный продукт ГЬ-22РА, подтверждения продукции антитела путем отбора пробы сыворотки, удаления селезенки для получения В-лимфоцитов, слияния В-лимфоцитом с миеломными клетками для получения гибридом, клонирования гибридом, отбора положительных клонов, продуцирующих антитела к данному антигену, культивирования клонов, продуцирующих антитела к данному антигену, и выделения антител из культур гибридом.

Кроме того, антитело против ГЙ-22РА по настоящему изобретению можно получить из моноклонального антитела человека. Моноклональные антитела человека получают у трансгенных мышей, созданных для продуцирования специфических антител человека в ответ на антигенную стимуляцию. При осуществлении данного метода элементы локуса тяжелой и легкой цепей человека вводят в линию мышей, полученных из линий эмбриональных стволовых клеток, содержащих целенаправленные разрушения эндогенных локусов тяжелой и легкой цепей. Трансгенные мыши могут синтезировать антитела человека, специфичные к антигенам человека, поэтому указанные мыши могут быть использованы для продуцирования гибридом, секретирующих антитела человека. Методы получения антител человека у трансгенных мышей описаны, например, в публикациях Сгееп е! а1., №Щ.1ге Сепе!. 7:13 (1994), ЬопЬегд е! а1., №!иге 368:856 (1994) и Тау1ог е! а1., Гп!. Гттип. 6:579 (1994).

Моноклональные антитела могут быть выделены и очищены от культур гибридом целым рядом хорошо известных методов. Такие методы выделения включают аффинную хроматографию на сефарозе с белком А, вытеснительную хроматографию и ионообменную хроматографию (см., например, публикации Сойдап е! радез 2.7.1-2.7.12 апб радез 2.9.1-2.9.3; Вашез е! а1., Риййсабоп оГ Гттипод1оЬийп С (ГдС), 1п Ме!йобз т Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 10, радез 79-104 (Тйе Нитапа Ргезз, Гпс. 1992)).

Для определенных применений может быть желательно получить фрагменты антител против ГЬ22КА. Такие фрагменты антител могут быть получены, например, в результате протеолитического гидролиза антитела. Фрагменты антител могут быть получены путем расщепления пепсином или папаином цельных антител стандартными методами. В качестве иллюстрации можно отметить, что фрагменты антител могут быть получены в результате ферментативного расщепления антител пепсином с образованием фрагмента 58, получившего название Т(аЬ')₂. Указанный фрагмент может быть далее расщеплен при помощи тиолового восстановителя с образованием моновалентных ТаЬ'-фрагментов 3.58. Реакция расщепления может быть необязательно осуществлена с использованием блокирующей группы для сульфгидрильных групп, образующихся в результате расщепления дисульфидных связей. В качестве альтернативы можно произвести ферментативное расщепление с помощью пепсина, в результате которого непосредственно образуются два моновалентных РаЬ-фрагмента и Тс-фрагмент. Указанные методы описаны, например, в патенте США № 4331647 (Со1бепЬегд) и публикациях №зопоГГ е! а1., Агсй. Вюсйет. Вюрйуз. 89:230 (1960), Ройет, Вюсйет. I. 73:119 (1959), Ебе1тап е! а1., ш Ме!йобз т Еп7уто1оду, Уо1. 1, раде 422 (Асабетю Ргезз 1967) и Сойдап а! радез 2.8.1-2.8.10 апб 2.10-2.10.4.

Можно использовать другие методы расщепления антител, такие как отделение тяжелых цепей с образованием моновалентных фрагментов с легкой-тяжелой цепью, дальнейшее расщепление фрагментов или другие ферментативные, химические или генетические методы, если указанные фрагменты связываются с антигеном, узнаваемым интактным антителом.

Например, Ρν-фрагменты включают связанные У_Н- и У_ъ-цепи. Указанная связь может быть нековалентной, как описано в публикации ГпЬаг е! а1., Ргос. №11'1 Асаб. 8с1. И8А 69:2659 (1972). Альтернативно цепи вариабельной области могут быть связаны межмолекулярной дисульфидной связью или перекрестно сшиты химическими веществами, такими как глутаровый альдегид (см., например, публикацию 8апбйи, Стй. Κν. Вю!есй. 12:437 (1992)).

Ρν-фрагменты могут включать У_Н- и У_ъ-цепи, соединенные пептидным линкером. Указанные одноцепочечные антигенсвязывающие белки (зсРу) получают путем создания структурного гена, включающего последовательности ДНК, кодирующие У_Н- и У_ъ-домены, соединенные олигонуклеотидом. Указанный структурный ген встраивают в экспрессирующий вектор, который затем вводят в клетку-хозяин, такую как Е.сой. Рекомбинантные клетки-хозяева синтезируют одну полипептидную цепь с линкерным пептидом, связывающим два У-домена. Методы получения зсΡν описаны, например, в публикациях \νΗί1ο\ν е! а1., Ме!йобз: А Сотраиюп !о Ме!йобз ш Епхуто1оду 2:97 (1991) (см. также публикацию Вйб е! а1., 8с1епсе 242:423 (1988), патент США № 4946778 (Ьабпет е! а1.), публикацию Раск е! а1., Вю/Тесйпо1оду 11:1271 (1993) и приведенную выше публикацию 8апбйи).

В качестве иллюстрации можно отметить, что зсΡν можно получить, подвергая лимфоциты воздействию полипептида ГЙ-22РА ш νίΐτο и отбирая библиотеки отображения антител с помощью фагового дисплея или в подобных векторах (например, в результате использования иммобилизованного или меченого белка или пептида ГЙ-22РА). Гены, кодирующие полипептиды, имеющие предполагаемые домены связывания полипептида ГЬ-22РА, можно получить в результате скрининга неспецифических пептидных библиотек, отображенных на фаговом дисплее (отображение с помощью фагового дисплея) или бактериях, таких как Е.сой. Нуклеотидные последовательности, кодирующие указанные полипептиды, можно получить рядом способов, таких как неспецифический мутагенез и неспецифический синтез полинуклео

- 32 015706 тидов. Указанные неспецифические пептидные библиотеки, отображенные на фаговом дисплее, можно использовать для скрининга пептидов, взаимодействующих с известной мишенью, которая может быть белком или полипептидом, таким как лиганд или рецептор, биологической или синтетической макромолекулой, органическим или неорганическим веществом. В данной области известны методы создания и скрининга таких неспецифических пептидных библиотек, отображенных на фаговом дисплее (патент США № 5223409 (Ьабпег е! а1.), патент США № 4946778 (Ьабпег е! а1.), патент США № 5403484 (Ьабпег е! а1.), патент США № 5571698 (Ьабпег е! а1.) и публикация Кау е! а1., Рйаде И1кр1ау οί Рерббек апб Рго!ешк (Асабетю Ргекк, 1пс 1996), при этом неспецифические пептидные библиотеки, отображенные на фаговом дисплее, и наборы для скрининга таких библиотек можно приобрести коммерческим путем, например, в компаниях СЬОЧТЕСН ^аЬο^а!ο^^ек, 1пс. (Τ;·ι1ο Μΐο, СА), 1п\йгодеп 1пс. (8ап ^^едο, СА), №\ν Епд1апб Вю1аЬк, 1пс. (Βеνе^1у, М.А.) и Рйагтааа ЬКВ Β^ο!есЬηο1οду 1пс. (Р1кса!а^ау, Ν.Ι). Скрининг неспецифических пептидных библиотек, отображенных на фаговом дисплее, можно произвести с использованием последовательностей 1Ь-22КА по настоящему изобретению для идентификации белков, связывающихся с 1Ь-22КА.

Другой формой фрагмента антитела является пептид, кодирующий один гипервариабельный участок (СОК). Пептиды СОК (минимальные узнающие единицы) могут быть получены в результате создания генов, кодирующих СОК представляющего интерес антитела. Такие гены получают, например, при помощи полимеразной цепной реакции, позволяющей синтезировать вариабельную область из РНК антителопродупирующих клеток (см., например, публикации Ьагбск е! а1., Мебюбк: А ^трапюп !ο Ме11юбк ш Εηζутο1οду 2:106 (1991), Сοи^ΐеηау-^иск, Сепебс Машри1а1юп οί Μοηοс1οηа1 Аη!^Ьοб^ек, ш Μοηοс1οηа1 АηбЬοб^ек: Р^οбисбοη, Епдшеебпд апб С11шса1 Арр1^сабοη, Кй!ег е! а1. (ебк.), раде 166 (СатЬббде ЬпгоегкЦу Ргекк 1995), апб \Уагб е! а1., Сепебс Машри1а!юп апб Ехргеккюп οί Апб^бхек, ш ΜοιιοсШпиН АηбЬοб^ек: Рбпс1р1ек апб Арр1юа!юпк, Вйсй е! а1., (ебк.), раде 137 (^йеу-Ыкк, 1пс. 1995)).

Альтернативно антитело против 1Й-22КА может быть выделено из гуманизированного моноклонального антитела. Гуманизированные моноклональные антитела получают путем переноса гипервариабельных участков из тяжелых и легких цепей вариабельной области иммуноглобулина мыши в вариабельную область человека. Характерные остатки антител человека затем заменяют в областях рамки считывания аналогов мыши. Использование компонентов антитела, выделенных из гуманизированных моноклональных антител, позволяет устранить возможные проблемы, связанные с иммуногенностью константных областей мыши. Стандартные методы клонирования вариабельных областей иммуноглобулина мыши описаны, например, в публикации Ог1апб1 е! а1., Ргос. №11'1 Асаб. 8сг И8А 86:3833 (1989). Методы получения гуманизированных моноклональных антител описаны, например, в публикациях .^пек е! а1., №1Шге 527:522 (1986), Сабег е! а1., Ргос. №11'1 Асаб. 8ег И8А 89:4285 (1992), 8апбйи, Сб!. Κν. Вю!есй. 12:437 (1992), 8шдег е! а1., 1. 1ттип. 150:2844 (1993), 8ибЫг (еб.), АηбЬοбу Епдшеебпд РгоФсюк (Нитапа Ргекк, 1пс. 1995), Ке11еу, Епдшеебпд Тйегареибс Аη!^Ьοб^ек, ш Рго!еш Епдшеебпд: Рбпс1р1ек апб Ргасбсе, С1е1апб е! а1. (ебк.), радек 399-434 (1ο1ιΐ'ΐ ^йеу & δο^, 1пс. 1996) и в патенте США № 5693762 (1997) (Онееп е! а1.).

Кроме того, антитела против 1Й-22КА или фрагменты антител по настоящему изобретению могут быть полиэтиленгликолированы методами, известными в данной области и раскрытыми в настоящем описании изобретения.

Поликлональные антиидиотипические антитела могут быть получены в результате иммунизации животных антителами или фрагментами антител против 1Й-22КА стандартными методами. См., например, публикацию Сгееп е! а1., Ргобис!юп οί Рο1ус1οηа1 Апбкега, ш Мебюбк 1п ΜοΚαι1;π· Βίο1οβν: 1ттигтосНетюб РюЮ^Ь, Мапгоп (еб.), радек 1-12 (Нитапа Ргекк 1992). Кроме того, см. публикацию СоИдам а! радек 2.4.1-2.4.7. Альтернативно моноклональные антиидиотипические антитела могут быть получены при использовании антител или фрагментов антител против 1Й-22КА в качестве иммуногенов вышеописанными методами. В качестве другой альтернативы вышеописанными методами могут быть получены гуманизированные антиидиотипические антитела или антиидиотипические антитела человекообразных обезьян. Методы получения антиидиотипических антител описаны, например, в патенте США № 5208146 (1пе), патенте США № 5637677 (Сгеепе е! а1.) и в публикации Vа^ίйакаν^ апб МатосНа, 1. Сеп. У1то1. 77:1875 (1996).

Антитело против 1Й-22КА может быть конъюгировано с визуализируемой меткой с образованием иммуноконъюгата против 1Й-22КА. Приемлемые визуализируемые метки включают, например, радиоизотопы, флуоресцентные метки, хемилюминесцентные метки, ферментные метки, биолюминесцентные метки или колоидное золото. Методы создания и обнаружения таких иммуноконъюгатов, меченных с возможностью обнаружения, хорошо известны специалистам в данной области и более подробно описаны ниже.

Визуализируемой меткой может быть радиоизотоп, обнаруживаемый при помощи авторадиографии. Изотопы, особенно пригодные для достижения целей по настоящему изобретению, включают ³Н, ¹²⁵Ι, ¹³¹Ι, ³⁵δ и ¹⁴С.

Иммуноконъюгаты против 1Й-22КА можно также метить флуоресцентным соединением. Присутствие антитела, меченного флуоресцентным соединением, определяют, подвергая иммуноконъюгат воз

- 33 015706 действию света с соответствующей длиной волны и визуализируя возникшую флуоресценцию. Метящие флуоресцентные соединения включают флуоресцеинизотиоцианат, родамин, фикоэритерин, фикоцианин, аллофикоцианин, офтальдегид и флуорескамин.

Альтернативно иммуноконъюгаты против ГБ-22КА можно метить с возможностью обнаружения путем связывания антитела с хемилюминесцентным соединением. Присутствие иммуноконъюгата, меченного хемилюминесцентным соединением, определяют, визуализируя присутствие люминесценции, возникающей в процессе химической реакции. Примеры метящих люминесцентных соединений включают люминол, изолюминол, ароматический сложный эфир акридиния, имидазол, соль акридиния и сложный эфир щавелевой кислоты.

Аналогичным образом для мечения иммуноконъюгатов против ГБ-22КА по настоящему изобретению может быть использовано биолюминесцентное соединение. Биолюминесценция является одним видом хемилюминесценции, обнаруживаемой в биологических системах, в которых каталитический белок увеличивает эффективность хемилюминесцентной реакции. Присутствие биолюминесцентного белка определяют путем обнаружения люминесценции. Пригодные для мечения биолюминесцентные соединения включают люциферин, люциферазу и аэкворин.

Альтернативно иммуноконъюгаты против ГБ-22КА можно метить с возможностью обнаружения путем связывания антитела против ГБ-22КА с ферментом. При инкубации конъюгата антитела против ГБ22КА с ферментом в присутствии соответствующего субстрата фермент взаимодействует с субстратом с образованием химической части, которая может быть обнаружена, например, спектрофотометрическими, флуорометрическими или визуальными средствами. Примеры ферментов, которые могут быть использованы для мечения полиспецифических иммуноконъюгатов с возможностью обнаружения, включают βгалактозидазу, глюкозооксидазу, пероксидазу и щелочную фосфатазу.

Специалистам в данной области должны быть известны другие приемлемые метки, пригодные для использования в соответствии с настоящим изобретением. Маркер можно связать с антителами против ГБ-22КА стандартными методами, известными в данной области. Характерные методы описаны в публикациях Кеипебу е! а1., СБи. СЫт. Ас1а 70:1 (1976), 8сБигз е! а1., СБи. СЫт. Ас!а 81:1 (1977), 8ЫБ е! а1., 1и!'1 1. Сапсег 46:1101 (1990), 8!еш е! а1., Сапсег Кез. 50:1330 (1990) и приведенной выше публикации СоБдаи.

Кроме того, удобство и универсальность иммунохимического обнаружения можно усилить с помощью антител против ГБ-22КА, конъюгированных с авидином, стрептавидином и биотином (см., например, публикации \У11с11ек е! а1. (ебз.), Ау1б1и-В1оБи ТесБио1оду, Мебюбз Ιη Епхуто1оду. Уо1. 184 (Асабетю Ргезз 1990) и Вауег е! а1., 1ттииосБет1са1 АррБсаБоиз о£ Ау1б1и-В1оБи ТесЪпо1оду, ш Мебюбз ш Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 10, Маизои (еб.), радез 149-162 (ТБе Нитаиа Ргезз, 1ис. 1992).

Методы осуществления иммуноанализов хорошо известны. См., например, публикации Соок аиб 8е1£, Моиос1оиа1 АиБЬоб1ез ш П1адиозБс 1ттииоаззауз, ш Моиос1оиа1 Аи!1Ьоб1ез: РгобисБои, Еидшеег1ид, аиб СБшса1 АррБсаБои, КЫег аиб Ьабутап (ебз.), радез 180-208 (СатЬпбде Ишуегзйу Ргезз, 1995), Репу, ТБе Ко1е о£ Моиос1оиа1 АиБЬоб1ез ш !Бе Абуапсетеи! о£ 1ттииоаззау ТесБио1оду, ш Моиос1оиа1 АиБЬоб1ез: Ргшар1ез аиб АррБсаБоиз, ВпсБ аиб Ьеипох (ебз.), радез 107-120 (^беу-Ызз, 1ис. 1995), аиб П1атапб1з, 1ттииоаззау (Асабетю Ргезз, 1ис. 1996).

Настоящее изобретение относится также к наборам для осуществления иммунологического диагностического анализа экспрессии гена ГБ-22КА. В комплект таких наборов входит по крайней мере один контейнер, содержащий антитело против ГБ-22КА или фрагмент указанного антитела. В комплект набора может также входить второй контейнер, содержащий один или несколько реагентов, позволяющих обнаружить присутствие антитела против ГБ-22КА или фрагментов указанного антитела. Примеры таких индикаторных реагентов включают визуализируемые метки, такие как радиоактивные метки, флуоресцентные метки, хемилюминесцентные метки, ферментные метки, биолюминесцентные метки, коллоидное золото и т.п. В комплект набора может также входить памятка для пользователя с указанием того, что антитела против ГБ-22КА или фрагменты указанного антитела предназначены для обнаружения белка 1Ь22КА. Например, в письменных инструкциях может быть указано, что входящее в набор антитело или фрагмент антитела может быть использовано для обнаружения ГБ-22КА. Письменная инструкция может быть вложена непосредственно в контейнер или напечатана на упаковке.

9. Использование антител против ГБ-22КА для антагонистического воздействия на связывание ГБ22КА с ГБ-22 или ГБ-20 и ГБ-22.

Альтернативные методы создания или отбора антител по настоящему изобретению включают ш νί!го воздействие лимфоцитов на полипептиды растворимого рецептора ГБ-22КА или их фрагменты, такие как антигенные детерминанты, и отбор библиотек антител, отображенных с помощью фагового дисплея, или в подобных векторах (например, в результате использования иммобилизованных или меченых полипептидов растворимого рецептора ГБ-22КА или их фрагментов, таких как антигенные детерминанты). Гены, кодирующие полипептиды, имеющие потенциальные области связывания, в частности полипептиды растворимого рецептора ГБ-22КА или их фрагменты, такие как антигенные детерминанты, могут быть получены путем скрининга неспецифических пептидных библиотек, отображенных на фаговом дисплее (отображение с помощью фагового дисплея) или бактериях, таких как Е.соБ. Нуклеотидные последова

- 34 015706 тельности, кодирующие полипептиды, могут быть получены разными способами, такими как неспецифический мутагенез и неспецифический синтез полинуклеотидов. Указанные неспецифические пептидные библиотеки, отображенные с помощью фагового дисплея, могут быть подвергнуты скринингу в отношении пептидов, взаимодействующих с известной мишенью, которая может быть белком или полипептидом, таким как лиганд или рецептор, биологическая или синтетическая макромолекула, органические или неорганические вещества. В данной области известны методы создания и скрининга таких неспецифических пептидных библиотек, отображенных с помощью фагового дисплея (патент США № 5223409 (Ьабпег е! а1.), патент США № 4946778 (Ьабпег е! а1.), патент США № 5403484 (Ьабпег е! а1.) и патент США № 5571698 (Ьабпег е! а1.), при этом неспецифические пептидные библиотеки, отображенные с помощью фагового дисплея, и наборы для скрининга таких библиотек можно приобрести коммерческим путем, например, в компаниях С1оп!есЬ (Ра1о А1!о, СА), ^йгодеп Лс. (8ап Б1едо, СА), Епд1апб В1о1аЬк, Лс. (Веνе^1у, МА) и РНагтас1а ЬКВ Вюр!есйпо1оду Лс. (Р1кса!а^ау, N1). Неспецифические пептидные библиотеки, отображенные с помощью фагового дисплея, могут быть подвергнуты скринингу с использованием полипептидов растворимого рецептора Ш-22КА или их фрагментов, таких как полипептидные последовательности антигенных детерминант по настоящему изобретению, для идентификации белков, связывающихся с полипептидами Ш-22КА-содержащих рецепторов. Указанные связывающие полипептиды, взаимодействующие с полипептидами Ш-22КА-содержащего растворимого рецептора, можно использовать для мечения клеток, для выделения гомологичных полипептидов методом аффинной очистки; указанные пептиды могут быть прямо или непрямо конъюгированы с лекарственными средствами, токсинами, радиоизотопами и тому подобными. Указанные связывающие полипептиды можно также использовать при осуществлении анализов, таких как скрининг библиотек экспрессируемых последовательностей и нейтрализующей активности, например, в отношении связывания, блокирования, ингибирования, ослабления, антагонистического воздействия или нейтрализации взаимодействия между лигандом и рецептором Ш-22 или связывания вируса с рецептором. Связывающие полипептиды можно также использовать для осуществления диагностических анализов по определению уровней полипептидов Ш-22КА-со держащего растворимого рецептора в кровотоке; обнаружения или количественного определения растворимых и нерастворимых Ш-22КА-содержащих рецепторов в качестве маркера существующей патологии или заболевания. Указанные связывающие полипептиды могут также действовать в качестве антагонистов, блокирующих или ингибирующих связывание растворимого или мембраносвязанного мономерного рецептора Ш-22КА или гомодимерного, гетеродимерного или мультимерного полипептида Ш-22КА (например, с лигандом) и передачу сигнала ш хПго и ш νί\Ό. Указанные связывающие полипептиды служат в качестве мономерного рецептора против Ш-22КА или гомодимерных, гетеродимерных или мультимерных полипептидов против Ш-22КА и пригодны для ингибирования активности Ш-22 или Ш-20 и Ш-22, а также активности рецептора или связывания белка. Антитела, созданные против природных комплексов рецепторов по настоящему изобретению, антитела, связывающиеся с антигенной детерминантой Ш-22КА, и нейтрализующие моноклональные антитела против Ш22КА могут быть предпочтительными вариантами осуществления изобретения, так как они могут более специфически действовать против Ш-22КА и могут ингибировать Ш-22 или Ш-20 и Ш-22. Кроме того, антагонистическую и связывающую активность антител по настоящему изобретению можно подвергнуть анализу, исследуя пролиферацию ЬБ-20 или Ш-22, трэппинг сигналов, люциферазу или связывание в присутствии соответственно Ш-20 или Ш-22 и Ш-22КА-содержащих растворимых рецепторов и осуществляя другие биологические или биохимические анализы, раскрытые в настоящем описании изобретения.

Антитела к полипептидам растворимых рецепторов Ш-22КА (например, антитела к 8ЕЦ Ш N0: 3) или их фрагментам, таким как антигенные детерминанты, могут быть использованы для ингибирования воспалительного действия Ш-20, Ш-22 или Ш-20 и Ш-22 ш νίνΌ, лечения псориаза, атспического дерматита, воспалительных заболеваний кожи, эндотоксемии, артрита, астмы, ΣβΌ, колита, псориатического артрита, ревматоидного артрита или других воспалительных заболеваний, вызываемых Ш-20 и Ш-22; мечения клеток, экспрессирующих рецепторы Ш-22КА; выделения полипептидов растворимых Ш-22КАсодержащих рецепторов методом аффинной очистки; осуществления диагностических анализов по определению уровней полипептидов растворимых Ш-22КА-содержащих рецепторов в кровотоке; обнаружения или количественного определения растворимых Ш-22КА-содержащих рецепторов в качестве маркеров существующей патологии или заболевания; в аналитических методах с использованием РАС8; для скрининга библиотек экспрессируемых последовательностей; создания антиидиотипических антител, способных действовать в качестве агонистов Ш-22 или Ш-20; и в качестве нейтрализующих антител или антагонистов, связывающих, блокирующих, ингибирующих, ослабляющих или оказывающих антагонистическое действие на функцию рецептора Ш-22КА или связывающих, блокирующих, ингибирующих, ослабляющих, оказывающих антагонистическое действие или нейтрализующих активность ЬБ-22 и/или ЬБ-20 (отдельно или вместе) ш хПго и ш νί\Ό. Приемлемые прямые метки включают радиоизотопы, ферменты, субстраты, кофакторы, биотин, ингибиторы, флуоресцентные маркеры, хемилюминесцентные маркеры, магнитные частицы и тому подобные; непрямые метки могут использовать пару биотин-авидин или другие пары комплемент-антикомплемент в качестве промежуточных продуктов. Антитела по на

- 35 015706 стоящему изобретению могут быть также прямо или непрямо конъюгированы с лекарственными средствами, токсинами, радиоизотопами и тому подобными, при этом указанные конъюгаты используют в диагностических или терапевтических целях ш у1уо. Кроме того, антитела к полипептидам растворимых 1Ь22ВА-содержащих рецепторов или их фрагментам могут быть использованы ш У1!го для обнаружения денатурированных или неденатурированных полипептидов 1Ь-22ВА-содержащих рецепторов или их фрагментов при осуществлении таких анализов как вестерн-блоттинг или других анализов, известных в данной области.

Антитела к растворимому рецептору 1Б-22ВА или полипептидам гомодимерных, гетеродимерных или мультимерных растворимых рецепторов 1Б-22ВА могут быть использованы для мечения клеток, экспрессирующих соответствующие рецепторы, и определения уровней экспрессии, для аффинной очистки, в диагностических анализах для определения уровней полипептидов рецепторов в кровотоке, в аналитических методах сортировки клеток с возбуждением флуоресценции. Кроме того, двухвалентные антитела и антиидиотипические антитела могут быть использованы в качестве агонистов, имитирующих действие лиганда 1Ь-22ВА, 1Ь-22 или 1Ь-20.

Антитела по настоящему изобретению могут быть также прямо или непрямо конъюгированы с лекарственными средствами, токсинами, радиоизотопами и тому подобными, и указанные конъюгаты могут быть использованы ш у1уо в диагностических и лечебных целях. Например, антитела или связывающие полипептиды, узнающие растворимый рецептор 1Б-22ВА или полипептиды гомодимерных, гетеродимерных или мультимерных растворимых рецепторов 1Ь-22ВА, могут быть использованы для идентификации или лечения тканей или органов, экспрессирующих соответствующую антикомплементарную молекулу (то есть 1Ь-22ВА-содержащий растворимый или мембраносвязанный рецептор). В частности, антитела к полипептидам растворимого 1Ь-22ВА-содержащего рецептора, их биологически активным фрагментам или частям могут быть связаны с визуализируемыми или цитотоксическими молекулами и доставлены в клетки, ткани или органы млекопитающего, экспрессирующие 1Ь-22ВА-содержащий рецептор, такие как раковые опухоли, экспрессирующие 1Б-22ВА. Приемлемые визуализируемые молекулы могут быть прямо или непрямо присоединены к полипептидам, связывающим полипептиды 1Ь-22ВАсодержащих рецепторов, таким как связывающие полипептиды (включая рассмотренные выше связывающие пептиды), антителам или их биологически активным фрагментам или частям. Приемлемые визуализируемые молекулы включают радиоизотопы, ферменты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, флуоресцентные маркеры, хемилюминесцентные маркеры, магнитные частицы и т.п. Приемлемые цитотоксические молекулы могут быть прямо или непрямо присоединены к полипептиду или антителу и включают бактериальные или растительные токсины (например, дифтерийный токсин, экзотоксин Ркеиботопак, рицин, абрин и т.п.), а также терапевтические радиоизотопы, такие как иод-131, рений-188 или иттрий-90 (например, присоединенные непосредственно к полипептиду или антителу или при помощи хелатирующей части). Связывающие полипептиды или антитела могут быть также конъюгированы с цитотоксическими средствами, такими как адриамицин. Для непрямого присоединения визуализируемой или цитотоксической молекулы указанная визуализируемая или цитотоксическая молекула может быть конъюгирована с членом пары комплемент-антикомплемент, в которой другой член связан со связывающим полипептидом или частью антитела. Характерной парой комплемент-антикомплемент для указанных целей является пара биотин-стрептавидин.

В другом варианте осуществления изобретения слитые белки, полученные гибридизацией связывающего полипептида и токсина, или слитые белки, полученные гибридизацией антитела и токсина, могут быть использованы для ингибирования или устранения клетки-мишени или ткани-мишени (например, для лечения раковых клеток или тканей). Альтернативно, если связывающий полипептид имеет несколько функциональных доменов (т.е. активирующий домен или лигандсвязывающий домен и домен направленного воздействия), слитый белок, включающий только домен направленного воздействия, может быть использован для направленной доставки визуализируемой молекулы, цитотоксической молекулы или комплементарной молекулы к представляющей интерес клетке или ткани. В тех случаях, когда слитый белок, содержащий только один домен, включает комплементарную молекулу, с визуализируемой или цитотоксической молекулой может быть конъюгирована антикомплементарная молекула. Слитые белки, полученные гибридизацией такого домена и комплементарной молекулы, представляют собой общий носитель для направленной клеточно- и тканеспецифической доставки общих конъюгатов антикомплемента и визуализируемой/цитотоксической молекулы.

В другом варианте осуществления изобретения слитые белки, полученные гибридизацией связывающего полипептида 1Б-22ВА и цитокина или антитела и цитокина, могут быть использованы для более эффективного уничтожения ш у1уо тканей-мишеней (например, раковых тканей селезенки, поджелудочной железы, крови, лимфоидной ткани, ободочной кишки и костного мозга), если слитый белок, полученный гибридизацией связывающего полипептида и цитокина или антитела против рецептора 1Б-22ВА и цитокина, направленно воздействует на гиперпролиферирующую клетку (см. публикацию Ногшск е! а1., В1ооб 89:4437-47, 1997). Описанные слитые белки делают возможной направленную доставку цитокина к требуемому месту действия, создавая повышенную локальную концентрацию цитокина. Приемлемые мономерные, гомодимерные, гетеродимерные или мультимерные антитела против 1Б-22ВА на

- 36 015706 правленно воздействуют на клетку или ткань (т.е. опухоль или лейкоз), и слитый цитокин опосредует более эффективный лизис клетки-мишени эффекторными клетками. Цитокины, приемлемые для указанной цели, включают, например, интерлейкин 2 и колониестимулирующий фактор гранулоцитарных макрофагов (СМ-С8Е).

Альтернативно белки, слитые со связывающими полипептидами рецептора 1Ь-22КА или антителом по настоящему изобретению, могут быть использованы для более эффективного уничтожения ш у1уо тканей-мишеней путем прямого стимулирования апоптического пути, модулированного рецептором 1Ь22КА, в результате чего происходит гибель гиперпролиферирующих клеток, экспрессирующих 1Ь-22КАсодержащие рецепторы.

10. Терапевтическое применение полипептидов, обладающих активностью 1Ь-22КА, или антител к Ш-22КА.

Аминокислотные последовательности, обладающие активностью растворимого рецептора 1Ь-22КА, могут быть использованы для модуляции иммунной системы путем связывания лигандов 1Ь-22КА, 1Ь-20 и 1Ь-22 (отдельно или вместе) и, следовательно, для предотвращения связывания лиганда 1Ь-22КА с эндогенным рецептором 1Ь-22КА. Антагонисты 1Ь-22КА, такие как антитела против 1Ь-22КА, могут быть также использованы для модуляции иммунной системы путем ингибирования связывания лиганда 1Ь22КА с эндогенным рецептором 1Ь-22КА. Таким образом, настоящее изобретение относится к использованию белков, полипептидов и пептидов, обладающих активностью 1Б-22КА (таких как полипептиды растворимого 1Б-22КА, фрагменты полипептидов 1Ь-22КА, аналоги 1Ь-22КА (например, антиидиотипические антитела против 1Ь-22КА) и слитые белки 1Б-22КА) для лечения субъекта, у которого отсутствует необходимое количество указанного полипептида или который продуцирует избыток лиганда 1Ь-22КА. Антагонисты 1Ь-22КА (например, антитела против 1Ь-22КА) могут быть также использованы для лечения субъекта, продуцирующего избыток лиганда 1Ь-22КА или 1Ь-22КА. Приемлемыми субъектами являются млекопитающие, такие как человек. Например, такие полипептиды 1Ь-22КА и антитела против 1Б-22КА пригодны для связывания, блокирования, ингибирования, ослабления, антагонистического воздействия или нейтрализации 1Ь-20 и 1Ь-22 (отдельно или вместе) при лечении псориаза, атопического дерматита, воспалительных заболеваний кожи, псориатического артрита, артрита, эндотоксемии, астмы, воспалительного заболевания кишечника (ΙβΌ), колита и других воспалительных заболеваний, раскрытых в настоящем описании изобретения.

Кроме того, установлено, что рецептор 1Ь-22КА связывает лиганд, именуемый индуцибельным фактором Т-клеток (1Ь-22) (8ЕО ΙΌ NО: 6; Питоибег, Ь. е! а1., Ргос. №11'1 Асаб. 8сг 97:10144-10149, 2000; последовательность 1Ь-22 мыши представлена в публикации Оитопбег е! а1., б. 1ттипо1. 164:1814-1819, 2000). Рецептор хсу1ог11 (1Ь-22КА) (патент США № 5965704) и рецептор СКЕ2-4 также связывают Ι6-22 в виде гетеродимера (см. публикации \У1РО № \¥О 00/24758; Оитопбег е! а1., б. 1ттипо1. 164:1814-1819, 2000; 8репсег, 8.Ό. е! а1., б. Ехр. Меб. 187:571-578, 1998; С1ЬЬк, УС апб Рептса Сепе 186:97-101, 1997 (СКЕ2-4 с1)№А); Х1е, М.Н. е! а1., б. Вю1. Сйет. 275:31335-31339, 2000; и Ко!епко, 8.У. е! а1., б. Вю1. Сйет. 276:2725-2732, 2001). Кроме того, рецептор Ι6-10β может служить в качестве рецептора для 1Ь-22 и считается синонимичным СКЕ2-4 (Питоибег, Ь. е! а1., Ргос. №61. Асаб. 8сг 97:10144-10149, 2000; Ьш Υ. е! а1., б. 1ттипо1. 152; 1821-1829, 1994 (1Ь-10К с^NА). Установлено, что рецептор 1Ь-22КА связывает лиганд, именуемый 1Ь-20 (8ЕО ΙΌ NО: 8; публикация \У1РО № \¥О 99/27103). В предпочтительных вариантах осуществления изобретения растворимый рецептор 1Ь-22КА (8ЕО ΙΌ NО: 3) является мономером, гомодимером, гетеродимером или многомером, который связывает, ингибирует, ослабляет, оказывает антагонистическое действие или нейтрализует 1Ь-22 и 1Ь-20 ш у1уо. Антитела и связывающие полипептиды к таким мономерам, гомодимерам, гетеродимерам или многомерам 1Ь-22КА также служат в качестве антагонистов активности 1Ь-22КА и в качестве антагонистов 1Ь-20 и 1Ь-22 (отдельно или вместе) по настоящему изобретению.

Кроме того, в настоящем описании изобретения было указано и продемонстрировано, что как поликлональные, так и моноклональные нейтрализующие антитела против 1Ь-22 связывают, блокируют, ингибируют, ослабляют, оказывают антагонистическое действие или нейтрализуют активность 1Ь-22 и 1Ь20 при осуществлении клеточных анализов нейтрализации.

Установлено, что 1Ь-22 индуцируется в присутствии 1Ь-9 и предположительно стимулирует иммунные реакции Тй1-типа и воспаления. 1Ь-9 стимулирует пролиферацию, активацию, дифференцировку и/или индукцию иммунной функции разными средствами и опосредует астму, мастоцитоз легких и другие заболевания, а также активирует пути 8ТАТ. Антагонисты функции 1Ь-22 или 1Ь-9 могут быть успешно использованы для лечения таких заболеваний у человека. Настоящее изобретение относится к таким новым антагонистам 1Ь-22.

Установлено, что 1Ь-22 повышает продуцирование реагентов острой стадии заболевания, таких как сывороточный амилоид А (8АА), а1-антихимотрипсин и гаптоглобин, и что экспрессия 1Ь-22 увеличивается при инъецировании липополисахарида (ЬР8) ш у1уо, указывая на то, что 1Ь-22 опосредует воспалительную реакцию (Питоибег, Ь. е! а1. Ргос. №ΐ'1. Асаб. 8сг 97:10144-10149, 2000). Продуцирование белков острой стадии заболевания, таких как 8АА, рассматривается как кратковременный механизм выжи

- 37 015706 вания, когда воспаление является благоприятным; однако сохранение белков острой стадии в течение более длительных периодов вызывает хроническое воспаление и может быть вредным для здоровья человека. См. публикации ИЫаг, С.М. апб ^ЬйеБеаб, А.8., Еиг. 1. ВюсБет. 265:501-523, 1999, и Ваитапп Н. апб Саи1б1е, 1. 1ттипо1оду Тобау 15:74-80, 1994. Кроме того, белок острой стадии 8АА определяет патогенез нескольких хронических воспалительных заболеваний, опосредует атеросклероз и ревматоидный артрит и является предшественником амилоидного белка А, осаждаемого при амилоидозе (ИЫаг, С.М. апб \У1Ше11еаб. см. выше). Таким образом, поскольку ГБ-22 действует в качестве провоспалительной молекулы и индуцирует продуцирование 8АА, его антагонисты должны быть полезны при лечении воспалительных заболеваний и других заболеваний, ассоциированным с белками реакции острой стадии, индуцируемыми ГБ-22. Такие антагонисты являются объектом настоящего изобретения. Например, способ ослабления воспаления, вызванного ГБ-22 или ГБ-9, включает введение млекопитающему, страдающему таким воспалением, определенного количества композиции, включающей растворимый ГБ-22ВАсодержащий рецептор, достаточного для ослабления воспаления. Кроме того, способ подавления воспалительной реакции у млекопитающего, страдающего воспалением, может включать: (1) определение уровня сывороточного амилоидного белка А; (2) введение композиции, включающей полипептид растворимого рецептора цитокина ГБ-22ВА по настоящему изобретению в приемлемом фармацевтическом носителе; (3) определение уровня сывороточного амилоидного белка А после введения; (4) сравнение уровня сывороточного амилоидного белка А на стадии (1) с уровнем сывороточного амилоидного белка А на стадии (3), при этом отсутствие увеличения или уменьшение уровня сывороточного амилоидного белка А свидетельствует о подавлении воспалительной реакции. Экспериментальные данные, приведенные в настоящем описании изобретения, показывают, что антагонисты ГБ-22, такие как растворимые рецепторы и антитела, действительно уменьшают уровень 8АА в моделях воспалительных заболеваний ш У1уо, указывая на то, что связывание, блокирование, ингибирование, ослабление, антагонистическое воздействие или нейтрализация ГБ-22 оказывают противовоспалительное действие.

Существующие данные показывают, что ГБ-20 и его рецепторы опосредуют псориаз. Данное полифакториальное заболевание кожи характеризуется повышенной пролиферацией кератиноцитов, изменением дифференцировки кератиноцитов и инфильтрацией иммунокомпетентных клеток в кожу. Первичные данные о роли ГБ-20 в псориазе свидетельствуют о наблюдаемом гиперкератозе и утолщении эпидермиса у трансгенных мышей, которые напоминают нарушения, характерные для псориаза у человека. Уменьшение числа тонофиламентов, которое, как считается, связано с нарушением кератинизации, является отличительным признаком псориаза у человека. Интрамитохондриальные включения обнаружены как в химически индуцированных, так и естественных гиперпластических состояниях кожи у мышей. Причина возникновения указанных включений и их воздействие на функцию митохондрия не известны. Трансгенным мышам, продуцирующим ГБ-20, присущи многие признаки, наблюдаемые в случае псориаза у человека.

Кроме того, мРНК рецептора 1Ь-20 (мРНК как 1Ь-20ВА, так и 1Ь-20ВВ) значительно увеличивается в коже человека, пораженной псориазом, по сравнению с нормальной кожей, что также свидетельствует об определенной роли ГБ-20 в псориазе. Обе субъединицы рецептора ГБ-20 экспрессированы в кератиноцитах эпидермиса, а также в субпопуляции иммунокомпетентных и эндотелиальных клеток. Авторы настоящего изобретения предположили, что повышенная экспрессия активированного рецептора ГБ-20 может изменять взаимодействие между эндотелиальными клетками, иммунокомпетентными клетками и кератиноцитами, вызывая нарушение пролиферации и дифференцировки кератиноцитов. Кроме того, данные, полученные для мышей с отсутствием рецептора ГБ-22ВА, показывают, что ГБ-22ВА необходим для индуцированного ЕБ-20 воспалительного воздействия на кожу у трансгенных животных. Полученные результаты показывают, что эффективное блокирование активности ГБ-22ВА, например, в результате удаления гена ГБ-22ВА или введения нейтрализующего моноклонального антитела к ГБ-22ВА по настоящему изобретению аналогичным образом уменьшает воздействия на кожу, индуцированные ГБ-20, а также ГБ-22, например, в случае псориаза, ГВЭ, колита или других воспалительных заболеваний, индуцируемых ГБ-20 и/или ГБ-22, включая ГВЭ, артрит, астму, псориатический артрит, колит, воспалительные заболевания кожи и атопический дерматит.

Кроме того, ГБ-20 стимулирует передачу сигналов в линии клеток НаСаТ кератиноцитов человека, поддерживая прямое воздействие указанного нового лиганда в коже. Белки ГБ-13, ЕСБ и ΤΝΡ-α, которые, как известно, являются активными в кератиноцитах и участвуют в передаче пролиферативных и провоспалительных сигналов в коже, усиливают реакцию на ГБ-20. В клетках НаСаТ и ВНК, экспрессирующих рецептор 1Б-20, указанный рецептор передает сигналы через 8ТАТ3.

В соответствии с приведенным выше описанием и нижеследующими примерами ГБ-20 опосредует патологию псориаза. Объектом настоящего изобретения является, в частности, способ лечения псориаза путем введения агентов, которые связывают, блокируют, ингибируют, ослабляют, оказывают антагонистическое действие или нейтрализуют ГБ-20. Антагонисты ГБ-20 могут представлять собой растворимый рецептор, связывающийся с ГБ-20, такой как растворимый рецептор ГБ-22ВА, или антитела, одноцепочечные антитела или фрагменты антител, связывающихся с ГБ-20 или рецептором ГБ-20, например, антитела против ГБ-22ВА. Антагонисты предотвращают активацию рецептора ГБ-20. Кроме того, поскольку

- 38 015706

1Ь-22КА является общим рецептором для 1Ь-20 и 1Ь-22, антагонисты, такие как растворимый 1Ь-22КА или антитела, одноцепочечные антитела или фрагменты антител, связывающихся с рецептором 1Ь-22КА, могут быть использованы для одновременного связывания, блокирования, ингибирования, ослабления, антагонистического воздействия или нейтрализации активности 1Ь-22 или как 1Ь-20, так и 1Ь-22.

Псориаз является одним из наиболее часто встречающихся дерматологических заболеваний, которым страдают 1-2% населения земного шара. Данное заболевание является хроническим воспалительным заболеванием кожи, характеризующимся наличием эритематозных, четко очерченных папул и круглых бляшек, покрытых серебристыми слюдяными чешуйками. Псориатические поражения кожи вызывают зуд. Псориаз часто возникает на травмированных участках тела. Кроме того, псориаз могут вызывать другие внешние факторы, включающие инфекции, стресс и лекарственные средства, например, литий, β-блокаторы и противомалярийные средства.

Наиболее распространенная разновидность псориаза относится к бляшечному типу. У субъектов, страдающих псориазом бляшечного типа, имеются устойчивые, медленно увеличивающиеся бляшки, которые не изменяются в течение длительных периодов времени. Бляшечный псориаз наиболее часто поражает локти, колени, ягодичную складку и волосистую часть кожи головы. Поражения обычно являются симметричными. Инверсный псориаз поражает интертригинозные области, включающие подмышечные ямки, паховые области, ретромаммарную область и пупок, а также волосистую часть кожи головы, ладони и подошвы стоп. Отдельные поражения представляют собой четко очерченные бляшки, которые могут быть влажными в зависимости от локализации. Бляшечный псориаз обычно развивается медленно и плохо поддается лечению. Данное заболевание редко временно ослабевает.

Эруптивный псориаз (каплевидный псориаз) наиболее часто встречается у детей и молодых людей. Данное заболевание прогрессирует в острой форме у субъектов, не страдающих псориазом или страдающих хроническим бляшечным псориазом. У субъектов появляется множество мелких эритематозных чешуйчатых папул часто после инфицирования верхних дыхательных путей β-гемолитическим стрептококком. У субъектов, страдающих псориазом, могут возникнуть пустулезные поражения. Указанные поражения могут располагаться на ладонях и подошвах стоп или могут быть генерализованными и сопровождаться лихорадкой, недомоганием, диареей и артралгией.

Примерно у половины всех субъектов, страдающих псориазом, поражены ногти пальцев рук в виде мелких углублений, утолщения ногтей или подногтевого гиперкератоза. Примерно 5-10% субъектов, страдающих псориазом, жалуются на боли в суставах, причем указанные симптомы наиболее часто проявляются у субъектов с пораженными ногтями пальцев рук. Хотя у некоторых субъектов одновременно наблюдается классический ревматоидный артрит, у многих субъектов заболевания суставов можно классифицировать как один из пяти типов, ассоциированных с псориазом: (1) заболевание, ограниченное одним или несколькими мелкими суставами (70% случаев); (2) серонегативное ревматоидное заболевание, подобное артриту; (3) поражение дистальных межфаланговых суставов; (4) сильный деструктивный артрит с образованием изуродованных суставов и (5) заболевание, ограниченное позвоночником.

Псориаз можно лечить путем введения агентов, которые связывают, блокируют, ингибируют, ослабляют, оказывают антагонистическое действие или нейтрализуют 1Ь-22, 1Ь-20 или 1Ь-20 и 1Ь-22 вместе. Предпочтительными антагонистами являются растворимые рецепторы для 1Ь-20 и 1Ь-22, такие как 1Ь-22КА (8Е0 ΙΌ N0: 3), или антитела, фрагменты антител или одноцепочечные антитела, связывающиеся с рецептором 1Ь-22КА, такие как нейтрализующие антитела по настоящему изобретению. Такие антагонисты можно вводить отдельно или в комбинации с другими существующими лекарственными средствами, такими как мази, кератолитические средства, местнодействующие кортикостероиды, местнодействующие производные витамина Ό, антралин, системые антиметаболические средства, такие как метотрексат, псорален-ультрафиолетовая терапия (РИУА), этретинат, изотретиноин, циклоспорин, и местнодействующее производное витамина Ό₃ кальципотриол. Кроме того, такие антагонисты можно вводить подкожно, внутривенно или чрескожно, используя крем или чрескожный пластырь, содержащий антагонист. При подкожном введении антагонист можно инъецировать в одну или несколько псориатических бляшек. При чрескожном введении антагонисты можно наносить непосредственно на бляшки, используя крем, мазь, лечебную повязку или раствор, содержащий антагонист.

Антагонисты 1Ь-20 или 1Ь-22 можно вводить субъекту, страдающему астмой, бронхитом, муковисцидозом или другом воспалительным заболеванием легких. Указанные антагонисты можно вводить любым приемлемым способом, включая внутривенное, подкожное введение, бронхиальный лаваж и использование ингалятора, содержащего данный антагонист.

Анализ распределения в тканях мРНК, соответствующей кДНК 1Ь-22КА, показал, что уровень мРНК является наиболее высоким в плаценте и селезенке, и лиганд, с которым связывается 1Ь-22КА (1Ь22), вызывает воспалительную реакцию, включая индукцию реакции острой стадии заболевания (Питоибег, Ь. е! а1., Ргос. Νΐ'1 Асаб. 8сг 97:10144-10149, 2000). Таким образом, конкретные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к использованию растворимого 1Ь-22КА и антител против 1Ь-22КА в качестве антагонистов при лечении воспалительных и иммунных заболеваний или состояний, таких как псориаз, псориатический артрит, атопический дерматит, воспалительные заболевания

- 39 015706 кожи, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника (160), болезнь Крона, дивертикулез, астма, панкреатит, диабет типа I (ШОМ), рак поджелудочной железы, болезнь Грейвса, рак кишечника, аутоиммунное заболевание, сепсис, трансплантация органов или костного мозга; воспаление вследствие эндотоксемии, травма, оперативное вмешательство или инфекция; амилоидоз; спленомегалия; реакция трансплантат против хозяина, и в тех случаях, когда необходимо ингибировать воспаление, подавить иммунную реакцию, уменьшить пролиферацию гемопоэтических и иммунокомпетентных клеток, клеток воспалительного инфильтрата или лимфоидных клеток, макрофагов, Т-клеток (включая Тй1- и Тй2-клетки), подавить иммунную реакцию на патоген или антиген, или в других случаях, когда желательно ингибировать цитокины 1Б-22 или 1Б-20.

Кроме того, антитела и связывающие полипептиды, которые связывают полипептиды ББ-22КА по настоящему изобретению, и сами полипептиды ББ-22КА пригодны

1) для блокирования, ингибирования, ослабления, антагонистического воздействия или нейтрализации передачи сигналов рецепторами 1Б-20 или 1Б-22 при лечении острого воспаления, воспаления вследствие травмы, повреждения ткани, оперативного вмешательства, сепсиса или инфекции и хронических воспалительных заболеваний, таких как астма, воспалительное заболевание кишечника (1ВО), хронический колит, спленомегалия, ревматоидный артрит, рецидивирующие острые воспалительные заболевания (например, туберкулез), амилоидоз и атеросклероз, болезнь Каслмана, астма и другие заболевания, ассоциированные с индукцией реакции острой стадии;

2) для блокирования, ингибирования, ослабления, антагонистического воздействия или нейтрализации передачи сигналов рецепторами 1Б-20 или 1Б-22 при лечении аутоиммунных заболеваний, таких как ШОМ, рассеянный склероз (МЗ), системная красная волчанка (ЗБ-Е), миастения, ревматоидный артрит и БВО, для предотвращения или ингибирования передачи сигналов в иммунокомпетентные клетки (такие как лимфоциты, моноциты, лейкоциты) через Ш-22КА (Нидйек С. е! а1., I. 1ттиио1. 153:3319-3325, 1994). Альтернативно антитела, такие как моноклональные антитела (МАЬ) к ББ-22КА-содержащим рецепторам, можно также использовать в качестве антагониста нежелательных иммунокомпетентных клеток при лечении аутоиммунного заболевания. С помощью моноклональных антител, например, против растворимых рецепторов ББ-22КА, которые подавляют иммунную реакцию или уничтожают клетки аллергена, можно лечить астму, аллергию и другие атопические заболевания. Блокирование, ингибирование, ослабление или антагонистическое воздействие на передачу сигналов ББ-22КА с использованием полипептидов и антител по настоящему изобретению может также быть благоприятным для болезней поджелудочной железы, почек, гипофиза и нейронов. Благоприятный эффект может быть достигнут при лечении ШОМ, МООМ, панкреатита и карциномы поджелудочной железы. ББ-22КА может служить в качестве мишени для лечения рака моноклональными антителами, когда антагонистическое воздействие моноклональных антител подавляет рост раковой опухоли и обеспечивает иммуноопосредованное направленное уничтожение раковых клеток. (НоШдег Р., аиб НоодеиЬоот, Н.: №11иге Вю!есй. 16:1015-1016 (1998). Моноклональные антитела к растворимому ББ-22КА могут быть также пригодны для лечения нефропатий, таких как гломерулосклероз, мембранозная нейропатия, амилоидоз (который также поражает почки наряду с другими тканями), атеросклероз почек, гломерулонефрит разных органов, фибропролиферативные заболевания почки, а также дисфункция почки, ассоциированная с ЗБЕ, ШОМ, диабетом типа II (ИШОМ), опухолями почки и другими заболеваниями;

3) для агонистического воздействия, усиления или инициации передачи сигналов через рецепторы ББ-20 или ББ-22 при лечении аутоиммунных заболеваний, таких как ШОМ, МЗ, ЗЕЕ, миастения, ревматоидный артрит и БВО. Нейтрализующие и моноклональные антитела против ББ-22КА могут передавать сигналы лимфоцитам или другим иммунокомпетентным клеткам о дифференцировке, изменении пролиферации или продуцировании цитокинов или поверхностных белков, которые улучшают аутоиммунитет. В частности, модуляция реакции Т-клеток-хелперов с изменением паттерна секреции цитокинов может изменить аутоиммунную реакцию в сторону ослабления заболевания (Зтйй Б. А. е! а1., I. 1ттиио1. 160:4841-4849, 1998). Аналогичным образом для передачи сигналов, удаления и изменения иммунокомпетентных клеток, опосредующих астму, аллергию и атопические заболевания, можно использовать гетеродимерные и мультимерные моноклональные антитела против растворимого рецептора ББ-22КА и против растворимого рецептора 10-226^0602-4, обладающие агонистической активностью. Передача сигналов через ББ-22КА может также оказывать благоприятное воздействие на заболевания поджелудочной железы, почки, гипофиза и нейронов. Благоприятное воздействие может быть достигнуто в случае ШОМ, МООМ, панкреатита и карциномы поджелудочной железы. ББ-22КА может служить в качестве мишени для лечения рака поджелудочной железы моноклональными антителами, когда передающее сигнал моноклональное антитело подавляет рост раковой опухоли и направляет доставку иммунокомпетентных клеток для уничтожения раковых клеток (Тий, А.Б. е! а1., I. 1ттиио1. 161:3175-3185, 1998). Рак почки можно также лечить моноклональными антителами к растворимым ББ-22КА-содержащим рецепторам по настоящему изобретению.

Полипептиды растворимого ББ-22КА по настоящему изобретению могут быть использованы для связывания, блокирования, ингибирования, ослабления, антагонистического воздействия или нейтрализации активности ББ-22 или ББ-20, отдельно или вместе, при лечении аутоиммунного заболевания, ато

- 40 015706 пического заболевания, МББМ, панкреатита и дисфункции почки. Растворимая форма №-22КА может быть использована для стимуляции гуморального иммунного ответа, опосредуемого Тк-клетками, и/или для стимуляции продуцирования №-4 и других цитокинов лимфоцитами или другими иммунокомпетентными клетками.

Растворимые №-22КА-содержащие рецепторы по настоящему изобретению являются полезными антагонистами цитокина ГЕ-20 или ГЕ-22. Такое антагонистическое действие может быть достигнуто в результате прямой нейтрализации или связывания №-20 или №-22. Помимо использования в качестве антагонистов растворимые рецепторы по настоящему изобретению могут связывать №-22 и действовать в качестве белков-носителей для цитокина №-20 или №-22 с целью перемещения лиганда в другие ткани, органы и клетки организма. В таком случае растворимые рецепторы по настоящему изобретению могут быть слиты или связаны с молекулами, полипептидами или химическими частями молекул, которые направляют комплекс растворимого рецептора и лиганда в конкретное место, такое как ткань, специфическая иммунокомпетентная клетка или опухоль. Например, в случае острой инфекции или некоторых типов рака благоприятное воздействие может быть достигнуто в результате индукции белков, вызывающих ответную реакцию на воспаление и местную острую реакцию, под воздействием №-22. Таким образом, растворимые рецепторы по настоящему изобретению могут быть использованы для специфического направления действия №-20 или №-22. См. публикации Соктап, Б. Су!окте 5: 95-106, 1993 и ЕегпапбехВо!гап, К. Ехр. 0рш. ИкекЕ Бгидк 9:497-513, 2000.

Кроме того, растворимые рецепторы по настоящему изобретению могут быть использованы для стабилизации №-22 или №-20, для увеличения биологической доступности, продолжительности лечебного эффекта и/или эффективности лиганда благодаря его стабилизации от разрушения или выведения или для направленной доставки указанного лиганда к месту действия в организме. Например, природный комплекс №-6 и растворимого №-6К стабилизирует №-6 и может передавать сигналы через рецептор др130. См. приведенные выше публикации Соктап, Б. и Еетапбе7-Во!гап, К. Кроме того, №-22КА может быть объединен с родственным лигандом, таким как №-22, с образованием комплекса лиганда с растворимым рецептором. Такие комплексы могут быть использованы для стимуляции реакций клеток, представляющих субъединицу рецептора-компаньона, такую как, например, рБ№81 (№-20КВ) или СКЕ2-4 (№-10КВ). Специфичность клеток при введении комплексов №-22КА./лиганд может отличаться от специфичности, наблюдаемой при введении одного лиганда. Кроме того комплексы могут обладать другими фармакокинетическими свойствами, такими как период полувыведения, зависимость доза-эффект и специфичность органов или тканей. Таким образом, комплексы I^-22КЛ/I^-22 или I^-22КЛ/I^-20 могут обладать агонистической активностью, усиливающей иммунную реакцию, стимулирующей мезангильные клетки или гепатоциты. Альтернативно только ткани, экспрессирующие сигнальную субъединицу, образующую гетеродимер с комплексом, могут подвергаться воздействию, аналогичному реакции на комплексы №6/№6К (НпоГа Н. е! а1., Ргос. №Г'1. Асаб. 8сЕ 92:4862-4866, 1995; Нпапо, Т. ш Ткотакоп, А. (Еб.) Тке Су!окше НапбЬоок, 3^гб Еб., р.208-209). Комплексы растворимого рецептора с цитокином для №12 и СКТЕ обладают аналогичной активностью.

Воспаление является защитной реакцией организма, направленной на уничтожение проникающего агента. Воспаление представляет собой каскадное явление, которое охватывает многие клеточные и гуморальные медиаторы. С одной стороны, подавление воспалительных реакций может ослабить иммунитет субъекта; однако при отсутствии лечения воспаление может привести к серьезным осложнениям, включая хронические воспалительные заболевания (например, псориаз, артрит, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, воспалительное заболевание кишечника и т. п.), септический шок или нарушение функции многих органов. Важно отметить, что вышеуказанные разные заболевания опосредуются общими медиаторами воспаления. Массовые заболевания, характеризующиеся воспалением, в значительной степени влияют на заболеваемость и смертность населения. Поэтому совершенно очевидно, что противовоспалительные белки, такие как №-22КА, и антитела против №-22КА обладают большим терапевтическим потенциалом при лечении целого ряда заболеваний человека и животных от астмы и аллергии до аутоиммунных заболеваний и септического шока.

1. Артрит.

Артрит, в том числе остеоартрит, ревматоидный артрит, подагра вследствие травмы и т.п. являются общими воспалительными заболеваниями, на которые благоприятное воздействие оказывает терапевтическое применение противовоспалительных белков, таких как полипептиды №-22КА по настоящему изобретению. Например, ревматоидный артрит (КА) является системным заболеванием, поражающим все тело, и одной из наиболее распространенных форм артрита. Данное заболевание характеризуется воспалением оболочки, выстелающей сустав, которое вызывает боль, тугоподвижность, повышение температуры, покраснение и опухание. Клетки воспалительного инфильтрата высвобождают ферменты, которые могут разрушать кость и хрящ. В результате ревматоидного артрита воспаленная выстилка сустава, синовиальная оболочка, может проникать в кость и хрящ, вызывая разрушение сустава и сильную боль наряду с другими физиологическими воздействиями. Пораженный сустав может утратить присущую ему форму и расположение, что вызывает боль и скованность движений.

Ревматоидный артрит (КА) является иммуноопосредуемым заболеванием, которое, в частности, ха

- 41 015706 рактеризуется воспалением, и последующим повреждением ткани и ведет к утрате трудоспособности и повышенной смертности. В ревматоидных суставах продуцируются разные цитокины. Результаты многочисленных исследований показали, что ГЬ-1 и ТИЕ-а, два прототипа провоспалительных цитокинов, играют важную роль в механизмах, определяющих синовиальное воспаление и прогрессирующее разрушение сустава. Действительно, введение субъектам, страдающим ревматоидным артритом, ингибиторов Т\Е-а и ГЬ-1 вызывает значительное ослабление клинических и биологических признаков воспаления и уменьшение радиологических признаков эрозии кости и разрушения хряща. Однако несмотря на обнадеживающие результаты, значительное число субъектов не реагирует на указанные агенты, из чего следует, что патофизиологию артрита определяют также другие медиаторы (СаЬау, Ехрей. 0рт. Вю1. Тйег. 2(2):135-149, 2002). Одним из указанных медиаторов может быть ГЬ-20 или ГЬ-22, поэтому молекулы, которые связывают или ингибируют активность ГЬ-22 или ГЬ-20, такие как полипептиды ГЬ-22ВА, антитела против ГЬ-22ВА или связывающие партнеры, могут служить в качестве ценного терапевтического средства, уменьшающего воспаление в случае ревматоидного артрита и других подобных заболеваний.

В данной области существует несколько животных моделей ревматоидного артрита. Например, модель артрита, индуцированного коллагеном (СГА), хронического воспалительного артрита у мышей, который близко напоминает ревматоидный артрит человека. Так как артрит, индуцированный коллагеном, характеризуется такими же иммунологическими и патологическими признаками, что и ревматоидный артрит, указанная модель является идеальной моделью для скрининга потенциальных противовоспалительных соединений для человека. Артрит, индуцированный коллагеном, является хорошо известной моделью у мышей и возникает в зависимости от иммунной реакции и воспалительной реакции. Иммунная реакция включает взаимодействие В-клеток и СЭ4+ Т-клеток в ответ на воздействие коллагена, который вводят в виде антигена, и вызывает образование антител против коллагена. Воспалительная стадия является результатом реакций ткани, вызываемых медиаторами воспаления, вследствие перекрестного взаимодействия некоторых из указанных антител с нативным коллагеном мыши и стимуляции пути активации комплемента. Преимуществом использования модели СГА является то, что известны основные механизмы патогенеза. Идентифицированы соответствующие Т-клеточные и В-клеточные антигенные детерминанты для коллагена типа ГГ, разные иммунологические (например, гиперчувствительность замедленного типа и антитело против коллагена) и воспалительные (например, цитокины, хемокины и разрушающие матрикс ферменты) параметры, определяющие иммуноопосредуемый артрит, которые, таким образом, могут быть использованы для оценки эффективности испытуемого соединения в модели СГА (νοοΕγ, Сигг. 0рш. Кйеит. 3:407-20, 1999; νίΚίαι^ е! а1., Гттипо1. 89:9784-788, 1992; Муегз е! а1., Ь1Ге 8с1. 61:1861-78, 1997; апб V апд е! а1., Гттипо1. 92:8955-959, 1995).

Полипептиды растворимого ГЬ-22ВА2-содержащего рецептора (хсу!ог16), такого как 7су!ог16-Ес4, или другие растворимые и слитые белки ГЬ-22ВА2 вводили мышам в модели СГА для оценки возможности применения ГЬ-22ВА2 в качестве антагониста ГЬ-22, используемого для ослабления симптомов и изменения течения заболевания. Результаты, свидетельствующие об ингибировании ГЬ-22 полипептидами ГЬ-22ВА2, подтверждают, что другие антагонисты ГЬ-22, такие как ГЬ-22ВА или антитела к ним, также могут быть использованы для ослабления симптомов и изменения течения заболевания. Так как лиганд ГЬ-22ВА2, ГЬ-22 индуцирует продуцирование 8АА, опосредующего патогенез ревматоидного артрита, и, как было показано, ГЬ-22ВА2 способен ингибировать активность ГЬ-22 и 8АА ш νί!το и ш νίνο, системное или местное введение полипептидов ГЬ-22ВА2-содержащих рецепторов, таких как хсу1ог16-Ес4 или других растворимых рецепторов ГЬ-22 (например, ГЬ-22ВА; 8ЕЦ ГО N0: 3), антител против ГЬ-22ВА и слитых белков потенциально может подавлять воспалительную реакцию в случае ревматоидного артрита. Инъецирование 10 мкг хсуЮг16-Ес (три раза в неделю в течение 4 недель) существенно снижает оценку заболевания (поражение лап, случаи воспаления или заболевания). Другими потенциальными лечебными средствами являются полипептиды ГЬ-22ВА, антитела против ГЬ-22ВА, антитела против ГЬ-22 или связывающие партнеры и т.п.

В одной группе животных было установлено, что антитело против ГЬ-22 мыши может ослаблять у мышей симптомы в модели артрита, индуцированного коллагеном, по сравнению с контрольными мышами, из чего следует, что полипептиды растворимого ГЬ-22ВА и нейтрализующие антитела к ГЬ-22ВА могут оказывать благоприятное воздействие при лечении данного заболевания у человека. Введение моноклонального антитела крысы, специфичного к ГЬ-22 мыши, (Р3/1) ослабляет симптомы артрита у животных как при профилактическом введении, так и после возникновения артрита, индуцированного коллагеном (публикация ν№0 02/068476 от 9 сентября 2002 г.). Таким образом, полипептиды растворимого ГЬ-22ВА и антитела против ГЬ-22ВА по настоящему изобретению, включая нейтрализующие антитела против ГЬ-22ВА человека по настоящему изобретению, могут быть использованы для нейтрализации ГЬ22 и ГЬ-20 при лечении специфических заболеваний человека, таких как псориаз, псориатический артрит, артрит, эндотоксемия, воспалительное заболевание кишечника (ГВО), колит и другие воспалительные заболевания, раскрытые в настоящем описании изобретения.

- 42 015706

2. Эндотоксемия.

Эндотоксемия является тяжелым заболеванием, обычно вызываемым инфекционными агентами, такими как бактерии и другие инфекционные агенты, сепсисом, синдромом токсического шока, или возникающим у субъектов с ослабленным иммунитетом, подверженных воздействию условно-патогенных микроорганизмов и т.п. Терапевтическое применение противовоспалительных белков, таких как полипептиды ГБ-22ЕА и антитела по настоящему изобретению, может способствовать профилактике и лечению эндотоксемии у человека и животных. Полипептиды ГБ-22ЕА, антитела против ГБ-22ЕА, антитела против ГБ-22 или связывающие партнеры могут служить в качестве ценного терапевтического средства для уменьшения воспаления и патологических эффектов в случае эндотоксемии.

Эндотоксемия, индуцированная липополисахаридом (БР8), опосредована многими провоспалительными медиаторами, которые оказывают патологическое действие в случае инфекционных заболеваний, поэтому БР8-индуцированная эндотоксемия у грызунов является широко используемой и приемлемой моделью для исследования фармакологического действия потенциальных провоспалительных или иммуномодулирующих агентов. БРС, продуцируемый грамотрицательными бактериями, является основным этиологическим фактором в патогенезе септического шока (С1аикпег е! а1., Бапсе! 338:732, 1991). Подобное шоку состояние можно вызвать у животных экспериментальным путем в результате одной инъекции БР8. Молекулы, продуцируемые клетками при введении БР8, могут прямо или косвенно направленно воздействовать на патогены. Несмотря на то что указанные биологические реакции защищают хозяина от проникающих патогенов, они могут также причинить вред. Так, выраженная стимуляция наследственного иммунитета, возникающая в результате тяжелого инфицирования грамотрицательными бактериями, вызывает избыточное продуцирование цитокинов и других молекул и развитие смертельного синдрома, синдрома септического шока, который характеризуется лихорадкой, гипотензией, диссеминированным внутрисосудистым свертыванием и нарушением функции многих органов (ΌιιιηίΙπι е! а1., Се11 103:1071-1083, 2000).

Вышеуказанные токсические эффекты БР8 относятся главным образом к активации макрофагов, вызывающей высвобождение многих медиаторов воспаления. Среди указанных медиаторов ЮТ, повидимому, играет главную роль, о чем свидетельствует предотвращение токсичности БР8 в результате введения нейтрализующих антител против Т№ (ВеиЙег е! а1., 8с1епсе 229:869, 1985). Установлено, что инъекция 1 мкг БР8 Е. сой мыши С57В1/6 вызывает значительное увеличение в кровотоке ГБ-6, Т№-а, ГБ-1 и белков острой стадии (например, 8АА) примерно через 2 ч после инъекции. Токсичность БР8, повидимому, опосредуют указанные цитокины, так как пассивная иммунизация против указанных медиаторов способствует снижению смертности (ВеиЙег е! а1., 8с1епсе 229:869, 1985). Потенциальные методы иммунной интервенции для профилактики и/или лечения септического шока включают введение моноклонального антитела против Т№, антагониста рецептора ГБ-1, БГР, ГБ-10 и С-С8Р.

Полипептиды растворимого ГБ-22ЕА2-содержащего рецептора, такого как 2су!ог16-Рс4, или другие растворимые или слитые белки ГБ-22ЕА вводили в модель БР8-индуцированной эндотоксемии для оценки способности ГБ-22ЕА2 ослаблять симптомы и изменять течение БР8-индуцированного заболевания. Кроме того, результаты, свидетельствующие об ингибировании Б-22 полипептидом ГБ-22ЕА2, подтверждают, что другие антагонисты ГБ-22, такие как ГБ-22ЕА или антитела к ним, могут быть использованы для ослабления симптомов в модели БР8-индуцированного заболевания и изменения течения заболевания. С помощью данной модели была продемонстрирована индукция ГБ-22 в результате инъекции БР8 и возможность лечения данного заболевания полипептидами ГБ-22ЕА2. Так как БР8 индуцирует продуцирование провоспалительного ГБ-22, 8АА и других провоспалительных факторов, которые, по-видимому, способствует патологии эндотоксемии, нейтрализация активности ГБ-22, 8АА и других провоспалительных факторов полипептидом ГБ-22ЕА2, являющимся антагонистом, позволяет ослабить симптомы эндотоксемии, наблюдаемые в случае эндотоксического шока. Другие потенциальные терапевтические средства включают полипептиды ГБ-22ЕА антитела против ГБ-22ЕА, антитела против ГБ-22 или связывающие партнеры и т. п.

3. Воспалительное заболевание кишечника (ГВЭ).

В США примерно 500000 человек страдают воспалительным заболеванием кишечника (ГВО), которое может поражать ободочную и прямую кишку (неспецифический язвенный колит), тонкую и толстую кишку (болезнь Крона). Патогенез указанных заболеваний до сих пор не изучен, но предполагает хроническое воспаление пораженных тканей. Полипептиды ГБ-22ЕА, антитела против ГБ-22ЕА, антитела против ГБ-22 или связывающие партнеры могут служить в качестве ценного терапевтического средства, уменьшающего воспаление и патологические эффекты в случае ГВЭ и родственных заболеваний.

Неспецифический язвенный колит (ИС) является воспалительным заболеванием толстой кишки, обычно именуемой ободочной кишкой, которое характеризуется воспалением и образованием язв в слизистой оболочке или внутренней выстилке ободочной кишки. Указанное воспаление вызывает частое опорожнение ободочной кишки, ведущее к диарее. Симптомами данного заболевания являются частый жидкий стул и связанные с ним спазмы брюшной полости, лихорадка и потеря массы тела. Хотя точная причина ИС не известна, недавно проведенные исследования позволяют предположить, что естественная защита организма направлена против белков, которые воспринимаются организмом как чужеродные

- 43 015706 (аутоиммунная реакция). Может быть, из-за того, что указанные белки напоминают бактериальные белки в кишечнике, они могут провоцировать или стимулировать воспалительный процесс, который начинается с разрушения выстилки ободочной кишки. По мере разрушения выстилки ободочной кишки образуются язвы, из которых выделяется слизь, гной и кровь. Указанное заболевание обычно начинается в ректальной области и может постепенно распространяться по всему толстому кишечнику. Рецидивы воспаления вызывают утолщение стенок кишечника и прямой кишки в результате образования рубцовой ткани. При тяжелом течении болезни может произойти отмирание ткани ободочной кишки или сепсис. Симптомы неспецифического язвенного колита могут характеризоваться разной тяжестью, и их возникновение может быть постепенным или внезапным. Поражения могут быть спровоцированы многими факторами, включающими респираторные инфекции или стресс.

Несмотря на то что в настоящее время отсутствуют методы, позволяющие вылечить ИС, лечение сфокусировано на подавлении аномального воспалительного процесса в выстилке ободочной кишки. Лечение включает назначение кортикостероидных иммунодепрессантов (например, азатиоприна, меркаптопурина и метотрексата) и аминосалицилатов. Однако длительный прием иммунодепрессантов, таких как кортикостероиды и азатиоприн, может вызвать серьезные побочные эффекты, включающие истончение костей, катаракты, инфекции и поражение печени и костного мозга. Субъектов, которые не поддаются лечению современными методами, подвергают оперативному вмешательству. Оперативное вмешательство предполагает удаление всей ободочной кишки и прямой кишки.

Существует несколько животных моделей, которые могут частично имитировать хронический неспецифический язвенный колит. Наиболее широко используемой моделью является модель колита, индуцированного 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой/этанолом (ТИВ8), которая характеризуется хроническим воспалением и образованием язв в ободочной кишке. ТИВ8, введенный в ободочную кишку восприимчивых мышей путем инстилляции в прямую кишку, вызывает иммунную реакцию, опосредованную Т-клетками, в слизистой оболочке ободочной кишки, что ведет к выраженному воспалению слизистой оболочки, характеризующемуся сильной инфильтрацией Т-клеток и макрофагов по всей стенке толстого кишечника. Кроме того, указанная гистопатологическая картина сопровождается клинической картиной постепенной потери массы тела (истощение), кровавым поносом, выпадением прямой кишки и утолщением стенок толстого кишечника (ЫеигаШ е! а1. ИЛет. Кеу. Iттиηо1. 19:51-62, 2000).

В другой модели колита использован декстран-сульфат натрия (Ό88), который вызывает острый колит, сопровождающийся кровавым поносом, потерей массы тела, укорачиванием ободочной кишки и образованием язв в слизистой оболочке с инфильтрацией нейтрофилов. 088-индуцированный колит характеризуется в гистологическом отношении инфильтрацией клеток воспалительного инфильтрата в тонкий слой, гиперплазией лимфоидной ткани, образованием очаговых крипт и язв в эпителии. Считается, что указанные изменения возникают вследствие токсического воздействия Ό88 на эпителий, фагоцитоза клеток тонкого слоя и продуцирования ЮТ-а и ШЫ-у. Несмотря на широкое использование данной модели, она не позволяет ответить на несколько вопросов, касающихся механизма воздействия Ό88 применительно к заболеванию человека. Считается, что данная модель не зависит от Т-клеток, так как 088-индуцированный колит возникает у животных с отсутствием Т-клеток, таких как мыши 8СШ.

Полипептиды растворимого I^-22КА2-содержащего рецептора, такого как /су1ог16-Ес4, и другие растворимые или слитые белки 1Е-22КА вводят в модели ТНВ8 или Ό88 для оценки возможности использования 1Е-22КА для ослабления симптомов и изменения течения желудочно-кишечного заболевания. Кроме того, результаты исследований, свидетельствующие об ингибировании ΙΕ-22 полипептидами 1Е-22КА2, подтверждают, что для ослабления симптомов в моделях колита/ШЭ и изменения течения болезни можно использовать другие антагонисты ΙΕ-22, такие как ЕЕ-22КА или антитела к ним. В результате осуществления КТ-РСК была обнаружена повышенная экспрессия ΙΕ-22 в тканях ободочной кишки у мышей, которым вводили Ό88, и синергическая активность ΙΕ-22 и ЕБ-1-β в линиях кишечных клеток. Имеющиеся данные показывают, что ΙΕ-22 может играть определенную роль в воспалительной реакции в случае колита, и нейтрализация активности ΙΕ-22 путем введения полипептидов ЕЕ-22КА2 является потенциальным способом лечения ШЭ. Другие потенциальные терапевтические средства включают полипептиды Ш^КА, антитела против Ш^КА, антитела против ΙΕ-22 или связывающие партнеры и т. п.

4. Псориаз.

Псориаз является хроническим заболеванием кожи, которым страдают более семи миллионов американцев. Псориаз диагностируется в тех случаях, когда происходит аномальный рост новых клеток кожи, в результате чего на коже образуются воспаленные, опухшие и чешуйчатые пятна, где старая кожа недостаточно быстро отшелушивается. Бляшечный псориаз, являющийся наиболее распространенной формой, характеризуется воспаленными пятнами кожи (поражениями), покрытыми серебристо-белыми чешуйками. Псориаз может ограничиваться несколькими бляшками или охватывать участки кожи среднего и большого размера, поражая главным образом волосистую часть кожи головы, колени, локти и туловище. Будучи весьма заметным, псориаз не является заразным заболеванием. Патогенез данного заболевания включает хроническое воспаление пораженных тканей. Полипептиды Ш^КА, антитела против

- 44 015706

1Ь-22ВА, антитела против 1Ь-22 и 1Ь-20 или связывающие партнеры могут служить в качестве ценного терапевтического средства, уменьшающего воспаление и патологические эффекты в случае псориаза, других воспалительных заболеваний кожи, аллергических заболеваний кожи и слизистой оболочки и родственных заболеваний.

Псориаз является воспалительным заболеванием кожи, опосредуемым Т-клетками, которое может вызывать значительный дискомфорт. Данное заболевание не излечивается и поражает людей всех возрастов. Псориазом страдают примерно 2% населения Европы и Северной Америки. Несмотря на то, что субъекты, страдающие легкой формой псориаза, часто могут контролировать данное заболевание местными средствами, более одного миллиона субъектов во всем мире нуждаются в лечении ультрафиолетовым светом или в системном введении иммунодепрессивных средств. К сожалению, неудобство и риск ультрафиолетового облучения, и токсичность многих лечебных средств делает невозможным их длительное применение. Кроме того, у субъектов обычно возникают рецидивы псориаза, в некоторых случаях вскоре после прекращения лечения иммунодепрессивными средствами.

1Ь-20 является новым гомологом 1Ь-10, который, как было установлено, вызывает смерть новорожденных с патологиями кожи, включая аберрантную дифференцировку эпидермальных клеток у трансгенных мышей, экспрессирующих 1Ь-20 (В1итЬегд Н. е! а1., Се11 104:9-19, 2001), которые характеризуются повышенным содержанием рецептора 1Ь-20 в коже, пораженной псориазом. Так как 1Ь-22 имеет одну субъединицу рецептора (хсуЮг11) с рецептором 1Ь-20, и трансгенные мыши, экспрессирующие 1Ь-22, относятся к такому же фенотипу, вполне возможно, что 1Ь-22 также имеет отношение к воспалительным заболеваниям кожи, таким как псориаз. Подкожное или местное введение полипептида 1Ь-22ВА или антагониста, являющегося антителом против 1Ь-22ВА, может потенциально ослаблять воспаление и его симптомы. Другие потенциальные терапевтические агенты включают полипептиды 1Ь-22ВА, полипептиды растворимого рецептора хсу!ог11/СВЕ2-4, антитела против 1Ь-22 или связывающие партнеры и т.п. Кроме того, в псориатических поражениях человека была обнаружена сверхэкспрессия 1Ь-22 и 1Ь-20, из чего следует, что 1Ь-22 подобно 1Ь-20 также опосредует псориаз человека. Как указано в настоящем описании изобретения, сверхэкспрессия 1Ь-20 или 1Ь-22 у трансгенных мышей показывает, что утолщение эпидермиса и появление иммунокомпетентных клеток являются показателями псориатического фенотипа; и, кроме того, инъекция 1Ь-22 здоровым мышам вызывает утолщение эпидермиса и появление иммунокомпетентных клеток, характерных для псориатического фенотипа, причем указанные симптомы могут быть устранены антагонистом растворимого рецептора 1Ь-22ВА2 (хсу1ог16; публикация \У1РО № \¥О 01/40467). Такие данные, полученные ш νίνΌ, далее позволяют предположить, что провоспалительный 1Ь-22 имеет непосредственное отношение к псориазу. Таким образом, антагонисты активности 1Ь-22 и 1Ь-20, такие как растворимые рецепторы 1Ь-22ВА и антитела к ним, включающие моноклональные и нейтрализующие антитела против 1Ь-22ВА человека по настоящему изобретению, пригодны для терапевтического лечения воспалительных заболеваний, особенно в качестве антагонистов 1Ь-22 и 1Ь-20 (отдельно или вместе) при лечении псориаза. Кроме того, антагонисты активности 1Ь-22, такие как растворимые рецепторы 1Ь-22ВА и антитела к ним, включающие моноклональные и нейтрализующие антитела против 1Ь-22ВА человека по настоящему изобретению, пригодны для терапевтического лечения других воспалительных заболеваний, например, в качестве агентов, которые связывают, блокируют, ингибируют, ослабляют, оказывают антагонистическое действие или нейтрализуют 1Ь-22 и 1Ь-20 при лечении атопического дерматита, ΙβΌ, колита, эндотоксемии, артрита, ревматоидного артрита и псориатического артрита, острого респираторного заболевания (АВЭ), септического шока, нарушения функции многих органов, воспалительного поражения легких, такого как астма или бронхит, бактериальной пневмонии, псориаза, экземы, атопического и контактного дерматита, воспалительного заболевания кишечника, такого как неспецифический язвенный колит и болезнь Крона.

Кроме того, антитела против 1Ь-22ВА и растворимые рецепторы 1Ь-22ВА по настоящему изобретению могут быть использованы для профилактики и лечения потери массы тела, связанной с рядом воспалительных заболеваний, раскрытых в настоящем описании изобретения, а также рака (например, химиотерапия), кахексии и инфекционных заболеваний. Например, сильная потеря массы тела является главным показателем в моделях септицемии, М8, ВА и опухолей. Кроме того, потеря массы тела является главным показателем многих заболеваний человека, включающих рак, инфекционные и воспалительные заболевания. Потеря массы тела была обнаружена у мышей, которым инъецировали аденовирус 1Ь-22, раскрытый в настоящем описании изобретения. Антитела против 1Ь-22 и антагонисты 1Ь-22, такие как растворимые рецепторы 1Ь-22ВА и антитела к ним по настоящему изобретению, а также рецепторы хсу!ог16 (1Ь-22ВА2) могут быть испытаны в отношении способности предотвращать и лечить потерю массы тела у мышей, которым инъецировали аденовирусы 1Ь-22, раскрытые в настоящем изобретении. В данной области известны способы определения схемы профилактического или терапевтического лечения такими антагонистами 1Ь-22, которые могут быть определены методами, раскрытыми в настоящем описании изобретения.

Полипептиды растворимых рецепторов 1Ь-22ВА и антитела к ним могут быть также использованы в диагностических системах для обнаружения содержания лиганда 1Ь-22 или 1Ь-20 в кровотоке и для обнаружения 1Ь-22, ассоциированного с воспалительной реакцией острой стадии заболевания. В родст

- 45 015706 венном варианте осуществления изобретения антитела или другие агенты, специфически связывающиеся с растворимыми рецепторами 1Б-22КА по настоящему изобретению, могут быть использованы для обнаружения полипептидов рецепторов в кровотоке; и наоборот растворимые рецепторы 1Б-22КА могут быть использованы для обнаружения полипептидов 1Ь-22 или 1Ь-20 в кровотоке или в месте поражения. Повышенные или пониженные уровни лиганда или полипептидов рецептора могут служить показателем патологических заболеваний, включающих воспаление или рак. Известно, что №-22 индуцирует воспалительную реакцию острой стадии заболевания. Кроме того, обнаружение белков или молекул острой стадии заболевания, таких как 1Ь-20 или 1Ь-22, может свидетельствовать о хроническом воспалении в определенных заболеваниях (таких как псориаз, ревматоидный артрит, колит, 1ВИ). Обнаружение таких состояний помогает диагностировать заболевание и позволяет лечащему врачу выбрать соответствующую схему лечения.

Введение нейтрализующих антител против 1Ь-22 или 1Ь-20 в матку можно использовать для определения эффективности указанных антител ш у1уо в моделях заболеваний в отношении ослабления или устранения фенотипа кожи, обнаруженного у трансгенных мышат, сверхэкспрессирующих 1Ь-22, или у трансгенных мышат, сверхэкспрессирующих 1Ь-20. В данной области известны случаи введения в матку нейтрализующих моноклональных антител (тАЬ). В одном случае на возникновение субпопуляции В-1 В-клеток существенно влияло лечение беременных самок мышей моноклональными антителами, специфичными к В-клеткам, СЭ19 (см., например, публикацию Кгор I. с! а1., Еиг. 1. 1ттипо1. 26(1):238-42, 1996). Кроп и др. внутрибрюшинно инъецировали беременным мышам 500 мкг моноклонального антитела крысы против СЭ19 мыши (или контрольного антитела, совместимого с изотипом крысы) в РВ8 на 9-й день беременности и повторяли инъекции через день до родов. Мышатам также один раз инъецировали 500 мкг указанных антител в возрасте 10 дней. При осуществлении другого эксперимента Танака и др. обнаружили, что введение в матку моноклонального антитела к β-цепи рецептора 1Ь-2 позволяет полностью устранить образование ТЬу-1+ дендритных клеток эпидермиса. Две разные субъединицы рецептора 1Ь-2, т.е. α-цепь (1Б-2К. α) и β-цепь (1Ь-2В β), экспрессированы почти взаимоисключающим образом при онтогенезе тимуса плода. Блокирование β-цепи 1Ь-2В, передающего сигналы компонента 1Ь2КА, путем введения нейтрализующего моноклонального антитела к β-цепи 1Ь-2В вызывало полное или избирательное исчезновение ТЬу-1+ дендритных клеток эпидермиса кожи. Образование любых других субпопуляций Т-клеток не изменялось. Из вышеизложенного следует, что 1Ь-2 играет важную роль в образовании γ-ν 5+ клеток плода и их потомков (см. публикацию Тапака, Т. с! а1., 1п!. 1ттипо1. 4(4): 4879, 1992). Кроме того, Скаттеманн и др. показали, что введение в матку РИСР-А необходимо для нормального развития сердечно-сосудистой системы мышей. Полученные данные позволяют предположить, что выделенная из тромбоцитов цепь фактора роста А (Р8СР-А) необходима для нормального развития сердечно-сосудистой системы эмбриона. Введение нейтрализующих антител против РИСР-А в отпадающую оболочку матки мышей вызывало избирательное нарушение взаимодействия между лигандом и рецептором РИСР-А ш у1уо в течение периода времени, равного 18-24 ч, и позволяло определить потребность в РИСР-А для развития сердечно-сосудистой системы и время возникновения такой потребности (см. публикацию 8сйа!!стапп С.С. с! а1., Ису. Вю1. 176 (1):133-42, 1996). Вышеуказанные результаты наряду с другими результатами, приведенными в научной литературе, показывают, что нейтрализующие моноклональные антитела могут оказывать сильное воздействие в матке. Аналогичным образом можно привести данные, свидетельствующие об эффективной нейтрализации 1Ь-20 или 1Ь-22 моноклональными антителами ш у1уо в моделях заболеваний для ослабления или устранения фенотипа кожи, обнаруженного у трансгенных мышат, экспрессирующих 1Ь-20 и 1Ь-22, которые соответственно сверхэкспрессируют 1Ь-20 и 1Ь-22. Указанные трансгенные мыши родились с блестящей кожей, по крайней мере частично, вследствие утолщения эпидермиса. Трансгенные мышата, экспрессирующие 1Ь-20 на достаточно низком уровне, могут выздороветь и дожить до появления потомства, но трансгенные мыши, экспрессирующие 1Ь-22, умирают вскоре после рождения, не доживая до 5-дневного возраста.

Например, нейтрализующие антитела к 1Ь-20 включают такие антитела как нейтрализующие моноклональные антитела, которые могут связываться с антигенными детерминантами 1Ь-20 и нейтрализовать активность 1Ь-20. Пептиды и полипептиды 1Ь-20, несущие антигенные детерминанты, пригодны для индукции антител, связывающихся с полипептидами 1Ь-20, раскрытыми в настоящем описании изобретения, а также для идентификации и скрининга моноклональных антител против 1Ь-20, которые являются нейтрализующими антителами и могут связывать, блокировать, ингибировать, ослаблять, оказывать антагонистическое действие или нейтрализовать активность 1Ь-20. Такие нейтрализующие моноклональные антитела по настоящему изобретению могут связываться с антигенной детерминантой 1Ь-20. Такие антигенные детерминанты в 8Е0 Ш ΝΌ: 8, прогнозируемые на основании графика Джеймсона-Вульфа, например, при помощи программы Рго!сап ^NА8ΤΛΒ (^NА8ΤΛΒ, 1пс, Маб1хоп, VI), являются предпочтительными антигенными детерминантами и могут быть определены специалистом в данной области. Такие антигенные детерминанты включают аминокислотные остатки 42 (11с) - 102 (Ахр) 8ЕО Ш ΝΌ: 8; аминокислотные остатки 42 (11с) - 60 (11с) 8ЕО Ш ЫО: 8; аминокислотные остатки 42 (11с) - 69 (С1и) 8ЕО Ш ЫО: 8; аминокислотные остатки 42 (11с) - 81 (Сух) 8ЕО Ш ЫО: 8; аминокислотные остатки 42 (11с) - 96

- 46 015706 (Ьук) 8Е0 ΙΩ N0: 8; аминокислотные остатки 42 (Не) - 102 (Акр) 8Е0 ΙΩ N0: 8; аминокислотные остатки 60 (Не) - 69 (С1и) 8Е0 ΙΩ N0: 8; аминокислотные остатки 60 (Не) - 81 (Сук) 8Е0 ΙΩ N0: 8; аминокислотные остатки 60 (Не) - 96 (Ьук) 8Е0 ΙΩ N0: 8; аминокислотные остатки 60 (Не) - 102 (Акр) 8Е0 ΙΩ N0: 8; аминокислотные остатки 69 (С1и) - 81 (Сук) 8Е0 ΙΩ N0: 8; аминокислотные остатки 69 (С1и) - 96 (Ьук) 8Е0 ΙΩ N0: 8; аминокислотные остатки 69 (С1и) - 102 (Акр) 8Е0 ΙΩ N0: 8; аминокислотные остатки 81 (Сук) - 96 (Ьук) 8Е0 ΙΩ N0: 8; аминокислотные остатки 81 (Сук) - 102 (Акр) 8Е0 ΙΩ N0: 8 и аминокислотные остатки 96 (Ьук) - 102 (Акр) 8Е0 ΙΩ N0: 8.

Помимо моделей заболеваний, раскрытых в настоящем описании изобретения, активность антител против ГБ-22ВА в отношении воспалительной ткани, выделенной из псориатических поражений человека, можно измерить ш у1уо, используя модель тяжелого комбинированного иммунодефицита (8СГО) у мышей. Было создано несколько моделей с использованием мышей, в которых клетки человека имплантировали мышам с иммунодефицитом (имеющие общее название моделей ксенотрансплантата); см., например, публикации Са!!ап А.В., Ьоид1ак Е., Ьеик. Век. 18:513-22, 1994 и Б1ауе11, Ω.4., Нета!о1од1са1 0псо1оду 14:67-82, 1996. В качестве модели ксенотрансплантата для исследования псориаза ш у1уо ткань кожи человека, пораженной псориазом, имплантировали в модель 8СГО у мышей и стимулировали соответствующим антагонистом. В данной области могут быть использованы другие животные модели псориаза для оценки антагонистов ГЬ-20 и ГЬ-22, такие как модель АСВ129 у мышей, которым имплантировали трансплантат кожи человека, пораженной псориазом, и стимулировали соответствующим антагонистом (см., например, интерактивную публикацию Воутап, О. е! а1., 1. Ехр. Меб. № 20031482, 2004, которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки). Антитела против ГБ-22А, которые связывают, блокируют, ингибируют, ослабляют, оказывают антагонистическое действие или нейтрализуют активность ГЬ-22 или ГЬ-20 и ГЬ-22 вместе, являются предпочтительными антагонистами, однако, в указанной модели могут быть использованы также антитела против Ш-20 и ΙΩ-22 (отдельно или в комбинации), растворимый Ш-22ВА и другие антагонисты ΙΩ-20 и ΙΩ-22. Аналогичным образом в модели 8СГО могут быть использованы ткани и клетки, выделенные из участков тела человека, пораженных колитом, ΚΩ, артритом, или других воспалительных поражений для оценки противовоспалительных свойств антагонистов Ш-20 и ΙΩ-22 по настоящему изобретению.

Методы лечения, целью которого является устранение, замедление или ослабление воспаления с помощью антител против Ш-22ВА или их производных, агонистов, конъюгатов или вариантов, могут быть исследованы путем введения антител против Ш-22ВА или растворимых соединений Ш-22ВА мышам с 8СГО, несущим воспалительную ткань человека (например, псориатические поражения и т.п.), или использования других моделей, раскрытых в настоящем описании изобретения. Эффективность лечения измеряют и оценивают статистическими методами в виде повышения противовоспалительного действия в популяции, подвергнутой лечению, в течение определенного периода времени при помощи методов, хорошо известных в данной области. Некоторые характерные методы включают, не ограничиваясь ими, измеренение, например, в модели псориаза толщины эпидермиса, числа клеток воспалительного инфильтрата в верхнем слое дермы и степеней паракератоза. Такие методы известны в данной области и рассмотрены в настоящем описании изобретения. См., например, публикации 2е1д1ег, М. е! а1. ЬаЬ. Шуек! 81:1253,2001; 2о11пег, Т.М. е! а1. Ь С1т. Шуек!. 109:671, 2002; Уатапака, N. е! а1. М1сгоЫо1. Iттиηο1. 45:507, 2001; ВаусЬаибЬшг, 8.Р. е! а1. Вг. Ь Оегта!о1. 144:931, 2001; ВоеЬпске, №.Н. е! а1. АгсЬ. Оегта!о1. Век. 291:104, 1999; ВоеЬпске, №.Н. е! а1. Ь Шуек!. Оегта!о1. 116:596, 2001; №ско1о£Г, ВЛ. е! а1. Ат. Ь Ра!Ьо1. 146:580, 1995; ВоеЬпске, №.Н. е! а1. Ь Си!ап. Ра!Ьо1. 24:1, 1997; 8ида1, Ь, М. е! а1. Ь Оегта!о1. 8ег 17:85, 1998; апб УШабкеп Ь.8. е! а1. Ь СЬп. ЬкекТ 112:1571, 2003. Воспаление можно также контролировать во времени при помощи хорошо известных методов, таких как проточная цитометрия (или РСВ), для количественного определения числа клеток воспалительного инфильтрата и патологически измененных клеток, присутствующих в образце, выставление оценок (потеря массы тела, диарея, ректальное кровотечение, длина ободочной кишки) для ΚΩ, выставление оценок при заболевании лап и воспалении в модели ревматоидного артрита, индуцированного коллагеном (СЧА). Например, терапевтические методы, пригодные для испытания в такой модели, включают непосредственное лечение антителами против I^-22ВΑ, другими антагонистами ΙΩ-20 и ΙΩ-22 (отдельно или вместе) или соответствующими конъюгатами или антагонистами, действие которых основано на разрушающем взаимодействии антител против ГО^ВА с лигандами ΙΩ-20 и ΙΠ-22, или клеточную терапию с использованием антител против ГО^ВА или их производных, агонистов, конъюгатов или вариантов.

Кроме того, псориаз является хроническим воспалительным заболеванием кожи, ассоциированным с гиперпластическими эпидермальными кератиноцитами и инфильтрацией мононуклеарных клеток, включающих СЭ4+ Т-клетки памяти, нейтрофилы и макрофаги (СЬпк!орЬегк, Ш!. АгсЬ. А11егду Iттиηο1., 110:199, 1996). В настоящее время существует мнение, что антигены окружающей среды играют существенную роль в инициации и стимуляции патологии данного заболевания. Однако считается, что патология псориаза опосредована утратой толерантности к аутоантигенам. Предполагается, что важную роль в представлении и узнавании антигена играют дендритные клетки и СЭ4+ Т-клетки, которые опосредуют иммунную реакцию, вызывающую патологию. Авторы настоящего изобретения недавно создали модель псориаза на основе модели переноса СЭ4+СО45ВВ (Эауепрой е! а1., Инета!. ^типорЫтасоГ, 2:653

- 47 015706

672). Мышам, используемым в данной модели, вводят антитела против ГЬ-20 и ГЬ-22 или антитела к ГЬ20К и/или ГЬ-22К, такие как антитела против ГЬ-22КА по настоящему изобретению или растворимый рецептор ГЬ-22КА. Снижение выставляемых оценок (поражения кожи, воспалительные цитокины) свидетельствует об эффективности антагонистов ЕЬ-20 и ГЬ-22 при лечении псориаза, например антител против ГЕ-22КА, растворимых рецепторов ГЬ-22КА или других антагонистов, таких как антитела против ГЬ-20 и/или ЕЬ-22 или их рецепторов.

5. Атопический дерматит.

В образцах, полученных у субъектов, страдающих атопическим дерматитом (АО), наблюдается повышенная экспрессия ГЬ-20 и ГЬ-22. Атопический дерматит является распространенным хроническим воспалительным заболеванием, которое характериется наличием гиперактивированных цитокинов субпопуляции 2 Т-клеток-хелперов (Т12). Несмотря на то что точная этиология атопического дерматита неизвестна, данное заболевание может быть вызвано многими факторами, включающими иммунные реакции, опосредуемые гиперактивными Т1 2 -клетками, аутоиммунитет, инфекции, аллергены и генетическую предрасположенность. Основные признаки данного заболевания включают ксероз (сухость кожи), зуд (кожный зуд), конъюнктивит, воспалительные поражения кожи, инфицирование 8!арЬу1ососсиз аигеиз, повышенное содержание эозинофильных лейкоцитов в крови, повышенное содержание ^Е и ^С1 в сыворотке, хронический дерматит, вызываемый инфильтрацией Т-клеток, мастоцитов, макрофагов и эозинофильных лейкоцитов. Установлено, что образование колоний или инфицирование 8. аигеиз обостряет атопический дерматит и вызывает хроническое течение данного кожного заболевания.

Атопический дерматит часто встречается у субъектов, страдающих астмой и аллергическим ринитом, и во многих случаях является первичным проявлением аллергического заболевания. Примерно 20% населения в западных странах страдают указанными аллергическими заболеваниями, причем по неизвестным причинам в развитых странах увеличивается число случаев заболевания атопическим дерматитом. Атопический дерматит обычно возникает в детстве и может сохраняться после достижения совершеннолетия. Современные методы лечения атопического дерматита включают местное применение кортикостероидов, пероральное введение циклоспорина А, некортикостероидных иммунодепрессантов, таких как такролимус (ЕК506 в виде мази), и γ-интерферона. Несмотря на разнообразие методов лечения атопического дерматита, у многих субъектов не наступает улучшения или возникают отрицательные реакции на лекарственные средства, что требует поиска других, более эффективных лекарственных средств. Полипептиды растворимого ГЬ-22КА и антитела против ГЬ-22КА по настоящему изобретению, включая нейтрализующие антитела против ГЕ-22КА человека по настоящему изобретению, могут быть использованы для нейтрализации ГЬ-22 и ГЬ-20 при лечении специфических заболеваний человека, таких как атопический дерматит, воспалительные заболевания кожи и другие воспалительные заболевания, раскрытые в настоящем описании изобретения.

Растворимые рецепторы ГЬ-22КА или антитела против ГЬ-22КА по настоящему изобретению, предназначенные для фармацевтического применения, могут входить в состав препаратов для парентерального, в частности внутривенного или подкожного введения известными методами. Указанные препараты можно вводить внутривенно в виде инъекции ударной дозы вещества, при помощи устройства с регулируемым высвобождением, например мининасосов или других приемлемых методов, или путем вливания в течение периода времени от одного до нескольких часов. Как правило, фармацевтические препараты включают гемопоэтический белок в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, таким как физиологический раствор, забуференный физиологический раствор, 5%-ный водный раствор декстрозы или т. п. Препараты могут далее включать один или несколько наполнителей, консервантов, растворителей, буферов, альбумин для предотвращения потери белка на поверхностях пробирок и т. д. При использовании такой комбинированной терапии цитокины могут быть объединены в одном препарате или могут быть введены в разных препаратах. Методы получения препаратов хорошо известны в данной области и описаны, например, в публикации Кетшд!оп'з РЬагтасеи!юа1 8с1епсез, Сеппаго, ей., Маск РиЬЬзЫпд Со., Еаз!оп РА, 1990, которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Терапевтические дозы обычно составляют от 0,1 до 100 мкг/кг массы тела субъекта в сутки, предпочтительно 0,5-20 мг/кг в сутки, причем точную дозу определяет лечащий врач на основании общепринятых стандартов с учетом характера и тяжести подлежащего лечению заболевания, особенностей субъекта и т. д. Специалисту в данной области должны быть известны способы определения дозы. Белки обычно вводят в течение периода времени до 28 дней с последующим осуществлением химиотерапии или трансплантации костного мозга или до достижения числа тромбоцитов >20000/мм³, предпочтительно >50000/мм³. Как правило, белки вводят в течение одной недели или меньше, часто в течение периода времени от одного до трех дней. Терапевтически эффективным количеством растворимого ГЬ-22КА или антител против ГЬ-22КА по настоящему изобретению является количество, достаточное для достижения клинически значимого увеличения пролиферации и/или дифференцировки клеток-предшественников лимфоидной или миелоидной ткани, которое проявляется в увеличении уровней зрелых клеток (например, тромбоцитов или нейрофилов) в кровотоке. Таким образом, лечение нарушений, связанных с тромбоцитами, продолжается до тех пор, пока количество тромбоцитов не достигнет по крайней мере 20000/мм³, предпочтительно 50000/мм³. Растворимый ГЬ-22КА или антитела против ГЬ-22КА по настоящему изобретению

- 48 015706 можно также вводить в комбинации с другими цитокинами, такими как Ш-3, -6 и -11, фактор самоподдержания стволовых клеток, эритропоэтин С-С8Р и СМ-С8Е. В соответствии со схемами комбинированного лечения суточные дозы других цитокинов обычно равны ЕРО 150 ед/кг; СМ-С8Е 5-15 мг/кг; Ш-3 15 мг/кг и С-С8Е 1-25 мг/кг. Комбинированную терапию с использованием ЕРО обычно назначают субъектам, страдающим анемией, с низкими уровнями ЕРО.

Доза вводимого растворимого Ш-22КА (аналога Ш-22КА или слитого белка) или антител против Ш-22КА может изменяться в зависимости от таких факторов, как возраст, масса тела, рост, пол, общее состояние здоровья и предшествующая история болезни субъекта. Реципиенту обычно желательно вводить дозу растворимого Ш-22КА или антител против Ш-22КА в пределах от около 1 пг/кг до 10 мг/кг (количество агента/массу тела субъекта), хотя в зависимости от обстоятельств вводимая доза может быть более низкой или более высокой.

Растворимый Ш-22КА или антитела против Ш-22КА можно вводить субъекту внутривенно, внутриартериально, внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожно, внутриплеврально, интратекально, путем перфузии через регионарный катетер или прямой инъекции в место поражения. Введение терапевтических белков в виде инъекции включает непрерывное вливание или одну или несколько инъекций ударной дозы вещества.

Дополнительные методы введения включают пероральное, легочное, чрескожное введение и введение в слизистую оболочку. Пероральное введение пригодно для доставки полиэфирных микросфер, цеиновых микросфер, белковых микросфер, полицианоакрилатных микросфер и липидных систем (см., например, публикации Б1Ваке апб Могге1, 0га1 БеНуегу ок Мюгоепсарки1а!еб Рго!е1п8, ш Рго!еш БеНуегу: РНукюа1 8ук!етк, 8апбегк апб Непбгеп (ебк.), радек 255-288 (Р1епит Ргекк 1997)). Интраназальное введение является характерным методом доставки инсулина (см., например, НтсНсКПс апб Шит, Абν. Бгид БеНу. Кеу. 35:199 (1999)). Могут быть получены сухие или жидкие частицы, включающие Ш-22КА, которые ингалируют при помощи диспергаторов сухого порошка, генераторов жидкого аэрозоля или распылителей (см., например, публикации Ре!Н! апб СотЬо!/, ТШТЕСН 16:343 (1998); Ра!!оп е! а1., Абу. Бгид БеНу. Кеу. 35:235 (1999)). Иллюстрацией данного метода является система лечения диабета АЕКХ, которая представляет собой ручной электронный ингалятор, обеспечивающий доставку аэрозолированного инсулина в легкие. Осуществленные исследования показали, что белки с молекулярной массой 48000 кДа могут быть доставлены в терапевтической концентрации через кожу при помощи низкочастотного ультразвука, иллюстрирующего возможность чрескожного введения (МНгадоНз е! а1., 8с1епсе 269:850 (1995)). Чрескожная доставка путем электропорации является еще одним способом введения молекулы, обладающей связывающей активностью Ш-22КА (Ро!!к е! а1., РНагт. Вю!есНпо1. 10:213 (1997)).

Фармацевтическая композиция, содержащая растворимый Ш-22КА или антитело против Ш-22КА, может быть получена известными методами приготовления фармацевтически приемлемых композиций, в которых терапевтические белки объединены в виде смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Носитель считается фармацевтически приемлемым носителем, если он хорошо переносится реципиентом. Стерильный физиологический раствор с фосфатным буфером является одним примером фармацевтически приемлемого носителя. Специалистам в данной области хорошо известны другие приемлемые носители. См., например, публикацию Се п па го (еб.), Кетшд!оп'к РНагтасеиНса1 8с1епсек, 19^Л Ебйюп (Маск РиЬНкЫпд Сотрапу 1995).

Раствормый Ш-22КА или антитело против Ш-22КА. в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем вводят субъекту в лечебных целях в терапевтически эффективном количестве. Считается, что комбинацию терапевтической молекулы по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемого носителя вводят в терапевтически эффективном количестве, если вводимое количество является физиологически значимым. Агент является физиологически значимым, если его присутствие вызывает визуализируемое изменение физиологии реципиента. Например, агент, используемый для лечения воспаления, является физиологически значимым, если его присутствие ослабляет воспалительную реакцию.

Фармацевтическая композиция, содержащая Ш-22КА (аналог Ш-22КА. или слитый белок) или нейтрализующее антитело против Ш-22КА, может быть получена в жидкой форме, в виде аэрозоля или в твердой форме. Примерами жидких форм являются инъекционные растворы и суспензии для перорального введения. Характерные твердые формы включают капсулы, таблети и формы с регулируемым высвобождением. Примером последней формы являются миниосмотические насосы и имплантаты (Вгетег е! а1., РНагт. Вю!есНпо1. 10:239 (1997); Капабе, ЛтрПпк ш Бгид БеНуегу, ш Бгид БеНуегу 8ук!етк, Капабе апб НоШпдег (ебк.), радек 95-123 (СКС Ргекк 1995); Вгетег е! а1., Рго!ет БеНуегу \уНН Шикюп Ритрк, 1п Рго!еш БеНуегу: РНукюа1 8ук!етк, 8апбегк апб Непбгеп (ебк.), радек 239-254 (Р1епит Ргекк 1997); Уе\уеу е! а1., БеНуегу ок Рго!ешк кгот а Соп!го11еб Ке1еаке Нцес^Ые 5 Iтр1аπ!, т Рго!еш БеНуегу: РНукюа1 8ук!етк, 8апбегк апб Непбгеп (ебк.), радек 93-117 (Р1епит Ргекк 1997)).

Липосомы являются одним средством доставки терапевтических полипептидов в организм субъекта путем внутривенного, внутрибрюшинного, интратекального, внутримышечного, подкожного или перорального введения, ингаляции или интраназального введения. Липосомы представляют собой микроскопические пузырьки, состоящие из одного или нескольких липидных бислоев, окружающих водный компартмент (см., например, публикации Ваккег-^оибепЬегд е! а1., Еиг. 1. СНп. МкгоЬюк Шес!. Б1к. 12

- 49 015706 (8ирр1. 1):861 (1993), Кхт, Эгидз 46:618 (1993) и Камбе, 8х!е-8ресхйс Эгид Пейуегу Изшд Ьхрозотез аз Саглегз, ίη Эгид Пейуегу 8уз!етз, Камбс апб НоЙтдег (ебз.), радез 3-24 (СКС Ргезз 1995). Липосомы по своему составу аналогичны клеточным мембранам, благодаря чему липосомы являются безопасными и биологически разлагаемыми. В зависимости от способа получения липосомы могут быть однослойными или многослойными и могут иметь разный диаметр в пределах от 0,02 до более 10 мкм. В липосомы могут быть инкапсулированы разные агенты: гидрофобные агенты размещают между бислоями, и гидрофильные агенты размещают во внутреннем водном пространстве (см., например, публикации Масйу е! а1., Ырозотез Ιη Се11 Вю1оду Ап6 Рйагтасо1оду Нойи ЫЬЬеу 1987), и 0з!го е! а1., Атепсаг! 1 Нозр. Рйагт. 46:1576 (1989)). Кроме того, терапевтическую доступность инкапсулированного агента можно регулировать путем изменения размера липосомы, числа бислоев, композиции липидов, а также заряда и поверхностных характеристик липосом.

Липосомы адсорбируются клетками любого типа, после чего медленно высвобождают инкапсулированный агент. Альтернативно абсорбированная липосома может быть подвергнута эндоцитозу фагоцитарными клетками. Вслед за эндоцитозом происходит расщепление липосомных липидов внутренними лизосомами и высвобождение инкапсулированных агентов (8сйегрйоГ е! а1., Апп. КУ. Асаб. 8сх. 446:368 (1985)). После внутривенного введения мелкие липосомы (0,1-1,0 мкм) обычно поглощаются клетками ретикулоэндотелиальной системы, локализованной главным образом в печени и селезенке, в то время как липосомы крупнее 3,0 мкм осаждаются в легких. Предпочтительное поглощение липосом меньшего размера клетками ретикулоэндотеальной системы используют для доставки химиотерапевтических агентов в макрофаги и опухоли печени.

Ретикулоэндотелиальную систему можно обойти несколькими способами, включающими насыщение большими дозами липосомных частиц или избирательную инактивацию макрофагов фармакологическими средствами (С1ааззех1 е! а1., Вюсйхт. Вюрйуз. Ас!а 802:428 (1984)). Кроме того, установлено, что введение гликолипидных или полиэтиленгликолевых производных фосфолипидов в мембраны липосом вызывает значительно меньшее поглощение ретикулоэндотелиальной системой (А11сп е! а1., Вюсйхт. Вюрйуз. Ас!а 1068:133 (1991); А11сп е! а1., Вюсйхт. Вюрйуз. Ас!а 1150:9 (1993)).

Липосомы, направленно воздействующие на определенные клетки или органы, могут быть созданы путем изменения фосфолипидного состава или введения в липосомы рецепторов или лигандов. Например, липосомы с высоким содержанием неионогенного поверхностно-активного вещества используют для направленной доставки в печень (патент Японии 04-244018 (Науака^а е! а1.); Ка!о е! а1., Вю1. Рйагт. Ви11. 16:960 (1993)). Указанные препараты были получены путем смешивания соевого фосфатидилхолина, α-токоферола и этоксилированного гидрогенизированного касторового масла (НСО-60) в метаноле, концентрирования полученной смеси в вакууме и последующего восстановления смеси водой. Кроме того, установлено, что липосомный препарат дипальмитоилфосфатидилхолина (ЭРРС) в сочетании с выделенной из сои смесью стерилглюкозида (8С) и холестерина (Сй) оказывает направленное воздействие на печень (8йхшххи е! а1., Вю1. Рйагт. Ви11. 20:881 (1997)).

Альтернативно с поверхностью липосомы могут быть связаны разные направленно воздействующие лиганды, такие как антитела, фрагменты антител, углеводы, витамины и транспортные белки. Например, липосомы могут быть модифицированы производными галактозиллипидов с разветвленной цепью для направленного воздействия на рецепторы азиалогликопротеина (галактозы), которые преимущественно экспрессированы на поверхности клеток печени (Ка!о ааб 8идхуата, Сгй. Кет. Тйег. Эгид Саггхег 8уз!. 14:287 (1997); Мигайазйх е! а1., Вю1. Рйагт. Ви11. 20:259 (1997)). Аналогичным образом в публикации \Ух1 е! а1., Нера!о1оду 27:772 (1998) показано, что мечение липосом азиалофетуином сокращает период полувыведения липосом из плазмы и значительно увеличивает поглощение меченной азиалофетуином липосомы гепатоцитами. С другой стороны, накопление в печени липосом, содержащих производные галактозиллипидов с разветвленной цепью, можно ингибировать путем предварительного инъецирования азиалофетуина (Мигайазйх е! а1., Вю1. Рйагт. Ви11. 20:259 (1997)). Полиаконитилированные липосомы сывороточного альбумина человека являются еще одним средством направленной доставки липосом в клетки печени (Катрз е! а1., Ргос. Ν!'1 Асаб. 8сх. И8А 94:11681 (1997)). Кроме того, в патенте США № 4603044 (Сейо е! а1.) описана система доставки липосомных пузырьков к гепатоцитам, которая обладает специфичностью к гепатобилиарным рецепторам, ассоциированным со специализированными метаболическими клетками печени.

В соответствии с общим методом направленного воздействия на ткани клетки-мишени предварительно метят биотинилированными антителами, специфичными к лиганду, экспрессируемому данной клеткой-мишенью (Нагазут е! а1., Абт. Эгид Эейт. Кет. 32:99 (1998)). После удаления из плазмы свободного антитела вводят липосомы, конъюгированные со стрептавидином. В соответствии с другим методом направленно воздействующие антитела присоединяют непосредственно к липосомам (Нагазут е! а1., Абт. Пгид Пейт. Кет. 32:99 (1998)).

Полипептиды и антитела могут быть инкапсулированы в липосомы стандартными методами микроинкапсулирования белков (см., например, публикации Ап6сгзоп е! а1., Шес!. Iттиη. 31:1099 (1981), Ап6сгзоп е! а1., Самег Кез. 50:1853 (1990), апб Сойсп е! а1., Вюсйхт. Вюрйуз. Ас!а 1063:95 (1991), А1ттд е! а1. Ргерага!юг1 апб Изе оГ Ырозотез ίη 1ттипо1од1са1 8!ибхез, ίη Ырозоте Тесйпо1оду, 2п6 Е6х!юп,

- 50 015706

Уо1. III 6гедопаб1з (еб.), раде 317 (СКС Ргезз 1993), УаззеГ е! а1., МеШ. Епхуто1. 749:124 (1987)). Как было указано выше, терапевтически пригодные липосомы могут содержать разные компоненты. Например, липосомы могут включать липидные производные полиэтиленгликоля (А11еи е! а1., ВюсЫт. ВюрБуз. Ас!а 1150:9 (1993)).

Разрушаемые полимерные микросферы были созданы для сохранения высоких системных уровней терапевтических белков. Микросферы получают из разрушаемых полимеров, таких как сополимер лактида и гликолида (РБС), полиангидриды, сложные полиортоэфиры, не поддающиеся биологическому разложению полиэтилвинилацетаты, и заключают белки в указанный полимер (СотЬо1х аиб Рейй, Вюсои)ида!е СБет. 6:332 (1995); Капабе, Ко1е оГ Ро1утегз ш Эгид Пе1Ыегу, ш Эгид ЭеШ'егу 8уз!етз, Каиабе аиб НоШидег (ебз.), радез 51-93 (СКС Ргезз 1995); Козкоз аиб МазШетею/, ЭедгабаЫе Соп!го11еб Ке1еазе 8уз!етз ИзеГи1 Гог Рго!ет Ое1кегу, т Рго!ет Эек'егу: РБузюа1 8уз!етз, 8аибегз аиб Неибгеи (ебз.), радез 45-92 (Р1еиит Ргезз 1997); Вайиз е! а1, 8с1еисе 281:1161 (1998); РиШеу аиб Вигке, №11иге Вю!есБпо1оду 16:153 (1998); Ри!иеу, Сигг. Орт. СБет. Вю1. 2:548 (1998)). Наносферы, покрытые полиэтиленгликолем (РЕС), также могут быть носителями для внутривенно вводимых терапевтических белков (см., например, публикацию СгеГ е! а1., РБагт. Вю!есБпо1. 10:167 (1997)).

Настоящее изобретение относится также к химически модифицированным полипептидам, обладающим связывающей активностью ГБ-22КА, таким как мономерные, гомодимерные, гетеродимерные или мультимерные растворимые рецепторы ГБ-22КА, и антагонистам ГБ-22КА, таким как антитела против ГБ-22КА, связывающие полипептиды или нейтрализующие антитела против ГБ-22КА, в которых полипептид связан с полимером вышеуказанными методами.

Специалистами в данной области могут быть созданы другие лекарственные формы, аналогичные представленным, например, в публикациях Аизе1 аиб Ророν^сБ, РБагтасеиБса1 Эозаде Рогтз аиб Эгид ЭеШ'егу 8уз!етз, 5'¹' Ебйюи (Беа & РеШдег 1990), Сеппаго (еб.), Кеттд!ои'з РБагтасеи!юа1 8с1еисез, 19'¹' Ебйюи (Маск РиЬБзШид Сотраиу 1995) и Каиабе аиб НоШидег, Эгид Эек'егу 8уз!етз (СКС Ргезз 1996).

В качестве иллюстрации можно отметить, что фармацевтические композиции могут быть предоставлены в виде набора, в комплект которого входит контейнер, содержащий полипептид с внеклеточным доменом 1Б-22КА, например мономерные, гомодимерные, гетеродимерные или мультимерные растворимые рецепторы 1Б-22КА, или антагонист 1Б-22КА (например, антитело, фрагмент антитела, связывающийся с полипептидом 1Б-22КА, или нейтрализующее антитело против ГБ-22КА). Терапевтические полипептиды могут быть получены в форме инъекционного раствора, рассчитанного на одну или несколько доз, или стерильного порошка, восстанавливаемого перед инъецированием. Альтернативно в комплект такого набора может входить диспергатор сухого порошка, генератор жидкого аэрозоля или распылитель для введения терапевтического полипептида. Такой набор может далее включать письменную инструкцию по использованию данной фармацевтической композиции. Кроме того, такая инструкция может содержать предостережение о том, композиция, включающая ББ-22КА, противопоказана субъектам с повышенной чувствительностью к ГБ-22КА.

Фармацевтическая композиция, включающая антитела против ГБ-22КА, связывающие партнеры (фрагменты антитела против ГБ-22КА, гибридные антитела, гуманизированные антитела и т.п.) или растворимый рецептор ГБ-22КА, может быть получена в жидкой форме, в виде аэрозоля или в твердой форме. Примерами жидких форм являются инъекционные растворы, аэрозоли, капли, топологические растворы и суспензии для перорального введения. Характерные твердые формы включают капсулы, таблетки и формы с регулируемым высвобождением. Примерами последней формы являются миниосмотические насосы и имплантаты (Вгетег е! а1., РБагт. Вю!есБпо1. 10:239 (1997); Каиабе, Гтр1аи!з т Эгид Эе1Аегу, 1и Эгид ЭеШ'егу 8уз!етз, Капабе аиб НоШидег (ебз.), радез 95-123 (СКС Ргезз 1995); Вгетег е! а1., Рго!ет ЭеШ'егу тейБ ГпГизюи Ритрз, т Рго!ет ЭеШ'егу: РБузюа1 8уз!етз, 8апбегз аиб Неибгеи (ебз.), радез 239-254 (Р1еиит Ргезз 1997); Уе\геу е! а1., ЭеШ'егу оГ Рго!етз Ггот а Сои!го11еб Ке1еазе Бцес1аЫе Гтр1аи!, ш Рго!ет ЭеШ'егу: РБузюа1 8уз!етз, 8апбегз аиб Неибгеи (ебз.), радез 93-117 (Р1еиит Ргезз 1997)). Другие твердые формы включают кремы, пасты, другие топологические средства и т.п.

Липосомы являются одним средством доставки терапевтических полипептидов в организм субъекта путем внутривенного, внутрибрюшинного, интратекального, внутримышечного, подкожного или перорального введения, ингаляции или интраназального введения. Липосомы представляют собой микроскопические пузырьки, состоящие из одного или нескольких липидных бислоев, окружающих водный компартмент (см., например, публикации Ваккег-УоибеиЬегд е! а1., Еиг. 1. СБи. МюгоЬюБ ГиГес!. Э1з. 12 (8ирр1. 1):861 (1993), К1т, Эгидз 46:618 (1993) и Капабе, 8йе-8рес1Бс Эгид Эек'егу Изтд Б1розотез аз Сатегз, т Эгид Эек'егу 8уз!етз, Капабе аиб НоШидег (ебз.), радез 3-24 (СКС Ргезз 1995)). Липосомы по своему составу аналогичны клеточным мембранам, благодаря чему липосомы являются безопасными и биологически разлагаемыми. В зависимости от способа получения липосомы могут быть однослойными или многослойными и могут иметь разный диаметр в пределах от 0,02 до более 10 мкм. В липосомы могут быть инкапсулированы разные агенты: гидрофобные агенты размещают между бислоями, и гидрофильные агенты размещают во внутреннем водном пространстве (см., например, публикации МасБу е! а1., Б1розотез Ги Се11 Вю1оду Аиб РБагтасо1оду (1оБп Б1ЬЬеу 1987), и Оз!го е! а1., Атепсаи 1. Нозр. РБагт. 46:1576 (1989)). Кроме того, терапевтическую доступность инкапсулированного агента можно регулиро

- 51 015706 вать путем изменения размера липосомы, числа бислоев, композиции липидов, а также заряда и поверхностных характеристик липосом.

Липосомы адсорбируются клетками любого типа, после чего медленно высвобождают инкапсулированный агент. Альтернативно абсорбированная липосома может быть подвергнута эндоцитозу фагоцитарными клетками. Вслед за эндоцитозом происходит расщепление липосомных липидов внутренними лизосомами и высвобождение инкапсулированных агентов (8с11егр1юГ е! а1., Апп. Ν.Υ. Асаб. 8сг 446:368 (1985)). После внутривенного введения мелкие липосомы (0,1-1,0 мкм) обычно поглощаются клетками ретикулоэндотелиальной системы, локализованной главным образом в печени и селезенке, в то время как липосомы крупнее 3,0 мкм осаждаются в легких. Предпочтительное поглощение липосом меньшего размера клетками ретикулоэндотеальной системы используют для доставки химиотерапевтических агентов в макрофаги и опухоли печени.

Ретикулоэндотелиальную систему можно обойти несколькими способами, включающими насыщение большими дозами липосомных частиц или избирательную инактивацию макрофагов фармакологическими средствами (С1ааккеп е! а1., ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а 802:428 (1984)). Кроме того, установлено, что введение гликолипидных или полиэтиленгликолевых производных фосфолипидов в мембраны липосом вызывает значительно меньшее поглощение ретикулоэндотелиальной системой (А11еп е! а1., ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а 1068:133 (1991); А11еп е! а1., ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а 1150:9 (1993)).

Липосомы, направленно воздействующие на определенные клетки или органы, могут быть созданы путем изменения фосфолипидного состава или введения в липосомы рецепторов или лигандов. Например, липосомы с высоким содержанием неионогенного поверхностно-активного вещества используют для направленной доставки в печень (патент Японии 04-244018 (Науака^а е! а1.); Кай е! а1., Вю1. РЬагт. Ви11. 16:960 (1993)). Указанные препараты были получены путем смешивания соевого фосфатидилхолина, α-токоферола и этоксилированного гидрогенизированного касторового масла (НСО-60) в метаноле, концентрирования полученной смеси в вакууме и последующего восстановления смеси водой. Кроме того, установлено, что липосомный препарат дипальмитоилфосфатидилхолина (ЭРРС) в сочетании с выделенной из сои смесью стерилглюкозида (8С) и холестерина (СИ) оказывает направленное воздействие на печень (81ιίιηίζιι е! а1., Вю1. РЬагт. Ви11. 20:881 (1997)).

Альтернативно с поверхностью липосомы могут быть связаны разные направленно воздействующие лиганды, такие как антитела, фрагменты антител, углеводы, витамины и транспортные белки. Например, липосомы могут быть модифицированы производными галактозиллипидов с разветвленной цепью для направленного воздействия на рецепторы азиалогликопротеина (галактозы), которые преимущественно экспрессированы на поверхности клеток печени (Кай апб 8ид1уата, Сгй. Кет. ТИег. Эгид Сатег 8ук!. 14:287 (1997); МигаЪакЫ е! а1., Вю1. РЬагт. Ви11. 20:259 (1997)). Аналогичным образом в публикации ХУи е! а1., НераЫЫду 27:772 (1998) показано, что мечение липосом азиалофетуином сокращает период полувыведения липосом из плазмы и значительно увеличивает поглощение меченной азиалофетуином липосомы гепатоцитами. С другой стороны, накопление в печени липосом, содержащих производные галактозиллипидов с разветвленной цепью, можно ингибировать путем предварительного инъецирования азиалофетуина (МигаЪакЫ е! а1., Вю1. РЬагт. Ви11. 20:259 (1997)). Полиаконитилированные липосомы сывороточного альбумина человека являются еще одним средством направленной доставки липосом в клетки печени (Катрк е! а1., Ргос. Νη1'1 Асаб. 8сг И8А 94:11681 (1997)). Кроме того, в патенте США № 4603044 (Се1то е! а1.) описана система доставки липосомных пузырьков к гепатоцитам, которая обладает специфичностью к гепатобилиарным рецепторам, ассоциированным со специализированными метаболическими клетками печени.

В соответствии с общим методом направленного воздействия на ткани клетки-мишени предварительно метят биотинилированными антителами, специфичными к лиганду, экспрессируемому данной клеткой-мишенью (Нагакут е! а1., Абт. Эгид ЭеКт. Кет. 32:99 (1998)). После удаления из плазмы свободного антитела вводят липосомы, конъюгированные со стрептавидином. В соответствии с другим методом направленно воздействующие антитела присоединяют непосредственно к липосомам (Нагакут е! а1., Абт. Эгид ЭеКт. Кет. 32:99 (1998)).

Нейтрализующие антитела против 1Ь-22КА и связывающие партнеры, обладающие активностью связывания 1Ь-22 или 1Ь-20, или растворимый рецептор 1Ь-22КА могут быть инкапсулированы в липосомы стандартными методами микроинкапсулирования белков (см., например, публикации Апбеггоп е! а1., 1пГес!. 1ттип. 31:1099 (1981), Апбеггоп е! а1., Сапсег Кек. 50:1853 (1990), апб СюНеи е! а1, ВюсЫт. ВюрНук. Ас!а 1063:95 (1991), АМпд е! а1. Ргерага!юп апб Ике οί ^^рοкοтек т Iттиηο1οд^са1 8!иб1ек, ш Ρ^ο^ικ ТесПадЫду, 2пб Ебйюп, νο1. III, С^едο^^аб^к (еб.), раде 317 (СКС Ргекк 1993), ХУаккеГ е! а1., Ме!1. Εηζутο1. 149:124 (1987)). Как было указано выше, терапевтически пригодные липосомы могут содержать разные компоненты. Например, липосомы могут включать липидные производные полиэтиленгликоля (А11еп е! а1., ВюсЫт. ВюрЬук. Ас!а 1150:9 (1993)).

Разрушаемые полимерные микросферы были созданы для сохранения высоких системных уровней терапевтических белков. Микросферы получают из разрушаемых полимеров, таких как сополимер лактида и гликолида (РЬС), полиангидриды, сложные полиортоэфиры, не поддающиеся биологическому разложению полиэтилвинилацетаты, и заключают белки в указанный полимер (СοтЬο!ζ апб Ре!б!, Вю

- 52 015706 соп)цда!е СЬет. 6:332 (1995); Вапабе, Во1е оГ Ро1утегз ш Эгид Оекуегу, ш Эгид ОеШ'егу 8уз!етз, Вапабе апб НоШпдег (ебз.), радез 51-93 (СВС Ргезз 1995); Возкоз апб МазИетас/, ЭедгабаЫе Соп!со11еб Ве1еазе 8уз!етз ИзеГи1 Гог Рго!ет ОеНуегу, т Рго!еш Оекуегу: РЬузка1 8уз!етз, 8апбегз апб Непбгеп (ебз.), радез 45-92 (Р1епит Ргезз 1997); ВагТиз е! а1., 8с1епсе 281:1161 (1998); РиТпеу апб Вигке, №1иге Вю!есЬпо1оду 16:153 (1998); Ри!пеу, Сигг. Орт. СЬет. ВюБ 2:548 (1998)). Наносферы, покрытые полиэтиленгликолем (РЕС), также могут быть носителями для внутривенно вводимых терапевтических белков (см., например, публикацию СгеГ е! а1., РЬагт. Вю!есЬпо1. 10:167 (1997)).

Настоящее изобретение относится также к химически модифицированным антителам против ГБ22ВА или связывающим партнерам, таким как антитела против ГБ-22ВА или растворимые рецепторы ГБ22ВА, связанные с полимером вышеуказанными методами.

Специалистами в данной области могут быть созданы другие лекарственные формы, аналогичные представленным, например, в публикациях Апзе1 апб РороуюЬ, РЬагтасеибса1 Эозаде Рогтз апб Эгид ОеНуегу 8уз!етз, 5¹¹' Еб1боп (Беа & РеЫдег 1990), Сеппаго (еб.), Ветшд!оп'з РЬагтасеибса1 8с1епсез, 19¹¹' Еб1боп (Маск РиЬНзЫпд Сотрапу 1995) и Вапабе апб НоШпдег, Эгид ОеНуегу 8уз!етз (СВС Ргезз 1996).

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим антитела против ГБ-22, к способам и терапевтическим применениям антител, пептидов или полипептидов, раскрытых в настоящем описании изобретения. Такие композиции далее содержат носитель. Носитель может быть обычным органическим или неорганическим носителем. Примеры носителей включают воду, буферный раствор, спирт, пропиленгликоль, макроголь, кунжутное масло, кукурузное масло и т. п.

11. Создание трансгенных мышей.

В псориатических поражениях человека была обнаружена сверхэкспрессия ГБ-20 и ГБ-22, из чего следует, что ГБ-20 и ГБ-22 опосредуют псориаз человека. Кроме того, как указано в настоящем описании изобретения, сверхэкспрессия ГБ-20 и ГБ-22 у трансгенных мышей вызывала утолщение эпидермиса и рекрутинг иммунокомпетентных клеток, характерных для псориатического фенотипа; и, кроме того, инъецирование ГБ-22 здоровым мышам также вызывало утолщение эпидермиса и рекрутинг иммунокомпетентных клеток, характерных для псориатического типа, причем указанные симптомы исчезали при введении антагониста растворимого рецептора хсуЮг16 (ГБ-22ВА2). Данные, полученные ш у1уо, позволяют далее предположить, что провоспалительный цитокин ГБ-22 вызывает псориаз. Таким образом, антагонисты активности ТБ-22, такие как нейтрализующие и моноклональные антитела против ББ-22ВА человека, а также растворимые рецепторы ГБ-22ВА пригодны для терапевтического лечения воспалительных заболеваний, в частности в качестве антагонистов ГБ-22 и ГБ-20 при лечении псориаза. Кроме того, агенты, которые связывают, блокируют, ингибируют, ослабляют, оказывают антагонистическое действие или нейтрализуют активность ГБ-22 или ГБ-20 и ГБ-22, такие как нейтрализующие и моноклональные антитела против ГБ-22ВА человека по настоящему изобретению, а также растворимые рецепторы ГБ-22ВА пригодны для терапевтического лечения других воспалительных заболеваний, например в качестве антагонистов ГБ-22 или ГБ-20 и ГБ-22 при лечении атопического дерматита, ГВО, колита, эндотоксемии, артрита, ревматоидного артрита и псориатического артрита, острого респираторного заболевания (АВО), септического шока, нарушения функции многих органов, воспалительного поражения легких, такого как астма или бронхит, бактериальной пневмонии, псориаза, экземы, атопического и контактного дерматита, воспалительного заболевания кишечника, такого как неспецифический язвенный колит и болезнь Крона и т. п.

Одним объектом настоящего изобретения является способ получения антитела к полипептиду, который включает иммунизацию животного полипептидом, выбираемым из группы, включающей: (а) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8ЕО ГО N0: 3 от аминокислоты 1 (Рго) до аминокислоты 6 (Азр); (Ь) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 3 от аминокислоты 26 (8ег) до аминокислоты 32 (Рго); (с) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 3 от аминокислоты 41 (Буз) до аминокислоты 47 (Азр); (б) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 2 от аминокислоты 49 (Уа1) до аминокислоты 62 (Суз); (е) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 3 от аминокислоты 41 (Буз) до аминокислоты 62 (Суз); (Г) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 3 от аминокислоты 84 (А1а) до аминокислоты 97 (8ег); (д) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 3 от аминокислоты 103 (ТЬг) до аминокислоты 108 (Азр); (1) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 3 от аминокислоты 130 (Агд) до аминокислоты 135 (Н1з); (1) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 3 от аминокислоты 164 (С1у) до аминокислоты 166 (Буз); (|) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 3 от аминокислоты 175 (Туг) до аминокислоты 179 (С1и); (к) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 3 от аминокислоты 193 (Буз) до аминокислоты 196 (А1а); (1) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 3 от аминокислоты 203 (Буз) до аминокислоты 209 (ТЬг); (т) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 3; и (п) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 4; индукцию указанным полипептидом иммунной реакции у животного с образованием антитела и выделение образовавшегося антитела из организма животного,

- 53 015706 причем указанное антитело специфически связывается с полипептидом ГЬ-22ВА (8ЕЦ ГО N0: 2 или 8ЕЦ ГО N0: 3) и уменьшает активность ГЬ-20 (8ЕЦ ГО N0: 8) или ГЬ-22 (8ЕЦ ГО N0: 6). Один вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором антитело, полученное таким способом, уменьшает провоспалительную активность ГЬ-20 (8ЕЦ ГО N0: 8) или ГЬ-22 (8ЕЦ ГО N0: 6). Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором антитело, полученное таким способом, нейтрализует взаимодействие ГЬ-20 (8ЕЦ ГО N0: 8) или ГЬ-22 (8ЕЦ ГО N0: 6) с ГЬ-22ВА (8ЕЦ ГО N0: 2). Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором степень нейтрализации антителом измеряют в результате осуществления клеточного анализа нейтрализации ш νί!Γ0 ГЬ-20 (8ЕЦ ГО N0: 8) или ГЬ-22 (8ЕЦ ГО N0: 6). Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором антитело, полученное таким способом, уменьшает провоспалительную активность как ГЬ-20 (8ЕЦ ГО N0: 8), так и ГЬ-22 (8ЕЦ ГО N0: 6). Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором антитело, полученное таким способом, нейтрализует взаимодействие как ГЬ-20 (8ЕЦ ГО N0: 8), так и ГЬ-22 (8ЕЦ ГО N0: 6) с ГЬ-22ВА (8ЕЦ ГО N0: 2). Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором степень нейтрализации антителом измеряют в результате осуществления клеточного анализа нейтрализации ш νί!Γ0 как ГЬ-20 (8ЕЦ ГО N0: 8), так и ГЬ-22 (8ЕЦ ГО N0: 6).

Другим объектом настоящего изобретения является антитело, полученное способом по настоящему изобретению, которое связывается с полипептидом 8ЕЦ ГО N0: 2 или 8ЕЦ ГО N0: 3. Один вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному антителу, которое является (а) поликлональным антителом, (Ь) моноклональным антителом мыши, (с) гуманизированным антителом, выделенным из антитела (Ь), (б) фрагментом антитела или (е) моноклональным антителом человека. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному антителу, которое далее включает радиоизотоп, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу или токсин. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному антителу, которое далее подвергнуто полиэтиленгликолированию. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному антителу, которое является (а) поликлональным антителом, (Ь) моноклональным антителом мыши, (с) гуманизированным антителом, выделенным из антитела (Ь), (б) фрагментов антитела или (е) моноклональным антителом человека. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному антителу, которое далее включает радиоизотоп, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу, лекарственное средство или токсин. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному антителу, которое далее подвергнуто полиэтиленгликолированию.

Другим объектом настоящего изобретения является антитело или фрагмент антитела, которые связываются с полипептидом, включающим последовательность аминокислотных остатков, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 3, и ослабляют провоспалительную активность ГЬ-20 (8ЕЦ ГО N0: 8) или ГЬ-22 (8ЕЦ ГО N0: 6). Один вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному антителу или фрагменту антитела, которые ослабляют провоспалительную активность как ГЬ-20 (8ЕЦ ГО N0: 8), так и ГЬ-22 (8ЕЦ ГО N0: 6). Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному антителу или фрагменту антитела, которые являются (а) поликлональным антителом, (Ь) моноклональным антителом мыши, (с) гуманизированным антителом, выделенным из антитела (Ь), (б) фрагментом антитела или (е) моноклональным антителом человека. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному антителу или фрагменту антитела, которые далее включают радиоизотоп, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу, лекарственное средство или токсин. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному антителу или фрагменту антитела, которые далее подвергнуты полиэтиленгликолированию. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному антителу или фрагменту антитела, которые являются (а) поликлональным антителом, (Ь) моноклональным антителом мыши, (с) гуманизированным антителом, выделенным из (Ь), (б) фрагментом антитела или (е) моноклональным антителом человека. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному антителу или фрагменту антитела, которые далее включают радиоизотоп, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу, лекарственное средство или токсин. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному антителу или фрагменту антитела, которые далее подвергнуты полиэтиленгликолированию.

Другим объектом настоящего изобретения является способ уменьшения или ингибирования индуцированной ГЬ-22 или ГЬ-20 пролиферации или дифференцировки гемопоэтических клеток или гемопоэтических клеток-предшественников, который включает культивирование клеток костного мозга или периферической крови с композицией, содержащей антитело по настоящему изобретению, в количестве, достаточном для уменьшения пролиферации или дифференцировки гемопоэтических клеток в клетках костного мозга или периферической крови по сравнению с клетками костного мозга или периферической крови, культивируемыми без указанного антитела. Один вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором гемопоэтические клетки и гемопоэтические клеткипредшественники являются лимфоидными клетками. Другой вариант осуществления изобретения отно

- 54 015706 сится к вышеописанному способу, в котором лимфоидные клетки являются макрофагами или Тклетками.

Другим объектом настоящего изобретения является способ уменьшения воспаления, индуцированного Ш-22 или Ш-20, который включает введение млекопитающему, имеющему воспаление, композиции, содержащей антитело по настоящему изобретению, в количестве, достаточном для уменьшения воспаления.

Другим объектом настоящего изобретения является способ уменьшения или ингибирования индуцированной Ш-22 и Ш-20 пролиферации или дифференцировки гемопоэтических клеток и гемопоэтических клеток-предшественников, который включает культивирование клеток костного мозга или периферической крови с композицией, содержащей антитело по настоящему изобретению, в количестве, достаточном для уменьшения пролиферации или дифференцировки гемопоэтических клеток в клетках костного мозга или периферической крови по сравнению с клетками костного мозга или периферической крови, культивируемыми без указанного антитела. Один вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором гемопоэтические клетки и гемопоэтические клетки-предшественники являются лимфоидными клетками. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором лимфоидные клетки являются макрофагами или Т-клетками.

Другим объектом настоящего изобретения является способ уменьшения воспаления, индуцированного Ш-22 и Ш-20, который включает введение млекопитающему, имеющему воспаление, композиции, содержащей антитело по настоящему изобретению, в количестве, достаточном для уменьшения воспаления.

Другим объектом настоящего изобретения является способ уменьшения или ингибирования индуцированной Ш-22 и Ш-20 пролиферации или дифференцировки гемопоэтических клеток и гемопоэтических клеток-предшественников, который включает культивирование клеток костного мозга или периферической крови с композицией, содержащей антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению, в количестве, достаточном для уменьшения пролиферации или дифференцировки гемопоэтических клеток в клетках костного мозга или периферической крови по сравнению с клетками костного мозга или периферической крови, культивируемыми без указанного антитела или фрагмента антитела. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором гемопоэтические клетки и гемопоэтические клетки-предшественники являются лимфоидными клетками. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором лимфоидные клетки являются макрофагами или Т-клетками.

Другим объектом настоящего изобретения является способ уменьшения воспаления, индуцированного Ш-22 и Ш-20, который включает введение млекопитающему, имеющему воспаление, композиции, содержащей антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению, в количестве, достаточном для уменьшения воспаления.

Другим объектом настоящего изобретения является способ уменьшения или ингибирования индуцированной Ш-22 и Ш-20 пролиферации или дифференцировки гемопоэтических клеток и гемопоэтических клеток-предшественников, который включает культивирование клеток костного мозга или периферической крови с композицией, содержащей антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению, в количестве, достаточном для уменьшения пролиферации или дифференцировки гемопоэтических клеток в клетках костного мозга или периферической крови по сравнению с клетками костного мозга или периферической крови, культивируемыми без антитела. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором гемопоэтические клетки или гемопоэтические клеткипредшественники являются лимфоидными клетками. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором лимфоидные клетки являются макрофагами или Тклетками.

Другим объектом настоящего изобретения является способ уменьшения воспаления, индуцированного Ш-22 и Ш-20, который включает введение млекопитающему, имеющему воспаление, композиции, содержащей антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению, в количестве, достаточном для уменьшения воспаления.

Другим объектом настоящего изобретения является способ подавления воспалительной реакции у млекопитающего, имеющего воспаление, который включает: (1) определение уровня сывороточного амилоидного белка А; (2) введение композиции, содержащей антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению в приемлемом фармацевтическом носителе; (3) определение уровня сывороточного амилоидного белка А после введения композиции; (4) сравнение уровня сывороточного амилоидного белка А на стадии (1) с уровнем сывороточного амилоидного белка А на стадии (3), при этом отсутствие увеличения или снижение уровня сывороточного амилоидного белка А свидетельствует о подавлении воспалительной реакции.

Другим объектом настоящего изобретения является способ лечения млекопитающего, страдающего воспалительным заболеванием, опосредуемым Ш-22 или Ш-20, который включает введение млекопитающему антагониста Ш-22 или Ш-20, уменьшающего воспаление, при этом указанный антагонист включает (1) антитело, фрагмент антитела или связывающий полипептид, который специфически связы

- 55 015706 вается с полипептидом или фрагментом полипептида ЕЕ-22КА (8Е0 ΙΌ N0: 3), или (ίί) полипептид или фрагмент полипептида ]Е-22КА (8Е0 ΙΌ N0: 3), и вызывает ослабление воспалительной активности ΙΕ22 (8Е0 ΙΌ N0: 6) или ΙΌ-20 (8Е0 ΙΌ N0: 8). Один вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором заболевание является хроническим воспалительным заболеванием. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором заболевание является хроническим воспалительным заболеванием, включающим воспалительное заболевание кишечника, неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, артрит, атопический дерматит или псориаз. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором заболевание является острым воспалительным заболеванием. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором заболевание является острым воспалительным заболеванием, включающим эндотоксемию, септицемию, синдром токсического шока или инфекционное заболевание. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором антитело, фрагмент антитела или связывающий полипептид далее включает радиоизотоп, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу, лекарственное средство или токсин.

Другим объектом настоящего изобретения является способ лечения млекопитающего, страдающего воспалительным заболеванием, опосредуемым ΙΌ-22 и ΙΌ-20, который включает введение млекопитающему антагониста ΙΌ-22 и ΙΌ-20, уменьшающего воспаление, при этом указанный антагонист включает (ί) антитело, фрагмент антитела или связывающий полипептид, который специфически связывается с полипептидом или фрагментом полипептида ЕЕ-22КА (8Е0 ΙΌ N0: 3), или (ίί) полипептид или фрагмент полипептида ЕЕ-22КА (8Е0 ΙΌ N0: 3), и вызывает ослабление воспалительной активности ΙΌ-22 (8Е0 ΙΌ N0: 6) или ΙΌ-20 (8Е0 ΙΌ N0: 8). Один вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором заболевание является хроническим воспалительным заболеванием. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором заболевание является хроническим воспалительным заболеванием, включающим воспалительное заболевание кишечника, неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, артрит, атопический дерматит или псориаз. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором заболевание является острым воспалительным заболеванием. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором заболевание является острым воспалительным заболеванием, включающим эндотоксемию, септицемию, синдром токсического шока или инфекционное заболевание. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором антитело, фрагмент антитела или связывающий полипептид далее включает радиоизотоп, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу, лекарственное средство или токсин.

Другим объектом настоящего изобретения является антитело, включающее моноклональное антитело, которое специфически связывается с антигенной детерминантой ]Е-22КА человека (8Е0 ΙΌ N0: 3), выбираемой из группы, включающей: (а) антигенную детерминанту, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 3 от аминокислоты 1 (Рго) до аминокислоты 6 (Авр); (Ь) антигенную детерминанту, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 3 от аминокислоты 26 (8ег) до аминокислоты 32 (Рго); (с) антигенную детерминанту, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 3 от аминокислоты 41 (Ьув) до аминокислоты 47 (Авр); (б) антигенную детерминанту, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2 от аминокислоты 49 (Уа1) до аминокислоты 62 (Сув); (е) антигенную детерминанту, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 3 от аминокислоты 41 (Ьув) до аминокислоты 62 (Сув); (!) антигенную детерминанту, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 3 от аминокислоты 84 (А1а) до аминокислоты 97 (8ег); (д) антигенную детерминанту, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 3 от аминокислоты 103 (ТНг) до аминокислоты 108 (Авр); (Н) антигенную детерминанту, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 3 от аминокислоты 130 (Агд) до аминокислоты 135 (Н1в); (ί) антигенную детерминанту, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 3 от аминокислоты 164 (О1у) до аминокислоты 166 (Ьув); (|) антигенную детерминанту, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 3 от аминокислоты 175 (Туг) до аминокислоты 179 (С1и); (к) антигенную детерминанту, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 3 от аминокислоты 193 (Ьув) до аминокислоты 196 (А1а); (1) антигенную детерминанту, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 3 от аминокислоты 203 (Ьув) до аминокислоты 209 (ТНг); (т) антигенную детерминанту, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 3; и (п) антигенную детерминанту, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 4; и уменьшает или нейтрализует активность ΙΌ-22 (8Е0 ΙΌ N0: 6) или ΙΌ-20 (8Е0 ΙΌ N0: 8) человека. Один вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному антителу, которое уменьшает или нейтрализует активность как ΙΌ-22 (8Е0 ΙΌ N0: 6), так и ΙΌ-20 (8Е0 ΙΌ N0: 8) человека. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному антителу, которое выбирают из группы, включающей: (а) моноклональное антитело мыши, (Ь) гуманизированное антитело, выделенное из антитела (а), (с) фрагмент антитела и (б) моноклональное антитело человека. Другой вариант осуществления изобретения относит

- 56 015706 ся к вышеописанному антителу, которое далее подвергают полиэтиленгликолированию. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному антителу, которое выбирают из группы, включающей: (а) моноклональное антитело мыши, (Ь) гуманизированное антитело, выделенное из антитела (а), (с) фрагмент антитела и (й) моноклональное антитело человека. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному антителу, которое далее подвергают полиэтиленгликолированию.

Другим объектом настоящего изобретения является способ лечения у субъекта патологического состояния, ассоциированного с активностью ГЕ-22ЕА, который включает введение эффективного количества антитела по настоящему изобретению, позволяющего лечить указанное патологическое состояние. Один вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором указанное патологическое состояние является хроническим воспалительным состоянием. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором указанное хроническое воспалительное состояние включает воспалительное заболевание кишечника, неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, артрит, атопический дерматит или псориаз. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором указанное патологическое состояние является острым воспалительным состоянием. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором указанное острое воспалительное состояние включает эндотоксемию, септицемию, синдром токсического шока или инфекционное заболевание.

Другим объектом настоящего изобретения является способ лечения млекопитающего, страдающего воспалительным заболеванием, опосредуемым Г1-22ЕА, который включает введение млекопитающему антагониста ГЕ-22ЕА, уменьшающего воспаление, при этом указанный антагонист включает антитело, фрагмент антитела или связывающий полипептид, который специфически связывается с полипептидом или фрагментом полипептида №-22ΒΛ (8Е0 ГО N0: 3), и уменьшает воспалительную активность. Один вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором заболевание является хроническим воспалительным заболеванием. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором заболевание является хроническим воспалительным заболеванием, включающим воспалительное заболевание кишечника, неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, артрит, атопический дерматит или псориаз. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором заболевание является острым воспалительным заболеванием. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором заболевание является острым воспалительным заболеванием, включающим эндотоксемию, септицемию, синдром токсического шока или инфекционное заболевание. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором антитело, фрагмент антитела или связывающий полипептид далее включает радиоизотоп, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер, пептидную метку, магнитную частицу, лекарственное средство или токсин. Другой вариант осуществления изобретения относится к вышеописанному способу, в котором антитело, фрагмент антитела или связывающий полипептид далее подвергают полиэтиленгликолированию.

Другим объектом настоящего изобретения является способ уменьшения воспаления, который включает введение млекопитающему, имеющему воспаление, композиции, содержащей антитело по настоящему изобретению, в количестве, достаточном для уменьшения воспаления.

Настоящее изобретение далее иллюстрируют приведенные ниже примеры, не ограничивающие объем изобретения.

Пример 1. Очистка полипептида №-22^2-^04 от трансфецированных клеток ВНК 570.

За исключением особо оговоренных случаев все операции были осуществлены при 4°С. Полипептид I^-22ЕΛ2 (полипептид зрелого растворимого рецептора, состоящий из остатков 23-231 8Е0 ГО N0: 13; полинуклеотиды, представленные в 8Е0 ГО N0: 12), С-конец которого слит с Рс4-фрагментом человека (8Е0 ГО N0: 14), получивший название I^-22ЕΛ2-Рс4, очищали нижеследующим способом. Примерно 16500 мл кондиционированной среды клеток ВНК 570, трансфецированных ^-22^2-^04, фильтровали через 0,2 мкм стерилизующий фильтр, после чего в указанную среду добавляли раствор ингибиторов протеазы до конечных концентраций, равных 0,001 мМ лейпептина (ВоегЫпдег-Маппйе1т, Гпй1апаройк, ГЦ), 0,001 мМ пепстатина (ВоегЫпдег-Маппйет) и 0,4 мМ пефаблока (ВоегЫпдег-Маппйет). Колонку с белком А50 Рогок (объем слоя 20 мл, Аррйей Вюкук!етк) заполняли и промывали 400 мл РВ8 (С1Ьсо/ВЕЬ). Затем через колонку пропускали дополненную кондиционированную среду со скоростью потока 15 мл/мин и промывали 800 мл РВ8 (ВЕЬ/С1Ьсо). ^-22^2-^04 элюировали из колонки 0,1М раствором глицина, рН 3,0, и 5 мл фракции собирали непосредственно в 0,5 мл 2М раствора трис-буфера, рН 7,8, доводя конечное значение рН во фракциях до 7,4.

Производительность колонки определяли путем вестерн-блоттинга восстанавливающих гелей для 8Э8-РАСЕ исходной среды с учетом пропускной способности колонки. При осуществлении вестернблоттинга использовали НЕР-меченное антитело против ГдС человека (Ате^ат), позволяющее обнаружить в исходной среде иммунореактивный белок с молекулярной массой 60000 Да, при этом в среде, прошедшей через колонку, белок полностью отсутствовал, что свидетельствует о полном улавливании белка. Фракции, элюированные белком А50, исследовали при помощи восстанавливающего геля для

- 57 015706

ЗЭЗ-РАСЕ. Указанный гель характеризовался наличием полосы, интенсивно окрашенной кумассии, при 60000 Да во фракциях 3-11. Фракции 3-11 объединяли.

Пул, элюированный белком А50, концентрировали с 44 мл до 4 мл, используя центробежный концентратор на 30000 Да ийгаГгее Вютах (объем 15 мл, М1Шроге). Фильтровальную колонку, заполненную гелем сефакрил З-300 (объем слоя 175 мл; Рйагтас1а), промывали 350 мл РВЗ (ВКБ/С1Ьсо). Концентрированный пул впрыскивали в колонку со скоростью потока 1,5 мл/мин и промывали 225 мл РВЗ (ВКБ/С1Ьсо). Элюированные пики собирали в виде 2 мл фракций.

Элюированные фракции исследовали с использованием восстанавливающих и невосстанавливающих гелей для ЗЭЗ-РАСЕ, окрашиваемых серебром (Сеио Тесйио1оду). Восстанавливающие гели для ЗЭЗ-РАСЕ, окрашенные серебром, характеризовались наличием интенсивно окрашенной полосы, соответствующей 60000 Да, во фракциях 14-31, в то время как невосстанавливающие гели для ЗЭЗ-РАСЕ, окрашенные серебром, характеризовались наличием интенсивно окрашенной полосы, соответствующей 160000 Да, во фракциях 14-31. Фракции 1-13 характеризовались наличием многих полос разного размера. Фракции 14-31 собирали, концентрировали до 22 мл, используя центробежный концентратор на 30000 Да ИНгаГгее Вютах (объем 15 мл, М1Шроге). Полученный концентрат фильтровали через 0,2 мкм стерилизующий фильтр Ас!гоб18с (Ра11 Согрогайои).

Концентрацию белка в концентрированных собранных фракциях определяли, осуществляя анализ ВСА (Р1егсе, КоскГоб, ББ), отбирали аликвоты материала и хранили при -80°С стандартными методами. Концентрация собранных фракций была равна 1,50 мг/мл.

Пример 2. Создание клеток ВаР3, экспрессирующих рецептор СКЕ2-4 (клетки ВаР3/СКЕ2-4), и клеток ВаР3, экспрессирующих рецептор СКЕ2-4 с рецептором Ш-22КА (клетки ВаГ3/СКЕ2-4/Ш-22КА).

Клетки ВаР3, экспрессирующие непроцессированный рецептор СРК2-4, были созданы с использованием 30 мкг описанного ниже вектора экспрессии СКЕ2-4. Клетки ВаЕ3, экспрессирующие рецептор СКЕ2-4, получили название ВаЕ3/СКЕ2-4. Указанные клетки, служащие в качестве контрольных клеток, затем трансфецировали непроцессированным рецептором Ш-22КА (патент США № 5965704) и использовали для описанного ниже скрининга активности ББ-22.

A. Создание клеток ВаР3, экспрессирующих рецептор СКБ2-4.

Непроцессированную последовательность кДНК рецептора СКЕ2-4 (номер доступа в банке генов СеиЬаик Ζ17227) выделяли из библиотеки кДНК линии клеток Дауди и затем клонировали в экспрессирующем векторе рΖР7Р.

Линию прелимфоидных клеток, зависящих от интерлейкина-3 (ББ-3), ВаЕ3, выделенную из костного мозга мыши (Ра1асю8 аиб З^ште!/, Се11 41:727-734, 1985; МаШеу-Ргеуо! е! а1., Мо1. Се11. ВюБ 6: 41334135, 1986), сохраняли в полной среде (среда КРМБ (БКН Вюкаеисе Бис., Ρό^χ;·!, КЗ), содержащей 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки, 2 нг/мл ББ-3 мыши (тББ-3) (К&Э, Мшиеаройк, М№), 2 мМ Б-д1ШаМах-1 ™ (С1Ьсо ВКБ), 1 мМ пирувата натрия (С1Ьсо ВКБ) и антибиотики РЗN (С1Ьсо ВКБ)). До осуществления электропорации получали СКΡ'2-4/рΖР7Р и очищали с помощью набора 0|адег1 Мах1 Ргер (О|адеи) в соответствии с инструкциями изготовителя. Для осуществления электропорации клетки ВаВ3 промывали один раз в бессывороточной среде КРМБ и затем ресуспендировали в бессывороточной среде КРМБ с плотностью клеток, равной 10⁷ клеток/мл. Один мл ресуспендированных клеток ВаР3 смешивали с 30 мкг плазмидной ДНК СКΕ2-4/рΖР7Р и переносили в отдельные камеры для электропорации одноразового применения (СБВС0 ВКБ). Клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин и подвергали двум последовательным ударам тока (800 Ф/300 В; 1180 Ф/300 В), создаваемым в устройстве для электропорации (СΕ^^-РΟКАТΟК™; СБВС0 ВКБ). По истечении 5минутного периода восстановления электропорированные клетки переносили в 50 мл полной среды и помещали в термостат на 15-24 ч (37°С, 5% СО2). Затем клетки центрифугировали и ресуспендировали в 50 мл полной среды, содержащей 2 мкг/мл пуромицина, в колбе Т-162 для выделения пула, устойчивого к пуромицину. Пулы трансфецированных клеток ВаР3, далее именуемых клетками ВаЕ3/СКЕ2-4, анализировали нижеописанным методом в отношении способности передавать сигналы. Кроме того, указанные клетки далее трансфецировали рецептором ББ-22КА в соответствии с приведенным ниже описанием.

B. Создание клеток ВаР3, экспрессирующих рецепторы СКЕ2-4 и Ш-22КА.

Клетки ВаЕ3/СКР2-4, экспрессирующие непроцессированный рецептор Ш-22КА, были созданы вышеописанным способом с использованием 30 мкг вектора экспрессии ББ-22КА. После восстановления отбирали трансфектанты, используя 200 мкг/мл зеоцина и 2 мкг/мл пуромицина. Клетки ВаР3/СКЕ2-4, экспрессирующие рецептор Ш-22КА, получили название клеток ВаЕ3/СКЕ2-4/Ш-22КА. Указанные клетки использовали для скрининга активности ББ-22, а также антагонистической активности в отношении ББ-22КА2.

Пример 3. Скрининг антагонистической активности в отношении ББ-22 с использованием клеток ВаΓ3/СКΕ2-4/I^-22КА при помощи анализа пролиферации с окрашиванием аламаровым синим.

А. Скрининг активности ББ-22 с использованием клеток ВаГ3/СКЕ2-4/ББ-22КА при помощи анализа пролиферации с окрашиванием аламаровым синим.

Очищенный белок ББ-22-СЕЕ (пример 4) использовали для исследования наличия пролиферирую

- 58 015706 щей активности в соответствии с приведенным ниже описанием. Очищенный полипептид 1Ь-22КА2-Ес4 (пример 1) использовали для оказания антагонистического воздействия на пролиферативную реакцию 1Ь-22 при осуществлении описанного ниже анализа.

Клетки ВаЕ3/СКР2-4/1Ь-22КА центрифугировали и промывали в полной среде (среда КРМ1 (6КН В1окс1епсе 1пс., Ьепеха, К8), содержащей 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки, 2 нг/мл 1Ь-3 мыши (ш1Ь-3) (Ρ&Ό, Мшпеаройк, МК), 2 мМ Ь-д1и!аМах-1™ (С1Ьсо ВКЬ)), 1 мМ пирувата натрия (С1Ьсо ВКЬ) и антибиотики Р^ (С1ВСО ВКЬ), но без ш1Ь-3 (далее определяется как среда без ш1Ь-3). Клетки центрифугировали и трижды промывали для полного удаления ш1Ь-3. Затем производили подсчет клеток в гемоцитометре. Клетки культивировали на 96-луночном планшете в количестве 5000 клеток/лунку в объеме 100 мкл/лунку, используя среду без ш1Ь-3.

Пролиферацию клеток ВаЕ3/СКЕ2-4/1Ь-22КА определяли с помощью белка Ш-22-СЕЕ, разведенного средой без ш1Ь-3 до концентраций, равных 50, 10, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,13, 0,06 нг/мл. К клеткам ВаЕ3/СКР2-4/1Ь-22КА добавляли 100 мкл разведенного белка. Общий объем анализируемой смеси был равен 200 мкл. Аналитические планшеты инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 3 дней, после чего добавляли аламаровый синий (Асситеб, СЫсадо, 1Ь) в количестве 20 мкл/лунку. Планшеты снова инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 24 ч. Окрашивание аламаровым синим позволяет получить флуорометрические данные, основанные на числе живых клеток и, таким образом, является методом прямого измерения пролиферации клеток по сравнению с отрицательным контрольным образцом. Планшеты снова инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 24 ч. Планшеты считывали в аппарате для чтения планшетов Ртах™ (Мо1еси1аг Осисек 8иппууа1е, СА), используя программу 8ойМах™ Рго, при длинах волн 544 (возбуждение) и 590 (испускание). Полученные результаты подтвердили наличие пролиферативной реакции клеток ВаР3/СКР2-4/1Ь-22КА под воздействием белка 1Б-22-СЕЕ в зависимости от дозы. Реакция, измеренная подобным образом, была примерно в 15 раз выше фоновой реакции при максимальной дозе, равной 50 нг/мл, и в 2 раза выше при минимальной дозе, равной 0,06 нг/мл. Клетки ВаР3 дикого типа и клетки ВаР3/СКЕ2-4 не пролиферировали под воздействием 1Б-22-СЕЕ, из чего следует, что цитокин 1Ь22 является специфичным к гетеродимерному рецептору СКР2-4/1Ь-22КА.

Для определения способности 1Ь-22КА2 оказывать антагонистическое воздействие на активность 1Ь-22 вновь осуществляли вышеописанный анализ, используя очищенный растворимый 1Ь-22КА2/Рс4. При объединении 1Ь-22 с 1Ь-22КА2 в количестве 10 мкг/мл реакция на 1Ь-22 при всех концентрациях снижалась до фонового значения. То, что присутствие растворимого 1Ь-22КА2 устраняло пролиферативные эффекты 1Ь-22, показывает, что данный полипептид является сильным антагонистом лиганда 1Ь-22. Указанный анализ может быть использован для испытания других антагонистов активности 1Ь-22 по настоящему изобретению, таких как антитела против 1Ь-22КА.

Пример 4. Очистка Ш-22-СЕЕ от клеток ВНК 570.

За исключением особо оговоренных случаев все операции были осуществлены при 4°С. Полипептид 1Ь-22, содержащий С-концевую метку С1иС1и (ЕЕ) (8ЕО ΙΌ NО: 15 или 8ЕО ΙΌ NО: 16), очищали описанным ниже способом. Кондиционированную среду клеток ВНК, экспрессирующих ΙΕ-22-СЕЕ, концентрировали в спиральном картридже Ашкоп 810Υ3 устройства РгоР1их А30. В концентрированную кондиционированную среду добавляли раствор ингибитора протеазы до конечных концентраций, равных 2,5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЕОТА, 81дта Сйеш1са1 Со. 8! Ьошк, МО), 0,003 мМ лейпептина (Воейппдег-Маппйет, [пб1апароНк, ΙΝ), 0,001 мМ пепстатина (Воейппдег-Маппйет) и 0,4 мМ РеГаЬ1ос (Воейппдег-Маппйет). Отбирали образцы для анализа и общий объем замораживали при -80°С до осуществления очистки. Общие концентрации белка-мишени в концентрированной кондиционированной среде определяли методом 8П8-РАСЕ и вестерн-блоттингом с использованием НКРконъюгированного антитела против ЕЕ.

Примерно 100 мл С-сефарозы против ЕЕ (полученной в соответствии с приведенным ниже описанием) выливали в стеклянную колонку ^а!егк АР-5 размером 5х10 см. Колонку заполняли проточным способом и уравновешивали в устройстве ВюСаб 8рпп! (Рег8ер!1уе В1о8ук!етк, Ргатшдйат, МА) физиологическим раствором с фосфатным буфером (РВ8), рН 7,4. Концентрированную кондиционированную среду оттаивали, фильтровали через 0,2-микронный стерилизующий фильтр, доводили рН до 7,4 и вводили в колонку в течение ночи со скоростью потока около 1 мл/мин. Колонку промывали 10 об. (СУ) физиологического раствора с фосфатным буфером (РВ8, рН 7,4) и пробку элюировали 200 мл РВ8 (рН 60), содержащим 0,5 мг/мл пептида ЕЕ (Апакрес, 8ап боке, СА), со скоростью 5 мл/мин. Используемый пептид ЕЕ имеет последовательность ΕΥМРМΕ (8ЕО ΙΌ NО: 15). Колонку промывали 10 об. РВ8, затем элюировали 5 об. 0,2М глицина, рН 3,0. Значение рН колонки, элюированной глицином, доводили до 7,0, используя 2 об. 5-кратного РВ8, и уравновешивали в РВ8 (рН 7,4). Фракции объемом 5 мл собирали в течение всего периода осуществления элюентной хроматографии, и контролировали оптическую плотность при 280 и 215 нм; также сохраняли и анализировали проточные и промывочные пулы. Фракции, соответствующие пику элюирования полипептида ЕЕ, анализировали в отношении белка-мишени методом 8П8-РАСЕ с окрашиванием серебром и вестерн-блоттинга с использованием НКР-конъгированного антитела против ЕЕ. Представляющие интерес элюированные фракции полипептида собирали и концен

- 59 015706 трировали с 60 до 5,0 мл при помощи центробежного концентратора с мембраной, отсекающей молекулярную массу 10000 Да (М1Шроге, ВебГогб, МА), в соответствии с инструкциями изготовителя.

Для отделения 1Ь-22-СЕЕ от других совместно используемых очищающих белков собранные элюированные фракции концентрированного полипептида подвергали воздействию РОВО8 НО-50 (сильная анионообменная смола компании Рег8ер0те Вю8у8!ет8, ЕгатшдЬат, МА) при рН 8,0. Содержимое колонки размером 1,0х6,0 см сливали и заполняли колонку проточным способом в устройстве ВюСаб 8ргш!. В колонку вводили противоионы и уравновешивали в 20 мМ трис-буфера, рН 8,0 (трис-буфер: гидроксиметиламинометан). Образец разводили в отношении 1:13 (для уменьшения ионной силы РВ8) и вводили в колонку Рого8 НО со скоростью 5 мл/мин. Колонку промывали 10 об. 20 мМ трис-буфера, рН 8,0, и элюировали 40 об. в градиенте 20 мМ трис-буфера/1М раствора хлорида натрия (№-1С1) со скоростью 10 мл/мин. Фракции объемом 1,5 мл собирали в течение всего периода осуществления хроматографии и контролировали оптическую плотность при 280 и 215 нм. Фракции, соответствующие пику элюирования, анализировали методом δΌδ-РАСЕ с окрашиванием серебром. Представляющие интерес фракции собирали и концентрировали до 1,5-2 мл в центробежном концентраторе с мембраной, отсекающей молекулярную массу 10000 Да (М1Шроге, ВебГогб, МА), в соответствии с инструкциями изготовителя.

Для отделения полипептида 1Ь-22-СЕЕ от свободного пептида ЕЕ и любых загрязняющих совместно используемых очищающих белков собранные концентрированные фракции очищали вытеснительной хроматографией на колонке размером 1,5x90 см с сефадексом 8200 (РЬагтааа, Р18са1а^ау, N1), уравновешенной РВ8, который вводили со скоростью потока 1,0 мл/мил в устройстве ВюСаб 8ргш!. Фракции объемом 1,5 мл собирали в течение всего времени осуществления хроматографии и контролировали оптическую плотность при 280 и 215 нм. Фракции, соответствующие пику элюирования, исследовали методом 8О8-ЕАСЕ с окрашиванием серебром и собирали только самые чистые фракции. Полученный материал представлял собой очищенный полипептид 1Ь-22-СЕЕ.

Очищенный материал вводили в колонку с 4 мл АсЕС^аи Е!ох (8!егодеие) для удаления любых оставшихся эндотоксинов. Образец четыре раза пропускали через РВ8-уравновешенную самотечную колонку и промывали колонку одним 3 мл объемом РВ8, который собирали вместе с очищенным образцом. Материал фильтровали через 0,2-микронный стерилизующий фильтр и хранили при -80°С до отбора аликвот.

При осуществлении вестерн-блоттинга с использованием гелей для 8П8-РАСЕ, окрашиваемых кумассии голубым и серебром, была получена одна основная полоса полипептида 1Ь-22-СЕЕ. Концентрацию белка в очищенном материале определяли при помощи анализа ВСА (Р1егсе, ВоскГогб, 1Ь), отбирали аликвоты белка и хранили при -80°С стандартными методами.

Для получения сефарозы против ЕЕ слой сефарозы с белком С объемом 100 мл (РЬагтааа, Р18са!аау, N1) трижды промывали 100 мл РВ8, содержащего 0,02% азида натрия, используя 0,45-микронное фильтрующее устройство с 500 мл №1деие. Гель промывали 6,0 об. 200 мМ триэтиноламина, рН 8,2 (ТЕА, 81дта, 8!. Ьош8, МО) и добавляли равный объем раствора антитела против ЕЕ, содержащего 900 мг антитела. Смесь инкубировали в течение ночи при 4°С, несвязанное антитело удаляли, промывая смолу 5 об. 200 мМ ТЕА. Смолу ресуспендировали в 2 об. ТЕА, переносили в соответствующий контейнер и добавляли диметилпимилимидат-2НС1 (Р1егсе, ВоскГогб, 1Ь), растворенный в ТЕА, до конечной концентрации, равной 36 мг/мл геля сефарозы с белком С, Гель встряхивали при комнатной температуре в течение 45 мин и удаляли жидкость, используя вышеуказанное фильтрующее устройство. Неспецифические участки геля затем блокировали, инкубируя в течение 10 мин при комнатной температуре с 5 об. 20 мМ этаноламина в 200 мМ ТЕА. Затем гель промывали 5 об. РВ8, содержащего 0,02% азида натрия, и хранили в данном растворе при 4°С.

Пример 5. Действие полипептида 1Ь-22 ш νί\Ό.

Мышей (самок, С57ВЕ/6Н в возрасте 8 недель; С1аг1е8 Вшег ЬаЬ8, Кшд8!ои, NΥ) распределяли в три группы. Предварительно стандартными методами был получен аденовирус, экспрессирующий полипептид 1Ь-22 (8ЕО ΙΌ NО: 6). В 0-й день мышам в первой (и=8) и второй (и=8) группах соответственно, парентерально или через хвостовую вену вводили аденовирус, экспрессирующий 1Ь-22, причем каждая мышь получала дозу, равную ~1х 10¹¹ частиц, в ~0,1 мл объеме. Третью группу (и=9) не подвергали никакому воздействию. На 12-й день мышей взвешивали и брали пробы крови. Осуществляли клинический анализ крови (СВС) и химический анализ сыворотки. В пробах крови животных, которым вводили аденовирус, экспрессирующий 1Ь-22, было обнаружено статистически значимое увеличение числа нейтрофилов и тромбоцитов по сравнению с группой животных, которым вводили исходный аденовирус. Кроме того, в группе животных, которым вводили аденовирус, экспрессирующий 1Ь-22, значительно уменьшилось число лимфоцитов и эритроцитов по сравнению с группой животных, которым вводили исходный аденовирус. У мышей, которым вводили аденовирус, экспрессирующий 1Ь-22, уменьшилась масса тела, в то время как у мышей, которым вводили исходный аденовирус, масса тела увеличилась. На 3-й день в сыворотке повысился уровень 1Ь-22 и понизился уровень глюкозы. Таким образом, у мышей, которым вводили аденовирус, экспрессирующий 1Ь-22, наблюдалась реакция острой стадии, которая может быть также инициирована другими провоспалительными цитокинами, такими как цитокины Т№-а, ΙΕ-1-β и

- 60 015706 др130. Реакция острой стадии представляет собой совокупность воспалительных реакций немедленного типа, инициируемых распознающими паттерн молекулами. Белки острой стадии обеспечивают усиленную защиту от микроорганизмов и модифицируют воспалительные реакции, воздействуя на направленную миграцию клеток и высвобождение медиаторов. Например, 8АА обладает сильной активирующей лейкоциты функцией, включающей индукцию хемотаксиса, усиление адгезии лейкоцитов к эндотелиальным клеткам и повышенный фагоцитоз. Понимание факторов, инициирующих и изменяющих величину и продолжительность реакции острой стадии, является важным шагом в создании новых методов лечения инфекционных и воспалительных заболеваний.

Полученные результаты позволяют предположить, что ГЬ-22 влияет на гемопоэз, т.е. на образование клеток крови ш νί\Ό. Таким образом, ГЬ-22 может обладать биологической активностью, воздействующей на разные стволовые клетки крови, в результате чего увеличивается или уменьшается число определенных дифференцированных клеток крови в специфической линии дифференцировки. Например, ГЬ-22, вероятно, уменьшает число лимфоцитов, что, по-видимому, происходит вследствие ингибирования коммитированных клеток-предшественников, образующих лимфоидные клетки. ГЬ-22 уменьшает также число эритроцитов, подтверждая мнение, что ГЬ-22 может опосредовать анемию, инфекционные, воспалительные и/или иммунные заболевания, воздействуя на клетки крови, участвующие в указанных процессах. Антагонисты ГЬ-22, такие как антитела или растворимый рецептор I^-22КΑ2, могут быть использованы в качестве терапевтических агентов при лечении указанных заболеваний.

Кроме того, эксперименты с использованием мышей, инфицированных аденовирусом, экспрессирующим ГЬ-22, позволяют предположить, что сверхэкспрессия ГЬ-22 увеличивает уровень нейтрофилов и тромбоцитов 1п у1уо. Известно, что существуют другие факторы (такие как цитокины и генымодификаторы), определяющие реакции на ГЬ-22 в организме животного. Тем не менее, полученные данные обоснованно подтверждают участие ГЬ-22 в гемопоэзе. Таким образом, ГЬ-22 и его рецепторы являются приемлемыми агентами/мишенями для диагностики и лечения разных заболеваний, таких как воспаление, иммунные нарушения, инфекции, анемия, рак крови и другие типы рака и тому подобные.

Пример 6. Трансгенные мыши, экспрессирующие ГЬ-22.

A. Создание трансгенных мышей, экспрессирующих ГЬ-22 мыши.

Фрагменты ДНК из трансгенного вектора, содержащего 5'- и 3'-концевые фланкирующие последовательности лимфоид-специфического промотора ЕрЬСК, ГЬ-22 мыши (8Е0 ГО N0: 10; полипептид, представленный в 8Е0 ГО N0: 11), интрон инсулина II крысы, кДНК ГЬ-22 и последовательность поли Агормона роста человека были получены стандартными методами и введены в оплодотворенные ооциты мышей В6С3Г1 (Тасошс, СегтаЩо^п, ΗΥ) стандартными методами микроинъецирования. См. публикацию Нодап, В. е! а1., Машри1айпд !Ье Моизе ЕтЬгуо. А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1й 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу Ргезз, 1994.

Среди 154 мышат с помощью лимфоид-специфического промотора ЕрЬСК были идентифицированы 25 мышей, трансгенных в отношении ГЬ-22 мыши. 11 трансгенных мышат умерли в течение нескольких часов после рождения, 9 трансгенных мышат с блестящей кожей были подвергнуты аутопсии в день рождения, и 2 мышонка выросли до взрослого состояния. У одного взрослого животного уровни экспрессии были низкими. Ткани подвергнутых аутопсии мышат были препарированы и гистологически исследованы в соответствии с приведенным ниже описанием.

Блестящая кожа новорожденных мышат, по-видимому, обусловлена повышенной жесткостью кожи, как если бы она высохла в результате отсутствия соответствующего ухода. Движения мышат также были затруднены.

B. Анализ генотипа и экспрессии у трансгенных мышей.

У новорожденных мышат в линии трансгенных мышей, экспрессирующих ГЬ-22 мыши, стимулированных промотором ЕрЬск, исследовали патологии в день рождения, после чего мышат умерщвляли для сбора тканей. Всем мышатам метили уши меткой с номером и во время умерщвления отмечали мышат, относящихся к фенотипу с блестящей кожей. Из 12 мышат 6 животных относились к фенотипу с блестящей кожей, при этом у двух животных был отмечен сильновыраженный фенотип. Животные с сильновыраженным фенотипом характеризовались низкой массой тела, плохой подвижностью, блестящей и очень сухой кожей. Кожу, взятую с левого бока каждого мышонка, замораживали в среде для заливки Т1ззие-Тек.

Генотипирование подтвердило, что блестящая кожа является хорошим индикатором трансгенного состояния при отсутствии данных об экспрессии. Из блоков замороженной кожи в криостате изготавливали срезы толщиной 7 мкм и окрашивали для выявления присутствия СЭ3, СЭ4, СЭ8, макрофагов мыши, В-клеток, СЭ80 и МНС класса II. Метод окрашивания включал связывание коммерчески доступных антител с тканью, обнаружение вторичного антитела, меченного пероксидазой, и осуществление взаимодействия с хромогеном ЭАВ для визуализации окрашивания.

Было обнаружено, что трансгенные животные характеризуются более высоким содержанием МНС класса II и СЭ80, которые окрашиваются соответственно в антигенпредставляющих клетках и дендритных клетках. С помощью маркера макрофагов было также обнаружено больше трансгенных клеток с

- 61 015706 сильновыраженным и не очень сильновыраженным фенотипом по сравнению с животными дикого типа, хотя указанные клетки были локализованы главным образом в верхних слоях дермы. Животные, которые были отнесены к сильновыраженным фенотипам, характеризовались наиболее интенсивным окрашиванием всех трех вышеуказанных маркеров, что свидетельствует о значительном увеличении числа и интенсивности клеток по сравнению с клетками дикого типа. Различия могут быть следствием разницы в уровне экспрессии №-22 у трансгенных мышат. Клетки, содержащие МНС класса II, были локализованы в нижних слоях дермы и расположены в виде свободных открытых кластеров, в то время как ΟΌ80положительные клетки располагались главным образом под дермой в мышечном/жировом слое или над ним. Две указанные популяции клеток, по-видимому, не перекрывают друг друга. Все другие маркеры характеризовались одинаковым окрашиванием у всех животных. Окрашивание мастоцитов толуидиновым синим позволило выявить незначительное различие или отсутствие различия между животными дикого типа и трансгенными животными.

С. Микроскопическое исследование тканей трансгенных мышей: гистология тканей трансгенных новорожденных мышат, экспрессирующих №-22, стимулированный промотором ТиБск.

Мышат из пометов трансгенных мышей, эспрессирующих №-22, гуманно умерщвляли в день рождения, и все тело фиксировали погружением в 10% забуференный формалин. 6 трансгенных и 2 нетрансгенных мышонка подвергали дальнейшему исследованию. Во время умерщвления у четырех из шести трансгенных животных была обнаружена блестящая кожа. Из фиксированных тканей изготавливали 5 срезов (продольный срез головы и поперечные срезы верхней и нижней части грудной клетки и верхней и нижней части брюшного отдела). Ткани погружали в парафин, подвергали стандартной обработке, изготавливали срезы толщиной 5 мкм (микротом 8ирсгси! Бипд 2065, Бека М1сгохух!стх, ν^^Γ, Сегтапу) и окрашивали Н&Е. Окрашенные ткани были исследованы под световым микроскопом (М1коп ЕсИрхе Е600, Ы1коп №с. МсМ11с, ΝΥ) ветеринарным патологоанатомом с сертификатом АС^Р.

При исследовании под микроскопом было обнаружено, что эпидермис двух трансгенных мышат был толще эпидермиса других шести мышей, включая контрольных животных. Ни у одного из мышей не были отмечены другие патологии кожи и других тканей. Характерные участки кожи из соответствующих областей грудной клетки и брюшного отдела фотографировали при 40-кратном увеличении при помощи присоединенной к микроскопу цифровой камеры Соо18пар (Корег 81спЕДс, Шс., 8ап Окдо, СА). Толщину эпидермиса определяли с помощью программного обеспечения для гистоморфометрического анализа (8сюп Инаде Гог \V^ηбо\νх (ЫШ Инаде), 8сюп Согр., Ргсбспск, МО, версия В4.0.2). Полученные результаты приведены в табл. 5.

Таблица 5

Генотип/фенотип	Средняя толщина кожи грудной клетки (мкм)	Средняя толщина кожи брюшного отдела (мкм)
Нетрансгенный/нормальный	5,2	5,4
Трансгенный/неблестящий	5,0	6,7
Трансгенный/блестящий	8,2	7,4
Трансгенный/все	7,1	7,1

Количество мышей было недостаточным для получения статистически значимых результатов; однако трансгенные мыши, в частности мыши с блестящей кожей, имели более толстый эпидермис по сравнению с трансгенными мышами без блестящей кожи и нетрансгенными контрольными животными. Трансгенные животные с блестящей кожей характеризовались более высоким уровнем экспрессии №-22, чем трансгенные мыши с неблестящей кожей; однако у указанных мышей не были определены уровни экспрессии. Полученные результаты позволили предположить, что №-22 играет определенную роль в возникновении псориаза, псориатического артрита, других воспалительных заболеваний кожи или других воспалительных заболеваний.

Пример 7. Действие полипептида ГБ-22 ш νί\Ό.

А. Индукция 8АА у мышей, инфицированных аденовирусом, экспрессирующим ББ-22.

Мышей (самок, С57ВБ/6Ы, в возрасте 8 недель; СИаг1сх Кгусг БаЬх, Ктдх!оп, ΝΥ) распределяли в три группы. Предварительно стандартными методами был получен аденовирус, экспрессирующий полипептид Ш-22 (8ЕО Ш ЫО: 6). В 0-й день мышам в первой (п=8) и второй (п=8) группах, соответственно, парентерально или через хвостовую вену вводили аденовирус, экспрессирующий ББ-22, причем каждая мышь получала дозу, равную ~1х 10¹¹ частиц, в ~0,1 мл объеме. Третью группу (п=8) не подвергали никакому воздействию. На 12-й день мышей взвешивали и брали пробы крови. На 20-й день исследования мышей умерщвляли, регистрировали массу тела и собирали кровь и ткани для анализа.

Осуществляли клинический анализ крови (СВС) и химический анализ сыворотки. На 12-й и 20-й

- 62 015706 день в пробах крови животных, которым вводили аденовирус, экспрессирующий Ш-22, было обнаружено статистически значимое увеличение числа нейтрофилов и тромбоцитов по сравнению с группой животных, которым вводили исходный аденовирус. Кроме того, в группе животных, которым вводили аденовирус, экспрессирующий Ш-22, на 12-й день значительно сократилось число лимфоцитов по сравнению с группой животных, которым вводили исходный аденовирус, но на 20-й день был обнаружен противоположный эффект. У мышей, которым вводили аденовирус, экспрессирующий Ш-22, уменьшилась масса тела, в то время как у мышей, которым вводили исходный аденовирус, масса тела увеличилась. В оба периода времени в сыворотке мышей, которым вводили аденовирус, экспрессирующий Ш-22, значительно понизился уровень глюкозы по сравнению с группой животных, которым вводили исходный аденовирус. Содержание сывороточного альбумина также значительно сократилось в оба периода времени. Уровни азота в мочевине крови значительно понизились на 20-й день. Уровни сывороточного глобулина в оба периода времени были значительно выше в группе животных, которым вводили аденовирус, экспрессирующий Ш-22, по сравнению с группой животных, которым вводили исходный аденовирус. При исследовании под микроскопом было установлено, что наблюдаемое гистоморфологическое изменение, приписываемое Ш-22, представляло собой тубулярную регенерацию в почке. Хотя указанное изменение не является необычным для мышей, в данной группе животных такое явление встречалось чаще и было более тяжелым. Нефропатия определяется как многоочаговая базофилия корковых клеток трубчатого эпителия.

Для проверки результатов и сбора дополнительных образцов был осуществлен дополнительный эксперимент, идентичный вышеописанному. В данном исследовании массу тела регистрировали через каждые три дня, пробы крови брали у мышей через 3 дня после инъекции аденовируса и мышей умерщвляли для сбора крови и тканей на 10-й день (п=4 в каждой группе) и 20-й день (п=4 в каждой группе). В пробах крови, полученных в группе животных, которым вводили аденовирус, экспрессирующий Ш-22, также было обнаружено повышенное число нейтрофилов и тромбоцитов по сравнению с группой животных, которым вводили исходный аденовирус. Указанный эффект был очевиден для нейтрофилов на 3-й день, хотя число тромбоцитов значительно не изменялось до 10-го дня. Кроме того, число лимфоцитов на 3-й и 10-й дни было значительно меньше в группе животных, которым вводили аденовирус, экспрессирующий Ш-22, по сравнению с группой животных, которым вводили исходный аденовирус, но данный показатель не увеличился на 20-й день, как это имело место в предыдущем исследовании. При осуществлении данного исследования у мышей, которым вводили аденовирус, экспрессирующий Ш-22, также наблюдалось снижение массы тела, в то время у мышей, которым вводили контрольный вирус или не подвергали никакому воздействию, масса тела увеличивалась. Показатели химического анализа сыворотки были сопоставимы с предыдущим исследованием. В данном исследовании были также подтверждены гистологические результаты тубулярной регенерации в почке, ассоциированной с аденовирусом, экспрессирующим Ш-22. Данный показатель соответствовал дополнительному обнаружению умеренного содержания мочевины белка у мышей, которым вводили аденовирус, экспрессирующий Ш-22 (20-й день).

Полученные результаты позволили предположить, что Ш-22 влияет на гемопоэз, т.е. образование клеток крови ш у1уо. Таким образом, Ш-22 может обладать биологической активностью, влияющей на разные стволовые клетки крови, в результате чего происходит увеличение или уменьшение определенных дифференцированных клеток крови в специфической линии дифференцировки. Например, Ш-22, вероятно, уменьшает количество лимфоцитов, по-видимому, вследствие ингибирования коммитированных клеток-предшественников, образующих лимфоидные клетки, что подтверждает мнение об участии Ш-22 в возникновении анемии, инфекционных, воспалительных и/или иммунных заболеваний вследствие воздействия на клетки крови, опосредующие данные процессы. Антагонисты Ш-22, такие как антитела или растворимый рецептор Ш-22КА2, могут быть использованы в качестве терапевтических агентов при лечении указанных заболеваний.

Кроме того, эксперименты с введением мышам аденовируса, экспрессирующего Ш-22, позволяют предположить, что сверхэкспрессия Ш-22 повышает уровень нейтрофилов и тромбоцитов ш у1уо. Известно, что существуют другие факторы (такие как цитокины и гены-модификаторы), опосредующие реакции на Ш-22 в организме животного. Тем не менее, полученные данные обоснованно подтверждают участие Ш-22 в гемопоэзе. Таким образом, Ш-22, антитела против Ш-22, растворимые рецепторы Ш22КА (например, 8Е0 ГО N0: 3) и антитела против Ш-22КА являются приемлемыми атентами/мишенями для диагностики и лечения разных заболеваний, таких как воспаление, иммунные нарушения, инфекции, анемия, рак крови и другие типы рака и т. п.

Взаимосвязь экспрессии Ш-22 с потерей массы тела, появлением белка 8АА острой стадии и нарушениями обмена веществ, о чем свидетельствует пониженное содержание глюкозы, альбумина и азота мочевины сыворотки, позволяет предположить, что I Ш-22 является цитокином, который действует на ранней стадии определенных воспалительных реакций. Мыши, которым вводили аденовирус, экспрессирующий Ш-22, могут достигать состояния хронического воспаления, характерного для ШБ, неспецифического язвенного колита, артрита, псориаза, псориатического артрита, астмы и т. п. заболеваний. Некоторые вредные воспалительные процессы могут быть ингибированы в результате использования антаго

- 63 015706 ниста ГЬ-22, такого как антитела против ГЬ-22, его рецепторы, такие как растворимые рецепторы ГЬ22КА (например, 8ЕЦ ГО N0: 3), антитела против ГЬ-22ВА и т.п.

B. ГЬ-22 является провоспалительным цитокином: уровень 8АА в сыворотке мышей, которым вводили аденовирус, экспрессирующий ГЬ-22.

Для определения уровня 8АА у мышей, которым вводили аденовирус, экспрессирующий ГЬ-22, осуществляли анализ ЕЬГ8А, используя набор для иммуноанализа 8АА мыши в соответствии с инструкциями по его применению (Вюзоигсе Гп!егпабопа1, СаНГогша, И8А). Разведенные эталоны и неизвестные вещества культивировали вместе с НКР-конъюгированным антителом против 8АА мыши на аналитических планшетах, предварительно сенсибилизированных антителом против 8АА мыши. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С и затем промывали в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору. Планшеты проявляли в течение 15 мин при комнатной температуре, используя ТМВ, и прекращали взаимодействие, добавляя 2М раствор Н₂80₄. Оптическую плотность при 450 нм измеряли в устройстве 8рес!готах 190 (Мо1еси1аг Ье^'Кез, СаНГогша, И8А). Полученные данные анализировали при помощи программы 8оГ!тах Рго (Мо1еси1аг Ье^'Кез, СаНГгша, И8А) и Ехсе1 (МкгозоГ! Согр., '№азЫпд!оп, И8А).

У мышей, инфицированных аденовирусом, экспрессирующим ГЬ-22, уровни т8АА были в 10 раз выше, чем у контрольных животных, которым вводили исходный аденовирус.

C. Анализ методом проточной цитометрии мышей, инфицированных аденовирусом, экспрессирующим ГЬ-22.

Для анализа воздействия экспрессии ГЬ-22 аденовирусом ш νίνο у мышей С57ВЬ/6№ инфицированных аденовирусом, зкспрессирующим ГЬ-22, на 10-й и 20-й дни после инфицирования удаляли периферическую кровь, селезенку и костный мозг. В пробирки с гепарином вводили примерно 100 мкл крови и путем гипотонического лизиса удаляли эритроциты (клетки лизировали в 4,5 мл бН₂0 в течение ~5 с и добавляли 1,5 мл 3,6% №С1). Селезенки измельчали между двумя матированными предметными стеклами, выделенные клетки пропускали через мембрану №1ех (сетчатый фильтр для клеток) и осаждали. Костный мозг получали, измельчая одну бедренную кость в ступке пестиком и пропуская клетки через сетчатый фильтр для клеток (Еа1соп). Клетки ресуспендировали в промывочном буфере для ЕАС8 (промывочный буфер=НВ88/1% В8А/10 мм НЕРЕ8), производили подсчет в трипановом синем и отбирали аликвоты 1 х 10⁶ жизнеспособных клеток каждого типа в 5-мл полистирольные пробирки. Клетки промывали и осаждали, затем инкубировали в течение 20 мин на льду с коктейлем из меченных флуоресцентным маркером (ЕГТС, РЕ и СуСйготе) моноклональных антител (РйагМтдеп, 8ап О1едо, СА), распознающих разные маркеры на поверхности клеток, используемых для идентификации субпопуляций определенных иммунокомпетентных клеток. Указанными маркерами являются нижеследующие маркеры (перечисленные по три в испытанных группах). Окрашивание крови: СЭ3, Сг1 и В220; окрашивание селезенки: (3)621., С1)44 и С1)+ СО21, С1)2.3 и В220; ГдО, ГдМ и В220; СО11Ь, Сг1 и СО8; окрашивание костного мозга: СО11Ь, Сг1, СЭ3; ГдО, ГдМ и В220. Клетки промывали 1,5 мл промывочного буфера и осаждали, затем ресуспендировали в 0,4 мл промывочного буфера и анализировали в устройстве ЕАС8сап при помощи программного обеспечения Се110иез1 (Вес!оп Окктзоп, МошИаш У|е\\\ СА).

Было обнаружено, что фракция нейтрофилов в крови мышей, которым вводили аденовирус, экспрессирующий ГЬ-22, была увеличена в 4-13 раз на 10-й день и в 2-3 раза на 20-й день. На 10-й день указанное изменение вызывало сопутствующее сокращение фракции лимфоцитов и моноцитов в крови. Было обнаружено, что в костном мозге общее число В-клеток уменьшилось в ~1,5 раза, в то время как процентное количество зрелых В-клеток в кровотоке увеличилось, и общее число незрелых В-клеток немного сократилось на 10-й день. На 20-й день многие вышеуказанные изменения отсутствовали, хотя было обнаружено небольшое увеличение фракции зрелых В-клеток в кровотоке. В селезенке общее число Вклеток было немного меньше (в 1,5-2 раза) в оба дня, в то время как на 20-й день фракция В-клеток краевой зоны (СЬ21+СЬ23-В220+) увеличилась в 2 раза и число фолликулярных В-клеток (СО21+СЬ23+В220+) сократилось в 2 раза. Считается, что В-клетки краевой зоны являются первой линией защиты от патогенов, так как они более чувствительны к В-клеточным митогенам (например, ЬР8), чем более распространенные фолликулярные В-клетки, и, встречая родственный антиген, они очень быстро дифференцируют с образованием антителосекретирующих клеток. Вполне возможно, что ГЬ-22 усиливает превращение фолликулярных В-клеток в В-клетки краевой зоны или избирательно уничтожает менее зрелые фолликулярные клетки. Изменение числа В-клеток, обнаруженное в костном мозге, может отражать повышенную дифференцировку пре/про-клеток и/или незрелых В-клеток или усиленный приток циркулирующих В-клеток из крови/селезенки и, возможно, одновременное увеличение экспорта незрелых В-клеток в периферические области. Фактическое число зрелых В-клеток не увеличивается, поэтому ГЬ-22 не может усиливать их пролиферацию. Альтернативно ГЬ-22 может блокировать, уменьшать или ингибировать дифференцировку незрелых В-клеток и таким образом увеличивать относительное представление зрелых В-клеток.

Ό. Нейтрализация ГЬ-22ВА2-Ес4 активности ГЬ-22 т νίνο: анализ 8АА методом ЕЬГ8А, показывающий, что экспрессия 8АА, индуцированная ГЬ-22, подавляется инъецированием ГЬ-22ВА2-Ес4.

Для определения способности ГЬ-22ВА2 ингибировать индукцию 8АА под воздействием ГЬ-22 мы

- 64 015706 шей (самки, С3Н/НЕ1, в возрасте 8 недель; Часккоп ЬаЬк, Ваг НагЬог, МЕ) распределяли в пять групп по три животных в каждой группе и инъецировали внутрибрюшинно белки, как показано в приведенной ниже табл. 6.

Таблица 6

№ группы	11,-22	ΙΓ-22ΚΑ2
Группа 1:	-	-
Группа 2:	-	100 мкг
Группа 3:	3 мкг	-
Группа 4:	3 мкг	20 мкг
Группа 5:	3 мкг	100 мкг

Ш-22ВА2 инъецировали мышам за 15 мин до инъекции Ш-22. Оба белка инъецировали внутрибрюшинно. У каждой мыши брали пробу крови до указанного воздействия и затем через 2 и 6 ч после воздействия. Из каждой пробы получали сыворотку для измерения 8АА и Ш-22.

Анализ ЕЫ8А осуществляли в соответствии с приведенным ранее описанием для определения уровня 8АА у мышей, подвергнутых воздействию ΙΩ-22 и растворимого рецептора для Ш-22, Ш-22ВА2Ес4 по настоящему изобретению. У мышей, которым вводили 3 мкг Ш-22 вместе с Ш^ВАЛ-Е^ в концентрации 20-100 мкг, наблюдалось снижение уровня 8АА, индуцированного Ш-22, до фоновых уровней, из чего следует, что Ш-22ВА2 подавляет индукцию 8АА, вызываемую Ш-22 ш у1уо.

Пример 8. Экспрессия Ш-22 в модели воспалительного заболевания кишечника у мышей.

Воспалительное заболевание кишечника (ШИ) является многофакторным заболеванием двух типов: неспецифический язвенный колит (ИС) и болезнь Крона (СИ). Этиология указанных заболеваний в настоящее время не известна и имеет разные клинические проявления. Неспецифический язвенный колит ограничен ободочной кишкой, и его симптомы включают кровавый понос, потерю массы тела и боль в брюшной полости. Макроскопические признаки неспецифического язвенного колита включают образование проникающих язв и укорачивание ободочной кишки. В отличие от этого болезнь Крона может поражать также другие отделы кишечника. Симптомы данного заболевания включают понос (который менее часто бывает кровавым, чем в случае неспецифического язвенного колита), небольшую лихорадку и боль. Макроскопические признаки включают фиброзные и стенозированные поражения кишечника в виде стриктуры, глубокие язвы, трещины и свищи.

Существует несколько животных моделей, имитирующих указанные болезни человека. Три модели колита, обычно используемые для скрининга новых лекарственных средств, включают модель колита у крыс, индуцированного 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (Т№8), модель переноса Т-клеток у мышей и модель колита у мышей, индуцированного декстран-сульфатом натрия (Ό88). Модель Ό88индуцированного колита была создана из модели, разработанной д-ром С. Мерфи с использованием системы оценки индекса активности заболевания (8.К8. МийЬу, Тгеа!теп! оГ Иех!гап 8и1£а!е ЗобштЧпбисеб Миппе Со11бк Ьу бИгасо^шс Сус1окрогш, И1декйуе И1кеакек апб 8с1епсек, Уо1. 38, №. 9 (8ер!етЬег 1993), рр.1722-1734).

В настоящем исследовании острый колит у мышей вызывали путем введения Ό88 в питьевой воде в течение 6 дней. У животных наблюдалась потеря массы тела и кровавый понос, имитирующие состояние субъектов, страдающих неспецифическим язвенным колитом. Механизм поражения, вызываемого Ό88, полностью не исследован, но считается, что Ό88 вызывает неспецифическую воспалительную иммунную реакцию и имитирует воздействия окружающей среды на кишечник. Возможно, что образуется Н₂8, который может быть токсичным для клеток. Кроме того, происходят изменения люминальной бактериальной флоры. В ободочной кишке были обнаружены активированные моноциты, макрофаги и мастоциты. Медиаторами для всех трех животных моделей являются воспалительные простагландины, метаболиты лейкотриена и цитокины.

А. Метод.

Колит вызывали, скармливая Ό88 самкам мышей 8\\зкк VеЬк!е^, предоставленным компанией СЬаг1ек В1уег ЬаЬогаЮпек. В начале исследования мыши находились в возрасте 10 и 11 недель. Одни мыши получали 4% Ό88 в питьевой воде в течение 6 дней (экспериментальные мыши), и другие мыши получали только обычную питьевую воду (контрольные мыши). Использовали клиническую оценку индекса активности заболевания (ИАЦ, которая включает совокупность измерений, включающих качество стула, скрытое кровотечение и потерю массы тела. Данные ^ΑI получали ежедневно для каждой мыши, начиная с первого дня после введения Ό88. Через 6 дней Ό88 удаляли из питьевой воды экспериментальных мышей. Состояние всех мышей контролировали на основании клинической оценки ^ΑI до умерщвления на 2-й, 7-й или 10-й дни с начала исследования. Во 2-й и 7-й дни умерщвляли четырех мышей, подвергнутых воздействию Ό88, и одну контрольную мышь. В 10-й день умерщвляли четырех мышей, подвергнутых воздействию Ό88, и двух контрольных мышей. У всех мышей после умерщвления измеряли длину ободочной кишки. Срезы ободочной кишки фиксировали в 10% нейтральном забуфе

- 65 015706 ренном формалине для осуществления гистологического анализа или замораживали для экстракции мРНК.

B. Гистологическая оценка и оценка индекса активности заболевания (ЭАГ).

Гистологический индекс оценивали методом, описанным в ссылке 1. Патологоанатом вслепую оценивал срезы ободочной кишки в отношении образования крипт, гиперплазии эпителия, деформации и воспаления.

Каждую мышь ежедневно включали в определенную категорию на основании клинической оценки с учетом потери массы тела, консистенции стула и кишечного кровотечения. Более высокие оценки присваивали за большую потерю массы тела, диарею и кровотечение. Ежедневная оценка для каждой мыши представляла собой среднее значение, полученное на основании трех результатов/наблюдений.

C. Результаты.

Длина ободочной кишки у мышей, подвергнутых воздействию Ό88, на 7-й и 10-й дни была несколько короче, чем у контрольных мышей, но полученные результаты не могут быть статистически значимыми (не проверены статистическим методом). Клинические оценки ЬАГ отражали усиление симптомов заболевания у мышей, подвергнутых воздействию Ό88, которые были аналогичны симптомам, наблюдаемым в указанной модели в прошлых исследованиях. Скрытое кровотечение было самым сильным примерно на 4-й и 5-й дни, в то время как частый жидкий стул преобладал на 6-й и 7-й дни. Результаты гистопатологии показывают, что оценки заболевания отличались от контрольных животных во все дни умерщвления, особенно на 7-й (максимум) и 10-й дни. Гистопатологические оценки были следующими: контрольные животные=0,5, мыши, подвергнутые воздействию Ό88, на 2-й день=8,8, мыши, подвергнутые воздействию Ό88, на 7-й день=21, мыши, подвергнутые воздействию Ό88, на 10-й день=18. Клинические и гистопатологические оценки показывают, что мыши, подвергнутые воздействию Ό88, характеризуются значительным поражением ободочной кишки по сравнению с контрольными животными. Замороженные образцы ткани использовали позже для определения мРНК в соответствии с приведенным ниже описанием.

Ό. Экспрессия РНК ГЬ-22 в ткани образцов ободочной кишки мыши, пораженной ГВЬ, определяемая методом ЕТ-РСЕ.

Для определения относительной экспрессии РНК ГЬ-22 мыши (8Е0 ГО N0: 10; 8Е0 ГО N0: 11) в модели воспалительного заболевания кишечника собирали дистальные отделы ободочной кишки мышей, подвергнутых воздействию Ό88, и быстро замораживали в жидком азоте. В данном эксперименте мышей подвергали воздействию Ό88 и получали образцы на 2-й, 7-й и 10-й дни после воздействия. Образцы также получали у здоровых, не подвергнутых воздействию мышей. РНК выделяли из образцов при помощи стандартного набора Е№аку М1йргер™ (01адеп, Уа1епс1а, СА) в соответствии с инструкциями изготовителя.

Для осуществления реакций ЕТ-РСЕ использовали одностадийную систему для ЕТ-РСЕ с платиновой меткой 8ирегкспр! (Ь1Ге Тесйпо1од1ек, СаййегкЬигд, МО). Каждая 25 мкл реакционная смесь включала следующие компоненты: 12,5 мкл 2-кратного реакционного буфера, 0,5 мкл (20 пмоль/мкл) 2С39289 (8Е0 ГО N0: 17), 0,5 мкл (20 пмоль/мкл) 2С39290 (8Е0 ГО N0: 18), 0,4 мкл смеси полимераз ЕТ/Тад, 10 мкл воды без РНКазы, 1,0 мкл общей РНК (100 нг/мкл). Амплификацию осуществляли следующим образом: один цикл при 50°С в течение 30 мин, затем 35 циклов при 94°С, 30 с; 58°С, 30 с; 72°С, 60 с; амплификацию прекращали после конечного удлинения цепи при 72°С в течение 7 мин. 8-10 мкл продукта реакции РСЕ подвергали стандартному электрофорезу в 2% агарозном геле. Правильно прогнозированный размер фрагмента кДНК определяли по слабой полосе в двух образцах, полученных на 2-й день. Сильная полоса была обнаружена в двух из трех образцов, полученных на 7-й день, в то время как в третьем образце, полученном на 7-й день, образовалась очень сильная полоса. Сильная полоса образовалась в трех образцах, полученных на 10-й день. И наконец, в двух нормальных контрольных образцах не образовалось ни одной полосы. Полученные результаты позволяют предположить, что повышенное содержание ГЬ-22 может иметь место в определенных типах воспалительных реакций в ободочной кишке, включая реакции, связанные с ГВЬ, ИС и СО. Полученные данные суммированы в приведенной ниже табл. 7, в которой относительная экспрессия оценена следующим образом: 0 = отсутствие полосы, 1 = слабая полоса, 2 = сильная полоса, 3 = очень сильная полоса.

- 66 015706

Таблица 7

Ткань	Относительная экспрессия (0-3)
Нормальная ободочная кишка	0
Нормальная оболочная кишка	0
2-ой день после воздействия	1
2-ой день после воздействия	1
7-ой день после воздействия	3
7-ой день после воздействия	2
7-ой день после воздействия	2
10-ый день после воздействия	2
10-ый день после воздействия	2
10-ый день после воздействия	2

Пример 9. Снижение уровней 1Ь-6 и 8АА под воздействием 1Й-22КА2 в модели артрита, индуцированного коллагеном (С1А), у мышей.

А. Модель артрита, индуцированного коллагеном (С1А), у мышей.

Самцов мышей ЭВА/Н (баскзог! ЬаЬз) в возрасте десяти недель распределяли в 3 группы по 13 мышей в каждой. На 21-й день животным подкожно инъецировали 50-100 мкл 1 мг/мл коллагена типа II цыпленка в составе полного адъюванта Фрейнда (полученного в компании Сйоп6гсх, Кебто^, ^А) и через три недели в 0-й день указанным животным инъецировали 100 мкл (25 мкг) липополисахарида (ЬР8) из Е. сой 0111:В4, полученного в количестве 250 мкг/мл из лиофилизованной аликвоты (81дта, 8!. Ьошз, МО). 1Й-22КА2 вводили в виде внутрибрюшинной инъекции 3 раза в неделю в течение 4 недель с 0-го дня до 25-го дня. Каждому животному в первых двух группах вводили 100 или 10 мкг 1Й-22КА2 в виде одной дозы и животным в третьей группе вводили контрольным носитель, РВ8 (Ьг£е Тесйпо1од1ез, КосктШе, МО). После инъекции ЬР8 у животных появлялись симптомы артрита, при этом у большинства животных воспаление возникало в течение 2-3 недель. Степень тяжести заболевания оценивали в каждой лапе, измеряя толщину лапы при помощи штангенциркуля, и присваивали клиническую оценку (0-3): 0 = нормальная, 0,5 = воспаление пальцев, 1 = слабое воспаление лапы, 2 = среднее воспаление лапы и 3 = сильное воспаление лапы.

Контроль заболевания.

Признаки воспаления лап возникали у животных вскоре после второй инъекции коллагена, причем у некоторых животных признаки воспаления пальцев могут возникать до второй инъекции коллагена. У большинства животных артрит возникает в течение 2-3 недель после повторной иммунизации, но для возникновения заболевания может потребоваться более продолжительный период времени. Частота возникновения заболевания в данной модели обычно составляет 95-100%, и при использовании в исследовании 40 животных обычно можно обнаружить 0-2 животных, не реагирующих на указанную стимуляцию (выявляемых через 6 недель наблюдения). Следует отметить, что сразу же после возникновения заболевания начинается характерное временное воспаление лап или пальцев с разной степенью тяжести. По указанной причине считается, что животное не поражено заболеванием до появления заметного постоянного опухания лапы.

Для определения степени заболевания в лапах производили ежедневное обследование всех животных и выставляли клиническую оценку качественного состояния каждой лапы. У каждого животного ежедневно оценивали состояние 4 лап в отношении тяжести клинического заболевания. Для определения клинической оценки лапа была разделена на 3 зоны: пальцы, сама лапа и лучезапястный или голеностопный сустав. Степень и тяжесть воспаления в указанных зонах определяли, обследуя все пальцы в отношении опухших суставов, сломанных когтей или покраснения, наличия отека или покраснения в лапах и утраты анатомической демаркации между сухожилиями или костями и оценивая лучезапястный или голеностопный сустав в отношении отека или покраснения и распространения воспаления по всей лапе. Оценка, равная 1, 2 или 3, во-первых, была основана на восприятии тяжести заболевания и, во-вторых, на числе пораженных зон. Ниже показаны возможные клинические оценки.

Клиническая оценка.

= нормальная лапа;

0,5 = заболеванием поражен один или несколько пальцев, но воспалены только пальцы;

= слабое воспаление лапы (1 зона), которое может охватывать один или несколько пальцев;

= среднее воспаление лапы, которое может охватывать пальцы и/или запястье/голеностоп (2 зоны);

= сильное воспаление лапы, запястья/голеностопа и некоторых или всех пальцев (3 зоны).

О возникновении заболевания свидетельствует качественная оценка воспаления, соответствующая 2 или большему значению, которая сохраняется в течение ночи (в течение двух последовательных дней).

- 67 015706

Регистрируют дату возникновения заболевания, которую определяют как первый день возникновения заболевания у животного.

В течение всего эксперимента у животных брали пробы крови для контроля уровней антител против коллагена в сыворотке. Животных умерщвляли на 21-й день и собирали кровь для осуществления клинического анализа крови (СВС) и сыворотки. Одну пораженную лапу каждого животного помещали в 10% ХВЕ для гистологического исследования и одну лапу замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С для осуществления анализа мРНК. Кроме того, собирали половину селезенки, половину тимуса, половину брыжеечных лимфатических узлов, одну долю печени и левую почку для последующего осуществления анализа РНК, а также половину селезенки, половину тимуса, половину брыжеечных лимфатических узлов, остальную часть печени и правую почку помещали в 10% НВЕ для гистологического исследования. Сыворотку собирали и замораживали при -80°С для анализов иммуноглобулина и цитокинов.

Не было обнаружено статистически значимой разницы между группами животных при анализе оценок поражения лап и данных измерения, хотя предположительно в одной группе животных, которым вводили I^-22КА2, была выявлена задержка в возникновении заболевания и прогрессировании воспаления лап. Не было обнаружено существенных различий между группами животных в отношении изменений массы тела, параметров СВС или уровней антитела против коллагена. Результаты, полученные на начальной стадии исследования, показывают, что I^-22КА2 не оказывает вредного воздействия на массу тела, эритроциты или лейкоциты или продуцирование антител но может уменьшать воспаление. В настоящее время ведутся исследования дозировки, механизма действия и эффективности (см., например, пример 10).

B. Данные анализа ЕЫ8А образования антител против коллагена в модели СЧА у мышей.

У мышей в модели индуцированного коллагеном артрита пробы сыворотки брали в 0-й, 7-й, 14-й, 21-й и 28-й дни относительно даты стимуляции ЬР8 (0-й день) (см. приведенный выше пример 9А). Пробы сыворотки анализировали методом ЕЫ8А в отношении титров антител против коллагена. Не было обнаружено статистически значимого воздействия I^-22КА2 в группах животных, которым вводили 100 или 10 мкг, на уровни антител против коллагена по сравнению с контрольным животными, которым вводили РВ8. Ниже приведено описание методов осуществления анализа ЕЫ8А образования антител против коллагена и материалов, используемых при осуществлении указанных методов.

При осуществлении анализов ЕЫ8А образования антител против коллагена были использованы 96луночные титрационные микропланшеты Мах1вогр (N^N0, Косйев1ег, ΗΥ), коллаген типа ΙΙ цыплят (Сйопбгех, Кебтопб, ’№А), суперблок (Р1егсе, КоскГогб, Ш), конъюгированное с пероксидазой из хрена (НКР) антитело против ^С+А+М (Н+Ь) мыши ^утеб, 8ои!Н 8ап Егапщвсо, СА) и субстрат на основе дигидрохлорида о-фенилендиамина (Р1егсе, КоскГогб, Ш). При осуществлении указанных анализов использовали разбавляющий буфер В для ЕЫ8А (РВ8+0,1% В8А+0,05% твина (81дта, 8ΐ. Ьошв, МО)), промывочный буфер С для ЕЫ8А (РВ8+0,05% твина) и проявляющий буфер Ό №уо (0,063М цитрата натрия, 0,037М лимонной кислоты), Н₂О₂ (81дта) и 1н. раствор Н₂80₄ (У^К, ТикуШа, -№А).

Примерно 100 мкл периферической крови, полученной позади глазницы, вводили в пробирки сепаратора сыворотки (Вее!оп Оюктвоп). Сыворотку собирали центрифугированием (2-3 мин, ускорение 16000хд, 4-6°С) и хранили при -20°С до осуществления анализа. Для определения уровней Ι§ антитела против коллагена планшеты NυNС сенсибилизировали 10 мкг/мл коллагена типа ΙΙ цыпленка (Сйопбгех, Кебтопб, VА) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали промывочным буфером С для ЕЫ8А, блокировали (5 мин при комнатной температуре) суперблоком (Р1егсе, КоскГогб, Ш) и промывали промывочным буфером С для ЕЫ8А. Образцы разведенной сыворотки (5-кратно разведенной в разбавляющем буфере В для ЕЫ8А в отношении от 1:5000 до 1:625000) помещали на планшеты для ЕЫ8А в трех экземплярах и инкубировали планшеты в течение ночи при 4°С. После инкубации планшеты промывали промывочным буфером С для ЕЫ8А и добавляли меченный пероксидазой Ес-фрагмент козы против Ι§ мыши ^утеб, 1:2000 в разбавляющем буфере В для ЕЫ8А). Планшеты инкубировали (при комнатной температуре 90 мин), снова промывали промывочным буфером С для ЕЫ8А и определяли активность НКР, используя субстрат на основе дигидрохлорида о-фенилендиамина (10 мл буфера Ό Nоνо+1 таблетка 0РЭ+10 мкл Н₂О₂, Р1егсе). Реакцию прекращали, добавляя 1н. раствор Н₂80₄. Относительную оптическую плотность образцов сыворотки при разведении в отношении 1:25000 измеряли при 490 нм в устройстве 8рес!га МАХ 190 и полученные данные анализировали при помощи программного обеспечения 8ойМах Рго (Мо1еси1аг 8еуюев Согрогайоп, Ра1о Айо, СА).

C. Анализ ΙΕ-6 и 8АА в модели СЧА у мышей.

У мышей, страдающих СЧА, брали пробы сыворотки в 0-й день (см. приведенный выше пример 9А) через 4 ч после внутрибрюшинного введения 25 мкг ЬР8. Пробы исследовали в отношении концентраций ΙΕ-6 и сывороточного амилоидного белка А (8АА) при помощи наборов для осуществления анализа ЕЫ8А, приобретенных в компании Вювоигсе ИЛегпаЕогий (СатагШо, СА), в соответствии с инструкциями изготовителя.

В группах мышей, подвергнутых воздействию 100 мкг I^-22КА2, 10 мкг I^-22КА2, и мышей, кото

- 68 015706 рым вводили РВ8, уровни №-6 были соответственно равны 9651±1563, 1086511478 и 1500612099 пг/мл. Концентрация Ш-6 в группе мышей, страдающих СЧА, которым вводили 100 мкг дозу Ш-22КА2, была значительно ниже по сравнению с аналогичным показателем у контрольных мышей, которым вводили РВ8, при р=0,0351. Статистическую значимость высчитывали, используя РЬ§Б Фишера, при 5%-м уровне значимости (АВАСИ8 Сопсер!к, ШС, Вегке1еу, СА).

Кроме того, в группах мышей, которым вводили 100 мкг Ш-22КА2, 10 мкг Ш-22КА2, и в группах контрольных мышей, которым вводили РВ8, концентрации 8АА были, соответственно, равны 381140, 348137 и 490150 мкг/мл. В группе мышей, страдающих СЧА, которым вводили 10 мкг дозу Ш-22КА2, концентрация 8АА была значительно ниже по сравнению с контрольным мышами, которым вводили РВ8, при р=0,0257. Статистическую значимость высчитывали, используя РЬ8Б Фишера, при 5%-м уровне значимости (АВАСИ8 Сопсер!к, ШС, Вегке1еу, СА).

Пример 10. Ослабление тяжести заболевания в модели С!А у мышей моноклональными антителами против Ш-22КА или моноклональными антителами против Ш-22.

Модель артрита, индуцированного коллагеном, является моделью ревматоидного артрита у мышей, которая в значительной степени отображает указанное заболевание, встречающееся у людей. (Мооге Ме!Нобк Мо1. Вю1. 225:175-179, 2003; ^акктап, 8сапб. 1. Тттипок, 56:12-34, 2002). Мышей иммунизировали в основание хвоста 2 дозами коллагена, эмульгированного в СРА. Подобная иммунизация вызывает опухание лап, которое увеличивается с течением времени, и может быть визуально оценено и измерено при помощи штангенциркуля. Кроме того, антитела против коллагена сыворотки хорошо соответствуют тяжести заболевания. На основании данных, свидетельствующих об индуцировании воспаления цитокинами Ш-20 и Ш-22, группам мышей, иммунизированных коллагеном, вводили моноклональные антитела против Ш-22КА и Ш-22 и оценивали их влияние на тяжесть заболевания. Уменьшение оценок поражения лап и толщины лап после введения моноклональных антител против Ш-22КА или Ш-22 позволяет предположить, что Ш-20 и Ш-22 стимулируют иммунную реакцию в модели аутоиммунитета, и блокирование, ингибирование, ослабление, антагонистическое воздействие или нейтрализация их функции может подавлять аутоиммунные заболевания. Ингибирование Т№а и антител против коллагена в сыворотке также позволяет предположить, что блокирование Ш-22КА может оказывать благоприятное воздействие при лечении аутоиммунных заболеваний.

Таким образом, для определения способности моноклональных антител против Ш-22КА или Ш-22 воздействовать на аутоиммунитет указанные антитела испытывали в модели ревматоидного артрита у мышей, а именно артрита, индуцированного коллагеном (СЧА). В частности, мышам ЭВАН инъецировали коллаген для индукции артрита ревматоидного типа.

Иммунизация в 0-й день представляла собой подкожную инъекцию гомогената, состоящего из полного адъюванта Фрейнда (СРА) и коллагена типа II (50-100 мкл, полученного в количестве 2 мг/мл коллагена). Инъекцию делали около основания хвоста. На 21-й день осуществляли вторую иммунизацию, единственным отличием которой было то, что гомоген получали с использованием неполного адъюванта Фрейнда (ГР А) вместо СРА. Ежедневно оценивали состояние лап и измеряли их толщину. Нескольким группам мышей 2 или 3 раза в неделю в течение 1-4 недель после второй инъекции коллагена внутрибрюшинно вводили РВ8, 20-200 мкг моноклонального антитела, соответствующего контрольному изотипу, или 20-200 мкг моноклонального антитела против Ш-22КА или моноклонального антитела против Ш22. Мышей ежедневно обследовали в течение 30 дней. Мышей умерщвляли на 30-й день, собирали сыворотку для анализа содержания антител против коллагена и анализа содержания цитокинов в сыворотке (Т№).

Уменьшение оценок состояния лап, толщины лап, содержания Т№а и антител против коллагена в сыворотке в результате введения моноклональных антител против Ш-22КА или Ш-22 позволяет предположить, что блокирование [^-22КА может связывать, блокировать, ингибировать, ослаблять, оказывать антагонистическое воздействие или нейтрализовать Ш-22, ингибировать возникающую иммунную реакцию в модели аутоиммунитета и аутоиммунные заболевания.

Пример 11. Экспрессия рецептора Ш-22, [^-22КА в модели Όδδ-индуцированного ЛЭ у мышей.

Для измерения уровней экспрессии Ш-22КА мыши в ободочных кишках мышей, страдающих Όδδиндуцированным воспалительным заболеванием кишечника (пример 8), осуществляли количественный анализ методом КТ-РСК. РНК выделяли из ободочной кишки здоровых мышей и из дистальных отделов ободочной кишки мышей, которым вводили Όδδ, на 2-й, 7-й и 10-й дни. КТ-РСК осуществляли в устройстве АррНеб Вюкук!етк 7700 ТацМап в соответствии с прилагаемыми инструкциями. Для создания праймеров против последовательности Ш-22КА мыши (2С39776 (δΕΟ Ю N0: 19) и ΖΡ’39777 (δΕΟ Ю N0: 20)) и зонда ТацМап, меченного РАМ/ТАМКА (2С38752 (δΕΟ Ю N0: 21)), использовали программное обеспечение Рптег Ехргекк в соответствии с инструкциями компании АррНеб Вюкук!етк. В каждую реакционную смесь добавляли 25 нг РНК вместе с основными реагентами Тас.|Мап ΕΖ для КТ-РСК РЕ/АррНеб Вюкук!етк и вышеуказанными праймерами и зондом. Реакции КТ-РСК осуществляли дважды в нижеследующих условиях: 50°С в течение 2 мин, 60°С в течение 30 мин, 95°С в течение 5 мин, 40 циклов при 94°С в течение 20 с и при 60°С в течение 1 мин. Значения экспрессии сравнивали со стандартной

- 69 015706 кривой известных членов молекул синтетического транскрипта РНК Ш-22КА мыши и выражали экспрессию в виде абсолютного числа молекул Ш-22КА мыши в одной реакционной смеси. Предварительные данные позволят предположить, что экспрессия Ш-22КА мыши может быть немного уменьшена в дистальных отделах ободочной кишки мышей, страдающих Б88-индуцированным КБ, на 7-й и 10-й дни по сравнению с уровнями экспрессии в ободочной кишке здоровых мышей.

Пример 12. Ш-22 и провоспалительные индикаторы в модели легкой формы эндотоксемии: модель ЬР8-индуцированной эндотоксемии у мышей.

A. Модель ЬР8-индуцированной эндотоксемии у мышей: оценка провоспалительных цитокинов и температуры тела в модели ЬР8-индуцированной эндотоксемии у мышей.

Целью эксперимента ίπ у1уо было исследование воздействия Ш-22КА2 (Ш-22КА2) в модели легкой формы ЬР8-индуцированной эндотоксемии у мышей. Для первоначальной оценки данной модели измеряли провоспалительные цитокины и температуру тела мышей для получения контрольных данных для указанной модели.

Самкам мышей Ва1Ь/с (СКЬ) в возрасте шести месяцев внутрибрюшинно ЦР) инъецировали 25 мкг ЬР8 (81дта) в стерильном РВ8. Пробы сыворотки брали в периоды времени, соответствующие 0, 1, 4, 8, 16, 24, 48 и 72 ч, в группах, состоящих из 8 мышей. Пробы сыворотки анализировали для определения уровней воспалительных цитокинов. Уровни Ш-1Ь, Ш-6, ТИЕа, Ш-10 и сывороточного амилоидного белка А (8АА) измеряли при помощи коммерческих наборов для осуществления анализа ЕЬША, приобретенных в компании Вюкоигсе ШШтайопЦ (СатагШо, СА).

Уровни Т№а повышались до максимального значения, равного 4000 пг/мл, и уровни Ш-10 были равны 341 пг/мл через 1 ч после инъекции ЬВ8. Через 4 ч после инъекции ЬР8 уровни Ш-6, Ш-1Ь и Ш-10 были, соответственно, равны 6100, 299 и 229 пг/мл. Уровни 8АА в сыворотке были равны 0,405 мг/мл через 4 ч после инъекции ЬР8. Концентрации 8АА в сыворотке продолжали увеличиваться до 3,9 мг/мл через 24 ч после инъекции ЬР8, однако, уровни 8АА в сыворотке, превышающие 1-2 мг/мл, трудно измерить точно или с воспроизводимыми результатами при помощи существующего набора для осуществления анализа ЕЫ8А из-за взаимодействия 8АА с другими компонентами сыворотки. Полученные результаты показали, что в данной модели помимо Ш-22 (пример 11В) были действительно продуцированы провоспалительные цитокины. Таким образом, в качестве биологических маркеров в модели легкой формы ЬР8-индуцированной эндотоксемии были приняты следующие критерии: уровни ТИЕа в сыворотке через 1 ч после инъекции ЬР8, уровни Ш-6 в сыворотке через 4 ч после инъекции ЬР8 и уровни 8АА в сыворотке через 4 и 8 ч после инъекции ЬР8.

Температуру тела животных в отдельной группе контролировали в течение 72 ч путем хирургической имплантации телеметрического устройства. Температура тела у мышей снизилась максимально на 2°С с 37,07 до 34,98°С через 30 мин после инъекции ЬР8.

Инъекция 100 мкг слитого белка Ш-22КА2-ЕС за 30 мин до инъекции ЬР8 значительно уменьшала примерно на 50% индукцию 8АА через 4 и 8 ч, в то время как инъекция 10 мкг Ш-22КА2-Ес не оказывала существенного воздействия. Отсутствуют существенные изменения уровней ЮТа и Ш-6. Инъекция Ш-22КА-ЕС уменьшала число нейтрофилов в кровотоке через 1 ч. Из вышеизложенного следует, что введение Ш-22КА2-Ес может нейтрализовать активность Ш-22 в отношении индукции 8АА.

B. Обнаружение активности Ш-22 в сыворотке мышей из модели ЬР8-индуцированной эндотоксемии у мышей с использованием клеток ВаЕ3/СКЕ2-4/Ш-22КА при осуществлении анализа пролиферации с окрашиванием аламаровым синим.

Клетки ВаЕ3/СКЕ2-4/Ш-22КА по настоящему изобретению центрифугировали и промывали в РВ8 2 раза для удаления шШ-3, затем центрифугировали в третий раз и ресуспендировали в полной среде (КРМI 1640, 10% ЕВ8, 1% С1иίаМЛX, 1% пирувата натрия), но без тШ-3 (указанная среда далее определяется как среда без тШ-3). Производили подсчет клеток в гемоцитометре. Клетки культивировали на 96-луночном планшете в количестве 5000 клеток/лунку в объеме 100 мкл/лунку с использованием среды без шШ-3.

Сыворотку, полученную у мышей, страдающих ЬР8-индуцированной эндотоксемией, которые были использованы в приведенном выше примере 11 А, разводили до 2% в среде без тШ-3 в верхнем ряду лунок планшета и затем производили серийное разведение в отношении 1:2 в остальных 7 рядах лунок 96луночного планшета, доводя объем до 100 мкл в каждой лунке. Затем указанную сыворотку добавляли к 100 мкл клеток до достижения конечных концентраций сыворотки, равных 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,063, 0,031, 0,016 и 0,018% в общем анализируемом объеме, равном 200 мкл. Аналитические планшеты инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 4 дней, после чего добавляли аламаровый синий (Асситеб, СЫсадо, Ш) в количестве 20 мкл/лунку. Планшеты снова инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 16 ч. Аламаровый синий позволяет получить флуорометрические данные, основанные на количестве живых клеток, и поэтому является прямым измерением пролиферации клеток по сравнению с отрицательным контрольным образцом. Планшеты считывали в счетчике №а11ас Ую!ог 2 1420 (№а11ас, Тигки, Е1п1апб) при длинах волн 530 (возбуждение) и 590 (испускание).

Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии значительной пролиферации, превышаю

- 70 015706 щей фоновые уровни, в периоды времени, соответствующие 0, 1, 8 и 16 ч. В пробах сыворотки, полученных через 4 ч, была обнаружена пролиферация, которая в 4-10 раз превышала фоновое значение, что указывает на присутствии [Б-22 в данных пробах.

С. Модель ЬР8-индуцированной эндотоксемии у мышей: эксперимент по оценке воздействия 1Ь22КА2.

В данном эксперименте исследовали способность [Б-22КА2 воздействовать на провоспалительные индикаторы, индуцированные в результате введения одной внутрибрюшинной дозы ЬР8, равной 25 мкг. Все пробы анализировали в отношении 8АА, [Б-22 и циркулирующих нейтрофилов. Субпопуляции клеток в каждой группе анализировали в отношении уровней определенных цитокинов (1-часовые пробы исследовали в отношении ТЫРа, 4-часовые пробы анализировали в отношении 1Ь-6). Животных умерщвляли в периоды времени, указанные в приведенной ниже табл. 8, собирали цельную кровь и сыворотку и отбирали аликвоты для анализа.

самкам мышей С’57ВЬ/6Н (СКЬ) внутрибрюшинно вводили одну дозу 1Ь-22КА2 в соответствии с приведенной ниже табл. 8. В качестве контрольных мышей использовали мышей С57ВЬ/6Ч (СКЬ).

Через 30 мин мышам делали еще одну внутрибрюшинную инъекцию 25 мкг БР8 (81дта) в 100 мкл для инициации каскадного развития эндотоксемии. Мышей в каждой группе умерщвляли в соответствующие периоды времени, указанные в табл. 8, собирали 50 мкл цельной крови для измерения общего количества циркулирующих нейтрофилов, остальную часть крови центрифугировали для получения сыворотки и отбирали аликвоты для осуществления разных анализов, представленных в настоящем описании изобретения.

Таблица 8

Группа	№	Воздействие	ЪРЗ	Умерщвление	Пробы
А	8	100 мкг ΙΏ-22ΗΑ2, внутрибрюшинно	25 мкг внутрибрюшинно через 30 минут после первой инъекции	1 час	Аликвоты сыворотки, кровь для СВС

В	8	10 мкг ΙΣ-22ΡΑ2, внутрибрюшинно	25 мкг внутрибрюшинно через 30 минут после первой инъекции	1	час	Аликвоты сыворотки, кровь для СВС
С	8	200 мкл РВЗ, внутрибрюшинно	25 мкг внутрибрюшинно через 30 минут после первой инъекции	1	час	Аликвоты сыворотки, кровь для СВС
0	8	100 мкг Ι1.-22ΚΑ2, внутрибрюшинно	25 мкг внутрибрюшинно через 30 минут после первой инъекции	4	часа	Аликвоты сыворотки, кровь для СВС
Е	8	10 мкг ΙΣ-22ΚΑ2, внутрибрюшинно	25 мкг внутрибрюшинно через 30 минут после первой инъекции	4	часа	Аликвоты сыворотки, кровь для СВС
Г	8	200 мкл РВ5, внутрибрюшинно	25 мкг внутрибрюшинно через 30 минут после первой инъекции	4	часа	Аликвоты сыворотки, кровь для СВС
6	8	100 мкг ΙΣ-22ΚΑ2, внутрибрюшинно	25 мкг внутрибрюшинно через 30 минут после первой инъекции	8	часов	Аликвоты сыворотки, кровь для СВС
Н	8	10 мкг ΙΣ-22ΚΑ2, внутрибрюшинно	25 мкг внутрибрюшинно через 30 минут после первой инъекции	3	часов	Аликвоты сыворотки, кровь для СВС

- 71 015706

σ	8	200 мкл РВЗ, внутрибрюшинно	25 мкг внутрибрюшинно через 30 минут после первой инъекции	8 часов	Аликвоты сыворотки, кровь для СВС
к	5	контрольные	не вводили	ДО введения ЬРЗ	Аликвоты сыворотки, кровь для СВС

Ό. Нейтрализация I^-22ΚΛ2-Εс4 индукции 8АА ш νί\Ό: анализ 8АА методом ЕБГЗА, свидетельствующий об ингибировании экспрессии 8АА, индуцированной БР8, в модели БР8-индуцированной эндотоксемии у мышей путем инъекции [^-22ВΛ2-Ес4.

Для определения способности ]Е-22ВА2 ингибировать индукцию 8АА в модели БР8индуцированной эндотоксемии у мышей, мышам инъецировали I^-22ΚΛ2 за 30 мин до инъецирования БР8, как показано в табл. 8 приведенного выше примера 11С.

Анализ ЕБГЗА для определения уровней 8АА в 4-часовых и 8-часовых пробах осуществляли при помощи набора для иммуноанализа 8АА мышей (Вю8оигсе !п!егпа!1опа1, СаШогша) в соответствии с инструкциями изготовителя. В период времени, соответствующий 4 ч, у мышей, которым вводили 100 мкг или 10 мкг !Б-22ВА2, наблюдалось статистически значимое уменьшение уровней 8АА в зависимости от дозы по сравнению с данным показателем у мышей, которым инъецировали РВ8. В период времени, соответствующий 8 ч, у мышей, которым вводили 100 мкг дозу, продолжало происходить статистически значимое снижение уровней 8АА по сравнению с мышами, которым инъецировали РВ8. Полученные результаты показывают, что ]Е-22ВА2 способен ингибировать индукцию 8АА, вызываемую БР8, ш у1уо.

Пример 13. Воздействие полипептида ГБ-22 на кожу ш νί\Ό.

А. Акантоз, индуцированный ГБ-22.

Мышей (самки, С3Н/НЕБ в возрасте 8 недель; 1аскзоп БаЬз, Ваг НагЬог, МЕ) распределяли в три группы по шесть животных в каждой и в одну группу, состоящую из 4 животных. ГБ-22, продуцированный в клетках ВНК человека, вводили путем непрерывного вливания при помощи миниосмотических насосов с достижением устойчивых локальных концентраций в сыворотке, пропорциональных концентрации ГБ-22 в насосе. Миниосмотические насосы А1/е1 (модель 2002; А1/а согрогабоп, Ра1о А1!о, СА) загружали в стерильных условиях белком ГБ-22 (А601Е, 0,22 мл), разведенным в физиологическом растворе с фосфатным буфером (рН 7,0) до концентрации в насосе, равной 2 мг/мл для мышей в 1-й группе, 0,2 мг/мл для мышей во 2-й группе, 0,02 мг/мл для мышей в 3-й группе или 0 мг/мл (только разбавитель) для мышей в 4-й группе. Насосы имплантировали мышам подкожно через 1-см надрез в коже спины, после чего кожу скрепляли стерильными скобами. Указанные насосы подавали содержимое со скоростью 0,5 мкл/ч в течение 14 дней. При указанной номинальной скорости вливания дозы, вводимые животным в группах 1-4, составляли, соответственно, 24, 2,4, 0,24 и 0 мкг/сутки.

В конце 14-дневного периода мышей умерщвляли и у каждой мыши удаляли образец кожи вокруг насоса, равный примерно 1 см². Кожу фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине. Образцы кожи, фиксированные в формалине, погружали в парафин, подвергали обычной обработке, изготавливали срезы толщиной 5 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином. Ткани были вслепую исследованы под микроскопом ветеринарным патологоанатомом с сертификатом АСУР. Были отмечены гистологические изменения, при этом тяжесть акантоза (т. е. утолщение эпидермиса) была оценена субъективно в соответствии со следующей системой оценок: 0 - нормальная, 1 - минимальный акантоз, 2 - слабый акантоз, 3 - средний акантоз и 4 - тяжелый акантоз. Кроме того, кожу животных в выбранных группах фотографировали цифровой камерой Соо18пар (Ворег 8с1епбйс, Гис., 8ап О1едо, СА) и толщину эпидермиса измеряли с помощью программного обеспечения для гистоморфометрического анализа (8сюп Инаде Гог ^тботез, ν. 4.02, 8сюп Согр., Егебебск, МБ).

Введение ГБ-22 в дозе, равной 2,4 и 24 мкг/сутки, вызывало утолщение эпидермиса, значительно превышающее данный показатель в контрольной группе, о чем свидетельствуют средние оценки акантоза. Кроме того, в эпидермисе животных, которым вводили !Б-22, были обнаружены инфильтраты мононуклеарных клеток. Указанные инфильтраты отсутствовали в коже контрольных животных, которым вводили носитель.

В приведенной ниже табл. 9 представлены оценки толщины эпидермиса и результаты измерения толщины кожи (выраженные в пикселях) в случае акантоза в разных группах.

- 72 015706

Таблица 9

№ группы	η	Насос	Средний акантоз	Измеренная толщина
1	6	24 мкг 1Ъ-22/сутки	3, 0	данных нет
2	6	2,4 мкг 1Ь-22/сутки	2,4	67,5
3	6	0,24 мкг 1Ь-22/сутки	2,2	данных нет
4	4	вливание РВ5	1, 8	45, 6

В. Воздействие I^-22КΑ2 на акантоз, индуцированный ГЬ-22.

Мышей (самки, С3Н/НЕ1, в возрасте 8 недель; 1аскзоп ЬаЬз, Ваг НагЬог, МЕ) распределяли в 8 групп по восемь животных в каждой. ГЬ-22 вводили путем непрерывного вливания при помощи миниосмотических насосов в соответствии с описанием, приведенным в примере 12А. Миниосмотические насосы А1хе1 (модель 2001; А1ха согрогайоп Ра1о А1!о, СА) загружали в стерильных условиях белком Ш-22 (А № 601Е, 0,22 мл), разведенным в физиологическом растворе с фосфатным буфером (рН 7,0) до концентрации в насосе, равной 0,22 мг/мл для мышей в группах 1-2, 0,45 мг/мл для мышей в группах 3-4, 0,9 мг/мл для мышей в группах 5-6 или 0 мг/мл (только разбавитель) для мышей в группах 7-8. Указанные насосы подавали содержимое со скоростью 0,5 мкл/ч в течение 14 дней. При указанной номинальной скорости вливания вводимые дозы составляли 10 мкг/сутки в группах 1-2, 5 мкг/сутки в группах 3-4, 2,5 мкг/сутки в группах 5-6 и 0 мкг/сутки в группах 7-8. В каждой паре групп, которым вводили указанную дозу ГЬ-22, одной из групп животных трижды (1-й, 3-й и 5-й дни) внутрибрюшинно инъецировали 0,1 мг белка I^-22КΑ2-Εс человека (по настоящему изобретению). Другой группе животных аналогичным образом инъецировали носитель (РВ8).

На 8-й день исследования мышей умерщвляли и у каждой мыши удаляли образец кожи вокруг насоса, равный примерно 1 см². Кожу фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине. Образцы кожи, фиксированные в формалине, погружали в парафин, подвергали обычной обработке, изготавливали срезы толщиной 5 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином. Ткани были вслепую исследованы под микроскопом ветеринарным патологоанатомом с сертификатом АСУР. Оценку кожи в данном исследовании производили не так, как в предыдущем примере. Определяли число слоев эпидермиса от базального слоя до гранулярного слоя. На основании полученных результатов производили оценку срезов: 0 - нормальная кожа (2-3 слоя), 1 - небольшое утолщение (3-4 слоя), 2 - среднее утолщение (4-6 слоев) и 3 - сильное утолщение (>6 слоев).

Введение ГЬ-22 в количестве 2,5, 5, 10 мкг/сутки вызывало утолщение эпидермиса (см. табл. 10). Кроме того, в эпидермисе животных, которым вводили ГЬ-22, были обнаружены инфильтраты мононуклеарных клеток. Указанные инфильтраты отсутствовали в коже контрольных животных, которым вводили носитель. Одновременное введение 100 мкг I^-22КΑ2 (3 инъекции) уменьшало толщину эпидермиса у мышей, которым вводили 5 мкг I^-22/сутки.

В приведенной ниже табл. 10 представлены оценки толщины эпидермиса в случае акантоза в разных группах.

Таблица 10

№ группы	η	Насос	Инъекция	Средний акантоз
1	8	2,5 мкг 1Ь-22/сутки	100 мкл носителя (3 инъекции)	1,1

- 73 015706

2	8	2,5 мкг 1Ь-22/сутки	100 мкг И-22ЕА2 (3 инъекции)	0,8
3	8	5 мкг 1Ъ-22/сутки	100 мкл носителя (3 инъекции)	2,0
4	8	5 мкг 1Ь-22/сутки	100 мкг 1Ъ-22КА2 (3 инъекции)	0, 6
5	8	10 мкг 1Ъ-22/сутки	100 мкл носителя (3 инъекции)	2,0
б	8	10 мкг 111-22/сутки	100 мкг ΙΣ-22ΗΑ2 (3 инъекции)	1, 9
7	8	Носитель	100 мкл носителя (3 инъекции)	0,0
8	8	Носитель	100 мкг 1Б-22КА2 (3 инъекции)	0, 0

В коже человека, пораженной псориазом, было также обнаружено утолщение эпидермиса и инфильтраты иммунокомпетентных клеток. Данный фенотип кожи, наблюдаемый в случае подкожной инъекции 1Ь-22, также свидетельствовал о потенциальной роли 1Ь-22 в патогенезе псориаза. То, что 1Ь22ВА2-ЕС может нейтрализовать фенотип кожи, индуцированный 1Ь-22, делает возможным потенциальное использование других антагонистов 1Ь-22, таких как нейтрализующее антитело против 1Ь-22 или растворимый рецептор, для лечения псориаза и других воспалительных заболеваний, индуцированных Ш-22.

С. Воздействие растворимых рецепторов 1Ь-22ВА и антител против 1Ь-22ВА на акантоз, индуцированный 1Ь-22 или 1Ь-20.

Активность растворимых рецепторов 1Ь-22ВА или антитела к 1Ь-22ВА в отношении ингибирования активности 1Ь-22 или 1Ь-20 1и νί\Ό оценивали аналогичным образом, используя конечные гистологические показатели акантоза, вызываемые подкожным вливанием белка 1Ь-22 или 1Ь-20. В примере указанной модели мышам С3Н/НЕЭ имплантировали подкожные миниосмотические насосы, описанные в приведенных выше примерах 12(А) и 12(В). В период воздействия 1Ь-22 или 1Ь-20 мышам инъецировали очищенное моноклональное антитело к 1Ь-22 или контрольным животным аналогичным образом инъецировали носитель. В конце периода вливания 1Ь-22 удаляли образцы кожи с участка, расположенного рядом с насосом, для осуществления гистологического анализа. Предполагается, что подобно антагонисту 1Ь-22, представляющему собой растворимый рецептор 1Ь-22ВА2, антагонисты 1Ь-22 или 1Ь-20, являющиеся растворимыми рецепторами 1Ь-22ВА или антителами против 1Ь-22ВА по настоящему изобретению, уменьшают утолщение эпидермиса и инфильтраты иммунокомпетентных клеток, вызываемые 1Ь22 или 1Ь-20, и поэтому могут быть использованы в качестве антагонистов 1Ь-22 или 1Ь-20 при лечении псориаза и других воспалительных заболеваний, индуцированных 1Ь-22 или 1Ь-20.

Пример 14. Увеличение 1Ь-22 в образцах кожи человека, пораженной псориазом.

A. Образцы РНК.

Были получены образцы нормальной кожи и кожи субъектов, страдающих псориазом бляшечного типа. Последние образцы включали кожу с участков, пораженных устойчивым псориазом бляшечного типа, и кожу со смежных непораженных участков. РНК выделяли из образцов кожи человека стандартными методами. Целостность и качество образцов РНК исследовали в биоанализаторе Адйеи! 2100 (Адйеи! ТесЬηο1οд^е8, ^а1бЬ^οηη, Сегтаиу).

B. Праймеры и зонды для количественного анализа методом ВТ-РСВ.

В научной литературе описан количественный анализ методом ВТ-РСВ в реальном времени с использованием системы обнаружения последовательностей АВ1 РВ18М 7700 (РЕ АррБеб Вю8у8!ет8, 1ис., Ео8!ег Сйу, СА) (см. публикации Не1б, С.А. е! а1., Сеиоте Ве8еагсй 6:986-994, 1996; С1Ь8ои, и.Е.М. е! а1., Сеиоте Ве8еагсй 6:995-1001, 1996; 8иибаге8аи, 8. е! а1., Еибосгто1оду 139:4756-4764, 1998). Указанный метод включает использование геноспецифического зонда, содержащего репортерные и гасящие флуоресцентные красители. В случае интактного зонда излучение репортерного красителя рассеивается вследствие близости гасящего красителя. Во время удлинения цепи при помощи РСВ с использованием дополнительных геноспецифических верхних и нижних праймеров зонд расщепляется под воздействием 5'-3' нуклеолитической активности ДНК-полимеразы гТГЪ, которая высвобождает репортерный краситель из зонда, вызывая усиление флуоресцентного излучения.

Праймеры и зонды, используемые при осуществлении количественных анализов экспрессии ГБ-22 методом ВТ-РСВ в реальном времени, были созданы при помощи программного обеспечения для создания праймеров Рйтег Ехрге88™ (РЕ Аррйеб Вю8у8!ет8, Ео8!ег Сйу, СА). Праймеры для 1Б-22 человека были созданы путем заполнения экзон-интронного сочленения для устранения амплификации геномной ДНК. При осуществлении реакции РСВ (см. ниже) верхний праймер 2С42459 (8ЕО ΙΌ NО: 22) и нижний

- 74 015706 праймер 2С42458 (8Е0 Ю ЫО: 23) были использованы в концентрации 800 нМ для синтеза продукта длиной 72 п.о. Соответствующий зонд 2С42460 к Ш-22 (8ЕО Ю ЫО: 24) был синтезирован и снабжен меткой в компании 2упоСспс!1сх. Зонд к Ш-22 был помечен у 5'-конца репортерным флуоресцентным красителем (6-карбоксифлуоресцеин) (РАМ) (РЕ Аррйсб Вюхух!стх) и у 3'-конца гасящим флуоресцентным красителем (6-карбокситетраметилродамин) (ТАМКА) (РЕ Аррйсб В1охух!стх).

С. Осуществление количественного анализа методом КТ-РСК в реальном времени.

Относительные уровни мРНК №-22 определяли, анализируя образцы общей РНК при помощи набора основных реагентов для КТ-РСК ТацМап ΕΖ (РЕ Аррйсб В1охух!стх). Для построения стандартной кривой, используемой для осуществления количественного анализа, был получен укороченный транскрипт №-22. Указанная кривая была построена в результате 10-кратных серийных разведений с образованием в общей сложности от около 1е8 до 1е3 копий полного транскрипта для Ш-22, при этом каждую точку стандартной кривой анализировали трижды. Образцы общей РНК из кожи также трижды анализировали в отношении уровней транскрипта Ш-22 человека и уровней ЙСИ8 в качестве эндогенного контрольного образца. Каждый образец РНК в общем объеме, равном 25 мкл, подвергали реакции КТ-РСК с использованием реагентов ТацМап ΕΖ (РЕ Аррйсб Вюхух!стх), включающих примерно 25 нг общей РНК в ОЕРС-обработанной воде (без ДНКазы/РНКазы), соответствующие праймеры (примерно 800 нм ΖС42459 (8ЕО Ю ЫО: 22) и ΖС42458 (8ЕО Ю ЫО: 23), соответствующий зонд (примерно 100 нМ ΖС42460 (8ЕО Ю ЫО: 24), однократный буфер ТацМап ΕΖ, 3 мМ ацетата марганца, по 300 мкМ б-СТР, б-АТР и б-СТР и 600 мкМ б-ИТР, ДНК-полимеразу гТ!й (0,1 ед/мкл) и АтрЕгахе ИЫС (0,01 ед/мкл). Реакцию РСК осуществляли в следующих условиях тепловой циклизации: начальная стадия обработки ИЫС, состоящая из одного цикла при 50°С в течение 2 мин; стадия обратной транскрипции (КТ), состоящая из одного цикла при 60°С в течение 30 мин; стадия дезактивации ИЫС, состоящая из одного цикла при 95°С в течение 5 мин; затем 40 циклов амплификации при 94°С в течение 20 с и при 60°С в течение 1 мин.

Относительные уровни РНК Ш-22 определяли методом стандартной кривой в соответствии с инструкциями изготовителя, компании РЕ Вюхух!стх (Ихег Ви11с!т № 2: АВI Рпхт 7700 Зсциспсе Ос!сс!юп 8ух!ст, Кс1айус Риапй!айоп оГ Сепс Ехргсххюп, ЭссетЬег 11, 1997). Измерения ЙСИ8 использовали для нормализации уровней Ш-22. Полученные данные приведены в нижеследующей табл. 11.

Таблица 11

Образец кожи	11-22
Нормальная кожа	0
Непораженный участок	0
Пораженный участок	1149

мРНК Ш-22 не была обнаружена в образцах кожи здоровых субъектов или кожи с непораженных участков. В отличие от этого имело место значительное увеличение транскрипта Ш-22 в пораженной коже субъектов, страдающих псориазом. Полученные данные подтверждают сильную ассоциацию Ш-22 с псориазом человека.

Сверхэкспрессия Ш-22 была обнаружения в псориатических поражениях человека, из чего следует, что №-22 опосредует псориаз человека. Кроме того, как указано в настоящем описании изобретения, сверхэкспрессия Ш-22 у трансгенных мышей сопровождалась утолщением эпидермиса и рекрутингом иммунокомпетентных клеток, характерными для псориатического фенотипа, при этом инъецирование Ш-22 здоровым мышам также вызывало утолщение эпидермиса и рекрутинг иммунокомпетентных клеток, характерные для псориатического фенотипа, но указанные симптомы были устранены при введении антагониста растворимого рецептора Ш-22КА2. Такие данные, полученные ш у1уо, позволяют далее предположить, что провоспалительный цитокин Ш-22 опосредует псориаз. Таким образом, антагонисты активности Ш-22, такие как моноклональные антитела против Ш-22 человека по настоящему изобретению, а также растворимые рецепторы и антитела к ним пригодны для терапевтического лечения воспалительных заболеваний, в частности, в качестве антагонистов Ш-22 при лечении псориаза. Кроме того, антагонисты активности Ш-22, такие как моноклональные антитела против Ш-22 человека по настоящему изобретению, а также растворимые рецепторы и антитела к ним пригодны для терапевтического лечения других воспалительных заболеваний, например, в качестве антагонистов Ш-22 при лечении атопического дерматита, ШО, колита, эндотоксемии, артрита, ревматоидного артрита и псориатического артрита, острого респираторного заболевания (АКО), септического шока, нарушения функции многих органов, воспалительного поражения легких, такого как астма или бронхит, бактериальной пневмонии, псориаза, экземы, атопического и контактного дерматитов и воспалительного заболевания кишечника, такого как неспецифический язвенный колит и болезнь Крона.

Пример 15. Увеличение №-22 в образцах кожи человека, пораженной атопическим дерматитом.

А. Образцы РНК.

Были получены образцы нормальной кожи (п=4) и кожи субъектов, страдающих атопическим дер

- 75 015706 матитом (и=4). РНК выделяли из образцов кожи человека стандартными методами. Целостность и качество образцов РНК исследовали в биоанализаторе АдБеи! 2100 (АдБеи! ТесБпо1од1ез, Уа1бЬгоип, Сегтаиу).

B. Праймеры и зонды для количественного анализа методом КТ-РСК.

В научной литературе описан количественный анализ методом КТ-РСК в реальном времени с использованием системы обнаружения последовательностей АВГ РКГ8М 7700 (РЕ АррБеб Вюзуз!етз, Гис., Роз!ег СБу, СА) (см. публикации Не1б, С.А. е! а1., Сеиоте КезеагсБ 6:986-994, 1996; С1Ьзои, и.Е.М. е! а1., Сеиоте КезеагсБ 6:995-1001, 1996; 8иибагезаи, 8. е! а1., Епбосппо1оду 139:4756-4764, 1998). Указанный метод включает использование геноспецифического зонда, содержащего репортерные и гасящие флуоресцентные красители. В случае интактного зонда излучение репортерного красителя рассеивается вследствие близости гасящего красителя. Во время удлинения цепи при помощи РСК с использованием дополнительных геноспецифических верхних и нижних праймеров зонд расщепляется под воздействием 5'-3' нуклеолитической активности ДНК-полимеразы гТ1Б, которая высвобождает репортерный краситель из зонда, вызывая усиление флуоресцентного излучения.

Праймеры и зонды, используемые при осуществлении количественных анализов экспрессии ГЬ-22 методом КТ-РСК в реальном времени, были созданы при помощи программного обеспечения для создания праймеров Рптег Ехргезз™ (РЕ АррБеб Вюзуз!етз, Роз!ег СБу, СА). Праймеры для ГЬ-22 человека были созданы путем заполнения экзон-интронного сочленения для устранения амплификации геномной ДНК. При осуществлении реакции РСК (см. ниже) верхний праймер 2С42459 (8ЕЦ Ш N0: 22) и нижний праймер 2С42458 (8ЕЦ ГО N0: 23) были использованы в концентрации 800 нМ для синтеза продукта длиной 72 п.о. Соответствующий зонд 2С42460 к ГЬ-22 (8ЕЦ ГО N0: 24) был синтезирован и снабжен меткой в компании 2уиоСеие!1сз. Зонд к ГЬ-22 был помечен у 5'-конца репортерным флуоресцентным красителем (6-карбоксифлуоресцеин) (РАМ) (РЕ АррБеб Вюзуз!етз) и у 3'-конца гасящим флуоресцентным красителем (6-карбокситетраметилродамин) (ТАМКА) (РЕ АррБеб В1озуз!етз).

C. Осуществление количественного анализа методом КТ-РСК в реальном времени.

Относительные уровни мРНК ГЬ-22 определяли, анализируя образцы общей РНК при помощи набора основных реагентов для КТ-РСК ТадМап ΒΖ (РЕ АррБеб В1озуз!етз). Для построения стандартной кривой, используемой для осуществления количественного анализа, был получен укороченный транскрипт ГЬ-22. Указанная кривая была построена в результате 10-кратных серийных разведений с образованием в общей сложности от около 1е8 до 1е3 копий полного транскрипта для ГЬ-22, при этом каждую точку стандартной кривой анализировали трижды. Образцы общей РНК из кожи также трижды анализировали в отношении уровней транскрипта ГЬ-22 человека и уровней БСИ8 в качестве эндогенного контрольного образца. Каждый образец РНК в общем объеме, равном 25 мкл, подвергали реакции КТ-РСК с использованием реагентов ТадМаи ΒΖ (РЕ АррБеб Вюзуз!етз), включающих примерно 25 нг общей РНК в ОЕРС-обработанной воде (без ДНКазы/РНКазы), соответствующие праймеры (примерно 800 нм 2С42459 (8Е0 ГО N0: 22) и 2С42458 (8Е0 ГО N0: 23), соответствующий зонд (примерно 100 нМ 2С42460 (8Е0 ГО N0: 24), однократный буфер ТадМап ΞΖ, 3 мМ ацетата марганца, по 300 мкМ б-СТР, б-АТР и б-СТР и 600 мкМ б-ИТР, ДНК-полимеразу гТ!Б (0,1 ед/мкл) и АтрЕгазе υNС (0,01 ед/мкл). Реакцию РСК осуществляли в следующих условиях тепловой циклизации: начальная стадия обработки ЦЦ6, состоящая из одного цикла при 50°С в течение 2 мин; стадия обратной транскрипции (КТ), состоящая из одного цикла при 60°С в течение 30 мин; стадия дезактивации ЬПС, состоящая из одного цикла при 95°С в течение 5 мин; затем 40 циклов амплификации при 94°С в течение 20 с и при 60°С в течение 1 мин.

Относительные уровни РНК ГЬ-22 определяли методом стандартной кривой в соответствии с инструкциями изготовителя, компании РЕ Вюзуз!етз (Изег ВиБеБи № 2: АВГ Рпзт 7700 8едиепсе Ье1ес11оп 8уз!ет, Ке1аΐ^νе ОнагИБаБоп оГ Сеие Ехргеззюи, ЬесетЬег 11, 1997). Измерения БСИ8 использовали для нормализации уровней ГЬ-22.

мРНК ГЬ-22 не была обнаружена в образцах кожи здоровых субъектов. В отличие от этого в 3 из 4 образцов кожи субъектов, страдающих атипическим дерматитом, имело место значительное увеличение транскрипта ГЬ-22 (примерно 400-2300 копий). Полученные данные подтверждают сильную ассоциацию ГЬ-22 с атопическим дерматитом.

Сверхэкспрессия ГЬ-22 была обнаружена в образцах кожи человека, пораженной атопическим дерматитом, из чего следует, что ГЬ-22 опосредует атопический дерматит человека. Кроме того, как указано в настоящем описании изобретения, сверхэкспрессия ГЬ-22 у трансгенных мышей сопровождается утолщением эпидермиса и рекрутингом иммунокомпетентных клеток, характерными для фенотипа атопического дерматита, при этом инъецирование ГЬ-22 здоровым мышам также вызывало утолщение эпидермиса и рекрутинг иммунокомпетентных клеток, характерные для фенотипа атопического дерматита, но указанные симптомы были устранены при введении антагониста растворимого рецептора ГЬ-22КА2. Такие данные, полученные 1и νίνΌ, позволяют далее предположить, что провоспалительный цитокин ГЬ-22 опосредует атопический дерматит. Таким образом, антагонисты активности ГЬ-22, такие как моноклональные антитела против ГЬ-22 человека по настоящему изобретению, а также растворимые рецепторы и антитела к ним пригодны для терапевтического лечения воспалительных заболеваний, в частности, в каче

- 76 015706 стве антагонистов ГЬ-22 при лечении атопического дерматита. Кроме того, антагонисты активности ГЬ22, такие как моноклональные антитела против ГЬ-22 человека по настоящему изобретению, а также растворимые рецепторы и антитела к ним пригодны для терапевтического лечения других воспалительных заболеваний, например, в качестве антагонистов ГЬ-22 при лечении атопического дерматита, ГВЬ, колита, эндотоксемии, артрита, ревматоидного артрита и псориатического артрита, острого респираторного заболевания (АЕП), септического шока, нарушения функции многих органов, воспалительного поражения легких, такого как астма или бронхит, бактериальной пневмонии, псориаза, экземы, атопического и контактного дерматитов и воспалительного заболевания кишечника, такого как неспецифический язвенный колит и болезнь Крона.

Пример 16. Поликлональные антитела против ГЬ-22 человека.

Поликлональные антитела против ГЬ-22 были получены в результате иммунизации 2 самок новозеландских белых кроликов очищенным зрелым рекомбинантным полипептидом ГЬ-22 человека (аминокислотные остатки 22 (А1а) - 167 (Г1е) 8ЕО ГО N0: 6), продуцированным в клетках ВНК (ГЬ-22-ВНК). Кроликам сначала внутрибрюшинно инъецировали 200 мкг очищенного белка в полном адъюванте Фрейнда, затем повторно внутрибрюшинно инъецировали 100 мкг пептида в неполном адъюванте Фрейнда через каждые три недели. Через 7-10 дней после второй бустер-инъекции (в общей сложности 3 инъекции) у животных брали пробы крови и сыворотки. Животных повторно иммунизировали и брали пробы крови через каждые три недели.

Поликлональные антитела, специфичные к ГЬ-22 человека, очищали аффинной хроматографией от иммунной сыворотки кролика на колонке, содержащей САВг-сефарозу и белок 4В (Рйагташа ЬКВ), которая была получена при использовании 10 мг рекомбинантного белка ГЬ-22-ВНК человека, очищенного от специфического антигена, на один грамм САВг-сефарозы, с последующим 20-кратным диализом в РВ8 в течение ночи. Антитела, специфичные к ГЬ-22 человека, исследовали методом ЕЬГ8А, используя 500 нг/мл очищенного рекомбинантного белка ГЬ-22-ВНК человека в качестве мишени для антитела. Нижний предел обнаружения (ЬЬЬ) антитела кролика против ГЬ-22 человека, очищенного аффинной хроматографией, равен 280 пг/мл в расчете на специфический очищенный рекомбинантный антиген ГЬ22-ВНК человека.

Поликлональные антитела, специфичные к ГЬ-22 человека, далее исследовали в отношении способности блокировать клеточнопролиферативную активность (анализ нейтрализации) очищенного рекомбинантного белка ГЬ-22-ВНК человека в клетках ΒаΕ3/СКР2-4/Г^-22КΛ (пример 2 и пример 3). 50кратный молярный избыток поликлональных антител, специфичных к ГЬ-22 человека, является достаточным для ингибирования пролиферации клеток.

Пример 17. Моноклональные антитела против ГЬ-22 человека.

Моноклональные антитела была получены в результате иммунизации 4 самок крыс 8ргадие-Эает1еу (Сйаг1ек Ещег ЬаЬога!опек, V^1ш^ηд!οη, МА) очищенным зрелым рекомбинантным полипептидом ГЬ-22 человека (аминокислотные остатки 22 (А1а) -167 (Г1е) 8Е0 ГО N0: 6), продуцированным в клетках ВНК (ГЬ-22-ВНК). Крысам сначала внутрибрюшинно (ГР) инъецировали 100 мкг очищенного рекомбинантного белка ГЬ-22 человека в полном адъюванте Фрейнда (Р1егсе, ЕоскГой, ГЬ), затем повторно внутрибрюшинно инъецировали 50 мкг очищенного рекомбинантного белка в неполном адъюванте Фрейнда через каждые две недели. Через 7-10 дней после третьей бустер-инъекции у животных брали пробы крови и сыворотки.

Пробы сыворотки крыс, специфичной к ГЬ-22 человека, исследовали методом ЕЬГ8А, используя 500 нг/мл биотинилированного белка ГЬ-22-ВНК человека и 500 нг/мл биотинилированного цитокина ГЬ-22 мыши, которые являются биотинилированными мишенями для антитела против тцГЬ-22-Е.сой (Ε+Ό 8ук!етк, М1ппеаройк, МК). Титр трех проб сыворотки крыс к биотинилированному ГЬ-22-ВНК, являющемуся мишенью для специфического антитела, соответствовал разведению 1:1Е5 и к биотинилированному тцГЬ-22-Е.сой, являющемуся мишенью для специфического антитела, соответствовал разведению 1:1Е4.

Спленоциты и клетки лимфатических узлов, полученные у 2 крыс с высоким титром, гибридизировали с миеломными клетками 8Р2/0 (мыши), используя РЕС 1500 в соответствии с двумя разными методами гибридизации (соотношение гибридизации спленоцитов с миеломными клетками равно 4:1, Ап!1Ьой1ек А ЬаЬога!огу Мапиа1, Е. Наг1о\\' апй Ό. Ьапе, Со1й 8рппд НагЬог Ргекк). По истечении 10 дней выращивания после гибридизации пулы гибридом, продуцирующих специфическое антитело, идентифицировали методом ЕЬГ8А, используя биотинилированный рекомбинантный белок ГЬ-22-ВНК человека и биотинилированный рекомбинантный белок тиГЬ-22-Е. сой в качестве отдельных мишеней для антитела. Положительные пулы гибридом по результатам обоих анализов ЕЬГ8А подвергали дальнейшему анализу в отношении способности блокировать или ослаблять клеточнопролиферативную активность (анализ нейтрализации) очищенного рекомбинантного белка тцГЬ-22-Е.сой в клетках ΒаΕ3/СКР2-4/Г^-22КΛ (примеры 2 и 3).

Положительные пулы гибридом по результатам отдельно осуществленного анализа ЕЬГ8А или анализа ЕЬГ8А в сочетании с анализом нейтрализации клонировали по крайней мере два раза методом ограниченного разведения.

- 77 015706

Моноклональные антитела, очищенные от культуральной среды, исследовали на пригодность для количественного определения методом ЕББЗА рекомбинантного и нативного ББ-22 человека в пробах сыворотки мыши и человека. Два отобранных антитела, использованных при осуществлении количественного анализа, позволили достичь более низкого предела обнаружения, соответствующего примерно 1 нг/мл рекомбинантного белка йиББ-22-Е.со11 в 100% сыворотке человека.

Моноклональные антитела, очищенные от культуральной среды, исследовали в отношении их способности блокировать или ослаблять клеточно-пролиферативную активность (анализ нейтрализации) очищенного рекомбинантного белка йиШ-22-Е.со11 или шиШ-22-Е.со11 в клетках ВаЕ3/СКР2-4/Ш-22КА (примеры 2 и 3). Подобным образом было идентифицировано шесть нейтрализующих моноклональных антител. Гибридомы, экспрессирующие нейтрализующие моноклональные антитела к ББ-22 человека, были депонированы в патентный депозитарий Американской коллекции типовых культур (АТСС; Маиаккак, УА) в качестве первичных депозитов согласно Будапештскому соглашению под следующими номерами доступа АТСС: клон 266.16.1.4.4.1 (обозначение патентного депозита АТСС РТА-5035); клон 266.5.1.2.2.3 (обозначение патентного депозита АТСС РТА-5033); клон 267.17.1.1.4.1 (обозначение патентного депозита АТСС РТА-5038); клон 267.4.1.1.4.1 (обозначение патентного депозита АТСС РТА5037); клон 266.12.6.1.3.2.1 (обозначение патентного депозита АТСС РТА-5034); клон 266.19.1.10.5.2 (обозначение патентного депозита АТСС РТА-5036) и клон 267.9.1.1.4.1 (обозначение патентного депозита АТСС РТА-5353).

Пример 18. Моноклональные антитела против ББ-22КА.

Моноклональные антитела были получены в результате иммунизации 4 крыс Бе\\зк (Коск1аиб Бшшииосйеш1са1к, СйЬейкуШе, РА) расщепленным и очищенным рекомбинантным слитым белком, шиББ22КА-Рс (ЗЕО Ш N0: 4). Крысам сначала внутрибрюшинно (БР) инъецировали 100 мкг очищенного рекомбинантного слитого белка в полном адъюванте Фрейнда (Р1егсе, КоскГогб, ББ), затем повторно внутрибрюшинно инъецировали 50 мкг очищенного рекомбинантного белка в неполном адъюванте Фрейнда через каждые две недели в течение четырех недель. После первых четырех недель иммунизации внутрибрюшинные бустер-инъекции 50 мкг расщепленного очищенного рекомбинантного белка, связанного с белком-носителем, являющимся гемоцианином лимфы улитки (КБН, Рейсе, КоскГогб, ББ), в неполном адъюванте Фрейнда осуществляли через каждые две недели в течение четырех недель. Через 7-10 дней после четвертой бустер-инъекции у животных брали пробы крови и сыворотки.

Пробы сыворотки крыс, специфичной к шиББ-22КА, исследовали методом ЕББЗА, используя 500 нг/мл очищенного рекомбинантного слитого белка шиББ-22КА-Рс в качестве мишени для специфического антитела и неродственного слитого белка в качестве мишени для неспецифического антитела.

Спленоциты, полученные у одной крысы с высоким титром, гибридизировали с миеломными клетками ЗР2/0 (мыши) в соответствии с оптимизированных РЕС-опосредуемым методом гибридизации (Коск1аиб Бштииосйешкак). По истечении 12 дней выращивания после гибридизации пулы гибридом, продуцирующий специфическое антитело, идентифицировали методом ЕББЗА, используя 500 нг/мл очищенного рекомбинантного слитого белка шиББ-22КА-Рс-Ву в качестве мишени для специфического антитела и неродственного слитого белка в качестве мишени для неспецифического антитела. Только пулы гибридом, продуцирующих специфическое антитело, анализировали в отношении их способности блокировать или ослаблять клеточно-пролиферативную активность (анализ нейтрализации) очищенного рекомбинантного белка шиШ-22-Е.со11 в клетках ВаР3/СКР2-4/Ш-22КА (примеры 2 и 3) и способности связываться с клетками ВаР3/СКР2-4/ББ-22КА, используемыми в качестве мишени для антитела, при осуществлении анализа методом РАСЗ (примеры 2 и 3).

Пулы гибридом, продуцирующих специфическое антитело по результатам анализа ЕББЗА, и пулы гибридом, продуцирующих неспецифическое антитело по результатам анализа методом РАСЗ или нейтрализующего анализа, клонировали по крайней мере два раза методом ограничения разведения.

Моноклональные антитела, находящиеся в культуральной среде, исследовали в отношении их способности блокировать или уменьшать пролиферацию клеток ВаР3/СКР2-4/Ш-22КА (примеры 2 и 3), выращенных в присутствии очищенных рекомбинантных белков шиББ-22-Е.со11 или йиББ-22-ВНК. Было идентифицировано четырнадцать нейтрализующих моноклональных антител и клонировано девять моноклональных антител.

Гибридомы, экспрессирующие нейтрализующие моноклональные антитела к ББ-22КА мыши по настоящему изобретению, были депонированы в патентный депозитарий Американской коллекции типовых культур (АТСС; Маиаккак, УА) в качестве первичных депозитов согласно Будапештскому соглашению под следующими номерами доступа АТСС: клон К2.1.1.С11.1 (обозначение патентного депозита АТСС РТА-6035); клон К2.1.5.Р4.1 (обозначение патентного депозита АТСС РТА-6024); клон К2.1.5.Н8.1 (обозначение патентного депозита АТСС РТА-6025); клон К2.1.12С7.1 (обозначение патентного депозита АТСС РТА-6036); клон К2.1.13.С8.1 (обозначение патентного депозита АТСС РТА-5037); клон К2.1.15Е2.1 (обозначение патентного депозита АТСС РТА-6038); клон К2.1.16С11.1 (обозначение патентного депозита АТСС РТА-6039); клон К2.1.18С8.1 (обозначение патентного депозита АТСС РТА6040) и клон К2.1.21С8.2 (обозначение патентного депозита АТСС РТА-6111).

Гибридомы, экспрессирующие нейтрализующие моноклональные антитела к ББ-22КА человека бы

- 78 015706 ли депонированы в патентный депозитарий Американской коллекции типовых культур (АТСС; Мапаккак, УА) в качестве первичных депозитов согласно Будапештскому соглашению под следующими номерами доступа АТСС: клон 280.46.3.4 (обозначение патентного депозита АТСС РТА-6284); клон 281.73.49.1.1 (обозначение патентного депозита АТСС РТА-6285); клон 283.4.1.2 (обозначение патентного депозита АТСС РТА-6287); клон 283.52.5.4 (обозначение патентного депозита АТСС РТА-6311) и клон 283.108.2.3 (обозначение патентного депозита АТСС РТА-6286).

Пример 19. Сродство связывания двух моноклональных антител крысы против Ш^КА мыши.

Антитело козы, специфичное к убдС-Рс крысы (басккоп), было иммобилизовано на биочипе СМ5 Вюсоге. Анализ был оптимизирован с достижением связывания каждого моноклонального антитела с улавливающей поверхностью антитела против гаммабдС-Рс крысы, после чего в моноклональное антитело инъецировали Ш^КА в разных концентрациях для исследования ассоциации (Ка) и диссоциации (Кб). После предварительного испытания было обнаружено неспецифическое связывание между слитым белком и улавливающей поверхностью биочипа. Была приобретена ампула с Ш^КА, имеющим метку Рс4, расщепляемую тромбином, который затем исследовали для выявления фоновых эффектов. После каждого испытания поверхности регенерировали для антитела против гамма-IдС-Рс крысы при помощи 2 инъекций 20 мМ НС1. Данные, полученные для каждого моноклонального антитела, использовали для оценки кинетики связывания антитела против Ш^КА с белком Ш^КА при помощи программного обеспечения для осуществления оценки (В^уШиа!^ койкаге уегкюп 3.2, Рйатшааа ВМсоге, Иррка1а, 8кебеп), как показано в приведенной ниже табл. 12.

Таблица 12

Клон К2.1.5Е4.1**	Клон К2.1.1.5Е2.1**
ка (М-15-1)	1,49Е+06	ка (М-13-1)	1,76Е+0б
кЬ (з-1)	1,70Е-04	кс! (з-1)	2,55Е-04
КА (М-1)	8,76Е+09	КА (М-1)	б,66Е+09

КО (М)	1,14Е-10	КО (М)	1,504Е-Ю
СМ2	2,08	СМ2	1,5

** Показаны константы скорости равновесной ассоциации (Ка) и диссоциации (Кб) для каждого моноклонального антитела против I^-22КА, значения которых находятся в пределах, ограниченных возможностями вычислительной техники.

СЫ2 означает сумму квадрата остатков между кривыми связывания и кривыми согласования оценок. Чем ближе к 0, тем более достоверными являются данные.

Как показано в табл. 12, оба моноклональных антитела против Ш^КА сильно связываются с белком 1В-22КА, что подтверждает связывание в пикомолярной концентрации с Ш^КА (метка Рс4, расщепляемая тромбином). Полученные данные характеризуются высокой степенью достоверности с учетом низких значений СЫ2 и показывают, что клон К2.1.5Р4.1 моноклональных антител обладает немного более сильным сродством к рецептору Ш^КА.

Пример 20. Иммуногистохимический анализ экспрессии белка ΙΕ-22 ш у1уо в образцах ткани.

A. Краткий обзор.

Иммуногистохимический (ШС) анализ экспрессии и локализации белка ΙΕ-22 осуществляли, используя моноклональное антитело против ΙΕ-22 человека (анти-ЫЬ-22) (МАВ 266.19.1.10.5.2) в следующих образцах ткани: сетка с несколькими нормальными тканями человека и сетка с опухолевыми тканями; образцы пораженной ткани поджелудочной железы, легкого и почки человека; образцы ткани человека, пораженной псориазом; ткани поджелудочной железы трансгенных мышей, экспрессирующих ΙΕ22-ΙΝ8 (экспрессированный из промотора инсулина крысы) и мышей дикого типа (^Т); образцы кожи трансгенных мышей, экспрессирующих тиI^-22Εи^СК, и мышей дикого типа (^Т); образец ободочной кишки мыши, пораженной О88-индуцированным колитом (дикого типа и с отсутствием ΙΕ-22). Кроме того, сравнивали картину окрашивания при использовании моноклонального антитела против ЫЬ-22 МАВ 266.19.1.10.5.2 (пример 17) и поликлонального антитела (антитело против ЫЬ-22 кролика) (пример 16).

Были исследованы моноклональные антитела крысы против Ш-22 человека МАВ 266.16.1.4.4.1 и МАВ 266.19.1.10.5.2 (пример 17), которые, как было установлено, окрашивают большинство клеток ВНК/Ш-22 человека (>50%), а также некоторые клетки ВНК/Ш-22 мыши (1-5%), поэтому указанные клетки использовали для исследования распределения в тканях и экспрессии Ш-22, как в образцах ткани человека, так и в образцах ткани животной модели, и полученную картину окрашивания сравнивали с поликлональным антителом кролика для подтверждения результатов.

B. Материалы и методы.

Клетки и ткани человека и животных моделей с использованием мышей фиксировали в формалине, заливали парафином и изготавливали срезы толщиной 5 мкм. Указанные клетки включали клетки ВНК,

- 79 015706 экспрессирующие ГЬ-22 человека или мыши, и клетки дикого типа, соответственно, в качестве положительных контрольных образцов и отрицательных контрольных образцов. Ткани человека были представлены на контрольном предметном стекле для нескольких тканей (№гта1Спб™; Вютеба, Еоз!ег Сбу, СА), включающем 50 срезов разных нормальных тканей человека (например, головного мозга, гипофиза, надпочечника, молочной железы, почки, сердца, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, печени плода, печени, кожи, поджелудочной железы, легкого, миндалины, яичника, яичка, предстательной железы, матки, плаценты, щитовидной железы и селезенки); на контрольном предметном стекле для нескольких тканей (ТитогСпб™; Вютеба, Еоз!ег Сбу, СА), включающем 50 срезов разных опухолей человека (например, аденокарциномы легкого, аденокарциномы печени, аденокарциномы почки, аденокарциномы ободочной кишки, аденокарциномы молочной железы, аденокарциномы щитовидной железы, аденокарциномы желудка, аденокарциномы предстательной железы, аденокарциномы поджелудочной железы, аденокарциномы яичника, лимфомы, меланомы, саркомы Юдинга, эпителиоидной саркомы, саркомы МЕН, рабдомиосаркомы, карциноидной опухоли, недифференцированной карциномы, мезотелиомы, тератомы и семиномы); ткань карциномы легкого, приобретенную в СНТN (Соорегабоп Нитап Т1ззие №!теогк, С^е1епб, 0бю); ткань нормальной поджелудочной железы, ткань поджелудочной железы, пораженной хроническим панкреатитом, ткань легкого, пораженного хроническим периваскулярным воспалением, ткань почек, пораженных множественным гломерулосклерозом, мезангиопролиферативным гломерулонефритом или склеротическим гломерулярным интерстициальным фиброзом, приобретенную в ХОНГ (№!юпа1 Ь1зеазе Незеагсй Гп!егсйапде, РЫ1абе1рЫа, РА); и образцы кожи человека, пораженной псориазом. Ткани мыши включали ткани ободочной кишки, полученные у мышей из животной модели воспалительного заболевания кишечника (модель 088-индуцированного колита, самки мышей 8 \\ззз VеЬз!е^) и животной модели колита у мышей дикого типа и мышей с отсутствием ГЬ-20 (мыши, подвергнутые воздействию Ό88, дикого типа и самки мышей с отсутствием ГЬ-20 (ГЬ-20), которые получали носитель или 4% Ό88 в питьевой воде в течение 7 дней; и образцы кожи, полученные у трансгенных (ТС) животных, экспрессирующих тГЬ^-ЕиЬСК, контрольных животных, экспрессирующих 1166-22-^8, и трансгенных животных. Один срез в каждом блоке/предметном стекле окрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е) для гистологического исследования, и остальные срезы подвергали иммуногистохимическому окрашиванию для определения экспрессии и локализации белка ГЬ-22.

Для осуществления иммуногистохимического анализа клетки и срезы ткани помещали на предметные стекла СйетМа!е™ СарШагу Сар Р1из (ВюТек, V^ηοοзк^. Уегтоп!), сушили в сушильном шкафу при 60°С в течение 60 мин и удаляли парафин в стандартных условиях, выдерживая 3х5 мин в ксилоле, 4 мин в 100% Е!0Н, 3 мин в 100% Е!0Н и 2 мин в 95% Е!0Н. Затем в соответствии с инструкциями изготовителя (2утеб, 8ои!й 8ап Егапазсо, СА) осуществляли стадию индуцируемого ферментом восстановления антигенной детерминанты в срезах ткани при использовании пепсина при 37°С в течение 20 мин (беоМагкегз Еетоп!, СА) и стадию блокирования авидином/биотином. Окрашивание производили в автоматическом устройстве для иммунного окрашивания ТесйМа!е 500™, и иммуногистохимический анализ на иммунопероксидазу (ГР) осуществляли в устройстве, визуализирующем авидин-биотиновый комплекс (Уеп!апа Вю!ек 8уз!етз, Тисзоп, А2). В автоматическом устройстве для иммунного окрашивания ТесйМа!е 500™ использован принцип капиллярного действия, и при осуществлении анализа на иммунопероксидазу использован тип иммунного окрашивания, определяемый как многослойный метод. Срезы предварительно блокировали 5% нормальной сывороткой козы (Уес!ог, Вигбпдате, СА) в РВ8 в течение 10 мин, затем 1 раз промывали однократным буфером (81дпе!, Оебйат, МА), инкубировали с первичным антителом против ГЬ-22 (МАВ 266.19.1.10.5.2) (пример 17), очищали РА8 в количестве 2,04 мг/мл, разводили в отношении 1:800 в течение 30 мин при комнатной температуре и 1 раз промывали 5-кратным буфером. Первичное антитело разводили в буфере для разведения антител ТесйМа!е 500™ (Уеп!апа). В качестве вторичных связывающих антител использовали биотинилированное антитело козы против ГдС крысы (Уес!ог), разведенное в отношении 1:200, 5% нормальную сыворотку козы и 25% обезжиренное сухое молоко в РВ8 в течение 25 мин при комнатной температуре, затем 1 раз промывали однократным буфером и 2-3 раза промывали однократным буфером (81дпе!). Срезы тканей подвергали воздействию 3% пероксидом водорода (НР) 3 раза по 7 мин (Уеп!апа) и 2-3 раза промывали 3-кратным буфером. Срезы ткани метили иммунопероксидазой, используя для указанной цели набор пероксидаз ЬАВ (Уеп!апа), инкубировали с авидин-биотиновым комплексом (АВС) в течение 30 мин, затем 2-3 раза промывали 5кратным буфером и диаминобензидином (ЬАВ) 4 раза по 4 мин, 2-3 раза промывали 2-кратным буфером и однократным объемом воды (81дпеЬ. номер по каталогу 2340). Затем ткани окрашивали метиленовым зеленым в течение 10 мин для исследования в счетном устройстве (Оако, номер по каталогу 81962), 2-3 раза промывали 2-кратным буфером и 3-кратным объемом воды. Контрольные образцы подвергали воздействию неиммунной первичной сыворотки, используя контрольный изотип первичного антитела крысы (2утеб) для замены первичного антитела.

Картину иммунного окрашивания исследовали под микроскопом 01утриз ВН-2 и полученные изображения фотографировали цифровой камерой Сοο18NАΡ НО (КоЬег 8с1епбйс, Тисзоп, А2).

- 80 015706

С. Результаты.

Линии положительных и отрицательных контрольных клеток. МАВ 266.19.1.10.5.2, моноклональное антитело против ЫЬ-22 характеризовалось положительным окрашиванием как в клетках ВНК, экспрессирующих 1Ь-22 человека (+++), так и в клетках ВНК, экспрессирующих 1Ь-22 мыши (+), при этом окрашивание отсутствовало в клетках ВНК дикого типа (-). Все линии положительных и отрицательных клеток ВНК с отрицательным контрольным изотипом крысы для замены первичного антитела не были окрашены (-), из чего следует, что указанное антитело является специфичным к лиганду 1Ь-22. Данное антитело обладало перекрестной иммунореактивностью с 1Ь-22 человека и мыши.

Ткани человека. Исследовали сетку с несколькими нормальными тканями человека и сетку с опухолевыми тканями; образцы пораженной ткани поджелудочной железы, легкого и почки; и образцы кожи человека, пораженной псориазом. Указанные ткани человека включали: 1) ткани головного мозга, гипофиза, надпочечника, молочной железы, почки, сердца, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, печени плода, печени, кожи, поджелудочной железы, легкого, миндалины, яичника, матки, яичка, плаценты, щитовидной железы и селезенки на контрольных предметных стеклах для нескольких тканей (№згта1Спб™)/нормальные ткани человека; 2) ткани аденокарциномы легкого, аденокарциномы печени, аденокарциномы почки, аденокарциномы щитовидной железы, аденокарциномы желудка, аденокарциномы предстательной железы, аденокарциномы поджелудочной железы, аденокарциномы яичника, лимфомы, меланомы, саркомы Юдинга, эпителиоидной саркомы, саркомы МЕН, рабдомиосаркомы, карциноидной опухоли, недифференцированной карциномы, мезотелиомы, тератомы и семиномы на контрольных предметных стеклах для нескольких тканей (ТитогСпб™)/патологические ткани/опухоли человека; 3) нормальная ткань поджелудочной железы, ткань поджелудочной железы, пораженной хроническим панкреатитом, ткань легкого, пораженного хроническим периваскулярным воспалением, ткань легкого, пораженного карциномой, ткань почки, пораженной множественным гломерулосклерозом, ткань почки, пораженной мезангиопролиферативным гломерулонефритом, ткань почки, пораженной склеротическим гломерулярным интерстициальным фиброзом, приобретенную в компании СΗТN и/или N0^1

Ткани мыши. Исследовали поджелудочную железу трансгенных мышей £N8, экспрессирующих 1Ь22, и мышей дикого типа. Клетки, рассеянные по островкам поджелудочной железы трансгенных мышей £N8, экспрессирующих 1Ь-22, характеризовались сильным положительным окрашиванием (+++) моноклональным антителом МАВ 266.19.1.10.5.2, при этом в поджелудочной железе мышей дикого типа окрашивание отсутствовало (-).

Сравнение поликлональных и моноклональных антител. Установлено, что поликлональное антитело против 1Ь-22 (пример 16) является восприимчивым антителом, в то время как моноклональное антитело МАВ 266.19.1.10.5.2 является специфическим антителом. Поликлональное антитело характеризовалось положительным окрашиванием в клетках ВНК, экспрессирующих 1Ь-22 человека (+++), в клетках ВНК, экспрессирующих 1Ь-22 мыши (+), в разных образцах тканей человека и мыши (+) и в островках трансгенных мышей £N8, эспрессирующих ш1Ь-22 (+++). Положительное окрашивание наблюдалось в большем количестве островков у трансгенных мышей (по сравнению с мышами дикого типа). У трансгенных мышей окрашивание было распределено по всему островку (+++), в то время как у мышей дикого типа окрашивание было в основном ограничено периферией островка (+). Однако указанное антитело характеризовалось также неспецифическим окрашиванием в отрицательных контрольных клетках ВНК дикого типа (+). МАВ 266.19.1.10.5.2 характеризовалось положительным окрашиванием в клетках ВНК, экспрессирующих 1Ь-22 человека (+++), в клетках ВНК, экспрессирующих 1Ь-22 мыши (+), и в островках трансгенных мышей £N8, экспрессирующих ш1Ь-22 (+++). У трансгенных мышей окрашивание было распределено по всему островку (+++), в то время как у мышей дикого типа отсутствовало окрашивание островков (-).

Пример 21. Увеличение 1Ь-20 в образцах кожи человека, пораженной псориазом.

A. Праймеры РНК.

Были получены образцы нормальной кожи и кожи субъектов, страдающих псориазом. Последние образцы включали кожу с участков, пораженных псориазом, и кожу со смежных непораженных участков. РНК выделяли из образцов кожи человека стандартными методами. Целостность и качество образцов РНК исследовали в биоанализаторе АдПеп! 2100 (АдПеп! Тесйио1одхез, ^а1бЬгопи, Сегтаиу).

B. Праймеры и зонды для количественного анализа методом КТ-РСК.

В научной литературе описан количественный анализ методом КТ-РСК в реальном времени с использованием системы обнаружения последовательностей АВ1 РК18М 7700 (РЕ АррНеб Вхозуз!етз, 1пс., Еоз!ег Сйу, СА) (см. публикации Нехб, С.А. е! а1., Сеноте Кезеагсй 6:986-994, 1996; СхЬзоп, и.Е.М. е! а1., Сеноте Кезеагсй 6:995-1001, 1996; 8ипбагезап, 8. е! а1., Епбосгхпо1оду 139:4756-4764, 1998). Указанный метод включает использование геноспецифического зонда, содержащего репортерные и гасящие флуоресцентные красители. В случае интактного зонда излучение репортерного красителя рассеивается вследствие близости гасящего красителя. Во время удлинения цепи при помощи РСК с использованием дополнительных геноспецифических верхних и нижних праймеров зонд расщепляется под воздействием

- 81 015706

5'-3' нуклеолитической активности ДНК-полимеразы гТ1й, которая высвобождает репортерный краситель из зонда, в результате чего усиливается флуоресцентное излучение.

Праймеры и зонды, используемые при осуществлении количественных анализов экспрессии ΙΕ-20 методом ВТ-РСВ в реальном времени, были созданы при помощи программного обеспечения для создания праймеров Рптег Ехргекк™ (РЕ Аррйеб В1окук!етк, Еок!ег Сйу, СА). При осуществлении реакции РСВ (см. ниже) верхний праймер 2С40541 (8ЕЦ ΙΌ N0: 25) и нижний праймер 2С40542 (8ЕЦ ΙΌ N0: 26) были использованы в концентрации 800 нМ для синтеза продукта длиной 71 п. о. Соответствующий зонд к ΙΕ-20 ТацМап®, 2С40544 (8ЕЦ ΙΌ N0: 27) был синтезирован и снабжен меткой в компании РЕ Аррйеб В1окук!етк. Зонд к ΙΕ-20 был помечен у 5'-конца репортерным флуоресцентным красителем (6карбоксифлуоресцеин) (ЕАМ) (РЕ Аррйеб Вюкук!етк) и у 3'-конца гасящим флуоресцентным красителем (6-карбокситетраметилродамин) (ТАМВА) (РЕ Аррйеб Вюкук!етк).

С. Осуществление количественного анализа методом ВТ-РСВ в реальном времени.

Относительные уровни мРНК ΙΕ-20 определяли, анализируя образцы общей РНК при помощи набора основных реагентов для ВТ-РСВ ТацМап ΞΖ (РЕ Аррйеб В1окук!етк). Для построения стандартной кривой, используемой для осуществления количественного анализа, был получен укороченный транскрипт ΙΕ-20. Указанная кривая была построена в результате 10-кратных серийных разведений с образованием в общей сложности от около 1е8 до 1е3 копий полного транскрипта для ΙΕ-20, при этом каждую точку стандартной кривой анализировали трижды. Образцы общей РНК из кожи также трижды анализировали в отношении уровней транскрипта ΙΕ-20 человека и уровней ЬСИ8 в качестве эндогенного контрольного образца. Каждый образец РНК в общем объеме, равном 25 мкл, подвергали реакции ВТ-РСВ с использованием реагентов ТацМап ΒΖ (РЕ Аррйеб Вюкук!етк), включающих примерно 25 нг общей РНК в ОЕРС-обработанной воде (без ДНКазы/РНКазы), соответствующие праймеры (примерно 800 нм ΖС40541 (8ЕЦ ΙΌ N0: 25) и ΖС40542 (8ЕЦ ΙΌ N0: 26), соответствующий зонд (примерно 100 нМ ΖС40544 (8ЕЦ ΙΌ N0: 27), однократный буфер ТацМап ΒΖ, 3 мМ ацетата марганца, по 300 мкМ б-СТР, б-АТР и б-СТР и 600 мкМ б-ИТР, ДНК-полимеразу гТ!Ь (0,1 ед/мкл) и АтрЕгаке υNС (0,01 ед/мкл). Реакцию РСВ осуществляли в следующих условиях тепловой циклизации: начальная стадия обработки ТОС, состоящая из одного цикла при 50°С в течение 2 мин; стадия обратной транскрипции (ВТ), состоящая из одного цикла при 60°С в течение 30 мин; стадия дезактивации υNС, состоящая из одного цикла при 95°С в течение 5 мин; затем 40 циклов амплификации при 94°С в течение 20 с и при 60°С в течение 1 мин.

Относительные уровни РНК ΙΕ-20 определяли методом стандартной кривой в соответствии с инструкциями изготовителя, компании РЕ Вюкук!етк (Икег Ви11е!т № 2: ΑΒI Рпкт 7700 8ес.|иепсе Ое!ес!юп 8ук!ет, Ве1айуе ОнапШаПоп оГ Сепе Ехргеккюп, ЭесетЬег 11, 1997). Измерения ЬСИ8 использовали для нормализации уровней ΙΕ-20. Полученные данные приведены в нижеследующей табл. 13.

Таблица 13

Образец кожи	ΙΕ-20
Нормальная	2903
Непораженный участок	7233
Пораженный участок	27695

Несмотря на то, что мРНК ΙΕ-20 была обнаружена в образцах кожи здоровых субъектов или кожи с непораженных участков, наблюдалось значительное увеличение транскрипта ΙΕ-20 в пораженной коже субъектов, страдающих псориазом. Субъединицы рецепторов для ΙΕ-20, включающие I^-20ВΑ, Ш-22ВА (Ш-22ВА) и №20^, были экспрессированы в нормальной и пораженной коже человека. Полученные данные подтверждают сильную ассоциацию ΙΕ-20 с псориазом человека.

Сверхэкспрессия ΙΕ-20 была обнаружена в псориатических поражениях человека, из чего следует, что ΙΕ-20 опосредует псориаз человека. Кроме того, как указано в настоящем описании изобретения, сверхэкспрессия ΙΕ-20 у трансгенных мышей сопровождается утолщением эпидермиса и рекрутингом иммунокомпетентных клеток, характерными для псориатического фенотипа. Такие данные, полученные ш у1уо, позволяют далее предположить, что ΙΕ-20 опосредует псориаз. Таким образом, антагонисты активности ΙΕ-20, такие как моноклональные антитела против I^-22ВΑ человека по настоящему изобретению, а также растворимые рецепторы и антитела к ним, нейтрализующие и моноклональные антитела против Ш-20 могут быть использованы в качестве антагонистов Ш-20 при терапевтическом лечении воспалительных заболеваний, таких как псориаз, и других заболеваний, раскрытых в настоящем описании изобретения.

Пример 22. Увеличение Ш-20 в образцах кожи человека, пораженной атопическим дерматитом.

А. Образцы РНК.

Были получены образцы нормальной кожи и кожи субъектов, страдающих атопическим дерматитом. РНК выделяли из образцов кожи человека стандартными методами. Целостность и качество образцов РНК исследовали в биоанализаторе Адйеп! 2100 (Адйеп! ТесЬпо1од1ек, Vа1бЬ^οηη, Сегтапу).

- 82 015706

B. Праймеры и зонды для количественного анализа методом КТ-РСК.

В научной литературе описан количественный анализ методом КТ-РСК в реальном времени с использованием системы обнаружения последовательностей АЫ РК18М 7700 (РЕ АррЬей Вюзуз!етз, ГОс., Еоз!ег СЬу, СА) (см. публикации Не1й, С.А. е! а1., Сепоте КезеагсЬ 6:986-994, 1996; С1Ьзоп, и.Е.М. е! а1., Сепоте КезеагсЬ 6:995-1001, 1996; 8ипйагезап, 8. е! а1., Епйосгто1оду 139:4756-4764, 1998). Указанный метод включает использование геноспецифического зонда, содержащего репортерные и гасящие флуоресцентные красители. В случае интактного зонда излучение репортерного красителя рассеивается вследствие близости гасящего красителя. Во время удлинения цепи при помощи РСК с использованием дополнительных геноспецифических верхних и нижних праймеров зонд расщепляется под воздействием 5'-3' нуклеолитической активности ДНК-полимеразы гТ£Ь, которая высвобождает репортерный краситель из зонда, в результате чего усиливается флуоресцентное излучение.

Праймеры и зонды, используемые при осуществлении количественных анализов экспрессии ГЬ-20 методом КТ-РСК в реальном времени, были созданы при помощи программного обеспечения для создания праймеров Рптег Ехргезз™ (РЕ АррЬей В1озуз!етз, Еоз!ег Сйу, СА). При осуществлении реакции РСК (см. ниже) верхний праймер ΖС40541 (8ЕО ГО N0: 25) и нижний праймер ΖС40542 (8ЕО ГО N0: 26) были использованы в концентрации 800 нМ для синтеза продукта длиной 71 п.о. Соответствующий зонд к ГО-20 ТадМап®, ΖС40544 (8Е0 ГО N0: 27) был синтезирован и снабжен меткой в компании РЕ АррЬей В1озуз!етз. Зонд к ГО-20 был помечен у 5'-конца репортерным флуоресцентным красителем (6карбоксифлуоресцеин) (ЕАМ) (РЕ АррЬей Вюзуз!етз) и у 3'-конца гасящим флуоресцентным красителем (6-карбокситетраметил-родамин) (ТАМКА) (РЕ АррЬей Вюзуз!етз).

C. Осуществление количественного анализа методом КТ-РСК в реальном времени.

Относительные уровни мРНК ГО-20 определяли, анализируя образцы общей РНК при помощи набора основных реагентов для КТ-РСК ТадМап ΞΖ (РЕ АррЬей В1озуз!етз). Для построения стандартной кривой, используемой для осуществления количественного анализа, был получен укороченный транскрипт ГО-20. Указанная кривая была построена в результате 10-кратных серийных разведений с образованием в общей сложности от около 1е8 до 1е3 копий полного транскрипта для ГО-20, при этом каждую точку стандартной кривой анализировали трижды. Образцы общей РНК из кожи также трижды анализировали в отношении уровней транскрипта ГО-20 человека и уровней ЬСИ8 в качестве эндогенного контрольного образца. Каждый образец РНК в общем объеме, равном 25 мкл, подвергали реакции КТ-РСК с использованием реагентов Тас.|Мап ΞΖ (РЕ АррЬей Вюзуз!етз), включающих примерно 25 нг общей РНК в ОЕРС-обработанной воде (без ДНКазы/РНКазы), соответствующие праймеры (примерно 800 нм ΖС40541 (8Е0 ГО N0: 25) и ΖС40542 (8Е0 ГО N0: 26), соответствующий зонд (примерно 100 нМ ΖС40544 (8Е0 ГО N0: 27), однократный буфер Тас.|Мап ΞΖ, 3 мМ ацетата марганца, по 300 мкМ й-СТР, й-АТР и й-СТР и 600 мкМ й-ИТР, ДНК-полимеразу гТ!Ь (0,1 ед/мкл) и АтрЕгазе υNС (0,01 ед/мкл). Реакцию РСК осуществляли в следующих условиях тепловой циклизации: начальная стадия обработки Шб, состоящая из одного цикла при 50°С в течение 2 мин; стадия обратной транскрипции (КТ), состоящая из одного цикла при 60°С в течение 30 мин; стадия дезактивации ЦИС, состоящая из одного цикла при 95°С в течение 5 мин; затем 40 циклов амплификации при 94°С в течение 20 с и при 60°С в течение 1 мин.

Относительные уровни РНК ГО-20 определяли методом стандартной кривой в соответствии с инструкциями изготовителя, компании РЕ Вюзуз!етз (Изег Ви11е!т № 2: ΑВI Рпзт 7700 8ес.|иепсе Ое!ес!юп 8уз!ет, Ке1айуе ОнапШаЕоп оГ Сепе Ехргеззюп, ЭесетЬег 11, 1997). Измерения ЬСИ8 использовали для нормализации уровней ГО-20.

мРНК ГО-20 была обнаружена в образцах кожи на низком уровне (примерно 800 копий). В отличие от этого в коже субъектов, страдающих атопическим дерматитом, имело место значительное увеличение транскрипта ГО-20 (примерно 8600 копий). Субъединицы рецепторов для ГО-20, включающие ГО-20КА, ГО-22КА и ГО-20КВ, были экспрессировали в нормальной и пораженной коже человека. Полученные данные подтверждают сильную ассоциацию ГО-20 с атопическим дерматитом человека.

Сверхэкспрессия ГО-20 была обнаружена в образцах кожи человека, пораженной атопическим дерматитом, из чего следует, что ГО-20 опосредует атопический дерматит человека. Кроме того, как указано в настоящем описании изобретения, сверхэкспрессия ГО-20 у трансгенных мышей сопровождается утолщением эпидермиса и рекрутингом иммунокомпетентных клеток, характерными для фенотипа атопического дерматита. Такие данные, полученные ш у1уо, позволяют далее предположить, что ГО-20 опосредует атопический дерматит. Таким образом, антагонисты активности ГО-20, такие как моноклональные антитела против ГО-22КА человека по настоящему изобретению, а также растворимые рецепторы и антитела к ним, нейтрализующие и моноклональные антитела против ГО-20 могут быть использованы в качестве антагонистов ГО-20 при терапевтическом лечении воспалительных заболеваний, таких как атопический дерматит, и других заболеваний, раскрытых в настоящем описании изобретения.

Пример 23. Увеличение ГО-8 под воздействием ГО-20.

Нормальные эпидермальные кератиноциты новорожденного (ЯНЕК) (компании ОопеОсз) после 2го пассажа культивировали и выращивали до слияния на 12-луночных культуральных планшетах.

- 83 015706

КОМ (среда для выращивания кератиноцитов) была приобретена в компании С'Чопейсв. После слияния клетки промывали средой КОМ без факторов роста=КВМ (базальная среда для кератиноцитов). Клетки выращивали в бессывороточной среде КВМ в течение 72 ч, после чего добавляли испытуемые соединения. В качестве положительных контрольных образцов использовали тромбин в количестве 1 м. ед./мл и трипсин в количестве 25 нМ. В каждую лунку добавляли один мл среды/лунку. В качестве отрицательного контрольного образца использовали только среду КВМ.

ΙΕ-20 получали в среде КВМ и добавляли в разных концентрациях от 2,5 мкг/мл до 618 нг/мл в первом эксперименте и от 2,5 мкг/мл до 3 нг/мл во втором эксперименте.

Клетки инкубировали при 37°С, 5% С0₂ в течение 48 ч. Супернатанты удаляли и замораживали при -80°С в течение нескольких дней до анализа уровней ΙΕ-8 и ОМ-С8Е. Для определения продуцирования цитокинов использовали набор для иммуноанализа Ш-8 человека № Ό8050 (ЕапбЭ 8ув!етв, Шс.) и набор для иммуноанализа ОМ-С8Е человека № Н8ОМ0 (КапбО 8ув!етв. Шс.) в соответствии с инструкциями изготовителя.

Результаты показали, что цитокин Ш-20 индуцировал экспрессию ΙΕ-8 и ОМ-С8Е.

Пример 24. Увеличение воспалительных цитокинов под воздействием Ш-20.

Линию кератиноцитов человека НаСаТ выращивали при 37°С в течение нескольких дней после слияния в культуральных флаконах Т-75. В указанный период времени нормальную питательную среду (ЭМЕМ + 10% ЕВ8) удаляли и заменяли бессывороточной средой. Клетки инкубировали в течение двух дней при 37°С. Затем среду ЭМЕМ удаляли и по четыре флакона с клетками в каждом эксперименте подвергали обработке в нижеследующих условиях в течение 4 ч при 37°С: рекомбинантный (гН) а-Ш-1 человека в количестве 5 нг/мл, гН а-Ш-1 в количестве 20 нг/мл, гН а-Ш-1 в количестве 5 нг/мл+Ш-20 в количестве 1 мкг/мл, Ш-20 в количестве 1 мкг/мл или гН ЕБ-10 в количестве 10 нг/мл.

После обработки цитокинами среду удаляли и клетки лизировали в растворе тиоцианата гуанидиния. Общую РНК выделяли из клеточного лизата центрифугированием в течение ночи в градиенте хлорида цезия. На следующий день осадок РНК ресуспендировали в растворе ТЕ/8Э8 и осаждали этанолом. Осуществляли количественное определение РНК в спектрофотометре, затем обрабатывали ДНКазой в соответствии с описанием, приведенным в руководстве пользователя 8есБоп У.В. о Г С1оп!есН'в АБав™ сЭНА Ехргеввюп Аггаув Ивег Мапиа1 (уегвюп РТ3140-1/РК9Х390, риЬБвйеб 11/5/99). Качество образцов РНК подтверждали путем вычисления чистоты на основании данных спектроскопии и визуализации на агарозном геле. Контаминирование генома в образцах РНК исключали в результате осуществления анализа методом РСК гена β-актина.

Обогащение полиА+, синтез зонда и гибридизацию осуществляли на матрице А!1ав™ в соответствии с инструкциями компании С1оп!есН (см. приведенное выше руководство и руководство пользователя АБав™ Риге То!а1 КЫА ЬаЬеБпд 8ув!ет Ивег Мапиа1, РТ3231-1/РК96157, риЬБвйеб 6/22/99). РНК полиА+ выделяли из 50 мг общей РНК при помощи магнитных шариков, покрытых стрептавидином (С1оп!есН, Рао1о А1!о, СА), и магнитного сепаратора частиц. РНК полиА+ метили а³²Р-бАТр методом КТ-РСК. При осуществлении указанной реакции использовали праймеры СЭ8 компании С1оп1есБ, специфичные к 268 генам на матрице цитакинов/рецепторов человека А!1ав™ (номер по каталогу 7744-1). Меченый зонд выделяли хроматографией на колонках и производили подсчет в сцинтилляционной жидкости.

Матрицы АБав™ предварительно гибридизировали с С1оп!ес11 ЕхргеввНуЬ в комбинации с 100 мг/мл денатурированной нагреванием ДНК спермы лосося в течение по крайней мере 30 мин при 68°С при непрерывном перемешивании. Мембраны гибридизировали с 1,9х10⁶ СРМ/мл (всего 1,14х10⁷ СРМ) в течение ночи при 68°С при непрерывном перемешивании. На следующий день мембраны 4 раза промывали в 2-кратном объеме 88С, 1% 8Ό8 при 68°С в течение 30 мин, один раз в 0,1-кратном объеме 88С, 0,5% 8Ό8 при 68°С в течение 30 мин и один раз в 2-кратном объеме 88С при комнатной температуре в течение 5 мин. Мембраны на матрицах помещали в пластиковые мешки Кобак, герметично закрывали и подвергали воздействию фосфорного экрана визуализирующего устройства в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день изображение на фосфорных экранах сканировали в визуализирующем устройстве и полученные данные анализировали при помощи программного обеспечения Аΐ1авIтаде™ 1,0 компании С1оп!есН.

Увеличение активности генов под воздействием ΙΕ-20.

1. Содержание фактора невроза опухолей (ТНЕ) увеличилось под воздействием Ш-20 в 1,9-2,4 раза.

2. Содержание плацентарных факторов роста 1 и 2 (РЬОЕ) увеличилось под воздействием Ш-20 в 1,9-2,0 раза.

3. Содержание рецепторов фактора свертывания крови ΙΙ увеличилось под воздействием ΙΕ-20 в 2,02,5 раза.

4. Содержание рецепторов кальцитонина увеличилось под воздействием Ш-20 в 2,2-2,3 раза.

5. Содержание ТНЕ-индуцируемого гиалуронатсвязывающего белка Т8О-6 увеличилось под воздействием Ш-20 в 2,1-2,2 раза.

6. Содержание предшественника рецептора-1 эндотелиального фактора роста сосудов (УЕОЕ), рецептора тирозинпротеинкиназы (ЕЬТ-1) (8ЕЬТ) увеличилось под воздействием Ш-20 в 2,1-2,7 раза.

- 84 015706

7. Содержание МВР-9 (кальцийсвязывающий белок в макрофагах, родственный МГЕ) увеличилось под воздействием Ш-20 в 2,9-4,1 раза.

8. Содержание МВР-14 (кальцийсвязывающий белок в макрофагах, родственный МГЕ) увеличилось под воздействием Ш-20 в 3,0-3,8 раза.

9. Содержание релаксина Н2 увеличилось под воздействием ГБ-20 в 3,14 раза.

10. Содержание рецептора Ш трансформирующего β-фактора роста (ТСЕР) с молекулярной массой 300 кДа увеличилось под воздействием ГБ-20 в 2,4-3,6 раза.

Гены, характеризующиеся синергическим действием при обработке ГБ-20+ГБ-Б

1. Содержание костного морфогенного белка 2а увеличилось под воздействием одного ГБ-20 в 1,8 раза, под воздействием одного ГБ-1 в 2,5 раза и при совместном воздействии ГБ-20 и ГБ-1 в 8,2 раза.

2. Содержание МВР-8 увеличилось под воздействием одного ГБ-20 в 2,9 раза, под воздействием одного ГБ-1 в 10,7 раза и при совместном воздействии ГБ-20 и ГБ-1 в 18,0 раз.

3. Содержание эритроид-дифференцирующего белка (БОЕ) увеличилось под воздействием одного ГБ-20 в 1,9 раза, под воздействием одного ГБ-1 в 9,7 раза и при совместном воздействии ГБ-20 и ГБ-1 в 19,0 раз.

4. Содержание МВР-14 (кальцийсвязывающий белок в макрофагах, родственный МГЕ) увеличилось под воздействием одного ГБ-20 в 3,0 раза, под воздействием одного ГБ-1 в 12,2 раза и при совместном воздействии ГБ-20 и ГБ-1 в 20,3 раза.

5. Содержание гепаринсвязывающего ЕСЕ-подобного фактора роста увеличилось под воздействием одного ГБ-20 в 2,0 раза, под воздействием одного ГБ-1 в 14 раз и при совместном воздействии ГБ-20 и ГБ1 в 25,0 раз.

6. Содержание β-тромбоглобулинподобного белка увеличилось под воздействием одного ГБ-20 в 1,5 раза, под воздействием одного ГБ-1 в 15 раз и при совместном воздействии ГБ-20 и ГБ-1 в 27 раз.

7. Содержание выделенного из головного мозга нейротрофического фактора (ВЭЧЕ) увеличилось под воздействием одного ГБ-20 в 1,7 раза, под воздействием одного ГБ-1 в 25 раз и при совместном воздействии ГБ-20 и ГБ-1 в 48 раз.

8. Содержание фактора гемотаксиса и активации моноцитов (МСАЕ) увеличилось под воздействием одного ГБ-20 в 1,3 раза, под воздействием одного ГБ-1 в 32 раза и при совместном воздействии ГБ-20 и ГБ1 в 56 раз.

Пример 25. Трансгенный фенотип ГБ-20.

ГБ-20 человека и мыши был сверхэкспрессирован у трансгенных мышей с использованием разных промоторов. Сначала для достижения необходимых уровней белка в кровотоке использовали альбуминовый промотор мыши, специфичный к печени и направляющий экспрессию ГБ-20 человека. Последующие исследования осуществляли, используя промотор на основе кератина 14 (К14), который вызывает направленную экспрессию главным образом в эпидермисе и другом многослойном чешуйчатом эпителии; промотор на основе металлотионеина-1 мыши, который характеризуется широким паттерном экспрессии; и промотор ЕцБСК, которые стимулирует экспрессию в клетках лимфоидной линии. Во всех четырех случаях были получены аналогичные результаты, вероятно, потому, что все указанные промоторы увеличивали уровни ГБ-20 в кровотоке.

Во всех случаях трансгенные мышата, экспрессирующие трансген ГБ-20, были меньше нетрансгенных мышат из того же помета, имели блестящую, жесткую, морщинистую кожу и умирали в течение первых нескольких дней после рождения. У мышат в желудке было обнаружено молоко, из чего следует, что они могли сосать. У указанных мышей была распухшие конечности, хвост, участки кожи вокруг носа и рта, и они с трудом двигались. Кроме того, указанные мыши были слабыми, у них отсутствовала видимая жировая ткань, и происходило медленное развитие ушей и пальцев. Низкие уровни экспрессии в печени (менее 100 молекул мРНК/клетку) были достаточны для гибели новорожденных мышат и патологии кожи. Трансгенные мыши без видимого фенотипа не экспрессировали данный трансген, не экспрессировали его на визуализируемых уровнях или были мозаичными.

Гистологический анализ кожи трансгенных мышей, экспрессирующих ГБ-20, показал наличие утолщенного эпидермиса, гиперкератоза и компактного рогового слоя по сравнению с нетрансгенными мышатами из того же помета. Иногда наблюдались сероклеточные струпья (корки). Анализ кожи трансгенных мышей под электронным микроскопом (ЕМ) показал наличие интрамитохондриальных липоидных включений, пятнистых кератогиалиновых гранул и относительно мало тонофиламентов, аналогичных встречающимся в коже человека, пораженной псориазом, и в моделях заболеваний кожи у мышей. Кроме того, многие трансгенные мыши имели погибшие лимфоциты в тимусе. При осуществлении гистопатологического анализа не было обнаружено других патологий. Результаты гистологического анализа и исследования под электронным микроскопом подтверждают и расширяют представление о макроскопических изменениях кожи.

Пример 26. Создание экспрессирующего вектора для экспрессии растворимого рецептора ГБ-22ВАтиЕс человека.

Был получен гибрид растворимого рецептора ГБ-22ВА человека и тиЕс-фрагмента (получивший

- 85 015706 название I^-22КА-С(т^2а), содержащий внеклеточный домен Ш-22КА., слитый с Рс-областью тяжелой цепи ЦС 2а (тС2а)). Экспрессирующая плазмида, содержащая I^-22КА-С(т62а), была создана методом гомологичной рекомбинации с использованием двух отдельных фрагментов ДНК и экспрессирующего вектора рΖМР40. Фрагменты полинуклеотидной последовательности Ш-22КА (δΕΟ ГО N0: 1) и тС2а (δΕΟ ГО N0: 39) были получены в результате амплификации методом РСК с использованием следующих праймеров: (а) праймеры для Ш-22КА ΖС45593 (δΕΟ ГО N0: 28) и ΖС45592 (δΕΟ ГО N0: 29) и (Ь) праймеры для тС2а ΖС45591 (δΕΟ ГО N0: 30) и ΖС45594 (δΕΟ ГО N0: 31).

Первый фрагмент содержал кодирующую область внеклеточного домена Ш-22КА., которая была получена с использованием полинуклеотида ГО-22КА (например, δΕΟ ГО N0: 1) в качестве матрицы. Первый фрагмент включал 5'-концевой сегмент ГО-22КА, перекрывающий неполную последовательность вектора рΖМР40, и 3'-концевой перекрывающий сегмент, содержащий линкерную последовательность и неполную последовательность тС2а. Условия осуществления РСК: 1 цикл, 94°С, 5 мин; 35 циклов, 94°С, 1 мин, затем 55°С, 2 мин, затем 72°С, 3 мин; 1 цикл, 72°С, 10 мин.

Второй фрагмент включал 5'-концевой сегмент тС2а, перекрывающий линкерную последовательность и неполную последовательность ГО-22КА, и 3'-концевой перекрывающий сегмент, содержащий неполную последовательность вектора рΖМР40. Рс-область тяжелой цепи ЛС 2а мыши (тС2а) (δΕΟ ГО N0: 39) была получена из клона кДНК тяжелой цепи ЦС 2а. тС2а содержит шарнирную область, С_Н2- и С_Н3-домены константной области тяжелой цепи γ-иммуноглобулина 2а. Условия осуществления РСК: 1 цикл, 94°С, 5 мин; 35 циклов 94°С, 1 мин, затем 55°С, 2 мин, затем 72°С, 3 мин; 1 цикл, 72°С, 10 мин.

Реакционные смеси для РСК очищали на 1% агарозном геле и при помощи набора для экстракции из геля Ο^Γ-μιΚΡ™ (О|адеп) экстрагировали из геля полосу, соответствующую размерам вставок.

Плазмиду рΖМР40, которую разрезали ВдШ, использовали в трехсторонней рекомбинации с использованием обоих фрагментов вставок для РСК. Плазмида рΖМР40 является экспрессирующим вектором млекопитающего, содержащим полигенный экспрессирующий кластер, имеющий промотор МРδV, сайты множественной рестрикции для введения кодирующих последовательностей; ориджин репликации Ε. сой; экспрессирующую единицу селектируемого маркера млекопитающего, включающую промотор δν40, энхансер и ориджин репликации, ген БНРК и терминатор δν40; последовательности ИКА.3 и СΕN-АКδ, необходимые для отбора и репликации в δ. сегеуШае. Плазмида рΖМР40 была создана из рΖМР21 (депонирована в Американскую коллекцию типовых культур, 10801 ишуегкйу Вои1еуагб, Мапаккак, VА 20110-2209, под № РТА-5266) в результате добавления к полилинкеру несколько сайтов для рестрикционных ферментов.

100 мкл компетентных дрожжевых (δ. сегеуШае) клеток независимо объединяли с 10 мкл ДНКвставки и 100 нг вырезанного вектора рΖМР40, после чего смесь переносили в 0,2-см кювету для электропорации. Смесь дрожжей/ДНК электропорировали при следующих установках источника питания (ВюКаб ЬаЬога!ог1ек, Негси1ек, СА): 0,75 кВ (5 кВ/см), х> Ом и 25 мкФ. В кювету добавляли 600 мкл 1,2М раствора сорбита, дрожжи помещали в виде 100 мкл и 300 мкл аликвот на два планшета ИКАГО и инкубировали при 30°С. Примерно через 72 ч трансформанты дрожжей Ига⁺ с одного планшета ресуспендировали в 1 мл Н2О и недолго центрифугировали с образованием дебриса дрожжевых клеток. Дебрис ресуспендировали в 0,5 мл лизирующего буфера (2% тритон Х-100, 1% δΌδ, 100 мМ №С1, 10 мМ трисбуфера, рН 8,0, 1 мМ Ε^ΤА). 500 мкл лизированной смеси вводили в пробирку Эппендорфа, содержащую 250 мкл промытых кислотой стеклянных шариков и 300 мкл фенола-хлороформа, подвергали вихревому перемешиванию в течение 3 мин и центрифугировали с максимальной скоростью в центрифуге Эппендорфа в течение 5 мин. 300 мкл водной фазы переносили в чистую пробирку, ДНК осаждали 600 мкл этанола (НЮН) и 30 мкл 3М раствора ацетата натрия и центрифугировали с максимальной скоростью в течение 30 мин. Пробирку декантировали и осадок промывали 1 мл 70% этанола. Пробирку декантировали и осадок ДНК ресуспендировалив 30 мкл ТЕ.

Электрокомпетентные клетки-хозяева Ε. сой (ΌΒ12δ) трансформировали, используя 5 мкл препарата дрожжевой ДНК и 50 мкл клеток. Клетки электропорировали при следующих электрических характеристиках: 2,0 кВ, 25 мкФ и 400 Ом. После электропорации добавляли 1 мл δ0С (2% бакто™ триптон (Э1ксо, БеНой, МЦ 0,5% дрожжевого экстракта (Б1ксо), 10 мМ №С1, 2,5 мМ КС1, 10 мМ МдС1₂, 10 мМ Мдδ0₄, 20 мМ глюкозы), после чего клетки помещали в виде 50 мкл и 200 мкл аликвот на два планшета с ЬВ АМР (бульон ЬВ (Ьеппох), 1,8% бакто™ агара (Б1ксо), 100 мг/л ампициллина).

Анализировали последовательности вставок трех клонов, используемые для созданной данной конструкции, и выбирали один клон для каждой конструкции, содержащий правильную последовательность. Более крупную плазмидную ДНК выделяли при помощи коммерчески доступного набора (^[АСΕN Р1акт1б Меда Кй, Р1адеп, Vа1еπс^а, СА) в соответствии с инструкциями изготовителя.

Пример 27. Экспрессия и очистка полипептида растворимого рецептора ГО^КА-тиРс человека.

Три серии из 200 мкг конструкции ГОЗ/КА-СОпС/а) (пример 22) гидролизовали 200 единицами Руи I при 37°С в течение 3 ч, осаждали при помощи ГОА и центрифугировали в 1,5 млмикроцентрифужной пробирке. Супернатант декантировали, осадок промывали 1 мл 70% этанола и инкубироовали в течение 5 мин при комнатной температуре. Пробирку центрифугировали в микроцентри

- 86 015706 фуге со скоростью 14000 об/мин в течение 10 мин и супернатант декантировали. Осадок ресуспендировали в 750 мкл среды РЕ-СНО в стерильных условиях и инкубировали при 60°С в течение 30 мин. Клетки 5Е6 АРЕЭХВ11 центрифугировали в трех пробирках и ресуспендировали в растворе среды с ДНК. Смесь клеток с ДНК вводили в 0,4-см кювету и электропорировали при следующих электрических характеристиках: 950 мкФ, высокое емкостное сопротивление и напряжение 300 В. Содержимое кювет удаляли, собирали, разводили в 25 мл среды РЕ-СНО и вводили в 125-мл встряхиваемую колбу. Колбу помещали в термостат на шейкере при 37°С, 6% СО₂ и встряхивали со скоростью 120 об/мин.

Линию клеток отбирали в отношении питательных веществ, амплифицировали до 100 нм метотрексата (МТХ), затем до 500 нМ МТХ и, наконец, до 1 мкМ МТХ. После амплификации СЭ8 клетки сортировали. Сортировку СЭ8 клеток производили путем отбора устойчивого пула, амплифицированного 1 мкМ МТХ, и окрашивания примерно 5Е6 клеток моноклональным антителом Е1ТС против СЭ8 клеток (ВО РйагМшдеп, № по каталогу 30324Х), используя концентрацию, рекомендованную изготовителями. Окрашенные клетки обрабатывали и сортировали в проточном цитометре ЕАС8 Vаηΐаде (ВО). Верхние 5% клеток собирали и выращивали. Экспрессию подтверждали методом вестерн-блоттинга, линию клеток увеличивали и белок очищали стандартными методами.

Пример 28. Нейтрализация йи1Е-22КА сывороткой мышей, иммунизированных йи1Е22КА-тС2а.

A. Клеточный анализ нейтрализации для исследования ингибирования 1Ь-20 и/или 1Ь-22.

Факторзависимую линию пре-В-клеток ВаЕ3, котрансфецированную 1Ь-22КА и Ш-20КВ (рЭ1К81) (клетки ВАЕ/1Е-22КА/1Ь-20КВ; пример 38), использовали для оценки нейтрализующего потенциала антител против 1Ь-22КА в результате антагонистического воздействия на 1Ь-20 в рецепторе 1Е-22КАЛЕ20КВ. Аналогичным образом клетки ВаЕ3, котрансфецированные 1Ь-22КА и 1Ь-10КВ (СКЕ2-4) (клетки ВАЕ/1Ь-22КА/СКЕ2-4; пример 2), использовали для оценки нейтрализующего потенциала антител против 1Ь-22КА в результате антагонистического воздействия на 1Ь-22 в рецепторе 1Ь-22КА/1Ь-10КВ. Пролиферацию в присутствии 1Ь-20 или 1Ь-22 в линии клеток, экспрессирующих соответствущий рецептор, и ингибирование такой пролиферации в присутствии антител-антагонистов оценивали при помощи анализа с окрашиванием аламаровым синим в соответствии с описанием, приведенным в примере 3. Ингибирование пролиферации в указанных клетках является показателем нейтрализущей активности в данном анализе.

B. Нейтрализация 1Ь-20 и 1Ь-22 сывороткой против 1Ь-22КА при осуществлении клеточного анализа нейтрализации.

В соответствии с анализом, описанным в примере 28А, сыворотку мышей с отсутствием 1Ь-2 2КА, иммунизированных йи1Е-22КА-тиС2а (пример 30(А) (1)), добавляли в виде серийных разведений, соответствующих 1, 0,5, 0,25, 0,13, 0,06, 0,03, 0,02 и 0%. Аналитические планшеты инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 4 дней, после чего в лунки добавляли аламаровый синий (Асситеб, СЫсадο, 1Ь) в количестве 20 мкл/лунку. Планшеты снова инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 16 ч. Окрашивание аламаровым синим позволяет получить флуорометрические данные на основании числа живых клеток и, таким образом, является прямым измерением пролиферации клеток по сравнению с отрицательным контрольным образцом. Планшеты считывали в счетчике Уа11ас νίΛοΓ 2 1420 (Уа11ас, Тигси, Е1п1апб) при длинах волн 530 (возбуждение) и 590 (испускание). Полученные результаты показали, что сыворотка всех семи иммунизированных животных может нейтрализовать передачу сигналов 1Ш1Б-22 и 1ш[Б-20 через йи1Е-22КА. Например, при концентрации, равной 1%, сыворотка пяти животных (16517, 16518, 16519, 16520 и 16527) полностью нейтрализовала пролиферацию, индуцированную йи1Е-22, при этом ингибирование пролиферации уменьшалось в зависимости от дозы при более низких концентрациях. Кроме того, при концентрации, равной 1%, сыворотки двух других животных (16471 и 16701) ингибировали примерно 90% пролиферации, индуцированной йи1Е-22, при этом ингибирование пролиферации уменьшалось в зависимости от дозы при более низких концентрациях. Аналогичным образом при концентрациях, равных 1 и 0,5%, сыворотка пяти животных (16517, 16518, 16519, 16520 и 16527) полностью нейтрализовала пролиферацию, индуцированную йи1Е-20, при этом ингибирование пролиферации уменьшалось в зависимости от дозы при более низких концентрациях. Кроме того, при концентрации, равной 1%, сыворотка животного 16701 полностью нейтрализовала пролиферацию, индуцированную йи1Ь-20, при этом ингибирование пролиферации уменьшалось в зависимости от дозы при более низких концентрациях. При концентрации, равной 1%, сыворотка животного 16471 нейтрализовала примерно 95% пролиферации, индуцированной йи1Е-20, при этом ингибирование пролиферации уменьшалось в зависимости от дозы при более низких концентрациях. Таким образом, сыворотка всех семи животных была способна нейтрализовать пролиферацию, индуцированную 1Ь-20 или 1Ь-22 через рецептор йи1Ь22КА. Полученные результаты далее показывают, что антитела к 1Ь-22КА действительно могут оказывать антагонистическое воздействие на активность провоспалительных лигандов 1Ь-20 и 1Ь-22 в низких концентрациях.

Приведенные результаты являются дополнительным свидетельством того, что эффективное блокирование активности 1Ь-22КА в результате связывания, блокирования, ингибирования, ослабления, антагонистического воздействия или нейтрализации активности 1Ь-20 или 1Ь-22 (отдельно или вместе), например, при помощи нейтрализующего моноклонального антитела к 1Ь-22КА по настоящему изобрете

- 87 015706 нию, может быть благоприятным для уменьшения эффектов Ш-20 и Ш-22 (отдельно или вместе) ш у1уо и может уменьшать воспаление, индуцированное №-20 и/или Ш-22, которое выражается в кожных проявлениях, вызываемых №-20 и №-22, в таких заболеваниях, как, например, псориаз, ШО, колит или другие воспалительные заболевания, вызываемые Ш-20 и/или Ш-22, которые включают ШО, артрит, астму, псориатический артрит, колит, воспалительные заболевания кожи и атопический дерматит.

Пример 29. Создание клеток Р815/ЫБ-22КА и иммунизация мышей.

А. Создание клеток Р815/МБ-22КА и инъецирование их мышам для образования антител против ЫБ-22КА.

Клетки VΤ Р815 (АТСС № ТШ-64) трансфецировали плазмидным вектором, содержащим последовательность кДНК ЫБ-22КА (например, 8Е0 ГО ЫО: 1) и селектируемый маркер устойчивости к пуромицину, полученный при использовании фугена в соответствии с инструкциями изготовителя (Кос1с, Ыбхапаройх, ТЫ). Через 48 ч после трансфекции клетки помещали в условия отбора пуромицином. Трансфектанты, устойчивые к пуромицину, клонировали методом ограниченного разведения и при помощи проточной цитометрии определяли уровень экспрессии МБ-22КА на поверхности клеток, используя биотинилированный цитокин Ш-22 человека (1ш№-22-биотин). Клетки инкубировали на льду с 5 мкг/мл 1ш№-22-биотина в течение 30 мин и промывали. Связывание 1ш№-22-биотина с клетками обнаруживали, используя РЕ-меченный стрептавидин в отношении 1:500. Клетки анализировали в проточном цитометре Расхсап при помощи программного обеспечения Сс11с|исх( (Всс!оп Оюкшхоп, Зап Бохе, СА).

Отобранный клон клеток Р815/Ш-22КА выращивали и собирали для инъецирования. Клетки собирали, трижды промывали в РВ8, подсчитывали, ресуспендировали в количестве 1 х 10⁸ клеток/мл и облучали 10000 Рад. Взвесь клеток переносили в 1-мл шприц и инъецировали внутрибрюшинно мышам ОВА/2. Мышей повторно иммунизировали аналогичным образом через 3 недели и исследовали сыворотку в отношении связывания с линией клеток трансфектанта ЫБ-22КА. Сыворотку разводили в отношении 1:100 в буфере Расх (НВ88, 2% В8А, 0,02% ЫаЫ₃) и инкубировали с Рс-блокированными клетками почки человека 293, сверхэкспрессирующими ЫБ-22КА. Связывание антител против Ш-22КА с клетками обнаруживали при помощи конъюгированного с флуоресцеином ЦС козы против мыши, разведенного в отношении 1:200 (ЗоШНсгп Вю!ссй, В1гтшдйат, АЬ). Клетки анализировали ранее описанным методом. Мышей повторно иммунизировали в общей сложности еще 3 раза и исследовали сыворотку описанным методом. Две мыши были отобраны для слияния гибридом при помощи стандартных методов, используемых в данной области для создания моноклональных антител (пример 25), на основании уровня связывания из сыворотки с трансфектантами ЫБ-22КА.

Вышеуказанный метод используют также для создания клеток Р815, экспрессирующих гетеродимерные рецепторы Ш-22КА, такие как I^-22КΛ/СКΕ2-4 (клетки Р815/I^-22КΛ/СКΕ2-4), Ш^КА/рОШ-Ш (клетки Р815/1^-22КΛ/р^IК81) или №-221К\/СК1^;2-4/р1)№81 (клетки Р815/№-221К\/СК1^;2-4/р1)№81), например, для иммунизации мышей с целью образования моноклональных антител против Ш-22КА и №22КА-содержащих гетеродимерных рецепторов.

Пример 30. Создание моноклональных антител мыши против Ш-22КА человека (Ш-22КА).

А. Иммунизации с целью образования антител против Ш-22КА.

(1) Использование растворимого рецептора Ш^КА-тиРс.

Мышей с отсутствием Ш-22КА в возрасте 6-12 недель (пример 26) иммунизировали путем внутрибрюшинной инъекции 25-50 мкг белка растворимого рецептора Ш^КА-тиРс человека (пример 23), смешанного в отношении 1:1 (об:об) с адъювантом Риби (81дта), через каждые две недели. Через 7-10 дней после третьей иммунизации у животных брали пробы крови позади глазницы, собирали сыворотку и оценивали ее способность ингибировать связывание Ш-22 или Ш-20 и Ш-22 с Ш-22КА при осуществлении анализов нейтрализации (например, раскрытых в настоящем описании изобретения) и окрашивать клетки 293, трансфецированные Ш-22КА, по сравнению с нетрансфецированными клетками 293 при осуществления анализа окрашивания методом РАС8. Мышей продолжали иммунизировать, при этом брали пробы крови и исследовали их вышеописанными методами, пока титры нейтрализующей сыворотки не достигали высокого уровня. В данный момент времени мышам с самыми высокими титрами нейтрализующей сыворотки интраваскулярно инъецировали 25-50 мкг белка растворимого рецептора №22КА-РС в РВ8. Через три дня у указанных мышей удаляли селезенку и лимфатические узлы и использовали их для создания гибридом, например, используя миеломные клетки (Р3-Х63-Ад8.653.3.12.11) мыши и другие приемлемые линии клеток в данной области, при помощи стандартных методов, известных в данной области (см., например, публикации Ксагпсу, ТР. с! а1., I Iттиηо1. 123:1548-50, 1979; и Ьапс, К.О., I ^типо! МеЛобх, 81:223-8, 1985).

(2) Использование трансфектантов Р815, экспрессирующих рецептор Ш-22КА.

Самок мышей ОВА/2 в возрасте 6-10 недель иммунизировали путем внутрибрюшинной инъекции 1х10⁵ живых трансфецированных клеток Р815, например клеток Р815/Ш-22КА, Р815/I^-22КΛ/СКΕ2-4, Р815/I^-22КΛ/р^IК81 или Р815/I^-22КΛ/СКΕ2-4/р^IК81 (пример 24) (например, 0,5 мл при плотности клеток 2х10⁵ клеток/мл). Перед инъецированием клетки находились в фазе экспоненциального роста. Предназначенные для инъецирования клетки собирали, трижды промывали РВ8 и ресуспендировали в

- 88 015706

РВ8 до плотности, равной 2х10⁵ клеток/мл. В указанной модели у мышей развивалась асцитическая опухоль в течение 2-3 недель, которая прогрессировала до гибели животных, происходившей через 4-6 недель, при отсутствии иммунной реакции на трансфецированный антиген-мишень. Через три недели мышей без явного опухания брюшного отдела (являющегося признаком асцита) повторно иммунизировали в соответствии с вышеуказанной процедурой с интервалами в 2-3 недели. Через 7-10 дней после второй иммунизации у животных брали пробы крови позади глазницы, собирали сыворотку и оценивали ее способность ингибировать связывание ГЬ-22 или ГЬ-20 и ГЬ-22 с ГЬ-22КА при осуществлении анализов нейтрализации (например, раскрытых в настоящем описании изобретения) и окрашивать клетки 293, трансфецированные ГЬ-22КА, по сравнению с нетрансфецированными клетками 293 при осуществлении анализа окрашивания методом РАС8. Мышей продолжали иммунизировать, при этом брали пробы крови и исследовали их вышеописанными методами, пока титры нейтрализующей сыворотки не достигали высокого уровня. В данный момент времени мышам с самыми высокими титрами нейтрализующей сыворотки внутрибрюшинно инъецировали 1х10⁵ живых трансфецированных клеток Р815. Через четыре дня у указанных мышей удаляли селезенку и лимфатические узлы и использовали их для создания гибридом, например, используя миеломные клетки (Р3-Х63-Ад8.653.3.12.11) мыши и другие приемлемые линии клеток в данной области, при помощи стандартных методов, известных в данной области (см., например, приведенные выше публикации Кеагиеу, ЕР. е! а1. и Ьапе, К.Э.).

Альтернативой вышеуказанной схеме иммунизации с использованием живых трансфецированных клеток Р815 является внутрибрюшинное инъецирование 1-5 х10⁶ облученных трансфецированных клеток через каждые 2-3 недели. В данном случае ни у одного животного не возник асцит, и ни одно животное не умерло от асцита. Вместо этого у животных исследовали нейтрализующую иммунную реакцию на ГЬ22КА в сыворотке, как было указано выше, начиная отбор проб крови после второй иммунизации. После того как титры нейтрализующей сыворотки достигали максимального уровня, мышам с самыми высокими титрами внутрибрюшинно инъецировали 5х 10⁶ облученных клеток и через четыре дня удаляли у указанных мышей селезенку и лимфатические узлы, которые использовали для создания гибридом, например используя миеломные клетки (Р3-Х63-Ад8.653.3.12.11) мыши и другие приемлемые линии клеток в данной области, при помощи стандартных методов, известных в данной области (см., например, приведенные выше публикации Кеагиеу, 1.Р. е! а1. и Ьаие, К.Э.).

В. Скрининг слитых гибридом в отношении антител, связывающих ГЬ-22КА и ингибирующих связывание ГЬ-22 с ГЬ-22КА.

Осуществляли два разных первичных анализа с использованием супернатантов гибридом через 8-10 дней после слияния. При осуществлении первого анализа антитела в супернатантах исследовали методом ЕЬГ8А в отношении способности связываться с белком растворимого рецептора ГЬ-22КА-тиРс, связанным с планшетом, используя НКР-конъюгированные вторичные антитела козы против к- и λ-легкой цепи мыши для идентификации связанных антител мыши. Для демонстрации специфичности к части ГЬ22КА белка ГЬ-22КА-тиРс положительные супернатанты, полученные в первом анализе, оценивали с использованием неродственного белка, слитого с той же Рс-областью мыши (тС2а). Антитела в указанных супернатантах, которые связывались с ГЬ-22КА-тиРс и не связывались с неродственным тиРссодержащим слитым белком, считались специфичными к ГЬ-22КА. При осуществлении второго анализа антитела во всех супернатантах гибридом оценивали методом ЕЬГ8А в отношении их способности ингибировать связывание биотинилированного цитокина ГЬ-22 человека с ГЬ-22КА-тиРс, связанным с планшетом.

Все супернатанты, содержащие антитела, специфически связывающиеся с ГЬ-22КА, независимо от наличия или отсутствия у них способности ингибировать связывание ГЬ-22 с ГЬ-22КА при осуществлении анализа ЕЬГ8А, затем испытывали в отношении способности ингибировать связывание (или сопутствующий пропролиферативный эффект) ГЬ-20 или ГЬ-22 с клетками ВаГ3, трансфецированными, соответственно, ^-22^/^-20^6 и I^-22КЛ/СКΕ2-4. Все супернатанты, которые обладали нейтрализующей способностью при осуществлении анализа ингибирования ГЬ-22 или анализов ингибирования ГЬ-20 и ГЬ22, затем оценивали в отношении способности окрашивать клетки ВаГ3, трансфецированные ГЬ-22КА, по сравнению с нетрансфецированными клетками ВаГ3 при осуществлении анализа методом РАС8. Указанный анализ должен был подтвердить, что ингибирование связывания ГЬ-22 с I^-22КЛ/СКΕ2-4 или связывания ГЬ-20 с I^-22КЛ/I^-20КВ действительно было обусловлено антителом, которое специфически связывает рецептор ГЬ-22КА. Кроме того, поскольку анализ методом РАС8 осуществляли с использованием вторичного антитела против ГдС, конкретные положительные результаты РАС8 показывают, что нейтрализующее антитело, по-видимому, относится к классу ГдС. Указанными методами была идентифицирована определяющая лунка, в которой антитело связывало рецептор ГЬ-22КА при осуществлении анализа ЕЬГ8А, ингибировало связывание ГЬ-22 с ГЬ-22КА при осуществлении анализа ингибирования методом ЕЬГ8А, блокировало взаимодействие ГЬ-20 и ГЬ-22 с клетками ВаГ3, трансфецированными соответственно ^-22^/^-20^8 и ^-22^/0^2-4 (пример 28), и вызывало положительное окрашивание клеток ВаГ3, трансфецированных I^-22КЛ/I^-20КВ и I^-22КЛ/СКΕ2-4, при использовании вторичного антитела против ГдС мыши.

- 89 015706

Ό. Клонирование гибридом, продуцирующих специфическое антитело против Ш-22КА.

Гибридому, продуцирующую моноклональное антитело против Ш-22КА, которое перекрестно нейтрализовало связывание Ш-20 и Ш-22 с должным образом трансфецированными клетками Вай, клонировали стандартным методом разведения с низкой плотностью (менее 1 клетки в лунке). Примерно через 5-7 дней после культивирования клоны исследовали методом ЕЫ8А в отношении Ш-22КА-тиЕс человека, связанного с планшетом, после чего положительные лунки повторно испытывали методом ЕЬША в отношении неродственного тиЕс-содержащего слитого белка в соответствии с приведенным выше описанием. Отобранные клоны, супернатанты которых связывались с Ш-22КА-тиЕс и не связывались с неродственным тиЕс-содержащим слитым белком, далее исследовали в отношении активности специфического антитела в результате повторного осуществления анализов нейтрализации и анализов ЕАС8. Все отобранные клоны, содержащие антитело к Ш-22КА, клонировали минимум два раза для гарантии клональности и оценки устойчивого продуцирования антитела. Последующие серии вышеописанного клонирования и исследования осуществляли до тех пор, пока предпочтительно по крайней мере 95% полученных клонов не были положительными в отношении продуцирования нейтрализующего антитела против Ш-22КА.

Е. Биохимическое исследование молекулы, распознаваемой моноклональными антителами против Ш-22КА.

Биохимическое исследование, подтверждающее, что молекула-мишень Ш-22КА, распознаваемая предполагаемыми моноклональными антителами против Ш-22КА, действительно является Ш-22КА, осуществляют стандартным методом иммунопреципитации с последующим осуществлением анализа 8Б8-РАСЕ или вестерн-блоттинга, в которых используют растворимые мембранные препараты из клеток Вай, трансфецированных Ш-22КА и нетрансфецированных клеток Вай. Кроме того, использованные растворимые мембранные препараты линий нетрансфецированных клеток, экспрессирующих Ш-22КА, показывают, что моноклональные антитела узнают цепь как нативного рецептора, так и трансфецированного рецептора. Альтернативно моноклональные антитела испытывали в отношении их способности специфически иммуноосаждать или блоттировать методом вестерн-блоттинга белок растворимого рецептора Ш^КА-тиЕс.

Пример 31. Нейтрализация киШ-22КА сывороткой мышей, которым инъецировали клетки Р815, трансфецированные киШ-22КА.

В соответствии с клеточным анализом нейтрализации, описанным в примере 28, сыворотку мышей, которым инъецировали живые клетки Р815, трансфецированные киШ-22КА (пример 30.А.2), добавляли в виде серийных разведений, соответствующих 1%, 0,5%, 0,25%, 0,13%, 0,06%, 0,03%, 0,02% и 0%. Аналитические планшеты инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 4 дней, после чего добавляли аламаровый синий (Асситеб, СЫсадо, Ш) в количестве 20 мкл/лунку. Планшеты снова инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 16 ч. Полученные результаты показали, что сыворотка четырех животных могла нейтрализовать передачу сигналов киШ-22 и киШ-20 через киШ-22КА.

При концентрации, равной 1%, сыворотка шести животных (7125, 7127, 7128, 7118, 7124 и 7117) нейтрализовала от 50 до 80% пролиферации, индуцированной киШ-22, при этом ингибирование пролиферации уменьшалось в зависимости от дозы при более низких концентрациях. Кроме того, при концентрации, равной 1%, сыворотка четырех животных (7125, 7127, 7118 и 7117) нейтрализовала от 40 до 70% пролиферации, индуцированной киШ-20, при этом ингибирование пролиферации уменьшалось в зависимости от дозы при более низких концентрациях. Полученные результаты далее показывают, что антитела к Ш-22КА действительно могут оказывать антагонистическое воздействие на активность провоспалительных лигандов Ш-20 и Ш-22 при низких концентрациях.

Полученные результаты дополнительно свидетельствуют о том, что эффективное блокирование активности Ш-22КА в результате связывания, блокирования, ингибирования, ослабления, антагонистического воздействия или нейтрализации активности Ш-20 или Ш-22 (отдельно или вместе), например, при помощи нейтрализующего моноклонального антитела к Ш-22КА по настоящему изобретению, может быть благоприятным для уменьшения эффектов Ш-20 и Ш-22 (отдельно или вместе) ш у1уо и может уменьшать воспаление, индуцированное Ш-20 и/или Ш-22, которое имеет место в таких заболеваниях кожи, вызываемых Ш-22 и Ш-22, как, например, псориаз, КБ, колит или другие воспалительные заболевания, вызываемые Ш-20 и/или Ш-22, которые включают КБ, артрит, астму, псориатический артрит, колит, воспалительные заболевания кожи и атопический дерматит.

Пример 32. Фенотип мышей с отсутствием Ш-22КА.

А. Создание мышей с генетическими модификациями.

1. Создание трансгенных мышей, экспрессируюших Ш-20 мыши, с блестящей кожей у новорожденных мышат.

а) Конструкция для экспрессии Ш-20 мыши, стимулированной промотором К14.

Для исследования биологической функции Ш-20 ш у1уо была создана трансгенная конструкция, в которой Ш-20 мыши стимулировали промотором К14 человека (см. также пример 21). Были получены олигонуклеотиды, способные создавать фрагмент РСК, содержащий консенсусную последовательность Козака и кодирующую область Ш-20 мыши. Указанные олигонуклеотиды имели сайт Е^ у 5'-конца и

- 90 015706 сайт АксГ у 3'-конца, облегчающие клонирование в рЕ8К14, стандартном трансгенном векторе, содержащем промотор, специфичный к кератиноцитам и эпителиальных клеткам человека.

Реакции РСЕ осуществляли с использованием примерно 200 нг матрицы ГЬ-20 мыши (8Е0 ГО N0: 33) и олигонуклеотидом, предназначенных для амплификации непроцессированной последовательности ГЬ-20 (8Е0 ГО N0: 34). Условия реакции РСЕ определяли методами, известными в данной области. Продукты РСЕ отделяли электрофорезом в агарозном геле и очищали при помощи набора для экстракции из геля 01а0шск™ (01адеп). Выделенный фрагмент ДНК правильной длины расщепляли РкеГ и АксГ (ВоегЫпдег-Маппйет), осаждали этанолом и лигировали с рЕ8К14, который предварительно расщепляли РкеГ и АксГ. Плазмида рЕ8К 14, предназначенная для экспрессии представляющего интерес гена в кератиноцитах и эпителиальных клетках трансгенных мышей, содержит полигенный экспрессирующий кластер, фланкированный промотором К14, специфичным к кератину человека, длиной 3 т.п.о.

Примерно 1 мкл реакционной смеси для лигирования электропорировали в компетентные клетки ЭН10В Е1ес!гоМах™ (СГВС0 ВЕЬ, СаййегкЬигд, МО) в соответствии с инструкциями изготовителя, культивировали на планшетах со средой ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и инкубировали в течение ночи. Колонии собирали и выращивали в среде ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Минипрепарат ДНК получали из собранных клонов и исследовали в отношении наличия вставки ГЬ-20 мыши путем расщепления рестрикционными ферментами РкеГ и АксГ и последующего осуществления электрофореза в агарозном геле. Получение трансгенной конструкции с правильными кДНК-вставками подтверждали путем секвенирования последовательности. Были получены максипрепараты правильного гибрида рЕ8К14-ГЬ-20 мыши.

Ь) Создание и исследование трансгенных мышей, экспрессирующих ГЬ-20, стимулированный промотором К14.

Фрагмент №0 длиной около 4 т.п.о. выделяли из трансгенного (ТС) вектора, содержащего 5'- и 3'концевые фланкирующие последовательности кератин-специфического промотора К14, ГЬ-20 мыши (8Е0 ГО N0: 33; полипептид, представленный в 8Е0 ГО N0: 34), интрон Гормона, кДНК ГЬ-20 и полиА сигнальные последовательности гормона роста человека. Полученный фрагмент использовали для микроинъецирования в оплодотворенные ооциты мышей В6С3Г1 (Тасошс, Сегтап!о^п, NΥ). Микроинъецирование и создание трансгенных мышей осуществляли в соответствии с описанием, приведенным в публикации Нодап, В. е! а1. Матри1а!тд !йе Мойке ЕтЬгуо, 2^пй ей., Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, ЬТУ, 1994.

Количественную экспрессию трансгенной РНК осуществляли методом ЕТ-РСЕ ТадМап™, используя праймеры для РСЕ, специфичные к полиА сигнальной последовательности гормона роста человека трансгена.

Все трансгенные конструкции, экспрессирующие ГЬ-20, характеризуются высоким показателем паранатальной смертности мышат, при этом родившиеся трансгенные мышата относятся к фенотипу с блестящей кожей. Блестящая кожа новорожденных мышат, по-видимому, обусловлена жесткостью кожи, как если бы кожа высохла вследствие отсутствия соответствующего ухода. Движения мышат, как правило, были затруднены. По результатам гистопатологического исследования у мышат с блестящей кожей был утолщенный эпидермис и компактный кератиновый слой. Большинство указанных мышат с блестящей кожей умирало в течение первых 5 дней, а мышата, которые выживали после периода грудного вскармливания, обычно не экспрессировали указанный трансген (при анализе транскрипта) или относились к химерному фенотипу (при низкой передаче указанного трансгена потомству).

Была получена одна линия животных, экспрессирующих ГЬ-20 мышей, стимулируемый промотором К14. Уровень экспрессии в коже и тимусе был низким, и все новорожденные мышата относились к фенотипу с блестящей кожей. Как правило, в указанной линии трансгенное потомство составляло 20%, при этом 50-60% трансгенных мышат умирало ш и!его. (При гемизиготном спаривании 50% потомства должно быть трансгенным).

2. Создание мышей, не экспрессирующих ГЬ-22ЕА; мыши с отсутствием ГЬ-22ЕА.

а) Создание конструкции с отсутствием (К0) ГЬ-22ЕА мыши.

Для дальнейшего исследования биологической функции ГЬ-22ЕА ш νί\Ό была создана линия мышей с отсутствием (К0) экспрессии ГЬ-22ЕА. Сначала использовали зонды к кДНК ГЬ-22ЕА для скрининга геномной библиотеки ВАС 129/8ν1 мыши.

Идентифицировали и исследовали клоны, содержащие геномный локус ГЬ-22ЕА. Полинуклеотид ГЬ-22ЕА мыши представлен в 8Е0 ГО N0: 41, и полипептид представлен в 8Е0 ГО N0: 42.

Для создания конструкции с отсутствием ГЬ-22ЕА методом клонирования ЕТ был получен вектор, лишенный ГЬ-22ЕА (2йапд е! а1., 1998. А пе\г 1одк Гог ^NА епдтееппд иктд гесотЬтайоп т Е. со11. №И. Сепе!. Уо1. 20:123-8). Вектор, лишенный ГЬ-22ЕА, (К0) содержит 5'-концевой фрагмент длиной 1,8 т.п.о. (короткий фрагмент), селектируемый маркер ГЕЕ8-Ьас2/МС1пео и 3'-концевой фрагмент длиной 10 т.п.о. (длинный фрагмент) гена ГЬ-22ЕА. В векторе К0 экзоны 2, 3 и 4, а также интроны 2 и 3 геномной последовательности ГЬ-22ЕА были заменены селектируемым маркером ГЕЕ8-Ьас2/МС1пео, в результате чего была получена делеция длиной около 44 т.п.о. вследствие гомологичной рекомбинации в клетках Е8.

- 91 015706

Вектор К0 линеаризовали рестрикционным ферментом РтеГ и электропорировали в клетки Е8 129/8ν1. Отбор гомологичных рекомбинаций и идентификацию рекомбинантных клонов Е8 осуществляли в соответствии с описанием, приведенным в публикации КоЬейзоп ЕЭ. е! а1., Тега!осагсшотаз апб ЕтЬгуошс 8!ет Се11з: А Ргасбса1 Арргоасй., 2^пб еб., ГКЬ Ргезз Ытйеб, 0хГогб, 1987.

Ь) Создание и анализ мышей с отсутствием экспрессии ГЬ-22КА.

Были размножены положительные клоны Е8 с делецией экзонов 2-4 и интронов 2-3 в геномном локусе ГЬ-22КА. Указанные клоны инъецировали в бластоциты мышей С57В1/6). После кратковременного вторичного размножения инъецированные бластоциты вводили псевдобеременным выкармливающим матерям для образования химер. Инъецирование в бластоциты, образование химер и последующий перенос мутированного ГЬ-22КА в зародышевую линию клеток осуществляли в соответствии с описанием, приведенным в публикации КоЬейзоп, ЕЛ. е! а1., Тега!осагсшотаз апб ЕтЬгуошс 8!ет Се11б: А Ргасбса1 Арргоасй. 2^пб еб., ГКЕ Ргезз Ытйез, 0хГогб, 1987.

Мутантных мышей с отсутствием ГЬ-22КА (К0) идентифицировали методом генотипирования при помощи НСК. Три праймера для РСК 2С22901 (8ЕО ГО N0: 35), 2С45039 (8ЕО ГО N0: 36), 2С38573 (8ЕЦ ГО N0: 37) использовали при осуществлении многократной реакции РСК с целью обнаружения аллеля дикого типа и мутантного аллеля. Аллель дикого типа (νψ) представляет собой фрагмент ДНК длиной 229 п.о., в то время как мутантный аллель образует фрагмент ДНК длиной 371 п.о.

Спаривание гемизиготных мышей дает нормальное соотношение гомозиготного (НОМ), гетерозиготного (Не!) потомства и потомства дикого типа (νΐ^, а также нормальное соотношение полов. Физиологическое обследование мышей при помощи программы Рйузю8сгееп (сбор данных о массе тела и массе тканей, осуществление клинического анализа крови (СВС) и клинического химического анализа, общее наблюдение и гистопатологическое исследование) не выявило различий между НОМ, Не! и VТ животными.

B. Необходимость ГЬ-22КА для экспрессии 8АА, индуцируемой ГЬ-22: анализ 8АА методом ЕЬГ8А, свидетельствующий об отсутствии экспрессии 8АА, индуцируемой ГЬ-22, у мышей с отсутствием ГЬ22КА.

Чтобы определить необходимость ГЬ-22КА для индукции 8АА у мышей, которым инъецировали ГЬ22, мышам с отсутствием ГЬ-22КА инъецировали 5 мкг ГЬ-22 и брали пробы крови через 6 ч.

Анализ ЕЬГ8А для определения уровней 8АА в пробах сыворотки осуществляли, используя набор для иммуноанализа 8АА у мышей (В1о8оигсе Гп!егпа!юпа1, СаНГогша), в соответствии с инструкциями изготовителя при разведении сыворотки в отношении 1:1000. У четырех из пяти мышей дикого типа были обнаружены повышенные уровни 8АА в виде реакции на инъекцию ГЬ-22, в то время как у четырех из пяти гомозиготных мышей с отсутствием ГЬ-22КА 8АА находился на исходном уровне. У двух исследованных гетерозиготных мышей с отсутствием ГБ-22КА были обнаружены повышенные уровни 8АА, которые были ниже уровней 8АА по сравнению с повышенными уровнями у мышей дикого типа. Из вышеизложенного следует, что ГЬ-22КА необходим для индукции 8АА под воздействием ГЬ-22.

Полученные результаты показывают, что эффективное блокирование активности ГЬ-22КА, например, в результате удаления гена ГЬ-22КА или при помощи нейтрализующего моноклонального антитела к ГЬ-22КА по настоящему изобретению, должно уменьшать воспаление, индуцированное ГЬ-22, например, имеющее место в случае псориаза, ГВО, колита, эндотоксемии или других воспалительных заболеваний, индуцированных ГЬ-22.

C. Необходимость ГЬ-22КА для утолщения эпителия, индуцируемого ГЬ-22: введение чистого белка ГЬ-22 при помощи подкожно имплантированного осмотического мининасоса не вызывает утолщения эпидермиса у мышей с отсутствием ГЬ-22КА.

Чтобы определить необходимость ГЬ-22КА для утолщения эпителия, индуцируемого ГЬ-22, гомозиготным мышам и мышам дикого типа с отсутствием ГЬ-22КА подкожно вводили ГЬ-22 при помощи осмотических мининасосов. Указанные насосы доставляли ГЬ-22 со скоростью 18,4 мкл/сутки в течение 7 дней. Четырем гомозиготным мышам и 6 мышам дикого типа с отсутствием ГЬ-22КА вводили белок ГЬ22, при этом 3 гомозиготным мышам и 1 мыши дикого типа вводили РВ8.

Пробы сыворотки, полученные у мышей, которым вводили ГЬ-22, исследовали при осуществлении анализа пролиферации ВаЕ3 для подтверждения присутствия ГЬ-22. Клетки ВаЕ3, трансфецированные ГБ-22КА и СКЕ2-4, требуют для пролиферации присутствия ГЬ-22 или ГЬ-3 мыши. Указанные клетки центрифугировали и промывали в полной среде без шГЬ-3 (среда КРМГ (ГКН Вюзаепсе Гпс., Ьепеха, К8), содержащей 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ Ь-д1и!аМах-1™ (С1Ьсо ВКЬ), 1 мМ пирувата натрия (С1Ьсо ВКЬ) и антибиотики Ρ8N (СГВС0 ВКЬ)) (далее определяется как среда без шГЬ-3). Клетки центрифугировали и промывали 3 раза для гарантии удаления шГЬ-3. Затем клетки подсчитывали в гемацитометре и культивировали на 96-луночном планшете в количестве 5000 клеток/лунку в конечном объеме, равном 200 мкл/лунку, используя среду без шГЬ-3. Сыворотка мышей присутствовала в лунках в концентрации, равной 1%, 0,5%, 0,25% или 0,125%. Аналитические планшеты инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 3 дней, после чего добавляли аламаровый синий (Асситеб, СЫсадо, ГЬ) в количестве 20 мкг/лунку. Планшеты снова инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 24 ч. Аламаровый синий позволяет получить флуорометрические данные, основанные на числе

- 92 015706 живых клеток, и, таким образом, является прямым измерением пролиферации клеток по сравнению с отрицательным контрольным образцом. Планшеты снова инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 24 ч. Планшеты считывали в счетчике \Уа11ас У1с!ог 2 1420 (^а11ас, Тигки, Еш1анб) при длинах волн 530 (возбуждение) и 590 (испускание). Полученные результаты показали отсутствие активности 1Ь-22 у всех животных, которым инъецировали РВ8, в то время как у 1 гетерозиготного животного, у 2 из 4 гомозиготных животных и у 3 из 6 животных дикого типа была обнаружена активность 1Ь-22. Пролиферация, индуцированная указанной сывороткой, была блокирована в присутствии 1 мкг/мл 1Ь-22ВР при условии его специфичности к 1Ь-22.

Образцы кожи, полученные у гомозиготных и гетерозиготных мышей с отсутствием 1Ь-22КА, которых подвергали и не подвергали воздействию 1Ь-22, и у контрольных мышей дикого типа, фиксировали методом погружения в 10% забуференный формалин. Разрезанные ткани погружали в парафин, обрабатывали стандартными методами, изготавливали срезы толщиной 5 мкм (суперрежущий микротон кпд 2065, Ье1са М1сгозуз!етз, ^еШаг, Сегтапу) и окрашивали Н&Е. Окрашенные ткани были исследованы под световым микроскопом (Ккоп ЕсПрзе Е600, Ккоп 1пс., МеМИе, NΥ) ветеринарным патологоанатом с сертификатом АСУР.

Каждый образец кожи оценивали по шкале от 0 (отсутствие воспаления) до 4 баллов (сильное воспаление) для определения тяжести воспаления в ткани, граничащей с местом имплантации насоса в гиподерме, и по шкале от 0 (отсутствие) до 3 баллов (диффузия) для определения степени утолщения эпидермиса (акантоза) и производили подсчет числа слоев эпителия в самой толстой части эпидермиса. Не было обнаружено различий между гомозиготными мышами и мышами дикого типа, которым вводили РВ8. Результаты, полученные в двух указанных группах, были объединены в одну группу, которой вводили РВ8. Для каждой экспериментальной группы определяли среднее значение и стандартное отклонение, которые представлены в приведенной ниже табл. 14.

Таблица 14

Воздействие	Контрольные мыши: введение РВ5	Гомози потные мыши с отсутствием 1Ь22КА: введение 1Ь-22	Мыши дикого типа: введение 1Ь-22
Число мышей	4	4	6
Толщина эпителия	3, 5+1,0	3,2+0,5	5,9+2,3
Степень акантоза	0, 5±1, 0	0,2+0,5	1,9±1,3
Воспаление	1,5+1,0	1, 2+1,0	2,0±1,0

Полученные результаты позволили выявить тенденцию в направлении увеличения толщины эпителия и акантоза у мышей дикого типа, подвергнутых воздействию 1Ь-22, и меньшую толщину эпителия и акантоза у гомозиготных мышей, экспрессирующих 1Ь-22КА, которых подвергали воздействию 1Ь-22.

Указанные результаты показывают, что эффективное блокирование активности 1Ь-22КА, например, в результате удаления гена 1Ь-22КА или при помощи нейтрализующего моноклонального антитела к 1Ь22КА по настоящему изобретению, должно уменьшать воздействие на кожу, индуцированное 1Ь-22, которое, например, имеет место в случае псориаза, ΙΕΩ, колита или других воспалительных заболеваний, индуцированных 1Ь-22.

Ό. Необходимость 1Ь-22КА для образования блестящей кожи у новорожденных мышат, индуцируемого 1Ь-20: кроссбридинг трансгенных мышей, экспрессирующих 1Ь-20 мыши, с мышами, лишенными 1Ь-22КА, позволяет получить трансгенных мышат без блестящей кожи.

Чтобы определить необходимость 1Ь-22КА для образования блестящей кожи у трансгенных новорожденных мышат, индуцируемого 1Ь-20, трансгенных мышей, экспрессирующих ти1Ь-20 К14, скрещивали с линией мышей, лишенных 1Ь-22КА, и исследовали новорожденных мышат с целью обнаружения фенотипа с блестящей кожей.

Родилось 69 мышат с менделевским соотношением генотипов. Все исходные трансгенные животные на теневом фенотипе Не! К0 имели блестящую кожу, в то время как ни у одного нетрансгенного животного и трансгенного животного на теневом фенотипе НОМ К0 не было обнаружено блестящей кожи.

Анализ пролиферации с окрашиванием аламаровым синим при использовании клеток ВаЕ3, экспрессирующих 1Ь-20КА и 1Ь-20КВ, осуществляли для определения присутствия 1Ь-20 в сыворотке мышей. Клетки пролиферировали под воздействием 1Ь-20 или 1Ь-3 мышей. Указанный анализ осуществляли в соответствии с описанием, приведенным в разделе С. Результаты данного анализа показали, что все трансгенные мыши характеризовались сравнимой активностью 1Ь-20, которая находилась на таком же уровне, что и у трансгенных мышей, экспрессирующих 1Ь-20, на теневом фенотипе С57ВЬ/6К Отсутствие у новорожденных мышат фенотипа с блестящей кожей показывает, что указанный фенотип зависит

- 93 015706 от присутствия В-22ВА. Результаты анализа пролиферации показали, что все трансгенные мыши характеризовались сравнимой активностью ΙΕ-20, которая была на таком же уровне, что и у трансгенных мышей, экспрессирующих ΙΕ-20, на теневом фенотипе С57ВБ/6№ Отсутствие у новорожденных мышат фенотипа с блестящей кожей показывает, что указанный фенотип зависит от присутствия В-22ВА.

На третий день после рождения мышат из пометов, содержащих трансген тиВ-20 К14, на теневом фенотипе с отсутствием В^ВА, гуманно умерщвляли, и все тело фиксировали погружением в 10% забуференный формалин. Из фиксированных тканей изготавливали поперечные срезы грудной клетки и брюшного отдела толщиной 5 мкм, погружали в парафин, обрабатывали стандартными методами (суперрежущих микротон 1иид 2065, Бека Мюго8у8!ет8, УеШаг, Сегтаиу) и окрашивали Н&Е. Окрашенные ткани были вслепую исследованы под световым микроскопом (Мкои Есйр8е Е600, №кои Вс., МеМ11е, NΥ) ветеринарным патологоанатомом с сертификатом АСУР. В процессе исследования регистрировали патологии тканей и подсчитывали число слоев эпителия в эпидермисе задней и передней частей грудной клетки.

В тканях трех трансгенных мышей, экспрессирующих ΙΕ-20, на теневом фенотипе НОМ с отсутствием В-22ВА (В-20 ТС/В-22ВА КО НОМ) и трех нетрансгенных мышей на теневом фенотипе НОМ с отсутствием В-22ВА (иои-ТСЛЕ-22ВА КО НОМ), которые исследовали под микроскопом, не было обнаружено патологий. Кроме того, были исследованы ткани двух трансгенных мышей, экспрессирующих ΙΕ-20, на теневом фенотипе Не! с отсутствием В-22ВА (Ш-20 ТСЛБ-22ВА КО Не!). Число слоев эпителия в эпидермисе было одинаковым у всех животных. Однако эпидермис двух мышей Ш-20 ТСЛБ-22ВА КО Не! был поражен гиперэозинофилией по сравнению с другими животными и характеризовался отсутствием зернистости в зернистом слое. В коже и других тканях мышей не было обнаружено других патологий.

Полученные результаты показывают, что эффективное блокирование активности Ш-22ВА, например, в результате удаления гена Ш-22ВА или при помощи нейтрализующего моноклонального антитела к Ш-22ВА по настоящему изобретению, должно уменьшать воздействия на кожу, индуцированные ΙΕ-20, а также воздействия на кожу, индуцированные ΙΕ-22, которые имеют место, например, в случае псориаза, ШИ, колита или других воспалительных заболеваний, индуцированных ΙΕ-20 и/или ΙΕ-22, которые включают ШИ, артрит, астму, псориатический артрит, колит, воспалительные заболевания кожи и атопический дерматит.

Пример 33. Гистоморфометрический визуализирующий анализ мышей с отсутствием В-22ВА.

Была создана линия трансгенных (ТС) мышей, экспрессирующих Ш-20 К14, в которой трансгенные новорожденные мышата характеризовались фенотипом с блестящей кожей. Указанный трансген был экспрессирован промотором К14, направляющим экспрессию в кератин-продуцирующие клетки кожи. Кроме того, была создана линия мышей с отсутствием (КО) Ш-22ВА, при этом у нестимулированных мышей отсутствовали существенные изменения. Две указанные линии скрещивали и отбирали новорожденных мышат с нижеследующими четырьмя разными генотипами: (1) ТС/-НОМ: экспрессия трансгена шВ-20 К14 на теневом фенотипе, не экспрессирующем В-22ВА; (2) ТС/-Не!: экспрессия трансгена ιηΒ20 К14 на теневом фенотипе, экспрессирующем некоторое количество В-22А из одной копии гена В22ВА; (3) УТ/НОМ: отсутствие экспрессии трансгена шВ-20 К14 на теневом фенотипе, не экспрессирующем В-22ВА; и (4) УТ/Не!: отсутствие экспрессии трансгена шВ-20 К14 на теневом фенотипе, экспрессирующем некоторое количество Ш-22ВА из одной копии гена В-22ВА. 34 новорожденных мышонка с вышеуказанными разными генотипами умерщвляли на 3-й день, примерно через 48 ч после рождения (табл. 15).

Таблица 15

	ΤΌ/-ΗΟΜ* (группа 1)	Т5/-Неб* (группа 2)	№Г/НОМ* (группа 3)	ТСТ/Не!:* (группа 4)
Всего	п«10	п=10	п=9	п=5

*ТС = трансгенные мыши; УТ = мыши дикого типа; НОМ = гомозиготные мыши;

Не! = гетерозиготные мыши и и = число мышей

Тело каждого мышонка разрезали в поперечном направлении на три части (краниальная часть грудной клетки, каудальная часть грудной клетки и брюшной отдел) и голову выбрасывали. Образцы ткани толщиной 4,0-5,0 мм фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, обрабатывали с образованием парафиновых блоков и окрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е) для осуществления стандартного гистологического исследования и гистоморфометрического визуализирующего анализа. Эпидермис дорсальной области позвоночника в каждом образце ткани подвергали гистоморфометрическому визуализирующему анализу при помощи микроскопа О1утри8 ВН-2, видеокамеры (Иаде-МТ!, МюЫдаи Сйу, В) и программного обеспечения Ушбо\\'8 98 ВюОнагИ Тгие Со1ог (В&М Вюте!йс8, Вс., №·ΐ81ινί1Β ТN 37209) при следующих установках: параметр: 10-кратное увеличение, смещение по оси Ζ, равное 0; матрица: длина (мкм); измерение: ручное и аддитивный режим. Толщину (мкм) эпидермиса и рогового или ороговевшего слоя на каждом образце кожи измеряли отдельно 10 раз с интервалом около

- 94 015706

0,1 мм между измерениями в каждом 10-кратном микроскопическом поле и с помощью программы Ехсе1 вычисляли среднее значение, стандартное отклонение и стандартную ошибку среднего. Все срезы были рандомизированы и измерены слепым методом. После измерения срезы идентифицировали, и полученные результаты соотносили с экспериментальными группами. Конечные результаты в зависимости от группы классифицировали следующим образом: 1) средняя толщина эпидермиса (мкм) в краниальной части грудной клетки, каудальной части грудной клетки и брюшном отделе, которые делили на подклассы: (а) средняя толщина эпидермиса в краниальной части грудной клетки; (Ь) средняя толщина эпидермиса в каудальной части грудной клетки и (с) средняя толщина эпидермиса в брюшном отделе; 2) средняя толщина рогового слоя (мкм) в краниальной части грудной клетки, каудальной части грудной клетки и брюшном отделе, которые делили на подклассы: (а) средняя толщина рогового слоя в краниальной части грудной клетки; (Ь) средняя толщина рогового слоя в каудальной части грудной клетки и (с) средняя толщина рогового слоя в брюшном отделе; 3) средняя толщина эпидермиса и рогового слоя в краниальной части грудной клетки, каудальной части грудной клетки и брюшном отделе. Полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения СгарйРаб БиЗ!а! (СгарйРаб Зой^аге, Бис., Заи О1едо, СА 92121). Дисперсионный анализ по одному признаку (АN0УА) осуществляли для исследования статистической значимости расхождений средних значений в группах с 1 по 4. Тестирование с множественными сравнениями Тукея-Крамера использовали для определения статистических расхождений средних значений между двумя группами (*Р<0,05; **Р<0,01; ***Р<0,001; ****Р<0,0001). Значения Р<0,05 считались статистически значимыми.

(1) Результаты гистоморфометрического анализа.

(а) Средняя толщина эпидермиса (мкм) в краниальной части грудной клетки, каудальной части грудной клетки и брюшном отделе.

Толщина эпидермиса была значительно больше у трансгенных мышат, экспрессирующих ББ-20, у которых отсутствовала одна копия гена ББ-22КА (СТ/-Не!), по сравнению с трансгенными мышатами, экспрессирующими ББ-20, у которых полностью отсутствовала экспрессия ББ-22КА (ТС/-Н0М, Р=0,001***), и контрольными однопометными животными (^Т/Н0М, Р=0,001*** и ^Т/Не!, Р=0,001***) (табл. 16). У мышей ТС/-Не! наблюдалось увеличение толщины некератизированного эпидермиса, вероятно, вследствие гипертрофии кератиноцитов. Указанный процесс мог охватывать все три некератизированных слоя (базальный, шиповатый и зернистый), но чаще всего относился к шиповатому слою клеток. Толщина эпидермиса у мышат ТС/-Не! увеличилась примерно на 25%, и шиповатый слой стал выпуклым. При этом эпидермис у мышат ТС/-Н0М был немного толще, чем у контрольных животных (ХУТ/Н0М и ^Т/Не!), и статистические данные свидетельствовали об отсутствии существенных различий между группами (Р>0,05). Кроме того, сравнивали толщину эпидермиса в краниальной части грудной клетки, каудальной части грудной клетки и брюшном отделе. Нормально тонкий эпидермис в брюшном отделе толще, чем в каудальной части грудной клетки, и эпидермис в каудальной части грудной клетки толще, чем в краниальной части грудной клетки (табл. 16).

Таблица 16

	ΤΞ/-ΗΟΜ (N=28)	ТС/-НеО (N=30)	ИТ/НОМ (N=27)	ИТ/НеС (N=15)
Среднее значение	32,58 + 1,25	41,05+2,04	31,31+1,08	30,83+1,43

Результаты представляют средние значения±стандартная ошибка среднего. N = число измеренных срезов.

Чешуйчатый эпителий кожи в краниальной части грудной клетки у мышат ТС/-Не! характеризовался увеличением толщины, сопровождавшимся гипертрофией эпидермальных клеток (кератиноцитов); однако в данном случае отсутствовало статистически значимое различие с другими группами, ТС/-Н0М, ХУТ/Н0М и \УТН\\1 (Р=0,1565, табл. 17). Подобный результат, по-видимому, является следствием гистологического артефакта, например различий между срезами, природной структуры эпидермиса, или отсутствия большого воздействия в тонкой коже краниальной части грудной клетки. Примечание: ошибки в процессе гистологического исследования или при изготовлении срезов ткани краниальной части грудной клетки не позволяют получить статистически значимые результаты при осуществлении гистоморфометрического анализа.

Таблица 17

	ТО/-НОМ (N=10)	Т6/-НеЪ (N=10)	ИТ/НОМ (N=9)	ΗΤ/Ηβί (N=5)
Среднее значение	29,18+2,24	33,20+2,24	27,28+0,62	29,38+1,77

Результаты представляют средние значения±стандартная ошибка среднего, N = число измеренных срезов.

Мыши, экспрессирующие Ш-20, (ТС/-) с одной копией гена Ш-22КА (Не!) характеризовались уве

- 95 015706 личением среднего значения толщины эпидермиса по сравнению соответственно с животными ТС/-НОМ (Р<0,05*), УТ/НОМ (Р<0,001***) и УТ/Не! (Р<0,01*) (табл. 18). Статистические данные свидетельствовали о чрезвычайно высоком уровне значимости в группах (Р<0,0001****). Толщина эпидермиса у животных ТС/-Не! увеличилась примерно на 29% по сравнению с животными УТ/Не!. Фенотип мышат, экспрессирующих ΙΕ-20, (ТС/-) при отсутствии I^-22КА (НОМ) частично напоминал фенотип мышат с отсутствием одной копии гена I^-22КА (Не!), ассоциированный с более толстым эпидермисом, по сравнению с контрольными однопометными животными (УТ/НОМ и УТ/Не!), однако, в данном случае отсутствовало статистически значимое различие с контрольными животными (Р>0,05). Толщина эпидермиса у мышат ТС/-НОМ увеличилась примерно на 14% по сравнению с мышатами УТ/НОМ. В отличие от мышат, экспрессирующих ΙΕ-20, (ТС/-) мышата с отсутствием рецептора I^-22КАт (ХУТ/НОМ и УТ/Не!) характеризовались относительно более тонким эпидермисом. Следует отметить, что результат гистоморфометрического исследования толщины эпидермиса в каудальной части грудной клетки был сопоставим со средней толщиной эпидермиса в краниальной части грудной клетки, каудальной части грудной клетки и брюшном отделе (табл. 15), из чего следует, что гистологическое исследование и изготовление срезов тканей каудальной части грудной клетки были осуществлены на высоком уровне качества для гистоморфометрического визуализирующего анализа.

Таблица 18

	тс/-ном (N=10)	ТЕ/-Неь (N=10)	НТ/НОМ (N=9)	ИТ/НеЬ (N=5)
Среднее значение	35,91+1,37	43,79±2,35	30,83+1,86	30,94±2,83

Результаты представляют средние значения±стандартная ошибка среднего. N = число измеренных срезов.

Результаты средней толщины эпидермиса в брюшном отделе (табл. 19) были аналогичны результатам, полученным в каудальной части грудной клетки (табл. 18), за исключением того, что у мышей ТС/НОМ отсутствовали различия с контрольными однопометными животными (УТ/НОМ и УТ/Не!, Р>0,05). Имели место некоторые различия в срезах ткани и, кроме того, отсутствовали два среза, т.е. в группе ТС/-НОМ не было эпидермиса, покрывающего дорсальную область.

Таблица 19

	ТС/-НОМ (N=8)	те/-неь (N=10)	ИТ/НОМ (N=9)	ИТ/НеТ (N=5)
Среднее значение	32,35±1,44	46,33±3,10	35,81±1,90	32,16+2,97

Результаты представляют средние значения±стандартная ошибка среднего. Ν = число измеренных срезов.

(Ь) Средняя толщина (мкм) рогового слоя в краниальной части грудной клетки, каудальной части грудной клетки и брюшном отделе.

Несмотря на увеличение толщины эпидермиса у трансгенных мышат, экспрессирующих ΙΕ-20, (ТС/-) на теневом фенотипе, не экспрессирующем I^-22КА (НОМ) или экспрессирующем одну копию гена (Не!), преимущественное уменьшение рогового слоя или ороговевшего слоя наблюдалось в коже мышей ТС/-НОМ и ТС/-Не! по сравнению с контрольными однопометными животными (УТ/НОМ и УТ/Не!), и статистические данные свидетельствовали о чрезвычайно высоком уровне значимости в группах (Р<0,0001****, табл. 20). Мышата ТС/-Не! характеризовались уменьшением кератина на поверхности эпидермиса примерно на 36, 50 и 49% по сравнению соответственно с мышами ТС/-НОМ (Р<0,01**), ХУТ/НОМ (Р<0,001***) и УТ/Не! (Р<0,001***). У мышат ТС/-НОМ наблюдалось значительное уменьшение толщины рогового слоя примерно на 22% по сравнению с контрольными животными (УТ/НОМ, Р<0,05*) и уменьшение только на 17% по сравнению с мышами УТ/Не!, которое не выявило статистической значимости (Р>0,05). Толщина рогового слоя у контрольных мышат УТ/НОМ и УТ/Не! была примерно одинаковой. Очевидно, что роговой слой в каудальной части грудной клетки толще, чем в брюшном отделе, и роговой слой в брюшном отделе толще, чем в краниальной части грудной клетки.

Таблица 20

	ТС/-ном (N=8)	ТС/-НеЪ (N=10)	ИТ/НОМ (N=9)	ИТ/НеО (N=5)
Среднее значение	33,26+2,69	21,41+1,27	42,54±2,01	40,31±3,82

Результаты представляют средние значения±стандартная ошибка среднего. Ν = число измеренных срезов.

Средняя толщина рогового слоя в краниальной части грудной клетки (табл. 21) соответствовала

- 96 015706 аналогичному показателю в краниальной части грудной клетки, каудальной части грудной клетки и брюшном отделе (табл. 20), однако, существенное уменьшение рогового слоя было обнаружено только у мышей ТС/-Не! по сравнению, соответственно, с мышами ТС/-Н0М (Р<0,05*) и VТ/НΟΜ (Р<0,01**). Стандартное отклонение и стандартная ошибка среднего имели высокие значения, что могло быть связано с плохим изготовлением срезов, отсутствием образцов кожи, природной структурой эпидермиса или отсутствием большого воздействия в краниальной части грудной клетки. Примечание: ошибки в процессе гистологического исследования или при изготовлении срезов ткани краниальной части грудной клетки не позволяют получить качественного результата при осуществлении гистоморфометрического анализа.

Таблица 21

	тс/-ном (Ν=2β)	ТС/-НеЪ (N=30)	НТ/НОМ (N=26)	ИТ/НеУ (N=14)
Среднее значение	34,96+3,53	18,14±3,99	40,47+4,38	32,96+8,11

Результаты представляют средние значения±стандартная ошибка среднего, N = число измеренных срезов.

Результаты средней толщины рогового слоя в каудальной части грудной клетки (табл. 22) были аналогичны результатам, полученным для краниальной части грудной клетки, каудальной части грудной клетки и брюшного отдела, при наличии трех исключений: (1) у мышей ТС/-Н0М по сравнению с мышами ТС/-Не! и у мышей ТС/-Н0М по сравнению с мышами VТ/НΟΜ отсутствовали статистически значимые различия (Р>0,05); (2) у мышей ТС/-Н0М по сравнению с мышами VТ/Не! имели место существенные различия (Р<0,01**); (3) роговой слой у мышей VТ/Не! был значительно утолщен, что может быть следствием обработки тканей, например, кератин разбухал или расширялся при введении в гипотонический раствор или слишком долго находился на водяной бане.

Таблица 22

	ТС/-НОМ (N=10)	Тб/-Не6 (N=10)	ИТ/НОМ (N=8)	НТ/НеС (N=4)
Среднее значение	35,64±3,4	24,22±1,54	44,35±3,51	53,77+7,21

Результаты представляют средние значения±стандартная ошибка среднего, N = число измеренных срезов.

Только у мышей ТС/-Н0М по сравнению с мышами VТ/НΟΜ и у мышей ТС/-Не! по сравнению с мышами VТ/НΟΜ было обнаружено статистически значимое различие, соответственно, Р<0,05* и Р<0,001*** (табл. 23). У мышат ТС/- имело место уменьшение толщины рогового слоя в брюшном отделе по сравнению с контрольными однопометными животными ^Т/Н0М и νΈ/Πο!).

Таблица 23

	ТС/-НОМ (N=8)	ТС/-НеЪ (N=10)	ит/ном (N=9)	ИТ/НеР (N=4)
Среднее значение	28,84±4,36	21,86+1,30	42,45+3,15	33,25+396

Результаты представляют средние значения±стандартная ошибка среднего, N = число измеренных срезов.

(с) Средняя толщина (мкм) эпидермиса вместе с роговым слоем в краниальной части грудной клетки, каудальной части грудной клетки и брюшном отделе.

У мышат ТС/-Не! наблюдалось значительное увеличение толщины эпидермиса и значительное уменьшение рогового слоя по сравнению с контрольными однопометными животными ^Т/Н0М и VТ/Не!); у мышат ТС/-Н0М имел место аналогичный результат, но с минимальным эффектом (табл. 24). Таблица 24

	ТС/-НОМ (N=10)	ТС/-НеР (N=10)	ИТ/НОМ (N=9)	ИТ/НеЪ (N=4)
Роговой слой	32,58	41,05	31,31	30,83
Эпидермис	33,26	21,41	42,54	40,31

Результаты представляют средние значения. N = число мышат.

- 97 015706 (б) Передача сигналов ГБ-20 через ГБ-20ВА и ГБ-22ВА.

Эпидермис является многослойным постоянно обновляющимся эпителием, зависимым в отношении гомеостаза от баланса между пролиферацией, дифференцировкой и гибелью клеток. В нормальном эпидермисе митотически активный базальный слой вызывает образование конечно дифференцирующих кератиноцитов, которые мигрируют из указанного слоя и, в конечном счете, отторгаются с поверхности кожи в виде энуклеированных чешуек, кератина или ороговевшего слоя, расположенного на роговом слое. Несмотря на то, что многие белки служат для сохранения гомеостаза в эпидермисе, молекулярная координация указанных явлений плохо изучена. ГБ-20 является новым белком, взаимодействующим с рецептором, который передает сигналы через рецепторы ГБ-20ВА или ГБ-22ВА (ГБ-22ВА), экспрессированные в слое кожи, ассоциированном с пролиферацией кератиноцитов. Трансгенные новорожденные мышата, экспрессирующие ГБ-20, характеризуются фенотипом с аномально утолщенной и блестящей кожей. При отсутствии ГБ-22ВАт (НОМ) мыши не реагируют на воздействие ГБ-22, в то время как мыши дикого типа, содержащие ген ГБ-22ВА и подвергнутые воздействию ГБ-22, характеризуются значительным увеличением толщины эпидермиса (Р<0,001***, см. результаты гистоморфометрического визуализирующего анализа ГБ-22ВАт К0/ГБ-22, РШ 59,2). Для исследования того, что отсутствие ГБ-22ВА оказывает воздействие на фенотип с блестящей кожей, обнаруженный у трансгенных новорожденных мышат, экспрессирующих ГБ-20т К14, трансгенных мышей, эктопически экспрессирующих ГБ-20, спаривали с гомозиготными (НОМ) или гетерозиготными (Не!) мышами, лишенными ГБ-22ВА. Количественный визуализирующий анализ толщины эпидермиса ранее осуществляли с использованием меньшего количества мышат при исследовании каудальной части грудной клетки (т.е. 19 мышат, 1 срез у одного мышонка, всего 19 срезов), при этом не была достигнута статистическая значимость вследствие ограниченного числа экспериментальных животных и разброса в группах. Целью настоящего исследования было гистоморфометрическое количественное изучение большего числа образцов кожи из краниальной части грудной клетки, каудальной части грудной клетки и брюшного отдела, полученных у каждого мышонка в одном эксперименте (т.е. 34 мышонка, 3 среза у одного мышонка, всего 102 среза), для исследования биологии ГБ-20 и получения надежных количественных результатов. Для осуществления эффективного визуализирующего анализа ориентация кожи в парафиновом блоке была одинаковой, и образцы кожи измеряли из одних и тех же соответствующих положений у всех отдельных животных и в группах мышат. Осуществляли измерения двух типов: (1) толщину эпидермиса измеряли 10 раз в 10-кратном микроскопическом поле в каждом образце кожи, полученной с дорсальной стороны позвоночника, для исследования роли ГБ-20 в опосредовании пролиферации и дифференцировки кератиноцитов; (2) толщину ороговевшего слоя или рогового слоя измеряли аналогичным образом для корреляции результатов, относящихся к трансгенным новорожденным мышатам, экспрессирующим ГБ-20.

Гистоморфометрический визуализирующий анализ толщины эпидермиса показал, что новорожденные мышата ТС/-Не!, экспрессирующие трансген ГБ-20т К14, на теневом фенотипе, экспрессирующем некоторое количество ГБ-22ВА из одной копии гена ГБ-22ВА, характеризуются утолщенным эпидермисом, и новорожденные мышата ТС/-Н0М, экспрессирующие трансген ГБ-20т К14, на теневом фенотипе, не экспрессирующем ГБ-22ВА, не имеют существенных изменений. Толщина эпидермиса значительно увеличилась у трансгенных мышат, экспрессирующих ГБ-20, с отсутствием одной копии гена ГБ-22ВА (ТС/-Не!) по сравнению с трансгенными мышатами, экспрессирующими ГБ-20, с отсутствием обеих копий генов ГБ-22ВА (ТС/-Н0М, Р=0,001***) и контрольными однопометными животными (\Т/Н0М, Р=0,001*** и \Т/Не!, Р=0,001***). У мышат ТС/-Не! наблюдалось увеличение толщины некератинизированного эпидермиса главным образом вследствие гипертрофии кератиноцитов в шиповатом слое. Толщина эпидермиса у мышат ТС/-Не! увеличилась примерно на 25%, в то время как толщина эпидермиса у мышат ТС/-Н0М была лишь немного больше, увеличившись примерно на 4-5%, чем у контрольных животных (\Т/Н0М и \ТНе!), при этом статистические данные свидетельствуют об отсутствии существенного различия между мышами ТС/-Н0М и контрольными мышами \Т/Н0М (Р>0,05).

Результаты гистоморфометрического исследования рогового слоя показали, что, несмотря на утолщение эпидермиса у новорожденных мышат ТС/-Не!, в коже мышей ТС/-Н0М и ТС/-Не! имело место преимущественное уменьшение кератина или ороговевшего слоя по сравнению с контрольными однопометными животными (\Т/Н0М и \Т/Не!), при этом статистические данные свидетельствуют о чрезвычайно высоком уровне значимости в группах (Р<0,0001****). У мышат ТС/-Не! наблюдалось уменьшение кератина на поверхности эпидермиса примерно на 36, 50 и 49% по сравнению, соответственно, с мышами ТС/-Н0М (Р<0,01**), \Т/Н0М (Р<0,001***) и \Т/Не! (Р<0,001***). У мышат ТС/-Н0М наблюдалось значительное уменьшение толщины рогового слоя примерно на 22% по сравнению с контрольными животными (\Т/Н0М, Р<0,05*) и лишь на 17% по сравнению с мышами \Т/Не! (Р>0,05). Толщина рогового слоя у контрольных мышат \ Т/Н0М и \ Т/Не! была примерно одинаковой. Уменьшение средней толщины рогового слоя у новорожденных мышат ТС/-Н0М и ТС/-Не!, по-видимому, согласуется с макроскопическими данными, в соответствии с которыми при высоком уровне кожа мышат, экспрессирующих ГБ-20, (ТС)/!Б-22ВА (Не!), характеризуется менее выраженным блеском (например, с меньшим количеством кератина), именуемым сиянием, в то время как кожа новорожденных мышат, экспрессирующих ГБ-20, (ТС)/ГБ-22ВА (НОМ) не блестит (например, с большим количеством кератина). В

- 98 015706 гистологическом отношении кератин в роговом слое мышат ТС/-, по-видимому, является более компактным, чем у мышат дикого типа. Утолщенный эпидермис, обусловленный гипертрофическими кератиноцитами, и тонкий роговой слой у трансгенных новорожденных мышат, экспрессирующих ГЬ-20, могут служить объяснением наличия у указанных животных фенотипа с блестящей кожей.

Повышенная гипертрофия и нарушенная конечная дифференцировка кератиноцитов наблюдались у трансгенных новорожденных мышат, экспрессирующих ГЬ-20, с целенаправленно удаленной одной копией гена ГЬ-22КА (Не!). Кожа характеризовалась гипертрофией кератиноцитов при неполной дифференцировке, отсутствии кератина или рогового слоя. Трансгенные новорожденные мышата, экспрессирующие ГЬ-20, с двумя разрушенными копиями генов ГЬ-22КА (НОМ) характеризовались фенотипом, напоминающим кожу мышей ТС/-Не!, но при меньшем или минимальном эффекте (фиг. 12-15). Вполне вероятно, что отсутствие ГЬ-22КА (НОМ) оказывает частичное воздействие на фенотип с блестящей кожей, имеющий место у трансгенных новорожденных мышат, экспрессирующих ГЬ-20т К14, и отсутствие ГЬ-22КА (Не!) оказывает минимальное воздействие или вообще не влияет на фенотип с блестящей кожей. Другими словами, передаче сигналов ГЬ-20, нового взаимодействующего с рецептором белка, передающего сигналы через рецептор ГЬ-20КА или ГЬ-22КА (I^-22КΑ), по-видимому, не препятствует отсутствие экспрессии одной копии гена ГЬ-22КА (Не!), но частично препятствует отсутствие экспрессии двух копий гена I^-22КΑ (НОМ).

Полученные результаты показывают, что эффективное блокирование активности I^-22КΑ, например, в результате удаления гена ГЬ-22КА или при помощи нейтрализующего моноклонального антитела к ГЬ-22КА по настоящему изобретению должно уменьшать воздействия на кожу, индуцированные ГЬ-20, а также воздействия на кожу, индуцированные ГЬ-22, которые имеют место, например, в случае псориаза, ГВО, колита или других воспалительных заболеваний, индуцированных Ш-20 и/или ГО-22.

Пример 34. Воздействие ГО-22 на мышей с отсутствием I^-22КΑ.

мышей, в том числе 23 мыши с отсутствием ГО-22 К А (НОМ) и 13 контрольных мышей ^Т), подвергали воздействию ГО-22 или РВ8, которые вводили подкожно при помощи имплантированного мининасоса с трубкой или одного мининасоса (табл. 25).

Таблица 25

	НОМ/РВЗ (группа 1)	ΗΟΜ/ΙΓ-22 (группа 2)	НТ/РВЗ (группа 3)	ΗΤ/ΙΒ-22 (группа 4)
Самцы	п=3	п-10	п-3	п=8
Самки	п=0	п=10	п=0	п=2
Всего	п=3	п=20	п=3	п=10

Образцы кожи длиной 1,5-2,5 см и толщиной 4,0-5,0 мм, полученные у каждого животного с места установки мининасоса, подвергали стандартному гистологическому исследованию и гистоморфометрическому визуализирующему анализу. Все образцы тканей фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине и помещали в парафиновые блоки. Шесть сегментированных срезов толщиной 5 мкм и с промежутком в 10 мкм между смежными срезами, в которых эпителий покрывал всю поверхность, полученные из одного образца кожи каждого животного, окрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е). Гистоморфометрический визуализирующий анализ образцов кожи осуществляли с помощью микроскопа 01утриз ВН-2, видеокамеры (^аде0ΜТI, М1сЫдап СЬу, Ш) и программного обеспечения 98

ВюОнагИ Тгие Со1ог (К&М ВютеГОсз, ГОс., НазНуШе, ΊΉ 37209) при следующих установках: параметр: 10-кратное увеличение, смещение по оси Ζ, равное 0; матрица: длина (мкм); измерение: ручное и аддитивный режим. Толщину (мкм) эпидермиса измеряли 5 раз в каждом 10-кратном микроскопическом поле, состоящем в общей сложности из 4 полей на расстоянии 0,4 см от центра каждого среза кожи (например, одно 10-кратное микроскопическое поле=0,1 см и четыре 10-кратных микроскопических поля=0,4 см). Измеряли 6 срезов, полученных у каждого животного, и с помощью программы Ехсе1 высчитывали среднее значение, стандартное отклонение и стандартную ошибку среднего. Все срезы были рандомизированы и измерены слепым методом. После измерения срезы идентифицировали, и полученные результаты соотносили с экспериментальными группами. Конечные результаты в зависимости от группы классифицировали следующим образом: 1) толщина эпидермиса у самцов и самок гомозиготных мышей и мышей дикого типа; 2) толщина эпидермиса у самцов гомозиготных мышей и самцов мышей дикого типа. Полученные данные анализировали при помощи программного обеспечения СгарЬРай Ш8!а! (СгарЬРай 8оГ!^аге, ГОс., 8ап О1едо, СА 92121). Дисперсионный анализ по одному признаку (ΑN0VΑ) осуществляли для исследования статистической значимости расхождений средних значений в группах с 1 по 4. Тестирование с множественными сравнениями Тукея-Крамера использовали для анализа значимости средних значений в двух группах. Значение Р<0,05 считалось статистически значимым.

III. Результаты гистоморфометрического анализа.

(1) Толщина эпидермиса (мкм) у самцов и самок гомозиготных мышей и мышей дикого типа.

Толщина эпидермиса значительно увеличивалась в коже мышей дикого типа, которых подвергали

- 99 015706 воздействию ΙΕ-22 ^Т/Ш-22), по сравнению с контрольными животными VТ/РΒ8 (Р=0,0001). Кожа мышей с отсутствием Ш-22КАт, подвергнутых воздействию Ш-22 (Н0М/Ш-22), характеризовалась более высоким средним значением толщины эпидермиса по сравнению с контрольными животными НОМ/РВ8, однако, статистические данные свидетельствуют об отсутствии существенной разницы между двумя группами (Р>0,05). Преимущественное уменьшение толщины эпидермиса наблюдалось у мышей с отсутствием Ш-22КА по сравнению с мышами дикого типа (например, Н0М/Ш-22 по сравнению с νΐ7ΙΕ-22; Р<0,001) (табл. 26).

Таблица 26

	НОМ/РВЗ (N=3)	НОМ/1И-22 (N=19)	ИТ/РВЗ (N=3)	ИТ/РЪ-22 (N=10)
Среднее значение	14,1510,19	19,0111,03	23,34+5,49	43,0811,85

Результаты представляют средние значения±стандартная ошибка среднего. N = число животных.

(2) Толщина эпидермиса (мкм) у самцов гомозиготных мышей и мышей дикого типа.

Толщина эпидермиса увеличилась примерно в 2 раза в коже самцов мышей дикого типа, которых подвергали воздействию Ш-22 ^Т/Ш-22), по сравнению с самцами контрольных мышей VТ/РΒ8 (Р=0,0001), однако, у самцов мышей с отсутствием Ш-22КАт, которых подвергали воздействию Ш-22 (Н0М/Ш-22), толщина эпидермиса увеличилась незначительно по сравнению с самцами контрольных мышей НОМ/РВ8 (Р>0,05). Следует отметить, что у мышей с отсутствием Ш-22КАт наблюдалось значительное уменьшение толщины эпидермиса по сравнению с самцами контрольных мышей дикого типа (например, НОМ/РВ8 по сравнению с VТ/РΒ8; Р<0,05; Н0М/Ш-22 по сравнению с VТ/I^-22: Р<0,001) (табл. 27).

Таблица 27

	НОМ/РВЗ (N=3)	НОМ/И-22 (N=9)	ИТ/РВЗ (N=3)	ИТ/Ш-22 (N=8)
Среднее значение	14,1510,19	15,86+0,75	23,34+5,49	41,4111,71

Результаты представляют средние значения±стандартная ошибка среднего.

(3) Толщина эпидермиса (мкм) у самцов гомозиготных мышей и мышей дикого типа по сравнению с самками.

Было установлено, что эпидермис у самок мышей толще, чем у самцов мышей (например, самец Н0М/Ш-22 по сравнению с самкой Н0М/Ш-22: Р<0,01; самец VТ/I^-22 по сравнению с самкой VТ/I^22: Р<0,05) (табл. 28).

Таблица 28

	НОМ/1Б-22 (самцы, N=9)	НОМ/1Ь-22 (самки, N=10)	ИТ/1Б-22 (самцы, N=8)	НТ/И-22 (самки, N=8)
Среднее значение	15,8610,75	21,8511,3	41, 4111,71	49,75+4,82

Результаты представляют средние значения±стандартная ошибка среднего.

(4) Толщина эпидермиса (мкм) у гомозиготных мышей при использовании насоса для Ш-22 по сравнению с насосом для Ш-22 с трубкой.

Было установлено, что эпидермис мышей с отсутствием Ш-22КАт (НОМ) при использовании насоса для Ш-22 с трубкой является значительно толще, чем у мышей (НОМ) с отсутствием Ш-22КАт при использовании насоса без трубки (Р<0,0001, неспаренный Т-критерий) (табл. 29).

- 100 015706

Таблица 29

	Насос для гомозиготных мышей с отсутствием 1Ъ-22 (М=8 и Е=2, N=10)	Насос с трубкой для гомозиготных мышей с отсутствием 1Ь-22 (М=2 и Г=8, N=10)
Среднее значение	15,85±0,65	23,30±1,36

Результаты представляют средние значения±стандартная ошибка среднего.

М: самцы; Р: самки; N общее число мышей

ГУ. Рассмотрение результатов.

Целью данного эксперимента является исследование изменений эпидермиса подвергнутой воздействию ГЬ-22 кожи мышей с отсутствием ГЬ-22КАт и мышей дикого типа, и соотнесение полученных результатов с клиническими показаниями. Толщину эпидермиса в окрашенных Н&Е срезах кожи определяли при помощи количественного визуализирующего анализа. Образцы кожи каждого животного 120 раз подвергали гистоморфометрическому измерению (т.е. 20 измерений каждого среза х 6 сегментированных срезов для каждой мыши=120 измерений) и с помощью программы Ехсе1 высчитывали среднюю толщину эпидермиса. Результаты гистоморфометрического исследования показали, что ГЬ-22 вызывает значительное увеличение толщины эпидермиса, особенно у мышей дикого типа при наличии рецептора ГЬ-22КА (значение Р<0,0001 при измерении методом АNОУА было признано в высшей степени статистически значимым), и оказывал гораздо меньшее или минимальное воздействие на мышей (НОМ), лишенных ГЬ-22КАт, при отсутствии рецептора ГЬ-22КА (Р>0,05). Толщина эпидермиса у мышей дикого типа, подвергнутых воздействию ГЬ-22, была увеличена примерно на 43% по сравнению с мышами, которым вводили РВ8 (например, УТ/РВ8, Р<0,001), в то время как у мышей (НОМ) с отсутствием ГЬ22КАт, подвергнутых воздействию ГЬ-22, толщина эпидермиса была увеличена только на 26% по сравнению с контрольными мышами (НОМ/РВ8, Р>0,05). Мыши с отсутствием ГЬ-22КАт имели более тонкий эпидермис по сравнению с мышами дикого типа (Р<0,001). Выявленное биологическое воздействие ГЬ-22 на кожу мыши позволяет предположить, что данный фактор может участвовать в регулировании роста и пролиферации эпидермиса.

Пример 35. Фармакокинетика моноклонального антитела против ГЬ-20 человека (клон № 262.7.1.3.2.4).

Испытуемое моноклональное антитело против ГЬ-20 человека (клон № 262.7.12.3.2.4), полученное в виде трех 3 мл-аликвот в концентрации 1,08 мг/мл (определенной по УФ-поглощению при 280 нм), хранили при -80°С до использования. В качестве носителя использовали 1-кратный объем РВ8 (50 мМ NаРО₄, 109 мМ №С1), рН 7,3. Моноклональное антитело оттаивали при комнатной температуре перед использованием и аликвоты 1 и 2 использовали в том виде как есть соответственно для внутривенного и подкожного введения в дозе, равной 100 мкг. Одну половину аликвоты 3 разводили в отношении 1:2 в 1кратном объеме РВ8 для подкожного введения в дозе, равной 50 мкг, и вторую половину аликвоты 3 разводили в отношении 1:10 в 1-кратном объеме РВ8 для подкожного введения в дозе, равной 10 мкг. Самки мышей 8СГО (и=96) были предоставлены компанией СБаг1ез ККег ЬаЬз. После доставки у животных проверяли состояние здоровья и распределяли по группам (3 животных в одной клетке). В начале исследования мыши находились в возрасте 12 недель и имели среднюю массу тела, равную 22 г.

A. Схема введения.

Самок мышей 8СГО (и=24 в одной группе) произвольно распределяли в четыре группы (см. табл. 30). Животным в группе 1 вводили моноклональное антитело против БиГЬ-20 в виде внутривенной инъекции в хвостовую вену в количестве около 93 мкл и животным в группах 2, 3 и 4 вводили моноклональное антитело в виде подкожной инъекции в заднюю часть шеи в количестве около 93 мкл.

B. Получение образцов.

Мышей полностью анестезировали галотаном или изофлуораном, после чего брали у них пробы крови. Пробы крови брали через сердечный катетер во все периоды времени за исключением периода времени, соответствующего 168 ч (у животных брали пробы крови через глаз, и затем у тех же животных снова брали пробы крови через сердечный катетер в период времени, соответствующий 504 ч). Кровь собирали в пробирки сепаратора сыворотки и оставляли для свертывания на 15 мин. Затем пробы центрифугировали со скоростью 14000 об/мин в течение 3 мин. После центрифугирования аликвоты, равные 125-150 мкл, распределяли по пробиркам Эппендорфа с этикетками и сразу же помещали на хранение при -80°С до осуществления анализа (табл. 30).

- 101 015706

Таблица 30

№ группы	Доза (РОА)	Животные	Периоды времени РК
1	100 мкг (внутривенно)	3 мыши/один период времени*	0,25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 и 504 часа
2	100 мкг (подкожно)	3 мыши/один период времени'’	0,25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 и 504 часа
3	50 мкг (подкожно)	3 мыши/один период времени*	0,25, 1, 4, 8, 24, 12, 168, 336 и 504 часа
4	10 мкг (подкожно)	3 мыши/один период времени*	0,25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 и 504 часа

* Пробы крови брали у одних и тех же животных в периоды времени, соответствующие 168 и 504 ч

С. Количественное определение методом ЕЫ8А концентраций моноклонального антитела против киШ-20 в сыворотке.

Фармакокинетическое исследование осуществляли при помощи твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЬША), который был разработан и специально предназначен для анализа проб сыворотки, полученных у мышей, которым вводили моноклональное антитело против Ш-20 267.7.1.3.2.4. В данном анализе нашло применение коммерчески доступное вторичное антитело и колориметрическое обнаружение с помощью ТМВ. Разведения, используемые для построения стандартной кривой, были модифицированы для улучшения определения линейной части стандартной кривой. Стандартная кривая, построенная для концентраций в пределах от 100 мкг/мл до 0,231 нг/мл при 2-кратных разведениях, позволила произвести количественное определение проб сыворотки мышей. Пробы ОС разводили в отношении 1:100, 1:1000 и 1:10000 в 10% сыворотке мышей 8СГО и высчитывали на основании стандартной кривой.

Ό. Фармакокинетический анализ.

Значения концентрации в сыворотке в зависимости от времени вводили в программное обеспечение №шЫоп1т Рго£еккюпа1 4.0 (РкагЦдк!, Шс., Сагу, N0) для осуществления фармакокинетического анализа. Фармакокинетические параметры определяли на основании средних значений для каждого периода времени с помощью некомпартментного анализа.

Е. Результаты.

Средние концентрации моноклонального антитела против Ш-20 человека в сыворотке при внутривенном введении 100 мкг и подкожном введении 100, 50 и 10 мкг приведены в табл. 31.

Таблица 31

Время (часы)	Концентрация при внутривенном введении 100 мкг (мкг/мл)	Концентрация при подкожном введении 10 мкг (мкг/мл)	Концентрация при подкожном введении 50 мкг (мкг/мл)	Концентрация при подкожном введении 100 мкг (мкг/мл)
0,25	196 (12)	ЬТК	0,101 (0,065)	0, 481 (0,485)
1	154 (18)	0,356 (0,146)	1,61 (0,52)	3,48 (1,72)
4	118 (20)	2, 42 (0,53)	10,4 (3,4)	19,7 (4,7)
8	112 (20)	3,41 (0,30)	18,9 (3,6)	40,2 (6,4)
24	103 (13)	4,95 (0, 05)	26,3 (0,7)	50,1 (6,2)
72	101 (16)	4,27 (0,79)	21,0 (3,4)	43,4 (2,7)
168	45,6 (15,4)	2,92 (0, 53)	19,6 (2,7)	37,6 (3,4)
336	36,4 (16,6)	3,60 (0,31)	23,5 (3,5)	34,4 (5,8)
504	28,8 (3,8)	2,74 (0,39)	20,5 (3,6)	25,7 (2,1)

ЬТК: меньше значения, подлежащего сообщению.

- 102 015706

После внутривенного введения концентрация моноклонального антитела в зависимости от временного профиля характеризовалась биэкспоненциальным снижением. После подкожного введения моноклонального антитела имела место фаза медленного поглощения и последующее выведение, ограниченное скоростью поглощения. Фармакокинетические параметры сыворотки, полученные на основании средних значений для каждого периода времени, представлены в табл. 32.

Таблица 32

Параметр	Единицы измерения	100 мкг внутри- венно	10 мкг подкожно	50 мкг подкожно	100 мкг подкожно
Со (внутривен- но ) ; Стах (подкожно)	мкг/мл	212	4, 95	26,3	50,1
Ттах	часы	Ν/Α	24	24	24
£1/2,λζ	часы	509	ЫП	Νϋ	612
АиС(О-Ъ)	час’мкг/мл	27059	1730	10845	18110
АиС(0-1п£)	час мкг/мл	48269	Νϋ	Νϋ	41561
ДОС (% экстраполиро- ванное)	%	43,9	ΝΏ	Νϋ	56,4
ν33 (внутривенно; ν2/Ε (подкожно)	МЛ	1,34	Νϋ	ΝΟ	2,12
С1(внутривен- но); С1/Г (подкожно)	мл/час	0, 002	ΝΟ	ΝΟ	0,002
Г (биологическая доступность)	%	Ν/Α	но	ΝΟ	86, 1

N0: определение не производилось из-за отсутствия данных в фазе конечного выведения, основанных на уменьшении концентрации в зависимости от временного профиля.

После внутривенного введения моноклональное антитело характеризовалось очень низким клиренсом (С1=0,002 мл/ч) и продолжительным периодом полувыведения (!ι_/2,_λζ«21 день). Моноклональное антитело характеризовалось устойчивым объемом распределения (У_кк=1,3 мл), который меньше объема в крови мыши («1,7 мл), из чего следует, что моноклональное антитело, по существу, не распределяется из сосудистого компартмента. Обратно вычисленная максимальная концентрация (С0) была выше по сравнению с прогнозируемой на основании инъецированной дозы и объема в крови мыши. Данный показатель наряду с низким значением Укк позволяет предположить, что моноклональное антитело может быть в значительной степени ограничено сывороточной фракцией крови.

После подкожного введения значения С_П1ах увеличивались линейно в зависимости от дозы. При подкожно вводимой дозе, равной 100 мкг, период полувыведения моноклонального антитела !ι_/2,_λζ был равен примерно 25 дням, и кажущийся объем распределения был аналогичен данному показателю после внутривенного введения. Биологическая доступность была равна 86%. При двух более низких подкожно вводимых дозах было невозможно определить большинство фармакокинетических параметров из-за отсутствия измеряемой фазы конечного выведения, даже если пробы брали через 504 ч. Поглощение моноклонального антитела после подкожного введения достигает устойчивого состояния при выведении в течение всего исследования.

Пример 36. Использование антагонистов ГЬ-20 и ГЬ-22 в модели колита и псориаза, вызванного переносом СО4'СО45ЕВ^й| (ΟΌ25^-) клеток.

А. Краткий обзор.

Введение 0Ό4'0Ό4 5Е.В¹ или ΟΌ4'ΟΌ25^- Т-клеток сингенным мышам 8СГО вызывает колит у указанных мышей. Совместное введение регуляторных Т-клеток (ΟΌ4+ΟΌ25+ или С^4+С^45КΒ^1ο) ингибирует колит. После введения ΟΌ4+ΟΌ25- Т-клеток у мышей, которым дополнительно инъецировали стафилококковый энтеротоксин В (8ЕВ), возникал не только колит, но и псориаз. Антитела против ГЬ-22ЕА,

- 103 015706

ГЬ-20, ГЬ-22, ГЬ-20К и/или ГЬ-22К или растворимые рецепторы ГЬ-22КА вводят в 0-21 день после переноса клеток и контролируют развитие симптомов колита и псориаза. Ингибирование псориаза или колита (гистология) показывает, что ГЬ-21 может ингибировать указанные аутоиммунные заболевания.

B. Метод исследования.

У мышей В10.Э2 удаляли селезенки и ингвинальные лимфатические узлы. Получали взвеси отдельных клеток и производили подсчет клеток. СЭ25+ клетки сортировали методом положительного отбора при помощи системы гранул М11!епу1. Клетки окрашивали СЭ25-РЕ (ВО Рйагшшдеп) при разведении в отношении 1:100 и инкубировали в течение 15 мин. Избыток антитела вымывали, и клетки инкубировали с 10 мкл гранул против РЕ/10⁶ клеток в течение 20 мин. Клетки промывали РВ8 и пропускали через колонку Ь8 (М11!епу1 В1о!есй). Клетки, проходившие через колонку (СО25-), сохраняли для последующего анализа. К указанным СЭ25- клеткам добавляли коктейль, обогащенный СЭ4 клетками (8!ет Се11 ТесйпоЕщез) (1:100), и инкубировали в течение 15 мин. Клетки промывали РВ8. К клеткам добавляли антибиотиновый тетрамер, разведенный в отношении 1:10, в течение 15 мин и затем магнитный коллоид (60 мкл/10⁶ клеток) в течение 15 мин (предоставлены компанией 8!ет Се11 Тесйпокщез). Клетки пропускали через колонку для отрицательного отбора (12,7 мм, 8!ет Се11 Тесйпокщез). Клетки, проходящие через колонку, являлись ί.Ό4+ί.Ό25- клетками. Степень чистоты анализировали с помощью проточной цитометрии. Интактным мышам СВ-17 8СГО внутривенно инъецировали 0,4х10⁶ клеток в общем объеме, равном 200 мкл. На следующий день (1-й день) мышам внутрибрюшинно инъецировали 10 мкг 8ЕВ. Симптомы псориаза и колита появлялись через 2-5 недель. Степень заболевания псориазом оценивали у мышей по следующим критериям: 0 = отсутствие поражений, 1 = слабые поражения на шее, 2 = сильные поражения на шее и спине (туловище), 3 = очень сильные поражения на шее, спине и животе мышей. В качестве меры тяжести заболевания измеряли также утолщение ушей. Группам мышей внутрибрюшинно инъецировали РВ8, 100 мкг контрольного антитела или 10-100 мкг антител против ГЬ22КА, ГЬ-20, ГЬ-22, ГЬ-20К, ГЬ-22К или растворимого рецептора ГЬ-22КА с 1-го по 30-й день в соответствии с разными схемами введения (3 раза в неделю или 2 раза в неделю).

C. Результаты и выводы.

Ингибирование симптомов псориаза и колита у мышей, которым вводили антитело, показывает, что ингибирование функции ГЬ-20 и/или ГЬ-22 может подавлять симптомы аутоиммунных заболеваний в модели псориаза и колита.

Пример 37. Использование антагонистов ГЬ-20 и ГЬ-22 в модели псориаза, вызванного трансплантацией кожи человека мышам 8СГО.

Пораженная псориазом кожа человека, трансплантированная мыши 8СГО, может сохранять свои клинические, микроскопические и иммуногистохимические признаки псориаза в течение нескольких недель. Указанная модель представляет собой систему для определения лечения, назначаемого для восстановления пораженной ткани до нормального фенотипа. После успешной пересадки кожи человека можно в течение нескольких недель вводить антитела против ГЬ-22КА, ГЬ-20, ГЬ-22, ГЬ20К и/или ГЬ-22К или растворимые рецепторы ГЬ-20 или ГЬ-22 и анализировать толщину эпидермиса для оценки воздействия указанных антагонистов на псориаз.

B. Метод исследования.

Полнослойные кожные трансплантаты толщиной 6 мм, состоящие из всего эпидермиса и нескольких мм дермы, были получены при помощи пункционной биопсии у здоровых взрослых добровольцев и субъектов, имеющих псориатические поражения кожи. У каждого донора было получено от четырех до шести биоптатов. Один пункционный биоптат каждого донора трансплантировали на поверхность спины мышей-реципиентов 8СГО (СВ-17, Тасошс). Всех животных содержали в стерильных условиях. Лечение начинали после успешной трансплантации (через 2-3 недели после трансплантации), осуществленной следующим образом: один биоптат для отрицательного контрольного образца (РВ8 или изотип тАЬ), один биоптат для положительного контрольного образца (циклоспорин А) и 2-3 биоптата для лечения моноклональными антителами против ГЬ-22КА человека, против ГЬ-20 человека, против ГЬ-22 человека или растворимыми рецепторами для ГЬ-20 или ГЬ-22 (внутрибрюшинная инъекция, три раза в неделю в течение 2-4 недель по графику М-№-Е).

C. Количественный анализ.

Клинические наблюдения и оценки производили регулярно в течение всех эспериментов и регистрировали полученные результаты. Тяжесть псориатических поражений оценивали по чешуйчатости, уплотнению и эритеме слепым методом. Указанные параметры можно оценивать по трехбалльной шкале: 0 = полное отсутствие поражения кожи; 1 = легкое поражение; 2 = среднее поражение; 3 = сильное поражение. В конце лечения всех животных умерщвляли и собирали ткани для гистологии и ГНС.

(1) Часть ткани фиксировали в 10%-м формалине и окрашивали гематоксилином и эозином. Площадь эпидермиса измеряли в зависимости от изменений толщины эпидермиса на единицу длины при помощи программного обеспечения обработки изображений МН. Несколько участков каждого трансплантата подвергали количественному измерению для определения высокого значения п и средней площади эпидермиса.

(2) Определяли число мононуклеарных клеток воспалительного инфильтрата в сильном поле

- 104 015706 (0,103x0,135 мм) в верхнем слое дермы.

(3) Степень паракератоза определяли по произвольной шкале от 0 до 3, где 0 соответствует отсутствию паракератоза, 1 соответствует паракератозу на площади, занимающей менее одной трети среза, 2 соответствует паракератозу на площади, занимающей более одной трети, но менее двух третей среза, и 3 соответствует паракератозу на площади, занимающей более двух третей среза.

(4) Остальную ткань окрашивали в отношении К167 (маркер пролиферирующих кератиноцитов) для определения числа пролиферирующих кератиноцитов К167 на одном миллиметре длины среза. Ослабление псориаза, определяемое по толщине эпидермиса, показывает, что нейтрализация функции №-20 и №22 может быть эффективной в данной модели псориаза. Для количественного определения ослабления псориаза измеряют толщину эпидермиса, число клеток воспалительного инфильтрата в верхнем слое дермы, число пролиферирующих кератиноцитов К167 и степень паракератоза. Значительное уменьшение всех четырех параметров в подвергнутых лечению группах по сравнению с контрольными мышами свидетельствует о возможности терапевтического применения антагонистов №-20, №-22.

Пример 38. Скрининг активности антагониста Ш-20 с использованием клеток ВаЕ3/Ш-22КА/Ш20КВ при осуществлении анализа пролиферации с окрашиванием аламаровым синим.

Факторзависимую линию пре-В-клеток ВаЕ3 котрансфецировали Ш-22КА и Ш-20КВ (см. метод, описанный в примере 3) и подвергали воздействию Ш-20 в разных концентрациях. Пролиферацию определяли методом с окрашиванием аламаровым синим, описанным в примере 3. Ш-20 стимулировал пролиферацию в зависимости от дозы в концентрациях, прогнозируемых для цитокина, из чего следует, что Ш-20 связывает и активирует гетеродимерный рецептор Ш-22КА/Ш-20КВ в концентрациях, прогнозируемых для цитокина. Отрицательные контрольные образцы, содержащие нетрансфецированные клетки ВаЕ3, не пролиферировали.

Для определения способности антител против Ш-22КА оказывать антагонистическое воздействие на активность Ш-20 осуществляли вышеописанный анализ с использованием антител против Ш-22КА в качестве антагониста активности Ш-20. При объединении Ш-20 с таким антагонистом реакция на Ш-20 снижалась до фоновых уровней. То, что присутствие антагониста устраняет или уменьшает пролиферативное действие Ш-20, показывает, что указанное антитело является антагонистом лиганда №-20. Данный анализ может быть использован для испытания других антагонистов активности №-20, таких как полипептиды, включающие растворимый рецептор Ш-22КА.

Пример 39. Нейтрализация активности Ш-20 и Ш-22 моноклональным антителом против 1ш№22КА.

В процессе осуществления клеточного анализа нейтрализации, описанного в примере 28, очищенное моноклональное антитело мыши против НиШ-22КА (пример 30(Ό)) добавляли в виде серийных разведений, например, в количестве 10, 5, 2,5, 1,25 мкг/мл, 625, 313, 156 и 78 нг/мл. Аналитические планшеты инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 4 дней, после чего добавляли аламаровый синий (Асситеб, СЫсадо, Ш) в количестве 20 мкл/лунку. Планшеты снова инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 16 ч. Полученные результаты показывают, что очищенное моноклональное антитело против НиШ-22КА может нейтрализовать передачу сигналов НиШ-22 и 1ш№-20 через НиШ-22КА. При концентрации, равной 10 мкг/мл, указанное антитело полностью нейтрализует пролиферацию, индуцированную 1ш№-22 или 1ш№20, при этом ингибирование пролиферации уменьшается в зависимости от дозы при более низких концентрациях. Совместимое с изотипом моноклональное антитело отрицательной контрольной мыши, испытанное в вышеуказанных концентрациях, не ингибировало пролиферацию ни одного цитокина. Полученные результаты далее показывают, что моноклональные антитела к Ш-22КА действительно могут оказывать антагонистическое воздействие на активность провоспалительных лигандов Ш-20 и Ш-22 в низких концентрациях.

Приведенные результаты являются дополнительным свидетельством того, что эффективное блокирование активности Ш-22КА, например, при помощи нейтрализующего моноконального антитела к Ш22КА по настоящему изобретению может быть благоприятным для блокирования, ингибирования, ослабления, антагонистического воздействия или нейтрализации эффекта Ш-20 и Ш-22 (отдельно или вместе) ш угуо и может уменьшать воспаление, индуцированное I №-20 и/или Ш-22, которое имеет место в таких заболеваниях кожи, вызываемых Ш-20 и/или Ш-22, как, например, псориаз, ΚΏ, колит или другие воспалительные заболевания, вызываемые Ш-20 и/или Ш-22, которые включают ЮБ, артрит, астму, псориатический артрит, колит, воспалительные заболевания кожи и атопический дерматит.

Пример 40. Лечение беременных трансгенных мышей, экспрессирующих Ш-20 и Ш-22, нейтрализующим моноклональным антителом против Ш-22КА.

Для испытания моноклонального антитела (тАЬ) крысы против Ш-22КА мыши в отношении нейтрализующей активности ш угуо беременным трансгенных (Тд) мышам, экспрессирующим Ш-20, и трансгенным мышам, экспрессирующим Ш-22, внутрибрюшинно инъецировали моноклональное антитело против Ш-22КА мыши. Новорожденных мышат затем исследовали на наличие или отсутствие фенотипа с блестящей кожей, который обычно является отличительным признаком мышей указанных линий.

В частности, самцов трансгенных мышей, экспрессирующих Ш-20 (которых обычно получают, ис

- 105 015706 пользуя кератин-14), или трансгенных мышей, экспрессирующих 1Ь-22 (полученных с использованием инсулинового промотора), скрещивали с самками С57ВЕ/6^ в период течки, и беременных самок идентифицировали по наличию влагалищной пробки на следующий день. Всех беременных самок помещали в отдельную клетку и ежедневно обследовали. Группы, предназначенные для лечения, включали по крайней мере 4 беременных самок в каждой, что позволяло осуществлять статистически значимый анализ трансгенных и нетрансгенных мышат. На основании ранее полученных данных об указанных трансгенных мышах можно отметить, что помет обычно состоит примерно из 6-8 мышат, из которых 2-3 животных являются трансгенными (Тд⁺).

Через 7-9 дней после скрещивания мышей (возраст эмбриона 7-9; е7-0) самкам внутрибрюшинно инъецировали 250-500 мкг моноклонального антитела крысы против 1Ь-22КА мыши (изотип 1дС2а крысы) в объеме 200-250 мкл РВ8. Во избежание инъецирования матки использовали короткие иглы под небольшим углом инъецирования. Беременным самкам делали инъекции вышеуказанным образом 3 дня в неделю (понедельник, среда и пятница) в течение 2 недель (до родов) для успешной доставки указанного антитела к развивающимся эмбрионам. Контрольные группы (включающие не менее 4 беременных самок в каждой) получали следующее лечение: моноклональное антитело контрольного изотипа 1дС2а крысы, моноклональное антитело против 1Ь-22 человека/мыши (изотип 1дС1 крысы) и моноклонаьное антитело контрольного изотипа 1дС1 крысы. В качестве контрольного эксперимента по нейтрализации 1Ь-20 мыши беременным самкам инъецировали слитый белок растворимого рецептора 1Ь-20К-Ес4, способный связываться и нейтрализовать 1Ь-20 человека и мыши или контрольный белок Ес4-фрагмента.

В 1-й и 2-й дни после рождения мышат тщательно обследовали с целью обнаружения фенотипа с блестящей кожей. На 2-й день мышат умерщвляли и удаляли часть хвоста для выделения ДНК для определения генотипа (трансгенный или нетрансгенный) каждого мышонка. Образцы кожи собирали для гистологического анализа, при осуществлении которого выявляли у мышат наличие утолщенных слоев эпидермальных клеток, которые обычно характерны для указанных трансгенных мышей. У мышат также брали кровь из туловища (и из глаз через один день после рождения) для количественного определения методом ЕЫ8А уровней моноклонального антитела против 1Ь-22Е1А в сыворотке каждой мыши. Так как указанные моноклональные антитела являются сильными ингибиторами 1Ь-20 и/или 1Ь-22 ίη т1то, у трансгенных мышат была нормальная кожа (т.е. без утолщения эпидермиса или блестящей поверхности).

Пример 41. Использование антагонистов 1Ь-20 и 1Ь-22 в органной культуре модели псориаза.

Кожа человека с псориатическими бляшками может сохраняться в органной культуре, при этом патогенные гистологические признаки пораженной кожи сохранятся при отсутствии экзогенных факторов роста. В такую культуру можно вводить антитела против 1Ь-22КА, 1Ь-20, 1Ь-22, 1Ь-20К и/или 1Ь-22К или растворимые рецепторы 1Ь-20 или 1Ь-22 и ослаблять гистологические признаки пораженной псориазом кожи.

B. Метод исследования.

Полнослойные кожные трансплантаты толщиной 2 мм, состоящие из всего эпидермиса и нескольких мм дермы, были получены при помощи пункционной биопсии у здоровых взрослых добровольцев и субъектов, имеющих псориатические поражения кожи. Сразу же после биопсии ткань погружали в культуральную среду, представляющую собой базальную среду с кератиноцитами (КВМ) (С1опебсз 1пс., \Уа1кегзу111е, МО). В культуральную среду добавляли СаС1₂ для доведения конечной концентрации Са2+ до 1,4 мМ (Уагаш е! а1., 1993, 1994). Биоптаты затем инкубировали в лунках 96-луночного планшета, содержащих 200 мкл среды КВМ, дополненной Са2+, с добавлением или без добавления антител против 1Ь-20, 1Ь-22, Ш-22КА или растворимых рецепторов 1Ь-20 или 1Ь-22. Культуры инкубировали при 37°С в атмосфере из 95% воздуха и 5% Со2 в течение 8 дней.

C. Количественный анализ.

В конце периода инкубации ткань фиксировали в 10%-м забуференном формалине и подвергали гистологическому исследованию после окрашивания гематоксилином и эозином. Внешний вид псориатической ткани, подвергнутой воздействию антител или растворимых рецепторов, ближе напоминал нормальные ткани по следующим признакам: первоначально дезорганизованные, имеющие неправильную форму базальные эпителиальные клетки приобрели более правильную цилиндрическую форму с восстановленной полярностью; выступы эпидермиса уменьшились при сокращении числа расширений эпителиальных клеток в дерму; разрушение верхних слоев эпидермиса уменьшилось. Модель органной культуры является быстрым и чувствительным методом определения возможности использования определенного соединения в качестве антигиперпролиферативного средста. Патологический гистологический признак может быть ослаблен в присутствии антагониста 1Ь-20, 1Ь-22, что свидетельствует об эффективности такого агента при лечении псориаза.

Пример 42. Картирование областей т£Ь-22КА (/Су!оК11т), связывающихся с нейтрализующими моноклональными антителами К2.1.5Т4.1 и К2.1.15Е2.1.

А. Антигенные детерминанты в 1Ь-22КА мыши, с которыми связываются нейтрализующие моноклональные антитела.

Описанные ниже эксперименты были осуществлены с целью идентификации одной или нескольких

- 106 015706 областей в аминокислотной последовательности белка растворимого рецептора 1Ь-22КА мыши (8ЕЦ ΙΌ NΟ: 62), которые имеют важное значение для активности рецептора или для связывания с антагонистом или нейтрализующим антителом. Белок ГЬ-22КА-Рс мыши, который предварительно был расщеплен тромбином для удаления Ес-фрагмента, затем расщепляли у С-конца до остатков метионина в последовательности путем инкубации с бромидом цианогена (СМВг). Пептиды, образованные СХВг, фракционировали и полученные фракции испытывали в отношении связывающей активности методом ЕЫ8А и реактивности методом вестерн-блоттинга с использованием моноклональных антител, обладающих нейтрализующими свойствами, клоны К2.1.5Е4.1 и К.2.1.15Е2.1.

После расщепления СМВг из невосстановленного непроцессированного белка ш!Ь-22КА были потенциально образованы следующие пептиды (табл. 33). В невосстановительных условиях цистеины связаны дисульфидными связями, которые могут образовывать внутреннюю связь в пептиде 1 и связь между пептидами 3 и 5. Остатки, выделенные жирным шрифтом, потенциально участвуют в связывании лиганда и соответствуют остаткам ГЬ-22КА человека, потенциально участвующим в связывании лиганда в 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 2 или 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 3, как описано в примере 42В. В частности, 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 48 соответствует аминокислотным остаткам 16 (Н1к) - 83 (Ме!) 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 42; 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 49 соответствует аминокислотным остаткам 84 (С1и) - 109 (Ме!) 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 42; 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 50 соответствует аминокислотным остаткам 110 (Т1г) - 137 (Ме!) 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 42; 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 51 соответствует аминокислотным остаткам 138 (Ьеи) - 177 (Ме!) 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 42, и 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 52 соответствует аминокислотным остаткам 163 (Н1к) 208 (Рго) 8ЕО ΙΌ ^: 42 или 163 (Н1к) - 212 (Агд) 8ЕЕ) ΙΌ 62.

Таблица 33

Номер пептида	от	до	Последовательность
Пептид 1, обр а з о в а нный СИВг	1	68	НТТУПТЗСЪЬОНУКГОЗЗЫЕЕКПЬТИОБбРАЗТЗ ϋΤνΥ3νΕΥΚΚΥ6ΕΒΚΗ1ΑΚΑ(3Ο0ΚΙΤ0ΚΕΟΝΕΤΜ (3Εβ ΙΟ N0:48)
невосстановленный: цистеины в пептиде 1 связаны
Пептид 2, образованный СПВг	69	94	ΕΤΚΝΗΤΕΕΎΥΆΚνΤΆνΞΑΕΟΡΡνΤΚΜ (3Ε0 Ю N0:49)
	Пептид 3, образованный СИВг	95	122	ΤϋΚΓ33ΕΟΗΤΤΙΚ₽ΡθνΤΟΙΡΚνκεΐΟΜ (5Е<2 10 N0:50)
невосстановленный: пептиды 3-5 связаны
Пептид 4, образованный СЫВг	123	162	ЬУНРТЬТРУЬЗЕОСНОЬТЬЕЕХЕНОЕГГНЪЕЬНУ ΝΗΤΥζΙΜ (ЗЕО Γϋ N0:51)
Пептид 5, образованный СЫВг	163	212	НЬЕСКаКЕ1ЕГЬСЬТРОТЕГЬС31Т1ЕТР1ЬЗКЕ ЗАРУУСКУКТЪРОУРК (ЗЕО Ю N0:52)

1. Расщепление СХВг и выделение пептидных фракций.

мкг ш!Ъ-22КА лиофилизовали и восстанавливали в 180 мкл муравьиной кислоты (70%). Добавляли 1 мкл 5М раствора СХВг в ацетонитриле. Образец смешивали и оставляли для взаимодействия в темноте при комнатной температуре в течение 18 ч. 150 мкл реакционной смеси фракционировали при помощи ВЭЖХ с обращенной фазой на аналитической колонке 8В300-С8 Ζοώηχ. Пики разделяли в градиенте, начиная с 25% ацетонитрила (0,085% ТФУ) и 75% воды (0,1% ТФУ) и кончая 95% ацетонитрила (0,085% ТФУ) и 5% воды (0,1% ТФУ). Собирали фракции, соответствующие трем основным и двум второстепенным пикам, обнаруженным в результате осуществления УФ-анализа. Каждую фракцию делили пополам; одну часть анализировали методом ЕЫ8А, другую часть лиофилизовали и восстанавливали в 150 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером (РВ8). УФ-анализ фракций, восстановленных в РВ8, подтвердил выход всех пиков, выделенных из аналитической колонки. Фракции, восстановленные в РВ8, анализировали методом вестерн-блоттинга.

2. ЕЫ8А.

Фракции, полученные в результате осуществления ВЭЖХ и содержащие пептидные последовательности из ГЬ-22КА расщепленного СХВг, разводили до одинаковой концентрации, используя буфер для ВЭЖХ (90% ацетонитрила, 10% Н₂О, 0,09% трифторуксусной кислоты). Образцы переносили на 96луночные титрационные микропланшеты по одному образцу в 4 лунки в количестве 100 мкл/лунку и сушили в вытяжном шкафу при комнатной температуре в течение ночи. Планшеты промывали буфером С для ЕЫ8А (РВ8, 0,05% твина-20) и затем блокировали буфером В для ЕЫ8А (РВ8, 0,1% В8А, 0,05%

- 107 015706 твина-20) в течение 2 ч при 37°С. Два моноклональных антитела (шАЬ) к Ш-22КА (клон К2.1.5Р4.1 и клон К2.1.15Е2.1) разводили до 2 мкг/мл в буфере В для ЕББЗА. Моноклональное антитело добавляли к каждому образцу пептидной последовательности в количестве 100 мкг/лунку и планшеты инкубировали в течение 60 мин при 37°С. Планшеты промывали для удаления несвязанного антитела, вторичное антитело (антитело козы против БдС крысы, конъюгированное с пероксидазой из хрена (Басккои)) разводили до 1 мкг/мл в буфере В для ЕЫЗА и добавляли во все лунки в количестве 100 мкл/лунку. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Лунки промывали буфером С для ЕББЗА и инкубировали с субстратом для микролунок НКР с ТМВ 1, (ВюРх) в течение 5 мин. Реакцию прекращали, добавляя реагент, прекращающий взаимодействие субстрата для микролунок ТМВ (ВюРх), и планшеты считывали при оптической плотности 450 нм в спектрофотометре для прочтения планшетов методом ЕНБЗА Оуиа!есй (Мо1еси1аг Осуюск).

Полученные результаты показывают, что моноклональное антитело К2.1.5Р4.1 взаимодействует с фракцией № 4, полученной ВЭЖХ при осуществлении реакции расщепления шШ-22КА реагентом СНВг, которая также образовала полосу в экспериментах, осуществленных методом вестерн-блоттинга.

3. Вестерн-блоттинг.

Фракции, полученные в результате осуществления ВЭЖХ и содержащие пептидные последовательности из ББ-22КА, расщепленного СНВг, лиофилизовали в течение ночи при комнатной температуре и восстанавливали в РВЗ. Образцы смешивали с невосстанавливающим буфером для образцов (БиуДгодеи) и кипятили в течение 10 мин. Образцы подвергали электрофорезу методом ЗОЗ-РАСЕ в 412% гелях ВД-Тпк (БиуДгодеи), используя однократный разделяющий буфер МЕЗ-ЗЭЗ (БиуДгодеи), и переносили на нитроцеллюлозу (0,2 мкм; Вю-Каб) в буфере для блоттинга с 20% метанола при комнатной температуре. Фильтры сушили в течение ночи при комнатной температуре. Затем фильтры блокировали 10% обезжиренным сухим молоком в буфере А (50 мМ трис-буфера, рН 7,4, 5 мМ ЕОТА, 0,05% игепала СА-630, 150 мМ №С1, 0,25% желатина) в течение 30 мин при комнатной температуре. Моноклональное антитело (шАЬ) к Ш-22КА (клон К2.1.5Р4.1) разводили до 2 мкг/мл в буфере А, содержащем 2,5% обезжиренного сухого молока. Блоты инкубировали с первичным антителом в течение 1 ч при комнатной температуре. После инкубации блоты три раза промывали в буфере А и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре со вторичным антителом (антитело козы против БдС крысы, меченное пероксидазой из хрена; Басккои, Бис.), разведенным в отношении 1:5000 в буфере А, содержащем 2,5% обезжиренного сухого молока. Блоты промывали, проявляли на хемилюминесцентном субстрате (субстрат для вестерн-блоттинга БипД-ЫдЫ; Косйе) и экспонировали при помощи люминесцентного формирователя изображений (Маиийе1ш Воейпидег БитМтадег).

При экспонировании в течение 30 мин в невосстанавливающем геле были обнаружены очень сильные полосы для фракций №4 и №5 и слабая полоса для фракции №3. Фракция №4 также дала положительный результат при испытании методом ЕЫЗА.

Секвенирование №конца активной фракции № 4.

Из пяти пептидных фракций, расщепленных СНВг, которые были получены из аналитической колонки для хроматографии с обращенной фазой, фракция № 4 демонстрировала активность при осуществлении анализа ЕЫЗА и дала положительный результат при исследовании методом вестерн-блоттинга. Для идентификации пептидов, присутствующих в активной фракции № 4, образец подвергали деградации Эдмана хорошо известными методами. В активной фракции были идентифицированы три №конца, сопоставимые с пептидами 2 (ЗЕО БО N0: 49), 3 (ЗЕО БО N0: 50) и 5 (ЗЕО БО N0: 52). Полученные результаты показали, что антитела связываются с пептидами 2 (ЗЕО БО N0: 49), 3 (ЗЕО БО N0: 50) и 5 (ЗЕО БО N0: 52).

- 108 015706

Таблица 34

Деградация Эдмана	М-концевая последовательность	Идентификация пептида
Первая	НЬЕСК βΡ,ΕΥΕ ЕЬСЬТ	Пептид 5,
последовательность г	ΡϋΤΕΓ	образованный
полученная из фракции №4	НЬЕСК βΚΕΥΕ ЕЬСЪТ	СИВг (8Εβ Ю
СЫВг-образованная	ΡΏΤΕΕ ΙΣΤΡΙ	N0:52)
последовательность	ЬЗКЕЗ АРУУС КУКТЬ
гп1Ь-22КА	РЪУРР
	(5Εβ 16 N0:53)
Вторая	ΕΤΚΝΗ ΤΕΓΪϊ АКУТА	Пептид 2,
последовательность,	УЗАСС	образованный
полученная из фракции №4	ΕΤΚΝΗ ΤΕΓΥΥ АКУТА	СИВг (5Е0 ΙΟ
СМВг-образованная	УЗАСС РРУТК М	N0:49)
последовательность	(3Εβ 10 N0:54)
т!Ь-22КА
Третья	ТРКЕЗ ХЬОНТ ΧΙΧΡΧ	Пептид 3,
последовательность,	ϋΧΧΧΙ	образованный
полученная из фракции №4	Т0КЕ5 ЗЬОНТ ΤΙΚΡΡ	С№г (3Εβ Ю
ΟΝΒχ-образованная	Г.УТС1 РКУВЗ юм	N0:50)
последовательность т1Ь-	(5Εβ Ю N0:55)
22КА

Рассмотрение результатов.

Из смеси СИВг-расщепленных пептидов юШ^КА были выделены пять фракций. Из указанных фракций только фракция № 4 была активной при осуществлении анализа ЕЫ8А и положительной при исследовании методом вестерн-блоттинга. В результате деградации Эдмана во фракции № 4 были идентифицированы три Ν-конца, сопоставимых с СИВг-образованными пептидами 2 (8ЕО ΙΌ ИО: 49), 3 (8ЕО Ш ИО: 50) и 5 (8ЕО ΙΌ ИО: 52). В указанных областях в связывании лиганда потенциально участвуют шесть остатков. Указанными остатками являются Υ93, К112, К210 и Е211 8ЕО ΙΌ ИО: 42 которые также соответствуют остаткам Υ78, К97, К195 и Е196 8ЕО ΙΌ ИО: 62. Остатки Υ60 и Р164 8ЕО ΙΌ ИО: 42 также участвуют в связывании лиганда.

В. Антигенные детерминанты в I^-22КА человека, с которыми связываются нейтрализующие моноклональные антитела.

Описанные ниже эксперименты были осуществлены с целью идентификации одной или нескольких областей во внеклеточном домене аминокислотной последовательности белка I^-22КА человека (8ЕО ΙΌ ИО: 2), которые имеют важное значение для активности рецептора, для связывания с антагонистом или нейтрализующим антителом. Белок растворимого рецептора I^-22КА человека (например, включающий 8ЕО ΙΌ ИО: 3, такой как I^-22КА-РС, расщепленный тромбином для удаления Рс-фрагмента) расщепляли у С-конца до остатков метионина в последовательности путем инкубации с бромидом цианогена (СИВг) или другим агентом, известным в данной области, который расщепляет белок человека с образованием определенных фрагментов. Пептиды, образованные СИВг, фракционировали, и полученные фракции испытывали в отношении связывающей активности методом ЕЫ8А и реактивности методом вестерн-блоттинга с использованием моноклональных антител, обладающих нейтрализующими свойствами.

В соответствии с прогнозом четыре цистеина связаны дисульфидными связями в соответствии со следующим паттерном связи: Сук71-Сук79 и Сук204-Сук217 8ЕО ΙΌ ИО: 2. После расщепления СИВг из невосстановленного непроцессированного I^-22КА человека были потенциально образованы следующие пептиды: пептид 6 (8ЕО ΙΌ ИО: 56), пептид 7 (8ЕО ΙΌ ИО: 57), пептид 8 (8ЕО ΙΌ иО: 58), пептид 9 (8ЕО ΙΌ ИО: 59), пептид 10 (8ЕО ΙΌ ИО: 60) и пептид 11 (8ЕО ΙΌ ИО: 61) (табл. 35). Цистеины связаны дисульфидными связями, которые образуют возможную связь между пептидами 7 (8ЕО ΙΌ ИО:57) и 10 (8ЕО ΙΌ ИО: 60). В частности, 8ЕО ΙΌ ИО: 56 соответствует аминокислотным остаткам 1 (Рго) - 92 (Ме!) 8ЕО ΙΌ ИО: 3; 8ЕО ΙΌ ИО: 57 соответствует аминокислотным остаткам 93 (ТЬг) - 120 (Ме!) 8ЕО ΙΌ ИО: 3; 8ЕО ΙΌ ИО: 58 соответствует аминокислотным остаткам 121 (Не) - 160 (Ме!) 8ЕО ΙΌ ИО: 3; 8ЕО ΙΌ ИО: 59 соответствует аминокислотным остаткам 161 (Н1к) - 185 (Ме!) 8ЕО ΙΌ ИО: 3; 8ЕО ΙΌ ИО: 60 соответствует аминокислотным остаткам 186 (Не) - 199 (Ме!) 8ЕО ΙΌ ИО: 3; и 8ЕО ΙΌ ИО: 61 соответствует аминокислотным остаткам 200 (Сук) - 211 (Тйг) 8ЕО ΙΌ ИО: 3.

- 109 015706

Номер пептида

Пептид € пептид 7,

Пептид 8 образованный

СМВг

Пептид 9,

Пептид 10

11е		Ηίδ	Рго	Т11Г	Рго	ТЬг	Рго
Не	Агд	А1а	С1у	Азр	С1у	ΗΪ3	Агд
Ьец	Τϊιγ	Ьеи	51и	Азр	11е	РЬе	Н1з
Азр	Ьеи	РЬе	Туг	Н1з	Ьеи	Е1и	Ьеи
61п	Уа1	Αεη	Агд	ТЬг	Туг	С1п	МеЬ
(ЗЕО Ю	N0:1	58)

□ΝΒγ

Пептид 11,	200	211	Суз Агд Уа1 Ьуз ТЬг Ьеи Рго Азр
образованный			Агд ТЬг Тгр ТЬг '
СИВг			{ЗЕО Ю N0:61}

Таблица 35

4. Расщепление СЫВг и выделение пептидных фракций, вестерн-блоттинг, ЕЫЗА и секвенирование Ы-конца.

Примерно 50 мкг I^-22КА человека лиофилизовали, восстанавливали, фракционировали, собирали и анализировали методами вестерн-блоттинга и ЕЫ8А, описанными в примере 42А, для идентификации фракций, содержащих моноклональные антитела против I^-22КА, и фракций, связывающих I^-22КА, по результатам анализов ЕЫ8А и вестерн-блоттинга. СЫВг-образованные пептидные фракции, которые собирали из аналитической колонки для хроматографии с обращенной фазой, затем исследовали в отношении активности методом ЕЫ8А и наличия положительного связывания методом вестерн-блоттинга. Пептиды в положительных фракциях идентифицировали путем деградации Эдмана хорошо известными методами.

Рассмотрение результатов.

СЫВг-образованный пептид № 5 мыши (8ЕЦ Ш ЫО: 52) соответствует СЫВг-образованным пептидам № 9 и № 10 человека (8ЕЦ Ш ЫО: 59 и 8ЕЦ Ш ЫО: 60); СЫВг-образованный пептид № 2 мыши (8ЕО Ш ЫО: 49) соответствует СЫВг-образованному пептиду № 6 человека (8ЕЦ Ш ЫО: 56); и СЫВгобразованный пептид № 3 мыши (ЗЕЦ Ш ЫО: 50) соответствует СЫВг-образованному пептиду № 7 че

- 110 015706 ловека (8ЕО ΙΩ NО: 57). Из фракций, выделенных из смеси С№г-расщепленных пептидов В^ВА человека, шесть остатков, находящихся в предполагаемых областях, потенциально участвуют в связывании лиганда: остатки 8Е0 ΙΩ NО: 2 (и соответствующие остатки 8Е0 ΙΩ NО: 3), которые имеют важное значение для связывания лиганда с рецептором, включают Туг-60 и РБе-164, Туг-93, Агд-112, Ьу8-210 и С1и211 8Е0 ΙΩ NО: 2 (и соответствующие остатки 8Е0 ΙΩ NО: 3). Кроме того, основные остатки 8Е0 ΙΩ NО: 2 (и соответствующие остатки 8Е0 ΙΩ NО: 3), имеющие важное значение для направления связывания лиганда с рецептором, включают Туг-60 и РБе-164 8Е0 ΙΩ NО: 2 (и соответствующие остатки 8Е0 ΙΩ NО: 3), и второстепенные остатки включают остатки Туг-93, Агд-112, Ьу8-210 и С1и-211 8Е0 ΙΩ NО: 2 (и соответствующие остатки 8Е0 ΙΩ NО: 3).

Из вышеизложенного должно быть понятно, что, хотя в настоящем описании изобретения в целях иллюстрации рассмотрены конкретные варианты осуществления изобретения, в настоящее изобретение могут быть внесены разные модификации, не выходящие за пределы духа и объема настоящего изобретения. Таким образом, настоящее изобретение ограничено только прилагаемой формулой изобретения.

Список последовательностей <110> Займоджинетикс, Инк.

<120> АНТИТЕЛА ПРОТИВ И-22РА И СВЯЗЫВАЮЩИЕ ПАРТНЕРЫ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ УКАЗАННЫХ ВЕЩЕСТВ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ <130> 04-14РС <150>

<151>

<150>

<151>

<160> 62 <170> Программа РавГЗЕО для Мпбоу/в, версия 4.0 <210> 1 <211> 2831 <212> ДНК <213> Человек <22О>

<221> СОЗ <222> (34),..(1755) <400> 1 сададдссаа дддадддсСс СдСдссадсс ссд асд адд асд ссд ссд асе асе 54 мег Агд тКг Ьеи Теи тИг 11е 1 5

«9

асе

дед

дда

есс

сед

9«

дсс

сас

дсс

ССС

дад

дас

ссс

сед

дат

102

Ьеи

тЬг

Уа1

сТу

Зег

ьеи

А1а

А1а

Н15

А1а

Рго

61и

Азр

Рго

Зег

А5р

10

15

20

ссд

ссс

сад

сас

дед

ааа

гее

сад

есс

аде

аас

ссс

да а

аас

асе

сед

150

чей

ьеи

61 η

Н15

УаТ

ьуз

рЬе

61 η

5ег

Зег

А5П

рЬе

61 и

А5П

11 е

ьеи

25

30

35

асд

дас

аде

999

сса

дад

ддс

асе

сса

дас

асд

дсс

сас

аде

аес

198

тНг

тгр

А5р

5ег

61у

Рго

61 и

61у

тЬг

Рго

Аэр

тЬг

Уа1

Туг

5ег

11е

40

45

50

55

9?9

сас

аад

асд

гас

дда

дад

адд

дас

едд

дед

дса

аад

аад

ддс

еде

246

61 и

туг

ьуз

тНг

туг 60

61у

61 и

Агд

АЗр

тгр 65

Уа1

А1а

ьуз

еуз

61у 70

суз

сад

едд

аес

асе

едд

аад

есс

еде

аас

сед

асд

де?

дад

асд

ддс

аас

294

61 η

Агд

Не

ТНг 75

Агд

ьуз

Зег

Суз

Азп 80

ьеи

ТНг

Уа1

61 и

ТЬг 85

б1у

Азп

ссс

асд

дад

с1:с

гас

сас

дсс

адд

дес

асе

дсс

дес

аде

дед

9?а

ддс

342

ьеи

тпг

61 и 90

ьеи

туг

туг

А1а

Агд 95

уа!

тНг

А1а

уа1

зег 100

А1а

61 у

61у

едд

еса

дсс

асе

аад

асд

асе

дас

адд

еес

аде

гое

сед

сад

сас

асе

390

лсд

Зег

А1а

тЬг

ЬуЗ

мее

ТЙГ

Азр

Агд

РНе

Зег

5ег

Ьеи

61п

Н1 5

тбг

105

110

115

асе

сес

аад

сса

ссе

да!

9*9

асе

еде

асе

есс

ааа

дед

ада

Сед

аес

438

тЬг

Ьеи

ьуа

РГО

Рго

А5Р

Уа1

тНг

СУЗ

11е

зег

ьуз

уа!

Агд

зег

11е

120

125

130

135

сад

агд

аее

дсг

сас

ссс

асе

ссс

асд

сса

асе

еде

дса

ддс

дас

ддс

486

- 111 015706

61 η

мег

11 е

Уа1

НТ 5

Рго

тНг

Рго

ТНг

Рго

11 е

Агд

А1а

61 у

Α5Ρ

61 у

140

145

150

сас

едд

ста

асе

стд

даа

дас

аге

ггс

саг

дас

стд

гтс

гас

сас

тта

534

Н15

Агд

Геи

ТЬг 155

Ьеи

61 и

Азр

11е

РЬе 160

НТ 5

А5р

Геи

РНе

Туг 165

НТ 5

геи

дад

сгс

сад

94

аас

сде

асе

Гас

саа

агд

сас

стт

дда

999

аад

сад

582

61 и

геи

61 η

Уа1

АЗП

Агд

тЬг

Туг

61 η

мег

Η*ΐ5

геи

61У

61у

Гу5

61 η

170

175

180

ада

даа

таг

дад

ттс

гтс

ддс

стд

асе

ссг

дас

аса

дад

ТТС

СТТ

ддс

630

Агд 61 и Туг 61 и РЬе РЬе оТу геи тНг Рго Азр ТЬг б!и рЬе ьеи бТу

185 190 195 асе атс агд атт где дтт ссс асе Гдд дес аад дад адг дес есс гас 678 тНг 11е Мег 11е су5 Уа1 рго тНг тгр А1а суз б!и бег А1а Рго туг

200

205

210

215

агд

где

еда

дтд

аад

аса

стд

сса

дас

едд

аса

гдд

асе

Гас

1СС

гтс

мет

Суз

Агд

Уа1

ьу;

ТНг

Геи

Рго

Азр

Агд

ТНг

Тгр

ТНг

туг

5ег

РНе

220 225 230

ТСС 5ег

дда 61у

дес А1а

тсс РНе 235

стд геи

ССс РНе

ТСС 5ег

агд мег

ддс С1у 240

ссе рНе

ССС геи

дес Уа1

дса А1а

дта Уа1 245

СТС геи

сдс Суз

774

Гас

егд

аде

Сас

ада

гас

дгс

асе

аад

сед

ссС

дса

ССТ

ССС

аас

Ссс

822

Туг

Геи

Зег 250

туг

Агд

туг

Уа1

ТНг 255

гуз

Рго

РГО

А1а

Рго 260

РГО

Азп

Зег

стд

аас

дТс

сад

еда

дес

сед

асе

ссс

сад

ссд

сед

сдс

ттс

асе

сад

870

геи

АЗП

Уа1

61 η

Агд

νβΐ

геи

тНг

рНе

б1п

Рго

Геи

Агд

рНе

11 е

61 η

265

270

275

дад

сас

дгс

стд

асе

ссс

дсс

СТС

дас

ссс

аде

ддс 61 у

ссс

аде

аде

стд

918

61 и

НТ5

νβΐ

Геи

11 е

Рго

Уа1

РНе

Азр

Геи

Зег

РГО

зег

5ег

геи

280

285

290

295

дес

сад

ссг

94

сад

Сас

есс

сад

ас с

адд

ТсТ

дда 61у

ссс

адд

дад

966

А1а

61 η

РГО

Уа1

б!п

Туг

Зег

61 η

11е

Агд

Зег

рго

Агд

61 и

300

305

310

ссс

дса

дда

дсг

сса

сад

едд

сас

аде

сед

ссс

дад

аТс

асе

тас

ста

1014

РГО

А1а

61у

А1а

РГО

61 η

Агд

НТ 5

Зег

Геи

зег

61 и

11е

тНг

Туг

Геи

315

320

325

999 61 у

сад

сса

дас

асе

Ссс

асе

ссс

сад

ссс

Ссс

аас

9*9 Уа1

сса

ССТ

ссс

1062

61 η

Рго

Азр

11 е

Зег

Не

Геи

61 η

рго

Зег

А5П

РГО

Рго

Рго

330

335

340

сад

атс

сгс

ссс

сса

сед

Ссс

сас

дсс

сса

аас

дет

дсс

сст

дад

94

1110

61 η

11 е

геи

5ег

РГО

геи

зег

Туг

А1а

РГО

А5П

А1а

А1а

Рго

61 и

Уа1

345

350

355

999 61у

ссс

сса

Ссс

гас

дса

ссс

сад

дед νβι

асе

ССС

даа

дет

саа

тсс

сса

1158

РГО

Рго

Зег

Туг

А1а

Рго

61 п

ТНг

рго

61 и

А1а

61П

Рпе

РГО

360

365

370

375

ГГС

гас

ОСС

сса

сад

дсс

асе

тсс

аад

дсс

сад

сст

тсс

Тсс

Ϊ3Ϊ

дсс

1206

РНе

Туг

А1а

РГО

61 п 380

А1а

Не

Зег

гуз

Уа1 385

61 η

РГО

зег

зег

Туг 390

А1а

ссг

саа

дсс

аст

ссд

дас

аде

тдд

есс

ссс

тсс

таг

999 61у

дса

где

атд

1254

РГО

61 η

А1а

ТНг

Рго

А5Р

зег

тгр

РГО

РГО

5ег

туг

Уа1

Суз

мет

395

400

405

даа

эдс

тсс

ддс

ааа

дас

тсс

ссс

асе

ддд

аса

стт

ТСТ

адт

ССТ

ааа

1302

- 112 015706

С1и

61 у

бег

61у

ГУЗ

АЗр

бег

Рго

Тбг

б1у

тНг

геи

бег

бег

РГО

Гуз

410

415

420

сас

с«

адд

ССС

ааа

дот

сад

С«

сад

ааа

дад

сса

сса

дес

дда

аде

1350

Н15

Геи

Агд

Рго

ьуз

61у

61 η

сеи

61 η

гуз

61 и

РГО

РГО

А1а

б1у

5ег

425

430

435

где

агд

сга

дот

ддс

сот

гсг

егд

сад

дад

дед

асе

гсс

ггд

дсг

агд

1398

суг

мег

Геи

б!у

61у

Сеи

бег

сеи

61 η

61 и

Уа1

тЬг

зег

сеи

А1а

мег

440

445

450

455

дад

даа

гсс

саа

даа

дса

ааа

гса

ггд

сас

сад

ссс

сед

999

аге

Где

1446

61 и

б!и

бег

61 η

21 и

А1а

ьуз

бег

сеи

нт 5

61 п

РГО

геи

бТу

11е

Суз

460

465

470

аса

дас

ада

аса

гсг

дас

сса

аас

дед

сга

сас

адг

999

дад

даа

ддд

1494

ТЬг

АЗр

Агд

тИг

5ег

Азр

Рго

Азп

Уа1

геи

нт'з

5ег

б1у

61 и

61 и

бТу

475

480

485

аса

сса

сад

гас

сга

аад

ддс

сад

сгс

ссс

сгс

сгс

гсс

гса

дгс

сад

1542

тИг

Рго

61 η

туг

ьеи

Ьуз

61у

61 η

Геи

Рго

Геи

геи

5ег

5ег

Уа1

61 η

490

495

500

асе

9ад

ддс

сас

ссс

агд

гсс

сгс

ссг

ссд

саа

ссг

ссг

гсс

99ΐ

сса

1590

Не

61 и

61У

Н15

Рго

мег

бег

Геи

Рго

геи

61п

РГО

рго

бег

б!у

Рго

505

510

515

гдг

ссс

ссс

гсд

дас

саа

дот

сса

аде

ссс

Гдд

ддс

сСд

егд

дад

гсс

1638

Су5

бег

РГО

бег

АЗр

61 η

61 у

РГО

бег

Рго

ТГр

б1у

геи

Сеи

61 и

5ег

520

525

530

535

ССС

9*9

где

ссс

аад

дас

даа

дес

аад

аде

сса

8£с

ссг

дад

асе

гса

1686

Ьеи

Уа1

суз

РГО

су=

Азр

61 и

А1а

гуз

Зег

рго

А1а

РГО

61 и

тЬг

бег

540

545

550

дас

егд

дад

сад

ссс

аса

даа

егд

даг

гсг

егг

ггс

ада

ддс

егд

дсс

1734

АЗр

Геи

61и

61 η

РГО

тНг

61 и

Ьеи

Α5Ρ

бег

Геи

рбе

Агд

61у

Сеи

А1а

555

560

565

сгд

асе

дга

сад

гдд

дад

гсс

сдад

ддда

аг д

ддаа

аддс

Г гд

д*дс

ггсс

1785

геи

ТКг

Уа1

61 η

тгр

61 и

5ег

570

Сссседгссс гасссадгдг сасагссггд дсгдгсаагс ссагдсседс ссагдссаса1845 сасгсгдсда Ссгддссгса дасдддгдсс сггдададаа дсададддад гддсагдсад1905 ддссссгдсс агдддгдсдс Гссгсассдд аасааадсад сагдаСаадд асгдсадсдд1965 дддадсгсгд дддадсадсг гдгдгадаса адсдсдгдсе сдсгдадссс гдсааддсад2025 ааагдасадг дсааддадда аагдсаддда аасгсссдад дгссададсс ссассгссга2085 асассагдда ггсааадгдс гсадддаагг гдссгсгссг гдссссаггс сгддссадгг2145 гсасаагсга дсгсдасада дсаГдаддсс ссгдссгсХГ сгдссагсдг гсаааддгдд2205 даадададсс гддаааадаа ссаддссгдд аааадаасса дааддаддсг дддсадаасс2265 адаасаассе дсасггсгдс сааддссадд дссадсадда сддсаддасг сгадддаддд2325 дгдгддссгд садсгсаггс ссадссаддд саасгдссгд асдггдсасд агессадсгг2385 саггссгсгд агадаасааа дсдааагдса ддгссассад ддадддадас асасаадссе2445 гггсгдсадд саддадпгс адасссгагс сгдадаагдд ддгггдааад дааддгдадд2505 дсгдгддссс сгддасдддг асаагаасас асгдгасгда гдгсасаасг ггдсаадсгс2565 гдссггдддг гсадсссагс гдддсгсааа ггссадсстс ассасгсаса адсгдгдгда2625 сггсааасаа агдаааесад гдсссадаас сгсддггесс гсагсгдеаа гдгддддагс2685 агаасассга ссгсагддад ггдСддгдаа даГдаааГда адгсагдгсг ггааадгдсг2745 еаагадгосс гддгасагод дсадгдссса агааасддга дсгагегааа аааааааааа2805 аааааааааа агадсддссд ссгеда2831 <210> 2 <211> 574 <212> Белок <213> Человек <400> 2

- 113 015706 мех Агд тНг Ьеи ьеи ТЬг 11е ьеи тЬг уа! б1у 5ег ьеи А1а А1а Нтз 15 1015

А1а рго 61 и Азр Рго 5ег Азр ьеи ьеи 61 η нтз Уа1 ьуз РЬе 61 η 5ег 20 2530 зег Азп рКе С1и Αεη Х1е ьеи тЬг тгр Азр зег С1у Рго б1и е1у тЬг 35 4045

Рго А5р ТЬг Уа1 туг Зег 11е 61и Туг 1уз тНг туг б1у 61 и Агд лзр 50 5560 тгр Уа1 А1а ьуз ьуз б!у суз 61п Агд 11е ТЬг лгд ьуз Зег сузазп

70 7580 ьеи ТЬг уа! 61 и тЬг б!у азп ьеи тНг б1и ьеи туг туг А1а АгдУа1

9095 тЬг А1а Уа1 зег А1а С1у б1у Агд Зег А1а ТЬг Ьуз мех тЬг А5р Агд 100 105110

РЬе Зег зег Ьеи 61п нтз ТЬг ТЬг Ьеи Ьуз Рго Рго Азр Уа1 ТЬг Су 5 115 120125

11е Зег ьуз Уа! Агд Зег 11е б1п мех 11е Уа! нт 5 рго ТЬг рго ТЬг 130 135140 рго 11е Агд А1а С1у Азр б!у нтз Агд ьеи ТЬг ьеи е!и Азр 11еРЬе

145 150 155160

Нт 5 Азр ьеи РЬе Туг нт 5 ьеи 61 и ьеи 61п Уа1 Азп Агд тЬг туг61 η

165 170175 мех нт5 ьеи 61 у 61 у ьу5 61 η лгд 61 и туг 61 и РЬе РЬе 61 у ьеи тЬг 180 185190

Рго Азр тЬг С1и РЬе ьеи с!у тЬг 11е мех 11е суз уа! Рго ТНг тгр 195 200205

А1а ьуз 61 и зег А1а Рго туг мех суз Агд Уа1 1_у5 тЬг ьеи Рго Азр 210 215220

Агд тЬг тгр тЬг туг Зег РЬе Зег С1у А1а РЬе Ьеи РЬе Зег мехб1у

225 230 235240

РЬе ьеи Уа1 А1а Уа! Ьеи Суз Туг Ьеи зег Туг Агд туг Уа1 ТЬгЬуз

245 250255

Рго

РГО

А1а

рго 260

Рго азп зег

ьеи А5П Уа1 265

61 η

Агд

Уа1

Ьеи 270

тЬг

рЬе

61 η

РГО

Ьеи

Агд

рЬе

11 е

61 η

61 и

нтз

Уа1

Ьеи

11 е

РГО

Уа1

РЬе

АЗр

275

280

285

ьеи

зег

б1у

Рго

зег

зег

Ьеи

А1а

61 η

РГО

Уа1

61 η

туг

Зег

61 η

11е

290

295

300

Агд

уа!

Зег

61 у

РГО

Агд

61 и

РГО

А1а

61 у

А1 а

Рго

61 η

Агд

НТ 5

5ег

305

310

315

320

ьеи

Зег

61 и

Не

тНг

туг

ьеи

61 у

61 η

РГО

Азр

11е

зег

11е

ьеи

61 η

325

330

335

Рго

5ег

А5П

Уа1

Рго

Рго

РГО

61п

11е

ьеи

зег

РГО

ьеи

Зег

туг

А1а

340

345

350

Рго

АЗП

А1а

А1а

рго

61 и

уа1

б!у

РГО

РГО

Зег

туг

А1а

РГО

61 η

Уа!

355

360

365

ТЬг

РГО

61 и

А1а

б1п

РЬе

РГО

РЬе

туг

А1а

РГО

61 η

А1а

11е

5ег

ьуз

370

375

380

Уа1

61 η

Рго

Зег

Зег

Туг

А1а

РГО

61 η

А1а

тЬг

Рго

Азр

Зег

тгр

РГО

385

390

395

400

Рго

зег

Туг

61 у

уа!

Суз

мех

61 и

61 у

Зег

61 у

ьуз

АЗР

Зег

РГО

ТЬг

405

410

415

61у

ТЬг

Ьеи

Зег

эег

РГО

ьуз

НТ5

Ьеи

лгд

Рго

ьуз

61 у

61 η

Ьеи

61 η

420

425

430

Ьуз

61 и

РГО

Рго

А1а

61 у

зег

суз

мех

Ьеи

61 у 61 у

Ьеи

Зег

Ьеи

61 η

435

440

445

61 и

уа1

ТЬг

Зег

ьеи

А1а

мех

61 и

61 и

Зег

61 η

61 и

А1а

Ьуз

Зег

ьеи

450

455

460

нтз

б1п

Рго

ьеи

61 у

11е

суз

ТЬг

АЗР

лгд

ТЬг

Зег

АЗр

Рго

Азп

Уа1

465

470

475

480

Ьеи

нтз

Зег

61 у

61 и

61 и

61 у

ТЬг

РГО

61 η

туг

ьеи

ьуз

61 у

61 η

ьеи

485

490

495

Рго

Ьеи

Ьеи

Зег

Зег

Уа!

61 п

11е

61 и

61 у

Нтз

РГО

мех

Зег

Ьеи

Рго

500

505

510

Ьеи

61 η

РГО

РГО

Зег

61 у

РГО

суз

5ег

РГО

Зег

АЗр

61η

61 у

РГО

Зег

515

520

525

РГО

Тгр

61 у

ьеи

Ьеи

61и

зег

ьеи

уа!

Суз

рго

ьуз

Азр

61 и

А1а

ьуз

530

535

540

- 114 015706

5ег Рго А1а Рго С1и Тйг 5ег Азр Ьеи с1и О1п Рго Тйг С1и Ьеи Азр 545 550 555 560 Зег Ьеи Рйе Агд б1у Ьеи А1а Ьеи Тйг УаЧ 61 η Тгр оЧи Зег

565 570 <210> 3 <211> 211 <212> Белок <213> Человек <400> 3

РГО

С1 и

Азр

РГО

зег

А$р

1_еи

Ьеи

61 η

НТВ

УаЧ

ьуз

РЬе

61 η

Зег

5ег

1

5

10

15

АЗП

Рйе

бЧи

А5П

Не

Ьеи

тЬг

Тгр

Азр

5ег

01 у

РГО

01 и

61 у

ТЙГ

РГО

20

25

30

Азр

тйг

УаЧ

туг

зег

Не

01 и

туг

ьуз

тйг

туг

61 у

61 и

Агд

Азр

тгр

35

40

45

УаЧ

дЧа

(.уз

(.уз

о!у

суз

01 η

Агд

Не

тйг

Агд

Бег

суз

АЗП

ьеи

50

55

60

тйг

Уа1

01 и

тНг

01у

АЗП

ьеи

тЬг

61 и

Ьеи

Туг

туг

А1а

дгд

Уа1

тйг

65

70

75

80

дЧа

УаЧ

зег

А1а

О1у як

61 у

Агд

Зег

А1а

ТЙг

ьуз

мег

Тйг

АЗр

Агд

рйе

Зег

Зег

Ьеи

61 η

о э НТЗ

тйг

тНг

Ьеи

ьуз

РГО

РГО

А5р

Уа1

тйг

суз

Не

100

105

но

зег

ьуз

Уа1

Агд

Зег

Пе

01 η

мег

Не

Уа1

НТ 5

РГО

ТЙГ

Рго

ТЙГ

РГО

115

120

125

Не

Агд

А1а

01 у

Азр

01 у

НТ 5

Агд

ьеи

тйг

ьеи

61 и

Азр

Не

Рйе

нтз

130

135

140

Азр

ьеи

Рйе

Туг

НТ 5

Геи

61 и

Ьеи

о1п

УаЧ

АЗП

Агд

тйг

туг

61 п

мет

145

150

155

160

НТ 5

Ьеи

01 у

61у

1-У5

01 η

Агд

61 и

туг

бЧи

рЬе

рКе

61 у

Ьеи

Тйг

Рго

165

170

175

Азр

Тйг

о! и

Рйе

Ьеи

01 у

Тйг

Не

МеТ

Пе

Суз

УаЧ

Рго

ТЬг

Тгр

А1а

180

185

Уа1

190

|_уз

61 и

5ег

А1а

Рго

туг

мет

Суз

Агд

ьуз

ТНг

Ьеи

Рго

АЗр

Агд

195

200

205

тйг

тгр

тйг

210 <210> 4 <211> 541 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <22О>

<22 3> Слитый полипептид растворимого 1Ь-22КА-Ес <400> 4

РГО

61 и

Азр

РГО

зег

А5р

ьеи

Ьеи

61 п

нтз

УаЧ

ьуз

РЬе

61 п

Зег

зег

1

5

10

15

АЗП

Рйе

61 и

АЗП

Не

Ьеи

ТЙГ

Тгр

АЗр

5ег

61 у

РГО

61 и

61 у

ТЙГ

РГО

20

25

30

АЗР

тйг

УаЧ

туг

5ег

11 е

61 и

туг

ьуз

ТЙГ

туг

61 у

61 и

Агд

Азр

Тгр

35

40

45

уа!

А1а сл

ьуз

ьуз

61 у

Суз

01 п

Агд

Пе

ТЙГ

Агд

ьуз

Зег

Суз

АЗП

ьеи

ТЙГ

Уа1

бЧи

ТЙГ

бЧу

А5П

из ьеи

ТЙГ

61 и

ьеи

туг

туг

А1а

Агд

УаЧ

ТЙГ

65

70

75

80

А1а

Уа1

Зег

А1а

61 у

61 у

Агд

Зег

А1а

ТЙГ

ьуз

мет

ТЬг

АЗр

Агд

Рйе

85

90

95

Зег

Зег

Ьеи

61 п

нтз

ТЬг

Тйг

Ьеи

ьуз

РГО

Рго

Азр

УаЧ

ТЙГ

Суз

Не

100

105

110

5ег

ьуз

Уа1

Агд

5ег

11 е

01 п

мет

11е

УаЧ

нтз

РГО

ТЙГ

РГО

ТЬг

Рго

115

120

125

Не

дгд

А1а

61 у

Азр

о! у

нтз

Агд

Ьеи

ТЙГ

ьеи

61 и

Азр

11е

рЬе

НП5

- 115 015706

130

135

140

абр

Ьеи

РЬе

туг

НТЗ

ьеи

61 и

Ьеи

61 п

Уа1

А5П

Агд

тЬг

Туг

61 η

мет

145

150

155

160

НТЗ

Ьеи

б!у

61 у

ЬУ5 1ПК

61 η

Агд

61 и

туг

61 и 1 7Л

РЬе

РЬе

61 у

ьеи

тЬг 174

рго

А5Р

тЬг

61 и

рЬе

ХОЗ геи

61У

тЬг

Не

мет

к/ и Не

суз

уа!

РГО

тЬг

X/ 3 тгр

А1а

180

185

190

ЬУЗ

61 и

Бег 1 ас

А1а

Рго

Туг

мет

суг ЭЛЛ

Агд

Уа!

ьуз

тЬг

ьеи

рго

А5Р

Агд

ТЬг

тгр

Л 53 тЬг

А1а

Бег

ТЬг

ьуз

4ии 61у

рго

Бег

уа!

рЬе

хиз Рго

Ьеи

А1а

Рго

210

215

220

Бег

Бег

ЬУ5

зег

тЬг

Бег

61 у

61 у

ТЬг

А1а

А1а

геи

61 у

суз

ьеи

уа!

225

230

235

240

ьуз Азр туг РЬе Рго с!и рго Уа! тЬг Уа! 5ег тгр Азп Бег б1у А1а 245 250 255

Ьеи ТЬг Бег б!у Уа1 Нтз ТЬг РЬе Рго А1а Уа1 Ьеи 61η Бег Бег б1у 260 265 270

Ьеи Туг Бег Ьеи Бег Бег Уа1 Уа1 тЬг Уа1 Рго Бег Бег Бег ьеи б!у 275 280 285

ТЬг 61п 290

тЬг

Туг

11е

Суз АЗП Уа1 АЗП 295

нтз

ьуз

Рго Бег 300

АЗП

ТЬг

Ьуз

Уа! 305

Азр

ьуз

ьуз

Уа1

61 и 310

Рго

ЬУЗ

Бег

суз

$

ЬУЗ

ТЬг

НТ 5

ТЬг

суз 320

Рго

рго

Суз

Рго

А1а

РГО

61 и

Ьеи

Ьеи

б1у б1у

Рго

Бег

Уа1

РЬе

Ьеи

325

330

335

РЬе

рго

рго

Ьуз

рго

1-У5

Азр

тЬг

Ьеи

мет

Не

Бег

Агд

тЬг

рго

61 и

340

345

350

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

А$р

Уа1

Бег

Нт 5

61 и

А5₽

Рго

61 и

Уа1

Ьуз

355

360

365

РЬе

АЗП

тгр туг

уа!

Азр

61 у

Уа1

61 и

Уа1

Н1з

Азп

А1а

ьуз

тЬг

ьуз

370

375

380

Рго

Агд

61 и

61 и

61 п

туг

АЗП

Бег

ТЬг

Туг

Агд

Уа!

Уа1

Бег

Уа1

ьеи

385

390

395

400

ТЬг

Уа1

Ьеи

НТ 5

61л

Азр

тгр

Ьеи

АЗП

61у

ьуз

61 и

Туг

ьуз

суз

ьуз

405

410

415

Уа1

Бег

АЗП

ьуз 420

А1а

ьеи

рго

д!а

Рго 425

Не

61 и

ьуз

тЬг

11е 430

Бег

ьуз

А1а

ьуз

61 у 435 61 и

61 п

РГО

Агд

61 и

РГО 440 61 п

61 п

Уа1

туг

тЬг

ьеи 445 суз

РГО

рго

зег

Агд

АЗр

Ьеи

ТЬг

ьуз

АЗП

Уа1

Бег

|_еи

ТЬг

ьеи

Уа1

ьуз

450

455

460

61 у

РЬе

туг

рго

Бег

Авр

11е

А1а

Уа1

61 и

тгр

С1и

Бег

АЗП

61 у

61 η

465

470

475

480

рго

61 и

АЗП

АЗП

туг

ьуз

тЬг

тЬг

Рго

рго

уа1

Ьеи

АЗр

Бег

АЗр

61 у

485

490

495

Бег

РЬе

РЬе

Ьеи

туг

Бег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа!

Азр

Ьуз

Бег

Агд

тгр

61 п

500

505

510

61 η

61 у

Азп

Уа!

РЬе

Бег

Суз

Бег

Уа1

мет

НТ 5

61 и

А! а

ьеи

Нтз

Азп

515

520

525

НТ 5

35

ТЬг

61 п

ьуз

Бег

ьеи

Бег

Ьеи

Бег

РГО

61 у

ьуз

535

540

<210> 5 <211> 1116 <212> ДНК <213> Человек <220>

<221> СРБ <222=- С21)...<557>

<400* 5 гсдадТСада атгдТсТдса агд дсс дсс сТд сад ааа тст дед аде тег тсс 53 Мет А1а А1а Ьеи 61 п Ьуэ Бег УаТ Бег Бег РЬе 15 10 стт атд ддд асе стд дсс асе аде Тдс стс стт стс ттд дсс стс ттд 101

- 116 015706

149

геи

мег

61 у

ТЬг

геи

А1а

ТЬг

5ег

суз

геи

геи

геи

геи

А1а

геи

геи

15

20

25

дга

сад

дда

дда

дса

дед

ссс

асе

аде

ссс

сас

где

адд

егг

дас

уа!

61 η

61 у

61 у

А1а

А1а

А1а

Рго

Не

5ег

5ег

Ηί 5

суз

Агд

геи

АЗр

30

35

40

аад гуз тсс Зег 45 сад аас ггс _ азп рЬе <>1 η сад η

ссс Рго гаг туг аге

Не асе

ТЬг аас АЗП сдс Агд 55 асе ТЬг ггс рЬе агд мег егд геи

197

9«

А1а аад

1У5 дад дсг аде г!д и А1а 5ег геи дсг

А1а даг

А5р аас АЗП аас АЗП аса

ТЬг дас Азр дгг Уа1 едг Агд сгс сей агг Не

245 агд мег дад и

ааа егд ггс сас гуз геи РЬе Нтз 80 дгс

Уа1 ад! Бег агд мег 85 аад гу5 сад дгд егд 61п Уа1 геи аас АЗП асе ггс ____

РЬе тЬг егг геи 100 даг гсг _ зег Азр адд ггс сад ссг гаг агд

Агд РЬе 61п рго туг мег

110 115 сад дад 61π 61 и адд сгс Агд геи 125 аде аас адд сга аде аса

5ег Азп лгд геи зег тЬг

130 гдг саг

Су5 НТ 5 саг аге

ΗΪ5 Не

140 сад адд ааг дгд саа аад

61η Агд А5п Уа1 61η гуз

145 егд аад геи гуз дда дад

С1у 61и агг дда

11е с*у

165 даа и

адг	дад	сдс	где	гаг	егд	293
5ег	61 и	Агд	Суз	Туг 90	геи
даа	дгд	егд	«с	СС!	саа	341
61 и	УЭ1	геи	РЬе	РГО	61 η
			105
дгд уа1	дгд Уа1	ссс РГО	!!С РЬе	егд геи	дсс А1а	389
		120
агг	даа	30!	да!	дас	С!д	437
11е	61 и 135	61у	АЗр	Азр	геи
дас	аса	дгд	ааа	аад	С!!	485
Азр	тЬг	уаТ	гуз	гуз	геи
150				155
даа	егд	даг	егд	егд	!!!	533
61 и	геи	Азр	геи	геи	РЬе
			170

587 агд гсг мег 5ег егд ада аас дсс где агг геи Агд азп А1а Суз 11е 175 гдассададс ааадссдааа аагдаагаас гаасссссгг гсссгдсгад аааддаадаг дддаадссаа !адггасааа ддааассааг сагадагагг гаггдагаас аггггггааа гааггдгегг ааассссгаа агадсггсаг гаггасгага адаегдеагг асагсаггсд агаггдегас гададсгага асагдгггаг ааагаасааг гадагдсссс асгссагсаг дагдддгдда дссасггггд гггагаадас агггсаггдг ааегддгдгг гггссагааа ааадаггасг дгггссагаа геадгаехгг ггагггагаг саггггагга ггдадгдгаа ддсгаагагг ггдассгсаа гааасасггд ааадсдаггг гггггаасса ггссааагда ассссгдсдг садааддгад асгггсгаад сгагасасад аааасааегг ггссаггссг ггаддддааа агагггагаа агдгагггаг агагддаггг агггагадаа дагагггагд асаагаагга дагагссга

647

707

767

827

887

947 1007 1067 1116 <210> 6 <211> 179 <212> Белок <213> Человек <400> 6

мег

д1а

А1а

геи

61 п

гуз

зег

Уа1

зег

зег

РЬе

геи

мег

61 у

ТЬг

геи

1

3

го

15

А1а

ТЬг

Зег

суз

геи

|_еи

геи

ьеи

А1а

геи

геи

νβΐ

61 п

61 у

61 у

А1а

20

25

30

А1а

А1а

РГО

Не

Зег

зег

НТ 5

Суз

Агд

геи

Азр

гуз

зег

Азп

РЬе

61 п

35

40

45

61 п

Рго ςη

туг

Не

ТЬг

Азп

Агд ее

ТЬг

РЬе

мег

геи

А1а СЛ

гуз

61 и

А1а

Зег

геи

эи А1а

Азр

АЗП

АЗП

тЬг

30 Азр

Уа1

Агд

геи

Не

νν 61 у

61 и

гуз

геи

РЬе

- 117 015706

65

70

75

80

Н15

С1у

Уа1

зег

мет

зег

61 и

Агд

суз

туг

геи

мет

1.У5

61 η

Уа1

ней

85

90

95

АЗП

РЬе

тЬг

геи

61 и

61 и

Уа1

геи

РЬе

рго

с! л

зег

Азр

Агд

РЬе

61 η

100

105

110

Рго

туг

мет

61 η

61 и

Уа1

Уа1

РГО

РЬе

Геи

А1а

Агд

Геи

5ег

АЗП

Агд

115

120

125

геи

зег 1 чл

тЬг

суз

Н13

Не

61 и Ί4ζ

61 у

Азр

Азр

геи

НТ 5 1 АП

Не

61л

Агд

А5П

Уа1

хои с1п

гуз

Геи

гуз

Азр

хо э тЬг

Уа1

1У5

Ьуз

геи

61 у

61 и

Зег

61 у

61 и

145

150

155

160

Не

цу5

А1а

Не

61 у

б!и

геи

АЗр

геи

геи

РЬе

мет

зег

ьеи

Агд

А5Л

165

170

175

А) а

суз

11 е

<210> 7 <211> 926 <212> ДНК <213> Человек <220>

<221> СОЗ <222> (45)...(575) <221> вариация <222> (188)...(188) <223> Нуклеотид может быть С или С в положении 188 <400> 7 сСССдааТСс сСадсесстд сддесгссад аСССсаддсс Саад атд ааа дсс ест 56

Мет Гуз А1а 5ег

адт стт дсс ттс аде стт стс Зег геи А1а РЬе Зег Ьеи Теи

1 тст дет дед ттт тас стс ста

бдд тгр

асе тЬг 20

104

зег

А1а

А1а Рпе 15

туг

геи

геи

5

10

сст

тсс

асе

дда

стд

аад

аса

стс

аат

ттд

дда

аде

тдт

дед

асе

дсс

152

РГО

зег

тНг

61 у

геи

гуз

тЬг

геи

АЗП

геи

С1у

зег

суз

Уа1

Не

А1а

25

30

35

аса

аас

стт

сад

даа

аса

еда

аат

дда 61 у

ттт

ТСТ

даз

ата

едд

ддс 61 у

аде

200

тЬг

АЗП

геи

61 п

61 и

Не

Агд

Азп

РЬе

Зег

Хаа

11е

Агд

Зег

40

45

50

саа

дсс

ааа

дат

дда 61у

аас

атт

дас

атс

ада

атс

тта

адд

адд

асе

248

61 η

А1а 55

гуз

Азр

АЗП

11 е 60

Азр

11е

Агд

11 е

геи 65

Агд

Агд

тЬг

дад

тст

Т1д

саа

дас

аса

аад

сст

дед

аат

еда

тде

бде

стс

сед

еде

296

61 и

Зег 70

геи

61 п

Азр

тЬг

гуз 75

Рго

А1а

Азп

Агд

суз 80

суз

Геи

Геи

Агд

саС

ттд

ста

ада

ст с

Таг

стд

дас

адд

д*а

ТТТ

ааа

аас

Сас

сад

асе

344

Нт 5

Геи

геи

Агд

геи

Ί»

геи

Азр

Агд

Уа1

РЬе

гуз

А5П

туг

61л

ТЬг

85

95

100

ССТ

дас

сат

сас

аст

СТС

едд

аад

ат с

аде

аде

стс

дсс

аат

Ссс

ССС

392

Нго

ΗΊ 3

Туг

ТНг

Ьеи

Агд

1_у5

тТе

Зег

зег

леи

А1а

А5П

зег

Р1че

105

110

115

СТТ

асе

ахс

аад

аад

дас

СТС

едд

СТС

ТдТ

сат

дсс

сас

атд

аса

хде

440

Геи

тЬг

11е

Гуэ 120

гуз

Азр

геи

Агд

геи 125

суз

Н18

А1 а

Н?5

мет 130

ТЬг

суз

сат

Ш

ддд

дад

даа

дса

агд

аад

ааа

гас

аде

сад

асе

ссд

аде

сас

488

- 118 015706

НТЗ

СУЗ

б!у

б1и

61 и

А1а

МеХ

ьуз

ЬУ5

туг

Зег

61 η

Не

ьеи

Зег

НТЗ

135

140

145

XXX

даа

аад

схд

даа

ССХ

сад

дса

дса

д«

9*9

аад

дсх

ххд

999

даа

рпе

61 и

ХУ5

ьеи

61 и

РГО

61 η

А1а

А1а

Уа1

уаТ

СУЗ

А1а

Хеи

бТу

61 и

150

155

160

сха

дас

ахх

схх

схд

саа

*дд

ахд

дад

дад

аса

даа

хад

даддааас

)*9

Хеи

А5р

Не

хеи

хеи

61 η

Тгр

мех

61 и

61 и

ТЙГ

61 и

Л·

165 170 175 ахдсхдсхдс хаадаахахх сдаддхсаад адсхссадхс ххсаахассх дсададдадд645 сахдасссса аассассахс хсхххасхдх асхадхсххд Хдсхддхсас адхдхагсхх705 ахххахдсах хасххдсххс сххдсаХдах хдхсхххахд сахссссаах сххааххдад765 ассахасххд саХаадаХХХ ХХдхааХаХс хххсхдсхах Хддахахахх хаххадххаа825 хахахххахх хаххххххдс хаххаахдха хххааххххх хасххдддса хдааасххха885 аааааааххс асаадаххах ахххахаасс хдасхададс а926 <210> 8 <211> 176 <212> Белок <213> Человек <220>

<221> Вариант <222> (48)...(48) <223> Аминокислота в положении 48 может быть ϋ (Аар) или Е (С1и) <221> Вариант <222> 48 <223> Хаа = любая аминокислота <400> 8

мех 1уз

А1а

Зег

5ег

Хеи

А1а

Р1те

Зег

ίθυ

хеи

Зег

А1а

А1а

РКе

Туг

1

5

10

15

ьеи хеи

тгр

тЬг >п

рго

5ег

Т1тг

61 у

хеи эс

хуз

ТЬг

хеи

АЗП

хеи эл

61 у

Зег

Суз Уа1

Не

ζυ А1а

тНг

А5П

Хеи

61 п

£ 5 61 и

Не

Агд

А5П

61 у

5и РЬе

5ег

хаа

35

40

45

Не Агд

61 у

Зег

Уа1

61 η

А1а

хуз

АЗр

61 у

АЗЛ

Не

Азр

Не

Агд

Не

50

55

60

хеи Агд

Агд

И1Г

61 и

зег

хеи

61 п

А5Р

тНг

1У5

Рго

А1а

АЗП

Агд

суз

65

70

75

80

суз хеи

Хеи

Агд

нтз 05

хеи

хеи

Агд

хеи

туг 40

Хеи

Азр

Агд

Уа1

рЬе 95

хуз

Азп туг

61 η

тНг

о о рго

Авр

Нтз

туг

тНг

Хеи

Агд

«-УЗ

Не

Зег

5ег

Хеи

100

105

110

А1а АЗП

Зег

рНе

хеи

тНг

Не

хуз

хуз

АЗр

ьеи

Агд

хеи

Суз

нтз

А1а

115

120

125

нтз мех

тЬг

суз

НТ 5

суэ

61 у

б1и

61 и

А1а

мех

хуз

хуз

туг

Зег

61 п

130

135

140

11е хеи

5ег

НТ 5

РЬе

61 и

Хуз

Хеи

61 и

РГО

61л

А1а

А1а

Уа1

Уа1

ХУ5

145

150

155

160

А1а Хеи

61 у

61 и

хеи

Азр

Не

хеи

Хеи

61 η

тгр

МеХ

61 и

61 и

тНг

61 и

165

170

175

<210> 9

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Пептидный линкер

<400> 9

61 у 61 у Зег е!у б!у 5ег 61 у б1у б!у 61 у

5ег

61у С1у 61у 61у

5ег

- 119 015706

1 5	10	15
<210> 10 <211> 1050 <212> ДНК <213> Мышца
<220> <221> СОЗ <222> (5)...(589)

<400> 10 ааса ддс есе се! сес аст пае саа сиг еед аса еее дед еда еед дед 49

61у 5ег рго ьеи тЬг Туг с1п ьеи ьеи тЬг Геи Уа1 Агд 5ег Уа1

1

5

1

0

15

аед

дсе

дес

сед

сад

ааа

есе

аед

аде

еее

есс

сее

аед

ддд

асе

еед

97

мае

А) а

уа1

1_еи

61 η

ьуз

зег

мее

зег

РЬе

зег

|_еи

мее

б!у

тЬг

1еи

20

25

30

дсс

дсе

аде

еде

сед

сее

сес

аее

дес

сед

едд

дсс

сад

дад

дса

аае

145

А1а

А1а

зег

Суз

1_еи

иеи

|.еи

Не

А1а

1.еи

тгр

А1а

61 η

61 и

А1а

АЗП

35

40

45

дед

сед

есс

аес

аас

аес

едд

еде

аад

сее

дад

дед

есс

аас

еее

сад

193

А1а

геи

рго

11 е

АЗП

тЬг

Агд

суз

|.уз

Геи

61 и

уа!

5ег

АЗП

РЬе

61 η

50

55

60

сад

сед

еас

аес

9ΐ£

аас

сдс

асе

еее

аед

сед

дсс

аад

дад

дсс

аде

241

61 п

Рго

туг

Не

Уа1

А5П

Агд

тЬг

рке

Мее

Геи

А1а

еуз

61 и

А1а

зег

65

70

75

сее

дса

дае

аас

аас

аса

дас

дес

едд

сес

аес

ддд

дад

ааа

сед

еее

289

ьеи

А1а

Азр

АЗП

Азп

ТЬг

АЗр

Уа1

Агд

ίβο

Не

оТу

61 и

Ьуз

1_еи

рке

80

85

90

95

еда

дда

дес

аде

дсе

аад

дае

сад

еде

Гас

сед

аед

аад

сад

дед

сес

337

Агд

б1у

Уа1

Зег

А1а 100

Ьуз

АЗр

61 η

суз

туг 105

ьеи

мее

ьуз

61 п

уа! 110

ееи

аас

тес

асе

сед

даа

дас

аее

сед

сес

ссс

сад

еса

дас

адд

еее

едд

385

АЗП

рЬе

тЬг

Ьеи

б1и

Азр

11е

ьеи

|_еи

Рго

61 η

зег

Азр

Агд

р(те

Агд

115

120

125

сее

еас

агд

сад

дад

дед

дед

ссе

сес

сед

асе

ааа

сес

аде

аае

сад

433

РГО

туг

мее

61 η

61 и

УаТ

Уа1

РГО

рЬе

Ьеи

тЬг

ьуз

|_еи

зег

АЗП

с1 п

130

135

140

сес

аде

есс

еде

сас

аес

аде

дде

дас

дас

сад

аас

аГс

сад

аад

аае

481

ьеи

Зег

зег

Суз

НТ 5

11 е

зег

61 у

Азр

АЗр

61 п

АЗП

11 е

61 η

ьуз

Азп

145

150

155

дес

ада

адд

сед

аад

дад

аса

дед

ааа

аад

сее

дда

дад

аде

дда

дад

529

Уа1

Агд

Агд

>.еи

еуз

61 и

ТЬг

Уа1

ьув

еуз

ίβυ

61у

61 и

зег

61у

61 и

160

165

170

175

аес

ааа

дед

аес

ддд

даа

сед

дас

сед

сед

еее

аед

есе

сед

ада

аае

577

11е

ьуз

А1а

11е

61у

61 и

1.еи

Азр

1_еи

1_еи

рНе

мее

зег

Ьеи

Агд

АЗП

180

185

190

дет

еде

дес

еда

деда

даад

|аа 6

|сеас

|аааа

.с да

.адаа

егде

: есс

:еесс

еде

629

А) а

С/5

Уа1

*

сеестааааа даасааеаад агссседаае ддасееееее асеаааддаа адедадаадс 689 еаасдессас саесаееада адаеетсаса едааасседд сесадеедаа ададааааеа 749 дедесаадее дгссаедада ссададдеад асеедагаас сасааадаее саггдасааг 809

- 120 015706 аттттаттдт даддттасст стттататат атддатттат т саттдатаат стсаттсстс дТаадТТТаТ ТТатадаааа дсаасадааа Тадаадаааа ТТаТТаТаад аттатстдат аадтатдтас дсстатдтаа татасатттт дттдататтт тттаааааат тдттсдааад сттсатттсс атаассаата атттатдтса дтттаттаат дадтатааад сааатаатат

869

929

989

1049

1050 <210>

<211>

<212>

<213>

194 Белок Мышца <400>

у

А1а зег I

Рго

1ец

Уа1 ьеи

А1а зег ьеи

РГО

А1а

Рго

Туг

Суз 35

Не п

ьеи

Азп

Не уа!

Азр

АЗП

АЗП у

Уа1

Зег рНе тКг туг

Зег

145

Агд мет

130 зег

Агд ьуз

А1а суз

Уа1 <210> <211> <212> <213>

<22О> <221> <222>

<400> атд мет аст тНг адд Агд ест Рго ааа ьуз

ТНг 5

Ьуз

Туг

5ег

Ьеи

Ьеи

61η мет

Не

Ьеи ьеи

Зег

ТНг

Агд

АЗП ьеи

115 п

А1а

100 и

и

Суз

Н15

Ьеи ьуз

Не у

180

2149 ДНК Человек тНг

Ьуз лгд

Азр

АЗР

АЗр е

Уа1

Уа1 е

и

165 и

Зег

150

ТЬг

СОЗ (1) .. . (693) атд мет суз тНг

А1а 40 ьуз рЬе

Ьеи тНг

Зег

ТГр

Уа1 π

ьеи

Рго

135 у

Уа1 ьеи Азр ьеи

Уа1

Агд

Зег рНе

Агд

Суз ьеи

120 рНе

Азр ьуз ьеи ьеи мет ьеи туг

105 РГО

Ьеи

Азр ьуз

Ьеи

185

Ьеи

А1а

Мет η

и ьеи

11е

Ьеи п

тЬг п

ьеи

170

РНе

Уа1

А1а у

мет

Зег ьуз

АЗП

155 у

мет у

Зег ьуз и

ьуз

Азр

Ьеи

140

Не и

зег и

АЗП тНг

А1а рНе и

А1а ьуз п

Агд

125

Зег п

Зег ьеи

Ьеи

Уа1 110 РНе

Азп ьуз у

Агд

190

Уа1

Ьеи

Мет

А1а

АЗП η

Зег рНе

Ьеи

Агд п

Азп и

175 АЗП

А1а п

Ьеи

Агд

АЗП

РГО

Ьеи

Уа1

160

11е

А1а ата е

дта

Уа1

999 б1у

9?Ь у

ССТ

ааа

саТ

тдс

ТТТ

ста

ддс

ТТС

СТС

атс

адт

ттс

ттс

СТТ

48

Рго

ьуз

Н1з 5

Суз

рЬе

ьеи

61у

РЬе 10

ьеи

Не

Зег

рНе

РНе 15

Ьеи

дта

дса

дда

аст

сад

тса

асд

саТ

дад

ТСТ

стд

аад

ССТ

сад

96

νβΐ

А1а

61у

ТНГ

61 п

Зег

тНг

ΗΊ 3

61 и

Зег

Ьеи

ьуз

Рго

61 п

20

25

30

саа

ТТС

сад

тсс

еда

аат

ТТТ

сас

аас

атт

ттд

саа

тдд

сад

144

61 π

РНе

61 п

5ег

Агд

АЗП

РНе

Н15

АЗП

Не

ьеи

61 п

тгр

61 п

35

40

45

адд

дса

СТТ

аст

ддс

аас

аде

адт

дтс

тат

ТТТ

дтд

сад

тас

192

Агд

А1 а

ьеи

тНг

б!у 55

АЗП

зег

эег

уа!

туг 60

рНе

уаТ

б1п

Туг

тас

903

сад

ада

саа

тдд

ааа

аат

ааа

даа

дас

тдь

тдд

ддс

240

Туг

61у

61 п

Агд

61 п

тгр

ьуз

АЗП

ьуз

61 и

Азр

суз

тгр

61у

- 121 015706

асх

саа

даа

схс

ХСХ

хдх

дас

СХХ

асе

адХ

даа

асе

хса

дас

аха

сад

тЬг

61 η

61 и

Ьеи

Бег

СУ5

АЗр

Ьеи

ТЬг

Бег

61 и

ТЬг

Бег

А5р

11 е

61η

85

90

95

9?а

ссХ

хах

Хас

999

адд

дхд

адд

дед

дес

Хед

дсх

999

аде

Хас

Хса

61 и

РГО

туг

Туг

61у

Агд

Уа1

Агд

А1а

А1а

Бег

А1а

61 у

5ег

Туг

Бег

100

105

110

даа

хдд

аде

ахд

асд

ссд

едд

ххе

асх

ссс

едд

едд

даа

аса

ааа

аХа

61 и

тгр

5ег

Мех

тЬг

Рго

Агд

РЬе

ТЬг

Рго

тгр

Тгр

61 и

ТЬг

Ьуз

Не

115

120

125

288

336

384

дах ест	сса дХс	ахд ааХ аха	асе саа аге	аах АЗП
АЗр	РГО 130	РГО	Уа1	мех	А5П	11 е 135	тЬг	61 п	Уа!
ахх	схс	сах	дсх	сса	ааХ	хха	сса	Тах	ада	хас
11 е	ьеи	Н1 5	А1а	РГО	Азп	ьеи	Рго	Туг	Агд	Туг
145					150			155
деа	хсх	аха	даа	дах	Хас	хах	даа	сХа	сха	Хас
уа1	Бег	11 е	61 и		туг	туг	61 и	Ьеи	ьеи 170	Туг
аас	ааХ	Хса	сха	даа	аад	дад	саа	аад	дхх	хах
А5П	АЗП	Бег	Ьеи	61 и	ьуз	61 и	61 η	ЬУ5	Уа1	туг
			180				185
дед	дхх	даа	ахх	даа	дсх	ста	аса	сса	сас	Хсс
А1а	уа!	61 и	Не	б1и	А1а	ьеи	ТЬг	рго	Н15	5ег
		195					200
дсх	даа	аха	ХаХ	сад	ссс	ахд	хха	дас	ада	ада
А1а	61 и	11 е	туг	с1п	Рго	мех	ьеи	А5Р	Агд	Агд
	210					215

ддс	хсх	«9	хед	дха
б1у	Бег	ьеи	Ьеи	Уа1
140
саа	аад	даа	ааа	аах
61 η	ьуз	61 и	Ьуз	АЗП
			160
еда	дХХ	XXX	аха	ахх
Агд	Уа1	РЬе	Не	Не
		175
даа 61 и	ддд 61 у	дсх А1а	сас Н1 5	ада Агд
		190
аде	хас	ХдХ	дха	дхд
Бег	туг 205	Суз	Уа1	УаТ
адт	сад	ада	адх	даа
Бег	61 п	Агд	Бег	61 и
220

432

480

528

576

624

672 дад ада ХдХ дхд даа ахх сса хдасххдхдд аахххддсах хсадсаахдх 723 и Агд Су5 Уа1 61 и Не Рго

225 230 ддаааххсха аадсхсссхд едссхххдха ххххсххааа ссаххсхххх ахссхххаха ааххдааахд хааадахдад схдаахдхаа сахсссхаах асаассаадд аахадхаххх асХдаддсдд хссхдаадса хдсхххдаса ахххаааасх хдаахахасх ххххахахах хдххххааад ХсХасХХХаХ хсхддаххда хахсхдаахх сссхсаххха ааадахахах ххаахссхдх сххадаадаа асааадаада ааддааассх сдссххссхс ахсхсхахах ддХсдасссс ахасададаа аддассддхд ххддхаддхд дссссхссхд схсасХдссХ саасадааад схдссххсхх хсхадхдадд адаХасаХаХ адххдахаас ааЕаХадХсд ХааааааХаХ хсадааахдх дадааХХддХ ХХССХХдсХХ дадасХдааа ааааааааах адаасаддаг дасхсдхдхх дсааХаХХса сХдХХасасс хххсахххха аасхахаххх дсададааха аадхдххсха аасаассххс аттсгтсхаа аадаааагдг хдааахаахх ахддхххххс асхсхсххах хсхахааадд хдаахахххх ххаххаххах хааахахххс дхааахаада асаддххххд аааасхахса асаасаадда хаадсххххс ххххсхдххх сххахсххха ххсхсаааах саххасхсаа хссххсхддс аддаддахсс сатдаахдах схсадсххда адсхддаадс ссхасадада схахададсх схссхдадха дааахсхддх сасххдаддс хаадхсххса сададаасаХ ХХдХасааХХ дтдсХХсХад ххахахдсаа аххддддддх ддаддадаах ссстдхахдс хсадааааса дсхсдадсдд ссдссахахс хдааддахсх хатххаааах ХХддддасХХ СХХХдХХХаХ даасдасахх ссссссдааа хдаааххсад аасхххаххх Хасадсаааа ХаааааХХХа хххххаааах адсаххасад хдадссаахх аааххдасах хсахасаххх схаххххаха хасххаахда ахсааааххх дддааааааа хсххахдахх адхсхасхсх дхасааххдх дхххххдххх хдхххадххх хааахдхаах ххххххадхд саададХдхс ххдсххдхдд ддхххаххдд даасхдсхдд асасадХддд Хадсаддада адасааадсс схссааасхд дассхааддс хсадхдсддх хахахдххха аддХХдХсХХ ссссахдааа аххдсхссаа дХасХсадьд ахааахддах аададдсада дсаададсха ххдахххдад сахадасдса сххддх

783 843

903

963 1023 1083 1143 1203 1263 1323 1383 1443 1503 1563 1623 1683 1743 1803 1863 192 ϊ 1983 2043 2103 2149 <210> 13

- 122 015706 <211> 231 <212> Белок <213> Человек <400> 13

мег

мег

Рго

1У5

Нт 5

Суз

РЬе

геи

61 у

РЬе

геи

Не

Зег

РЬе

РЬе

геи

1

Уа1

5

10

15

тЬг

51у

А1а

61 у

ТЬг

61 η

5ег

ТЬг

Нтз

61 и

5ег

геи

гуз

рго

б!п

20

25

30

Агд

Уа1

С1п

РЬе

61 п

Зег

Агд

Азл

РЬе

НТ 5

АЗП

Не

геи

б1п

тгр

61 η

35

40

45

Рго

61 у

Агд

А1а

геи

ТЬг

61 у

А5П

Зег

5ег

Уа1

Туг

РЬе

Уа1

61 η

Туг

50

55

60

гуз 65

Не

туг

61у

61 η

Агд 70

61 п

тгр

гуз

АЗП

гуз 7ς

61 и

Азр

суз

тгр

61 у ОЛ

ТЬг

61 п

61 и

геи

зег

1 V суз

Азр

геи

ТЬг

Зег

/ Э 61 и

ТЬг

Зе г

АЗр

Не

©и 61 п

85

90

95

61 и

Рго

туг

Туг ΊΠΩ

б!у

Агд

Уа1

Агд

А1а 1 Πζ

А1а

зег

А1а

б1у

зег 11Л

Туг

Зег

61 и

тгр

Зег

хии мег

тЬг

Рго

Агд

рЬе

хиэ ТЬг

Рго

Тгр

Тгр

61 и

XXV тНг

гуз

И е

115

Уа1

120

125

АЗр

РГО

РГО

Мег

Аз η

Не

тЬг

61 η

Уа1

А5П

61 у

5ег

ьеи

геи

уа!

130

135

140

Не

геи

Н15

А1а

РГО

АЗП

геи

рго

туг

Агд

Туг

61П

гуз

С1и

гуз

А5П

145

150

155

160

Уа1

5ег

Не

61 и

АЗр

Туг

туг

61 и

геи

геи 170

Туг

Агд

Уа1

РКе

Не 17^

Не

АЗП

АЗП

зег

геи

Χνί б!и

иу®

б1и

61 η

гуз

Уа1

Туг

61 и

61 у

А1а

X/ э Н75

Агд

180

185

190

А1а

Уа1

61 и

Не

61 и

А1а

геи

тЬг

Рго

ΗΊ5

Зег

Зег

Туг

СУ5

Уа1

Уа1

195

200

205

АЗ а

61 и

11 е

туг

61 η

рго

мег

геи

Азр

Агд

Агд

зег

61 η

Агд

5ег

61 и

210 215 220 ίΤΊ·ι А 5/ίΊ ΛΊ I I τΐό СИЛ « I VI ί“»ι у '-У-' »»· >и » И хк; I ιν 225 230 <210> 14 <211> 699 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> С-концевая метка Рс4 <400> 14 дадсссадаг стгсадасаа аасгсасаса гдсссассдг дсссадсасс гдаадссдад60 ддддсассдг садгсггссг сггсссссса ааасссаадд асасссесаг дагсгсссдд120 ассссгдадд гсасагдсдг ддеддтддас дтдадссасд аадасссгда ддссаадггс180 аасгддгасд гддасддсдг ддаддгдсаг аагдссаада сааадссдсд ддаддадсад240

Тасаасадса сдгассдгдг ддгсадсдгс стсассдусс гдсассадда сгддсгдаат300 ддсааддадг асаадгдсаа ддрсгссаас ааадсссгсс сагссгссаг сдадаааасс360 а!сгссааад ссааадддса дссссдадаа ссасаддСдг асасссгдсс сссатсссдд420 датдадстда ссаадаасса ддгсадссгд ассгдссгдд гсаааддсгг сгагсссадс480 дасагсдссд гддадгддда дадсаатддд садссддада асаастасаа дассасдссг540 сссдгдсгдд асгссдасдд сгссггсггс сгсгасадса адсгсассдт ддасаададс600 аддтддсадс аддддаасдг сггсгсагдс гссдгдагдс агдаддсгсг дсасаассас660 гасасдсада ададссгсгс ссгдгсгссд ддгааагаа699 <210> 15 <211> 6 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептидная метка 61и-(31и (СЕЕ) <4О0> 15

- 123 015706

С1и Туг мет рго Мет б1и 1 5 <210> 16 <211> 10 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Пептидная метка <31и-О|и (СЕЕ) со спейсером <400> 16

С1у 5ег бТу С1у б1и Туг мет рго мет С1и 15 10 <210> 17 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ39289 <400> 17 тссдаддадт саатдстаад 20 <210> 18 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ39290 <400> 18 тссаадсттт ттсастдтст 20 <210> 19 <211> 16 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер 2С39776 <400> 19 дддсссдста дсасст 16 <210> 20 <211> 16 <212> днк <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ39777 <400> 20 дддтдатссд стддса Ю <210> 21 <211> 36 <212> ДНК с213> Искусственная последовательность <220>

<223> Зонд ΖΟ38752 ТадМап, меченный ЕАМ/ТатКА, к Н_-20

- 124 015706 <400> 21 ссадссасп кпмссд ташсгт атгсса зе <210> 22 <211> 16 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Верхний праймер ΖΟ42459 <400> 22 тддссаддсТ садсаа 1θ <210> 23 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Нижний праймер ΖΟ42458 <400> 23 дсасагтссС стдда1атдс а 21 <210> 24 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Зонд ТадМап к ΙΙ.-22, ΖΟ42460 <400> 24 аддстаадса сатд1са1ат Тдааддтдат д 31 <210> 25 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Верхний праймер ΖΟ40541 <400> 25 тсдссаахгс скгсгсасс а 21 <210> 26 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Нижний праймер 2С40542 <400> 26 сссасаагдд сагдтсатдт 20 <210> 27 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Зонд ТадМап к 11.-20, ΖΟ40544 <400> 27

- 125 015706 адааддасст ссддсТсТдТ саТдс <210>

<211>

<212>

<213>

ДНК

Искусственная последовательность <22О>

<223> Олигонуклеотидный праймер 2С45 593 <400> 28 саддааатсс атдссдадтт дадасдсттс сдтадасасд сссстдадда сссстсд 57 <21О> 29 <211> 63 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ45 592 <400> 29 тстдддстса ссдсттссад асссдсттсс адасссдстт сстдтссддт стддсадтдт 60 стт 63 <210> 30 <211> 63 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ45 591 <400> 30 „ уассуунсау уааусуууКС иууаауСууу ТСьууаауСу уТуауСьСау аууССССаСа 60 атс 63 <210> 31 <211> 57 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер гс45 594 <400> 31 ададстдттт тааддсдсдс стстадатта тттттаттта сссддадтсс дддадаа 57 <210> 32 <211> 531 <212> ДНК <213> Мышца <220>

<221> С05 <222> (1)..,(531) <400> 32

атд мег

ааа ьуз

ддс С1у

т« Р1те

091: С1у

СТТ Кеи

дес А1а

ттт рЬе

дда 61 у

стд Кеи

ГИС рНе

гсс Зег

дет А1а

дТд Уа1

дд* 61 у

ттт рпе

48

1

5

10

15

стт

СТС

тдд

аст

сст

тта

аст

999

СТС

аад

асе

сгс

сат

ттд

дда

аде

96

Геи

кеи

Тгр

ТНг

РГО

Кеи

тпг

бТу

Кеи

Куз

ТНг

1_еи

Нт 5

Кеи

б!у

5ег

20

25

30

ТдТ

дтд

атт

аст

9«

аас

ста

сад

дса

ага

саа

аад

даа

ттт

ТсТ

дад

144

суз

Уа1

Не

ТЬг

А1а

АЗП

кеи

б1п

А1а

11 е

61 п

ьуз

61 и

рЬе

5ег

61 и

126 015706

35

40

45

атт

едд

дат

адт

дтд

саа

дет

даа

дат

аса

аат

атт

дас

11е

Агд

Азр

5ег

Уа1

61 η

А1а

61 и

АЗр

ТЬг

АЗП

11 е

Азр

50

55

60

тта

адд

асд

асе

дад

тст

ттд

ааа

дас

ата

аад

тст

ттд

ьеи 65

Агд

ТЬг

тЬг

61 и

Зег 70

Ьеи

Ьуз

Азр

Не

ьуз 75

Зег

Ьеи

тдс

ТТС

СТТ

едт

сат

ста

дтд

ада

ТТС

тат

стд

дас

адд

Су5

РЬе

ьеи

Агд

НТ 5 85

Ьеи

Уа1

Агд

РЬе

туг 90

ьеи

А5р

Агд

дтс

тас

сад

асе

сст

дас

сас

сат

асе

сед

ада

аад

атс

Уа1

туг

С1п

тЬг 100

РГО

Азр

НТЗ

НТЗ

тЬг 105

ьеи

Агд

ьуз

Не

дсс

аас

Тсс

ттт

СТТ

атс

атс

аад

аад

дас

сТс

Тса

дтс

А1а

АЗП

Зег

рЬе

ьеи

11 е

11е

ьуз

ьуз

Азр

ьеи

Зег

Уа1

115

120

125

сас

атд

дса

тдт

сат

едт

999

9аа

даа

дса

асд

дад

ааа

нтз

мет

А1а

суз

НТ 5

суз

61у

61 и

61 и

А1а

мет

61 и

ьуз

130

135

140

атт

сед

адт

сас

ттс

аса

дад

ттд

даа

СТТ

сад

дса

дед

Не

ьеи

5ег

нтз

рЬе

11е

61 и

Ьеи

61 и

Ьеи

б!п

А1а

А1а

155

145

150

Сас туг тдт суз дат Азр дта

Уа1 атс е

аде

5ег

110 ада Агд адд Агд

З?¹ АТ а даа и

ста Ьеи 165 ддс

61у асе

11е

СТТ ьеи стд Ьеи ада Агд 170

199 Тгр асд мет

9ад и

Тад *

<210> 33 <211> 176 <212> Белок <213> Мышца <400> 33

мет	Ьуз	61 у	РЬе	61 у	ьеи	А1а	рЬе	61 у	ьеи
1		5					10
Ьеи	Ьеи	Тгр	ТЬг	Рго	Ьеи	тЬг	61 у	Ьеи	ьуз
		20				25
суз	Уа1	11 е	ТЬг	А1а	А5П	ьеи	61 п	АТ а	Не
	35					40
Не	Агд ςΛ	АЗр	5ег	Уа1	61 п	А1а ΕΪ	61 и	А5р	тЬг
ьеи	□V Агд	тЬг	ТЬг	61 и	5ег	□ X Ьеи	Ьуз	А5р	Не
65				70
суз	РЬе	Ьеи	Агд	Нтз	Ьеи	Уа1	Агд	РЬе	туг
				85		нтз			90
Уа1	туг	61 η	ТЬг	Рго	Азр	НТ 5	тЬг	ьеи
		100				105
АТ а	АЗП	Зег	РЬе	Ьеи	Не	Не	Ьуз	ЬУ5	Азр
		115					120
НТ 5	мет 1 ЧП	А1а	Суз	нтз	суз	с1у 1ЭГ	61 и	61 и	А1а
11е	хэи ьеи	5ег	нтз	РЬе	Не	ХЭ 9 С1и	Ьеи	61 и	ьеи
145					150
А1а	Ьеи	61 у	61 и	Ьеи	61 у	11е	ьеи	Ьеи	Агд
			165				170

атт

11е тде

Суз ттс ааа

РЬе ьуз 95 аде стс

Зег ьеи сат тст Нтз Зег аас саа

АЗП 61П дад аТд ста и мет ьеи

175

РЬе	зег	А1а	уа1	61 у 15
тЬг	Ьеи	НТЗ	Ьеи 30	61 у
61 η	ьуз	61 и 45	рЬе	Зег
АЗП	11 е 60	Азр	11 е	Агд
ьуз 75	зег	ьеи	А5Р	Агд
Ьеи	АЗр	Агд	Уа1	РЬе 95 5ег
Агд	ьуз	11 е	зег 110
ьеи	5ег	уа! 125	Су 5	нтз
мет	61 и 140 А1а	ьуз	Туг	Азп
61 η 155	А1а	Уа!	Уа1
Тгр	мет	61 и	61 и	мет 175

РЬе

Зег и

11е

Ьеи суз

Ьуз

Зег η

ьуз

160

Ьеи

192

240

288

336

384

432

480

528

531

- 127 015706 <210> 34 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> _Л .

<223> Олигонуклеотидныи праймер гс22901 <400> 34 саХсааассд ссхдахдхда с 21 <210> 35 <211> 21 <212> ДНК <213? Искусственная последовательность <22О>

<223> Олигонуклеотидный праймер Ζ645039 <400> 35 аххаддсххд ддадддаахд д 21 <210> 36 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ38573 <400* 36

Хддсдатдсс хдсххдссда аха 23 <21О> 37 <211> 22 <212> ДНК <213? Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер гС25223 <400> 37 дхсххссхса сахсхдххах сд 22 <210> 38 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер ΖΟ40128 <400> 38 ддсххдаасх ХХдадааадд садх 24 <210> 39 <211> 1473 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Внеклеточный домен И-22КА с лидерной последовательностью 1Ра, слитый с Ес-областью тяжелой цепи гамма-|дС 2а мыши (тС2а) <221> СО5 <222> (1)...(1473)

- 128 015706 <400> 39

асд

дас

дса

агд

аад

ада

ддд

сгс

где

где

сгд

ссд

сгд

где

ддс

мет

А5р

А1а

мег

ьуз

Агд

<31 у

кеи

Суз

Суз

νβ*

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Суз

сТу

1

5

10

15

дсс

дсс

ггс

дгг

Ссд

сгс

аде

сад

даа

асе

саг

дсс

дад

ггд

ада

сдс

А1а

уа!

рНе

Зег

кеи

£ег

οΊ η

С1и

11 е

Н1£

А1 а

С1и

ьеи

Агд

Агд

25 30 «с еде ада сас дсс ссе дад дас ссс ссд дас ссд сСс сад сас дед 144

РЬе Агд Агд Нтз А1а Рго 61 и Азр Рго Бег Азр Ьеи ьеи 61 η нтз уа!

40 45

ааа

ССс

сад

есс

аде

аас

ссс

даа

аас

асе сед

асд

¢99

дас

аде

ддд

192

ьуз

РЬе

61 η

зег

5ег

А5П

РЬе

61 и

АЗП

11е Ьеи

тЬг

тгр

Азр

Зег

б!у

50

55

60

сса

дад

ддс

асе

сса

дас

асд

дСс

Сас

аде аес

дад

СаС

аад

асд

Сас

240

РГО 65

61 и

61У

тпг

РГО

Азр 70

тЬг

Уа1

туг

Зег 11е 75

61 и

туг

ьуз

ТЬг

дда

дад

адд

дас

едд

дса

дса

аад

аад

ддс сдс

сад

едд

асе

асе

едд

288

61 у

61 и

Агд

Азр

тгр 85

Уа1

А1а

ьуз

ьуз

61 у Суз 90

61 η

Агд

Не

тЬг 95

Агд

аад

ссс

где

аас

ссд

асд

дед

дад

асд

ддс аас

сгс

асд

дад

сСс

сас

336

ьуз

Зег

Суз

Азп

ьеи

ТЬг

Уа1

61 и

тЬг

б1у А5П

ьеи

ТЬг

61 и

Ьеи

Туг

100

105

110

Сае

дсс

адд

дес

асе

дсс

дсс

аде

дед

дда ддс

едд

сса

9«

асе

аад

384

туг

А1а

Агд

Уа1

Тпг

А1а

Уа1

5ег

А1а

с!у б1у

Агд

5ег

А1а

ТЬг

ьуз

115

120

125

аса

асе

дас

адд

ссс

аас

ссс

ссд

сач

сас асе

асе

ССС

аад

сса

ссе

432

мес

тЬг

Азр

Агд

Рпе

зёг

Зег

Ьей

61л

нт з тЬг

тЬг

ьеи

ьуз

Рго

Рго

130

135

140

дас

дед

асе

еде

асе

есс

ааа

дтд

ада

ссд аес

сад

асд

асе

9«

сас

480

Азр

Уа1

тЬг

суз

Не

зег

ьуз

Уа1

Агд

Зег Не

61 η

мес

И е

Уа1

НТ 5

145

150

155

160

ссе

асе

ссс

асд

сса

асе

сдс

дса

д?с

дас ддс

сас

едд

сса

асе

ссд

528

РГО

ТЬГ

РГО

ТЬг

Рго

11 е

лгд

А1а

61у

Азр 61у

нт'з

Агд

ьеи

ТЬг

ьеи

165

170

175

даа

дас

асе

«с

сас

дас

ссд

ССс

Сас

сас сса

дад

ссе

сад

дес

аас

576

61 и

Азр

11е

РЬе

НТ 5

Азр

Ьеи

РЬе

Туг

Нтз Ьеи

61 и

Ьеи

61 п

Уа1

Азп

180

185

190

сдс

асе

гас

саа

асд

сас

ссс

дда

999

аад сад

ада

даа

гас

дад

есс

624

Агд

тЬг

туг

61 п

Мес

НТ5

ьеи

61у

б'у

ьуз 61 η

Агд

61 и

Туг

61 и

РЬе

195

200

205

ССс

ддс

сед

асе

ссе

дас

аса

дад

ССс

есс ддс

асе

асе

асд

асе

еде

672

рЬе

61 у

ьеи

тЬг

РГО

Азр

тЬг

61 и

рЬе

ьеи б1у

тЬг

Не

мес

Не

суз

210

215

220

дес

ссс

асе

едд

дсс

аад

дад

аде

дсс

ссс Сас

асд

еде

еда

дед

аад

720

Уа1

РГО

тЬг

Тгр

А1а

Ьуэ

61 и

Зег

А1а

Рго Туг

мес

Суз

Агд

Уа1

Ьуз

225

230

235

240

аса

сед

сса

дас

едд

аса

д?а

аде

999

есс дда

аде

999

СсС

дда

аде

768

ТЬг

Ьеи

Рго

Азр

ТЬг

61у

зег

С1у

Зег 61 у 250

5ег

С1у

5ег

С1у 255

5ег

99 ΐ

дад

ссс

ада

ддс

ссс

аса

асе

аад

ссс сдс

ссе

сса

еде

ааа

еде

816

61 у

61 и

Рго

Агд

61у

РГО

ТЬг

Не

Ьуз

рго суз

Рго

Рго

суз

Ьуз

Су5

- 129 015706

260 265 270

сса

дса

ссг

аас

сгс

«9

ддг

дда

сса

гсс

дгс

ггс

асе

ггс

ссг

сса

864

РГО

А1а

РГО

АБП

геи

геи

61у

б1у

рго

Зег

Уа1

РНе

11 е

РНе

Рго

Рго

275

280

285

аад

аге

аад

даг

дга

сгс

агд

аге

гсс

егд

аде

ссс

ага

дгс

аса

гдг

912

ТуЗ

Не

ьу5

АБр

Уа1

геи

мег

11 е

зег

геи

зег

Рго

11е

уа1

тНг

суз

290

295

300

дгд Уа1

даг Азр

«3

аде 5ег

дад 61 и

даг Азр

дас Азр

сса Рго

даг Азр

дгс Уа1

сад 61 η

аге Не

аде 5ег

гдд тгр

960

305

310

315

320

«т

дгд

аас

аас

дгд

даа

дга

сас

аса

дсг

сад

аса

саа

асе

саг

ада

1008

РНе

УаТ

АБЛ

АЗЛ

Уа1

61 и

Уа1

НТ 5

тНг

А1а

61л

тНг

61 η

тНг

НТ 5

Агд

325

330

335

дад

даг

гас

аас

адт

асг

сгс

едд

дгд

дгс

адг

дес

сгс

ссс

аге

сад

1056

61 и

Азр

туг

АЗП 340

5ег

ТНг

геи

Агд

Уа1 345

Уа1

5ег

А1а

геи

Рго 350

Не

61 η

сас

сад

дас

гдд

агд

адг

ддс

аад

дад

ггс

ааа

где

аад

дгс

аас

аас

1104

НТЗ

61 η

АЗО

Тгр

мег

Зег

61у

гуз

61 и

рНе

гуэ

Суз

гу5

Уа1

АЗП

А5П

355

360

365

ааа

дас

сгс

сса

дед

ссс

аге

дад

ада

асе

аге

гса

ааа

ссс

ааа

ддд

1152

гуз

Агр 370

геи

РГО

А1а

рго

Не 375

61 и

Агд

тНг

11 е

Зег 380

гуз

РГО

гуз

б1у

сса

дга

ада

дсг

сса

сад

дга

гаг

дгс

ггд

ссг

сса

сса

даа

даа

дад

1200

5ег

Уа1

Агд

А1а

РГО

61 η

Уа1

туг

уа1

геи

РГО

Рго

РГО

61 и

61 и

61 и

385

390

395

400

агд

асг

аад

ааа

сад

дгс

асг

егд

асе

где

агд

дгс

аса

дас

ггс

агд

1248

мег

ТНг

гуз

гуз

61 η

Уа1

ТНг

геи

ТНг

Суз

мег

Уа1

ТНг

АБр

РНе

мет

405

410

415

сст

даа

дас

агг

Гас

дгд

дад

гдд

асе

аас

аас

ддд

ааа

аса

дад

ста

1296

РГО

61 и

Азр

Не

Ту Г

Уа1

61 и

тгр

ТНг

АЗП

А5Л

бТу

гуз

ТНг

61 и

геи

420

425

430

аас

гас

аад

аас

асг

даа

сса

дгс

егд

дас

гсг

дат

ддг

гст

гас

ттс

1344

АБП

Туг

гуз 435

АБП

тНг

61 и

Рго

Уа1 440

геи

Азр

Зег

Азр

61 у 445

зег

туг

рНе

агд

1ас

аде

аад

егд

ада

дгд

даа

аад

аад

аас

гдд

дгд

даа

ада

аат

1392

мег

туг

Зег

гуз

геи

Агд

νβΐ

61 и

гуз

гуз

Азп

Тгр

Уа1

б!и

Агд

АЗП

450

455

460

аде

гас

гсс

гдг

гса

дгд

дгс

сас

дад

ддг

егд

сас

ааг

сас

сас

асд

1440

5ег

туг

5ег

суз

5ег

Уа1

Уа1

НТ 5

61 и

61 у

геи

НТ 5

А5П

нтз

нтз

тНг

465

470

475

480

аст

аад

аде

ггс

гсс

едд

асг

ссд

ддг

ааа

гаа

1473

тНг

гу5

5ег

РНе

5ег

Агд

ТНг

рго

61у

гуз

*

485 490 <210> 40 <211> 490 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Внеклеточный домен Ιί-22Ε?Α с лидерной последовательностью (Ра, слитый с Рс-областью тяжелой цепи гамма-1дС 2а мыши (тС2а)

- 130 015706 <400> 40

мет

Азр

А1а

мет

ьуз

Агд

61 у

ьеи

Суэ

Суз

Уа!

ьеи

Ьеи

Ьеи

Су5

61 у

1

5

10

15

А1а

Уа1

РЙе

Уа1

Зег

ьеи

зег

61 п

61 и бе

Не

НТЗ

А1а

61 и

ьеи ял

Агд

Агд

Рйе

Агд

Агд Эг

хи НТ 5

А1а

РГО

61 и

Азр ап

РГО

зег

Азр

Ьеи

ьеи л с

61 п

Нт 5

уа!

Туз

Рйе

ЭЭ 61 η

зег

зег

АЗП

Рйе

61 и

А5П

Не

ьеи

ТЙг

тгр

Азр

зег

61 у

50

55

60

РГО

61 и

61 у

Тйг

Рго

Азр

Тйг

Уа1

туг

зег

11е

61 и

туг

ьуз

ТЙГ

туг

65

70

75

80

61 у

61 и

Агд

АЗр

тгр як

уа1

А1а

Ьу5

ьуз

61 у оп

Су5

61 п

Агд

11е

Тйг ос

Агд

ьуз

5ег

суз

АЗП

о э 1_еи

тйг

УаЧ

61и

ТЙГ

б!у

Азп

Ьеи

Тйг

б!и

а Э ьеи

Туг

100

105

110

туг

А1а

Агд

Уа1

ТЙГ

А1а

Уа!

зег

А1а

61 у

61 у

Агд

зег

А1а

ТЙГ

Ьуз

115

120

125

мет

ТЙГ

Азр

Агд

Рйе

Зег

5ег

Ьеи

61 п

нтз

тйг

Тйг

ьеи

ьуз

Рго

Рго

130

135

140

АЗр

уа1

ТЙГ

Суз

Не

Зег

ьуз

уа!

Агд

зег

Не

61 п

мет

Пе

Уа1

НТЗ

145

150

155

160

РГО

ТЙГ

Рго

ТЙГ

Рго Ί Дс

11 е

Агд

А1а

61 у

А5р 17П

61 у

НТЗ

Агд

Ьеи

ТЙГ 175

Ьеи

61 и

А5р

Не

Рйе 1ЛП

хоз НТЗ

Азр

ьеи

рйе

туг 1 Ос

X/ ν нтз

Ьеи

61 и

ьеи

61 п т пп

X/ X Уа1

Азп

дгд

ТЙГ

туг

хои 61 п

мет

Нтз

ьеи

б!у

ХоЭ 61 у

ьуз

61 п

Агд

61 и

туи Туг

61 и-

Рйе

195

200

205

рйе

61 у

ьеи

ТЙГ

рго

Азр

ТЙГ

61и

Рйе

Ьеи

61 у

ТЙГ

Не

МеТ

Не

СУ5

210

215

220

Уа!

Рго

ТЙГ

тгр

А1а

ьуз

61 и

Зег

А1а

Рго

туг

мет

Суз

Агд

Уа!

Ьуз

225

230

235

240

тйг

ьеи

Рго

Азр

Агд

ТЙГ

61 у

Зег

61 у

зег

61у

5ег

61 у

Зег

61 у

Зег

245

250

255

61 у

61 и

Рго

Агд

61 у

Рго

ТЙГ

11 е

ьуз

РГО

Су 5

РГО

Рго

суэ

ьуз

суз

260

265

270

Рго

А1а

РГО

АЗП

Ьеи

Ьеи

61у

61 у

РГО

5ег

Уа1

Рйе

Не

Рйе

Рго

Рго

275

280

285

ьуз

11е

ьуз

АЗр

Уа!

ьеи

мет

Не

зег

ьеи

5ег

РГО

Не

Уа1

ТЙГ

суз

290

295

300

Уа1

Уа1

уа1

АЗр

Уа1

Зег

61и

АЗр

АЗР

РГО

АЗр

Уа1

61 п

Пе

зег

тгр

305

310

315

320

Рйе

Уа!

А5П

АЗП

Уа!

61 и

Уа!

Н15

ТЙГ

А1а

61 п

Тйг

61 п

Тйг

НТ 5

Агд

325

330

335

61 и

Азр

Туг

Азп

Зег

ТЙГ

Ьеи

Агд

Уа1

Уа!

Зег

А1а

ьеи

РГО

Не

61 п

340

345

350

НТЗ

61 п

Азр

тгр

мет

Зег

61 у

ьуз

61 и

рйе

ьуз

суз

ьуз

Уа1

АЗП

АЗП

355

360

365

ьуз

АЗР

Ьеи

Рго

А1а

РГО

Пе Ч7Ч

61 и

дгд

ТЙГ

Не

зет чял

ьуз

Рго

Ьуз

61 у

5ег

5 ί и Уа1

Агд

А1а

РГО

61 π

Э/ 7 Уа1

Туг

Уа1

ьеи

РГО

Эо у РГО

РГО

61 и

61 и

61 и

385

390

395

400

мет

тйг

ьуз

ьуз

61 п

Уа1

ТЙГ

Ьеи

ТЙГ

суз

мет

Уа1

Тйг

АЗР

Рйе

мет

405

410

415

Рго

61 и

АЗр

Пе

туг

Уа1

61 и

тгр

тйг

А5П

АЗП

61 у

ьуз

ТЙГ

61 и

ьеи

420

425

430

АЗП

туг

ьуз

А5П

ТЙГ

61 и

РГО

Уа1

Ьеи

АЗр

Зег

АЗр

61 у

Зег

туг

РЙе

435

440

445

мет

туг

5ег

ьуз

Ьеи

Агд

Уа1

б1и

ьуз

ьуз

Азп

тгр

Уа!

61 и

Агд

А5П

450

455

460

зег

туг

зег

Суз

зег

Уа!

Уа1

нтз

61 и

61 у

ьеи

нтз

АЗП

НТЗ

нтз

тйг

465

470

475

480

Тйг

ьуз

Зег

рйе

Зег

Агд

ТЙГ

РГО

61 у

Ьуз

485

490

<210> 41 <211> 1834

- 131 015706 <212> ДНК <213> Мышца <22 0>

<221> С05 <222> (43)...(1788) <400> 41

ССддСссада дссдаддссс дааддддссс сддадддасс са асд аад аса сСа 54 Мех хуэ тЬг 1_еи 1

схд асе ахс Хеи тЬг 11е 5

сед хеи

асд тЬг

дед дда есс сед дес УаТ 61у Зег хеи А1а 10

дес А1а 15

сас Нт 5

асе ТЬг

асе дед тЬг УаТ

дас Азр 20

102

аса

Хее

99*

СХС

есс

саа

сас

9*9 Уа1

ааа

ххе

сад

есс

аде

аас

ССС

дад

150

тЬг

5ег

61 у

ьеи

хеи

61 η

нтз

хуз

РЬе

61л

5ег

Зег

АЗП

РЬе

61 и

25

30

35

аас

ахс

**9

асд

хдд

дас

99* 61 у

ддд 61у

ССС

дсх

аде

асе

ССС

дас

асе

дес

198

АЗП

Не

хеи

ТЬг

тгр

Азр

Рго

А1а

зег

тЬг

Зег

Азр

тЬг

уа!

40

45

50

Хас

аде

?Й

даа

сас

аад

ааа

еас

дда 61 у

дад

ада

аад

*99

сед

дес

аад

246

туг

зег

61 и

туг

хуз

хуз

туг

б1и

Агд

хуз

Тгр

хеи

А1а

хуз

55

60

65

дед

ддс С1у

еде

сад

едд

асе

асе

сад

аад

гее

еде

аас

сед

асе

асд

9?9

294

А1а

суз

61 η

Агд

Не

тЬг

61 η

ЦУ5

РЬе

суз

АЗП

Хеи

тЬг

мех

61 и

70

75

80

асе

еде

аас

сас

асе

дад

ССС

сас

£ас

дес

аад

9*с

асд

дса

9*с

аде

342

тЬг

Агд

А5П

НТ 5

ТЬг

61 и

РЬе

туг туг

А1а

ьуз

Уа!

тЬг

А1а

уа!

5ег

85

90

95

100

дса

доа 61 у

ддс 61у

сса

сса

дес

аса

аад

асд

асе

дас

ед*

ССС

аде

сед

сед

390

А1а

РГО

Рго

Уа!

ТЬг

хуз

мех

тЬг

Азр

Агд

РЬе

5ег

зег

Хеи

105

но

115

сад

сас

асе

асе

ахс

ааа

сед

ССС

дас

д*д уа!

асе

еде

асе

ССС

ааа

«3

438

61 п

Н15

тЬг

ТЬг 120

Не

хуз

РГО

РГО

Азр 125

ТЬг

Су5

Не

Рго 130

хуз

адд

Хее

аех

сад

асд

сед

дес

сас

ССС

аса

СХС

аса

сед

дес

схс

сед

486

Агд

Зег

11е

61 п

мех

Хеи

Уа1

нтз

рго

тЬг

хеи

тЬг

Рго

Уа1

хеи

Зег

135

140

145

даа

дат

ддс

сас

сад

ста

асе

сед

дад

дад

асе

ССС

саС

дас

сед

ССс

534

61 и

АЗр

б!у

НТЗ

61л

хеи

тНг

хеи

61 и

61 и

11е

РЬе

НТ 5

АЗр

хеи

РЬе

150

155

160

хас

еде

сса

дад

схс

сас

дес

аас

сас

асе

сас

сад

асд

сас

есс

даа

582

туг

Агд

хеи

61 и

Хеи

нтз

Уа1

АЗП

нтз

ТЬг

туг

61 η

мех

НТВ

хеи

61 и

165

170

175

180

99* 61у

ааа

сад

ада

даа

хае

дад

схс

сет

ддс

сед

асе

ССС

дас

аса

дад

630

хуз

61 η

Агд

61 и 185

Туг

61 и

РЬе

хеи

61 у 190

хеи

тЬг

РГО

Азр

тЬг 195

61 и

ххе

схс

ддс бТу

есс

асе

аса

асе

хсд

асе

сед

аса

сед

есс

аад

даа

аде

678

рЬе

Хеи

зег

11е

ТЬг

И е

хеи

тНг

РГО

11 е

хеи

Зег

Хуз

61 и

Зег

200

205

210

дес

ССС

Хае

9*9 Уа!

Сде

еда

9*9 уа!

аад

асд

сед

ССС

дас

едд

асд

*дд

дес

726

А1а

Рго

туг

Суз

Агд

Хуз

тЬг

хеи

Рго

АЗр

а (9

тЬг

тгр

А1а

215 220 225

- 132 015706

гас гсс туг 5ег

ггс рЬе

гсд ддс дсс

дгд Уа1 235

сгс ггг гсс агд ддг

ггс РЬе

сгс дгс

9?с 61 у

774

Бег 61у

А1а

геи

рпе

Бег

Мег

61 у 240

геи

Уа1

230

ггд

сгс

гдг

гаг

егд

ддс

гас

ааа

гас

аге

асе

аад

сса

ссг

дга

ссг

822

геи

геи

су®

туг

геи

61у

Туг

гуз

туг

11е

ТЬг

гуз

РГО

РГО

Уа1

РГО

245

250

255

260

ссг

аас

гсс

егд

аас

дгс

саа

ед!

дгс

егд

асе

ггг

саа

ссс

сга

сдс

870

Рго

АЗП

Бег

геи

АЗП

Уа1

61 η

Агд

Уа1

геи

тЬг

рЬе

61 п

РГО

геи

Агд

265

270

275

ггс

аге

саа

даа

сас

дга

егд

аге

ссг

дгс

ггд

дас

сгс

адг

ддс бТу

ССС

918

РЬе

11 е

61 η

61 и

Н13

уа!

геи

Не

РГО

Уа1

геи

АЗр

геи

Бег

РГО

280

285

290

аде Бег

ад! Бег

егд геи

ссг РГО

сад с! η

ссс РГО

аге Не

сад 61 п

гас туг

гсс Бег

саа 61л

дгд уа!

ρΐα дгд Уа1 Уа1

гсг Бег

ддд 61 у

966

295

300

305

ССС

адд

дад

ссг

ссг

дда 61у

дсг

гдд

едд

сад

аде

егд

гсг

дас

сгс

1014

РГО

Агд 310

61 и

РГО

РГО

А1а 315

Тгр Агд

61η

Бег 320

геи

Бег

Авр

геи

асе

гас

д!а

999

сад

гса

даг

дгс

ГСС

аге

егд

саа

ссг

асе

аас

дтд Уа1

1062

тЬг

Туг

Уа1

61у

61 η

Бег

А5р

уа1

Бег

11 е

геи

61 η

РГО

ТЬг

А5П

325

330

335

340

сса

дсг

сад

сад

аса

егд

гсс

сса

сса

гсс

гас

дсг

ссд

аад

дсг

дгс

1110

РГО

А1а

61 η

61 п

ТЬг

геи

Бег

РГО

Рго

Бег

туг

А1а

РГО

гуз

А1а

Уа1

345

350

355

сст Рго

дад дгс сад

ссс ссг гсс гас

дед ссг

сад дга дсс

гсд Бег 370

дат дсс

1158

61 и

Уа1 <31 п 360

РГО

рго Бег Туг

А1а 365

РГО

61 η

Уа1

А1а

Азр

А1а

ааа

дсг

егд

ггс

гас

сса

сса

саа

сад

999

агд

аад

асе

адд

ссг

дсс

1206

ЬУ5

А1а

геи 375

РЬе

туг

Бег

Рго

61 η 380

61 η

б!у

мес

гу5

тЬг 385

Агд

Рго

А1а

асе

гаг

дас

ссд

сад

дас

аСС

ссд

дас

аде

где

ссг

дсг

гсг

гаг

дсг

1254

ТЬг

Туг АЗр

рго

61 η

Азр

11е

геи

Авр

Бег

СУ5

РГО

А1а

Бег

ту Г

А1а

390

395

400

дгд Уа1

гдг

дгд УаТ

даа

дас

гсг

9?с

ааа

дас

гсг

асе

сса

ддс 61у

аге

сгс

гсс

1302

суз

61 и

АЗр

Бег

б1у

гуз

А5р

Бег

ТЬг

РГО

И е

геи

Бег

405

410

415

420

асг

ссс

ааа

гас

сСс

аад

аса

ааа

ддс

сад

ССС

сад

даа

дас

аса

егг

1350

тЬг

РГО

1-У5

туг

геи

гуз

тЬг

Суз

61у

61п

геи

61л

б!и

Азр

тЬг

геи

425

430

435

дгг

ада

аде

гдг

ссс

сса

999

дас

егг

гсг

сга

сад

ааа

дгс

асе

гсс

1398

Уа1

Агд

Бег

суз

геи

РГО

61 у

Азр

геи

Бег

геи

61 η

гуз

Уа1

тЬг

Бег

440

445

450

сга

ддг

даа

ддд

вад

аса

сад

ада

сса

ааа

гса

сгс

ссс

гса

ссг

егд

1446

геи

61 у

61 и

61у

61 и

тЬг

61 η

Агд

РГО

суз

Бег

геи

РГО

Бег

РГО

геи

455

460

465

дда

ггг

где

аса

дас

ада

дда

ссг

дас

егх

сас

аса

«д

сдс

адг

9?д

1494

61 у

рЬе 470

Су 5

ТЬг

Азр

Агд

61 у 475

Рго

Авр

геи

нтз

ТЬг 480

геи

Агд

Бег

61 и

даа

сса

дад

аса

сса

едд

гас

егд

аад

999

дед

егд

гсг

с! с

егд

гсс

1542

61 и

РГО

61 и

тЬг

РГО

Агд

Туг

геи

суз

61 у

А1а

геи

Бег

геи

геи

Бег

485 490 495 500

- 133 015706

ТСТ Зег

дед сад атс дад

ддс 61у

сас Н15

сст дсс есс стс сст

ттд геи

сас Н1 5

дтс Уа1 515

сас НТ 5

1590

Уа! 61 η И е

61 и 505

РГО

Уа!

Зег 510

Геи

Рго

ТСТ

дсс

сса

еде

гсс

ссс

хса

дас

дад

дда

сса

адт

ссс

едд

ддс 61у

сед

1638

5ег

Уа1

Зег

суз

зег

Рго

зег

Азр

61 и

61у

РГО

Зег

РГО

тгр

геи

520

525

530

стд

дас

Ссс

ест

Й1

еде

сса

аад

дас

дад

90ΐ б1у

ссс

дед

дтс

дад

асе

1686

Геи

А5р

Зег

Геи

Суз

РГО

гуз

Азр

61 и

Рго

А1а

уа!

61 и

тЬг

535

540

545

дад

дсс

атд

Где

ссс

адт

дсх

дса

дсс

ссс

дад

стд

дад

сад

Ссс

аса

1734

61 и

А1а

мет

Суз

РГО

Зег

А1а

А1а

А1а

Зег

61 и

Геи

61 и

61 η

Зег

ТЬг

550

555

560

даа

стд

дас

тсс

Οΐΐ

тсс

ааа

ддс

ссд

дсс

сед

аст

дед уа!

сад

едд

даа

1782

61 и

геи

А5Р

зег

|_еи

РЬе

ьуз

61 у

геи

А1а

геи

тЬг

61 η

Тгр

61 и

565

570

575

580

тсс тда адддадагсд дадсаадсад дсстаадттт ссесссдссс сасста 1834 бег * <210> 42 <211> 581 <212> Белок <213> Мышца

<40'

0> 4,

2

Мес

гуз

ТЬг

геи

геи

ТЬг

Не

геи

тЬг

Уа1

с1у

Зег

геи

а! а

А! а

НТ 5

1

5

10

15

ТЬг

ТЬг

Уа1

Азп

ТЬг

Зег

61 у

Геи

Геи

61 π

НТ 5

Уа!

гуз

рЬе

61П

зег

20

25

30

5ег

АЗЛ

рЬе

61 и

АЗЛ

1!е

геи

ТЬг

тгр

Азр

61 у

С1у

РГО

А1а

Зег

тЬг

35

40

45

Зег

Азр

тЬг

Уа!

Туг

5ег

Уа!

61 и

Туг

Гуз

гуз

туг

61 у

61 и

Агд

гуз

50

55

60

Тгр 6е;

Геи

а! а

гуз

А1а

61 у 70

суз

61 п

Агд

11 е

тЬг 7ζ

б!п

гуз

РЬе

Суз

АЗП ЯЛ

геи

тЬг

мег

61 и

тЬг ОС

/ и Агд

АЗЛ

НТ 5

ТЬг

61 и оп

/ Э рЬе

туг

туг

А1а

гуз ок

Уа1

ТЬг

А1а

Уа1

Зег т пл

о> а! а

61 у

61 у

Рго

Рго т ля

уи Уа1

тЬг

гуз

мес

ТЬг 11 Л

Азр

Агд

рЬе

Зег

Зег

хии Геи

61 п

НТ 5

тЬг

тЬг

хи х Не

1У5

Рго

Рго

АЗр

ίΧν уа!

тЬг

Суз

115

120

125

11 е

Рго

гуз

Уа1

Агд

зег

Не

61 π

мес

Геи

Уа!

НТ 5

РГО

ТЬг

Геи

ТЬг

130

135

140

рго

Уа!

Геи

5ег

61 и

Азр

61 у

нтз

61 п

Геи

тЬг

Геи

61 и

61 и

Не

РЬе

145

150

155

160

НТВ

Азр

Геи

РЬе

Туг

Агд

Геи

61 и

Геи

Нт 5

Уа1

АЗП

нт 5

тЬг

туг

б! п

165

170

175

мес

Нт 5

Геи

61 и

61 у

Гуз

61 п

Агд

61 и

Туг

61 и

РЬе

геи

61 у

Геи

тЬг

180

185

190

рго

Азр

ТЬг

61 и

рЬе

Геи

61 у

Зег

11 е

ТЬг

Не

геи

тЬг

РГО

11 е

геи

195

200

205

Зег

гуз

61 и

зег

А1а

Рго

туг

Уа!

Суз

Агд

Уа1

1-У5

тЬг

геи

Рго

дзр

210

215

220

Агд

тЬг

тгр

А1а

туг

Зег

РЬе

Зег

61 у

А1а

Уа1

геи

РЬе

зег

Мег

с!у

225

230

235

240

РЬе

геи

уа!

61 у

геи 245

геи

суз

туг

геи

61у 250

туг

гуз

Туг

Не

ТЬг

гуз

рго

Рго

Уа1

Рго

Рго

Азп

Зег

геи

Азп

ναΊ

61 п

Агд

Уа!

геи

ТЬг

РЬе

260

265

270

б1л

рго

геи

Агд

рЬе

11 е

61 п

61 и

нт 5

уа1

геи

Не

РГО

уа!

геи

Азр

275

280

285

ьеи

Зег

61 у

Рго

5ег

5ег

Геи

рго

61 п

РГО

11е

61 п

туг

Зег

61л

уа!

- 134 015706

	290
уа!	Уа1	Зег	61 у	РГО
305			тЬг 77с
Ьеи	Зег	Азр	Ьеи
Рго	тЬг	АЗЛ	Уа1	РГО
			340
Рго	ьуз	А1а э ГС	Уа1	РГО
А1а	зег	3 3 □ А$р	А1а	ьуз

370

ТЬг Агд Рго А1а тЬг 385

А1а Зег Туг А1а Уа1

405 у 11е ьеи Зег ТЬг 420 и Аар ТНг Ьеи Уа1

435 ьуз Уа1 тЬг Зег ьеи 450 рго Зег Рго Ьеи С1у

465 ьеи Агд зег 61 и 61 и

485 зег Ьеи ьеи Зег зет 500

Ьеи Н15 Уа! нтз Зег 515

Рго тгр 61у ьеи ьеи 530

А1а Уа! 61 и тЬг 61 и 545 с!и 61 η Зег ТЬг с1и

565

Уа! 61п тгр 61 и зег

580

295

Агд 61 и

310

Туг Уа1

А1а 61п и Уа1

А1а ьеи

375 Туг АЗр

390

Суз Уа1

Рго ьуз

Агд зег

61у 61 и

455 РЬе суз 470 рго 61и

Уа1 61 η

Уа1 Зег

Азр 5ег

535

А1а Мех 550 ьеи Азр

300

РГО	Рго	61 у	А1а	Уа1	Тгр	Агд	б1п	5ег
		315			320
61 у	61 п	Зег ээп	АЗР	Уа1	Зег	Не	ьеи	61 п
61 п	ТЬг	ьеи	зег	Рго	Рго	Зег	777 Туг	А1а
	345					350
61 η	Рго	РГО	Зег	туг	А1а	РГО	61 п	Уа1
360				365
рЬе	Туг	зег	Рго	б1п	61л	С1у	мех	ьуз
			380
РГО	61 η	АЗр	11е	ьеи	АЗр	Зег	Суз	рго
		395			400
61 и	Азр	5ег ДТП	61 у	ьуз	Азр	Зег	ТЬг 41 8	Рго
Туг	ьеи 478	*+ιυ ьуз	тЬг	ьуз	61 у	61л	ьеи	61л
Су5	ьеи	Рго	61 у	Азр	ьеи	Зег	ьеи	61л
440				445
61 у	61 и	тЬг	61 η	Агд	РГО	Ьуз	Зег	Ьеи
			460
ТЬг	Азр	Агд	61 у	РГО	АЗр	Ьеи	нтз	тЬг
	475				480
тЬг	рго	Агд ДОП	туг	ьеи	ьуз	61 у	А1а доз	ьеи
Не	61 и	61 у	нтз	рго	Уа1	Зег	•»37 Ьеи	рго
	505				510
Суз	Зег	РГО	зег	АЗр	61 и	61 у	РГО	5ег
520				525
Ьеи	Уа!	Су5	РГО	ьуз слА	Азр	61 и	61 у	Рго
Суз	РГО	5ег	А1а	эчи А! а	д1а	Зег	61 и	ьеи
		555					560
Зег	Ьеи	РЬе	ьуз	61 у	ьеи	А1а	ьеи	тЬг

570 575 <210> 43 <211> 660 <212> ДНК <213> Человек <220>

<221> СОЗ <222> (1)...С660)

<400> 43

ахд мех 1

дед хдд адх ехх

999 61 у

аде Хдд ехд дох ддс хде ехд ехд

дед Уа1 15

Хса Зег

А1а

Тгр

5ег ьеи 5

Зег

Тгр

Ьеи

б!у 10

61 у

Суз

ьеи ьеи

дса

ххд

дда оТу

ахд

дха

сса

ест

ссс

даа

аах

дхс

ада

ахд

аах

хсх

д«

А1а

ьеи

мех

Уа1

РГО

рго

Рго

С1и

АЗП

уа!

лгд

мех

А5П

5ег

Уа!

20

25

30

аах

ххе

аад

аас

ахх

сха

сад

Хдд

дад

хса

ССХ

9СХ

XXX

дес

ааа

999

АЗП

рЬе

Тз

А5П

11е

ьеи

61 п

Тгр 40

61 и

зег

рго

А1а

РЬе 45

А1а

ьуз

сТу

аас

ехд

асх

ххе

аса

дсх

сад

хае

сха

адх

хах

адд

аха

ххе

саа

дах

АЗП

ьеи

тЬг

РЬе

тЬг

А1а

61П

Туг

Ьеи

Зег

туг

Агд

11е

рЬе

61 п

Азр

50

55

60

ааа

хде

ахд

аах

асх

асе

«9

асд

даа

еде

дах

ххе

тса

адх

ехх

Хсс

ьуз

Суз

Мех

АЗП

тЬг

тЬг

ьеи

тЬг

61 и

Суз

Азр

РЬе

Зег

зег

Ьеи

Зег

70 75 80

144

192

240

- 135 015706

аад

еае

дде

дас

сас

аес

еед

ада

дтс

адд

дсе

даа

еее

дса

дае

дад

288

ьуз

Туг

еТу

Азр

Нтз 85

ТЬг

иеи

Агд

Уа1

А1а

61 и

РЬе

А1а

Азр 95

61 и

сае

еса

дас

едд

деа

аас

аес

асе

еее

тдт

ссе

дтд

дае

дас

асе

аес

336

НТ 5

5ег

А5р

тгр 100

νβΐ

АЗП

Не

ТЬг

РЬе 105

суз

Рго

Уа1

АЗр

Азр 110

ТЬг

11 е

аее 11 е

дда б1у

ссс Рго

ссе РГО

дда б!у

аед мее

саа 61 п

деа Уа1

даа 61 и

деа Уа1

сее иеи

дае Азр

дае Азр

есе зег

ееа иеи

сае НТ 5

384

115

120

125

аед

еде

еее

ееа

дсс

ссе

ааа

аее

дад

аае

даа

гас

даа

асе

едд

асе

432

мее

Агд

РЬе

иеи

А1а

РГО

1-У5

Не

61 и

А5П

61 и

туг

61 и

ТЬг

тгр

ТЬг

130

135

140

аед

аад

аае

дед

гае

аас

еса

ΐ90

асе

еае

аае

дед

саа

еас

тдд

ааа

480

мее

иуз

АЗП

Уа1

туг

Азп

Бег

тгр

ТЬг

туг

АЗЛ

Уа1

61 п

туг

тгр

иуз

145

150

155

160

аас

39*

асе

дае

даа

аад

еее

саа

аее

асе

ссс

сад

еае

дас

еее

дад

528

А5П

бгу

ТЬг

Азр

61 и

иуэ

РЬе

61 п

11 е

ТЬг

РГО

61 п

туг

А5Р

РЬе

61 и

165

170

175

дес

сес

ада

аас

сед

дад

сса

едд

аса

асе

еае

еде

д«

саа

9«

еда

576

Уа1

иеи

Агд

АЗП 180

иеи

б!и

рго

тгр

тЬг 185

тЬг

туг

суз

Уа1

61 п 190

уа!

Агд

ддд

еее

сее

ссе

дае

едд

аас

ааа

дсе

ддд

даа

едд

аде

дад

ссе

дес

624

61 у

рНе

1_еи

Рго

А5р

Агд

Азп

иуз

А1а

61у

61 и

Тгр

зег

61 и

Рго

Уа1

195

200

205

еде

дад

саа

аса

асе

сае

дас

даа

аед

дтс

ссс

есс

660

суз

61 и

61 п

тНг

ТЬг

НТ 5

Азр

61 и

тЬг

Уа1

Рго

Зег

210

215

220

<210> 44 <211> 220 <212> Белок <213> Человек <400> 44

мее

А1а

тгр

эег

сеи

61 у

Зег

тгр

иеи

61 у

61 у

суз

иеи

иеи

Уа1

Зег

1

5

10

15

А1а

1_еи

61 у

мее

Уа1

РГО

рго

Рго

61 и

А5П

Уа1

лгд

мее

АЗП

5ег

Уа1

20

25

30

Азп

РЬе

иуз

АЗП

Не

иеи

61 п

тгр

61 и

Зег

РГО

А1а

РЬе

А1а

иуз

61 у

35

40

45

АЗП

иеи со

ТЬг

РЬе

ТЬг

А1а

61 п сс

туг

иеи

Зег

туг

Агд АП

11е

РЬе

61 п

А5р

иуз

Суз

мее

АЗП

тЬг

ТЬг

X х иеи

тЬг

61 и

Суз

А$р

ои РЬе

Зег

5ег

иеи

Зег

65

70

75

80

1_уэ

Туг

61 у

Азр

Нтз

ТЬг

иеи

Агд

Уа1

Агд

А1а

61 и

рЬе

А1а

Азр

61 и

85

90

95

Нтз

Зег

Азр

тгр тпп

Уа1

АЗП

11 е

тЬг

рЬе 1 ле

суз

РГО

Уа!

А5р

Азр ιιλ

ТЬг

Не

Не

б!у

РГО

хи и Рго

61 у

мет

61 п

Уа1

хиэ 61 и

Уа1

иеи

Азр

Азр

Зег

иеи

нтз

115

120

125

МеТ

Агд

РЬе

иеи

А1а

РГО

иуз

11 е

б1и

Азп

61 и

Туг

с! и

ТЬг

Тгр

тЬг

130

135

140

Мес

еу=

Азп

Уа1

туг

АЗП

зег

Тгр

тЬг

туг

АЗП

Уа!

61л

туг

тгр

иуз

145

150

155

160

А5П

61 у

тЬг

Азр

61 и ή св

Ьуз

РЬе

с! п

Не

тЬг 1 7П

РГО

61 п

туг

Азр

рЬе

61 и

Уа1

иеи

Агд

Азп

ХОЭ Ьеи

61 и

Рго

тгр

тЬг

X/ ν тЬг

туг

суз

Уа!

61 п

X/ 3 Уа1

Агд

180

185

190

- 136 015706 у РЬе Геи Рго

195 суэ 61 и 61п ТНг 210

АЗр

ТЬг лгд

НТ 5

АЗП

АЗр

215

СУ5

200 и

А1а

ТЬг у

Уа1 и

РГО тгр зег

220

Зег

205 и

рго уа!

<210> <211> <212> <213>

199

Белок Человек <400> МеТ

АЗП

Уа1

Рго

Рго

РЬе

АЗП

АЗр 05 Тгр

Рго геи

Уа1

Азр

145

А5П

Рго

ТЬг

Не геи тЬг

ТЬг нтз

А1а

ТЬг

ТЬг

Уа1

А5П у

А1а

Туг

130 и

геи

Азр тЬг мет

Рго

115

А5П

Ьуз и

Агд

Нтз

195

61П п

Геи геи

Не п

100 гуз

РГО 5 тгр туг тЬг и

А5П

Уа1

Агд и

зег

РГО мет

РЬе

А5Л зег

Уа1

А5П

Геи и

Зег суз

Агд туг

АЗр

А1а

Агд 11 е

РЬе зег

А1а у

РЬе

Зег η

А5Р

Зег

А5П гуз ₽Ье цеи суз гуз тЬг мег гуз

Агд Уа1

ТЬг РЬе

Уа1 61 и уа!

А1а и РЬе

Су5

Рго геи

11е 61 и Азп

Зег Тгр ТЬг Туг

135

РЬе 61 п Не ТЬг 150 рго тгр тЬг тЬг 165 гуз А1а

АЗП

180

Азр у

С1и ТЬг

Уа1 и

120 Азп

Рго туг б1и уа! Аэр 90

А1а Азр

105

Туг 61 и

Уа1 61 п

61п туг

Суз Уа1

170 тгр зег 185

А1а

А5р

Зег

ТЬг

Туг

Азр

155 п

и

Геи

Азр 61 и Нтз

ТЬг Не Не геи нтз мет

110 тгр ТЬг мет 125

Тгр Гу5 А5П

140

РЬе 61 и Уа1

Уа1 Агд 61 у рго Уа1 суз

190

Туг у

Зег у

Агд

АЗр рго

РЬе

ЬУ5

АЗП у

тЬг геи

РЬе

175 и

π <210> 46 <2И> 211 <212> Белок <213> Человек <400> 46

Зег

Азр

А1а

Н1 5

61 у

ТЬг

61 и

геи

РГО

зег

РГО

РГО

Зег

Уа1

Тгр

РЬе

1

5

10

15

61 и

А1а

61 и

рНе

РЬе

нтз

нтз

Не

геи

НТ 5

Тгр

ТЬг

Рго

Не

Рго

АЗП

20

25

30

61 п

зег

61 и

Зег

ТЬг

Суз

туг

61 и

уа1

А1а

геи

геи

Агд

туг

61 у

11 е

35

40

45

61 и

5ег СП

Тгр

АЗП

Зег

11 е

Зег СС

Азп

Суз

5ег

61 п

тЬг сл

Геи

5ег

туг

АЗр

геи

тЬг

А1а

Уа1

ТЬг

геи

Азр

геи

туг

НТЗ

Зег

ои АЗП

61 у

туг

Агд

А1а

65

70

75

80

Агд

Уа1

Агд

а! а

Уа1 яс

Азр

61 у

Зег

Агд

НТ 5 ол

Зег

АЗЛ

Тгр

тЬг

Уа1 ос

ТЬг

Азп

ТЬг

Агд

рЬе

ОД 5ег

уа1

Азр

61 и

Уа1

тЬг

геи

ТЬг

Уа1

С1у

УД Зег

уа!

100

105

110

А5П

1_еи

с! и

11 е

Нтз

Азп

61 у

РЬе

Не

геи

61 у

гуз

11 е

61 π

Геи

РГО

115

120

61 и

125

Агд

РГО

гуз

мет

А1а

РГО

А1а

АЗП

Азр

ТЬг

Туг

Зег

Не

РЬе

Зег

130

135

140

нтз

рЬе

Агд

61 и

Туг

61 и

Не

А1а

Не

Агд

гуз

уа!

Рго

61 у

АЗП

РЬе

145

150

155

160

ТЬг

РЬе

ТЬг

Нтз

Гуз

Гуз

Уа1

Гуз

НТЗ

61 и

Азп

РЬе

Зег

ьеи

Геи

ТЬг

1Б5

170

175

- 137 015706

бег

61 у

61 и

Уа1

61 у

61 и

РНе

суз

Уа1

61 п

Уа1

Гуз

РГО

бег

Уа!

А1а

180

185

190

бег

Агд

бег

Азп

Суз

61 у

Μθΐ

тгр

бег

гуэ

61 и

61 и

суз

Не

бег

Геи

195

200

205

тНг

Агд

61 η

210

<210> 47 <211> 201 <212> Белок <213> Человек <400> 47

Азр

61 и

Уа1

А1а

Не

геи

РГО

А1а

РГО

61 п

АЗП

Сеи

бег

Уа!

Сеи

бег

1

5

10

15

ТНг

А5П

мес

гуз

НТ 5

геи

сеи

мес

Тгр

бег

РГО

уа1

11е

А1а

РГО

61 у

20

25

30

61 и

тЬг

Уа!

туг

туг

бег

Уа1

61 и 40

Туг

61 η

61 у

61 и

туг

61 и

бег

сеи

туг

тЬг

бег

НТВ

Н е

Тгр

Не

РГО

бег

бег

тгр

су 5

*гЗ бег

сеи

тНг

61 и

50

55

60

61 у

Рго

61 и

Су5

АЗр

уа1 7Л

тНг

АЗР

Азр

И е

ТНг

А1а

тЬг

уа!

РГО

туг ЯП

V Э АЗП

геи

Агд

уа!

Агд

/V А1а

ТНг

сеи

61 у

бег

( 3 б1п

ТНг

бег

А1а

тгр

ои бег

85

90

95

11е

геи

суз

НТ 5

Рго

рНе

АЗП

Агд

АЗП

бег

тНг

Не

сеи

ТЬг

Агд

Рго

100

105

но

61 у

мес

61 и

11е

ТНг

гуз

Азр

б!у

РНе

нт 5

сеи

Уа!

Не

61 и

Сеи

б!и

115

120

125

Азр

Геи Т5Л

61 у

Рго

61 η

РНе

61 и 1ЭЕ

РНе

Сеи

Уа!

А1а

туг 140

тгр

Агд

Агд

61 и

РГО

±зи 61 у

А1а

61 и

61 и

НТЗ

±3 3 Уа1

суз

мес

Уа!

Агд

бег

61 у

61 у

Не

Рго

145

150

155

160

Уа1

ΗΪ5

Геи

61 и

ТНг

Мес

61 и

Рго

61 у

А1а

А1а

Туг

Суз

Уа1

СУ5

А1а

165

170

175

61 η

тНг

рЬе

Уа1

гуз

А1а

11е

О1у

Агд

туг

бег

А1а

₽Не

бег

61 п

тНг

180

185

190

61 и

суз

уа1

61 и

Уа!

61 η

61 у

61 и

А1а

195 200 <210> 48 <211> 68 <212> Белок <213> Мышца <400> 48 нт5 тНг тНг Уа1 Азр тЬг бег б1у сеи геи 61η Нтэ уа! гуз РНе 61η 15 1015 бег бег Азл рНе С1и Азп Не сеи тЬг тгр А5р б1у С1у Рго А1а бег 20 2530 тНг бег Азр тНг Уа1 туг бег Уа1 С1и туг гуз гуз туг б!у б1и Агд 35 4045

Гуз тгр сеи А1а гуз А1а 61у Суз 61п Агд 11е тНг 61η гуз РНе Суз 50 5560 азп Геи ТЬг мег <210> 49 <211> 26 <212> Белок <213> Мышца <400> 49

С1и ТНг Агд Азп нтз ТНг С1и РНе Туг туг А1а Гуз Уа1 ТНг А1а Уа! 15 10 15

- 138 015706

Бег А1а 61у 61у рго рго Уа1 тНг Ьуз мет

25 <210> 50 <211> 28 <212> Белок <213> Мышца <400> 50 тЬг Азр Агд РНе 5ег Зег Ьеи 61п нтз тНг ТНг 11е ьуз Рго Рго Азр 1 5 10 15

Уа1 ТНг суз Не Рго Ьуз Уа1 Агд 5ег Не 61η мет

25 <210> 51 <211> 40 <212> Белок <213> Мышца <400> 51

Ьеи

Уа1

НтЗ

РГО

ТНг

Ьеи

ТНг

РГО

Уа1

ьеи

Зег

61 и

АЗр

б1у

НТ 5

61 п

1

5

10

15

Ьеи

тНг

ьеи

61 и

61 и

Не

РНе

нт 5

Азр

Ьеи

РНе

Туг

Агд

Ьеи

61и

Ьеи

20

25

30

НТЗ

Уа1

Азп

Ηί 5

ТНг

туг

61 п

мет

35

40

<210> 52 <211> 50 <212> Белок <213> Мышца <400> 52

нт 5

Ьеи

61 и

61 у

ьуз

61 п

Агд

61 и

Туг

61 и

РНе

ьеи

61 у

Ьеи

ТНг

Рго

1

5

10

15

АЗр

ТНг

61 и

РНе

Ьеи

61 у

Зег

Не

тНг

11 е

Ьеи

ТНг

Рго

Не

ьеи

Зег

20

25

30

ьуз

61 и

зег

А1а

РГО

туг

Уа1

Суз

Агд

Уа1

ьуз

тНг

Ьеи

Рго

Ьеи

Уа1

35

40

45

Рго Агд <210> 53 <211> 70 <212> Белок <213> Мышца <400> 53

НТ 5

Ьеи

61 и

61 у

ьуз

61 п

Агд

61 и

Туг

61 и

РНе

ьеи

61 у

Ьеи

ТНг

рго

1

5

10

15

Азр

тНг

61 и

РНе

НТ 5

Ьеи

б1и

61 у

ьуз

61 п

Агд

б1и

Туг

61 и

рНе

ьеи

20

25

30

61 у

ьеи

ТНг

Рго

А5р

ТНг

61 и

РНе

ьеи

61 у

Зег

Не

ТНг

Не

Ьеи

тНг

35

40

45

РГО

Не

Ьеи

5ег

ьуз

61 и

5ег

А1а

РГО

Туг

Уа1

Суз

Агд

Уа1

ьуз

тНг

50

55

60

ьеи

Рго

Ьеи

Уа1

Рго

Агд

65

70

<210> 54 <211> 46 <212> Белок <213> Мышца

- 139 015706 <400> 54

бЧи

тЬг

Агд

АЗП

НТ5

ТЬг

бЧи

РЬе

Туг

Туг

АЧа

гуэ

УаЧ

тЬг

АЧа

УаЧ

1

5

10

15

зег

АЧа

бЧу

64 у

бЧи

ТЬг

Агд

А5П

НТЗ

тЬг

бЧи

РЬе

туг

туг ЧП

АЧа

гуз

УаЧ

ТЬг

АЧа

ди УаЧ

Зег

АЧа

бЧу

бЧу

ί. 3 РГО

Рго

УаЧ

ТЬг

гуз

зи мег

35

40

45

<210> 55 <211> 48 <212> Белок <213> Мышца <22О>

<221> Вариант <222> 6, 11, 13, <223> Хаа = любая аминокислота <400> 55

тЬг

Азр

Агд

РЬе

зег 5

хаа

геи

61л

НТ 5

ТЬг 1 о

хаа

Не

хаа

РГО

Хаа

Азр

хаа

хаа

хаа

14 е

тЬг

Азр

Агд

рЬе

зег

Зег

геи

бЧп

НТ 5

ТЬг

ТЬг

13 е

20

25

30

гуз

Рго

Рго

Азр

УаЧ

ТЬг

Суз

14 е

Рго

ЬУ5

УаЧ

Агд

Зег

Не

сЧп

мег

35

40

45

<210> 56 <211> 92 <212> Белок <213> Человек

<400> 51

5

рго

сЧи

АЗр

рго

зег

АЗр

геи

геи

сЧп

нт 5

УаЧ

гуз

РЬе

бЧп

Зег

Зег

1

5

10

15

АЗП

РЬе

бЧи

АЗП

Не

геи

ТЬг

Тгр

Азр ЭС

5ег

бЧу

РГО

61 и

бЧу

тЬг

рго

А5р

ТЬг

УаЧ

Αν туг

5ег

Не

бЧи

туг

Д 3 гуз

ТЬг

Туг

сЧу

бЧи де

зи Агд

АЗр

Тгр

УаЧ

АЧа ел

□ 3 ьуз

гуз

бЧу

Су 5

63 η с€

Агд

1Че

ТЬг

Агд

гуз

чэ £ег

суз

АЗП

геи

ТЫ

зи УаЧ

бЧи

ТЬг

63 у

А5П

33 Ьеи

ТЬг

61 и

геи

Туг

ои Ту Г

А1а

Агд

УаЧ

тЬг

65

70

75

80

АЧа

УаЧ

Зег

АЧа

63 у

63 у

Агд

зег

АЧа

ТЬг

гуз

Мег

85

90

<210> 57 <211> 28 <212> Белок <213> Человек <400> 57

ТЬг Азр Агд РЬе 5ег 5ег геи бЧп Нтз тЬг ТЬг геи гуз рго рго А5р 1 5 10 15

УаЧ ТЫ Суэ Не Зег гуз УаЧ Агд Зег 11е бЧл мет

25 <210> 58 <211> 40 <212> Белок <213> Человек <400> 58

Не Уа1 Н15 рго ТЬг Рго тЬг рго Не дгд А1а бЧу Азр сЧу нтз Агд

- 140 015706

1015 кеи ТЬг ίβιι <з1и А5р Не РЬе нтз Азр кеи РЬе туг нтз Беи б1и Беи 20 2530

61л Уа1 А5П Агд ТЬг Туг С1л МеТ

3540 <210> 59 <211> 25 <212> Белок <213> Человек <400> 59

Нтз Кеи б1у б1у 1	куз	С1п	Агд	61 и	туг	61 и РЬе РЬе 61у кеи 10	ТЬг РГО 15
Азр тЬг 61 и рЬе 20	Кеи	61 у	тЬг	Не	мет 25
<210>	60
<211>	14
<212>	Белок
<213>	Человек
<400>	60
11е Суз Уа1 рго	тЬг	тгр	А1а	куз	61 и	Зег А1а Рго туг мет
1		5			10
<210>	61
<211>	12
<212>	Белок
<213>	Человек
<400>	61
Суз Агд Уа1 куз	тЬг	кеи	Рго Азр	Агд	тЬг тгр тЬг
1		5				10

<210> 62 <211> 212 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Растворимый рецептор И-22КА мыши с сайтом расщепления (Беи Х/аI Рго Агд), оставшимся у С-конца <400> 62

ΗΪ5

тЬг

тЬг

Уа1

А5р

ТЬг

5ег

61 у

кеи

Кеи

61 п

НТ 5

Уа1

куз

РЬе

61 п

1

5

10

15

Зег

зег

АЗП

РЬе

61 и

АЗП

Не

Кеи

ТЬг

тгр

А5р

61 у

61 у

РГО

А1а

зег

ТЬг

20

25

30

5ег

Азр ΐΚ

тЬг

Уа1

туг

зег

Уа1 40

61 и

туг

куз

куз

туг

61 у

61 и

Агд

цуз

Тгр ЧП

Кеи

А1а

куз

А1а

61 у ЕС

суз

61 п

Агд

Не

ТЬг АЙ

61 п

куэ

рЬе

Суз

АЗП

ьеи

ТЬг

мет

б!и

ТЬг

□ О Агд

Азп

Нт 3

тЬг

61 и

РЬе

Туг

туг

А1а

куз

65

70

75

80

Уа1

тЬг

А1а

Уа1

Зег

А1а

61 у

61 у

РГО

РГО

Уа1

ТЬг

куз

мет

ТЬг

АЗР

85

90

95

Агд

Рбе

5ег

зег

Кеи

61 п

Нт 5

ТЬг

ТЬг

Не

куз

РГО

Рго

Азр

νβΐ

ТЬг

100

105

110

Суз

Не

РГО

ьуз

Уа1

Агд

зег

Не

61 п

мет

кеи

Уа1

нтз

Рго

тЬг

кеи

115

120

125

ТЬг

РГО

Уа1

Кеи

Зег

61 и

АЗр

61 у

нтз

61 п

Кеи

тЬг

Кеи

61 и

61 и

Не

130

135

140

РЬе

НТ 5

Азр

ьеи

Р1те

туг

Агд

кеи

61 и

кеи

НТЗ

Уа1

АЗП

НТ 5

ТЬг

Туг

145

150

155

160

61 п

мет

НТ 5

кеи

61 и

61 у

куз

61 п

Агд

61 и

туг

61 и

РЬе

Кеи

61 у

Ьеи

165

170

175

тЬг

рго

Азр

ТЬг

61 и

рЬе

кеи

61 у

Зег

11 е

тЬг

11е

кеи

тЬг

Рго

Не

180

185

190

Кеи

5ег

куз

61 и

5ег

А1а

РГО

туг

Уа1

суз

Агд

Уа1

куз

тЬг

кеи

Рго

195

200

205

кеи

Уа1

Рго

Агд

210

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (15)

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые экспрессируются гибридомой, выбранной из группы, состоящей из:

a) гибридомного клона 280.46.3.4 АТСС РТА - 6284;

b) гибридомного клона 281.73.49.1.1 АТСС РТА - 6285;

- 141 015706

с) гибридомного клона 283.4.1.2 АТСС РТА - 6287;

б) гибридомного клона 283.52.5.4 АТСС РТА - 6311 и

е) гибридомного клона 283.108.2.3 АТСС РТА - 6286, где указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент связываются с ГЬ-22КА полипептидом, в частности с 8ЕЦ ГО N0: 2 или 8ЕЦ ГО N0: 3.

2. Гуманизированное антитело, полученное из антитела по п.1, где указанное гуманизированное антитело связывается с 8ЕЦ ГО N0: 2 или 8ЕЦ ГО N0: 3.

3. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент пегилированы.

4. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержат радионуклид, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентную метку, хемилюминесцентную метку, пептидную метку, магнитную частицу, лекарственное средство или токсин.

5. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4.

6. Иммуноконъюгат, включающий антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-3.

7. Иммуноконъюгат по п.6, где иммуноконъюгат является пегилированным.

8. Иммуноконъюгат по п.6, где иммуноконъюгат дополнительно содержит радионуклид, фермент, субстрат, кофактор, флуоресцентную метку, хемилюминесцентную метку, пептидную метку, магнитную частицу, лекарственное средство или токсин.

9. Фармацевтическая композиция, содержащая иммуноконъюгат по любому из пп.6-8.

10. Гибридома, продуцирующая моноклональное антитело по п.1, выбранная из группы, состоящей из:

a) гибридомного клона 280.46.3.4 АТСС РТА - 6284;

b) гибридомного клона 281.73.49.1.1 АТСС РТА - 6285;

c) гибридомного клона 283.4.1.2 АТСС РТА - 6287;

б) гибридомного клона 283.52.5.4 АТСС РТА - 6311 и

е) гибридомного клона 283.108.2.3 АТСС РТА - 6286.

11. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1 или 2 для получения лекарственного средства для лечения млекопитающего, страдающего воспалительным заболеванием, связанным с ГЬ-22КА, путем снижения воспаления.

12. Применение по п.11, где заболевание представляет собой хроническое воспалительное заболевание.

13. Применение по п.12, где заболевание представляет собой хроническое воспалительное заболевание, выбранное из группы, состоящей из воспалительного заболевания кишечника, язвенного колита, болезни Крона, артрита, артрита при псориазе, ревматоидного артрита и псориаза.

14. Применение по п.11, где заболевание представляет собой острое воспалительное заболевание.

15. Применение по п.14, где заболевание представляет собой острое воспалительное заболевание, выбранное из группы, состоящей из эндотоксемии, септицемии, септического шока и инфекционных заболеваний.

Евразийская патентная организация, ЕАПВ

Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2