PL190316B1 - Zastosowanie przerywacza wiązania CD40:CD154 - Google Patents

Abstract

1. Zastosowanie przerywacza wiązania CD40:CD154 do wytwarzania leku do hamowania rozwoju zespołu inhibitora białka egzogennego u osobnika dotkniętego albo zagrożonego tym zespołem. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że egzogenne białko jest: a) wymiennikiem dla endogennego, lecz defektywnego białka; albo b) białkiem o zasadniczo takiej samej strukturze pierwszorzędowej, co odpowiednie, białko endogenne; albo c) wytwarzane z izolowanych komórek gospodarza niosących możliwy do ekspresji, rekombinowany kwas nukleinowy kodujący białko egzogenne; albo d) pochodzenia bakteryjnego; albo e) czynnikiem krzepnięcia, włącznie z czynnikiem VIII albo czynnikiem IX; albo f) hormonem wzrostu, czynnikiem gojenia rany, czynnikiem wzrostu, cytokiną, limfokiną, enzymem, czynnikiem krzepnięcia albo składnikiem osocza; albo g) streptokinazą 4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, ze człowiek jest hemofilitykiem

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przerywacza wiązania CD40:CD154.

Niniejsze zgłoszenie jest kontynuacją w części uprzedniego tymczasowego zgłoszenia USA 60/050,276, zgłoszonego 20 czerwca 1997. Ujawnienia wcześniej zgłoszonego zgłoszenia patentowego włączone są niniejszym na drodze odniesienia.

Dziedzina wynalazku

Wynalazek dotyczy w ogólności zahamowania niepożądanej reakcji odpornościowej, w szczególności anty-adaptacyjnej reakcji odpornościowej za pośrednictwem limfocytów T. Rozwiązania według wynalazku w szczególności dotyczą zapobiegania, leczenia, tłumienia i odwracania zahamowania aktywności terapeutycznej podawanych egzogennych białek albo innych biologicznych czynników terapeutycznych.

Podstawa wynalazku

Hemofilia A jest genetyczną chorobą niedoboru sprzęgniętą z chromosomem X, która dotyka 1-2 męzczyzn na 10000 żywych urodzeń. Osobnicy z Hemofilią A wykazują

190 316 częściowy albo całkowity funkcjonalny niedobór endogennego VIII czynnika krzepnięcia (FVIII) i muszą otrzymywać terapię zastępczą oczyszczonego albo rekombinowanego czynnika VIII. Lusher i in., (1993), 328 N. Engl. J. Med., 453-459. Około 15% osobników z hemofilią A rozwija wysokie miana przeciwciał (tj. >10 BU/ml) przeciwko VIII. Osobnicy ci określani są jako osobnicy silnie reagujący („high responders”). McMillan i in., (1988), 71 Blood 344-348. Przeciwciała te, określane jako inhibitory FVIII, blokują działanie (aktywność biologiczną) zastępczego czynnika terapeutycznego FVIII, przez wiązanie podawanego egzogennego FVIII. Ta anty-adaptacyjna humoralna reakcja odpornościowa sprawia, ze terapia krwawień u tych osobników staje się problematyczna. Niewielkie epizody krwawienia (np. siniaki) często leczy się z powodzeniem koncentratami aktywowanej protrombiny (np. Autoplex albo FEIBA, aktywność pomijająca inhibitor FVIII), ale ciężkie krwawienia są z trudnością kontrolowane przez te czynniki. Brettler (1996), 9 Clin. Hematol. 319-329. Większość z „high responders” wykazuje niski poziom przeciwciał hamujących FVIII dopóki nie otrzymają kolejnej infuzji FVIII, która stymuluje (przypomina) wytwarzanie przeciwciał blokujących. Stąd, ponowna indukcja przeciwciał hamujących u tych osobników jest możliwa do przewidzenia. Brettler (1996), 9 Clin. Hematol. 319-329. Wykazano, że profilaktyka FVIII zmniejsza częstość krwawień wewnątrzstawowych i przewlekłej artropatii u hemofilityków. Liesner i in., (1996), 92 Br. J. Haematol. 973-978. Jednakże, z powodu reakcji humoralnej swoistej wobec FVIII, osobnicy silnie reagujący nie mogą otrzymywać profilaktycznej terapii FVIII.

Osobników silnie reagujących indukowalną, gwałtowną reakcją na FVIII często leczy się regularnymi wlewami bardzo wysokich dawek FVIII w schematach mających na celu indukowanie tolerancji na egzogenny FVIII. Brettler (1996), 9 Clin. Hematol. 319-329. W niektórych przypadkach do tego schematu dodaje się czynniki immunomodulujące (glikokortykoidy, cyklofosfamid, dożylne immunoglobuliny (IVIg)). Terapia toleryzująca jest skuteczna u 50%-80% osobników silnie reagujących.

Mariani i in., (1994), 72 Thromb. Haemostasis 155-158. Koszt takiego leczenia wynosi od około 200000 do niemal 1000000 USD na jednego osobnika. Ponieważ wlewy FVIII indukują bardzo wysokie poziomy inhibitorów u osobników silnie reagujących - co trwa od trzech do ośmiu miesięcy, osobnicy ci nie mogą być leczeni FVIII jeżeli doznają krwawienia. Brettler (1996), 9 Clin. Hematol. 319-329.

Po pomyślnej indukcji tolerancji, osobnicy są często utrzymywani na profilaktycznych wlewach FVIII 2-3 razy w tygodniu. Brettler (1996), 9 Clin. Hematol. 319-329. Mechanizm indukcji tolerancji przy użyciu tych protokołów jest niejasny, ale może obejmować indukcję przeciwciał antyidiotypowych (Gilles i in., (1996), 97 J. Clin. Invest. 13821388) albo bardziej bezpośrednie stłumienie klonów limfocytów B wytwarzających przeciwciała hamujące FVIII. Oprócz tego, preparaty IVIg zawierają przeciwciała antyidiotypowe przeciwko inhibitorom FVIII, czym może wyjaśniać skuteczność tej terapii u niektórych osobników silnie reagujących. Sułtan i in., (1991) 91 Am. J. Med. 5A-35S-5A-39S. W bardzo ciężkich, zagrażających życiu przypadkach, w których konieczne jest podawanie FVIII z powodu krwawienia, inhibitory FVIII można usunąć przez pozaustrojową immunoabsorpcję na kolumnach anty-Ig albo z białkiem A. Knobl i in., (1995), 74 Thromb. Haemostasis 1035-1038; Gjorstrup i in., (1991), 61 Vox Sang. 244-250. Protokoły te są czasochłonne i powodują 50%-75% obniżenie całkowitego poziomu immunoglobulin w surowicy (Knobl i in., (1995), 74 Thromb. Haemostasis 1035-1038) zwiększając potencjalnie ryzyko zakażenia.

Podobne komplikacje terapii zastępczej napotyka się podczas leczenia innych wrodzonych albo nabytych chorób niedoborów białek, w tym niedoborów czynników krzepnięcia, białek krwi i osocza, czynników wzrostowych itp. Ponadto, analogiczne komplikacje napotyka się podczas innych wskazań klinicznych, podczas których podaje się rekombinacyjnie wytworzony odpowiednik endogennego, ale rzadkiego albo ograniczonego przestrzennie białka w celu leczenia. Przykładowo, analogiczne komplikacje napotyka się podczas podawania rekombinowanych cytokin, limfokin, czynników wzrostowych albo enzymów. Jednym z przykładów jest podawanie erytropoetyny (EPO) w leczeniu anemii. Innym jest podawanie interferonu β (IFN3) w leczeniu stwardnienia rozsianego (MS).

190 316

Jeszcze innym jest podawanie ludzkiego hormonu wzrostu (hGH) w leczeniu przyspieszającym wzrost. Analogiczne komplikacje napotyka się również gdy białko drobnoustroju podaje się leczniczo, jak w przypadku streptokinazy podawanej w leczeniu udaru albo innego rodzaju zamknięcia naczynia.

Tak więc, istnieje potrzeba ulepszonego albo skuteczniejszego leczenia immunosupresyjnego albo immunomodulującego w celu minimalizacji albo zahamowania rozwoju przeciwciał hamujących, które wiążą się i blokują aktywność terapeutyczną podawanych białek egzogennych. W szczególności, istnieje zapotrzebowanie na leczenie, które nie wymaga uogólnionej supresji limfocytów T, tj. leczenie, które nie pozostawi biorcy podatnym na nowotwory i zakazenia oportunistyczne. Bardziej szczegółowo, istnieje potrzeba odwrócenia albo zahamowania zespołów inhibitorów, które uniemożliwiają podawanie koniecznego białka terapeutycznego, takiego jak FVIII wymagającemu tego osobnikowi.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przerywacza wiązania CD40:CD154 do wytwarzania leku do hamowania rozwoju zespołu inhibitora białka egzogennego u osobnika dotkniętego albo zagrożonego tym zespołem. Korzystnie egzogenne białko jest: a) wymiennikiem dla endogennego, lecz defektywnego białka; albo b) białkiem o zasadniczo takiej samej strukturze pierwszorzędowej, co odpowiednie, białko endogenne; albo c) wytwarzane z izolowanych komórek gospodarza niosących możliwy do ekspresji, rekombinowany kwas nukleinowy kodujący białko egzogenne; albo d) pochodzenia bakteryjnego; albo e) czynnikiem krzepnięcia, włącznie, z czynnikiem VIII albo czynnikiem IX, albo f) hormonem wzrostu, czynnikiem gojenia rany, czynnikiem wzrostu, cytokiną, limfokiną, enzymem, czynnikiem krzepnięcia albo składnikiem osocza; albo g) streptokinazą. Również korzystnie osobnikiem jest człowiek, a korzystniej człowiek będący hemofilitykiem.

W zastosowaniu według wynalazku przerywaczem wiązania CD40:CD154 jest korzystnie przeciwciało monoklonalne anty-CD154. Korzystniej, przeciwciało monoklonalne anty-CD154 posiada charakterystykę swoistego wiązania antygenu przeciwciała 5c8 wytwarzanego przez ATCC HB 10916. Ponadto korzystnie przeciwciało monoklonalne anty-CD154 jest wybrane z grupy składającej się z: przeciwciał chimerycznych, przeciwciał humanizowanych i przeciwciał primatyzowanych.

Również w korzystnej postaci wykonania przerywacz wiązania CD40:CD154 jest otrzymany z przeciwciała monoklonalnego anty-CD154. Korzystniej, przerywacz wiązania CD40:CD154 jest wybrany z grupy składającej się z: fragmentów Fab, fragmentów swoiście wiążących antygen, związków F(ab')2, regionów Vh i przeciwciał jednołańcuchowych.

Rozwiązania według wynalazku umożliwiają dostarczenie czynnika immunomodulującego, który osłabia ciężkość anty-adaptacyjnej reakcji limfocytów T, opóźnia moment wystąpienia anty-adaptacyjnej reakcji limfocytów T, hamuje albo odwraca antyadaptacyjną reakcję limfocytów T wobec koniecznego, egzogennego białka terapeutycznego. Rozwiązania według wynalazku umożliwiają również dostarczenie czynnika immunomodulacyjnego, który przerywa dostarczanie sygnału ko-stymulującego do aktywowanych limfocytów T, w szczególności sygnału ko-stymulującego wytwarzanie immunoglobulin. Ponadto rozwiązania według wynalazku umożliwiają zastosowania w terapii przerywacza CD40:CD154, takiego jak czynnik blokujący CD154, do, w szczególności w leczeniu łagodzącym, opóźniającym moment wystąpienia, albo odwracającym antyadaptacyjną reakcję przeciwciał Hamujących wobec koniecznego, egzogennego białka terapeutycznego, takiego jak FVIII.

Rozwiązania według wynalazku opierają się na ujawnieniu, że zastosowanie przerywacza wiązania CD40:CD154, takiego jak czynnik blokujący CD154, osłabia, łagodzi, tłumi, zapobiega, opóźnia, Hamuje albo odwraca anty-adaptacyjną reakcję przeciwciał wobec antygenów białkowych, bez konieczności uogólnionej immunosupresji układu odpornościowego biorcy. Konkretniej, wynalazek opiera się na ujawnieniu, że zastosowanie przerywacza wiązania CD40:CD154, takiego jak czynnik blokujący CD154, osłabia, łagodzi, tłumi, zapobiega, opóźnia, Hamuje albo odwraca anty-adaptacyjną reakcję przeciw190 316 ciał, która blokuje aktywność biologiczną białka terapeutycznego podawanego biorcy w celu zastąpienia albo wspomożenia natywnej aktywności biologicznej endogennego, choć defektywnego białka, takiego jak czynnik krzepnięcia, np. FVIII.

Tak więc, rozwiązania według wynalazku znajdują zastosowanie w opisanych tutaj sposobach i kompozycjach do immunomodulacyjnej terapii zespołów inhibitorów białek egzogennych. Pierwszy sposób osłabia albo łagodzi ciężkość zespołu inhibitora białka egzogennego. Drugi sposób hamuje niepożądane objawy zespołu. Trzeci sposób zapobiega rozwojowi zespołu. Czwarty sposób opóźnia moment wystąpienia zespołu. Piąty sposób hamuje rozwój zespołu. Szósty sposób odwraca zespół. Siódmy sposób zachowuje skuteczność terapeutyczną egzogennego białka, takiego jak białko podawane w celu zastąpienia albo uzupełnienia natywnego, choć defektywnego białka. Ósmy sposób przywraca skuteczność terapeutyczną takiego egzogennego białka.

Wszystkie powyzsze sposoby obejmują traktowanie osobnika dotkniętego, albo zagrożonego rozwojem zespołu inhibitora białka egzogennego, przez co rozumie się antyadaptacyjna humoralną reakcję odpornościową, która blokuje (zakłóca) aktywność biologiczną białka egzogennego, przy użyciu przerywacza wiązania CD40:CD154, przez co rozumie się dowolny czynnik, który przerywa wiązanie ligandu CD40 (tj. CD40L, znanego również jako CD 154 albo antygen 5c8, a czasem określanego jako gp39) z receptorem (tu, CD40). Przerywaczem wiązania jest czynnik blokujący CD 154 (CD40L), przez co rozumie się dowolny czynnik, który wiąże się z CD 154 i zapobiega albo zakłóca wiązanie z receptorem (np. CD40). Przykładowym czynnikiem blokującym CD154 jest przeciwciało monoklonalne (mAb) szczególnie przeciwciało o charakterystyce wiązania mAb 5c8 ujawnionego w patencie USA 5,474,771, którego ujawnienie załączono tu na drodze odniesienia.

Jak wspomniano wyżej, rozwiązania według wynalazku można stosować w celu osłabienia albo złagodzenia zespołów inhibitorów skierowanych przeciwko białkom egzogennym, które są podawane w celu zastąpienia albo wspomożenia aktywności biologicznej natywnego (endogennego) białka, które jest defektywne, albo w celu złagodzenia albo osłabienia zespołów inhibtorów, skierowanych przeciwko innym białkom egzogennym, w tym dowolnym białkom egzogennym, które podaje się w celach leczniczych. Przykładowo, rozwiązania według wynalazku można zastosować do stłumienia, odwrócenia albo zahamowania reakcji inhibitorów skierowanych przeciwko dowolnemu wytworzonemu rekombinacyjnie białku terapeutycznemu, w szczególności białku terapeutycznemu o strukturze pierwszorzędowej (sekwencji) zasadniczo przypominającej (np. zasadniczo identycznej) natywne, funkcjonalne ale rzadkie białko, albo natywne białko, które naturalnie jest ograniczone przestrzennie w konkretnej strukturze organizmu albo przedziale, jak szpik, węzeł chłonny albo ośrodkowy układ nerwowy. Podobnie, rozwiązania według wynalazku można zastosować do stłumienia, odwrócenia albo zahamowania reakcji inhibitora na rekombinowaną wersję natywne-go białka, które ulega przemijającej ekspresji albo ekspresji jedynie w reakcji na określone bodźce środowiskowe albo w konkretnych momentach rozwoju, np. do osłabienia albo złagodzenia reakcji inhibitorów wobec hormonu wzrostu, czynnika gojenia rany (np. czynnika regeneracji tkanki albo czynnika różnicowania), cytokiny albo limfokiny (np. czynnika pobudzającego tworzenie kolonii, czynnika komórek macierzystych, interferonu albo interleukiny), enzymu (np. glukocerebrozydazy), czynnika krzepnięcia krwi (np. trombiny, protrombiny, czynnika V, czynnika VII, czynnika VIII, czynnika IX, czynnika X, czynnika XI albo czynnika XII), albo innego składnika osocza (np. albuminy, tkankowego aktywatora plazminogenu). Ponadto, rozwiązania według wynalazku można zastosować do osłabiania albo łagodzenia reakcji inhibitora wobec obcego białka, szczególnie białka bakteryjnego (np. streptokinazy), które jest podawane w celu terapeutycznym (np. leczenie zamknięcia naczyń). W szczególności, rozwiązania według wynalazku można zastosować do osłabienia albo złagodzenia zespołów inhibitora czynnika krzepnięcia u hemofilityków.

Powyzsze i inne cele, cechy i zalety rozwiązań według wynalazku, jak również sam wynalazek, staną się lepiej zrozumiałe z poniższego opisu korzystnych wykonań.

190 316

Szczegółowy opis wynalazku

Aktywacja limfocytów T i zależne od niej procesy immunologiczne wymagają sygnałów za pośrednictwem receptora limfocytu T (TCR) oraz równocześnie dostarczanych sygnałów ko-stymulujących. Istotnym sygnałem ko-stymulującym jest sygnał dostarczany przez związanie CD40 na komórce prezentującej antygen, takiej jak limfocyt B, przez CD40L (CD154) na limfocycie T. Ludzka CD40 jest białkiem powierzchniowym 50 kDa, wyrażanym na limfocytach B, jak również makrofagach i aktywowanych komórkach śródbłonka. CD40 należy do klasy receptorów związanych z programowaną śmiercią komórek, w tym Fas/CD95 i receptor czynnika martwicy nowotworu (TNF) alfa. Ludzki CD 154 (CD40L) jest glikoproteiną błonową typu II o 32 kDa, z homologią do TNF-alfa, która ulega przemijającej ekspresji głównie na aktywowanych limfocytach T. Wykazano, ze wiązanie CD40:CDi54 jest niezbędne do reakcji przeciwciał zależnej od limfocytów T. W szczególności, wiązanie CD40:CD154 zapewnia sygnały pobudzające zapobiegające apoptozie i/lub pobudzające limfokiny.

Ważność wiązania CD40:CD154 w promowaniu zależnej od limfocytów T reakcji biologicznej jest podkreślona przez ujawnienie, że powiązany z chromosomem X zespół nadmiernego wytwarzania IgM (X-HIGM) u ludzi jest fenotypem wynikającym z nieobecności funkcjonalnego CD154. Osobnicy chorzy mają normalny albo wysoki poziom IgM, ale nie są w stanie wytwarzać przeciwciał IgG, IgA ani IgE. Chorujący osobnicy cierpią na nawracające, czasami ciężkie, zakazenia bakteryjne i zakazenia pasożytnicze, jak również zwiększonej częstości chłoniaki i nowotwory jamy brzusznej. Podobny fenotyp można zaobserwować u zwierząt ze znokautowanym genem kodującym CD 154 (zwierzęta nokautowane). Limfocyty B nokautowanych zwierząt mogą wytwarzać IgM pod nieobecność wiązania CD40:CD154, ale są niezdolne do przełączania izotypów albo do przezywania po dojrzewaniu powinowactwa. Histologicznie, centra namnazania węzłów chłonnych nie rozwijają się prawidłowo, zaś limfocyty B pamięci są nieobecne lub źle wykształcone. Funkcjonalnie, defekty te przyczyniają się do znacznego zmniejszenia lub braku wtórnej (dojrzałej) reakcji przeciwciał. Defekty odporności komórkowej są również obserwowane, manifestując się zwiększoną częstością występowania zakazeń bakteryjnych i pasożytniczych. Wiele z tych defektów komórkowych można odwrócić przez podanie IL-12 albo IFN-gamma. Obserwacje te wspierają pogląd, ze normalne wiązanie CD40:CD154 wspomaga rozwój reakcji odpornościowej limfocytów pomocniczych T typu I.

Blokowanie oddziaływania CD40:CD154 podczas immunizacji antygenem białkowym może swoiście zablokować reakcję przeciwciał wobec antygenu u myszy. Foy i in., (1993) J. Exp. Med. 1567-1575. Przykładowo, przeciwciała anty-CD154 mogą blokować indukcję przeciwciał przeciw-kolagenowych w zapaleniu stawów wywołanym kolagenem. Durie i in., (1993)261. Science 1328-1330 Przeciwciała przeciwko CD154 mogą zmniejszyć ilość przeciwciał anty-dsDNA i przeciwciał przeciwko nukleosomom u myszy ze spontanicznym toczniem. Mohan i in., (1995), 154 J. Immunol. 3,470-1,480. Oprócz tego, przeciwciała przeciwko CD 154 mogą zmniejszać objawy u myszy z doświadczalnym autoagresyjnym zapaleniem mózgu i opon mózgowych (EAE), modelu MS. Podobne wyniki opisano dla modeli choroby przeszczep przeciwko biorcy, kłębuszkowego zapalenia nerek wywołanego chlorkiem rtęci oraz choroby zapalnej jelita grubego, u gryzoni.

Tak więc, blokada CD40:CD154 może zapewnić potencjalnie silną terapię w celu osłabienia albo złagodzenia niepożądanej humoralnej reakcji odpornościowej, w szczególności w kontekście chorób autoagresyjnych albo, gdzie celem jest białko o znaczeniu terapeutycznym, które to znaczenie jest osłabiane przez anty-adaptacyjną reakcję odpornościową. Jednakże, mimo licznych doniesień o obiecujących rezultatach, badania przeprowadzone na modelach gryzoni indukowanej anty-adaptacyjnej choroby immunologicznej (np. autoagresji) słabo korelowały z wynikami testu obecnej choroby autoagresyjnej, albo nawet na większych zwierzętach w modelowych układach przedklinicznych (np. na naczelnych).

Ujawniono tu protokół oceny wpływu korzystnego czynnika blokującego CD 154, humanizowanego mAb 5c8 (Lederman i in., J. Exp. Med. 175:1091-1101, 1992) w mode190 316 lach przedklinicznych uznawanych za przewidujące skuteczność terapeutyczną w leczeniu zespołów inhibitorów białek egzogennych. Konkretnie, obecne modele obejmują terapię blokującą CD 154 w celu złagodzenia albo osłabienia hamującej aktywność biologiczną odporności humoralnej swoistej wobec czynników krzepnięcia (np. FVIII) i limfokin (np. IFNP). Modele te można zaadaptować, posługując się niczym więcej poza rutynowymi manipulacjami, do zastosowania w celu ustalenia skuteczności terapii blokującej CD154 w celu złagodzenia albo osłabienia hamującej reakcji humoralnej skierowanej przeciwko dowolnemu białku o wartości terapeutycznej.

Poniższa dyskusja ilustruje i podaje przykładowe różnorodne konteksty i okoliczności w których można przeprowadzać rozwiązania według wynalazku, jak również dostarcza badania sprawdzające wykorzystujące różne postacie wykonania rozwiązań według wynalazku.

Osobnicy leczeni

Rozwiązania według wynalazku można zastosować do leczenia albo profilaktyki dla dowolnego ssaczego osobnika wymagającego, albo juz otrzymującego terapię zastępczą białkiem, dowolnym białkiem terapeutycznym. Osobnicy są dotknięci albo zagrożeni rozwojem zespołu inhibitora białka egzogennego. Przykładowo, hemofilitycy leczeni egzogennym FVIII są zasadniczo zagrozeni tym, ze staną się osobnikami silnie reagującymi, po czym FVIII traci skuteczność hamującą zjawiska krwawienia. Tak więc rozwiązania według wynalazku są szczególnie odpowiednie do zastosowania u hemofiiityków. Procedury określania czy hemofilitycy rozwinęli reakcję hamującą przeciwko podawanemu FVIII i/lub stali się osobnikami silnie reagującymi są dobrze znane. Patrz, np. Hematology: Clinical and Laboratory Practice, tom 2, Bick (wyd.), Mosby-Year Book, Inc., (1993) str. 1544-1548. Korzystnie, osobnikiem ssaczym jest naczelny, jeszcze korzystniej wyzszy naczelny, najkorzystniej człowiek. Osobnikiem może być inny ssak dotknięty, albo zagrozony rozwojem zespołu białka egzogennego, szczególnie ssak istotny gospodarczo albo zwierzę domowe albo inne wartościowe zwierzę takie jak członek zagrożonego gatunku. Tak więc, osobnicy obejmują również, choć nie wyłącznie owce, konie, bydło, kozy, świnie, psy, koty, króliki, świnki morskie, chomiki, dzerbile, szczury i myszy.

Przykładowe przerywacze wiązania CD40 CD154

Związki terapeutyczne przydatne w zastosowaniu według wynalazku obejmują dowolny związek, który blokuje oddziaływanie powierzchniowego CD40 (np. na limfocytach B) z CD40L (CDI 54) wyrażanym na powierzchni aktywowanych limfocytów T. Przerywacze wiązania CD40:CD154, takie jak czynniki blokujące CD 154, które są szczególnie uwzględniane, obejmują przeciwciała poliklonalne i monoklonalne (mAb), jak również pochodne przeciwciał takie jak przeciwciała chimeryczne, cząsteczki humanizowane, cząsteczki o zmniejszonej funkcji efektorowej, cząsteczki o podwójnej swoistości i koniugaty przeciwciał. Przeciwciałem może być na przykład 5c8, jak opisane w patencie USA nr 5,474,771, którego ujawnienie jest włączone tu jako odnośnik. W korzystnym wykonaniu, przeciwciałem może być przeciwciało humanizowane 5c8. Inne znane przeciwciała przeciwko CD154 obejmują przeciwciała ImxM90, ImxM91. ImxM92 (Immunex), przeciwciało monoklonalne przeciwko CD154 dostępne z Ancell (klon 24-33331, nr kat. 353-020, Bayport, MN) i przeciwciało monoklonalne przeciwko CD40L dostępne z Genzyme (Cambridge, MA, nr kat. 80-3703-01). Również dostępne jest przeciwciało monoklonalne przeciwko CD 154 z PharMingen (San Diego, nr kat. 33580D). Wytworzono i scharakteryzowano liczne przeciwciała przeciwko CDI54 (patrz, np. WO 96/23071, Bristol-Myers Squibb, załączone tu jako odnośnik).

Rozwiązania według wynalazku wykorzystują również cząsteczki blokujące CD154 innego rodzaju, takie jak kompletne fragmenty Fab, związki F(ab‘) 2, regiony Vh, regiony Fv, przeciwciała jednołańcuchowe, (patrz, np. WO 96/23071), polipeptydy, fuzyjne konstrukty polipeptydowe, fuzje CD40 (takie jak CD40Ig, Hollenbaugh i in., J. Immunol. Meth., 188:1-7, 1995, załączone tu jako odnośnik) oraz związki drobnocząsteczkowe, takie jak półpeptydowe związki drobnocząsteczkowe albo związki niepeptydowe, zdolne do blokowania albo przerywania wiązania CD40:154. Procedury projektowania, badania

190 316 przesiewowego i optymalizacji związków drobnocząsteczkowych dostarczone są w zgłoszeniu PCT/US96/10664, zgłoszonym 21 czerwca 1996, załączone tu jako odnośnik.

Tak więc rozwiązania według wynalazku można przeprowadzić stosując pochodzące z mAb różne czynniki blokujące CDI54 wytworzone z użyciem standardowych technik rekombinacji DNA (Winter i Milstein, Naturę 349:293-99, 1991). Jedna klasa takich czynników blokujących CD 154 obejmuje chimeryczne przeciwciała lub białka fuzyjne skonstruowane przez połączenie kwasu nukleinowego kodującego domenę wiązącą antygen nieludzkiego przeciwciała ssaczego (np. przeciwciała mysiego lub szczurzego) o pożądanej swoistości do kwasu nukleinowego kodującego region stały ludzkiej immunoglobuliny (Ig). Cabilly i in. , patent USA nr 4,816,567; Morrison i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-55, 1984. Przeciwciała chimeryczne wyrażane z takich konstruktów w ogólności wykazują zmniejszoną immunogenność, kiedy są stosowane w terapii lub profilaktyce u ludzi, niz przeciwciała nie pochodzące od ludzi w oparciu o które otrzymana została chimera. Druga klasa czynników blokujących CDI54 obejmuje przeciwciała „humanizowane” lub „primatyzowane”. Przeciwciała humanizowane łub primatyzowane są przeciwciałami pochodzącymi z przeciwciał ssaka nie będącego człowiekiem o pożądanej swoistości, w których zastosowano technologię inżynierii genetycznej w celu zastąpienia całości albo części kodonów aminokwasów niekoniecznych do wiązania antygenu kodonami aminokwasów z odpowiednich regionów łańcucha ciężkiego i lekkiego immunoglobuliny ludzkiej lub pochodzącej od naczelnych. Oznacza to, że są to chimery obejmujące w większości sekwencje immunoglobuliny ludzkiej, do których wprowadzono regiony odpowiedzialne za swoiste wiązanie antygenu (patrz, np. zgłoszenie PCT nr WO 94/04679). Humanizowane przeciwciała dają mniejsze prawdopodobieństwo wywołania niepożądanej reakcji odpornościowej. Obecnie, humanizowane mAb o zasadniczo tej samej swoistości antygenowej co 5c8 (tu, hu5c8) są korzystne .

Inna klasa czynników blokujących CDI54 pochodząca z mAb obejmuje ludzkie przeciwciała, które można wytworzyć w zwierzętach nie będących człowiekiem, takich jak zwierzęta transgeniczne niosące jeden albo wiele transgenów ludzkich immunoglobulin. Zwierzęta takie można zastosować jako źródło splenocytów do wytwarzania hybrydoma, jak to opisano w patencie USA nr 5,569,825.

Oczywiście dowolny antygenowe swoisty fragment wiązący jednego z wyżej wymienionych mAb lub czynnik terapeutyczny otrzymany z mAb może być stosowany w rozwiązaniach według wynalazku, przy założeniu, że fragment jest wystarczająco duży aby sterycznie hamować wiązanie CD 154 z jego przeciwreceptorem. Tak więc w rozwiązaniach według wynalazku można stosować również fragmenty przeciwciał i przeciwciała jedno wartościowe. Przeciwciało jednowartościowe obejmuje dimer łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego, połączonych regionem Fc (albo zrębem) drugiego łańcucha ciężkiego „Region Fab” oznacza tę część łańcuchów, które są z grubsza równoważne albo analogiczne z sekwencjami, które obejmują rozgałęzienie Y łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego w całości, i które razem (jako agregat) wykazują aktywność przeciwciała. Białko Fab obejmuje agregaty jednego łańcucha ciężkiego i jednego lekkiego (zwykle określane jako Fab'), jak również tetramery, które odpowiadają dwóm segmentom rozgałęzień przeciwciała Y (zwykle określanego jako F(ab')2), niezależnie czy połączony kowalencyjnie czy nie kowalencyjnie, jak długo agregat jest zdolny do wybiórczego reagowania z konkretnym antygenem albo rodziną antygenów.

Oprócz tego, standardowe techniki rekombinacji DNA można zastosować do zmiany powinowactwa wiązania rekombinowanych przeciwciał z ich antygenami, przez zmianę reszt aminokwasowych w sąsiedztwie miejsc wiązania antygenu. Powinowactwo wiązania antygenu humanizowanego przeciwciała można zwiększyć przez mutagenezę opartą na modelowaniu molekularnym (Queen i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-33, 1989; zgłoszenie PCT nr WO 94/04679). Mozę być pożądane zwiększenie albo zmniejszenie powinowactwa przeciwciał do CD 154, zaleznie od docelowej tkanki albo przewidywanego schematu leczenia. Można to zrobić przez wykorzystanie technologii prezentacji fagowej (patrz, Winter i in , Ann Rev. Immunol., 12:433-455; Schier i in., J. Mol. Biol., 255:28-43, 1996, załączone tu jako odnośnik). Przykładowo, korzystne może być

190 316 leczenie pacjenta stałym poziomem przeciwciał o zmniejszonym powinowactwie do CD154 w pół-profilaktycznym celu. Podobnie, przeciwciała o zwiększonym powinowactwie do CD 154 mogą być korzystniejsze podczas krótkotrwałego leczenia.

Droga podawania

Związki przerywające wiązanie CD40:CD154, w tym czynniki blokujące CD 154 mogą być podawane każdym sposobem, który jest medycznie dopuszczalny. Zależnie od swoistych okoliczności pożądane może być podawanie miejscowe albo układowe. Korzystnie, czynnik jest podawany drogą dootrzewnową, taką jak wstrzyknięcia dożylne, dotętnicze, podskórne, domięśniowe, dogałkowe, dokomorowe, dootrzewnowe, dootrebkowe, doczaszkowe, dokanałowe, albo donosowe, wlewy albo inhalacje. Związek może być również podawany gospodarzowi biorcy przez wszczepienie pompy infuzyjnej, albo implant o przedłużonym uwalnianiu biokompatybilny i biodegradowalny, zarówno przed, jak i po wszczepieniu tkanki dawcy. Alternatywnie, konkretne czynniki, albo icH formulacje mogą być odpowiednie do podawania doustnego albo dojelitowego. Ponadto inne czynniki mogą być przydatne do podawania miejscowego.

Przerywacz wiązania CD40:CD154 może być dostarczany biorcy pośrednio, przez podanie wektora albo innego materiału genetycznego zdolnego do wyrażania przerywacza. Materiał genetyczny jest internalizowany i wyrażany w komórkach albo tkance biorcy, z wytworzeniem przerywacza in situ Przykładowo, przydatny konstrukt kwasu nukleinowego obejmujący sekwencję kodująca jeden albo więcej łańcuchów immunoglobulin (Ig) mAb 5c8 jak ujawnione w patencie USA 5,474,771. Inne przydatne konstrukty obejmują sekwencje kodujące chimeryczne albo Humanizowane wersje łańcuchów Ig mAb 5c8 albo ich fragmenty wiążące antygen. Jeszcze inne przydatne konstrukty obejmują sekwencje kodujące część albo całość innych mAb swoistych wobec CD154. Konstrukty te dostarcza się układowe, albo miejscowo, np. w miejsce w pobliżu miejsca wszczepienia tkanki wyrażającej insulinę.

Alternatywnie, wektor, albo inny materiał genetyczny kodujący przerywacz jest internalizowany do odpowiedniej populacji izolowanych komórek w celu wytworzenia komórek gospodarza wytwarzających przerywacz. Komórki te wszczepia się albo podaje we wlewie biorcy, miejscowo albo układowe, w celu zapewnienia wytwarzania przerywacza wiązania CD40:CD154 in situ Odpowiednie komórki gospodarza obejmują komórki Hodowlane, takie jak komórki unieśmiertelnione, jak również komórki otrzymane od biorcy (np. komórki krwi obwodowej albo komórki węzła chłonnego, takie jak naturalne komórki niszczące (NK)).

Formulacja

Ogólnie, związki stosowane w rozwiązaniach według wynalazku są zawieszane, rozpuszczane albo dyspergowane w zaróbce albo nośniku dopuszczalnym farmaceutycznie. Powstała kompozycja terapeutyczna nie wpływa ujemnie na Homeostazę biorcy, szczególnie na równowagę elektrolitową. Tak, więc przykładowy nośnik obejmuje normalna sól fizjologiczną (0,15 M NaCl, pH 7,0 do 7,4). Inne dopuszczalne nośniki są dobrze znane w stanie techniki i opisane, na przykład w Remington Pharmaceutical Science, Gennaro, ed., Mack PublisHing Co., 1.990. Dopuszczalne nośniki mogą obejmować biokompatybilne, obojętne albo bioadsorbowalne sole, czynniki buforujące, oligo- albo polisacharydy, polimery, czynniki poprawiające lepkość, konserwanty i podobne.

Przerywacz wiązania CD40:CD154, taki jak związek blokujący CD 154, stosowany w opisanych tu sposobach jest podawany w farmaceutycznie skutecznej albo terapeutycznie skutecznej ilości, która jest ilością wystarczającą do wytworzenia wykrywalnego, korzystnie klinicznie dobroczynnego efektu u biorcy. Medycznie dobroczynne wpływy mogą obejmować zapobieganie, opóźnienie albo złagodzenie pogarszania, albo wykrywalną poprawę, stanu klinicznego biorcy. Przykładowo, miano przeciwciał hamujących swoistych wobec koniecznego, egzogennego białka leczniczego można stłumić albo obniżyć. Tak więc, przykładowo, skuteczna dawka związku, takiego jak czynnik blokujący CDI 54, jest ilością, która w sposób wykrywalny przywraca skuteczność terapeutyczną lecznicze10

190 316 go białka. Optymalną skuteczną ilością jest taka ilość, która zasadniczo uwalnia biorcę od anty-adaptacyjnych przeciwciał, dających zespół inhibitora.

Dawkowanie i częstość leczenia

Ilość i częstość dawkowania każdego związku zastosowanego pozostaje w zakresie wiedzy i osądu praktykujących lekarzy. Ogólne dawki i schemat podawania został ustalony przez badania przedkliniczne i kliniczne, obejmujące intensywne, lecz rutynowe badania określające optymalne parametry dawkowania związku. Nawet po ustaleniu takich rekomendacji, lekarze mogą często zmieniać te dawki dla różnych gospodarzy biorców, w oparciu o różne założenia, takie jak wiek osobnika, stan medyczny, ciężar, płeć i jednoczesne leczenie innymi związkami farmakologicznymi. Określenie optymalnego dawkowania i schematu podawania każdego związku blokującego CD40:CD154 jest rutynowym postępowaniem dla specjalistów farmaceutów i lekarzy. Częstość dawkowania związku blokującego CD40:CD154 jest rutynową czynnością w dziedzinie farmacji i medycyny. Dawkowanie i częstość dawkowania powinna być odpowiednia dla wytworzenia korzystnej medycznie zmiany w jednym albo wielu wskaźnikach stanu zdrowia osobnika. Przykładowe schematy częstości podawania i dawkowania przedstawiono w badaniach przedstawionych niniejszym.

W celu zilustrowania rozważań dotyczących dawkowania związku przeciw CDI54, poniżej podano przykłady schematów dawkowania mAb przeciwko CD 154. Wielkości dawek można łatwo dopasować dla różnych typów związków przeciw CD 154. Ogólnie, rozważane są pojedyncze dawki pomiędzy około 0,05 i około 50 mg/kg ciężaru ciała pacjenta, najczęściej dawki w zakresie 1-20 mg/kg. W celu zapoczątkowania terapii blokowania CDI54 profilaktycznie, gdy osobnik znajduje się w remisji, albo w przypadku nagłym, skuteczna dawka mAb zawiera się w zakresie od około 1 mg/kg ciężaru ciała do około 20 mg/kg ciężaru ciała, podawane w odstępach jednodniowych albo w odstępach od dwóch do trzech dni. Przewlekłe leczenie można również prowadzić przez podawanie od około 0,1 mg/kg ciężaru ciała do około 20 mg/kg ciężaru ciała z odstępami między dawkowaniu wahającymi się od około tygodnia do około 3 miesięcy. Korzystne jest podawanie w odstępach jednomiesięcznych (czterech tygodni).

Terapię blokującą CDI54 można prowadzić, jeżeli to konieczne, kolejno albo w skojarzeniu z konwencjonalną terapią immunosupresyjną. Tradycyjne czynniki immunosupresyjne (na przykład kortykosteroidy albo inhibitory kalcyneuryny) można podawać równocześnie podczas blokowania CDI54 co jest oczywiste dla praktyka. Korzystnie pozwalają one na podawania tradycyjnego czynnika w ilości mniejszej niz dawkowanie tradycyjne, na przykład, mniej niż około 50% tradycyjnego dawkowania, gdy czynnik jest podawany w monoterapii. Zgodnie z tym można uniknąć występowanie wielu efektów ubocznych związanych z takim czynnikiem. Terapie złozone według wynalazku obejmują zastosowanie przeciwciał przeciw CD 154 łącznie z czynnikami ukierunkowanymi na limfocyty B, takie jak przeciwciała przeciwko CD19, CD28, albo CD20 (nie sprzęgnięte albo znakowane pierwiastkami promieniotwórczymi), antagoniści IL-14, LJP394 (blokery receptorów LaJolla Pharmaceuticals), IR-1116 (małe cząstki Takeda) i idiotypowe przeciwciała monoklonalne przeciwko Ig. Alternatywnie, kombinacje mogą obejmować czynniki ukierunkowane na limfocyty T/B, takie jak CTLA4Ig, antagoniści IL-2, antagoniści IL-4, antagoniści IL-6, antagoniści receptorów, przeciwciała monoklonalne przeciwko CD80/CD86, TNF, antagoniści LFA 1/ICAM, antagoniści VFA4/VCAM, brekwinar i koniugaty toksyny IL-2 (np. DAB), prednizon, Mab przeciwko CD3 (OKT3), mykofenolanu mofetilu (MMF), cyklofosfamid i inne leki immunosupresyjne, takie jak blokery sygnałowe kalcyneuryny, obejmujące lecz nie ograniczone do takrolimus (FK506). Kombinacje mogą również obejmować czynniki ukierunkowane na limfocyty T, takie jak antagoniści CD4, antagoniści CD2 i IL-12. Przedkliniczne układy modelowe do oceny schematów leczenia przerywaczy CD40:CD154

Korzystny, przykładowy układ modelowy do badania skuteczności związku przerywającego CD40:CD154 (np. związek przeciwko CD40L, takie jak mAb 5c8) podano poniżej. W każdym z układów, możliwe jest dokonanie modyfikacji i rutynowych zmian, dostosowujących opublikowane techniki, w celu oceny efektów dowolnego pożądanego

190 316 związku przerywającego wiązanie CD40:CD154 na miana białek hamujących u zwierzęcia modelowego. W opisie wspomina się niektóre przykładowe modyfikacje; jednakże, wiele innych odpowiednich modyfikacji jest oczywistych dla praktyka i uwzględnia się je tutaj.

Model hemofilii A u myszy z nokautem genu

Ostatnio, naukowcy z American Red Cross załozyli kolonię myszy, które mają znokautowany gen natywnego mysiego FVIII. Bi i in., (1995) 10 Naturę Genetics 119. Myszy te wykazują wszystkie istotne patologie ludzkiej hemofilii A. Ponadto, model mysi dokładnie naśladuje etiologię tej choroby: wrodzony albo nabyty brak biologicznie czynnego natywnego FVIII. Podanie ludzkiego FVIII, podanego w sposób odpowiadający konwencjonalnej terapii zastępczej FVIII wywołuje, jak opisano, wytwarzanie przeciwciał hamujących FVIII u tych myszy. Quian i in. (1996) 88 Blood 656a (supl.). Inne drogi podania, zwłaszcza konstytutywne zastępowanie przez integrację wektora adenowirusowego kodującego funkcjonalny FVIII wydaje się stanowić lek w mniej immunogennym kontekście. Connely i in. (1998) 91 Blood 3273-3281.

Efekty czynnika blokującego CD 154, np. przeciw-mysie CD 154, na rozwój osobników silnie reagujących w populacji wyżej opisanych myszy HemofilitycznycH można określić w następujący sposób: antygen (FVIII) można wstrzykiwać w dawce bolus (np. 0,2 μ-g) w dniu 0 i 14. W dni, albo w pobliżu dnia 54 można pobrać próbkę krwi i badać (stosując rutynowy test ELISA) na obecność przeciwciał hamujących FVIII. Następnie, grupę badaną (np. 5 zwierząt; podobną liczbę przydziela się do jednej albo wielu grup kontrolnych) można leczyć odpowiednią dawką przeciw-mysiego CD154 (np. 250 pg i.p., albo i.v), przykładowo, w dniach albo w okolicy dni 55 i/lub 57. Można następnie podać dawkę prowokującą FVIII w dniu, albo w okolicy dnia 56. Następnie, można pobrać próbki krwi i badać w odpowiednich dniach w celu śledzenia rozwoju, zaś w grupach testowych zahamowania albo odwrócenia, wtórnej reakcji przeciwciał hamujących FVIII. Przykładowo, krew można pobrać w dniu, albo w okolicy dnia 74, 81 albo 96. Mimo pewnych zmienności indywidualnych pomiędzy zwierzętami w grupie badanej, oczekuje się, że blokowanie CDI 54 powinno zasadniczo zmniejszyć albo zahamować wtórną reakcję humoralną na FVIII.

Model chimerycznych myszy SCID-hu

Ten chimeryczny model mysi, opisany po raz pierwszy przez Mosier i in., (1988) 335 Naturę 256-259, jest oparty na ratowaniu immunologicznym (funkcjonalnej rekonstytucji) ciężkiego złozonego niedoboru odporności (SCID) u myszy przez przeszczepienie normalnych ludzkich leukocytów krwi obwodowej (PBL), z wytworzeniem chimery mysio-ludzkiej. Układ ten zastosowano w licznych badaniach nad behawioralnymi i dynamicznymi oddziaływaniami ludzkich limfocytów in vivo Co istotne, ten układ modelowy zastosowano do badania wpływu czynników przerywających CD40:CD154 na reakcję normalnych ludzkich leukocytów wobec mysich erytrocytów (zastosowanych jako modelowy antygen). Chen i in., (1995) 155, J. Immunol. 2833-2840. W tym badaniu wykazano, ze mAb przeciwko CD40 i CDI 54 modulują ujemnie całkowite wytwarzanie ludzkich Ig.

Ten układ modelowy umożliwia ocenę wpływu przeciwciał przeciwko ludzkiemu CD154, np. hu5c8 na ludzkie limfocyty T in vivo, stosując pożądane białko jako badany antygen. W jednej z odpowiednich modyfikacji, chimery mysie SCID-hu można wytworzyć przez przeszczepienie ludzkich PBL od osobników z hemofilią, takich jak osobnicy silnie reagujący. Oczywiście, podejście to można przeprowadzić z PBL od dowolnego osobnika dotkniętego zespołem inhibitora białka egzogennego. W przypadku myszy SCID-hu wytworzonych z hemofilityków silnie reagujących, odpowiednią liczbę (np. 2 do 5 albo więcej) myszy można przydzielić do grup badanych w następujący sposób: Grupa A (hu5c8 i fViII); Grupa B (samo hu5c8); Grupa C (sam FVIII); Grupa D (sam nośnik); Grupa E (kontrolne Ig i FVIII); Grupa F (same kontrolne Ig). Zaznaczone czynniki badane i/lub kontrolne miesza się z huPBL w momencie przeszczepienia i podaje się i.p. w dniu albo w pobliżu dnia 2 i/lub 4. Kinetykę reakcji przeciwko FVIII można śledzić standardowymi technikami (ELISA) stosując krew pobraną w odpowiednich odstępach przez

190 316 okres kilku tygodni. Leczenie hu5c8 powinno zahamować albo osłabić wtórną reakcję odpornościową przeciwko FYIII.

Modele na naczelnych innych niz ludzie

Model AVONEX (IFNP). Małpy rezus albo cynomolgus rozdziela się do odpowiedniej grupy badanej, np. dwa do czterech zwierząt na grupę, w następujący sposób: Grupa 1 (kontrolny antygen (HAS); 50 pg/kg i hu5c8; 5 mg/kg), Grupa 2 (nośnik i hu5c8; 5 mg/kg), Grupa 3 (AVONEX; 50 pg/kg i hu5c8; 5 mg/kg), Grupa 4 (AVONEX; 50 pg/kg i hu5c8; 5 mg/kg), Grupa 5 (nośnik i hu5c8; 5 mg/kg). Grupy 1, 2 i 3 otrzymują hu5c8 począwszy od dnia 1, a następnie co około drugi albo trzeci dzień. Grupy 4 i 5 otrzymują hu5c8 począwszy od dnia 17, a następnie około co drugi albo trzeci dzień. Wszystkie grupy otrzymujące AVONEX otrzymywały go q.o.d. począwszy od, albo w okolicy 3 dnia. Rozwój i kinetykę przeciwciał hamujących AVONEX śledzono stosując rutynową technikę ELISA. Oczekuje się istotnych różnic pomiędzy grupami leczonymi AVONEX-em, leczonymi albo nie leczonymi hu5c8. Konkretnie, wstępne leczenie hu5c8 powinno, jak się oczekuje zahamować albo osłabić rozwój przeciwciał hamujących AVONEX. Opóźnione leczenie hu5c8 powinno, jak się oczekuje, zasadniczo stłumić albo odwrócić rozwój wtórnej reakcji odpornościowej przeciwko AVONEX-owi.

Powyżej opisany model można rutynowo zaadaptować w celu oceny wpływu hu5c8 albo innego czynnika blokującego CD154 na pierwotną, i/lub wtórną reakcję hamującą wobec innych modelowych antygenów, w tym egzogennych białek terapeutycznych. Przykładowo, rutynowo można przeprowadzić odpowiednie modyfikacje protokołu i poziomu dawkowania w celu określenia zachowania FVTII albo innych czynników krzepnięcia u naczelnych leczonych profilaktycznym albo terapeutycznym schematem blokowania CD154.

Ekwiwalenty

Wynalazek można zrealizować w innej konkretnej postaci bez oddalania się od ducha i jego zasadniczej charakterystyki. Powyższe wykonania są uważane za ilustrujące, nie zaś ograniczające ujawniony wynalazek. Zakres wynalazku określony jest więc przez dołączone zastrzeżenia, nie zaś przez powyższy opis, zaś wszystkie zmiany wchodzą w zakres i zrozumienie zamienności zawartych tu zastrzeżeń.

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 50 egz Cena 4,00 zł.

Claims (9)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie przerywacza wiązania CD40:CD154 do wytwarzania leku do hamowania rozwoju zespołu inhibitora białka egzogennego u osobnika dotkniętego albo zagrożonego tym zespołem.
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że egzogenne białko jest:

   a) wymiennikiem dla endogennego, lecz defektywnego białka; albo

   b) białkiem o zasadniczo takiej samej strukturze pierwszorzędowej, co odpowiednie, białko endogenne; albo

   c) wytwarzane z izolowanych komórek gospodarza niosących możliwy do ekspresji, rekombinowany kwas nukleinowy kodujący białko egzogenne; albo

   d) pochodzenia bakteryjnego; albo

   e) czynnikiem krzepnięcia, włącznie z czynnikiem VIII albo czynnikiem IX; albo

   f) hormonem wzrostu, czynnikiem gojenia rany, czynnikiem wzrostu, cytokiną, limfokiną, enzymem, czynnikiem krzepnięcia albo składnikiem osocza; albo

   g) streptokinazą.
3. 3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że osobnikiem jest człowiek.
4. 4. Zaśtosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że człowiek jest hemofilitykiem.
5. 5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przerywaczem wiązania CD40:CD154 jest przeciwciało monoklonalne anty-CD154.
6. 6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, ze przeciwciało monoklonalne anty-CD154 posiada charakterystykę swoistego wiązania antygenu przeciwciała 5c8 wytwarzanego przez ATCC HB 10916.
7. 7. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, ze przeciwciało monoklonalne anty-CD154 jest wybrane z grupy składającej się z: przeciwciał chimerycznych, przeciwciał humanizowanych i przeciwciał primatyzowanych.
8. 8. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, ze przerywacz wiązania CD40:CD154 jest otrzymany z przeciwciała monoklonalnego anty-CD154.
9. 9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, ze przerywacz wiązania CD40:CD154 jest wybrany z grupy składającej się z: fragmentów Fab, fragmentów swoiście wiążących antygen, związków F(abj2, regionów Vh i przeciwciał jednołańcuchowych.