ES2347672T3 - Anticuerpos dirigidos contra il-22ra y compañeros de union procedimientos de uso en enefermedades inflamatorias. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se expresa mediante un hibridoma procedente del grupo de: (a) el clon de hibridoma 280.46.3.4 (Designación de depósito de patente ATCC PTA-6284); (b) el clon de hibridoma 281.73.49.1.1 (Designación de depósito de patente ATCC PTA-6285); (c) el clon de hibridoma 283.4.1.2 (Designación de depósito de patente ATCC PTA-6287); (d) el clon de hibridoma 283.52.5.4 (Designación de depósito de patente ATCC PTA-6311); y (e) el clon de hibridoma 283.108.2.3 (Designación de depósito de patente ATCC PTA-6286).

Description

DESCRIPCIÓN [0001] Las citocinas son pequeñas proteínas solubles que median una variedad de efectos biológicos, que incluyen la regulación del crecimiento y la diferenciación de muchos tipos de células (véase, por ejemplo, Arai y col., Annu. Rev. Biochem 59:783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991); Paul y Seder, Cell 76:241 (1994)). Las proteínas que constituyen el grupo de las citocinas incluyen interleucinas, interleucina-17 humana, factores estimuladores de colonias, factores de necrosis tumoral, y otras moléculas reguladoras. Por ejemplo, la interleucina-17 humana es una citocina que estimula la expresión de la interleucina-6, la molécula de adhesión intracelular 1, la interleucina-8, el factor estimulador de colonias de granulocitos macrófagos, y la expresión de la prostaglandina E2, y juega un papel en la maduración preferente de los precursores hematopoyéticos CD34+ a neutrófilos (Yao y col., J. Immunol. 155:5483 (1995); Fossiez y col., J. Exp. Med. 183:2593 (1996)). [0002] Los receptores que se unen a citocinas están compuestos normalmente por una o más proteínas de membrana integral que se unen a la citocina con elevada afinidad y transducen este episodio de unión a la célula mediante las porciones citoplásmicas de algunas subunidades del receptor. Los receptores de las citocinas se han agrupado en diversos tipos sobre la base de similitudes en sus regiones de unión al ligando celular. Por ejemplo, las cadenas de los receptores responsables de unir y/o transducir el efecto de los interferones son miembros de la familia de receptores de la citocina de tipo II, basándose en unos 200 restos característicos de la región extracelular. [0003] Los documentos WO 2004/085476 y WO 2004/085475 describen anticuerpos y compañeros de unión dirigidos contra IL-20, y anticuerpos y compañeros de unión dirigidos contra IL-22RA, y los procedimientos para uso de estos en enfermedades inflamatorias. [0004] Las actividades de las citocinas y sus receptores demostradas in vivo ilustran el potencial clínico y la necesidad de otras citocinas, receptores de citocinas, agonistas de citocinas, y antagonistas de citocinas. Por ejemplo, las actividades demostradas in vivo de la familia de las citocinas proinflamatorias ilustra el enorme potencial clínico y la necesidad de antagonistas de las moléculas proinflamatorias. La presente invención resuelve estas necesidades proporcionando antagonistas de las citocinas proinflamatorias IL20 e IL22, según se define en las reivindicaciones. Dichos antagonistas de la presente invención, que pueden bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la actividad de IL-22, IL-20 o IL-20 e IL-22, incluyen neutralizar los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA, según se define en las reivindicaciones. La invención proporciona además usos de los anteriores en enfermedades inflamatorias, así como composiciones y procedimientos relacionados

1. VISIÓN GLOBAL

[0005] Entre otras invenciones, la presente memoria descriptiva describe usos novedosos de un receptor soluble, designado como “Zcytor 11” o “IL-22RA”. La presente invención proporciona anticuerpos neutralizantes de los receptores de la citocina IL-22RA, según se define en las reivindicaciones. La presente memoria descriptiva describe fragmentos del polipéptido IL-22RA soluble y proteínas de condensación, para uso en enfermedades inflamatorias y autoinmunes humanas. Los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA, y los receptores de IL-22RA solubles, que incluyen los anticuerpos neutralizantes dirigidos contra IL-22RA de la presente invención, se pueden usar para bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la actividad de cualquiera de IL-22 o IL-20, o de IL-20 e IL-22 en el tratamiento de enfermedades humanas específicas tales como la psoriasis, psoriasis artrítica, artritis, endotoxemia, enfermedad del intestino inflamatorio (IBD), colitis y otras dolencias inflamatorias dadas a conocer en el presente documento. [0006] Se proporciona una secuencia de nucleótidos ilustrativa que codifica Zcytor 11 (IL-22RA) mediante la SEC. DE ID Nº 1; se muestra el polipéptido codificado en la SEC. DE ID Nº 2. IL-22RA es una subunidad del receptor de IL-20 e IL-22. Se da a conocer Zcytor 11 (IL-22RA) en la Patente de los Estados Unidos de titularidad compartida Nº 5.965.704, la publicación WIPO de titularidad compartida WO 02/12345, y la publicación WIPO de titularidad compartida WO 02/072607. El análisis de un clon de ADNc humano que codificaba IL-22RA (SEC. DE ID Nº 1) desveló un marco de lectura abierto que codificaba 574 aminoácidos (SEC. DE ID Nº 2) que comprendía una región de unión al ligando extracelular de aproximadamente 211 restos de aminoácido (restos 18-228 de la SEC. DE ID Nº2; SEC. DE ID Nº 3), una región transmembrana de aproximadamente 23 restos de aminoácidos (restos 229251 de la SEC. DE ID Nº 2), y una región intracelular de aproximadamente 313 restos de aminoácidos (restos 252 a 574 de la SEC. DE ID Nº2). De esta manera, las moléculas descritas en el presente documento incluyen polipéptidos que incluyen una región de unión a la citocina que comprende los restos de aminoácidos 18-228 de la SEC. DE ID Nº 2; SEC. DE ID Nº 3. En una realización, la IL-22R soluble se condensa con la región constante de la cadena pesada (representante mostrado en la SEC. DE ID Nº 4). Las personas expertas en la técnica reconocerán que estos límites de la región son aproximados. Es posible la delección de restos en los extremos de las regiones. [0007] Según se describe a continuación, la presente memoria descriptiva describe polipéptidos aislados que comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 %, al menos un 80 %, o al menos un 90 %, o mayor de un 95 %, tal como un 96 %, 97 %, 98 % 0 mayor del 99 % o más idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia del 18 al 228 de la SEC. DE ID Nº 2, que se muestra también como la SEC. DE ID Nº 3, en la que el polipéptido aislado se une específicamente con un anticuerpo que se une específicamente con un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº 3. Los polipéptidos ilustrativos incluyen polipéptidos que comprenden tanto los restos de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº 3 como los restos de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº 3. Además, la presente memoria descriptiva describe polipéptidos aislados según se han dado a conocer anteriormente que se unen a IL-22 (por ejemplo, la secuencia del polipéptido IL-22 humano que se muestra en la SEC. DE ID Nº 6). Se muestra la secuencia del polinucleótido IL-22 humano en la SEC. DE ID Nº 5. Se muestra la secuencia del polinucleótido IL-22 de ratón en la SEC. DE ID Nº 10, y se muestra el correspondiente polipéptido en la SEC. DE ID Nº 11. La presente memoria descriptiva describe polipéptidos aislados y dados a conocer anteriormente que se unen a IL-20 (por ejemplo, la secuencia del polipéptido IL-20 humano que se muestra en la SEC. DE ID Nº 8; Publicación WIPO Nº WO 99/27103). Se muestra la secuencia del polinucleótido IL-20 en la SEC. DE ID Nº 7. [0008] La presente memoria descriptiva describe polipéptidos y epítopos aislados que comprenden al menos 15 restos de aminoácidos contiguos de una secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº 3. Los polipéptidos ilustrativos incluyen polipéptidos que bien comprenden, bien están constituidos por la SEC. DE ID Nº 3, un epítopo antigénico de la misma, o un fragmento de la misma de unión funcional a IL20 o IL-22. Además, la presente memoria descriptiva describe polipéptidos aislados según se han dado a conocer anteriormente que se unen, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan o neutralizan la actividad de IL-22 o IL-20. [0009] La presente memoria descriptiva describe polipéptidos IL-22RA variantes, en los que la secuencia de aminoácidos del polipéptido variante comparte una identidad con los restos de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº 3 seleccionados entre el grupo constituido por al menos un 70 % de identidad, al menos un 80 % de identidad, al menos un 90 % de identidad, al menos un 95 % de identidad, o más de un 95 % de identidad tal como un 96 %, 97 %, 98 %, o más del 99 % o más de identidad, y en el que cualquier diferencia entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido variante y la correspondiente secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº 3 se debe a una o más sustituciones conservativas de aminoácidos. Se describen en el presente documento dichas sustituciones conservativas de aminoácidos. Además, la presente memoria descriptiva describe polipéptidos aislados según se han dado a conocer anteriormente, que se unen, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan o neutralizan la actividad de IL-22 o IL-20. [0010] La presente invención proporciona además anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, según se define en las reivindicaciones, que se unen específicamente con dichos polipéptidos. Los anticuerpos a modo de ejemplo incluyen anticuerpos neutralizantes, anticuerpos monoclonales de murino, anticuerpos humanizados derivados de anticuerpos monoclonales de murino, y anticuerpos monoclonales humanos. Los fragmentos de anticuerpos ilustrativos incluyen F(ab’)2, F(ab)2, Fab’, Fab, Fv, scFv, y unidades de reconocimiento mínimas. Los anticuerpos neutralizantes se unen preferiblemente a IL-22RA de manera que la interacción de IL-20 e IL-22 con IL-22RA se bloquea, inhibe, reduce, antagoniza o neutraliza; se describen también en el presente documento anticuerpos neutralizantes dirigidos contra IL-22RA de manera que la unión de cualquiera de IL-20 o IL-22 con IL-22RA se bloquea, inhibe, reduce, antagoniza o neutraliza. Esto es, los anticuerpos neutralizantes dirigidos contra IL22RA pueden tanto unir, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar como neutralizar cada uno de IL-20 o IL-22 singularmente, o unir, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar IL-20 e IL-22 conjuntamente. La presente invención incluye además composiciones que comprenden un vehículo y un péptido, polipéptido, o anticuerpo descrito en el presente documento. [0011] Adicionalmente, la presente memoria descriptiva describe composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y al menos un vector de expresión o virus recombinante de ese tipo que comprende dichos vectores de expresión. La presente memoria descriptiva describe composiciones farmacéuticas, que comprenden un vehículo y un polipéptido o anticuerpo farmacéuticamente aceptables descritos en el presente documento. [0012] La presente memoria descriptiva describe anticuerpos antiidiotípicos, o fragmentos de anticuerpos antiidiotípicos, que se unen específicamente a un anticuerpo

o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº 3 o uno de sus fragmentos. Un anticuerpo antiidiotípico a modo de ejemplo se une con un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido constituido por la SEC. DE ID Nº 3. [0013] La presente memoria descriptiva describe proteínas de condensación, que comprenden un polipéptido IL-22RA y un resto de inmunoglobulina. En dichas proteínas de condensación, el resto de inmunoglobulina puede ser una región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, tal como un fragmento Fc humano. La presente memoria descriptiva describe moléculas de ácido nucleico aislado que codifican dichas proteínas de condensación. [0014] La presente invención proporciona también anticuerpos monoclonales según se define en las reivindicaciones que se unen a polipéptidos que comprenden una región extracelular de IL-22RA tal como receptores monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos y multiméricos, que incluyen receptores solubles. Además, se pueden usar dichos anticuerpos para antagonizar la unión de los ligandos de IL-22RA, IL-22 (SEC. DE ID Nº 6), e IL-20 (SEC. DE ID Nº 8), individual o conjuntamente con el receptor IL-22RA. [0015] Además, se demostró la sobreexpresión o regulación en exceso de IL-22 e IL-20 en lesiones psoriáticas humanas, y muestras de piel humana con dermatitis atópica, sugiriendo que IL-22, de manera similar a IL-20, está también implicado en la psoriasis humana, la dermatitis atópica u otras enfermedades inflamatorias de la piel y los tejidos epiteliales. Además, según se describe en el presente documento, la expresión en exceso de IL-20 o IL-22 en ratones transgénicos mostró engrosamiento epidérmico e implicación de células inmunes indicativos de un fenotipo psoriático; y, adicionalmente, la inyección de IL-22 en ratones normales mostró engrosamiento epidérmico e implicación de células inmunes indicativas de un fenotipo psoriático que se eliminó mediante el antagonista del receptor soluble de IL-22RA2 (Zcytor16; Publicación WIPO Nº WO 01140467). Dichos datos in vivo sugieren adicionalmente que IL-22 proinflamatorio está implicado en la psoriasis, la dermatitis atópica u otras enfermedades inflamatorias de la piel y tejidos epiteliales. De este modo, los antagonistas de la actividad de IL-22 e IL-20, tales como los receptores solubles de IL22RA y los anticuerpos de los anteriores, que incluyen los anticuerpos neutralizantes y monoclonales dirigidos contra IL-22RA humano de la presente invención, son útiles en el tratamiento terapéutico de las enfermedades inflamatorias, particularmente como antagonistas de IL-22 e IL-20 singular o conjuntamente en el tratamiento de la psoriasis. Además, los antagonistas de la actividad de IL-22, tales como los receptores solubles de IL-22RA y los anticuerpos de los anteriores, que incluyen los anticuerpos neutralizantes y monoclonales dirigidos contra IL-22RA humano de la presente invención, son útiles en el tratamiento terapéutico de otras enfermedades inflamatorias, por ejemplo, ya que se unen, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan o neutralizan IL22 e IL-20 (tanto individual como conjuntamente) en el tratamiento de la dermatitis atópica, IBD, colitis, endotoxemia, artritis, artritis reumatoide, y artritis psoriática, síndrome de estrés respiratorio (ARD), choque séptico, fallo orgánico múltiple, lesión inflamatoria del pulmón tal como asma o bronquitis, neumonía bacteriana, psoriasis, eczema, dermatitis atópica y de contacto, y enfermedad inflamatoria del intestino tal como colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn.

2. DEFINICIONES

[0016] En la descripción que sigue se usan extensamente numerosos términos. Se proporcionan las siguientes definiciones para facilitar la comprensión de la invención. [0017] Según se usa en el presente documento, “ácido nucleico” o “molécula de ácido nucleico” se refiere a polinucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y fragmentos generados por cualquier ligadura, escisión, acción de la endonucleasa, y acción de la exonucleasa Las moléculas de ácido nucleico pueden estar compuestas por monómeros que son nucleótidos que se producen naturalmente (tales como ADN y ARN), o análogos de nucleótidos que se producen naturalmente (por ejemplo, formas α-enantioméricas de nucleótidos que se producen naturalmente), o una combinación de ambas. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en restos de azúcar y/o en restos de base pirimidina o purina. Las modificaciones de azúcares incluyen, por ejemplo, la sustitución de uno o más grupos hidroxilo con halógenos, grupos alquilo, aminas, y grupos azido, o se pueden funcionalizar los azúcares como éteres o ésteres. Además, se puede sustituir el resto azúcar completo con estructuras estérica y electrónicamente similares, tales como aza-azúcares, y análogos de azúcares carbocíclicos. Los ejemplos de modificaciones en un resto base incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas, u otros sustitutos heterocíclicos bien conocidos. Se pueden unir monómeros de ácido nucleico mediante enlaces fosfodiéster o análogos de tales enlaces. Los análogos de enlaces fosfodiéster incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoanilidato, fosforoamidato, y similares. El término “molécula de ácido nucleico” incluye también los así denominados “ácidos nucleicos peptídicos”, que comprenden base de ácido nucleico modificadas o que se producen naturalmente unidas a un esqueleto de poliamida. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios.

[0018] La expresión “complemento de una molécula de ácido nucleico” se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria y orientación inversa en comparación a una secuencia de nucleótidos de referencia. Por ejemplo, la secuencia 5’ ATGCACGGG 3’ es complementaria a 5’ CCCGTGCAT 3’. [0019] La expresión “secuencia de nucleótidos degenerada” denota una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados en comparación con una molécula de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido. Los codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos, pero codifican el mismo resto aminoácido (es decir, los tripletes GAU y GAC codifican cada uno Asp). [0020] El término “gen estructural” se refiere a una molécula de ácido nucleico que se transcribe en ARN mensajero (ARNm), que a continuación se traduce en una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido específico. [0021] Una “molécula de ácido nucleico aislado” es una molécula de ácido nucleico que no se integra en el ADN genómico de un organismo. Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica un factor de crecimiento que se ha separado del ADN genómico de una célula es una molécula de ADN aislado. Otro ejemplo de molécula de ácido nucleico aislado es una molécula de ácido nucleico químicamente sintetizado que no se integra en el genoma de un organismo. Una molécula de ácido nucleico que se ha aislado de una especie particular es más pequeña que la molécula de ADN completo de un cromosoma de esta especie. [0022] Una “construcción de molécula de ácido nucleico” es una molécula de ácido nucleico, tanto monocatenario como bicatenario, que se ha modificado por intervención humana para contener segmentos de ácido nucleico combinados y yuxtapuestos en una disposición que no existe en la naturaleza. [0023] “ADN lineal” denota moléculas de ADN no circular que tienen los extremos 5’ y 3’ libres. Se puede preparar ADN lineal a partir de moléculas de ADN circular cerrado, tales como plásmidos, mediante digestión enzimática o perturbación física. [0024] “ADN complementario (ADNc)” es una molécula de ADN monocatenario que se forma a partir de una plantilla de ARNm mediante la enzima transcriptasa inversa. Normalmente, se emplea un cebador complementario a las porciones de ARNm para el inicio de la transcripción inversa. Las personas expertas en la técnica usan también el término “ADNc” para referirse a una molécula de ADN bicatenario constituida por dicha molécula de ADN monocatenario y su cadena de ADN complementario. El término “ADNc” se refiere también a un clon de una molécula de ADNc sintetizado a partir de una plantilla de ARN. [0025] Un “promotor” es una secuencia de nucleótidos que dirige la transcripción de un gen estructural. Normalmente, se localiza un promotor en la región 5’ no codificante de un gen, próxima al lugar de inicio de la transcripción de un gen estructural. Los elementos de la secuencia en el interior de los promotores que funcionan en el inicio de la transcripción se caracterizan a menudo por secuencias de nucleótidos de consenso. Estos elementos del promotor incluyen lugares de unión a la ARN polimerasa, secuencias TATA, secuencias CAAT, elementos específicos de la diferenciación (DSE; McGehee y col., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993)), Elementos de respuesta al AMP cíclico (CRE) elementos de respuesta al suero (SRE; Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990)), elementos de respuesta a glucocorticoides (GRE), y lugares de unión para otros factores de la transcripción, tales como CRE/ATF (O’Reilly y col., J. Biol. Chem. 267: 19938 (1992)), AP2 (Ye y col., J. Biol. Chem. 269:25728 (1994)), SP1, proteínas de unión a los elementos de respuesta al AMPc (CREB; Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993)) y factores octaméricos (véanse, en general, Watson y col., eds., Molecular Biology of the Gene, 4ª ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987), y Lemaigre y Rousseau, Biochem. J. 303: 1 (1994)). Si un promotor es un promotor inducible, entonces la velocidad de la transcripción aumenta en respuesta al agente inductor. En contraste, la velocidad de la transcripción no está regulada por un agente inductor si el promotor es un promotor constitutivo. Se conocen también los promotores represibles. [0026] Un “promotor mínimo” contiene las secuencias de nucleótidos esenciales pata la función del promotor, que incluyen la secuencia TATA y el inicio de la transcripción Por esta definición, un promotor mínimo puede tener o no actividad detectable en ausencia de secuencias específicas que pueden potenciar la actividad o conferir específica de tejido. [0027] Un “elemento regulador” es una secuencia de nucleótidos que modula la actividad de un promotor mínimo. Por ejemplo, un elemento regulador puede contener una secuencia de nucleótidos que se une a factores celulares que permiten la transcripción exclusiva o preferentemente en células, tejidos, u orgánulos particulares: Estos tipos de elementos reguladores se asocian normalmente con genes que se expresan de una manera “específica de célula”, “específica de tejido”, o “específica de orgánulo” [0028] Un “potenciador” es un tipo de elemento regulador que puede aumentar la eficacia de la transcripción, con respecto a la distancia o a la orientación del potenciador con respecto al lugar de inicio de la transcripción. [0029] “ADN heterólogo” se refiere a una molécula de ADN, a una población de moléculas de ADN, que no existe naturalmente en una célula hospedadora dada. Las moléculas de ADN heterólogo de una célula hospedadora particular pueden contener ADN derivado de la especie de célula hospedadora (es decir, ADN endógeno) Siempre que el ADN del hospedador se combine con el ADN del no hospedador (es decir, ADN exógeno). Por ejemplo, una molécula de ADN que contiene un segmento de ADN no de hospedador que codifica un polipéptido unido de manera operable a un segmento de ADN del hospedador que comprende un promotor de la transcripción se considera que es una molécula de ADN heterólogo. Inversamente, una molécula de ADN heterólogo puede comprender un gen endógeno unido de manera operable con un promotor exógeno. Como otra ilustración, se considera que una molécula de ADN que comprende un gen derivado de una célula natural es ADN heterólogo si la molécula de ADN se introduce en una célula mutante que carece del gen natural. [0030] Un “polipéptido” es un polímero de restos de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos, producidos tanto natural como sintéticamente. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 restos de aminoácidos se denominan comúnmente como “péptidos”. [0031] Una “proteína” es una macromolécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas. Una proteína puede comprender también componentes no peptídicos, tales como grupos carbohidratos. Se pueden añadir carbohidratos y otros sustituyentes no peptídicos a una proteína por la célula en la que se produce la proteína, y variarán con el tipo de célula. Se definen las proteínas en el presente documento en términos de las estructuras de sus esqueletos de aminoácidos; no se especifican generalmente sustituyentes tales como grupos carbohidratos, pero pueden, sin embargo, estar presentes. [0032] Un péptido o polipéptido codificado por una molécula de ADN no hospedador es un péptido o polipéptido “heterólogo”. [0033] Un “vector de clonación” es una molécula de ácido nucleico, como un plásmido, cósmido, o bacteriófago, que tiene la capacidad de replicarse autónomamente en una célula hospedadora. Los vectores de clonación contienen normalmente uno o un pequeño número de lugares de reconocimiento de la endonucleasa de restricción que permiten la inserción de una molécula de ácido nucleico de una manera que se puede determinar sin pérdida de una función biológica esencial del vector, así como las secuencias de nucleótidos que codifican un gen marcador que es adecuado para el uso en la identificación y selección de células transformadas con el vector de clonación. Los genes marcadores incluyen normalmente genes que proporcionan resistencia a la tetraciclina o resistencia a la ampicilina. [0034] Un “vector de expresión” es una molécula de ácido nucleico que codifica un gen que se expresa en una célula hospedadora. Normalmente, un vector de expresión comprende un promotor de la transcripción, un gen, y un finalizador de la transcripción. La expresión del gen se sitúa normalmente bajo el control de un promotor y se dice que dicho gen “se une de manera operable con” el promotor. Similarmente, un elemento regulador y un promotor mínimo se unen de manera operable si el elemento regulador modula la actividad del promotor mínimo. [0035] Un “hospedador recombinante” es una célula que contiene una molécula de ácido nucleico heterólogo, tal como un vector de clonación o un vector de expresión. En el presente contexto, un ejemplo de hospedador recombinante es una célula que produce IL-22RA a partir de un vector de expresión. En contraste, se puede producir IL-22RA por una célula que es una “fuente natural” de IL-22RA, y que carece de un vector de expresión. [0036] “Transformantes integradores” son células hospedadoras recombinantes, en las que el ADN heterólogo ha llegado a integrarse en el ADN genómico de las células. [0037] Una “proteína de condensación” es una proteína híbrida expresada por una molécula de ácido nucleico que comprende las secuencias de nucleótidos de al menos dos genes. Por ejemplo, una proteína de fusión puede comprender al menos parte de un polipéptido IL-22RA condensado con un polipéptido que se une a una matriz de afinidad. Dicha proteína de condensación proporciona un medio para aislar grandes cantidades de IL-22RA usando la cromatografía de afinidad. [0038] El término “receptor” denota una proteína asociada a célula que se une a una molécula bioactiva denominada “ligando”. Esta interacción media el efecto del ligando sobre la célula. Los receptores pueden estar unidos a la membrana, citosólicos

o nucleares, monoméricos (por ejemplo, receptor de la hormona estimuladora tiroidea, receptor beta-adrenérgico) o multiméricos (por ejemplo, receptor de PDGF, receptor de la hormona de crecimiento, receptor de IL-3, receptor de GM-SCF, receptor de GCSF, receptor de la eritropoyetina y receptor de IL-6). Los receptores de unión a la membrana se caracterizan por una estructura multiregión que comprende una región extracelular de unión al ligando y una región intracelular del efector que está implicada normalmente en la transducción de la señal. En algunos receptores unidos a membrana, la región extracelular de unión al ligando y la región intracelular del efector se localizan en polipéptidos separados que comprenden el receptor funcional completo. [0039] En general, la unión del ligando al receptor da como resultado un cambio conformacional en el receptor que produce una interacción entre la región del efector y otra molécula(s) en la célula, que a su vez conduce a una alteración en el metabolismo de la célula. Los episodios metabólicos que están conectados a menudo con las interacciones receptor-ligando incluyen la transcripción génica, la fosforilación, la defosforilación, aumenta la producción de AMP cíclico, la movilización del calcio celular, la movilización de lípidos de membrana, la adhesión celular, la hidrólisis de lípidos de inositol, y la hidrólisis de fosfolípidos. [0040] Un “receptor soluble” es un polipéptido receptor que no se une a una membrana celular. Lo más frecuente es que los receptores solubles sean polipéptidos receptores de unión al ligando que carecen de regiones transmembrana y citoplásmica, y de otros enlaces con la membrana celular tales como vía glicofosfoinositol (gpi). Los receptores solubles pueden comprender restos de aminoácidos adicionales, tales como etiquetas de afinidad que proporcionan la purificación del polipéptido o proporcionan lugares para la unión del polipéptido al sustrato, o secuencias de la región constante de la inmunoglobulina. Se han producido naturalmente muchos receptores superficiales celulares, contrapartes solubles que se producen mediante proteolisis o se traducen a partir de ARNm cortados y empalmados como alternativa. Los receptores solubles pueden ser monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos, o multiméricos, con receptores multiméricos que no comprenden generalmente más de 9 subunidades, que no comprenden preferiblemente más de 6 subunidades, y lo más preferible, que no comprenden más de 2 subunidades. Se dice que los polipéptidos receptores están sustancialmente libres de segmentos de polipéptidos transmembrana e intracelulares cuando carecen de suficientes porciones de estos segmentos para proporcionar un anclaje a la membrana o la transducción de la señal, respectivamente los receptores solubles de tipo I y tipo II de los receptores de citocinas comprenden generalmente la región de unión a la citocina extracelular libre de una región transmembrana y la región intracelular: Por ejemplo, los receptores solubles representativos incluyen receptores solubles de CRF2-4 (es decir, IL-10RB) (Nº de Acceso Genbank Z17227) como se muestra en la SEC. DE ID Nº 44 y la SEC. DE ID Nº 45; un receptor soluble de IL-10RA (Nos de Acceso Genbank U00672 y NM_001558) como se muestra en la SEC. DE ID Nº 46; un receptor soluble de pDIRS1 (es decir, IL-20RB) (Nº de Acceso Genbank AY358305) como se muestra en la SEC. DE ID Nº 47; y un receptor soluble de IL-22RA (Patente de los Estados Unidos Nº 5.965.704) como se muestra en la SEC. DE ID Nº 3. Está bien comprendido dentro del nivel de conocimiento de una persona experta en la técnica delinear qué secuencias de una secuencia conocida de citocina de tipo I o tipo II comprenden la región de unión a la citocina extracelular libre de una región transmembrana y la región intracelular. Además, una persona experta en la técnica que usa el código genético puede determinar fácilmente los polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos receptores solubles. [0041] La expresión “secuencia señal secretora” denota una secuencia de ADN que codifica un péptido (un “péptido secretor”) que, como componente de un polipéptido más grande, dirige el polipéptido mediante una ruta secretora de una célula en la que se sintetiza. El polipéptido más grande se escinde comúnmente para eliminar el péptido secretor durante el tránsito a través de la ruta secretora. [0042] Un “polipéptido aislado” es un polipéptido que está esencialmente libre de componentes celulares contaminantes, tales como carbohidratos, lípidos u otras impurezas proteináceas asociadas con el polipéptido en la naturaleza. Normalmente, una preparación de polipéptido aislado contiene el polipéptido en forma muy purificada, es decir, al menos aproximadamente un 80 % puro, al menos aproximadamente un 90 % puro, al menos aproximadamente un 95 % puro, más de un 95 % puro, tal como un 96 %, 97 %, o 98 % o más puro, o más de un 99 % puro. Un medio para mostrar que una preparación de proteína particular contiene un polipéptido aislado es mediante la aparición de una única banda tras la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS) de la preparación de proteína y la tinción del gel con Azul Brillante de Coomasie. Sin embargo, el término “aislado” no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tales como dímeros o formas como alternativa glicosiladas o derivatizadas. [0043] Los términos “aminoterminal” y “carboxiterminal” se usan en el presente documento para denotar posiciones en el polipéptido. Cuando el contexto lo permite, se usan estos términos con referencia a una secuencia o porción particular de un polipéptido para denotar proximidad o una posición relativa. Por ejemplo, una determinada secuencia situada carboxiterminal a una secuencia de referencia en un polipéptido se localiza próxima al término carboxilo de la secuencia de referencia, pero no necesariamente en el término carboxi del polipéptido completo. [0044] El término “expresión” se refiere a la biosíntesis de un producto génico.

Por ejemplo, en el caso de un gen estructural, la expresión implica la transcripción del gen estructural en el ARN y la traducción del ARNm en uno o más polipéptidos. [0045] La expresión “variante de corte y empalme” se usa en el presente documento para denotar formas alternativas del ARN transcrito de un gen. La variación de corte y empalme surge naturalmente a través del uso de lugares de corte y empalme alternativos en el interior de una molécula de ARN transcrito, o menos comúnmente entre moléculas de ARN transcritas separadamente, y puede dar como resultado diversos ARNm transcritos a partir del mismo gen. Las variantes de corte y empalme pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. El término variante de corte y empalme se usa también en el presente documento para denotar un polipéptido codificado por una variante de corte y empalme del ARNm transcrito a partir de un gen. [0046] Según se usa en el presente documento, el término “inmunomodulador” incluye citocinas, factores de crecimiento de citoblastos, linfotoxinas, moléculas coestimuladoras, factores hematopoyéticos, y similares, y los análogos sintéticos de estas moléculas. [0047] El término “pareja de complemento/anticomplemento” denota restos no idénticos que forman una pareja estable no asociada covalentemente en las condiciones apropiadas. Por ejemplo, biotina y avidina (o estreptavidina) son miembros prototípicos de una pareja de complemento/anticomplemento. Otras parejas de complemento/anticomplemento a modo de ejemplo incluyen parejas de receptor/ligando, parejas de anticuerpo/antígeno (o hapteno o epítopo), parejas de polinucleótidos de sentido directo/sentido contrario, y similares. Cuando es deseable la posterior disociación de la pareja de complemento/anticomplemento, la pareja de complemento/anticomplemento tiene, preferiblemente, una afinidad de unión de menos de 109 M-1. [0048] Un “anticuerpo antiidiotípico” es un anticuerpo que se une con el dominio de la región variable de una inmunoglobulina. En el presente contexto, un anticuerpo antiidiotípico se une con la región variable de un anticuerpo dirigido contra IL-22RA, y de esta manera, un anticuerpo antiidiotípico mimetiza un epítopo de IL-22RA. [0049] Un “fragmento de anticuerpo” es una porción de un anticuerpo tal como F(ab’)2, F(ab)2, Fab’, Fab, y similar. Con respecto a la estructura, un fragmento de anticuerpo se une con el mismo antígeno que se reconoce por el anticuerpo intacto. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo monoclonal dirigido contra IL-22RA se une con un epítopo de IL-22RA.

[0050] El término “fragmento de anticuerpo” incluye también un polipéptido sintético o construido mediante ingeniería sintética que se une a un antígeno específico, dichos polipéptidos están constituidos por la región variable de la cadena ligera, fragmentos “Fv” constituidos por las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, moléculas de polipéptidos de cadena única recombinante en los que las regiones variables ligera y pesada están conectadas por un péptido enlazante (“proteínas scFv”), y unidades mínimas de reconocimiento constituidas por los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable. [0051] Un “anticuerpo quimérico” es una proteína recombinante que contiene las regiones variables y regiones determinantes de la complementariedad derivadas de un anticuerpo de roedor mientras que el resto de la molécula de anticuerpo se deriva de un anticuerpo humano. [0052] Los “anticuerpos humanizados” son proteínas recombinantes en las que las regiones determinantes de la complementariedad en murino de un anticuerpo monoclonal se han transferido desde las cadenas variables pesada y ligera de la inmunoglobulina de murino a una región variable humana. La construcción de anticuerpos humanizados para uso terapéutico en seres humanos que se derivan de anticuerpos de murino, tales como los que se unen a o neutralizan una proteína humana, está comprendida dentro del conocimiento de una persona experta en la técnica. [0053] Según se usa en el presente documento, un “agente terapéutico” es una molécula o átomo que está conjugado con un resto de anticuerpo para producir un conjugado que es útil para terapia. Los ejemplos de agentes terapéuticos incluyen fármacos, toxinas, inmunomoduladores, quelantes, compuestos borados, agentes fotoactivos o colorantes, y radioisótopos. [0054] Una “marca detectable” es una molécula o átomo que se puede conjugar en un resto de anticuerpo para producir una molécula útil para diagnóstico. Los ejemplos de marcas detectables incluyen quelantes, agentes fotoactivos, radioisótopos, agentes fluorescentes, iones paramagnéticos u otros restos marcadores. [0055] La expresión “etiqueta de afinidad” se usa en el presente documento para denotar un segmento de polipéptido que se puede unir a un segundo polipéptido para posibilitar la purificación o detección del segundo polipéptido o posibilitar lugares de unión del segundo polipéptido a un sustrato. Principalmente, se puede usar cualquier péptido o proteína para los cuales está disponible un anticuerpo u otro agente de unión específico, como etiqueta de afinidad. Las etiquetas de afinidad incluyen un tramo de polihistidina, proteína A (Nilsson y col., EMBO J. 4: 1075 (1985); Nilsson y col., Methods Enzymol. 198:3 (1991)), glutatión S transferasa (Smith and Johnson, Gene

67: 31 (1988)), etiqueta de afinidad Glu-Glu (Grussenmeyer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952 (1985)), sustancia P, péptido FLAG (Hopp y col., Biotechnology 6:1204 (1988)), péptido de unión a estreptavidina, u otro epítopo antigénico o región de unión. Véase, en general, Ford y col., Protein Expression and Purification 2:95 (1991). Están disponibles de suministradores comerciales moléculas de ADN que codifican las etiquetas de afinidad (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). [0056] Un “anticuerpo desnudo” es un anticuerpo completo, en oposición a un fragmento de anticuerpo, que no está conjugado con un agente terapéutico los anticuerpos desnudos incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales, así como algunos anticuerpos recombinantes, tales como anticuerpos quiméricos y humanizados. [0057] Según se usa en el presente documento, el término “componente de anticuerpo” incluye el anticuerpo completo y un fragmento de anticuerpo. [0058] Un “inmunoconjugado” es un conjugado de un componente de anticuerpo con un agente terapéutico o una marca detectable. [0059] Según se usa en el presente documento, el término “proteína de condensación del anticuerpo” se refiere a una molécula recombinante que comprende un componente de anticuerpo y un componente del polipéptido IL-22RA. Los ejemplos de una proteína de condensación del anticuerpo incluyen una proteína que comprende una región extracelular de IL-22RA, y cualquiera de una región Fc o de una región de unión al antígeno. [0060] Un “polipéptido diana” o un “péptido diana” es una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un epítopo, y que se expresa en una célula diana, tal como una célula tumoral, o una célula que transporta un antígeno del agente infeccioso. Las células T reconocen los epítopos peptídicos presentados por una molécula del complejo de histocompatibilidad mayor a un polipéptido diana o péptido diana y lisan normalmente la célula diana o reclutan otras células inmunes en el lugar de la célula diana, eliminando por tanto la célula diana. [0061] Un “péptido antigénico” es un péptido que se unirá a una molécula del complejo de histocompatibilidad mayor para formar un complejo MHC-péptido que se reconoce por una célula T, induciendo por tanto una respuesta de los linfocitos citotóxicos tras la presentación a las células T. de esta manera, los péptidos antigénicos son capaces de unirse a una molécula del complejo de histocompatibilidad mayor e inducir una respuesta de las células T citotóxicas, tal como la lisis celular o la liberación de citocinas específicas contra la célula diana que se une o expresa el antígeno. El péptido antigénico se puede unir en el contexto de una molécula de tipo I

o del tipo II del complejo de histocompatibilidad mayor, o una célula que presenta el antígeno o sobre una célula diana. [0062] En eucariotas, la ARN polimerasa II cataliza la transcripción de un gen estructural para producir ARNm. Se puede diseñar una molécula de ácido nucleico para contener una plantilla de la ARN polimerasa II en la que la transcripción de ARN tiene una secuencia que es complementaria con la de un ARNm específico. La transcripción de ARN se denomina “ARN de sentido contrario” y una molécula de ácido nucleico que codifica el ARN de sentido contrario se denomina “gen de sentido contrario”. Las moléculas de ARN de sentido contrario son capaces de unirse a moléculas de ARNm, dando como resultado una inhibición de la traducción del ARNm. [0063] Un “oligonucleótido de sentido contrario específico de IL-22RA” o un “oligonucleótido de sentido contrario de IL-22RA” es un oligonucleótido que tiene una secuencia (a) capaz de formar un triplete estable con una porción del gen IL-22RA, o

(b) capaz de formar un duplete estable con una porción de una transcripción de ARNm del gen IL-22RA. [0064] Una “ribozima” es una molécula de ácido nucleico que contiene un centro catalítico. El término incluye las enzimas de ARN, los ARN autocortados y empalmados, los ARN autoescindidos, y las moléculas de ácido nucleico que llevan a cabo estas funciones catalíticas. Una molécula de ácido nucleico que codifica una ribozima se denomina un “gen ribozima”. [0065] Una secuencia “guía externa” es una molécula de ácido nucleico que dirige la ribozima endógena, la RNasa P, a una especie particular de ARNm intracelular, dando como resultado la escisión del ARNm por la RNasa P. una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia guía externa se denomina “gen de la secuencia guía externa”. [0066] La expresión ”gen IL-22RA variante” se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es una modificación de la SEC. DE ID Nº 3. Dichas variantes incluyen polimorfismos que se producen naturalmente de los genes IL-22RA, así como genes sintéticos que contienen sustituciones conservativas de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº 3. Las formas variantes adicionales de los genes IL-22RA con moléculas de ácidos nucleicos que contienen inserciones o delecciones de las secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento. Se puede identificar un gen IL-22RA variante, por ejemplo, determinando si el gen se hibrida con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC. DE ID Nº 1, o su complemento, en condiciones de restricción. [0067] Como alternativa, se pueden identificar genes IL-22RA variantes por comparación de la secuencia. Dos secuencias de aminoácidos tienen un “100 % de identidad de la secuencia de aminoácidos” si los restos de aminoácidos de las dos secuencias de aminoácidos son los mismos cuando se alinean para la máxima correspondencia Similarmente, dos secuencias de nucleótidos tienen un “100 % de identidad de la secuencia de nucleótidos” si los restos de nucleótidos de la dos secuencias de nucleótidos son los mismos cuando se alinean para la máxima correspondencia. Se pueden llevar a cabo comparaciones de secuencias usando programas de software estándares tales como los incluidos en la suite bioinformática LASERGENE, que está producida por DNASTAR (Madison, Wisconsin). Las personas expertas en la técnica conocen cien por otros procedimientos para comparar dos nucleótidos o las secuencias de aminoácidos determinando la alineación óptima (véanse, por ejemplo, Peruski y Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997), Wu y col. (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins," en Methods in Gene Biotechnology, páginas 123-151 (CRC Press, Inc. 1997), y Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc. 1998)). Se describen a continuación los Procedimientos particulares para determinar la identidad de la secuencia. [0068] Con respecto al procedimiento particular usado para identificar un gen IL22RA variante o polipéptido IL-22RA variante, se puede caracterizar funcionalmente la capacidad de un gen variante o polipéptido codificado por un gen variante de unirse específicamente con un anticuerpo dirigido contra IL-22RA. Se puede caracterizar funcionalmente la capacidad de un gen IL-22RA variante o polipéptido IL-22RA variante de unirse a su ligando, IL-22, usando un ensayo biológico o bioquímico descrito en el presente documento. [0069] El término “variante alélica” se usa en el presente documento para denotar cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente mediante mutación, y puede dar como resultado un polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen alterada la secuencia de aminoácidos. Se usa también el término variante alélica en el presente documento para denotar una proteína codificada por una variante alélica de un gen. [0070] El término “ortólogo” denota un polipéptido o proteína obtenido de una especie que es la contraparte funcional de un polipéptido o proteína procedente de diferentes especies. Las diferencias de secuencias entre ortólogos son el resultado de la especiación. [0071] “Parálogas” son proteínas distintas pero estructuralmente relacionadas fabricadas por un organismo. Se cree que las proteínas parálogas surgen de la duplicación génica. Por ejemplo, α-globina, β-globina, y mioglobina son parálogas entre sí. [0072] La presente invención incluye fragmentos funcionales de los genes IL22RA. Dentro del contexto de esta invención, un “fragmento funcional” de un gen IL22RA se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una porción de un polipéptido IL-22RA que es una región descrita en el presente documento o al menos se une específicamente con un anticuerpo dirigido contra IL-22RA. [0073] Debido a la imprecisión de los procedimientos analíticos estadarizados, se entiende que los pesos moleculares y las longitudes de los polímeros tienen valores aproximados. Cuando se expresa dicho valor como “en torno” a X o “aproximadamente” X, se entenderá que el valor establecido de X tendrá una precisión de ± 10 %.

3. PRODUCCIÓN DE POLINUCLEÓTIDOS O GENES IL-22RA

[0074] Se pueden obtener moléculas de ácido nucleico que codifican un gen IL22RA humano cribando un ADNc humano o una biblioteca genómica usando sondas de polinucleótidos basadas en la SEC. DE ID Nº 1. Estás técnicas son estándares y bien establecidas, y se pueden llevar a cabo usando kits de clonación disponibles de suministradores comerciales. Véanse, por ejemplo, Ausubel y col. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3ª Edición, John Wiley & Sons 1995; Wu y col., Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc. 1997; Aviv y Leder, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 69:1408 (1972); Huynh y col., "Constructing and Screening cDNA Libraries in λgt10 and λgt11," en DNA Cloning: A Practical Approach Vol. I, Glover (ed.), página 49 (IRL Press, 1985); Wu (1997) en las páginas 47-52. [0075] Se pueden obtener también moléculas de ácido nucleico que codifican un gen IL-22RA humano usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores oligonucleótidos que tienen secuencias de nucleótidos que se basan en las secuencias de nucleótidos del gen IL-22RA o ADNc. Se proporcionan procedimientos generales para cribar bibliotecas con la PCR en, por ejemplo, Yu y col., "Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries," en Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), Humana Press, Inc., 1993. Además, se describen técnicas para usar la PCR para aislar genes relacionados en, por ejemplo, Preston, "Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members," en Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), Humana Press, Inc. 1993. Como alternativa, se puede obtener un gen IL-22RA sintetizando moléculas de ácido nucleico usando oligonucleótidos de longitud mutuamente cebados y las secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento 8véase, por ejemplo, Ausebel (1995)). Las técnicas establecidas que usan la reacción en cadena de la polimerasa proporcionan la capacidad de sintetizar moléculas de ADN de al menos dos kilobases de longitud (Adang y col., Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993), Bambot y col., PCR Methods and Applications 2:266 (1993), Dillon y col., "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes," en Methods in Molecular Biology, Vol.

15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), páginas 263-268, (Humana Press, Inc. 1993), y Holowachuk y col., PCR Methods Appl. 4:299 (1995)). For reviews on polynucleotide synthesis, véanse, por ejemplo, Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura y col., Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984), y Climie y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 87:633 (1990).

4. PRODUCCIÓN DE VARIANTES DE GENES IL-22RA

[0076] La presente invención proporciona una variedad de moléculas de ácido nucleico, que incluyen moléculas de ADN y ARN, que codifican los polipéptidos IL22RA dados a conocer en el presente documento. Las personas expertas en la técnica reconocerán fácilmente que, a la vista de la degeneración del código genético, es posible una variación considerable de la secuencia entre estas moléculas de polinucleótidos. Además, la presente memoria descriptiva describe polipéptidos receptores solubles monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos y multiméricos que comprenden al menos una subunidad del receptor IL-22RA que es sustancialmente homóloga con el polipéptido receptor de la SEC. DE ID Nº 3. De esta manera, la presente memoria descriptiva describe moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos IL-22RA que comprenden nucleótidos degenerados de la SEC. DE ID Nº

1, y sus equivalentes de ARN. [0077] La Tabla 1 muestra los códigos de una letra que denotan las posiciones de los nucleótidos degenerados. “Resoluciones” son los nucleótidos denotados por una letra de código. “Complemento” indica el código del nucleótido(s) complementario.

5 Por ejemplo, el código Y denota tanto C como T, y su complemento R denota A o G, siendo A complementario a T, y siendo G complementario a C.

Tabla 1

Nucleótido

Resolución Complemento Resolución

A

A

T T

C

C

G G

G

G

C C

T

T

A A

R

A|G Y C|T

Y

C|T R A|G

M

A|C K G|T

K

G|T M A|C

S

C|G S C|G

W

A|T W A|T

H

A|C|T D A|G|T

B

C|G|T V A|C|G

V

A|C|G B C|G|T

D

A|G|T H A|C|T

N

A|C|G|T N A|C|G|T

[0078] Se muestran en la Tabla 2 los codones degenerados, que abarcan todos los posibles codones de un aminoácido dado.

5

Tabla 2

Aminoácido

Código de una letra Codones Codón degenerado

Cys

C TGC TGT TGY

Ser

S AGC AGT TCA TCC TCG TCT WSN

Thr

T ACA ACC ACG ACT ACN

Pro

P CCA CCC CCG CCT CCN

Ala

A GCA GCC GCG GCT GCN

Gly

G GGA GGC GGG GGT GGN

Asn

N AAC AAT AAY

Asp

D GAC GAT GAY

Glu

E GAA GAG GAR

Gln

Q CAA CAG CAR

His

H CAC CAT CAY

Arg

R AGA AGG CGA CGC CGG CGT MGN

Lys

K AAA AAG AAR

Met

M ATG ATG

Ile

I ATA ATC ATT ATH

Leu

L CTA CTC CTG CTT TTA TTG YTN

Val

V GTA GTC GTG GTT GTN

Phe

F TTC TTT TTY

Tyr

Y TACTAT TAY

Trp

W TGG TGG

Ter

. TAA TAG TGA TRR

Asn|Asp

B RAY

Glu|Gln

Z SAR

Any

X NNN

[0079] Una persona normalmente experta en la técnica apreciará que se introduce alguna ambigüedad en la determinación de un código degenerado, representativo de todos los posibles codones que codifican un aminoácido. Por ejemplo, el codón 5 degenerado de la serina (WSN) puede, en algunas circunstancias, codificar la arginina (AGR), y el codón degenerado de la arginina (MGN) puede, en algunas circunstancias, codificar la serina (AGY). Existe una relación similar entre los codones que codifican la fenilalanina y la leucina. De esta manera, algunos polinucleótidos abarcados por la

secuencia degenerada pueden codificar secuencias de aminoácidos variantes pero una persona normalmente experta en la técnica puede identificar fácilmente dichas secuencias variantes por referencia a las secuencias de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº 3. Se pueden ensayar fácilmente las secuencias variantes para la funcionalidad, según se describe en el presente documento. [0080] Diferentes especies pueden presentar “utilización preferente del codón”. Véanse, en general, Grantham y col., Nucl. Acids Res. 8: 1893 (1980), Haas y col. Curr. Biol. 6: 315 (1996), Wain-Hobson y col., Gene 13:355 (1981), Grosjean y Fiers, Gene 18: 199 (1982), Holm, Nuc. Acids Res. 14: 3075 (1986), Ikemura, J. Mol. Biol.

158: 573 (1982), Sharp y Matassi, Curr. Opin. Genet. Dev. 4:851 (1994), Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6: 494 (1995), y Makrides, Microbiol. Rev. 60: 512 (1996). Según se usa en el presente documento, el término “utilización preferente del codón” o “codón preferente” es un término de una técnica que se refiere a codones de traducción de proteínas que se usan más frecuentemente en células de algunas especies, favoreciendo de esta manera uno o unos pocos de los posibles codones representativos que codifican cada aminoácido (Véase la Tabla 2). Por ejemplo, se puede codificar el aminoácido treonina (Thr) por ACA, ACC, ACG, o ACT, pero en células de mamíferos ACC es el codón más comúnmente usado; en otras especies, por ejemplo, células de insectos, levaduras, virus o bacterias, pueden ser preferentes diferentes codones de Thr. Se pueden introducir codones preferentes de una especie particular en los polinucleótidos de la presente invención mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. La introducción de secuencias de codones preferentes en el ADN recombinante puede, por ejemplo, potenciar la producción de proteína haciendo la traducción de la proteína más eficaz dentro de un tipo celular o especie particular. Por tanto, las secuencias de codones degenerados dadas a conocer en el presente documento sirven como plantilla para optimizar la expresión de polinucleótidos en diversos tipos celulares y especies comúnmente usados en la técnica y dados a conocer en el presente documento. Se pueden ensayar y optimizar las secuencias que contienen codones preferentes para la expresión en diversas especies, y ensayarse para la funcionalidad según se da a conocer en el presente documento. [0081] Se puede aislar un ADNc que codifica IL-22RA mediante una variedad de procedimientos, tales como sondeando con un ADNc humano completo o parcial o con uno o más conjuntos de sondas degeneradas basadas en las secuencias dadas a conocer. Se puede clonar también un ADNc usando la reacción en cadena de la polimerasa con cebadores diseñados a partir de las secuencias de IL-22RA humanas representativas dadas a conocer en el presente documento. Adicionalmente, se puede usar una biblioteca de ADNc para transformar o transfectar células hospedadoras, y se puede detectar la expresión del ADNc de interés con un anticuerpo para el polipéptido IL22RA. [0082] Las personas expertas en la técnica reconocerán que la secuencia dada a conocer en la SEC. DE ID Nº 1 representa un alelo único de IL-22RA humano, y que se espera que se produzcan esta variación alélica y el corte y empalme alternativo. Se pueden clonar variantes alélicas de esta secuencia sondando el ADNc o las bibliotecas genómicas de diferentes individuos según los procedimientos normalizados. Las variantes alélicas de las secuencias de nucleótidos dadas a conocer en el presente documento, que incluyen las que contienen mutaciones silenciosas y aquellas en las cuales las mutaciones dan como resultado cambios en la secuencia de aminoácidos, están dentro del alcance de la presente invención, ya que son proteínas que son variantes alélicas de las secuencias de aminoácidos dadas a conocer en el presente documento, se describen en el presente documento moléculas de ADNc generadas a partir de ARNm cortados y empalmados como alternativa, que retienen las propiedades del polipéptido IL-22RA, ya que son polipéptidos codificados por dichos ADNc y ARNm. Se pueden clonar las variantes alélicas y variantes de corte y empalme de estas secuencias sondando el ADNc o las bibliotecas genómicas de diferentes individuos o tejidos según los procedimientos normalizados conocidos en la técnica. [0083] Usando los procedimientos discutidos anteriormente, una persona normalmente experta en la técnica puede preparar una variedad de polipéptidos que comprenden una subunidad del receptor soluble de IL-22RA que es sustancialmente homóloga a la SEC. DE ID Nº 1, o que codifica los aminoácidos de la SEC. DE ID Nº 3, o sus variantes alélicas y retiene las propiedades de unión al ligando del receptor de IL-R22A natural. Dichos polipéptidos pueden incluir también segmentos polipeptídicos adicionales según se da a conocer generalmente en el presente documento. [0084] Las moléculas de ácido nucleico aislado pueden hibridarse en condiciones de restricción con moléculas de ácido nucleico que comprenden las secuencias de nucleótidos dadas a conocer en el presente documento. Por ejemplo, dichas moléculas de ácido nucleico pueden hibridarse en condiciones de restricción con moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos de la SEC. DE ID Nº 1, o con moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos complementaria con la SEC. DE ID Nº 1, o sus fragmentos. [0085] En general, las condiciones de restricción se seleccionan para que sean aproximadamente de 5º C menos que las del punto de ebullición térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos) a la cual el 50 % de la secuencia diana se hibrida con una sonda perfectamente emparejada. Tras la hibridación, se pueden lavar las moléculas de ácido nucleico para eliminar las moléculas de ácido nucleico no hibridadas en condiciones de restricción, o en condiciones muy restrictivas. (Véanse, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausebel y col., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger y Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); y Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990)). Software de análisis de secuencias tal como OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) y Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA), así como las páginas web en internet, son herramientas disponibles para analizar una secuencia dada y calcular la Tm, basándose en criterios definidos por el usuario. Está dentro de las capacidades de una persona experta en la técnica adaptar las condiciones de hibridación y lavado para el uso con un polinucleótido híbrido particular. [0086] La presente memoria descriptiva describe polipéptidos IL-22RA aislados que tienen una identidad de secuencia sustancialmente similar a la de los polipéptidos de la SEC. DE ID Nº 3, o sus análogos. El término “identidad de secuencia sustancialmente similar” se usa en el presente documento para denotar polipéptidos que tienen al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, tal como un 96 %, 97 %, 98 %, o más de un 95 % de identidad de la secuencia con las secuencias que se muestran en la SEC E ID Nº 3, o sus ortólogos. Por ejemplo, se pueden usar receptores de IL-R22A variantes y ortólogos para generar una respuesta inmune y aumentar los anticuerpos con reactividad cruzada a IL-R22A humano. Se pueden humanizar dichos anticuerpos, y modificarse según se describe en el presente documento, y usarse terapéuticamente para tratar la psoriasis, la artritis psoriática, la IBD, la colitis, la endotoxemia así como en otras actividades terapéuticas descritas en el presente documento. [0087] La presente memoria descriptiva describe moléculas de ácido nucleico variantes de IL-22RA que se pueden identificar usando dos criterios: una determinación de la similitud entre el polipéptido codificado con la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº 3, y un ensayo de hibridación. Dichas variantes de IL-22RA incluyen moléculas de ácido nucleico (1) que permanecen hibridadas con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC. DE ID Nº 1 (o su complemento) en condiciones de lavado de restricción, en la que la restricción del lavado es equivalente a 0,5x – 2xSSC con SDS al 0,1 % a 55 – 65º C, y (2) que codifican un polipéptido que tiene al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, o más de un 95 %, tal como un 96 %, 97%, 98 %, o 99 %, de identidad de la secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº 3 Como alternativa, se pueden caracterizar las variantes de IL-22RA como moléculas de ácido nucleico (1) que permanecen hibridadas con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC. DE ID Nº 1 (o su complemento) en condiciones de lavado muy restrictivas, en las que la restricción del lavado es equivalente a 0,1x – 0,2x SSC con SDS al 0,1 % a 50 – 65º C, y (2) que codifican un polipéptido que tiene al meno un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o más de un 95 %, tal como un 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % o más, de identidad de la secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº 3. [0088] Se determina el porcentaje de identidad de la secuencia mediante procedimientos convencionales. Véanse, por ejemplo, Altschul y col., Bull. Math. Bio.

48:603 (1986), y Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992). Brevemente, dos secuencias de aminoácidos se alinean para optimizar las puntuaciones de la alineación usando una penalización por apertura de hueco de 10, una penalización por extensión de hueco de 1, y la matriz de puntuación “BLOSUM62” de Henikoff y Henikoff (ibid.) que se muestra en la Tabla 3 (se indican los aminoácidos mediante los códigos de una letra estándares). A continuación se calcula el porcentaje de identidad como. ([Número total de emparejamiento idénticos]/[longitud de la secuencia más larga más el número de huecos introducido en la secuencia más larga con el fin de alinear las dios secuencias]) (100).

Tabla 3

A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V A 4 R -1 5 N -2 0 6 D -2 -2 1 6 C 0 -3 -3 -3 9 Q -1 1 0 0 -3 5 E -1 0 0 2 -4 2 5 G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6 H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8 I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4 L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4 K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5 M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5 F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6 P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7 S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4 T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5 W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 -1 -4 -3 -2 11 Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7 V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0-3 -1 4 [0089] Las personas expertas en la material aprecian que existen muchos algoritmos establecidos disponibles para alinear dos secuencias de aminoácidos. El algoritmo de búsqueda de similitud “FASTA” de Pearson y Lipman es un procedimiento de alineación de proteínas adecuado para examinar el nivel de identidad compartido por una secuencia de aminoácidos dada a conocer en el presente documento y la secuencia de aminoácidos de una presunta variante de IL-22RA. Pearson y Litman describen el algoritmo FASTA, Proc. Nat’l acad. Sci. USA 85: 2444 81988), y por Pearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990). Brevemente, FASTA caracteriza en primer lugar la similitud de la secuencia identificando secuencias compartidas por la secuencia solicitada (por ejemplo, SEC. DE ID Nº 2 o SEC. DE ID Nº 3) y una secuencia de ensayo que tiene tanto la densidad más elevada de identidades (si la variable ktup es 1) como parejas de identidades (si ktup = 2), sin considerar las sustituciones, inserciones, o delecciones conservativas de aminoácidos).

Las diez regiones con la densidad más elevada de identidades se vuelven a continuación a puntuar comparando la similitud de todos los aminoácidos emparejados usando una matriz de sustitución de aminoácidos, y se·”recortan” los extremos de las regiones para incluir únicamente los restos que contribuyen a la puntuación más elevada. Si existen algunas regiones con puntuaciones mayores de las del valor de corte (calculado mediante una fórmula predeterminada basada en la longitud de la secuencia y el valor de ktup), entonces, se examinan las regiones iniciales recortadas, para determinar si se pueden unir las regiones para formar una alineación con huecos aproximada. Finalmente, se alinean las regiones con puntuación más elevada de las dos secuencias de aminoácidos usando una modificación del algoritmo de NeedlemanWunchs-Sellers (Needleman y Wuncsch, J. mol. Biol. 48: 444 81970). Sellers, SIAM

J. Appl. Math. 26: 787 (1974)), que permite las inserciones y delecciones de aminoácidos. Los parámetros ilustrativos para el análisis FASTA son ktup = 1, penalización por apertura de hueco-10, penalización por extensión de hueco = 1, y matriz de sustitución = BLOSUM62. se pueden introducir estos parámetros en un programa FASTA modificando el archivo de la matriz de puntuación (“SMATRIX”), según se explica en el Apéndice 2 de Pearson, Meth. Enzymol. 183. 63 (1990). [0090] Se puede usar también FASTA para determinar la identidad de la secuencia de las moléculas de ácido nucleico usando una relación según se han dado a conocer anteriormente. Para comparaciones de las secuencias de nucleótidos, el valor ktup puede oscilar entre uno y seis, preferiblemente entre tres y seis, lo más preferible tres, con otros parámetros configurados como se describe anteriormente. [0091] La presente memoria descriptiva describe moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que tienen un cambio conservativo de aminoácidos, en comparación con la secuencia de aminoácidos dada a conocer en el presente documento. Por ejemplo, se pueden obtener variantes que contengan una o más sustituciones de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº 3, en la que un alquil aminoácido se sustituye por un alquil aminoácido en una secuencia de aminoácidos de IL-22RA, se sustituye un aminoácido aromático por un aminoácido aromático en una secuencia de aminoácidos de IL-22RA, se sustituye un aminoácido que contiene azufre por un aminoácido que contiene azufre por un aminoácido que contiene azufre en una secuencia de aminoácidos de IL-22RA, se sustituye un aminoácido que contiene hidroxi por un aminoácido que contiene hidroxi en una secuencia de aminoácidos de IL-22RA, se sustituye un aminoácido ácido por un aminoácido ácido en una secuencia de aminoácidos de IL-22RA, se sustituye un aminoácido básico por un aminoácido básico en una secuencia de aminoácidos de IL-22RA, o se sustituye un aminoácido monocarboxílico dibásico por un aminoácido monocarboxílico dibásico en una secuencia de aminoácidos de IL-22RA. Entre los aminoácidos comunes, por ejemplo, se ilustra una “sustitución conservativa de aminoácidos” por una sustitución entre aminoácidos dentro de cada uno de los siguientes grupos. (1) glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina, (2) fenilalanina, tirosina, y triptófano, (3) serina y treonina, (4) aspartato y glutamato, (5) glutamina y asparagina, y (6) lisina, arginina e histidina. La tabla BLOSUM62 es una matriz de sustitución de aminoácidos derivada de aproximadamente 2.000 alineaciones múltiples locales de segmentos de la secuencia de proteínas, que representan regiones muy conservadas de más de 500 grupos de proteínas relacionadas (Henikoff y Henikoff, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 89: 10915 (1992)). Según esto, se pueden usar frecuencias de sustitución de BLOSUM62 para definir sustituciones conservativas de aminoácidos que se pueden introducir en las secuencias de aminoácidos de la presente invención. Aunque es posible diseñar sustituciones de aminoácidos basadas únicamente en las propiedades químicas (según se ha discutido anteriormente), el lenguaje “sustitución conservativa de aminoácidos” se refiere preferiblemente a una sustitución representada por un valor de BLOSUM62 de más de -1. por ejemplo, una sustitución de aminoácidos es conservativa si la sustitución se caracteriza por un valor de BLOSUM62 de 0, 1, 2, ó 3. según este sistema, las sustituciones conservativas de aminoácidos preferidas se caracterizan por un valor de BLOSUM62 de al menos 1 (por ejemplo, 1, 2 o 3), aunque las sustituciones conservativas de aminoácidos más preferidas se caracterizan por un valor de BLOSUM62 de al menos 2 (por ejemplo, 2 ó 3). Las variantes particulares de IL22RA se caracterizan por tener al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o más de un 95 %, tal como un 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % o más de identidad de la secuencia con la secuencia de aminoácidos correspondiente (por ejemplo, la SEC. DE ID Nº 3), en la que la variación en la secuencia de aminoácidos es debida a una o más sustituciones conservativas de aminoácidos. [0092] Se pueden introducir cambios conservativos de aminoácidos en un gen IL22RA, por ejemplo, sustituyendo nucleótidos por los nucleótidos descritos en la SEC. DE ID Nº 1. Dichas variantes “conservativas de aminoácidos” se pueden obtener mediante mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, mutagénesis de escaneo de enlazantes, mutagénesis usando la reacción en cadena de la polimerasa, y similares (véanse Ausebel (1995); y McPherson (ed.), Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991)). Se puede identificar una variante del polipéptido IL22RA mediante la capacidad para unirse específicamente a anticuerpos dirigidos contra IL-22RA. [0093] Las proteínas descritas en el presente documento pueden comprender también restos de aminoácidos que no se producen naturalmente. Los aminoácidos que no se producen naturalmente incluyen, sin limitación, trans-3-metilprolina, 2,4metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alotreonina, metiltreonina, hidroxietilcisteína, hidroxietilhomocisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, tiazolidina, ácido carboxílico, deshidroprolina, 3 y 4-metilprolina, 3,3-dimetilprolina, terc-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3azafenilalanina, 4-azafenilalanina 4-fluorofenilalanina. Se conocen en la técnica diversos procedimientos para incorporar restos de aminoácidos que no se producen naturalmente en proteínas. Por ejemplo, se puede emplear un sistema in vitro en el que se suprimen las mutaciones sin sentido usando supresores del ARNt químicamente aminoacilados. Se conocen en la técnica los procedimientos para sintetizar aminoácidos y aminoacilar el ARNt. La transcripción y la traducción de plásmidos que contienen mutaciones sin sentido se lleva a cabo normalmente en un sistema libre de células que comprende un extracto de S30 de E. coli y enzimas comercialmente disponibles y otros reactivos. Se purifican las proteínas mediante cromatografía. Véanse, por ejemplo, Robertson y col., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722 (1991), Ellman y Chung y col., Methods Enzymol. 202: 301 (1991), Chung y col., Science 259: 806 (1993), y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 90: 10145 (1993). [0094] En un segundo procedimiento, se lleva a cabo la traducción en oocitos de Xenopus mediante microinyección de ARNm mutado y ARNt supresor químicamente aminoacilado (Turcatti y col., J. Biol. Chem. 271: 19991 (1996)). Dentro de un tercer procedimiento, se cultivan células de E. coli en ausencia de un aminoácido natural que se va a sustituir (por ejemplo, fenilalanina) y en presencia del aminoácido(s) deseado que no se produce naturalmente (por ejemplo, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4azafenilalanina, o 4-fluorofenilalanina). El aminoácido que no se produce naturalmente se incorpora en las proteínas en lugar de su contraparte natural. Véase Koide y col., Biochem. 33: 7470 (1994). Se pueden convertir los restos de aminoácidos que se producen naturalmente en especies que no se producen naturalmente mediante modificación química in vitro. Se puede combinar la modificación química con la mutagénesis dirigida al emplazamiento para expandir adicionalmente el intervalo de sustituciones (Wynn y Richards, Protein Sci. 2. 395 (1993)). [0095] Se pueden sustituir un número limitado de aminoácidos no conservativos, aminoácidos que no están codificados por el código genético, aminoácidos que no se producen naturalmente y aminoácidos no naturales por restos de aminoácidos de IL22RA. [0096] Se pueden identificar aminoácidos esenciales en los polipéptidos descritos en el presente documento según los procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida al emplazamiento o la mutagénesis de escaneo de alanina (Cunningham y Wells, science 244; 1081 (1989), Bass y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 88: 4498 (1991), Coombs y Corey, “Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering”, en proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed), páginas 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)). En la última técnica, se introducen mutaciones únicas de alanina en cada resto en la molécula, y se ensayan las moléculas mutantes resultantes para la actividad biológica para identificar restos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Véase también, Milton y col., J. Biol. Chem. 271. 4699 (1996). [0097] Aunque se puede usar el análisis de la secuencia para definir adicionalmente la región de unión al ligando IL-22RA, se pueden determinar también los aminoácidos que juegan un papel en la actividad de unión a IL-22RA (tal como la unión de IL-22RA al ligando IL-22, o a un anticuerpo dirigido contra IL-22RA) mediante el análisis físico de la estructura, según se determina mediante dichas técnicas tales como la resonancia magnética nuclear, la cristalografía, la difracción de electrones o el marcado de fotoafinidad, junto con la mutación de los posibles aminoácidos del sitio de contacto. Véanse, por ejemplo, de Vos y col., Science 255. 306 (1992), smith y col., J Mol. Biol. 224: 899 (1992), y Wlodaver y col., FEBS Lett.

309: 59 (1992). [0098] Se pueden hacer múltiples sustituciones de aminoácidos y ensayarse usando procedimientos conocidos de mutagénesis y cribado, tales como los dados a conocer por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241: 53 (1988)) o Bowie y Sauer (Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86: 2152 (1989)). Brevemente, estos autores dan a conocer procedimientos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionándolas para el polipéptido funcional, y a continuación secuenciando los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permisibles en cada posición. otros procedimientos que se pueden usar incluyen la presentación de fagos (por ejemplo, Lowman y col., Biochem. 30: 10832 (1991), Ladner y col., Patente de los Estados Unidos Nº 5.223.409, Huse, publicación internacional Nº WO 92/06204, y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire y col.,

Gene 46: 145 (1986), y Ner y col., DNA 7: 127, (1988)). Además, se puede usar IL22RA marcado con biotina o FITC para la clonación de la expresión de los ligandos de IL-22RA. [0099] Se pueden generar también variantes de los nucleótidos y secuencias polipeptídicas de IL-22RA dados a conocer mediante arrastre del ADN, según se da a conocer por Stemmer, Nature 370: 389 (1994), Stemmer, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA

91: 10747 (1994), y la publicación internacional No WO 97/20078. brevemente, se generan moléculas variantes de ADN mediante recombinación homóloga in vitro mediante fragmentación aleatoria de un ADN parental seguido por reensamblaje usando la PCR., dando como resultado mutaciones puntuales introducidas aleatoriamente: Se puede modificar esta técnica usando una familia de moléculas de ADN parentales, tal como variantes alélicas o moléculas de ADN de diferentes especies, para introducir variabilidad adicional en el proceso. La selección o cribado de la actividad deseada, seguido por iteraciones adicionales de la mutagénesis y ensayo proporciona una rápida “evolución” de secuencias seleccionando las mutaciones deseables a la vez que seleccionándolas simultáneamente contra cambios perjudiciales. [0100] Se dan a conocer en el presente documento procedimientos de mutagénesis que se pueden combinar con elevado rendimiento, procedimientos automatizados de cribado para detectar la actividad de los polipéptidos mutagenizados clonados en células hospedadoras. Las moléculas de ADN mutagenizado que codifican los polipéptidos biológicamente activos, o los polipéptidos que se unen con anticuerpos dirigidos contra IL-22RA, se pueden recuperar de las células rápidamente usando equipo módem. Estos procedimientos permiten la rápida determinación de la importancia de los restos de aminoácidos funcionales en un polipéptido de interés, y se pueden aplicar a polipéptidos de estructura desconocida. [0101] La presente memoria descriptiva describe “fragmentos funcionales” de polipéptidos y moléculas de ácido nucleico de IL-22RA que codifican dichos fragmentos funcionales. Se pueden llevar a cabo análisis rutinarios de delección de las moléculas de ácido nucleico para obtener fragmentos funcionales de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de IL-22RA. Como ilustración, se pueden digerir moléculas de ADN que tienen la secuencia de nucleótidos de la SEC. DE ID Nº 1 con la nucleasa Bal31 par obtener una serie de delecciones anidadas. A continuación se insertan los fragmentos en vectores de expresión en un marco de lectura apropiado, y se aíslan y ensayan los polipéptidos expresados para la capacidad de unirse a anticuerpos dirigidos contra IL-22RA. Una alternativa a la digestión de la exonucleasa es usar la mutagénesis dirigida a oligonucleótidos para introducir delecciones o codones de detención para especificar la producción de un fragmento deseado. Como alternativa, se pueden sintetizar fragmentos de un gen IL-22RA usando la reacción en cadena de la polimerasa.

5 [0102] Se ejemplifica esta solución general mediante estudio sobre el truncamiento en cualquiera o ambos términos de los interferones que se han resumido por Horisberger y Di Marco, Pharmac. Ther. 66:507 (1995). Además, se describen técnicas normalizadas para el análisis funcional de las proteínas en, por ejemplo, Treuter y col., Molec. Gen. Genet. 240: 113 (1993), Content y col., "Expression and

10 preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon," en Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), páginas 65-72 (Nijhoff 1987), Herschman, "The EGF Receptor," en Control of Animal Cell Proliferation, Vol. 1, Boynton y col., (eds.) páginas 169-199 (Academic Press 1985), Coumailleau y col., J. Biol. Chem. 270:

15 29270 (1995); Fukunaga y col., J. Biol. Chem. 270: 25291 (1995); Yamaguchi y col., Biochem. Pharmacol. 50: 1295 (1995), y Meisel y col., Plant Molec. Biol.30: 1 (1996). [0103] El análisis de las secuencias particulares dadas a conocer en el presente documento proporciona un conjunto de fragmentos funcionales ilustrativos presentados en la Tabla 4. Se pueden determinar los nucleótidos que codifican regiones

20 variantes funcionales de IL-22Ra humana descritas en el presente documento, que no se muestran en la Tabla 4, con referencia a la SEC. DE ID Nº 1. dichos fragmentos funcionales incluyen, por ejemplo, las siguientes secuencias de nucleótidos de la SEC. DE ID Nº 1: nucleótidos 85-381, 206-717 y 85-717 de la SEC. DE ID Nº 1, y las secuencias de aminoácidos correspondientes codificadas por tanto como se muestra en

25 la SEC. DE ID Nº 2 y la SEC. DE ID Nº 3, respectivamente. Tabla 4

Característica de IL22RA

Restos de aminoácidos (SEC. DE ID Nº 2) Nucleótidos (SEC. DE ID Nº 1)

Primera región Ig

18-116 85-381

Segunda región Ig

125-228 206-717

Ambas regiones Ig

18-228 85-717

[0104] La presente memoria descriptiva describe fragmentos funcionales de un gen IL-22RA que tienen cambios de aminoácidos, en comparación con una secuencia de aminoácidos dada a conocer en el presente documento. Se puede identificar una 30 variante del gen IL-22RA sobre la base de la estructura, determinando el nivel de

identidad con los nucleótidos y secuencias de aminoácidos dados a conocer, según se ha descrito anteriormente. Una solución alternativa para identificar una variante de un gen sobre la base de la estructura es determinar si una molécula de ácido nucleico que codifica una variante potencial de un gen IL-22RA puede hibridarse con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos, tal como la SEC. DE ID Nº 1. [0105] La presente memoria descriptiva describe el uso de fragmentos funcionales de polipéptidos de IL-22RA, epítopos antigénicos, porciones que soportan epítopos de polipéptidos de IL-22RA, y moléculas de ácidos nucleicos que codifican dichos fragmentos funcionales, epítopos antigénicos, porciones que soportan epítopos de polipéptidos de IL-22RA. Se usan dichos fragmentos para generar polipéptidos para uso en la generación de anticuerpos y compañeros de unión que se unen, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan o neutralizan la actividad de IL-22 o de IL-20 e IL-22. Un polipéptido de IL-22RA “funcional” o su fragmento, según se define en el presente documento, se caracteriza por su capacidad para bloquear, inhibir, reducir, antagonizar

o neutralizar la actividad inflamatoria, proliferativa o diferenciadora de IL-20 o IL-22, mediante su capacidad para inhibir o inducir funciones celulares especializadas, o mediante su capacidad para unirse específicamente a un anticuerpo dirigido contra IL22RA, una célula, IL-20 o IL-22. según se ha descrito anteriormente en el presente documento, IL-22RA se caracteriza por una estructura y las regiones del receptor de la citocina de tipo II, según se describe en el presente documento. De esta manera, la presente memoria descriptiva describe el uso de proteínas de condensación que abarcan:

(a)

moléculas de polipéptido que comprenden una o más de las regiones descritas anteriormente; y

(b)

fragmentos funcionales que comprenden una o más de estas regiones. La otra porción de polipéptidos de la proteína de condensación puede estar contribuidas por otro receptor de la citocina de tipo II, tal como IL-10R, IL-13R, IL-20RA, IL-20RB, IL-10RB (CRF2-4), IL-22RA2, o mediante un péptido señal secretor no natural y/o no relacionado que facilita la secreción de la proteína de condensación.

[0106] La presente memoria descriptiva describe fragmentos polipéptidicos o péptidos que comprenden una porción que soporta un epítopo de un polipéptido de IL22RA descrito en el presente documento. Dichos fragmentos o péptidos pueden comprender un “epítopo inmunógeno”, que es una parte de una proteína que estimula una respuesta a un anticuerpo cuando se usa la proteína completa como inmunógeno. Se pueden identificar los péptidos que soportan epítopos inmunógenos usando procedimientos normalizados (véase, por ejemplo, Geysen y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 81: 3998 (1983)). [0107] En contraste, los fragmentos polipéptidicos o péptidos pueden comprender un “epítopo antigénico”, que es una región de una molécula de proteína que se puede unir específicamente a un anticuerpo. Algunos epítopos están constituidos por un tramo lineal o contiguo de aminoácidos, y la antigenicidad de dicho epítopo no se perturba por agentes desnaturalizantes. Se conoce en la técnica que se pueden usar péptidos sintéticos relativamente cortos que pueden minimizar epítopos de una proteína para estimular la producción de anticuerpos dirigidos contra la proteína (véase, por ejemplo, Sutcliffe y col., Science 219:660 (1983)). Según esto, los péptidos que soportan epítopos antigénicos, péptidos antigénicos, epítopos, y polipéptidos, so n útiles para incrementar los anticuerpos que se unen con los polipéptidos descritos en el presente documento, así como para identificar y cribar anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL-22RA que son neutralizantes, y que se pueden unir, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la actividad de IL-22 e IL-20 (individual o conjuntamente). Dichos anticuerpos monoclonales neutralizantes de la presente invención pueden unirse a un epítopo antigénico de IL-22RA. Se pueden usar perfiles de hidrofilia Hopp/Woods para determinar las regiones que tienen el mayor potencial antigénico dentro de la SEC. DE ID Nº 3 (Hopp y col., Proc. Natl. Acad. Sci.78:38243828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88: 1-18, 1986 y Triquier y col., Protein Engineering, 11: 153-169, 1998). Se basa el perfil en una ventana deslizante de seis restos. Se ignoraron los restos G, S, Y T enterrados y los restos H, Y, y W expuestos. Una persona experta en la materia puede determinar estas regiones de IL-22RA. Además, lo epítopos antigénicos de IL-22RA dentro de la SEC. DE ID Nº 3 según se predice mediante una representación gráfica Jameson-Wolf, usando, por ejemplo, el programa ENASTAR Protean (ENASTAR, Inc., Madison, WI) sirven como epítopos antigénicos preferidos, y se pueden determinar por una persona experta en la técnica. Dichos epítopos antigénicos incluyen (1) restos de aminoácidos 1 (Pro) a 6 (Asp) de la SEC. DE ID Nº 3; (2) restos de aminoácidos 26 (Ser) a 32 (Pro) de la SEC. DE ID Nº 3; (3) restos de aminoácidos 41 (Lys) a 47 (Asp) de la SEC. DE ID Nº 3; (4) restos de aminoácidos 49 (Val) a 62 (Cys) de la SEC. DE ID Nº 3; (5) restos de aminoácidos 41 (Lys) a 62 (Cys) de la SEC. DE ID Nº 3; (6) restos de aminoácidos 84 (Ala) a 97 (Ser) de la SEC. DE ID Nº 3; (7) restos de aminoácidos 103 (Thr) a 108 (Asp) de la SEC.

DE ID Nº 3; (8) restos de aminoácidos 130 (Arg) a 135 (His) de la SEC. DE ID Nº 3;

(9) restos de aminoácidos 164 (Gly) a 166 (Lys) de la SEC. DE ID Nº 3; (10) restos de aminoácidos 175 (Tyr) a 179 (Glu) de la SEC. DE ID Nº 3; (11) restos de aminoácidos 193 (Lys) a 196 (Ala) de la SEC. DE ID Nº 3; (12) restos de aminoácidos 203 (Lys) a 209 (Thr) de la SEC. DE ID Nº 3. los epítopos adicionales incluyen los siguientes péptidos que se generan potencialmente a partir de IL-22RA humano de longitud completa no reducido escindido con CnBr: péptido 6 (SEC. DE ID Nº 56), péptido 7 (SEC. DE ID Nº 57); péptido 8 (SEC. DE ID Nº 58); péptido 9 (SEC. DE ID Nº 59); péptido 10 (SEC. DE ID Nº 60); y péptido 11 (SEC. DE ID Nº 61). Las cisteínas están unidas mediante enlaces disulfuro, lo que da como resultado un posible enlace entre los péptidos 7 (SEC. DE ID Nº 57) y 10 (SEC. DE ID Nº 60. Específicamente, la SEC. DE ID Nº 56 corresponde a los restos de aminoácidos 1 (Pro) a 92 (Met) de la SEC. DE ID Nº3; la SEC. DE ID Nº 57 corresponde a los restos de aminoácidos 93 (Thr) a 120 (Met) de la SEC. DE ID Nº 3, la SEC. DE ID Nº 58 corresponde a los restos de aminoácidos 121 (Ile) a 160 (Met) de la SEC. DE ID Nº 3, la SEC. DE ID Nº 59 corresponde a los restos de aminoácidos 161 (His) a 185 (Met) de la SEC. DE ID Nº 3, la SEC. DE ID Nº 60 corresponde a los restos de aminoácidos 186 (Ile) a 199 (Met) de la SEC. DE ID Nº 3 y la SEC. DE ID Nº 61 corresponde a los restos de aminoácidos 200 (Cys) a 211 (Thr) de la SEC. DE ID Nº 3. Adicionalmente, los restos de la SEC. DE ID Nº 2 (y que corresponden a los restos de la SEC. DE ID Nº 3) que son importantes para la unión ligando-receptor comprenden Tyr-60, y Phe-164, Tyr-93, Arg-112, Lys-210, y Glu-211 de la SEC. DE ID Nº 2 y (y que corresponden a los restos de la SEC. DE ID Nº 3). Además, los restos primarios de la SEC. DE ID Nº 2 (y que corresponden a los restos de la SEC. DE ID Nº 3, que son importantes para dirigir la unión ligando-receptor que comprende Tyr-60, and Phe-164 de la SEC. DE ID Nº 2 (y que corresponden a los restos de la SEC. DE ID Nº 3), y los restos secundarios comprenden Tyr-93, Arg-112, Lys-210, y Glu-211 de la SEC. DE ID Nº 2 y (y que corresponden a los restos de la SEC. DE ID Nº 3). En las realizaciones preferidas, los epítopos antigénicos a los cuales se unen los anticuerpos neutralizantes de la presente invención podrían contener restos de la SEC. DE ID Nº 2 (y que corresponden a los restos de la SEC. DE ID Nº 3) que son importantes par la unión ligando-receptor, por ejemplo con IL-22RA e IL-20 o IL-22 (individual o conjuntamente). [0108] Los péptidos y polipéptidos que soportan epítopos antigénicos pueden contener al menos cuatro a diez aminoácidos, al menos diez a quince aminoácidos, o aproximadamente 1 a aproximadamente 30 aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada a conocer en el presente documento. Se pueden producir dichos péptidos y polipéptidos que soportan epítopos fragmentando un polipéptido de IL22RA, de péptidos aleatorios o mediante síntesis química peptídico, según se describe el presente documento. Además, se pueden seleccionar los epítopos mediante presentación de fagos de bibliotecas de péptidos (véanse, por ejemplo, Lane y Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5:268 (1993), y Cortese y col., Curr. Opin. Biotechnol. 7:616 (1996)). Se describen procedimientos normalizados para identificar epítopos y producir anticuerpos a partir de pequeños péptidos que comprenden un epítopo, por ejemplo, en Mole, "Epitope Mapping," en Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), páginas 105-116 (The Humana Press, Inc. 1992), Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter y Ladyman (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995), y Coligan y col. (eds.), Current Protocols in Immunology, páginas 9.3.1 - 9.3.5 y páginas 9.4.1 - 9.4.11 (John Wiley & Sons 1997). [0109] Para cualquier polipéptido de IL-22RA, incluyendo las variantes y las proteínas de condensación, una persona normalmente experta en la materia puede generar fácilmente una secuencia de polinucleótidos completamente degenerada que codifica esta variante que usa la información que se muestra en las Tablas 1 y 2 anteriores. Además, las personas expertas en la materia pueden usar software estándar para dispones variantes de IL-22RA basadas en los nucleótidos y secuencias de aminoácidos descritos en el presente documento.

5. PRODUCCIÓN DE POLIPÉPTIDOS DE IL-22RA

[0110] Los polipéptidos descritos en el presente documento, que incluyen polipéptidos de longitud completa, receptores monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos y multiméricos solubles; receptores de longitud completa; fragmentos de receptores (por ejemplo, fragmentos de unión a ligando y epítopos antigénicos), fragmentos funcionales, y proteínas de condensación, se pueden producir en células hospedadoras recombinantes siguiendo técnicas convencionales. Para expresar un gen IL-22RA, se debe unir de manera operable una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido a secuencias reguladoras que controlan la expresión transcripcional en un vector de expresión, y a continuación, introducirse en una célula hospedadora. Adicionalmente a las secuencias reguladoras transcripcionales, tales como promotores y potenciadores, los vectores de expresión pueden incluir secuencias reguladoras traduccionales y un gen marcador que sea adecuado para la selección de células que transportan el vector de expresión. [0111] Los vectores de expresión que son adecuados para la producción de una proteína extraña en células eucariotas contienen normalmente (1) elementos de ADN procariótico que codifican un origen de replicación bacteriano y un marcador de resistencia a antibióticos para posibilitar el crecimiento y la selección del vector de expresión en un hospedador bacteriano; (2) elementos de ADN eucariótico que controlan el inicio de la transcripción, tales como un promotor, y (3)elementos de ADN que controlan el procesamiento de las transcripciones, tales como una secuencia de finalización/poliadenilación de la transcripción. Según se ha discutido anteriormente, los vectores de expresión pueden incluir también secuencias de nucleótidos que codifican una secuencia secretora que dirige el polipéptido heterólogo en la ruta secretora de una célula hospedadora. Por ejemplo, un vector de expresión de IL-22RA puede comprender un gen IL-22RA y una secuencia secretora derivada de cualquier gen segregado. [0112] Se pueden expresar proteínas de IL-22RA en células de mamíferos. Los ejemplos de células hospedadoras de mamíferos adecuadas incluyen células de riñón de mono verde africano (Vero; ATCC CRL 1687), células de riñón embriónico humano (293-HEK; ATCC CRL 1573), células de riñón de cría de hámster (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), células de riñón canino (MDCK; ATCC CCL 34), células de ovario de hámster chino (CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44 (Chasin y col., Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555, 1986)), células de pituitaria de rata (GH1; ATCC CCL82), células HeLa S3 (ATCC CCL2.2), células de hematoma de rata (H-4-II-E; ATCC CRL 1548), células de riñón de mono transformadas con SV40 (COS-1; ATCC CRL 1650) y células embriónicas de murino (NIH-3T3; ATCC CRL 1658). [0113] Para un hospedador mamífero, se pueden derivar las señales reguladoras transcripcionales y traduccionales de fuentes víricas de mamíferos, por ejemplo, adenovirus, virus del papiloma bovino, virus de simio, o similares, en el que las señales reguladoras se asocian con un gen particular que tiene un elevado nivel de expresión. Se pueden obtener también las secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales adecuadas a partir de genes de mamíferos, por ejemplo, genes de actina, colágeno, miosina y metalotioneina. [0114] Las secuencias reguladoras transcripcionales incluyen una región promotora suficiente para dirigir el inicio de la síntesis de ARN, los promotores eucariotas adecuados incluyen el promotor del gen de la metalotioneina I de ratón (Hamer y col., J. Molec. Appl. Genet. 1: 273 (1982)), el promotor TK del virus del Herpes (McKnight, Cell 31: 355 (1982)), el promotor temprano de SV40 (Benoist y col., Nature 290: 304 (1981)), el promotor del virus del sarcoma de Rous (Gorman y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 79: 6777 (1982)), el promotor del citomegalovirus (Foecking y col., Gene 45: 101 (1980)), (véase, generalmente, Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture," en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland y col. (eds.), páginas 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)). [0115] Como alternativa, se puede usar un promotor procariota, tal como un promotor de la ARN polimerasa del bacteriófago T3 para controlar la expresión del gen IL-22RA en células de mamíferos si el promotor procariota está regulado por un promotor eucariota (Zhou y col., Mol. Cell. Biol. 10: 4529 (1990), y Kaufman y col., Nucl. Acids Res. 19: 4485 (1991)). [0116] En algunas realizaciones, una secuencia de ADN que codifica un polipéptido del receptor soluble de IL-22RA, o un fragmento del polipéptido de IL22RA se une de manera operable a otros elementos genéticos requeridos para su expresión, que incluyen generalmente un promotor de la transcripción y un finalizador, dentro de un vector de expresión. El vector contendrá también comúnmente uno o más marcadores seleccionables y uno o más orígenes de replicación, aunque las personas expertas en la materia reconocerán que dentro de algunos sistemas se pueden proporcionar marcadores seleccionables en vectores independientes, y que se puede proporcionar la replicación del ADN exógeno mediante integración en el genoma de la célula hospedadora. La selección de promotores, finalizadores, marcadores seleccionables, vectores y otros elementos es una materia rutinaria de diseño comprendida dentro del nivel de conocimiento de la persona normalmente experta en la técnica. Se describen muchos de dichos elementos en la bibliografía y están disponibles a través de suministradores comerciales. Se pueden transfectar simultáneamente múltiples componentes de un complejo receptor soluble en vectores de expresión individuales o contenerse en un único vector de expresión. Se conocen bien en la técnica dichas técnicas de expresar múltiples componentes de complejos de proteínas. [0117] Se puede introducir un vector de expresión en células hospedadoras usando una variedad de técnicas normalizadas que incluyen transfección con fosfato de calcio, transfección medida por liposomas, administración mediada por microproyectiles, electroporación, y similares. Se pueden seleccionar y propagar las células transfectadas para proporcionar células hospedadoras recombinantes que comprendan el vector de expresión integrado de manera estable en el genoma de la célula hospedadora. Se describen las técnicas para introducir vectores eucariotas y las técnicas para seleccionar dichos transformantes estables usando un marcador seleccionable dominante, por ejemplo, en Ausubel (1995) y por Murray (ed), Gene transfer and Expression protocols (Humana Press 1991). [0118] Por ejemplo, un marcador seleccionable adecuado es un gen que proporciona resistencia al antibiótico neomicina. En este caso, se lleva a cabo la selección en presencia de un fármaco tipo neomicina, como G-418 o similar. Se pueden usar sistemas de selección para aumentar el nivel de expresión del gen de interés, un proceso denominado como “amplificación”. Se lleva a cabo la amplificación cultivando transfectantes en presencia de un nivel bajo del agente selectivo, y aumentando a continuación la cantidad de agente selectivo para seleccionar las células que producen elevados niveles de los productos de los genes introducidos. Un marcador seleccionable amplificable adecuado es dihidrofolato reductasa (DHFR), que confiere resistencia a metotrexato. Se pueden usar también otros genes de resistencia a fármacos (por ejemplo, resistencia a la higromicina, resistencia multifármaco, puromicina acetiltransferasa). Como alternativa, se pueden usar marcadores que introducen un fenotipo alterado, tal como la proteína fluorescente verde, o proteínas superficiales celulares tales como CD4, CD8, MHC de Tipo I, fosfatasa alcalina placentaria para acortar las células transfectadas a partir de células no transfectadas mediante dichos medios como tecnología de separación mediante perlas magnéticas o acortamiento mediante FACS. [0119] Se pueden producir polipéptidos de IL-22RA mediante células de mamíferos cultivadas usando un sistema de administración vírica. Los virus a modo de ejemplo para este objetivo incluyen adenovirus, retrovirus, herpesvirus, virus vaccinia y virus adenoasociados (AAV). Adenovirus, un virus de ADN bicatenario, es actualmente el mejor vector de transferencia génica estudiado para la administración de un ácido nucleico heterólogo (para una revisión, véanse Becker y col., Meth. Cell Biol. 43: 161 (1994), y Douglas y Curiel, Science & Medicine 4: 44 (1997)). Las ventajas del sistema de adenovirus incluyen el acomodo de inserciones de ADN relativamente grandes, la capacidad de crecer a un título elevado, la capacidad de infectar una amplia gama de tipos de células de mamíferos, y la flexibilidad que permite usar un gran número de vectores disponibles que contienen diferentes promotores.

[0120] Al eliminar porciones del genoma de adenovirus, se pueden acomodar inserciones más grandes (hasta de 7 kb) de ADN heterólogo. Se pueden incorporar estas inserciones en el ADN vírico mediante ligadura directa o mediante recombinación homóloga con un plásmido transfectado simultáneamente. Una opción es eliminar el gen E1 esencial procedente del vector vírico, lo que da como resultado la incapacidad de replicarse a no ser que la célula hospedadora proporcione el gen E1. Se pueden hacer crecer las células 293 humanas infectadas con el vector de adenovirus (ATCC Nos. CRL-1573, 45504, 45505), por ejemplo, como células adherentes o en cultivo en suspensión a una densidad celular relativamente elevada para producir cantidades significativas de proteína (véase Garnier y col., Cytotechnol. 15: 145 (1994)). [0121] Se puede expresar también IL-22RA en otras células eucariotas superiores, tales como células aviares, fúngicas, de insectos, de levaduras, o plantas. El sistema de baculovirus proporciona un medio eficiente para introducir genes IL-22RA clonados en células de insectos: Los vectores de expresión adecuados se basan en el virus de la polihedrosis nuclear múltiple de Autographa californica (AcMNPV) y contiene promotores bien conocidos tales como el promotor 70 de la proteína de choque térmico de Drosophila (hsp), el promotor temprano inmediato del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (ie-1) y el promotor temprano retardado de 39K, el promotor p10 de baculovirus y el promotor de la metalotioneína de Drosophila. Un segundo procedimiento de preparar baculovirus recombinante utiliza un sistema basado en transposón descrito por Luckow (Luckow, y col., J. Virol.

67: 4566 (1993)). Este sistema, que utiliza vectores de transferencia, se comercializa en el kit BAC-to-BAC (Life Technologies, Rockville, MD). Este sistema utiliza un vector de transferencia, PFASTBAC (Life Technologies) que contiene un transposón Tn7 para movilizar el ADN que codifica el polipéptido de IL-22RA en un genoma de baculovirus mantenido en E. coli como un plásmido grande denominado un “bácmido”. Véanse Hill-Perkins y Possee, J. Gen. Virol. 71: 971 (1990), Bonning, y col., J. Gen. Virol. 75: 1551 (1994), y Chazenbalk, y Rapoport, J. Biol. Chem. 270: 1543 (1995). Adicionalmente, los vectores de transferencia pueden incluir una condensación en marco con el ADN que codifica una etiqueta de epítopo en el término C o N del polipéptido de IL-22RA expresado, por ejemplo, una etiqueta de epítopo Glu-Glu (Grussenmeyer y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. 82: 7952 (1985)). Usando una técnica conocida en la materia, se transforma un vector de transferencia que contiene un gen IL-22RA en E. coli, y se criba para los bácmidos que contienen un gen lacZ interrumpido indicativo de baculovirus recombinante. El bácmido de ADN que contiene el genoma de baculovirus recombinante se aísla a continuación usando técnicas comunes. [0122] Se puede modificar el vector PFASTBAC ilustrativo en un grado considerable. Por ejemplo, se puede eliminar el promotor de la polihedrina y sustituirse por el promotor de la proteína básica de baculovirus (conocido también como promotor Pcor, p6.9 o MP9 que se expresa más pronto en la infección por baculovirus, y se ha demostrado que es ventajoso para expresar las proteínas segregadas (véanse, por ejemplo, Hill-Perkins y Possee, J. Gen. Virol. 71: 971 (1990), Bonning, y col., J. Gen. Virol. 75: 1551 (1994), y Chazenbalk y Rapoport, J. Biol. Chem. 270: 1543 (1995). En dichas construcciones de vectores de transferencia, se puede usar una versión corta o larga del promotor de la proteína básica. Además, se pueden construir vectores de transferencia que sustituyan las secuencias señal secretoras de IL-22RA derivadas de proteínas de insectos. Se puede usar, por ejemplo, una secuencia señal secretora de de Ecdisteroide Glucosiltransferasa (EGT), Melitina de abejas melíferas (Invitrogen Corporation; Carslbad, CA) o gp67 de baculovirus (Pharmingen: San Diego, CA) en las construcciones para sustituir la secuencia señal secretora de la IL22RA natural. [0123] El virus o bácmido recombinante se usa para transfectar células hospedadoras. Las células hospedadoras de insectos adecuados incluyen líneas celulares derivadas de IPLB-Sf-21, una línea celular de ovario de Spodoptera frugiperda pupal, tal como Sf9 (ATCC CRL 1711), Sf21AE, y Sf21 (Invitrogen Corporation; San Diego, CA), así como células Scneider-2 de Drosophila, y la línea celular HIGH FIVEO (Invitrogen) derivada de Trichoplusia ni (Patente de los Estados Unidos Nº 5.300.435). Se pueden usar medios prácticamente exentos de suero comercialmente disponibles para hacer crecer y mantener las células. Los medios adecuados son Sf900 IITM (Life Technologies) o ESF 921TM (Expression Systems) para las células Sf9; y ExcellO405TM (JRH Biosciences, Lenexa, KS) o Express FiveO™ (Life Technologies) para las células de T. ni. Cuando se usa virus recombinante, se hacen crecer las células normalmente hasta una densidad de inoculación de aproximadamente 2-5 x 105 células a una densidad de 1-2 x 106 células, momento en el que se añade un depósito vírico recombinante a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 a 10, más normalmente casi 3. [0124] Se proporcionan las técnicas establecidas para producir proteínas recombinantes en sistemas de baculovirus por Bailey y col., "Manipulation of Baculovirus Vectors," en Methods in Molecular Biology, Volumen 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), Páginas 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991), en Patel y col., "The baculovirus expression system," en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª Edición, Glover y col. (eds.), Páginas 205-244 (Oxford University Press 1995), en Ausubel (1995) en las páginas 16-37 a 16-57, en Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995), y en Lucknow, "Insect Cell Expression Technology," en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland y col. (eds.), páginas 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996). [0125] Se pueden usar también células fúngicas, incluyendo células de levaduras, para expresar los genes descritos en el presente documento. Las especies de levaduras de particular interés a este respecto incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, y Pichia methanolica. Los promotores adecuados para la expresión en levaduras incluyen promotores de GAL1 (galactosa), PGK (fosfoglicerato quinasa), ADH (alcohol deshidrogenasa), AOX1 (alcohol oxidasa), HIS4 (histidinol deshidrogenasa), y similares. Se han diseñado muchos vectores de clonación de levaduras y están fácilmente disponibles. Estos vectores incluyen vectores basados en YIp, tales como vectores YIp5, YRp, tales como YRp17, vectores YEp tales como YEp13 y vectores YCp, tales como YCp19. Se dan a conocer procedimientos para transformar células de S. cerevisiae con ADN exógeno y producir polipéptidos recombinantes de los anteriores en, por ejemplo, Kawasaki. Patente de los Estados Unidos Nº 4.599.311, Kawasaki y col., Patente de los Estados Unidos Nº 4.931.373, Brake. Patente de los Estados Unidos Nº 4.870.008, Welch y col., Patente de los Estados Unidos Nº 5.037.743, y Murray y col., Patente de los Estados Unidos

4.845.075. Las células transformadas se seleccionan mediante el fenotipo determinado por el marcador seleccionable, normalmente para la resistencia al fármaco o la capacidad de crecer en ausencia de un nutriente concreto (por ejemplo, leucina). Un sistema de vectores adecuados para uso en Saccharomyces cerevisiae es el sistema de vectores POT1 dado a conocer por Kawasaki y col. (patente de los Estados Unidos Nº. 4.931.373), que permite seleccionar las células transformadas por el crecimiento en medios que contienen glucosa. Los promotores y finalizadores adecuados adicionales para uso en levaduras incluyen los de los genes de los enzimas glicolíticos (véanse, por ejemplo, Kawasaki, Patente de los Estados Unidos Nº 4.599.311, Kingsman y col., Patente de los Estados Unidos Nº 4.615.974, y Bitter, Patente de los Estados Unidos Nº 4.977.092) y los genes de la alcohol deshidrogenasa. Véanse también las patentes de los Estados Unidos Nos 4.990.446, 5.063.154, 5.139.936, y 4.661.454.

[0126] Se conocen en la técnica sistemas de transformación de otras levaduras, incluyendo Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii y Candida maltosa. Véanse por ejemplo, Gleeson y col., J. Gen. Microbiol. 132: 3459 (1986), y Cregg, Patente de los Estados Unidos Nº 4.882.279. Se pueden utilizar células de Aspergillus según los procedimientos de McKnight y col., Patente de los Estados Unidos Nº 4.935.349. Se dan a conocer procedimientos para transformar Acremonium chrysogenum en Sumino y col., Patente de los Estados Unidos Nº 5.162.228. Se dan a conocer procedimientos para transformar Neurospora en Lambowitz, Patente de los Estados Unidos Nº. 4.486.533. [0127] Se da a conocer, por ejemplo, el uso de Pichia methanolica como hospedador para la producción de proteínas recombinantes en Raymond, Patente de los Estados Unidos Nº 5.716.808, Raymond, Patente de los Estados Unidos Nº 5.736.383, Raymond y col., Yeast 14: 11-23 (1998), y en las publicaciones internacionales Nos WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536, y WO 98/02565. Se prepararán moléculas de ADN para el uso en P. methanolica, como plásmidos circulares bicatenarios, que se linealizan preferiblemente antes de la transformación. Para la producción de polipéptidos en P. methanolica, el promotor y el finalizador en el plásmido pueden ser los de un gen de P. methanolica, tal como el gen de la utilización de alcohol de P. methanolica (AUG1 o AUG2). Otros promotores útiles incluyen los genes de la dihidroxiacetona sintasa (DHAS), la formiato deshidrogenasa (FMD), y la catalasa (CAT). Para facilitar la integración del ADN en el cromosoma del hospedador, se prefiere tener el segmento de expresión completo del plásmido flanqueado en ambos extremos por las secuencias de ADN del hospedador. Un marcador seleccionable adecuado para uso en Pichia methanolica es un gen ADE2 de

P. methanolica, que codifica la fosforibosil-5-aminoimidazol carboxilasa (AIRC; EC 4.1.1.21) y que permite a las células hospedadoras ade2 crecer en ausencia de adenina. Para procesos industriales a gran escala en los que es deseable minimizar el uso de metanol, se pueden usar células hospedadoras en la que se eliminan ambos genes de utilización del metanol (AUG1 y AUG2). Para la producción de proteínas segregadas, las células hospedadoras pueden ser deficientes en los genes de la proteasa vacuolar (PEP4 y PRB1). Se usa la electroporación para facilitar la introducción de un plásmido que contiene ADN que codifica un polipéptido de interés en las células de P. methanolica. Se pueden transformar las células de P. methanolica mediante electroporación usando un campo eléctrico pulsante que decae exponencialmente que tiene una fuerza del campo de entre 2,5 a 4,5 kV/cm, preferiblemente de aproximadamente 3,75 kV/cm, y una constante de tiempo (t) de entre 1 y 40 milisegundos, lo más preferible de aproximadamente 20 milisegundos. [0128] Se pueden introducir también vectores de expresión en protoplastos de plantas, tejidos intactos de plantas, o células aisladas de plantas. Los procedimientos para introducir vectores de expresión en tejidos de plantas incluyen la infección directa

o el cultivo simultáneo de tejidos de plantas con Agrobacterium tumefaciens, administración mediada por microproyectiles, inyección de ADN, electroporación, y similares. Véanse, por ejemplo, Horsch y col., Science 227:1229 (1985), Klein y col., Biotechnology 10: 268 (1992), y Miki y col., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants," en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick y col. (eds.), páginas 67-88 (CRC Press, 1993). [0129] Como alternativa, se pueden expresar genes IL-22RA en células hospedadoras procariotas. Las personas expertas en la técnica conocen bien los promotores adecuados que se pueden usar para expresar polipéptidos de IL-22RA en un hospedador procariota e incluyen promotores capaces de reconocer las polimerasas T4, T3, Sp6 y T7, los promotores PR and PL del bacteriófago lambda, los promotores trp, recA, del choque térmico, lacUV5, tac, lpp-lacSpr, phoA, y lacZ de E. coli, los promotores de B. subtilis, los promotores de los bacteriófagos de Bacillus, los promotores de Streptomyces, el promotor int del bacteriófago lambda, el promotor bla de pBR322 y el promotor CAT del gen de la cloranfenicol acetil transferasa. Se han revisado promotores eucariotas en Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987), Watson y col., Molecular Biology of the Gene, 4ª Ed. (Benjamin Cummins 1987), y en Ausubel y col. (1995). [0130] Los hospedadores procariotas adecuados incluyen E. coli y Bacillus subtilis. Las cepas adecuadas de E. coli incluyen BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF’, DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451, y ER1647 (véase, por ejemplo, Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)). Las cepas adecuadas de Bacillus subtilis incluyen BR151, YB886, MI119, MI120, y B170 (véase, por ejemplo, Hardy, "Bacillus Cloning Methods," en DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)). [0131] Cuando un polipéptido de IL-22RA se expresa en bacterias tales como E. coli, se puede retener el polipéptido en el citoplasma, normalmente como gránulos insolubles, o se puede dirigir al espacio periplásmico mediante una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, se lisan las células y se recuperan y se desnaturalizan los gránulos usando, por ejemplo, isotiocanato de guanidina o urea. A continuación se puede replegar y dimerizar el polipéptido desnaturalizado diluyendo el desnaturalizante, tal como mediante diálisis contra una disolución de urea y una combinación de glutatión reducido y oxidado, seguido por diálisis contra una disolución salina tamponada. En el último caso, se puede recuperar el polipéptido desde el espacio periplásmico en una forma soluble y funcional perturbando las células (mediante, por ejemplo, sonicación o choque osmótico) para liberar los contenidos del espacio periplásmico y recuperar la proteína, obviando por tanto la necesidad de desnaturalización y repliegue. [0132] Las personas expertas en la técnica conocen bien los procedimientos para expresar proteínas en hospedadores procariotas (véanse, por ejemplo, Williams y col., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific poligonal antibodies," en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª Edición, Glover y col. (eds.), página 15 (Oxford University Press 1995), Ward y col., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995), and Georgiou, "Expression of Proteins in Bacteria," en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland y col. (eds.), página 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)). [0133] Se proporcionan procedimientos normalizados para introducir vectores de expresión en células bacterianas, de levaduras, insectos y plantas, por ejemplo, en Ausubel (1995). [0134] Se proporcionan procedimientos generales para expresar y recuperar proteínas extrañas producidas por un sistema celular de mamífero en, por ejemplo, Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture," en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland y col. (eds.), páginas 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996). Se proporcionan técnicas normalizadas para recuperar proteínas producidas por un sistema bacteriano en, por ejemplo, Grisshammer y col., "Purification of overproduced proteins from E. coli cells," en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª Edición, Glover y col. (eds.), páginas 59-92 (Oxford University Press 1995). Se describen procedimientos establecidos para aislar proteínas recombinantes de un sistema de baculovirus en Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995). [0135] Como alternativa, se pueden sintetizar polipéptidos mediante síntesis exclusiva en fase sólida, procedimientos parciales en fase sólida, síntesis de condensación de fragmentos o en disolución clásica. Las personas expertas en la técnica conocen bien estos procedimientos de síntesis (véanse, por ejemplo, Merrifield,

J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963), Stewart y col., "Solid Phase Peptide Synthesis" (2ª Edición), (Pierce Chemical Co. 1984), Bayer y Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986), Atherton y col., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989), Fields y Colowick, "Solid-Phase Peptide Synthesis," Methods in Enzymology Volumen 289 (Academic Press 1997), y Lloyd-Williams y col., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc. 1997)). Están también normalizadas las variaciones en las estrategias totals de síntesis química tales como “ligadura química natural” y “ligadura de la proteína ex`resada” (véanse, por ejemplo, Dawson y col., Science 266: 776 (1994), Hackeng y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA

94: 7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol. 287: 34 (1997), Muir y col, Proc. Nat’l Acad Sci.USA 95: 6705 (1998), y Severinov y Muir, J. Biol. Chem. 273: 16205 (1998)). [0136] Los péptidos y los polipéptidos descritos en el presente documento comprenden al menos seis, al menos nueve, o al menos 15 restos de aminoácidos contiguos de la SEC. DE ID Nº 3. Dentro de algunas formas de realización, los polipéptidos comprenden 20, 30, 40, 50, 100, o más restos contiguos de estas secuencias de aminoácidos. Las moléculas de ácido nucleico que codifican dichos péptidos y polipéptidos son útiles como cebadores y sondas de la reacción en cadena de la polimerasa. [0137] Además, se pueden expresar polipéptidos de IL-22RA y sus fragmentos como monómeros, homodímeros, heterodímeros, o multímeros en células eucariotas superiores. Se pueden usar dichas células para producir polipéptidos monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos y multiméricos de IL-22RA que comprenden al menos un polipéptido de IL-22RA (“receptores que comprenden E-22RA” o “polipéptidos receptores que comprenden IL-22RA”) o se pueden usar como células de ensayo en sistemas de cribado. En un aspecto, se produce un polipéptido que comprende la región extracelular de IL-22RA mediante una célula cultivada, y se usa la célula para cribar los ligandos del receptor, incluyendo el ligando natural, Il-22 así como los agonistas y antagonistas del ligando natural. Para resumir esta solución, se combina un ADNc o gen que codifica el receptor con otros elementos genéticos requeridos para su expresión (por ejemplo, un promotor de la transcripción, y se inserta el vector de expresión resultante en una célula hospedadora. Se seleccionan las células que expresan el ADN y producen el receptor funcional y se usan dentro de una variedad de sistemas de cribado. Se puede expresar cada componente del complejo receptor monomérico, homodimérico, heterodimérico y multimérico en la misma célula. Además, se pueden condensar también los componentes del complejo monomérico, homodimérico, heterodimérico y multimérico con una región transmembrana u otro resto de condensación de la membrana que permita el ensamblaje del complejo y el cribado de los transfectantes según se ha descrito anteriormente. [0138] Para ensayar los polipéptidos y anticuerpos antagonistas de IL-20 e IL-22, las células de mamíferos adecuadas para el uso en la expresión de los receptores que comprenden IL-22RA u otros receptores conocidos por unirse a IL-20 o IL-22 (por ejemplo , células que expresan IL-22RA/CRF2-4; y E-20RA, IL-20RB, IL-22RA/IL20RB. o IL-20RA/IL-20RB) y que transducen una señal mediada por el receptor incluyen células que expresan otras subunidades receptoras que pueden formar un complejo funcional con IL-22RA (o IL-20RA). Estas subunidades pueden incluir las de la familia del receptor del interferón u otros receptores de citocinas de tipo II o tipo I; por ejemplo, CRF2-4 (Nº de Acceso Genbank. Z17227), IL-10R (Nos de Acceso Genbank U00672 y NM_001558), IL-22RA (Patente de los Estados Unidos de propiedad compartida Nº 5.965.704), zcytor7 (IL-20RA) (Patente de los Estados Unidos de propiedad compartida Nº. 5.945.511), IL-20RA/IL-20RB (Publicación WIPO Nº WO 01/46232), e IL-9R. se prefiere también usar una célula de la misma especie como receptor que se va a expresar. Dentro de una realización preferida, la célula es dependiente de un factor de crecimiento hematopoyético suministrado exógenamente para su proliferación. Las líneas celulares preferidas de este tipo son la línea celular TF-1 humana (ATCC número CRL-2003) y la línea celular AML-193 (ATCC número CRL-9589), que son líneas celulares leucémicas humanas dependientes de GM-CSF y BaF3 (Palacios y Steinmetz, Cell 41: 727-734, (1985)), que es una celular pre-B de murino dependiente de IL-3. Otras líneas celulares incluyen células BHK, COS-1 y CHO. Se pueden construir mediante ingeniería genética células hospedadoras adecuadas para producir las subunidades receptoras adecuadas u otros componentes celulares necesarios para la respuesta celular deseada. Esta solución es ventajosa debido a que se pueden construir mediante ingeniería genética líneas celulares para expresar subunidades receptoras de cualquier especie, superando por tanto las potenciales limitaciones que surgen de la especificidad de especies. Se pueden clonar especies ortólogas del ADNc receptor humano y usarse dentro de líneas celulares de la misma especie, tales como ADNc de ratón en la línea celular BaF3. Se pueden construir de esta manera mediante ingeniería genética líneas celulares que son dependientes de un factor de crecimiento hematopoyético, tal como GM-CSF o IL-3, para llegar a ser dependientes de otra citocina que actúa a través del receptor IL-22RA, tal como IL-22. [0139] Se usan células que expresan receptores funcionales. Se conocen una variedad de ensayos adecuados. Estos ensayos se basan en la detección de una respuesta biológica en una célula diana. Uno de dichos ensayos es un ensayo de proliferación celular. Se cultivan células en presencia o ausencia de un compuesto de ensayo, y se detecta la proliferación celular mediante, por ejemplo, midiendo la incorporación de timidina tritiada o mediante ensayo colorimétrico basado en el fracaso metabólico del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio (MTT) (Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63, (1983)). Un formato de ensayo alternativo usa células que se construyen además mediante ingeniería genética para expresar un gen indicador. El gen indicador se une a un elemento promotor que es sensible a la ruta unida al receptor, y el ensayo detecta la activación de la transcripción del gen indicador. Un elemento promotor preferido a este respecto es un elemento de respuesta a suero, o SER. Véase, por ejemplo, Shaw y col., Cell 56: 563-572, (1989).Un gen preferido tal como un gen indicador es un gen de la luciferasa (de Wet y col., Mol. Cell. Biol. 7: 725, (1987)). Se detecta la expresión del gen de la luciferasa mediante luminiscencia usando procedimientos conocidos en la técnica (por ejemplo, Baumgartner y col., J. Biol. Chem. 269: 29094-29101, (1994); Schenborn y Goiffin, Promega_Notes. 41: 11, 1993). Los kits de ensayo de la actividad de la luciferasa están comercialmente disponibles de, por ejemplo, Promega Corp., Madison, WI. Se pueden usar líneas de células diana de este tipo para cribar bibliotecas de medios de cultivo acondicionados celularmente mediante agentes químicos, caldos fúngicos, muestras de suelo, muestras de agua, y similares. Por ejemplo, se puede ensaya un banco de medios acondicionados celularmente en una célula diana, para identificar las células que producen un ligando. A continuación se usan células positivas para producir una biblioteca de ADN en un vector de expresión mamífero, que se divide en combinaciones, transfectadas en células hospedadoras, y se expresa. A continuación se ensayan las muestras de medios de las células transfectadas, con la posterior división de las combinaciones, retransfección, subcultivo y reensayo de células positivas para aislar un ADNc clonado que codifica el ligando. [0140] Se conocen en la técnica o se pueden construir diversas líneas celulares sensibles a IL-20, por ejemplo, la línea celular Baf3/DIRS1/cytoR11 (Publicación WIPO No. WO 02/072607). Además, se conocen diversas líneas celulares sensibles a IL-22 (Dumontier y col., J. Immunol. 164: 1814-1819, 2000; Dumoutier, L y col., Proc. Nat’l. Acad. Sci. 97: 10144-10149, 2000; Xie MH y col., J. Biol. Chem. 275: 31335-31339, 2000; Kotenko SV y col., J. Biol. Chem. 276: 2725-2732, 2001), así como los que expresan la subunidad IL-22RA del receptor IL-22. Por ejemplo, las siguientes células son sensibles a IL-22: TK-10 (XieMH y col., más arriba.) (carcinoma renal humano); SW480 (ATCC Nº CCL-228) (adenocarcinoma de colon humano); HepG2 (ATCC Nº. HB-8065) (hepatoma humano); PC12 (ATCC Nº CRL1721) (modelo de células neuronales de murino; feocromocitoma de rata); y MES13 (ATCC Nº. CRL-1927) (línea de células mesangiales de riñón de murino). Adicionalmente, algunas líneas celulares que expresan IL-22RA (receptor IL-22) son también candidatas de las líneas celulares sensibles a IL-22: A549 (ATCC Nº CCL185) (carcinoma de pulmón humano); G-361 (ATCC Nº CRL-1424) (melanoma humano); y Caki-1 (ATCC Nº HTB-46) (carcinoma renal humano). Adicionalmente, se pueden construir líneas celulares sensibles a IL-22, por ejemplo, la línea celular Baf3/cytoR11/CRF2-4 descrita en el presente documento (Publicación WIPO Nº WO 02/12345). Se pueden usar estas células en ensayos para evaluar la funcionalidad de IL-22RA como un antagonista o factor antiinflamatorio de IL-20 o IL-22. [0141] Un enfoque de cribado adicional descrito en el presente documento incluye el uso de polipéptidos se dividen en dos tipos generales. Dentro del primer tipo, la región intracelular de IL-22RA, se une a la región de unión al ligando de un segundo receptor. Un segundo tipo de polipéptidos receptores híbridos comprende la región extracelular (de unión al ligando) de IL-22RA (SECV DE ID Nº 3) con una región intracelular de un segundo receptor, preferiblemente un receptor de citocina hematopoyético, y una región transmembrana. Los receptores monómeros, homodímeros, heterodímeros y multímeros de IL-22RA híbrido de este segundo tipo se expresan en células conocidas por ser capaces de responder a las señales transducidas por el segundo receptor. En conjunto, estos dos tipos de receptores híbridos permiten la identificación de un tipo de célula sensible para el desarrollo de un ensayo para detectar IL-22 o IL-20. Además, se pueden usar dichas células en presencia de IL-22 o iL-20 para evaluar los antagonistas del receptor soluble en un ensayo de tipo competición. En dicho ensayo, una disminución en la proliferación o en la actividad de transducción de la señal de IL-22 o IL-20 en presencia de un receptor soluble de la presente invención demuestra la actividad antagonista. Además se pueden usar ensayos de unión al receptor soluble de IL-22RA, y los ensayos basados en células para evaluar si un receptor soluble se une, bloquea, inhibe, reduce, antagoniza o neutraliza la actividad de IL-22 o IL-20.

6. PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS DE CONDENSACIÓN Y CONJUGADOS DE IL-22RA

[0142] Un tipo general de análogos de IL-22RA son las variantes que tienen una secuencia de aminoácidos que es una mutación de la secuencia de aminoácidos dada a conocer en el presente documento. Se proporciona otro tipo general de análogos de IL22RA mediante anticuerpos antiidiotípicos, y sus fragmentos, como se describe a continuación. Además, se pueden usar como análogos anticuerpos recombinantes que comprenden regiones variables contra idiotipo (véase por ejemplo, Monfardini y col., Proc. Assoc. Am. Physicians 108: 420 (1996)). Debido a que las regiones variables de los anticuerpos de IL-22RA antiidiotípicos imitan IL-22RA, estas regiones pueden proporcionar actividad de unión a IL-22RA. Las personas expertas en la técnica conoces los procedimientos para produciré anticuerpos catalíticos contra idiotipo (véanse, por ejemplo, Joron y col., Ann. N Y Acad. Sci. 672: 216 (1992), Friboulet y col., Appl. Biochem. Biotechnol. 47: 229 (1994), y Avalle y col., Ann. N Y Acad. Sci.

864: 118 (1998)). [0143] Se proporciona otro enfoque para identificar análogos de IL-22RA mediante el uso de bibliotecas combinatorias. Se proporcionan procedimientos para construir y cribar bibliotecas de presentación de fagos y otras bibliotecas combinatorias, por ejemplo, en Kay y col., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press 1996), Verdine, Patente de los Estados Unidos Nº 5.783.384, Kay, y col., Patente de los Estados Unidos Nº 5.747.334, y Kauffman y col., Patente de los Estados Unidos Nº 5.723.323. [0144] Los polipéptidos de IL-22RA tienen usos in vivo e in vitro. Como ilustración, se puede añadir una forma soluble al medio de cultivo para inhibir los efectos del ligando IL-22RA producido por las células cultivadas. [0145] Se pueden usar proteínas de condensación de IL-22RA para expresar IL22RA en un hospedador recombinante, y para aislar el IL-22RA producido. Según se describe a continuación, las proteínas de condensación de IL-22RA particulares tienen también usos en el diagnóstico y la terapia. Un tipo de proteína de condensación comprende un péptido que guía un polipéptido de IL-22RA desde una célula hospedadora recombinante. Para dirigir un polipéptido de IL-22RA a la ruta secretora de una célula hospedadora eucariota, se proporciona una secuencia señal secretora (conocida también como péptido señal, secuencia líder, secuencia prepro o secuencia pre) en el vector de expresión de IL-22RA. Aunque se puede derivar la secuencia señal secretora de IL-22RA, se puede derivar también una secuencia señal adecuada de otra proteína secretada o sintetizada de novo. La secuencia señal secretora se une de manera operable con una secuencia que codifica IL-22RA de tal manera que las dos secuencias se unen en el marco de lectura correcto y se sitúan para dirigir el polipéptido recientemente sintetizado a la ruta secretora de la célula hospedadora. Las secuencias señal secretoras se sitúan comúnmente a 5’ de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de interés, aunque algunas secuencias señal secretoras se pueden situar en cualquier parte en la secuencia de nucleótidos de interés (véanse, por ejemplo, Welch y col., patente de los Estados Unidos Nº 5.037.743; Holland y col., Patente de los Estados Unidos Nº 5.143.830). [0146] Aunque la secuencia señal secretora de IL-22RA u otra proteína producida por células de mamíferos (por ejemplo, la secuencia señal del activador del plasminógeno de tipo tejido, según se describe, en la Patente de los Estados Unidos Nº 5.641.655) es útil para la expresión de IL-22RA en mamíferos hospedadores recombinantes, se prefiere una secuencia señal de levadura para la expresión en células de levaduras. Los ejemplos de secuencias señal de levaduras adecuadas son las derivadas del factor α de las feromonas de emparejamiento de levadura (codificado por el gen MFα1), la invertasa (codificada por el gen SUC2), o la fosfatasa ácida (codificada por el gen PHO5). Véase, por ejemplo, Romanos y col., "Expression of Cloned Genes in Yeast," en DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2ª Edición, Glover y Hames (eds.), páginas 123-167 (Oxford University Press 1995). [0147] Se pueden preparar polipéptidos del receptor soluble de IL-22RA expresando un ADN truncado que codifica la región extracelular, por ejemplo, un polipéptido que contiene la SEC. DE ID Nº 3, o la región correspondiente de un receptor no humano. Se prefiere preparar los polipéptidos de la región extracelular en forma sustancialmente libre de segmentos polipeptídicos transmembrana e intracelulares. Para dirigir la exportación de la región del receptor desde la célula hospedadora, el ADN del receptor se une a un segundo segmento de ADN que codifica un péptido secretor, tal como un péptido secretor t-PA. Para facilitar la purificación de la región receptora segregada, se puede condensar una región terminal C, tal como una etiqueta de polihistidina, sustancia P, péptido FlagTM (Hopp y col., Biotechnology 6: 1204-1210, (1988); disponible de Eastman Kodak Co., New Haven, CT) u otro polipéptido o proteína para la cual está disponible un anticuerpo u otro agente de unión específica con el polipéptido receptor. Además, se preparan también según se ha descrito anteriormente, epítopos antigénicos de IL-22RA a partir de las regiones de unión a la citocina extracelular. [0148] En un enfoque alternativo, una región receptora extracelular de IL-22RA u otro componente receptor de la citocina de tipo I o II se puede expresar como una condensación con las regiones constantes de la cadena pesada de la inmunoglobulina, normalmente un fragmento Fc que contiene dos dominios de la región constante y una región en bisagra pero que carece de la región variable (véase, Sledziewski, AZ y col., Patentes de los Estados Unidos Nos 6.018.026 y 5.750.375). Los polipéptidos solubles de IL-22RA descritos en el presente documento incluyen dichas condensaciones. Se muestra una de dichas condensaciones en la SEC. DE ID Nº 4. Dichas condensaciones se segregan normalmente como moléculas multiméricas en las que las porciones Fc se unen mediante enlaces disulfuro entre sí y dos polipéptidos receptores se disponen en estrecha proximidad entre sí. Se pueden usar condensaciones de este tipo para purificar mediante afinidad el ligando análogo a partir de la solución, como una herramienta de ensayo in vitro, para bloquear, inhibir o reducir las señales in vitro valorando específicamente el ligando, y como antagonistas in vivo, administrándolos parenteralmente para unirse al ligando circulante y aclarar éste de la circulación. Para purificar el ligando, se añade una quimera de IL-22RA-Ig a una muestra que contiene el ligando (por ejemplo, medios de cultivo acondicionados celularmente o extractos de tejidos) en condiciones que faciliten la unión receptor-ligando (normalmente próxima a la temperatura fisiológica, pH, y fuerza iónica). A continuación se separa el complejo quimera-ligando por la mezcla usando proteína A, que se inmoviliza sobre un soporte sólido (por ejemplo, perlas de resina insoluble). A continuación se eluye el ligando usando técnicas químicas convencionales, tales como con una sal o gradiente de pH. En la alternativa, se puede unir la propia quimera a un soporte sólido con unión y elución llevadas a cabo como anteriormente. Se pueden usar las quimeras in vivo para regular las respuestas inflamatorias que incluyen las respuestas en fase aguda tales como el Amiloide A del suero (SAA) la proteína reactiva C (CRP), y similares. Se administran quimeras con una elevada afinidad de unión parenteralmente (por ejemplo, mediante inyección intramuscular, subcutánea o intravenosa). El ligando se une a moléculas circulantes y se aclara de la circulación mediante procesos fisiológicos normales. Para uso en ensayos, las quimeras se unen a un soporte mediante la región Fc y se usan en un formato ELISA. [0149] Para ayudar a aislar el complemento contra IL-22RA y los compañeros de unión, se puede emplear ventajosamente un sistema de ensayo que usa un receptor de unión al ligando (o un anticuerpo, un miembro de una pareja complemento/anticomplemento) o uno de sus fragmentos de unión, y un instrumento biosensor comercialmente disponible (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Dicho receptor, anticuerpo, miembro de una pareja complemento/anticomplemento o fragmento se inmoviliza sobre la superficie de un chip receptor. Se da a conocer el uso de este instrumento en Karlsson, J. Immunol. Methods 145: 229-40, 1991 y Cunningham y Wells, J. Mol. Biol. 234: 554-63, 1993. Un receptor, anticuerpo, miembro o fragmento se une covalentemente, usando la química de la amina o el suflhidrilo, a fibras de dextrano que se unen a una película de oro en el interior de una celda de flujo. Se pasa una muestra de ensayo a través de la celda. Si está presente un ligando, epítopo, o miembro opuesto de la pareja complemento/anticomplemento en la muestra, se unirá al receptor, anticuerpo o miembro inmovilizado, respectivamente, produciendo un cambio en el índice de refracción del medio, que se detecta como un cambio en la resonancia del plasmón superficial de la película de oro. Este sistema permite la determinación de las tasas de activación y desactivación, a partir de las cuales se puede calcular la afinidad de unión, y hacer la evaluación de la estequiometría de unión. Como alternativa, se puede analizar la unión ligando/receptor usando tecnología SELDI(TM) (Ciphergen, Inc., Palo Alto, CA). Además, se puede usar tecnología BIACORE, descrita anteriormente, a usarse en experimentos de competición para determinar si diferentes anticuerpos monoclonales se unen al mismo o diferentes epítopos del polipéptido de IL-22RA, y de esta forma, se usan para ayudar en el mapeado de epítopos de los anticuerpos neutralizantes de la presente invención que se unen, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan o neutralizan IL-22 o IL-20 e IL-22. [0150] Se pueden usar también los polipéptidos del receptor de unión al ligando con otros sistemas de ensayo conocidos en la técnica. Dichos sistemas incluyen el análisis Scatchard para la determinación de la afinidad de unión (véase Scatchard, Ann. NY Acad Sci. 51: 660-72, 1949) y los ensayos calorimétricos (Cunningham y col., Science 253: 545-48, 1991; Cunningham y col., Science 245: 821-25, 1991). [0151] La presente memoria descriptiva describe una variedad de diferentes polipéptidos de condensación y de proteínas multiméricas relacionadas que comprenden una o más condensaciones de polipéptidos. Por ejemplo, se puede preparar un receptor soluble de IL-22RA como una condensación de una proteína de dimerización según se da a conocer en las Patentes de los Estados Unidos Nos 5.155.027 y 5.567.584. Las proteínas de dimerización preferidas a este respecto incluyen dominios de la región constante de la inmunoglobulina, por ejemplo, IgGγ1 y la cadena ligera κ humana. Se pueden expresar condensaciones de Inmunoglobulina – IL-22RA soluble en células construidas mediante ingeniería genética para producir una variedad de análogos del receptor IL-22RA multimérico. Se pueden condensar las regiones auxiliares con un receptor soluble de IL-22RA para dirigirlas a las células, tejidos o macromoléculas específicas (por ejemplo, colágeno, o células que expresan los ligando IL-22RA, IL-22 o IL-20). Se puede condensar un polipéptido de IL-22RA con dos o más restos, tales como una etiqueta de afinidad para la purificación y una región directora. Las condensaciones de polipéptidos pueden comprender también uno

o más lugares de escisión, particularmente entre regiones. Véase, Tuan y col., Connective Tissue Research 34: 1-9, 1996. [0152] En células bacterianas es a menudo deseable expresar una proteína heteróloga como una proteína de condensación para disminuir la toxicidad, aumentar la estabilidad, y potenciar la recuperación de la proteína expresada. Por ejemplo, se puede expresar IL-22RA como una proteína de condensación que comprende un polipéptido de la glutatión S transferasa. Las proteínas de condensación de la glutatión S transferasa son normalmente solubles, y fácilmente purificables de lisados de E. coli

o columnas de glutatión inmovilizado. En soluciones similares, se puede aislar una proteína de condensación de IL-22RA que comprende un polipéptido de la proteína de unión a la maltosa con una columna de resina de amilosa, aunque se puede purificar una proteína de condensación que comprende el extremo C terminal de un gen de la Proteína A truncada usando IgG-Sefarosa. Se describen las técnicas establecidas para expresar un polipéptido heterólogo como una proteína de condensación en una célula bacteriana, por ejemplo, en Williams y col., "Expression of Foreign Proteins in E. coli Using Plasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies," en DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2ª Edición, Glover y Hames (Eds.), páginas 15-58 (Oxford University Press 1995). Adicionalmente, se dispone de sistemas de expresión comercialmente disponibles. Por el ejemplo, el sistema de purificación PINPOINT de la proteína Xa (Promega Corporation; Madison, WI) proporciona un procedimiento para aislar una proteína de condensación que comprende un polipéptido que llega a estar biotinilado durante la expresión con una resina que comprende avidina. [0153] Las etiquetas de péptidos que son útiles para aislar polipéptidos heterólogos expresados tanto por células procariotas como eucariotas incluyen etiquetas de polihistidina (que tienen una afinidad por la resina quelante de níquel),

etiquetas c-myc, proteína de unión a la calmodulina (aislada con cromatografía de afinidad por la calmoludina), sustancia P, la etiqueta RYIRS (que se une con anticuerpos dirigidos contra RYIRS), la etiqueta Glu-Glu, y la etiqueta FLAG (que se une con anticuerpos dirigidos contra FLAG). Véanse, por ejemplo, Luo y col., Arch. Biochem. Biophys. 329: 215 (1996), Morganti y col., Biotechnol. Appl. Biochem. 23: 67 (1996), y Zheng y col., Gene 186: 55 (1997). Están disponibles moléculas de ácido nucleico que codifican dichas etiquetas de péptidos, por ejemplo, de Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO). [0154] Otra forma de proteína de condensación comprende un polipéptido de IL22RA y una región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, normalmente un fragmento Fc, que contiene dos o tres dominios de la región constante y una región en bisagra pero que carece de la región variable. Como ilustración, Chang y col., Patente de los Estado Unidos Nº 5.723.125, describen una proteína de condensación que comprende un interferón humano y un fragmento Fc de la inmunoglobulina humana. El c terminal del interferón se une al N terminal del fragmento Fc mediante un resto enlazante al péptido. Un ejemplo de péptido enlazante es un péptido que comprende principalmente una secuencia inerte de célula T, que es inmunológicamente inerte. Un péptido enlazante a modo de ejemplo tiene una secuencia de aminoácidos: GGSGG SGGGGSGGGG S (SEC. DE ID Nº 9) En esta proteína de condensación, un resto Fc ilustrativo es una cadena γ4 humana, que es estable en disolución y tiene poca

o ninguna actividad de activación del complemento. Según esto, la presente invención contempla una proteína de condensación de IL-22RA que comprende un resto de IL22RA y un fragmento Fc humano, en el que el término C del resto de IL-22RA se une al término N del fragmento Fc mediante un péptido enlazante, tal como un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº 4. El resto de IL-22RA puede ser una molécula de IL-22RA o uno de sus fragmentos. Por ejemplo, una proteína de condensación puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº 3 y un fragmento Fc (por ejemplo, un fragmento Fc humano) (SEC. DE ID Nº 4). [0155] En otra variación, una proteína de condensación de IL-22RA comprende una secuencia de IgG, un resto de IL-22RA unido covalentemente al extremo aminoterminal de la secuencia de IgG, y un péptido señal que se une covalentemente al aminoterminal del resto de IL-22RA, en el que la secuencia de IgG está constituida por los siguientes elementos en el siguiente orden; una región en bisagra, una región CH2, y una región CH3. Según esto, la secuencia de IgG carece de una región CH1. El resto

de IL-22RA muestra una actividad de IL-22RA, según se describe en el presente documento, tal como la capacidad de unirse con un ligando IL-22RA. Esta solución general para producir proteínas de condensación que comprende porciones de anticuerpo y sin anticuerpo se ha descrito por LaRochelle y col., documento EP 742830 (documento WO 95/21258). [0156] Se pueden usar proteínas de condensación que comprendan un resto de IL22RA, por ejemplo, como una herramienta de ensayo in vitro. Por ejemplo, se puede detectar un ligando IL-22RA en una muestra biológica usando una proteína de condensación de IL-22RA-inmunoglobulina, en la que se usa el resto de IL-22RA para unirse al ligando, y una macromolécula, tal como una Proteína A o anticuerpo dirigido contra Fc, para unir la proteína de condensación a un soporte sólido. Se pueden usar dichos sistemas para identificar agonistas y antagonistas que interfieran con la unión de unos ligandos de IL-22RA, por ejemplo, IL-22 o IL-20 e IL-22, a su receptor. [0157] Otros ejemplos de proteínas de condensación de anticuerpos incluyen polipéptidos que comprenden una región de unión al antígeno y un fragmento de IL22RA que contiene una región extracelular de IL-22RA. Se pueden usar dichas moléculas para dirigir tejidos concretos para el beneficio de la actividad de unión de IL-22RA. [0158] La presente memoria descriptiva describe una variedad de diferentes polipéptidos de condensación. Por ejemplo, se puede intercambiar parte de todo de una región(s) que confieren una función biológica entre el IL-22RA de la presente invención, con la región(s) con funcionalidad equivalente a partir de otro miembro de la familia del receptor de la citocina. Se pueden expresar polipéptidos de condensación en células hospedadoras recombinantes para producir una variedad de análogos de condensación de IL-22RA. Se puede condensar un polipéptido de IL-22RA con dos o más restos o regiones, tales como una etiqueta de afinidad para a purificación y una región directora. Las condensaciones de polipéptidos pueden comprender también uno

o más lugares de escisión, particularmente entre regiones. Véase, por ejemplo, Tuan y col., Connective Tissue Research 34: 1 (1996). [0159] Se pueden preparar proteínas de condensación mediante procedimientos conocidos por las personas expertas en la materia preparando cada componente de la proteína de condensación y conjugándolo químicamente. Como alternativa, se puede generar un polinucleótido que codifica ambos componentes de la proteína de condensación en el marco de lectura apropiado usando técnicas conocidas y expresarse mediante los procedimientos descritos en el presente documento. Se describen los

procedimientos generales para la escisión enzimática y química de las proteínas de condensación, por ejemplo, en Ausubel (1995) en las páginas 16-19 a 16-25. [0160] Se pueden caracterizar adicionalmente las regiones de unión a IL-22RA mediante análisis físico de la estructura, según se determina mediante dichas técnicas como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o marcado de fotoafinidad, conjuntamente con la mutación de posibles aminoácidos del lugar en el lugar de contacto de los agonistas del ligando IL-22RA. Véanse, por ejemplo, de Vos y col., Science 255: 306 (1992), Smith y col., J. Mol. Biol. 224: 899 (1992), y Wlodaver y col., FEBS Lett. 309: 59 (1992). [0161] La presente memoria descriptiva describe composiciones de IL-22RA químicamente modificadas, en las que se une un polipéptido de IL-22RA con un polímero. Los polipéptidos de IL-22RA ilustrativos son polipéptidos solubles que carecen de una región transmembrana funcional, tales como un polipéptido constituido por los restos de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº 3 normalmente, el polímero es hidrosoluble de tal manera que el conjugado de IL-22RA no precipita en un entorno acuoso, tal como un entorno fisiológico. Un ejemplo de un polímero adecuado es uno que se ha modificado para tener un único grupo reactivo, tal como un éster activo para acilación, o un aldehído para alquilación. De esta manera, se puede controlar el grado de polimerización. Unos ejemplos de aldehído reactivo es polietilenglicol propionaldehído, o mono-(C1-C10) alcoxi, o derivados ariloxi del mismo (véase, por ejemplo, Harris, y col., Patente de los Estados Unidos Nº 5.252.714). El polímero puede ser ramificado o no ramificado. Además, se puede usar una mezcla de polímeros para producir conjugados de IL-22RA. [0162] Los conjugados de IL-22RA usados para terapia pueden comprender restos de polímeros solubles en agua farmacéuticamente aceptables. Los polímeros solubles en agua adecuados incluyen polietilenglicol (PEG), monometoxi-PEG, mono-(C1C10)alcoxi-PEG, ariloxi-PEG, poli-(N-vinilpirrolidona)PEG, tresil monometoxi PEG, PEG propionaldehído, gis-succinimidil carbonato de PEG, homopolímeros de propilenglicol, u copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico, dextrano, celulosa, u otros polímeros basados en carbohidratos. Los PEG adecuados pueden tener un peso molecular entre aproximadamente 600 y aproximadamente 60.000, incluyendo, por ejemplo, 5.000, 12.000, 20.000 y 25.000. Un conjugado de IL-22RA puede comprender también una mezcla de dichos polímeros solubles en agua. [0163] Un ejemplo de conjugado de IL-22RA comprende un resto de IL-22RA y un resto de óxido de polialquilo unido al término N del resto de IL-22RA. PEG es un óxido de polialquilo adecuado. Como ilustración, se puede modificar IL-22RA con PEG, un proceso conocido como “PEGilación”. Se puede llevar a cabo la PEGilación de IL-22RA mediante cualquiera de las reacciones de PEGilación conocidas en la técnica (véanse, por ejemplo, el documento EP 0 154 316, Delgado y col., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249 (1992), Duncan y Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27: 290 (1994), y Francis y col., Int J Hematol 68: 1 (1998)). Se puede llevar a cabo, por ejemplo, la PEGilación mediante una reacción de acilación o mediante una reacción de alquilación con una molécula de polietilenglicol reactiva. En una solución alternativa, se forman conjugados de IL-22RA condensando PEG activado, en el que se ha sustituido un grupo hidroxi o aminoterminal de PEG por un enlazante activado (véase, por ejemplo, Karasiewicz y col., Patente de los Estados Unidos Nº 5.382.657). [0164] La PEGilación mediante acilación requiere normalmente hacer reaccionar un derivado de éster activo de PEG con un polipéptido de IL-22RA. Un ejemplo de un éster de PEG activado es PEG esterificado a N-hidroxisuccinimida. Según se usa en el presente documento, el término “acilación” incluye los siguientes tipos de enlaces entre IL-22RA y un polímero hidrosoluble: amida, carbamato, uretano y similares. Los procedimientos para preparar IL-22RA PEGilado mediante acilación comprenderán normalmente las etapas de (a) hacer reaccionar un polipéptido de IL-22RA con PEG (tal como un éster reactivo de un derivado de aldehído de PEG) en condiciones en las que uno o más grupos PEG se unen a IL-22RA, y (b) obtener el producto(s) de reacción. Generalmente, las condiciones óptimas de reacción para las reacciones de acilación se determinarán basándose en parámetros conocidos y en los resultados deseados. Por ejemplo, cuanto mayor sea la relación PEG:IL-22RA, mayor porcentaje de producto de IL-22RA poliPEGilado. [0165] El producto de la PEGilación mediante acilación es normalmente un producto de IL-22RA poliPEGilado, en el que los grupos ε-amino de la lisina se PEGilan mediante un grupo acilo enlazante. Un grupo de enlace de conexión es una amida. Normalmente, el IL-22RA resultante estará al menos un 95 % mono, di, o tri pegilado, aunque se pueden formar algunas especies con mayores grados de PEGilación dependiendo de las condiciones de reacción. Se pueden separar las especies PEGiladas a partir de polipéptidos de IL-22RA no conjugados, usando procedimientos de purificación normalizados, tales como diálisis, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, y similares.

[0166] La PEGilación mediante alquilación implica generalmente hacer reaccionar un derivado de aldehído terminal de PEG con IL-22RA en presencia de un agente reductor. Se pueden unir grupos PEG al polipéptido mediante un grupo –CH2-NH. [0167] Además, se pueden PEGilar anticuerpos dirigidos contra IL-22RA o fragmentos de anticuerpos de la presente invención usando los procedimientos de la técnica y descritos en el presente documento. [0168] La derivatización mediante alquilación reductora para producir un producto monoPEGilado tiene la ventaja de la reactividad diferencial de los diferentes grupos amino primarios disponibles para la derivatización. Normalmente, se lleva a cabo la reacción a un pH que permia tener la ventaja de diferencias de pKa entre los grupos ε-amino de los restos de lisina y los grupos α-amino del resto N terminal de la proteína. Mediante dicha derivatización selectiva, se controla la unión de un polímero hidrosoluble que contiene un grupo reactivo tal como un aldehído, con una proteína. La conjugación con el polímero se produce predominantemente en el término N de la proteína sin modificación significativa de otros grupos reactivos tales como los grupos amino de la cadena secundaria de la lisina. La presente invención proporciona una preparación sustancialmente homogénea de los monopolímeros conjugados de IL22RA. [0169] La alquilación reductora para producir una población sustancialmente homogénea de una molécula monopolimérica conjugada de IL-22RA puede comprender las etapas de: (a) hacer reaccionar un polipéptido de IL-22RA con un PEG reactivo en condiciones de alquilación reductora a un pH adecuado para permitir la modificación selectiva del grupo α-amino en el término amino del IL-22RA y (b) obtener el producto(s) de reacción. El agente reductor usado para la alquilación reductora debe ser estable en disolución acuosa y capaz de reducir únicamente la base de Schiff formada en el proceso inicial de la alquilación reductora. Los agentes reductores ilustrativos incluyen borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, dimetilamina borano, trimetilamina borano, y piridina borano. [0170] Para una población sustancialmente homogénea de monopolímeros conjugados de IL-22RA, las condiciones de reacción de la alquilación reductora son las que permiten la unión selectiva del resto de polímero hidrosoluble al término N de IL-22RA. Dichas condiciones de reacción proporcionan generalmente diferencias de pKa entre los grupos amino de la lisina y el grupo α-amino en el término N. El pH afecta también la relación de polímero a proteína que se va a usar. En general, si el pH es más bajo, se deseará un exceso más grande de polímero a proteína debido a la menor reactividad del grupo α N terminal, se necesita la mayor parte de polímero para alcanzar las condiciones óptimas. Si el pH es mayor, la relación polímero:IL-22RA no es tan grande debido a que están disponibles más grupos reactivos. Normalmente, el pH se encontrará comprendido dentro del intervalo de 3 a 9, o de 3 a 6. Se puede emplear este procedimiento para preparar conjugados de IL-22RA que comprendan receptores solubles homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos. [0171] Otro factor a considerar es el peso molecular del polímero hidrosoluble. Generalmente, cuanto mayor sea el peso molecular del polímero, menor número de moléculas de polímero se pueden unir a la proteína. Para las reacciones de PEGilación, el peso molecular típico es de aproximadamente 2 kDa a aproximadamente 100 kDa, aproximadamente 5kDa a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 12 kDa a aproximadamente 25 kDa. La relación molar de polímero hidrosoluble a IL-22RA estará generalmente en el intervalo de 1:1 a 100:1. Normalmente, la relación molar de polímero hidrosoluble a IL-22RA será de 1:1 a 20:1 para la PEGilación, y de 1:1 a 5:1 para la monoPEGilación. [0172] Se conocen en la técnica los procedimientos generales para producir conjugados que comprendan restos polipeptídicos y de polímero hidrosoluble Véanse, por ejemplo, Karasiewicz y col., Patente de los Estados Unidos Nº 5.382.657, Greenwald y col., patente de los Estados Unidos Nº 5.738.846, Nieforth y col., Clin. Pharmacol. Ther. 59: 636 (1996), Monkarsh y col., Anal. Biochem. 247: 434 (1997)). [0173] La presente invención contempla composiciones que comprenden un anticuerpo, según se define en las reivindicaciones. Dichas composiciones pueden comprender además un vehículo. El vehículo puede ser un vehículo orgánico o inorgánico convencional. Los ejemplos de vehículos incluyen agua, disolución tampón, alcohol, propilenglicol, macrogol, aceite de sésamo, aceite de maíz, y similares.

7. AISLAMIENTO DE POLIPÉPTIDOS DE IL-22RA

[0174] Se pueden purificar los polipéptidos descritos en el presente documento hasta al menos un 80 % de pureza, hasta al menos un 90 % de pureza, hasta al menos un 95 % de pureza, o más de un 95 %, tal como un 96 %, 97 %, 98 % o más de un 99 % de pureza con respecto a las macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y ácidos nucleicos, y libres de agentes infecciosos y pirógenos. Se pueden purificar también los polipéptidos descritos en el presente documento a un estado farmacéuticamente puro, que es mayor de un 99 % de pureza. En algunas preparaciones, el polipéptido purificado está sustancialmente libre de otros polipéptidos, particularmente otros polipéptidos de origen animal. [0175] Se pueden usar procedimientos de purificación por fraccionamiento y/o convencionales para obtener preparaciones de IL-22RA purificadas a partir de fuentes naturales (por ejemplo, fuentes de tejido humano), polipéptidos sintéticos de IL-22RA, y polipéptidos recombinantes de IL-22RA y polipéptidos de condensación de IL-22RA purificados a partir de células hospedadoras recombinantes. En general, se puede usar la precipitación con sulfato de amonio o la extracción caótropa para el fraccionamiento de las muestras. Las etapas de purificación a modo de ejemplo incluyen la hidroxiapatita, la exclusión por tamaño, la FPLC y la cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa. Los medios cromatográficos adecuados incluyen dextranos derivatizados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, especialmente sílices, y similares, Son adecuados derivados de PEI, DEAE, QAE y Q, Los medios cromatográficos a modo de ejemplo incluyen los medios derivatizados con grupos fenilo, butilo u octilo, tales como Fenil-Sefarosa FF (Pharmacia), Toyopearl butil 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octil-Sefarosa (Pharmacia) y similares; o resinas poliacrílicas, tales como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares. Los soportes sólidos adecuados incluyen perlas de vidrio, resinas basadas en sílice, resinas celulósicas, perlas de agarosa, perlas de agarosa reticuladas, perlas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticuladas y similares que son insolubles en las condiciones en las que se van a usar. Se pueden modificar estos soportes con grupos reactivos que permitan la unión de las proteínas mediante grupos amino, grupos carboxilo, grupos suflhidrilo, grupos hidroxilo y/o restos de carbohidratos. [0176] Los ejemplos de las químicas de acoplamiento incluyen la activación mediante bromuro de cianógeno, la activación mediante N-hidroxisuccinimida, la activación mediante epóxido, la activación mediante suflhidrilo, la activación mediante hidrazida, y las químicas de acoplamiento del carboxilo y los derivados amino de la carbodiimida. Estos y otros medios sólidos son bien conocidos y se usan en la técnica, y están disponibles de suministradores comerciales. La selección de un procedimiento particular para el aislamiento y la purificación de polipéptidos es materia de diseño rutinario y se determina en parte por las propiedades del soporte escogido. Véanse, por ejemplo, Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology 1988), y Doonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996). [0177] Las personas expertas en la material pueden diseñar variaciones adicionales en el aislamiento y la purificación de IL-22RA. Se pueden usar, por ejemplo, anticuerpos dirigidos contra IL-22RA, obtenidos según se describe a continuación para aislar grandes cantidades de proteínas mediante purificación por inmunoafinidad. [0178] Se pueden aislar también los polipéptidos descritos en el presente documento mediante aprovechamiento de las propiedades particulares. Por ejemplo, se puede usar la cromatografía de adsorción de iones metálicos inmovilizados (IMAC) para purificar proteínas ricas en histidina, incluyendo las que comprenden etiquetas de histidina. Brevemente, se introducen en primer lugar en un gel, iones metálicos divalentes para formar un quelato (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (1985)). Las proteínas ricas en histidina se adsorberán en esta matriz con diferentes afinidades, dependiendo del ión metálico usado, y se eluirán mediante elución competitiva, disminuyendo el pH, o el uso de agentes quelantes fuertes. Otros procedimientos de purificación incluyen la purificación de proteínas glicosiladas mediante cromatografía de afinidad de lectina y cromatografía de intercambio iónico (M. Deutscher, (ed.), Meth. Enzymol. 182: 529 (1990)). Dentro de las realizaciones adicionales, se puede construir una condensación del polipéptido de interés y una etiqueta de afinidad (por ejemplo, una proteína de unión a maltosa, una región de la inmunoglobulina) para facilitar la purificación. Además, se pueden aprovechar las propiedades de unión al ligando de la región extracelular de IL-22RA para la purificación, por ejemplo, de los receptores solubles que comprenden IL-22RA; por ejemplo, usando la cromatografía de afinidad en la que el ligando IL-22 se une a una columna y el receptor que comprende IL-22RA se une y se eluye posteriormente usando procedimientos de cromatografía normalizados. [0179] Se pueden preparar también polipéptidos de IL-22RA o sus fragmentos mediante síntesis química, según se ha descrito anteriormente. Los polipéptidos de IL22RA pueden ser monómeros o multímeros; glicosilados o no glicosilados; PEGilados

o no PEGilados; y pueden o no incluir un resto inicial del aminoácido metionina.

8. PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS DE PROTEÍNAS DE IL-22RA

[0180] Se pueden obtener anticuerpos de IL-22RA, usando, por ejemplo, el producto de un vector de expresión de IL-22RA o IL-22RA aislado de una fuente natural como un antígeno. Los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA particularmente útiles “se unen específicamente” con IL-22RA. Se considera que los anticuerpos se unen específicamente si los anticuerpos presentan al menos una de las dos siguientes propiedades; (a) los anticuerpos se unen a IL-22RA con un nivel umbral de actividad de unión, y (2) los anticuerpos no se entrecruzan significativamente con polipéptidos relacionados con IL-22RA. [0181] Con respecto a la primera característica, los anticuerpos se unen específicamente si se unen a un polipéptido, péptido o epítopo de IL-22RA con afinidad de unión (Ka) de 106 M-1 o mayor. Una persona normalmente experta en la técnica puede determinar fácilmente la afinidad de unión de un anticuerpo, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660 (1949)). Con respecto a la segunda característica, los anticuerpos no experimentas significativamente reacciones cruzadas con moléculas de polipéptidos relacionados, por ejemplo, si detectan IL-22RA, pero no polipéptidos actualmente conocidos usando un análisis de transferencia Western. Los ejemplos de polipéptidos relacionados conocidos incluyen receptores de citocina conocidos. [0182] Se pueden producir anticuerpos dirigidos contra IL-22RA usando péptidos y polipéptidos que soportan epítopos antigénicos de IL-22RA. Los péptidos y polipéptidos que soportan epítopos antigénicos de la presente invención contienen una secuencia de al menos nueve, o entre 15 y aproximadamente 30 aminoácidos contenidos dentro de la SEC. DE ID Nº 3 u otra secuencia de aminoácidos dada a conocer en el presente documento. Sin embargo, los péptidos o polipéptidos que comprenden una porción más grande de una secuencia de aminoácidos de la invención, que contienen entre 30 y 50 aminoácidos, o cualquier longitud hasta e incluyendo la secuencia completa de aminoácidos de un polipéptido de la invención, son también útiles para inducir anticuerpos que se unan a IL-22RA. Es deseable que la secuencia de aminoácidos del péptido que soporta el epítopo se seleccione para proporcionar solubilidad sustancial en disolventes acuosos (es decir, la secuencia incluye restos relativamente hidrófilos, mientras que se evitan normalmente los restos hidrófobos). Además, pueden ser también deseables las secuencias de aminoácidos que contienen restos de prolina para la producción de anticuerpos. [0183] Como ilustración, se identificaron los emplazamientos antigénicos potenciales en IL-22RA usando el procedimiento de Jameson-Wolf, Jameson y Wolf, CABIOS4: 181, (1988), según se implementó mediante el programa PROTEAN (versión 3.14) de LASERGENE (DNASTAR; Madison, WI). Se usaron parámetros por defecto en este análisis. [0184] El procedimiento de Jameson-Wolf predice determinantes antigénicos potenciales combinando seis subrutinas mayores para la predicción de la proteína estructural. Brevemente, se usó en primer lugar el procedimiento HoppWoods, Hopp y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 78: 3824 (1981), para identificar las secuencias de aminoácidos que representaban las áreas de mayor hidrofilia local (parámetro: siete restos promediados). En la segunda etapa, se usó el procedimiento de Emini, Emini y col., J. Virology 55: 836 (1985), para calcular las probabilidades superficiales (parámetro: umbral de decisión superficial (0,6) = 1). En tercer lugar, se usó el procedimiento Karplus-Schultz, Karplus y Schultz, Naturwissenschaften 72: 212 (1985), para predecir la flexibilidad estructural de la cadena (parámetro: umbral de flexibilidad (0,2) = 1). En la cuarta y quinta etapas del análisis, se aplicaron predicciones de la estructura secundaria a los datos usando los procedimientos de Chou-Fasman, Chou, "Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Composition," en Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Fasman (ed.), Páginas 549-586 (Plenum Press 1990), y Garnier-Robson, Garnier y col., J. Mol. Biol. 120: 97 (1978) (parámetros de Chou-Fasman: tabla de conformación = 64 proteínas; umbral de la región α = 103; umbral de la región β = 105; parámetros de Gamier-Robson: constantes de decisión α y β = 0). En la sexta subrutina, se combinaron los parámetros de flexibilidad y los factores de accesibilidad hidropatía/disolvente para determinar un valor de contorno superficial, designado como “índice antigénico”. Finalmente, se aplicó una función de ampliación del pico al índice antigénico, que amplía los picos de mayor superficie añadiendo 20, 40, 60 u 80 % del valor del pico respectivo para tener en cuenta la energía libre adicional derivada de la movilidad de las regiones superficiales con respecto a las regiones interiores. No se aplicó este cálculo, sin embargo a cualquier pico mayor que reside en la región helicoidal, debido a que las regiones helicoidales tienden a ser menos flexibles. [0185] Los resultados de este análisis indicaron que las siguientes secuencias de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº 3 podrían proporcionar péptidos antigénicos adecuados: Se pueden usar los perfiles de hidrofilia de Hopp/Woods para determinar las regiones que tienen el mayor potencial antigénico dentro de la SEC. DE ID Nº 3 (Hopp y col., Proc. Natl. Acad. Sci.78: 3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88: 1-18, 1986 y Triquier y col., Protein Engineering 11: 153-169, 1998). Se basa el perfil en la ventana de seis restos deslizantes. Los restos G, S, y T enterrados y se ignoraron los restos H, Y y W expuestos. Además, los epítopos antigénicos de IL-22RA dentro de la SEC. DE ID Nº 3 según se predice mediante una representación grafica de Jameson-Wolf, usando, por ejemplo el programa DNASTAR Protean sirven como epítopos antigénicos preferidos y una persona experta en la técnica puede determinarlos. Dichos epítopos antigénicos incluyen (1) los restos de aminoácidos 1 (Pro) a 6 (Asp) de la SEC. DE ID Nº 3; (2) los restos de aminoácidos 26 (Ser) a 32 (Pro) de la SEC. DE ID Nº 3; (3) los restos de aminoácidos 41 (Lys) a 47 (Asp) de la SEC. DE ID Nº 3; (4) los restos de aminoácidos 49 (Val) a 62 (Cys) de la SEC. DE ID Nº 3; (5) los restos de aminoácidos 41 (Lys) a 62 (Cys) de la SEC. DE ID Nº 3; (6) los restos de aminoácidos 84 (Ala) a 97 (Ser) de la SEC. DE ID Nº 3; (7) los restos de aminoácidos 103 (Thr) a 108 (Asp) de la SEC. DE ID Nº 3; (8) los restos de aminoácidos 130 (Arg) a 135 (His) de la SEC. DE ID Nº 3; (9) los restos de aminoácidos 164 (Gly) a 166 (Lys) de la SEC. DE ID Nº 3; (10) los restos de aminoácidos 175 (Tyr) a 179 (Glu) de la SEC. DE ID Nº 3; (11) los restos de aminoácidos 193 (Lys) a 196 (Ala) de la SEC. DE ID Nº 3; (12) los restos de aminoácidos 203 (Lys) a 209 (Thr) de la SEC. DE ID Nº 3. La presente memoria descriptiva describe el uso de una cualquiera de los péptidos antigénicos 1 a 12 para generar anticuerpos de IL-22RA o como una herramienta para cribar o identificar anticuerpos monoclonales neutralizantes de la presente invención. La presente invención contempla también el uso de cualquier péptido o epítopo antigénico descritos en el presente documento para generar anticuerpos de IL-22RA, así como para identificar y cribar anticuerpos monoclonales contra IL-22RA que son neutralizantes, y que se pueden unir, bloquear, inhibiré, reducir, antagonizar o neutralizar la actividad de IL-22 e IL-20 (individual o conjuntamente). [0186] Además, los antígenos adecuados incluyen también los polipéptidos de IL22RA que comprenden una unión a la citocina de IL-22RA, tal como los que forman polipéptidos heterodiméricos o multiméricos solubles de IL-22RA, tales como IL22RA/CRF2-4, IL-22RMzcytor11, IL-22RA/zcytor7 solubles, y similares. [0187] Se pueden preparar anticuerpos policlonales de la proteína IL-22RA recombinante o de IL-22RA aislada de fuentes naturales usando procedimientos bien conocidos por las personas expertas en la técnica. Véanse, por ejemplo, Green y col., "Production of Polyclonal Antisera," en Immunochemical Protocols (Manson, ed.), páginas 1-5 (Humana Press 1992), y Williams y col., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies," en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª Edición , Glover y col. (eds.), página 15 (Oxford University Press 1995). Se puede aumentar la inmunogenicidad de un polipéptido de IL-22RA mediante el uso de un adyuvante, tal como alum (hidróxido de aluminio) o adyuvante completo o incompleto de Freund. Los polipéptidos útiles para la inmunización incluyen también polipéptidos de condensación, tales como condensaciones de IL-22RA o de una de sus porciones con un polipéptido de la inmunoglobulina o con una proteína de unión a maltosa: El polipéptido inmunógeno puede ser una molécula de longitud completa o una de sus porciones. Si la porción de polipéptido está “libre de hapteno”, se puede unir ventajosamente dicha porción o enlazarse a un vehículo macromolecular (tal como hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina de suero bovino (BSA) o toxoide del tétanos) para la inmunización. [0188] Aunque los anticuerpos policlonales se cultivan normalmente en animales tales como caballos, vacas, perros, gallinas, ratas, ratones, conejos, cobayas, cabras, u ovejas, se puede derivar también un anticuerpo dirigido contra IL-22RA a partir de un anticuerpo de primate subhumano. Se pueden encontrar técnicas generales para incrementar anticuerpos diagnóstica y terapéuticamente útiles en babuinos, por ejemplo, en Goldenberg y col., publicación de patente internacional Nº WO91/11465, y en Losman y col., Int. J. Cancer 46: 310 (1990). [0189] Como alternativa, se pueden generar anticuerpos monoclonales contra IL22RA. Se pueden obtener anticuerpos monoclonales de roedores para antígenos específicos mediante procedimientos conocidos por las personas expertas en la técnica (véanse, por ejemplo, Kohler y col., Nature 256: 495 (1975), Coligan y col. (eds.), Current Protocols in Immunology, Vol. 1, páginas 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) ["Coligan"], Picksley y col., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli," en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª Edición, Glover y col. (eds.), página 93 (Oxford University Press 1995)). [0190] Brevemente, se pueden obtener anticuerpos monoclonales inyectando ratones con una composición que comprende un producto del gen IL-22RA, verificando la presencia de producción de anticuerpos retirando una muestra de suero, retirando el bazo para extraer linfocitos B, fusionando los linfocitos B con células de mieloma para producir hibridomas, clonando los hibridomas, seleccionando los clones positivos que producen anticuerpos para el antígeno, cultivando los clones que producen anticuerpos para el antígeno, y aislando los anticuerpos de los cultivos de hibridoma. [0191] Adicionalmente, se puede derivar un anticuerpo dirigido contra IL-22RA a partir de un anticuerpo monoclonal humano. Se obtienen los anticuerpos monoclonales humanos de ratones transgénicos que se han diseñado mediante ingeniería genética para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta al estímulo antigénico. En esta técnica, se introducen elementos del locus de la cadena pesada y ligera humana en cepas de ratones derivadas de líneas de citoblastos embriónicos que contienen perturbaciones dirigidas del los loci de la cadena pesada y de la cadena ligera endógenas. El ratón transgénico puede sintetizar anticuerpos humanos específicos de antígenos humanos, y se pueden usar los ratones para producir hibridomas secretores de anticuerpos. Se describen procedimientos para obtener anticuerpos humanos a partir de ratones transgénicos, por ejemplo, en Green y col., Nature Genet. 7: 13 (1994), Lonberg y col., Nature 368: 856 (1994), y Taylor y col., Int. Immun. 6: 579 (1994). [0192] Se pueden aislar y purificar anticuerpos monoclonales a partir de cultivos de hibridoma mediante una variedad de técnicas bien establecidas. Dichas técnicas de aislamiento incluyen la cromatografía de afinidad con proteína-A-sefarosa, la cromatografía de exclusión por tamaño, y la cromatografía de intercambio iónico (véanse, por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1-2.7.12 y en las páginas 2.9.1-2.9.3; Baines y col., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," en Methods in Molecular Biology, Vol. 10, páginas 79-104 (The Human Press, Inc. 1992)). [0193] Para usos particulares, puede ser deseable preparar fragmentos de anticuerpos dirigidos contra IL-22RA. Se pueden obtener dichos fragmentos de anticuerpos, por ejemplo mediante hidrólisis proteolítica del anticuerpo. Se pueden obtener fragmentos de anticuerpos mediante digestión con pepsina o papaína de anticuerpos completos mediante procedimientos convencionales. Como ilustración, se pueden producir fragmentos de anticuerpos mediante escisión enzimática de los anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denotado F(ab’)2. Se puede escindir adicionalmente este fragmento usando un agente reductor de tiol para producir fragmentos monovalentes 3,5S Fab’. Opcionalmente, se puede llevar a cabo la reacción de escisión usando un grupo de bloqueo de los grupos suflhidrilo que da como resultado la escisión de los enlaces disulfuro. Como alternativa, una escisión enzimática usando pepsina produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fc directamente. Se describen estos procedimientos, por ejemplo, en Goldenberg, patente de los Estados Unidos Nº 4.331.647, Nisonoff y col., Arch Biochem. Biophys.

89: 230 (1960), Porter, Biochem. J. 73: 119 (1959), Edelman y col., en Methods in Enzymology Vol. 1, página 422 (Academic Press 1967), y en Coligan en las páginas 2.8.1-2.8.10 y 2.10.-2.10.4. [0194] Se pueden usar también otros procedimientos de escisión de anticuerpos, tales como la separación de las cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena ligera-pesada monovalentes, escisión adicional de los fragmentos, u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, siempre que los fragmentos se unan al antígeno que se reconoce por el anticuerpo intacto. [0195] Por ejemplo, los fragmentos Fv comprenden una asociación de cadenas VH y VL. esta asociación puede ser no covalente, según se describe en Inbar y col., Proc.

Nat’l Acad. Sci. USA 69: 2659 (1972). Como alternativa, se pueden unir las cadenas variables mediante un enlace disulfuro intermolecular o entrecruzarse mediante agentes químicos tales como glutaraldehído (véase, por ejemplo, Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992)). [0196] Los fragmentos Fv pueden comprender las cadenas VH y VL que se conectan mediante un péptido enlazante. Estas proteínas de unión a antígeno de cadena única (scFv) se preparan construyendo un gen estructural que comprende secuencias de ADN que codifican las regiones de VH y VL que se conectan mediante un oligonucleótido. El gen estructural se inserta en un vector de expresión que se introduce posteriormente en una célula hospedadora, tal como E. coli. Las células hospedadoras recombinantes sintetizan una única cadena de polipéptido con un péptido enlazante que forma un puente entre las dos cadenas V. se describen los procedimientos para producir scFv , por ejemplo, en Whitlow y col., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 97 (1991) (véanse también, Bird y col., Science 242: 423 (1988), Ladner y col., Patente de los Estado Unidos Nº 4.946.778, Pack y col., Bio/Technology 11: 1271 (1993), y Sandhu, más arriba). [0197] Como ilustración, se puede obtener una scFV exponiendo linfocitos a un polipéptido de IL-22RA in vitro, y seleccionando bibliotecas de presentación de anticuerpos en fagos o vectores similares (por ejemplo, mediante el uso de una proteína o péptido de IL-22RA inmovilizada o marcada). Se pueden obtener genes que codifican los polipéptidos tienen potenciales regiones de unión al polipéptido de IL22RA mediante bibliotecas de péptidos cribados aleatoriamente presentados en fagos (presentación de fagos) o en bacterias, tales como E. coli. Se pueden obtener secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos por numerosos medios, tales como mediante mutagénesis aleatoria y síntesis aleatoria de polinucleótidos. Se puede usar estas bibliotecas aleatorias de presentación de péptidos para cribar los péptidos que interactúan con una diana conocida que puede ser una proteína o polipéptido, tal como un ligando o receptor, una macromolécula biológica o sintética, o sustancias orgánicas o inorgánicas. Se conocen en la técnica las técnicas para crear y cribar dichas bibliotecas aleatorias de presentación de péptidos (Ladner y col., Patente de los Estados Unidos Nº. 5.223.409, Ladner y col., Patente de los Estados Unidos Nº 4.946.778, Ladnerc y col., Patente de los Estados unidos Nº 5.403.484, Ladner y col., Patente de los Estados Unidos Nº 5.571.698, y Kay y col., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996)) yestán comercialmente disponibles bibliotecas aleatorias de presentación de fagos y los kits para cribar dichas bibliotecas, por ejemplo de CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA), y Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ). Se pueden cribar las bibliotecas aleatorias de presentación de fagos usando las secuencias de IL-22RA dadas a conocer en el presente documento para identificar las proteínas que se unen a IL-22RA. [0198] Otra forma de fragmento de anticuerpo es un péptido que codifica una única región determinante de la complementariedad (CDR). Se pueden obtener péptidos de CDR (“unidades de reconocimiento mínimo” construyendo genes que codifican la CDR de un anticuerpo de interés. Se preparan dichos genes, por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable a partir de ARN de las células productoras de anticuerpos (véanse, por ejemplo, Larrick y col., Methods: A Companion to Methods in Ezymology 2: 106 (1991), Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter y col. (eds.), página 166 (Cambridge University Press 1995), y Ward y col., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch y col., (eds.), página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)). [0199] Como alternativa, se puede derivar un anticuerpo dirigido contra IL-22RA de un anticuerpo monoclonal “humanizado”. Los anticuerpos monoclonales humanizados se producen transfiriendo regiones determinantes de la complementariedad de ratón de las cadenas variables pesada y ligera de la inmunoglobulina de ratón en una región variable humana, Los restos típicos de anticuerpos humanos se sustituyen a continuación en las regiones marco de las contrapartes de murino. El uso de componentes de anticuerpos derivados de anticuerpos monoclonales humanizados obvia los problemas potenciales asociados con la inmunogenicidad de las regiones constantes de murino. Se describen técnicas generales para clonar las regiones variables de la inmunoglobulina de murino, por ejemplo, en Orlandi y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86: 3833 (1989). Se describen las técnicas para producir anticuerpos monoclonales humanizados, por ejemplo en Jones y col., Nature 321: 522 (1986), Carter y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992), Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437 (1992), Singer y col., J. Immun. 150: 2844 (1993), Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995), Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies," en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland y col. (eds.), páginas 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996), y en Queen y col., Patente de los Estados Unidos Nº 5.693.762 (1997).

[0200] Además, se pueden PEGilar los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos dirigidos contra IL-22RA de la presente invención usando los procedimientos en la técnica y descritos en el presente documento. [0201] Se pueden preparar anticuerpos policlonales contra idiotipo inmunizando animales con anticuerpos o fragmentos de anticuerpos dirigidos contra IL-22RA, usando las técnicas normalizadas. Véase, por ejemplo, Green y col., "Production of Polyclonal Antisera," en Methods In Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (ed.), páginas 1-12 (Humana Press 1992). Véase también Coligan en las páginas 2.4.1-2.4.7. Como alternativa, se pueden preparar anticuerpos monoclonales contra idiotipo usando anticuerpos o fragmentos de anticuerpos dirigidos contra IL22RA como inmunógenos, con las técnicas descritas anteriormente. Como otra alternativa, se pueden preparar anticuerpos humanizados antiidiotípicos o anticuerpos de primate subhumano antiidiotípicos usando las técnicas anteriormente descritas. Se describen procedimientos para producir anticuerpos antiidiotípicos, por ejemplo, en Irie, Patente de los Estados Unidos Nº 5.208.146, Greene, y col., Patente de los Estados Unidos nº 5.637.677, y Varthakavi y Minocha, J. Gen. Virol. 77: 1875 (1996). [0202] Se puede conjugar un anticuerpo dirigido contra IL-22RA con una marca detectable para formar un inmunoconjugado dirigido contra IL-22RA. Las marcas detectables incluyen, por ejemplo, un radioisótopo, una marca fluorescente, una marca quimioluminiscente, una marca de enzima, una marca bioluminiscente u oro coloidal. Las personas normalmente expertas en la técnica conocen bien los procedimientos para preparar y detectar dichos inmunoconjugados marcados detectablemente, y se describen con más detalle a continuación. [0203] La marca detectable puede ser un radioisótopo que se detecta mediante autorradiografía, Los isótopos que son particularmente útiles para el objetivo de la presente invención son 3H, 125I, 131I, 35S y 14C. [0204] Se pueden marcar también inmunoconjugados dirigidos contra IL-22RA con un compuesto fluorescente. La presencia de un anticuerpo marcado fluorescentemente se determina exponiendo el inmunoconjugado a la luz de la longitud de onda apropiada y detectando la fluorescencia resultante. Los compuestos con marca fluorescente incluyen isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina. [0205] Como alternativa, se pueden marcar detectablemente los inmunoconjugados dirigidos contra IL-22RA acoplando un componente de anticuerpo a un compuesto quimioluminiscente. La presencia de un inmunoconjugado etiquetado quimioluminiscentemente se determina detectando la presencia de luminiscencia que surge durante el curso de una reacción química. Los ejemplos de compuestos marcados quimioluminiscentemente incluyen luminol, isoluminol, un éster aromático de acridinio, una sal de acridinio y un éster de oxalato. [0206] Similarmente, se puede usar un compuesto bioluminiscente para marcar los inmunoconjugados dirigidos contra IL-22RA de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia que se encuentra en sistemas biológicos en los que una proteína catalítica aumenta la eficacia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes que son útiles para el marcado, incluyen luciferina, luciferasa y aecuorina. [0207] Como alternativa, se pueden marcar detectablemente los inmunoconjugados dirigidos contra IL-22RA uniendo un componente de anticuerpo dirigido contra IL-22RA a una enzima. Cuando se incuba el conjugado de la enzima dirigida contra IL-22RA en presencia del sustrato apropiado, el resto de enzima reacciona con el sustrato para producir un resto químico que se puede detectar, por ejemplo, mediante medios espectrofotométricos, fluorométricos o visuales. Los ejemplos de enzimas que se pueden usar para marcar detectablemente inmunoconjugados poliespecíficos incluyen β galactosidasa, glucosa oxidasa, peroxidasa y la fosfatasa alcalina. [0208] Las personas expertas en la técnica conocerán otras marcas adecuadas que se pueden emplear según la presente invención. La unión de los restos marcadores a anticuerpos dirigidos contra IL-22RA se puede llevar a cabo usando técnicas normalizadas conocidas en la técnica Se describe la metodología típica a este respecto en Kennedy y col., Clin. Chim. Acta 70: 1 (1976), Schurs y col., Clin. Chim. Acta 81: 1 (1977), Shih y col., Int’l J. Cancer 46: 1101 (1990), Stein y col., Cancer Res. 50: 1330 (1990), y Coligan, más arriba. [0209] Además, se puede potenciar la conveniencia y la versatilidad de la detección inmunoquímica usando anticuerpos dirigidos contra IL-22RA que se han conjugado con avidina, estreptavidina, y biotina (véase, por ejemplo, Wilchek y col. (eds.), "Avidin-Biotin Technology," Methods In Enzymology, Vol. 184 (Academic Press 1990), y Bayer y col., "Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology," en Methods In Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), páginas 149162 (The Humana Press, Inc. 1992). [0210] Los Procedimientos para llevar a cabo inmunoensayos están bien establecidos. Véanse, por ejemplo, Cook y Self, "Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays," en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter y Ladyman (eds.), páginas 180-208, (Cambridge University Press, 1995), Perry, "The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology," en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch y Lennox (eds.), páginas 107-120 (Wiley-Liss, Inc. 1995), y Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996). [0211] La presente memoria descriptiva describe kits para llevar a cabo un ensayo diagnóstico inmunológico de la expresión del gen IL-22RA. Dichos kits comprenden al menos un contenedor que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo dirigido contra IL-22RA. Un kit puede comprender también un segundo contendor que comprende uno o más reactivos capaces de indicar la presencia de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos dirigidos contra IL-22RA, los ejemplos de dichos reactivos indicadores incluyen marcas detectables tales como una marca radioactiva, una marca fluorescente, una marca quimioluminiscente, una marca de enzima, un marca bioluminiscente, oro coloidal, y similar. Un kit puede comprender también medios para transportar al usuario los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos dirigidos contra IL-22RA que se usan para detectar la proteína IL-22RA. Por ejemplo, instrucciones escritas pueden definir que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo encerrado se puede usar para detectar IL-22RA. Se puede aplicar el material escrito directamente a un contenedor, o se puede proporcionar el material escrito en forma de una inserción en el envase.

9. USO DE ANTICUERPOS DIRIGIDOS CONTRA IL-22RA PARA ANTAGONIZAR LA UNIÓN DE IL-22RA CON IL-22 O IL-20 e IL-22

[0212] Las técnicas alternativas para generar o seleccionar anticuerpos útiles en el presente documento incluye la exposición in vitro de linfocitos a polipéptidos del receptor soluble de IL-22RA y sus fragmentos, tales como epítopos antigénicos, y la selección de librerías de presentación de anticuerpos en fagos o vectores similares (por ejemplo, mediante el uso de polipéptidos del receptor soluble de IL-22 inmovilizado o marcado y sus fragmentos, tales como epítopos antigénicos). Se pueden obtener genes que codifican polipéptidos que tienen potenciales regiones de unión tales como polipéptidos del receptor soluble de IL-22RA o sus fragmentos, tales como epítopos antigénicos cribando bibliotecas de péptidos aleatorios presentados en fagos (presentación de fagos) o en bacterias, tales como E. coli. Se pueden obtener las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos de numerosas maneras, tales como mediante mutagénesis aleatoria y síntesis aleatoria de polinucleótidos. Se pueden usar estas bibliotecas aleatorias de presentación de péptidos para cribar los péptidos que interactúan con una diana conocida que puede ser una proteína o polipéptido, tal como un ligando o receptor, una macromolécula biológica o sintética, o sustancias orgánicas o inorgánicas. Se conocen en la técnica las técnicas para crear y cribar dichas bibliotecas aleatorias de presentación de péptidos (Ladner y col., Patente de los Estados Unidos Nº 5.223.409; Ladner y col., Patente de los Estados Unidos Nº 4.946.778; Ladner y col., Patente de los Estados Unidos Nº 5.403.484 y Ladner y col., Patente de los Estados Unidos Nº 5.571.698) y están comercialmente disponibles bibliotecas aleatorias de presentación de péptidos y los kits para cribar dichas bibliotecas, por ejemplo, de Clontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) y Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ). Se pueden cribar las bibliotecas aleatorias de presentación de péptidos usando polipéptidos del receptor soluble de IL-22RA o sus fragmentos, tales como las secuencias polipeptídicas de epítopos antigénicos dadas a conocer en el presente documento para identificar las proteínas que se unen a los polipéptidos del receptor que comprende IL-22RA. Estos “polipéptidos de unión”, que interactúan con polipéptidos del receptor soluble que comprende IL-22RA, se pueden usar para etiquetar células; para aislar polipéptidos homólogos mediante purificación por afinidad; se pueden conjugar directa o indirectamente a fármacos, toxinas, radionucleidos y similares. Se pueden usar también estos polipéptidos de unión en procedimientos analíticos tales como para bibliotecas de expresión de cribado y actividad neutralizante, por ejemplo, para unir, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la interacción entre el ligando y el receptor de Il-22, o la unión vírica a un receptor. Se pueden usar también los polipéptidos de unión para ensayos diagnósticos para determinar los niveles en circulación de los polipéptidos del receptor soluble que comprende IL-22RA, para detectar o cuantificar los receptores que comprenden IL22RA soluble o no soluble, como marcadores de patologías o enfermedades subyacentes. Estos polipéptidos de unión pueden actuar también como “antagonistas” para bloquear o inhibir los receptores monoméricos solubles de IL-22RA unido a membrana u homodimérico o la unión de los polipéptidos homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos de Il-22RA (por ejemplo, a un ligando) y la transducción de la señal in vitro e in vivo. De nuevo, estos polipéptidos de unión sirven como receptores monoméricos dirigidos contra IL-22RA o los polipéptidos homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos dirigidos contra IL-22RA y son útiles para inhibir la actividad de Il-22 o de IL-20 e IL-22, así como la actividad del receptor

o la unión a la proteína. Los anticuerpos aumentados con los complejos de receptores naturales de la presente invención, y los anticuerpos de unión a epítopos de IL-22RA, y los anticuerpos monoclonales neutralizantes dirigidos contra IL-22RA pueden ser realizaciones preferidas ya que pueden actuar más específicamente contra IL-22RA y pueden inhibir IL-22 o IL-20 e IL-22. Además, se puede evaluar la actividad antagonista y de unión de los anticuerpos de la presente invención en una proliferación de Il-20 o IL-22, trampa de señal, ensayos de la luciferasa o de unión en presencia de IL-20 o IL-22 respectivamente, y los receptores solubles que comprenden IL-22RA, y otros ensayos biológicos o bioquímicos descritos en el presente documento. [0213] Se pueden usar anticuerpos de polipéptidos del receptor soluble de IL22RA (por ejemplo, anticuerpos de la SEC. DE ID Nº 3) o sus fragmentos, tales como epítopos antigénicos para inhibir los efectos inflamatorios de IL-20, IL-22, o IL-20 e IL-22 in vivo, para uso terapéutico contra la psoriasis, dermatitis atópica, dolencias inflamatorias de la piel, endotoxemia, artritis, asma, IBD, colitis, artritis psoriática, artritis reumatoide u otras dolencias inflamatorias inducidas por IL-20 e IL-22; etiquetando las células que expresan los receptores de IL-22RA; para aislar los polipéptidos del receptor soluble que comprenden IL-22RA mediante purificación por afinidad; para ensayos diagnósticos para determinar los niveles en circulación de los polipéptidos del receptor soluble que comprende IL-22RA; para detectar o cuantificar los receptores solubles que comprenden IL-22RA como marcadores de patologías o enfermedades subyacentes; en procedimientos analíticos que emplean FACS; para cribar bibliotecas de expresión; para generar anticuerpos antiidiotípicos que pueden actuar como agonistas de IL-22 o IL-20; y como anticuerpos neutralizantes o como agonistas para unir, bloquear, inhibir, reducir, o antagonizar la función del receptor IL22RA, o para unir, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la actividad de Il-22 y/o IL-20 (tanto individual como conjuntamente) in vitro e in vivo. Las etiquetas

o marcas directas adecuadas incluyen radionucleidos, enzimas, sustratos, cofactores, biotina, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares; las etiquetas o marcas indirectas pueden usar como característica biotina-avidina u otras parejas de complemento/anticomplemento como intermedios. Se pueden conjugar directa o indirectamente los anticuerpos en el presente documento con fármacos, toxinas, radionúclido y similares, y usarse estos conjugados para el diagnóstico in vivo o aplicaciones terapéuticas. Además, se pueden usar los anticuerpos de los polipéptidos solubles que comprenden IL-22RA, o sus

fragmentos in vitro para detectar polipéptidos del receptor soluble que comprende IL22RA desnaturalizado o no desnaturalizado o sus fragmentos en ensayos, por ejemplo, Transferencia Western, u otros ensayos conocidos en la técnica. [0214] Los anticuerpos del receptor soluble de IL-22RA o los polipéptidos del receptor soluble homodimérico, heterodimérico o multimérico de IL-22RA son útiles para etiquetar células que expresan los receptores correspondientes y evaluar sus niveles de expresión, para la purificación por afinidad, dentro de los ensayos diagnósticos para determinar los niveles en circulación de los polipéptidos receptores, los procedimientos que emplean el acortamiento celular activado por fluorescencia. Además, se pueden usar anticuerpos divalentes, y anticuerpos antiidiotípicos como agonistas para imitar el efecto del ligando IL-22RA, IL-22 o IL-20. [0215] Se pueden conjugar también directa o indirectamente los anticuerpos en el presente documento con fármacos, toxinas, radionucleidos y similares, y usarse estos conjugados para el diagnóstico in vivo o aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos o polipéptidos de unión que reconocen el receptor soluble de IL-22RA o los polipéptidos del receptor soluble homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos de IL-22RA para identificar o tratar tejido u órganos que expresan una molécula anticomplementaria correspondiente (es decir, un receptor soluble que comprende IL-22RA o unido a membrana). Más específicamente, los anticuerpos del receptor soluble que comprende IL-22RA, o sus fragmentos o porciones bioactivas , se pueden acoplar a moléculas detectables o citotóxicas y administrarse a un mamífero que tiene, células, tejidos u órganos que expresa el receptor que comprende IL-22RA tal como los cánceres que expresan IL-22RA. [0216] Las moléculas detectables adecuadas se pueden unir directa o indirectamente a polipéptidos que se unen a los polipéptidos del receptor que comprende IL-22RA, tal como los “polipéptidos de unión” (que incluyen los péptidos de unión dados a conocer anteriormente), los anticuerpos, o sus fragmentos o porciones bioactivas. Las moléculas detectables adecuadas incluyen radionucleidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Se pueden unir directa o indirectamente las moléculas citotóxicas adecuadas al polipéptido o anticuerpo, e incluyen toxinas bacterianas o de plantas (por ejemplo, la toxina de la difteria, la exotoxina de Pseudomonas, la ricina, la abrina y similares), así como a radionucleidos terapéuticos, tales como yodo-131, renio-188 o itrio-90 (unidas tanto directamente al polipéptido o anticuerpo, como unidas indirectamente por medio de un resto quelante, por ejemplo). Se pueden conjugar también los polipéptidos o anticuerpos de unión a fármacos citotóxicos, tales como adriamicina. Para la unión indirecta de una molécula detectable o citotóxica, se puede conjugar la molécula detectable o citotóxica con un miembro de una pareja complementaria/anticomplementaria, en el que el otro miembro se une al polipéptido de unión o a la porción de anticuerpo. Para estos objetivos, biotina/estreptavidina es una pareja complementaria/anticomplementaria a modo de ejemplo. [0217] En otra realización, las proteínas de condensación del polipéptido-toxina de unión se pueden usar para dirigir la inhibición o la ablación de células o tejidos (por ejemplo, para tratar células o tejidos cancerosos). Como alternativa, si el polipéptido de unión tiene múltiples regiones funcionales (es decir, una región de activación o una región de unión al ligando, más una región directora), puede ser adecuada una proteína de condensación que incluya únicamente la región directora para dirigir una molécula detectable, una molécula citotóxica o una molécula complementaria a un tipo de célula

o tejido de interés. En los ejemplos en los que la proteína de condensación incluye únicamente una única región, incluye una molécula complementaria. Dichas proteínas de condensación de la molécula complementaria de la región representan de esta manera un vehículo director genérico para la administración específica a células/tejidos de los conjugados genéricos de la molécula anticomplementaria detectable/citotóxica. [0218] En otra realización se pueden usar las proteínas de condensación del polipéptido-citocina o del anticuerpo-citocina de unión a IL-22RA para potenciar la muerte in vivo de los tejidos diana (por ejemplo, cánceres de bazo, pancreático, sangre, linfoide, colon, y médula ósea), si el polipéptido-citocina de unión y el anticuerpo del receptor dirigido contra IL-22RA se dirigen a la célula hiperproliferativa (véase, generalmente, Homick y col., Blood 89: 4437-47, 1997). Las proteínas de condensación descritas permiten dirigir una citocina a un lugar de acción deseado, proporcionando por tanto una concentración local elevada de citocina. Los anticuerpos monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos dirigidos contra IL22RA adecuados se dirigen a una célula o tejido indeseable (es decir, un tumor o una leucemia) y la citocina condensada media la lisis mejorada de la célula diana mediante las células efectoras. Las citocinas adecuadas para este objetivo incluyen interleucina 2 y factor de estimulación de las colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), por ejemplo. [0219] Como alternativa, se pueden usar los polipéptidos de unión al receptor IL22RA o las proteínas de condensación del anticuerpo para potenciar in vivo la muerte de los tejidos diana estimulando directamente la ruta apoptótica modulada por el receptor IL-22RA, dando como resultado la muerte celular de las células hiperproliferativas que expresan los receptores que comprenden IL-22RA.

10. USOS TERAPÉUTICOS DE LOS POLIPÉPTIDOS QUE TIENE ACTIVIDAD DE IL-22RA o ANTICUERPO DE IL-22RA

[0220] Se pueden usar las secuencias de aminoácidos que tienen actividad soluble de IL-22RA para modular el sistema inmune uniendo los ligandos IL-20 e IL-22 de IL22RA (tanto única como conjuntamente), y evitando de esta manera, la unión del ligando IL-22RA con el receptor endógeno de IL-22RA. Los antagonistas de IL-22RA, tales como los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA, se pueden usar también para modular el sistema inmune inhibiendo la unión del ligando IL-22RA con el receptor endógeno de IL-22RA. Según esto, la presente memoria descriptiva describe el uso de proteínas, polipéptidos, y péptidos que tienen actividad de IL-22RA (tales como los polipéptidos solubles de IL-22RA, los fragmentos de los polipéptidos de IL-22RA, los análogos de IL-22RA (por ejemplo, los anticuerpo antiidiotípicos dirigidos contra IL22RA y las proteínas de condensación de IL-22RA), a un sujeto que carece de una cantidad adecuada de este polipéptido, o que produce un exceso de ligando IL-22RA. Se pueden usar también los antagonistas de IL-22RA (por ejemplo, los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA) para tratar a un sujeto que produce un exceso tanto de ligando IL-22RA como de IL-22RA. Los sujetos adecuados incluyen mamíferos, tales como seres humanos. Por ejemplo, dichos polipéptidos de IL-22RA y anticuerpos dirigidos contra IL-22RA son útiles para unir, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar IL-20 e IL-22 (tanto única como conjuntamente), en el tratamiento de la psoriasis, dermatitis atópica, dolencias inflamatorias de la piel, artritis psoriática, endotoxemia, asma, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), colitis y otras dolencias inflamatorias dadas a conocer en el presente documento. [0221] Además, los inventores han demostrado que el receptor IL-22RA se une se une a un ligando denominado Factor inducible de las células T (IL-22) (SEC. DE ID Nº 6; Dumoutier, L. y col., Proc. Nat’l. Acad. Sci. 97: 10144-10149, 2000; se Muestra la secuencia de IL-22 de ratón en Dumontier y col., J. Immunol. 164: 1814-1819. 2000). Además, el zcytor11 (IL-22RA) (Patente de los Estados Unidos Nº 5.965.704) de propiedad compartida y el receptor de CRF2-4 se unen también a IL-22 como un heterodímero (Véanse, publicación WIPO WO 00/24758; Dumontier y col., J. Immunol. 164: 1814-1819, 2000; Spencer, SD y col., J. Exp. Med. 187: 571-578, 1998; Gibbs, VC y Pennica Gene 186: 97-101, 1997 (CRF2-4 cDNA); Xie, MH y col.,

J. Biol. Chem. 275: 31335-31339, 2000; y Kotenko, SV y col., J. Biol. Chem. 276: 2725-2732, 2001). Además el receptor de IL-10β puede estar implicado como receptor de IL-22 y se cree que es sinónimo de CRF2-4 (Dumoutier, L. y col., Proc. Nat’l. Acad. Sci. 97: 10144-10149, 2000; Liu Y y col, J Immunol. 152; 1821-1829,1994 (IL10R cDNA). Además, los inventores han demostrado que el receptor IL-22RA se une a un ligando denominado IL-20 SEC. DE ID Nº 8; Publicación WIPO Nº WO 99/27103). Dentro de las realizaciones preferidas, la forma soluble del receptor IL22RA, (SEC. DE ID Nº 3) es un monómero, homodímero, heterodímero, o multímero que se une a, bloquea, inhibe, reduce, antagoniza o neutraliza IL-22 e IL-20 in vivo. Los anticuerpos y los polipéptidos de unión de dichos monómeros, homodímeros, heterodímeros, o multímeros de IL-22RA, sirven también como antagonistas de la actividad de IL-22RA, y como antagonistas de IL-20 e IL-22 (única o conjuntamente), según se describe en el presente documento. [0222] Adicionalmente, los inventores han descrito en el presente documento, y han demostrado que ambos anticuerpos policlonales y monoclonales neutralizantes dirigidos contra IL-22 se unen a, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan o neutralizan la actividad de IL-22 e IL-20 en ensayos de neutralización basados en células. [0223] Se ha demostrado que se induce IL-22 en presencia de IL-9, y se sospecha que está implicado en la promoción de respuestas inmunes de tipo Th1, y en la inflamación. IL-9 estimula la proliferación, activación, diferenciación y/o inducción de la función inmune en una variedad de manera y está implicado en el asma, la mastocitosis de pulmón, y otras enfermedades, así como en las rutas activadas de STAT. Los antagonistas de IL-22 o IL-9 pueden tener uso beneficioso contra dichas enfermedades humanas. La presente memoria descriptiva describe dichos novedosos antagonistas de IL-22. [0224] Se ha demostrado que IL-22 está implicado en la regulación en exceso de la producción de reactivos en fase aguda, tales como el amiloide A del suero (SAA), la αl-antiquimotripsina, y la haptoglobina, y que la expresión de IL-22 aumenta tras la inyección de lipopolisacárido (LPS) in vivo, sugiriendo que IL-22 está implicado en la respuesta inflamatoria (Dumoutier, L. y col., Proc. Nat’l. Acad. Sci. 97: 10144-10149, 2000). Se considera la producción de proteínas en fase aguda, tales como SAA, como un mecanismo de supervivencia a corto plazo en el que la inflamación es beneficiosa; sin embargo, el mantenimiento de las proteínas en fase aguda durante periodos más largos contribuye a la inflamación crónica y puede ser perjudicial para la salud humana. Para una revisión, véanse Uhlar, CM y Whitehead, AS, Eur. J. Biochem. 265: 501-523, 1999, y Baumann H. y Gauldie, J. Immunology Today 15: 74-80, 1994. Además, la proteína SAA en fase aguda está implicada en laa patogénesis de diversas enfermedades inflamatorias crónicas, está implicada en la ateroesclerosis y en la artritis reumatoide, y es la precursora de la proteína A amiloide depositada en la amiloidosis (Uhlar, CM y Whitehead, más arriba.). De esta manera, ya que IL-22 actúa como molécula proinflamatoria e induce la producción de SAA, los antagonistas podrían ser útiles en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria y otras enfermedades asociadas con la respuesta de las proteínas en fase aguda inducida por IL-22. Se describen dichos antagonistas en el presente documento. Por ejemplo, el procedimiento de reducir la inflamación inducida por IL-22 o inducida por IL-9 comprende la administración a un mamífero con inflamación de una cantidad de una composición de receptor soluble que comprende IL-22RA suficiente para reducir la inflamación. Además, un procedimiento para suprimir una respuesta inflamatoria en un mamífero con inflamación puede comprender: (1) determinar un nivel de proteína A amiloide en suero; (2) administrar un composición que comprende un polipéptido del receptor de la citocina soluble de IL-22RA según se describe en el presente documento en un vehículo farmacéuticamente aceptable; (3) determinar un nivel de posterior administración de proteína A amiloide en suero; (4) el nivel de proteína A amiloide en suero en la etapa (19 con el nivel de proteína A amiloide en suero en la etapa (3), en el que una carencia de aumento o una disminución en el nivel de proteína A amiloide en suero es indicativa de la supresión de una respuesta inflamatoria. La evidencia experimental descrita en el presente documento demuestra que los antagonistas de Il22, tales como los receptores y anticuerpos solubles, reducen, de hecho, los niveles de SAA en los modelos in vivo de enfermedades inflamatorias, mostrando que la unión, bloqueo, inhibición, reducción, antagonización o neutralización de IL-22 tiene efectos antiinflamatorios. [0225] La evidencia indica que IL-20 y sus receptores tienen un papel que está implicado en la psoriasis. La enfermedad multigénica de la piel se caracteriza por un aumento en la proliferación de queratinocitos, diferenciación alterada de los queratinocitos, e infiltración de células inmunes en la piel. La primera línea de evidencia de un papel de IL-20 en la psoriasis es que la hiperqueratosis y el engrosamiento de la epidermis observados en el ratón transgénico se asemeja a las anormalidades psoriáticas humanas. Se piensa que la disminución del número de tonofilamentos que está relacionada con queratinización defectiva, es una característica llamativa de la psoriasis humana; se ha encontrado que las inclusiones intramitocondriales inducidas química y naturalmente produjeron dolencias hiperplásicas de la piel en ratones. La causa de las inclusiones y sus efectos sobre la función mitocondrial, si acaso, son desconocidas. Los ratones IL-20 transgénicos presentan muchas de las características observadas en la psoriasis humana. [0226] Además, el ARNm del receptor de IL-20 (el ARNm de IL-20RA e IL20RB) está marcadamente regulado en exceso en la piel psoriática humana en comparación con la piel normal sugiriendo adicionalmente un papel de IL-20 en la psoriasis. Ambas subunidades del receptor de IL-20 se expresan en queratinocitos a través de la epidermis y se expresan también en un subconjunto de células inmunes y endoteliales. Los inventores proponen que el aumento en la expresión de un receptor activado de Il-20 puede alterar las interacciones entre células endoteliales, células inmunes y queratinocitos, conduciendo a la desregulación de la proliferación y diferenciación de los queratinocitos. Adicionalmente, los datos de ratones con genes inactivados descritos en el presente documento, en los que se inactiva el receptor IL22RA, muestran que fue necesario IL-22RA para los efectos inflamatorios inducidos por IL-20 en la piel de animales transgénicos. Estos resultados proporcionan la evidencia de la eficaz actividad bloqueante de IL-22RA, por ejemplo, mediante la inactivación de un gen de IL-22RA, o similarmente, mediante un anticuerpo monoclonal neutralizante de IL-22RA de la presente invención, que reduciría similarmente los efectos en la piel inducidos por IL-22, por ejemplo, en la psoriasis, IBD, colitis, u otras enfermedades inflamatorias inducidas por Il-20, y o IL-22, que incluyen la IBD, artritis, asma, artritis psoriática, colitis, dolencias inflamatorias de la piel, y dermatitis atópica. [0227] Además, IL-20 estimula la transducción de la señal en la línea celular HaCaT de queratinocitos humanos, apoyando una acción directa de este novedoso ligando en la piel. Adicionalmente, las proteínas IL-1β, EGF y TNF-α, conocidas por ser activas en los queratinocitos y estar implicadas con las señales proliferativas y proinflamatorias en la piel, potencian la respuesta de IL-20. En las células HaCaT y BHK, las células que expresan el receptor de IL-20, IL-20 señala a través de STAT3. [0228] Según se indica en la discusión anterior y en los ejemplos a continuación, IL-20 está implicado en la patología de la psoriasis. La presente invención proporciona un uso para tratar la psoriasis de los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA, según se define en las reivindicaciones. Los antagonistas evitarán de esta manera la activación del receptor de IL-20. Además, debido a que IL-20 e IL-22 comparten IL-22RA como un receptor común, antagonistas tales como IL-22RA soluble, o anticuerpos, se pueden usar anticuerpos monocatenarios o fragmentos de anticuerpos que se unen al receptor IL-22RA para unirse concurrentemente a, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la actividad de IL-22 o de IL-20 e IL-22. [0229] La psoriasis es una de las enfermedades dermatológicas más comunes, que afecta hasta un 1 a 2 por ciento de la población mundial. Es un trastorno inflamatorio crónico de la piel caracterizado por pápulas eritematosas, claramente demarcadas y placas redondeadas, cubiertas por costras micosas plateadas. Las lesiones de la piel de la psoriasis tienen prurito variable. La áreas traumatizadas desarrollan a menudo lesiones de psoriasis. Adicionalmente, otros factores externos pueden exacerbar la psoriasis incluyendo las infecciones, el estrés, y las medicaciones, por ejemplo, litio, beta bloqueantes y, antimaláricos. [0230] La variedad más común de la psoriasis se denomina tipo placa. Los pacientes con psoriasis tipo placa tendrán placas estables que crecen lentamente, que permanecen básicamente sin cambiar durante largos periodos de tiempo. La áreas más comunes para que se produzca la psoriasis de placa son los codos, la hendidura de los glúteos, y el cuero cabelludo. La afectación tiende a ser simétrica. De manera inversa, la psoriasis afecta a las regiones intertriginosas que incluyen, la axila, la ingle, la región submamaria y el ombligo, y tiende también a afectar, el cuero cabelludo, las palmas de la mano, y las plantas de los pies. Las lesiones individuales son placas claramente demarcadas pero pueden estar húmedas debido a su localización. La psoriasis tipo placa se desarrolla generalmente lentamente y avanza con un curso indolente. Raramente remite espontáneamente. [0231] La psoriasis eruptiva (psoriasis en gotas) es la más común en niños y jóvenes. Se desarrolla agudamente en individuos sin psoriasis o en aquellos con psoriasis en placas crónica. Los pacientes presentan muchas pápulas pequeñas escamosas eritematosas, frecuentemente tras infección del tracto respiratorio superior con estreptococos beta-hemolíticos. Los pacientes con psoriasis pueden desarrollar también lesiones pustulares. Se pueden localizar estas en las palmas de las manos y las plantas de los pies o pueden ser generalizadas y asociadas con fiebre, malestar, diarrea, y artralgias. [0232] Aproximadamente, la mitad de todos los pacientes con psoriasis tienen implicación en las uñas, apareciendo como depresiones puntiformes, engrosamiento de las uñas o hiperqueratosis subungual. Aproximadamente, del 5 al 10 por ciento de los pacientes con psoriasis tienen dolores en las articulaciones, y estos se desarrollan más a menudo en paciente con implicación en las uñas. Aunque algunos tienen la incidencia coincidente de artritis reumatoide clásica, pueden tener enfermedad en las articulaciones que está comprendida en uno de los cinco tipos asociados con la psoriasis: (1) enfermedad limitada a una única o a unas pocas articulaciones pequeñas (70 por ciento de los casos); (2) una enfermedad del tipo de la artritis reumatoide seronegativa; (3) implicación de las articulaciones interfalangeales distales; (4) artritis destructiva grave con el desarrollo de “artritis mutilante”; y (5) enfermedad limitada a la médula espinal. [0233] Se puede tratar la psoriasis administrando agentes que se unan a, bloqueen, inhiban, reduzcan, antagonicen o neutralicen a IL-22, IL-20 o IL-20 e IL-22. Los antagonistas preferidos son tanto un receptor soluble de IL-20 e IL-22, tal como IL22RA (SEC. DE ID Nº 3) como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o anticuerpos monocatenarios que se unen al receptor IL-22RA, tales como los anticuerpos neutralizantes de la presente invención. Se pueden administrar dichos antagonistas solos o en combinación con otras terapias establecidas tales como lubricantes, queratolíticos, corticoesteroides tópicos, derivados tópicos de la vitamina D, antralina, antimetabolitos sistémicos tales como metotrexato, terapia de luz ultravioleta con psoraleno (PUVA), etretinato, isotretinoína, ciclosporina, y calcipotriol tópico derivado de la vitamina D3. Además, se pueden administrar dichos antagonistas a individuos por vía subcutánea, intravenosa, o transdérmica usando una crema o parche transdérmico que contenga el antagonista. Si se administra subcutáneamente, se puede inyectar el antagonista en una o más placas psoriáticas. Si se administra transdérmicamente, se pueden administrar los antagonistas directamente en las placas usando una crema, pomada, salvia o disolución que contenga el antagonista. [0234] Se pueden administrar los antagonistas de IL-20 o IL-22 a una persona que tiene asma, bronquitis o fibrosis cística u otra enfermedad inflamatoria del pulmón para tratar la enfermedad. Se pueden administrar los antagonistas mediante cualquier procedimiento adecuado, que incluye el intravenoso, subcutáneo, el lavado bronquial, y el uso de un inhalante que contenga el antagonista. [0235] El análisis de la distribución en tejido del ARNm correspondiente al ADNc de IL-22RA mostró que el nivel del ARNm fue más elevado en placenta y en bazo, y el ligando al cual se une IL-22RA (IL-22) está implicado en la inducción de la respuesta inflamatoria que incluye la inducción de la respuesta en la fase aguda (Dumoutier, L. y col., Proc. Nat’l. Acad. Sci. 97: 10144-10149, 2000). De esta manera, las realizaciones particulares de la presente invención se dirigen al uso de IL-22Ra y anticuerpos dirigidos contra IL-22RA solubles como antagonistas en enfermedades o dolencias inflamatorias e inmunes tales como psoriasis, artritis psoriática, dermatitis atópica, dolencias inflamatorias de la piel, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), Enfermedad de Chron, diverticulosis, asma, pancreatitis, diabetes tipo I (IDDM), cáncer pancreático, pancreatitis, Enfermedad de Graves, cáncer de colon e intestinal; enfermedad autoinmune, sepsia, trasplante de órganos o de médula ósea; inflamación debida a endotoxemia, trauma, cirugía o infección; amiloidosis; esplenomegalia; enfermedad de injerto frente a hospedador; y en el que existe inhibición de la inflamación, supresión inmune, reducción de la proliferación de las células hematopoyéticas, inmunes, inflamatorias o linfoides, macrófagos, células T (que incluyen células Th1 y Th2), supresión de la respuesta inmune a un patógeno o antígeno, u otros ejemplo en los que se desea la inhibición de las citocinas de IL-22 o IL-20. [0236] Además, los anticuerpos o polipéptidos de unión que se unen a los polipéptidos de IL-22RA descritos en el presente documento, y los propios polipéptidos de IL-22RA son útiles para:

1) Bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la vía de señalización de los receptores de IL-20 o IL-22 en el tratamiento de la inflamación aguda, inflamación como resultado de trauma, lesión del tejido, cirugía, sepsia o infección, y de enfermedades inflamatorias crónicas tales como asma, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), colitis crónica, esplenomegalia, artritis reumatoide, episodios inflamatorios agudos recurrentes (por ejemplo, tuberculosis), y tratamiento de amiloidosis, y aterosclerosis, enfermedad de Castleman, asma, y otras enfermedades asociadas con la inducción de la respuesta en la fase aguda.

2) Bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la vía de señalización de los receptores de IL-20 o IL-22 en el tratamiento de las enfermedades autoinmunes tales como IDDM, esclerosis múltiple (MS), lupus sistémico eritematoso (SLE), miastenia grave, artritis reumatoide, e IBD para evitar o inhibir la señalización en células inmunes (por ejemplo, linfocitos, monocitos, leucocitos) vía IL-22RA (Hughes C y col., J. Immunol 153: 3319-3325, 1994). Como alternativa, los anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales (MAb) de los receptores que comprenden IL-22RA, se pueden usar como un antagonista para agotar completamente las células inmunes no deseadas para tratar la enfermedad autoinmune. Se pueden tratar el asma, la alergia y otras enfermedades atópicas con un MAb contra, por ejemplo los receptores solubles de IL-22RA soluble para inhibir la respuesta inmune o para agotar completamente las células ofensoras. Bloquear, inhibir, reducir, o antagonizar la vía de señalización de IL22RA, usando los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención, puede beneficiar también las enfermedades del páncreas, riñón, pituitaria y células neuronales. Pude beneficiar IDDM, NIDDM, la pancreatitis y el carcinoma pancreático. IL-22RA puede servir como diana para la terapia de MAb del cáncer en la que el MAb antagonizante inhibe el crecimiento del cáncer y dirige la muerte mediada por el sistema inmune. (Holliger P, y Hoogenboom, H: Nature Biotech. 16: 1015-1016, 1998).Los MAb de IL-22RA soluble pueden ser también útiles para tratar las nefropatías tales como la glomeruloesclerosis, neuropatía membranosa, amiloidosis (que afecta también al riñón entre otros tejidos), la arterioesclerosis renal, glomerulonefritis de diversos orígenes, enfermedades fibroproliferativas del riñón, así como la disfunción renal asociada con SLE, IDDM, diabetes tipo II (NIDDM), tumores renales y otras enfermedades.

3) Agonizar, potenciar, aumentar o iniciar la vía de señalización de los receptores de IL-20 o IL-22 en el tratamiento de las enfermedades autoinmunes tales como IDDM, MS, SLE, miastenia grave, artritis reumatoide, e IBD. Los anticuerpos monoclonales y neutralizantes dirigidos contra IL-22RA pueden señalar linfocitos u otras células inmunes para diferenciar, alterar la proliferación, o cambiar la producción de citocinas o proteínas superficiales celulares que mejoran la autoinmunidad. Específicamente, la modulación de la respuesta de una célula T auxiliar a un modelo alternativo de secreción de citocina puede desviar una respuesta autoinmune para mejorar la enfermedad (Smith JA y col.,

J. Immunol. 160: 4841-4849, 1998). Similarmente, se pueden usar anticuerpos monoclonales heterodiméricos y multiméricos dirigidos contra IL-22RA soluble, dirigidos contra IL-22RA/CRF2-4 soluble, para señalar, agotar completamente y desviar las células inmunes implicadas en el asma, la alergia y la enfermedad atópica: La vía de señalización de IL-22RA, puede beneficiar también a las enfermedades del páncreas, riñón, pituitaria y células neuronales. Puede beneficiar a IDDM, NIDDM, y al carcinoma pancreático. IL-22RA puede servir como diana para la terapia de MAb del cáncer pancreático en el que una señalización de MAb inhibe el crecimiento del cáncer y dirige la muerte mediada por el sistema inmune (Tutt, AL y col., J Immunol. 161: 3175-3185, 1998).

Similarmente, se puede tratar el carcinoma de células renales con anticuerpos

monoclonales de los receptores solubles que comprenden IL-22RA de la

presente invención. [0237] Se pueden usar los polipéptidos solubles de IL-22RA descritos en el presente documento para unir, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la actividad de IL-22 o Il-20, tanto única como conjuntamente, en el tratamiento de la enfermedad autoinmune, la enfermedad atópica, NIDDM, la pancreatitis y la disfunción renal según se ha descrito anteriormente. Se puede usar una forma soluble de IL-22RA para promover una respuesta de anticuerpo mediada por las células Th y/o para promover la producción de IL-4 u otras citocinas por los linfocitos u otras células inmunes. [0238] Los receptores que comprenden IL-22RA soluble descritos en el presente documento son útiles como antagonistas de la citocina de IL-20 o IL-22. Se pueden alcanzar dichos efectos antagonísticos mediante neutralización directa o unión de IL20 o IL-22. Adicionalmente a los usos antagonísticos, los receptores solubles descritos en el presente documento pueden unirse a IL-22 y actuar como proteínas vehículo de la citocina de IL-20 o Il-22, con el fin de transportar el Ligando a diferentes tejidos, órganos, y células en el interior del cuerpo. Como tales, los receptores solubles descritos en el presente documento se pueden fusionar o acoplar a moléculas, polipéptidos o restos químicos que dirigen el complejo del Ligando del receptor soluble a un lugar específico, tal como un tejido, célula inmune específica, o tumor. Por ejemplo, en la infección aguda o en algunos cánceres, el beneficio puede resultar de la inducción de la inflamación y de la respuesta en la fase aguda local de las proteínas por la acción de IL-22. De esta manera, se pueden usar los receptores solubles descritos en el presente documento para dirigir específicamente la acción de Il-20 o Il-22. Véanse, Cosman, D. Cytokine 5: 95-106, 1993; y Fernandez-Botran, R. Exp. Opin. Invest. Drugs 9: 497-513, 2000. [0239] Además, se pueden usar los receptores solubles descritos en el presente documento para estabilizar IL-22 o IL-20, para aumentar la biodisponibilidad, la longevidad terapéutica, y/o la eficacia del Ligando para estabilizar el Ligando de la degradación o el aclaramiento, o dirigiendo el ligando a un lugar de acción en el interior del cuerpo. Por ejemplo, el complejo IL-6/IL-6R soluble que se produce naturalmente estabiliza IL-6 y puede señalar a través del receptor gp130. Véase, Cosman, D. más arriba, y Fernandez-Botran, R. más arriba. Además, se puede combinar IL-22RA con un ligando análogo tal como IL-22 que comprende un complejo de ligando/receptor soluble. Se pueden usar dichos complejos para estimular respuestas de células que presentan una subunidad compañera del receptor tal como, por ejemplo, pDIRSI (IL-20RB) o CRF2-4 (IL-10RB). La especificidad celular de los complejos IL-22RA/ligando puede diferir de la observada para el ligando administrado únicamente. Además, los complejos pueden tener distintas propiedades farmacocinéticas tales como las que afectan a la semivida, dosis/respuesta y especificidad de órgano o tejido. Los complejos IL-22RA/IL-22 o IL-22RA/IL-20 pueden tener de esta manera actividad agonista para potenciar una respuesta inmune o estimular las células mesangiales o para estimular las células hepáticas. Como alternativa, únicamente los complejos que expresan una subunidad de señalización que heterodimeriza con el complejo pueden estar afectados de manera análoga a la respuesta de los complejos IL6/IL6R (Hirota H. y col., Proc. Nat’1. Acad. Sci. 92: 4862-4866, 1995; Hirano, T. en Thomason, A. (Ed.) "The Cytokine Handbook", 3ª Ed., p. 208-209). Los complejos receptor soluble/citocina de IL12 y CNTF muestran similares actividades. [0240] Además, la inflamación es una respuesta protectora de un organismo para rechazar un agente invasor. La inflamación es un episodio en cascada que implica muchos mediadores celulares y humorales. Por una parte, la supresión de las respuestas inflamatorias puede dejar a un hospedador inmunocomprometido; sin embargo, si se deja sin comprobar, la inflamación puede conducir a seria complicaciones que incluyen las enfermedades inflamatorias crónica (por ejemplo, psoriasis, artritis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino y similares, choque séptico e insuficiencia multiorgánica. Importantemente, estos diversos estados de enfermedad comparten mediadores inflamatorios comunes. Las enfermedades colectivas, que se caracterizan por inflamación tienen un gran impacto en la morbilidad y mortalidad humanas. Por tanto, resulta claro que las proteínas antiinflamatorias, tales como IL-22RA, y los anticuerpos dirigidos contra IL22RA, podrían tener un crucial potencial terapéutico para un gran número de enfermedades humanas y animales, desde el asma y la alergia a la autoinmunidad y el choque séptico.

1. ARTRITIS [0241] La artritis, que incluye la osteoartritis, artritis reumatoide, articulaciones artríticas como resultado de lesión, y similares, son dolencias inflamatorias comunes que se beneficiarían del uso terapéutico de las proteínas antiinflamatorias, tales como los polipéptidos de IL-22RA de la presente invención. Por ejemplo, la artritis reumatoide (RA) es una enfermedad sistémica que afecta al cuerpo completo y es una de las formas más comunes de la artritis. Se caracteriza por la inflamación de la membrana que recubre la articulación, lo que produce dolor, agarrotamiento, calor, enrojecimiento, e hinchazón. Las células inflamatorias liberan enzimas que pueden digerir el hueso y el cartílago. Como resultados de la artritis reumatoide, la membrana inflamada de la articulación, el sinovio, puede invadir y dañar el hueso y el cartílago conduciendo al deterioro de la articulación y a un severo dolor entre otros efectos fisiológicos. La articulación implicada puede perder su forma y alineación, dando como resultado dolor y pérdida de movimiento. [0242] La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad inmunomediada particularmente caracterizada por la inflamación y posterior daño del tejido que condice a una grave discapacidad y a un aumento de la mortalidad. Se producen localmente una variedad de citocinas en las articulaciones reumatoides. Numerosos estudios han demostrado que IL-1 y TNF-alfa, dos citocinas prototípicas proinflamatorias, juegan un importante papel en los mecanismos implicados en la inflamación sinovial y en la progresiva destrucción de la articulación. De hecho, la administración de inhibidores de TNF-alfa e IL-1 en pacientes con RA ha conducido a una drástica mejora de los signos clínicos y biológicos de la inflamación y a una reducción de los signos radiológicos de erosión ósea y destrucción del cartílago. Sin embargo, a pesar de estos resultados alentadores, un significativo porcentaje de pacientes no responden a estos agentes, sugiriendo que están implicados también otros mediadores en la patofisiología de la artritis (Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2): 135-149, 2002). Uno de los mediadores podría ser IL-20 o IL-22, y como tal una molécula que se una o inhiba la actividad de Il-22 o IL-20, tal como los polipéptidos de IL-22RA, o los anticuerpos o compañeros de unión dirigidos contra IL-22RA, serviría como terapéutica valiosa para reducir la inflamación en la artritis reumatoide, y otras enfermedades artríticas. [0243] Existen diversos modelos animales de la artritis reumatoide conocidos en la técnica. Por ejemplo, en el modelo de artritis inducida por colágeno (CIA), los ratones desarrollan artritis inflamatoria crónica que se asemeja estrechamente a la artritis reumatoide humana. Debido a que CIA comparte características inmunológicas y patológicas similares con RA, esto convierte a éste en un modelo ideal para seleccionar potenciales compuestos antiinflamatorios humanos. El modelo CIA es un modelo bien conocido en ratones que depende de una respuesta inmune, y una respuesta inflamatoria, en el orden en que se produzcan. La respuesta inmune comprende la interacción de células B y células T CD4+ en respuesta al colágeno, que se proporciona como antígeno, y conduce a la producción de anticuerpos dirigidos contra colágeno. La fase inflamatoria es el resultado de las respuestas tisulares a los mediadores de la inflamación, como consecuencia de que algunos de estos anticuerpos se entrecruzan con el colágeno natural del ratón y activan la cascada del complemento. Una ventaja de usar el modelo CIA es que se conocen los mecanismos básicos de la patogénesis. Se han identificado los epítopos de las células T y las células B relevantes en el colágeno de tipo II, y se han determinado diversos parámetros inmunológicos (por ejemplo, hipersensibilidad de tipo retardado y anticuerpos dirigidos contra colágeno) e inflamatorios (por ejemplo, citocinas, quimiocinas, y enzimas degradadores de la matriz) relacionados con la artritis inmunomediada, y se pueden usar de esta manera para evaluar la eficacia del compuesto de ensayo en el modelo CIA (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3: 407-20, 1999; Williams y col., Immunol. 89: 9784-788, 1992; Myers y col., Life Sci. 61: 1861-78, 1997; y Wang y col., Immunol.

92: 8955-959, 1995). [0244] Se usó la administración de polipéptidos soluble que comprenden IL22RA2 (Zcytor 16), tales como zcytor16-Fc4 u otras proteínas solubles de IL-22RA2 y de condensación en este modelo CIA de ratones para evaluar el uso de IL-22RA2 como antagonista del IL-22 usado para mejorar los síntomas y alterar el curso de la enfermedad. Debido a que el ligando IL-22RA2, IL-22, induce la producción de SAA, que está implicada en la patogénesis de la artritis reumatoide, y que se demostró que I;22RA2 era capaz de inhibir la actividad de IL-22 y SAA in vitro e in vivo, la administración sistémica o local de los polipéptidos que comprenden IL-22RA2, tales como zcytor16-Fc4 u otros receptores solubles de IL-22 (por ejemplo, IL-22RA; SEC. DE ID Nº 3) y de los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA, y de las proteínas de condensación, puede suprimir potencialmente la respuesta inflamatoria en RA. La inyección de 10 µg de zcytor16-Fc (tres veces a la semana durante 4 semanas) redujo significativamente la puntuación de la enfermedad (puntuación de la pata, incidente de inflamación o enfermedad). Otra terapéutica potencial incluye los polipéptidos de IL22RA, los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA, o los anticuerpos o compañeros de unión dirigidos contra IL-22, y similares). [0245] Un grupo ha demostrado que un anticuerpo dirigido contra Il-22 de ratón puede reducir los síntomas en un modelo CIA de ratón con respecto a los ratones control, mostrando de esta manera conceptualmente que los polipéptidos solubles de Il-22RA y los anticuerpos neutralizantes de IL-22RA pueden ser beneficiosos en el tratamiento de la enfermedad humana. La administración de un único anticuerpo monoclonal de rata específico de IL-22 de ratón (P3/1 redujo los síntomas de la artritis en los animales cuando se introdujo profilácticamente o tras artritis inducida por CIA se indujo en el modelo (Publicación WIPO 02/068476; publicada el 9 de septiembre de 2002). Por tanto, los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA de la presente invención, que incluyen los anticuerpos neutralizantes dirigidos contra IL-22RA humana de la presente invención, se pueden usar para neutralizar IL-22 e IL-20 en el tratamiento de enfermedades humanas específicas tales como la psoriasis, artritis psoriática, artritis, endotoxemia, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), colitis y otras dolencias inflamatorias dadas a conocer en el presente documento.

2. ENDOTOXEMIA [0246] La endotoxemia es una grave dolencia comúnmente resultante de agentes infecciosos tales como bacterias y otros agentes infecciosos de enfermedades, sepsia, síndrome del choque tóxico, o en pacientes inmunocomprometidos sometidos a infecciones oportunistas, y similares. Las proteínas antiinflamatorias terapéuticamente útiles, tales como los anticuerpos de IL-22RA de la presente invención, podrían ayudar en la prevención y el tratamiento de la endotoxemia en seres humanos y animales. Los polipéptidos de IL-22RA, los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA, o los anticuerpos

o compañeros de unión dirigidos contra IL-22, podrían servir como terapéutica valiosa para reducir la inflamación y los efectos patológicos en la endotoxemia. [0247] La endotoxemia inducida por lipopolisacárido engrana muchos de los mediadores proinflamatorios que producen efectos patológicos en las enfermedades infecciosas y la endotoxemia inducida por LPS en roedores es un modelo ampliamente usado y aceptable para estudiar los efectos farmacológicos de potenciales agentes proinflamatorios o inmunomoduladores. LPS, producido en bacterias gram-negativas, es un agente causante principal en la patogénesis del choque séptico (Glausner y col., Lancet 338: 732. 1991). Se puede inducir, de hecho, un estado similar al choque experimentalmente, mediante una única inyección de LPS en animales. Las moléculas producidas por las células que responden a LPS pueden hacer diana en los patógenos directa o indirectamente. Aunque estas respuestas biológicas protegen al hospedador contra patógenos invasores, pueden también producir un perjuicio. De esta manera, la estimulación masiva de la inmunidad innata, que se produce como resultados de graves infecciones bacterianas de Gram negativos, conduce a un exceso de producción de citocinas y otras moléculas, y al desarrollo de un síndrome fatal, el síndrome de choque séptico, que se caracteriza por fiebre, hipotensión, coagulación intravascular

diseminada, y una insuficiencia multiorgánica (Dumitru y col. Cell 103: 1071-1083, 2000). [0248] Estos efectos tóxicos de LPS se relacionan en su mayor parte con la activación de los macrófagos que conduce a la liberación de múltiples mediadores inflamatorios. Entre estos mediadores, TNF parece jugar un papel crucial, según se indica por la prevención de la toxicidad de LPS mediante la administración de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra TNF (Beutler y col., Science 229: 869, 1985). Está bien establecido que la inyección cargada de LPS de E. coli en ratón C57B1/6 dará como resultado un significativo aumento de IL-6, TN-alfa, IL-1, y las proteínas de la fase aguda (por ejemplo SAA) en circulación, aproximadamente 2 horas después de la inyección. La toxicidad de LPS parece estar mediada por estas citocinas ya que la inmunización pasiva contra estos mediadores puede dar como resultado una disminución de la mortalidad (Beutler y col., Science 229: 869, 1985). Las potenciales estrategias de inmunointervención para la prevención y/o el tratamiento del choque séptico incluyen MAb dirigido contra TNF, el antagonista del receptor de IL-1, LIF, IL-10 y G-CSF. [0249] Se usó la administración de polipéptidos solubles que comprenden IL22RA2, tales como Zcytor16-Fc4 u otras proteínas solubles de IL-22RA y de condensación en este modelo inducido por LPS para evaluar el uso de IL-22RA2 para mejorar los síntomas y alterar el curso de la enfermedad inducida por LPS. Además, los resultados que muestran la inhibición de IL-22 por IL-22RA2 proporcionan pruebas del concepto de que se pueden usar también otros antagonistas de IL-22, tales como IL-22RA o los anticuerpos del mismo, para mejorar los síntomas en el modelo inducido por LPS y alterar el curso de la enfermedad. El modelo mostró la inducción de IL-22 mediante una inyección de LPS y el potencial tratamiento de la enfermedad mediante los polipéptidos de IL-22RA2. Debido a que LPS induce la producción de IL-22 proinflamatorio, SAA u otros factores proinflamatorios contribuyen posiblemente a la patología de la endotoxemia, la neutralización de la actividad de IL22, se pueden usar SAA u otros factores proinflamatorios mediante un polipéptido antagonista de Il-22RA2 para reducir los síntomas de la endotoxemia, tal como se observa en el choque endotóxico. Otras terapéuticas potenciales incluyen los polipéptidos de IL-22RA, los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA, o los anticuerpos

o compañeros de unión dirigidos contra IL-22, y similares.

3. ENFERMEDAD INFLAMATORIA DEL INTESTINO. IBD [0250] En los Estados Unidos, aproximadamente 500.000 personas padecen de Enfermedad Inflamatoria del Intestino (IBD) que puede afectar tanto al colon o al recto (Colitis ulcerosa) como al intestino delgado y al grueso (Enfermedad de Crohn), La patogénesis de estas enfermedades no está clara, pero implica la inflamación crónica de los tejidos afectados. Los polipéptidos de IL-22RA, los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA, o los anticuerpos o compañeros de unión dirigidos contra IL-22, podrían servir como terapéutica valiosa para reducir la inflamación y los efectos patológicos en la IBD y las enfermedades relacionadas. [0251] La colitis ulcerosa (CU) es una enfermedad inflamatoria del intestino grueso, denominado comúnmente colon, caracterizada por la inflamación y la ulceración de la mucosa o el recubrimiento más interno del colon. Esta inflamación produce que el colon se vacíe frecuentemente, dando como resultado diarrea. Los síntomas incluyen heces sueltas y calambres abdominales asociados, fiebre y pérdida de peso. Aunque la causa exacta de la CU es desconocida, recientes investigaciones sugieren que las defensas naturales del cuerpo están trabajando contra las proteínas en el cuerpo y que el cuerpo piensa que son extrañas (una “reacción autoinmune”). Quizá debido a que se asemejan a proteínas bacterianas en el intestino, estas proteínas pueden tanto instigar como estimular el proceso inflamatorio que comienza a destruir la membrana que recubre el colon, A medida que se destruye la membrana que recubre el colon, se forman úlceras que liberan moco, pus y sangre. La enfermedad comienza usualmente en el área rectal y se puede extender eventualmente a través del intestino grueso completo. Episodios repetidos de inflamación conducen al engrosamiento de la pared del intestino y el recto con tejido cicatrizado. Se puede producir la muerte del tejido del colon o la sepsia con enfermedad grave. Los síntomas de la colitis ulcerosa varían en la gravedad y su comienzo puede ser gradual o brusco. Se pueden provocar ataques por muchos factores, que incluyen infecciones respiratorias o estrés. [0252] Aunque no existe actualmente cura disponible para la CU, los tratamientos se centran en suprimir el proceso inflamatorio anormal en la membrana que recubre el colon. Están disponibles tratamientos que incluyen corticoesteroides inmunosupresores (por ejemplo, azatioprina, mercaptopurina, y metotrexato) y aminosalicilatos, para tratar la enfermedad. Sin embargo, el uso a largo plazo de inmunosupresores tales como corticoesteroides y azatioprina puede dar como resultado serios efectos secundarios que incluyen disolución de los huesos, cataratas, infección, y efectos en el hígado y la médula ósea. En los pacientes en los que las terapias actuales no son satisfactorias, la cirugía es una opción. La cirugía implica la eliminación completa del colon y el recto.

[0253] Existen varios modelos animales que pueden imitar parcialmente la colitis ulcerosa crónica. El modelo más ampliamente usado es el modelo de colitis inducido por ácido 2,4,6-trinitrobencesulfónico/etanol (TNBS), que induce inflamación y ulceración crónicas en el colon. Cuando se introduce TNBS en el colon de ratones susceptibles mediante instilación intrarrectal, éste induce la respuesta inmune mediada por células T en la mucosa colónica, conduciendo en este caso a una inflamación mucosal masiva caracterizada por una densa infiltración de células T y macrófagos a través de la pared completa del intestino grueso. Además, este cuadro histopatológico se acompaña por el cuadro clínico de progresiva pérdida de peso (debilitamiento), diarrea sanguinolenta, prolapso rectal, y engrosamiento de la pared del intestino grueso (Neurath y col. Intern. Rev. Immunol. 19: 51-62, 2000). [0254] Otro modelo de colitis usa sulfato de sodio dextrano (DSS), que induce una colitis aguda manifestada por diarrea sanguinolenta, pérdida de peso, acortamiento del colon y ulceración mucosal con infiltración de neutrófilos. La colitis inducida por DSS se caracteriza histológicamente por la infiltración de células inflamatorias en la lámina propia, con hiperplasia linfoide, daño de la cripta focal, y ulceración epitelial. Se piensa que estos cambios se desarrollan debido a un efecto tóxico del DSS en el epitelio y por la fagocitosis de las células de la lámina propia y la producción de TNFalfa e IFN-gamma. A pesar de su uso común, quedan sin resolver algunas características con respecto a los mecanismos del DSS acerca de la relevancia en la enfermedad humana. Se observa DSS como modelo independiente de células T debido a que se observó en animales deficientes en células T tales como ratones SCID. [0255] Se puede usar la administración de polipéptidos que comprenden IL22RA2, tales como zcytor16-Fc4 u otras proteínas solubles de IL-22RA y de condensación en estos modelos TNBS o DSS para evaluar el uso de IL-22RA para mejorar los síntomas y alterar el curso de la enfermedad gastrointestinal. Además, los resultados que muestra la inhibición de IL-22 por IL-22RA2 proporcionan pruebas del concepto de que se pueden usar otros antagonistas de Il-22, tales como IL-22RA o los anticuerpos del mismo, para mejorar los síntomas en los modelos de colitis/IBD y alterar el curso de la enfermedad. Los inventores observaron el aumento de la expresión de IL-22 en tejidos del colon de ratones DSS mediante la RT-PCR, y la actividad sinérgica de IL-22 con IL-1beta en líneas celulares intestinales. Esto indica que IL-22 puede jugar un papel en la respuesta inflamatoria en la colitis, y la neutralización de la actividad de IL-22 administrando polipéptidos de IL-22RA2 es una potencial solución terapéutica de la IBD. Otras terapéuticas potenciales incluyen los polipéptidos de IL-22RA, los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA, o los anticuerpos o compañeros de unión dirigidos contra IL-22, y similares.

4. PSORIASIS [0256] La psoriasis es una dolencia crónica de la piel que afecta a más de siete millones de americanos. La psoriasis se produce cuando las células nuevas de la piel crecen anormalmente, daño como resultado manchas inflamadas, hinchadas, y escamosas de la piel en las que la piel de más edad no se suprime de manera suficientemente rápida. La psoriasis de placas, la forma más común, se caracteriza por manchas inflamadas de la piel (“lesiones”) con escamas blancas plateadas en la parte superior. La psoriasis puede estar limitada a unas pocas placas o implicar áreas moderadas a extensivas de la piel, que aparecen más comúnmente en el cuero cabelludo, rodillas, codos y tronco. Aunque es muy visible, la psoriasis no es contagiosa. La patogénesis de las enfermedades implica inflamación crónica de los tejidos afectados Los polipéptidos de IL-22RA, anticuerpos dirigidos contra IL-22RA,

o anticuerpos o compañeros de unión dirigidos contra IL-22 y dirigidos contra IL-20, podrían servir como terapéutica valiosa para reducir la inflamación y los efectos patológicos en la psoriasis, otras enfermedades inflamatorias de la piel, alergias de la piel y mucosales, y las enfermedades relacionadas. [0257] La psoriasis es una enfermedad inflamatoria de la piel mediada por células T que puede producir considerable malestar. La psoriasis afecta aproximadamente a un dos por ciento de las poblaciones de Europa y Norte América. Aunque los individuos con psoriasis suave pueden controlar a menudo su enfermedad con agentes tópicos, más de un millón de pacientes a nivel mundial requiere terapia ultravioleta o inmunosupresora sistémica. Desafortunadamente, los inconvenientes y riesgos de la radiación ultravioleta y las toxicidades de muchas terapias limitan su uso a largo plazo. Además, los pacientes usualmente tienen recurrencia a la psoriasis, en algunos casos rebote, poco después de suprimir la terapia inmunosupresora. [0258] IL-20 es un novedoso homólogo de IL-10 que demostró producir letalidad neonatal con las anormalidades de la piel que incluyen la diferenciación epidérmica aberrante en ratones transgénicos IL-20 (Blumberg H y col., Cell 104: 9-19, 2001). El receptor de IL-20 está regulado en exceso en la piel psoriática. Debido a que IL-22 comparte una subunidad receptora (zcytor11) con el receptor de IL-20, y que los ratones transgénicos IL-22 muestran un fenotipo similar, es posible que IL-22 esté también implicado en enfermedades inflamatorias de la piel tales como la psoriasis. La administración del polipéptido de IL-22RA o de un antagonista del anticuerpo dirigido contra IL-22RA, tanto subcutánea como tópicamente, puede reducir potencialmente la inflamación y los síntomas. Otras terapéuticas potenciales incluyen los polipéptidos de IL-22RA, los polipéptidos solubles del receptor zcytor11/CRF2-4 o los anticuerpos o compañeros de unión dirigidos contra IL-22, y similares. [0259] Además, se demostró la expresión en exceso de IL-22 e IL-20 en lesiones psoriáticas humanas, sugiriendo que IL-20, lo mismo que IL-20 está también implicado en la psoriasis humana. Además, según se ha descrito en el presente documento, la expresión en exceso de IL-20 o IL-22 en ratones transgénicos mostró engrosamiento epidérmico e implicación de células inmunes indicativos de un fenotipo psoriático; y adicionalmente, la inyección de IL-22 en ratones normales mostró engrosamiento epidérmico e implicación de células inmunes indicativos de un fenotipo psoriático que se suprimió mediante el antagonista del receptor soluble de IL-22RA2 (Zcytor16; Publicación WIPO Nº WO 01/40467). Dichos datos in vivo sugieren además que IL-22 proinflamatorio está implicado en la psoriasis. Como tales, los antagonistas de la actividad de IL-22 e IL-20, tales como los receptores solubles de IL22RA, y los anticuerpos de los mismos que incluyen los anticuerpos monoclonales y neutralizantes dirigidos contra IL-22RA humana de la presente invención, son útiles en el tratamiento terapéutico de las enfermedades inflamatorias, particularmente como antagonistas de IL-22 e IL-20, única o conjuntamente en el tratamiento de la psoriasis. Además, los antagonistas de la actividad de IL-22, tales como los receptores solubles de IL-22RA, y los anticuerpo de los mismos, que incluyen los anticuerpos monoclonales y neutralizantes dirigidos contra IL-22RA humana de la presente invención, son útiles en el tratamiento terapéutico de otras enfermedades inflamatorias, por ejemplo, como agentes que se unen a, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan o neutralizan IL-22 e IL-20 en el tratamiento de la dermatitis atópica, IBD, colitis, endotoxemia, artritis, artritis reumatoides, y artritis psoriática, síndrome de estrés respiratorio (ARD), choque séptico, insuficiencia multiorgánica, lesión inflamatoria del pulmón tal como asma o bronquitis, neumonía bacteriana, psoriasis, eczema, dermatitis atópica y de contacto, y enfermedad inflamatoria del intestino tal como colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn. [0260] Además, se pueden usar los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA de la presente invención en la prevención y la terapia contra la pérdida de peso asociada con numerosas enfermedades inflamatorias descritas en el presente documento, así como para cáncer (por ejemplo, quimioterapia y caquexia), y enfermedades infecciosas. Por ejemplo, la grave pérdida de peso es un marcador clave asociado con modelos de septicemia, MS, RA, y modelos de tumores. Adicionalmente, la pérdida de peso es un parámetro clave asociado con modelos de cáncer, enfermedad infecciosa y enfermedad inflamatoria. Se demostró la pérdida de peso en ratones inyectados con el adenovirus de IL-22 descrito en el presente documento. Se pueden ensayar anticuerpos dirigidos contra IL-22 y antagonistas de IL-22 tales como los receptores solubles de IL-22RA, y los anticuerpos de los anteriores de la presente invención, así como los receptores de zcytor16 (IL-22RA2), para su capacidad de prevenir y tratar la pérdida de peso en ratones inyectados con los adenovirus de IL-22 descritos en el presente documento. Se conocen en la técnica los procedimientos para determinar un régimen profiláctico o terapéutico para dichos antagonistas de IL-22 y se pueden determinar usando los procedimientos descritos enelpresente documento. [0261] Se pueden usar también los polipéptidos del receptor soluble de IL-22RA y los anticuerpos de los mismos dentro de sistemas diagnósticos para la detección de los niveles en circulación del ligando IL-22 o IL-20, y en la detección de IL-22 asociada con la respuesta inflamatoria en la fase aguda. Comprendidos dentro de una realización relacionada, se pueden usar se pueden usar los anticuerpos u otros agentes que se unen específicamente a los receptores solubles de IL-22RA descritos en el presente documento para detectar los polipéptidos del receptor en circulación; inversamente, se pueden usar los propios receptores solubles de IL-22RA para detectar los polipéptidos de IL-22 o IL-20 en circulación o que actúan localmente. Niveles elevados o deprimidos del ligando o de los polipéptidos del receptor pueden ser indicativos de dolencias patológicas, que incluyen inflamación o cáncer. Se sabe que IL-22 induce la respuesta inflamatoria en la fase aguda asociada. Además, la detección de las proteínas

o de moléculas tales como IL-20 o IL-22 en la fase aguda puede ser indicativa de dolencia inflamatoria crónica en algunos estados de enfermedad (por ejemplo, psoriasis, artritis reumatoide, colitis, IBD). La detección de dichas dolencias sirve como adyuvante en el diagnóstico de la enfermedad así como de ayuda al médico para escoger la terapia apropiada. [0262] Se puede usar la administración en el útero de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra IL-22 o IL-20 para mostrar la eficacia in vivo en modelos de enfermedad reduciendo o eliminando el fenotipo que se encuentra en la piel en las crías transgénicas de IL-22 que expresan en exceso IL-22, o las crías transgénicas de IL-20 que expresan en exceso IL-20. Existen precedentes en la técnica para el tratamiento en el útero con anticuerpos monoclonales neutralizantes (MAb). En un caso, el desarrollo del subconjunto B-1 de células B afectó drásticamente el tratamiento de ratones hembra embarazadas con un MAb específico de la molécula específica de las células B, CD19 (por ejemplo Krop I. y col., Eur. J. Immunol. 26(1): 238-42, 1996). Krop y col., inyectaron ratones hembra embarazadas de manera temporalizada intraperitonealmente con 500 µg de MAb CD19 de rata dirigido contra ratón (o un isótopo de rata correspondiente al control An) en PBS, comenzando en el día 9 de la gestación, con inyecciones posteriores en días alternos hasta el alumbramiento. Se inyectaron también crías una vez con 500 µg de estos anticuerpos a los 10 días de edad. En otro caso, Tanaka y col., encontraron que en el tratamiento en el útero con anticuerpo monoclonal del receptor de IL-2, la beta cadena abrogó completamente el desarrollo de las células epidérmicas dendríticas Thy-1+. Las dos distintas subunidades del receptor de IL-2, es decir, la alfa cadena (IL-2R alfa) y la beta cadena (IL-2R beta), se expresaron de manera casi mutua a través de la ontogenia del timo fetal. El bloqueo de IL2Rbeta, un componente de transducción de la señal de IL-2R, administrando un MAb neutralizante de IL-2R beta, dio como resultado la desaparición completa y selectiva de las células epidérmicas dendríticas Thy-1+ No estuvo comprometido el desarrollo de cualquier otro subconjunto de células T. Esto indica que IL-2 juega un papel crucial en el desarrollo de células fetales V gamma 5+ y sus descendientes (véase, Tanaka, T. y col., Int Immunol. 4(4): 487-9, 1992). Adicionalmente, Schattemann GC y col., demostraron que se requiere PDGF para el desarrollo cardiovascular de murino normal usando un sistema en el útero. Algunas líneas de evidencias sugieren que se necesita la cadena A del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-A) para el desarrollo cardiovascular embriónico normal. La introducción de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra PDGF-A en la membrana endometrial caduca en el útero de ratón dio como resultado la perturbación selectiva de las interacciones in vivo del ligando de PDGF-A/receptor durante un periodo de 18-24 horas y permitió la evaluación de si se necesitaba PDGF-A para el desarrollo cardiovascular y cuando se requería (véase, Schattemann GC y col., Dev. Biol. 176(1): 133-42, 1996). Estos resultados, así como otros descritos en la técnica, proporcionan evidencias de que los MAb neutralizantes pueden estimular fuertes efectos en el útero. Se pueden mostrar, similarmente, los datos que muestran la eficacia in vivo de IL-20 o IL-22 neutralizantes con los anticuerpos monoclonales en modelos de enfermedad para eliminar el fenotipo que se encuentra en la piel de crías transgénicas de IL-20 o IL-22. Estos ratones transgénicos nacen con una apariencia de piel “brillante”, debida al menos en parte al engrosamiento de la epidermis según se ha descrito en el presente documento. Las crías de IL-20 TG que expresan débilmente bajos niveles de la citocina transgénica, pueden recuperarse y sobrevivir a la reproducción, pero los ratones IL-22 TG mueren rápidamente tras el alumbramiento, generalmente, antes de los 5 días de edad. [0263] Por ejemplo, los anticuerpos neutralizantes incluyen anticuerpos de IL-20, tales como anticuerpos monoclonales neutralizantes que se pueden unir a epítopos antigénicos de IL-20 y neutralizar la actividad de IL-20. Según esto; los péptidos que soportan epítopos antigénicos y polipéptidos de IL-20 son útiles para aumentar los anticuerpos que se unen con los polipéptidos de IL-20 descritos en el presente documento, así como para identificar y cribar anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL-20 que sean neutralizantes, y que se puedan unir, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la actividad de IL-20. Dichos anticuerpos monoclonales neutralizantes se pueden unir a un epítopo antigénico de IL-20. Dichos epítopos en el interior de la SEC. DE ID Nº 8, como los predichos por la representación gráfica de Jameson-Wolf, usando, por ejemplo, el programa DNASTAR Protean (DNASTAR, Inc., Madison, WI), sirven como epítopos antigénicos preferidos, y pueden determinarse por una persona experta en la técnica. Dichos epítopos antigénicos incluyen: los restos de aminoácidos 42 (Ile) a 102 (Asp) de la SEC. DE ID Nº8; los restos de aminoácidos 42 (Ile) a 60 (Ile) + de la SEC. DE ID Nº8; los restos de aminoácidos 42 (Ile) a 69 (Glu) de la SEC. DE ID Nº8; los restos de aminoácidos 42 (Ile) a 81 (Cys) de la SEC. DE ID Nº8; los restos de aminoácidos 42 (Ile) a 96 (Lys) de la SEC. DE ID Nº8; los restos de aminoácidos 42 (Ile) a 102 (Asp) de la SEC. DE ID Nº8; los restos de aminoácidos 60 (Ile) a 69 (Glu) de la SEC. DE ID Nº8; los restos de aminoácidos 60 (Ile) a 81 (Cys) de la SEC. DE ID Nº8; los restos de aminoácidos 60 (Ile) a 96 (Lys) de la SEC. DE ID Nº8; los restos de aminoácidos 60 (Ile) a 102 (Asp) de la SEC. DE ID Nº8; los restos de aminoácidos 69 (Glu) a 81 (Cys) de la SEC. DE ID Nº8; los restos de aminoácidos 69 (Glu) a 96 (Lys) de la SEC. DE ID Nº8; los restos de aminoácidos 69 (Glu) a 102 (Asp) de la SEC. DE ID Nº8; los restos de aminoácidos 81 (Cys) a 96 (Lys) de la SEC. DE ID Nº8; los restos de aminoácidos 81 (Cys) a 102 (Asp) de la SEC. DE ID Nº8; y los restos de aminoácidos 96 (Lys) a 102 (Asp) de la SEC. DE ID Nº8. [0264] Adicionalmente a otros modelos de enfermedad descritos en el presente documento, se puede medir in vivo la actividad de los anticuerpos dirigidos contra IL22RA en tejidos inflamatorios derivados de lesiones psoriáticas humanas usando un modelo combinado de ratón inmunodeficiente grave (SCID). Se han desarrollado diversos modelos de ratón en los que se implantan células humanas en ratones inmunodeficientes (denominados colectivamente como modelos de xenoinjerto); véanse, por ejemplo, Cattan AR, Douglas E, Leuk. Res. 18: 513-22, 1994 y Flavell, DJ, Hematological Oncology 14: 67-82, 1996. Como modelo de xenoinjerto de la psoriasis, el tejido de la piel psoriática humana se implanta en el modelo de ratón SCID, y se estimula con un antagonista apropiado. Además, se pueden usar en la técnica otros modelos animales de psoriasis para evaluar los antagonistas de IL-20 e IL-22, tales como los injertos de piel psoriática implantados en el modelo de ratón AGR129, y se estimulan con un antagonista apropiado (por ejemplo, véase, Boyman,

O. y col., J. Exp. Med. Publicación en línea nº 20031482, 2004). Los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA que se unen, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan o neutralizan la actividad de IL-22 o de IL-20 e IL-22 son antagonistas preferidos, sin embargo, se pueden usar anticuerpos dirigidos contra IL-20 y dirigidos contra IL-22 (solos o en combinación), IL-22RA soluble, así como otros antagonistas de IL-20 e IL22 en este modelo. Similarmente, se pueden usar tejidos o células derivados de colitis, IBD, artritis, u otras lesiones inflamatorias humanas en el modelo SCID para evaluar las propiedades antiinflamatorias de los antagonistas de IL-20 e IL-22 descritos en el presente documento. [0265] Se pueden ensayar terapias para suprimir, retardar, o reducir la inflamación usando anticuerpos dirigidos contra IL-22RA o sus derivados, agonistas, conjugados o variantes mediante la administración de anticuerpos dirigidos contra IL-22RA o compuestos solubles de IL-22RA en ratones SCID que soportan tejido inflamatorio humano (por ejemplo, lesiones psoriáticas y similares), u otros modelos descritos en el presente documento. La eficacia del tratamiento se mide y evalúa estadísticamente como aumento del efecto antiinflamatorio dentro de la población tratada en el tiempo usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Algunos procedimientos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a medir, por ejemplo, en un modelo de psoriasis, el engrosamiento epidérmico, el número de células inflamatorias en la dermis superior, y los grados de paraqueratosis. Se conocen dichos procedimientos en la técnica y se describen en el presente documento. Véanse, por ejemplo, Zeigler, M. y col. Lab Invest 81: 1253, 2001; Zollner, T. M. y col. J. Clin. Invest. 109: 671, 2002; Yamanaka, N. y col. Microbio.1 Immunol. 45: 507, 2001; Raychaudhuri, S. P. y col. Br. J. Dermatol. 144: 931, 2001; Boehncke, W. H y col. Arch. Dermatol. Res. 291: 104, 1999; Boehncke, W. H y col. J. Invest. Dermatol. 116: 596, 2001; Nickoloff, B. J. y col. Am. J. Pathol. 146: 580, 1995; Boehncke, W. H y col. J. Cutan. Pathol. 24: 1, 1997; Sugai, J., M. y col. J. Dermatol. Sci. 17: 85, 1998; y Villadsen L.S. y col. J. Clin.

Invest. 112: 1571, 2003. Se puede vigilar también la inflamación en el tiempo Usando Procedimientos bien conocidos tales como la citometría de flujo (o la PCR) para cuantificar el número de células inflamatorias o productoras de lesión en, una muestra, puntuación (pérdida de peso, diarrea, sangrado rectal, longitud del colon) de IBD, puntuación de la enfermedad de la pata y puntuación de la inflamación en un modelo CIA de RA. Por ejemplo, las estrategias terapéuticas apropiadas para ensayar en dicho modelo incluyen el tratamiento directo usando anticuerpos dirigidos contra IL-22RA, otros antagonistas de IL-20 e IL-22 (única o conjuntamente) o los conjugados o antagonistas relacionados basándose en la interrupción de la perturbación de los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA con sus ligando IL-20 e IL-22 o para terapias basadas en células utilizando anticuerpos dirigidos contra IL-22RA o sus derivados, agonistas, conjugados o variantes. [0266] Además, la psoriasis es una enfermedad inflamatoria crónica de la piel que se asocia con queratinocitos epidérmicos hiperplásicos e infiltración de células mononucleares, incluyendo las células T de memoria CD4+, neutrófilos y macrófagos (Christophers, Int. Arch. Allergy Immunol., 110: 199, 1996). Se cree actualmente que los antígenos ambientales juegan un papel significativo en la iniciación y la contribución a la patología a la enfermedad. Sin embargo, se piensa que la pérdida de tolerancia de los autoantígenos media en la patología de la psoriasis. Se piensa que las células dendríticas y las células T CD4+ juegan un importante papel en la presentación y reconocimiento del antígeno que media en la respuesta inmune conduciendo a la patología. Los inventores han desarrollado recientemente un modelo de psoriasis basado en el modelo de transferencia CD4+CD45RB (Davenport y col., Internat. Immunopharmacol., 2: 653-672). Se administran a los ratones los anticuerpos dirigidos contra IL20, los anticuerpos dirigidos contra IL22 o los anticuerpos de IL20R y/o IL22R, tales como los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA de la presente invención,

o IL-22RA soluble. La inhibición de las puntuaciones de enfermedad (lesiones de la piel, citocinas inflamatorias) indica la efectividad de los antagonistas de IL-20 e IL-22 en la psoriasis, por ejemplo, los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA o los receptores solubles de IL-22RA, u otros antagonistas tales como los anticuerpos dirigidos contra IL20 y/o IL-22 o sus receptores.

DERMATITIS ATÓPICA. [0267] IL-20 e IL-22 están regulados en exceso en las muestras de pacientes con dermatitis atópica humana. AD es la enfermedad inflamatoria crónica común que se caracteriza por hiperactividad de las citocinas del subconjunto 2 de las células T auxiliares (Th2). Aunque la etiología exacta de la AD es desconocida, se han implicado múltiples factores, que incluyen las respuestas inmunes de Th2 hiperactiva, la autoinmunidad, infección, alérgenos, y predisposición genética. Las características clave de la enfermedad, incluyen xerosis (sequedad de la piel= prurito (comezón de la piel), conjuntivitis, lesiones inflamatorias de la piel. Infección por Staphylococcus aureus, elevada eosinofilia en sangre, elevación de IgE e IgG1 en suero, y dermatitis crónica con células C, mastocitos, macrófagos e infiltración de eosinófilos. Se ha reconocido que la colonización o la infección con S. aureus exacerba AD y perpetúa la cronicidad de esta enfermedad de la piel. [0268] AD se encuentra a menudo en pacientes con asma y rinitis alérgica, y es frecuentemente la manifestación inicial de la enfermedad alérgica. Aproximadamente, el 20 % de la población en países occidentales padece de estas enfermedades alérgicas, y la incidencia de la AD en países desarrollados está aumentando por razones desconocidas. La AD comienza normalmente y puede a menudo persistir a lo largo de la adolescencia en personas adultas. Los tratamientos actuales de la AD incluyen corticoesteroides tópicos, ciclosporina A oral, inmunosupresores no corticoesteroides tales como tacrolimus (FK506 en forma de pomada), e interferón gamma. A pesar de la variedad de tratamientos de la AD, los síntomas de muchos pacientes no mejoran, o tienen reacciones adversas a las medicaciones, requiriendo la búsqueda de otros agentes terapéuticos más efectivos. Los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA de la presente invención, que incluyen los anticuerpos neutralizantes dirigidos contra IL22RA humana de la presente invención, se pueden usar para neutralizar IL-22 e IL-20 en el tratamiento de enfermedades humanas específicas tales como la dermatitis atópica, las dolencias inflamatorias de la piel, y otras dolencias inflamatorias dadas a conocer en el presente documento. [0269] Para uso farmacéutico, los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA de la presente invención se formulan para la administración parenteral, particularmente intravenosa o subcutánea, con administración según los procedimientos convencionales, La administración intravenosa será mediante inyección en bolo, con administración controlada, usando, por ejemplo, mini bombas u otra tecnología apropiada, o mediante infusión durante un periodo normal de una a algunas horas. En general, las formulaciones farmacéuticas incluirán una proteína hematopoyética en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como disolución salina, disolución salina tamponada, dextrosa al 5 % en agua o similares. Las formulaciones pueden incluir adicionalmente uno o más excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes tamponantes, albúmina para evitar la pérdida de proteína en superficies de viales, etc. Cuando se utiliza dicha terapia de combinación, se pueden combinar las citocinas en una única formulación o se pueden administrar en formulaciones separadas. Los procedimientos de formulación son bien conocidos en la técnica y se dan a conocer, por ejemplo, en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990. Las dosis terapéuticas estarán generalmente en el intervalo de 0,1 a 100 mg/kg del peso del paciente por día, preferiblemente 0,5-20 mg/kg por día, con la dosis exacta determinada por el médico según los estándares aceptados, teniendo en cuenta la naturaleza y la gravedad de la dolencia que se va a tratar, rasgos del paciente, etc. La determinación de la dosis está comprendida dentro del nivel de conocimiento de una persona normalmente experta en la técnica. Las proteínas se administrarán comúnmente durante un periodo de hasta 28 días tras la quimioterapia o el trasplante de médula ósea o hasta que se alcance un recuento de plaquetas de > 20.000/mm3, preferiblemente > 50.000/mm3. Más comúnmente, se administrarán las proteínas durante una semana o menos, a menudo durante un periodo de uno a tres días. En general, una cantidad terapéuticamente efectiva de anticuerpos contra IL-22RA de la presente invención es una cantidad suficiente para producir un aumento clínicamente significativo en la proliferación y/o la diferenciación de células progenitoras linfoides o mieloides, que se manifestará en un aumento en los niveles en circulación de células maduras (por ejemplo, plaquetas o neutrófilos). El tratamiento de los trastornos plaquetarios continuará de esta manera hasta que se alcance un recuento de plaquetas de al menos 20.000/mm3, preferiblemente 50.00/mm3. Se pueden administrar también anticuerpos solubles de IL-22RA o dirigidos contra IL22RA de la presente invención en combinación con otras citocinas tales como IL-2, 6 y 11; factor citoblástico; eritropoyetina; G-CSF y GM-CSF. Dentro de los regímenes de la terapia de combinación, las dosis diarias de otras citocinas serán en general: EPO, 150 U/kg; GM-CSF, 5-15 lg/kg; IL-3, 1-5 lg/kg; y G-CSF, 1-25 lg/kg. La terapia de combinación con EPO, por ejemplo está indicada en pacientes anémicos con bajos niveles de EPO. [0270] Generalmente, la dosificación del IL-22RA soluble administrado (o del análogo o la proteína de condensación de IL-22RA) o de los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA variará dependiendo de dichos factores como la edad del paciente, el peso, el sexo, el estado médico general y el historial médico anterior. Normalmente, es necesario proporcionar al receptor con una dosificación de IL-22RA soluble o de anticuerpos dirigidos contra IL-22RA que esté en el intervalo de entre aproximadamente 1 pg/kg a 10 mg/kg (cantidad de agente/peso corporal del paciente) aunque se puede administrar también una dosificación más baja o más alta según dicten las circunstancias. [0271] La administración de anticuerpos solubles de IL-22RA o dirigidos contra IL-22RA a un sujeto puede ser intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intrapleural, intratecal, por perfusión, a través de un catéter regional, o mediante inyección directa intralesional. Cuando se administra las proteínas terapéuticas mediante inyección, la infusión puede ser mediante infusión continua o mediante bolos únicos o múltiples. [0272] Las rutas adicionales de administración incluyen la oral, la de la membrana mucosal, la pulmonar, y la transcutánea. La administración oral es adecuada para microesferas de poliéster, microesferas de zeína, microesferas de proteinoide, microesferas de policianoacrilato, y sistemas basados en lípidos (véase, por ejemplo, DiBase y Morrel, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins," en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 255-288 (Plenum Press 1997)). La factibilidad de una administración intranasal se ejemplifica por dicho modo de administración de insulina (véase, por ejemplo, Hinchcliffe e Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35: 199 (1999)). Se pueden preparar partículas secas o líquidas que comprenden IL-22RA e inhalarse con la ayuda de dispersantes de polvo en seco, generadores de aerosoles líquidos, o nebulizadores (por ejemplo, Pettit y Gombotz, TIBTECH 16: 343 (1998); Patton y col., Adv. Drug Deliv. Rev. 35: 235 (1999)). Se ilustra esta solución mediante el sistema AERX de gestión de la diabetes, que es un inhalador electrónico auto mantenido que administra insulina en aerosol en los pulmones. Los estudios han demostrado que proteínas tan grandes como 48.000 kDa se han administrado a través de la piel a concentraciones terapéutica con la ayuda de ultrasonidos de baja frecuencia, lo que ilustra la factibilidad de la administración transcutánea (Mitragotri y col., Science 269:850 (1995)). La administración transdérmica usando la electroporación proporciona otro medio para administrar una molécula que tiene actividad de unión de IL-22RA (Potts y col., Pharm. Biotechnol. 10: 213 (1997)). [0273] Se puede formular una composición farmacéutica de un anticuerpo soluble de IL-22RA o dirigido contra IL-22RA según los procedimientos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, por los cual, las proteínas terapéuticas se combinan en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se dice que una composición es un “vehículo farmacéuticamente aceptable” si se puede tolerar su administración por un paciente receptor. Las personas expertas en la técnica conocen otros vehículos adecuados. Véase, por ejemplo, Gennaro (ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19ª Edición (Mack Publishing Company 1995). [0274] A objeto de terapia, se administran moléculas de anticuerpos solubles de IL-22RA o dirigidas contra IL-22RA y un vehículo farmacéuticamente aceptable a un paciente en una cantidad terapéuticamente efectiva. Se dice que se administra una combinación de una molécula terapéutica de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable en una “cantidad terapéuticamente efectiva” si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Un agente es fisiológicamente significativo si su presencia da como resultado un cambio detectable en la fisiología del paciente receptor Por ejemplo, un agente usado para tratar la inflamación es fisiológicamente significativo si su presencia alivia la respuesta inflamatoria. [0275] Una composición farmacéutica que comprende IL-22RA (o un análogo o proteína de condensación de IL-22RA) o un anticuerpo neutralizante dirigido contra IL-22RA se puede proporcionar en forma líquida, en un aerosol, o en forma sólida. Las formas líquidas se ilustran por disoluciones inyectables y suspensiones orales. Las formas sólidas a modo de ejemplo incluyen cápsulas, comprimidos y formas de administración controlada. La última forma se ilustra mediante bombas miniosmóticas e implantes (Bremer y col., Pharm. Biotechnol. 10: 239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery," en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 95-123 (CRC Press 1995); Bremer y col., "Protein Delivery with Infusion Pumps," en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey y col., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant," en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 93-117 (Plenum Press 1997)). [0276] Los liposomas proporcionan un medio para administrar polipéptidos terapéuticos a un sujeto por vía intravenosa, intraperitoneal, intratecal, intramuscular, subcutánea, o mediante administración oral, mediante inhalación, o administración intranasal. Los liposomas son vesículas microscópicas que están constituidas por una o más bicapas lipídicas que rodean compartimentos acuosos (véase, generalmente, Bakker-Woudenberg y col., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1): S61 (1993), Kim, Drugs 46: 618 (1993), y Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carners," en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 3-24 (CRC Press 1995)). Los liposomas tienen composición similar a las membranas celulares y como resultado, se pueden administrar los liposomas con seguridad y son biodegradables. Dependiendo del procedimiento de preparación, los liposomas pueden ser unilamelares o multilamelares, y los liposomas pueden variar de tamaño con diámetros que oscilan desde 0,02 µm a más de 10 µm. Se pueden encapsular una variedad de agentes en liposomas: repartiendo agentes hidrófobos en las bicapas y repartiendo agentes hidrófilos en el interior del espacio(s) acuoso interno (véanse, por ejemplo, Machy y col., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987), y Ostro y col., American J. Hosp. Pharm. 46: 1576 (1989)). Además, es posible controlar la disponibilidad terapéutica del agente encapsulado variando el tamaño de los liposomas, el número de bicapas, la composición lipídica, así como las características de carga y superficiales de los liposomas. [0277] Los liposomas pueden adsorber virtualmente cualquier tipo de célula y liberar a continuación lentamente el agente encapsulado. Como alternativa, un liposoma adsorbido puede experimentar endocitosis por las células que son fagocíticas Se continúa la endocitosis por la degradación intralisosómica de los lípidos lisosómicos y la liberación de los agentes encapsulados (Scherphof y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446: 368 (1985)). Tras la administración intravenosa, las células capturan normalmente los pequeños liposomas (0,1 a 10 µm) del sistema reticuloendotelial, mientras que los liposomas más grandes se depositan en el pulmón. Se ha usado esta captación preferente de liposomas más pequeños por las células del sistema reticuloendotelial para administrar agentes quimioterapéuticos a los macrófagos y a los tumores del hígado. [0278] Se puede rodear el sistema reticuloendotelial mediante diversos procedimientos que incluyen la saturación con grandes dosis de partículas de liposomas, o la inactivación selectiva de macrófagos por medios farmacológicos (Claassen y col., Biochim. Biophys. Acta 802: 428 (1984)). Adicionalmente, la incorporación de fosfolípidos derivatizados de glicolípidos o polietilenglicol en las membranas de los liposomas ha demostrado dar como resultado una captación significativamente reducida por el sistema reticuloendotelial (Allen y col., Biochim. Biophys. Acta 1068: 133 (1991); Allen y col., Biochim. Biophys. Acta 1150: 9 (1993)). [0279] Se pueden preparar también liposomas para hacer diana en células u órganos concretos variando la composición de fosfolípidos o insertando receptores o ligandos en los liposomas. Por ejemplo, se han usado liposomas con un elevado contenido de tensioactivo no iónico, para hacer diana en el hígado (Hayakawa y col., Patente Japonesa 04-244,018; Kato y col., Biol. Pharm. Bull. 16: 960 (1993)). Se prepararon estas formulaciones mezclando fosfatidil colina de soja, α-tocoferol, y aceite de ricino hidrogenado etoxilado (HCO-60) en metanol, concentrando la mezcla a vacío, y a continuación, reconstituyendo la mezcla con agua. Una formulación liposómica de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) con una mezcla de esteril glucósido derivado de soja (SG) y colesterol (Ch) ha demostrado hacer diana en el hígado (Shimizu y col., Biol. Pharm. Bull. 20: 881 (1997)). [0280] Como alternativa, se pueden unir algunos ligandos directores a la superficie del liposoma, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, carbohidratos, vitaminas, y proteínas transportadoras. Por ejemplo, se pueden modificar los liposomas con derivados de galactosilípidos de tipo ramificado para hacer diana en receptores de la asiaglicoproteína (galactosa), que se expresan exclusivamente en la superficie de las células del hígado (Kato y Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14: 287 (1997); Murahashi y col., Biol. Pharm. Bull.20: 259 (1997)). Similarmente, Wu y col., Hepatology 27: 772 (1998), ha demostrado que los liposomas marcados asialofetuína conducen a un acortamiento de la semivida de los liposomas en plasma y potencian mucho la captación de los liposomas marcados con asialofetuína por los hepatocitos. Por otra parte, la acumulación hepática de liposomas que comprenden derivados de galactosilípidos de tipo ramificado se puede inhibir mediante la preinyección de asialofetuína (Murahashi y col., Biol. Pharm. Bull.20: 259 (1997)). Los liposomas de albúmina de suero humano poliaconitilados proporcionan otra solución para que los liposomas hagan diana en células del hígado (Kamps y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 94: 11681 (1997)). Además, Geho, y col. Patente de los Estados Unidos Nº 4.603.044, describe un sistema de administración de vesículas liposómicas dirigido a hepatocitos, que tiene especificidad por los receptores hepatobiliares asociados con las células metabólicas especializadas del hígado. [0281] En una solución más general para la dirección de tejidos, se premarcan las células diana con anticuerpos biotinilados específicos de un ligando expresado por la célula diana (Harasym y col., Adv. Drug Deliv. Rev. 32: 99 (1998)). Tras la eliminación de los anticuerpos libres en plasma, se administran liposomas conjugados con estreptavidina. En otra solución, los anticuerpos directores se unen directamente a liposomas (Harasym y col., Adv. Drug Deliv. Rev. 32: 99 (1998)). [0282] Se pueden encapsular los polipéptidos y los anticuerpos en el interior de liposomas usando técnicas normalizadas de microencapsulación de proteínas (véanse, por ejemplo, Anderson y col., Infect. Immun. 31: 1099 (1981), Anderson y col., Cancer Res. 50: 1853 (1990), y Cohen y col., Biochim. Biophys. Acta 1063: 95 (1991), Alving y col. "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies," en Liposome Technology, 2ª Edición, Vol. III, Gregoriadis (ed.), Página 317 (CRC Press 1993), Wassef y col., Meth. Enzymol. 149: 124 (1987)). Según se ha señalado anteriormente, los liposomas terapéuticamente útiles pueden contener una variedad de componentes. Por ejemplo, los liposomas pueden comprender derivados de lípidos de poli(etilenglicol) (Allen y col., Biochim. Biophys. Acta 1150: 9 (1993)). [0283] Se han diseñado microesferas de polímeros degradables para mantener niveles sistémicos elevados de proteínas terapéuticas. Se preparan microesferas de polímeros degradables tales como poli(láctido-co-glicólido), polianhídridos, poli(ortoésteres), polímeros de acetato de etilvinilo no biodegradables, en los que las proteínas se atrapan en el polímero (Gombotz y Pettit, Bioconjugate Chem. 6: 332 (1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery," en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 51-93 (CRC Press 1995); Roskos y Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery," en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus y col., Science 281: 1161 (1998); Putney y Burke, Nature Biotechnology

16: 153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 548 (1998)). Se pueden proporcionar también vehículos de nanoesferas recubiertas con polietilenglicol (PEG) para la administración de proteínas terapéuticas (véase, por ejemplo, Gref y col., Pharm. Biotechnol. 10: 167 (1997)). [0284] La presente memoria descriptiva describe polipéptidos químicamente modificados que tienen actividad de unión a IL-22RA tal como receptores solubles monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos de IL-22RA, y antagonistas de IL-22RA, por ejemplo, anticuerpos contra IL-22RA o polipéptidos de unión, o anticuerpos neutralizantes contra IL-22RA, cuyo polipéptido se une con un polímero, según se ha discutido anteriormente. [0285] Las personas expertas en la técnica pueden concebir otras formas de dosificación, según se muestra, por ejemplo, en Ansel y Popovich, Pharmaceutical Dosage Formsand Drug Delivery Systems, 5ª Edición (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19ª Edición (Mack Publishing Company 1995), y en Ranade y Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996). [0286] Como ilustración, se pueden suministrar las composiciones farmacéuticas como un kit que comprende un contenedor que comprende un polipéptido con una región extracelular de IL-22RA, por ejemplo, los receptores solubles monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos de IL-22RA, o de un antagonista de IL-22RA (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido de IL-22RA, o a un anticuerpo neutralizante dirigido contra IL-22RA). Se pueden proporcionar polipéptidos terapéuticos en forma de una disolución inyectable de dosis única o múltiple, o como un polvo estéril que se reconstituirá antes de la inyección. Como alternativa, dicho kit puede incluir un dispersante de polvo en seco, un generador de aerosol líquido, o un nebulizador para la administración de un polipéptido terapéutico. Dicho kit puede comprender además información o indicaciones escritas y la utilización de la composición terapéutica. Además, dicha información puede incluir una declaración de que la composición de IL-22RA está contraindicada en pacientes con hipersensibilidad conocida a IL-22RA. [0287] Una composición farmacéutica que comprende anticuerpos o compañeros de unión dirigidos contra IL-22RA (o fragmentos de anticuerpos dirigidos contra IL22RA, anticuerpos de condensación, anticuerpos humanizados y similares), o receptores solubles de IL-22RA, se pueden proporcionar en forma líquida, en un aerosol, o en forma sólida. Las formas líquidas se ilustran por disoluciones inyectables, aerosoles, gotículas, disoluciones topológicas y suspensiones orales. Las formas sólidas a modo de ejemplo incluyen cápsulas, comprimidos, y formas de administración controlada. La última forma se ilustra mediante bombas miniosmóticas e implantes (Bremer y col., Pharm. Biotechnol. 10: 239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery," en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 95-123 (CRC Press 1995); Bremer y col., "Protein Delivery with Infusion Pumps," en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), pages 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey y col., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant," en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 93-117 (Plenum Press 1997)). Otras formas sólidas incluyen cremas, pastas, otras aplicaciones topológicas, y similares. [0288] Los liposomas proporcionan un medio para administrar polipéptidos terapéuticos a un sujeto por vía intravenosa, intraperitoneal, intratecal, intramuscular, subcutánea, o mediante administración oral, mediante inhalación, o administración intranasal. Los liposomas son vesículas microscópicas que están constituidas por una o más bicapas de lípidos que rodean compartimentos acuosos (véanse, generalmente, Bakker-Woudenberg y col., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1): S61 (1993), Kim, Drugs 46: 618 (1993), y Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers," en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 3-24 (CRC Press 1995)). Los liposomas tienen composición similar a las membranas celulares y como resultado, se pueden administrar los liposomas con seguridad y son biodegradables. Dependiendo del procedimiento de preparación, los liposomas pueden ser unilamelares o multilamelares, y los liposomas pueden variar de tamaño con diámetros que oscilan desde 0,02 µm a más de 10 µm. Se pueden encapsular una variedad de agentes en liposomas: repartiendo agentes hidrófobos en las bicapas y repartiendo agentes hidrófilos en el interior del espacio(s) acuoso interno (véanse, por ejemplo, Machy y col., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987), y Ostro y col., American J. Hosp. Pharm. 46: 1576 (1989)). Además, es posible controlar la disponibilidad terapéutica del agente encapsulado variando el tamaño de los liposomas, el número de bicapas, la composición lipídica, así como las características de carga y superficiales de los liposomas. [0289] Los liposomas pueden adsorber virtualmente cualquier tipo de célula y liberar a continuación lentamente el agente encapsulado. Como alternativa, un liposoma adsorbido puede experimentar endocitosis por las células que son fagocíticas Se continúa la endocitosis por la degradación intralisosómica de los lípidos lisosómicos y la liberación de los agentes encapsulados (Scherphof y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446: 368 (1985)). Tras la administración intravenosa, las células capturan normalmente los pequeños liposomas (0,1 a 10 µm) del sistema reticuloendotelial, mientras que los liposomas más grandes se depositan en el pulmón. Se ha usado esta captación preferente de liposomas más pequeños por las células del sistema reticuloendotelial para administrar agentes quimioterapéuticos a los macrófagos y a los tumores del hígado. [0290] Se puede rodear el sistema reticuloendotelial mediante diversos procedimientos que incluyen la saturación con grandes dosis de partículas de liposomas, o la inactivación selectiva de macrófagos por medios farmacológicos (Claassen y col., Biochim. Biophys. Acta 802: 428 (1984)). Adicionalmente, la incorporación de fosfolípidos derivatizados de glicolípidos o polietilenglicol en las membranas de los liposomas ha demostrado dar como resultado una captación significativamente reducida por el sistema reticuloendotelial (Allen y col., Biochim. Biophys. Acta 1068: 133 (1991); Allen y col., Biochim. Biophys. Acta 1150: 9 (1993)). [0291] Se pueden preparar también liposomas para hacer diana en células u órganos concretos variando la composición de fosfolípidos o insertando receptores o ligandos en los liposomas. Por ejemplo, se han usado liposomas con un elevado contenido de tensioactivo no iónico, para hacer diana en el hígado (Hayakawa y col., Patente Japonesa 04-244,018; Kato y col., Biol. Pharm. Bull. 16: 960 (1993)). Se prepararon estas formulaciones mezclando fosfatidil colina de soja, α-tocoferol, y aceite de ricino hidrogenado etoxilado (HCO-60) en metanol, concentrando la mezcla a vacío, y a continuación, reconstituyendo la mezcla con agua. Una formulación liposómica de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) con una mezcla de esteril glucósido derivado de soja (SG) y colesterol (Ch) ha demostrado hacer diana en el hígado (Shimizu y col., Biol. Pharm. Bull. 20: 881 (1997)). [0292] Como alternativa, se pueden unir algunos ligandos directores a la superficie del liposoma, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, carbohidratos, vitaminas, y proteínas transportadoras. Por ejemplo, se pueden modificar los liposomas con derivados de galactosilípidos de tipo ramificado para hacer diana en receptores de la asiaglicoproteína (galactosa), que se expresan exclusivamente en la superficie de las células del hígado (Kato y Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14: 287 (1997); Murahashi y col., Biol. Pharm. Bull.20: 259 (1997)). Similarmente, Wu y col., Hepatology 27: 772 (1998), ha demostrado que los liposomas marcados asialofetuína conducen a un acortamiento de la semivida de los liposomas en plasma y potencian mucho la captación de los liposomas marcados con asialofetuína por los hepatocitos. Por otra parte, la acumulación hepática de liposomas que comprenden derivados de galactosilípidos de tipo ramificado se puede inhibir mediante la preinyección de asialofetuína (Murahashi y col., Biol. Pharm. Bull.20: 259 (1997)). Los liposomas de albúmina de suero humano poliaconitilados proporcionan otra solución para que los liposomas hagan diana en células del hígado (Kamps y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 94: 11681 (1997)). Además, Geho, y col. Patente de los Estados Unidos Nº 4.603.044, describe un sistema de administración de vesículas liposómicas dirigido a hepatocitos, que tiene especificidad por los receptores hepatobiliares asociados con las células metabólicas especializadas del hígado. [0293] En una solución más general para la dirección de tejidos, se premarcan las células diana con anticuerpos biotinilados específicos de un ligando expresado por la célula diana (Harasym y col., Adv. Drug Deliv. Rev. 32: 99 (1998)). Tras la eliminación de los anticuerpos libres en plasma, se administran liposomas conjugados con estreptavidina. En otra solución, los anticuerpos directores se unen directamente a liposomas (Harasym y col., Adv. Drug Deliv. Rev. 32: 99 (1998)). [0294] Se pueden encapsular los polipéptidos y los anticuerpos en el interior de liposomas usando técnicas normalizadas de microencapsulación de proteínas (véanse, por ejemplo, Anderson y col., Infect. Immun. 31: 1099 (1981), Anderson y col., Cancer Res. 50: 1853 (1990), y Cohen y col., Biochim. Biophys. Acta 1063: 95 (1991), Alving y col. "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies," en Liposome Technology, 2ª Edición, Vol. III, Gregoriadis (ed.), Página 317 (CRC Press 1993), Wassef y col., Meth. Enzymol. 149: 124 (1987)). Según se ha señalado anteriormente, los liposomas terapéuticamente útiles pueden contener una variedad de componentes. Por ejemplo, los liposomas pueden comprender derivados de lípidos de poli(etilenglicol) (Allen y col., Biochim. Biophys. Acta 1150: 9 (1993)). [0295] Se han diseñado microesferas de polímeros degradables para mantener niveles sistémicos elevados de proteínas terapéuticas. Se preparan microesferas de polímeros degradables tales como poli(láctido-co-glicólido), polianhídridos, poli(ortoésteres), polímeros de acetato de etilvinilo no biodegradables, en los que las proteínas se atrapan en el polímero (Gombotz y Pettit, Bioconjugate Chem. 6: 332 (1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery," en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 51-93 (CRC Press 1995); Roskos y Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery," en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus y col., Science 281: 1161 (1998); Putney y Burke, Nature Biotechnology

16: 153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 548 (1998)). Se pueden proporcionar también vehículos de nanoesferas recubiertas con polietilenglicol (PEG) para la administración de proteínas terapéuticas (véase, por ejemplo, Gref y col., Pharm. Biotechnol. 10: 167 (1997)). [0296] La presente memoria descriptiva describe polipéptidos químicamente modificados que tienen actividad de unión a IL-22RA tal como receptores solubles monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos de IL-22RA, y antagonistas de IL-22RA, por ejemplo, anticuerpos contra IL-22RA o polipéptidos de unión, o anticuerpos neutralizantes contra IL-22RA, cuyo polipéptido se une con un polímero, según se ha discutido anteriormente. [0297] Las personas expertas en la técnica pueden concebir otras formas de dosificación, según se muestra, por ejemplo, en Ansel y Popovich, Pharmaceutical Dosage Formsand Drug Delivery Systems, 5ª Edición (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19ª Edición (Mack Publishing Company 1995), y en Ranade y Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996). [0298] La presente invención contempla composiciones de anticuerpos dirigidos contra IL-22, y los procedimientos y usos terapéuticos que comprenden un anticuerpo, según se define en las reivindicaciones. Dichas composiciones pueden comprender un vehículo El vehículo puede ser un vehículo orgánico u inorgánico convencional. Los ejemplos de vehículos incluyen agua, disolución salina, alcohol, propilenglicol, macrogol, aceite de sésamo, aceite de maíz, y similares.

11. PRODUCCIÓN DE RATONES TRANSGÉNICOS

[0299] Se demostró la expresión en exceso de IL-20 e IL-22 en lesiones psoriáticas humanas, sugiriendo que IL-20 e IL-22 están implicados en la psoriasis humana. Además, según se ha descrito en el presente documentos, la expresión, la expresión de IL-20 e IL-22 en ratones transgénicos demostró el engrosamiento epidérmico y la implicación de células inmunes indicativas de un fenotipo psoriático; y, adicionalmente, la inyección de IL-22 en ratones normales demostró el engrosamiento epidérmico y la implicación de células inmunes indicativas de un fenotipo psoriático que se suprimió mediante el antagonista del receptor soluble Zcytor16 (IL-22RA2). De tal manera, los datos in vivo sugieren además que IL-22 proinflamatorio está implicado en la psoriasis. Como tales, los antagonistas de la actividad de IL-22, tales como los anticuerpos neutralizantes y monoclonales dirigidos contra IL-22RA humana de la presente invención, así como los receptores solubles de IL-22RA, son útiles en el tratamiento terapéutico de las enfermedades inflamatorias, particularmente como antagonistas de IL-22 e IL-20 en el tratamiento de la psoriasis. Además, los agentes que se unen a, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan o neutralizan la actividad de IL-22 o de IL-20 e IL-22, tal como los anticuerpos neutralizantes y monoclonales dirigidos contra IL-22RA humana de la presente invención, así como los receptores solubles de IL-22RA, son útiles en el tratamiento terapéutico de diferentes enfermedades inflamatorias, por ejemplo, como antagonistas de IL-22 o de IL-20 e IL-22 en el tratamiento de la dermatitis atópica, la IBD, la colitis, la endotoxemia, la artritis, la artritis reumatoide, y la artritis psoriática y el estrés respiratorio (ARD), el choque séptico, la insuficiencia multiorgánica, la lesión inflamatoria del pulmón, tal como asma o bronquitis, la neumonía bacteriana, la psoriasis, el eczema, la dermatitis atópica y de contacto, y la enfermedad inflamatoria del intestino tal como la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn, y similares. [0300] Dentro de un aspecto, la presente memoria descriptiva describe un procedimiento para producir un anticuerpo de un polipéptido que comprende: inocular a un animal con un polipéptido seleccionado entre el grupo constituido por: (a) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº 3 desde el aminoácido número (19 (Pro), al aminoácido número 6 (Asp); (b) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº3 desde el aminoácido número 26 (Ser), al aminoácido número 32 (Pro); (c) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº3 desde el aminoácido número 41 (Lys), al aminoácido número 47 (Asp); (d) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº2 desde el aminoácido número 49 (Val), al aminoácido número 62 (Cys); (e) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº3 desde el aminoácido número 41 (Lys) al aminoácido número 62 (Cys); (f) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº3 desde el aminoácido número 84 (Ala) al aminoácido número 97 (Ser); (g) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº3 desde el aminoácido número 103 (Thr) al aminoácido número 108 (Asp); (h) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº3 desde el aminoácido número 130 (Arg) al aminoácido número 135 (His); (i) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº3 desde el aminoácido número 164 (Gly) al aminoácido número 166 (Lys); (j) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº3 desde el aminoácido número 175 (Tyr), al aminoácido número 179 (Glu); (k) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº3 desde el aminoácido número 193 (Lys) al aminoácido número 196 (Ala); (I) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº3 desde el aminoácido número 203 (Lys) al aminoácido número 209 (Thr); and (m) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº3; y (n) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº4; y en el que el polipéptido estimula una respuesta inmune en el animal para producir el anticuerpo; y aislando el anticuerpo del animal; y en el que el anticuerpo se une específicamente a un polipéptido de IL-22RA (SEC. DE ID Nº 2 o SEC. DE ID Nº 3; y reduce la actividad tanto de IL-20 (SEC. DE ID Nº 8) como de IL-22 (SEC. DE ID Nº 6). En una realización, el procedimiento es según se ha descrito anteriormente, en el que el anticuerpo producido mediante el procedimiento reduce la actividad proinflamatoria tanto de IL-20 (SEC. DE ID Nº 8) como de IL-22 (SEC. DE ID Nº 6). En otra realización, el procedimiento es según se ha descrito anteriormente, en el que el anticuerpo producido mediante el procedimiento neutraliza la interacción tanto de IL-20 (SEC. DE ID Nº 8) como de IL-22 (SEC. DE ID Nº 6) con IL-22RA (SEC. DE ID Nº 2). En otra realización, el procedimiento es según se ha descrito anteriormente, en el que se mide la neutralización mediante el anticuerpo mostrando la neutralización tanto de IL-20 (SEC. DE ID Nº 8) como de IL-22 (SEC. DE ID Nº 6) en un ensayo de neutralización in vitro basado en células. En otra realización, el procedimiento es según de ha descrito anteriormente, en el que el anticuerpo producido mediante el procedimiento reduce la actividad proinflamatoria de IL-20 (SEC. DE ID Nº 8) y de IL-22 (SEC. DE ID Nº 6). En otra realización, el procedimiento es según se ha descrito anteriormente, en el que el anticuerpo producido mediante el procedimiento neutraliza la interacción de IL-20 (SEC. DE ID Nº 8) e IL-22 (SEC. DE ID Nº 6) con IL-22RA (SEC. DE ID Nº 2). En otra realización, el procedimiento es según se ha descrito anteriormente, en el que se mide la neutralización mediante el anticuerpo mostrando la neutralización de IL-20 (SEC. DE ID Nº 8) e IL-22 (SEC. DE ID Nº 6) en un ensayo de neutralización in vitro basado en células. [0301] Dentro de otros aspectos, la presente invención proporciona un anticuerpo según se define en las reivindicaciones, que se une a un polipéptido de la SEC. DE ID Nº 2 o de la SEC. DE ID Nº 3. La memoria descriptiva describe un anticuerpo, en el que el anticuerpo es (a) un anticuerpo policlonal, (b) un anticuerpo monoclonal de murino, (c) un anticuerpo humanizado derivado de (b), (d) un fragmento de anticuerpo,

o € un anticuerpo monoclonal humano. En otra realización, el anticuerpo es según se define en las reivindicaciones, en el que el anticuerpo comprende además un radionucleido, enzima, sustratos, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, etiqueta peptídica, partícula magnética, o toxina. En otra realización, el anticuerpo es según se define en las reivindicaciones, en el que el anticuerpo comprende además la PEGilación. [0302] Dentro de otro aspecto la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo según se define en las reivindicaciones que se une a un polipéptido que comprende una secuencia de restos de aminoácidos según se muestra en la SEC. DE ID Nº 3; y reduce la actividad proinflamatoria tanto de IL-20 (SEC. DE ID Nº 8) como de IL-22 (SEC. DE ID Nº 6). En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es según se define en las reivindicaciones, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo reduce la actividad proinflamatoria de IL-20 (SEC. DE ID Nº 8) y de IL-22 (SEC. DE ID Nº 6). En otra realización, la memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, en el que o el fragmente de anticuerpo es (a) un anticuerpo policlonal, (b) un anticuerpo monoclonal de murino,

(c) un anticuerpo humanizado derivado de (b), (d) un fragmento de anticuerpo, o € un anticuerpo monoclonal humano. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es según se define anteriormente, en el que el anticuerpo comprende además un radionucleido, enzima, sustrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, etiqueta peptídica, partícula magnética, fármaco, o toxina. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es según se ha descrito anteriormente, en el que el anticuerpo comprende además la PEGilación. [0303] Dentro de otros aspecto, la presente memoria descriptiva describe un procedimiento para reducir o inhibir la proliferación o la diferenciación de células hematopoyéticas y de progenitores de células hematopoyéticas inducida por IL-22 e inducidas por IL-20, que comprende cultivar células de la médula ósea o de sangre periférica con una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo según se da a conocer en el presente documento, suficiente para reducir la proliferación o la diferenciación de las células hematopoyéticas en la medula ósea o en las células de la sangre periférica en comparación con las células de la médula ósea o de la sangre periférica cultivadas en ausencia del anticuerpo. En una realización, el procedimiento es según se ha descrito anteriormente, en el que las células hematopoyéticas y las células progenitoras hematopoyéticas son células linfoides. En otra realización, el procedimiento es según se ha descrito anteriormente, en el que las células linfoides son macrófagos. [0304] Dentro de otro aspecto, la presente memoria descriptiva describe un procedimiento para reducir la inflamación inducida por IL-22 o inducida por IL-20 que comprende administrar a un mamífero con inflamación una cantidad de una composición de un anticuerpo según se da a conocer en el presente documento, suficiente para reducir la inflamación. [0305] Dentro de otro aspecto, la presente memoria descriptiva describe un procedimiento para reducir o inhibir la proliferación o la diferenciación de células hematopoyéticas y de progenitores de células hematopoyéticas inducida por IL-22 e inducida por IL-20 que comprende cultivar células de médula ósea o de sangre periférica con una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo según se da a conocer en el presente documento, suficiente para reducir la proliferación o la diferenciación de las células hematopoyéticas en las células de médula ósea o de sangre periférica en comparación con las células de médula ósea o de sangre periférica cultivadas en ausencia del anticuerpo. En una realización, el procedimiento es según se ha descrito anteriormente, en el que las células hematopoyéticas y las células progenitoras hematopoyéticas son células linfoides. En otra realización, el procedimiento es según se ha descrito anteriormente, en el que las células linfoides son macrófagos o células T. [0306] Dentro de otro aspecto, la presente memoria descriptiva describe un procedimiento para reducir la inflamación inducida por IL-22 e inducida por IL-20 que comprende administrar a un mamífero con inflamación una cantidad de una composición de un anticuerpo según se da a conocer en el presente documento, suficiente para reducir la inflamación. [0307] Dentro de otro aspecto, la presente memoria descriptiva describe un procedimiento para reducir o inhibir la proliferación o la diferenciación de células hematopoyéticas y de progenitores de células hematopoyéticas inducida por IL-22 e inducida por IL-20 que comprende cultivar células de médula ósea o de sangre periférica con una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo según se da a conocer en el presente documento, suficiente para reducir la proliferación o la diferenciación de las células hematopoyéticas en las células de la médula ósea o de la sangre periférica en comparación con las células de médula ósea o de sangre periférica cultivadas en ausencia del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En otra realización, el procedimiento es según se ha descrito anteriormente, en el que las células hematopoyéticas y las células progenitoras hematopoyéticas son células linfoides. En otra realización, el procedimiento es según se ha descrito anteriormente, en el que las células linfoides son macrófagos o células T. [0308] Dentro de otro aspecto, la presente memoria descriptiva describe un procedimiento para reducir la inflamación inducida por IL-22 e inducida por IL-20 que comprende administrar a un mamífero con inflamación una cantidad de una composición de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo según se da a conocer en el presente documento, suficiente para reducir la inflamación. [0309] Dentro de otro aspecto, la presente memoria descriptiva describe un procedimiento para reducir o inhibir la proliferación o la diferenciación de células hematopoyéticas y de progenitores de células hematopoyéticas inducida por IL-22 e inducida por Il-20 que comprende cultivar células de médula ósea o de sangre periférica con una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo según se da a conocer en el presente documento, suficiente para reducir la proliferación o la diferenciación de las células hematopoyéticas en las células de la médula ósea o de la sangre periférica en comparación con las células de médula ósea o de sangre periférica cultivadas en ausencia del anticuerpo. En otra realización, el procedimiento es según se ha descrito anteriormente, en el que las células hematopoyéticas y las células progenitoras hematopoyéticas son células linfoides. En otra realización, el procedimiento es según se ha descrito anteriormente, en el que las células linfoides son macrófagos o células T.

[0310] Dentro de otro aspecto, la presente memoria descriptiva describe un procedimiento para reducir la inflamación inducida por IL-22 e inducida por IL-20 que comprende administrar a un mamífero con inflamación una cantidad de una composición de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo según se da a conocer en el presente documento, suficiente para reducir la inflamación. [0311] Dentro de otro aspecto, la presente memoria descriptiva describe un procedimiento para suprimir una respuesta inflamatoria en un mamífero con inflamación que comprende: (1) determinar un nivel de proteína A amiloide en suero;

(2) administrar una composición que comprende un anticuerpo según un anticuerpo o fragmento de anticuerpo descrito en el presente documento en un vehículo farmacéuticamente aceptable; (3) determinar un nivel de posterior administración de proteína A amiloide en suero; (4) comparar el nivel de proteína A amiloide en suero en la etapa (1) con el nivel de proteína A amiloide en la etapa (3), en el que una carencia de aumento o una disminución en el nivel de proteína A amiloide en suero es indicativa de la supresión de una respuesta inflamatoria. [0312] Dentro de otro aspecto, la presente memoria descriptiva, la presente memoria descriptiva describe un procedimiento para tratar a un mamífero que padece una enfermedad inflamatoria en la que IL-22 o IL-20 juega un papel, que comprende: administrar un antagonista de IL-22 o IL-20 a un mamífero de tal manera que se reduzca la inflamación, en el que el antagonista comprende (i) un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o polipéptido de unión que se une específicamente a un polipéptido o fragmento de polipéptido de IL-22RA (SEC. DE ID Nº 3) o (ii) un polipéptido o fragmento de polipéptido de IL-22RA (SEC. DE ID Nº 3; y en el que se reduce la actividad inflamatoria tanto de IL-22 (SEC. DE ID Nº 6) como de IL-20 (SEC. DE ID Nº 8). En una realización, el procedimiento es según se ha descrito anteriormente, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria crónica. En otra realización, el procedimiento es según se ha descrito anteriormente, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria crónica que comprende la enfermedad inflamatoria del intestino, la colitis ulcerosa, la enfermedad de Crohn, la artritis, la dermatitis atópica, o la psoriasis. En otra realización, el procedimiento es según se ha descrito anteriormente, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria aguda que comprende endotoxemia, septicemia, síndrome del choque tóxico, o enfermedad infecciosa. En otra realización, el procedimiento es según se ha descrito anteriormente, en el que el anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o polipéptido de unión comprende además un radionucleido, enzima, sustratos, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, etiqueta peptídica, partícula magnética, fármaco, o toxina. [0313] Dentro de otros aspecto, la presente memoria descriptiva describe un procedimiento para tratar un mamífero que padece una enfermedad inflamatoria en la que IL-22 e IL-20 juegan un papel, que comprende: administrar un antagonista de IL22 e IL-20 al mamífero de tal manera que se reduzca la inflamación, en el que el antagonista comprende (i) un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o polipéptido de unión que se une específicamente a un polipéptido o fragmento de polipéptido de IL22RA (SEC. DE ID Nº 3) o (ii) un polipéptido o fragmento de polipéptido de IL-22RA (SEC ID Nº 3); y en el que se reduce la actividad inflamatoria de IL-22 (SEC. DE ID Nº 6) y de IL-20 (SEC. DE ID Nº 8). En una realización, el procedimiento es según se ha descrito anteriormente, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria crónica. En otra realización, el procedimiento es según se ha descrito anteriormente, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria crónica que comprende la enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, dermatitis atópica, o psoriasis. En otra realización, el procedimiento es según se ha descrito anteriormente, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria aguda. En otra realización, el procedimiento es según se ha descrito anteriormente, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria aguda que comprende endotoxemia, septicemia, síndrome del choque tóxico o enfermedad infecciosa. En otra realización, el procedimiento es según se ha descrito anteriormente, en el que el anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o polipéptido de unión comprende además un radionucleido, enzima, sustrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, etiqueta peptídica, partícula magnética, fármaco, o toxina. [0314] Dentro de otro aspecto, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un epítopo antigénico de IL22RA humana (SEC. DE ID Nº 3) seleccionado entre el grupo constituido por: (a) un epítopo constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº3 desde el aminoácido número 1 (Pro), al aminoácido número 6 (Asp); (b) un epítopo constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº3 desde el aminoácido número 26 (Ser), al aminoácido número 32 (Pro); (c) un epítopo constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº3 desde el aminoácido número 41 (Lys), al aminoácido número 47 (Asp); (d) un epítopo constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº2 desde el aminoácido número 49 (Val), al aminoácido número 62 (Cys); (e) un epítopo constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº3 desde el aminoácido número 41 (Lys) al aminoácido número 62 (Cys); (f) un epítopo constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº3 desde el aminoácido número 84 (Ala) al aminoácido número 97 (Ser); (g) un epítopo constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº3 desde el aminoácido número 103 (Thr) al aminoácido número 108 (Asp); (h) un epítopo constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº3 desde el aminoácido número 130 (Arg) al aminoácido número 135 (His); (i) un epítopo constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº3 desde el aminoácido número 164 (Gly) al aminoácido número 166 (Lys); (j) un epítopo constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº3 desde el aminoácido número 175 (Tyr), al aminoácido número 179 (Glu); (k) un epítopo constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº3 desde el aminoácido número 193 (Lys) al aminoácido número 196 (Ala); (1) un epítopo constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº3 desde el aminoácido número 203 (Lys) al aminoácido número 209 (Thr); and (m) un epítopo constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº3; y (n) un epítopo constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID Nº4; y en el que el anticuerpo reduce o neutraliza la actividad tanto de IL-22 (SEC. DE ID Nº 6) como de IL-20 (SEC. DE ID Nº 8) humanos. En una realización, el anticuerpo es según se ha descrito anteriormente, en el que el anticuerpo reduce o neutraliza la actividad de IL-22 (SEC. DE ID Nº 6) e IL-20 (SEC. DE ID Nº 8) humanos. En otra realización, el anticuerpo es según se ha descrito anteriormente, en el que el anticuerpo se selecciona entre el grupo constituido por: (a) un anticuerpo monoclonal de murino, (b) un anticuerpo humanizado derivado de (a),

(c) un fragmento de anticuerpo, y (d) un anticuerpo monoclonal humano. En otra realización, el anticuerpo es según se ha descrito anteriormente, en el que el anticuerpo comprende además la PEGilación. [0315] Dentro de otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo según se define en las reivindicaciones, para tratar una dolencia patológica en un mamífero asociada con la actividad de IL22RA, tratando por tanto dicha dolencia patológica, en la que dicha dolencia patológica es una enfermedad inflamatoria. Dicha dolencia patológica puede ser una dolencia inflamatoria crónica. En otra realización, dicha dolencia inflamatoria crónica es una enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, artritis, dermatitis atópica, o psoriasis. En otra realización, la dolencia es endotoxemia, septicemia, síndrome del choque tóxico, o enfermedad infecciosa.

[0316] La presente invención proporciona de esta manera el uso de un anticuerpo

o fragmento de unión a antígeno del mismo, según se define en las reivindicaciones, para la fabricación de un medicamento para tratar un mamífero que padece una enfermedad inflamatoria en la que IL-22RA juega un papel, de tal manera que se reduzca la inflamación, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une específicamente a un polipéptido o fragmento de polipéptido de IL-22RA (SEC. DE ID Nº 3); y en el que se reduce la actividad inflamatoria. En una realización, el uso es según se ha descrito anteriormente, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria crónica. En otra realización, el uso es según se ha descrito anteriormente, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria crónica que comprende la enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, artritis, dermatitis atópica o psoriasis. En otra realización, el uso es según se ha descrito anteriormente; en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria aguda. En otra realización, el uso es según se ha descrito anteriormente, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria aguda que comprende endotoxemia, septicemia, síndrome del choque tóxico o enfermedad infecciosa. En otra realización, el uso es según se ha descrito anteriormente, en el que el anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o polipéptido de unión comprende además un radionucleido, enzima, sustrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, etiqueta peptídica, partícula magnética, fármaco, o toxina. En otra realización, el uso es según se ha descrito anteriormente, en el que el anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o polipéptido de unión comprende además la PEGilación. [0317] Dentro de otro aspecto, la presente memoria descriptiva describe un procedimiento para reducir la inflamación, que comprende administrar a un mamífero con inflamación una cantidad de una composición de un anticuerpo según se da a conocer en el presente documento, suficiente para reducir la inflamación. [0318] La invención se ilustra además por los siguientes ejemplos no limitantes. EJEMPLO 1 PURIFICACIÓN DEL POLIPÉPTIDO IL-22RA2-Fc4 A PARTIR DE CÉLULAS BHK 570 TRANSFECTADAS [0319] A no ser que se señale otra cosa, todas las operaciones se llevaron a cabo a 4º C. Se usó el siguiente procedimiento para purificar el polipéptido de IL-22RA2 (polipéptido del receptor soluble maduro de los restos 23 a 231 de la SEC. DE ID Nº 13; polinucleótidos según se muestran en la SEC. DE ID Nº 12) que contenía la condensación C terminal con la Fc4 humana (SEC. DE ID Nº 14) designada IL22RA2-Fc4. Se filtraron aproximadamente 16.500 ml de los medios acondicionados procedentes de células BHK 570 transfectadas con IL-22RA2-Fc4 a través de un filtro esterilizante de 0,2 µm y a continuación se suplementaron con una disolución de inhibidores de la proteasa, hasta concentraciones finales de leupeptina 0,001 mM (Boerhinger-Mannheim, Indianápolis, IN), pepstatina 0,001 mM (Boerhinger-Mannheim) y Pefabloc 0,4 mM (Boerhinger-Mannheim). Se empaquetó una columna A50 de proteína Poros A (20 ml de volumen de lecho, Applied Biosystems) y se lavó con 400 ml de PBS (Gibco/BRL), Se pasaron los medios acondicionados sobre la columna con un caudal de 15 ml/minuto, seguido por lavado con 800 ml de PBS (BRL/Gibco). Se eluyó la IL-22RA2-Fc4 a partir de la columna con Glicina 0,1 M, pH 3,0, y se recogieron fracciones de 5 ml directamente en 0,5 ml de Tris 2 M pH 7,8, para ajustar el pH final a 7,4 en las fracciones. [0320] Se caracterizó el rendimiento de la columna mediante transferencia western reduciendo los geles SDS-PAGE de los medios de partida y se pasaron a través de la columna. La transferencia western usó el anticuerpo dirigido contra IgG HRP humana (Amersham), que mostró una proteína inmunoreactiva a 60.000 Da en los medios de partida, sin nada a su paso, sugiriendo la captura completa. Las fracciones eluídas de la proteína A50 se caracterizaron reduciendo el gel SDS PAGE. Este gel mostró una banda intensamente teñida con Coomasie a 60.000 Da en las fracciones 3 a 11. Se combinaron las fracciones 3 a 11. [0321] Se concentró el combinado de elución de la proteína A50 desde 44 ml a 4 ml usando un concentrador de centrífuga Ultrafree Biomax de 30.000 Da (15 ml de volumen, Millipore). Se lavó una columna de filtración de gel Sefacril S-300 (volumen de lecho de 175 ml; Pharmacia) con 350 ml de PBS (BRL/Gibco). Se inyectó el combinado concentrado sobre la columna con un caudal de 1,5 ml/min, seguido por lavado con 225 ml de PBS (BRL/Gibco). Se recogieron los picos eluidos en fracciones de 2 ml. [0322] Se caracterizaron las fracciones eluidas reduciendo y sin reducir los geles SDS PAGE teñidos con plata (Geno, Technology). La reducción de los geles SDS PAGE teñidos con plata mostró una banda intensamente teñida 160.000 Da en las fracciones 14-31, mientras que los geles SDS PAGE teñidos con plata sin reducción mostraron una banda intensamente teñida a 160.000 Da en las fracciones 14-31. Las fracciones 1-13 mostraron muchas bandas de diversos tamaños. Se combinaron las fracciones 14-31, se concentraron a 22 ml usando un concentrador de centrífuga Ultrafree Biomax de 30.000 Da (15 ml de volumen, Millipore). Se filtró este concentrado a través de un filtro esterilizante Acrodisc de 0,2 µm (Pall Corporation). [0323] Se llevó a cabo la concentración de la proteína de las fracciones combinadas concentradas mediante el análisis BCA (Pierce, Rockford, IL) y se distribuyó en alícuotas el material, y se almacenó a -80º C según los procedimientos normalizados de los inventores. La concentración de las fracciones combinadas fue de 1,50 mg/l.

EJEMPLO 2 CONSTRUCCIÓN DE CÉLULAS BaF3 QUE EXPRESAN EL RECEPTOR DE CRF2-4 (CÉLULAS BaF3/CRF2-4) Y DE CÉLULAS BaF3 QUE EXPRESAN EL RECEPTOR DE CRF2-4 CON EL RECEPTOR DE IL-22RA (CÉLULAS BaF3/CRF2-4/IL-22RA) [0324] Se construyeron células BaF3 que expresaban el receptor de CFR2-4 de longitud completa, usando 30 µg de un vector de expresión de CFR2-4, descrito a continuación. Se designaron las células BaF3 que expresaban el receptor de CFR2-4 como BaF3/CFR2-4. Se usaron estas células como control, y se transfectaron adicionalmente con el receptor IL-22RA de longitud completa (Patente de los Estados Unidos Nº 5.965.704) y se usaron para construir un cribado de la actividad de IL-22 según se describe a continuación.

A. CONSTRUCCIÓN DE CÉLULAS QUE EXPRESAN EL RECEPTOR DE CRF2-4 [0325] Se aisló la secuencia del ADNc de longitud completa de CRF2-4 (Nº de Acceso Genbank Nº Z17227) de una biblioteca de ADNc de líneas de células Daudi, y a continuación se clonó en un vector de expresión pZP7P. [0326] BaF3, una línea celular prelinfoide dependiente de interleucina-3 (IL-3) derivada de médula ósea de murino (Palacios y Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot y col., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986), se mantuvo en medios completos (JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS) suplementados con suero de ternera fetal inactivado térmicamente al 10 %, 2 ng/ml de IL-3 de murino (mIL-3) (R & D, Minneapolis, MN), L-glutaMax-1™ 2 mM (Gibco BRL), Piruvato de sodio 1 mM (Gibco, BRL), y antibióticos PSN (GIBCO BRL). Antes de la electroporación, se preparó CRF2-4/pZP7P y se purificó usando un kit Maxi Prep de Qiagen (Qiagen) según las instrucciones del fabricante: Para la electroporación, se lavaron una vez las células BaF3 en medios RPMI libres de suero y a continuación se volvieron a suspender en medios RPMI libres de suero a una densidad celular de 107 células/ml. Se mezcló un ml de células BaF3 vueltas a suspender con 30 µg del ADN del plásmido CRF2-4/p2ZP7P y se transfirió a cámaras de electroporación desechables separadas (GIBCO BRL). Tras una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente se proporcionaron a las células dos choques en serie (800 IFad/300 V.; 1180 IFad/300 V.) administrados mediante un equipo de electroporación (CELL-PORATOR™; GIBCO BRL). Tras un tiempo de recuperación de 5 minutos, se transfirieron las células electroporadas a 50 ml de medios completos y se colocaron en una estufa de incubación durante 15-24 horas (37º C, CO2 al 5 %). Se agitaron las células y se volvieron a suspender en 50 ml de medios completos que contenían 2 µg/ml de puromicina en un matraz T-162 para aislar el combinado resistente a la puromicina. Se evaluaron los combinados de las células BaF3 transfectadas, denominados a partir de ahora en el presente documento células BaF3/CRF2-4, para la capacidad de señalización según se describe a continuación. Además, se transfectaron estas células adicionalmente con el receptor IL-22RA según se describe a continuación.

B. CONSTRUCCIÓN DE CÉLULAS BaF3 QUE EXPRESAN LOS RECEPTORES DE CRF2-4 E IL-22RA. [0327] Se construyeron células BaF3/CRF2-4 que expresaban el receptor IL22RA de longitud completa según lo anterior, usando 30 µg de un vector de expresión de IL-22RA. Tras la recuperación, se seleccionaron los transfectantes usando 200 µg/ml de zeocina y 2 µg/ml de puromicina. La células BaF3/CRF2-4 que expresaban el receptor IL-22RA se designaron como células BaF3/CRF2/IL-22RA. Se usaron estas células para cribar la actividad de IL-22 así como la actividad del antagonista de IL-22RA2 descrito en el presente documento.

EJEMPLO 3 CRIBADO DE LA ACTIVIDAD DEL ANTAGONISTA DE IL-22 USANDO CÉLULAS BaF3/CRF2-4/IL-22RA USANDO UN ENSAYO DE PROLIFERACIÓN ALAMAR BLUE A CRIBADO DE LA ACTIVIDAD DE IL-22 USANDO CÉLULAS BaF3/CRF24/IL-22RA USANDO UN ENSAYO DE PROLIFERACIÓN ALAMAR BLUE [0328] Se usaron células IL-22-CEE purificadas (Ejemplo 4) para ensayar la presencia de actividad de proliferación según se describe a continuación. Se usó IL22RA2-Fc4 humano (Ejemplo 1) para antagonizar la respuesta proliferativa de IL-22 en este ensayo, según se describe a continuación. [0329] Se agitaron células BaF3/CRF2-4/IL-22-RA y se lavaron en medios completos, (medio RPMI (JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS) suplementados con suero de ternera fetal térmicamente inactivado al 10 %, 2 ng/ml de Il-3 de murino (mIL-3) (R & D, Minneapolis, MN), L-glutaMax-1™ 2 mM (Gibco BRL), Piruvato de sodio 1 mM (Gibco BRL), y antibióticos PSN (GIBCO BRL)), pero sin mIL-3 (referido en el presente documento como “medio libre de mIL-3”). Se agitaron las células y se lavaron 3 veces para asegurar la eliminación del mIl-3: Se contaron las células en un hemacitómetro. Se plaquearon las células en un formato de 96 pocillos a 5000 células por pocillo en un volumen de 100 µl por pocillo usando los medios libres de mIL-3. [0330] Se evaluó la proliferación de las células BaF3/CRF2-4/IL-22RA usando la proteína IL-22-CEE diluida con medios libres de mIL-3 a concentraciones de 50, 10, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,13, 0,06 ng/ml. Se añadieron 100 µl de la proteína diluida a las células BaF3/CRF2-4/IL-22RA. El volumen total del ensayo es de 200 µl. se incubaron las placas de ensayo a 37º C, CO2 al 5 % durante 3 días en cuyo momento, se añadió Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) a 20 µl/pocillo. Se incubaron de nuevo las placas a 37º C, CO2 al 5 % durante 24 horas. Alamar Blue proporciona una lectura de salida basada en el número de células vivas, y es de esta manera una medida directa de la proliferación celular en comparación con un control negativo. Se incubaron de nuevo las placas a 37º C, CO2 al 5 % durante 24 horas. Se leyeron las placas en el lector de placas FmaxTM (Molecular Devices Sunnyvale, CA) usando el programa SoftMax™ Pro, a longitudes de onda de 544 (Excitación) y 590 (Emisión). Los resultados confirmaron la respuesta proliferativa dependiente de la dosis de las células BaF3/CRF2-4/IL-22RA con IL-22-CEE. La respuesta, según se midió, fue aproximadamente de 15 veces sobre el fondo en el extremo superior de 50 ng/ml bajando a una inducción de 2 veces en el extremo inferior de 0,06 ng/ml. Las células naturales BaF3, y las células BaF3/CRF2-4 no proliferan en respuesta a IL-22-CEE mostrando que IL-22 es específico del receptor heterodimérico de CRF2-4/IL-22RA. Con el fin de determinar si IL-22RA2 es capaz de antagonizar la actividad de IL-22, se repitió el ensayo descrito anteriormente usando IL-22RA2/Fc4 soluble purificado. Cuando se combinó IL-22 con IL-22RA2 a 10 µg/ml, la respuesta a IL-22 a todas las concentraciones descendió hasta el fondo. Que la presencia de IL-22RA2 soluble suprima los efectos proliferativos de IL-22 demuestra que es un potente antagonista del ligando Il-22. Se puede usar este ensayo para ensayar otros antagonistas de la actividad de IL-22 descrita en el presente documento, tal como los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA.

EJEMPLO 4 PURIFICACIÓN DE IL-22-CEE A PARTIR DE CÉLULAS BHK 570

[0331] A no ser que se señale otra cosa, todas las operaciones se llevaron a cabo a 4º C. Se usó el siguiente procedimiento para purificar el polipéptido de IL-22 que contenía la etiqueta GluGlu C terminal (EE) (SEC. DE ID Nº 15; o SEC DE ID Nº 16) Se concentraron los medios acondicionados procedentes de células BHK que expresaban IL-22-CEE con un cartucho espiral Amicon S10Y3 en un ProFlux A30. Se añadió una disolución inhibidora de la proteasa a los medios acondicionados concentrados hasta concentraciones finales de ácido etilendiaminotetraacético 2,5 mM (EDTA, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO),, leupeptina 0,003 mM (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN), pepstatina 0,001 mM (Boehringer-Mannheim) y Pefabloc 0,4 mM (Boehringer-Mannheim). Se retiraron las muestras para el análisis y se congeló todo el volumen a -80º C hasta que se inició la purificación. Se determinaron las concentraciones totales de la proteína diana de los medios acondicionados concentrados mediante SDS-PAGE y análisis de transferencia Western con el anticuerpo conjugado dirigido contra EE HRP. [0332] Se vertió una columna de aproximadamente 100 ml de G-Sefarosa dirigida contra EE (preparada según se describe a continuación) en una columna de vidrio de 5 cm x 10 cm AP-5 de Waters. Se hizo fluir la columna empaquetada y se equilibró en un BioCad Sprint (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) con disolución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4. Se descongelaron los medios acondicionados concentrados, con un filtro estéril de 0,2 micrómetros, se ajustó el pH a 7,4, a continuación se introdujo en la columna durante la noche con un caudal de aproximadamente 1 ml/minuto. Se lavó la columna con 10 volúmenes de columna

(CV) de disolución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4), a continuación se eluyó el tapón con 200 ml de PBS (pH 6,0) que contenía 0,5 mg/ml de péptido EE (Anaspec, San Jose, CA) a 5 ml/minuto. El péptido EE usado tiene la secuencia EYMPME (SEC. DE ID Nº 15). Se lavó la columna durante 10 CV con PBS, a continuación se eluyó con 5 CV de glicina 0,2 M, pH 3,0. Se ajustó el pH de la columna eluída con glicina a 7,0 con 2 CV de 5 x PBS, a continuación se equilibró en PBS (pH 7,4). Se recogieron fracciones de 5 ml durante la cromatografía de elución completa y se vigiló la absorbancia a 280 y 215 nm; se guardaron también el flujo pistón y las combinaciones de lavado y se analizaron. Se analizaron las fracciones de los picos de elución del polipéptido EE para la proteína diana mediante tinción de plata de SDS-PAGE y Transferencia Western con el anticuerpo conjugado contra EE HRP. Se combinaron las fracciones de elución del polipéptido de interés desde 60 ml a 5,0 ml usando un concentrador giratorio con una membrana con un corte de pesos moleculares de 10.000 Dalton (Millipore, Bedford, MA) según las instrucciones del fabricante. [0333] Para separar IL-22-CEE de otras proteínas de purificación simultánea, se sometieron las fracciones combinadas de elución del polipéptido concentrado a una POROS HQ-50 (resina de fuerte intercambio aniónico de PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) a pH 8,0 Se vertió una columna de 1,0 x 6,0 cm y se empaque el flujo en un BioCad Sprint. Se cargó la columna de contraiones, a continuación se equilibró en TRIS 20 mM pH 8,0 (Hidroximetil Aminometano). Se diluyó la muestra

1:13 (para reducir la fuerza iónica de la PBS) a continuación se introdujo en la columna Poros HQ a 5 ml/minuto. Se lavó la columna durante 10 CV con Tris 20 mM pH 8,0, a continuación se eluyó con un gradiente 40 CV de Tris 20 mM/cloruro de sodio 1 M (NaCl) a 10 ml/minuto. Se recogieron fracciones de 1,5 ml durante la cromatografía completa y se vigiló la absorbancia a 280 y 215 nM. Se analizaron las fracciones de los picos de elución mediante la tinción de plata de SDS-PAGE. Se combinaron las fracciones de interés y se concentraron a 1,5-2 ml usando un concentrador giratorio con una membrana con un corte de pesos moleculares de 10.000 Dalton (Millipore, Bedford, MA) según las instrucciones del fabricante. [0334] Para separar el polipéptido IL-22-CEE del péptido EE libre y cualquier proteína de purificación simultánea contaminante, se sometieron las fracciones concentradas combinadas a la cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Sephadex S200 de 1,5 x 90 cm (Pharmacia, Piscataway, NJ) equilibrada y cargada en PBS a un caudal de 1,0 ml/min usando un BioCad Sprint. Se recogieron fracciones de 1,5 ml a lo largo de la cromatografía completa y se vigiló la absorbancia a 280 y 215 nM. Se caracterizaron las fracciones de los picos mediante la tinción de plata de SDSPAGE, y únicamente se combinaron las fracciones más puras. Este material representó el polipéptido IL-22-CEE purificado. [0335] Este material purificado se sometió finalmente a una columna ActiClean Etox de 4 ml (Sterogene) para eliminar cualquier endotoxina restante. Se pasó la muestra sobre la columna de gravedad equilibrada con PBS cuatro veces, y a continuación se lavó la columna con un volumen único de 3 ml de PBS, que se combinó con la muestra “limpia”. A continuación se filtro el material con un filtro estéril de 0,2 micrómetros y se almacenó a -80º C hasta que se distribuyó en alícuotas. [0336] En la transferencia Western, se tiñeron los geles SDS-PAGE de Azul y Plata de Coomasie, el polipéptido de IL-22-CEE tenía una banda principal. Se llevó a cabo la concentración de la proteína del material purificado mediante el análisis BCA (Pierce, Rockford, IL) y se distribuyó la proteína en alícuotas, y se almacenó a -80º C según los procedimientos normalizados. [0337] Para preparar Sefarosa contra EE, se lavó tres veces un volumen de lecho de 100 ml de proteína G-Sefarosa (Pharmacia, Piscataway, NJ) con 100 ml de PBS que contenía azida de sodio al 0,02 % usando una unidad de filtro Nalgene de 0,45 micrómetros de 500 ml. Se lavó el gel con 6,0 volúmenes de trietanolamina 200 mM, pH 8,2 (TEA, Sigma, St. Louis, MO), y se añadió un volumen igual de disolución de anticuerpo de EE que contenía 900 mg de anticuerpo. Tras una incubación durante la noche a 4º C, se retiró el anticuerpo no unido lavando la resina con 5 volúmenes de TEA 200 mM según se ha descrito anteriormente. Se volvió a suspender la resina en 2 volúmenes de TEA, transferida en un contenedor adecuado, y se añadió dimetilpimilidato-2HCl (Pierce, Rockford, IL) disuelto en TEA a una concentración final de 36 mg/ml de gel de proteína G-Sefarosa. Se agitó el gel a temperatura ambiente durante 45 min y se eliminó el líquido usando la unidad de filtro según se ha descrito anteriormente. A continuación se bloquearon los emplazamientos no específicos del gel incubando durante 10 min. a temperatura ambiente con 5 volúmenes de etanolamina en TEA 200 mM. A continuación se lavó el gel con 5 volúmenes de PBS que contenían azida de sodio al 0,02 % y se almacenaron en esta disolución a 4º C.

EJEMPLO 5 EFECTOS IN VIVO DEL POLIPÉPTIDO DE IL-22 [0338] Se dividieron ratones (hembras, C57BL/6N, 8 semanas de edad; Charles River Labs, Kingston, NY) en tres grupos. Se preparó previamente un adenovirus que expresaba un polipéptido de IL-22 (SEC. DE ID Nº 6) usando los procedimientos normalizados. En el día 0, se administró adenovirus parental o de IL-22 al primer (n=8) y segundo (n=8) grupos, respectivamente, mediante la vena de la cola, recibiendo cada ratón una dosis de ~1 x 1011 partículas en ~0,1 ml de volumen. El tercer grupo (n=8) no recibió tratamiento, En los días 12, se pesaron os ratones y se extrajo sangre de los ratones. Se analizaron las muestras para el recuento de la sangre completa (CBC) y la química del suero. Se detectaron los recuentos de las elevaciones estadísticamente significativas en neutrófilos y plaquetas en las muestras de sangre del grupo administrado con adenovirus de IL-22 con respecto al grupo tratado con adenovirus parental. También, los recuentos de linfocitos y de glóbulos rojos fueron significativamente reducidos a partir del grupo administrado con adenovirus de IL-22 con respecto al grupo tratado con adenovirus parental. Adicionalmente, disminuyó el peso corporal de los ratones tratados con adenovirus de IL-22, mientras que los ratones tratados con adenovirus parental ganaron peso. También aumentó el nivel de IL-22 en suero y disminuyó el nivel de glucosa en el día 3. En resumen, los ratones tratados con adenovirus de IL-22 mostraron una respuesta en la fase aguda que se puede iniciar también por otras citocinas inflamatorias tales como las citocinas TNF-alfa, IL-1beta, y gp130 la respuesta en la fase aguda es el conjunto de respuestas inflamatorias inmediatas iniciado por las moléculas de reconocimiento del modelo. Las proteínas de la fase aguda proporcionan una protección potenciada contra los microorganismos y modifican las respuestas inflamatorias mediante los efectos del tráfico de células y la liberación del mediador. Por ejemplo, SAA tiene una potente función de activación de los leucocitos que incluye la inducción de la quimiotaxis, la potenciación de la adhesión de los leucocitos a las células endoteliales, y un aumento de la fagocitosis. La comprensión de los factores que inician y alteran la magnitud y la duración de la respuesta en la fase aguda representa una importante etapa en el desarrollo de nuevas terapias para las enfermedades infecciosas e inflamatorias. [0339] Los resultados sugirieron que IL-22 afecta la hematopoyesis, es decir, la formación de células de la sangre in vivo. . Como tal, IL-22 podría tener actividades biológicas que afectan diferentes hemocitoblastos, dando como resultado d3e esta manera un aumento o una disminución de algunas células de la sangre diferenciadas en un linaje específico. Por ejemplo, IL-22 parece reducir los linfocitos, lo que es probablemente debido alainhibición de las células progenitoras comprometidas que proporcionan un incremento de las células linfoides. IL-22 disminuye también los glóbulos rojos, apoyando la noción de que IL-22 podría jugar un papel en la anemia, infección, inflamación, y/o las enfermedades inmunes influenciando las células de la sangre implicadas en este proceso. Podrían usarse antagonistas de IL-22 o su receptor soluble de IL-22RA2, como reactivos terapéuticos en estas enfermedades. [0340] Además, estos experimentos usando adenovirus de IL-22 en ratones sugieren que la expresión en exceso de IL-22 aumenta el nivel de neutrófilos y plaquetas in vivo. Es concebible que existen otros factores (tales como citocinas y genes modificadores) implicados en las respuestas de IL-22 en el sistema animal completo. Sin embargo, estos datos apoyan fuertemente la implicación de IL-22 en la hematopoyesis. De esta manera, IL-22 y sus receptores son reactivos/dianas adecuados para el diagnóstico y el tratamiento en una variedad de trastornos, tales como inflamación, trastornos inmunes, infección, anemia, cánceres hematopoyéticos y otros, y similares.

EJEMPLO 6 RATONES TRANSGÉNICOS QUE EXPRESAN IL-22

A. GENERACIÓN DE RATONES TRANSGÉNICOS QUE EXPRESAN IL-22 DE RATÓN [0341] Se prepararon fragmentos de ADN de un vector transgénico que contenía las secuencias que flanquean 5’ y 3’ del promotor EµLCK linfoide específico , IL-22 de ratón (SEC. DE ID Nº 10; polipéptido que se muestra en la SEC. DE ID Nº 11), el intrón II de la insulina de rata, ADNc de IL-22 y la secuencia poli A de la hormona de crecimiento humana usando los procedimientos normalizados, y se usaron para microinyección en oocitos de murino B6C3f1 fertilizados (Taconic, Germantown, NY), usando el protocolo de inyección normalizado. Véase, Hogan, B. y col., Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994. [0342] Se identificaron veinticinco ratones transgénicos de IL-22 de ratón con el promotor EµLCK linfoide específico entre 154 crías. Once de las crías transgénicas murieron en las horas del alumbramiento, 9 de las crías transgénicas con apariencia brillante se sometieron a necropsia el día del alumbramiento, y 2 crecieron hasta la edad adulta. Los niveles de expresión fueron bajos en un animal adulto. Se prepararon los tejidos de las crías sometidas a necropsia y se examinaron histológicamente según se describe a continuación. [0343] La apariencia brillante de las crías neonatas pareció estar asociada con un agarrotamiento de la piel, según se iban secando, dando como resultado una reducción de la lactancia apropiada. Sus movimientos llegaron a agarrotarse en general.

B. ANÁLISIS GENOTÍPICO Y DE EXPRESIÓN DE RATONES

TRANSGÉNICOS [0344] De la línea transgénica de IL-22 de ratón impulsada por el promotor EµLck, descrita anteriormente, se observaron las crías recién nacidas para las anormalidades en el día uno (día del alumbramiento) y se sacrificaron para la recogida de tejidos. Se proporcionó a todas las crías un único número de etiqueta en la oreja, y se anotaron las designadas como teniendo un fenotipo de piel brillante en el momento del sacrificio. De las doce crías, se observó que seis tenían el fenotipo de piel brillante, con dos fenotipos designados como “comprometidos”. Se definieron los fenotipos graves como crías pequeñas con poca movilidad cuya piel era especialmente brillante y muy seca. Se recogió la piel del lado lateral izquierdo de cada cría, y se congelo en medio de inclusión Tissue-Tek.

[0345] La genotipación confirmó que la piel brillante era un buen indicador del estado transgénico, aunque no se recogieran los datos de expresión. Se seccionaron los bloques de piel congelada de 7 micrómetros en un criostato y se tiñeron para observar la presencia de CD3, CD4, CD8, macrófagos de ratón, células B, CD80 y MHC de tipo

II. El protocolo de tinción implicó la unión de anticuerpos comercialmente disponibles al tejido, la detección con anticuerpo secundario marcado con peroxidasa, y la reacción del cromógeno DAB para visualizar la tinción. [0346] Se encontró que eran más los animales transgénicos en MHC de tipo II y CD80, que se tiñeron para las células que presentaban antígeno y las células dendríticas respectivamente. El marcador de macrófagos detectó también más células en los animales transgénicos comprometidos y no comprometidos que en los animales naturales, aunque la distribución de estas células estuvo muy localizada en la dermis superior. Los animales clasificados como fenotipos comprometidos tuvieron tinción más robusta con los tres tipos de estos marcadores, mostrando un drástico aumento en la intensidad y número de células cuando se compararon con el tipo natural. Esta variabilidad puede ser debida a una diferencia en el nivel de expresión de IL-22 en estas crías precursoras transgénicas. Las células MHC positivas de tipo II se localizaron en la dermis inferior dispuestas en agrupaciones con amplia abertura, mientras que las células CD80 positivas estuvieron predominantemente por debajo de la dermis tanto en como justamente por encima del músculo/capa de grasa. Estas dos poblaciones celulares no parecen solaparse. Todos los otros marcadores fueron de tinción equivalente en todos los animales. La tinción de los mastocitos con azul de toluidina desveló ligeras a sin diferencias entre los animales naturales y transgénicos.

C. EVALUACIÓN MICROSCÓPICA DE TEJIDOS DE RATONES

TRANSGÉNICOS: IL-22 CON EL PROMOTOR EµLck TIENE UNA HISTOLOGÍA NEONATAL LETAL [0347] En el día del alumbramiento, las crías de las camadas que contenían IL-22 transgénicos se sometieron a eutanasia de manera humana y se fijó por inmersión el cuerpo completo en formalina tamponada al 10 %. Seis crías transgénicas y dos no transgénicas se sometieron a estudio médico completo. Se señaló que cuatro de las seis crías transgénicas tenían piel brillante en el momento de la eutanasia. Los tejidos fijados se cortaron en 5 secciones (sección longitudinal de la cabeza y secciones transversales del tórax superior e inferior y abdomen superior e inferior). Se incluyeron los tejidos en parafina, se procesaron rutinariamente, se seccionaron a 5 µm (Jung 2065 microtomo Supercut, Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) y se tiñeron con H&E. Se evaluaron los tejidos teñidos bajo un microscopio óptico (Nikon Eclipse E600, Nikon Inc., Melville, NY) por un patólogo veterinario legalmente certificado (ACVP). [0348] En el examen microscópico, se observó la epidermis de dos de las crías

5 transgénicas por ser más gruesa que la epidermis de los otros seis ratones, incluyendo los controles. No se señalaron otras anormalidades en la piel y otros tejidos de cualquiera de los ratones. Las áreas representativas de la piel de las correspondientes regiones del tórax y del abdomen se sometieron a diagnóstico por imagen con lentes con un objetivo de 40X y con una cámara digital CoolSnap (Roper Scientific, Inc., San

10 Diego, CA) que se conectó al microscopio. A continuación se determinó el grosor de la epidermis usando software de histomorfometría (Scion Image para Windows (NIH Image), Scion Corp., Frederick, MD, v. B4.0.2). Los resultados que se muestran en la Tabla 5 fueron como sigue: Tabla 5

Genotipo/fenotipo

Promedio del grosor de la piel torácica (µm) Promedio del grosor de la piel abdominal (µm)

No transgénico/normal

5,2 5,4

Transgénico/no brillante

5,0 6,7

Transgénico/brillante

8,2 7,4

Transgénico/todo

7,1 7,1

15 [0349] Fueron insuficientes los números de ratones para determinar la significancia estadística; sin embargo, los transgénicos, especialmente aquellos con piel brillante, tendieron a tener la epidermis más gruesa que los transgénicos no brillantes y los controles no transgénicos. Los transgénicos brillantes pueden tener un nivel de expresión mayor de IL-22 que los transgénicos no brillantes; sin embargo, no

20 se determinaron los niveles de expresión de estos ratones. Esto sugirió un papel de IL22 en la psoriasis, la artritis psoriática u otras dolencias inflamatorias de la piel u otras enfermedades inflamatorias. EJEMPLO 7 AFECCIONES IN VIVO DEL POLIPÉPTIDO DE IL-22

25 A. RATONES INFECTADOS CON ADENOVIRUS DE IL-22 MUESTRAN LA INDUCCIÓN DE SAA [0350] Se dividieron los ratones (hembras, C57BL/6N, 8 semanas de edad; Charles River Labs, Kingston, NY) en tres grupos. Se preparó previamente un adenovirus que expresaba un polipéptido de IL-22 (SEC. DE ID Nº 6) usando los procedimientos normalizados. En el día 0, se administró adenovirus parental o de IL22 al primer (n=8) y segundo (n=8) grupos, respectivamente, mediante la vena de la cola, recibiendo cada ratón una dosis de ~1 x 1011 partículas en un volumen de ~0,1 ml. El tercer grupo (n=8) no recibió tratamiento. En el día 12, se pesaron los ratones y se extrajo sangre de los ratones. En el día 20 del estudio, se sacrificaron los ratones, se registró el peso corporal, y se recogieron las muestras y tejidos para el análisis. [0351] Se analizaron todas las muestras de sangre para el recuento de la sangre completa (CBC) y la química del suero. En el día 12 y 20, se detectaron elevaciones estadísticamente significativas en los recuentos de neutrófilos y plaquetas en las muestras de sangre procedentes del grupo administrado con el adenovirus de IL-22 con respecto al grupo tratado con el adenovirus parental. También, los recuentos de linfocitos se redujeron significativamente a partir del grupo administrado con adenovirus de IL-22 con respecto al grupo tratado con adenovirus parental en el día 12, pero en el día 20 se observaron efectos opuestos. Adicionalmente, disminuyó el peso corporal de los ratones tratados con adenovirus de IL-22, mientras que los ratones tratados con adenovirus parental ganaron peso. Se redujo significativamente la glucosa en ambos puntos temporales en las muestra de sueros del grupo tratado con adenovirus de IL-22 con respecto al grupo tratado con adenovirus parental. También se redujo significativamente la albúmina en suero en ambos puntos temporales. Se redujeron significativamente los niveles de nitrógeno de la urea en sangre en el día 20. Aumentaron significativamente los niveles de globulina en suero en el grupo administrado con adenovirus de IL-22 con respecto al grupo tratado con adenovirus parental en ambos puntos temporales. Microscópicamente, un cambio histomorfológico observado atribuido a IL-22 fue la regeneración tubular en el riñón. Aunque no es común en ratones, existió un aumento en la incidencia y la gravedad en este grupo de animales. La nefropatía se caracteriza como áreas multifocales de basofilia de las células epiteliales tubulares corticales. [0352] Se llevó a cabo un experimento adicional, idéntico en diseño a uno descrito anteriormente, con el fin de verificar los resultados y recoger muestras adicionales. En este estudio, se registró el peso corporal cada tres días, se recogió la sangre de los ratones tres días después de la inyección de adenovirus, y se sacrificaron los ratones para la sangre y la recogida de tejidos en el día 10 (n=4 por grupo) y el día 20 (n=4 por grupo). Se detectaron de nuevo recuentos elevados de neutrófilos y plaquetas en las muestras de sangre procedentes del grupo administrado con adenovirus de IL-22 con respecto al grupo tratado con adenovirus parental. Este efecto fue evidente para los neutrófilos en el día 3, pero el recuento de plaquetas no fue significativamente diferente hasta el día 10. También, se redujeron significativamente los recuentos de linfocitos procedentes del grupo administrado con adenovirus de IL-22 con respecto al grupo tratado con adenovirus parental en el día 3 y 10, pero no se elevaron en el día 20 como en el estudio previo. De nuevo, los ratones a los que se administró adenovirus de IL-22 perdieron peso durante el curso del estudio, mientras que los ratones tratados y no tratados con el virus control ganaron peso. Los parámetros de la química del suero fueron consistentes con el estudio previo. Se confirmaron también en este estudio los hallazgos histológicos de regeneración tubular en el riñón asociados con el tratamiento de adenovirus de IL-22. Esto fue consistente con el hallazgo adicional de proteinuria moderada en ratones a los que se proporcionó adenovirus de IL-22 (día 20). [0353] Los resultados sugirieron que IL-22 afecta la hematopoyesis, es decir, la formación de células de la sangre in vivo. Como tal, IL-22 podría tener actividades biológicas que afectaran diferentes hemocitoblastos, dando como resultado de esta manera un aumento o una disminución de algunas células de la sangre diferenciadas en un linaje específico. Por ejemplo, IL-22 parece reducir los linfocitos, lo que es probablemente debido a la inhibición de las células progenitoras comprometidas que proporcionan un incremento de las células linfoides, apoyando la noción de que IL-22 podría jugar un papel en la anemia, la infección, la inflamación, y/o las enfermedades inmunes influenciando las células de la sangre implicadas en estos procesos. Podrían usarse antagonistas contra IL-22, tales como anticuerpos o su receptor soluble de IL22RA2, como reactivos terapéuticos en estas enfermedades. [0354] Además, estos experimentos usando adenovirus de IL-22 en ratones sugieren que la expresión en exceso de IL-22 aumenta el nivel de neutrófilos y plaquetas in vivo. Es concebible que existan otros factores (tales como citocinas y genes modificadores) implicados en las respuestas a IL-22 en el sistema del animal completo. Sin embargo, estos datos apoyan fuertemente la implicación de IL-22 en la hematopoyesis. De esta manera, IL-22, los anticuerpos contra IL-22, los receptores solubles (por ejemplo, SEC ID Nº 3), y los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA son adecuados reactivos/dianas para el diagnóstico y el tratamiento en una variedad de trastornos, tales como inflamación, trastornos inmunes, infección, anemia, cánceres hematopoyéticos y otros, y similares. [0355] La asociación de la expresión de IL-22 con pérdida de peso, aparición de proteína SAA en fase aguda, y perturbaciones metabólicas evidenciada por disminución de glucosa en suero, albúmina y nitrógeno de la urea sugieren que IL-22 es una citocina que actúa tempranamente en algunas respuestas inflamatorias. Los ratones a los que se proporciona adenovirus de IL-22 pueden representar un estado de inflamación crónica, tal como el observado en la IBD, colitis ulcerosa, artritis, psoriasis, artritis psoriática, asma, y similares. Algunos procesos inflamatorios perjudiciales se pueden inhibir mediante el uso de un antagonista de IL-22, tal como los anticuerpos dirigidos contra IL-22, y sus receptores, tales como los receptores solubles de IL-22RA (por ejemplo, SEC. DE ID Nº 3), y los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA y similares.

B. IL-22 ES UNA CITOCINA PROINFLAMATORIA: NIVEL EN SUERO DE SAA EN RATONES ADENO-IL-22: [0356] Se llevó a cabo un ELISA para determinar el nivel de SAA en ratones Adeno-IL-22 usando un Kit y el protocolo de Inmunoensayo de SAA de Ratón (Biosource International, California, EE:UU). Se plaquearon patrones diluidos y desconocidos junto con placas de ensayo HRP dirigidas contra SAA de ratón prerrecubiertas con anticuerpos dirigidos contra SAA de ratón. Se incubaron las placas durante una hora a 37 grados C y se lavaron según las instrucciones del kit. Se desarrollaron las placas durante 15 minutos a temperatura ambiente usando TMB y se detuvieron con H2SO4 2 M. Se leyó la absorbancia a 450 nm usando un Spectromax 190 (Molecular Devices, California, EE.UU.). Se analizaron los datos resultantes usando Softmax Pro (Molecular Devices, California, USA) y Excel (Microsoft Corp., Washington, EE.UU.). [0357] Los ratones infectados con Adenovirus-IL-22 tuvieron niveles muy elevados de SAAm, sobre 10 veces, con respecto al Adenovirus Parental control.

C. ANÁLISIS DE CITOMETRÍA DE FLUJO DE RATONES INFECTADOS CON ADENOVIRUS DE IL-22 [0358] Para analizar los efectos de la expresión de IL-22 in vivo por adenovirus, los inventores aislaron sangre periférica, de bazo, y médula ósea de ratones C57BL/6N infectados con adenovirus de IL-22, en el día 10 y el día 20 después de la infección. Se recogieron aproximadamente 100 µl de sangre en tubos heparinizados, a continuación se eliminaron los glóbulos rojos de la sangre mediante lisis hipotónica (se lisaron las células en 4,5 ml de H2Od durante 5 segundos antes de añadir 1,5 ml de NaCl al 3,6 %). Se trituraron los bazos entre dos portas de vidrio escarchados, y se hicieron pasar la células liberadas sobre una membrana Nytex (cribador celular) y se aglomeraron. Se obtuvo médula roja triturando un fémur con mortero y mano y haciendo pasar las células sobre un cribador celular (Falcon). Se volvieron a suspender las células en tampón de lavado FACS (WB = HBSS/BSA al 1 %/ hepes 10 mM), se contaron en azul de tripán, y se distribuyeron en alícuotas 1 x 106 células viables de cada tipo en tubos de poliestireno de 5 ml. Se lavaron las células y se aglomeraron, a continuación se incubaron durante 20 min en hielo con combinaciones de anticuerpos monoclonales marcados fluorescentemente (FITC, PE, y CyChrome) (PharMingen, San Diego, CA) que reconocen diversos marcadores superficiales celulares usados para identificar subconjuntos de células inmunes particulares. Estos marcadores incluyen los siguientes (relacionados en grupos de 3 que los inventores han ensayado). Paralatinción de la sangre: CD3, Gr1, y B220; para la tinción del bazo: CD62L, CD44, y CD3; CD21, CD23, y B220; IgD, IgM, y B220; CD11b, Gr1, y CD8; para la tinción de la médula ósea: CD11b, Gr1, CD3; IgD, IgM, y B220. Se lavaron las células con 1,5 ml de WB y se aglomeraron, a continuación se volvieron a suspender en 0,4 ml de WB y se analizaron en un FACscan usando el software CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA). [0359] Los inventores han encontrado que la fracción de neutrófilos en la sangre de ratones tratados con adeno-IL-22 se elevó 4-13 veces en el Día 10 y 2-3 veces en el Día 20. En el Día 10, esta diferencia dio como resultado una disminución concomitante en la fracción de linfocitos y monocitos en sangre. En la médula ósea, los inventores han encontrado que el número total de células B disminuía 1,5 veces, mientras que el porcentaje de células B en recirculación maduras aumentaba y el número total de células B inmaduras disminuía ligeramente en el Día 10. En el Día 20, muchas de estas diferencias no fueron aparentes, los inventores encontraron un ligero aumento en la fracción de células B en recirculación maduras. En el bazo, el número total de células B disminuyó ligeramente (1,5-2 veces) en los días ensayados, mientras que en el Día 20, la fracción de células B de la zona marginal (CD21+CD23-B220+) aumentó en 2 veces y el número de células B foliculares (CD21+CD23+B220+) disminuyó 2 veces. Se considera que las células B de la zona marginal están en la primera línea de defensa contra los patógenos, ya que son más sensibles a las células B mitógenas (por ejemplo, LPS) que las células B foliculares más comunes, y cuando encuentran su antígeno análogo, diferencian muy rápidamente entre las células que segregan anticuerpos. Es posible a IL-22 potencie tanto la conversión la conversión de las células B de la zona marginal a folicular, o que estas eliminen selectivamente las células foliculares menos maduras. Los cambios en el número de células B que se encuentran en la médula ósea pueden reflejar un potenciamiento de la diferenciación de las células B pre/pro y/o inmaduras o un aumento del influjo de las células B en recirculación procedentes de la sangre/bazo, y quizá, un aumento coincidente en la exportación de células B inmaduras a la periferia. El número real de células B BM maduras no aumenta, de tal manera que IL-22 puede no potenciar su proliferación Como alternativa, IL-22 puede bloquear, reducir o inhibir la diferenciación de células B inmaduras y aumentar por tanto la

5 representación relativa de las células B maduras.

D. IL-22RA2-Fc4 NEUTRALIZA LA ACTIVIDAD IN VIVO DE IL-22: ELISA DE SAA MUESTRA QUE SE INHIBE LA EXPRESIÓN DE SAA INDUCIDA POR IL-22 [0360] Para evaluar si IL-22RA2 podría inhibir la inducción de SAA en ratones

10 IL-22 (hembras, C3H/HEJ, 8 semanas de edad; Jackson Labs, Bar Harbor, ME) se dividieron en cinco grupos de tres animales cada uno mediante la inyección IP de proteínas según se muestra en la Tabla 6 a continuación:

Tabla 6

Grupo nº

IL-22 IL-22RA2

Grupo 1:

- -

Grupo 2:

- 100 µg

Grupo 3:

3 µg -

Grupo 4:

3 µg 20 µg

Grupo 5:

3 µg 100 µg

[0361] Se precedieron en 15 minutos las inyecciones de IL-22RA2 por la

15 inyección de IL-22. Se proporcionaron ambas inyecciones de proteínas mediante ruta intraperitoneal. Se tomó una muestra de sangre de cada ratón antes del tratamiento, a continuación a las 2 y a las 6 horas después del tratamiento. Se preparó suero de cada una de las muestras para la medida de SAA e IL-22. [0362] Se llevó a cabo un ELISA según se ha descrito anteriormente para

20 determinar el nivel de SAA en ratones tratados con IL-22 y un receptor soluble de IL22, IL-22RA2-Fc4 descrito en el presente documento. Los ratones tratados con 3 µg de IL-22 conjuntamente con IL-22RA2-Fc4 a concentraciones entre 20-100 µg mostró una reducción en el nivel de SAA inducido por IL-22 solo a niveles de fondo, demostrando que IL-22RA2 inhibió la actividad de inducción de SAA de IL-22 in

25 vivo.

EJEMPLO 8 EXPRESIÓN DE IL-22 EN UN MODELO DE RATÓN DE LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA DEL INTESTINO

[0363] La enfermedad Inflamatoria del Intestino (IBD) es una enfermedad multifactorial, dividida en dos tipos, colitis ulcerosa (CU) y Enfermedad de Crohn (CD). No se conoce actualmente la etiología de estas enfermedades y las manifestaciones clínicas difieren. CU está restringida al colon, y los síntomas incluyen diarreas sanguinolentas, pérdida de peso y dolor abdominal. Las características macroscópicas de la CU incluyen úlceras puntuadas y un acortamiento del colon En contraste, la enfermedad de Crohn puede afectar también otras partes del intestino. Los síntomas incluyen diarrea (que es a menudo menos sanguinolenta que la observada en la CU), fiebre y dolor de menor grado incluyen constricciones fibróticas y estenóticas del intestino, profundas úlceras, fisuras y fístulas. [0364] Están disponibles algunos modelos animales que imitan estas enfermedades humanas. Tres modelos comúnmente usados de colitis para cribado de nuevos fármacos son el modelo de rata inducido por el ácido 2,4,6-trinitrobenceno sulfónico (TNBS), el modeló de transferencia de células T de ratón, y el modelo de ratón inducido por DSS o sulfato de sodio dextrano: El modelo DSS se derivó de un modelo del Dr. S. Murthy, usando un sistema de puntuación del índice de actividad de la enfermedad (S.N.S. Murthy, Treatment of Dextran Sulfate Sodium-Induced Murine Colitis by Intracolonic Cyclosporin, Digestive Diseases and Sciences, Vol. 38, No. 9 (Septiembre 1993), pp.1722-1734). [0365] El presente estudio dio como resultado una colitis aguda en los ratones a los que se alimentó con DSS en su agua de bebida durante 6 días. Los animales presentaron pérdidas de peso y diarrea sanguinolenta, imitando la dolencia de los pacientes con CU. No está bien caracterizado el mecanismo de la lesión por DSS, pero se piensa que induce una respuesta inmune inflamatoria no específica e imita los efectos del entorno intestinal. Es posible que se produzca H2S, que sería tóxico para las células. Adicionalmente, se producen cambios en la flora bacteriana luminal. Se ha demostrado que existen monocitos, macrófagos y mastocitos activados en el colon. Los mediadores de los tres modelos animales incluyen prostaglandinas inflamatorias, metabolitos del leucotrieno y citocinas.

A. PROCEDIMIENTO [0366] Se indujo la colitis mediante ingestión de DSS en ratones hembra Swiss Webster de Charles River Laboratories. Los ratones tenían 10 y 11 semanas de edad al comienzo del estudio. Se proporcionó a los ratones DSS al 4 % en el agua de la bebida durante un periodo de 6 días (ratones tratados), o se proporcionó únicamente agua de bebida normal (ratones control). Se usó una puntuación clínica del Índice de Actividad de la Enfermedad (DAI), que comprende una combinación de medidas que incluyen a calidad de la deposición, sangre oculta y pérdida de peso. Se obtuvo el DAI diariamente de cada ratón comenzando un día después del tratamiento con DSS. Después de 6 días, se eliminó el DSS del agua de la bebida de los ratones tratados. Se vigilaron todos los ratones mediante la puntuación clínica del DAI hasta el sacrificio en cualquiera de los días 2, 7 ó 10 desde el comienzo del estudio. En cada uno de los días 2 y 7, se sacrificaron cuatro de los ratones tratados con DSS y un ratón control En el día 10, se sacrificaron cuatro de los ratones tratados con DSS y dos de los ratones control. Se midió la longitud del colon de todos los animales después del sacrificio. Se fijaron las secciones de colon en formalina tamponada neutra al 10 % para el análisis histológico o la extracción de ARNm congelado.

B. PUNTUACIÓN HISTOLÓGICA Y PUNTUACIÓN DEL ÍNDICE DE ACTIVIDAD DE LA ENFERMEDAD (DAI) [0367] Se obtuvieron las puntuaciones del índice histológico siguiendo el procedimiento en la referencia 1. Generalmente, las secciones de colon se puntuaron ciegas por un patólogo para las puntuaciones de la cripta, el epitelio hiperplásico, la perturbación de la cripta y la inflamación. [0368] Diariamente, se calificó cada ratón con una puntuación clínica basada en la pérdida de peso, la consistencia de la deposición, y el sangrado intestinal. Se asignaron puntuaciones mayores para el incremento de las cantidades de pérdida de peso, diarrea y sangrado. La puntuación diaria de cada ratón fue la calificación promedio obtenida de los tres resultados/observaciones.

C. RESULTADOS [0369] Las longitudes del colon de los ratones tratados con DSS fueron algo más cortas en los días 7 y 10 que las de los ratones control no tratados, pero los resultados pueden no haber sido significativos (no se comprobaron mediante una aplicación estadística). Las puntuaciones clínicas del DAI reflejaron un aumento en los síntomas de la enfermedad en los ratones tratados con DSS similar al observado en los estudios anteriores usando este modelo. La sangre oculta fue mayor aproximadamente en los días 4 y 5, mientras que la disminución de las deposiciones fue más prevalente en los días 6 y 7. Los resultados de la histopatología muestras que las puntuaciones de la enfermedad fueron diferentes de las de los controles en todos los días de sacrificio, especialmente en los días 7 (pico) y 10. Las puntuaciones de cribado histopatológico fueron: controles = 0,5, día 2 ratones tratados con DSS = 8,8, día 7 ratones tratados con DSS = 21, día 10 ratones tratados con DSS = 18. Las puntuaciones clínicas y de la histopatología muestran que los ratones tratados con DSS tuvieron una enfermedad significativa del colon con respecto a los controles no tratados. Se usaron las muestras de tejido congelado para las determinaciones del ARNm según se describe a continuación.

D. EXPRESIÓN DE ARN DE IL-22 EN TEJIDO EN MUESTRAS DE COLON DE IBD DE MURINO USANDO LA RT-PCR: [0370] Para determinar la expresión relativa del ARN de IL-22 de ratón (SEC. DE ID Nº 10; SEC DE DE ID Nº 11) en un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino, se recogieron los colones distales de ratones tratados con DSS y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. En este experimento, se trataron los ratones con DSS y se tomaron muestras en los días 2, 7 y 10 después del tratamiento, Se recogieron también muestras de los ratones normales no tratados. A continuación se aisló el ARN de las muestras usando el Kit RNeasy MidiprepTM estándar (Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante. [0371] Las reacciones de la RT-PCR usaron el ‘Sistema Superscript de la RT-PCR en Una Etapa con Platinum Taq’ (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Cada 25 µl de la reacción estaban constituidos por lo siguiente: 12,5 ml de 2X Tampón de Reacción, 0,5 µl (20 pmol/ml) ZC39,289 (SEC. DE ID Nº 17), 0,5 ml (20 pmol/µl) ZC39.290 (SEC. DE ID NO:18), 0.4 ml RT/mezcla de polimerasa Taq, 10 µl RNasa libre de agua, 1,0 ml de ARN total (100 ng/ml). Se llevó a cabo la amplificación como sigue: un ciclo a 50º durante 30 minutos seguido por 35 ciclos de 94º, 30 segundos; 58º, 30 segundos; 72º, 60 segundos; finalizados a continuación con una extensión final a 72º durante 7 minutos. Se sometieron 8 a 10 µl del producto de reacción de la PCR a electroforesis estándar en gel de agarosa usando un gel de agarosa al 2 %. Se observó el tamaño correcto predicho del fragmento de ADNc como sigue: hubo una débil banda en ambas muestras del día 2. Dos de las tres muestras del día 7 generaron una fuerte banda mientras que la tercera muestra del día 7 generó una banda muy fuerte. Las tres muestras del día 10 generaron una banda fuerte. Finalmente, las dos muestras control ‘normales’ no generaron ninguna banda. Estos resultados sugieres que puede haber una regulación en exceso de IL-22 en algunos tipos de respuestas inflamatorias en el colon, incluyendo las asociadas con IBD, CU, y CD. En la Tabla 7 a continuación se resumen los datos, en los que se puntuó la Expresión Relativa como sigue: 0 = Sin banda, 1 = banda débil, 2 = banda fuerte, 3 = banda muy fuerte.

Tabla 7

imagen1

Colon normal

0

Colon normal

0

Día 2 después del tratamiento

1

Día 2 después del tratamiento

1

Día 7 después del tratamiento

3

Día 7 después del tratamiento

2

Día 7 después del tratamiento

2

Día 10 después del tratamiento

2

Día 10 después del tratamiento

2

Día 10 después del tratamiento

2

EJEMPLO 9 IL-22RA2 DISMINUYE LOS NIVELES DE IL-6 Y SAA EN EL MODELO DE RATÓN DE ARTRITIS INDUCIDA POR COLÁGENO (CIA)

A. MODELO DE RATÓN DE ARTRITIS INDUCIDA POR COLÁGENO (CIA) 5 [0372] Ratones DBA/1J machos de diez semanas de edad (Jackson Labs) se dividieron en 3 grupos de 13 ratones/grupo. En el día 21, se administró a los animales una inyección subcutánea de 50-100 µl de 1 mg/ml de colágeno de pollo de Tipo II formulado en Adyuvante de Freund Completo (preparado por Chondrex, Redmon, WA), y tres semanas después, en el Día 0, se proporcionó una inyección de 100 µl (25

10 µg) de LPS de E. coli 0111:B4, preparado como 250 µg/ml de una alícuota liofilizada (Sigma, St. Louis, MO). Se administró IL-22RA2 en inyección intraperitoneal 3 veces a la semana durante 4 semanas, desde el Día 0 al Día 25 Los dos primeros grupos recibieron tanto 100 como 10 µg de IL-22RA2 por animal por dosis, y el tercer grupo recibió el vehículo control, PBS (Life Technologies, Rockville, MD). Los animales

15 comenzaron a mostrar síntomas de artritis traslaadministración de la inyección de LPS, desarrollado la mayor parte de animales inflamación en 2-3 semanas. Se evaluó la extensión de la enfermedad en cada pata usando un calibre para medir el grosor de la pata, y asignando una puntuación clínica (0-3) a cada pata: 0 = Normal, 0,5 = Dedo(s) de la pata inflamado, I = ligera inflamación de la pata, 2 = Moderada inflamación de la

20 pata, y 3 = Grave inflamación de la pata, según se detalla a continuación. SEGUIMIENTO DE LA ENFERMEDAD: [0373] Los animales pueden comenzar a mostrar signos de inflamación en la pata poco después de la segunda inyección de colágeno, y algunos animales pueden incluso comenzar a tener signos de inflamación en los dedos de la pata antes de la segunda inyección de colágeno. La mayor parte de los animales desarrollan artritis en el perdió comprendido en las 2-3 semanas de la inyección del estímulo, pero algunos pueden requerir un periodo más largo de tiempo. La incidencia de la enfermedad en este modelo es normalmente del 95-100 %, y se observan normalmente 0-2 animales sin respuesta (según se determinó tras 6 semanas de observación) en un estudio usando 40 animales. Señalar que a medida que comienza la inflamación se puede producir una incidencia de inflamación transitoria en la pata o los dedos de la pata de baja intensidad variable. Por esta razón, no se considera que se ha establecido la enfermedad en un animal hasta que no se ha desarrollado en la pata una hinchazón marcada y persistente. [0374] Se observaron todos los animales diariamente para evaluar el estado de la enfermedad en sus patas, lo que se llevó a cabo asignando una puntuación clínica cualitativa a cada una de las patas. Cada día, el animal tenía sus 4 patas puntuadas según su estado clínico de la enfermedad. Para determinar la puntuación clínica, se piensa que la pata tiene 3 zonas, los dedos, la propia pata (mano o pie), y la articulación de la muñeca o el tobillo. Se señalo la extensión y la gravedad de la inflamación con respecto a estas zonas incluyendo la observación de todos los dedos de cualquier articulación con hinchazón, uñas rotas, o enrojecimiento, señalando cualquier evidencia de edema o enrojecimiento en cualquiera de las patas, y señalando cualquier pérdida de demarcación anatómica fina de tendones o huesos, y la evaluación de cualquier edema o enrojecimiento en la muñeca o el tobillo, y señalando si la inflamación se extiende proximalmente hasta el miembro. Una puntuación en una pata de 1, 2 ó 3 estaba basada en primer lugar en la impresión global de gravedad, y en segundo lugar en como se encontraban implicadas muchas zonas. A continuación se muestra la escala usada para la puntuación clínica.

PUNTUACIÓN CLÍNICA: [0375]

0 = Normal 0,5 = Uno o más dedos implicados, pero solo se inflaman los dedos. 1 = ligera inflamación que implica la pata (zona 1), y puede incluir un dedo

o dedos. 2 = inflamación moderada en la pata y que puede incluir alguno de los dedos y/o la muñeca/tobillo (zonas 2) 3 = grave inflamación en la pata, muñeca/tobillo, y alguno o todos los dedos (zonas 3)

[0376] La enfermedad establecida se define como una puntuación cualitativa de la inflamación de la pata que varía desde 2 o más, que persiste durante la noche (dos días seguidos). Una vez la enfermedad establecida está presente, se registra la fecha y se designa como el primer día del animal con “enfermedad establecida”. [0377] Se recogió sangre mediante el experimento de vigilar los niveles en suero de los anticuerpod dirigidos contra colágeno. Se sometieron los animales a eutanasia en el Día 21, y se recogió la sangre para el suero y para el CBC. De cada animal, se retiró una pata afectada en NBF al 10 % para la histología y se congeló una en nitrógeno líquido y se almacenó a -80º C para el análisis del ARNm. También se retiraron 1/2 bazo, 1/2 timo, 1/2 nódulo linfático mesentérico, el hígado restante y el riñón izquierdo en RNAlater para el análisis del ARN, y se recogieron 1/2 bazo, 1/2 timo, 1/2 nódulo linfático mesentérico, el hígado restante, y el riñón derecho en NBF al 10 % para la histología. Se recogió el suero y se congeló a -80ºC para los ensayos de inmunoglobulinas y citocinas. [0378] No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos cuando se analizaron los datos de puntuaciones y medidas de las patas, aunque hubo una sugerencia de que un grupo de tratamiento que recibía IL-22RA puede haber tenido un retraso en el comienzo y la progresión de la inflamación de la pata. No hubo diferencias significativas entre los grupos sobre los cambios en el peso corporal, los parámetros de CBC, o los niveles de anticuerpos dirigidos contra colágeno. Estos resultados iniciales indican que IL-22RA2 no afecta adversamente el peso corporal, los glóbulos rojos o blancos de la sangre, o la producción de anticuerpos, pero puede ser capaz de reducir la inflamación. Están en curso investigaciones adicionales sobre la dosificación, el mecanismo de acción, y la eficacia (por ejemplo, Ejemplo 10).

B. DATOS DE ELISA DIRIGIDO CONTRA COLÁGENO EN EL MODELO CIA DE RATÓN [0379] Se recogieron muestras de suero en los días 0, 7, 14, 21 y 28 en relación a la fecha del estímulo de LPS (día 0) procedentes del modelo de murino de artritis inducida por colágeno (Ejemplo 9A anterior). Se cribaron las muestras de suero mediante ELISA para los títulos de anticuerpo dirigido contra colágeno. No hubo efectos estadísticamente significativos del tratamiento de IL-22RA2 en los grupos de tratamiento con 100 µg o 10 µg sobre los niveles de anticuerpos dirigidos contra colágeno que comparación con los controles de PBSA continuación se proporciona una descripción de los procedimientos y materiales de ELISA dirigido contra colágeno. [0380] Los reactivos usados para el ELISA dirigido contra colágeno fueron las placas de microvaloración de 96 pocillo Maxisorp (NUNC, Rochester, NY), colágeno de pollo de tipo II (Chondrex, Redmond, WA), Super Block (Pierce, Rockford, IL), IgG+A+M (H+L) de cabra dirigida contra ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Zymed, South San Francisco, CA) y sustrato de diclorhidrato de ofenilendiamina (Pierce, Rockford, IL). Los tampones usados en todos los ensayos fueron tampón diluyente ELISA B (PBS + BSA al 0,1 %, Tween al 0,05 % (Sigma, St. Louis, MO)), tampón de lavado ELISA C (PBS + Tween al 0,05 %) y tampón de desarrollo NovoD (citrato de sodio 0,063 M, ácido cítrico 0,037 M), H2O2 (Sigma) e IN H2SO4 (VWR, Tukwilla, WA). [0381] Se recogieron aproximadamente 100 µl de sangre periférica mediante sangrado retro-orbital en tubos separadores de suero (Becton Dickinson). Se recogió el suero mediante centrifugación (2-3 min, 16.00xg, 4-6º C) y se almacenó a -20º C hasta que se analizó. Para determinar los niveles de anticuerpo Ig dirigido contra colágeno., se recubrieron placas NUNC con 10 µg/ml de colágeno de pollo de tipo II (Chondrex, Redmond WA) y se incubaron durante la noche a 4º C. Se lavaron las placas con ELISA C, se bloquearon (5 minutos, temperatura ambiente) con Super Block (Pierce, Rockford, IL), y se lavaron con ELISA C. las muestras de suero diluido (diluidas en ELISA B 5 veces desde 1:5000 a 1:625.000) se añadieron a placas de ELISA por triplicado y se incubaron las placas durante la noche a 4º C. Tras la incubación, se lavaron las placas con ELISA C, y se añadió Ig Fc de cabra dirigida contra ratón marcada con peroxidasa (Zymed, 1:2000 en ELISA B). Se incubaron las placas (temperatura ambiente, 90 minutos), se enjuagaron de nuevo usando ELISA C, y se desarolló la actividad de la HRP usando sustrato de diclorhidrato de o-fenilendiamina (10 ml de NovoD + 1 comprimido de OPD + 10 µl de H2O2, Pierce). Se detuvo la reacción con H2SO4 1 N. Se tomaron las medidas de la densidad óptica relativa de las muestras de suero a una dilución 1:25.000 a 490 nm usando un Spectra MAX 190, y se analizaron los datos usando el software SoftMax Pro (Molecular Devices Corporation, Palo Alto, CA).

C. ANÁLISIS DE IL-6 Y SAA EN EL MODELO CIA DE RATÓN [0382] El Día 0 se cosecharon las muestras de suero procedentes de ratones CIA (Ejemplo 9A anterior) 4 horas después de la administración de 25 µg de LPS intraperitonealmente. Se cribaron las muestras para las concentraciones de IL-6 y el amiloide A en suero (SAA) mediante kits ELISA comerciales adquiridos a Biosource International (Camarillo, CA) según las instrucciones del fabricante. [0383] Los niveles de IL-6 fueron de 9651 +/- 1563 pg/ml, 10.865 +/- 1478 pg/ml y 15.006 +/- 2.099 pg/ml en los grupos de ratones sometidos a 100 µg de IL-22RA2, 10 µg de IL-22RA2 y PBS control, respectivamente. La concentración de IL-6 en el grupo de ratones CIA expuestos a la dosis de 100 µg de IL-22RA2 fue significativamente inferior en comparación con los ratones PBS control con p = 0,0351. Se calculó la significancia estadística usando PLSD de Fisher con un nivel de significancia del 5 % (ABACUS Concepts, INC, Berkeley, CA). [0384] Adicionalmente, las concentraciones de SAA fueron 381 +/-40 mg/ml, 348 +/- 37 mg/ml y 490 +/- 50 mg/ml en los grupos de ratones sometidos a 100 µg IL22RA2, 10 µg IL-22RA2 y los grupos PBS control, respectivamente. La concentración de SAA en el grupo de ratones CIA expuestos a la dosis de 10 µg de IL-22RA2 fue significativamente inferior en comparación con los ratones PBS control con p = 0,0257. Se calculó la significancia estadística usando PLSD de Fisher con un nivel de significancia del 5 % (ABACUS Concepts, INC, Berkeley, CA).

EJEMPLO 10 LOS MAb DIRIGIDOS CONTRA IL-22RA O LOS MAb DIRIGIDOS CONTRA IL-22 INHIBEN LA GRAVEDAD DE LA ENFERMEDAD EN UN MODELO CIA DE RATÓN [0385] El modelo de artritis inducida por colágeno (CIA) es un modelo de ratón de la artritis reumatoide que refleja la gran extensión de la enfermedad que se observa en seres humanos (Moore, Methods Mol. Biol. 225: 175-179, 2003: Waksman, Scand.

J. Immunol., 56: 12-34, 2002). Se inmunizaron los ratones con 2 dosis de colágeno emulsionado en CFA en la base de la cola. Esto da como resultado la hinchazón de las patas que aumenta en un periodo de tiempo y se puede puntuar visualmente y medirse usando calibres. Además los anticuerpos en sueros dirigidos contra colágeno se correlacionan bien con la gravedad de la enfermedad. Basándose en los datos que muestran que IL-20 e IL-22 induce la inflamación, se administran MAb dirigidos contra IL-22RA y dirigidos contra IL-22 a los grupos de ratones inmunizados con colágeno y se evaluaron los efectos sobre las puntuaciones de la enfermedad. Una disminución en las puntuaciones de las patas y en el grosor de las patas tras la administración de MAb dirigidos contra IL-22RA o MAb dirigidos contra IL-22 promueve la respuesta inmune en curso en un modelo de autoinmunidad y bloqueando, inhibiendo, reduciendo, antagonizando o neutralizando su función puede inhibir los trastornos autoinmunes. La inhibición de TNFa y de los anticuerpos dirigidos contra colágeno en suero sugiere también que bloquear IL-22RA puede ser beneficioso en la enfermedad autoinmune.

[0386] De esta manera, para determinar si los MAb dirigidos contra IL-22RA o los MAb dirigidos contra IL-22 tienen un efecto sobre la autoinmunidad, se ensayaron en un modelo de ratón de la artritis reumatoide – artritis inducida por colágeno (CIA). Específicamente, se proporcionan a ratones inyecciones de colágeno para inducir la artritis de tipo reumatoide. La inoculación en el Día 0 es una inyección subcutánea de un homogenado constituido por Adyuvante de Freund Completo (CFA) y colágeno de Tipo II (50-100 µl, preparado como 2 mg/ml de colágeno). Se proporciona la inyección próxima a la base de la cola. En el Día 21 se administra una segunda inoculación, siendo la única diferencia que se preparó el homogenado usando Adyuvante de Freund Incompleto (IFA), en vez del CFA. Se midieron diariamente las puntuaciones y los grosores de las patas. Los grupos de ratones reciben PBS, 20-200 µg de anticuerpo monoclonal correspondiente al isotipo control o 20-200 µg de MAb dirigido contra IL-22RA o MAb dirigido contra IL-22 i.p. 2X o 3X/semana durante 14 semanas comenzando en la segunda inyección de colágeno. Se vigilaron los ratones diariamente hasta el día 30. Se sacrificaron los ratones en el día 30, se tomó el suero para el análisis del anticuerpo dirigido contra colágeno y el análisis de la citocina en suero (TNFa). [0387] La inhibición de las puntuaciones de las patas, los grosores de las patas, TNFa en suero y los anticuerpos dirigidos contra colágeno en suero mediante la administración de MAb dirigidos contra IL-22RA o dirigidos contra IL-22 sugiere que bloqueando IL-22RA se puede unir, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar IL-22, e inhibir la respuesta inmune en curso en un modelo de autoinmunidad y puede inhibir los trastornos autoinmunes.

EJEMPLO 11 EXPRESIÓN DEL RECEPTOR DE IL-22, IL-22RA, EN EL MODELO DSS DE RATÓN [0388] Se llevó a cabo la RT-PCR para medir los niveles de expresión de IL22RA en el colon de los ratones con IBD inducida por DSS (Ejemplo 8). Se aisló el ARN de colon normal de ratón y de los colones distales de ratones tratados con DSS del tratamiento de los días 2, 7 y 10. Se llevó a cabo la RT-PCR usando el equipo y los protocolos de 7700TaqMan de Applied Biosystems. Brevemente, se usó el software “Primes Express” para diseñar los cebadores contra la secuencia de IL-22RA de ratón (ZC39776 (SEC. DE ID Nº 19) y ZC39777 (SEC. DE ID Nº 20)) y la sonda TaqMan marcada con FAM/TAMRA (ZC38752 (SEC. DE ID Nº 21)) según las directrices de Applied Biosystems. Se añadieron 25 ng de ARN a cada reacción, junto con los reactivos PE/TaqMan EZ RT-PCR Core de Applied Biosystems y los cebadores y la sonda anteriormente mencionados. Se hicieron avanzar las reacciones de la RT-PCR por duplicado con las siguientes condiciones; 50º C durante 2 minutos, 60º C durante 30 minutos, 95º C durante 5 minutos, 40 ciclos de 94º C durante 20 segundos y 60º C durante 1 minuto. Se compararon los valores de expresión con una curva estándar de números conocidos de moléculas de una transcripción de ARN sintético de IL-22RA de ratón, y se informó la expresión como el número absoluto de moléculas de IL-22RA de ratón por reacción. Los datos preliminares sugieren que la expresión de IL-22RA de ratón puede ser ligeramente regulada por disminución en los colones distales del día 7 y el día 10 de ratones con IBD inducida por DSS cuando se comparan con los niveles de expresión en colon de ratón normal.

EJEMPLO 12 INDICADORES DE IL-“” Y PROINFLAMATORIOS EN EL MODELO DE LIGERA ENDOTOXEMIA: MODELO DE ENDOTOXEMIA INDUCIDA POR LPS EN RATÓN

A. MODELO DE ENDOTOXEMIA INDUCIDA POR LPS EN RATÓN: EVALUACIÓN DE CITOCINAS PROINFLAMATORIAS Y DE

TEMPERATURA CORPORAL EN EL MODELO DE ENDOTOXEMIA INDUCIDA POR LPS EN RATÓN [0389] Se diseñó un experimento in vivo para examinar el efecto de IL-22RA2 (IL-22RA2) en un modelo LPS de ligera endotoxemia en ratón. Para evaluar inicialmente el modelo, los inventores midieron las citocinas proinflamatorias y la temperatura corporal para recoger datos de referencia para el modelo. [0390] Brevemente, se inyectó a ratones hembra Balb/c (CRL) de seis meses con 25 µg de LPS (Sigma) en PBS estéril intraperitonealmente (IP). Se recogieron muestras de suero a las 0, 1, 4, 8, 16, 24, 48 y 72 horas de grupos de 8 ratones para cada punto temporal. Se evaluaron las muestras de suero para los niveles de citocinas inflamatorias. Se midieron los niveles de IL-1b, IL-6, TNFa, IL-10 y proteína A amiloide en suero (SAA) usando kits ELISA comerciales adquiridos de Biosource International (Camarillo, CA). [0391] Los niveles de TNFa mostraron un pico a 4000 pg/ml y los niveles de EL10 fueron de 341 pg/ml 1 hora después de la inyección de LPS. A las 4 horas después de la inyección de LPS, IL-6, IL-1b e IL-10 fueron de 6.100 pg/ml, 299 pg/ml y 229 pg/ml, respectivamente. Los niveles de SAA en suero fueron de 0,405 mg/ml en las 4 horas después de la inyección de LPS. Las concentraciones de SAA en suero continuaron aumentando hasta 3,9 mg/ml en las 24 horas después de la inyección de LPS, sin embargo, niveles de SA mayores de 1 a 2 mg/ml en suero son difíciles de medir con precisión o reproduciblemente con el kit ELISA existente debido a las interacciones entre SAA y otros componentes del suero. Estos resultados indicaron que las citocinas proinflamatorias, adicionalmente a IL-22 (Ejemplo 11B), se produjeron, de hecho, en este modelo. De esta manera, se establecieron los siguientes criterios como marcadores biológicos para el modelo LPS de ligera endotoxemia: niveles de TNFa en suero 1 hora después de la inyección de LPS, niveles de IL-6 en suero 4 horas después de la inyección de LPS y niveles de SAA en suero 4 y 8 horas después de la inyección de LPS. [0392] Se vigilaron las temperaturas corporales en un grupo separado de animales mediante dispositivos de telemetría implantados quirúrgicamente durante el curso del experimento de 72 horas. Las temperaturas corporales en ratones disminuyeron máximamente en 2º C desde 37,07º C a 34,98º C 30 minutos después de la inyección de LPS. [0393] La inyección de 100 µg de la proteína de fusión IL-22RA2-Fc 30 minutos antes de la inyección de LPS redujo significativamente aproximadamente un 50 % la inducción de SAA en el punto temporal de 4 horas y 8 horas, mientras que 10 µg de IL-22RA2-Fc no tiene efecto significativo. No existe cambio significativo en el nivel de TNF-alfa e IL-6. La inyección de IL-22RA2-Fc redujo el recuento de neutrófilos en circulación en el punto temporal de 1 hora. Esto demostró que la administración de IL22RA2-Fc puede neutralizar la actividad de IL-22 en términos de inducción de SAA.

B. DETECCIÓN DE LA ACTIVIDAD DE IL-22 EN SUERO DE RATÓN PROCEDENTE DEL MODELO DE ENDOTOXEMIA INDUCIDA POR LPS EN RATÓN USANDO CÉLULAS BaF3/CRF2-4/IL-22RA EN UN ENSAYO DE PROLIFERACIÓN ALAMAR BLUE [0394] Se centrifugaron células BaF3/CRF2-4/IL-22RA, descritas en el presente documento, y se lavaron 2 veces en PBS para asegurar la eliminación de MIL-3, y a continuación se centrifugaron una tercera vez y se volvieron a suspender en los medios completos (RPMI 1640, FBS al 10 %, GlutaMAX al 1 %, Piruvato de Sodio al 1 %), pero sin mIL-3 (denominado en el presente documento a partir de ahora como “medios libres de mIL-3”). A continuación se contaron las células en un hemocitómetro. Se plaquearon las células en un formato de 96 pocillos a 5000 células por pocillo en un volumen de 100 µl por pocillo usando los medios libres de mIL-3. [0395] Se diluyó el suero procedente de ratones con endotoxemia inducida por LPS procedente del experimento descrito en el Ejemplo 11A anterior, al 2 % en medios libres de mIL-3 en la hilera superior de la placa y a continuación se diluyeron en serie descendente 1:2 la 7 hileras restantes en la placa de 96 pocillos, dejando un volumen de 100 µl en cada pocillo. A continuación se añadieron a los 100 µl de células, para concentraciones finales en suero del 1 %, 0,5 %, 0,25 %, 0,125 %, 0,063 %, 0,031 %, 0,016 %, y 0,018 % en un volumen total de ensayo de 200 µl. Se incubaron las placas de ensayo a 37º C, CO2 durante 4 días en cuto momento se añadió Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) a 20 µl/pocillo. Se incubaron de nuevo las placas a 37º C, CO2 al 5 % durante 16 horas. Alamar Blue proporciona una lectura Fluorométrica basada en el número de células vivas, y de esta manera, una medida directa de la proliferación celular en comparación con un control negativo. Se leyeron las placas en el Contador Victor 2 1420 Multilabel de Wallac (Wallac, Turku, Finlandia) a longitudes de onda de 530 (Excitación) y 590 (Emisión). [0396] Los resultados no mostraron proliferación significativa por encima de los niveles de fondo en los puntos temporales de 0 horas, 1 hora, 8 horas, 1 16 horas: Las muestras de suero procedentes del punto temporal de las 4 horas mostraron un incremento de 4 veces a más de 10 veces en la proliferación por encima del fondo, indicando la presencia de IL-22 en las muestras.

C. Modelo de endotoxemia inducida por LPS en ratón: Experimento para evaluar los efectos de IL-22RA2 [0397] Se ensayó la capacidad del tratamiento con IL-22RA2 de afectar los indicadores proinflamatorios inducidos con una única dosis IP de 25 µg de LPS en ratones. Se analizaron todas las muestras para la SAA, IL-22 y los recuentos de neutrófilos en circulación. Se analizaron subconjuntos de cada grupo para los niveles particulares de citocinas (se cribaron muestras de 1 hora par TNF alfa, se analizaron muestras de 4 horas para IL-6). Se sacrificaron los animales en los puntos temporales indicados en la Tabla 8 a continuación y se recogieron muestras de sangre y suero completos y se distribuyeron en alícuotas para análisis. [0398] Se proporcionó a 72 ratones hembras C57BL/6N (CRL) una única dosis IP de IL-22RA2 según se describe en la Tabla 8 a continuación. Los ratones control fueron C57BL/6N (CRL). [0399] 30 minutos después, recibieron otra inyección IP de 25 µg de LPS (Sigma) en 100 µl, para iniciar una cascada de endotoxemia. Se sacrificaron los ratones de cada grupo en los puntos temporales correspondientes según se indica en la Tabla 8, se recogieron 50 µl de sangre completa para medir los números totales de neutrófilos en circulación y se centrifugó el resto para el suero y se distribuyó en alícuotas para los diversos ensayos descritos en el presente documento.

Tabla 8

Grupo

Nº Tratamiento LPS Sacrificio Muestras

A

8 100 µg de IL 25 µg IP 30 min 1 hora Alícuotas de suero y

22RA2 IP

después de tx sangre para CBC

B

8 10 µg de IL22RA2 IP 25 µg IP 30 min después de tx 1 hora Alícuotas de suero y sangre para CBC

C

8 200 µl de PBS 25 µg IP 30 min 1 hora Alícuotas de suero y

IP

después de tx sangre para CBC

D

8 100 µg de IL 25 µg IP 30 min 4 horas Alícuotas de suero y

22RA2 IP

después de tx sangre para CBC

E

8 10 µg de IL22RA2 IP 25 µg IP 30 min después de tx 4 horas Alícuotas de suero y sangre para CBC

F

8 200 µl de PBS 25 µg IP 30 min 4 horas Alícuotas de suero y

IP

después de tx sangre para CBC

G

8 100 µg de IL 25 µg IP 30 min 8 horas Alícuotas de suero y

22RA2 IP

después de tx sangre para CBC

H

8 10 µg de IL22RA2 IP 25 µg IP 30 min después de tx 8 horas Alícuotas de suero y sangre para CBC

J

8 200 µl de PBS 25 µg IP 30 min 8 horas Alícuotas de suero y

IP

después de tx sangre para CBC

K

5 Controles Ninguno Pre LPS Alícuotas de suero y sangre para CBC

D. IL-22RA2-Fc4 NEUTRALIZA LA INDUCCIÓN IN VIVO DE SAA: ELISA

5 DE SAA QUE MUESTRA LA EXPRESIÓN DE SAA INDUCIDA POR LPS EN EL MODELO DE ENDOTOXEMIA INDUCIDA POR LPS EN RATÓN SE INHIBIÓ MEDIANTE LA INYECCIÓN DE IL-22RA2-Fc4: [0400] Para evaluar si IL-22RA2 podría inhibir la inducción de SAA en el modelo de endotoxemia inducida por LPS en ratón, se inyectaron ratones con IL-22RA2, 30

10 minutos antes de la inyección de LPS, según se muestra en la Tabla 8 en el Ejemplo 11C anterior. [0401] Se llevó a cabo un ELISA para determinar los niveles de SAA en las muestras de 4 horas y 8 horas, usando el Kit de Inmunoensayo de SAA de Ratón (BioSource International, California) siguiendo las indicaciones del fabricante En el punto temporal de las 4 horas, los ratones tratados con 100 µg o 10 µg de IL-22RA2 mostraron una reducción estadísticamente significativa dependiente de la dosis en los niveles de SAA con respecto a los ratones inyectados con PBS. En el punto temporal de las 8 horas, los ratones tratados con 100 µg, continuaron mostrando una reducción estadísticamente significativa en los niveles de SAA con respecto a los ratones inyectados con PBS. Esto indica que la presencia de IL-22RA2 es capaz de inhibir la inducción de SAA por LPS in vivo.

EJEMPLO 13 EFECTOS IN VIVO DEL POLIPÉPTIDO DE IL-22 EN LA PIEL

A. ACANTOSIS INDUCIDA POR IL-22 [0402] Se dividieron ratones (hembras, CH3/HEJ, 8 semanas de edad; Jackson Labs, Bar Harbor, ME) en tres grupos de seis animales y un grupo de 4. Se administró IL-22 producido por BHK humana mediante infusión constante mediante bombas miniosmóticas, dando como resultado concentraciones de suero en estado local y estacionario proporcionales a la concentración de IL-22 contenida en la bomba. Se cargaron bombas miniosmóticas Alzet (modelo 2002; Alza Corporation Palo Alto, CA) en condiciones estériles con proteína IL-22 (A601, 0,22 ml) diluida en disolución tamponada con fosfato (pH 7,0) a una concentración en el interior de la bomba de 2 mg/ml para los ratones del grupo 1, 0,2 mg/ml para los ratones del grupo 2, 0,02 mg/ml para los ratones del grupo 3, o 0 mg/ml (diluyente únicamente) para los ratones del grupo 4. Se implantaron las bombas subcutáneamente en los ratones mediante una incisión de 1 cm en la piel dorsal, y se cerró la piel con vendajes de cierre estériles. Se diseñaron estas bombas para administrar sus contenidos a una velocidad de 0,5 µl por hora durante un periodo de 14 días. Usando esta velocidad nominal de infusión, se calcularon los niveles de las dosis para ser de 24 µg/día, 2,4 µg/día, 0,24 µg/día y 0 µg/día para los grupos 1-4, respectivamente. [0403] Al término del periodo de 14 días, se sometieron a eutanasia los ratones y se recogió de cada ratón una muestra de aproximadamente 1 cm cuadrado de piel que rodeaba el área de la bomba. Se fijó la piel en formalina tamponada neutra al 10 %. Las muestras de piel fijadas con formalina se incluyeron en parafina, procesadas de manera rutinaria, se seccionaron a 5 µm y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Se examinaron los tejidos microscópicamente de una manera ciega por un patólogo veterinario legalmente certificado ACVP. Se señalaron los cambios histológicos, y se puntuó la gravedad de la acantosis (es decir, el engrosamiento epidérmico) de una manera subjetiva usando el siguiente sistema de puntuación: 0-normal, 1-acantosis mínima, 2-ligera acantosis, 3-acantosis moderada y 4-acantosis grave. Adicionalmente, se sometió a diagnóstico por imágenes la piel de los grupos seleccionados con una cámara digital CoolSnap (Roper Scientific, Inc., San Diego, CA) y se midió el

5 engrosamiento epidérmico usando software de histomorfometría (Scion Image para Windows, v. 4.02, Scion Corp., Frederick, MD). [0404] La administración de IL-22 a 2,4, y 24 µg/día dio como resultado un engrosamiento epidérmico según se muestra mediante la puntuación promedio de la acantosis (véase s) consistentemente mayor que el observado en la piel del grupo

10 control. Además, los animales tratados con IL-22 tuvieron también infiltraciones de células mononucleares en la epidermis. Estas infiltraciones no se observaron en los controles tratados con vehículo. [0405] En la tabla 9 a continuación, se muestran las puntuaciones de la acantosis de los engrosamientos epidérmicos y las medidas de los engrosamientos de la piel (en

15 unidades genéricas de píxeles) por grupos, como sigue: Tabla 9: Grupo Nº n = Bomba Acantosis Grosor promedio medido

1 6 24 µg de IL-22/día 3,0 ND 2 6 2,4 µg de IL-22/día 2,4 67,5 3 6 0,24 µg de IL-22/día 2,2 ND 4 4 Infusión de PBS 1,8 45,6

B. EFECTO DE IL-22RA2 SOBRE LA ACANTOSIS INDUCIDA POR IL-22 [0406] Se dividieron ratones (hembras, CH3/HEJ, 8 semanas de edad; Jackson Labs, Bar Harbor, ME) en ocho grupos de ocho animales cada uno. Se administró IL

20 22 mediante infusión constante mediante bombas miniosmóticas, según se describe en el Ejemplo 12A. Se cargaron las bombas miniosmóticas Alzet (modelo 2001; Alza Corporation Palo Alto, CA) en condiciones estériles con la proteína IL-22 (A nº 601F, 0,22 ml) diluida en disolución salina tamponada con fosfato (pH 7,0) a una concentración en el interior de la bomba de 0,22 mg/ml para los ratones del grupo 1-2,

25 0,45 mg/ml para los ratones del grupo 3-4, 0,9 mg/ml para los ratones del grupo 5-6, o 0 mg/ml (diluyente únicamente) para los ratones del grupo 7-8. Se diseñaron estas bombas para administrar sus contenidos a una velocidad de 0,5 µl por hora durante un periodo de a4 días. Usando esta velocidad nominal de infusión, se calcularon los niveles de las dosis para ser de 10 µg/día en los grupos 1-2, 5 µg/día en los grupos 3-4, 2,5 µg/día en los grupos 5-6 y de 0 µg/día para los grupos 7-8. Para cada par de grupos a un nivel dado de dosis de IL-22, se inyectó uno de los grupos tres veces (días 1, 3, y 5) con 0,1 mg de la proteína IL-22RA2 Fc (descrita en el presente documente) mediante ruta interperitoneal. Se inyectó al otro grupo de la misma manera con el

5 vehículo (PBS). [0407] En el día 8 del estudio, se sometieron los ratones a eutanasia y se recogió una muestra de aproximadamente 1 cm cuadrado de la piel que rodeaba el área de la bomba da cada ratón. Se fijó la piel en formalina tamponada neutra al 10 %. Las muestras de piel fijadas con formalina se incluyeron en parafina, procesadas de manera

10 rutinaria, se seccionaron a 5 µm y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Se examinaron los tejidos microscópicamente de manera ciega por un patólogo veterinario legalmente certificado. Se puntuó este estudio de una manera diferente que la del ejemplo anterior. Se determinó el número de capas en la epidermis, desde el estrato basal al estrato granuloso. Basándose en los resultados, se puntuaron las secciones como sigue. 0

15 normal (2-3 capas), 1-ligero engrosamiento (3-4 capas), 2-engrosamiento moderado (46 capas), y 3-engrosamiento grave (> de 6 capas). [0408] La administración de IL-22 a 2,5, 5, 10 µg/día di como resultado engrosamiento epidérmico (véase la Tabla 10. Además, los animales tratados con IL22 tuvieron también infiltraciones de células mononucleares en la epidermis. No se

20 observaron estas infiltraciones en los controles tratados con vehículo. La administración concurrente de 100 µg de IL-22RA2 (3 inyecciones) disminuyó la cantidad de engrosamiento epidérmico en los ratones tratados con 5 µg de IL-22/día. [0409] En la Tabla 10, a continuación, se muestran las puntuaciones de la acantosis de los engrosamientos epidérmicos, como sigue:

25

Tabla 10:

Grupo Nº

n = Bomba Inyección Acantosis promedio

1

8 2,5 µg de IL-22/día 100 µl de vehículo (3 inyecciones) 1,1

2

8 2,5 µg de IL-22/día 100 µg de IL-22RA2 (3 inyecciones) 0,8

3

8 5 µg de IL22/día 100 µl de vehículo (3 inyecciones) 2,0

4

8 5 µg de IL22/día 100 µg de IL-22RA2 (3 inyecciones) 0,6

5

8 10 µg de IL-22/día 100 µl de vehículo (3 inyecciones) 2,0

6

8 10 µg de IL-22/día 100 µg de IL-22RA2 (3 inyecciones) 1,9

7

8 Vehículo 100 µl de vehículo (3 inyecciones) 0,0

8

8

Vehículo 100 µg de IL-22RA2 (3 inyecciones) 0,0

Se observaron también los engrosamientos epidérmicos y las infiltraciones inmunes en pieles psoriáticas humanas. El fenotipo de la piel observado en la inyección subcutánea de IL-22 indicó adicionalmente el potencial papel de IL-22 en la patogénesis de la

5 psoriasis. El hecho de que IL-22RA2-Fc pueda neutralizar el fenotipo de la piel inducido por IL-22 sugiere que el uso potencial de otros antagonistas de IL-22 tales como el anticuerpo neutralizante dirigido contra IL-22 o el receptor soluble para el tratamiento de la psoriasis y otras enfermedades inflamatorias inducidas por IL-22.

C. EFECTO DE LOS RECEPTORES SOLUBLES DE IL-22RA Y DE LOS

10 ANTICUERPOS DIRIGIDOS CONTRA IL-22RA SOBRE LA ACANTOSIS INDUCIDA POR IL-22 O INDUCIDA POR IL-20 [0410] Se evaluó la actividad de los receptores solubles de IL-22RA, o de un anticuerpo de IL-22RA, para inhibir la actividad in vivo de IL-22 o de IL-20 de una manera similar, usando el criterio de valoración histológico de la acantosis producida

15 por la infusión subcutánea de la proteína IL-22 o IL-20. En un ejemplo de este modelo, se implantaron ratones C3H/HEJ con bombas miniosmóticas subcutáneas según se ha descrito en los ejemplos 12(A) y 12(B) anteriores. Durante el periodo de exposición a IL-22 o IL-20, se trataron los ratones mediante inyección con el anticuerpo monoclonal purificado de IL-22 o se inyectaron similarmente con vehículo como control. Al término del periodo de infusión de IL-22, se podrían tomar muestras de la piel procedentes del área de la bomba para el análisis histológico. De manera similar a la del antagonista de IL-22 del receptor soluble de IL-22RA2, se espera que los receptores solubles de IL-22RA antagonistas de IL-22 o de IL-20, o los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA de la presente invención muestren reducción en el engrosamiento epidérmico y en las infiltraciones de células inmunes producidas por IL-22 o IL-20, y por tanto, sean útiles como antagonistas de IL-22 o de IL-20 como terapéuticas para la psoriasis y otras enfermedades inflamatorias inducidas por IL-22 o IL-20.

EJEMPLO 14 IL-22 ESTÁ REGULADO EN EXCESO EN MUESTRAS DE ARN

PROCEDENTES DE MUESTRAS DE PIEL PSORIÁTICA HUMANA MUESTRAS DE ARN: [0411] Se obtuvieron muestras de piel normal así como piel de pacientes psoriáticos. La última incluyó piel afectada de psoriasis estable tipo placa y de la piel adyacente no afectada. Se aisló ARN de muestras de piel humana mediante procedimientos convencionales. La calidad e integridad de las muestras de ARN se comprobaron mediante un analizador Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Waldbronn Alemania). Cebadores y sondas para PCR-RT cuantitativa [0412] La PCR-RT cuantitativa en tiempo real mediante el sistema de detección ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) se ha descrito con anterioridad (Consultar, Heid, C.A. y col., Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson, U.E.M. y col., Genome Research 6:995-1001, 1996; Sundaresan, S. y col., Endocrinology 139:4756-4764, 1998. Este procedimiento incorpora el uso de una sonda específica de gen que contiene colorantes tanto indicador como de detención rápida. Cuando la sonda está intacta, la emisión del colorante es negativa debido a la estrecha vecindad del colorante de detención rápida. Durante la extensión PCR usando cebadores específicos directo e inverso específicos del gen, la sonda se escinde mediante la actividad nucleolítica 5’ a 3’ de la rTth ADN polimerasa que libera el colorante indicador desde la sonda dando como resultado un incremento en la emisión fluorescente. [0413] Los cebadores y sondas usados en análisis RT-PCR cuantitativo de la expresión de IL-22 se diseñaron mediante el programa informático para diseño de cebadores Primer Express™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Los cebadores de IL-22 humana se diseñaron ampliando una unión intrón-exón para eliminar la amplificación del ADN genómico. El cebador directo, ZC42459 (SEC. DE ID Nº 22) y el cebador inverso, ZC42458 (SEC. DE ID Nº 23) se usaron en una reacción de PCR (a continuación) a una concentración de 800 nM para sintetizar un producto de 72 pb. La correspondiente sonda de IL-22, ZC42460 (SEC. DE ID Nº 24) se sintetizó y etiquetó en las propias instalaciones de ZymoGenetics. La sonda de IL-22 se etiquetó en el extremo 5’ con un colorante fluorescente indicador (6-carboxifluoresceina) (FAM) (PE Applied Biosystems) y en el extremo 3’ con un colorante fluorescente de detención rápida (6-carboxitetrametil-rodamina) (TAMRA) (PE Applied Biosystems).

C. RT-PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL [0414] Se determinaron los niveles relativos de ARNm de ARNm de IL-22 analizando muestras de ARN total mediante el kit TaqMan EZ RTPCR Core Reagents (PE Applied Biosystems). Se preparó una segunda vuelta de transcripciones de IL-22 para generar una curva patrón usada para cuantificación. La curva estaba constituida por diluciones en serie decimales comprendidas entre aproximadamente 1e8 a 1e3 de copias totales del mensaje completo para IL-22 y cada punto de la curva patrón se analizó por triplicado. Las muestras de ARN total procedentes de la piel también se analizaron por triplicado para determinar los niveles de transcripciones para la IL-22 humana y los niveles de hGUS como control endógeno. En un volumen total de 25 �l, cada muestra de ARN se sometió a reacción RT-PCR TaqMan EZ (PE Applied Biosystems) conteniendo: aproximadamente 25 ng de ARN total en agua tratada mediante DEPC (exenta de Dnasa/Rnasa); cebadores adecuados (aproximadamente 800 nM de ZC 42459 (SEC. DE ID Nº 22) y ZC 42458 (SEC. DE ID Nº 23); sonda adecuada (aproximadamente 100 nM de ZC 42460 (SEC. DE ID Nº 24); tampón 1X TaqMan EZ; acetato de manganeso 3 mM; 300 mM de cada uno de d-CTP, d-ATP, y d-GTP y 600 mM de d-UTP; rTth ADN polimerasa (0,1 U/

�l); y AmpErasa UNG (0,01 U/

�l). Las condiciones de ciclación térmica fueron como sigue: una etapa de tratamiento inicial con UNG de un ciclo a 50˚C durante 2 minutos; seguido por una etapa de transcripción inversa (RT) de un ciclo a 60˚C durante 30 minutos; seguido por una desactivación de la etapa de UNG de un ciclo a 95˚C durante 5 minutos; seguido por 40 ciclos de amplificación a 94˚C durante 20 segundos y 60˚C durante 1 minuto. [0415] Los niveles relativos de ARN de IL-22 se determinaron mediante el método de la curva patrón según descripción del fabricante, PE Biosystems (User Bulletin nº2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Relative Quantitation of Gene Expression, Diciembre 11, 1997). Se usaron las mediciones de hGUS para normalizar los niveles de IL-22. Los datos se muestran en la Tabla 11 siguiente.

Tabla 11

Muestra de piel

IL-22

Normal

0

No afectada

0

Afectada

1149

5 [0416] No fue posible detectar el ARNm de IL-22 en muestras de piel procedentes de pacientes normales o de áreas no afectadas. Por el contrario, se produjo una fuerte regulación en exceso del mensaje de IL-22 en la piel afectada procedente de pacientes psoriáticos. Estos datos apoyan una fuerte asociación con la dolencia para IL-22 respecto de la psoriasis humana.

10 [0417] La expresión en exceso de IL-22 se ha demostrado en lesiones psoriáticas humanas, sugiriendo la implicación de IL-22 en la psoriasis humana. Adicionalmente, según se describe en el presente documento, la expresión en exceso de IL-22 en ratones transgénicos mostró engrosamiento epidérmico e implicación de células inmunes lo que es indicativo de un fenotipo psoriático, y además la inyección de IL-22

15 en ratones normales mostró engrosamiento epidérmico e implicación de células inmunes lo que es indicativo de un fenotipo psoriático destruido por el antagonista del receptor soluble IL-22RA2. Datos in vivo de este tipo sugieren adicionalmente que IL22 proinflamatoria está implicada en la psoriasis. De esta manera, los antagonistas de la actividad de IL-22 como los anticuerpos monoclonales dirigidos contra la IL-22

20 humana de la presente invención, así como los receptores solubles y anticuerpos de los mismos, son útiles en el tratamiento terapéutico de enfermedades inflamatorias, particularmente como antagonistas de IL-22 en el tratamiento de la psoriasis. Adicionalmente, los antagonistas de la actividad de IL-22, como los anticuerpos monoclonales dirigidos contra la IL-22 humana de la presente invención, así como los

25 receptores solubles y anticuerpos de los mismos, son útiles en el tratamiento terapéutico de otras enfermedades inflamatorias por ejemplo como antagonistas de IL22 en el tratamiento de la dermatitis atópica, IBD, colitis, endotoxemia, artritis, artritis reumatoide, y artritis psoriática, síndrome de dificultad respiratoria (ARD), choque séptico, insuficiencia multiorgánica, lesión pulmonar inflamatoria tal como asma o

30 bronquitis, neumonía bacteriana, psoriasis, eczema, dermatitis atópica y de contacto, y enfermedad inflamatoria del intestino como colitis ulcerosa y Enfermedad de Crohn.

EJEMPLO 15 IL-22 ESTÁ REGULADA EN EXCESO EN MUESTRAS DE PIEL HUMANA CON DERMATITIS ATÓPICA [0418] Se obtuvieron muestras de piel normal (n=4) así como piel procedente de pacientes con dermatitis atópica (n=4). Se aisló ARN procedente de muestras de piel humana con procedimientos convencionales. La integridad y la calidad de las muestras de ARN se comprobó mediante el analizador Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Waldbronn Alemania). Cebadores y sondas para RT-PCR cuantitativa [0419] La RT-PCR cuantitativa en tiempo real usando el sistema ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) se ha descrito con anterioridad (Consultar, Heid, C.A. y col., Genome Research 6:986994, 1996; Gibson, U.E.M. y col., Genome Research 6:995-1001, 1996; Sundaresan,

S. y col., Endocrinology 139:4756-4764, 1998. Este procedimiento incorpora el uso de una sonda específica de gen que contiene colorantes tanto indicador como de detención rápida. Cuando la sonda está intacta, la emisión del colorante es negativa debido a la estrecha vecindad del colorante de detención rápida. Durante la extensión PCR usando cebadores específicos directo e inverso específicos del gen, la sonda se escinde mediante la actividad nucleolítica 5’ a 3’ de la rTth ADN polimerasa que libera el colorante indicador desde la sonda dando como resultado un incremento en la emisión fluorescente. [0420] Los cebadores y sondas usados en el análisis mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real de la expresión de IL-22 se diseñaron usando el programa informático de diseño de cebadores Primer Express™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Los cebadores de IL-22 humana se diseñaron ampliando una unión intrónexón para eliminar la amplificación del ADN genómico. El cebador directo, ZC42459 (SEC. DE ID Nº 22) y el cebador inverso, ZC42458 (SEC. DE ID Nº 23) se usaron en una reacción de PCR (más adelante) a una concentración de 800 nM para sintetizar un producto de 72 pb. La correspondiente sonda de IL-22, ZC42460 (SEC. DE ID Nº 24) se sintetizó y etiquetó en las propias instalaciones de ZymoGenetics. La sonda de IL22 se etiquetó en el extremo 5’ con un colorante indicador fluorescente (6-carboxifluoresceina) (FAM) (PE Applied Biosystems) y el extremo 3’ con un colorante de detención rápida fluorescente (6-carboxitetrametil-rodamina) (TAMRA) (PE Applied Biosystems).

C. RT-PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL [0421] Se determinaron los niveles relativos de ARNm de ARNm de IL-22 analizando muestras de ARN total mediante el kit TaqMan EZ RTPCR Core Reagents (PE Applied Biosystems). Se preparó una segunda vuelta de transcripciones de IL-22 para generar una curva patrón usada para cuantificación. La curva estaba constituida por diluciones en serie decimales comprendidas entre aproximadamente 1e8 a 1e3 de copias totales del mensaje completo para IL-22 y cada punto de la curva patrón se analizó por triplicado. Las muestras de ARN total procedentes de la piel también se analizaron por triplicado para determinar los niveles de transcripciones para la IL-22 humana y los niveles de hGUS como control endógeno. En un volumen total de 25 �l, cada muestra de ARN se sometió a reacción RT-PCR TaqMan EZ (PE Applied Biosystems) conteniendo: aproximadamente 25 ng de ARN total en agua tratada mediante DEPC (exenta de Dnasa/Rnasa); cebadores adecuados (aproximadamente 800 nM de ZC 42459 (SEC. DE ID Nº 22) y ZC 42458 (SEC. DE ID Nº 23); sonda adecuada (aproximadamente 100 nM de ZC 42460 (SEC. DE ID Nº 24); tampón 1X TaqMan EZ; acetato de manganeso 3 mM; 300 mM de cada uno de d-CTP, d-ATP, y d-GTP y 600 mM de d-UTP; rTth ADN polimerasa (0,1 U/

�l); y AmpErasa UNG (0,01 U/

�l). Las condiciones de ciclación térmica fueron como sigue: una etapa de tratamiento inicial con UNG de un ciclo a 50˚C durante 2 minutos; seguido por una etapa de transcripción inversa (RT) de un ciclo a 60˚C durante 30 minutos; seguido por una desactivación de la etapa de UNG de un ciclo a 95˚C durante 5 minutos; seguido por 40 ciclos de amplificación a 94˚C durante 20 segundos y 60˚C durante 1 minuto. [0422] Los niveles relativos de ARN de IL-22 se determinaron usando el método del a curva patrón según descripción del fabricante, PE Biosystems (User Bulletin nº2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Relative Quantitation of Gene Expression, Diciembre 11, 1997). Se usaron las medidas de hGus para normalizar los niveles de IL-22. [0423] No fue posible detectar el ARNm de IL-22 en muestras de piel procedentes de pacientes normales. Por el contrario, se produjo una importante regulación en exceso del mensaje de IL-22 en 3 de 4 muestras de piel procedentes de pacientes con dermatitis atópica (aproximadamente 400 - 2300 copias). Estos datos soportan una fuerte asociación en la dolencia entre el IL-22 y la dermatitis atópica humana. [0424] La expresión en exceso de IL-22 se ha demostrado en pieles con dermatitis atópica humana, sugiriendo que IL-22 está implicada en la dermatitis atópica humana. Adicionalmente, según se describe en el presente documento, la expresión en exceso de IL-22 en ratones transgénicos mostró engrosamiento epidérmico e implicación de células inmunes lo que es indicativo de un fenotipo de dermatitis atópica, y además una inyección de IL-22 en ratones normales mostró engrosamiento epidérmico e implicación de células inmunes lo que es indicativo de un fenotipo de dermatitis atópica destruido por el antagonista del receptor soluble IL-22RA2. Dichos datos in vivo sugieren además que el IL-22 proinflamatorio está implicado en la dermatitis atópica. De esta manera, los antagonistas de la actividad de IL-22, tal como los anticuerpos monoclonales dirigidos contra la IL-22 humana de la presente invención, así como los receptores solubles y anticuerpos de los mismos, son útiles en el tratamiento terapéutico de enfermedades inflamatorias, particularmente como antagonistas de IL-22 en el tratamiento de la dermatitis atópica. Adicionalmente, los antagonistas de la actividad de IL-22, tal como los anticuerpos monoclonales dirigidos contra la IL-22 humana de la presente invención, así como los receptores solubles y anticuerpos de los mismos, son útiles en el tratamiento terapéutico de otras enfermedades inflamatorias por ejemplo como antagonistas de IL-22 en el tratamiento de la dermatitis atópica, ID, colitis, endotoxemia, artritis, artritis reumatoide, and artritis psoriática, síndrome de dificultad respiratoria (ARD), choque séptico, insuficiencia multiorgánica, lesión pulmonar inflamatoria tal como asma o bronquitis, neumonía bacteriana, dermatitis atópica, eczema, dermatitis atópica y de contacto, y enfermedad inflamatoria del intestino tal como colitis ulcerosa and Enfermedad de Crohn.

EJEMPLO 16 ANTICUERPOS POLICLONALES DE IL-22 HUMANA [0425] Se prepararon anticuerpos policlonales dirigidos contra IL-22 por inmunización de 2 conejos hembra New Zealand con el polipéptido IL-22 humano recombinante purificado maduro (restos de aminoácido 22 (Ala) a 167 (Ile) de la SEC. DE ID Nº 6), producido a partir de células BHK (IL-22-BHK). Se proporcionó a cada conejo una inyección intraperitoneal (ip) de 200 �g de proteína purificada en adyuvante completo de Freund seguido por inyecciones IP de estimulación de 100 �g de proteína purificada en adyuvante completo de Freund cada tres semanas. Entre siete y diez días después de la segunda inyección de estímulo (3 inyecciones en total), se extrajo sangre de los animales y se recogió el suero. A continuación, se extrajo sangre y se estimuló a los animales cada tres semanas. [0426] Los anticuerpos policlonales específicos de IL-22 humana se purificaron por afinidad del inmunosuero de conejo usando una columna para proteínas CNBrSEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB) que se preparó usando 10 �g de la proteína recombinante purificada del antígeno específico contra IL-22-BHK humana por gramo de CNBr-SEPHAROSE, seguido por 20X diálisis en PBS durante toda la noche. Los anticuerpos específicos de IL-22 humana se caracterizaron mediante ELISA utilizando 500 ng/ml de la proteína recombinante purificada IL-22-BHK humana como diana del anticuerpo. El límite inferior de detección (LLD) del anticuerpo de conejo dirigido contra IL-22 humana purificado por afinidad es de 280 pg/ml respecto de su antígeno recombinante purificado específico IL-22-BHK humano. [0427] Los anticuerpos policlonales específicos de IL-22 humana se caracterizaron adicionalmente por su capacidad de bloquear la actividad proliferativa de las células ("ensayo de neutralización") de la IL-22-BHK humana recombinante purificada en células BaF3/CRF2-4/IL-22RA (Ejemplo 2 y Ejemplo 3). Un exceso molar de 50X de los anticuerpos policlonales específicos de IL-22 humana fue suficiente para inhibir la proliferación celular.

EJEMPLO 17 ANTICUERPOS MONOCLONALES DIRIGIDOS CONTRA IL-22 HUMANA [0428] Se prepararon anticuerpos monoclonales por inmunización de 4 ratas hembra Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), con el polipéptido IL-22 humano maduro recombinante purificado (restos de aminoácido 22 (Ala) a 167 (Ile) de la SEC. DE ID Nº 6), producidos a partir de células BHK (IL-22BHK). Se proporcionó a cada rata una inyección intraperitoneal (IP) de 100 �g de proteína IL-22 recombinante humana purificada en adyuvante completo de Freund (Pierce, Rockford, IL) seguido por inyecciones IP de estimulación de 50 mg de la proteína recombinante purificada en adyuvante incompleto de Freund cada dos semanas. Entre siete y diez días después de la tercera inyección de estímulo se extrajo sangre de los animales y se recogió el suero. [0429] Las muestras de suero de rata específico de IL-22 humana se caracterizaron mediante ELISA utilizando 500 ng/ml de las dianas de anticuerpo IL-22-BHK humano biotinilado y 500 ng/ml IL-22 de ratón biotinilado, muIL-22-E.coli biotinilado (R+D Systems, Minneapolis, MN). Tres muestras de suero de rata tuvieron títulos respecto de la diana de anticuerpo específica de IL-22-BHK humano biotinilado a una dilución de 1:1E5 y respecto de la diana de anticuerpo específica para muIL-22-E.coli biotinilado a una dilución de 1:1E4. [0430] Se cosecharon esplenocitos y células de nódulos linfáticos de las 2 ratas con títulos más altos y se fusionaron con células de mieloma SP2/0 (ratón) usando PEG 1500 en dos procedimientos de fusión independientes (relación de fusión 4:1, esplenocitos a células de mieloma, "Antibodies A Laboratory Manual, E. Harlow and D.Lane, Cold Spring Harbor Press). Tras 10 días de crecimiento tras la fusión, las combinaciones de hibridomas productoras de anticuerpos específicos se identificaron mediante ELISA utilizando la proteína recombinante IL-22-BHK humana biotinilada y la proteína recombinante muIL-22-E.coli biotinilada como dianas diferenciadas. Las combinaciones de hibridoma que dieron positivo en ambos protocolos ELISA se analizaron posteriormente respecto a su capacidad para bloquear o reducir la actividad proliferativa de células ("ensayo de neutralización") de la muIL-22-E.coli purificada recombinante en células BaF3/CRF2-4/IL-22RA (Ejemplo 2 y Ejemplo 3). [0431] Las combinaciones de hibridoma con resultados positivos solamente en ELISA o en ELISA y en el "ensayo de neutralización" se clonaron al menos dos veces por dilución limitante. [0432] Los anticuerpos monoclonales purificados del medio de cultivo tisular se caracterizaron por su utilidad en ELISA para la determinación cuantitativa de IL-22 humana recombinante y natural en muestras de suero de ratón y ser humano. Los dos anticuerpos seleccionados dieron resultado en un ensayo cuantitativo con un límite de detección inferior de aproximadamente 1 ng/ml de huIL-22-E.coli recombinante en suero 100 % humano Los anticuerpos monoclonales purificados del medio de cultivo tisular se caracterizaron por su capacidad para bloquear o reducir la actividad proliferativa de células ("ensayo de neutralización") de huIL-22-E.coli recombinante purificado o muIL-22-E.coli en células BaF3/CRF2-4/IL-22RA (Ejemplo 2 y Ejemplo 3). Se identificaron de esta forma seis anticuerpos monoclonales "neutralizantes". Los hibridomas que expresaban los anticuerpos monoclonales neutralizantes de la IL-22 humana anteriormente descritos se depositaron en el depositario de patentes de la American Type Tissue Culture Collection (ATCC; Manassas VA) como depósito original según el Tratado de Budapest y se les otorgó los siguientes números de acceso ATCC: clon 266,16,1,4,4,1 (Designación del depósito de patentes de la ATCC PTA5035); clon 266,5,1,2,2,3 (Designación del depósito de patentes de la ATCC PTA5033); clon 267,17,1,1,4,1 (Designación del depósito de patentes de la ATCC PTA5038); clon 267,4,1,1,4,1 (Designación del depósito de patentes de la ATCC PTA5037); clon 266,12,6,1,3,2,1 (Designación del depósito de patentes de la ATCC PTA5034); clon 266,19,1,10,5,2 (Designación del depósito de patentes de la ATCC PTA5036); y clon 267,9,1,1,4,1 (Designación del depósito de patentes de la ATCC PTA5353).

EJEMPLO 18 ANTICUERPOS MONOCLONALES DIRIGIDOS CONTRA IL-22RA [0433] Se prepararon anticuerpos monoclonales por inmunización de 4 ratas Lewis (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA), con la proteína de fusión recombinante escindida y purificada, muIL-22RA-Fc (SEC. DE ID Nº 4). Se proporcionó a cada rata una inyección intraperitoneal (IP) de 100 �g de la proteína de fusión recombinante purificada en adyuvante completo de Freund (Pierce, Rockford, IL) seguido por inyecciones IP de estímulo de 50 �g de la proteína recombinante purificada adyuvante incompleto de Freund cada dos semanas durante cuatro semanas. Tras las primeras cuatro semanas de inmunizaciones, las inyecciones IP de estímulo de 50�g de proteína recombinante purificada escindida combinadas con la proteína de transporte hemocianina de lapa californiana (KLH, Pierce, Rockford, IL) en incompleto de Freund se administraron cada dos semanas durante cuatro semanas. Entre siete y diez días tras la administración de la cuarta inyección de estímulo, se extrajo sangre de los animales y se recogió el suero. [0434] Las muestras de suero de rata específicas de muIL-22RA se caracterizaron mediante ELISA utilizando 5000 ng/ml de la proteína de fusión recombinante purificada muIL-22RA-Fc como diana de anticuerpo específica y una proteína de fusión no relacionada como diana de anticuerpo no específica. [0435] Se cosecharon los esplenocitos de la rata con mayores títulos y se fusionaron con células de mieloma SP2/0 (ratón) en un protocolo de fusión optimizado mediado por PEG (Rockland Immunochemicals). Tras 12 días de crecimiento se identificaron combinaciones de hibridomas productoras de anticuerpos específicos mediante ELISA utilizando 500 ng/ml de cada una de las proteínas de fusión recombinante purificada muIL-22RA-Fc-Bv como diana de anticuerpo específica y una proteína de fusión no relacionada como diana de anticuerpo no específica. Las combinaciones de hibridoma que dieron positivo para la diana de anticuerpo específica solamente se analizaron posteriormente respecto de su capacidad para bloquear o reducir la actividad proliferativa de células ("ensayo de neutralización") de muIL-22E.coli recombinante purificado en células BaF3/CRF2-4/IL-22RA (Ejemplo 2 y Ejemplo 3) y la capacidad para unirse mediante análisis FACS a células BaF3/CRF24/IL-22RA (Ejemplo 2 y Ejemplo 3) como diana del anticuerpo. [0436] Las combinaciones de hibridoma que dieron un resultado positivo específico en el ensayo ELISA y resultados positivos bien en FACS o en el "ensayo de neutralización" se clonaron al menos dos veces por dilución limitante.

[0437] Los anticuerpos monoclonales de los medios de cultivo tisular se caracterizaron por su capacidad para bloquear o reducir la proliferación de células BaF3/CRF2-4/IL-22RA (Ejemplo 2 y Ejemplo 3), que crecieron en presencia de las proteínas recombinantes purificadas muIL-22-E.coli o huIL-22-BHK. Se identificaron catorce anticuerpos monoclonales "neutralizantes" y se clonaron nueve anticuerpos monoclonales. [0438] Los hibridomas que expresaban los anticuerpos monoclonales neutralizantes para IL-22RA de ratón anteriormente descritos se depositaron en el depositario de patentes American Type Tissue Culture Collection (ATCC; Manassas VA) como depósitos originales según el Tratado de Budapest y se les otorgó los siguientes números de acceso ATCC: clone R2,1,1G11,1 (Designación del depósito de patentes de la ATCC PTA-6035); clon R2,1,5F4,1 (Designación del depósito de patentes de la ATCC PTA-6024); clon R2,1,5H8,1 (Designación del depósito de patentes de la ATCC PTA-6025); clon R2,1,12G7,1 (Designación del depósito de patentes de la ATCC PTA-6036); clon R2,1,13C8,1 (Designación del depósito de patentes de la ATCC PTA-6037); clon R2,1,15E2,1 (Designación del depósito de patentes de la ATCC PAT-6038); clon R2,1,16C11,1 (Designación del depósito de patentes de la ATCC PTA-6039); clon R2,1,18C8,1 (Designación del depósito de patentes de la ATCC PTA-6040); y clon R2,1,21G8,2(Designación del depósito de patentes de la ATCC PTA-6111). [0439] Los hibridomas que expresan los anticuerpos monoclonales del IL-22RA humano se depositaron en el depositario de patentes American Type Tissue Culture Collection (ATCC; Manassas VA) como depósitos originales según el Tratado de Budapest y se les otorgó los siguientes números de acceso ATCC: 280,46,3,4 (Designación del depósito de patentes de la ATCC PTA-6284); clon 281,73,49,1,1 (Designación del depósito de patentes de la ATCC PTA-6285); clon 283,4,1,2 (Designación del depósito de patentes de la ATCC PTA-6287); clon 283,52,5,4 (Designación del depósito de patentes de la ATCC PTA-6311); y clon 283,108,2,3 (Designación del depósito de patentes de la ATCC PTA-6286). Ejemplo 19 Afinidad de unión de dos MAb dirigidos contra Ms-IL-22RA de rata [0440] Se inmovilizó anticuerpo gamma específico de cabra dirigido contra IgG-Fc de rata (Jackson) en un chip CM5 Biacore. El ensayo se optimizó para enlazar cada mAb en la superficie de captura dirigida contra rata y a continuación se inyectó una serie de concentraciones de IL-22RA entre los mAb para verificar la asociación (Ka) y la disociación (Kd). Tras las pruebas preliminares, se observó unión no específica entre la proteína de fusión y la superficie de captura del chip. Se adquirió un vial de IL22RA que tenía la etiqueta Fc4 escindida por trombina y posteriormente se ensayo sin mostrar efectos de fondo. Tras cada ensayo, la superficie se volvió a regenerar con el

5 anticuerpo dirigido contra rata con 2 inyecciones de HCl 20mM. Los datos se generaron para cada MAb y se usó un programa informático (BIAevaluation versión 3,2, Pharmacia BIAcore, Uppsala, Suecia) para evaluar la cinética de la unión del anticuerpo dirigido contra anti-IL-22RA unido a la proteína IL-22RA, como se muestra en la siguiente Tabla 12:

10

Tabla 12

Clon R2,1,5F4,1**

Clon R2,1,15E2,1**

ka (M-1s-1)

1,49E+06 ka (M-1s-1) 1,76E+06

kd (s-1)

1,70E-04 kd (s-1) 2,55E-04

KA (M-1)

8,76E+09 KA (M-1) 6,66E+09

KD (M)

1,14E-10 KD (M) 1,504E-10

Chi2

2,08 Chi2 1,5

** Se muestran las constantes de velocidad del equilibrio de asociación (Ka) y disociación (Kd) para cada MAB dirigido contra IL-22RA y los valores están comprendidos en los límites del equipo. Chi2 se refiere a la suma de los cuadrados de los residuos entre las curvas de unión y las curvas de ajuste de evaluación. Cuando más cerca de 0, más confianza en los datos.

[0441] Como se muestra en la Tabla 12, ambos MAb dirigidos contra IL-22RA se unen fuertemente a la proteína IL-22RA, como se evidencia por la unión en la concentración picomolar al IL-22RA (marca Fc4 escindida con trombina). Este dato se

5 muestra con buena confianza según los bajos valores Chi2 y muestra que el clon mAb R2.1.5F4.1 tiene una afinidad ligeramente superior por el receptor de IL-22RA.

EJEMPLO 20 ANÁLISIS INMUNOHISTOQUÍMICO DE LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA IL-22 IN VIVO EN MUESTRAS DE TEJIDO

10 A. RESUMEN [0442] El análisis inmunohistoquímico (IHC) de la expresión y localización de la proteína IL-22 se consiguió usando un anticuerpo monoclonal dirigido contra IL-22 humana (anti-hIL-22) Mab 266,19,1,10,5,2) en las siguientes muestras de tejido: Grid normal y Grid tumoral humanos múltiples; pancreatitis humana, muestras de

15 enfermedad pulmonar y renal; muestras de piel con psoriasis humana; INS IL-22 TG (expresado a partir del promotor de la insulina en rata) y páncreas de ratón de tipo natural; muestra de piel de ratón muIL-22-EuLCK TG y natural; y muestra de colon de ratón DSS (natural y con inhibición de IL-22). Adicionalmente, se comparó el modelo de tinción del anticuerpo monoclonal MAB 266,19,1,10,5,2 anti-hIL-22 (Ejemplo 17)

20 vs. el anticuerpo policlonal (conejo dirigido contra hIL-22) (Ejemplo 16). [0443] Los anticuerpos monoclonales MAb 266,16,1,4,4,1 y MAb 266,19,1,10,5,2 de rata dirigidos contra IL-22 humana (Ejemplo 17) ensayados mostraron tinción en la mayoría de IL-22 BHK/humano pero también en parte de las células IL-22 BHK/ratón (1-5 %), y se usaron para investigar la distribución en el tejido y la expresión de IL-22 en muestras tanto de paciente humano como de modelo animal y se usaron para comparar el modelo de tinción con el del anticuerpo policlonal de conejo para confirmar los resultados.

B. Materiales y procedimientos [0444] Células y tejidos fijados con formalina e incrustados en parafina procedentes de fuentes humanas y modelos animales de ratón se seccionaron a 5 mm. Las células incluyendo células BHK expresaban IL-22 de ser humano o de ratón y de tipo natural como control positivo y control negativo, respectivamente. Los tejidos humanos incluyeron una extensión de control multitisular (NormalGrid™; Biomeda, Foster City, CA) con 50 secciones de varios tejidos humanos normales (por ejemplo, cerebro, glándula pituitaria, glándula adrenal, mama, riñón, corazón, estómago, intestino delgado, intestino grueso, hígado fetal, hígado, piel, páncreas, pulmón, amígdala, ovario, testículo, próstata, útero, placenta, tiroides y bazo); una extensión de control multitisular (TumorGrid™; Biomeda, Foster City, CA) con 50 secciones de varios tumores humanos (por ejemplo, adenocarcinoma de pulmón, adenocarcinoma de de hígado, adenocarcinoma de riñón, adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma de mama, adenocarcinoma de tiroides, adenocarcinoma de estómago, adenocarcinoma de próstata, adenocarcinoma de páncreas, adenocarcinoma de ovario, linfoma, melanoma, sarcoma de Ewing, sarcoma epiteloide, sarcoma MFH, sarcoma Rhabdo, carcinoide, carcinoma no diferenciado, mesotelioma, teratoma y seminoma); carcinoma de pulmón procedente de CHTN (Cooperation Human Tissue Network, Cleveland, Ohio); páncreas normal, páncreas con pancreatitis crónica, pulmón con inflamación perivascular crónica, riñones con tanto glomeruloesclerosis multifocal, glomerulonefritis mesangioproliferativa o fibrosis intersticial esclerótica glomerular procedente de NDRI (National Disease Research Interchange, Filadelfia, PA); y muestras de piel psoriática procedente de ser humano. Los tejidos de ratón incluyeron colon de un modelo animal de enfermedad inflamatoria del intestino (modelo DSS dado a conocer en el presente documento, ratones hembra Webster) y de IL-20 de tipo natural e inhibida en un modelo animal de colitis (ratones DSS, ratones hembra de tipo natural y con inhibición en IL-20 (IL-20)) tratados bien con vehículo o DSS al 4 % en el agua de bebida durante 7 días; y muestras de piel de modelos animales transgénicos (TG) incluyendo animales mIL-22-EuLCK TG y mIL-22-INS control y TG. Se tiñó una sección por bloque/extensión microscópica con hematoxilina y eosina (H&E) para examen histológico y las secciones siguientes se tiñeron inmunohistoquímicamente para determinar la expresión y localización de la proteína IL-22. [0445] Para la inmunohistoquímica, las extensiones microscópicas de células y tejidos se colocaron en portas de microscopio ChemMate™ Capillary Gap Plus (BioTek, Winooski, Vermont), se secaron a 60˚C en estufa durante 60 minutos se eliminó la cera en condiciones estándar de 3 x 5 minutos en xileno, 4 minutos en EtOH al 100 %, 3 minutos en EtOH al 100 %, y 2 minutos en EtOH al 95 %. Las secciones de tejido se sometieron a continuación a un procedimiento de 20 minutos para recuperar el epitopo inducido por enzima a 37˚C con pepsina (NeoMarkers Fremont CA) seguido por una etapa de bloqueo con avidina/biotina realizado según las instrucciones de los fabricantes (Zymed, South San Francisco, CA). Se utilizaron para la tinción el equipo TechMate 500™ Automated Immunostainer y el protocolo inmunohistoquímico de la Inmunoperoxidasa (IP) con sistema de detección del complejo avidina-biotina (Ventana Biotek Systems, Tucson, AZ). El equipo TechMate 500™ Automated Immunostainer empleado emplea el principio de acción capilar y el protocolo IP utilizó un tipo de inmunotinción que se denomina técnica "sándwich". Las extensiones microscópicas se bloquearon previamente con suero de cabra normal al 5 % (Vector, Burlingame CA) en PBS durante 10 minutos seguido por 1X de tampón de lavado 1 (Signet, Dedham MA) y a continuación se incubaron con un anticuerpo primario contra IL-22 (MAB 266,19,1,10,5,2) (Ejemplo 17), purificado por PAS a 2,04mg/ml) diluido a 1:800 durante 30 minutos a temperatura ambiente seguido por 5X de tampón de lavado 1. El anticuerpo primario se diluyó en el tampón de dilución de anticuerpo TechMate 500™ (Ventana). La IgG dirigida contra rata biotinilada (Vector) diluida a 1:200 junto a suero de cabra normal al 5 % y leche en polvo desnatada al 2,5 % en PBS se usó como anticuerpo ligante durante 25 minutos a temperatura ambiente seguido por 1X de tampón de lavado 1 y 1X de tampón de lavado 2 y 3 (Signet). Las extensiones microscópicas de tejido se sometieron a 3X7 minutos de bloqueo con peróxido de hidrógeno (HP) al 3 % (Ventana) seguido por 3X de tampón de lavado 2 y 3. El marcado con inmunoperoxidasa se realizó con un kit de peróxidos DAB (Ventana), incubando el complejo avidina-biotina (ABC) durante 30 minutos seguido por 5X de tampón de lavado 2 y 3 y de diaminobenzidina (DAB) durante 4X4 minutos seguido por 2X de tampón de lavado 2 y 3 y 1X de lavado con agua (Signet, Nº de catálogo 2340). A continuación, se contaron los tejidos teñidos con verde de metilo (Dako, Nº de catálogo S1962) durante 10 minutos seguido por 2X de tampón de lavado 2 y 3 y 3X de lavado con agua. El control incluyó sueros primarios no inmunes usando anticuerpo primario de rata como isotipo control (Zymed) para

sustituir el anticuerpo primario. [0446] Se observó la inmunotinción mediante un microscopio Olympus BH-2 y las imágenes se capturaron mediante una cámara digital CoolSNAP HQ (Roper Scientific, Tucson, AZ).

C. Resultados [0447] Líneas celulares de control positivo y negativo: MAB 266.19.1.10.5.2, un anticuerpo monoclonal anti-hIL-22, demostró tinción positiva tanto en células BHK que expresaban IL-22 humana (+++) como en células BHK que expresaban IL-22 murina (+), y no mostraron tinción en las células BHK naturales (-). Todas las líneas celulares BHK positivas y negativas que se tiñeron con el control negativo de isotipo de rata para sustituir el anticuerpo primario no mostraron tinción (-) lo que indica que el anticuerpo es específico del ligando IL-22.El anticuerpo tuvo inmunorreactividad cruzada para IL-22 tanto humano como de ratón. [0448] Tejidos humanos: Grid multitejido normal y Grid tumoral humano; se examinaron muestras de páncreas, muestras de enfermedad pulmonar y renal; y muestras de piel humana con psoriasis. Estos tejidos humanos incluyeron 1). Cerebro, glándula pituitaria, glándula adrenal, mama, riñón, corazón, estómago, intestino delgado, intestino grueso, hígado fetal, hígado, piel, páncreas, pulmón, amígdala, ovario, útero, testículo, placenta, tiroides y bazo en las extensiones microscópicas de control multitisular (NormalGrid™) /tejidos humanos normales; 2). Adenocarcinoma de pulmón, adenocarcinoma de hígado, adenocarcinoma de riñón, adenocarcinoma de tiroides, adenocarcinoma de estómago, adenocarcinoma de próstata, adenocarcinoma de páncreas, adenocarcinoma de ovario, linfoma, melanoma, sarcoma de Ewing, sarcoma epitelioide, sarcoma MFH, sarcoma Rhabdo, carcinoide, carcinoma no diferenciado, mesotelioma, teratoma, y seminoma, en las extensiones microscópicas de control multitisular (TumorGrid™) /tejidos anormales humanos /tumor; 3). Páncreas normal, páncreas con pancreatitis crónica, pulmón inflamación perivascular crónica, adenocarcinoma de pulmón, riñón con glomerulosclerosis multifocal, riñón con glomerulonefritis mesangioproliferativa, riñón con fibrosis glomerular esclerótica intersticial procedente de CHTN y/o NDRI; 4). [0449] Tejidos de ratón: se examinaron INS IL-22 TG y natural de páncreas de ratón. Las células distribuidas por los islotes en el páncreas de INS IL-22 TG demostró una tinción fuertemente positiva (+++) con el Mab MAB 266,19,1,10,5,2 y el páncreas de tipo natural no mostró tinción (-). [0450] Comparación de anticuerpos policlonales y monoclonales. Se demostró que el anticuerpo policlonal dirigido contra IL-22 (Ejemplo 16) era sensible, mientras que el anticuerpo monoclonal MAB266.19.1.10.5.2 era específico. El anticuerpo policlonal mostró tinción positiva en células BHK que expresaban IL-22 humana (+++), en células BHK que expresaban IL-22 de murino (+), en varias muestras de tejido humano y de ratón (+), y en los islotes INS mIL-22 de ratón TG (+++). Un elevado porcentaje de los islotes de los transgénicos (frente a los de tipo natural) consiguieron una tinción positiva. La tinción en los islotes transgénicos estuvo distribuida por lo general por todo el islote (+++) mientras que la tinción en los islotes de tipo natural estuvo generalmente limitada a la periferia del islotes (+). Sin embargo, este anticuerpo también mostró una tinción no específica de las células WTBHK de control negativo (+).MAB266.19.1.10.5.2 mostró tinción positiva en células BHK que expresaban IL-22 humana (+++), en células BHK que expresaban IL-22(+) murino, y en los islotes de INC mIL-22 en ratones TG (+++).La tinción en los islotes transgénicos estuvo distribuida por lo general por todo el islote (+++) mientras que los islotes de tipo natural demostraron tinción negativa (-).

EJEMPLO 21 IL-20 ESTÁ REGULADA EN EXCESO EN MUESTRAS DE PIEL

PSORIÁTICA HUMANA

A. MUESTRAS DE ARN: [0451] Se obtuvieron muestras de piel normal así como de piel procedente de pacientes psoriáticos. Esta última incluyó piel afectada de psoriasis y de piel no afectada por psoriasis. Se aisló ARN procedente de muestras de piel humana con procedimientos convencionales. La integridad y la calidad de las muestras de ARN se comprobaron mediante el analizador Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Waldbronn Alemania).

B. Cebadores y sondas para RT-PCR cuantitativa [0452] La RT-PCR cuantitativa en tiempo real usando el sistema de detección de secuencia ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) se ha descrito con anterioridad (Consultar, Heid, C.A. y col., Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson, U.E.M. y col., Genome Research 6:9951001, 1996; Sundaresan, S. y col., Endocrinology 139:4756-4764, 1998. Este procedimiento incorpora el uso de una sonda específica del gen que contiene ambos colorantes fluorescentes indicador y de terminación rápida. Cuando la sonda está intacta, la emisión del colorante indicador es negativa debido a la vecindad del colorante de terminación rápida. Durante la extensión por PCR utilizando cebadores directo e inverso adicionales específicos de gen, la sonda se escindió por la actividad nucleolítica de 5’ a 3’ de la rTth ADN polimerasa que libera el colorante indicador de la sonda dando como resultado un aumento en la emisión fluorescente. [0453] Los cebadores y sondas usados en el análisis mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real de la expresión de IL-20 se diseñaron usando el programa informático de diseño de cebadores Primer Express™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). El cebador directo, ZC40541 (SEC. DE ID Nº 25) y el cebador inverso, ZC 40542 (SEC. DE ID Nº 26) se usaron en una reacción de PCR (a continuación) a una concentración de 800 nM para sintetizar un producto de 71 pb. La correspondientes sonda IL-20 TaqMan®, ZC 40544 (SEC. DE ID Nº 27) fue sintetizada y etiquetada por PE Applied Biosystems. La sonda IL-20 se marcó en el extremo 5’ con un colorante indicador fluorescente (6-carboxifluoresceína) (FAM) (PE Applied Biosystems) y en el extremo 3’ con un colorante fluorescente de detención rápida (6-carboxy-tetrametilrodamina) (TAMRA) (PE Applied Biosystems).

C. RT-PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL [0454] Se determinaron los niveles relativos de ARNm de IL-22 analizando muestras de ARN total mediante el kit TaqMan EZ RTPCR Core Reagents (PE Applied Biosystems). Se preparó una segunda vuelta de transcripciones de IL-20 para generar una curva patrón usada para cuantificación. La curva estaba constituida por diluciones en serie decimales comprendidas entre aproximadamente 1e8 a 1e3 de copias totales del mensaje completo para IL-22 y cada punto de la curva patrón se analizó por triplicado. Las muestras de ARN total procedentes de la piel también se analizaron por triplicado para determinar los niveles de transcripciones para la IL-20 humana y los niveles de hGUS como control endógeno. En un volumen total de 25 �l, cada muestra de ARN se sometió a reacción RT-PCR TaqMan EZ (PE Applied Biosystems) conteniendo: aproximadamente 25 ng de ARN total en agua tratada mediante DEPC (exenta de Dnasa/Rnasa); cebadores adecuados (aproximadamente 800 nM de ZC 42459 (SEC. DE ID Nº 22) y ZC 42458 (SEC. DE ID Nº 23); sonda adecuada (aproximadamente 100 nM de ZC 42460 (SEC. DE ID Nº 24); tampón 1X TaqMan EZ; acetato de manganeso 3 mM; 300 mM de cada uno de d-CTP, d-ATP, y d-GTP y 600 mM de d-UTP; rTth ADN polimerasa (0,1 U/

�l); y AmpErasa UNG (0,01 U/

�l). Las condiciones de ciclación térmica fueron como sigue: una etapa de tratamiento inicial con UNG de un ciclo a 50˚C durante 2 minutos; seguido por una etapa de transcripción inversa (RT) de un ciclo a 60˚C durante 30 minutos; seguido por una desactivación de la etapa de UNG de un ciclo a 95˚C durante 5 minutos; seguido por 40 ciclos de amplificación a 94˚C durante 20 segundos y 60˚C durante 1 minuto. [0455] Los niveles relativos de ARN de IL-20 se determinaron mediante el método de la curva patrón según descripción del fabricante, PE Biosystems (User Bulletin nº2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Relative Quantitation of

5 Gene Expression, Diciembre 11, 1997). Se usaron las mediciones de hGUS para normalizar los niveles de IL-20. Los datos se muestran en la Tabla 13 siguiente. Tabla 11

Muestra de piel

IL-20

Normal

2903

No afectada

7233

Afectada

27,695

[0456] Aunque se pudo detectar el ARNm de IL-20 en muestras de piel procedentes de pacientes normales o de áreas no afectadas, se produjo una fuerte

10 regulación en exceso del mensaje de IL-20 en la piel afectada procedente de pacientes de psoriasis. Se expresaron las subunidades de receptor de IL-20, incluyendo IL-20RA, IL-22RA (IL-22RA), e IL-20RB en piel humana tanto normal como enferma. Estos datos apoyan una fuerte asociación con la dolencia para IL-20 respecto de la psoriasis humana.

15 [0457] La expresión en exceso de IL-20 se ha demostrado en lesiones psoriáticas humanas, sugiriendo la implicación de IL-20 en la psoriasis humana. Adicionalmente, según se describe en el presente documento, la expresión en exceso de IL-20 en ratones transgénicos mostró engrosamiento epidérmico e implicación de células inmunes lo que es indicativo de un fenotipo psoriático, y además la inyección de IL-22

20 en ratones normales mostró engrosamiento epidérmico e implicación de células inmunes lo que es indicativo de un fenotipo psoriático destruido por el antagonista del receptor soluble IL-22RA2. Estos datos in vivo sugieren adicionalmente que la IL-20 está implicada en la psoriasis. De esta manera, los antagonistas de la actividad de IL20 como los anticuerpos monoclonales dirigidos contra la IL-20 humana de la presente

25 invención, así como los receptores solubles y anticuerpos de los mismos, son útiles en el tratamiento terapéutico de enfermedades inflamatorias, particularmente como antagonistas de IL-20 en el tratamiento de la psoriasis, así como en otras dolencias que se dan a conocer en el presente documento. EJEMPLO 22

30 IL-20 ESTÁ REGULADA EN EXCESO MUESTRAS DE PIEL HUMANA CON DERMATITIS ATÓPICA

C. MUESTRAS DE ARN: [0458] Se obtuvieron muestras de piel normal así como piel procedente de pacientes afectados de dermatitis atópica. Se aisló ARN procedente de muestras de piel humana con procedimientos convencionales. La integridad y la calidad de las muestras de ARN se comprobó mediante el equipo Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Waldbronn Germany).

D. Cebadores y sondas para RT-PCR cuantitativa [0459] La RT-PCR cuantitativa en tiempo real usando el sistema de detección de secuencia ABI PRISM 7700 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) se ha descrito con anterioridad (Consultar, Held, C.A. y col., Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson, U.E.M. y col., Genome Research 6:995-1001, 1996; Sundaresan, S. y col., Endocrinology 139:4756-4764, 1998. Este procedimiento incorpora el uso de una sonda específica del gen que contiene ambos colorantes fluorescentes indicador y de terminación rápida. Cuando la sonda está intacta, la emisión del colorante indicador es negativa debido a la vecindad del colorante de terminación rápida. Durante la extensión por PCR utilizando cebadores directo e inverso adicionales específicos de gen, la sonda se escindió por la actividad nucleolítica de 5’ a 3’ de la rTth ADN polimerasa que libera el colorante indicador de la sonda dando como resultado un aumento en la emisión fluorescente. [0460] Los cebadores y sondas usados en el análisis mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real de la expresión de IL-20 se diseñaron usando el programa informático de diseño de cebadores Primer Express™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). El cebador directo, ZC40541 (SEC. DE ID Nº 25) and el cebador inverso, ZC 40542 (SEC. DE ID Nº 26) se usaron en una reacción de PCR (a continuación) a una concentración de 800 nM para sintetizar un producto de 71 pb. La correspondientes sonda de IL-20 ZC 40544 (SEC. DE ID Nº 27) fue sintetizada y etiquetada por PE Applied Biosystems. La sonda de IL-20 se etiquetó en el extremo 5’ con un colorante indicador fluorescente (6-carboxifluoresceína) (FAM) (PE Applied Biosystems)y en el extremo 3’ con un colorante indicador de detención rápida (6carboxi-tetrametil-rodamina) (TAMRA) (PE Applied Biosystems).

C. RT-PCR cuantitativa en tiempo real [0461] Se determinaron los niveles relativos de ARNm de IL-22 analizando muestras de ARN total mediante el kit TaqMan EZ RTPCR Core Reagents (PE Applied Biosystems). Se preparó una segunda vuelta de transcripciones de IL-20 para generar una curva patrón usada para cuantificación. La curva estaba constituida por diluciones en serie decimales comprendidas entre aproximadamente 1e8 a 1e3 de copias totales del mensaje completo para IL-22 y cada punto de la curva patrón se analizó por triplicado. Las muestras de ARN total procedentes de la piel también se analizaron por triplicado para determinar los niveles de transcripciones para la IL-20 humana y los niveles de hGUS como control endógeno. En un volumen total de 25 �l, cada muestra de ARN se sometió a reacción RT-PCR TaqMan EZ (PE Applied Biosystems) conteniendo: aproximadamente 25 ng de ARN total en agua tratada mediante DEPC (exenta de Dnasa/Rnasa); cebadores adecuados (aproximadamente 800 nM de ZC 42459 (SEC. DE ID Nº 22) y ZC 42458 (SEC. DE ID Nº 23); sonda adecuada (aproximadamente 100 nM de ZC 42460 (SEC. DE ID Nº 24); tampón 1X TaqMan EZ; acetato de manganeso 3 mM; 300 mM de cada uno de d-CTP, d-ATP, y d-GTP y 600 mM de d-UTP; rTth ADN polimerasa (0,1 U/

�l); y AmpErasa UNG (0,01 U/

�l). Las condiciones de ciclación térmica fueron como sigue: una etapa de tratamiento inicial con UNG de un ciclo a 50˚C durante 2 minutos; seguido por una etapa de transcripción inversa (RT) de un ciclo a 60˚C durante 30 minutos; seguido por una desactivación de la etapa de UNG de un ciclo a 95˚C durante 5 minutos; seguido por 40 ciclos de amplificación a 94˚C durante 20 segundos y 60˚C durante 1 minuto. [0462] Los niveles relativos de ARN de IL-20 se determinaron mediante el método de la curva patrón según descripción del fabricante, PE Biosystems (User Bulletin nº2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Relative Quantitation of Gene Expression, Diciembre 11, 1997). Se usaron las mediciones de hGUS para normalizar los niveles de IL-20. Los datos se muestran en la Tabla 13 siguiente. [0463] Se pudo detectar el ARNm de IL-20 en muestras de piel a bajos niveles (aproximadamente 800 copias). Por el contrario, se produjo una regulación en exceso del mensaje de IL-20 en la piel afectada procedente de pacientes de dermatitis atópica. Se expresaron las subunidades de receptor de IL-20, incluyendo IL-20RA, IL-22RA (IL-22RA), e IL-20RB en piel humana tanto normal como enferma. Estos datos apoyan una fuerte asociación con la dolencia para IL-20 respecto de la psoriasis humana. La expresión en exceso de IL-20 se ha demostrado en pieles humanas con dermatitis atópica, sugiriendo la implicación de IL-20 en la dermatitis atópica. Adicionalmente, según se describe en el presente documento, la expresión en exceso de IL-20 en ratones transgénicos mostró engrosamiento epidérmico e implicación de células inmunes lo que es indicativo de un fenotipo de dermatitis atópica. Estos datos in vivo sugieren adicionalmente que la IL-20 está implicada en la dermatitis atópica. De esta manera, los antagonistas de la actividad de IL-20 como los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el IL-22RA humano de la presente invención, así como los receptores solubles y anticuerpos de los mismos, y los anticuerpos dirigidos contra IL-20 neutralizantes y monoclonales son útiles terapéuticamente como antagonistas de IL-20 en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, como la dermatitis atópica, así como otras dolencias que se dan a conocer en el presente documento.

EJEMPLO 23 REGULACIÓN EN EXCESO DE IL-8 MEDIANTE IL-20 [0464] Queratinocitos de epidermis normal de neonato humano (NHEK) (de Clonetics) en paso 2 se plaquearon y se hicieron crecer hasta confluencia y en placas para cultivo de tejidos con 12 pocillos. Se adquirió KGM (medio de crecimiento para queratinocitos) de Clonetics. Cuando las células alcanzaron la confluencia, se lavaron con medio KGM menos factores de crecimiento = KBM (medio basal para queratinocitos). Las células se dejaron sin suero en KBM durante 72 horas antes de la adición de los compuestos de ensayo. Se usaron trombina a 1 U.I./ml y tripsina a 25nM como controles positivos. Se agregó un ml de medio/pocillo. El KBM sólo se usó como control negativo. [0465] Se preparó IL-20 en medio KBM y se agregó a concentraciones variables, desde 2,5mg/ml hasta 618ng/ml en un primer experimento y desde 2,5mg/ml hasta 3ng/ml en un segundo experimento. [0466] Las células se incubaron a 37˚ C, 5 % de CO2 durante 48 horas. Los sobrenadantes se retiraron y congelaron a -80˚ C durante varios días antes de ensayar los niveles de IL-8 y GM-CSF. Se usaron el kit de inmunoensayo Human IL-8 Immunoassay nº D8050 (RandD Systems, Inc.) y el kit de inmunoensayo human GMCSF Immunoassay nº HSGMO (RandD Systems, Inc.) para determinar la producción de citocina según las instrucciones del fabricante. [0467] Los resultados indicaron que la expresión de IL-8 y GM-CSF estuvieron inducidas por IL-20.

EJEMPLO 24 REGULACIÓN EN EXCESO DE CITOCINAS INFLAMATORIAS MEDIANTE IL-20 [0468] La línea celular de queratinocito humano, HaCaT, se hizo crecer a 37˚C hasta varios días después de alcanzar la confluencia en frascos T-75 para cultivo de tejido. En ese punto, el medio de crecimiento normal (DMEM + 10 % FBS) fue eliminado y sustituido por medio exento de suero. A continuación, las células se incubaron durante varios días a 37˚C. A continuación, se eliminó el DMEM y cuatro frascos de células por tratamiento se trataron con una de las siguientes condiciones durante cuatro horas a 37˚C: (rh) IL-1 alfa recombinante humana a 5 ng/ml, rh IL-1 alfa a 20 ng/ml, rh IL-1 alfa a 5 ng/ml + IL-20 a 1mg/ml, IL-20 a 1mg/ml, ó rh IL-10 a 10 ng/ml. [0469] Tras el tratamiento con citocina, se retiró el medio y las células se lisaron con una solución de tiocianato de guanidinio. Se aisló el ARN total del lisato celular por agitación durante toda la noche en un gradiente de cloruro de cesio. Al día siguiente, el residuo de ARN se volvió a suspender en una disolución de TE/SDS y se precipitó con etanol. A continuación se cuantificó el ARN con un espectrofotómetro, seguido por tratamiento con DNasa según la Sección V.B. del Clontech’s Atlas™ cDNA Expression Arrays User Manual (versión PT3140-1/PR9X390, publicada el 5/11/99). Se verificó la calidad de las muestras de ARN mediante cálculos de pureza basados en lecturas espectrof. y por visualización sobre gel de agarosa. Se descartó la contaminación genómica de las muestras de ARN mediante análisis por PCR del gen de la beta-actina. [0470] Se siguieron los protocolos de Clontech para el enriquecimiento en poliA+, síntesis de la sonda e hibridación en matrices Atlas™ (ver más arriba, junto con Atlas™Pure Total RNA Labeling System User Manual, PT3231-1/PR96157, publicado el 22/6/99). En resumen, se aisló ARN de poliA+ a partir de 50 mg de ARN total usando perlas magnéticas revestidas de estreptavidina (de Clontech, Paolo Alto, CA) y un separador de partículas magnéticas. A continuación, el ARN de poliA+ se etiquetó con alfa32P-dA TP mediante RT-PCR. Se usaron en la reacción cebadores Clontech CDS específicos de los 268 genes de la matriz de citocina/receptor humano Atlas™ (Cat. Nº 7744-1). La sonda etiquetada se aisló mediante cromatografía en columna y se contó en fluido de centelleo. [0471] Las matrices Atlas™ se prehibridaron con Clontech ExpressHyb más 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado térmicamente durante al menos treinta minutos a 68˚C con agitación continua. A continuación las membranas se hibridaron con 1,9 x 106 CPM/ml (un total de 1,14 x 107 CPM) durante toda la noche a 68˚C con agitación continua. Al día siguiente, las membranas se lavaron durante treinta minutos x 4 en 2X SSC, SDS al 1 % a 68˚ C, más treinta minutos x 1 en 0,1X SSC, SDS al 0,5 % a 68˚C, seguido por un lavado final a temperatura ambiente durante cinco minutos en 2X SSC. A continuación se colocaron las membranas matriz en bolsitas de plástico Kodak, se sellaron y expusieron a una criba de captura de imagen de fósforo durante toda la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, las cribas de fósforo se escanearon en un dispositivo de captura de imagen de fósforo y se analizaron mediante el programa informático Clontech’s AtlasImage™ 1,0.

GENES REGULADOS EN EXCESO POR IL-20: [0472]

1.

Factor de necrosis tumoral factor (TNF) se reguló en exceso 1,9-2,4 veces mediante IL-20.

2.

Factores de crecimiento placentario 1 y 2 (PLGF) se regularon en exceso 1,9-2,0 veces mediante IL-20.

3.

El receptor del factor de coagulación II receptor se reguló en exceso 2,0-2,5 veces mediante IL-20.

4.

El receptor de calcitonina receptor se reguló en exceso 2,2-2,3 veces mediante IL

20.

5.

La proteína TSG-6 de unión al hialuronato inducible mediante TNF se reguló en exceso 2,1-2,2 veces mediante IL-20.

6.

El precursor del receptor-1 del factor de crecimiento endoteliar (VEGF), receptor de la cinasa de la proteína tirosina (FLT-1) (SFLT) se reguló en exceso 2,1-2,7 veces mediante IL-20.

7.

MRP-8 (proteína de unión a calcio en macrófagos relacionada con MIF) se reguló en exceso 2,9-4,1 veces mediante IL-20.

8.

MRP-14 (proteína de unión a calcio en macrófagos relacionada con MIF) se reguló en exceso 3,0-3,8 veces mediante IL-20.

9.

Relaxina H2 se reguló en exceso 3,14 veces mediante IL-20.

10.

El receptor III del factor beta de crecimiento transformante (TGFβ) de 300 kDa se reguló en exceso 2,4-3,6 veces mediante IL-20.

GENES QUE MUESTRAN SINERGIA EN EL TRATAMIENTO CON IL-20 + IL-1: [0473]

1.

La proteína morfogenética del hueso 2a se reguló en exceso 1,8 veces con el tratamiento con IL-20 en solitario, 2,5 veces con el tratamiento con IL-1 en solitario, y 8,2 veces con el tratamiento simultáneo con IL-20 e IL-21.

2.

MRP-8 se reguló en exceso 2,9 veces con el tratamiento con IL-20 en solitario, 10,7 veces con el tratamiento con IL-1 en solitario y 18,0 veces con el tratamiento simultáneo con IL-20 e IL-21.

3.

La proteína de diferenciación eritroide (EDF) se reguló en exceso 1,9 veces con el tratamiento con IL-20 en solitario, 9,7 veces con el tratamiento con IL-1 en solitario

and 19,0 veces con el tratamiento simultáneo con IL-20 e IL-21.

4.

La MRP-14 (proteína de unión a calcio en macrófagos, relacionada con MIF) se reguló en exceso 3,0 veces con el tratamiento con IL-20 en solitario, 12,2 veces con el tratamiento con IL-1 en solitario and 20,3 veces con el tratamiento simultáneo con IL20 e IL-21.

5.

El factor de crecimiento tipo EGF de unión a heparina se reguló en exceso 2,0 veces con el tratamiento con IL-20 en solitario, 14 veces con el tratamiento con IL-1 en solitario and 25,0 veces con el tratamiento simultáneo con IL-20 ye IL-21.

6.

La proteína tipo beta-tromboglobulina se reguló en exceso 1,5 veces con el tratamiento con IL-20 en solitario, 15 veces con el tratamiento con IL-1 en solitario and 27 veces con el tratamiento simultáneo con IL-20 e IL-21.

7.

El factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) se reguló en exceso 1,7 veces con el tratamiento con IL-20 en solitario, 25 veces con el tratamiento con IL-1 en solitario and 48 veces con el tratamiento simultáneo con IL-20 e IL-21.

8.

El factor quimiotáctico y activante de monocitos MCAF se reguló en exceso 1,3 veces con el tratamiento con IL-20 en solitario, 32 veces con el tratamiento con IL-1 en solitario and 56 veces con el tratamiento simultáneo con IL-20 e IL-21.

EJEMPLO 25 IL-20 FENOTIPO TRANSGÉNICO [0474] IL-20 tanto humana como de ratón se expresaron en exceso en ratones transgénicos mediante varios promotores. El promotor de la albúmina de ratón específico del hígado, que dirige la expresión de IL-20 humana, se usó inicialmente en un intento de conseguir niveles de proteína en circulación. Los estudios posteriores se realizaron usando el promotor de la queratina 14 (K14) que principalmente se dirige a la expresión en la epidermis y resto de epitelio escamoso estratificado; el promotor de la metalotioneína-1 de ratón, que proporciona un amplio modelo de expresión; y el promotor EmLCK, que impulsa la expresión en células de linaje linfoide. Se obtuvieron resultados similares en los cuatro casos, posiblemente debido a que todos los promotores consiguen niveles en circulación de IL-20. [0475] En todos los casos, las crías transgénicas que expresaban el transgén IL-20 fueron más pequeñas que sus compañeros de camada, tuvieron una apariencia brillante y una piel tirante y arrugada y murieron a los pocos días del alumbramiento. Las crías tenían leche en el estómago, indicación de que eran capaces de mamar. Estos ratones tenían extremidades hinchadas, y dificultades de movimiento en las regiones de la cola, orificios nasales y boca. Además, los ratones eran frágiles, carecían de tejido adiposo visible y mostraban retraso en el desarrollo de orejas y dedos. Bajos niveles de expresión en el hígado (menos de 100 moléculas de ARNm/célula) fueron suficientes tanto para la letalidad neonatal como para las anormalidades de la piel. Los ratones transgénicos sin fenotipo visible bien no expresaron el transgén, o no lo expresaron a niveles detectables, o fueron tipo mosaico. [0476] El análisis histológico de la piel de los ratones transgénicos IL-20 mostró una epidermis engrosada, hiperqueratosis y un stratum corneum compacto en comparación con sus compañeros de camada. Se observaron ocasionalmente costras serocelulares (escaras). El análisis por microscopía electrónica (EM) de la piel procedente de ratones transgénicos mostró inclusiones lipoides intramitocondriales, gránulos con vetas queratohialinas, y relativamente pocos tonofilamentos similares a los observados en la piel psoriática humana y en los modelos de ratón de enfermedades cutáneas. Además, muchos de los ratones transgénicos tenían linfocitos tímicos apoptóticos. No se detectaron anormalidades adicionales en el análisis histopatológico. Estos resultados histológico y por EM apoyan y extienden las alteraciones groseras de la piel observadas.

EJEMPLO 26 CONSTRUCCIÓN DE UN VECTOR DE EXPRESIÓN PARA EXPRESIÓN DE IL-22RA-MUFC SOLUBLE HUMANO [0477] Se preparó una fusión del receptor IL-22RA humano soluble-muFc (denotado como IL-22RA-C(mG2a) que contenía la región extracelular de IL-22RA fusionado con la región Fc de la cadena pesada gamma 2a (mG2a) de murino. Se construyó un plásmido de expresión que contenía IL-22RA-C(mG2a) mediante recombinación homóloga de dos fragmentos independientes de ADN y el vector de expresión pZMP40. Los fragmentos de la secuencia del polinucleótido de IL-22RA (SEC. DE ID Nº 1), y mG2a SEC. DE ID Nº 39 se generaron por amplificación mediante PCR usando los siguientes cebadores: (a) cebadores de IL-22RA ZC45,593 (SEC. DE ID Nº 28), y ZC45,592 (SEC. DE ID Nº 29); y (b) cebadores de mG2a ZC45,591 (SEC. DE ID Nº 30), y ZC45,594 (SEC. DE ID Nº 31). [0478] El primer fragmento contenía la región que codifica el dominio extracelular de IL-22RA, que se preparó usando un polinucleótido de IL-22RA (por ejemplo, SEC. DE ID Nº 1) como plantilla. El primer fragmento incluyó un 5’ solapante con una secuencia parcial del vector pZMP40, el segmento IL-22RA, y un 3’ solapante que contiene una secuencia enlazante y una secuencia parcial mG2a. Condiciones de la PCR: 1 ciclo, 94˚C, 5 minutos; 35 ciclos, 94˚C, 1 minuto, seguido por 55˚C, 2 minutos, seguido por 72˚C, 3 minutos; 1 ciclo, 72˚C, 10 minutos. [0479] El segundo fragmento incluyó un 5’ solapante con una secuencia enlazante y una secuencia parcial IL-22RA, el segmento mG2a, y un 3’ solapante que contiene una secuencia parcial del vector pZMP40. La región Fc de la cadena pesada gamma 2a (mG2a) de murino (SEC. DE ID Nº 39) se generó a partir de un clon de ADNc de una cadena pesada gamma 2a de Ig. El mG2a contiene las regiones bisagra, CH2, y CH3 de la región constante de la cadena pesada gamma 2a de murino. Condiciones de la PCR: 1 ciclo, 94˚C, 5 minutos; 35 ciclos, 94˚C, 1 minuto, seguido por 55˚C, 2 minutos, seguido por 72˚C, 3 minutos; 1 ciclo, 72˚C, 10 minutos. [0480] Las mezclas de la reacción de PCR se analizaron en un gel de agarosa al 1 % y la banda correspondiente a los tamaños de los insertos se extrajo del gel mediante el kit QIAquick™ Gel Extraction (Qiagen). [0481] El plásmido pZMP40, que se cortó con BgIII, se usó en una recombinación de tres vías con ambos fragmentos de inserción PCR. El plásmido pZMP40 es un vector de expresión mamífero que contiene un casete de expresión que tiene el promotor MPSV, y varios lugares de restricción para inserción de secuencias de codificación; un origen de replicación de E. coli; una unidad de marcador seleccionable de mamífero que comprende un promotor, potenciador y origen de replicación de SV40, y el terminador de SV40; y las secuencias URA3 y CEN-ARS necesarias para la selección y replicación en S. cerevisiae. El plásmido pZMP40 se construyó a partir de pZMP21 (depositado en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, y designado con el Nº PTA5266) por adición de varios sitios de enzimas de restricción al polienlazante. [0482] Cien microlitros de células competentes de levadura (S. cerevisiae) se combinaron independientemente con 10 �l del inserto de ADN y 100ng del vector pZMP40 cortado, y la mezcla se transfirió a una cubeta de electroporación de 0,2-cm. La mezcla levadura/ADN se electropulsó usando una configuración del suministro de corriente eléctrica (BioRad Laboratories, Hercules, CA) de 0,75 kV (5 kV/cm), ∞ ohmios, y 25 �F. Se agregaron a la cubeta seiscientos �l de sorbitol 1,2 M y la levadura se plaqueó en alícuotas de 100 �l y 300 �l en dos placas URA-D y se incubaron a 30˚C. Tras aproximadamente 72 horas, los transformantes de levadura Ura+ procedentes de una placa individual se volvieron a suspender en 1 ml de H2O y se centrifugaron un corto periodo de tiempo para romper las células de levadura. El residuo celular se volvió a suspender en 0,5 ml de tampón de lisis (Triton X-100 al 2 %, SDS al 1 %, NaCl 100 mM, Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM). Los quinientos microlitros de la mezcla de lisis se agregaron a un tubo Eppendorf que contenía 250 ml de perlas de vidrio lavadas con ácido y 300 ml de fenol-cloroformo, se vortizó durante 3 minutos, y se centrifugó durante 5 minutos en una centrífuga Eppendorf a máxima velocidad. Se transfirieron trescientos microlitros de la fase acuosa a un tubo nuevo, y el ADN se precipitó con 600 �l de etanol (EtOH) y 30�l de acetato de sodio 3M, seguido por centrifugación durante 30 minutos a máxima velocidad. El tubo se decantó, y el residuo se lavó con 1 ml de etanol al 70 %. El tubo se decantó, y el residuo de ADN se volvió a suspender en 30 �l de TE. [0483] La transformación de células hospedadoras de E. coli electrocompetentes (DH12S) se realizó usando 5 �l del ADN de levadura preparado y 50 �l de células. Las células se electropulsaron a 2,0 kV, 25 mF, y 400 ohmios. Tras la electroporación, se añadieron 1 ml de SOC (Tryptone Bacto™ al 2 % (Difco, Detroit, MI), extracto de levadura al 0,5 % (Difco), NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM, glucosa 20 mM) y a continuación las células se plaquearon en alícuotas de 50 �l y 200

�l en dos placas LB AMP (caldo LB (Lennox), agar Bacto™ al 1,8 % (Difco), 100 mg/l de ampicilina). [0484] Los insertos de tres clones de la construcción se sometieron a análisis de secuencia y se seleccionó un clon de cada construcción, que contenía la secuencia correcta. Se aisló a gran escala el plásmido de ADN usando un kit comercialmente disponible (QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante.

EJEMPLO 27 EXPRESIÓN Y PURIFICATION DEL POLIPÉPTIDO IL-22RA-MUFC HUMANO SOLUBLE [0485] Tres conjuntos de 200 �g de la construcción IL-22RA-C(mG2a) (Ejemplo 22) se digirieron independientemente con 200 unidades de Pvu I a 37˚C durante tres horas y a continuación se precipitaron con IPA y se centrifugaron en un tubo de micrófuga de 1,5 ml. El sobrenadante se separó por decantación del residuo, y el residuo se lavó con 1 ml de etanol al 70 % y se dejó incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. El tubo se centrifugó en una microcentrífuga durante 10 minutos a 14.000 RPM y el sobrenadante se separó por decantación del residuo. A continuación, el residuo se volvió a suspender en 750 �l de medio PF-CHO en un entorno estéril, y se dejo incubar a 60˚C durante 30 minutos. 5E6 células APFDXB11 se centrifugaron en tres tubos independientes, y se volvieron a suspender usando la disolución de medio de ADN. Las mezclas ADN/célula se colocaron en una cubeta con 0,4 cm de separación y se electroporaron usando los siguientes parámetros: 950 �F, capacitancia alta, y 300 V. Los contenidos de las cubetas se retiraron a continuación, se combinaron y se diluyeron hasta 25 ml con medio PF-CHO media y se colocaron en un matraz de agitación de 125 ml. El matraz se colocó en una incubadora sobre un agitador a 37˚C, CO2 al 6 %, y se agitó a 120 RPM. [0486] La línea celular se sometió a selección de nutrientes seguido por una etapa de amplificación a metotrexato (MTX) 100nM, a continuación a 500nM de MTX, y finalmente hasta MTX �M. La etapa de amplificación fue seguida por una clasificación de células CD8. La clasificación de células CD8 se llevó a cabo tomando una combinación estable amplificada en MTX 1mM y tiñendo aproximadamente 5E6 células con un anticuerpo monoclonal FITC dirigido contra CD8 (BD PharMingen, nº de cat. 30324X) usando la concentración recomendada por el fabricante. Las células teñidas se procesaron y clasificaron en un citómetro de flujo FACS Vantage (BD). El 5 % superior de las células se recogieron e hicieron crecer. La expresión se confirmó mediante transferencia western, y la línea celular se escaló, y siguió la purificación de proteínas por procedimientos estandarizados.

EJEMPLO 28 NEUTRALIZACIÓN DE HUIL-22RA MEDIANTE SUERO PROCEDENTE DE RATONES INMUNIZADOS CON HUL22RA-MG2A

A. ENSAYO DE NEUTRALIZACIÓN BASADO EN CÉLULAS PARA LA INHIBICIÓN DE IL-20 Y/O IL-22. [0487] Se usó la línea celular BaF3 dependiente del factor pre-B transfectada simultáneamente con IL-22RA y IL-20RB (pDIRS1) (células BAF/IL-22RA/IL-20RB; Ejemplo 38) para evaluar el potencial de neutralización de los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA mediante la antagonización de IL-20 en el receptor IL-22RA/IL20RB. De forma similar, se usó BaF3 transfectada simultáneamente con IL-22RA y IL-10RB (CRF2-4) (células BAF/IL-22RA/CRF2-4; Ejemplo 2) para evaluar el potencial de neutralización de los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA mediante la antagonización de IL-20 en el receptor IL-22RA/IL10RB. La proliferación en presencia de IL-20 o IL22 en su respectiva línea celular que expresa el receptor, y la inhibición de dicha proliferación en presencia de los anticuerpos antagonistas, se evaluó usando un ensayo Alamar blue según se ha descrito en el Ejemplo 3. La inhibición de la proliferación de estas células es indicativa de la actividad neutralizante en este ensayo.

B. El suero dirigido contra IL-22RA neutraliza ambos IL-20 y IL-22 en el ensayo de neutralización basado en células. [0488] Utilizando el ensayo descrito en el Ejemplo 28A, el suero procedente de ratones inmunizados con huIL-22RAmuG2a que tenían IL-22RA desactivado (Ejemplo 30(A)(1)) se añadió como una dilución en serie a 1 %, 0,5 %, 0,25 %, 0,13 %, 0,06 %, 0,03 %, 0,02 %, y 0 %. Las placas de ensayo se incubaron a 37ºC, CO2 al 5 % durante 4 días, en cuyo momento se añadió Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) a 20 l/pocillo. Las placas se incubaron de nuevo a 37º C, C, CO2 al 5 % durante 16 horas. El Alamar Blue proporciona una lectura fluorométrica basada en el número de células vivas, y por tanto es una medida directa de la proliferación celular en comparación con un control negativo. Las placas se leyeron en el contador Wallac Victor 2 1420 Multilabel Counter (Wallac, Turku, Finland) en las longitudes de onda 530 (Excitación) y 590 (Emisión). Los resultados muestran que el suero procedente de los siete animales inmunizados podía neutralizar la señalización de ambos huIL-22 y huIL20 mediante huIL-22RA. Por ejemplo, a la concentración del 1 %, el suero procedente de cinco animales (16517, 16518, 16519, 16520, y 16527) neutralizó completamente la proliferación inducida por huL-22, disminuyendo la inhibición de la proliferación de forma dependiente de la dosis a las concentraciones inferiores. Adicionalmente, a la concentración del 1 %, el suero procedente de otros dos animales (16471 y 16701) inhibió aproximadamente el 90 % de la proliferación inducida por huIL-22, disminuyendo la inhibición de la proliferación de forma dependiente de la dosis a las concentraciones inferiores. De forma similar, a las concentraciones de 1 % y 0,5 % el suero procedente de cinco animales (16517, 16518, 16519, 16520, y 16527) neutralizó completamente la proliferación inducida por huIL-20, disminuyendo la inhibición de la proliferación de forma dependiente de la dosis a las concentraciones inferiores. Más aún, a la concentración del 1 %, el suero procedente del animal 16701 neutralizó completamente la proliferación inducida por huIL-20, disminuyendo la inhibición de la proliferación de forma dependiente de la dosis a las concentraciones inferiores. A la concentración del 1 %, el suero procedente del animal 16471 neutralizó aproximadamente el 95 % la proliferación inducida por huIL-20, disminuyendo la inhibición de la proliferación de forma dependiente de la dosis a las concentraciones inferiores. De esta forma, el suero de los siete animales fue capaz de neutralizar la proliferación inducida por cualquiera de IL-20 o IL-22 mediante el receptor huIL22RA. Estos resultados demuestran adicionalmente que los anticuerpos de IL-22RA pueden antagonizar de esta manera la actividad de los ligandos proinflamatorios IL-20 y IL-22 a bajas concentraciones.

[0489] Estos resultados proporcionan evidencia adicional de que bloquear eficazmente la actividad de IL-22RA mediante enlace, bloqueo, inhibición, reducción, antagonismo o neutralización de la actividad de IL-20 o IL-22 (individual o simultáneamente), por ejemplo mediante un anticuerpo monoclonal neutralizante de IL-22RA de la presente invención, puede ser beneficioso en la reducción de los efectos de IL-20 e IL-22 (por separado o simultáneamente) in vivo y se puede reducir la inflamación inducida por IL-20 y/o IL-22, tal como la vista en los efectos para la piel inducidos por IL-20 así como los efectos para la piel inducidos por IL-22, por ejemplo en psoriasis, IBD, colitis, u otras enfermedades inflamatorias inducidas por IL-20, y/o IL-22 incluyendo IBD, artritis, asma, artritis psoriática, colitis, dolencias inflamatorias de la piel, y dermatitis atópica.

EJEMPLO 29 GENERACIÓN DE CÉLULAS P815/HIL-22RA E INMUNIZACIÓN DE RATONES GENERACIÓN DE CÉLULAS P815/HIL-22RA E INYECCIÓN EN RATONES PARA GENERACIÓN DE ANTICUERPOS DIRIGIDOS CONTRA HIL-22RA: [0490] Células P815 de tipo natural (ATCC Nº. TIB-64) se transfectaron con un vector plásmido que contenía la secuencia de ADNc de hIL-22RA (por ejemplo, SEC. DE ID Nº 1) y un marcador de resistencia a la puromicina que se puede seleccionar, usando el reactivo de Fugene según el protocolo del fabricante) (Roche, Indianapolis, IN). Las células se sometieron a selección por puromicina 48 horas después de la transfección. Los transfectantes resistentes a la puromicina se clonaron por dilución limitante y se cribaron por su nivel de expresión de hIL-22RA en la superficie celular mediante citometría de flujo, usando IL-22 biotinilado humano (huIL-22-biotina). Brevemente, las células se incubaron con 5 ug/ml de huIL-22-biotina durante 30 minutos en hielo y se lavaron a continuación. La unión de huIL-22-biotin a las células se detectó seguidamente mediante estreptavidina marcada con PE a 1:500. Las células se analizaron en un citómetro de flujo Facscan usando el programa informático Cellquest. (Becton Dickinson, San Jose, CA). [0491] El clon celular de P815/IL-22RA seleccionado se hizo crecer y a continuación se cosechó para inyección. Las células se recogieron, se lavaron tres veces en PBS, se contaron, se volvieron a suspender a 1x108 células por mililitro, y se irradiaron con 10.000 rads. La suspensión celular se transfirió a continuación a una jeringa de 1 ml y se inyectaron a ratones DBA/2 por ruta intraperitoneal. Los ratones se estimularon de forma idéntica 3 semanas después, y el suero se cribó por el enlace de la línea celular de transfectantes a hIL-22RA. Brevemente, el suero se diluyó 1:100 en tampón Facs (HBSS, BSA al 2 %, NaN3 al 0,02 %) y se incubaron a continuación con células de riñón humano 293 con Fc bloqueado que expresaban en exceso hIL22RA. Se detectó la unión de los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA a las células usando IgG de cabra dirigida contra ratón diluida a 1:200 (Southern Biotech, Birmingham, AL). Las células se analizaron como se ha descrito anteriormente. Los ratones se volvieron a inmunizar un total de 3 veces más y el suero se cribó como se ha descrito. Dos ratones se seleccionaron para fusión de hibridoma, usando procedimientos estandarizados en la técnica para generación de anticuerpos monoclonales (Ejemplo 25), basándose en el nivel de la unión del suero a los transfectantes hIL-22RA. [0492] El procedimiento anterior se usó también para generar células P815 que expresaban receptores IL-22RA heterodiméricos, tales como IL-22RA/CRF2-4 (células P815/IL-22RA/CRF2-4), IL-22RA/pDIRS1 (células P815/IL-22RA/pDIRS1),

o IL-22RA/CRF2-4/pDIRS1 (células P815/IL-22RA/CRF2-4/pDIRS1), por ejemplo para inmunizar ratones para la generación de anticuerpos monoclonales contra receptores heterodiméricos que comprendenIL-22RA y IL-22RA.

EJEMPLO 30 GENERACIÓN DE MABS DE MURINO DIRIGIDOS CONTRA IL-22RA HUMANO (IL-22RA)

A. INMUNIZACIÓN POR GENERACIÓN DE ANTICUERPOS DIRIGIDOS CONTRA IL-22RA:

(1)

Uso de IL-22RA-muFc soluble [0493] Ratones de de seis a doce semanas de edad con IL-22RA inactivado (Ejemplo 26) se inmunizaron mediante inyección intraperitoneal con 25-50 ug de proteína IL-22RA-muFc soluble humana (Ejemplo 23) mezclada 1:1 (v:v) con adyuvante de Ribi (Sigma) en una pauta bisemanal. Entre siete y diez días tras la tercera inmunización, se tomaron muestras de sangre por sangrado retroorbital, se cosechó el suero, y se evaluó por su capacidad para inhibir la unión de IL-22 o de ambos IL-20 y IL-22 a IL-22RA en un ensayo de neutralización (por ejemplo, el descrito en el presente documento) y para distinguir por tinción las células 293 transfectadas con IL-22RA respecto a las no transfectadas en un ensayo de tinción con FACS. Los ratones continuaron siendo inmunizados y las muestras de sangre se extrajeron y evaluaron como se ha descrito anteriormente hasta que los títulos de neutralización alcanzaron una meseta. En ese momento, los ratones con los títulos de neutralización más elevados fueron inyectados intravascularmente con 25-50 ug de

proteína IL-22RA-Fc soluble en PBS. Tres días después, se cosecharon el bazo y nódulos linfáticos de dichos ratones y se usaron para generación de hibridomas, por ejemplo usando células de mieloma de ratón (P3-X63-Ag8.653.3.12.11) u otras líneas celulares apropiadas en la técnica, usando procedimientos estandarizados conocidos en la técnica (por ejemplo, consultar Kearney, J.F. y col., J Immunol. 123: 1548-50, 1979; y Lane, R.D. J Immunol Methods 81:223-8, 1985).

(2)

Uso de transfectantes P815 que expresan el receptor IL-22RA. [0494] Ratones DBA/2 hembra de seis a diez semanas de edad se inmunizaron mediante inyección intraperitoneal de 1 x 105 células transfectadas con P815 vivas, por ejemplo células P815/IL-22RA, P815/IL-22RA/CRF2-4, P815/IL-22RA/pDIRS1 o P815/IL-22RA/CRF2-4/pDIRS1 (Ejemplo 24) (por ejemplo, 0,5 ml a una densidad celular de 2 x 105 células/ml). Antes de la inyección, las células se mantuvieron en la fase de crecimiento exponencial. Para inyección, las células se cosecharon, se lavaron tres veces con PBS, y a continuación se volvieron a suspender en PBS hasta una densidad de 2 x 105 células/ml. En dicho modelo, los ratones desarrollan un tumor ascites en 2-3 semanas y progresa hasta la muerte en 4-6 salvo que se active una respuesta inmune contra el antígeno diana transfectadas. A las tres semanas, los ratones sin hinchazón abdominal (indicativo de ascites) se volvieron a inmunizar como anteriormente en intervalos de 2-3 semanas. Entre siete y diez días tras la segunda inmunización, se tomaron muestras de sangre por sangrado retroorbital, se cosechó el suero, y se evaluó por su capacidad para inhibir la unión de IL-22 o de ambos IL-20 y IL-22 a IL-22RA en un ensayo de neutralización (por ejemplo, el descrito en el presente documento) y para distinguir por tinción las células 293 transfectadas con IL22RA respecto a las no transfectadas en un ensayo de tinción con FACS. Los ratones continuaron siendo inmunizados y las muestras de sangre se extrajeron y evaluaron como se ha descrito anteriormente hasta que los títulos de neutralización alcanzaron una meseta. En ese momento, los ratones con los títulos de neutralización más elevados fueron inyectados intravascularmente con 1 x 105 células transfectadas con P815 vivas. Cuatro días después, el bazo y nódulos linfáticos de estos ratones se cosecharon y se usaron en la generación de hibridomas, por ejemplo, usando células de mieloma de ratón (P3-X63-Ag8.653.3.12.11) u otras líneas celulares apropiadas en la técnica, usando procedimientos estandarizados conocidos en la técnica (por ejemplo, consultar Kearney, J.F. y col., más arriba.; y Lane, R.D. más arriba.). [0495] Una alternativa al esquema de inmunización anterior con células transfectadas con P815 vivas implica inyección intraperitoneal de 1-5 x 106 células

transfectadas irradiadas cada 2-3 semanas. Con esta hipótesis, ningún animal desarrolló ni murió de ascites. En su lugar, los animales se controlaron en busca de una respuesta inmune neutralizante frente a IL-22RA en el suero como se ha detallado anteriormente, partiendo con un sangrado tras la segunda inmunización. Una vez los títulos de neutralización alcanzaron un nivel máximo, se proporcionó a los ratones con los títulos más altos una inyección intraperitoneal pre-fusión de 5 x 106 células irradiadas y cuatro días después, el bazo y nódulos linfáticos de estos ratones se cosecharon y usaron para generar hibridomas, por ejemplo usando células de mieloma de ratón (P3-X63-Ag8.653.3.12.11) u otras líneas celulares apropiadas en la técnica, usando procedimientos estandarizados conocidos en la técnica (por ejemplo, consultar Kearney, J.F. y col., más arriba.; y Lane, R.D. más arriba.).

B. CRIBADO DE LOS HIBRIDOMAS DE CONDENSACIÓN DE LOS ANTICUERPOS QUE SE UNEN A IL-22RA E INHIBEN LA UNIÓN DE IL-22 CON IL-22RA: [0496] Se llevaron a cabo dos cribados diferentes primarios sobre los sobrenadantes de los hibridomas a los 8-10 días después de la condensación. Para el primer ensayo, se ensayaron anticuerpos en los sobrenadantes por su capacidad de unirse a una proteína IL-22RA-muFc humana soluble unida a placa mediante ELISA usando los reactivos de la segunda etapa de cabra dirigida contra la cadena kappa de ratón y dirigida contra la cadena ligera lambda conjugados con HRP para identificar los anticuerpos de ratón unidos. Para demostrar la especificidad por la porción de IL22RA de la proteína IL-22RA-muFc, se evaluaron los sobrenadantes positivos en el ensayo inicial sobre una proteína irrelevante condensada con la misma región Fc de murino (mG2a). El anticuerpo en los sobrenadantes que se une a IL-22RA-muFc y no a la proteína de condensación irrelevante que contiene muFc se consideró que era específico de IL-22RA. Para el segundo ensayo, se evaluaron los anticuerpos en todos los sobrenadantes de los hibridomas mediante ELISA para su capacidad de inhibir la unión de IL-22 humana biotinilado a la placa que se une a IL-22RA-muFc. [0497] Todos los sobrenadantes que contenían los anticuerpos que se unen específicamente a IL-22RA ya inhibieran o no la unión de IL-22 a IL-22RA en el ensayo ELISA, se ensayaron posteriormente respecto de su capacidad de inhibir la unión (y el efecto proliferativo concomitantes) de IL-20 o IL-22 a IL-22RA/IL-20RB y las células Baf3 transfectadas con IL-22RA/CRF2-4, respectivamente. Todos los sobrenadantes cuya neutralización fue positiva tanto en el ensayo de inhibición de IL22 como en los ensayos de inhibición de IL-20 e IL-22 se evaluaron posteriormente respecto de su capacidad de teñir las células BaF3 transfectadas versus no transfectadas con IL-22RA mediante el análisis FACS. Se diseñó este análisis para confirmar que la inhibición de la unión de IL-22 con IL-22RA/CRF2-4, o la unión de Il-20 con IL-22RA/IL-20RB, fue, de hecho, debida a un anticuerpo que se une específicamente al receptor de IL-22RA. Adicionalmente, debido a que se llevó a cabo el análisis FACS con un reactivo de de la segunda etapa dirigido contra IgG, los resultados positivos específicos de FACS indican que el anticuerpo neutralizante era probable que fuera del tipo IgG. Por estos medios, se identificó un pocillo principal que se unía a IL-22RA en la placa de unión a ELISA, que inhibió la unión de IL-22 con IL-22RA en el ensayo de inhibición basado en ELISA, bloqueó la interacción de Il-20 e IL-22 con las células BAF3 transfectadas con IL-22RA/IL-20RB e IL22RA/CRF2-4 (Ejemplo 28), respectivamente, y fue fuertemente positivo para la tinción de IL-22RA/IL-20RB y las células BaF3 transfectadas con IL-22RA/CRF2-4 con un reactivo de la segunda etapa dirigido contra IgG de ratón.

D. CLONACIÓN DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS DIRIGIDOS CONTRA IL-22RA QUE PRODUCEN HIBRIDOMAS: [0498] Se clonó un hibridoma que producía un mAb dirigido contra IL-22RA que neutralizaba en cruzado la unión de IL-20 e IL-22 con células BaF3 apropiadamente transfectadas mediante una solución de dilución estándar de baja densidad (menos de 1 célula por pocillo). Aproximadamente 5-7 días después del plaqueo, se cribaron los clones mediante ELISA sobre una placa unida a IL-22RA-muFc humano seguido por una repetición del ensayo de los pocillos positivos mediante ELISA sobre muFc irrelevante que contenía la proteína de fusión según se he descrito anteriormente. Se confirmó adicionalmente la actividad específica del anticuerpo de los clones seleccionados cuyos sobrenadantes se unen a Rel-22RA-muFc y no la de muFc irrelevante que contiene la proteína de fusión repitiendo ambos ensayos de neutralización así como el análisis FACS. Se clonaron todos los clones positivos de los anticuerpos de IL-22RA un mínimo de dos veces para ayudar a asegurar la clonalidad y para evaluar la estabilidad de la producción de anticuerpos. Se llevaron a cabo ciclos de clonación adicionales y se cribaron según se ha descrito hasta que, preferiblemente, al menos un 95 % de los clones resultantes fueron positivos para la producción de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra IL-22RA.

E. CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE LA MOLÉCULA RECONOCIDA POR LOS mAb DIRIGIDOS CONTRA IL-22RA: [0499] Se llevó a cabo la confirmación bioquímica de que la molécula diana, IL

22RA, reconocida poe los posibles mAb dirigidos contra IL-22RA es, de hecho, IL22RA, mediante inmunoprecipitación estándar seguida por los procedimientos de análisis SDS-PAGE o de transferencia western, empleando ambos preparaciones de membranas solubles de células BaF3 transfectadas con IL-22RA versus células BaF3 no transfectadas. Además, se usaron preparaciones de membranas solubles de las líneas celulares no transfectadas que expresan IL-22RA para mostrar que los mAb reconocen la cadena receptora natural así como la transfectada. Alternativamente, se ensayaron los mAb para su capacidad de inmunoprecipitar o transferir mediante transferencia western específicamente la proteína IL-22RA-muFc soluble.

EJEMPLO 31 NEUTRALIZACIÓN DE huL22RA MEDIANTE SUEROS DE RATONES INYECTADOS CON CÉLULAS P815 TRANSFECTADAS CON huIL22RA [0500] Usando el ensayo de neutralización basado en células descrito en el Ejemplo 28, se añadió el suero de ratones inyectados con células P815 vivas transfectadas con huIL-22RA como una dilución en serie al 1 %, 0,5 %, 0,25 %, 0,13 %, 0,06 %, 0,03 %, 0,02 %, y 0 %. Se incubaron las placas de ensayo a 37º C, CO2 al 5 % durante 4 días en cuyo momento se añadió Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) a 20 µl/pocillo. Se incubaron de nuevo las placas a 37º C, CO2 al 5 % durante 16 horas. Los resultados mostraron que el suero de cuatro de los animales podría neutralizar la señalización de huIL-22 y huIL20 a través de huIL-22RA. [0501] A la concentración del 1 %, el suero de seis animales (7125, 7127, 7128, 7118, 7124 y 7117) neutralizo entre un 50 % y un 80 % de la proliferación inducida por huIL-22, disminuyendo la inhibición de la proliferación de una manera dependiente de la dosis a concentraciones más bajas. Además, a la concentración del 1 %, el suero de cuatro animales (7125, 7127, 7118, y 7117) neutralizó entre un 40 % y un 70 % de la proliferación inducida por huIL20, disminuyendo la inhibición de la proliferación de una manera dependiente de la dosis a concentraciones más bajas. Estos resultados demostraron además que los anticuerpos de IL-22RA podrían de hecho antagonizar la actividad de los ligandos proinflamatorios, IL-20 e IL-22 a bajas concentraciones. [0502] Estos resultados proporcionaron evidencias adicionales de que la actividad eficazmente bloqueante de IL-22RA uniendo, bloqueando, inhibiendo, reduciendo, antagonizando o neutralizando la actividad de IL-20 o IL-22 (individual o conjuntamente), por ejemplo, mediante un anticuerpo monoclonal neutralizante de IL22RA de la presente, podría ser ventajosa para reducir los efectos de IL-20 e IL-22 (solos o en conjunto) in vivo, y puede reducir la inflamación inducida por IL-20 y/o IL22, tal como la que se observa en los efectos sobre la piel inducidos por I-20, así como en los efectos en la piel inducidos por IL-22, por ejemplo, en la psoriasis, IBD, colitis u otras enfermedades inflamatorias inducidas por Il-20 y/o IL-22 que incluyen la IBD, artritis, asma, artritis psoriática, colitis, dolencias inflamatorias de la piel, y dermatitis atópica.

EJEMPLO 32 FENOTIPO DE RATONES QUE TIENEN IL-22RA INACTIVADO

A. GENERACIÓN DE RATONES QUE CONTIENEN MODIFICACIONES GENÉTICAS

1. GENERACIÓN DE RATONES TRANSGÉNICOS QUE EXPRESAN IL-20 CON UN NEONATO DE PIEL BRILLANTE a). CONSTRUCCIÓN PARA EXPRESAR IL-20 DE MURINO A PARTIR DEL PROMOTOR k14 [0503] Con el fin de investigar la función biológica de IL-20 in vivo, se preparó un producto transgénico, en el que se impulsó IL-20 de murino mediante el promotor K14 humano (véase también, el Ejemplo 21). Se diseñaron oligonucleótidos para generar un fragmento de la PCR que contenía una secuencia Kozak consenso y la región de codificación de IL-20 de murino. Se diseñaron estos oligonucleótidos con un lugar FseI en el extremo 5’ y un lugar AscI en el extremo 3’ para facilitar la clonación en pRSK14, un vector transgénico estándar, que contenía un promotor de los queratinocitos humanos y específico de células epiteliales. [0504] Se llevaron a cabo las reacciones de la PCR con aproximadamente 200 ng de plantilla de IL-20 de murino (SEC DE ID Nº: 33) y los oligonucleótidos diseñados para amplificar la longitud completa de IL-20 (SEC DE ID Nº: 34). Se determinaron las condiciones de la reacción de la PCR usando procedimientos conocidos en la técnica. Se separaron los productos de la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa y se purificaron usando un kit de extracción con gel QiaQuickTM (Qiagen). Se digirió el fragmento de ADN aislado, correctamente dimensionado con FSEI y AscI (Boerhinger-Mannheim), se precipitó con etanol y se ligó en pRSK14, previamente digerido con FseI y AscI. El plásmido pRSK14, diseñado para expresar un gen de interés en células de queratinocitos y epiteliales en ratones transgénicos, contiene un casete de expresión flanqueado por un promotor K14 específico de queratina humana de aproximadamente 3 kb. [0505] Se sometió a electroporación aproximadamente un microlitro de la reacción de ligadura en células competentes DH10B con ElectroMaxTM (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) según las indicaciones del fabricante y se plaquearon sobre placas LB que contenían 100 µg/ml de ampicilina, y se incubaron durante la noche. Se repicaron las colonias y se hicieron crecer en medios LB que contenían 100 µg/ml de ampicilina. Se preparó ADN miniprep a partir de los clones repicados y se cribaron para la inserción de IL-20 de murino mediante digestión con restricción de FseI y AscI combinados, y posterior electroforesis en gel de agarosa. Se confirmó la construcción TG con las inserciones correctas de ADNc mediante el análisis por secuenciación. Se llevaron a cabo maxipreps del IL20 de PRSK14-murino correcto.

b) GENERACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE RATONES TRANSGÉNICOS K14 IL-20 [0506] Se aisló un fragmento Notl de aproximadamente 4 b de longitud procedente del vector transgénico (TG) que contenía las secuencias que flanquean 5’ y 3’ del promotor K14 específico de queratina, IL-20 de ratón (SEC DE ID Nº: 33; polipéptido que se muestra en la SEC DE ID Nº: 34), el intrón Gordon, ADNV de IL20 y las secuencias señal poliA de la hormona del crecimiento humano. Se usó la para la microinyección en oocitos de murino B6C3f1 fertilizados (Taconic, Germantown, NY). La microinyección y la producción de ratones transgénicos se produjeron según se describe en Hogan, B. y col. Manipulating the Mouse Embryo, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1994. [0507] Se usó una reacción de la RT-PCR TaqManTM para cuantificar la expresión del ARN de TG usando cebadores de la PCR específicos de la porción de la señal poliA de la hormona del crecimiento humano del transgen. [0508] Todas las construcciones TG que expresaban IL-20 presentaron un elevado índice de mortalidad paranatal, y las crías TG que nacieron presentaron normalmente un fenotipo “de piel brillante”. Esta apariencia brillante de las crías neonatas pareció estar asociada con agarrotamiento de la piel, ya que si se secó, dio como resultado una reducción de la lactancia apropiada. Sus movimientos se volvieron agarrotados en general. Histopatológicamente, las crías de piel brillante tienen una epidermis engrosada y se compactó la capa de queratina. La mayoría de estas crías precursoras de piel brillante murieron en los primeros cinco días, y las crías sobrevivientes y destetadas no expresaron en general el transgen (según el análisis de la transcripción) o eran quiméricas (según la baja transmisión del transgen a la descendencia). [0509] Se estableció una línea que expresaba IL-20 de murino, impulsada por el promotor K14 El nivel de expresión en la piel y el timo era bajo, y los neonatos nacieron con un fenotipo de piel brillante. En general esta línea tuvo un 20 % de descendencia TG, indicando que el 50-60 % de las crías transgénicas murió en el útero. (En un apareamiento hemicigótico, el 50 % de la descendencia debería ser TG).

2. GENERACIÓN DE RATONES CON SUPRESIÓN DE LA EXPRESIÓN DE IL-22RA; RATONES QUE TIENEN INACTIVADO IL-22RA a). GENERACIÓN DE CONSTRUCCIONES CON GENES INACTIVADOS (KO) DE IL-22RA DE MURINO [0510] Para estudiar adicionalmente la función biológica de IL-22RA in vivo, se creó una estirpe de ratones con genes inactivados (KO) para suprimir la expresión de LI-22RA. En primer lugar, se usaron ADNc de IL-22RA de ratón para cribar una biblioteca BAC genómica de ratones 129/SvJ. Se identificaron los clones que contenían el locus genómico de IL-22RA y se caracterizaron. Se muestran polinucleótidos de IL-22RA de murino en la SEC DE ID Nº: 41 y el polipéptido en la SEC DE ID Nº: 42. [0511] Para crear una construcción con genes inactivados para la supresión de IL22RA, se preparó un vector con genes inactivados usando la técnica de clonación ET (Zhang y col. 1998. A new logic for DNA engineering using recombination in E. coli. Nat. Genet. Vol. 20: 123-8). Brevemente, el vector KO contiene un brazo 5’ de 1,8 kb (brazo corto), un marcador seleccionable IRES-LacZ/MClneo, y un brazo 3’ de 10 kb (brazo largo) del gen IL-22RA. En el vector KO, se sustituyeron los exones 2, 3 y 4 así como los intrones 2 y 3 de la secuencia genómica de IL-22RA por el marcador seleccionable IRES-LacZ/MClneo de tal manera que se generó una delección de aproximadamente 4,4 kb mediante recombinación homóloga en las células ES. [0512] Tras la linealización del vector KO mediante la enzima de restricción PmeI, se sometió a electroporación en células ES de 129/SvJ. Se llevó a cabo la selección de episodios de recombinación homóloga, así como la identificación de clones ES recombinantes según se describe en Robertson, E.J. y col. Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. 2ª ed., IRL Press Limited, Oxford, 1987.

b). CREACIÓN Y ANÁLISIS DE RATONES CON EXPRESIÓN SUPRIMIDA DE IL-22RA [0513] Se expandieron los clones ES positivos en los que se produce la delección de los Exones 2-4 y de los Intrones 2-3 del locus genómico de IL-22RA. Se inyectaron en blastocistos de ratones C57BI/6j. Tras una breve reexpansión de los blastocistos inyectados, se introdujeron en madres de acogida pseudoembarazadas para generar quimeras. La inyección de los blastocistos, la reproducción de las quimeras y la posterior transmisión de la línea germinal de IL-22RA mutada se llevó a cabo según se describe en Robertson, E.J. y col. Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, 2ª ed., IRL Press Limited, Oxford, 1987. [0514] Se identificaron los ratones mutantes KO mediante la estrategia de genotipación de la PCR. Se usaron tres cebadores de la PCR ZC22901 (SEC DE ID Nº: 35), ZC45039 ((SEC DE ID Nº:36), ZC38573 (SEC DE ID Nº:37) en una reacción multiplex de la PCR para detectar el alelo natural y el alelo mutante. El alelo natural (WT) dio como resultado un fragmento de ADN de 229 pb de longitud, mientras que el alelo mutante genera un fragmento de ADN de 372 pb de longitud. [0515] El emparejamiento de ratones hemicigóticos produce una relación normal de descendencia homocigótica (HOM), heterocigótica (Het), y naturas (WT) así como una relación normal de sexos. Inspeccionando los ratones mediante un PhysioScreen (recogiendo el peso corporal, el peso del tejido, el recuento de sangre completa (CBC), la química clínica, la observación ordinaria, y la histopatología, no se desvelaron diferencias aparentes entre los animales HOM, Het, y WT.

B. IL-22RA ERA NECESARIO PARA LA INDUCCIÓN DE SAA POR IL-22: LA EXPRESIÓN DE SAA QUE MUESTRA ELISA DE SAA INDUCIDA POR IL-22 ESTABA AUSENTE EN RATONES QUE TIENEN INACTIVADO IL22RA: [0516] Para evaluar si era necesario IL-22RA para la inducción de SAA en ratones inyectados con IL-22, se inyectaron ratones KO IL-22RA con 5 µg de IL-22 y se sangraron 6 horas después. [0517] Se llevó a cabo un ELISA para determinar los niveles de SAA en las muestras de suero usando el Kit de Inmunoensayo de SAA de Ratón (BioSource International, California) usando las indicaciones del fabricante, con el suero diluido 1:1000. Cuatro de cinco ratones WT mostraron elevados niveles de SAA en respuesta a la inyección de IL-22, mientras que cuatro de cinco ratones KO IL-22RA HOM mostraron niveles basales de SAA. Los ratones KO IL-22RA Het tienen elevados niveles de SAA, pero inferiores a los elevados niveles de SAA en ratones WT. Esto indica que fue necesaria IL-22RA para la inducción de SAA por IL-22. [0518] Estos resultados proporcionan evidencias de que la actividad eficazmente bloqueante de IL-22RA, por ejemplo mediante un gen IL-22RA inactivado o similarmente, mediante un anticuerpo monoclonal neutralizante de IL-22RA de la presente invención, podría reducir similarmente la inflamación inducida por IL-22, por ejemplo, en la psoriasis, IBD, colitis, endotoxemia, u otras enfermedades inflamatorias inducidas por IL-22.

C IL-22RA ERA NECESARIO PARA EL ENGROSAMIENTO EPITELIAL INDUCIDO POR IL-22: LA ADMINISTRACIÓN DE PROTEÍNA PURA IL-22 MEDIANTE MINIBOMBA OSMÓTICA IMPLANTADA

SUBCUTÁNEAMENTE NO PRODUCE ENGROSAMIENTO DE LA EPIDERMIS DE RATONES KO IL-22R. [0519] Para evaluar si IL-22RA era necesario para el engrosamiento epitelial inducido por IL-22, se administró IL-22 subcutáneamente a ratones HOM IL-22RA y KO WT mediante minibombas osmóticas Las bombas administraron IL-22 a una velocidad de 18,4 µl por día durante 7 días. Cuatro ratones HOM y 6 KO IL-22RA WT recibieron proteína IL-22, mientras que 3 HOM y 1 WT recibieron PBS. [0520] Se ensayaron las muestras de suero de ratones tratados con IL-22 en el ensayo de proliferación de BaF3 para confirmar la presencia de IL-22. Las células BaF3 transfectadas con IL-22RA y CRF2-4 requieren la presencia tanto de IL-22 como de IL-3 de murino para proliferar. Se centrifugaron estas células y se lavaron en medios completos, sin mIL-3 (medio RPMI (JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS) suplementado son suero de ternera fetal térmicamente inactivado al 10 % L-glutaMax1™ 2 mM (Gibco BRL), piruvato de sodio 1 mM (Gibco BRL), y antibióticos PSN (GIBCO BRL)) (denominados en el presente documento como “medios exentos de mIL-3). Se centrifugaron las células y se lavaron 3 veces para asegurar la eliminación de mIL-3. Se contaron las células en un hematocitómetro y se plaquearon en un formato de 96 pocillos a 5000 células por pocillo en un volumen final de 200 µl por pocillo usando los medios exentos de mIL-3. El suero de ratón estaba presente en los pocillos al 1 %, 0,5 %, 0,25 % o 0,125 %. Se incubaron las placas de ensayo a 37º C, CO2 al 5 % durante 3 días, en cuyo momento se añadió Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) a 20 µl/pocillo. Se incubaron de nuevo las placas a 37º C, CO2 al 5 % durante 24 horas. Alamar Blue proporcionó una lectura fluorométrica basada en el número de células vivas, y de esta manera era una medida directa de la proliferación celular en comparación con un control negativo. Se incubaron de nuevo las placas a 37º C, CO2 al 5 % durante 24 horas. Se leyeron las placas en el Contador Victor 2 1420 Multilabel de Wallac (Wallac, Turku, Finlandia) a longitudes de onda de 530 (Excitación) y 590 (Emisión). Los resultados mostraron que ninguno de los animales inyectados con PBS tuvieron actividad de IL-22, mientras que 1 de 1 animal Het, 2 de 4 animales HOM, y 3 de 6 animales WT tuvieron actividad de IL-22 detectable. La proliferación inducida por este suero se bloqueó por la presencia de 1 µg/ml de IL22BP, proporcionando que este fuera específico de IL-22. [0521] Las muestras de piel de ratones HOM IL-22RA y Het con genes inactivados (KO) y WT controles tratados y no tratados con IL-22 se fijaron por

5 inmersión en formalina tamponada al 10 %. Los tejidos se cortaron e incluyeron e parafina, procesados de manera rutinaria, se seccionaron a 5 µm (microtomo Jung 2065 Supercut, Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) y se tiñeron con H&E. Los tejidos teñidos se evaluaron con un microscopio óptico (Nikon Eclipse E600, Nikon Inc., Melville, NY) por un patólogo veterinario legalmente certificado ACVP.

10 [0522] Se evaluó cada muestra de piel en una escala de 0 (ninguna) a 4 (grave) para la gravedad de la inflamación en el tejido que bordea el lugar de implante de la bomba en la hipodermis, en una escala de 0 (ninguna) a 3 (difusa) para la extensión del engrosamiento epidérmico (acantosis), y se contó el número de capas epiteliales en la parte más gruesa de la epidermis. No se encontraron diferencias entre los ratones HOM

15 y los ratones WT que hubieran sido proporcionadas por PBS. Se combinaron los resultados de estos dos grupos en un grupo PBS. Se determinaron el promedio y la desviación estándar de cada grupo de tratamiento y se mostraron en la Tabla 14 a continuación. Tabla 14

Treatment

PBS control HOM KO: IL-22 WT: IL-22

Número de ratones

4 4 6

Espesor epitelial

3,5 ± 1,0 3,2 ± 60,5 5,9 + 2,3

Exento de acantosis

0,5 ± 1,0 0,2 +0 ,5 1,9 ± 1,3

Inflamación

1,5 ± 1,0 1,2 ± 1,0 2,0 ± 1,0

20 [0523] Los resultados mostraron una tendencia hacia el aumento del engrosamiento epitelial y la acantosis en ratones WT tratados con IL-22 y una disminución en el engrosamiento epitelial y la acantosis en ratones HOM IL-22RA cuando se expusieron a Il-22. [0524] Estos resultados proporcionan evidencias de la actividad eficazmente

25 bloqueante de IL-22RA, por ejemplo, mediante un gen que tiene inactivado IL-22RA o similarmente mediante un anticuerpo monoclonal neutralizante de IL-22RA de la presente invención, que podrían similarmente reducir los efectos sobre la piel inducidos por IL-22, por ejemplo, en la psoriasis, IBD, colitis, u otras enfermedades inflamatorias inducidas por IL-22.

30 D. IL-22RA ERA NECESARIO PARA LA PIEL BRILLANTE INDUCIDA POR

IL-20 DE LA PIEL DE CRÍAS NEONATAS: LA REPRODUCCIÓN CRUZADA DE RATONES TRANSGÉNICOS QUE EXPRESAN IL-20 DE MURINO CON RATONES KO IL-22RA PRODUCE CRÍAS TRANSGÉNICAS QU NO TIENEN LA PIEL BRILLANTE [0525] Para evaluar si IL-22RA era necesario para la piel brillante inducida por IL-20 de las crías TG neonatas, se cruzó el gen K14 muIL-20 en la línea KO IL-22RA, y se observaron los neonatos respecto del fenotipo de piel brillante. [0526] Nacieron sesenta y nueve crías con una relación genotípica mendeliana. Todas las TG en un fondo de Het KO fueron de piel brillante, mientras que ninguna de las no TG, ni las TG en el fondo HOM KO fueron de piel brillante. [0527] Se llevó a cabo un ensayo de proliferación alamar blue usando células BaF3 que expresaban IL-20RA e IL-20RB para evaluar la presencia de IL-20 en el suero de ratón. Estas células proliferarán en respuesta tanto a IL-20 como a IL-3 de murino. El procedimiento fue el mismo que el descrito en la Sección C anterior. Los resultados del ensayo mostraron que todos los ratones TG tenían actividad de IL-20 comparable y en el mismo nivel que los IL-20 TG en el fondo C57BL/6N. La ausencia de cualquier fenotipo de piel brillante en neonatos indica que el fenotipo de piel brillante en neonatos era dependiente de la presencia de IL-22RA. El ensayo de proliferación mostró que todos los ratones TG tenían actividad de IL-20 comparable, y en el mismo nivel que los IL-20 TG en el fondo C57BL/6N. La ausencia de cualquier fenotipo de piel brillante en neonatos indica que el fenotipo de piel brillante en neonatos era dependiente en la presencia de IL-22RA. [0528] En el tercer día después del parto, las crías de las camadas que contenían K14 muIL-20 TG en el fondo IL-22RA KO se sometieron a eutanasia de manera humana y se fió por inmersión el cuerpo completo en formalina tamponada al 10 %. Los tejidos fijados se cortaron en secciones cruzadas del tórax y el abdomen, se incluyeron en parafina, se procesaron de manera rutinaria, se seccionaron a 5 µm (microtomo Jung 2065 Supercut, Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) y se tiñeron con H&E. Los tejidos teñidos se evaluaron con un microscopio óptico (Nikon Eclipse E600, Nikon Inc., Melville, NY) de una manera ciega por un patólogo veterinario legalmente certificado ACVP. Se señalaron las anormalidades del tejido y se contó el número de las capas epiteliales en la epidermis del tórax anterior dorsal. [0529] Se examinaron microscópicamente los tejidos procedentes de tres ratones IL-20 TG en el fondo HOM IL-22RA KO (IL-20 TG/IL-22RA KO HOM) y tres ratones no TG en el fondo IL-22RRA HOM KO (no-TG/IL-22RA KO HOM) y se encontró que no contenían anormalidades. Se examinaron también los tejidos procedentes de dos ratones IL-20 TG en el fondo Het IL-22RA KO (IL-20 TG/IL22RA KO Het). El número de capas epiteliales en la epidermis era similar en todos los animales. Sin embargo, la epidermis de los dos ratones Eel-20 TG/IL-22RA KO Het era hipereosinófila en comparación con la de los otros animales y presentó pérdida de granularidad en el estrato granuloso. No se señalaron otras anormalidades en la piel u otros tejidos de ninguno de los ratones. [0530] Estos resultados proporcionan evidencias de que la actividad eficazmente bloqueante de IL-22RA, por ejemplo, mediante un gen que tiene inactivado IL22RA o similarmente, mediante un anticuerpo monoclonal neutralizante de IL-22RA de la presente invención, podrían reducir similarmente los efectos sobre la piel inducidos por Il-20, así como los efectos sobre la piel inducidos por Il-22, por ejemplo, en la psoriasis, IBD, colitis, u otras enfermedades inflamatorias inducidas por Il-20, y/o IL22 que incluyen la IBD, artritis, asma, artritis psoriática, colitis dolencias inflamatorias de la piel, y dermatitis atópica.

EJEMPLO 33 ANÁLISIS HISTOMORFOMÉTRICO DE IMÁGENES DE RATONES QUE TIENEN INACTIVADO IL-22RA [0531] Se ha establecido una línea de ratones transgénicos (TG) k14 IL-20 m, y los neonatos TG presentan un fenotipo de piel brillante. El transgen se expresa mediante el promotor k14, que dirige la expresión de las células que producen queratina en la piel. Se ha establecido también una línea de ratones que tienen inactivado (KO) IL-22RA, y no se han observado cambios significativos en los ratones no estimulados. Se cruzaron las dos líneas entre sí y se recogieron los neonatos que tenían los siguientes cuatro diferentes genotipos. (1) TG/-HOM: que expresan el transgen k14 IL-20 m en un fondo que no expresa Il-22RA; (2) TG/-het: que expresan el transgen k14 Il-20 m en un fon do que expresa que expresa algún IL-22RA procedente de una copia del gen IL-22RA; (3) WT/HOM: que no expresan el transgen k14 IL-20 m en un fondo que expresa algún IL-22RA procedente de una copia del gen IL-22RA. Se sometieron a eutanasia treinta y cuatro crías de neonato de estos diversos genotipos en el día 3, aproximadamente 48 horas después del parto (Tabla 15).

Tabla 15

TG/-HOM* TG/-Het* WT/HOM*

WT/Het*

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3

Grupo 4

Total n=10 n=10 n=9

n=5

TG = transgénico; WT = tipo natural; HOM = homocigótico; Het = heterocigótico; y n = número de cachorros.

[0532] Se cortó cada cría transversalmente en tres secciones (tórax craneal, tórax caudal y abdomen) a través del cuerpo y se descartó la cabeza. Los especímenes de tejido, de 4,0-5,0 mm de grosor, se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 %, se 5 procesaron en bloques de parafina y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) para el examen histológico rutinario y el análisis histomorfométrico de imágenes. Se escogió la epidermis del área dorsal de la médula espinal en cada muestra de tejido para el análisis histomorfométrico de imágenes usando un microscopio Olympus BH2, una videocámara (Dage-MTI, Michigan City, IN) y el software BioQuant True 10 Color para windows 98 (R&M Biometrics, Inc. Nashville, TN 37209) con la siguiente configuración: Parámetro: mag. IOX, desviación Z 0; Matriz: longitud (µm); Medida: modo manual y aditivo. Se midieron individualmente el grosor (µm) de la epidermis y el estrato córneo o la capa cornificada de cada muestra de piel 10 veces, con aproximadamente 0,1 mm de intervalo entre cada medida, en cada campo 15 microscópico y se obtuvieron el valor promedio, la SD y SEM mediante el cálculo con Excel. Se aleatorizaron todas las secciones y se midieron de una manera ciega. Tras la medida, se desvelaron las secciones, y se emparejaron los resultados de los grupos de tratamiento. Los resultados finales en el grupo de tratamiento se clasificaron como sigue: 1. Grosor epidérmico promedio (µm) en el tórax craneal, tórax caudal y 20 abdomen, y a continuación se subclasificaron como (a) Grosor epidérmico promedio en el tórax craneal; (b) Grosor epidérmico promedio en el tórax caudal; y (c) Grosor epidérmico promedio en el abdomen. 2. Grosor promedio del estrato córneo (µm) en el tórax craneal, tórax caudal y abdomen, y se subclasificaron como (a) Grosor promedio del estrato córneo en el tórax craneal; grosor promedio del estrato córneo en el tórax 25 caudal, y (c) grosor promedio del estrato córneo en el abdomen. 3. Grosor promedio de la epidermis más el estrato córneo en el tórax craneal, tórax caudal y abdomen. Se analizaron los datos resultantes usando el software GraphPad InStat (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA 92121). Se aplicó el análisis de la varianza en una vía (ANOVA) para examinar la significancia estadística de las diferencias en los valores

promedio entre el grupo 1 y el grupo 4. Se usó el Test de Múltiples Comparaciones de Tukey-Kramer para la determinación de las diferencias estadísticas en los valores promedio entre los dos grupos (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001). Se consideraron significativas las observaciones de P<0,05.

5 (1) RESULTADOS HISTOMORFOMÉTRICOS

(a) GROSOR EPIDÉRMICO PROMEDIO (µM) EN EL TÓRAX CRANEAL, TÓRAX CAUDAL Y ABDOMEN [0533] El grosor epidérmico aumentó significativamente en crías transgénicas de Il-20 que carecían de una copia del gen IL-22RA (TG/-Het) versus las crías

10 transgénicas de IL-20 sin expresión de IL-22RA (TG/- HOM, P=0.001***) y versus los compañeros de camada controles (WT/HOM, P=0.001***, and WT/Het, P=0.001***), respectivamente (Tabla 16). Las crías TG/-Het mostraron un aumento de grosor de la epidermis no queratinizada debido posiblemente a hipertrofia de los queratinocitos. Este aumento puede implicar las tres capas no queratinizadas (basal,

15 espinosa y granular) pero afectó más a menudo a la capa celular espinosa. La epidermis de las crías TG/-Het aumentó aproximadamente un 25 % de grosor y la capa espinosa llegó a ser prominente. Mientras que la epidermis de las crías TG/-HOM fue ligeramente más gruesa que la de los controles (WT/HOM y WT/Het) y la estadística no indicó diferencias significativas entre los grupos (P>0,05). Se comparó también el

20 grosor epidérmico en el tórax craneal, el tórax caudal y el abdomen. La epidermis normalmente delgada del abdomen es más gruesa que la del tórax caudal, y la del tórax caudal es más gruesa que la del tórax craneal (Tabla 16)

Tabla 16

TG/- HOM TG/- Het WT/HOM WT/Het

(N=28) (N=30) (N=27) (N=15)

Promedio 32,58 ± 125 41,05 ± 2,04 31,31 ± 1,08 30,83 ± 1,43

Los resultados representan valores medios ± SEM. N = número de secciones medidas

[0534] El epitelio escamoso de la piel en el tórax craneal procedente de las crías

25 TG/-Het mostró un aumento en el grosor acompañado por hipertrofia de las células epidérmicas (queratinocitos), sin embargo, no hubo diferencias estadísticas en comparación con los otros grupos, los TG/-HOM, WT/HOM y WT/Het (P=0.1565, Tabla 17). Esto parece ser el resultado de cualquier artefacto histológico, por ejemplo, variabilidad sección a sección, la arquitectura natural de la epidermis, o a que no hubo

30 mucho efecto en la piel delgada en el tórax craneal. Nota: el procedimiento de histología o la sección del tejido del tórax craneal puede descalificar el análisis

histomorfométrico para obtener la significancia estadística. Tabla 17

TG/- HOM TG/- Het WT/HOM WT/Het

(N=10) (N=10) (N=9) (N=5)

Promedio 29,18 ± 2,24 33,20 ± 2,24 27,28 ± 0,62 29,38 ± 1,77

Los resultados representan valores medios ± SEM. N = número de secciones medidas

[0535] Los IL-20 (TG/-) con una copia del gen IL-22RA (het) mostraron un valor promedio aumentado del grosor epidérmico en comparación con los TG/- HOM (P<0.05*), WT/HOM (P<0.001***), y WT/Het (P<0.01*), respectivamente (Tabla 5 18). La estadística indicó resultados extremadamente significativos entre los grupos (P<0.0001****). La epidermis de TG/-Het aumentó aproximadamente un 29 % más que la de WT/Het. El fenotipo de las crías de IL-20 (TG/-) con ausencia de IL-22RA (HOM) se asemejó en parte al de las crías que carecían de una copia del gen IL-22RA (Het) asociada con epidermis más gruesa que la de los compañeros de camada 10 controles (WT/HOM y WT/Het), sin embargo, no se demostraron diferencias estadísticas en comparación con los controles (P>0,05). La epidermis de TG/_HOM aumentó aproximadamente un 14 % más que la de WT/HOM. A diferencia de las crías IL-20 TG/-, las crías deficientes en el receptor de IL22RAm (WT/HOM y WT/Het) demostraron un grosor epidérmico relativamente más delgado. Significativamente, el

15 resultado histomorfométrico del grosor epidérmico en el tórax caudal fue un hallazgo consistente correlacionado con el grosor epidérmico promedio en el tórax craneal, el tórax caudal y el abdomen (Tabla 15), lo que indicó que el procedimiento histológico y la sección del tejido del tórax caudal verificó la mejor calidad para el análisis histomorfométrico de imágenes.

20

Tabla 18

TG/- HOM TG/- Het WT/HOM WT/Het

(N=10) (N=10) (N=9) (N=5)

Promedio 35,91 ± 1,37 43,79 ± 2,35 30,83 ± 1,86 30,94 ± 2,83

Los resultados representan valores medios ± SEM. N = número de secciones medidas

[0536] Los resultados del grosor epidérmico promedio en el abdomen (Tabla 19) fueron similares a los del tórax caudal (Tabla 18) excepto que los TG/-HOM no mostraron diferencias en comparación con los compañeros de camada controles

5 (WT/HOM y WT/Het, P>0.05). Hubo algunas variaciones en las secciones de tejido y desaparecieron también dos secciones, es decir, sin epidermis cubriendo el área dorsal en el grupo TG/-HOM. Tabla 19

TG/- HOM TG/- Het WT/HOM WT/Het

(N=8) (N=10) (N=9) (N=5)

Promedio 32,35 ± 1,44 46,33 ± 3,10 35,81 ± 1,90 32,16 ± 2,87

Los resultados representan valores medios ± SEM. N = número de secciones medidas

(b) GROSOR PROMEDIO (µM) DEL ESTRATO CÓRNEO EN EL TÓRAX

10 CRANEAL, EL TÓRAX CAUDAL Y EL ABDOMEN [0537] A pesar del aumento en el grosor epidérmico de las crías transgénicas de IL-20 (TG/-) tanto en un fondo que expresa IL-22RA (HOM) como que expresa una copia del gen (Het), se observó la reducción predominante en el grosor del estrato córneo o de la capa cornificada en las pieles de TG/-HOM y TG/- Het en comparación

15 con los compañeros de camada controles (WT/HOM y WT/Het) y la estadística indicó resultados extremadamente significativos entre los grupos (P<0.0001****, Tabla 20). Las crías TG/-Het mostraron aproximadamente cantidades disminuidas un 36 %, 50 % y 49 %, sobre la superficie de la epidermis versus las TG/-HOM (P<0,01**), WT/HOM (P<0,001***) y WT/Het (P<0,001***), respectivamente. Las crías TG/

20 HOM mostraron aproximadamente un 22 % de reducción significativa en el grosor del estrato córneo en comparación con su control (WT/HOM, P<0.05*) y únicamente un 17 % de reducción versus las WT/Het que no desvelaron significancia estadística (P>0,05). El grosor del estrato córneo en las cría controles, WT/HOM y WT/Het fue aproximadamente el mismo. Aparentemente, el estrato córneo en el tórax caudal es

25 más grueso que en el abdomen y el del abdomen es más grueso que el del tórax craneal.

Tabla 20

TG/- HOM TG/- Het WT/HOM WT/Het

(N=8) (N=10) (N=9) (N=5)

Promedio 33,26 ± 2,69 21,41 ± 1,27 42,54 ± 2,01 40,31 ± 3,82

Los resultados representan valores medios ± SEM. N = número de secciones medidas

[0538] El grosor promedio del estrato córneo en el tórax craneal (Tabla 21) se asemejo al de en el tórax craneal, tórax caudal y abdomen (Tabla 20), sin embargo, se encontró únicamente una reducción significativa del estrato córneo en los TG/- Het vs. 5 TG/- HOM (P<0.05*) y vs. WT/HOM (P<0.01**), respectivamente. La desviación estándar y el error estándar del promedio fueron elevados, los que puede ser debido a una mala sección; la desaparición de muestras de la piel, la arquitectura natural de la epidermis o a que no hubo mucho efecto en el tórax craneal. Nota: el procedimiento de histología o la sección del tejido del tórax craneal puede descalificar el análisis

10 histomorfométrico con el fin de obtener resultados de calidad.

Tabla 21

TG/- HOM TG/- Het WT/HOM WT/Het

(N=28) (N=30) (N=26) (N=14)

Promedio 34,69 ± 3,53 18,14 ± 3,99 40,47 ± 4,38 32,96 ± 8,11

Los resultados representan valores medios ± SEM. N = número de secciones medidas

[0539] El resultado del grosor promedio del estrato córneo en el tórax caudal (Tabla 22) fue similar al de en el tórax craneal, tórax caudal y abdomen, pero con tres excepciones: (1) TG/-HOM vs. TG/-Het y TG/-HOM vs. WT/HOM no mostraron

5 diferencias estadísticas (P>0,05); (2) TG/-HOM vs. WT/Het mostraron diferencias significativas (P<0,01**); (3) El estrato córneo en los WT/Het se engrosó de manera remarcable lo que puede ser consecuencia de un artefacto de procesamiento del tejido, por ejemplo, la queratina se hinchó o expandió cuando se colocó en disolución hipotónica o se dejó en un baño de agua demasiado tiempo.

10 Tabla 22

TG/- HOM TG/- Het WT/HOM WT/Het

(N=10) (N=10) (N=8) (N=4)

Promedio 35,64 ± 3,4 24,22 ± 1,54 44,35 ± 3,51 53,77 ± 7,21

Los resultados representan valores medios ± SEM. N = número de secciones medidas

[0540] Únicamente los TG/-HOM vs. WT/HOM y TG/-Het vs. WT/HOM mostraron diferencias estadísticamente significativas P<0,05* y P<0,001***, respectivamente (Tabla 23). Las crías TG/- presentaron una reducción en el grosor del estrato córneo en el abdomen en comparación con sus compañeros de camada

15 controles (WT/HOM y WT/Het).

Tabla 23

TG/- HOM TG/- Het WT/HOM WT/Het

(N=8) (N=10) (N=9) (N=4)

Promedio 28,84 ± 4,36 21,86 ± 1,30 42,45 ± 3,15 33,25 ± 3,96

Los resultados representan valores medios ± SEM. N = número de secciones medidas

c) GROSOR PROMEDIO (µM) DE LA EPIDERMIS MÁS EL ESTRATO CÓRNEO EN EL TÓRAX CRANEAL, TÓRAX CAUDAL Y ABDOMEN [0541] Las crías TG/-Het presentaron un significativo aumento en el grosor

5 epidérmico y una significativa disminución en el grosor de estrato córneo en comparación con los compañeros de camada controles (WT/HOM y WT/Het) y las crías TG/-HOM produjeron un resultado similar pero con un mínimo efecto (Tabla 24). Tabla 24

TG/- HOM TG/- Het WT/HOM

WT/Het

(N=10) (N=10) (N=9)

(N=4)

Estrato córneo 32,58 41,05 31,31

30,83

Epidermis 33,26 21,41 42,54

40,31

Los resultados representan valores medios N = número de cachorros

(d) SEÑALIZACIÓN DE IL-20 A TRAVÉS DE IL-20RA E IL-22RA

10 [0542] Se estratificó la epidermis, renovando continuamente el epitelio dependiente en un equilibrio entre la proliferación celular, la diferenciación, y la muerte por homeostasis. En la epidermis normal, una capa basal mitóticamente activa proporciona un aumento de los queratinocitos que se diferencian terminalmente que migran hacia el exterior y se desprenden de manera última de la superficie de la piel

15 como escamas enucleadas, la queratina o capa cornificada localizada en el estrato córneo. Aunque se conocen muchas proteínas que funcionan en el mantenimiento de la homeostasis epidérmica, se comprende muy mal la coordinación molecular de estos episodios. IL-20 es una novedosa proteína que interactúa con el receptor u señala a través de cualquiera de los receptores de IL-20RA o IL-22RA. (IL-22RA) se expresa

20 en una capa de piel asociada con la proliferación de queratinocitos. Los neonatos transgénicos de IL-20 presentan un fenotipo con grosor anormal y piel brillante. La deficiencia de IL-22RAm (HOM) en ratones no mostró respuesta al tratamiento con IL-22, mientras que los ratones naturales con el gen IL-22RA y tratados con EeU-22 demostraron un significativo aumento en el engrosamiento epidérmico P<0,001***,

25 véanse los resultados del análisis histomorfométrico de imágenes en IL-22RAm KO/IL-22, PID 59.2). Para investigar si la ausencia de IL-22RA tenía un efecto sobre el fenotipo de piel brillante observado en los K14 IL-20m TG neonatos, se aparearon ratones transgénicos que expresaban ectópicamente IL-20 con ratones homocigóticos IL-22RA (HOM) heterocigóticos deficientes en IL-22RA (Het). Se llevó a cabo previamente un análisis de imágenes cuantitativo del engrosamiento epidérmico en unas pocas crías en el tórax caudal de este estudio (es decir, 19 crías, 1 sección por cría, para un total de 19 secciones) pero no se obtuvo significancia estadística debido al limitado número de animales estudiado y a la variación dentro de los grupos. El objeto del presente estudio fue cuantificar histomorfométricamente más muestras de piel en el tórax craneal, el tórax caudal y el abdomen de cada cría procedentes del mismo estudio (es decir, 19 crías, 3 secciones por cría, para un total de 102 secciones) para explorar la biología de IL-20 y obtener resultados cuantitativos fiables. Para un análisis de imágenes efectivo, los inventores estaban seguros de que la orientación de la piel en el bloque de parafina era consistente y se midieron las muestras de piel desde las mismas localizaciones respectivas en todos los individuos y grupos de crías. Se llevaron a cabo dos tipos de medidas: (1) Se midió el engrosamiento de la epidermis 10 veces por campo microscópico de 10x en cada muestra de piel, cada una en el lado dorsal de la médula espinal, para investigar el papel de IL-20 en la mediación de la proliferación y la diferenciación de queratinocitos; (2) Se midió el engrosamiento de la capa cornificada o el estrato córneo de la misma manera para correlacionar los resultados con la apariencia de piel brillante en los IL-20 TG neonatos. [0543] El análisis histomorfométrico de imágenes del engrosamiento epidérmico desveló que los TG/-Het neonatos, que expresan el transgen k14 IL-20 m en un fondo que expresa algún IL-22RA procedente de una copia del gen IL-22RA presentaron una epidermis engrosada y los TG/-HOM neonatos, que expresan el transgen k14 IL-20m en un fondo que no expresa IL-22RA no tuvieron cambios significativos. El engrosamiento epidérmico aumentó significativamente en crías transgénicas de Il-20 que carecían de una copia del gen IL-22RA (TG/-Het) versus 6 crías transgénicas de IL-20 que carecían de ambas copias de los genes IL-22RA (TG/-HOM, P=0.001***) y versus los compañeros de camada controles (WT/HOM, P=0,001*** y WT/Het, P=0,001***). Las crías TG/-Het mostraron un aumento del engrosamiento de la epidermis no queratinizada debido principalmente a la hipertrofia de los queratinocitos en la capa espinosa. La epidermis de las crías TG/-Het aumentó aproximadamente un 25 de grosor, mientras que la epidermis de las crías TG/-HOM fue solo ligeramente más gruesa, aumento aproximadamente un 4-5 %, que la de los controles (WT/HOM y WT/Het) y la estadística no indicó diferencias significativas entre las TG/-HOM y su control WT/HOM (P>0,05). [0544] Los resultados histomorfométricos del estrato córneo mostraron que a pesar del engrosamiento epidérmico en los TG/.Het neonatos, se observo una reducción predominante de queratina o un engrosamiento de la capa cornificada en las pieles de TG/-HOM y TG/-Het en comparación con los compañeros de camada controles (WT/HOM y WT/Het) y la estadística indicó resultados extremadamente significativos entre los grupos (P<0,0001****). Las crías TG/-Het mostraron aproximadamente cantidades disminuidas en un 36 %, 50 % y 49 % de la queratina en la superficie de la epidermis versus las TG/-HOM(P<0,01**),WT/HOM(P<0,001***) y WT/Het (P<0,001***), respectivamente. Las crías TG/-HOM mostraron una reducción significativa del 22 % en el grosor del estrato córneo en comparación con su control (WT/HOM, P<0,05*) y únicamente un 17 % de reducción versus las WT/Het (P>0,05). El engrosamiento del estrato córneo en las cría control WT/HOM y WT/Het fue aproximadamente el mismo. La reducción en el engrosamiento promedio del estrato córneo en los TG/-HOM y TG/-Het neonatos pareció correlacionarse con el hallazgo ordinario en el saco, en el que a un nivel ordinario los IL-20 (TG)/>Z-22RA (Het) neonatos parecen tener una reducción de piel brillante (por ejemplo, con menos queratina), denominada brillo, mientras que los IL-20 (TG)/IL-22RA (HOM) neonatos no tienen piel brillante (por ejemplo, con más queratina). Histológicamente, la queratina en el estrato córneo en las crías TG/- pareció ser más compacta que la de la en las crías WT. En conjunto, la epidermis engrosada asociada con queratinocitos hipertróficos y la capa delgada del estrato córneo en neonatos transgénicos de IL-20 puede explicar porqué presentan el fenotipo de piel brillante. [0545] Se observaron un aumento de la hipertrofia y una perturbación en la diferenciación terminal de los queratinocitos en neonatos transgénicos de Il-20 con una inactivación dirigida de una copia del gen IL-22RA (Het). La piel presento hipertrofia en los queratinocitos pero fracasó en diferenciarse completamente, careciendo de queratina o del estrato córneo. Los neonatos transgénicos de IL-20 con una perturbación de dos copias de los genes IL-22RA (HOM) presentaron un fenotipo que se asemejaba a la piel TG/-Het pero que mostro inferior o mínimo efecto (Figura 1215). Parece que la ausencia de IL-22RA (HOM) tenía mínimo o ningún efecto sobre el fenotipo de piel brillante. En otras palabras, la señalización de IL-20, una novedosa proteína que interactúa con el receptor que señala a través tanto del receptor de IL20RA como del receptor de IL-22RA (IL-22RA) es probable que no se obstruya por la deficiente expresión de una copia del gen IL-22RA (het) pero que se obstruya parcialmente por la deficiente expresión de dos copias del gen IL-22RA (HOM). [0546] Estos resultados proporcionan evidencias de que la actividad eficazmente bloqueante de IL-22RA, por ejemplo, mediante un gen que tiene inactivado IL-22RA o

5 similarmente, mediante un anticuerpo monoclonal neutralizante de IL-22RA de la presente invención, podría similarmente reducir los efectos sobre la piel inducidos por IL-20, así como los efectos sobre la piel inducidos por IL-22, por ejemplo, en la psoriasis, IBD, colitis, u otras enfermedades inflamatorias inducidas por IL-20, y/o IL

22.

10 EJEMPLO 34 EFECTO DE IL-22 SOBRE RATONES CON GENES INACTIVADOS CON IL22RA [0547] Se trataron treinta y seis ratones incluyendo 23 KO con IL-22RA (HOM) y 13 controles (WT) tanto con IL-22 o PBS administrados subcutáneamente mediante

15 una minibomba implantada con tubo o solo una minibomba (Tabla 25)

Tabla 25

HOM/PBS

HOM/IL-22 WT/PBS WT/IL-22

(Grupo 1)

(Grupo 2) (Grupo 3) (Grupo 4)

Macho

n=3 n=10 n=3 n=8

Hembra

n=0 n=10 n=0 n=2

Total

n=3 n=20 n=3 n=10

[0548] Se obtuvo una muestra de piel, de 1,5-2,5 cm de longitud y 4,0-5,0 mm de grosor, de la zona de bombeo de cada animal para examen histológico rutinario y análisis histomorfométrico mediante diagnóstico de imágenes. Todos los especímenes 5 de tejido se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 % y se procesaron en bloques de parafina. Se tiñeron seis secciones segmentales, de 5 µm de grosor y un intervalo de 10 µm entre las secciones adyacentes con el epitelio cubriendo la superficie completa, de cada muestra de piel por animal, con hematoxilina y eosina (H&E). Se llevó a cabo el análisis histomorfométrico mediante diagnóstico por imágenes usando un 10 microscopio Olympus BH-2, una videocámara (Dage-MTI, Michigan City, IN) y el software BioQuant True Color para Windows 98 (R&M Biometrics, Inc. Nashville, TN 37209) que se configuró de la siguiente manera: Parámetro: mag. 10X, desplazamiento Z 0: Matriz: longitud (µm); Medida: modo manual y aditivo. Se midió el grosor de la epidermis (µm) 5 veces en cada campo microscópico de 10X de un total 15 de 4 campos capturados a partir de 0,4 cm del centro de cada sección de piel (por ejemplo, un campo microscópico de 10x y cuatro campos microscópicos de 10x = 0,4 cm). Se midieron un total de 6 secciones de cada animal y se obtuvieron el valor promedio, la SD y SEM mediante cálculo con Excel. Se aleatorizaron y midieron todas las secciones de una manera ciega. Tras la medida, se desvelaron las secciones, y se 20 emparejaron los resultados con los grupos de tratamiento. Los resultados finales por grupo de tratamiento se clasificaron como sigue: 1. Engrosamientos epidérmicos de ratones machos y hembras HOM y WT. 2. Engrosamientos epidérmicos de ratones machos HOM y WT. Se analizaron los datos resultantes usando el software GraphPad InStat (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA 92121). Se aplicó el análisis de

25 varianza de una vía (ANOVA) para examinar la significancia estadística de las diferencia en los valores promedio entre el grupo 1 y el grupo 4 Se aplicaron el Test de Múltiples Comparaciones de Tukey-Kramer y el Test de la T No Emparejada para analizar la significancia en los valores promedio entre dos grupos. Se consideraron significativas las observaciones de P<0,05.

30 III. RESULTADOS HISTOMORFOMÉTRICOS 1) ENGROSAMIENTO

EPIDÉRMICO (µm) DE RATONES MACHOS Y HEMBRAS HOM Y WT [0549] El engrosamiento epidérmico aumentó significativamente en las pieles de ratones WT tratados con IL-22 (WT/IL-22) frente a los WT/PBS controles (P=0,0001). La piel de los ratones KO con IL-22RAm tratados con IL-22 (HOM/IL-22) mostró un

5 aumento en el valor promedio de engrosamiento epidérmico con respecto a los HOM/PBS controles, sin embargo, la estadística no indicó diferencias significativas entre los dos grupos (P>0,05) se observó una reducción predominante del engrosamiento epidérmico en los ratones KO con IL-22RA en comparación con las ratones WT (por ejemplo, HOM/IL-22 vs. WT/IL-22: P<0,001) (Tabla 26).

10 Tabla 26

HOM/PBS HOM/IL-22 WT/PBS WT/IL-22

(N = 3) (N = 19) (N = 3) (N = 10)

Promedio 14,15 ± 0,19 19,01 ± 1,03 23,34 ± 5,49 43,08 ± 1,85

Los resultados representan valores medios ± SEM. N = número de animales

(2) ENGROSAMIENTO EPIDÉRMICO (µm) DE RATONES MACHOS HOM Y WT [0550] El engrosamiento epidérmico aumentó aproximadamente 2 veces en las pieles de ratones machos WT tratados con IL-22 (WT/IL-22) cuando se compararon

15 con machos WT/PBS controles (P=0,0001), sin embargo, la epidermis de ratones machos KO con IL-22RAm tratados con IL-22 (HOM/IL-22) mostró solo un ligero aumento en comparación con los machos HOM/PBS controles (P>0,05). Significativamente, los ratones KO con IL-22RAm presentaron una marcada reducción del grosor epidérmico cuando se compararon con su control, los ratones macho WT

20 (por ejemplo, HOM/PBS VS WT/PBS: P<0,05; HOM/IL-22 VS WT/IL-22: P<0,001) (Tabla 27). Tabla 27

HOM/PBS HOM/IL-22 WT/PBS WT/IL-22 (N = 3) (N = 9) (N = 3) (N = 8) Promedio

14,15 ± 0,19 15,86 ± 0,75 23,3465,49 41,41 ± 1,71 Los resultados representan valores medios ± SEM. N = número de animales

(3) ENGROSAMIENTO EPIDÉRMICO (µm) DE RATONES HOM Y WT, MACHOS VS HEMBRAS

25 [0551] Se encontró más gruesa la epidermis de ratones hembras que la de ratones machos (por ejemplo, HOM/IL-22/macho VS HOM/IL-22/hembra: P<0,01; WT/IL

22/macho VS WT/IL-22/hembra: P<0,05) (Tabla 28). Tabla 28

HOM/PBS HOM/IL-22 WT/PBS WT/IL-22

(Machos, N = 9) (Hembras N = 10) (Machos, N = 8) (Hembras N = 2)

Promedio 15,86 ± 0,75 21,85 ± 1,3 41,41 ± 1,71 49,75 ± 4,82

Los resultados representan valores medios ± SEM. N = número de animales

(4) ENGROSAMIENTO EPIDÉRMICO (µm) DE RATONES HOM, BOMBA DE IL-22 VS BOMBA DE IL-22 CON TUBO

5 [0552] Las epidermis de ratones KO con IL-22RAm (HOM) con bomba de IL-22 y tubo se encontraron significativamente más gruesas que las de los ratones KO con IL-22RAm (HOM) solo con bomba (P<0,0001, mediante el test de la T no emparejada) (Tabla 29)

Tabla 29

HOM w/IL-22 bomba

HOM w/IL-22 bomba con tubo

(M=8 & F=2, N=10)

(M=2 & F=8, N=10)

Promedio

15,85 + 0,65 23,30 + 1,36

Los resultados representan valores medios ± SEM. M: machos; F: hembras; N = número de animales

10 IV: DISCUSIÓN: [0553] Tomado en su conjunto, el objeto de este estudio es caracterizar los efectos epidérmicos en las pieles tratadas con IL-22 de los ratones KO con IL-22RAm y WT y se refieren estos hallazgos a las indicaciones clínicas. Se llevó a cabo un análisis cuantitativo de imágenes para determinar el grosor de la epidermis de las secciones de

15 piel teñidas con H&E. Se midieron histomorfométricamente las muestras de piel de cada animal 120 veces (es decir, 20 veces cada sección X 6 secciones segmentales de cada ratón = 120 medidas) y se obtuvo el promedio del grosor epidérmico mediante cálculo con Excel. El estudio histomorfométrico demostró que IL-22 dio como resultado un significativo aumento en el grosor epidérmico, especialmente en los

20 ratones WT con presencia del receptor de IL-22RA (P<0,0001 mediante ANOVA, considerado extremadamente significativo) y mostró menos o mínimos efectos en los ratones KO con IL-22RAm (HOM) con ausencia del receptor de IL-22RA (P>0,05): El grosor epidérmico en los ratones WT tratados con IL-22 aumentó aproximadamente un 43 % con respecto al de los tratados con PBS (por ejemplo, WT/PBS, P<0,001), mientras que los ratones KO con IL-22RAm (HOM) tratados con IL-22 solo mostró un aumento del 26 % en el grosor epidérmico en comparación con el control (HOM/PBS, P>0,05). Los ratones KO con IL-22RAm presentaron una epidermis más delgada cuando se los comparó con la de los ratones WT (P>0,001). Globalmente, los efectos biológicos de Il-22 sobre piel de ratón sugieren que este factor puede estar implicado en la regulación del crecimiento y la proliferación epidérmica.

EJEMPLO 35 FARMACOCINÉTICA DE UN ANTICUERPO MONOCLONAL DIRIGIDO CONTRA IL-20 HUMANO (CLON Nº 262.7.1.3.2.4) [0554] Se proporcionó el anticuerpo monoclonal de ensayo, mAb dirigido contra IL-20 humano, (clon nº 262.7.1.3.3.4) en alícuotas de 2 x 3 ml a una concentración de 1,08 mg/ml (determinada mediante Absorbancia UV a 280 nM) y se almacenó a -80º C hasta el uso. El vehículo fue 1XPBS (NaPO4 50 mM, NaCl 109mM). Se descongeló el mAb a temperatura ambiente antes del uso y se usaron las alícuotas 1 y 2 según se proporcionó para los grupos de dosificación de 100 µg IV y SC, respectivamente. Se diluyó la mitad de la alícuota 3 1:2 en 1XPBS para el grupo de dosis de 50 µg SC y se diluyó la segunda mitad de la alícuota 3 1:10 en 1XPBS para el grupo de dosis de 10 µg SC. Se recibieron ratones SCID hembras (n=96) de los Charles River Labs. Se comprobó la salud de los animales a la llegada y se alojaron en grupo (3 animales por jaula). Los ratones tenían 12 semanas de edad con un peso promedio corporal de 22 g al comienzo del estudio.

A. PROTOCOLO DE DOSIFICACIÓN [0555] Se colocaron aleatoriamente ratones SCID hembras (n=24/grupo de dosis) en cuatro grupos de dosificación (véase la Tabla 30), Se administró al Grupo 1 el mAb dirigido contra huIl-20 mediante inyección de aproximadamente 93 µl en una vena de la cola y se administraron a los Grupos 2, 3, y 4 le mAb mediante inyección SC de aproximadamente 93 µl en el cogote.

B. RECOGIDA DE MUESTRAS [0556] Antes de la recogida de sangre, los ratones se anestesiaron completamente con halotano o isofluorano. Se recogieron muestras de sangre mediante inyección directa en el corazón para todos los puntos temporales excepto para el punto temporal de las 168 horas (recogida mediante sangrado del ojo y los mismos animales se sangraron de nuevo en el punto temporal de las 504 horas mediante inyección directa en el corazón). Se recogió la sangre en tubos separadores de suero y se dejó coagular durante 15 minutos. Se centrifugaron posteriormente las muestras durante 3 minutos a 14.000 rpm. Tras la centrifugación, se dispensaron alícuotas de 125-150 µl en tubos eppendorf marcados y se almacenaron inmediatamente a -80º C hasta el análisis (Tabla 30).

Tabla 30

Nº de grupo

Dosis (ROA) Animales Puntos temporales PK

1

100 �g(IV) 3 ratones/punto temporal * 0.25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 y 504 h

2

100 �g(IV) 3 ratones/punto temporal * 0.25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 y 504 h

3

100 �g(IV) 3 ratones/punto temporal * 0.25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 y 504 h

4

100 ��(IV) 3 ratones/punto temporal * 0.25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 y 504 h

* Se usaron los mismos animales en los puntos temporales 168 y 504 h

5 C. CUANTIFICACIÓN DE LAS CONCENTRACIONES EN SUERO DE mAb DIRIGIDO CONTRA huIL-20 MEDIANTE ELISA [0557] Se desarrolló un Ensayo Inmunosorbente Unido a Enzima (ELISA) y se cualificó para analizar muestras de suero de ratón de animales dosificados con mAb

267.7.1.3.2.4 dirigido contra IL-20 durante los estudios farmacocinéticos. Se diseño

10 este ensayo para aprovechar las ventajas de un anticuerpo secundario comercialmente disponible y la detección colorimétrica usando TMB. Las diluciones usadas para la curva estándar se modificaron para mejorar la definición de la porción lineal de la curva estándar. Una curva estándar en el intervalo de 100 ng/ml a 0,231 ng/ml con diluciones 2 veces permitió la cuantificación de las muestras de suero de ratón. Se

15 diluyeron las muestras QC a 1:100, 1:1000 y 1:10000 en suero de ratones SCID al 10 %y se volvieron a calcular a partir de la curva estándar.

D. ANÁLISIS FARMACOCINÉTICO [0558] Se descargaron los datos de concentración en suero frente a tiempo en el software WinNonlin Professional 4.0 (Pharsight, Inc.; Cary, NC) para el análisis

20 farmacocinético. Se usó el análisis no compartimental para determinar los parámetros farmacocinéticos basados en los datos promedio en cada punto temporal.

E. RESULTADOS [0559] En la Tabla 31 se muestran las concentraciones promedio de mAb dirigido contra IL-20 humano en suero tras la administración de 100 µg IV y 100, 50, y 10 µg

25 SC:

Tabla 31

Tiempo (h)

100 �g IV Con. (mg/ml) 10 �g IV Con. (mg/ml) 50 �g SC Con. (mg/ml) 100 �g SC Con. (mg/ml)

0,25

196 (12) LTR 0,101 (0,065) 0,481 (0,485)

1

154 (18) 0,356 (0,146) 1,61 (0,52) 3,48 (1,72)

4

118 (20) 2,42 (0,53) 10,4 (3,4) 19,7 (4,7)

8

112 (20) 3,41 (0,30) 18,9 (3,6) 40,2 (6,4)

24

103 (13) 4,95 (0,05) 26,3 (0,7) 50,1 (6,2)

72

101 (16) 4,27 (0,79) 21,0 (3,4) 43,4 (2,7)

168

45,6 (15,4) 2,92 (0,53) 19,6 (2,7) 37,6 (3,4)

336

36,4 (16,6) 3,60 (0,31) 23,5 (3,5) 34,4 (5,8)

504

28,8 (3,8) 2,74 (0,39) 20,5 (3,6) 25,7 (2,1)

LTR: inferior a lo que se puede detectar

[0560] Tras la administración IV, la concentración de mAb frente al perfil del tiempo demostró un declive biexponencial. Tras la administración SC, el mAb pareció tener una lenta fase de absorción con eliminación limitada de la velocidad de

5 absorción. En la Tabla 32 se muestran loa parámetros farmacocinéticos del suero basados en los datos promedio en cada punto temporal: Tabla 32

Parámetro

Unidades 100 �g IV 10 �g SC 50 �g SC 100 �.g SC

C0(IV); Cmax (SC)

mg/ml 212 4,95 26,3 50,1

Tmax

h N/A 24 24 24

t1/2, λz

H 509 ND ND 612

AUC(0-t)

h•mg/ml 27059 1730 10845 18110

AUC(0-inf)

h•mg/ml 48269 ND ND 41561

AUC (% extrapolado)

% 43,9 ND ND 56,4

Vss(IV); Vz/F (SC)

ml 1,34 ND ND 2,12

Cl(IV); Cl/F (SC)

ml/h 0,002 ND ND 0,002

F (biodisponibilidad)

% N/A ND ND 86,1

ND: no determinable por falta de datos en la fase de eliminación terminal en el perfil de concentración frente al tiempo

[0561] Tras la administración IV, el mAb demostró un aclaramiento muy bajo (CI = 0,002 ml/h) y una larga semivida de eliminación (t1/2, λz = 21 días). El mAb demostró

un volumen de distribución en estado estacionario (Vss = 1.3 m) que es inferior al del volumen sanguíneo en un ratón (≈ 1,7 ml), sugiriendo que el mAb no se distribuye sustancialmente fuera del compartimento vascular. La concentración máxima vuelta a calcular (C0) fue mayor que la esperada basándose en la dosis inyectada y el volumen sanguíneo en el ratón. Estos, junto con el pequeño Vss sugiere que se puede confinar el mAb, en una gran extensión, en la fracción de suero de la sangre. [0562] Tras la administración SC, los valores Cmax aumentaron linealmente con la dosis. A la dosis SC de 100 µg, el mAb tuvo una t1/2, λz de aproximadamente 25 días con aclaramiento y un volumen de distribución aparente similar al de la siguiente dosificación IV. La biodisponibilidad fue del 86 %. A las dos dosis SC inferiores, la mayor parte de los parámetros farmacocinéticos no se puede estimar debido a la carencia de una fase de eliminación terminal medible, incluso aunque se cojan las muestras a las 504 horas. La absorción del mAb tras la dosificación SC parece alcanzar un estado estacionario con eliminación a través de la duración del estudio.

EJEMPLO 36 ANTAGONISTAS DE IL-20 E IL-22 EN UN MODELO DE COLITIS Y PSORIASIS CD4+CD45RBhi (CD25-)

A. RESUMEN [0563] La transferencia de células T CD4+ CD45RBhi o CD4+CD25- en ratones SCID singénicos dio como resultado colitis en los ratones. La transferencia simultánea de células T reguladoras (CD4+CD25+ o CD4+CD45RBlo) inhibe esta colitis. Tras la transferencia de células T CD4+CD25- en ratones, si los ratones se inyectan adicionalmente con enterotoxina B estafilocócica (SEB), los ratones no solo desarrollan colitis, sino también psoriasis. Se administraron anticuerpos contra IL22RA, IL-20, IL-22, IL20R y/o IL-22R, o receptores solubles de IL-22RA en los días 0-21 después de la transferencia celular y se vigilaron los síntomas de la colitis y la psoriasis. La inhibición de la puntuación psoriática o de la colitis (histología) indica que IL-21 puede inhibir estas enfermedades autoinmunes.

B. DISEÑO DEL ESTUDIO [0564] Se aislaron bazos y nódulos linfoides inguinales de ratones B10.D2. Se formaron suspensiones de células únicas y se contaron. Usando el sistema Miltenyi Bead, se clasificaron las células CD25+ mediante selección positiva. Se tiñeron las células con CD25-PE (BD Pharmingen) a una dilución 1:100 y se incubaron durante 15 minutos. Se lavó el anticuerpo en exceso y se incubaron las células con 10 µl de perlas dirigidas contra PE/106 células durante 20 minutos. Se lavaron las células con PBS y se pasaron sobre una columna LS (Miltenyi Biotech). Se retuvieron las células que pasaban a través de la columna (CD25-) para análisis adicional. Se añadió (1:100) una combinación de enriquecimiento de CD4 (Stem Cell Technologies) a estas células CD25- y se incubaron durante 15 minutos. Se lavaron las células con PBS. Se añadió una dilución 1:10 de tetrámero dirigido contra biotina a las células durante 15 minutos seguido por un coloide magnético (60 µl/106 células) durante 15 minutos (todo de Stem Cell Technologies). Se pasaron las células a través de una columna de selección negativa (0,5" (1,27 cm), Stem Cell Technologies). Las células que pasan a través son células CD4+CD25-. Se analizó la pureza usando citometría de flujo. Se inyectaron 0,4 x 106 células i.v. en ratones SCID CB-17 sin tratamiento previo en un volumen total de 200 µl. se inyectaron los ratones i.p. con 10 µg de SEB el siguiente día (dl), Se siguieron los síntomas de la psoriasis y la colitis durante 2-5 semanas. Se puntuaron los ratones para la enfermedad de la psoriasis con los siguientes criterios. 0-sin lesiones, 1-ligeras lesiones en el cuello, 2-graves lesiones en el cuello y el lomo (tronco) 3-lesiones muy graves en el cuello, lomo y vientre de los ratones. Se midió también el engrosamiento de la oreja como una medida de la gravedad de la enfermedad. Se inyectaron los grupos de ratones i.p. con PBS, 100 µg de anticuerpo control o 10-100 µg de anticuerpos contra IL-22RA, IL-20, IL-22, IL-20R o IL-22R, o IL-22RA soluble en los días 1-30 con diferente régimen de dosificación (3X/semana o 2X/semana)

C. RESULTADOS Y CONCLUSIÓN [0565] La inhibición de los síntomas psoriáticos y de la colitis en los ratones tratados con anticuerpo indica que la inhibición de la función de IL-20 y/o IL-22 puede inhibir los síntomas autoinmunes en este modelo de psoriasis y colitis.

EJEMPLO 37 ANTAGONISTAS DE IL-20, E IL-22 EN EL MODELO SCID-hu DE PSORIASIS POR TRASPLANTE. [0566] La piel injertada con psoriasis humana en ratones SCID puede mantener sus características psoriáticas clínicas, al microscopio óptico, e inmunohistoquímicas durante algunas semanas. Este modelo proporciona un sistema para evaluar terapias que se pretende que restauren el tejido lesionado a un fenotipo normal. Una vez la piel humana se injerta satisfactoriamente, se pueden administrar anticuerpos contra IL22RA, IL-20, IL-22, IL-20R y/o IL-22R, o los receptores solubles de Il-20 o IL-22 durante algunas semanas, y se puede analizar el engrosamiento epidérmico para evaluar el efecto de estos antagonistas sobre la psoriasis.

B. DISEÑO DEL ESTUDIO [0567] Se obtuvieron biopsias con un punzón de 6 mm del engrosamiento completo constituidas por la epidermis completa y algunos mm de dermis de adultos voluntarios sanos y de pieles con lesiones psoriática. Se obtuvieron de cuatro a seis biopsias de cada donante. Se trasplantó una biopsia con punzón de cada donante sobre la superficie dorsal de un ratón SCID receptor (CB-17, Taconic). Se mantuvo a los animales en un entorno libre de patógenos. Se inició el tratamiento tras un injerto satisfactorio (2-3 semanas después del trasplante) como sigue; una biopsia para el control negativo (PBS o isotipo mAb), una biopsia para el control positivo (Ciclosporina A), y 2-3 biopsias para el tratamiento con IL-22RA dirigido contra humano, IL-20 dirigido contra humano, mAb dirigido contra IL-22 humano o los receptores solubles de IL-20 o IL-22 (inyección intraperitoneal, tres veces a la semana durante 2-4 semanas en un calendario L-M-V).

C. ANÁLISIS CUANTITATIVO: [0568] Se realizarán regularmente observaciones y evaluaciones clínicas a través de los experimentos, y se registrarán. Se evaluó la gravedad de las lesiones psoriáticas para el grados de escamación, endurecimiento, y eritema de una manera ciega. Se pueden puntuar los parámetros usando la escala de tres puntos: 0 = carencia completa de implicación cutánea; 1 = ligera implicación; 2 = implicación moderada; 3 = implicación grave. Al término del periodo de dosificación, se sometió a eutanasia cada animal y se recogieron los tejidos para la histología y el IHC. (1) Se fijo parte del tejido en formalina al 10 % y se tiñó con hematoxilina y eosina. Se midió el área epidérmica como función de los cambios en el engrosamiento epidérmico por unidad de longitud usando el software de diagnóstico por imágenes NIH. Se cuantificaron múltiples áreas de cada trasplante para proporcionar un valor n elevado y un área epidérmica promedio. (2) el número de células mononucleares inflamatorias por campo de alta energía (0,103 x 0,135) en la dermis superior; (3) se puntuó el grado de paraqueratosis en una escala arbitraria de 0 a 3, en la que 0 es sin paraqueratosis, 1 es la paraqueratosis es menor que un tercio de la sección, 2 hubo paraqueratosis en más de un tercio pero menos de dos tercios de la sección, y de 3 es paraqueratosis en más de dos tercios de la sección. (4) Se teñirá el resto del tejido para Ki67 (marcador de queratinocitos proliferativos), para evaluar el número de queratinocitos por milímetro por longitud de sección que ciclan Ki67. La reducida gravedad de la psoriasis según se midió por el engrosamiento epidérmico, indica que la neutralización de la función de IL-20 e IL-22 puede ser efectiva en este modelo de psoriasis, Para cuantificar la reducida gravedad de la psoriasis, los inventores han medido el engrosamiento epidérmico, el número de células inflamatorias en la dermis superior, el número de queratinocitos que ciclan Ki67, y el grado de paraqueratosis. Los cuatro parámetros significativamente reducidos para los grupos tratados en comparación con los ratones control, indican el potencial uso terapéutico de los antagonistas de IL-20, IL-22. EJEMPLO 38

CRIBADO DE LA ACTIVIDAD DE IL-20 USANDO CÉLULAS BaF3/IL22RA/IL-20RB USANDO UN ENSAYO DE PROLIFERACIÓN ALAMAR BLUE [0569] La línea de células BaF3 dependiente del factor pre-B se transfectó simultáneamente con IL-22RA e IL-20RB (véase, el procedimiento en el Ejemplo 3) y se trató con IL-20 a diversas concentraciones Se evaluó la proliferación usando un ensayo alamar blue según se ha descrito en el Ejemplo 3. IL-20 estimuló la proliferación en una manera dependiente de la dosis a las concentraciones esperadas para una citocina, demostrando que IL-20 se une y activa el receptor heterodimérico de IL-22RA/IL-20RB a las concentraciones esperadas para una citocina. Los controles negativos que contienen BaF3 no transfectadas no proliferan. [0570] Con el fin de determinar si los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA son capaces de antagonizar la actividad de IL-20, se llevó a cabo el ensayo descrito anteriormente usando anticuerpos dirigidos contra IL-22RA como un antagonista de IL-20. Cuando se combinó IL-20 con dicho antagonista. La respuesta a IL20 es de “niveles inferiores al fondo”. Esta presencia de un antagonista que suprime o reduce los efectos proliferativos de IL-20 demuestra que es un antagonista del ligando de IL

20. Se puede usar este ensayo para ensayar otros antagonistas de la actividad de IL-20 descritos en el presente documento, tales como los polipéptidos antagonistas que comprenden un receptor soluble de IL-22RA.

EJEMPLO 39 NEUTRALIZACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE IL-20 E IL-22 POR EL ANTICUERPO MONOCLONAL DIRIGIDO CONTRA huIL22RA [0571] Usando el ensayo de neutralización basado en células descrito en el Ejemplo 28, se añadió un anticuerpo monoclonal purificado de ratón dirigido contra huIL-22RA (Ejemplo 30(D)) como una dilución en serie, por ejemplo, a 10 µg/ml, 5 µg/ml, 2,5 µg/ml, 1,25 µg/ml, 625 ng/ml, 313 ng/ml, 156 ng/ml y 78 ng/ml. Se incubaron las placas de ensayo a 37º C, CO2 al 5 %, durante 4 días, en cuyo momento, se añadió Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) a 20 µl/pocillo. Se incubaron las placas de nuevo a 37º C, CO2 al 5 % durante 16 horas. Los resultados mostraron que el anticuerpo monoclonal purificado dirigido contra huIL-22RA podría neutralizar la señalización de huIL-22 y huIL-20 a través de huIL-22RA, disminuyendo la inhibición de la proliferación en una manera dependiente de la dosis a concentraciones inferiores. Cualquier control negativo emparejado con isótopo de mAb de ratón, ensayado a las concentraciones descritas anteriormente, no proporcionó la inhibición de la proliferación de cualquier citocina. Estos resultados demuestran además que los anticuerpos monoclonales de IL-22RA podrían de hecho antagonizar la actividad de los ligandos proinflamatorios, IL-20 e IL-22 a bajas concentraciones. [0572] Estos resultados proporcionan evidencias adicionales de que la actividad eficazmente bloqueante de IL-22RA, por ejemplo, mediante un anticuerpo monoclonal neutralizante de IL-22RA de la presente invención, podrí ser ventajosa para bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar los efectos de IL-20 e IL-22 (solos o en conjunto) in vivo y que se puede reducir la inflamación inducida por IL-20 y/o IL-22, tal como la que se observa en los efectos sobre la piel inducidos por IL-20, así como en los efectos sobre la piel inducidos por IL-22, por ejemplo, en la psoriasis, IBD, colitis, u otras enfermedades inflamatorias inducidas por IL-20, y/o IL-22 , que incluyen la IBD, artritis, asma, artritis psoriática, colitis, dolencias inflamatorias de la piel, y dermatitis atópica.

EJEMPLO 40 TRATAMIENTO DE RATONES TRANSGÉNICAS IL-20 E IL-22

EMBARAZADAS CON ANTICUERPO MONOCLONAL NEUTRALIZANTE DIRIGIDO CONTRA IL-22RA [0573] Para ensayar el anticuerpo monoclonal de rata dirigido contra IL-22RA de ratón (mAb) para neutralizar la actividad in vivo, las ratones transgénicas (Tg) IL-20 e IL-22 Tg embarazadas se inyectaron intraperitonealmente con un mAb dirigido contra IL-22RA de ratón. A continuación se evaluaron las crías recién nacidas para la presencia o ausencia del fenotipo de piel “brillante” que caracteriza normalmente estas estirpes de ratones. [0574] Se engendraron, específicamente, ratones machos IL-20 Tg (que se generaron usando la queratina-14) o IL-22 TG (usando el promotor de la insulina) por hembras C57BL/6N en celo y se identificaron las hembras embarazadas por la presencia de un tapón vaginal el siguiente día. Cada hembra embarazada se coloca aparte en una jaula separada y se vigila diariamente. Los grupos de tratamiento incluyen al menos 4 hembras embarazadas cada uno, para permitir un análisis estadísticamente significativo de las crías Tg y no Tg. Basándose en la experiencia anterior con estos ratones Tg, una camada oscila normalmente entre aproximadamente 6 a 8 crías por camada, de las cuales, entre 2 y 3 son Tg+. [0575] Siete a nueve días después de que se produjera el embarazo de los ratones (edad embriónica 7-9; e7-9), se inyectaron las hembras intraperitonealmente con 250500 µg de mAb de rata dirigido contra IL-22RA de ratón (isotipo IgG2a de rata) en un volumen de 200-250 µl de PBS. Se usaron agujas cortas en un ángulo de inyección poco profundo para evitar inyectar directamente el útero. Se inyectaron las hembras embarazadas de esta manera 3 días a la semana (lunes, miércoles, y viernes) durante 2 semanas (hasta el alumbramiento) con el fin de acceder satisfactoriamente a los embriones desarrollados. Los grupos control (de no menos de 4 ratones hembras embarazadas cada uno) incluyen los siguientes: Isotipo de mAb control de IgG2a de rata, mAb dirigido contra IL-22 humano/ratón (isotipo IgG1 de rata), y un isotipo de mAb control de IgG1 de rata. Como control para la neutralización de IL-20 de murino, se inyectaron las hembras embarazadas tanto con una proteína de condensación soluble IL20R-Fc4 que se puede unir y neutralizar IL-20 humano y de murino, como con una proteína Fc4 control. [0576] A partir de los días 1 y 2 tras el alumbramiento, se vigilaron las crías estrechamente para la aparición del fenotipo de piel brillante. En el día 2, se sometieron a eutanasia las crías y se recogió una porción de la cola para el aislamiento del ADN para determinar el genotipo (Tg o no Tg) de cada cría. Se recogieron muestras de piel para el análisis histológico con el fin de evaluar si las crías presentaron capas de células epidérmicas engrosadas que caracterizan normalmente a estos ratones Tg. Se recogió también sangre del tronco de las crías (y se llevó a cabo un sangrado ocular de las madres un día después del alumbramiento) para cuantificar, mediante ELISA, los niveles de mAb dirigido contra IL-22RA en el suero de cada ratón. Debido a que estos mAb son potentes inhibidores de IL-20 y/o IL-22 in vivo, las crías Tg tienen fenotipo normal. (es decir, sin engrosamiento epidérmico o apariencia “brillante”).

EJEMPLO 41 ANTAGONISTAS DE IL-20 E IL-22 en el modelo de psoriasis de cultivo de órganos [0577] Se puede mantener la placa psoriática de la piel humana en un cultivo de órganos, y los rasgos histológicos anormales de la piel lesionada se mantienen en ausencia de factores de crecimiento exógenos. Se pueden administrar anticuerpos contra IL-22RA, IL-20, IL-22, IL20R y/o IL-22R, o los receptores solubles de IL-20 o IL-22, y se pueden mejorar los rasgos histológicos de la piel psoriática lesionada.

B. DISEÑO DEL ESTUDIO [0578] Se obtuvieron biopsias de engrosamiento completo con un punzón de 2 mm constituidas por la epidermis completa y algunos mm de dermis tanto de adultos voluntarios sanos como de piel psoriática lesionada. Inmediatamente después de la biopsia se sumergió el tejido en medio de cultivo constituido por Medio Basal de Queratinocitos (KBM) (Clonetics Inc, Walkersville, MD). Se suplementó el medio de cultivo con CaCl2 para llevarlo hasta una concentración final de Ca2+ de 1,4 mM (Varani y col, 1993, 1994). A continuación se incubaron las biopsias en pocillos de una placa de 96 pocillos que contenía 200 µl de KBM suplementado con Ca2+ con o sin tratamientos adicionales de anticuerpos dirigidos contra IL-20, IL-22, IL-22RA, o los receptores solubles de IL-20 o IL-22. Se incubaron los cultivos a 37º C en una atmósfera de aire al 95 %, y CO2 al 5 % durante 8 días.

C. ANÁLISIS CUANTITATIVO: [0579] Al término del periodo de incubación, se fijó el tejido con formalina tamponada al 10 % y se examinó histológicamente tras la tinción con hematoxilina y eosina. La apariencia del tejido psoriático expuesto a los anticuerpos o a los receptores solubles podría asemejarse más estrechamente al de los tejidos normales, incluyendo la siguiente observación: las células epiteliales basales con forma irregular, inicialmente desorganizada desarrollaron una apariencia más columnar con polaridad restaurada; regresión de los bordes de la rete epidérmica, con unas pocas áreas de expansión celular epitelial en el espacio dérmico; y existió menos degeneración global de las capas epidérmicas superiores. El modelo de cultivo de órganos proporciona un medio rápido y sensible para determinar si un compuesto particular tiene potencial como agente antihiperproliferativo. Se puede mejorar el rasgo histológico anormal en presencia de un antagonista de IL-20 e IL22, sugiriendo la efectividad de dicho agente en el tratamiento de la psoriasis.

EJEMPLO 42 MAPEADO DE LAS REGIONES DE UNIÓN DE mIL22RA (zCytoR11m) CON LOS mAb NEUTRALIZANTES DE R2.1.5F4.1 y DE R2.1.15E2.1

A. EPÍTOPOS EN IL-22RA DE MURINO A LOS QUE SE UNEN ANTICUERPOS MONOCLONALES NEUTRALIZANTES [0580] Los experimentos descritos a continuación tenían por objeto identificar una región o regiones en la secuencia de aminoácidos de la proteína del receptor soluble de IL-22RA de murino (SEC DE ID Nº: 62) que eran importantes para la actividad del receptor, o para el antagonista o la unión del anticuerpo neutralizante. La proteína IL-22RA-Fc de murino, que se escindió previamente con trombina para eliminar Fc, se escindió a continuación C terminalmente con los restos de metionina en la secuencia

5 mediante incubación con bromuro de cianógeno (CNBr): Se fraccionaron los péptidos generados por CNBr, y se ensayaron las fracciones para la actividad de unión según se detectó mediante ELISA y la reactividad mediante el análisis Western usando anticuerpos monoclonales con propiedades neutralizantes, los clones R2.1.5F4.1 y R2.1.15E2.1.

10 [0581] Tras la escisión con CNBr, se generaron potencialmente los siguientes péptidos a mártir de mIL.22RA de longitud completa no reducido (Tabla 33) . En condiciones no reductoras, las cisteínas se unen mediante enlaces disulfuro, lo que puede dar como resultado un enlace interno en el péptido 1 y un enlace entre los péptidos 3 y 5. Los residuos en negrita están implicados en la unión del ligando que

15 corresponde con los restos de IL-22RA humano implicados en la unión del ligando en la SEC DE ID Nº: 2 o la SEC DE ID Nº: 3 según se describe en el Ejemplo 42B. Específicamente, la SEC DE ID Nº: 48 corresponde a los restos de aminoácidos 1 (His) a 83 (Met) de la SEC DE ID Nº: 42; la SEC de ID Nº: 49 corresponde a los restos de aminoácidos 84 (Glu) a 109 (Met) de la SEC DE ID Nº: 42, la SEC DE ID Nº: 50

20 corresponde a los restos de aminoácidos 110 (Thr) a 137 (Met) de la SEC DE ID Nº: 42, la SEC DE ID Nº: 51 corresponde a los restos de aminoácidos 138 (Leu) a 177 (Met) de la SEC DE ID Nº: 42, y la SEC DE ID Nº: 52 que corresponde a los restos de aminoácidos 163 (His) a 208 (Pro) de la SEC DE ID Nº: 42 o 163 (His) a 212 (Arg) de la SEC DE ID Nº: 62.

25 Tabla 33 1. ESCISIÓN CON CNBr Y AISLAMIENTO DE LAS FRACCIONES DE PÉPTIDOS [0582] Se liofilizaron 50 µg de mIL22RA y se reconstituyeron en 180 µl de ácido fórmico (70 %). Se añadió 1 µl de CNBr 5 M disuelto en acetonitrilo. Se mezcló la

Numero de péptido

De A Secuencia

CNBr Péptido 1

1 68

No reducido: las cisteínas del péptido 1 se han unido

CNBr Péptido 2

69 94

CNBr Péptido 3

95 122 imagen2

No reducido: los péptidos 3-5 se han unido

CNBr Péptido 4

123 162

CNBr Péptido 5

163 212

5 muestra y se dejó reaccionar durante 18 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Se fraccionaron 150 µl de la mezcla de reacción mediante HPLC en fase inversa equipada con una columna analítica Zorbax SB300-C8. Se separaron los picos usando un gradiente de partida de acetonitrilo al 25 % (TFA al 0,085 %) y agua al 75 % (TFA al 0,1 %) y acabando con acetonitrilo al 95 % (TFA al 0,085 %) y agua al 5 % (TFA al

10 0,1 %). El análisis UV mostró tres picos principales y dos menores, que se recogieron, Se dividió cada fracción en dos; una porción se sometió a ELISA, la otra porción se liofilizó y se reconstituyó en 150 µl de disolución salina tamponada con fosfato (PBS). El análisis UV de las fracciones de PBS confirmó la recuperación de todos los picos recogidos a partir de la columna analítica. Las fracciones de PBS se enviaron para el

15 análisis Western.

2. ELISA [0583] Se diluyeron las fracciones de HPLC que contenían las secuencias de péptidos del IL-22RA escindido con CNBr hasta una concentración igual estimada usando tampón de HPLC (90 % de acetonitrilo, 10 % de agua, 0,09 de ácido

20 trifluoroacético). Se introdujeron las muestras en placas de microvaloración de noventa y seis pocillos en cuatro pocillos cada uno a 100 µl/pocillo y se dejaron secar durante la noche a temperatura ambiente en una campana extractora. Se lavaron las placas con tampón ELISA C (PBS, Tween-20 al 0,05 %), y a continuación se bloquearon con tampón ELISA B (PBS, BSA al 0,1 %, Tween-20 al 0,05 %) durante 2 horas a 37º C.

25 Se diluyeron dos anticuerpos monoclonales (mAb) de IL22RA (Clon R2.1.5F4.1, y Clon R2.1.15E2.1) a 2 µg/ml en ELISA B. Se añadió cada mAb a cada muestra de secuencia de péptidos a 100 µl/pocillo y se incubaron las placas durante 60 minutos a 37º C. Se lavaron las placas para eliminar el anticuerpo no unido, y se diluyó un anticuerpo secundario (se diluyó IgG de cabra dirigido contra rata en peroxidasa de rábano picante (Jackson)) a 1 µg/ml en tampón ELISA B y se añadió a todos los pocillos a 100 µl/pocillo. Se incubaron las placas durante 1 hora a 37º C. Se lavaron los pocillos con tampón ELISA C, y a continuación se incubaron con el componente TMB1 del Sustrato HRP Microwell (BioFx) durante 5 minutos. Se detuvo la reacción mediante la adición de 450 nm de Reactivo de Detención de TMB Microwell (BioFx) y se leyeron las placas a una absorbancia de 450 nm en un lector de placas ELISA Dynatech (Molecular Devices). [0584] Los resultados indican que el mAb de R2.1.5F4.1 reaccionó con la fracción nº 4 de la HPLC de la reacción de mIL22RA con CNBr, lo que produjo también una banda en los experimentos de transferencia Western.

3. Western [0585] Se liofilizaron las fracciones de la HPLC que contenían secuencias de péptidos de IL22RA escindidos con CNBr durante la noche a temperatura ambiente, y se reconstituyeron en PBS. A continuación se mezclaron las muestras con tampón de muestras no reductor (Invitrogen) y se sometieron a ebullición durante 10 min. Se introdujeron las muestras y se sometieron a electroforesis mediante SDS-PAGE en geles Bis-Tris al 4-12 % (Invitrogen) usando x Tampón de Avance MES-SDS (Invitrogen) y se transfirieron a nitrocelulosa (0,2 µm; Bio-Rad) en tampón de transferencia de Metanol al 20 %, todo a temperatura ambiente. Se dejaron secar los filtros durante la noche a temperatura ambiente. Se bloquearon los filtros con leche en polvo desnatada al 10 % en tampón A (Tris 50 mM, pH 7.4, EDTA 5 mM, Igepal CA630 al 0,05%, NaCl 150 mM, gelatina al 0,25%) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se diluyó un anticuerpo monoclonal (mAb) de IL22RA (Clon R2.1.5F4.1) en 2 µg/ml en tampón A que contenía leche en polvo desnatada al 2,5 %. Se incubaron las transferencias en este anticuerpo primario durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras la incubación, se lavaron las transferencias tres veces en tampón A y se incubaron 1 hora a temperatura ambiente con una dilución 1:5000 de anticuerpo secundario peroxidasa de rábano picante-IgG de cabra dirigido contra rata; Jackson, Inc) en tampón A con leche en polvo desnatada al 2,5 %. A continuación se lavaron las transferencias, se desarrollaron con un sustrato quimioluminiscente (Sustrato de Transferencia Western Lumi-Light; Roche), y se expusieron usando un equipo de diagnóstico por imágenes luminiscente (Mannheim Boehringer Lumi-Imager). [0586] Usando una exposición de 30 minutos, el gel no reductor mostró bandas muy fuertes para las fracciones nº 4 y nº 5, junto con una banda débil para la fracción nº 3. La fracción nº 4 dio también un ensayo positivo en el ELISA.

SECUENCIACIÓN N TERMINAL DE LA FRACCIÓN ACTIVA Nº 4 [0587] De las cinco fracciones de péptidos recogidas de la columna analítica en fase inversa, la fracción nº 4 mostró actividad en el ELISA y fue también positiva para la transferencia Western. Para identificar los péptidos presentes en la fracción activa nº

5 4, se sometió la muestra a la degradación de Edman usando procedimientos bien conocidos. Se identificaron tres N terminales de la fracción activa que fueron consistentes con los péptidos 2 (SEC DE ID Nº: 49), 3 (SEC DE ID Nº: 50), y 5 (SEC DE ID Nº: 52). Estos resultados indicaron que los anticuerpos se unieron a lo péptidos 2 (SEC DE ID Nº: 49), 3 (SEC DE ID Nº: 50); y 5 (SEC DE ID Nº: 52).

10

Tabla 34

Degradación de Edman

Secuencia N-terminal Identificación del péptido

Primera secuencia obtenida de la Fracción nº 4

Péptido 5 CNBr (SEC DE ID Nº: 52)

Secuencia mIL22RA generada por CNBr

Segunda secuencia obtenida de la Fracción nº 4

Péptido 2 CNBr (SEC DE ID Nº: 49)

Secuencia mIL22RA generada por CNBr

Tercera secuencia obtenida de la Fracción nº 4

Péptido 3 CNBr (SEC DE ID Nº: 50)

Secuencia mIL22RA generada por CNBr

DISCUSIÓN [0588] Se aislaron cinco fracciones de una mezcla de péptidos de mIL22RA escindidos con CNBr De éstos, únicamente la fracción nº 4 fue activa en un ELISA y

5 positiva para el análisis Western. La degradación de Edman identificó tres N terminales consistentes con los péptidos 2 (SEC DE ID Nº:49), 3 (SEC DE ID Nº: 50, y 5 (SEC DE ID Nº: 52) escindidos con CNBr en la fracción nº 4. Dentro de estas regiones, se implicaron potencialmente seis restos en la unión del ligando. Estos restos son Y93, R112, K210, y E211 de la SEC DE ID Nº: 42, que se corresponden también

10 con los restos Y78, R97, K195, y E196 de la SEC DE ID Nº: 62. Los restos Y60 y F164 de la SEC DE ID Nº: 42 están también implicados en la unión del ligando.

B. EPÍTOPOS EN IL-22RA HUMANO A LOS QUE SE UNEN ANTICUERPOS MONOCLONALES NEUTRALIZANTES [0589] Los experimentos descritos a continuación tienen por objeto identificar una

15 región o regiones en el dominio extracelular de la secuencia de aminoácidos de la proteína IL-22RA humana (SEC DE ID Nº:2) que son importantes para la actividad del receptor, o para el antagonista o para neutralizar la unión del anticuerpo. A continuación se escinde C terminalmente un receptor soluble humano de la proteína IL-22RA (que comprende, por ejemplo, la SEC DE ID Nº: 3, tal como IL-22RA-Fc escindido con trombina para eliminar Fc) con los restos de metionina en la secuencia mediante la incubación con bromuro de cianógeno (CNBr), u otro agente conocido en la técnica que escinde la proteína humana en fragmentos definidos. Se fraccionaron los péptidos generados mediante CNBr, y se ensayaron las fracciones resultantes para la actividad de unión según se detectó mediante ELISA y para la reactividad mediante el análisis Western usando anticuerpos monoclonales con propiedades neutralizantes. [0590] Se predijo la unión de cuatro cisteínas mediante enlace disulfuro con un modelo de enlace de Cys71-Cys79 y Cys204-Cys217 de la SEC DE ID Nº: 2. Tras la escisión con CNBr, se generaron potencialmente los siguientes péptidos procedentes de IL-22RA humana de longitud completa no reducida: péptido 6 (SEC DE ID Nº:56), péptido 7 (SEC DE ID Nº:57); péptido 8 (SEC DE ID Nº:58); péptido 9 (SEC DE ID Nº:59); péptido 10 (SEC DE ID Nº:60); y péptido 11 (SEC DE ID Nº:61) (Tabla 35). Las cisteínas se unen mediante enlace disulfuro, lo que da como resultado una posible unión entre los péptido 7 (SEC DE ID Nº: 57) y 10 (SEC DE ID Nº: 60). Específicamente, la SEC DE ID Nº: 56 corresponde a los restos de aminoácidos 1 (Pro) y 92 (Met) de la SEC DE ID Nº: 3; la SEC DE ID Nº: 57 corresponde a los restos de aminoácidos 93 (Thr) y 120 (Met) de la SEC DE ID Nº: 3, la SEC DE ID Nº: 58 corresponde a los restos de aminoácidos 121 (Ile) y 160 (Met) de la SEC DE ID Nº: 3, la SEC DE ID Nº: 59 corresponde a los restos de aminoácidos 161 (His) y 185 (Met) de la SEC DE ID Nº: 3, la SEC DE ID Nº: 60 corresponde a los restos de aminoácidos 186 (Ile) y 199 (Met) de la SEC DE ID Nº: 3 y la SEC DE ID Nº: 61 corresponde a los restos de aminoácidos 200 (Cys) y 211 (Thr) de la SEC DE ID Nº: 3.

Tabla 35

imagen3

CNBr Péptido 6

1 92

CNBr Péptido 7

93 120

CNBr Péptido 8

121 160

CNBr Péptido 9

161 185

CNBr Péptido 10

186 199

CNBr Péptido 11

200 211

4. ESCISIÓN MEDIANTE CNBr Y AISLAMIENTO DE FRACCIONES Y PÉPTIDOS, WESTERN Y ELISA, Y SECUENCIACIÓN N TERMINAL [0591] Se liofilizaron aproximadamente 50 µg de IL22RA humana y se reconstituyeron, fraccionaron, recogieron y analizaron usando el análisis Western, y

5 ELISA, según se describe en el EJEMPLO 42A, para identificar las fracciones que contenían anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL-22RA, y las que se unían a IL22RA según se muestra mediante ELISA y el análisis Western. Se ensayaron las fracciones de péptidos escindidos mediante CNBr que se recogieron procedentes de la columna analítica en fase inversa para la actividad en el ELISA y se confirmaron como

10 positivas para la transferencia Western. Se identificaron los péptidos de las fracciones positivas mediante la degradación de Edman usando procedimientos bien conocidos. DISCUSIÓN [0592] El péptido nº 5 (SEC DE ID Nº: 52) escindido mediante CNBr en ratón corresponde a los péptidos nº 9, y nº 10 (SEC DE ID Nº: 59 y SEC DE ID Nº: 60) escindido mediante CNBr en ser humano; el péptido nº 2 (SEC DE ID Nº: 49) escindido mediante CNBr en ratón corresponde al péptido nº 6 (SEC DE ID Nº: 56) escindido mediante CNBr en ser humano; y el péptido nº 3 (SEC DE ID Nº: 50) escindido mediante CNBr en ratón corresponde al péptido nº 7 (SEC DE ID Nº: 57) escindido mediante CNBr en ser humano. De las fracciones que se aislaron de una mezcla de péptidos de IL-22RA humanos escindidos mediante CNBr, seis restos dentro de las posibles regiones están implicados en la unión del ligando: Los restos de la SEC DE ID Nº: 2 (y los restos correspondientes de la SEC DE ID Nº: 3) que son importantes para la unión ligando-receptor comprenden Tyr-60, y Phe-164, Tyr-93, Arg-112, Lys-210, y Glu-211 de la SEC DE ID Nº: 2 (y los restos correspondientes de la SEC DE IDNº: 3). Además, los restos primarios de la SEC DE ID Nº: 2 (y los restos correspondientes de la SEC DE ID Nº: 3) que son importantes para dirigir la unión ligando-receptor comprenden Tyr-60, y Phe-164 de la SEC DE ID Nº: 2 (y los restos correspondientes de la SEC DE ID Nº: 3), y los restos secundarios comprenden Tyr93, Arg-112, Lys-210, y Glu-211 de la SEC DE ID Nº: 2 y (los restos correspondientes de la SEC DE ID Nº: 3).

LISTADO DE SECUENCIAS [0593]

<110> ZymoGenetics, Inc. y col.

<120> ANTICUERPOS DIRIGIDOS CONTRA IL-22RA Y COMPAÑEROS DE UNIÓN Y PROCEDIMIENTOS DE USO EN ENFERMEDADES INFLAMATORIAS

<130> 04-14PC

<150>

<151>

<150>

<151>

<160> 62

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

<210> 1

<211> 2831

<212> ADN

<213> Homo sapiens <220>

<221> CDS

<222> (34)...(1755)

imagen4

imagen2

imagen2

imagen2

<210> 2

<211> 574

<212>

PRT 5 <213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 211

<212>

PRT 5 <213> Homo sapiens

imagen2

imagen2

<400> 3

imagen2

<210> 4

<211> 541 10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> A Soluble IL-22RA-Fc Fusion Polypeptide

<400> 4

imagen2

imagen2

<210> 5

<211> 1116

<212> ADN

<213> Homo sapiens 5 <220>

<221> CDS

<222> (21)...(557)

<400> 5

imagen2

<210> 6

<211> 179

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

imagen2

5 <210> 7

<211> 926

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 10 <221> CDS

<222> (45)...(575)

<221> variación

<222> (188)...(188)

<223> El nucleótido puede ser C o G en la posición 188 15 <400> 7 <210> 8

imagen2

<211> 176 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> <221> VARIANTE

<222> (48)...(48)

<223> El aminoácido en la posición 48 `puede ser D (Asp) o E (Glu)

<221> VARIANTE 5 <222> 48

<223> Xaa = Cualquier aminoácido

<400> 8

imagen2

<210> 9 10 <211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido ligante 15 <400> 9

imagen2

<210> 10

<211> 1050

<212> ADN 20 <213> Mus musculus <220>

<221> CDS

<222> (5)...(589)

<400> 10

imagen2

<210> 11

<211> 194

<212> PRT

<213> Mus musculus

imagen2

<400> 11 5 <210> 12

<211> 2149

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 10 <221> CDS

<222> (1)...(693)

<400> 12

imagen2

imagen2

<210> 13

<211> 231

<212> PRT 5 <213> Homo sapiens

<400> 13

imagen2

<210> 14

<211> 699

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5 <220>

<223> Marca Fc4 C-terminal

<400> 14

imagen2

<210> 15 10 <211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Marca del péptido Glu-Glu (CEE) 15 <400> 15

imagen2

<210> 16

<211> 10

<212> PRT 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Marca del péptido Glu-Glu (CEE) con espaciador

<400> 16

imagen2

25 <210> 17

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleótido ZC39289

<400> 17

tccgaggagt caatgctaag

20

<210> 18

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleótido ZC39290

<400> 18

tccaagcttt ttcactgtct

20

<210> 19

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleótido ZC39776

<400> 19

gggcccgcta gcacct

16

<210> 20

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleótido ZC39777

<400> 20

gggtgatccg ctggca

16

<210> 21

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> IL-20 FAM/TAMRA labeled TaqMan probe ZC38752

<400> 21

ccagccactt tctctctccg tatttcttat attcca

<210> 22

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador directo, ZC42459

<400> 22 tggccaggct cagcaa

<210> 23

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador inverso, ZC42458

<400> 23 gcacattcct ctggatatgc a

<210> 24

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> IL-22 TaqMan probe, ZC42460

<400> 24 aggctaagca catgtcatat tgaaggtgat g 31

<210> 25

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador directo, ZC40541

<400> 25 tcgccaattc ctttcttacc a

<210> 26

<211> 20

249

16

21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador inverso, ZC40542

<400> 26

cccacaatgg catgtcatgt

20

<210> 27

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> IL-20 TaqMan® sonda ZC40544

<400> 27

agaaggacct ccggctctgt catgc

25

<210> 28

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleótido ZC45593

imagen5

<210> 29

<211> 63

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleótido ZC45592

<400> 29

imagen2

<210> 30

<211> 63

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleótido ZC45591

<400> 30

imagen2

<210> 31 5 <211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleótido ZC45594 10 <400> 31

imagen2

<210> 32

<211> 531

<212> ADN 15 <213> Mus musculus

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(531)

<400> 32

imagen2

<210> 33

<211> 176

<212> PRT 5 <213> Mus musculus

<400> 33

imagen2

<210> 34

<211> 21

<212> ADN

5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleótido ZC22901

<400> 34

catcaaaccg cctgatgtga c

21

10

<210> 35

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> Cebador oligonucleótido ZC45039

<400> 35

attaggcttg ggagggaatg g

21

20 <210> 36

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleótido ZC38573

<400> 36 tggcgatgcc tgcttgccga ata 23

<210> 37

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleótido ZC25223

<400> 37 gtcttcctca catctgttat cg 22

<210> 38

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleótido ZC40128

<400> 38 ggcttgaact ttgagaaagg cagt 24

<210> 39

<211> 1473

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región extracelular de IL-22RA con la secuencia líder tPA y fusionada con la región Fc de la cadena pesada pesada gamma 2a de murino (mG2a)

<221> CDS

<222> (1)...(1473)

<400> 39

imagen2

imagen2

imagen2

<210> 40

<211> 490

<212> PRT

<213>

Secuencia artificial 5 <220>

<223> Región extracelular de IL-22RA con la secuencia líder tPA y fusionada con la región Fc de la cadena pesada pesada gamma 2a de murino

<400> 40

<210> 41

<211> 1834

<212> ADN

<213>

Mus musculus 5 <220>

imagen2

<221> CDS

<222> (43)...(1788)

<400> 41

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

<210> 42

<211> 581

<212>

PRT 5 <213> Mus musculus

<400> 42

<210> 43

<211> 660

<212>

ADN 5 <213> Homo Sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(660)

<400> 43

<210> 44

<211> 220

<212>

PRT 5 <213> Homo Sapiens

<400> 44

<210> 45

<211> 199

<212>

PRT 5 <213> homo sapiens

<400> 45

<210> 46

<211> 211

<212>

PRT 5 <213> Homo sapiens

<400> 46

<210> 47

<211> 201

<212>

PRT 5 <213> homo sapiens

<400> 47

<210> 48

<211> 68

<212>

PRT 5 <213> Mus musculus

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

imagen2

<400> 48

imagen2

<210> 49

<211> 26 10 <212> PRT

<213> mus musculus

<400> 49

imagen2

<210> 50

<211> 28

<212> PRT

<213> mus musculus 5 <400> 50

imagen2

<210> 51

<211> 40

<212> PRT 10 <213> Mus musculus

<400> 51

imagen2

<210> 52

<211> 50 15 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 52

imagen2

<210> 53 20 <211> 70

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 53

imagen2

<210> 54

<211> 46

<212> PRT 5 <213> Mus musculus

<400> 54

imagen2

<210> 55

<211> 48 10 <212> PRT

<213> mus musculus

<220>

<221> VARIANTE

<222> 6, 11, 13, 15 <223> Xaa = Cualquier aminoácido

<400> 55

imagen2

<210> 56

<211> 92 20 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 56

imagen2

<210> 57

<211> 28 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 57

imagen2

<210> 58 10 <211> 40

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 58

imagen2

15 <210> 59

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

imagen6

<210> 60

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5 <400> 60

imagen2

<210> 61

<211> 12

<212> PRT 10 <213> Homo sapiens

<400> 61

imagen2

<210> 62

<211> 212 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Receptor soluble de IL-22RA de murino con emplazamiento de escisión (Leu

Val Pro Arg) remanente en el extremo en C 20 <400> 62

imagen2

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REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

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Documentos de patente citados en la descripción

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WO 2004085476 A [0003]

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WO 2004085475 A [0003]

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US 5965704 A [0006] [0040] [0138] [0221] [0324]

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WO 0212345 A [0006] [0140]

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WO 02072607 A [0006] [0140]

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WO 9927103 A [0007] [0221]

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WO 01140467 A [0015]

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WO 9206204 A, Huse [0098]

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WO 9720078 A [0099]

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US 4599311 A, Kawasaki [0125]

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US 4870008 A, Brake [0125]

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US 5037743 A, Welch [0125] [0145]

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US 4845075 A, Murray [0125]

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US 4615974 A, Kingsman [0125]

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US 4977092 A, Bitter [0125]

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US 4990446 A [0125]

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US 5063154 A [0125]

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US 5139936 A [0125]

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US 4661454 A [0125]

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US 4882279 A, Cregg [0126]

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US 4935349 A, McKnight [0126]

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US 5162228 A, Sumino [0126]

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US 4486533 A, Lambowitz [0126]

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US 5716808 A, Raymond [0127]

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US 5736383 A, Raymond [0127]

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WO 9717450 A [0127]

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WO 9717451 A [0127]

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WO 9802536 A [0127]

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WO 9802565 A [0127]

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US 5945511 A [0138]

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WO 0146232 A [0138]

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US 5783384 A, Verdine [0143]

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US 5747334 A [0143]

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US 5723323 A, Kauffman [0143]

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US 5143830 A, Holland [0145]

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US 5641655 A [0146]

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US 6018026 A, Sledziewski, AZ [0148]

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US 5750375 A [0148]

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US 5155027 A [0151]

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US 5567584 A [0151]

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US 5723125 A, Chang [0154]

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EP 742830 A, LaRochelle [0155]

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WO 9521258 A [0155]

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US 5252714 A, Harris [0161]

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EP 0154316 A [0163]

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US 5382657 A, Karasiewicz [0163] [0172]

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US 5738846 A, Greenwald [0172]

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WO 9111465 A, Goldenberg [0188]

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US 4331647 A [0193]

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US 4946778 A, Ladner [0196] [0197] [0212]

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US 5403484 A, Ladner [0197] [0212]

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US 5571698 A, Ladner [0197] [0212]

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US 5693762 A, Queen [0199]

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US 5208146 A, Irie [0201]

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US 5637677 A [0201]

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WO 0024758 A [0221]

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WO 02068476 A [0245]

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WO 0140467 A [0259]

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JP 4244018 A [0279] [0291]

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US 4603044 A, Geho [0280] [0292]

Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

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Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se expresa mediante un hibridoma procedente del grupo de:

   (a)

   el clon de hibridoma 280.46.3.4 (Designación de depósito de patente ATCC PTA-6284);

   (b)

   el clon de hibridoma 281.73.49.1.1 (Designación de depósito de patente ATCC PTA-6285);

   (c)

   el clon de hibridoma 283.4.1.2 (Designación de depósito de patente ATCC PTA-6287);

   (d)

   el clon de hibridoma 283.52.5.4 (Designación de depósito de patente ATCC PTA-6311); y

   (e)

   el clon de hibridoma 283.108.2.3 (Designación de depósito de patente ATCC PTA-6286).

2. 2.

   Un anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo de la Reivindicación 1, en el que el anticuerpo humanizado se une a un polipéptido como se muestra en la SEC DE ID Nº 2 o en la SEC DE ID Nº 3.

3. 3.

   Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según la Reivindicación 1 ó 2, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno está pegilado.

4. 4.

   Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende además un radionúclido, enzima, sustrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, etiqueta de péptido, partícula magnética, fármaco o toxina.

5. 5.

   Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

6. 6.

   Un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo monoclonal expresado mediante un hibridoma procedente del grupo de:

   (a) el clon de hibridoma 280.46.3.4 (Designación de depósito de patente ATCC PTA-6284);

   (b) el clon de hibridoma 281.73.49.1.1 (Designación de depósito

   de patente ATCC PTA-6285);

   (c)

   el clon de hibridoma 283.4.1.2 (Designación de depósito de patente ATCC PTA-6287);

   (d)

   el clon de hibridoma 283.52.5.4 (Designación de depósito de patente ATCC PTA-6311); y

   (e)

   el clon de hibridoma 283.108.2.3 (Designación de depósito de patente ATCC PTA-6286).

7. 7.

   Un inmunoconjugado según la Reivindicación 6, en el que el inmunoconjugado está pegilado.

8. 8.

   Un inmunoconjugado según la Reivindicación 6 ó 7, en la que el inmunoconjugado comprende además radionúclidos, enzima, sustrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, etiqueta de péptido, partícula magnética, fármaco o toxina.

9. 9.

   Una composición farmacéutica que comprende un inmunoconjugado según cualquiera de las Reivindicaciones 6-8.

10. 10.

    Un hibridoma procedente del grupo de:

    (a)

    el clon de hibridoma 280.46.3.4 (Designación de depósito de patente ATCC PTA-6284);

    (b)

    el clon de hibridoma 281.73.49.1.1 (Designación de depósito de patente ATCC PTA-6285);

    (c)

    el clon de hibridoma 283.4.1.2 (Designación de depósito de patente ATCC PTA-6287);

    (d)

    el clon de hibridoma 283.52.5.4 (Designación de depósito de patente ATCC PTA-6311); y

    (e)

    el clon de hibridoma 283.108.2.3 (Designación de depósito de patente ATCC PTA-6286).

11. 11.

    Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la Reivindicación 1 ó 2 para tratar un mamífero que padece una enfermedad inflamatoria en la que IL-22RA tiene un papel, reduciendo la inflamación.

12. 12.

    Uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la Reivindicación 1 ó 2 en la fabricación de un medicamento para tratar un mamífero que padece una enfermedad inflamatoria en la que IL-22RA tiene un papel, reduciendo la

    5 inflamación.

13. 13.

    Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso según la Reivindicación 11, o uso según la Reivindicación 12, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria crónica.

14. 14.

    Un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o uso según la Reivindicación 13, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria crónica del grupo de enfermedad inflamatoria del intestino; colitis ulcerosa; enfermedad de Crohn; artritis; artritis psoriática; artritis reumatoide; y psoriasis.

    10

    15
15. 15. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso según la Reivindicación 11, o uso según la Reivindicación 12, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria aguda.

    20 16. Un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o uso según la Reivindicación 15, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria aguda del grupo de endotoxemia; septicemia; síndrome de choque tóxico; y enfermedad infecciones.