KR20070084486A - 항-ｉｌ-22ｒａ 항체 및 결합 파트너 및 염증에서의사용방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 IL-22, IL-20, 또는 IL-20과 IL-22 모두의 폴리펩티드 분자의 활성을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 것에 관한 것이다. IL-20 및 IL-22는 염증 과정 및 사람의 질환에 연루되는 사이토카인이다. IL-22RA(zcytor11)이 IL-20 및 IL-22에 대한 공통된 수용체이다. 본 발명은 항-IL-22RA 항체 및 결합 파트너, 및 이러한 항체 및 결합 파트너를 이용하여 IL-22 또는 IL-20과 IL-22를 길항하는 방법을 포함한다.

Description

항-ＩＬ-22ＲＡ 항체 및 결합 파트너 및 염증에서의 사용방법{ANTI-IL-22RA ANTIBODIES AND BINDING PARTNERS AND METHODS OF USING IN INFLAMMATION}

사이토카인은 많은 세포 유형의 성장 및 분화의 조절을 포함한, 다양한 생물학적 효과를 매개하는 가용성, 소 단백질이다(예를 들면, Arai et al., Annu . Rev. Biochem. 59:783 (1990); Mosmann, Curr . Opin . Immunol . 3:311 (1991); Paul and Seder, Cell 76:241 (1994) 참조). 사이토카인 그룹을 구성하는 단백질은 인터루킨, 인터페론, 콜로니 자극 인자, 종양 괴사 인자 및 다른 조절 분자를 포함한다. 예를 들면, 사람 인터루킨-17은 인터루킨-6, 세포내 부착 분자 1, 인터루킨-8, 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자의 발현 및 프로스타글란딘 E3 발현을 자극하는 사이토카인이며, CD34+ 조혈 전구체의 호중구로의 선택적 성숙에서 중요한 역할을 한다(Yao et al., J. Immunol . 155:5483 (1995); Fossiez et al., J. Exp . Med . 183: 2593 (1996)).

사이토카인과 결합하는 수용체는 전형적으로 사이토카인과 높은 친화력으로 결합하고 이 결합 이벤트를 어떤 수용체 하위단위체의 세포질 부분을 통하여 세포에 전달하는 하나 이상의 내재성 막 단백질로 구성된다. 사이토카인 수용체는 그것들의 세포외 리간드 결합 도메인의 유사성에 기초, 몇 개 부류로 분류되었다. 예를 들면, 인터페론과 결합 및/또는 그 효과를 변화시키는 수용체 사슬이 II형 사이토카인 수용체 패밀리의 일원이며, 200개 잔기의 세포외 도메인을 특징으로 한다.

사이토카인 및 그것들의 수용체의 증명된 생체내 활성은 다른 사이토카인, 사이토카인 수용체, 사이토카인 작용제 및 사이토카인 길항제의 임상적 잠재력 및 그것들에 대한 필요를 설명해준다. 예를 들어, 전-염증 사이토카인 패밀리의 증명된 생체내 활성은 전-염증 분자의 길항제의 막대한 임상적 잠재력 및 그것들에 대한 필요를 설명해준다. 본 발명은 전-염증 사이토카인 IL-20 및 IL-22에 대한 길항제를 제공함으로써 이들 필요를 다룬 것이다. IL-11, IL-20, 또는 IL-20과 IL-22의 활성을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 본 발명의 이러한 길항제는 가용성 IL-22RA 수용체 및 중화 항-IL-22RA 항체를 포함한다. 더 나아가, 본 발명은 염증 질환에서 이들의 사용과, 관련된 조성물 및 방법을 제공한다.

1. 개요

다른 발명들 중에서도 특히 본 발명은 "Zcytor11" 또는 "IL-22RA"로 명명된 가용성 수용체 및 IL-22RA 사이토카인 수용체에 대한 중화 항체의 신규 이용을 제공한다. 또한, 본 발명은 사람의 염증 및 자가면역 질환에서 사용하기 위한 가용성 IL-22RA 폴리펩티드 단편 및 융합 단백질을 제공한다. 본 발명의 중화 항-IL-22RA 항체를 포함한, 본 발명의 항-IL-22RA 항체, 및 가용성 IL-22RA 수용체는 건선, 건선성 관절염, 관절염, 내독소혈증, 염증성 장 질환(IBD), 결장염, 및 본원에 개시된 다른 염증성 상태와 같은 특정한 사람의 질환의 치료에서, IL-22 또는 IL-20의 활성, 또는 IL-20과 IL-22 모두의 활성을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는데 사용될 수 있다.

사람 Zcytor11을 코딩하는 예시적 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:1로 제공되며, 코딩된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2에 나타낸다. IL-22RA는 IL-20과 IL-22 모두의 수용체 하위단위체이다. Zcytor11(IL-22RA)는 공동소유 미국특허 제5,965,704호, 공동소유 WIPO 공보 WO 02/12345, 및 공동소유 WIPO 공보 WO 02/072607에 개시된다. IL-22RA(SEQ ID NO:1)을 코딩하는 사람 cDNA 클론의 분석은 약 211 아미노산 잔기(SEQ ID NO:2의 잔기 18-228; SEQ ID NO:3)의 세포외 리간드-결합 도메인, 약 23 아미노산 잔기의 막통과 도메인(SEQ ID NO:2의 잔기 229-251), 및 약 313 아미노산 잔기의 세포내 도메인(SEQ ID NO:2의 잔기 252-574)을 포함하는 574 아미노산(SEQ ID NO:2)을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 드러냈다. 따라서, 본 발명의 분자는 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 18-228; SEQ ID NO:3을 포함하는 사이토카인 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 가용성 수용체의 한 구체예에서, 가용성 IL-22RA는 중쇄의 불변영역과 융합된다(예로서 SEQ ID NO:4로 나타낸 것). 당업자는 이들 도메인 경계가 대략적임을 인정할 것이다. 도메인 단부에서 잔기가 결실될 수도 있다.

하기 설명된 대로, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 18-228, 즉 SEQ ID NO:3로 나타낸 기준 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 95% 이상, 예를 들어 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한, 또는 이보다 더 동일한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공하며, 이 분리된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체와 특이적으로 결합한다. 예시적인 폴리펩티드는 아미노산 잔기 SEQ ID NO:3 또는 아미노산 잔기 SEQ ID NO:3를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 더욱이, 본 발명은 또한 IL-22(예를 들어, SEQ ID NO:6에 나타낸 사람 IL-22 폴리펩티드 서열)와 결합하는 상기 개시된 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 사람 IL-22 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:5에 나타낸다. 마우스 IL-22 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:10에 나타내며, 상응하는 폴리펩티드는 SEQ ID NO:11에 나타낸다. 본 발명은 또 IL-20(예를 들어, SEQ ID NO:8에 나타낸 사람 IL-20 폴리펩티드 서열; WIPO 공보 WO 99/27103)와 결합하는 상기 개시된 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 사람 IL-20 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:7에 나타낸다.

또한, 본 발명은 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열 중 15 이상의 연속 아미노산 잔기를 포함하는 분리된 폴리펩티드 및 에피토프를 제공한다. 예시적인 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3를 포함하거나, 또는 SEQ ID NO:3으로 구성되는 폴리펩티드, 그것의 항원 에피토프, 또는 그것의 기능적 IL-20 또는 IL-22 결합 단편을 포함한다. 더욱이, 본 발명은 또한 IL-22 또는 IL-20과 결합하여 그 활성을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 상기 개시된 폴리펩티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열이 적어도 70% 동일성, 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 또는 95% 이상의 동일성, 예를 들어 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상, 또는 그 이상의 동일성으로 구성된 군으로부터 선택된 SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기와 동일성을 공유하는 변이체 IL-22RA 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열과 SEQ ID NO:3의 상응하는 아미노산 서열의 어떤 차이는 1개 이상의 보존성 아미노산 치환으로 인한 것이다. 이러한 보존성 아미노산 치환이 본원에 설명된다. 더욱이, 본 발명은 또한 IL-22 또는 IL-20과 결합하여 그 활성을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 상기 개시된 분리된 폴리펩티드를 제공한다.

더 이상으로, 본 발명은 이러한 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체 및 항체 단편을 제공한다. 전형적인 항체는 중화 항체, 폴리클로날 항체, 쥐과 모노클로날 항체, 쥐과 모노클로날 항체로부터 유래된 사람화 항체, 및 사람 모노클로날 항체를 포함한다. 예시적인 항체 단편은 F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab, Fv, scFv, 및 최소 인식 단위체를 포함한다. 중화 항체는 바람직하게 IL-22RA와 결합하여, IL-20 및 IL-22와 IL-22RA의 상호작용을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화한다; IL-20 또는 IL-22와 IL-22RA의 결합을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 항-IL-22RA 중화 합체도 본 발명에 포함된다. 즉, 본 발명의 중화 항-IL-22RA 항체는 IL-20 또는 IL-22 각각에 단독으로 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화할 수 있거나, 또는 IL-20과 IL-22에 함께 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화할 수 있다.

추가하여, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체 및 이러한 발현 벡터 중 적어도 하나 또는 이러한 발현를 포함하는 재조합 바이러스를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체 및 본원에 설명된 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다.

또한, 본 발명은 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열 또는 그 단편을 포함하는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편과 특이적으로 결합하는, 항-유전형 항체, 또는 항-유전형 항체의 단편을 고찰한다. 전형적인 항-유전형 항체는 SEQ ID NO:3로 구성되는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체와 결합한다.

또한, 본 발명은 IL-22RA 폴리펩티드와 면역글로불린 부분을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 이러한 융합 단백질에서 면역글로불린 부분은 사람 Fc 단편과 같은 면역글로불린 중쇄 불변영역일 수 있다. 더 이상으로, 본 발명은 이러한 융합 단백질을 코딩하는 분리된 핵산 분자를 포함한다.

또한, 본 발명은 가용성 수용체를 포함한, 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머 및 멀티머 수용체와 같은 IL-22RA 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 결합하는 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 제공한다. 더욱이, 이러한 항체는 IL-22RA 리간드, IL-22(SEQ ID NO:6), 및 IL-20(SEQ ID NO:8) 각각과의 또는 모두 함께와의 IL-22RA 수용체의 결합을 길항하는데 사용될 수 있다.

더욱이, IL-22 및 IL-20의 과발현 또는 상향조절이 사람의 건선성 병소와 사람의 아토피 피부염 피부 샘플에서 보여졌는데, 이는 IL-20과 마찬가지로 IL-22도 역시 사람의 건선, 아토피 피부염 또는 피부 및 상피조직의 다른 염증 질환에 연루됨을 시사한다. 또한, 본원에 설명된 대로, 트랜스제닉 마우스에서 IL-20 또는 IL-22의 과별현은 건선 표현형의 표시인 상피 비후 및 면역세포 병발을 나타냈다; 그리고 추가하여, 정상 마우스에 IL-22를 주사하자 건선 표현형의 표시인 상피 비후 및 면역세포 병발이 나타났으며, 이것은 가용성 수용체 길항제 IL-22RA2(zcytor16: WIPO 공보 WO 01/40476)에 의해 제거되었다. 이러한 생체내 데이터가 또한 전-염증 IL-22가 건선, 아토피 피부염 또는 피부 및 상피조직의 다른 염증 질환에 연루됨을 시사한다. 이와 같이, 본 발명의 IL-22RA 가용성 수용체 및 항-사람-IL-22RA 모노클로날 및 중화 항체를 포함한 그에 대한 항체와 같은, IL-22 및 IL-20 활성의 길항제는, 특히 건선의 치료에서 IL-22 및 IL-20 각각에 작용하거나 또는 두 가지에 함께 작용하는 길항제로서, 염증 질환의 치료학적 치료에 유용하다.

더욱이, 본 발명의 IL-22RA 가용성 수용체 및 항-사람-IL-22RA 모노클로날 및 중화 항체를 포함한 그에 대한 항체와 같은, IL-22 활성의 길항제는, 예를 들어 아토피 피부염, IBD, 결장염, 내독소혈증, 관절염, 류마티스 관절염 및 건선성 관절염, 성인 호흡기 질환(ARD), 패혈쇼크, 복합장기부전, 천식이나 기관지염 같은 염증성 폐 손상, 세균성 폐렴, 건선, 습진, 아토피 및 접촉성 피부염, 및 궤양성 결장염 및 크론병과 같은 염증성 장 질환의 치료에서 IL-22 및 IL-20(개별적으로 또는 함께)과 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하므로, 다른 염증성 질환의 치료학적 치료에 유용하다.

본 발명의 이들 및 다른 양태는 하기 상세한 설명을 참조하면 명백해질 것이다. 뿐만 아니라, 여러 참고문헌들이 하기에서 확인되며, 이들은 그 전문이 참고문헌으로서 포함된다.

2. 정의

이어지는 설명에서, 많은 용어들이 광범위하게 사용된다. 하기 정의는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제공된다.

본원에 사용된 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 디옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA), 올리고뉴클레오티드, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의하여 생성된 단편, 및 리게이션, 절단, 엔도뉴클레아제 작용 및 엑소뉴클레아제 작용 중 어떤 것에 의하여 발생된 단편을 말한다. 핵산 분자는 자연적으로 발생한 뉴클레오티드(예를 들면, DNA 및 RNA)인 모노머, 또는 자연적으로 발생한 뉴클레오티드의 유사체(예를 들면, 자연적으로 발생한 뉴클레오티드의 α-거울상이성질체 형태), 또는 두 개의 조합으로 구성될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 당 부분 및/또는 피리미딘이나 퓨린 염기 부분에 변형을 가질 수 있다. 예를 들면, 당 변형은 하나 이상의 히드록실기를 할로겐, 알킬, 아민, 및 아지도 기로 치환하는 것을 포함하거나, 또는 당은 에테르 또는 에스테르로 기능화될 수 있다. 또한, 전체 당 부분이 아자-당 및 카르보사이클릭 유사체와 같이, 입체적으로 및 전자적으로 유사한 구조로 치환될 수 있다. 염기 부분에서의 변형의 예는 알킬화된 퓨린 및 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘, 또는 다른 공지의 헤테로사이클릭 치환기를 포함한다. 핵산 모노머는 포스포디에스테르 결합 또는 이러한 결합의 유사체에 의하여 결합될 수 있다. 포스포디에스테르 결합의 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐리데이트, 포스포라미데이트 등을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 또한 폴리아미드 백본에 부착된 자연적으로 발생한 또는 변형된 핵산 염기를 포함하는, 소위 "펩티드 핵산"을 포함한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.

용어 "핵산 분자의 상보체"는 기준 뉴클레오티드 서열과 비교하여 상보적 뉴클레오티드 서열 및 역방향을 가진 핵산 분자를 말한다. 예를 들면, 서열 5' ATGCA CGGG 3'은 5' CCCGTGCAT 3'에 상보적이다.

용어 "축퇴성 핵산 서열"은 폴리펩티드를 코딩하는 기준 핵산 분자에 비해서 하나 이상의 축퇴성 코돈을 포함한 뉴클레오티드의 서열을 말한다. 축퇴성 코돈은 뉴클레오티드의 다른 트리플렛을 함유하지만 동일한 아미노산 잔기를 코딩한다(즉, GAU 및 GAC 트리플렛은 각각 Asp를 코딩한다).

용어 "구조 유전자"는 전달자 RNA(mRNA)로 전사되고, 그 후 특정 폴리펩티드의 아미노산 특성의 서열로 번역되는 핵산 분자를 말한다.

"분리된 핵산 분자"는 개체의 게놈 DNA에 통합되지 않은 핵산 분자이다. 예를 들면, 세포의 게놈 DNA로부터 분리된 성장 인자를 코딩하는 DNA 분자는 분리된 DNA 분자이다. 분리된 핵산 분자의 다른 예는 개체의 게놈에 통합되지 않은 화학적으로 합성된 핵산 분자이다. 특정 종에서 분리된 핵산 분자는 그 종의 염색체의 완전한 DNA 분자보다 더 작다.

"핵산 분자 구성체"는 자연에 존재하지 않은 배열로 결합되고 병치된 핵산의 단편을 함유하도록 사람 개입을 통하여 변형된, 단일 또는 이중 가닥의 핵산 분자이다.

"선형 DNA"는 자유 5'- 및 3'-단부를 가진 비-고리형 DNA 분자를 나타낸다. 선형 DNA는 효소적 분해 또는 물리적 파괴에 의하여 플라스미드와 같은 폐-고리형 DNA 분자로부터 제조될 수 있다.

"상보적 DNA(cDNA)"는 역전사효소에 의하여 mRNA 주형으로부터 형성된 단일 가닥 DNA 분자이다. 전형적으로, 역전사의 개시를 위하여 mRNA의 일부에 상보적인 프라이머를 도입한다. 당해 기술분야의 숙련자들은 용어 "cDNA"를 이러한 단일 가닥 DNA 분자 및 그것의 상보적 DNA 가닥으로 구성된 이중 가닥 DNA 분자를 말하는 것으로 사용한다. 용어 "cDNA"는 또한 RNA 주형으로부터 합성된 cDNA 분자의 클론을 말한다.

"프로모터"는 구조 유전자의 전사를 지시하는 뉴클레오티드 서열이다. 전형적으로, 프로모터는 구조 유전자의 전사 시작 부위에 인접한 유전자의 5' 비-코딩 영역에 위치한다. 전사의 개시에서 기능을 하는 포로모터 내 서열 요소는 흔히 공통 뉴클레오티드 서열을 특징으로 한다. 이들 프로모터 요소는 RNA 중합효소 결합 부위, TATA 서열, CAAT 서열, 분화-특이적 요소(DSE; McGehee et al., Mol . Endoc -rinol. 7:551(1993)), 고리형 AMP 반응 요소(CRE), 혈청 반응 요소(SRE; Treisman, Seminars in Cancer Biol . 1:47 (1990)), 글루코코르티코이드 반응 요소 (GRE), 및 CRE/ATF 같은 다른 전사 인자의 결합 부위(O'Reilly et al., J. Biol . Chem . 267: 19938 (1992)), AP2(Ye et al., J. Biol . Chem . 269:25728 (1994)), SP1, cAMP 반응 요소 결합 단백질(CREB; Loeken, Gene Expr . 3:253 (1993)) 및 옥타머 인자(일반적으로, Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987), 및 Lemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994) 참조)를 포함한다. 프로모터가 유도성 프로모터인 경우, 전사의 속도는 유도 인자에 반응하여 증가한다. 대조적으로, 전사의 속도는 프로모터가 항시발현 프로모터인 경우 유도 인자에 의하여 조절되지 않는다. 억제성 프로모터도 또한 공지되어 있다.

"코어 프로모터"는 TATA 박스 및 전사의 시작을 포함한 프로모터 기능에 필수적인 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 이 정의에 의하면, 코어 프로모터는 활성을 증대시키거나 조직 특이적 활성을 부여할 수 있는 특이적 서열의 부재시에 검출가능한 활성을 갖거나 갖지 않을 수 있다.

"조절 요소"는 코어 프로모터의 활성을 조절하는 뉴클레오티드 서열이다. 예를 들면, 조절 인자는 배타적으로 또는 바람직하게는 특정 세포, 조직, 또는 세포기관에서 전사를 가능하게 하는 세포 인자와 결합하는 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 이들 형태의 조절 인자는 보통 "세포-특이적", "조직-특이적", 또는 "세포기관-특이적" 방식으로 발현되는 유전자와 연관된다.

"인핸서"는 전사의 시작 부위와 관련하여 인핸서의 거리 또는 방향에 상관없이 전사의 효율성을 증가시킬 수 있는 조절 인자의 형태이다.

"이종 DNA"는 주어진 숙주 세포에 자연적으로 존재하지 않는 DNA 분자, 또는 DNA 분자의 집단을 말한다. 특정 숙주 세포에 이종인 DNA 분자는 숙주 DNA가 비-숙주 DNA(즉, 외인성 DNA)와 조합되는 한, 숙주 세포 종에서 유래된 DNA(즉, 내인성 DNA)를 함유할 수 있다. 예를 들면, 전사 프로모터를 포함한 숙주 DNA 단편에 작동가능하게 결합된 폴리펩티드를 코딩하는 비-숙주 DNA 단편을 함유한 DNA 분자는 이종 DNA 단편인 것으로 고려된다. 반대로, 이종 DNA 분자는 외인성 프로모터와 작동가능하게 결합된 내인성 유전자를 포함할 수 있다. 다른 설명으로서, 야생형 세포로부터 유래된 유전자를 포함한 DNA 분자는, 이 DNA 분자가 야생형 유전자가 결핍된 돌연변이체 세포 내로 도입된 경우 이종 DNA인 것으로 고려된다.

"폴리펩티드"는 자연적으로 생성되든지 합성적으로 생성되든지 펩티드 결합에 의하여 결합된 아미노산 잔기의 폴리머이다. 약 10 아미노산 잔기 미만의 폴리펩티드는 보통 "펩티드"로 언급된다.

"단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함한 거대분자이다. 단백질은 또한 탄수화물 기와 같은 비-펩티드 성분을 포함할 수 있다. 탄수화물 및 다른 비-펩티드 치환체는 단백질이 생성된 세포에 의하여 단백질에 첨가될 수 있으며, 이는 세포의 유형에 따라 다양할 것이다. 단백질은 본원에서 그것들의 아미노산 백본 구조로 정의되며, 탄수화물 기와 같은 치환체는 일반적으로 일일이 열거되지 않지만 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.

비-숙주 DNA 분자에 의하여 코딩되는 펩티드 또는 폴리펩티드는 "이종" 펩티드 또는 폴리펩티드이다.

"클로닝 벡터"는 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있는 능력을 가진 플라스미드, 코스미드, 또는 박테리오파지와 같은 핵산 분자이다. 클로닝 벡터는 전형적으로 클로닝 벡터로 형질전환된 세포의 동정 및 선별에 사용하기에 적합한 마커 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 벡터의 필수적 생물학적 기능의 손실 없이 결정가능한 방식으로 핵산 분자를 삽입할 수 있는 하나 또는 적은 수의 제한효소 인식 부위를 함유한다. 마커 유전자는 전형적으로 테트라마이신 내성 또는 앰피실린 내성을 제공하는 유전자를 함유한다.

"발현 벡터"는 숙주 세포에 발현된 유전자를 코딩하는 핵산 분자이다. 전형적으로 발현 벡터는 전사 프로모터, 유전자 및 전사 종결자를 포함한다. 유전자 발현은 대개 프로모터의 통제 하에 배치되는데, 이러한 유전자를 프로모터에 "작동가능하게 결합되다"라고 부른다. 유사하게, 조절 인자 및 코어 프로모터는 조절 인자가 코어 프로모터의 활성을 조절하면 작동가능하게 결합된다.

"재조합 숙주"는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터와 같은 이종 핵산 분자를 함유한 세포이다. 본 문맥에서, 재조합 숙주의 예는 발현 벡터로부터 IL-22RA를 생성하는 세포이다. 반대로, IL-22RA는 IL-22RA의 "자연 공급원"이며 발현 벡터가 결핍된 세포에 의하여 생성될 수 있다.

"통합 형질전환체"는 이종 DNA가 세포의 게놈 DNA 내로 통합된 재조합 숙주 세포이다.

"융합 단백질"은 적어도 두 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함한 핵산 분자에 의하여 발현된 하이브리드 단백질이다. 예를 들면, 융합 단백질은 친화성 매트릭스에 결합하는 폴리펩티드와 융합된 IL-22RA 폴리펩티드의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 이러한 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피를 이용하여 IL-22RA의 많은 양을 분리하기 위한 수단을 제공한다.

용어 "수용체"는 "리간드"라고 불리는 생활성 분자에 결합하는 세포-연관된 단백질을 나타낸다. 이 상호작용은 세포에 대한 리간드의 효과를 매개한다. 수용체는 막 결합성 수용체, 세포질성 수용체 또는 핵 수용체; 모노머(예를 들면, 갑상선 자극 호르몬 수용체, 베타-아드레날린 수용체) 또는 멀티머(예를 들면, PDGF 수용체, 성장 호르몬 수용체, IL-3 수용체, GM-CSF 수용체, G-CSF 수용체, 에리트로포이에틴 수용체 및 IL-6 수용체)일 수 있다. 막 결합성 수용체는 전형적으로 신호전달에 관련된 세포외 리간드-결합 도메인 및 세포내 작용자 도메인을 포함하는 멀티 도메인을 특징으로 한다. 어떤 막 결합성 수용체에서, 세포외 리간드-결합 도메인 및 세포내 작용자 도메인은 완전한 기능성 수용체를 포함한 개별 폴리펩티드에 위치한다.

대체로, 리간드와 수용체의 결합은 효과자 도메인과 다른 분자(들) 간의 상호작용을 야기하는 수용체에 형태적 변화를 가져오고, 이는 차례로 세포의 대사에 변경을 초래한다. 수용체-리간드 상호작용과 흔히 연관된 대사 사건들은 유전자 전사, 인산화, 탈인산화, 고리형 AMP 생성의 증가, 세포의 칼슘의 이동, 막 지질의 이동, 세포 부착, 이노시톨 지질의 가수분해 및 인지질의 가수분해를 포함한다.

"가용성 수용체"는 세포막에 결합되지 않은 수용체 폴리펩티드이다. 가용성 수용체는 가장 통상적으로 막통과 및 세포질 도메인 및 예를 들면 글리코포스포이노시톨(gpi)을 통한 세포막으로의 다른 결합이 결핍된 리간드-결합 수용체 폴리펩티드이다. 가용성 수용체는 폴리펩티드의 정제를 제공하거나 기질에 폴리펩티드의 부착을 위한 부위 또는 면역글로불린 불변 영역 서열을 제공하는 친화성 태그와 같은 추가 아미노산을 포함할 수 있다. 많은 세포 표면 수용체는 단백질분해에 의하여 생성되거나 교대로 스플라이싱된 mRNA로부터 번역된 자연적으로 발생한, 가용성 대응물을 가진다. 가용성 수용체는 일반적으로 9 이상의 하위단위체를 포함하지 않고, 바람직하게는 6 이상의 하위단위체를 포함하지 않으며, 가장 바람직하게는 3 이상의 하위단위체를 포함하지 않는 멀티머 수용체를 가진 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머, 또는 멀티머일 수 있다. 수용체 폴리펩티드는 그것들이 각각 막 고정 또는 신호전달을 제공하기 위한 이들 단편의 충분한 부분이 결핍될 때 막통과 및 세포내 폴리펩티드 단편이 실질적으로 없다고 한다. 사이토카인 수용체의 가용성 수용체는 일반적으로 막통과 도메인 및 세포내 도메인이 없는 세포외 사이토카인 결합 도메인을 포함한다. 예를 들면, 대표적 가용성 수용체는 SEQ ID NO:44 및 SEQ ID NO:45에 나타낸 CRF2-4(a.k.a., IL-10RB)(Genbank Accession No. Z17227)에 대한 가용성 수용체; SEQ ID NO:46에 나타낸 IL-10RA(Genbank Acession No. U00627 및 No. NM_001558)에 대한 가용성 수용체; SEQ ID NO:47에 나타낸 pDIRSI(a.k.a., IL-20RB(Genback Accession No. AY358305)에 대한 가용성 수용체; 및 SEQ ID NO:3에 나타낸 IL-22RA(미국특허 제5,965,704)에 대한 가용성 수용체를 포함한다. 공지된 I형 또는 II형 사이토카인 수용체 서열 중 어떤 서열이 막통과 도메인 및 세포내 도메인이 없는 세포외 사이토카인 결합 도메인을 포함하는지를 서술하는 것은 당업자의 기술 수준 내에 있다. 더욱이, 유전자 암호를 사용하여 당업자는 이러한 가용성 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 용이하게 결정할 수 있다.

용어 "분비성 신호 서열"은 큰 폴리펩티드의 성분으로서, 그것이 합성된 세포의 분비 경로를 통하여 큰 폴리펩티드를 인도하는 펩티드("분비성 펩티드")를 코딩하는 DNA 서열을 나타낸다. 큰 폴리펩티드는 통상적으로 절단되어 분비성 경로를 통하여 이동하는 동안 분비성 펩티드를 제거한다.

"분리된 폴리펩티드"는 탄수화물, 지질 또는 자연 상태에서 폴리펩티드와 연관된 다른 단백질성 불순물과 같은 오염된 세포 성분이 필수적으로 제거된 폴리펩티드이다. 전형적으로, 분리된 폴리펩티드 제제는 고도로 정제된 형태, 즉 약 적어도 80% 순도, 약 적어도 90% 순도, 약 적어도 95% 순도, 95% 이상의 순도, 예를 들면, 96%, 97% 또는 98% 또는 그 이상의 순도, 또는 99% 이상의 순도의 폴리펩티드를 함유한다. 특정 단백질 제제가 분리된 폴리펩티드를 함유한다는 것을 보여주는 한 가지 방법은 단백질 제제의 소듐 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 겔의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색 후의 단일 밴드의 출현에 의한 것이다. 그러나, 용어 "분리된"은 다이머와 같은 대체 물리적 형태 또는 대체 글리코실화된 또는 유도체화된 형태의 동일한 폴리펩티드의 존재를 배제하지 않는다.

용어 "아미노-말단" 및 "카르복실-말단"은 폴리펩티드 내의 위치를 나타내는 것으로 본원에서 사용된다. 문맥이 허락한다면, 이들 용어는 특정 서열 또는 폴리펩티드의 부분과 관련하여 사용되며, 이들의 근접성 또는 상대적 위치를 나타낸다. 예를 들면, 폴리펩티드 내 기준 서열에 대한 어떤 위치의 카르복실-말단은 기준 서열의 카르복실 말단에 인접하게 위치하지만, 반드시 완전한 폴리펩티드의 카르복실 말단에 있는 것은 아니다.

용어 "발현"은 유전자 생성물의 생합성을 말한다. 예를 들면, 구조 유전자의 경우에, 발현은 구조 유전자의 mRNA로의 전사 및 mRNA의 하나 이상의 폴리펩티드로의 번역을 포함한다.

용어 "스플라이스 변이체"는 유전자로부터 전사된 RNA의 대안적 형태를 나타내는 것으로 본원에 사용된다. 스플라이스 변이체는 전사된 RNA 분자 내에 또는 덜 통상적으로는 개별적으로 전사된 RNA들 사이에 대체 스플라이싱 부위의 사용을 통하여 자연적으로 발생하고, 동일한 유전자로부터 전사된 일부 mRNA를 생성할 수 있다. 스플라이스 변이체는 변경된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 용어 스플라이스 변이체는 또한 유전자로부터 전사된 mRNA의 스플라이스 변이체에 의하여 코딩된 폴리펩티드를 나타내는 것으로 본원에 사용된다.

본원에 사용된 용어 "면역조절자"는 사이토카인, 줄기세포 성장인자, 림포독소, 공동자극 분자, 조혈인자 등 및 이들 분자들의 합성 유사체를 포함한다.

용어 "보체/항-보체 쌍"은 적합한 조건 하에서 비공유 결합된, 안정된 쌍을 형성하는 일치하지 않은 부분을 나타낸다. 예를 들어, 비오틴 및 아비딘(또는 스트렙토아비딘)은 보체/항-보체 쌍의 전형적인 구성원이다. 다른 예시적 보체/항-보체 쌍은 수용체/리간드 쌍, 항체/항원(또는, 합텐 또는 에피토프) 쌍, 센스/안티센스 폴리뉴클레오티드 쌍 등을 포함한다. 보체/항-보체 쌍의 연속적인 분리가 바람직한 경우, 보체/항-보체 쌍은 바람직하게는 10⁹ M^-1 미만의 결합 친화력을 가진다.

"항-유전형 항체"는 면역글로불린의 가변영역 도메인과 결합하는 항체이다. 본 문맥에서, 항-유전형 항체는 항-IL-22RA 항체의 가변영역과 결합함으로써, 항-유전형 항체가 IL-22RA의 에피토프를 모방하게 된다.

"항체 단편"은 F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab 등과 같은 항체의 일부이다. 구조와 관계없이 항체 단편은 완전한 항체에 의하여 인식되는 것과 동일한 항원과 결합한다. 예를 들어, IL-22RA 모노클로날 항체 단편은 IL-22RA의 에피토프와 결합한다.

용어 "항체 단편"은 또한, 특정 항원, 예를 들면 경쇄 가변영역으로 구성된 폴리펩티드, 중쇄 및 경쇄의 가변영역으로 구성된 "Fv" 단편, 경쇄 및 중쇄 가변영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단쇄 폴리펩티드 분자("scFv 단백질"), 및 초가변영역을 모방하는 아미노산 잔기로 구성된 최소 인식 단위체에 결합된 합성된 또는 유전적으로 조작된 폴리펩티드를 포함한다.

"키메라 항체"는 가변영역 및 설치류 항체로부터 유래된 상보적 결정 영역을 함유하며, 항체 분자의 나머지는 사람 항체로부터 유래하는 재조합 단백질이다.

"사람화 항체"는 모노클로날 항체의 쥐과 상보성 결정 영역이 쥐과 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변영역으로부터 사람 가변 도메인으로 전달된 재조합 단백질이다. 사람 단백질에 결합하거나 사람 단백질을 중화시키는 것들과 같은 쥐과 항체로부터 유래된 사람에 대한 치료학적 사용을 위한 사람화 항체의 구성은 당업계의 기술 범위 내이다.

본원에 사용된 "치료제"는 치료에 유용한 콘쥬게이트를 생성하기 위하여 항체 부분에 콘쥬게이트된 분자 또는 원자이다. 치료제의 예로는 약물, 독소, 면역조절자, 킬레이터, 붕소 화합물, 광-활성제 또는 염료, 및 방사선 동위원소가 있다.

"검출가능한 표지"는 진단에 유용한 분자를 생성하기 위하여 항체 부분에 콘쥬게이트될 수 있는 분자 또는 원자이다. 검출가능한 표지의 예로는 킬레이터, 광-활성제, 방사선 동위원소, 형광제, 상자성 이온, 또는 다른 마커 부분이 있다.

용어 "친화성 태그"는 제 2 폴리펩티드의 정제 또는 검출을 제공하거나, 또는 기질에 제 2 폴리펩티드의 부착을 위한 부위를 제공하기 위해서, 제 2 폴리펩티드에 부착될 수 있는 폴리펩티드 조각을 나타내는 것으로 본원에 사용된다. 원칙적으로, 항체나 다른 특이적 결합제가 이용될 수 있는 어떤 펩티드 또는 단백질이 친화성 태그로 사용될 수 있다. 친화성 태그는 폴리히스티딘 관, 단백질 A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol . 198:3(1991)), 글루타티온 S 전이효소(Smith and Johnson, Gene 67:31(1988)), Glu-Glu 친화성 태그(Grussenmeyer et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82:7952 (1985)), 기질 P, FLAG 펩티드(Hopp et al., Biotechnology 6:1204 (1988)), 스트렙토아비딘 결합 펩티드, 또는 다른 항원성 에피토프 또는 결합 도메인이 있다. 일반적으로, Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95(1991)을 참조한다. DNA 분자 코딩 친화성 태그는 상업적 공급처에서 구입할 수 있다(예를 들면, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

"네이키드 항체"는 항체 단편에 반대되는 전체 항체로서, 치료제와 콘쥬게이트되지 않는다.

본원에 사용된 용어 "항체 성분"은 전체 항체 및 항체 단편을 둘 다 포함한다.

"면역콘쥬게이트"는 항체 성분과 치료제 또는 검출가능한 표지의 콘쥬게이트이다.

본원에 사용된 용어 "항체 융합 단백질"은 항체 성분 및 IL-22RA 폴리펩티드 성분을 포함하는 재조합 분자를 말한다. 항체 융합 단백질의 예는 IL-22RA 세포외 도메인, 및 Fc 도메인 또는 항원-결합 영역을 포함하는 단백질을 포함한다.

"표적 폴리펩티드" 또는 "표적 펩티드"는 적어도 하나의 에피토프를 포함하고, 종양 세포, 또는 감염성 인자 항원을 지닌 세포 같은 표적 세포 상에서 발현된 아미노산 서열이다. T 세포는 주 조직적합성 복합체에 의하여 표적 폴리펩티드 또는 표적 펩티드에 제시된 펩티드 에피토프를 인식하고, 전형적으로 표적 세포를 용해하거나, 표적 세포의 부위에 다른 면역 세포를 동원하여 표적 세포를 죽인다.

"항원성 펩티드"는 주 조직적합성 복합체 분자에 결합하여, T 세포에 의하여 인식되는 MHC-펩티드 복합체를 형성하고, 이로써 T 세포에 제시될 때 세포독성 림프구 반응을 유도하는 펩티드이다. 따라서, 항원성 펩티드는 적합한 주 조직적합성 복합체 분자에 결합할 수 있으며, 항원에 결합하거나 항원을 발현하는 표적 세포에 대한 세포 용해 또는 특이적 사이토카인의 분비와 같은 세포독성 T 세포 반응을 유도할 수 있다. 항원성 펩티드는 항원 제시 세포 또는 표적 세포 상의, 제 I 형 또는 제 II 형 주 조직적합성 복합체 분자와 관련하여 결합될 수 있다.

진핵세포에서, RNA 중합효소 II는 구조 유전자의 전사를 촉매하여 mRNA를 생성한다. 핵산 분자는 RNA 전사체가 특정 mRNA의 서열에 상보적인 서열을 가진 RNA 중합효소 II 주형을 함유하도록 설계될 수 있다. RNA 전사체는 "항-센스 RNA"라고 말하고, 항-센스 RNA를 코딩하는 핵산 분자는 "항-센스 유전자"라고 말한다. 항-센스 RNA 분자는 mRNA 번역의 억제를 야기하는 mRNA 분자에 결합할 수 있다.

"IL-22RA 특이적 항-센스 올리고뉴클레오티드" 또는 "IL-22RA 항-센스 올리고뉴클레오티드"는 (a) IL-22RA 유전자의 일부분과 안정한 트리플렉스를 형성할 수 있거나, (b) IL-22RA 유전자의 mRNA 전사체의 일부분과 안정한 듀플렉스를 형성할 수 있는 서열을 가진 올리고뉴크레오티드이다.

"리보자임"은 촉매 중심을 함유한 핵산 분자이다. 이 용어는 RNA 효소, 자기-스플라이싱 RNA, 자기-절단 RNA, 및 촉매 기능을 수행하는 핵산 분자를 포함한다. 리보자임을 코딩하는 핵산 분자를 "리보자임 유전자"라고 한다.

"외부 안내 서열"은 내인성 리보자임인 RNase P를 특정 종의 세포내 mRNA로 인도하여 RNase P에 의한 mRNA의 절단을 일으키는 핵산 분자이다. 외부 안내 서열을 코딩하는 핵산 분자를 "외부 안내 서열 유전자"라고 한다.

용어 "변이체 IL-22RA 유전자"는 SEQ ID NO: 3의 변형인 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 말한다. 이러한 변이체는 IL-22RA 유전자의 자연적으로 발생하는 다형체들과, 뿐만 아니라 SEQ ID NO:3의 보존적 아미노산 치환을 함유하는 합성 유전자를 포함한다. IL-22RA 유전자의 추가 변이체 형태는 본원에 설명된 뉴클레오티드 서열의 삽입 또는 결실을 함유하는 핵산 분자이다. 변이체 IL-22RA 유전자는, 예를 들면 이 유전자가 긴축 조건 하에서 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자, 또는 그것의 보체와 혼성화하는지를 측정함으로써 확인될 수 있다.

대안적으로, 변이체 IL-22RA 유전자는 서열 비교에 의하여 확인될 수 있다. 최대한 일치되도록 정렬되었을 때 두 아미노산 서열의 아미노산 잔기가 동일하면 두 아미노산 서열은 "100% 아미노산 서열 동일성"을 가진다. 유사하게, 최대한 일치되도록 정렬되었을 때 두 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 잔기가 동일하면 두 뉴클레오티드 서열은 "100% 뉴클레오티드 서열 동일성"을 가진다. 서열 비교는 DNA STAR(Madison, Wisconsin)에 의해 제조된 LASERGENE 바이오인포메틱스 컴퓨팅 스위트에 포함된 것들과 같은 표준 소프트웨어 프로그램을 사용, 수행될 수 있다. 최적 정렬을 결정함으로써 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 비교하는 다른 방법도 당업자에게 공지되어 있다(예를 들면, Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research(ASM Press, Inc. 1997), Wu et al. (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins" in Methods in Gene Biotechnology, pp. 123-151(CRC Press, Inc. 1997), 및 Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc. 1998) 참조). 서열 동일성을 결정하기 위한 구체적 방법은 하기에 설명된다.

변이체 IL-22RA 유전자 또는 변이체 IL-22RA 폴리펩티드를 확인하는데 사용된 특정한 방법과 상관없이, 변이체 유전자에 의해 코딩된 변이체 유전자 또는 폴리펩티드는 항-IL-22RA 항체에 특이적으로 결합하는 능력으로 기능적으로 특성화될 수 있다. 변이체 IL-22RA 유전자 또는 변이체 IL-22RA 폴리펩티드는 또한, 본원에 설명된 생물학적 또는 생화학적 분석을 사용하여, 그것의 리간드, 즉 IL-22에 결합하는 능력으로 기능적으로 특성화될 수 있다.

용어 "대립형질 변이체"는 동일한 염색체 유전자좌를 차지하는 유전자의 두 개 이상의 다른 형태 중 어떤 것을 나타내는 것으로 본원에 사용된다. 대립형질 변이는 돌연변이를 통하여 자연적으로 발생하고, 집단 내에 표현형적 다형성을 야기할 수 있다. 유전자 돌연변이는 침묵할 수 할 수 있거나(또는 코딩된 폴리펩티드에 아무런 변화 없음) 또는 변경된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 용어 대립형질 변이체는 또한 유전자의 대립형질 변이체에 의하여 코딩된 단백질을 나타내는 것으로 본원에 사용된다.

용어 "오토로그(ortholog)"는 상이한 종으로부터의 폴리펩티드 또는 단백질의 기능적 대응물인 한 종으로부터 얻어진 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 오토로그 간의 서열 차이는 종분화의 결과이다.

"파라로그(paralog)"는 개체에 의하여 만들어진 구별되지만 구조적으로 연관된 단백질이다. 파라로그는 유전자 복제를 통하여 발생하는 것으로 믿어진다. 예를 들면, α-글로빈, β-글로빈, 및 미오글로빈은 서로의 파라로그이다.

본 발명은 IL-22RA 유전자의 기능적 단편을 포함한다. 본 발명의 문맥 내에서, IL-22RA 유전자의 "기능적 단편"은 본원에 설명된 도메인이거나 항-IL-22RA 항체와 적어도 특이적으로 결합하는 IL-22RA 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 핵산 분자를 말한다.

표준 분석 방법의 부정확성 때문에, 폴리머의 분자량 및 길이는 대략적 수치인 것으로 이해된다. 이러한 수치가 "약" X로 표현된 경우, X의 기록된 값은 ±10%까지 정확한 것으로 이해될 것이다.

3. IL-22RA 폴리뉴클레오티드 또는 유전자의 생성

사람 IL-22RA 유전자를 코딩하는 핵산 분자는 SEQ ID NO:1에 기초한 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하여 사람 cDNA 또는 유전체 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다. 이들 기술은 표준이므로 잘 확립되어 있으며, 상업적 공급처에서 구입가능한 클로닝 키트를 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들면, Ausubel et al.(eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3판, John Wiley & Sons 1995; Wu et al., Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc. 1997; Aviv and Leder, Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 69:1408 (1972); Huynh et al., "Constructing and Screening cDNA Libraries in λgt10 and λgt11", DNA Cloning: A Practical Approach Vol. 1, Glover(ed.), p. 49(IRL Press, 1985); Wu(1997) p. 47-52을 참조한다.

사람 IL-22RA 유전자를 코딩하는 핵산 분자는 또 IL-22RA 유전자 또는 cDNA의 뉴클레오티드 서열에 기초한 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 얻을 수 있다. PCR로 라이브러리를 스크리닝하는 일반적 방법은, 예를 들면 Yu et al., Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries, in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), Humana Press, Inc., 1993에 제공된다. 또한, PCR을 사용하여 관련 유전자를 분리하는 기술이, 예를 들면 Preston, Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members", in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), Humana Press, Inc. 1993에 설명된다. 대안적으로, IL-22RA 유전자는 본원에 설명된 서로 프라이밍하는 긴 올리고뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 서열을 사용하여 핵산 분자를 합성함으로써 얻어질 수 있다(예를 들면, Ausubel (1995) 참조). 중합효소 연쇄 반응을 사용하는 확립된 기술은 적어도 2 킬로염기 길이의 DNA 분자를 합성할 수 있다(Adang et al., Plant Molec . Biol . 21:1131(1993), Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266 (1993), Dillon et al., Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes", in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), p. 263-268(Humana Press, Inc. 1993), 및 Holowachuk et al., PCR Methods Appl . 4:299(1995)). 폴리뉴클레오티드 합성에 대한 검토는, 예를 들면 Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Appli -cations of Recombinant DNA(ASM Press 1994), Itakura et al. Annu .Rev. Biochem . 53:323(1984), 및 Climie et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 87:633(1990))을 참조한다.

4. IL-22RA 유전자 변이체의 생성

본 발명은 본원에 개시된 IL-22RA 폴리펩티드를 코딩하는, DNA 및 RNA 분자를 포함한 다양한 핵산 분자를 제공한다. 당업자는 유전암호의 축퇴성의 관점에서, 상당한 서열 변이가 이들 폴리뉴클레오티드 분자 간에 가능하다는 것을 쉽게 인식할 것이다. 더욱이, 본 발명은 또한 SEQ ID NO:3의 수용체 폴리펩티드에 실질적으로 상동성인 적어도 하나의 IL-22RA 수용체 하위단위체를 포함하는 분리된 가용성 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머 및 멀티머 수용체 폴리펩티드를 제공한다. 따라서, 본 발명은 SEQ ID NO:1의 축퇴성 뉴클레오티드를 포함하는 IL-22RA 폴리펩티드-코딩 핵산 분자, 및 이들의 RNA 등가물을 고찰한다.

표 1은 축퇴성 뉴클레오티드 위치를 나타내는 한 문자 코드를 제시한다. "분해능"은 코드 문자에 의해 표시되는 뉴클레오티드이다. "보체"는 상보적 뉴클레오티드(들)에 대한 코드를 나타낸다. 예를 들면, 코드 Y는 C 또는 T를 나타내고, 그것의 보체 R은 A 또는 G를 나타내며, A는 T에 상보적이고, G는 C에 상보적이다.

주어진 아미노산에 대한 모든 가능한 코돈을 포함하는 축퇴성 코돈을 표 2에 나타낸다.

당업자는 어떤 모호성이 아미노산을 코딩하는 모든 가능한 코돈을 대표하는 축퇴성 코돈을 결정하는데 도입된다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 어떤 상황에서, 세린의 축퇴성 코돈(WSN)은 아르기닌(AGR)을 코딩할 수 있고, 아르기닌의 축퇴성 코돈은 일부 상황에서 세린(AGY)을 코딩할 수 있다. 페닐알라닌 및 류신을 코딩하는 코돈 간에 유사한 관계가 존재한다. 따라서, 축퇴성 서열에 의해 포함된 어떤 폴리뉴클레오티드는 변이체 아미노산 서열을 코딩할 수 있으며, 당업자라면 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열에 관한 이러한 변이체 서열을 용이하게 확인할 수 있다. 변이체 서열은 본원에 설명된 바와 같이 기능성에 대해 용이하게 시험될 수 있다.

상이한 종들은 "우선적 코돈 사용"을 나타낼 수 있다. 일반적으로, 예를 들면, Grantham et al., Nucl . Acids Res. 8:1893 (1980), Haas et al. Curr . Biol . 6:315(1996), Wain-Hobson et al., Gene 13:355 (1981), Grosjean and Fiers, Gene 18:199(1982), Holm, Nuc . Acids Res. 14:3075(1986), Ikemura, J. Mol . Biol . 158: 573(1982), Sharp and Matassi, Curr . Opin . Genet. Dev . 4:851(1994), Kane, Curr . Opin. Biotechnol . 6:494(1995) 및 Makrides, Microbiol . Rev. 60:512(1996)을 참조한다. 본원에 사용된 용어 "우선적 코돈 사용" 또는 "우선적 코돈"은 특정한 종의 세포에서 가장 빈번하게 사용되며, 따라서 각 아미노산 서열을 코딩하는 가능한 코돈들 중에서 1개 또는 몇 개의 대표적인 것으로서 선호되는 단백질 번역 코돈을 말하는 당업계의 용어이다(표 2 참조). 예를 들면, 아미노산 트레오닌(Thr)은 ACA, ACC, ACG, 또는 ACT에 의하여 코딩될 수 있지만, 포유동물 세포에서는 ACC가 가장 흔하게 사용되는 코돈이고, 다른 종, 예를 들면 곤충 세포, 효모, 바이러스, 또는 박테리아에서는 다른 Thr 코돈이 우선적일 수 있다. 특정한 종에 대한 우선적 코돈이 당업계에 공지된 다양한 방법에 의하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있다. 우선적 코돈 서열을 재조합 DNA에 도입하는 것은, 예를 들면, 특정한 세포 유형 또는 종 내에서 단백질 번역을 더 효율적이게 함으로써 단백질의 생성을 증대시킬 수 있다. 따라서, 본원에 설명된 축퇴성 코돈 서열은 당업계에 흔히 사용되고 본원에 개시된 다양한 세포 유형 및 종에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 최적화하기 위한 주형으로 작용한다. 우선적 코돈을 함유한 서열을 시험하여 다양한 종에서의 발현에 대해 최적화할 수 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 기능성에 대해서 시험할 수 있다.

IL-22RA-코딩 cDNA는 다양한 방법, 예를 들면 완전한 또는 부분적 사람 cDNA 또는 개시된 서열에 기초한 축퇴성 프로브의 하나 이상의 세트로 프로빙함으로써 분리될 수 있다. 또한, 본원에 개시된 대표적 사람 IL-22RA 서열로부터 설계된 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄 반응을 하여 cDNA를 클로닝할 수 있다. 게다가, cDNA 라이브러리는 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염하는데 사용될 수 있으며, 관심 있는 cDNA의 발현은 IL-22RA 폴리펩티드의 항체를 이용, 검출될 수 있다.

당업자는 SEQ ID NO:1에 개시된 서열이 사람 IL-22RA의 단일 대립유전자를 나타내고, 대립형질 변이 및 대체 스플라이싱이 일어날 것으로 예상된다는 것을 인식할 것이다. 이 서열의 대립형질 변이체는 표준 과정에 따라서 상이한 개체들로부터의 cDNA 또는 유전체 라이브러리를 프로빙함으로써 클로닝될 수 있다. 침묵 돌연변이를 함유한 것들 및 돌연변이가 아미노산 서열 변화를 야기하는 것들을 포함한, 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열의 대립형질 변이체는 본 발명의 범주 내이며, 본원에 개시된 아미노산 서열의 대립형질 변이체인 단백질도 마찬가지이다. IL-22RA 폴리펩티드의 특성을 보유하는 다른 식으로 스플라이싱된 mRNA로부터 발생된 cDNA 분자도 본 발명의 범주 내에 포함되며, 이러한 cDNA 및 mRNA에 의하여 코딩된 폴리펩티드도 마찬가지이다. 이들 서열의 대립형질 변이체 및 스플라이스 변이체는 당업계에 공지된 표준 과정에 따라서 상이한 개체들 또는 조직들로부터의 cDNA 또는 유전체 라이브러리를 프로빙함으로써 클로닝될 수 있다.

상기 논의된 방법을 사용하여, 당업자는 SEQ ID NO:1에 실질적으로 상동성이거나, SEQ ID NO:3의 아미노산을 코딩하는 가용성 IL-22RA 수용체 하위단위체, 또는 그것의 대립형질 변이체를 포함하고, 야생형 IL-22RA 수용체의 리간드-결합 특성을 보유하는 다양한 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 또한 본원에 일반적으로 개시된 추가 폴리펩티드 조각을 포함할 수 있다.

본 발명의 어떤 구체예 내에서, 분리된 핵산 분자는 긴축 조건 하에서 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 혼성화할 수 있다. 예를 들면, 이러한 핵산 분자는 긴축 조건 하에서, SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는 SEQ ID NO:1에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는 그들의 단편과 혼성화할 수 있다.

대체로, 긴축 조건은 한정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 가열 녹는점(Tm) 보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은 표적 서열의 50%가 완전히 일치된 프로브에 혼성화되는 온도이다(한정된 이온 강도 및 pH 하에). 혼성화 후, 핵산 분자는 긴축 조건 하에서 또는 고도로 긴축 조건 하에서, 비혼성화된 핵산 분자를 제거하기 위하여 세척될 수 있다. 예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition(Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); 및 Wetmur, Crit . Rev. Biochem . Mol . Biol . 26:227 (1990)를 참조한다. OLIGO 6.0(LSR; Long Lake, MN)와 Primer Premier 4.0(Premier Biosoft International; Palo Alto, CA) 같은 서열 분석 소프트웨어 및 인터넷상의 사이트가 주어진 서열을 분석하고 사용자 정의된 기준에 기반한 Tm을 계산하기 위해 이용할 수 있는 도구이다. 혼성화 및 특정 폴리뉴클레오티드 하이브리드에 사용하기 위한 세척 조건을 적합화하는 것은 당업자의 능력 내에 있다.

또한, 본 발명은 SEQ ID NO:3의 폴리펩티드에 대해 실질적으로 유사한 서열 동일성을 가진 분리된 IL-22RA 폴리펩티드, 또는 그 오토로그를 제공한다. 용어 "실질적으로 유사한 서열 동일성"은 SEQ ID NO:3에 나타낸 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 예를 들어 96%, 97%, 88%, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 가진 폴리펩티드, 또는 그 오토로그를 나타내는 것으로 본원에 사용된다. 예를 들면, 변이체 및 오토로그 IL-22RA 수용체는 면역반응을 발생시키고 사람 IL-22RA에 대한 교차반응성 항체를 일으키는 데 사용될 수 있다. 이러한 항체는 사람화되고, 본원에 설명된 대로 변형될 수 있으며, 건선, 건선성 관절염, IBD, 결장염, 내독소혈증을 치료하기 위해서 뿐만 아니라 본원에 설명된 다른 치료학적 용도에서 치료학적으로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 두 기준, 즉 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열로 코딩된 폴리펩티드 간 유사성의 결정, 및 혼성화 분석을 사용하여 확인될 수 있는 IL-22RA 변이체 핵산 분자를 고찰한다. 이러한 IL-22RA 변이체는 (1) 세척 긴축도가 55-65℃에서 0.1% SDS가 들은 0.5x - 2x SSC와 동등한 긴축 세척 조건 하에서, SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열(또는 그것의 보체)를 가진 핵산 분자와 혼성화를 유지하고, (2) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 95% 이상, 예를 들어 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 또는, IL-22RA 변이체는 (1) 세척 긴축도가 50-65℃에서 0.1% SDS가 들은 0.1x - 2x SSC와 동등한 고도 긴축 세척 조건 하에서, SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열(또는 그것의 보체)를 가진 핵산 분자와의 혼성화를 유지하고, (2) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 95% 이상, 예를 들어 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로서 특성화될 수 있다.

서열 동일성 퍼센트는 종래의 방법에 의하여 결정된다. 예를 들면, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603(1986), 및 Henikoff and Henikoff, Proc . Natl . Acad. Sci . USA 89:10915(1992)을 참조한다. 간단히 말하면, 두 아미노산 서열은 표 3에 나타낸 바와 같이 10의 갭 개방 벌점, 1의 갭 연장 벌점, 및 Henikoff and Henicoff(동일한 문헌)의 "BLOSUM62" 채점 매트릭스를 사용하여 정렬 점수가 최적화되도록 배열된다(아미노산은 표준 한 문자 코드로 표시된다). 그 다음 동일성 퍼센트는 다음과 같이 계산된다: ([동일한 일치의 전체 수]/[더 긴 서열의 길이 + 두 서열을 정렬하기 위하여 더 긴 서열에 도입된 갭의 수])(100).

당업자는 두 아미노산 서열을 정렬하는데 이용가능한 많은 확립된 알고리즘이 있다는 것을 알고 있다. Pearson 및 Lipman의 "FASTA" 유사성 검색 알고리즘은 본원에 개시된 아미노산 서열과 후보 IL-22RA 변이체의 아미노산 서열에 의해 공유된 동일성의 수준을 조사하기 위한 적합한 단백질 정렬 방법이다. FASTA 알고리즘은 Pearson and Lipman, Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 85:2444(1988), 및 Pearson, Meth. Enzymol . 183:63 (1990))에서 설명된다. 간단히 말하면, FASTA는 먼저 쿼리 서열(예를 들면, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3)과, 보존적 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 고려하지 않은, 가장 고밀도의 동일성(ktup 변수가 1인 경우) 또는 동일성의 쌍(ktup = 2인 경우)을 가진 시험 서열에 의해 공유된 영역을 확인함으로써 서열을 특성화한다. 그 후 아미노산 치환 매트릭스를 이용하여 모든 쌍을 이룬 아미노산의 유사성을 비교함으로써 가장 고밀도를 가진 10개 영역을 재채점하고, 이 영역들의 단부를 가장 높은 점수에 기여한 잔기들만 포함하도록 "손질"한다. 그 후 (서열 길이 및 ktup 값에 기초하여 사전 결정된 공식으로 계산된) "컷오프" 값보다 큰 수치를 가진 일부 영역이 있는 경우, 손질된 시작 영역은 그 영역이 갭과 대략적인 정렬을 이루도록 결합될 수 있는지를 결정하기 위하여 조사된다. 마지막으로, 두 아미노산 서열의 최고점 영역이 Needleman-Wunsch-Sellers 알고리즘(Needleman and Wunsch, J. Mol . Biol . 48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl . Math. 26:787 (1974))의 변형을 사용하여 정렬되고, 이것이 아미노산 삽입 및 결실을 허용한다. FASTA 분석의 예시적 매개변수는 다음과 같다: ktup=1, 갭 공개 벌점=10, 갭 연장 벌점=1, 및 치환 매트릭스=BLOSUM62. 이들 매개변수는 Pearson, Meth . Enzymol . 183:63 (1990))의 부록 2에 설명된 채점 매트릭스 파일("SMATRIX")을 수정함으로써 FASTA 프로그램에 도입될 수 있다.

FASTA는 또한 상기에 개시된 비율을 사용하여 핵산 분자의 서열 동일성을 결정하는데 사용될 수 있다. 뉴클레오티드 서열 비교를 위하여, ktup 값은 전술한 다른 매개변수 세트와 함께 1 내지 6, 바람직하게는 3 내지 6, 가장 바람직하게는 3의 범위일 수 있다.

본 발명은 본원에 개시된 아미노산 서열과 비교하여 보존적 아미노산 변화를 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 예를 들면, SEQ ID NO:3의 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하는 변이체가 얻어질 수 있는데, 여기서 IL-22RA 아미노산 서열에 있는 알킬 아미노산을 알킬 아미노산으로 치환하거나, IL-22RA 아미노산 서열에 있는 방향족 아미노산을 방향족 아미노산으로 치환하거나, IL-22RA 아미노산 서열에 있는 황 함유 아미노산을 황 함유 아미노산으로 치환하거나, IL-22RA 아미노산 서열에 있는 히드록시 함유 아미노산을 히드록시 아미노산으로 치환하거나, IL-22RA 아미노산 서열에 있는 산성 아미노산을 산성 아미노산으로 치환하거나, IL-22RA 아미노산 서열에 있는 염기성 아미노산을 염기성 아미노산으로 치환하거나, 또는 IL-22RA 아미노산 서열에 있는 2염기성 모노카르복실 아미노산을 2염기성 모노카르복실 아미노산으로 치환한다. 공통된 아미노산 중에서, 예를 들면 "보존적 아미노산 치환"은 다음의 각 그룹에 내에서의 아미노산 간 치환으로 설명된다: (1) 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신, (2) 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판, (3) 세린 및 트레오닌, (4) 아스파르트산 및 글루탐산, (5) 글루타민 및 아스파라긴, 및 (6) 리신, 아르기닌 및 히스티딘. BLOSUM62 표는 관련 단백질 중에서 500개 이상의 그룹의 고도로 보존된 영역을 나타내는, 단백질 서열 조각의 약 2,000개의 국소 다중 정렬로부터 유래된 아미노산 치환 매트릭스이다(Henikoff and Henikoff, Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 89:10915 (1992)). 따라서, BLOSUM62 치환 빈도는 본 발명의 아미노산 서열 내에 도입될 수 있는 보존적 아미노산 치환을 정의하는데 사용될 수 있다. 오로지 (전술한 바와 같은) 화학적 특성에만 기초한 아미노산 치환을 설계하는 것이 가능하며, 용어 "보존적 아미노산 치환"은 바람직하게는 -1 이상의 BLOSUM62 값으로 표시되는 치환을 말한다. 예를 들면, 아미노산 치환은 그 치환이 0, 1, 2, 또는 3의 BLOSUM62 값을 특징으로 하는 경우 보존적이다. 이 시스템에 의하면, 바람직한 보존적 아미노산 치환은 1 이상(예를 들면, 1, 2 또는 3)의 BLOSUM62 값을 특징으로 하고, 더욱 바람직한 아미노산 치환은 2 이상(예를 들면, 2 또는 3)의 BLOSUM62 값을 특징으로 한다. IL-22RA의 특정 변이체는 상응하는 아미노산 서열(예를 들면, SEQ ID NO:3)에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 95% 이상, 예를 들면 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 가진 것을 특징으로 하며, 아미노산 서열의 변이는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 기인한다.

IL-22RA 유전자에서 보존적 아미노산 변화는, 예를 들면 SEQ ID NO:1에 있는 뉴클레오티드 대신 뉴클레오티드를 치환함으로써 도입될 수 있다. 이러한 "보존적 아미노산" 변이체는 올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이생성, 링커-스캐닝 돌연변이생성, 중합효소 연쇄 반응 등을 사용하여 돌연변이생성을 행함으로써 얻어질 수 있다(Ausubel(1995); McPherson(ed.), Directed Mutagenesis : A Practical Approach (IRL Press 1991)). 변이체 IL-22RA 폴리펩티드는 항-IL-22RA 항체에 특이적으로 결합하는 능력에 의하여 확인될 수 있다.

본 발명의 단백질은 또한 비자연적으로 발생한 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 비자연적으로 발생한 아미노산은, 한정하는 것은 아니지만, trans-3-메틸프롤린, 2,4-메타노프롤린, cis-4-히드록시프롤린, trans-4-히드록시프롤린, N-메틸글리신, allo-트레오닌, 메틸트레오닌, 히드록시에틸시스테인, 히드록시에틸호모시스테인, 니트로글루타민, 호모글루타민, 피페코린산, 티아졸리딘 카르복시산, 디히드로프롤린, 3- 및 4-메틸프롤린, 3,3-디메틸프롤린, tert-류신, 노르발린, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌 및 4-프루오로페닐알라닌을 포함한다. 비자연적으로 발생한 아미노산 잔기를 단백질에 혼입하기 위한 일부 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 넌센스 돌연변이가 화학적으로 아미노아실화된 억제자 tRNA를 사용하여 억제되는 시험관내 시스템이 도입될 수 있다. 아미노산을 합성하고 tRNA를 아미노아실화하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 넌센스 돌연변이를 함유한 플라스미드의 전사 및 번역은 전형적으로 대장균 S30 추출물 및 상업적으로 이용가능한 효소 및 다른 시약을 포함한 무세포 시스템에서 수행된다. 단백질은 크로마토그래피로 정제한다. 예를 들면, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc . 113:2722 (1991), Ellman et al., Methods Enzymol . 202:301 (1991), Chung et al., Science 259:806 (1993), 및 Chung et al., Proc . Natl Acad . Sci . USA 90:10145 (1993))을 참조한다.

두 번째 방법에서, 번역은 Xenopus 난모세포에서 돌연변이된 mRNA와 화학적으로 아미노아실화된 억제자 tRNA를 미세주입함으로써 수행된다(Turcatti et al., J. Biol . Chem . 271:19991(1996)). 세 번째 방법에서는, 대장균 세포가 치환된 자연적 아미노산(예를 들면, 페닐알라닌)의 부재하에 그리고 원하는 비자연적으로 발생하는 아미노산(들)(예를 들면, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌, 또는 4-플루오로페닐알라닌)의 존재하에 배양된다. 비자연적으로 발생하는 아미노산은 그것의 자연적인 대응물 대신에 단백질에 혼입된다. Koide et al., Biochem. 33:7470 (1994)을 참조한다. 자연적으로 발생하는 아미노산 잔기는 시험관내 화학적 변형에 의하여 비자연적으로 발생하는 종으로 변환될 수 있다. 화학적 변형은 위치지정 돌연변이유발과 조합되어 치환의 범위를 더 확장할 수 있다(Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395 (1993)).

IL-22RA 아미노산 잔기를 한정된 수의 비보존적 아미노산, 유전 암호에 의하여 코딩되지 않는 아미노산, 비자연적으로 발생하는 아미노산, 및 비자연적인 아미노산으로 치환할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 중의 필수적 아미노산은 당업계에 공지된 과정, 예를 들면 위치지정 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발에 따라서 확인될 수 있다(Cunningham and Wells, Science 244:1081 (1989), Bass et al., Proc . Nat'l Acad. Sci . USA 88:4498 (1991), Coombs and Corey, "Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering", in Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), p. 259-311(Academic Press, Inc. 1998)). 후자의 기술에서, 단일 알라닌 돌연변이는 분자의 모든 잔기에 도입되고, 생성된 돌연변이 분자는 분자의 활성에 결정적인 아미노산 잔기를 확인하기 위하여 생물학적 활성을 시험할 수 있다. 또한, Hilton et al., J. Biol . Chem . 271:4699(1996)을 참조한다.

서열 분석이 IL-22RA 리간드 결합 영역을 더 규명하는 데 사용될 수 있지만, IL-22RA 결합 활성(예를 들면 IL-22RA과 리간드 IL-22 또는 항-IL-22RA 항체의 결합)에 중요한 역할을 하는 아미노산은 또한 후보 접촉 부위 아미노산의 돌연변이와 함께 핵자기공명, 전자회절 또는 광친화성 표지와 같은 기술에 의해 측정되는 물리적 구조 분석에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, de Vos et al., Science 255:306 (1992), Smith et al., J. Mol . Biol . 224:899 (1992), 및 Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59 (1992)을 참조한다.

다중 아미노산 치환은 Reidhaar-Olson 및 Sauer(Science 241:53(1988)) 또는 Bowie 및 Sauer(Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 86:2152(1989))에 의하여 개시된 것들과 같은, 돌연변이유발 및 스크리닝과 같은 공지된 방법을 사용하여 수행되고 시험될 수 있다. 간단히 말하면, 이들 저자들은 폴리펩티드 중의 두 개 이상의 위치를 동시에 무작위로 고르고, 기능성 폴리펩티드에 대하여 선택한 후, 돌연변이화된 폴리펩티드를 서열화하여 각 위치에서 허용되는 치환의 스펙트럼을 결정한다. 사용가능한 다른 방법은 파지 디스플레이(예를 들면, Lowman et al., Biochem . 30:10832 (1991), Ladner et al., 미국 특허 제5,223,409호, Huse, 국제 공보 WO 92/06204), 및 영역지정 돌연변이유발(Derbyshire et al., Gene 46:145(1986), 및 Ner et al., DNA 7:127, (1988))을 포함한다. 더욱이, 비오틴 또는 FITC로 표지된 IL-22RA은 IL-22RA 리간드의 클로닝을 발현시키는 데 사용될 수 있다.

개시된 IL-22RA 뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열 변이체는 Stemmer, Nature 370:389(1994), Stemmer, Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 91:10747(1994), 및 국제공보 WO 97/20078에 개시된 DNA 셔플링을 통하여 발생될 수 있다. 간단히 말하면, 변이체 DNA 분자는 모 DNA의 무작위 졀편화에 의한 시험관내 상동 재조합, 이어서 무작위로 도입된 점 돌연변이를 야기하는 PCR을 사용한 재조립에 의해 발생된다. 이 기술은 그 과정에 추가 변이성을 도입하기 위하여 다른 종으로부터의 대립형질 변이체 또는 DNA 분자와 같은 모 DNA 분자의 패밀리를 사용함으로써 변형될 수 있다. 원하는 활성을 선택 또는 스크리닝, 이어서 돌연변이유발 및 분석의 추가적 반복은 동시에 불리한 변화에 대하여 선택하면서 바람직한 돌연변이에 대하여 선택함으로써 서열의 빠른 "진화"를 제공한다.

본원에 개시된 돌연변이유발 방법은 숙주 세포에서 클로닝된, 돌연변이화된 폴리펩티드의 활성을 검출하기 위하여 대용량처리, 자동화된 스크리닝 방법과 조합될 수 있다. 생물학적 활성의 폴리펩티드, 또는 항-IL-22RA 항체와 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 돌연변이화된 DNA 분자를 숙주 세포로부터 회수할 수 있고, 현대적 장치를 사용하여 신속하게 서열화할 수 있다. 이들 방법은 관심대상의 폴리펩티드에 있는 각각의 아미노산 잔기의 중요성을 신속하게 결정하게 해주고, 미지의 구조의 폴리펩티드에 적용할 수 있다.

본 발명은 또한 IL-22RA 폴리펩티ㄷ의 "기능성 단편" 및 이러한 기능성 단편을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 핵산 분자의 일반적인 분석은 IL-22RA 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 기능성 단편을 얻기 위하여 수행될 수 있다. 실례로서, SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA 분자를 Bal31 뉴클레아제로 분해하여 일련의 네스티드 결실을 얻을 수 있다. 그 후 단편을 적합한 리딩 프레임으로 발현 벡터에 삽입하고, 발현된 폴리펩티드를 분리하여 항-IL-22RA 항체와 결합하는 능력에 대하여 시험하였다. 엑소뉴클레아제 분해에 대한 한 대안적 방법은 올리고뉴클레오티드-유도된 돌연변이유발을 사용하여 결실 또는 원하는 단편의 생성에 조건으로서 지정한 종결 코돈을 도입하는 것이다. 대안적으로, IL-22RA 유전자의 특정 단편은 중합효소 연쇄반응을 사용하여 합성될 수 있다.

이 일반적인 접근법으로는 Horisberger and Di Marco, Pharmac . Ther . 66:507 (1995)에 요약되어 있는 인터페론의 한쪽 말단 또는 두 말단에서의 절단에 관한 연구가 좋은 예가 된다. 또한, 단백질의 기능적 분석에 대한 표준기술은, 예를 들면 Treuter et al., Molec . Gen. Genet. 240:113(1993), Content et al., "Expression and preliminary deletion analysis of the 42kDa 2-5A synthetase induced by human interferon", in Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR - TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), p. 65-72(Nijhoff 1987), Hersch- man, "The EGF Receptor", in Control of Animal Cell Proliferation, Vol. 1, Boynton et al.,(eds.) p. 169-199(Academic Press 1985), Coumailleau et al., J. Biol. Chem . 270:29270(1995); Fukunaga et al., J. Biol . Chem . 270:25291(1995); Yamaguchi et al., Biochem . Pharmacol . 50:1295(1995), 및 Meisel et al., Plant Molec. Biol . 30:1(1996)에 설명된다.

본원에 개시된 특정 서열의 분석은 표 4에 제시된 예시적인 기능성 단편들의 세트를 제공한다. 표 4에 나타내지는 않지만, 본원에 개시된 추가의 사람 IL-22RA 기능적 변이체 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 SEQ ID NO:1을 참조하여 결정될 수 있다. 이러한 기능성 단편은, 예를 들어 SEQ ID NO:의 다음 뉴클레오티드 서열: SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 85-381, 206-717, 및 85-717, 및 SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3에 각각 나타낸 이에 의해 코딩된 상응하는 아미노산 서열을 포함한다.

또한, 본 발명은 본원에 개시된 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 변화를 가진 IL-22RA 유전자의 기능성 단편을 고찰한다. 변이체 IL-22RA 유전자는 상기 논의된 대로, 개시된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열과의 동일성의 수준을 결정함으로써 구조에 기초하여 확인될 수 있다. 구조에 기초하여 변이체 유전자를 확인하는 다른 접근법은 잠재적 변이체 IL-22RA 유전자를 코딩하는 핵산 분자가 SEQ ID NO:1과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자와 혼성화할 수 있는지를 결정하는 것이다.

본 발명은 또한 IL-22RA 폴리펩티드의 기능성 단편, 항원성 에피토프, IL-22RA 폴리펩티드의 에피토프-보유 부분, 및 이러한 기능성 단편, 항원성 에피토프, IL-22RA 폴리펩티드의 에피토프-보유 부분을 코딩하는 핵산 분자를 사용하는 것을 포함한다. 이러한 단편을 사용하여 IL-22 활성 또는 IL-20과 IL-22 모두의 활성과 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 항체와 결합 파트너를 생성하는데 사용되는 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 본원에 정의된 "기능성" IL-22RA 폴리펩티드 또는 그것의 단편은 IL-20 또는 IL-22 염증성, 증식성 또는 분화 활성을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 그것의 능력, 특수화된 세포 기능을 유도 또는 억제하는 그것의 능력, 또는 항-IL-22RA 항체, 세포, 또는 IL-20 또는 IL22에 특이적으로 결합하는 그것의 능력을 특징으로 한다. 본원에 이미 설명된 대로, IL-22RA는 본원에 설명된 II형 사이토카인 수용체 구조 및 도메인을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명은 (a) 전술한 도메인들 중 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드 분자; 및 (b) 이들 도메인들 중 하나 이상을 포함하는 기능성 단편을 포함한 융합 단백질을 사용하는 것을 더 고찰한다. 융합 단백질의 나머지 폴리펩티드 부분은 또 다른 II형 사이토카인 수용체, 예를 들어 IL-10R, IL-13R, IL-20RA, IL-20RB, IL-10RB(CRF2-4), IL-22RA2에 의해서, 또는 융합 단백질의 분비를 촉진하는 비-천연 및/또는 관련되지 않은 분비성 신호 펩티드에 의하여 기여될 될 수 있다.

본 발명은 또한 본원에 설명된 IL-22RA 폴리펩티드의 에피토프 보유 부분을 포함하는 폴리펩티드 단편 또는 펩티드를 제공한다. 이러한 단편 또는 펩티드는 전체 단백질이 면역원으로 사용될 때 항체 반응을 유도하는 단백질의 부분인 "면역원성 에피토프"를 포함할 수 있다. 면역원성 에피토프 보유 펩티드는 표준 방법을 사용하여 확인될 수 있다(예를 들면, Geysen et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 81:3998(1983) 참조).

반대로, 폴리펩티드 단편 또는 펩티드는 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역인 "항원성 에피토프"을 포함할 수 있다. 어떤 에피토프는 아미노산의 선형 또는 연속 스트레치로 구성되고, 이러한 에피토프의 항원성은 변성제에 의하여 파괴되지 않는다. 단백질의 에피토프를 모방할 수 있는 상대적으로 짧은 합성 펩티드는 단백질에 대한 항체의 생산을 촉진하는데 사용될 수 있는 것으로 당업계에 공지되어 있다(예를 들면, Sutcliffe et al., Science 219:660(1983) 참조). 따라서, 항원성 에피토프 보유 펩티드, 항원성 펩티드, 에피토프, 및 본 발명의 폴리펩티드는 본원에 설명된 폴리펩티드와 결합하는 항체를 유도하는 것뿐만 아니라 중화하고, IL-22 및 IL-20의 활성을 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화할 수 있는 항-IL-22RA 모노클로날 항체를 확인하고 스크린하는 데 유용하다. 본 발명의 이러한 중화 모노클로날 항체는 IL-22RA 항원성 에피토프에 결합할 수 있다. Hopp/Woods 친수성 프로파일은 SEQ ID NO:3 내에서 가장 큰 항원성 잠재력을 가진 영역을 결정하는데 사용될 수 있다(Hopp et al., Proc . Natl . Acad . Sci .78:3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun . Meth . 88:1-18, 1986 및 Triquier et al., Protein Engineering 11:153-169, 1998). 프로파일은 슬라이딩 6-잔기 윈도우에 기초한다. 감춰진 G, S 및 T 잔기와 노출된 H, Y 및 W 잔기는 무시되었다. IL-22RA에서 이들 영역은 당업자에 의하여 결정될 수 있다. 더욱이, 예를 들면 DNASTAR 다양성 프로그램(DNASTAR, Inc., Madison, WI)을 사용하여 Jameson-Wolf 플롯에 의하여 예측된 SEQ ID NO:3 내의 IL-22RA 항원성 에피토프 바람직한 항원성 에피토프로 사용되며, 당업자에 의하여 결정될 수 있다. 이러한 항원성 에피토프는 (1) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 1(Pro)에서 6(Asp); (2) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 26(Ser)에서 32 (Pro); (3) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 41(Lys)에서 47(Asp); (4) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 49(Val)에서 62(Cys); (5) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 41(Lys)에서 62(Cys); (6) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 84(Ala)에서 97(Ser); (7) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 103(Thr)에서 108(Asp); (8) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 130(Arg)에서 135(His); (9) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 164(Gly)에서 166(Lys); (10) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 175(Tyr)에서 179(Glu); (11) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 193(Lys)에서 196(Ala); (12) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 203(Lys)에서 209(Thr)를 포함한다. 추가의 에피토프는 CnBr로 절단된 비-환원성 전장 사람 IL-22RA로부터 잠재적으로 발생되는 다음과 같은 펩티드를 포함한다: 펩티드 6(SEQ ID NO:56), 펩티드 7(SEQ ID NO:57); 펩티드 8(SEQ ID NO:58); 펩티드 9(SEQ ID NO:59); 펩티드 10(SEQ ID NO:60); 및 펩티드 11(SEQ ID NO:61). 시스테인은 이황화 결합되며, 그 결과 펩티드 7(SEQ ID NO:57)과 10(SEQ ID NO:60) 사이에 가능한 연결을 만든다. 구체적으로, SEQ DD NO:56는 SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 1(Pro)에서 92(Met)에 상응하고; SEQ DD NO:57은 SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 93(Thr)에서 120(Met)에 상응하고; SEQ DD NO:58은 SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 121(Ile)에서 160(Met)에 상응하고; SEQ DD NO:59는 SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 161(His)에서 185(Met)에 상응하고; SEQ DD NO:60은 SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 186(Ile)에서 199(Met)에 상응하고; SEQ DD NO:61은 SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 200(Cys)에서 211(Thr)에 상응한다. 추가하여, 리간드-수용체 결합에 중요한 SEQ ID NO:2의 잔기(및 SEQ ID NO:3의 상응하는 잔기)는 SEQ ID NO:2의 Tyr-60, 및 Phe-164, Tyr-93, Arg-112, Lys-210, 및 Glu-211(및 SEQ ID NO:3의 상응하는 잔기)를 포함한다. 더욱이, 리간드-수용체 결합을 지시하는데 중요한 SEQ ID NO:2의 1차 잔기(및 SEQ ID NO:3의 상응하는 잔기)는 SEQ ID NO:2의 Tyr-60, 및 Phe-164(및 SEQ ID NO:3의 상응하는 잔기)를 포함하고, 2차 잔기는 SEQ ID NO:2의 잔기 Tyr-93, Arg-112, Lys -210, 및 Glu-211(및 SEQ ID NO:3의 상응하는 잔기)를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 중화 항체와 결합하는 항원성 에피토프는, 예를 들어 IL-22RA 및 IL-20 또는 IL-22(개별적으로 또는 함께)와의 리간드-수용체 결합에 중요한 SEQ ID NO:2의 잔기(및 SEQ ID NO:3의 상응하는 잔기)를 함유할 것이다.

항원성 에피토프-보유 펩티드 및 폴리펩티드는 본원에 개시된 아미노산 서열 중 적어도 4 내지 10 아미노산, 적어도 10 내지 15 아미노산, 또는 약 15 내지 약 30 아미노산을 함유할 수 있다. 이러한 에피토프-보유 펩티드 및 폴리펩티드는 본원에 설명한 대로 IL-22RA 폴리펩티드를 단편으로 분해함으로써 또는 화학적 펩티드 합성에 의하여 생성될 수 있다. 더욱이, 에피토프는 무작위 펩티드 라이브러리의 파지 디스플레이에 의하여 선택될 수 있다(예를 들면, Lane and Stephen, Curr . Opin. Immunol . 5:268 (1993) 및 Cortese et al., Curr . Opin . Biotechnol . 7:616 (1996)) 참조). 에피토프를 확인하고 에피토프를 포함하는 작은 펩티드로부터 항체를 생산하기 위한 표준 방법은, 예를 들면 Mole, "Epitope Mapping", in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson(ed.), p. 105-116(The Humana Press, Inc. 1992), Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), p. 60-84(Cambridge University Press 1995), 및 Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, p. 9.3.1 - 9.3.5 및 페이지 9.4.1 - 9.4.11(John Wiley & Sons 1997))에 설명된다.

변이체 및 융합 단백질을 포함한, 어떤 IL-22RA 폴리펩티드에 대해서, 당업자는 상기 표 1 및 2에 나타낸 정보를 사용하여 그 변이체를 코딩하는 완전히 변성된 폴리뉴클레오티드 서열을 용이하게 발생시킬 수 있다. 또한, 당업자는 표준 소프트웨어를 사용, 본원에 설명된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 기초한 IL-22RA 변이체를 고안해 낼 수 있다.

5. IL-22RA 폴리펩티드의 생성

전장 폴리펩티드; 가용성 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머 및 멀티머 수용체; 전장 수용체; 수용체 단편(예를 들면, 리간드-결합 단편 및 항원성 에피토프), 기능성 단편, 및 융합 단백질을 포함하는, 본 발명의 폴리펩티드는 종래의 기술을 사용하여 재조합 숙주 세포에서 생성될 수 있다. IL-22RA 유전자를 발현시키기 위하여, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 발현 벡터에서 전사 발현을 제어하는 조절 서열에 작동가능하게 결합되고, 그 다음 숙주 세포 내로 도입되어야 한다. 프로모터 및 인핸서와 같은 전사 조절 서열뿐만 아니라, 발현 벡터는 발현 벡터를 운반하는 세포의 선택에 적합한 번역 조절 서열 및 마커 유전자를 포함할 수 있다.

진핵세포에서 외래 단백질의 생산에 적합한 발현 벡터는 전형적으로 (1) 박테리아 숙주에서 발현 벡터의 성장 및 선택을 제공하는 박테리아 복제 기점 및 항생제 내성 마커를 코딩하는 원핵 DNA 요소; (2) 프로모터와 같은 전사의 개시를 제어하는 진핵 DNA 요소; 및 (3) 전사 종결/폴리아데닐화 서열과 같은 전사체의 가공을 제어하는 DNA 요소를 함유한다. 상기에 논의된 대로, 발현 벡터는 또한 이종 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로로 안내하는 분비성 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, IL-22RA 발현 벡터는 IL-22RA 유전자 및 어떤 분비된 유전자로부터 유래된 분비성 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 IL-22RA 단백질은 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포의 예는, 아프리카 녹색 원숭이 신장세포(Vero; ATCC CRL 1587), 사람 배아 신장세포(293-HEK; ATCC CRL 1573), 새끼 햄스터 신장세포(BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), 개 신장세포(MDCK; ATCC CCL 34), 중국 햄스터 난소세포(CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44(Chasin et al., Som . Cell. Molec . Genet. 12:555, 1986)), 레트 뇌하수체 세포(GH1; ATCC CCL82), HeLa S3 세포(ATCC CCL2.2), 레트 간세포(H-4-II-E; ATCC CRL 1548) SV40-형질전환된 원숭이 신장세포 (COS-1; ATCC CRL 1650) 및 쥐과 배아세포(NIH-3T3; ATCC CRL 1658)를 포함한다.

포유동물 숙주에 대해서, 전사 및 번역 조절 신호는 포유동물 바이러스 공급원, 예를 들면 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 유인원 바이러스 등에서 유래할 수 있고, 이 조절 신호는 고 수준의 발현을 하는 특정 유전자와 연관된다. 또한, 적합한 전사 및 번역 조절 신호는 포유동물 유전자, 예를 들면 액틴, 콜라겐, 미오신, 및 메탈로티오네인 유전자에서 얻을 수 있다.

전사 조절 서열은 RNA 합성 개시를 지시하기에 충분한 프로모터 영역을 포함한다. 적합한 진핵 프로모터는 마우스 메탈로티오네인 I 유전자의 프로모터(Hamer et al., J. Molec . Appl . Genet. 1:273 (1982)), 헤르페스 바이러스의 TK 프로모터(McKnight, Cell 31:355 (1982)), SV40 초기 프로모터(Benoist et al., Nature 290:304 (1981)), Rous 육종 바이러스 프로모터(Gorman et al., Proc . Nat'l Acad . Sci. USA 79:6777 (1982)), 사이토메갈로바이러스 프로모터(Foecking et al., Gene 45:101 (1980)), 및 마우스 유선 종양 바이러스 프로모터(일반적으로 Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture", in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), p. 163-181(John Wiley & Sons, Inc. 1996) 참조)를 포함한다.

대안적으로, 원핵 프로모터, 예를 들면 박테리오파지 T3 RNA 중합효소 프로모터는 그 원핵 프로모터가 진핵 프로모터에 의하여 조절된다면 포유동물 세포에서 IL-22RA 유전자 발현을 조절하는데 사용될 수 있다(Zhou et al., Mol . Cell. Biol . 10:4529(1990), 및 Kaufman et al., Nucl . Acids Res. 19:4485(1991)).

어떤 구체예에서, IL-22RA 가용성 수용체 폴리펩티드 또는 IL-22RA 폴리펩티드의 단편을 코딩하는 DNA 서열은 일반적으로 발현 벡터 내에 전사 프로모터 및 종결자를 포함한 그것의 발현에 필요한 다른 유전 인자에 작동가능하게 연결된다. 당업자는 어떤 시스템 내에서 선택가능한 마커가 별개의 벡터에 제공될 수 있고, 외인성 DNA의 복제가 숙주 세포 게놈 내에 통합됨으로써 제공될 수 있다는 것을 인식하겠지만, 벡터는 또한 공통적으로 하나 이상의 선택가능한 마커 및 하나 이상의 복제 기점을 함유할 것이다. 프로모터, 종결자, 선택가능한 마커, 벡터 및 다른 요소의 선택은 당업자 수준 내에서 일상적인 설계의 문제이다. 이러한 많은 요소들은 상업적 제조업체로부터 구입할 수 있다. 가용성 수용체 복합체의 다중 성분은 각각의 발현 벡터에 공동-트랜스팩션되거나 단일 발현 벡터에 함유될 수 있다. 단백질 복합체의 다중 성분을 발현시키는 이러한 기술들은 당업계에 주지되어 있다.

발현 벡터는 인산칼슘 트랜스팩션, 리포솜-매개된 트랜스팩션, 마이크로프로젝타일-매개 전달, 일렉트로포레이션 등을 포함한 다양한 표준 기술을 사용하여 숙주 세포에 도입될 수 있다. 숙주 세포 게놈에 안정되게 통합된 발현 벡터를 포함한 재조합 숙주 세포를 제공하는 트랜스팩션된 세포를 선택하고 증식할 수 있다. 벡터를 진핵 세포에 도입하기 위한 기술 및 우성의 선택가능한 마커를 사용하여 이러한 안정한 형질전환체를 선택하기 위한 기술은, 예를 들면 Ausubel(1995) and Murray (ed.), Gene Transfer and Expression Protocols(Humana Press 1991))에 설명된다.

예를 들면, 한 적합한 선택가능한 마커는 항생제 네오마이신에 내성을 제공하는 유전자이다. 이 경우에, 선택은 G-418 등과 같은 네오마이신 형 약물의 존재에서 수행된다. 선택 시스템은 "증식"이라 불리는 과정인 관심있는 유전자의 발현 수준을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 증식은 저 수준의 선택제의 존재 하에 트랜스팩턴트를 배양하고, 그 후 도입된 유전자의 고 수준의 생성물을 생산하는 세포를 선택하기 위하여 선택제의 양을 증가시킴으로써 수행된다. 적합한 증식가능한 마커는 메토트렉세이트에 내성을 부여하는 디히드로폴산 환원효소(DHFR)이다. 또한 다른 약물 내성 유전자(예를 들면, 히그로마이신 내성, 다중 약물 내성, 퓨로마이신 아세틸트랜스페라제)를 사용할 수 있다. 대안적으로, 변경된 표현형, 예를 들면 녹색 형광 단백질, 또는 세포 표면 단백질, 예를 들면 CD4, CD8, MHC 제 I 형, 태반 알칼린 포스파타제를 도입하는 마커는 FACS 분류 또는 자기 비드 분리 기술과 같은 수단에 의하여 트랜스팩션되지 않은 세포로부터 트랜스팩션된 세포를 분류하는 데 사용될 수 있다.

IL-22RA 폴리펩티드는 또한 바이러스 전달 시스템을 사용하여 배양된 포유동물 세포에 의하여 생성될 수 있다. 이러한 목적을 위한 예시적 바이러스는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스바이러스, 백시니아 바이러스 및 아데노-연관된 바이러스(AAV)를 포함한다. 이중 가닥 DNA 바이러스인 아데노바이러스는 이종 핵산의 전달을 위하여 최근 가장 잘 연구된 유전자 전달 벡터이다(검토를 위해서, Becker et al., Meth . Cell Biol . 43:161 (1994), 및 Douglas and Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997))을 참조한다). 아데노바이러스의 장점은 비교적 큰 DNA 삽입체의 수용, 높은 역가로 성장하는 능력, 넓은 범위의 포유동물 세포 유형을 감염시키는 능력, 및 상이한 프로모터를 함유한 많은 수의 이용가능한 벡터와 사용할 수 있는 유연성을 포함한다.

아데노바이러스 게놈을 일부를 결실함으로써, 이종 DNA의 더 큰 삽입체(7kb 까지)를 수용할 수 있다. 직접 리게이션에 의하여 또는 공동-트랜스팩션된 플라스미드와 상동 재조합에 의하여 바이러스 DNA에 이들 삽입체를 혼입할 수 있다. 선택은 바이러스 벡터에서 필수 E1 유전자를 결실하는 것이며, 이는 E1 유전자가 숙주 세포에 의하여 제공되지 않는다면 복제 불능을 초래한다. 아데노바이러스 벡터-감염된 사람 293 세포(ATCC No. CRL-1573, 45504, 45505)는, 예를 들면 충분한 양의 단백질을 생성하기 위하여 비교적 높은 세포 밀도로 부착 세포로 또는 현탁 배양물에서 성장할 수 있다(예를 들면, Garnier et al., Cytotechnol . 15:145 (1994)) 참조).

IL-22RA은 또한, 다른 상위 진핵 세포, 예를 들면 조류, 균류, 곤충, 효모, 또는 식물 세포에서 발현될 수 있다. 배큘로바이러스 시스템은 클로닝된 IL-22RA 유전자를 곤충 세포에 도입하는 효율적인 수단을 제공한다. 적합한 발현 벡터는 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica ) 다중 핵다각체병 바이러스(AcMNPV)에 기초하고, 초파리(Drosophila) 열 쇼크 단백질(hsp) 70 프로모터, 오토그라파 캘리포니카 핵다각체병 바이러스 즉시-초기 유전자 프로모터(ie-1) 및 지연된 초기 39K 프로모터, 배큘로바이러스 p10 프로모터 및 초파리 메탈로티오네인 프로모터와 같은 주지된 프로모터를 함유한다. 재조합 배큘로바이러스를 제조하기위한 두 번째 방법은 Luckow에 의해 설명된 트랜스포존-기재 시스템을 이용한다(Luckow, et al., J. Virol . 67:4566 (1993)). 전달 벡터를 이용하는 이 시스템은 BAC-to-BAC 키트로 구매된다(Life Technologies, Rockville, MD). 이 시스템은 IL-22RA 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 "백미드(bacmid)"라고 불리는 큰 플라스미드 같은 대장균(E. coli)에 보존된 배큘로바이러스 게놈으로 이동시키는 Tn7 트랜스포존을 함유한 전달 벡터, PFASTBAC(Life Technologies)을 이용한다. Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971(1990), Bonning, et al., J. Gen. Virol . 75:1551(1994) 및 Chazen- balk, and Rapoport, J. Biol . Chem . 270:1543 (1995)을 참조한다. 또한, 전달 벡터는 발현된 IL-22RA 폴리펩티드의 C- 또는 N-말단 에피토프 태그, 예를 들면 Glu-Glu 에피토프 태그를 코딩하는 DNA와의 인프레임 융합을 포함할 수 있다(Grussenm-eyer et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . 82:7952(1985)). 당업계에 공지된 기술을 사용하여, IL-22RA 유전자를 함유한 전달 벡터를 대장균에 형질전환시켜 재조합 배큘로바이러스를 나타내는 방해된 lacZ 유전자를 함유한 백미드에 대하여 스크리닝한다. 그 후 일반 기술을 사용하여 재조합 배큘로바이러스 게놈을 함유한 백미드 DNA을 분리한다.

예시적 PFASTBAC 벡터는 상당한 정도로 변형될 수 있다. 예를 들어, 폴리헤드리린 프로모터를 제거하고 배큘로바이러스 감염시 초기에 발현되는 배큘로바이러스 기본 단백질 프로모터(Pcor, p6.9 또는 MP 프로모터라고도 함)로 치환할 수 있으며, 분비성 단백질을 발현시키는데 유리한 것으로 나타났다(예를 들면, Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol . 71:971 (1990), Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994), 및 Chazenbalk and Rapoport, J. Biol . Chem . 270:1543 (1995)) 참조). 이러한 전달 벡터 구성체에서는 기본 단백질 프로모터의 짧거나 긴 버전을 사용할 수 있다. 또한, 천연 IL-22RA 분비성 신호 서열을 곤충 단백질에서 유래된 분비성 신호 서열로 대체하는 전달 벡터를 구성할 수 있다. 예를 들면, 엑디스테로이드 글루코실전이효소(EGT)의 분비성 신호 서열, 꿀벌 멜리틴(Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA), 또는 배큘로바이러스 gp67 (PharMingen: San Diego, CA)가 천연 IL-22RA 분비성 신호 서열을 대체하기 위해 구성체에서 사용될 수 있다.

재조합 바이러스 또는 백미드는 숙주 세포를 트랜스팩션하는 데 사용될 수 있다. 적합한 곤충 숙주 세포는 초파리 슈나이더-2 세포, 및 트리코플루시아 니 (Trichoplusia ni) 유래 HIGH FIVEO 세포주(Invitrogen)(미국특허 제5,300,435호)뿐만 아니라 IPLB-Sf-21에서 유래된 세포주, 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 번데기 난소 세포주, 예를 들면 Sf9(ATCC CRL 1711), Sf21AE, 및 Sf21 (Invitrogen Corporation; San Diego, CA)을 포함한다. 상업적으로 구입가능한 무혈청 배지가 세포를 성장시키고 유지하는 데 사용될 수 있다. 적합한 배지는, Sf9 세포의 경우 Sf900 II™(Life Technologies) 또는 ESF 921™(Expression Systems); 그리고 T. ni 세포의 경우, Ex-cellO405™(JRH Biosciences, Lenexa, KS) 또는 Express FiveO™(Life Technologies)이다. 재조합 바이러스가 사용될 때, 세포는 전형적으로 약 2-5x10⁵ 세포의 접종 밀도 내지 1-2x10⁶ 세포의 밀도로 성장하고, 각 시점에 재조합 바이러스 원액은 0.1 내지 10, 더욱 전형적으로 거의 3의 감염다중성(MOI)으로 첨가된다.

배큘로바이러스 시스템에서 재조합 단백질을 생성하기 위한 확립된 기술은 Bailey et al., "Manipulation of Baculovirus Vectors", in Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), p. 147-168(The Humana Press, Inc. 1991), Patel et al "The baculovirus expression system", in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), p. 205-244(Oxford University Press 1995), Ausubel(1995), p. 16-37 내지 16-57, Richardson(ed.), Baculovirus Expression Protocols(The Humana Press, Inc. 1995), Lucknow "Insect Cell Expression Technology", Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), p. 183-218(John Wiley & Sons, Inc. 1996)에 제공된다.

또한, 효모 세포를 포함한 곰팡이 세포는 본원에 설명된 유전자를 발현시키는 데 사용될 수 있다. 이와 관련하여 특정 관심대상의 효모 종은 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae ), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris ), 및 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica)를 포함한다. 효모에서 발현을 위한 적합한 프로모터는 GAL1(갈락토스), PGK(포스포글리세르산 키나제), ADH(알코올 탈수소효소), AOX1(알코올 산화효소), HIS4(히스티디놀 탈수소효소) 등의 프로모터를 포함한다. 많은 효모 클로닝 벡터가 설계되었으며 용이하게 이용가능하다. 이들 벡터는 YIp5와 같은 YIp-기재 벡터, YRp17와 같은 YRp 벡터, YEp13와 같은 YEp 벡터, 및 YCp19와 같은 YCp 벡터를 포함한다. 사카로미세스 세레비시아 세포를 외인성 DNA로 형질전환하고 그것들로부터 재조합 폴리펩티드를 생성하기 위한 방법은, 예를 들면 Kawasaki, 미국특허 제4,599,311호, Kawasaki 등, 미국특허 제4,931,373호, Brake, 미국특허 제4,870,008호, Welch 등, 미국특허 제5,037,743호, 및 Murray 등, 미국특허 제4,845,075호에 개시된다. 형질전환된 세포를 선택가능한 마커로 결정된 표현형, 통상적인 약물 내성 또는 특정 영양분(예를 들면, 류신)의 부재시에 성장하는 능력으로 선택한다. 사카로미세스 세레비시아에 사용하기 위한 적합한 벡터 시스템은 형질전환된 세포가 글루코스-함유 배지에서 성장함으로써 선택되도록 하는, Kawasaki 등, 미국특허 제4,931,373호에 개시된 POT1 벡터 시스템이다. 효모에 사용하기 위한 추가적인 적합한 프로모터 및 종결자는 해당 효소 유전자(예를 들면, Kawasaki, 미국특허 제4,599,311호, Kingsman 등, 미국특허 제4,615,974호, 그리고 Bitter, 미국특허 제4,977,092호 참조) 및 알코올 탈수소효소 유전자의 것들을 포함한다. 미국특허 제4,990,446호, 제5,063,154호, 제5,139,936호, 및 제4,661,454호를 또한 참조한다.

한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 스키조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로미세스 프라길리스(Kluyveromyces fragilis), 우스틸라고 마이디스(Ustilago maydis), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피카아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피키아 길레르몬디(Pichia guillermondii) 및 캔디다 말토사(Candida maltosa)를 포함하는 다른 효소용 형질전환 시스템이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol . 132:3459 (1986), 및 Cregg, 미국특허 제4,882,279호를 참조한다. 아스페르길루스(Aspergillus) 세포는 McKnight 등, 미국특허 제4,935,349호의 방법에 의해서 사용될 수 있다. 아크레모늄 크리소게눔(Acremonium chrysogenum)을 형질전환하기 위한 방법은 Sumino 등, 미국특허 제5,162,228호에 개시된다. 뉴로스포라(Neurospora)를 형질전환하기 위한 방법은 Lambowitz, 미국특허 제4,486,533호에 개시된다.

예를 들면, 재조합 단백질의 생성을 위한 숙주로서 피키아 메타놀리카를 사용하는 것은 Raymond, 미국특허 제5,716,808호, Raymond, 미국특허 제5,736,383호, Raymond et al., Yeast 14:11-23(1998), 및 국제공보 WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536, 및 WO 98/02565에 개시된다. 피키아 메타놀리카를 형질전환하는데 사용하기 위한 DNA 분자는 통상적으로 바람직하게는 형질전환 전에 선형화되는 이중 가닥, 고리형 플라스미드로 제조될 것이다. 피키아 메타놀리카에서의 폴리펩티드 생성을 위하여, 플라스미드의 프로모터 및 종결자는 피키아 메타놀리카 알코올 이용 유전자(AUG1 또는 AUG2) 같은 피키아 메타놀리카 유전자의 것일 수 있다. 다른 유용한 프로모터는 디히드로아세톤 합성효소(DHAS), 포름산 탈수소효소 (FMD), 및 카탈라제(CAT) 유전자의 것들을 포함한다. DNA가 숙주 염색체에 통합되는 것을 촉진하기 위하여, 숙주 DNA 서열의 양쪽 말단에 인접해 있는 플라스미드의 전체 발현 조각을 갖는 것이 바람직하다. 피키아 메토놀리카에 사용하기에 적합한 선택가능한 마커는 포스포리보실-5-아미노이미다졸 카르복실라제(AIRC; EC 4.1.1.2.1)를 코딩하고, 아데닌의 부재시에 ade2 숙주 세포가 성장할 수 있게 하는 피키아 메타놀리카 ADE2 유전자이다. 메탄올의 사용을 최소화하는 것이 바람직한 대용량, 산업 공정의 경우, 두 메탄올 이용 유전자(AUG1 및 AUG2)가 결실된 숙주 세포가 사용될 수 있다. 분비성 단백질의 생성을 위해 숙주 세포는 공포 단백질분해효소 유전자(PEP4 및 PRB1)가 결핍될 수 있다. 일렉트로포레이션은 피키아 메타놀리카 세포 내에 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 함유한 플라스미드을 도입하는 것을 촉진하는 데 사용된다. 피키아 메타놀리카 세포는 2.5 내지 4.5kV/cm, 바람직하게는 약 3.75 kV/cm의 전계 강도, 그리고 1 내지 40 밀리초, 가장 바람직하게는 약 20 밀리초의 시간상수(t)를 가진 급격히 쇠퇴하는 펄스 전기장을 이용한 일렉트로포레이션에 의하여 형질전환될 수 있다.

발현 벡터는 또한 식물 원형질체, 무결 식물 조직, 또는 분리된 식물 세포에 도입될 수 있다. 발현 벡터를 식물 조직에 도입하기 위한 방법은 뿌리혹박테리아 (Agrobacterium tumefaciens), 마이크로프로젝타일-매개 전달, DNA 주입, 일렉트로포레이션 등을 통한 식물 조직의 직접적 감염 또는 공동-배양을 포함한다. 예를 들면, Horsch et al., Science 227:1229(1985), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992), 및 Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants", in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (eds.), p. 67-88(CRC Press, 1993))을 참조한다.

대안적으로, IL-22RA 유전자는 원핵 숙주 세포에서 발현될 수 있다. IL-22RA 폴리펩티드를 발현시키는데 사용될 수 있는 적합한 프로모터는 당업자에게 주지되어 있으며, T4, T3, Sp6 및 T7 중합효소를 인식할 수 있는 프로모터, 박테리오파지 람다, trp, recA, 열 쇼크, lacUV5, tac, lpp - lacSpr, phoA의 P_R 및 P_L 프로모터, 및 대장균의 lacZ 프로모터, 바실루스 서브틸리스(B. subtilis)의 프로모터, 바실루스(Bacillus)의 박테리오파지 프로모터, 박테리오파지 람다의 int 프로모터, 스트렙토미세스 프로모터, 박테리오파지 람다의 int 프로모터, pBR322의 bla 프로모터, 클로람페니콜 아세틸 전이효소 유전자의 CAT 프로모터를 포함한다. 원핵 프로모터는 Glick, J. Ind . Microbiol . 1:277(1987), Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4 th Ed.(Benjamin Cummins 1987), 및 Ausubel et al. (1995))에서 재검토되었다.

적합한 원핵 숙주는 대장균과 바실루스 서브틸루스를 포함한다. 대장균의 적합한 균주는 BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER2151, 및 ER1647을 포함한다(예를 들면, Brown(ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991) 참조). 바실루스 서브틸루스의 적합한 균주는 BR151, YB886, MI119, MI120, 및 B170을 포함한다(예를 들면, Hardy, "Bacillus Cloning Methods", DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)) 참조).

대장균과 같은 박테리아에서 IL-22RA 폴리펩티드를 발현시킬 때, 폴리펩티드는 세포질, 전형적으로는 불용성 과립에 보유될 수 있거나, 박테리아 분비 서열에 의하여 원형질막 공간으로 인도될 수 있다. 전자의 경우에, 세포를 용해시키고, 과립을 회수하여, 예를 들면 구아니딘 이소티오시안산 또는 우레아를 사용하여 변성시킨다. 그 다음 변성된 폴리펩티드를 다시 폴딩시켜 변성제의 희석에 의하여, 예를 들면 우레아 용액 및 환원되고 산화된 글루타티온의 조합에 대한 투석, 이어서 완충된 식염수 용액에 대한 투석에 의하여 다이머를 형성할 수 있다. 후자의 경우에, 폴리펩티드는 원형질막 공간의 내용물을 분비하도록 세포를 파괴하고, 단백질을 회수하여 변성 및 재폴딩의 필요를 미연에 방지함으로써 가용성 및 기능성 형태로 원형질막 공간에서 회수될 수 있다.

원핵 숙주에서 단백질을 발현시키기 위한 방법은 당업자에게 주지되어 있다(예를 들면, Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies", in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al.(eds.), p. 15(Oxford University Press 1995), Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, p. 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995) 및 Georgiou, "Expression of Proteins in Bacteria", in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), p. 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)) 참조).

발현 벡터를 박테리아, 효모, 곤충, 및 식물 세포에 도입하기 위한 표준 방법은, 예를 들면 Ausubel(1995)에 의하여 제공된다.

포유동물 세포 시스템에 의하여 생성된 외래 단백질을 발현시키고 회수하기 위한 일반적 방법은, 예를 들면 Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture", in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), p. 163(Wiley-Liss, Inc. 1996))에 제공된다. 박테리아 시스템에 의해 생성된 단백질을 회수하기 위한 표준 기술은, 예를 들면 Grisshammer et al., "Purification of over-produced proteins from E. coli cells", in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), p. 59-92 (Oxford University Press 1995))에 제공된다. 배큘로바이러스 시스템에서 재조합 단백질을 분리하기 위한 확립된 방법은 Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols(The Humana Press, Inc. 1995)에 설명된다.

대안으로서, 본 발명의 폴리펩티드는 배타적 고체상 합성, 부분적 고체상 방법, 단편 축합반응 또는 고전적인 용액 합성에 의하여 합성될 수 있다. 이들 합성 방법은 당업자에게 공지되어 있다(예를 들면, (Merrifield, J. Am. Chem . Soc . 85: 2149 (1963), Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis", 2nd Edition, (Pierce Chemical Co. 1984), Bayer and Rapp, Chem . Pept . Prot . 3:3 (1986), Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach(IRL Press 1989), Fields and Colowick, "Solid-Phase Peptide Synthesis", Methods in Enzymology Volume 289(Academic Press 1997) 및 Lloyd-Williams et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc. 1997)) 참조). "천연 화학적 리게이션" 및 "발현된 단백질 리게이션"과 같은 전체 화학 합성 전략에서의 변이도 표준 기술이다(예를 들면, Dawson et al., Science 266:776 (1994), Hackeng et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 94:7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol . 287:34(1997), Muir et al, Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 95:6705 (1998), 및 Severinov and Muir, J. Biol . Chem . 273:16205 (1998)) 참조).

본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3의 적어도 6, 적어도 9, 또는 적어도 15 연속 아미노산 잔기를 포함한다. 한 예로서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3의 적어도 6, 적어도 9, 또는 적어도 15 연속 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 폴리펩티드는 이들 아미노산 잔기의 20, 30, 40, 50, 100 또는 그 이상의 잔기를 포함한다. 이러한 펩티드 및 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 중합효소 연쇄 반응 프라이머 및 프로브로서 유용하다.

더욱이, IL-22RA 폴리펩티드 및 그것의 단편은 고등 진핵세포 내에 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머, 또는 멀티머로 발현될 수 있다. 이러한 세포들은 적어도 하나의 IL-22RA 폴리펩티드를 포함하는 IL-22RA 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머 및 멀티머 수용체 폴리펩티드("IL-22RA-포함 수용체" 또는 "IL-22RA-포함 수용체 폴리펩티드")를 생성하는 데 사용될 수 있거나, 스크리닝 시스템에서 분석 세포들로 사용될 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, IL-22RA 세포외 도메인을 포함한 본 발명의 폴리펩티드는 배양된 세포에 의하여 생성되고, 그 세포는 천연 리간드, IL-22, 또는 심지어 천연 리간드의 작용제 및 길항제를 포함한 수용체의 리간드를 스크린하는 데 사용된다. 이 접근법을 요약하면, cDNA 또는 수용체를 코딩하는 유전자는 그것의 발현에 필요한 다른 유전 요소(예를 들면, 전사 프로모터)와 조합되고, 생성된 발현 벡터는 숙주 세포 내에 삽입된다. DNA를 발현시키고 기능성 수용체를 생성하는 세포는 선택되며 다양한 스크리닝 시스템에서 사용된다. 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머 및 멀티머 수용체 복합체의 각 성분은 동일한 세포에서 발현될 수 있다. 더욱이, 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머 및 멀티머 수용체 복합체의 성분은 막통과 도메인 또는 다른 막 융합 부분과 융합되어 전술한 복합체 조립 및 트랜스팩턴트의 스크리닝을 가능케 할 수 있다.

본 발명의 IL-20 및 IL-22 길항제 폴리펩티드 및 항체를 분석하기 위하여, IL-22RA-포함 수용체 또는 IL-20 또는 IL-22와 결합하는 것으로 알려진 다른 수용체(예를 들어, IL-22RA/CRF2-4를 발현하는 세포; 및 IL-20RA, IL-20RB, IL22RA/IL-20RB, 또는 IL-20RA/IL-20RB)를 발현시키고 수용체-매개 신호를 전달하는데 적합한 포유동물 세포는 IL-22RA(또는 IL-20RA)와 기능성 복합체를 형성할 수 있는 다른 수용체 하위단위체를 발현시키는 세포를 포함한다. 이들 하위단위체는 인터페론 수용체 패밀리 또는 다른 II형 또는 I형 사이토카인 수용체의 것들, 예를 들어 CRF2-4(Genbank Accession No. Z17227), IL-10R(Genbank Accession No.s U00672 및 No. NM_001558), IL-22RA(공동소요 미국특허 제5,965,704호), zcytor7(IL-20RA)(공동소유 미국특허 제5,945,511호), IL-20RA/IL-20RB(WIPO 공보 WO 01/46232), 및 IL-9R을 포함한다. 또한, 발현될 수용체와 같은 종 유래의 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에서, 세포는 그것의 증식을 위해 외부적으로 공급된 조혈성장인자에 의존적이다. 이 유형의 바람직한 세포주는 사람 TF-1 세포주(ATCC 번호 CRL-2003) 및 AML-193 세포주(ATCC 번호 CRL-9589)이며, 이들은 GM-CSF-의존성 사람 백혈병 세포주와 IL-3 의존성 쥐과 전구-B 세포주 BaF3(Palacios 및 Steinmetz, Cell 41: 727-734,(1985))이다. 다른 세포주는 BHK, COS-1 및 CHO 세포를 포함한다. 적합한 숙주세포는 필요한 수용체 하위단위체 또는 원하는 세포 반응에 필요한 다른 세포 성분을 생성하도록 조작될 수 있다. 이 접근법은 세포주가 어떤 종의 수용체 하위단위체를 발현하도록 조작되어, 종 특이성으로부터 발생한 잠재적 한계를 극복할 수 있기 때문에 유리하다. 사람 수용체 cDNA의 종 오토로그를 클로닝하여, BaF3 세포주에 있는 마우스 cDNA와 같이, 동일한 종으로부터의 세포주 내에서 사용할 수 있다. 따라서 GM-CSF 또는 IL-3과 같은 한 조혈성장인자에 의존하는 세포주는 IL-22와 같은 IL-22RA 수용체를 통하여 작용하는 다른 사이토카인에 의존하도록 조작될 수 있다.

기능성 수용체를 발현하는 세포는 스크리닝 분석에 사용된다. 다양한 적합한 분석이 당업계에 공지되어 있다. 이들 분석은 표적 세포에서의 생물학적 반응의 검출에 기초한다. 이러한 한 분석은 세포 증식 분석이다. 세포는 시험 화합물의 존재 또는 부재시에 배양되고 세포 증식은 예를 들면 삼중 티미딘의 혼입을 측정하거나, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드(MTT)의 대사적 분해작용에 기초한 비색계 분석에 의하여 검출될 수 있다(Mosman, J. Immunol . Meth. 65: 55-63(1983)). 대안적 분석 포맷은 리포터 유전자를 발현하도록 더 조작된 세포를 사용한다. 리포터 유전자는 수용체 결합된 경로에 반응하는 프로모터 요소와 결합되며, 그 분석은 리포터 유전자의 전사의 활성화를 검출한다. 이와 관련된 바람직한 프로모터 인자는 요소는 혈청반응인자, 또는 SRE이다. 예를 들면, Shaw et al., Cell 56:563-572, (1989)을 참조한다. 이러한 바람직한 리포터 유전자는 루시페라제 유전자이다(de Wet et al., Mol . Cell. Biol . 7:725(1987)). 루시페라제 유전자의 발현은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 발광에 의하여 검출된다(예를 들면, Baumgartner et al., J. Biol . Chem . 269:29094-29101, (1994); Schenborn and Goiffin, Promega Notes 41:11, 1993). 루시페라제 활성 분석 키트는, 예를 들면 Promega Corp.(Madison, WI)에서 상업적으로 구입가능하다. 이 유형의 표적 세포주는 화학물질, 세포-조절된 배양 배지, 곰팡이 액체배지, 토양 샘플, 물 샘플 등의 라이브러리를 스크린하는 데 사용될 수 있다. 다른 대안적 분석은 리간드 결합 및 수용체의 활성화에 반응하여 세포 신호전달 경로의 인산화(전사인자, 키나제 등)를 검출한다. 예를 들면, 세포-조절된 배지 샘플의 한 뱅크는 리간드를 생성하는 세포를 확인하기 위하여 표적 세포에서 분석될 수 있다. 그 다음 양성 세포를 포유동물 발현 벡터에서 cDNA 라이브러리를 생성하는 데 사용하는데, 이것을 풀(pool)로 나누고, 숙주 세포에 트랜스팩션하여 발현시킨다. 그 다음 리간드를 코딩하는 클로닝된 cDNA를 분리하기 위하여 트랜스팩션된 세포의 배지 샘플을 그 후의 풀의 분열, 재-트랜스팩션, 2차 배양, 및 양성 세포의 재분석으로 분석한다.

몇 가지 IL-20 반응성 세포주가 본 분야에 공지이며, 예를 들어 baf3/DIRS1/ cytoR11 세포주(WIPO 공보 WO 02/072607)가 구성될 수 있다. 더욱이, 몇 가지 IL-22 반응성 세포주(Dumontier et al. J. Immunol. 164:1814-1819, 2000; Dumoutier, L. et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 97:10144-10149, 2000; Xie MH et al., J. Biol. Chem. 275: 31335-31339, 2000; Kotenko SV et al., J. Biol. Chem. 276: 2725-2732, 2001), 뿐만 아니라 IL-22 수용체 하위단위체인 IL-22RA를 발현하는 것들이 공지이다. 예를 들어, 다음의 세포들이 IL-22에 반응성이다: TK-10(Xie MH et al., supra.)(사람 신장암종); SW480(ATCC No. CCL-228)(사람 결장선암종); HepG2 (ATCC No. HB-8065)(사람 간종양); PC12(ATCC No. CRL-1721)(쥐과 신경세포 모델; 쥐 갈색세포종); 및 MES13(ATCC No. CRL-1927)(쥐과 신장 혈관사이 세포주). 추가하여, IL-22RA(IL-22 수용체)를 발현하는 어떤 세포주가 IL-22에 대한 반응성 세포주의 후보이다: A549(ATCC No. CCL-185)(사람 폐암종); G-361(ATCC No. CRL-1424) (사람 흑색종); 및 Caki-1(ATCC No. HTB-46)(사람 신장암종). 추가하여, IL-22-반응성 세포주, 예를 들어 여기(WIPO 공보 WO02/12345)에 설명된 Baf3/cytoR11/CRF2-4 세포주가 구성될 수 있다. 이들 세포는 IL-20 또는 IL-22 기길항제 또는 항염증 인자로서 IL-22RA의 기능성을 평가하는 분석에 사용될 수 있다.

본 발명에 의하여 제공된 추가 스크리닝 접근법은 하이브리드 수용체 폴리펩티드의 사용을 포함한다. 이들 하이브리드 폴리펩티드는 두 가지 일반 부류로 나뉜다. 제 1 부류에서, IL-22RA의 세포내 도메인은 제 2 수용체의 리간드 결합 도메인에 결합된다. 하이브리드 수용체 폴리펩티드의 제 2 부류는 제 2 수용체의 세포내 도메인, 바람직하게는 조혈 사이토카인 수용체, 및 막통과 도메인이 있는 IL-22RA의 세포외(리간드-결합) 도메인(SEQ ID NO:3)을 포함한다. 이 제 2 부류의 본 발명의 수용체의 하이브리드 IL-22RA 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머 및 멀티머는 제 2 수용체에 의하여 전달된 신호에 반응할 수 있는 것으로 알려진 세포에서 발현된다. 종합하면, 하이브리드 수용체의 이들 두 클래스는 IL-22 또는 IL-20을 검출하기 위한 분석의 개발을 위한 반응성 세포 유형의 확인을 가능하게 한다. 더욱이, 이러한 세포는 경쟁 유형 분석에서 본 발명의 가용성 수용체 길항제를 분석하기 위하여 IL-22 또는 IL-20의 존재 하에 사용될 수 있다. 이러한 분석에서, 본 발명의 가용성 수용체의 존재 하에 IL-22 또는 IL-20의 증식 또는 신호 전달 활성의 감소는 상반된 활성을 나타낸다. 더욱이, IL-22RA-가용성 수용체 결합 분석, 및 세포 기재 분석은 또한 가용성 수용체가 IL-22 또는 IL-20 활성을 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는지를 분석하는 데 사용될 수 있다.

6. IL-22RA 융합 단백질 및 콘쥬게이트의 생성

IL-22RA 유사체의 한 일반적 부류는 본원에 설명된 아미노산 서열의 돌연변이인 아미노산 서열을 가진 변이체이다. IL-22RA 유사체의 다른 일반적 부류는 아래에서 설명하는 항-유전형 항체, 및 그것의 단편으로 제공된다. 더욱이, 항-유전형 가변 도메인을 포함한 재조합 항체는 유사체로 사용될 수 있다(예를 들면, Mon-fardini et al., Proc . Assoc . Am. Physicians 108:420 (1996)) 참조). 항-유전형 IL-22RA 항체의 가변 도메인은 IL-22RA을 모방하기 때문에, 이들 도메인은 IL-22RA 결합 활성을 제공할 수 있다. 항-유전형 촉매 항체를 생성하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다(예를 들면, Joron et al., Ann. N Y Acad . Sci. 672:216 (1992), Friboulet et al., Appl . Biochem . Biotechnol . 47:229 (1994), 및 Avalle et al., Ann. N Y Acad . Sci . 864:118 (1998)).

IL-22RA 유사체를 확인하는 다른 접근법은 조합의 라이브러리의 사용에 의하여 제공된다. 파지 디스플레이 및 다른 조합의 라이브러리를 구성하고 스크리닝하기 위한 방법은, 예를 들면 Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press 1996), Verdine, U.S. Patent No. 5,783,384, Kay, et. al., U.S. Patent No. 5,747,334, 및 Kauffman et al., U.S. Patent No. 5,723,323에 제공된다.

IL-22RA 폴리펩티드는 생체내 및 시험관내 모두에서 사용될 수 있다. 예시로서, IL-22RA의 가용성 형태는 세포 배양 배지에 첨가되어 배양된 세포에 의하여 생성된 IL-22RA 리간드의 효과를 억제할 수 있다.

IL-22RA의 융합 단백질은 재조합 숙주에 IL-22RA를 발현시키고 생성된 IL-22RA을 분리하는 데 사용될 수 있다. 하기에 설명하는 바와 같이, 특정 IL-22RA 융합 단백질은 또한 진단 및 치료에 사용될 수 있다. 융합 단백질의 한 유형은 재조합 숙주 세포로부터 IL-22RA 폴리펩티드를 안내하는 펩티드를 포함한다. IL-22RA 폴리펩티드를 진핵 숙주 세포의 분비 경로로 안내하기 위하여, 분비성 신호 서열(신호 펩티드, 리더 서열, 전프로 서열, 전 서열이라고도 함)은 IL-22RA 발현 벡터에 제공된다. 분비성 신호 서열은 IL-22RA에서 유래할 수 있는 한편, 적합한 신호 서열은 다른 분비된 단백질에서 유래되거나 새롭게 합성될 수 있다. 분비성 신호 서열은 IL-22RA-코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 두 서열은 정확한 리딩 프레임에 결합하고 새롭게 합성된 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로로 안내하도록 위치가 정해진다. 어떤 분비성 신호 서열이든지 관심 있는 뉴클레오티드 서열에 어디든지 위치할 수 있지만, 분비성 신호 서열은 통상적으로 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치한다(예를 들면, Welch et al., U.S. Patent No. 5,037,743; Holland et al., U.S. Patent No. 5,143,830 참조).

IL-22RA의 분비성 신호 서열 또는 포유동물 세포에 의하여 생성된 다른 단백질(예를 들면, U.S. Patent No. 5,641,655에 설명된 조직-유형 플라스미노겐 활성자 신호 서열)은 재조합 포유동물 숙주에서 IL-22RA의 발현에 유용하지만, 효모 신호 서열은 효모 세포에서의 발현에 바람직하다. 적합한 효모 신호 서열의 예는 효모 교배 호르몬 α-인자(MFα1 유전자에 의하여 코딩된), 인베르타제(SUC2 유전자에 의하여 코딩된), 또는 산 포스파타제(PHO5 유전자에 의하여 코딩된)에서 유래된 것이다. 예를 들면, Romanos et al., "Expression of Cloned Genes in Yeast," in DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2^nd Edition, Glover and Hames (eds.), 페이지 123-167 (Oxford University Press 1995)을 참조한다.

IL-22RA 가용성 수용체 폴리펩티드는 세포외 도메인, 예를 들면 SEQ ID NO:3 또는 비-사람 수용체의 대응되는 영역을 함유한 폴리펩티드를 코딩하는 절단된 DNA를 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 세포외 도메인 폴리펩티드는 막통과 및 세포내 폴리펩티드 조각이 실질적으로 없는 형태로 제조되는 것이 바람직하다. 숙주 세포로부터 수용체 도메인의 이출을 지시하기 위하여, 수용체 DNA는 t-PA 분비성 펩티드와 같은 분비성 펩티드를 코딩하는 두 번째 DNA 조각에 연결된다. 분비된 수용체 도메인의 정제를 촉진하기 위하여, C-말단 연장, 예를 들면 폴리히스티딘 태그, P 물질, Flag^TM 펩티드(Hopp et al., Biotechnology 6:1204-1210, (1988); Eastman Kodak Co.(New Haven, CT)에서 구입가능) 또는 항체 또는 다른 특정 결합제가 이용가능한 다른 폴리펩티드 또는 단백질은 수용체 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 더욱이, 세포외 사이토카인 결합 도메인의 IL-22RA 항원성 에피토프는 또한 전술한 바와 같이 제조된다.

대안적 접근법에서, IL-22RA의 수용체 세포외 도메인 또는 다른 사이토카인 수용체 성분은 두 불변 영역 도메인 및 힌지 영역을 함유하지만 가변 영역이 결핍된 면역글로불린 중쇄 불변 영역, 전형적으로는 Fc 단편과의 융합으로 발현될 수 있다(Sledziewski, AZ et al., US Patent No. 6,018,026 및 5,750,375 참조). 본 발명의 가용성 IL-22RA 폴리펩티드는 이러한 융합을 포함한다. 이러한 한 융합은 SEQ ID NO:4에 나타낸다. 이러한 융합은 전형적으로 Fc 부분이 서로 이황화 결합으로 결합되고 두 수용체 폴리펩티드는 서로에게 매우 근접하게 배열되는 멀티머 분자로 분비된다. 이 유형의 융합들은 용액으로부터 동족 리간드를 친화력 정제하는 데 리간드를 특이적으로 적정함으로써 시험관내에서 신호를 차단, 억제 또는 감소시키는 시험관내 분석 도구, 및 순환하는 리간드와 결합하여 그것을 순환으로부터 제거하도록 그것들을 비경구로 투여함으로써 생체내의 길항제로서 사용될 수 있다. 리간드를 정제하기 위하여, IL-22RA-Ig 키메라는 수용체-리간드 결합(전형적으로 거의 생리적 온도, pH, 및 이온의 세기)을 촉진하는 조건 하에서 리간드(예를 들면, 세포-조절된 배양 배지 또는 조직 추출물)를 함유한 샘플에 첨가된다. 그 다음 키메라-리간드 복합체는 고체 지지체(예를 들면, 불용성 수지 비드) 상에 고정된 단백질 A를 사용한 혼합물에 의하여 분리된다. 그 다음 리간드를 종래의 화학 기술, 예를 들면 염 또는 pH 기울기를 사용하여 용출한다. 대안적으로, 키메라 자체는 상기에 수행된 결합 및 용출로 고체 지지체에 결합될 수 있다. 키메라는 혈청 아밀로이드 A(SAA), C-반응성 단백질(CRP) 등과 같은 급성 시기 반응을 포함한 염증성 반응을 조절하기 위하여 생체내에서 사용될 수 있다. 고 결합 친화력을 가진 키메라는 비경구로 투여된다(예를 들면, 근육내, 피하 또는 정맥내 주사). 순환하는 분자는 리간드와 결합하고 정상적인 생리학적 과정에 의하여 순환으로부터 제거된다. 분석에 사용하기 위하여, 키메라는 Fc 영역을 통하여 지지체에 결합되고 ELISA 포맷에 사용된다.

본 발명의 항-IL-22RA과 결합 파트너의 분리를 돕기 위하여, 리간드-결합 수용체(또는 항체, 보체/항-보체 쌍의 한 구성원) 또는 그것의 결합 단편, 및 상업적으로 구입가능한 바이오센서 기구(BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)를 이용한 분석 시스템은 이롭게 사용될 수 있다. 이러한 수용체, 항체, 보체/항-보체 쌍의 구성원 또는 단편은 수용체 칩의 표면에 고정된다. 이 기구의 사용은 문헌(Karlsson, J. Immunol. Methods 145:229-40, 1991 및 Cunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234:554-63, 1993)에 개시된다. 수용체, 항체, 구성원 또는 단편은 유동 세포 내에 금 필름에 부착된 덱스트란 섬유에 아민 또는 술프히드릴 화학을 사용하여 공유결합된다. 시험 샘플은 세포를 통하여 통과된다. 리간드, 에피토프, 또는 보체/항-보체 쌍의 반대 구성원이 샘플에 존재한다면, 배지의 굴절률에 변화를 야기하는, 고정된 수용체, 또는 항체 또는 구성원 각각에 결합될 것이며, 이는 금 필름의 표면 플라즈몬 공명에서의 변화로 검출된다. 이 시스템을 통하여 이로부터 결합 친화력이 계산될 수 있는 온 속도 및 오프 속도를 결정하고, 결합의 화학량론을 평가할 수 있다. 대안적으로, 리간드/수용체 결합은 SELDI(TM) 기술(Ciphergen, Inc., Palo Alto, CA)을 사용하여 분석될 수 있다. 더욱이, 전술한 BIACorE 기술은 상이한 모노클로날 항체가 IL-22RA 폴리펩티드 상의 동일한 또는 상이한 에피토프에 결합하는 지를 결정하기 위하여 경쟁 실험에 사용될 수 있고, 마찬가지로 IL-22 또는 IL-20과 IL-22 모두와 결합, 차단, 억제, 감소, 상쇄 또는 중화시키는 본 발명의 중화 항체의 에피토프 맵핑을 돕는 데 사용될 수 있다.

리간드-결합 수용체 폴리펩티드는 당업계에 공지된 다른 분석 시스템에 사용될 수 있다. 이러한 시스템은 결합 친화력을 결정하는 Scatchard 분석(Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660-72, 1949 참조) 및 열량측정 검사(Cunningham et al., Science 253:545-48, 1991; Cunningham et al., Science 245:821-25, 1991)을 포함한다.

본 발명은 다양한 다른 폴리펩티드 융합 및 하나 이상의 폴리펩티드 융합을 포함한 관련된 멀티머 단백질을 더 제공한다. 예를 들면, 가용성 IL-22RA 수용체는 U.S. Patents No. 5,155,027 및 5,567,584에 개시된 다이머를 이루는 단백질에 대한 융합으로 제조될 수 있다. 이와 관련하여 바람직한 다이머를 이루는 단백질은 면역글로불린 불변 영역 도메인, 예를 들면 IgGγ1 및 사람 κ경쇄를 포함한다. 면역글로불린-가용성 IL-22RA 융합은 유전학적으로 조작된 세포에서 발현되어 다양한 멀티머 IL-22RA 수용체 유사체를 생성할 수 있다. 보조 도메인들은 가용성 IL-22RA 수용체에 융합되어 그것들을 특정 세포, 조직, 또는 거대분자(예를 들면, 콜라겐, 또는 IL-22RA 리간드, IL-22 또는 IL-20을 발현하는 세포)에 표적화할 수 있다. IL-22RA 폴리펩티드는 정제를 위한 친화성 태그 및 표적화 도메인과 같은 두 개 이상의 부분에 융합될 수 있다. 또한 폴리펩티드 융합은 특히 도메인 사이에 하나 이상의 절단 부위를 포함할 수 있다. 문헌(Tuan et al., Connective Tissue Research 34:1-9, 1996)을 참조한다.

박테리아 세포에서, 독성을 감소시키고, 안정성을 증가시키며, 발현된 단백질의 회수를 증대시키는 융합 단백질로서 이종 단백질을 발현시키는 것이 흔히 바람직하다. 예를 들면, IL-22RA은 글루타티온 S-전이효소 폴리펩티드를 포함한 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 글루타티온 S-전이효소 융합 단백질은 전형적으로 가용성이 있으며, 고정된 글루타티온 칼럼 상의 대장균 용해물로부터 용이하게 정제가능하다. 유사한 접근법에서, 말토스 결합 단백질 폴리펩티드를 포함한 IL-22RA 융합 단백질은 아밀로스 수지 칼럼으로 분리될 수 있는 한편, 절단된 단백질 A 유전자의 C-말단 끝을 포함한 융합 단백질은 IgG-세파로스를 사용하여 정제될 수 있다. 박테리아 세포에서 융합 단백질인 이종 폴리펩티드를 발현시키기 위한 확립된 기술은 예를 들면 문헌(Williams et al., "Expression of Foreign Proteins in E. coli Using Plasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies", in DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2판, Glover and Hames (Eds.), 페이지 15-58 (Oxford University Press 1995))에 설명된다. 뿐만 아니라, 상업적으로 구입가능한 발현 시스템을 이용할 수 있다. 예를 들어, PINPOINT Xa 단백질 정제 시스템(Promega Corporation; Madison, WI)은 발현하는 동안 아비딘을 포함한 수지로 비오틴화된 폴리펩티드를 포함한 융합 단백질을 분리하기 위한 방법을 제공한다.

원핵 또는 진핵 세포에 의하여 발현된 이종 폴리펩티드를 분리하는 데 유용한 펩티드 태그는 폴리히스티딘 태그(니켈-킬레이팅 수지에 대하여 치환성을 가진), c-myc 태그, 칼모듈린 결합 단백질(칼모듈린 친화성 크로마토그래피로 분리된), P 물질, RYIRS 태그(항-RYIRS 항체와 결합하는), Glu-Glu 태그, 및 FLAG 태그(항-FLAG 항체와 결합하는)를 포함한다. 예를 들면, 문헌(Luo et al., Arch. Biochem . Biophys. 329:215 (1996), Morganti et al., Biotechnol . Appl . Biochem . 23:67 (1996), 및 Zheng et al., Gene 186:55 (1997))을 참조한다. 이러한 펩티드 태그를 코딩하는 핵산 분자는 예를 들면 Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO)에서 구입가능하다.

다른 형태의 융합 단백질은 IL-22RA 폴리펩티드 및 두 개 이상의 불변 영역 도메인 및 힌지 영역을 함유하지만 가변 영역이 결핍된 면역글로불린 중쇄 불변 영역, 전형적으로 Fc 단편을 포함한다. 한 예시로서, Chang et al., U.S. Patent No. 5,723,125는 사람 인터페론 및 사람 면역글로불린 Fc 단편을 포함한 융합 단백질을 설명한다. 인터페론의 C-말단은 펩티드 링커 부분에 의하여 Fc 단편의 -말단에 연결된다. 펩티드 링커의 예는 주로 면역학적으로 활성이 없는 T 세포 비활성 서열을 포함한 펩티드이다. 예시적 펩티드 링커는 아미노산 서열: GGSGG SGGGG SGGGG S (SEQ ID NO:9)을 가진다. 이 융합 단백질에서, 예시적 Fc 부분은 용액에서 안정하고 보체 활성화 활성이 약간 있거나 없는 사람 γ4 사슬이다. 따라서, 본 발명은 IL-22RA 부분과 사람 Fc 단편을 포함한 IL-22RA 융합 단백질을 고려하는데, IL-22RA 부분의 C-말단은 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함한 펩티드와 같은 펩티드 링커를 통하여 Fc 단편의 N-말단에 부착된다. IL-22RA 부분은 IL-22RA 분자 또는 그것의 단편일 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질은 SEQ ID NO:3 및 Fc 단편(예를 들면, 사람 Fc 단편)(SEQ ID NO:4)의 아미노산을 포함할 수 있다.

다른 변이에서, IL-22RA 융합 단백질은 IgG 서열, IgG 서열의 아미노 말단 단부에 공유결합된 IL-22RA 부분, 및 IL-22RA 부분의 아미노 말단에 공유결합된 신호 펩티드를 포함하며, IgG 서열은 다음 순서로 다음 요소로 구성된다: 힌지 영역, CH₂ 도메인, 및 CH₃ 도메인. 따라서, IgG 서열은 CH₁ 도메인이 결핍되어 있다. IL-22RA 부분은 IL-22RA 리간드와 결합하는 능력과 같은, 본원에 설명된 IL-22RA 활성을 나타낸다. 이 항체와 비-항체 부분 모두를 포함한 융합 단백질을 생성하는 이 일반 접근법은 문헌(LaRochelle et al., EP 742830 (WO 95/21258))에 설명되었다.

IL-22RA 부분 및 Fc 부분을 포함한 융합 단백질은 예를 들면 시험관내 분석 도구로 사용될 수 있다. 예를 들면, 생물학적 샘플에서 IL-22RA 리간드의 존재는 IL-22RA-면역글로불린 융합 단백질을 사용하여 검출될 수 있고, 여기서 IL-22RA 부분은 리간드와 결합하는 데 사용되고, 단백질 A 또는 항-Fc 항체와 같은 거대분자는 융합 단백질을 고체 지지체에 결합시키는 데 사용된다. 이러한 시스템은 작용제 및 IL-22RA 리간드, 예를 들면 IL-22 또는 IL-20과 IL-22 모두와 그것의 수용체의 결합을 방해하는 길항제를 확인하는 데 사용될 수 있다.

항체 융합 단백질의 다른 예는 항원-결합 도메인을 포함한 폴리펩티드 및 IL-22RA 세포외 도메인을 함유한 IL-22RA 단편을 포함한다. 이러한 분자는 IL-22RA 결합 활성을 위하여 특정 조직을 표적화하는 데 사용될 수 있다.

본 발명은 다양한 다른 폴리펩티드 융합을 더 제공한다. 예를 들면, 생물학적 기능을 부여하는 도메인(들)의 일부 또는 전부는 사이토카인 수용체 패밀리의 다른 구성원과 기능적으로 동등한 도메인(들)을 가진 본 발명의 IL-22RA 간에 교환될 수 있다. 폴리펩티드 융합은 다양한 IL-22RA 융합 유사체를 생성하는 재조합 숙주 세포에서 발현될 수 있다. IL-22RA 폴리펩티드는 정제를 위한 친화성 태그 및 표적화 도메인과 같은 두 개 이상의 부분 또는 도메인에 융합될 수 있다 폴리펩티드 융합은 또한 특히 도메인 간에 하나 이상의 절단 부위를 포함할 수 있다. 예를 들면, 문헌(Tuan et al., Connective Tissue Research 34:1 (1996))을 참조한다.

융합 단백질은 융합 단백질의 각 성분을 제조하고 그것들을 화학적으로 콘쥬게이션함으로써 당업자에게 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 대안적으로, 적합한 리딩프레임에 있는 융합 단백질의 두 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 공지된 기술을 사용하여 생성되며 본원에 설명된 방법에 의하여 발현될 수 있다. 융합 단백질의 효소적 및 화학적 절단을 위한 일반적 방법은 예를 들면 문헌(Ausubel (1995), 페이지 16-19 내지 16-25)에 설명된다.

IL-22RA 결합 도메인은 IL-22RA 리간드 작용제의 후보 접촉 부위 아미노산의 돌연변이와 함께 핵 자기 공명, 결정학, 전자 회절 또는 광친화성표지와 같은 기술에 의하여 결정된 구조의 물리적 분석으로 더 특성화될 수 있다. 예를 들면, 문헌(de Vos et al., Science 255:306 (1992), Smith et al., J. Mol . Biol . 224:899 (1992), 및 Wlodaver et al., FEBS Lett . 309:59 (1992))을 참조한다.

본 발명은 또한 화학적 변형된 IL-22RA 조성물을 고려하는데, 여기서 IL-22RA 폴리펩티드는 폴리머와 연결된다. 예시적 IL-22RA 폴리펩티드는 기능적 막통과 도메인이 결핍된 가용성 폴리펩티드, 예를 들면 SEQ ID NO:3을 포함한 폴리펩티드이다. 전형적으로, 폴리머는 IL-22RA 콘쥬게이트가 생리적 환경과 같은 수용성 환경에서 침전하지 않도록 수용성이다. 적합한 폴리머의 예는 아실화를 위한 활성 에스테르, 또는 알킬화를 위한 알데히드와 같은 단일 반응기를 가지도록 변형된 것이다. 이 방식으로, 중합화의 정도는 제어될 수 있다. 반응성 알데히드의 예는 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 또는 모노(C1-C10) 알콕시, 또는 그것의 아릴록시 유도체이다(예를 들면, Harris, et al., U.S. Patent No. 5,252,714 참조). 폴리머는 가지가 있을 수 있거나 없을 수 있다. 더욱이 폴리머의 혼합물은 IL-22RA 콘쥬게이트를 생성하는 데 사용될 수 있다.

치료에 사용된 IL-22RA 콘쥬게이트는 약학적으로 허용되는 수용성 폴리머 부분을 포함할 수 있다. 적합한 수용성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 모노메톡시-PEG, 모노-(C1-C10)알콕시-PEG, 아릴록시-PEG, 폴리-(N-비닐 피롤리돈)PEG, 트레실 모노메톡시 PEG, PEG 프로피온알데히드, bis-숙신이미딜 카보네이트 PEG, 프로필렌 글리콜 호모폴리머, 폴리프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 코폴리머, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들면, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 덱스트란, 셀룰로스, 또는 탄수화물-기재 폴리머를 포함한다. 적합한 PEG는 예를 들면, 5,000, 12,000, 20,000 및 25,000을 포함한 약 600 내지 약 60,000의 분자량을 가질 수 있다. IL-22RA 콘쥬게이트는 또한 이러한 수용성 폴리머의 혼합물을 포함할 수 있다.

IL-22RA 콘쥬게이트의 한 예는 IL-22RA 부분 및 IL-22RA 부분의 N-말단에 부착된 폴리알킬 산화물 부분을 포함한다. PEG는 한 적합한 폴리알킬 산화물이다. 예시로서, IL-22RA은 "PEG화"라고 알려진 과정에 의하여 PEG로 변형될 수 있다. IL-22RA의 PEG화는 당업계에 공지된 PEG화 반응 중 어떤 것에 의하여 수행될 수 있다(예를 들면, EP 0 154 316, Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249 (1992), Duncan and Spreafico, Clin . Pharmacokinet . 27:290 (1994), 및 Francis et al., Int J Hematol 68:1 (1998) 참조). 예를 들면, PEG화는 아실화 반응 또는 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자와의 알킬화 반응에 의하여 수행될 수 있다. 대안적 접근법에서, IL-22RA 콘쥬게이트는 활성화된 PEG를 농축시킴으로서 형성되며, PEG의 말단 히드록시 또는 아미노기는 활성화된 링커에 의하여 대체되었다(예를 들면, Karasiewicz et al., U.S. Patent No. 5,382,657 참조).

아실화에 의한 PEG화는 전형적으로 PEG의 활성 에스테르 유도체를 IL-22RA 폴리펩티드와 반응시키는 것을 필요로 한다. 활성화된 PEG 에스테르의 예는 N-히드록시숙신이미드에 PEG 에스테르화된다. 본원에 설명된 바와 같이, 용어 "아실화"는 IL-22RA과 수용성 폴리머 간에 다음 유형의 결합을 포함한다: 아미드, 카바메이트, 우레탄 등. 아실화에 의하여 PEG화된 IL-22RA를 제조하는 방법은 전형적으로 (a) 하나 이상의 PEG기가 IL-22RA에 부착하는 조건 하에 IL-22RA 폴리펩티드를 PEG(예를 들면 PEG의 알데히드 유도체의 반응성 에스테르)와 반응시키는 단계, 및 (b) 반응 생성물(들)을 얻는 단계를 포함할 것이다. 일반적으로, 아실화 반응을 위한 최적의 반응 조건은 공지된 매개변수 및 원하는 결과에 기초하여 결정될 것이다. 예를 들면, PEG:IL-22RA의 비율이 클 수록, 폴리PEG화된 IL-22RA 생성물의 비율이 더 커진다.

아실화에 의한 PEG화의 생성물은 전형적으로 폴리PEG화된 IL-22RA 생성물이고, 리신 ε-아미노기는 아실 연결기를 통하여 PEG화된다. 연결하는 결합의 예는 아미드이다. 전형적으로, 더 높은 정도의 PEG화를 가진 일부 종이 반응 조건에 따라서 형성될 수 있지만 생성된 IL-22RA는 적어도 95% 모노-, 디-, 또는 트리-PEG화될 것이다. PEG화된 종은 투석, 한외여과, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등과 같은 표준 정제 방법을 사용하여 콘쥬게이트되지 않은 IL-22RA 폴리펩티드에서 분리될 수 있다.

알킬화에 의한 PEG화는 일반적으로 환원제의 존재 하에서 PEG의 말단 알데히드 유도체를 IL-22RA와 반응시키는 단계를 포함한다. PEG기는 -CH₂-NH기를 통하여 폴리펩티드에 부착될 수 있다.

더욱이, 본 발명의 항-IL-22RA 또는 항체 단편은 당업계의 방법 및 본원에 설명된 방법을 사용하여 PEG화될 수 있다.

모노PEG화된 생성물을 생성하기 위한 환원적 알킬화를 통한 유도체화는 상이한 유형의 1차 아미노기의 차별적 반응성을 이용한다. 전형적으로, 반응은 리신 잔기의 ε-아미노기와 단백질의 N-말단 잔기의 α-아미노기 간의 pKa 차이를 이용할 수 있는 pH에서 수행된다. 이러한 선택적 유도체화에 의하여, 단백질에 알데히드와 같은 반응기를 함유한 수용성 폴리머의 부착은 제어된다. 폴리머와의 콘쥬게이션은 리신 측쇄 아미노기와 같은 다른 반응기의 현저한 변형없이 단백질의 N-말단에서 우세하게 발생한다. 본 발명은 IL-22RA 모노폴리머 콘쥬게이트의 실질적으로 동종인 제제를 제공한다.

모노폴리머 IL-22RA 콘쥬게이트의 실질적으로 동종인 집단을 생성하는 환원성 알킬화는 (a) IL-22RA의 아미노 말단에서 α-아미노기의 선택적 변형을 허용하기에 적합한 pH에서 환원성 알킬화 조건 하에 IL-22RA 폴리펩티드를 반응성 PEG와 반응시키는 단계, 및 (b) 반응성 생성물(들)을 얻는 단계를 포함할 수 있다. 환원성 알킬화에 사용된 환원제는 수용액에서 안정해야 하고 환원성 알킬화의 초기 과정에서 형성된 Schiff 염기만을 환원시킬 수 있다. 예시적 환원제는 소듐 보로하이드리드, 소듐 시아노보로하이드리드, 디메틸아민 보란, 트리메틸아민 보란, 및 피리딘 보란을 포함한다.

모노폴리머 IL-22RA 콘쥬게이트의 실질적 동종 집단의 경우, 환원성 알킬화 반응 조건은 IL-22RA의 N-말단에 수용성 폴리머 부분의 선택적 부착을 허용하는 것이다. 이러한 반응 조건은 일반적으로 리신 아미노기와 N-말단의 α-아미노기 간의 pKa 차이를 제공한다. 대체로, pH가 더 낮은 경우, N-말단 α기의 반응성이 낮을 수 록, 최적의 조건을 달성하기 위하여 더 많은 폴리머가 필요하기 때문에, 단백질에 대하여 더 초과하는 양의 폴리머가 바람직할 것이다. pH가 더 높은 경우, 많은 반응기가 이용가능하기 때문에 폴리머:IL-22RA는 클 필요가 없다. 전형적으로, pH는 3 내지 9, 또는 3 내지 6의 범위 내에 있을 것이다. 이 방법은 호모다이머, 헤테로다이머 또는 멀티머 가용성 수용체 콘쥬게이트를 포함한 IL-22RA를 제조하기 위하여 사용될 수 있다.

고려할 다른 요소는 수용성 폴리머의 분자량이다. 일반적으로, 폴리머의 분자량이 클수록, 단백질에 부착될 수 있는 폴리머 분자의 수는 적다. PEG화 반응의 경우, 전형적인 분자량은 약 2 kDa 내지 약 100 kDa, 약 5 kDa 내지 약 50 kDa, 또는 12 kDa 내지 약 25 kDa이다. 수용성 폴리머 대 IL-22RA의 몰비는 일반적으로 1:1 내지 100:1의 범위에 있을 것이다. 전형적으로, 수용성 폴리머 대 IL-22RA의 몰비는 폴리PEG화의 경우 1:1 내지 20:1, 그리고 모노PEG화의 경우 1:1 내지 5:1일 것이다.

폴리펩티드 및 수용성 폴리머 부분을 포함한 콘쥬게이트를 생성하기 위한 일반적 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(Karasiewicz et al., U.S. Patent No. 5,382,657, Greenwald et al., U.S. Patent No. 5,738, 846, Nieforth et al., Clin . Pharmacol . Ther . 59:636 (1996), Monkarsh et al., Anal. Biochem . 247:434 (1997))을 참조한다. 이 방법은 IL-22RA-함유 호모다이머, 헤테로다이머 또는 멀티머 가용성 수용체 콘쥬게이트를 제조하는 데 사용될 수 있다.

본 발명은 본원에 설명된 가용성 수용체 또는 항체와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한 조성물을 고려한다. 이러한 조성물은 담체를 더 포함할 수 있다. 담체는 종래의 유기 또는 무기 담체일 수 있다. 담체의 예로는 물, 완충액, 알코올, 프로필렌 글리콜, 마크로골, 참기름, 옥수수 기름 등이 있다.

7. IL-22RA 폴리펩티드의 분리

본 발명의 폴리펩티드는 거대분자, 특히 다른 단백질 및 핵산을 오염시키는 것과 관련하여, 적어도 약 80% 순도, 적어도 약 90% 순도, 적어도 약 95% 순도, 또는 95% 이상, 예를 들면 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 순도로 정제될 수 있으며, 감염성이 없고 발열제가 없을 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 99.9% 이상의 순도인 약학적으로 순수한 상태로 정제될 수 있다. 어떤 제조에서, 정제된 폴리펩티드는 다른 폴리펩티드, 특히 동물 기원의 다른 폴리펩티드가 실질적으로 없다.

분별법 및/또는 종래의 정제 방법은 천연 공급원(예를 들면, 사람 조직 공급원)으로부터 정제된 IL-22RA의 제제, 합성 IL-22RA 폴리펩티드, 및 재조합 IL-22RA 폴리펩티드 및 재조합 숙주 세포로부터 정제된 융합 IL-22RA 폴리펩티드를 얻는 데 사용될 수 있다. 대체로, 황산암모늄 침전 및 산 또는 카오트로프 추출은 샘플의 분별에 사용될 수 있다. 예시적 정제 단계는 히드록시아파티트, 크기 배제, FPLC 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 적합한 크로마토그래피 매질은 유도체화된 덱스트란, 아가로스, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 특수 실리카 등을 포함한다. PEI, DEAE, QAE 및 Q 유도체가 적합하다. 예시적 크로마토그래피 매질은 페닐, 부틸, 또는 옥틸기, 예를 들면 페닐-세파로스 FF(Pharmacia), 토요펄 부틸 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), 옥틸-세파로스 (Pharmacia) 등; 또는 폴리아크릴 수지, 예를 들면 Amberchrom CG 71 (Toso Haas) 등을 포함한다. 적합한 고체 지지체로는 유리 비드, 실리카-기재 수지, 셀룰로스 수지, 아가로스 비드, 교차결합된 아가로스 비드, 폴리스티렌 비드, 교차결합된 폴리아크릴아미드 수지 등이 있는데, 이것들이 사용되는 조건 하에서 불용성이다. 이들 지지체는 아미노기, 카르복실기, 술프히드릴기, 히드록실기 및/또는 탄수화물 부분에 의한 단백질의 부착을 허용하는 반응기로 변형될 수 있다.

결합 화학의 예는 시아노겐 브로미드 활성화, N-히드록시숙신이미드 활성화, 에폭시드 활성화, 술프히드릴 활성화, 히드라지드 활성화, 및 카보디이미드 결합 화학의 카르복실 및 아미노산 유도체를 포함한다. 이들 및 다른 고체 매질은 주지되어 있고 당업계에서 널리 사용되며 상업적 공급업자로부터 구입가능하다. 폴리펩티드 분리 및 정제를 위한 특정 방법의 선택은 일반적인 설계의 문제이고 선택된 지지체의 특성에 의하여 부분적으로 결정된다. 예를 들면, 문헌(Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology 1988), 및 Doonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996))을 참조한다.

IL-22RA 분리 및 정제의 추가적 변화는 당업자에 의하여 고안될 수 있다. 예를 들면, 하기에 설명하는 바와 같이 얻어진 항-IL-22RA 항체는 면역친화성 정제의 대용량을 분리하는 데 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 폴리펩티드는 어떤 특성을 이용함으로써 분리될 수 있다. 예를 들면, 고정된 금속 이온 흡수(IMAC) 크로마토그래피는 폴리히스티딘 태그를 포함한 것들을 포함한, 히스티딘-풍부 단백질을 정제하는 데 사용될 수 있다. 간단히 말하면, 겔은 처음에 2가 금속 이온으로 하전되어 킬레이트를 형성한다(Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (1985)). 히스티딘-풍부 단백질은 사용된 금속 이온에 따라서 다른 친화성을 가진 이 매트릭스에 흡수될 것이며, 경쟁 용출, pH 낮춤, 또는 강한 킬레이트제의 사용에 의하여 용출될 것이다. 정제의 다른 방법은 렉틴 친화성 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피에 의한 글리코실화된 단백질의 정제를 포함한다(M. Deutscher, (ed.), Meth. Enzymol. 182:529 (1990)). 본 발명의 추가 구체예에서, 관심있는 폴리펩티드와 치환성 태그(예를 들면, 말토스-결합 단백질, 면역글로불린 도메인)의 융합은 정제를 촉진하도록 구성될 수 있다. 더욱이, IL-22RA 세포외 도메인의 리간드-결합 특성은 예를 들면 IL-17C 리간드가 칼럼에 결합되고 IL-22RA을 포함하는 수용체가 결합되며 이어서 표준 크로마토그래피 방법을 사용하여 용출되는 친화성 크로마토그래피를 사용함으로써 예를 들면 IL-22RA을 포함하는 가용성 수용체의 정제를 위하여 이용될 수 있다.

IL-22RA 폴리펩티드 또는 그것의 단편은 또한 전술한 바와 같이 화학 합성을 통하여 제조될 수 있다. IL-22RA 폴리펩티드는 모노머 또는 멀티머일 수 있고, 글리코실화되거나 글리코실화되지 않을 수 있으며, PEG화되거나 PEG화되지 않을 수 있고, 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

8. IL-22RA 단백질에 대한 항체의 생성

예를 들면 IL-22RA 발현 벡터의 생성물 또는 항원으로서 천연 공급원으로부터 분리된 IL-22RA을 사용하여 IL-22RA에 대한 항체를 얻을 수 있다. 특히 유용한 항-IL-22RA 항체는 IL-22RA과 "특이적으로 결합한다". 항체가 다음 두 가지 특성 중 적어도 하나를 나타내는 경우 항체는 특이적으로 결합하는 것으로 고려된다: (1) 항체가 결합 활성의 역치 수준으로 IL-22RA에 결합한다, 그리고 (2) 항체가 IL-22RA에 관련된 폴리펩티드와 유의하게 교차반응하지 않는다.

첫 번째 특성과 관련하여, 항체는 이들이 10⁶ M^-1 이상, 바람직하게는 10⁷ M^-1 이상, 더 바람직하게는 10⁸ M^-1 이상, 그리고 가장 바람직하게는 10⁹ M^-1 이상의 결합 친화성(Ka)을 가진 IL-22RA 폴리펩티드, 펩티드 또는 에피토프에 결합한다면 특이적으로 결합한다. 항체의 결합 친화성은 예를 들면 Scatchard 분석으로 당업자에 의하여 용이하게 결정될 수 있다(Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660 (1949)). 두 번째 특성과 관련하여, 항체는 그것들이 표준 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 현재 공지된 폴리펩티드를 검출하지 않고 IL-22RA을 검출한다면 관련된 폴리펩티드 분자와 유의하게 교차반응하지 않는다. 공지된 관련 폴리펩티드의 예는 공지된 사이토카인 수용체를 포함한다.

항-IL-22RA 항체는 항원성 IL-22RA 에피토프-보유 펩티드 및 폴리펩티드를 사용하여 생성될 수 있다. 본 발명의 항원성 에피토프-보유 펩티드 및 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3에 함유된 적어도 9, 또는 15 내지 약 30 아미노산의 서열 또는 본원에 개시된 다른 아미노산 서열을 함유한다. 그러나, 30 내지 50 아미노산 또는 임의의 길이를 함유한 본 발명의 아미노산 서열의 큰 부분 및 본 발명의 폴리펩티드의 전체 아미노산 서열을 포함한 펩티드 또는 폴리펩티드는 또한 IL-22RA과 결합하는 항체를 유도하는데 유용하다. 에피토프-보유 펩티드의 아미노산 서열이 수용성 용매에서 실질적 용해도를 제공하도록 선택되는 것이 바람직하다(즉, 서열은 상대적으로 친수성 잔기를 포함하고, 소수성 잔기는 전형적으로 회피하게 된다). 더욱이, 프롤린 잔기를 함유한 아미노산 잔기는 또한 항체 생성에 바람직할 수 있다.

한 예시로서, IL-22RA에서의 잠재적 항원성 부위는 LASERGENE의 PROTEAN 프로그램(버젼 3.14)(DNASTAR; Madison, WI)에 의하여 실행된 Jameson-Wolf 방법(Jameson and Wolf, CABIOS 4:181, (1988))을 사용하여 확인될 수 있다. 디폴트 매개변수를 이 분석에 사용하였다.

Jameson-Wolf 방법은 단백질 구조 예상을 위하여 6개의 주요 서브루틴을 조합하여 잠재적 항원성 결정기를 예상한다. 간단히 말하면, Hopp-Woods 방법(Hopp et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78:3824 (1981))은 처음에 가장 큰 국부 친수성의 영역을 나타내는 아미노산 서열을 확인하는 데 사용되었다(매개변수: 7 잔기의 평균을 냄). 두 번째 단계에서, Emini 방법(Emini et al., J. Virology 55:836 (1985))은 표면 확률을 계산하는데 사용되었다(매개변수: 표면결정역치(0.6) = 1). 세 번째, Karplus-Schultz 방법(Karplus and Schultz, Naturwissenschaften 72:212 (1985))은 백본 사슬 가요성을 예측하는데 사용되었다(매개변수: 가요성 역치(0.2) = 1). 분석의 네 번째 및 다섯 번째 단계에서, 2차 구조 예상은 Chou-Fasman의 방법(Chou, "Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Composi-tion", in Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Fasman (ed.), 페이지 549-586 (Plenum Press 1990), 및 Garnier-Robson, Garnier et al., J. Mol. Biol. 120:97 (1978) (Chou-Fasman 매개변수: 형태 표 = 64 단백질; α 영역 역치 = 103; β 영역 역치 = 105; Garnier-Robson 매개변수: α 및 β 결정 상수 = 0))을 사용하여 데이터에 적용되었다. 6번째 서브루틴에서, 가요성 파라미터 및 수치요법/용매 접근가능성 인자는 "항원성 지수"라고 지시된 표면 윤곽 값을 결정하기 위하여 조합될 수 있다. 마지막으로, 피크 확대 기능을 항원성 지수에 적용하였는데, 이것은 내부 영역에 관한 표면 영역의 이동성에서 유래된 추가 자유 에너지를 설명하는 각 피크 값의 20, 40, 60, 또는 80%을 추가함으로써 주요 표면 피크를 확대한다. 그러나, 이 계산은 나선 영역이 덜 유연한 경향이 있기 때문에 나선 영역에 있는 어떤 주요 피크에도 적용되지 않았다.

이 분석 결과는 SEQ ID NO:3의 다음 아미노산 서열들이 적합한 항원성 펩티드를 제공한다는 것을 나타내었다: Hopp/Woods 친수성 프로파일을 이용하여 SEQ ID NO:3 내에서 가장 항원성 잠재성을 갖는 영역들을 결정할 수 있다(Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci.78:3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. [pound]8:1-18, 1986 and Triquier et al., Protein Engineering 11:153-169, 1998). 이 프로파일은 슬라이딩 6 잔기 윈도우에 기초한다. 감춰진 G, S, 및 T 잔기와 노출된 H, Y, 및 W 잔기는 무시했다. 더욱이, 예를 들면, DNASTAR Protean 프로그램(DNASTAR, Inc., Madison, WI)을 사용하여 Jameson-Wolf 플롯에 의하여 예측된 SEQ ID NO:3 내의 IL-22RA 항원성 에피토프가 바람직한 항원성 에피토프로 작용하며, 당업자에 의하여 결정될 수 있다. 이러한 항원성 에피토프는 (1) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 1(Pro)부터 6(Asp)까지; (2) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 26(Ser)부터 32(Pro)까지; (3) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 41(Lys)부터 47(Asp)까지; (4) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 49(Val)부터 62(Cys)까지; (5) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 41(Lys)부터 62(Cys)까지; (6) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 84(Ala)부터 97(Ser)까지; (7) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 103(Thr)부터 108(Asp)까지; (8) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 130(Arg)부터 135(His)까지; (9) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 164(Gly)부터 166(Lys)까지; (10) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 175(Tyr)부터 179(Glu)까지; (11) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 193(Lys)부터 196(Ala)까지; (12) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 203(Lys)부터 209(Thr)까지. 본 발명은 IL-22RA에 대한 항체를 발생시키는데 있어서 또는 본 발명의 중화 모노클로날 항체를 스크린 또는 확인하는 도구로서 항원성 펩티드 1 내지 12 중 어느 하나의 사용을 고찰한다. 또한, 본 발명은 항원성 펩티드 1 내지 10 중 적어도 하나를 포함하는 폴리펩티드를 고찰한다. 본 발명은 IL-22RA에 대한 항체를 발생시키는데 있어서 뿐만 아니라 Il-22 및 IL-20(개별적으로 또는 함께)의 활성과 결합, 그것을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 항-IL-22RA 모노클로날 항체를 확인하고 스크린하는데 있어서 본원에 설명된 어떤 항원성 펩티드 또는 에피토프의 사용을 고찰한다.

더욱이, 적합한 항원은 또한 IL-22RA 사이토카인 결합을 포함한 IL-22RA 폴리펩티드, 또는 다른 I형 또는 II형 사이토카인 세포외 도메인과 조합된 상기에 개시된 세포외 도메인, 예를 들면 가용성 IL-22RA 헤테로다이머 또는 멀티머 폴리펩티드, 예를 들어 가용성 IL-22RA/CRF2-4, IL-22RA/zcytor11, IL-22RA/zcytor7 등을 형성하는 것들을 포함한다.

재조합 IL-22RA 단백질 또는 천연 공급원으로부터 분리된 IL-22RA에 대한 폴리클로날 항체는 당업자에게 주지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Green et al., "Production of Polyclonal Antisera", in Immunochemical Protocols(Manson ed.), p.1-5(Humana Press 1992) 및 Williams et al. Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies", in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), p. 15 (Oxford University Press 1995). IL-22RA 폴리펩티드의 면역원성은 명반(수산화알루미늄) 또는 프로인드 완전 또는 불완전 보조제와 같은 보조제의 사용을 통하여 증가될 수 있다. 면역화에 유용한 폴리펩티드는 또한 IL-22RA 또는 그것의 부분과 면역글로불린 폴리펩티드 또는 말토스 결합 단백질의 융합과 같은 융합 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드 면역원은 전체길이 분자 또는 그것의 부분일 수 있다. 폴리펩티드 부분이 "합텐-유사"인 경우, 이러한 부분은 면역화를 위하여 거대분자 담체(예를 들면, 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌(KLH), 소 혈청 알부민(BSA) 또는 파상풍 톡소이드)에 이롭게 연결되거나 결합될 수 있다.

폴리클로날 항체는 말, 소, 개, 닭, 레트, 마우스, 토끼, 기니 돼지, 염소, 또는 양과 같은 동물에서 생성되지만, 본 발명의 항-IL-22RA 항체는 또한 유인 영장류 항체에서 유래될 수 있다. 개코원숭이에서 진단학적으로 및 치료학적으로 유용한 항체를 생성하기 위한 일반 기술은 예를 들면 문헌(Goldenberg et al., 국제 특허공보 WO 91/11465, 및 Losman et al., Int. J. Cancer 46:310 (1990))에서 확인될 수 있다.

대안적으로, 모노클로날 항-IL-22RA 항체를 생성할 수 있다. 특정 항원에 대한 쥐과 모노클로날 항체는 당업자에게 공지된 방법에 의하여 얻어질 수 있다(예를 들면, Kohler et al., Nature 256:495 (1975), Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, Vol. 1, 페이지 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) ["Coligan", Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli", in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), 페이지 93 (Oxford University Press 1995) 참조).

간단히 말하면, 마우스에 IL-22RA 유전자 생성물을 포함한 조성물을 주사하는 단계, 혈청 샘플을 제거함으로써 항체 생산의 존재를 입증하는 단계, B 림프구를 얻기 위하여 비장을 제거하는 단계, 하이브리도마를 생산하기 위하여 B 림프구를 골수종 세포와 융합하는 단계, 하이브리도마를 클로닝하는 단계, 항원에 대한 항체를 생산하는 양성 클론을 선택하는 단계, 항원에 대한 항체를 생산하는 클론을 배양하는 단계, 및 하이브리도마 배양물로부터 항체를 분리하는 단계에 의하여 모노클로날 항체를 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 항-IL-22RA 항체는 사람 모노클로날 항체에서 유래될 수 있다. 사람 모노클로날 항체는 항원성 자극에 반응하여 특정 사람 항체를 생성하도록 조작된 트랜스제닉 마우스에서 얻어진다. 이 기술에서, 사람 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 요소는 내인성 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 표적이된 파괴를 함유한 배아 줄기세포주에서 유래된 마우스의 세포주에 도입된다. 트랜스제닉 마우스는 사람 항원에 특이적인 사람 항체를 합성할 수 있고, 마우스는 사람 항체-분비 하이브리도마를 생성하는 데 사용될 수 있다. 트랜스제닉 마우스에서 사람 항체를 얻기 위한 방법은 예를 들면 문헌(Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994), 및 Taylor et al., Int . Immun . 6:579 (1994))에 설명된다.

다양한 잘 확립된 기술에 의하여 하이브리도마 배양물에서 모노클로날 항체를 분리하고 정제할 수 있다. 이러한 분리 기술은 단백질-A 세파로스가 있는 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 이온-교환 크로마토그래피를 포함한다(예를 들면, Coligan, 페이지 2.7.1-2.7.12 및 페이지 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, 페이지 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992) 참조).

특정한 사용의 경우, 항-IL-22RA 항체의 단편을 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 항체 단편은 예를 들면 항체의 단백질가수분해에 의하여 얻을 수 있다. 항체 단편은 종래의 방법에 의하여 전체 항체의 펩신 또는 파파인 분해에 의하여 얻을 수 있다. 한 예시로서, 항체 단편은 F(ab')₂라고 나타낸 5S 단편을 제공하기 위하여 펩신을 통한 항체의 효소적 절단에 의하여 생성될 수 있다. 이 단편은 3.5 Fab' 1가 단편을 생성하는 티올 환원제를 사용하여 더 절단될 수 있다. 선택적으로, 절단 반응은 이황화 결합의 절단으로부터 발생한 술프히드릴기의 차단기를 사용하여 수행될 수 있다. 한 예시로서, 펩신을 이용한 효소적 절단은 두 1가 Fab 단편 및 Fc 단편을 직접 생성한다. 이들 방법은 예를 들면 문헌(Goldenberg, U.S. patent No. 4,331,647, Nisonoff et al., Arch Biochem . Biophys . 89:230 (1960), Porter, Biochem . J. 73:119 (1959), Edelman et al., in Methods in Enzymology Vol. 1, 페이지 422 (Academic Press 1967), 및 Coligan, 페이지 2.8.1-2.8.10 및 2.10.-2.10.4)에 설명된다.

또한 1가 경쇄-중쇄 단편을 형성하는 중쇄의 분리, 단편의 추가 절단, 또는 달느 효소적, 화학적 또는 유전학적 기술과 같은 절단 항체의 다른 방법은 단편이 무결 항체에 의하여 인식된 항원에 결합하는 한 사용될 수 있다.

예를 들면, Fv 단편은 V_H와 V_L 사슬의 결합을 포함한다. 이 결합은 문헌(Inbar et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 69:2659 (1972))에 설명된 바와 같이 비공유 결합일 수 있다. 대안적으로, 가변 사슬은 분자내 이황화 결합에 의하여 결합되거나 글루타르알데히드와 같은 화학물질에 의하여 교차결합될 수 있다(예를 들면, Sandhu, Crit . Rev. Biotech. 12:437 (1992)).

Fv 단편은 펩티드 링커에 의하여 연결된 V_H 및 V_L 사슬을 포함할 수 있다. 이들 단쇄 항원 결합 단백질(scFv)은 올리고뉴클레오티드에 의하여 연결된 V_H 및 V_L 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 포함한 구조 유전자를 구성함으로써 제조된다. 구조 유전자는 발현 벡터에 삽입되고 이어서 대장균과 같은 숙주 세포에 도입된다. 재조합 숙주 세포는 두 V 도메인을 가교하는 링커 펩티드를 가진 단일 폴리펩티드를 합성한다. svFv를 생성하기 위한 방법은 예를 들면 문헌(Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97 (1991) (또한, Bird et al., Science 242:423 (1988), Ladner et al., U.S. Patent No. 4,946,778, Pack et al., Bio/Technology 11:1271 (1993), 및 Sandhu, 상기) 참조))에 설명된다.

한 예시로서, 림프구를 시험관내에서 IL-22RA 폴리펩티드에 노출시키고, 파지 또는 유사한 벡터에서 항체 디스플레이 라이브러리를 선택함으로써(예를 들면, 고정된 또는 표지된 IL-22RA 단백질 또는 펩티드의 사용을 통하여) scFV를 얻을 수 있다. 잠재적 IL-22RA 폴리펩티드 결합 도메인을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 파지(파지 디스플레이) 또는 대장균과 같은 박테리아에 디스플레이된 무작위 펩티드 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 많은 방식으로, 예를 들면, 무작위 돌연변이유발 및 무작위 폴리뉴클레오티드 합성을 통하여 얻을 수 있다. 이들 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리는 단백질 또는 폴리펩티드, 예를 들면 리간드 또는 수용체, 생물학적 또는 합성 거대분자, 또는 유기 또는 무기 물질일 수 있는 공지된 표적과 상호작용하는 펩티드를 스크린하는 데 사용될 수 있다. 이러한 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있고(Ladner et al., U.S. Patent No. 5,223,409, Ladner et al., U.S. Patent No. 4,946,778, Ladner et al., U.S. Patent No. 5,403,484, Ladner et al., U.S. Patent No. 5,571,698, 및 Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996)) 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리 및 이러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 키트는 예를 들면 Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA), 및 Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ)로부터 상업적으로 구입가능하다. 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리는 IL-22RA에 결합하는 단백질을 확인하기 위하여 본원에 개시된 IL-22RA 서열을 사용하여 스크린될 수 있다.

다른 형태의 항체 단편은 단일 상보성-결정 영역(CDR)을 코딩하는 펩티드이다. CDR 펩티드("최소 인식 단위체")는 관심있는 항체의 CDR을 코딩하는 유전자를 구성함으로써 얻을 수 있다. 이러한 유전자는 예를 들면 항체-생산 세포의 RNA으로부터 가변 영역을 합성하기 위하여 중합효소 연쇄반응을 이용하여 제조된다(예를 들면, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106 (1991), Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies", in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), 페이지 166 (Cambridge University Press 1995), and Ward et al., Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), 페이지 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995) 참조).

대안적으로, 항-IL-22RA 항체는 "사람화" 모노클로날 항체로부터 유래할 수 있다. 마우스 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변부의 마우스 상보적 결정 영역을 사람 가변 도메인으로 옮김으로써 사람화 모노클로날 항체를 생성한다. 그 다음 사람 항체의 전형적인 잔기는 쥐과 대응물의 골격 영역에서 치환된다. 사람화된 모노클로날 항체에서 유래된 항체 성분의 사용은 쥐과 불변 영역의 면역원성과 연관된 잠재적 문제를 제거한다. 쥐과 면역글로불린 가변 도메인을 클로닝하기 위한 일반 기술은 예를 들면 문헌(Orlandi et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 86:3833 (1989))에 설명된다. 사람화 모노클로날 항체를 생산하기 위한 기술은 예를 들면 문헌(Jones et al., Nature 321:522 (1986), Carter et al., Proc . Nat'l Acad . Sci. USA 89:4285 (1992), Sandhu, Crit . Rev. Biotech. 12:437 (1992), Singer et al., J. Immun . 150:2844 (1993), Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995), Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies", in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), 페이지 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996), 및 Queen et al., U.S. Patent No. 5,693,762 (1997))에 설명된다.

더욱이, 본 발명의 항-IL-22RA 항체 또는 항체 단편은 당업계의 방법 및 본원에 설명된 방법을 사용하여 PEG화될 수 있다.

폴리클로날 항-유전형 항체는 표준 기술을 사용하여 항-IL-22RA 항체 또는 항체 단편을 가진 동물을 면역화함으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Green et al., "Production of Polyclonal Antisera", in Methods In Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (ed.), 페이지 1-12 (Humana Press 1992)을 참조한다. 또한, Coligan(페이지 2.4.1-2.4.7)을 참조한다. 대안적으로, 모노클로날 항-유전형 항체는 전술한 기술들을 통하여 면역원인 항-IL-22RA 항체 또는 항체 단편을 사용하여 제조될 수 있다. 다른 대안으로서, 사람화 항-유전형 항체 또는 유인 영장류 항-유전형 항체는 전술한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 항-유전형 항체를 생산하기 위한 방법은 예를 들면 문헌(Irie, U.S. Patent No. 5,208,146, Greene, et. al., U.S. Patent No. 5,637,677, 및 Varthakavi and Minocha, J. Gen. Virol . 77:1875 (1996))에 설명된다.

항-IL-22RA 항체는 검출가능한 표지와 콘쥬게이트되어 항-IL-22RA 면역콘쥬게이트를 형성할 수 있다. 적합한 검출가능한 표지는, 예를 들면, 방사성동위원소, 형광 표지, 화학발광 표지, 효소 표지, 생물발광, 콜로이드 골드를 포함한다. 이러한 검출가능하게 표지된 면역콘쥬게이트의 제조 및 검출 방법은 당업자에게 주지되어 있으며, 하기에 더 상세하게 설명된다.

검출가능한 표지는 자가방사법에 의하여 검출된 방사성동위원소일 수 있다. 본 발명의 목적에 특히 유용한 동위원소는 ³H, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S 및 ¹⁴C이다.

항-IL-22RA 면역콘쥬게이트는 또한 형광 화합물로 표지될 수 있다. 형광으로 표지된 항체의 존재는 면역콘쥬게이트를 적합한 파장에 노출시키고 생성된 형광을 검출함으로써 결정된다. 형광 표지 화합물은 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데하이드 및 플루오레스카민을 포함한다.

대안적으로, 항-IL-22RA 면역콘쥬게이트는 항체 성분을 화학발광 화합물에 결합시킴으로써 검출가능하게 표지될 수 있다. 화학발광-태그가 있는 면역콘쥬게이트의 존재는 화학반응의 과정 동안 발생하는 발광의 존재를 검출함으로써 결정된다. 화학발광 표지 화합물의 예는 루미놀, 이소루미놀, 방향족 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄염 및 옥살레이트 에스테르를 포함한다.

유사하게, 생물발광 화합물은 본 발명의 항-IL-22RA 면역콘쥬게이트를 표지하는 데 사용될 수 있다. 화학발광은 촉매 단백질이 화학발광 반응의 효율성을 증가시키는 생물학적 시스템에서 확인된 화학발광의 유형이다. 생물발광 단백질의 존재는 발광의 존재를 검출함으로써 결정된다. 표지에 유용한 생물발광 화합물은 루시페린, 루시페라제 및 에쿼린을 포함한다.

대안적으로, 항-IL-22RA 면역콘쥬게이트는 항-IL-22RA 항체 성분을 효소에 연결시킴으로써 검출가능하게 표지될 수 있다. 항-IL-22RA 효소 콘쥬게이트가 적합한 기질의 존재 하에 인큐베이션될 때, 효소 부분은 기질과 반응하여 예를 들면 분광광도계, 형광계 또는 시각적 수단에 의하여 검출될 수 있다. 다중특이적 면역콘쥬게이트를 검출가능하게 표지하는 데 사용될 수 있는 효소의 예는 β-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제, 페록시다제 및 알칼린 포스파타제를 포함한다.

당업자라면 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 다른 적합한 표지를 알 것이다. 마커 부분을 항-IL-22RA 항체에 결합시키는 것은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 이와 관련한 전형적인 방법론은 문헌(Kennedy et al., Clin. Chim . Acta 70:1 (1976), Schurs et al., Clin . Chim . Acta 81:1 (1977), Shih et al., Int'l J. Cancer 46:1101 (1990), Stein et al., Cancer Res. 50:1330 (1990), 및 Coligan, 상기 참조)에 설명된다.

더욱이, 면역화학적 검출의 편리성 및 다용도성은 아비딘, 스트렙타비딘, 및 비오틴과 콘쥬게이트된 항-IL-22RA 항체를 사용함으로써 향상될 수 있다(예를 들면, 문헌(Wilchek et al. (eds.), "Avidin-Biotin Technology", Methods In Enzymology, Vol. 184 (Academic Press 1990), and Bayer et al., "Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology", in Methods In Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), 페이지 149-162 (The Humana Press, Inc. 1992) 참조).

면역분석을 수행하기 위한 방법은 잘 확립되어 있다. 예를 들면, 문헌(Cook and Self, "Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays", in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), 페이지 180-208, (Cambridge University Press, 1995), Perry, "The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology", in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch and Lennox (eds.), 페이지 107-120 (Wiley-Liss, Inc. 1995), 및 Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996))을 참조한다.

본 발명은 IL-22RA 유전자 발현을 위한 면역학적 진단 분석을 수행하기 위한 키트를 고려한다. 이러한 키트는 항-IL-22RA 항체, 또는 항체 단편을 포함한 적어도 한 용기를 포함한다. 키트는 또한 IL-22RA 항체 또는 항체 단편의 존재를 지시할 수 있는 하나 이상의 시약을 포함한 두 번째 용기를 포함할 수 있다. 이러한 지시 시약의 예는 방사성 표지, 형광 표지, 화학발광 표지, 효소 표지, 생물발광 표지, 콜로이드 골드 등과 같은 검출가능한 표지를 포함한다. 키트는 또한 IL-22RA 단백질을 검출하기 위하여 IL-22RA 항체 또는 항체 단편이 사용되는 사용자에게 운반하기 위한 수단을 포함한다. 예를 들면, 명시된 설명서는 동봉된 항체 또는 항체 단편이 IL-22RA을 검출하는 데 사용될 수 있다는 것을 진술할 수 있다. 명시된 재료는 직접 용기에 사용될 수 있고, 또는 명시된 재료는 포장된 삽입물의 형태로 제공될 수 있다.

9. IL-22 또는 IL-20과 IL-22 모두에 대한 IL-22RA의 결합을 길항하는 항-IL-22RA 항체의 사용

본원에서 유용한 항체를 생성하거나 선택하기 위한 대안적 기술은 가용성 IL-22RA 수용체 폴리펩티드 또는 그것의 단편, 예를 들면 항원성 에피토프에 대한 시험관내 림프구 노출 및 파지 또는 유사한 벡터에서 항체 디스플레이 라이브러리의 선택(예를 들면, 고정된 또는 표지된 가용성 IL-22RA 수용체 폴리펩티드 또는 그것의 단편, 예를 들면 항원성 에피토프의 사용을 통하여)을 포함한다. 가용성 IL-22RA 수용체 폴리펩티드 또는 그것의 단편, 예를 들면 항원성 에피토프와 같은 잠재적 결합 도메인을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 파지(파지 디스플레이) 또는 대장균과 같은 박테리아에 디스플레이된 무작위 펩티드 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 여러가지 방법, 예를 들면 무작위 돌연변이유발 및 무작위 폴리뉴클레오티드 합성을 통해서 얻을 수 있다. 이들 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리는 단백질 또는 폴리펩티드, 예를 들면 리간드 또는 수용체, 생물학적 또는 합성적 거대분자, 또는 유기 또는 무기 물질일 수 있는 공지된 표지와 상호작용하는 펩티드를 스크린하는 데 사용될 수 있다. 이러한 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리를 만들고 스크리닝하는 기술은 당업계에 공지되어 있고(Ladner et al., US Patent NO. 5,223,409; Ladner et al., US Patent NO. 4,946,778; Ladner et al., US Patent NO. 5,403,484 및 Ladner et al., US Patent NO. 5,571,698), 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리 및 이러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 키트는 예를 들면 Clontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) 및 Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ)에서 상업적으로 구입가능하다. 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리는 IL-22RA-포함 수용체 폴리펩티드에 결합하는 단백질을 확인하기 위하여 본원에 개시된 항원성 에피토프 폴리펩티드 서열과 같은 가용성 IL-22RA 수용체 폴리펩티드 또는 그것의 단편을 사용하여 스크린될 수 있다. 가용성 IL-22RA-포함 수용체 폴리펩티드와 상호작용하는 이들 "결합 폴리펩티드"는 세포에 태그를 다는 것; 친화성 정제에 의하여 동족 폴리펩티드를 분리하는 데 사용될 수 있으며, 이것들은 약물, 독소, 방사선뉴클레오티드 등에 직접적 또는 간접적으로 콘쥬게이션될 수 있다. 이들 결합 폴리펩티드는 또한 발현 라이브러리를 스크리닝하고 예를 들면 IL-22 리간드와 수용체 간의 상호작용을 결합, 차단, 억제, 감소, 상쇄 또는 중화, 또는 수용체에 대한 바이러스의 결합에 대한 활성을 중화하기 위한 분석적 방법에 사용될 수 있다. 결합 폴리펩티드는 또한 가용성 IL-22RA-포함 수용체 폴리펩티드의 순환 수준을 결정하고; 잠재적인 병리 또는 질환의 마커인 가용성 또는 불용성 IL-22RA-포함 수용체를 검출하거나 정량화하기 위한 진단 분석에 사용될 수 있다. 이들 결합 폴리펩티드는 또한 가용성 또는 막결합 IL-22RA 모노머 수용체 또는 IL-22RA 호모다이머, 헤테로다이머 또는 멀티머 폴리펩티드 결합(예를 들면, 리간드에 대한)과 시험관내 및 생체내에서의 신호전달을 차단 또는 억제하는 "길항제"로서 작용할 수 있다. 다시 말하면, 이들 결합 폴리펩티드는 항-IL-22RA 모노머 수용체 또는 항-IL-22RA 호모다이머, 헤테로다이머 또는 멀티머 폴리펩티드로 작용하고 수용체 활성 또는 단백질 결합뿐만 아니라 IL-22 또는 IL-20과 IL-22 모두의 활성을 억제하는데 유용하다. 본 발명의 천연 수용체 복합체에 대하여 발생한 항체, 및 IL-22RA-에피토프-결합 항체, 및 항-IL-22RA 중화 모노클로날 항체는 그것들이 IL-22RA에 대하여 더 특이적으로 작용할 수 있으며 IL-20 또는 IL-20과 IL-22 모두를 억제할 수 있으므로 바람직한 구체예일 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체의 길항제 및 결합 활성은 IL-20 또는 IL-22 각각 및 IL-22RA-포함 가용성 수용체의 존재에서 IL-20 또는 IL-22 증식, 신호 트랩, 루시페라제, 인단백질, 또는 본원에 설명된 결합 분석 및 다른 생물학적 또는 생화학적 분석에서 분석될 수 있다.

가용성 IL-22RA 수용체 폴리펩티드(예를 들면, SEQ ID NO:3) 또는 그것의 단편, 예를 들면 항원성 에피토프에 대한 항체는 생체내에서 IL-20, IL-22, 또는 IL-20과 IL-22 모두의 염증성 효과의 억제에, 예를 들어 건선, 아토피 피부염, 염증성 피부 상태, 내독소혈증, 관절염, 천식, IBD, 결장염, 건선성 관절염, 류마티스 관절염 또는 다른 IL-20 및 IL-22-유도 염증성 상태에 대한 치료학적 사용에; IL-22RA 수용체를 발현하는 세포의 태깅에; 친화성 정제에 의한 가용성 IL-22RA-포함 수용체 폴리펩티드의 분리에; 가용성 IL-22RA 포함 수용체 폴리펩티드의 순환 수준을 결정하기 위한 진단 분석에; 잠재적인 병리 또는 질환의 마커인 가용성 IL-22 RA-포함 수용체의 검출 또는 정량에; FACS를 사용한 분석 방법에; 발현 라이브러리의 스크리닝에; IL-22 또는 IL-20 작용제로 작용할 수 있는 항-유전형 항체의 생성에; 그리고 IL-22RA 수용체 기능을 결합, 차단, 억제, 감소, 또는 길항하거나, 시험관내 및 생체내에서 IL-22 및/또는 IL-20 활성을 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 중화 항체 또는 길항제로서 사용될 수 있다. 적합한 직접 태그 또는 표지는 방사성핵종, 효소, 기질, 보조인자, 비오틴, 억제제, 형광 마커, 화학발광 마커, 자성 입자 등을 포함하고, 간접 태그 또는 표지는 비오틴-아비딘 또는 중간체인 다른 보체/항-보체쌍의 사용을 특징으로 할 수 있다. 본원의 항체는 또한 약물, 독소, 방사성핵종 등에 콘쥬게이트될 수 있고, 이들 콘쥬게이트는 생체내 진단 또는 치료적 적용에 사용될 수 있다. 더욱이, 가용성 IL-22RA-포함 수용체 폴리펩티드에 대한 항체, 또는 그것의 단편은 분석, 예를 들면, 웨스턴 블롯 또는 당업계에 공지된 다른 분석에서 변성된 또는 변성되지 않은 IL-22RA-포함 수용체 폴리펩티드 또는 그것의 단편을 시험관내에서 검출하는데 사용될 수 있다.

가용성 IL-22RA 수용체 또는 가용성 IL-22RA 호모다이머, 헤테로다이머 또는 멀티머 수용체 폴리펩티드에 대한 항체는 수용체 폴리펩티드의 순환 수준을 결정하기 위한 진단 분석, 형광-활성 세포 분류를 사용하는 분석 방법에서 대응되는 수용체를 발현하는 세포를 태깅하고 그것들의 발현 수준을 분석하는 데 유용하다. 더욱이, 2가 항체 및 항-유전형 항체는 IL-22RA 리간드, IL-22 또는 IL-20의 효과를 모방하는 작용제로 사용될 수 있다.

본원의 항체는 또한 약물, 독소, 방사성핵종 등에 직접적 또는 간접적으로 콘쥬게이트될 수 있고, 이들 콘쥬게이트는 생체내 진단 또는 치료적 적용에 사용될 수 있다. 예를 들면, 가용성 IL-22RA 수용체 또는 가용성 IL-22RA 호모다이머, 헤테로다이머 또는 멀티머 수용체 폴리펩티드를 인식하는 항체 또는 결합 폴리펩티드는 대응되는 항-상보적 분자(즉, IL-22RA-포함 가용성 또는 막결합 수용체)를 발현시키는 조직 또는 기관을 확인하거나 치료하는 데 사용될 수 있다. 더 구체적으로, 가용성 IL-22RA-포함 수용체 폴리펩티드 또는 생물활성 단편 또는 그것의 일부에 대한 항체는 검출가능한 또는 세포독성 분자에 결합될 수 있고 IL-22RA-발현 암과 같은 IL-22RA-포함 수용체를 발현하는 세포, 조직 또는 기관을 가진 포유동물에 전달될 수 있다.

적합한 검출가능한 분자는 "결합 폴리펩티드"(상기에 개시된 결합 펩티드를 포함한), 항체 또는 생물활성 단편 또는 그것의 일부와 같은 IL-22RA-포함 수용체 폴리펩티드에 결합하는 폴리펩티드에 직접적 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 적합한 검출가능한 분자는 방사성핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광 마커, 화학발광 마커, 자성 입자 등을 포함한다. 적합한 세포독성 분자는 폴리펩티드 또는 항체에 직접적 또는 간접적으로 부착될 수 있고, 요오드-131, 레늄-188 도는 이트륨-90과 같은 치료적 방사상핵종(폴리펩티드 또는 항체에 직접적으로 부착되거나, 예를 들면, 킬레이트 부분의 수단을 통하여 간접적으로 부착된)뿐만 아니라 박테리아 또는 식물 독소(예를 들면, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소, 리신, 아브린 등)를 포함할 수 있다. 결합 폴리펩티드 또는 항체는 또한 아드리아마이신과 같은 세포독성 약물에 콘쥬게이트될 수 있다. 검출가능한 또는 세포독성 분자의 간접 부착의 경우, 검출가능한 또는 세포독성 분자는 보체/항-보체 쌍의 일부와 콘쥬게이트될 수 있고, 다른 부분은 결합 폴리펩티드 또는 항체 부분에 결합된다. 이 목적을 위하여, 비오틴/스트렙타비딘은 예시적 보체/항-보체 쌍이다.

다른 구체예에서, 결합 폴리펩티드-독소 융합 단백질 또는 항체-독소 융합 단백질은 표적 세포 또는 조직의 억제 또는 절제(예를 들면, 암 세포 또는 조직을 치료하기 위하여)에 사용될 수 있다. 대안적으로, 결합 폴리펩티드가 다중 기능 도메인(즉, 활성화 도메인 또는 리간드 결합 도메인, + 표적 도메인)을 가진 경우, 표적 도메인만을 포함한 융합 단백질은 검출가능한 분자, 세포독성 분자 또는 보체 분자를 관심있는 세포 또는 조직 유형으로 인도하기에 적합할 수 있다. 단일 도메인만을 포함한 융합 단백질이 보체 분자를 포함한 경우에는, 항-보체 분자는 검출가능한 또는 세포독성 분자에 콘쥬게이트될 수 있다. 따라서 이러한 도메인-보체 분자 융합 단백질은 일반적 항-보체-검출가능한/세포독성 분자 콘쥬게이트의 세포/조직-특이적 전달을 위한 일반적 표적 비히클을 나타낸다.

다른 구체예에서, 결합 폴리펩티드-사이토카인 또는 항-IL-22RA 수용체 항체가 과다증식성 세포를 표적으로 하는 경우, IL-22RA 결합 폴리펩티드-사이토카인 또는 항체-사이토카인 융합 단백질은 표적 조직(예를 들면, 비장, 췌장, 혈액, 림프구, 결장 및 골수암)의 생체내 괴사를 증대시키는 데 사용될 수 있다(일반적으로, Hornick et al., Blood 89:4437-47, 1997 참조). 설명한 융합 단백질은 사이토카인의 표적화가 원하는 부위에 작용하도록 함으로써, 상승된 국부 농도의 사이토카인을 제공한다. 적합한 항-IL-22RA 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머 또는 멀티머 항체는 바람직하지 않은 세포 또는 조직(즉, 종양 또는 백혈병)을 표적으로 하고, 융합된 사이토카인은 작용기 세포에 의하여 향상된 표적 세포 용해를 매개한다. 이 목적을 위한 적합한 사이토카인은 예를 들면 인터루킨 2 및 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF)를 포함한다.

대안적으로, 본원에 설명된 IL-22RA 수용체 결합 폴리펩티드 또는 항체 융합 단백질은 IL-22RA-포함 수용체를 발현시키는 과다증식성 세포의 세포사멸을 초래하는 IL-22RA 수용체-조절된 아포프토시스 경로를 직접 자극함으로써 표적 조직의 생체내 사멸을 증대시키는데 이용될 수 있다.

10. IL-22RA 활성을 가진 폴리펩티드 또는 IL-22RA에 대한 항체의 치료적 사용

가용성 IL-22RA 활성을 가진 아미노산 서열은 IL-22RA 리간드 IL-20 및 IL-22(단독으로 또는 함께)에 결합하여, IL-22RA 리간드와 내인성 IL-22RA 수용체의 결합을 방지함으로써 면역계를 조절하는데 사용될 수 있다. 가용성 IL-22RA 또는 항-IL-22RA 항체와 같은 IL-22RA 길항제는 또한 IL-22RA 리간드와 내인성 IL-22RA 수용체의 결합을 억제함으로써 면역계를 조절하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 이 폴리펩티드의 적합한 양이 결핍되거나, IL-22RA 리간드를 과다하게 생산하는 피험체에게 IL-22RA 활성을 가진 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드(예를 들면, 가용성 IL-22RA 폴리펩티드, IL-22RA 폴리펩티드 단편, IL-22RA 유사체(예를 들면, 항-IL-22RA 항-유전형 항체), 및 IL-22RA 융합 단백질)를 사용하는 것을 포함한다. IL-22RA 길항제(예를 들면, 항-IL-22RA 항체)는 또한 IL-22RA 리간드 또는 IL-22RA를 과다하게 생산하는 개체를 치료하는데 사용될 수 있다. 적합한 피험체는 사람과 같은 포유동물을 포함한다. 예를 들면, 이러한 IL-22RA 폴리펩티드 및 항-IL-22RA 항체는, 건선, 아토피 피부염, 염증성 피부 상태, 건선성 관절염, 관절염, 내독소혈증, 천식, 염증성 장 질환(IBD), 결장염, 및 본원에 개시된 다른 염증성 상태의 치료에서, IL-20 및 IL-22(단독으로 또는 함께)와 결합하여, 그것을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는데 유용하다.

더욱이, 우리는 IL-22RA 수용체가 T-세포 유도성 인자(IL-22)(SEQ ID NO:6; Dumoutier, L. et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 97:10144-10149, 2000; 마우스 IL-22 서열은 Dumontier et al., J. Immunol. 164:1814-1819, 2000에 도시된다)라고 명명된 수용체와 결합한다는 것을 밝혔냈다. 더욱이, 공동소유의 zcytor11(IL-22RA)(미국특허 제5,965,704호) 및 CRF2-4 수용체도 역시 헤테로다이머로서 IL-22과 결합한다(WIPO 공보 WO 00/24758; Dumontier et al., J. Immunol. 164:1814-1819, 2000; Spencer, SD et al., J. Exp. Med. 187:571-578, 1998; Gibbs, VC and Pennica Gene 186:97-101, 1997(CRF2-4 cDNA); Xie, MH et al., J. Biol. Chem. 275: 31335-31339, 2000; and Kotenko, SV et al., J. Biol. Chem. 276:2725-2732, 2001). 더욱이, IL-10β 수용체가 IL-22에 대한 수용체로서 연루될 수 있으며, 그것은 CRF2-4와 동의어인 것으로 여겨진다(Dumoutier L. et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. 97:10144-10149, 2000; Liu Y et al, J Immunol. 152; 1821-1829, 1994 (IL-1OR cDNA)). 더욱이, 본 출원인은 IL-22RA 수용체가 IL-20(SEQ ID NO:8; WIPO 공보 WO 99/27103)이라 불리는 리간드와 결합한다는 것을 밝혀냈다. 바람직한 구체예에서, IL-22RA의 가용성 수용체 형태(SEQ ED NO:3)는 생체내 IL-22 및 IL-20과 결합, 그것을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머, 또는 멀티머이다. 이러한 IL-22RA 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머, 또는 멀티머에 대한 항체 및 결합 폴리펩티드는 또한 IL-22RA 활성의 길항제로서, 그리고 본원에 개시된 IL-20 및 IL-22 길항제(단독으로 또는 함께)로서 사용된다.

여기에 더하여, 본원에서는 폴리클로날 및 모노클로날 중화 항-IL-22 항체가 세포 기반 중화 분석에서 IL-22 및 IL-20 활성에 결합, 그것을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화한다는 것을 설명 및 증명했다.

IL-22는 IL-9의 존재하에 유도되는 것으로 나타났으며, Th1-유형 면역반응 및 염증을 촉진하는데 연루되는 것으로 의심된다. IL-9은 다양한 방식으로 면역 기능의 증식, 활성화, 분화 및/또는 유도를 자극하고, 천식, 폐 비만세포증, 및 다른 질환들에 연루될 뿐만 아니라, STAT 경로를 활성화한다. IL-22 또는 IL-9 기능의 길항제는 이러한 사람의 질환에 대해 유리하게 이용될 수 있다. 본 발명은 이러한 신규 IL-22 길항제를 제공한다.

IL-22는 혈청 아밀로이드 A(ASS), α1-항키모트립신, 및 햅토글로빈과 같은 급성 시기 반응물질의 생성을 상향조절하는데 연루되고, IL-22 발현은 생체내 지질다당질(LPS)의 주입시 증가된다는 것이 밝혀졌는데, 이는 IL-22가 염증 반응에 연루된다는 것을 시사한다(Dumoutier, L. et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. 97:10144-10149, 2000). SAA 같은 급성 시기 단백질의 생성은 염증이 유익한 s 단기 생존 메커니즘으로 생각된다; 그러나, 급성 시기 단백질의 장기간의 유지는 만성 염증에 기여하며, 사람의 건강에 해로울 수 있다. Uhlar, CM and Whitehead, AS, Eur. J. Biochem. 265:501-523, 1999 and Baumann H. and Gauldie J. Immunology Today 15: 74-80, 1994를 참조한다. 더욱이, 급성 시기 단백질 SAA는 몇몇 만성 염증 질환의 병리학에 연루되고, 죽상경화증 및 류마티스 관절염에 연루되며, 아밀로이드증에서 침착되는 아밀로이드 A 단백질의 전구물질이다(Uhlar, CM and Whitehead, supra.). 따라서, IL-22가 전-염증 분자로 작용하고 SAA의 생성을 유도하기 때문에, 염증 질환 및 IL-22에 의해 유도된 급성 시기 반응과 관련된 다른 질환의 치료에서 길항제가 유용할 것이다. 이러한 길항제가 본 발명에 의해 제공된다. 예를 들어, IL-22-유도 또는 IL-9-유도 염증을 감소시키는 방법은 염증을 가진 포유동물에게 염증을 감소시키는데 충분한 양의 가용성 IL-22RA-포함 수용체의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 또한, 염증을 가진 포유동물에서 염증 반응을 억제하는 방법은, (1) 혈청 아밀로이드 A 단백질의 수준을 측정하는 단계; (2) 허용되는 약학적 부형제 중에 본원에 설명된 가용성 IL-22RA 사이토카인 수용체 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계; (3) 혈청 아밀로이드 A 단백질의 투여 후 수준을 측정하는 단계; (4) 단계 (1)에서의 혈청 아밀로이드 A 단백질 수준과 단계 (3)에서의 혈청 아밀로이드 A 단백질 수준을 비교하는 단계를 포함하며, 이때 혈청 아밀로이드 A 단백질 수준이 증가하지 않거나 감소하는 것은 염증 반응이 억제된 표시이다. 본원에 설명된 실험 증거는 가용성 수용체 및 항체와 같은 IL-22 길항제가 실제로 생체내 모델에서 염증성 질환에 대한 SAA 수준을 감소시킨다는 것을 나타내며, 이는 IL-22와의 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화가 항-염증 효과를 가진다는 것을 나타낸다.

증거는 IL-20 및 그 수용체의 역할이 건선에 연루된다는 것을 암시한다. 이 복합적 피부 질환은 증가된 각질세포 증식, 변경된 각질세포 분화, 및 면역세포의 피부로의 침입을 특징으로 한다. 건선에서 IL-20의 역할에 대한 첫째 유형의 증거는 사람의 건선 이상성을 닮은 트랜스제닉 마우스에서 각화과다증과 상피 비후화가 관찰된 것이다. 결함성 각질화에 관련된 것으로 생각되는 감소된 수의 당김미세섬유가 사람 건선의 두드러진 특징이다. 미토콘드리아내 포함이 마우스에서 화학적으로 유도된 과다형성 피부 상태와 자연적으로 발생한 과다형성 피부 상태에서 모두 발견되었다. 이 포함의 원인 및 만약 있다면 미토콘드리아 기능에 대한 이들의 효과는 아직 알려지지 않았다. IL-20 트랜스제닉 마우스는 사람 건선에서 관찰된 특징들의 대부분을 나타낸다.

더욱이, IL-20 수용체 mRNA(IL-20RA 및 IL-20RB mRNA 모두)는 정상 피부에 비하여 사람의 건선 피부에서 현저하게 상향조절되는데, 이 또한 건선에서 IL-20의 역할을 시사하는 것이다. 두 IL-20 수용체 하위단위체는 모두 상피 전체의 각질세포를 통해 발현되며, 또한 면역 및 내피 세포의 하위단위체에서도 발현된다. 본 출원인은 활성화된 IL-20 수용체의 증가된 발현이 내피세포, 면역세포 및 각질세포 간 상호작용을 변경시킬 수 있으며, 그 결과 각질세포 증식 및 분화의 조절곤란을 야기한다는 것을 제안한다. 게다가, IL-22RA가 녹아웃된 본원에 설명된 마우스 녹아웃 데이터는 IL-22RA가 트랜스제닉 동물의 피부에서 IL-20-유도 염증 효과에 필수적이었음을 나타낸다. 이들 결과는, 예를 들어 IL-22RA 유전자 녹아웃을 통해, 또는 유사하게는 본 발명의 IL-22RA에 대한 중화 모노클로날 항체를 통해, IL-22RA 활성을 효과적으로 차단하는 것이, 예를 들어 건선, IBD, 결장염, 또는 IL-20에 의해 유도된 다른 염증 질환들, 및/또는 IL-22 유도 IBD, 관절염, 천식, 건선성 관절염, 결장염, 염증상 피부 상태, 및 아토피 피부염에서, IL-20-유도 피부 효과뿐만 아니라 IL-22-유도 피부 효과를 유사하게 감소시킬 것이라는 증거를 제공했다.

더욱이, IL-20은 사람 각질세포 HaCaT 세포주에서 신호 변환을 자극하는데, 이는 피부에서 이 신규 리간드의 직접적인 작용을 시사하는 것이다. 게다가, 각질세포에서 활성이고 피부에서 증식성 및 전-염증 신호에 연루된다고 알려진 단백질인 IL-1β, EGF 및 TNF-α가 IL-20에 대한 반응을 증진시킨다. IL-20 수용체를 발현하는 HaCaT와 BHK 세포 모두에서, IL-20은 STAT3을 통해 신호전달된다.

상기 논의 및 하기 실시예에 나타낸 대로, IL-10은 건선의 병리학에 연루된다. 구체적으로, 본 발명은 IL-20과 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 제제를 투여함으로써 건선을 치료하는 방법에 관한 것이다. IL-20에 대한 길항제는 가용성 IL-22RA, 또는 항체 같은 IL-20에 결합하는 가용성 수용체, IL-20 또는 IL-20 수용체에 결합하는 단쇄 항체 또는 항체 단편, 예를 들어 항-IL-22RA일 수 있다. 이와 같이, 길항제는 IL-20 수용체의 활성화를 막을 것이다. 더욱이, IL-20과 IL-22가 공통 수용체로서 IL-22RA를 공유하고 있기 때문에, 가용성 IL-22RA, 또는 항체, IL-22RA 수용체와 결합하는 단쇄 항체 또는 항체 단편과 같은 길항제는 IL-22 또는 IL-20과 IL-22 활성에 동시에 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는데 사용될 수 있다.

건선은 세계 인구의 1 내지 2% 이하가 걸려 있는 가장 흔한 피부 질환이다. 이것은 은색 운모 비늘로 덮인 홍반, 날카롭게 구획화된 비늘 및 둥근형 플라크를 특징으로 하는 만성 염증성 피부 장애이다. 건선의 피부 병소는 일정하지 않게 가렵다. 건선 병소에서는 외상 영역이 대체로 발생한다. 추가하여, 감염, 스트레스, 및 약물, 예를 들어 리튬, 베타 차단제 및 항-말라리아제를 포함하는 다른 외부 요인이 건선을 악화시킬 수 있다.

건선의 가장 흔한 이종은 플라크 형이라고 불리는 것이다. 플라크-형 건선을 가진 환자는 안정하고 느리게 자라는 플라크를 가질 것이며, 이것은 오랜 시간 동안 기본적으로 변화하지 않은 채 유지된다. 플라크 건선이 발생하는 가장 흔한 영역은 팔꿈치, 무릎, 둔부 사이, 및 두피이다. 병발은 대칭성인 경향이 있다. 역위건선은 겨드랑이, 샅고랑 부위, 유방밑 영역, 및 배꼽을 포함하는 간찰성 영역에서 생길 수 있으며, 또한 두피, 손바닥 및 발바닥에도 생기는 경향이 있다. 각 병소는 날카롭게 구획화된 플라크이며, 이들의 병소로 인한 습기가 있을 수도 있다. 플라크-형 건선은 일반적으로 서서히 발생하며 무통성이다. 그것은 거의 자발적으로 완화되지 않는다.

발진성 건선(방울 건선)은 아이들 및 젊은 성인들에서 가장 흔하다. 그것은 건선이 없는 사람 또는 만성 플라크 건선을 가진 사람들에서 갑자기 발생한다. 환자는 베타-용혈성 스트렙토코시로 상부 호흡기 감염된 후에 종종 많은 작은 홍반성 비늘 플라크를 나타낸다. 건선을 가진 환자에서 또한 농포 병소가 발생할 수 있다. 이들은 손바닥과 발바닥에 국한될 수 있거나, 또는 보편화되어 열, 오한, 설사 및 관절통과 관련될 수 있다.

건선에 걸린 모든 환자 중 약 반이 손톱 병발을 가지는데, 이는 점 함요, 손톱 비후화 또는 손발톱밑 각화과다증으로서 나타난다. 건선에 걸린 환자 중 약 5 내지 10%는 관련된 관절 호소증상을 가질 수 있으며, 이들은 가장 빈번하게는 손톱 병발을 가진 환자에서 발견된다. 일부는 일반적인 류마티스 관절염과 동시에 발생하지만, 대다수는 건선에 관련된 5가지 유형 중의 하나에 속하는 관절 질환을 가진다: (1) 단일 또는 소수의 관절에 제한된 질환(사례 중 70%); (2) 음성혈청반응 류마티스 관절염-유사 질환; (3) 먼 중지골간 관절의 병발; (4) "관절염 단절"이 발병한 심한 파괴성 관절염; 및 척추에 제한된 질환.

건선은 IL-22, IL-20, 또는 IL-20과 IL-22 모두와 결합하여, 그것을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 제제를 투여함으로써 치료될 수 있다. 바람직한 길항제는 IL-22RA(SEQ ID NO:3)와 같은 IL-20 또는 IL-22에 대한 가용성 수용체 또는 IL-22RA 수용체에 결합하는 항체, 항체 단편 또는 단쇄 항체, 예를 들어 본 발명의 중화 항체이다. 이러한 길항제는 단독으로 또는 윤활제, 각질용해제, 국소 코르티코스테로이드, 국소 비타민 D 유도체, 안트랄린, 전신성 항대사물질, 예를 들어 메토트렉세이트, 소라렌-자외선 치료제(PUVA), 에트레티네이트, 이소트레티오인, 시클로스포린, 및 국소 비타민 D3 유도체 칼시포트리올과 같은 다른 확립된 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 더욱이, 이러한 길항제는 피하, 정맥내, 또는 길항제를 함유하는 크림이나 경피 패치를 이용하여 경피 경로로 개체에게 투여될 수 있다. 피하 투여되는 경우에, 길항제는 하나 이상의 건선성 플라크에 주사될 수 있다. 경피 투여되는 경우에, 길항제는 길항제를 함유하는 크림, 연고, 고약 또는 용액을 이용, 플라크 위에 직접 투여될 수 있다.

IL-20 또는 IL-22에 대한 길항제는 천식, 기관지염 또는 낭성 섬유증, 또는 다른 염증성 폐 질환을 가진 사람에게 질환을 치료하기 위해 투여될 수 있다. 길항제는 정맥내, 피하, 기관지 세척, 및 길항제를 함유하는 흡입제의 사용을 포함하는 어떤 적합한 방법에 의해 투여될 수 있다.

IL-22RA cDNA에 상응하는 조직 분포의 분석은 mRNA 수준이 태반 및 비장에서 최고였으며, IL-22RA가 결합하는 리간드(IL-22)가 급성 시기 반응의 유도를 포함하는 염증 반응을 유도하는데 연루된다는 것을 나타냈다(Dumoutier, L. et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. 97:10144-10149, 2000). 따라서, 본 발명의 특정 구체예는 염증 및 면역 질환 또는 상태, 예를 들어 건선, 건선성 관절염, 아토피성 피부염, 염증성 피부 상태, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 다발성게실증, 천식, 췌장염, 제1형 당뇨병(IDDM), 췌장암, 그레이브스병, 결장암 및 장암, 자가면역 질환, 패혈증, 기관 또는 골수 이식; 내독소혈증, 외상, 수술 또는 감염으로 인한 염증; 아밀로이드증; 비종; 이식편대숙주병; 그리고 염증, 면역 억제, 조혈, 면역, 염증성 또는 림프양 세포, 대식세포, T-세포(Th1 및 Th2 세포를 포함)의 증식의 감소, 병원 또는 항원에 대한 면역반응의 억제의 경우에, 또는 IL-22 또는 IL-20 사이토카인의 억제가 바람직한 다른 예에서 길항제로서 가용성 IL-22RA 및 항-IL-22RA 항체의 사용에 관한 것이다.

더욱이, 본원에 설명된 IL-22RA 폴리펩티드에 결합하는 가용성 수용체와 같은 항체 또는 결합 폴리펩티드, 및 IL-22RA 폴리펩티드 그 자체는:

1) 급성 염증, 외상, 조직 손상, 수술, 패혈증 또는 감염의 결과인 염증, 및 천식, 염증성 장 질환(IBD), 만성 대장염, 비종, 류마티스 관절염, 재발성 급성 염증성 발작(예를 들면, 결핵) 및 아밀로이드증과 같은 만성 염증성 질환의 치료에서, 그리고 아테롬성 동맥경화증, 거대임파절증식증, 천식, 및 급성 시기 반응의 유도와 연관된 다른 질환의 치료에서, IL-20 또는 IL-22 수용체를 통한 신호전달을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하고,

2) 면역세포(예를 들면, 림프구, 단핵구, 백혈구)에서 신호전달을 방지 또는 억제하기 위하여 IDDM, 다발성경화증(MS), 전신성홍반성루프스(SLE), 중증근무력증, 류마티스 관절염, 및 IBD과 같은 자가면역질환의 치료에서 IL-20 또는 IL-22 수용체를 통한 신호전달을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는데 유용하다(Hug hes C et al., J. Immunol 153:3319-3325, 1994). 대안적으로, 항체, 예를 들면 IL-22RA-포함 수용체에 대한 모노클로날 항체(MAb)는 또한 자가면역 질환을 치료하기 위하여 원하지 않는 면역 세포를 고갈시키는 길항제로 사용될 수 있다. 천식, 알레르기 및 다른 아토피성 질환은 면역 반응을 억제하거나 공격하는 세포를 고갈시키기 위하여, 예를 들면 가용성 IL-22RA 수용체에 대한 본 발명의 MAb로 치료될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 및 항체를 사용하여 IL-22RA를 통한 신호전달을 차단, 억제, 감소 또는 길항하는 것은 또한 췌장, 신장, 뇌하수체 및 신경 세포의 질환에 유리할 수 있다. IDDM, NIDDM, 췌장염, 및 췌장암종에서 유리할 수 있다. IL-22RA은 길항하는 MAb가 암 성장을 억제하고 면역-매개된 사멸을 표적으로 하는 암의 MAb 치료 표적으로 작용할 수 있다(Holliger P, and Hoogenboom, H: Nature Biotech. 16: 1015-1016, 1998). 또한, 가용성 IL-22RA에 대한 MAb는 SLE, IDDM, 제2형 당뇨병(NIDDM), 신종양 및 다른 질환과 연관된 신부전뿐만 아니라 신장병증, 예를 들면 사구체경화증, 막성 신경병증, 아밀로이드증(이것 역시 다른 조직들 중에서도 특히 신장에 영향을 미친다), 신장 동맥경화증, 다양한 기원의 사구체신염, 신장의 섬유증식성 질환을 치료하는데 유용할 수 있다.

3) IDDM, MS, SLE, 중증근무력증, 류마티스관절염 및 IBD과 같은 자가면역 질환의 치료에서 IL-20 또는 IL-22 수용체를 통한 신호전달을 어렵게 하고, 향상시키고, 증가시키고, 또는 개시하는데 유용하다. 항-IL-22RA 중화 및 모노클로날 항체는 림프구 또는 다른 면역세포가 분화하고, 증식을 변경하거나, 사이토카인 또는 자가면역을 개선하는 세포표면 단백질의 생성을 변화시키도록 신호전달할 수 있다. 구체적으로, 사이토카인 분비의 양식을 변경하는 T-헬퍼 세포 반응의 조절은 자가면역 반응을 벗어나게 하여 질환을 개선할 수 있다(Smith JA et al., J. Immunol. 160:4841-4849, 1998). 유사하게, 작용성 항-가용성 IL-22RA 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머 및 멀티머 모노클로날 항체는 천식, 알레르기 및 아토피성 질환과 관련된 면역세포에 신호전달하고, 그것을 고갈시키며, 그것에서 벗어나도록 하는데 사용될 수 있다. 또한, IL-22RA을 통한 신호전달은 췌장, 신장, 뇌하수체 및 신경 세포의 질환에 유리할 수 있다. IDDM, NIDDM, 췌장염, 및 췌장암종에서 유리할 수 있다. IL-22RA은 신호전달하는 MAb가 암 성장을 억제하고 면역-매개 사멸을 표적으로 하는 췌장암의 MAb 치료 표적으로 작용할 수 있다(Tutt, AL et al., J Immunol. 161: 3175-3185, 1998). 유사하게, 신세포암은 본 발명의 IL-22RA-포함 가용성 수용체에 대한 모노클로날 항체로 치료될 수 있다.

본원에 설명된 가용성 IL-22RA 폴리펩티드는 전술한 자가면역질환, 아토피성 질환, NIDDM, 췌장염 및 신부전의 치료에서, IL-20 또는 IL-22 활성을 단독으로 또는 함께 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는데 사용될 수 있다. IL-22RA의 가용성 형태는 Th 세포에 의하여 매개된 항체 반응을 촉진하고/하거나 림프구 또는 다른 면역 세포에 의하여 IL-4 또는 다른 사이토카인의 생성을 촉진하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 가용성 IL-22RA-포함 수용체는 IL-20 또는 IL-22 사이토카인의 길항제로서 유용하다. 이러한 길항제 효과는 IL-20 또는 IL-22의 직접 중화 또는 결합에 의하여 달성될 수 있다. 길항제 용도뿐만 아니라, 본 발명의 가용성 수용체는 리간드를 체내의 다른 조직, 기관 및 세포에 운반하기 위하여 IL-22에 결합하고, IL-20 또는 IL-22 사이토카인의 캐리어 단백질로 작용할 수 있다. 그러한 것으로서, 본 발명의 가용성 수용체는 가용성-수용체-리간드 복합체를 조직, 특정 면역세포, 또는 종양과 같은 특정 부위로 인도하는 분자, 폴리펩티드 또는 화학부분에 융합되거나 결합될 수 있다. 예를 들면, 급성 감염 또는 일부 암에서, 이로운 점은 IL-22의 작용에 의하여 염증 및 국부 급성 시기 반응 단백질의 유도에서 비롯될 수 있다. 따라서, 본 발명의 가용성 수용체는 IL-20 또는 IL-22의 작용을 특이적으로 지시하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, Cosman, D. Cytokine 5: 95-106, 1993; 및 Fernandez-Botran, R. Exp . Opin . Invest. Drugs 9:497-513, 2000을 참조한다.

더욱이, 본 발명의 가용성 수용체는 분해 또는 제거로부터 그것을 안정화시키거나, 리간드를 체내의 작용 부위에 표적화함으로써, IL-22 또는 IL-20을 안정화시키고, 생물학적 이용가능성, 치료 수명, 및/또는 이 리간드의 효능을 증가시키는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 자연적으로 발생하는 IL-6/가용성 IL-6R 복합체는 IL-6을 안정화시키고 gp130 수용체를 통하여 신호를 전달할 수 있다. 문헌(Cosman, D. 상기 참조, 및 Fernandez-Botran, R. 상기 참조)을 참조한다. 이러한 복합체는 동반 수용체 하위단위체를 제시하는 세포로부터 반응을 자극하는데 사용될 수 있다. IL-22RA/리간드 복합체의 세포 특이성은 단독으로 투여된 리간드의 경우에 나타난 것과 다를 수 있다. 나아가, 복합체는 반감기, 투여량/반응 및 기관 또는 조직 특이성과 같은 다른 약동학적 특성을 가질 수 있다. 따라서 IL-22RA/IL-22 또는 IL-22RA/IL-20 복합체는 면역반응을 향상시키거나 사구체간질세포를 자극하거나 간 세포를 자극하는 작용제 활성을 가질 수 있다. 대안적으로, 복합체와 헤테로다이머를 이루는 신호전달 하위단위체를 발현하는 조직만이 IL6/IL6R 복합체에 대한 반응에 유사하게 영향을 받을 수 있다(Hirota H. et al., Proc . Nat'l . Acad . Sci . 92:4862-4866, 1995; Hirano, T. in Thomason, A. (Ed.) "The Cytokine Handbook", 3 판, p. 208-209). IL-12 및 CNTF에 대한 가용성 수용체/사이토카인 복합체는 유사한 활성을 나타낸다.

더욱이, 염증은 칩입자에 저항하는 개체에 의한 방어적 반응이다. 염증은 많은 세포성 및 체액성 매개자가 관련된 단계적인 반응이다. 한편, 염증성 반응의 억제는 숙주를 면역약화시킬 수 있지만, 확인되지 않는 경우, 염증은 만성 염증성 질환(예를 들면, 건선, 관절염, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 염증성 장 질환 등), 패혈성 쇼크 및 복합장기부전을 포함한 중증 합병증을 초래할 수 있다. 중요하게는, 이들 다양한 질환 상태는 공통된 염증성 매개자를 공유한다. 염증을 특징으로 하는 집단적 질환은 사람 치사율 및 사망률에 큰 영향을 줄 수 있다. 따라서, IL-22RA와 같은 항-염증성 단백질 및 항-IL-22RA 항체는 천식 및 알레르기로부터 자가면역 및 패혈성 쇼크에 이르는 광범위한 수의 사람 및 동물 질환의 중대한 치료적 잠재력을 가질 수 있다.

1. 관절염

골관절염, 류마티스 관절염, 상해의 결과인 관절염성 관절 등을 포함한 관절염은 본 발명의 IL-22RA 가용성 폴리펩티드 및 MAb와 같은 항-염증성 단백질의 치료적 사용으로부터 이득을 얻는 공통된 염증성 상태이다. 예를 들면, 류마티스 관절염(RA)은 전체 몸에 영향을 미치는 전신성 질환이며 관절염의 가장 흔한 형태 중 하나이다. 이것은 관절을 채우는 막의 염증을 특징으로 하는데, 이는 통증, 경직, 흥분, 열상 및 종기를 야기한다. 류마티스 관절염의 결과로서, 염증을 일으킨 관절 내용물인 활막은 다른 생리학적 효과 중에서도 관절 퇴화 및 심각한 통증을 야기하면서 뼈와 연골을 공격하고 손상을 줄 수 있다. 관련된 관절은 그 모양과 정렬을 잃을 수 있고 통증 및 움직임의 감소를 야기한다.

류마티스 관절염(RA)은 염증 및 계속된 조직 손상을 특징으로 하는 면역-매개 질환이며, 중증 장애 및 증가된 사망률을 야기한다. 다양한 사이토카인이 류마티스 관절에서 국부적으로 생성된다. IL-1 및 TNF-알파, 이 두 원형 염증촉진성 사이토카인이 활액 염증 및 진행성 관절 파괴에 관련된 메커니즘에서 중요한 역할을 한다는 것을 많은 연구들이 증명하였다. 실제로, RA가 있는 환자에서 TNF-알파 및 IL-1 억제제의 투여는 염증의 임상적 및 생물학적 신호의 급격한 개선과 골침식 및 연골 파괴의 방사성물질에 의한 신호의 감소를 가져왔다. 그러나, 이러한 고무적인 결과에도 불구하고, 상당한 퍼센트의 환자들이 이들 인자에 대하여 반응하지 않는데, 이는 다른 매개자가 또한 관절염의 병리생리학에 관여한다는 것을 시사한다 (Gabay, Expert. Opin . Biol . Ther . 2(2):135-149, 2002). 그러한 매개자들 중 하나는 IL-20 또는 IL-22일 수 있고, IL-22 또는 IL-20 활성을 결합 또는 억제하는 이러한 분자로서, 예를 들면 가용성 IL-22RA, IL-22RA 폴리펩티드 또는 항-IL-22RA 항체 또는 결합 파트너는 류마티스 관절염 및 다른 관절염 질환에서 염증을 감소시키는 가치있는 치료제로 작용할 수 있다.

당업계에 공지된 류마티스 관절염에 대한 몇몇 동물 모델이 있다. 예를 들면, 콜라겐-유도된 관절염(CIA) 모델에서, 마우스는 사람 류마티즘성 관절염을 밀접하게 닮은 만성 염증성 관절염을 진행시킨다. CIA는 RA와 유사한 면역학적 및 병리학적 특징을 공유하기 때문에 잠재적 사람 항-염증성 화합물을 스크리닝하기 위한 이상적인 모델이 된다. CIA 모델은 발생시키기 위해서 면역 반응 및 염증성 반응에 의존하는 마우스에서 주지된 모델이다. 면역 반응은 항원으로 제공되고 항-콜라겐 항체의 생산을 야기하는 콜라겐에 반응한 B 세포와 CD4+ T-세포의 상호작용을 포함한다. 염증 시기는 마우스 천연 콜라겐에 교차반응하고 보체 캐스케이드를 활성화하는 이들 항체들 중 일부의 결과로서 염증의 매개자로부터의 조직 반응의 결과이다. CIA 모델을 사용하는 이점은 발병의 기본 메커니즘이 공지되어 있다는 점이다. II형 콜라겐에 관련된 T 세포 및 B 세포 에피토프는 동정되었고, 면역 매개 관절염에 관한 다양한 면역학적(예를 들면, 지연형 과민성 및 항-콜라겐 항체) 및 염증성(예를 들면, 사이토카인, 케모카인, 및 매트릭스-퇴화 효소) 매개변수는 결정되었으며, 따라서 CIA 모델에서 시험 화합물 효능을 평가하는 데 사용될 수 있다 (Wooley, Curr . Opin . Rheum. 3:407-20, 1999; Williams et al., Immunol. 89:9784 -788, 1992; Myers et al. Life Sci. 61:1861-78, 1997; 및 Wang et al., Immunol. 92:8955-959, 1995).

가용성 IL-22RA2 포함 폴리펩티드(zcytor16), 예를 들면 zcytor16-Fc4 또는 다른 IL-22RA2 가용성 및 융합 단백질을 이들 CIA 모델 마우스에 투여하는 것은 증상을 개선하고 질환의 과정을 변경하는 데 사용된 IL-22에 대한 길항제로서 가용성 IL-22RA2의 사용을 평가하는데 사용된다. 더욱이, 본 발명의 가용성 IL-22RA2에 의한 IL-22의 억제를 나타낸 결과는 가용성 IL-22RA 또는 그것에 대한 중화 항체와 같은 다른 IL-22 길항제가 또한 증상을 개선하고 질환의 과정을 변경하는데 사용될 수 있다는 개념의 증거를 제공한다. IL-22RA2의 리간드인 IL-22는 류마티스 관절염의 병리생리학에 연루되는 SAA의 생성을 유도하고, IL-22RA2가 시험관내 또는 생체내에서 IL-22와 SAA의 활성을 억제할 수 있다고 증명되었기 때문에, IL-22RA2 포함 폴리펩티드, 예를 들어 zcytor16-Fc4 또는 다른 IL-22 가용성 수용체(예를 들어, IL-22RA; SEQ ID NO:3) 및 항-IL-22RA 항체, 및 융합 단백질의 전신적 또는 국소적 투여는 잠재적으로 RA에서 염증반응을 억제할 수 있다. 10ug zcytor16-Fc의 주사(4주 동안 3회)는 질환 점수(발 점수, 염증 또는 질환의 발병)을 현저하게 감소시켰다. 다른 잠재적인 치료제는 IL-22RA 폴리펩티드, 항-IL-22RA 항체, 또는 항 IL-22 항체 또는 결합 파트너 등을 포함한다.

다른 그룹은 항-마우스 IL-22 항체가 대조군 마우스에 비하여 마우스 CIA-모델에서 증상을 감소시킬 수 있음을 나타냈는데, 이것은 가용성 IL-22RA 폴리펩티드 및 IL-22RA에 대한 중화 항체가 사람의 질환을 치료하는데도 유리할 수 있음을 개념적으로 나타내는 것이다. 단일 마우스-IL-22-특이적 쥐 모노클로날 항체(P3/1)의 투여는 예방학적으로 도입되었을 때나, 또는 CIA-유도 관절염이 모델에서 유도된 후에, 동물에서 관절염의 증상을 감소시켰다(WIPO 공보 02/068476; 2002년 9월 9일 공개). 따라서, 본 발명의 중화 항-사람 IL-22RA 항체를 포함하는, 본 발명의 가용성 IL-22RA 폴리펩티드 및 항-IL-22RA 항체는 건선, 건선성 관절염, 관절염, 내독소혈증, 염증성 장 질환(IBD), 결장염 및 본원에 개시된 다른 염증성 상태와 같은 특정한 사람 질환의 치료에서 IL-22 및 IL-20을 중화하는데 사용될 수 있다.

2. 내독소혈증

내독소혈증은 박테리아와 같은 감염성 인자 및 다른 감염성 질환 인자, 패혈증, 독성 쇼크 증후군, 또는 기회감염에 노출된 면역약화된 환자 등에서 흔히 유래되는 중증 상태이다. 본 발명의 IL-22RA 폴리펩티드 및 항체와 같은 치료적으로 유용한 항-염증성 단백질은 사람과 동물에서 내독소혈증을 예방하고 치료하는 데 도움을 줄 수 있다. IL-22RA 폴리펩티드 또는 항-IL-22RA 항체, 또는 항 IL-22 항체 또는 결합 파트너는 내독소혈증에서 염증 및 병리학적 효과를 감소시키는 가치있는 치료제로 작용할 수 있다.

지질다당체(LPS) 유도된 내독소혈증은 감염성 질환에서 병리학적 효과를 발생시키는 많은 염증촉진성 매개자와 연관되고 쥐과에서 LPS 유도된 내독소혈증은 잠재적 염증촉진제 또는 면역조절제의 약리학적 효과를 연구하기 위하여 널리 사용되며 허용가능한 모델이다. 그람-음성 박테리아에서 생성된 LPS는 패혈성 쇼크의 발병에서의 주요 원인 인자이다(Glausner et al., Lancet 338:732, 1991). 실제로 쇼크 유사 상태는 동물에 LPS의 단독 주사에 의하여 실험적으로 유도될 수 있다. LPS에 반응하여 세포에 의하여 생성된 분자는 직접 또는 간접으로 병원균을 표적으로 할 수 있다. 이들 생물학적 반응은 침입하는 병원균에 대항하여 숙주를 보호하지만, 또한 해로움을 야기할 수 있다. 따라서, 중증 그람-음성 박테리아 감염의 결과로서 발생하는 선천성 면역의 대량 자극은 사이토카인 및 다른 분자의 초과 생성과 열, 저혈압, 파종성혈관내응고병증, 및 복합장기부전을 특징으로 하는 치명 증후군, 패혈성 쇼크 증후군의 진행을 유도한다(Dumitru et al. Cell 103:1071-1083, 2000).

LPS의 이들 독성 효과는 대체로 다중 염증성 매개자의 분비를 유도하는 대식세포 활성화와 관련된다. 중화시키는 항-TNF 항체의 투여에 의한 LPS 독성의 예방으로 나타난 바와 같이, 이들 매개자들 중에서 TNF가 중요한 역할을 하는 것으로 보인다(Beutler et al., Science 229:869, 1985). 대장균 LPS의 1 μg을 C57B1/6 마우스에 주사하면 주사 후 약 2시간에 순환하는 IL-6, TNF-알파, IL-1, 및 급성기 단백질(예를 들면, SAA)의 현저한 증가를 가져온다는 것이 잘 확립되어 있다. 이들 매개자에 대한 수동 면역화가 감소된 사망률을 야기할 수 있으므로 LPS의 독성은 이들 사이토카인에 의하여 매개되는 것처럼 보인다(Beutler et al., Science 229:869, 1985). 패혈성 쇼크의 예방 및/또는 치료를 위한 잠재적 면역개입 전략은 항-TNF mAb, IL-1 수용체 길항제, LIF, IL-10, 및 G-CSF를 포함한다.

가용성 IL-22RA2 포함 폴리펩티드, 예를 들어 Zcytor16-Fc4 또는 다른 IL-22RA 가용성 및 융합 단백질을 이들 LPS-유도된 모델에 투여하는 것은 증상을 개선하고 LPS-유도된 질환의 과정을 변경하기 위한 IL-22RA2의 사용을 평가하는데 사용될 수 있다. 더욱이, IL-22RA2에 의한 IL-22의 억제를 나타낸 결과는 IL-22RA 또는 그것에 대한 항체와 같은 다른 IL-22 길항제가 또한 LPS-유도된 모델에서 증상을 개선하고 질환의 과정을 변경하는데 사용될 수 있다는 개념의 증거를 제공한다. 상기 모델은 LPS 주사에 의한 IL-22의 유도 및 IL-22RA2 폴리펩티드에 의한 질환의 잠재적 치료를 나타낼 것이다. LPS가 내독소혈증의 병리에 아마도 기여하는 전-염증 IL-22, SAA 또는 다른 전-염증 인자의 생산을 유도하므로, 길항제 IL-22RA2 폴리펩티드에 의한 IL-22 활성, SAA 또는 다른 전-염증 인자의 중화는 내독소성 쇼크에서 나타난 바와 같이 내독소혈증의 증상을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 다른 잠재적 치료제는 IL-22RA 폴리펩티드, 항-IL-22RA 항체, 또는 항-IL-22 항체 또는 결합 파트너 등을 포함한다.

3. 염증성 장 질환 IBD

미국에서는 약 500,00명의 사람들이 결장 및 직장(궤양성대장염) 또는 소장 및 대장(크론씨병)에 영향을 미칠 수 있는 염증성 장 질환(IBD)으로 고생한다. 이들 질환의 발병은 명확하지 않지만, 영향을 받은 조직의 만성 염증과 관련된다. IL-22RA 폴리펩티드, 항-IL-22RA 항체 또는 항 IL-22 항체 또는 결합 파트너는 IBD 및 관련 질환에서 염증 및 병리학적 효과를 감소시키는 가치있는 치료제로 작용할 수 있다.

궤양성 대장염(UC)은 결장의 점막 또는 가장 깊은 내용물의 염증 및 궤양을 특징으로 하는, 흔히 결장으로 불리는 대장의 염증성 질환이다. 이 염증은 결장이 자주 비게 하여 설사를 야기한다. 증상은 대변의 이완 및 연관된 복부 장경련, 열 및 체중 감소를 포함한다. UC의 정확한 원인은 알려지지 않았지만, 최근 연구는 몸의 자연 방어가 몸이 외래물질이라고 생각하는 체내의 단백질에 대하여 작동한다는 것을 제시한다("자가면역 반응"). 아마도 이것들은 장에서의 박테리아 단백질을 닮고 있기 때문에, 이들 단백질은 결장의 내용물을 파괴하기 시작하는 염증성 과정을 유발하거나 자극할 수 있다. 결장의 내용물이 파괴될 때, 궤양은 분비성 점액, 고름 및 피를 형성한다. 상기 질환은 대개 직장 영역에서 시작해서 결국 대장 전체에 걸쳐 퍼질 수 있다. 염증의 반복된 발병은 상처 조직을 가진 장과 직장의 벽을 두껍게 한다. 결장 조직의 괴사 또는 패혈증은 중증 질환과 동반하여 발생할 수 있다. 궤양성 대장염의 증상은 중증 면에서 다양하고 그것의 발병은 점진적이거나 갑작스러울 수 있다. 발병은 호흡기 감염 또는 스트레스를 포함한 많은 인자에 의하여 유발될 수 있다.

현재 사용가능한 UC의 치료제가 없지만, 치료는 결장 내막에서 복부 염증성 과정을 억제하는 것에 초점이 맞추어져 있다. 코르티코스테로이드 면역억제(예를 들면, 아자티오프린, 머캅토퓨린 및 메토트랙세이트) 및 아미노살리시테이트를 포함한 치료는 질환을 치료하는 데 사용가능하다. 그러나, 코르티코스테로이드 및 아자티오프린과 같은 면역억제제의 장기 사용은 뼈의 약화, 백내장, 감염, 및 간과 골수 영향을 포함한 심각한 부작용을 초래할 수 있다. 현대 치료법이 성공적이지 않은 환자에게는, 수술이 한 선택이다. 수술은 전체 결장 및 직장의 제거를 포함한다.

만성 궤양성 대장염을 부분적으로 모방할 수 있는 몇몇 동물 모델이 있다. 가장 널리 사용되는 모델 중 일부는 옥사졸론 및 2,4,6-트리니트로벤술폰산/에탄올(TNBS) 유도된 대장염 모델인데, 이들은 결장에서 만성 염증 및 궤양을 유도한다. 옥사졸론 또는 TNBS가 직장내 점적주사를 통하여 감염되기 쉬운 마우스의 결장에 도입될 때, 그것은 결장 점막에서 T 세포 매개 면역반응을 유도하고, 이 경우에 대장의 전체 벽에 걸쳐서 T 세포 및 대식세포의 밀집 침윤을 특징으로 하는 대량 점막 염증을 야기한다. 더욱이, 이 조직병리학적 상황은 진행성 체중 감소(소모성), 피섞인 설사, 직장 탈수, 및 대장벽 비대의 임상학적 상황을 수반한다(Neurath et al. Intern. Rev. Immunol. 19:51-62, 2000).

다른 대장염 모델은 피섞인 설사, 체중감소, 결장의 축소 및 중성구 침윤을 통한 점막 궤양에 의하여 나타난 급성 대장염을 유도하는 덱스트란 황산나트륨(DSS)을 사용한다. DSS-유도된 대장염은 조직학적으로 림프구 과형성, 병소 잠복 손상, 및 상피 궤양이 있는 고유층에 염증성 세포를 침투시키는 것을 특징으로 한다. 이들 변화는 DSS가 상피에 미치는 독성 효과에 기인하여 그리고 고유층 세포의 식세포작용 및 TNF-알파 및 IFN-감마의 생성에 의하여 발생하는 것으로 생각된다. 그것의 통상적인 사용에도 불구하고, 사람 질환에 대한 관련성에 관한 DSS의 메커니즘과 관련된 몇 가지 이슈는 해결되지 않은 채로 남아있다. DSS는 그것이 SCID 마우스와 같은 T 세포-결핍 동물에서 관찰되기 때문에 T 세포-의존적 모델로 간주된다.

가용성 IL-22RA2 포함 폴리펩티드, 예를 들어 Zcytor16-Fc4 또는 다른 IL-22RA 가용성 및 융합 단백질을 이들 TNBS 또는 DSS 모델에 투여하는 것은 증상을 개선하고 위장 질환의 과정을 변경하는 IL-22RA의 사용을 평가하는데 사용될 수 있다. 더욱이, IL-22RA2에 의한 IL-22의 억제를 나타낸 결과는 가용성 IL-22RA 또는 그것에 대한 항체와 같은 다른 IL-22 길항제가 대장염/IBD 모델에서 증상을 개선하고 질환의 과정을 변경하는데 사용될 수 있다는 개념의 증거를 제공한다. 본 출원인은 RT-PCR에 의해 DSS-마우스의 결장 조직에서 IL-22의 증가된 발현, 및 장 세포주 상에서 IL-1베타와 IL-22의 상승작용적 활성을 관찰했다. 이것은 IL-22가 결장염에서 염증 반응에 어떤 역할을 할 수 있으며, IL-22RA2 폴리펩티드의 투여에 의한 IL-22 활성의 중화가 IBD에 대한 잠재적인 치료학적 접근법임을 나타낸다.

4. 건선

건선은 7 백만 이상의 미국인들에게 영향을 미치는 만성 피부 상태이다. 건선은 새 피부 세포가 비정상적으로 자랄 때 발생하는 데, 이것은 오래된 피부가 충분히 빨리 떨어지지 않는 경우 염증이 생기고, 붓고, 비늘 모양의 피부 조각을 야기하게 된다. 가장 흔한 형태인 판상형 건선은 은백색 비늘로 덮인 염증이 생긴 피부 조각("병터")을 특징으로 한다. 건선은 일부 판상에 한정될 수 있거나 두피, 무릎, 팔꿈치 및 몸통에 가장 흔하게 나타나는, 피부의 보통 내지 광범위한 영역을 포함할 수 있다. 고도로 시각적이지만, 건선은 전염성 질환은 아니다. 질환의 발병은 영향받은 조직의 만성 염증을 포함한다. IL-22RA 폴리펩티드, 항-IL-22RA 항체 또는 항-IL-22 및 항 IL-20 항체 또는 결합 파트너는 건선, 다른 염증성 피부 질환, 피부 및 점막 알레르기, 및 관련된 질환에서 염증 및 병리학적 효과를 감소시키는 가치있는 치료제로 작용할 수 있다.

건선은 상당한 불편을 야기할 수 있는 피부의 T 세포 매개된 염증성 장애이다. 이것은 치료제가 없고 모든 연령층의 사람들에게 영향을 미치는 질환이다. 건선은 유럽인과 북미 인구의 약 2%에 영향을 미친다. 순한 건선이 있는 개인은 흔히 국소 치료제로 이들 질환을 통제할 수 있지만, 세계 백만 이상의 환자들은 자외선 또는 전신성 면역억제 치료를 필요로 한다. 불행히도, 자외선 방사선의 불편 및 위험성 그리고 많은 치료법의 독성은 그것들의 장기 사용을 제한한다. 더욱이, 환자들은 대개 건선이 재발하며, 일부 경우에는 면역억제 치료를 멈춘 직후 재발한다.

IL-20은 IL-20 트랜스젠 마우스에서 비정상 상피 분화를 포함한 피부 이상성으로 인한 신생아 치사를 야기하는 것으로 나타난 신규 IL-10 상동체이다(Blumberg H et al., Cell 104:9-19, 2001). IL-20 수용체는 건선성 피부에서 대단히 상향조절된다 IL-22가 IL-20 수용체와 수용체 하위단위체(zcytor11)를 공유하며, IL-22 트랜스제닉 마우스가 유사한 표현형을 나타내기 때문에, IL-22도 건선과 같은 염증성 피부 질환에 연루될 가능성이 있다. IL-22RA 폴리펩티드 또는 항-IL-22RA 항체 길항제의 피하 또는 국소 투여는 염증 및 증상을 감소시킬 수 있다. 다른 잠재적인 치료제는 IL-22RA 폴리펩티드, 가용성 zcytor11/CRF2-4 수용체 폴리펩티드, 또는 항 IL-22 항체 또는 결합 파트너 등을 포함한다.

더욱이, IL-22 및 IL-20의 과발현이 사람의 건선성 병소에서 나타났는데, 이는 IL-20과 마찬가지로 IL-22 역시 사람의 건선에 연루된다는 것을 시사한다. 더욱이, 본원에 설명된 대로, 트랜스제닉 마우스에서 IL-20 또는 IL-22의 과발현은 건선 표현형의 표시인 상피 비후화 및 면역세포 병발을 나타냈고; 추가하여 정상 마우스에 IL-22를 주사하자 건선 표현형의 표시인 상피 비후화 및 면역세포 병발이 나타났으며, 이것은 가용성 수용체 길항제 IL-22RA2(zcytor16; WIPO 공보 WO 01/40 467)에 의해 제거되었다. 더 나아가, 이러한 생체내 데이터는 전-염증 IL-22가 건선에 연루된다는 것을 시사한다. 이와 같이, IL-22 및 IL-20 활성에 대한 길항제, 예를 들어 본 발명의 항-사람 IL-22RA 모노클로날 및 중화 항체를 포함하는 IL-22RA 가용성 수용체 및 그것에 대한 항체는 염증 질환의 치료학적 치료에 있어서, 특히 건선의 치료에서 IL-22 및 IL-20 각각의 또는 둘 다에 대한 길항제로서 유용하다. 더욱이, 본 발명의 항-사람 IL-22RA 모노클로날 및 중화 항체를 포함하는 IL-22RA 가용성 수용체 및 그것에 대한 항체와 같은, IL-22 활성에 대한 길항제는 다른 염증성 질환의 치료학적 치료에 있어서, 예를 들어 아토피 피부염, IBD, 결장염, 내독소혈증, 관절염, 류마티스 관절염 및 건선성 관절염, 성인 호흡기 질환 (ARD), 패혈쇼크, 복합장기부전, 천식이나 기관지염 같은 염증성 폐 손상, 세균성 폐렴, 건선, 습진, 아토피 및 접촉성 피부염, 및 궤양성 결장염 및 크론병과 같은 염증성 장 질환의 치료에서 IL-22 및 IL-20과 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 제제로서 유용하다.

더욱이, 본 발명의 항-IL-22RA 항체 및 IL-22RA 가용성 수용체는 본원에 설명된 많은 염증성 질환 및 암(예를 들어, 화학요법 및 악액질), 및 감염성 질환과 관련된 체중 손실에 대한 예방 및 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 심각한 체중 손실은 패혈증, MS, RA, 및 종양 모델에 관련된 중요한 마커이다. 또한, 체중 손실은 암, 감염성 질환 및 염증 질환을 포함하는 많은 사람의 질환에서 중요한 매개변수이다. 체중손실은 본원에 설명된 IL-22 아데노바이러스 주사된 마우스에서 나타났다. 본 발명의 IL-22RA 가용성 수용체 및 그것에 대한 항체와 같은, 항-IL-22 항체 및 IL-22 길항제 뿐만 아니라 zcytor16(IL-22RA2) 수용체가 본원에 설명된 IL-22 아데노바이러스 주사된 마우스에서 체중 손실을 예방 및 치료하는 능력에 대해 시험되었다. 이러한 IL-22 길항제의 예방학적 또는 치료학적 섭생을 결정하는 방법은 본 분야에 공지되어 있고, 본원에 설명된 방법을 이용하여 결정될 수 있다.

또한, IL-22RA 가용성 수용체 폴리펩티드 및 그것에 대한 항체는 IL-22 또는 IL-20 리간드의 순환 수준의 검출을 위한 진단 시스템에서, 그리고 급성 시기 염증 반응과 관련된 IL-22의 검출에서 사용될 수 있다. 관련 구체예에서, 본 발명의 IL-22RA 가용성 수용체와 특이적으로 결합하는 항체 또는 다른 제제를 사용하여 순환하는 수용체 폴리펩티드를 검출할 수 있다; 역으로, IL-22RA 가용성 수용체 자체를 사용하여 순환하는 또는 국소적으로 작용하는 IL-22 또는 IL-20 폴리펩티드를 검출할 수 있다. 리간드 또는 수용체 폴리펩티드의 상승된 또는 저하된 수준이 염증 또는 암을 포함하는 병리학적 상태의 표시이다. IL-22는 급성 시기 염증 반응과 관련되어 유도된다고 알려져 있다. 더욱이, IL-20 또는 IL-22와 같은 급성 시기 단백질 또는 분자의 검출은 어떤 질환 상태(예를 들어, 건선, 류마티스 관절염, 결장염, IBD)에서는 만성 염증 상태의 표시일 수도 있다. 이러한 상태의 검출은 질환 진단을 도울 수 있을 뿐만 아니라, 적합한 치료법을 선택하도록 의사에게 도움을 준다.

중화 항-IL-22 또는 IL-20 항체의 자궁내 투여를 사용하여, IL-22를 과발현하는 IL-22 트랜스제닉 강아지, 또는 IL-20을 과발현하는 IL-20 트랜스제닉 강아지에서 발견된 피부 표현형을 감소 또는 제거함으로써, 질환 모델에서의 생체내 효능을 나타낼 수 있다. 중화 모노클로날 항체(mAb)를 이용한 자궁내 치료는 본 분야에 이미 선례가 있다. 한 사례에서, B 세포의 B-1 하위단위체의 발생은 B 세포-특이적 분자에 특이적인 mAb, 즉 CD19를 이용한 임신한 암컷 마우스의 치료에 의해 대단히 영향을 받았다(예를 들어, Krop I. et al. Eur. J. Immunol. 26(1):238-42, 1996). Krop 등은 임신한 마우스에게 PBS 중의 쥐 항-마우스 CD19 mAb(또는 쥐 동형-일치 대조군 Ab) 500ug를 임신 9일째에 시작하여 일정 시간 후 복강내 주사했고, 이어서 출산시까지 격일로 주사했다. 또한, 강아지에게는 출생 10일째에 이들 항체 500ug를 한번 주사했다. 다른 사례에서, Tanaka 등은 IL-2 수용체 베타-사슬에 대한 모노클로날 항체를 이용한 자궁내 치료가 Thy-1+ 수지상 상피세포의 발생을 완전히 없앤다는 것을 발견했다. IL-2 수용체의 두 하위단위체, 즉 알파-사슬(IL-2R 알파) 및 베타-사슬(IL-2R 베타)는 태아 흉선 개체발생기 내내 거의 상호 배타적인 방식으로 발현된다. IL-2R 베타에 대한 중화 mAb의 투여에 의한 IL-2R의 신호 변환 성분인 IL-2R 베타의 차단은 Thy-1+ 피부 수지상 상피세포의 완전하고 선택적인 소실을 가져왔다. 어떤 다른 T 세포 하위단위체의 발생은 손상되지 않았다. 이것은 IL-2가 대타 V 감마 5+ 세포 및 그 자손들의 발생에 있어 중요한 역할을 한다는 것을 시사하는 것이다(Tanaka, T. et al., Int Immunol. 4(4):487-9, 1992 참조). 추가하여, Schattemann GC 등은 PDGF-A가 자궁내 시스템을 이용한 정상 쥐과 심장혈관 발생에서 필요함을 밝혀냈다. 몇 라인의 증거는 혈소판-유래 성장인자 A 사슬(PDGF-A)이 정상 배아 심장혈관 발생에 필요함을 시사한다. 자궁에서 항-PDGF-A 중화 항체를 마우스 탈락막에 도입하는 것은 18-24시간 동안 생체내에서 PDGF-A 리간드-수용체 상호작용의 선택적인 파괴를 야기했으며, 이것은 PDGF-A가 심장혈관 발생에 필요한지의 여부와 그것이 필요한 시기의 평가를 허용했다(Schattemann GC et al., Dev. Biol. 176(1):133-42, 1996 참조). 이들 결과뿐만 아니라 본 분야에서 설명된 다른 사항들은 중화 mAb가 자궁에서 강한 효과를 도출할 수 있다는 증거를 제공한다. 유사하게, IL-20 및 IL-22를 각각 과발현하는 IL-20 및 IL-22 트랜스제닉 강아지에서 발견된 피부 표현형을 감소 또는 제거하기 위해서, 질환 모델에서 생체내에서 모노클로날 항체로 IL-20 또는 IL-22를 중화하는 것의 효능이 밝혀질 수 있다. 이들 트랜스제닉 마우스는 매끈매끈한 피부 외형을 가지고 태어나는데, 이것은 일부분 본원에 설명된 상피 비후화로 인한 것이다. 상당히 낮은 수준의 트랜스제닉 사이토카인을 발현하는 IL-20 TG 강아지는 회수되어 교배시까지 생존할 수 있지만, IL-22 TG 마우스는 출생 후 바로, 일반적으로 5일 전에 죽었다.

예를 들어, IL-20에 대한 중화 항체는 IL-20 항원성 에피토프에 결합하여 IL -20 활성을 중화할 수 있는 중화 모노클로날 항체 같은 항체를 포함한다. 따라서, IL-20의 항원성 에피토프-보유 펩티드 및 폴리펩티드가 본원에 설명된 IL-20 폴리펩티드와 결합하여 항체를 발생시키는데 있어서 뿐만 아니라, IL-20의 활성을 중화하고, 활성과 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화할 수 있는 항-IL-20 모노클로날 항체를 확인하고 스크린하는데 유용하다. 예를 들면, DNASTAR Protean 프로그램(DNASTAR, Inc., Madison, WI)을 사용하여 Jameson-Wolf 플롯에 의해 예측된 SEQ ID NO:8 내의 이러한 항원성 에피토프가 바람직한 항원성 에피토프로 작용하며, 당업자에 의하여 결정될 수 있다. 이러한 항원성 에피토프는, SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 42(Ile)부터 102(Asp)까지; SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 42(Ile)부터 60 (Ile)까지; SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 42(Ile)부터 69(Glu)까지; SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 42(Ile)부터 81(Cys)까지; SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 42(Ile)부터 96(Lys)까지; SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 42(Ile)부터 102(Asp)까지; SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 60(Ile)부터 69(Glu)까지; SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 60 (Ile)부터 81(Cys)까지; SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 60(Ile)부터 96(Lys)까지; SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 60(Ile)부터 102(Asp)까지; SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 69(Glu)부터 81(Cys)까지; SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 69(Glu)부터 96(Lys)까지; SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 69(Glu)부터 102(Asp)까지; SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 81(Cys)부터 96(Lys)까지; SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 81(Cys)부터 102(Asp)까지; 및 SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 96(Lys)부터 102(Asp)까지를 포함한다.

본원에 설명된 다른 질환 모델뿐만 아니라, 사람 건선 손상에서 유래된 염증 조직에 대한 항-IL-22RA 항체의 활성은 중증 합병 면역결핍(SCID) 마우스 모델을 사용하여 생체내에서 측정할 수 있다. 사람 세포가 면역결핍 마우스에 이식된 일부 마우스 모델이 개발되었다(전체적으로 이종이식 모델이라고 언급); 예를 들면, 문헌(Cattan AR, Douglas E, Leuk . Res. 18:513-22, 1994 and Flavell, DJ, Hematol -ogical Oncology 14:67-82, 1996)을 참조한다. 건선에 대한 생체내 이종이식 모델로서, 사람 건선 피부를 SCID 마우스 모델에 이식하고, 적합한 길항제로 시험한다. 더욱이, 당업계에서의 다른 건선 동물 모델을 AGR129 마우스 모델에 이식된 사람 건선 피부 이식과 같은 IL-20 및 IL-22 길항제를 평가하는데 사용할 수 있고, 적합한 길항제로 시험할 수 있다(예를 들면, 본원에 참고문헌으로 포함된 Boyman, O. et al., J. Exp . Med . 온라인 공보 #20031482, 2004 참조). IL-22 또는 IL-20과 IL-22 모두의 활성을 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 항-IL-22RA 항체가 바람직한 길항제이지만, 항-IL-20 및 항-IL-22 항체(단독으로 또는 조합으로), 가용성 IL-22RA 뿐만 아니라 다른 IL-20 및 IL-22 길항제도 이 모델에서 사용될 수 있다. 유사하게, 사람 대장염, IBD, 관절염, 또는 다른 염증성 손상에서 유래된 조직 또는 세포는 본원에 설명된 IL-20 및 IL-22 길항제의 항-염증성 특성을 평가하기 위하여 SCID 모델에서 사용될 수 있다.

항-IL-22RA 항체 또는 그것의 유도체, 작용제, 콘쥬게이트 또는 변이체를 사용하여 염증을 제거, 지연, 또는 감소시키도록 고안된 치료법은 항-IL-22RA 항체 또는 가용성 IL-22RA 화합물을 사람 염증 조직(예를 들면, 건선 손상 등)을 보유한 SCID 마우스 또는 본원에 설명된 다른 모델에 투여함으로써 시험할 수 있다. 치료의 효능은 당업계에 주지된 방법을 사용하여 시간에 따라 치료받은 집단 내에서의 증가된 항-염증 효과로 측정되고 통계적으로 평가될 수 있다. 일부 예시적 방법은, 한정하는 것은 아니지만, 건선 모델에서, 표피 비대, 상부 진피의 염증 세포의 수, 및 부전각화증을 측정하는 것을 포함한다. 이러한 모델은 당업계에 공지되어 있으면 본원에 설명된다. 예를 들어, 문헌(Zeigler, M. et al. Lab Invest 81:1253, 2001; Zollner, T. M. et al. J. Clin . Invest. 109:671, 2002; Yamanaka, N. et al. Microbio .l Immunol. 45:507, 2001; Raychaudhuri, S. P. et al. Br. J. Dermatol. 144:931, 2001; Boehncke, W. H et al. Arch. Dermatol. Res. 291:104, 1999; Boehncke, W. H et al.. J. Invest. Dermatol . 116:596, 2001; Nickoloff, B. J. et al. Am. J. Pathol. 146:580, 1995; Boehncke, W. H et al. J. Cutan . Pathol. 24:1, 1997; Sugai, J., M. et al. J. Dermatol. Sci. 17:85, 1998; 및 Villadsen L.S. et al. J. Clin . Invest. 112:1571, 2003)을 참조하라. 염증은 샘플에 존재하는 염증 또는 손상 세포의 수, IBD의 기록(체중 감소, 설사, 직장 출혈, 결장 길이), 발 질환 기록 및 CIA RA 모델에 대한 염증 기록을 정량하기 위하여 유체세포측정법과 같은 주지된 방법을 사용하여 시간에 따라 모니터될 수 있다. 예를 들면, 이러한 모델에서 시험하기 위한 적합한 치료 전략은 가용성 항-IL-22RA 항체, 다른 IL-20 및 IL-22 길항제(단독으로 또는 함께), 또는 항-IL-22RA 항체와 그것의 리간드 IL-20 및 IL-22의 분열 상호작용에 기초한 관련된 콘쥬게이트 또는 길항제를 사용한 직접 치료, 또는 항-IL-22RA 항체 또는 그것의 유도체, 작용제, 콘쥬게이트 또는 변이체를 이용한 세포 기재 치료법을 포함한다.

더욱이, 건선은 CD4+ 기억 T 세포, 중성구 및 대식세포를 포함한, 과증식 표피 케라틴세포 및 침투성 단핵구 세포와 연관된 만성 염증성 피부 질환이다(Christophers, Int . Arch. Allergy Immunol., 110:199, 1996). 현재 주위의 항원은 질환의 병리를 개시하고 그것에 기여하는 데 중대한 역할을 하는 것으로 믿어진다. 그러나, 건선의 병리를 매개하는 것으로 생각되는 것은 자기 항원에 대한 내성의 상실이다. 수지상 세포 및 CD4 T+ 세포는 병리를 야기하는 면역반응을 매개하는 항원 제시 및 인식에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 본 발명자들은 최근에 CD4+CD45RB 전달 모델에 기초한 건선의 모델을 개발하였다(Davenport et al., Internat. Immunopharmacol., 2:653-672). 본 발명의 항-IL-20, 항-IL-22 또는 IL-20R 및/또는 IL-22R에 대한 항체, 예를 들어 본 발명의 항-IL-22RA 항체, 또는 가용성 IL-22RA가 마우스에 투여된다. 질병 점수(피부 손상, 염증성 사이토카인)의 억제는 건선에서의 IL-20 및 IL-22 길항제, 예를 들면 항-IL-22RA 항체 또는 IL-22 RA 가용성 수용체, 또는 IL-20 및/또는 IL-22 또는 이들의 수용체에 대한 항체 같은 다른 길항체의 유효성을 나타낸다.

아토피성 피부염

IL-20과 IL-22가 모두 사람의 아토피 피부용(AD) 환자 샘플에서 상향조절된다. AD는 헬퍼 T 세포 서브세트 2(Th2)의 과다활성화된 사이토카인을 특징으로 하는 통상적인 만성 염증성 질환이다. AD의 정확한 병인은 알려지지 않았지만, 과민한 Th2 면역반응, 자가면역, 감염, 알레르겐, 및 유전적 경향을 포함한 복합 인자가 관련되어 있다. 이 질환의 핵심 특징은 건조증(피부의 건조), 소양증(피부의 가려움), 결막염, 염증성 피부 손상, 포도상구균(Staphylococcus aureus) 감염, 상승된 혈액 호산구증다증, 혈청 IgE 및 IgG1의 증가, 및 T 세포, 비만세포, 대식세포 및 호산구 침윤을 통한 만성 피부염을 포함한다. 포도상구균을 통한 콜로니화 또는 감염은 AD를 악화시키고 이 피부 질환의 만성을 지속시키는 것으로 인식되었다.

AD는 천식 및 알레르기성 비염이 있는 환자에게서 종종 발견되며 흔히 알레르기성 질환의 초기 발현이다. 서양 국가의 인구 중 약 20%는 이들 알레르기성 질환으로 고생하며, 선진국에서의 AD의 발병은 알려지지 않은 이유로 발생하고 있다. AD는 전형적으로 유아기에 시작되고 종종 청소년기를 거쳐 성인기에 이르기까지 지속될 수 있다. 현재 AD에 대한 치료는 국부 코르티코스테로이드, 경구 사이클로스포린 A, 비-코르티코스테로이드 면역억제제, 예를 들면 타크로리무스(연고 형태의 FK506), 및 인터페론-감마를 포함한다. AD에 대한 다양한 치료에도 불구하고, 많은 환자의 증상은 개선되지 않거나, 그것들은 다른 더 효과적인 치료제에 대한 검색을 필요로 하는 등 의약에 대한 부작용을 가진다. 본 발명의 중화 항-사람 IL-22RA 항체를 포함한 본 발명의 가용성 IL-22RA 폴리펩티드 및 항-IL-22RA 항체는 아토피성 피부염, 염증성 피부상태, 및 본원에 개시된 다른 염증 상태와 같은 특정 사람 질환의 치료에서 IL-22 및 IL-20을 중화하는데 사용될 수 있다.

약학적 사용을 위하여, 본 발명의 가용성 IL-22RA 또는 항-IL-22RA 항체는 종래의 방법에 따라서 비경구, 특히 정맥내 또는 피하 전달용으로 제조된다. 정맥내 투여는 예를 들면 미니-펌프 또는 다른 적합한 기술을 사용한 볼루스 주사, 통제된 방출, 또는 한 시간 내지 몇 시간의 전형적인 기간 동안에 걸친 주입에 의하여 이루어질 것이다. 대체로, 약학적 제형은 식염수, 완충된 식염수, 수 중 5% 덱스트로스 등과 같은 약학적으로 허용되는 비히클과 조합하여 조혈 단백질을 포함할 것이다. 제형은 바이알 표면 등에 단백질 손실을 방지하기 위하여 하나 이상의 첨가제, 보존제, 용해제, 완충제, 알부민을 더 포함할 수 있다. 이러한 조합 치료를 이용할 때, 사이토카인은 단일 제형으로 조합될 수 있거나 별개의 제형으로 투여될 수 있다. 제형의 방법은 예를 들면 본원에 참고문헌으로 포함된 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990)에 주지되어 있다. 치료적 투여량은 일반적으로 치료받는 상태의 성질 및 중증, 환자 특징 등을 고려한 허용되는 표준에 따라서 의사에 의하여 결정된 정확한 투여량으로 하루 당 환자 체중의 0.1 내지 100 mg/kg, 바람직하게는 하루 당 0.5-20 mg/kg의 범위가 될 것이다. 투여량의 결정은 당업자의 수준 내에 있다. 단백질은 통상적으로 화학치료 또는 골수 이식 후 28일의 기간 동안 또는 >20,000/mm³, 바람직하게는 >50,000/mm³ 혈소판 수가 얻어질 때까지 투여될 것이다. 더 통상적으로는, 단백질은 1 주일 미만으로, 종종 1 내지 3일의 기간 동안 투여될 것이다. 대체로, 본 발명의 가용성 IL-22RA 또는 항-IL-22RA 항체의 치료적 유효량은 림프구 또는 골수 전구 세포의 증식 및/또는 분화의 임상학적으로 현저한 증가를 만들기에 충분한 양이며, 이는 성숙한 세포(예를 들면, 혈소판 또는 중성구)의 순환하는 수준의 증가로 발현될 것이다. 따라서 혈소판 장애의 치료는 적어도 20,000/mm³, 바람직하게는 50,000/mm³의 혈소판 수가 도달할 때까지 계속될 것이다. 또한 본 발명의 가용성 IL-22RA 또는 항-IL-22RA 항체는 IL-3, -6 및 -11; 줄기세포 인자; 에리트로포이에틴; G-CSF 및 GM-CSF와 같은 다른 사이토카인과 조합하여 투여될 수 있다. 조합 치료의 양생법 내에서, 다른 사이토카인의 일일 투여량은 일반적으로: EPO, 150 U/kg; GM-CSF, 5-15 1g/kg; IL-3, 1-5 1g/kg; 및 G-CSF, 1-25 1g/kg이 될 것이다. 예를 들면, EPO의 조합 치료는 저 EPO 수준을 가진 빈혈 환자에서 지시된다.

일반적으로, 투여되는 가용성 IL-22RA(또는 IL-22RA 유사체 또는 융합 단백질) 또는 항-IL-22RA 항체의 투여량은 환자의 연령, 체중, 키, 성, 일반적 의료 상태 및 이전 의료기록과 같은 인자에 따라서 다양할 것이다. 더 낮거나 더 높은 투여량이 또한 상황에 따라서 투여될 수는 있지만, 전형적으로 약 1 pg/kg 내지 10 mg/kg(제제의 양/환자의 체중)의 범위인 가용성 IL-22RA 또는 항-IL-22RA 항체의 투여량을 수용자에게 제공하는 것이 바람직하다.

피험체에게 가용성 IL-22RA 또는 항-IL-22RA 항체를 투여하는 것은 지역적 카테터를 통한 관류에 의하여, 또는 직접적 병변내 주입에 의하여 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 흉막내, 수막강내일 수 있다. 주사에 의하여 치료 단백질을 투여할 때, 투여는 연속적 관류에 의하거나 단일 또는 다중 볼루스에 의할 수 있다.

투여의 추가적 경로는 경구, 점막, 폐 및 경피를 포함한다. 경구 전달은 폴리에스테르 미소구체, 제인 미소구체, 프로티노이드 미소구체, 폴리시아노아크릴레이트 미소구체, 및 지질-기재 시스템에 적합하다(예를 들면, DiBase and Morrel, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins", in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), 페이지 255-288 (Plenum Press 1997)) 참조). 비강내 전달의 실행가능성은 인슐린 투여의 형식에 의하여 예시된다(예를 들면, Hinchcliffe and Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199 (1999)). 가용성 IL-22RA 또는 항-IL-22RA 항체를 포함한 건조한 또는 액체 입자는 제조되어 건조-분말 분산제, 액체 에어로졸 발생기, 또는 분무기의 도움으로 흡입될 수 있다(예를 들면, Pettit and Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998); Patton et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999)). 이 접근법은 에어로졸화된 인슐린을 폐에 전달하는 휴대용 전자흡입기인 AERX 당뇨병 관리시스템에 의하여 예시된다. 연구들은 48,000 kDa의 단백질이 저진동수 초음파의 도움으로 치료적 농도로 피부를 통하여 전달되었으며, 이는 경피 투여의 실행가능성을 설명해준다는 것을 보여주었다(Mitragotri et al., Science 269:850(1995)). 일렉트로포레이션을 사용한 경피 전달은 IL-22RA 결합 활성을 가진 분자를 투여하는 다른 수단을 제공한다(Potts et al., Pharm. Biotechnol. 10:213 (1997)).

가용성 IL-22RA 또는 항-IL-22RA 항체를 포함한 약학적 조성물은 약학적으로 유용한 조성물을 제조하는 공지된 방법에 따라서 제조될 수 있으며, 치료 단백질은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합되어 조합된다. 조성물은 수용 환자가 그것의 투여를 견딜 수 있다면 "약학적으로 허용되는 담체"라고 불린다. 멸균 인산염-완충된 식염수는 약학적으로 허용되는 담체의 한 예이다. 다른 적합한 담체는 당업자에게 주지되어 있다. 예를 들면, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995)을 참조한다.

치료 목적을 위해서, 가용성 IL-22RA 또는 항-IL-22RA 항체 및 약학적으로 허용되는 담체는 치료적 유효량으로 환자에게 투여된다. 본 발명의 치료 분자와 약학적으로 허용되는 담체의 조합은 투여되는 양이 생리학적으로 유의하다면 "치료적 유효량"으로 투여된다고 말한다. 제제는 그것의 존재가 수용 환자의 생리상태의 검출가능한 변화를 가져온다면 생리학적으로 유의하다. 예를 들면, 염증을 치료하기 위하여 사용된 제제는 그것의 존재가 염증성 반응을 경감시킨다면 생리학적으로 유의하다.

IL-22RA(또는 IL-22RA 유사체 또는 유합 단백질) 또는 중화 항-IL-22RA 항체를 포함한 약학적 조성물은 액체 형태, 에어로졸, 또는 고체 형태로 제공될 수 있다. 액체 형태는 주사가능한 용액 및 경구 현탁액으로 설명된다. 예시적 고체 형태는 캡슐, 정제 및 제어된 방출 형태를 포함한다. 후자 형태는 미니삼투압 펌프 및 이식에 의해 설명된다(Bremer et al., Pharm . Biotechnol . 10:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery", in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), 페이지 95-123 (CRC Press 1995); Bremer et al., "Protein Delivery with Infusion Pumps", in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), p. 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant", in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), p. 93-117 (Plenum Press 1997)).

리포좀은 정맥내, 복강내, 수막강내, 근육내, 피하 또는 경구 투여, 흡입 또는 비강내 투여를 통하여 피험체에게 치료 폴리펩티드를 전달하는 한 수단을 제공한다. 리포좀은 수용성 구획을 둘러싼 하나 이상의 지질이중막으로 구성된 초소형 비히클이다(일반적으로, Bakker-Woudenberg et al., Eur . J. Clin . Microbiol . Infect. Dis . 12 ( Suppl . 1):S61 (1993), Kim, Drugs 46:618 (1993), and Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers", in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), 페이지 3-24 (CRC Press 1995) 참조). 리포좀은 조성면에서 세포막과 유사하여 결과적으로 리포좀은 안전하게 투여될 수 있고 생분해성이 있다. 제조의 방법에 따라서, 리포좀은 단일층 또는 다층일 수 있으며, 리포좀은 직경 크기 0.02㎛부터 10㎛ 이상까지의 범위로 다양할 수 있다. 다양한 제제가 리포좀에 캡슐화되는데, 소수성 제제는 이중층에 분배되고 친수성 제제는 내부 수용성 공간(들) 내에 분배된다(예를 들면, Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987), and Ostro et al., American J. Hosp . Pharm . 46:1576 (1989) 참조). 더욱이, 리포좀의 전하 및 표면 특성뿐만 아니라 리포좀 크기, 이중층의 수, 지질 조성을 다양하게 함으로써 캡슐에 싸인 제제의 치료적 이용가능성을 조절하는 것이 가능하다.

리포좀은 실질적으로 어떤 유형의 세포라도 흡수할 수 있고 그 다음 캡슐화된 제제를 천천히 방출할 수 있다. 대안적으로, 흡수된 리포좀은 탐식성 세포에 의하여 흡수될 수 있다. 엔도시토시스는 리포좀 지질의 리소좀내 분해 및 캡슐화된 제제의 방출을 수반한다(Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad . Sci . 446:368 (1985)). 정맥내 투여 후, 전형적으로 소 리포좀(0.1 내지 1.0㎛)은 원칙적으로 간과 비장에 위치한 세망내피계의 세포에 의하여 흡수되는 반면, 3.0㎛보다 큰 리포좀은 폐에 위치한다. 세망내피계의 세포에 의한 소 리포솜의 우선적 흡수를 이용하여 간의 대식세포 및 종양에 화학치료제가 송달된다.

세망내피계는 리포좀 입자의 큰 투여량으로의 포화, 또는 약리학적 수단에 의한 선택적 대식세포 비활성화를 포함한 몇 가지 방법에 의하여 포위될 수 있다(Claassen et al., Biochim . Biophys . Acta 802:428 (1984)). 뿐만 아니라, 당지질- 또는 폴리에텔렌 글리콜-유도체화된 인지질을 리포좀막에 혼입하는 것은 세망내피계에 의한 현저히 감소된 흡수를 야기하는 것으로 나타났다(Allen et al., Biochim. Biophys . Acta 1068:133 (1991); Allen et al., Biochim . Biophys . Acta 1150:9 (1993)).

리포좀은 또한 인지질 성분을 다양하게 함으로써 또는 수용체 또는 리간드를 리포좀에 삽입함으로써 특정 세포 또는 기관을 표적으로 하도록 제조될 수 있다. 예를 들면, 고 함량의 비이온성 계면활성제로 제조된 리포좀은 간을 표적으로 하는 데 사용되었다(Hayakawa et al., 일본특허 04-244,018; Kato et al., Biol . Pharm . Bull. 16:960 (1993)). 이들 제형은 메탄올에 콩 포스파티딜콜린, α-토코페롤, 및 에톡실화된 수소화된 캐스터 오일(HCO-60)을 혼합하고, 진공 하에서 혼합물을 농축시키고, 그 후 혼합물을 물과 재구성함으로써 제조되었다. 콩-유래 스테릴글루코시드 혼합물(SG) 및 콜레스테롤(Ch)을 가진 디팔리토일포스파티딜콜린(DPPC)의 리포좀 제형은 또한 간을 표적으로 하는 것으로 나타났다(Shimizu et al., Biol . Pharm. Bull. 20:881 (1997)).

대안적으로, 다양한 표적화 리간드는 항체, 항체 단편, 탄수화물, 비타민, 및 운송 단백질과 같은 리포좀의 표면에 결합될 수 있다. 예를 들면, 리포좀은 간 세포의 표면상에 배타적으로 발현되는 아시알로당단백질(갈락토스)을 표적으로 하는 분지형 갈락토실지질로 변형될 수 있다(Kato and Sugiyama, Crit . Rev. Ther . Drug Carrier Syst. 14:287 (1997); Murahashi et al., Biol . Pharm . Bull.20:259 (1997)). 유사하게, 문헌(Wu et al., Hepatology 27:772 (1998))은 리포좀을 아시알로페투인으로 표지하는 것은 리포좀 혈장 수명을 단축시키고 간세포에 의한 아시알로페투인-표지된 리포좀의 흡수를 크게 향상시켰다는 것을 나타냈다. 한편, 분지형 갈락토실지질 유도체를 포함한 리포좀의 간 축적은 아시알로페투인의 사전주사에 의하여 억제될 수 있다(Murahashi et al., Biol . Pharm . Bull.20:259 (1997)). 폴리아코니틸화된 사람 혈청 알부민 리포좀은 간 세포에 리포좀을 표적화하기 위한 다른 접근법을 제공한다(Kamps et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 94:11681 (1997)). 더욱이, Geho, et al. U.S. Patent No. 4,603,044는 간의 특수화된 대사 세포와 연관된 간담도 수용체에 대한 특이성을 가진 간세포-유도 리포좀 비히클 전달 시스템을 설명한다.

조직 표적화에 대한 더 일반적인 접근법에서, 표적 세포는 표적 세포에 의하여 발현된 리간드에 특이적인 비오틴화된 항체로 사전표지된다(Harasym et al., Adv. Drug Deliv . Rev. 32:99 (1998)). 자유 항체의 혈장 제거 후, 스트렙타비딘-콘쥬게이트된 리포좀을 투여한다. 다른 접근법에서, 표적화 항체는 리포좀에 직접 부착된다(Harasym et al., Adv . Drug Deliv . Rev. 32:99 (1998)).

폴리펩티드 및 항체는 단백질 마이크로캐슐화의 표준 기술을 사용하여 리포좀 내에 캐슐로 싸일 수 있다(를 들면, Anderson et al., Infect. Immun . 31:1099 (1981), Anderson et al., Cancer Res. 50:1853 (1990), 및 Cohen et al., Biochim. Biophys . Acta 1063:95 (1991), Alving et al. "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies" in Liposome Technology, 2nd Edition, Vol. III, Gregoriadis (ed.), p. 317(CRC Press 1993), Wassef et al., Meth . Enzymol . 149:124 (1987) 참조). 상기에 기록한 바와 같이, 치료적으로 유용한 리포좀은 다양한 성분을 함유할 수 있다. 예를 들면, 리포좀은 폴리(에틸렌 글리콜)의 지질 유도체를 포함할 수 있다(Allen et al., Biochim . Biophys . Acta 1150:9 (1993)).

분해가능한 폴리머 미소구체는 치료 단백질의 고 체계수준을 유지하도록 고안되었다. 미소구체는 분해가능한 폴리머, 예를 들면 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLG), 폴리무수물, 폴리(오르토 에스테르), 생분해불가능한 에틸비닐 아세테이트 폴리머로부터 제조되며, 이들 단백질은 폴리머에 포합된다(Gombotz and Pettit, Bioconjugate Chem . 6:332 (1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery", in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), 페이지 51-93 (CRC Press 1995); Roskos and Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery", in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), 페이지 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus et al., Science 281:1161 (1998); Putney and Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998); Putney, Curr . Opin . Chem . Biol . 2:548 (1998)). 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-코팅된 나노스피어는 또한 치료 단백질의 정맥내 투여를 위한 담체를 제공할 수 있다(예를 들면, Gref et al., Pharm . Biotechnol . 10:167 (1997) 참조).

본 발명은 또한 IL-22RA 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머 또는 멀티머 가용성 수용체, 및 IL-22RA 길항제, 예를 들면 항-IL-22RA 항체 또는 결합 폴리펩티드, 또는 중화 항-IL-22RA 항체와 같은 결합 IL-22RA 활성을 가진 화학적으로 변형된 폴리펩티드를 고려하는데, 이들 폴리펩티드는 상기에 논의한 바와 같이 폴리머와 연결된다.

다른 투여 형태는, 예를 들면 Ansel and Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5판 (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19판 (Mack Publishing Company 1995), 및 Ranade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996))에 나타난 바와 같이 당업자에 의하여 고안될 수 있다.

한 예시로서, 약학적 조성물은 IL-22RA 세포외 도메인을 가진 폴리펩티드, 예를 들면 IL-22RA 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머, 또는 멀티머 가용성 수용체, 또는 IL-22RA 길항제(예를 들면, IL-22RA 폴리펩티드에 결합하는 항체 또는 항체 단편, 또는 중화 항-IL-22RA 항체)를 포함한 용기를 포함한 키트로 제공될 수 있다. 치료 폴리펩티드는 단일 또는 다중 투여를 위한 주사가능한 용액의 형태로, 또는 주사하기 전에 재구성될 멸균 분말로 제공될 수 있다. 대안적으로, 이러한 키트는 치료 폴리펩티드의 투여를 위한 건조-분말 분산제, 액체 에어로졸 발생기, 또는 분무기를 포함할 수 있다. 이러한 키트는 약학적 조성물의 지시사항 및 사용에 관한 명시된 정보를 더 포함할 수 있다. 또한, 이러한 정보는 IL-22RA 조성물이 IL-22RA에 대하여 공지된 과민성이 있는 환자에서는 금지된다는 선언을 포함할 수 있다.

항-IL-22RA 항체 또는 결합 파트너(또는 항-IL-22RA 항체 단편, 항체 융합, 사람화 항체 등) 또는 IL-22RA 가용성 수용체를 포함한 약학적 조성물은 액체 형태, 에어로졸, 또는 고체 형태로 제공될 수 있다. 액체 형태는 주사가능한 용액, 에어로졸, 방울, 위상 용액 및 경구 현탁액으로 예시된다. 예시적 고체 형태는 캡슐, 정제, 및 제어된 방출 형태를 포함한다. 후자는 미니삼투 펌프 및 이식에 의하여 설명된다(Bremer et al. Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery", in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), 페이지 95-123 (CRC Press 1995); Bremer et al., "Protein Delivery with Infusion Pumps", in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), 페이지 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant" in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), 페이지 93-117 (Plenum Press 1997)) 다른 고체 형태는 크림, 연고, 다른 위상 외용약 등을 포함한다.

리포좀은 치료 폴리펩티드를 피험체에 정맥내, 복강내, 수막강내, 근육내, 피하로, 또는 경구 투여, 흡입, 또는 비강내 투여를 통하여 전달하는 한 수단을 제공한다. 리포좀은 수용성 구획을 둘러싼 하나 이상의 지질 이중층으로 구성된 초소형 소포이다(일반적으로, Bakker-Woudenberg et al., Eur . J. Clin . Microbiol . Infect. Dis . 12 ( Suppl . 1):S61 (1993), Kim, Drugs 46:618 (1993), and Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers", in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), p. 3-24 (CRC Press 1995) 참조). 리포좀은 조성면에서 새포막과 유사하여 결과적으로 안전하게 투여될 수 있고 생분해가능하다. 제조방법에 따라서, 리포좀은 단일층 또는 다층일 수 있으며, 리포좀은 직경 크기 0.02㎛부터 10㎛ 이상까지의 범위로 다양할 수 있다. 다양한 제제가 리포좀에 캡슐화되는데, 소수성 제제는 이중층에 분배되고 친수성 제제는 내부 수용성 공간(들) 내에 분배된다(예를 들면, Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987), 및 Ostro et al., American J. Hosp . Pharm. 46:1576 (1989) 참조). 더욱이, 리포좀의 전하 및 표면 특성뿐만 아니라 리포좀 크기, 이중층의 수, 지질 조성을 다양하게 함으로써 캡슐에 싸인 제제의 치료적 이용가능성을 조절하는 것이 가능하다.

리포좀은 실질적으로 어떤 유형의 세포라도 흡수할 수 있고 그 다음 캡슐화된 제제를 천천히 방출할 수 있다. 대안적으로, 흡수된 리포좀은 탐식성 세포에 의하여 흡수될 수 있다. 엔도시토시스는 리포좀 지질의 리소좀내 분해 및 캡슐화된 제제의 방출을 수반한다(Scherphof et al. Ann. N.Y. Acad . Sci . 446:368 (1985)). 정맥내 투여 후, 전형적으로 소 리포좀(0.1 내지 1.0㎛)은 원칙적으로 간과 비장에 위치한 세망내피계의 세포에 의하여 흡수되는 반면, 3.0㎛ 보다 큰 리포좀은 폐에 위치한다. 세망내피계의 세포에 의한 더 작은 리포좀의 이러한 우선적 흡수는 화학치료제를 대식세포 및 간의 종양에 전달하는데 사용되었다.

세망내피계는 리포좀 입자의 큰 투여량으로의 포화, 또는 약리학적 수단에 의한 선택적 대식세포 비활성화를 포함한 몇 가지 방법에 의하여 포위될 수 있다(Claassen et al., Biochim . Biophys . Acta 802:428 (1984)). 뿐만 아니라, 당지질- 또는 폴리에텔렌 글리콜-유도체화된 인지질을 리포좀막에 혼입하는 것은 세망내피계에 의한 현저히 감소된 흡수를 야기하는 것으로 나타났다(Allen et al., Biochim. Biophys . Acta 1068:133 (1991); Allen et al., Biochim . Biophys . Acta 1150:9 (1993)).

리포좀은 또한 인지질 성분을 다양하게 함으로써 또는 수용체 또는 리간드를 리포좀에 삽입함으로써 특정 세포 또는 기관을 표적으로 하도록 제조될 수 있다. 예를 들면, 고 함량의 비이온성 계면활성제로 제조된 리포좀은 간을 표적으로 하는 데 사용되었다(Hayakawa et al., 일본특허 04-244,018; Kato et al., Biol . Pharm . Bull. 16:960 (1993)). 이들 제형은 메탄올에 콩 포스파티딜콜린, α-토코페롤, 및 에톡실화된 수소화된 캐스터 오일(HCO-60)을 혼합하고, 진공 하에서 혼합물을 농축시키고, 그 후 혼합물을 물과 재구성함으로써 제조되었다. 콩-유래 스테릴글루코시드 혼합물(SG) 및 콜레스테롤(Ch)을 가진 디팔리토일포스파티딜콜린(DPPC)의 리포좀 제형은 또한 간을 표적으로 하는 것으로 나타났다(Shimizu et al., Biol . Pharm. Bull. 20:881 (1997)).

대안적으로, 다양한 표적화 리간드는 항체, 항체 단편, 탄수화물, 비타민, 및 운송 단백질과 같은 리포좀의 표면에 결합될 수 있다. 예를 들면, 리포좀은 간 세포의 표면상에 배타적으로 발현되는 아시알로당단백질(갈락토스)을 표적으로 하는 분지형 갈락토실지질로 변형될 수 있다(Kato and Sugiyama, Crit . Rev. Ther . Drug Carrier Syst. 14:287 (1997); Murahashi et al., Biol . Pharm . Bull.20:259 (1997)). 유사하게, 문헌(Wu et al., Hepatology 27:772 (1998))은 리포좀을 아시알로페투인으로 표지하는 것은 리포좀 혈장 수명을 단축시키고 간세포에 의한 아시알로페투인-표지된 리포좀의 흡수를 크게 향상시켰다는 것을 나타냈다. 한편, 분지형 갈락토실지질 유도체를 포함한 리포좀의 간 축적은 아시알로페투인의 사전주사에 의하여 억제될 수 있다(Murahashi et al., Biol . Pharm . Bull.20:259 (1997)). 폴리아코니틸화된 사람 혈청 알부민 리포좀은 간 세포에 리포좀을 표적화하기 위한 다른 접근법을 제공한다(Kamps et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 94:11681 (1997)). 더욱이, Geho, et al. U.S. Patent No. 4,603,044는 간의 특성화된 대사 세포와 연관된 간담도 수용체에 대한 특이성을 가진 간세포-유도 리포좀 비히클 전달 시스템을 설명한다.

조직 표적화에 대한 더 일반적인 접근법에서, 표적 세포는 표적 세포에 의하여 발현된 리간드에 특이적인 비오틴화된 항체로 사전표지된다(Harasym et al., Adv. Drug Deliv . Rev. 32:99 (1998)). 자유 항체의 혈장 제거 후, 스트렙타비딘-콘쥬게이트된 리포좀을 투여한다. 다른 접근법에서, 표적화 항체는 리포좀에 직접 부착된다(Harasym et al., Adv . Drug Deliv . Rev. 32:99 (1998)).

항-IL-22RA 중화 항체 및 IL-22 또는 IL-20결합 활성을 가진 결합 파트너, 또는 IL-22RA 가용성 수용체는 단백질 마이크로캐슐화의 표준 기술을 사용하여 리포좀 내에 캐슐로 싸일 수 있다(예를 들면, Anderson et al., Infect. Immun . 31: 1099 (1981), Anderson et al., Cancer Res. 50:1853 (1990), 및 Cohen et al., Biochim. Biophys . Acta 1063:95 (1991), Alving et al. "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies", in Liposome Technology, 2판, Vol. III, Gregoriadis (ed.), 페이지 317 (CRC Press 1993), Wassef et al., Meth . Enzymol . 149:124 (1987) 참조). 상기에 기록한 바와 같이, 치료적으로 유용한 리포좀은 다양한 성분을 함유할 수 있다. 예를 들면, 리포좀은 폴리(에틸렌 글리콜)의 지질 유도체를 포함할 수 있다(Allen et al., Biochim . Biophys . Acta 1150:9 (1993)).

분해가능한 폴리머 미소구체는 치료 단백질의 고 체계수준을 유지하도록 고안되었다. 미소구체는 분해가능한 폴리머, 예를 들면 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLG), 폴리무수물, 폴리(오르토 에스테르), 생분해불가능한 에틸비닐 아세테이트 폴리머로부터 제조되는데, 이들 단백질은 폴리머에 포합된다(Gombotz and Pettit, Bioconjugate Chem . 6:332 (1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery", in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), p. 51-93 (CRC Press 1995); Roskos and Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery", in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), p. 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus et al., Science 281:1161 (1998); Putney and Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998); Putney, Curr . Opin . Chem . Biol . 2:548 (1998)). 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-코팅된 나노스피어는 또한 치료 단백질의 정맥내 투여를 위한 담체를 제공할 수 있다(예를 들면, Gref et al., Pharm . Biotechnol . 10:167 (1997) 참조).

본 발명은 또한 화학적으로 변형된 항-IL-22RA 항체 또는 결합 파트너, 예를 들면 상기에 논의한 바와 같이 폴리머와 연결된 항-IL-22RA 항체 또는 IL-22RA 가용성 수용체를 고려한다.

다른 투여 형태는, 예를 들면 Ansel and Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5판 (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19판 (Mack Publishing Company 1995), 및 Ranade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996))에 나타난 바와 같이 당업자에 의하여 고안될 수 있다.

본 발명은 항-IL-22 항체의 조성물, 및 본원에 설명된 항체, 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한 방법 및 약학적 사용을 고려한다. 이러한 조성물은 담체를 더 포함할 수 있다. 담체는 종래의 유기 또는 무기 담체일 수 있다. 담체의 예는 물, 완충액, 알코올, 프로필렌 글리콜, 마크로골, 참기름, 옥수수 기름 등을 포함한다.

11. 트랜스제닉 마우스의 생산

IL-20과 IL-22 모두의 과발현이 사람의 건선 병소에서 나타났으며, 이는 IL-20과 IL-22가 모두 사람 건선에 연루됨을 시사한다. 더욱이, 본원에 설명된 대로, 트랜스제닉 마우스에서 IL-20 또는 IL-22의 과별현은 건선 표현형의 표시인 상피 비후 및 면역세포 병발을 나타냈다; 그리고 추가하여, 정상 마우스에 IL-22를 주사하자 건선 표현형의 표시인 상피 비후 및 면역세포 병발이 나타났으며, 이것은 가용성 수용체 길항제 zcytor16(IL-22RA2)에 의해 제거되었다. 이러한 생체내 데이터가 또한 전-염증 IL-22가 건선에 연루됨을 시사한다. 이와 같이, 본 발명의 항-사람-IL-22RA 중화 및 모노클로날 항체뿐만 아니라 가용성 IL-22 수용체와 같은, IL-22 활성의 길항제는, 특히 건선의 치료에서 IL-22 및 IL-20에 대한 길항제로서, 염증 질환의 치료학적 치료에 유용하다. 더욱이, 본 발명의 항-사람-IL-22RA 중화 및 모노클로날 항체뿐만 아니라 가용성 IL-22RA와 같은, IL-22 또는 IL-20과 IL-22 활성을 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 제제는, 예를 들어 아토피 피부염, IBD, 결장염, 내독소혈증, 관절염, 류마티스 관절염 및 건선성 관절염, 성인 호흡기 질환(ARD), 패혈쇼크, 복합장기부전, 천식이나 기관지염 같은 염증성 폐 손상, 세균성 폐렴, 건선, 습진, 아토피 및 접촉성 피부염, 및 궤양성 결장염 및 크론병과 같은 염증성 장 질환의 치료에서, IL-22 또는 IL-20과 IL-22 모두에 대한 길항제로서, 다른 염증성 질환의 치료학적 치료에 유용하다.

한 양태에서, 본 발명은, (a) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 1(Pro)부터 아미노산 번호 6(Asp)까지로 구성된 폴리펩티드; (b) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 26(Ser)부터 아미노산 번호 32(Pro)까지로 구성된 폴리펩티드; (c) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 41(Lys)부터 아미노산 번호 47(Asp)까지로 구성된 폴리펩티드; (d) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 아미노산 번호 49(Val)부터 아미노산 번호 62(Cys)까지로 구성된 폴리펩티드; (e) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 41(Lys)부터 아미노산 번호 62(Cys)까지로 구성된 폴리펩티드; (f) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 84(Ala)부터 아미노산 번호 97(Ser)까지로 구성된 폴리펩티드; (g) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 103(Thr)부터 아미노산 번호 108(Asp)까지로 구성된 폴리펩티드; (h) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 130(Arg)부터 아미노산 번호 135(His)까지로 구성된 폴리펩티드; (i) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 164(Gly)부터 아미노산 번호 166(Lys)까지로 구성된 폴리펩티드; (j) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 175(Tyr)부터 아미노산 번호 179(Glu)까지로 구성된 폴리펩티드; (k) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 193(Lys)부터 아미노산 번호 196(Ala)까지로 구성된 폴리펩티드; (l) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 203(Lys)부터 아미노산 번호 209(Thr)까지로 구성된 폴리펩티드; 및 (m) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; 및 (n) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드로 구성되는 군에서 선택되는, 동물에서 면역반응을 도출하여 항체를 생산하는 폴리펩티드를 동물에 접종하는 단계; 및 동물로부터 항체를 분리하는 단계를 포함하며, 이때 항체는 IL-22RA 폴리펩티드(SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3)과 특이적으로 결합함으로써, IL-20(SEQ ID NO:8) 또는 IL-22(SEQ ID NO:6)의 활성을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드에 대한 항체의 생산 방법을 제공한다. 상기 설명된 방법의 한 구체예에서, 상기 방법에 의해 생산된 항체는 IL-20(SEQ ED NO:8) 또는 IL-22(SEQ ID NO:6)의 전-염증 활성을 감소시킨다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 상기 방법에 의해 생산된 항체는 IL-20(SEQ ED NO:8) 또는 IL-22(SEQ ID NO:6)과 IL-22RA(SEQ ID NO:2)의 상호작용을 중화시킨다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 항체에 의한 중화는 시험관내 세포-기반 중화 분석에서 IL-20(SEQ ED NO:8) 또는 IL-22(SEQ ED NO:6)의 중화를 나타냄으로써 측정된다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 상기 방법에 의해 생산된 항체는 IL-20(SEQ ED NO:8) 및 IL-22 (SEQ ID NO:6) 둘 다의 전-염증 활성을 감소시킨다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 상기 방법에 의해 생산된 항체는 IL-20(SEQ ED NO:8) 및 IL-22(SEQ ID NO:6) 둘 다와 IL-22RA(SEQ ID NO:2)의 상호작용을 중화시킨다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 항체에 의한 중화는 시험관내 세포-기반 중화 분석에서 IL-20(SEQ ED NO:8) 및 IL-22(SEQ ED NO:6) 둘 다의 중화를 나타냄으로써 측정된다.

다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ TD NO:3의 폴리펩티드에 결합하는 본원에 설명된 방법에 의하여 생산된 항체를 제공한다. 상기 설명된 항체의 한 구체예에서, 항체는 (a) 폴리클로날 항체, (b) 쥐과 모노클로날 항체, (c) (b)로부터 유래된 사람화 항체, (d) 항체 단편, 또는 (e) 사람 모노클로날 항체이다. 상기 설명된 항체의 다른 구체예에서, 항체는 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩티드 태크, 자기 입자, 또는 독소를 더 포함한다. 상기 설명된 항체의 다른 구체예에서, 항체는 PEG화를 더 포함한다. 상기 설명된 항체의 다른 구체예에서, 항체는 (a) 폴리클로날 항체, (b) 쥐과 모노클로날 항체, (c) (b)로부터 유래된 사람화 항체, (d) 항체 단편, 또는 (e) 사람 모노클로날 항체이다. 상기 설명된 항체의 다른 구체예에서, 항체는 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩티드 태크, 자기 입자, 또는 독소를 더 포함한다. 상기 설명된 항체의 다른 구체예에서, 항체는 PEG화를 더 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:3에 나타낸 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 폴리펩티드와 결합하고; IL-20(SEQ ID NO:8) 또는 IL-22(SEQ ID NO:6)의 전-염증 활성을 감소시키는 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 상기 설명된 항체 또는 항체 단편의 한 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 IL-20(SEQ ID NO:8) 및 IL-22 (SEQ ID NO:6) 둘 다의 전-염증 활성을 감소시킨다. 상기 설명된 항체 또는 항체 단편의 다른 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 (a) 폴리클로날 항체, (b) 쥐과 모노클로날 항체, (c) (b)로부터 유래된 사람화 항체, (d) 항체 단편, 또는 (e) 사람 모노클로날 항체이다. 상기 설명된 항체 또는 항체 단편의 다른 구체예에서, 항체는 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩티드 태크, 자기 입자, 또는 독소를 더 포함한다. 상기 설명된 항체 또는 항체 단편의 다른 구체예에서, 항체는 PEG화를 더 포함한다. 상기 설명된 항체 또는 항체 단편의 다른 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 (a) 폴리클로날 항체, (b) 쥐과 모노클로날 항체, (c) (b)로부터 유래된 사람화 항체, (d) 항체 단편, 또는 (e) 사람 모노클로날 항체이다. 상기 설명된 항체 또는 항체 단편의 다른 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩티드 태크, 자기 입자, 또는 독소를 더 포함한다. 상기 설명된 항체 또는 항체 단편의 다른 구체예에서, 항체는 PEG화를 더 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 항체 없이 배양된 골수 또는 말초혈 세포와 비교하여, 골수 또는 말초혈 세포에서 조혈세포의 증식 또는 분화를 감소시키기에 충분한 양의 본원에 개시된 항체를 포함하는 조성물과 함께 골수 또는 말초혈 세포를 배양하는 단계를 포함하는 조혈세포 및 조혈세포 전구체의 IL-22-유도 또는 IL-20-유도 증식 또는 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다. 상기 설명된 방법의 한 구체예에서, 조혈세포 및 조혈세포 전구체는 림프양 세포이다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 림프양 세포는 대식세포 또는 T 세포이다.

다른 양태에서, 본 발명은 염증을 가진 포유동물에게 염증을 감소시키기에 충분한 양으로 본원에 개시된 항체 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, IL-22-유도 또는 IL-20-유도 염증을 감소시키는 방법을 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 항체 없이 배양된 골수 또는 말초혈 세포와 비교하여, 골수 또는 말초혈 세포에서 조혈세포의 증식 또는 분화를 감소시키기에 충분한 양의 본원에 개시된 항체를 포함하는 조성물과 함께 골수 또는 말초혈 세포를 배양하는 단계를 포함하는 조혈세포 및 조혈세포 전구체의 IL-22-유도 또는 IL-20-유도 증식 또는 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다. 상기 설명된 방법의 한 구체예에서, 조혈세포 및 조혈세포 전구체는 림프양 세포이다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 림프양 세포는 대식세포 또는 T 세포이다.

다른 양태에서, 본 발명은 염증을 가진 포유동물에게 염증을 감소시키기에 충분한 양으로 본원에 개시된 항체 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, IL-22-유도 또는 IL-20-유도 염증을 감소시키는 방법을 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 항체 또는 항체 단편 없이 배양된 골수 또는 말초혈 세포와 비교하여, 골수 또는 말초혈 세포에서 조혈세포의 증식 또는 분화를 감소시키기에 충분한 양의 본원에 개시된 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물과 함께 골수 또는 말초혈 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 조혈세포 및 조혈세포 전구체의 IL-22-유도 및 IL-20-유도 증식 또는 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 조혈세포 및 조혈세포 전구체는 림프양 세포이다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 림프양 세포는 대식세포 또는 T 세포이다.

다른 양태에서, 본 발명은 염증을 가진 포유동물에게 염증을 감소시키기에 충분한 양으로 본원에 개시된 항체 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, IL-22-유도 또는 IL-20-유도 염증을 감소시키는 방법을 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 항체 배양된 골수 또는 말초혈 세포와 비교하여, 골수 또는 말초혈 세포에서 조혈세포의 증식 또는 분화를 감소시키기에 충분한 양의 본원에 개시된 항체를 포함하는 조성물과 함께 골수 또는 말초혈 세포를 배양하는 단계를 포함하는 조혈세포 및 조혈세포 전구체의 IL-22-유도 및 IL-20-유도 증식 또는 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 조혈세포 및 조혈세포 전구체는 림프양 세포이다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 림프양 세포는 대식세포 또는 T 세포이다.

다른 양태에서, 본 발명은 염증을 가진 포유동물에게 염증을 감소시키기에 충분한 양으로 본원에 개시된 항체 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, IL-22-유도 또는 IL-20-유도 염증을 감소시키는 방법을 제공한다.

다른 양태로서, 본 발명은 (1) 혈청 아밀로이드 A 단백질의 수준을 측정하는 단계; (2) 허용되는 약학적 부형제 중에 제 3 항에 따른 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계; (3) 혈청 아밀로이드 A 단백질의 투여 후 수준을 측정하는 단계; (4) 단계 (1)에서의 혈청 아밀로이드 A 단백질 수준과 단계 (3)에서의 혈청 아밀로이드 A 단백질 수준을 비교하는 단계를 포함하며, 이때 혈청 아밀로이드 A 단백질 수준이 증가하지 않거나 감소하는 것은 염증 반응이 억제된 표시인 것을 특징으로 하는, 염증을 가진 포유동물에서 염증 반응을 억제하는 방법을 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 포유동물에 IL-22 또는 IL-20의 길항제를 투여하여 염증을 감소시키는 단계를 포함하며, 여기서 길항제는 (i) IL-22RA(SEQ ID NO:3)의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편과 특이적으로 결합하는 항체, 항체 단편 또는 결합 폴리펩티드, 또는 (ii) IL-22RA(SEQ ID NO:3)의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 포함하고, IL-22 (SEQ ID NO:6) 또는 IL-20(SEQ ID NO:8) 중 하나의 염증 활성이 감소하는 것을 특징으로 하는, IL-22 또는 IL-20이 어떤 역할을 하는 염증 질환으로 고생하는 포유동물의 치료 방법을 제공한다. 상기 설명된 방법의 한 구체예에서, 질환은 만성 염증성 질환이다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 질환은 염증성 장 질환, 궤양성 결장염, 크론병, 관절염, 아토피 피부염 또는 건선을 포함하는 만성 염증성 질환이다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 질환은 급성 염증성 질환이다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 질환은 내독소혈증, 패혈증, 독성쇼크 증후군 또는 감염성 질환을 포함하는 급성 염증성 질환이다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 항체, 항체 단편, 또는 결합 폴리펩티드는 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩티드 태크, 자기 입자, 또는 독소를 더 포함한다.

다른 양태로서, 본 발명은 포유동물에 IL-22 또는 IL-20의 길항제를 투여하여 염증을 감소시키는 단계를 포함하며, 여기서 길항제는 (i) IL-22RA(SEQ ID NO:3)의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편과 특이적으로 결합하는 항체, 항체 단편 또는 결합 폴리펩티드, 또는 (ii) IL-22RA(SEQ ID NO:3)의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 포함하고, IL-22 (SEQ ID NO:6) 및 IL-20(SEQ ID NO:8) 둘 다의 염증 활성이 감소하는 것을 특징으로 하는, IL-22 또는 IL-20이 어떤 역할을 하는 염증 질환으로 고생하는 포유동물의 치료 방법을 제공한다. 상기 설명된 방법의 한 구체예에서, 질환은 만성 염증성 질환이다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 질환은 염증성 장 질환, 궤양성 결장염, 크론병, 관절염, 아토피 피부염 또는 건선을 포함하는 만성 염증성 질환이다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 질환은 급성 염증성 질환이다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 질환은 내독소혈증, 패혈증, 독성쇼크 증후군 또는 감염성 질환을 포함하는 급성 염증성 질환이다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 항체, 항체 단편, 또는 결합 폴리펩티드는 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩티드 태크, 자기 입자, 또는 독소를 더 포함한다.

다른 양태로서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 1(Pro)부터 아미노산 번호 6(Asp)까지로 구성된 폴리펩티드; (b) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 26(Ser)부터 아미노산 번호 32(Pro)까지로 구성된 폴리펩티드; (c) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 41(Lys)부터 아미노산 번호 47(Asp)까지로 구성된 폴리펩티드; (d) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 아미노산 번호 49(Val)부터 아미노산 번호 62(Cys)까지로 구성된 폴리펩티드; (e) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 41(Lys)부터 아미노산 번호 62(Cys)까지로 구성된 폴리펩티드; (f) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 84(Ala)부터 아미노산 번호 97(Ser)까지로 구성된 폴리펩티드; (g) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 103(Thr)부터 아미노산 번호 108(Asp)까지로 구성된 폴리펩티드; (h) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 130(Arg)부터 아미노산 번호 135(His)까지로 구성된 폴리펩티드; (i) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 164(Gly)부터 아미노산 번호 166(Lys)까지로 구성된 폴리펩티드; (j) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 175(Tyr)부터 아미노산 번호 179(Glu)까지로 구성된 폴리펩티드; (k) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 193(Lys)부터 아미노산 번호 196(Ala)까지로 구성된 폴리펩티드; (l) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 203(Lys)부터 아미노산 번호 209(Thr)까지로 구성된 폴리펩티드; 및 (m) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; 및 (n) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드로 구성되는 군에서 선택되는 사람 IL-22RA(SEQ ID NO:3)의 항원성 에피토프에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 포함하는, 사람 IL-22(SEQ ID NO:6) 또는 IL-20(SEQ ID NO:8) 중 하나의 활성을 감소 또는 중화시키는 항체를 제공한다. 상기 설명된 항체의 다른 구체예에서, 항체는 (a) 폴리클로날 항체, (b) 쥐과 모노클로날 항체, (c) (b)로부터 유래된 사람화 항체, (d) 항체 단편, 또는 (e) 사람 모노클로날 항체로 구성된 군에서 선택된다. 상기 설명된 항체의 다른 구체예에서, 항체는 PEG화를 더 포함한다. 상기 설명된 항체의 다른 구체예에서, 항체는 (a) 폴리클로날 항체, (b) 쥐과 모노클로날 항체, (c) (b)로부터 유래된 사람화 항체, (d) 항체 단편, 또는 (e) 사람 모노클로날 항체로 구성된 군에서 선택된다. 상기 설명된 항체의 다른 구체예에서, 항체는 PEG화를 더 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 항체의 유효량을 투여함으로써 병원성 상태를 치료하는 것을 포함하는 IL-22RA 활성과 관련된 피험자에서 병원성 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 설명된 방법의 한 구체예에서, 상기 병원성 상태는 만성 염증성 상태이다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 상기 만성 염증성 상태는 염증성 장 질환, 궤양성 결장염, 크론병, 관절염, 아토피 피부염 또는 건선을 포함한다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 상기 병원성 상태는 급성 염증성 상태이다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 상기 급성 염증성 상태는 내독소혈증, 패혈증, 독성쇼크 증후군 또는 감염성 질환을 포함한다.

다른 양태에서, 포유동물에 IL-22RA의 길항제를 투여하여 염증을 감소시키는 단계를 포함하며, 여기서 길항제는 IL-22RA(SEQ ID NO:3)의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편과 특이적으로 결합하는 항체, 항체 단편, 또는 결합 폴리펩티드를 포함하고, 염증 활성이 감소하는 것을 특징으로 하는, IL-22RA가 어떤 역할을 하는 염증 질환으로 고생하는 포유동물의 치료 방법을 제공한다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 질환은 만성 염증성 질환이다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 질환은 염증성 장 질환, 궤양성 결장염, 크론병, 관절염, 아토피 피부염 또는 건선을 포함하는 만성 염증성 질환이다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 질환은 급성 염증성 질환이다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 질환은 내독소혈증, 패혈증, 독성쇼크 증후군 또는 감염성 질환을 포함한다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 항체, 항체 단편, 또는 결합 폴리펩티드는 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩티드 태크, 자기 입자, 또는 독소를 더 포함한다. 상기 설명된 방법의 다른 구체예에서, 항체, 항체 단편, 또는 결합 폴리펩티드는 PEG화를 더 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 염증을 가진 포유동물에 염증을 감소시키는데 충분한 양의 본원에 개시된 항체 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 염증 감소 방법을 제공한다.

본 발명은 다음의 비제한적인 실시예들에 의해 더 예시된다.

실시예 1

형질전환된 BHK 570 세포로부터의 IL-22 RA2 - Fc4 폴리펩티드의 정제

다른 언급이 없는 한, 모든 조작은 4℃에서 수행하였다. 다음의 과정을 사용하여 IL-22RA2-Fc4로 표시되는, 사람 Fc4 (SEQ ID NO:14)에 융합된 C-말단을 함유하는 IL-22RA2 폴리펩티드 (SEQ ID NO:13의 잔기 23부터 231까지의 성숙한 가용성 수용체 폴리펩티드; SEQ ID NO:12에 나타낸 바와 같은 폴리뉴클레오티드)를 정제하였다. IL-22RA2-Fc4로 형질전환된 BHK 570 세포로부터 취한 조절된 배지 약 16,500ml을 0.2um 멸균 필터를 통해 여과한 후, 프로테아제 억제제 용액을 첨가하여, 최종 농도가 각각 0.001mM 로이펩틴 (Boerhinger-Mannheim, Indianapolis, IN), 0.001mM 펩스타틴 (Boerhinger-Mannheim) 및 0.4mM Pefabloc (Boerhinger-Mannheim)이 되도록 하였다. 다공성 단백질 A50 칼럼 (20ml 베드 부피, Applied Biosystems)을 충전하고, 400ml의 PBS (Gibco/BRL)로 세척하였다. 보충된 조절된 배지를 칼럼을 통해 15ml/분의 유속으로 통과시킨 후, 800ml의 PBS (BRL/Gibco)로 세척하였다. 칼럼으로부터 0.1M 글리신 pH 3.0을 사용하여 IL-22RA2-Fc4를 용출하고, 5ml의 분획을 직접 0.5ml의 2M 트리스 pH 7.8에 수집하고, 분획내의 최종 pH를 7.4로 조정하였다.

칼럼 성능의 특성을 출발 배지의 환원 SDS-PAGE 겔의 웨스턴 블롯팅과 칼럼 관통을 통해 설명하였다. 웨스턴 블롯팅은 항-사람 IgG HRP (Amersham) 항체를 사용하였는데, 그것은 출발 배지 중의 60,000 Da에서 면역반응성 단백질을 나타냈고, 칼럼 관통에서 주지된 것과 함께, 완전한 포착을 시사한다. 단백질 A50이 용출된 분획을 환원 SDS PAGE 겔에 의해 특성확인하였다. 이 겔은 분획 3 내지 11에서 60,000Da에서 강하게 쿠마찌로 염색된 밴드를 나타냈다. 분획 3 내지 11을 모았다.

단백질 A50 용출 풀(pool)을 44ml로부터 4ml로, 30,000Da Ultrafree Biomax 원심분리 농축기 (15ml 부피, Millpore)를 사용하여 농축하였다. 세파크릴 S-300 겔 여과 칼럼 (175ml 베드 부피; Pharmacia)을 350ml의 PBS (BRL/Gibco)로 세척하였다. 농축된 풀을 칼럼 위로 1.5ml/분의 유속으로 주입한 후, 225ml의 PBS(BRL/Gibco)로 세척하였다. 용출된 피크를 2ml의 분획으로 수집하였다.

용출된 분획을 환원 및 비-환원 은 염색된 (Geno Technology) SDS PAGE 겔에 의해 확인하였다. 환원 은 염색된 SDS PAGE 겔은 분획 14 내지 31에서 60,000Da에서 강력하게 염색된 밴드를 나타낸 반면, 비-환원 은 염색된 SDS PAGE 겔은 분획 14 내지 31에서 160,000Da에서 강력하게 염색된 밴드를 나타냈다. 분획 1 내지 13은 다양한 크기의 많은 밴드를 나타냈다. 분획 14 내지 31을 모아서 30,000Da Ultrafree Biomax 원심분리 농축기 (15ml 부피, Millpore)를 사용하여 22ml로 농축하였다. 이 농축액을 0.2㎛ 아크로디스크 멸균 필터 (Pall Corporation)를 통하여 여과하였다.

농축되고 모아진 분획의 단백질 농축을 BCA 분석 (Pierce, Rockford, IL)에 의해 수행하였고, 물질을 분취하여 -80℃에서 본 발명자들의 표준 과정에 따라 보관하였다. 모아진 분획의 농도는 1.50mg/ml이었다.

실시예 2

CRF2 -4 수용체를 발현하는 BaF3 세포 ( BaF3 / CRF2 -4 세포) 및 IL-22RA 수용체와 함께 CRF2 -4 수용체를 발현하는 BaF3 세포 ( BaF3 / CRF2 -4/IL-22RA 세포)의 제조

전 길이의 CRF2-4 수용체를 발현하는 BaF3 세포를 30㎍의 CRF2-4 발현 벡터를 사용하여, 아래에서 설명되는 바와 같이 제조하였다. CRF2-4 수용체를 발현하는 BaF3 세포는 BaF3/CRF2-4로 표시하였다. 이들 세포를 대조표준으로 사용하여, 추가로 전 길이의 IL-22RA 수용체 (미국 특허 5,965,704호)로 형질전환하였고, 그것을 아래에서 설명되는 바와 같이 IL-22 활성에 대한 스크린을 제조하는데 사용하였다.

A. CRF2 -4 수용체를 발현하는 BaF3 세포의 제조

CRF2-4의 전 길이의 cDNA 서열 (Genbank 승인 번호 Z17227)을 다우디 셀라인 cDNA 라이브러리로부터 분리한 후, 발현 벡터 pZP7P에 클론하였다.

쥐의 골수로부터 유도된 인터류킨-3 (IL-3) 의존성 전-림프종 셀라인인 BaF3 (Palacios and Steinmetz, Cell 41:727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol . Cell. Biol . 6:4133-4135, 1986)을 완전 배지 (10%의 열-비활성화 우태아 혈청, 2ng/ml의 쥐 IL-3 (mIL-3)(R&D, Minneapolis, MN), 2mM의 L-글루타Max-1^TM (Gibco BRL), 1mM의 피루브산 나트륨 (Gibco BRL), 및 PSN 항생물질 (GIBCO BRL)이 첨가된 RPMI 배지 (JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS))에서 유지하였다. 일렉트로포레이션 전에, CRF2-4/pZP7P를 제조하고 Qiagen Maxi Prep 키트 (Qiagen)를 사용하여 제조업체의 지시대로 정제하였다. 일렉트로포레이션을 위해 BaF3 세포를 혈청이 없는 RPMI 배지에서 한 번 세척한 후, 혈청이 없는 RPMI 배지에 10⁷ 세포/ml의 세포 밀도로 재현탁하였다. 재현탁된 BaF3 세포 1ml을 30㎍의 CRF2-4/pZP7P 플라스미드 DNA와 혼합하고, 별도의 일회용 일렉트로포레이션 챔버 (GIBCO BRL)에 옮겼다. 그것을 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 후에 세포에 일렉트로포레이션 장치 (CELL-PORATOR^TM; GIBCO BRL)에 의해 전달된 두 번의 일련의 쇼크 (800 lFad/300 V; 1180 lFad/300 V)를 주었다. 5분 동안의 회복 시간이 지난 후, 일렉트로포레이트된 세포를 50ml의 완전 배지에 옮기고 인큐베이터에 15 내지 24시간 동안 (37℃, 5% CO₂) 넣어두었다. 그런 다음 세포를 회전시키고 T-162 플라스크에 들어있는 2㎍/ml의 퓨로마이신을 함유하고 있는 50ml의 완전 배지에 재현탁하여 퓨로마이신-내성 풀을 분리하였다. 형질전환된 BaF3 세포의 풀을 이하 BaF3/CRF2-4 세포로 부르고, 아래에서 설명되는 바와 같이 신호화 능력에 대해 분석하였다. 나아가 이들 세포를 다시 IL-22RA 수용체로 아래에서 설명되는 바와 같이 형질전환하였다.

B. CRF2 -4 및 IL-22RA 수용체를 발현하는 BaF3 세포의 제조

전 길이의 IL-22RA 수용체를 발현하는 BaF3/CRF2-4 세포를 위에서 설명한 바와 같이, 30㎍의 IL-22RA 발현 벡터를 사용하여 제조하였다. 그것을 회수한 후에 형질전환체를 200㎍/ml의 제오신과 2㎍/ml의 퓨로마이신을 사용하여 선택하였다. IL-22RA 수용체를 발현하는 BaF3/CRF2-4 세포를 BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포로 표시하였다. 이들 세포를 사용하여 본원에서 기술되는 IL-22 활성뿐 아니라 IL-22RA 길항체 활성에 대하여 스크린하였다.

실시예 3

알라마르 블루 증식 분석을 사용한 BaF3 / CRF2 -4/IL-22RA 세포를 사용하는 IL-22 길항체 활성에 대한 스크리닝

A. 알라마르 블루 증식 분석을 사용한 BaF3 / CRF2 -4/IL-22RA 세포를 사용하는 IL-22 활성에 대한 스크리닝

정제된 IL-22-CEE (실시예 4)를 사용하여 아래에서 설명되는 것과 같은 증식 활성의 존재에 대하여 시험하였다. 정제된 IL-22RA2-Fc4 (실시예 1)를 아래에서 설명되는 것과 같이, 이 분석에서 IL-22의 증식 반응을 길항하는 데 사용하였다.

BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포를 회전시키고 mIL-3이 없는 완전 배지 (10%의 열-비활성화 우태아 혈청, 2ng/ml의 쥐 IL-3 (mIL-3)(R&D, Minneapolis, MN), 2mM의 L-글루타Max-1^TM (Gibco BRL), 1mM의 피루브산 나트륨 (Gibco BRL), 및 PSN 항생물질 (GIBCO BRL)이 첨가된 RPMI 배지 (JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS))(이하 "mIL-3 유리 배지"로 언급함)로 세척하였다. 세포를 회전시키고 3회 세척하여 mIL-3을 완전히 제거하였다. 그런 다음 세포를 혈구 계산기에서 계수하였다. 세포를 96-웰 포맷에 웰당 5000 세포로, mIL-3 유리 배지를 사용하여 웰당 100㎕의 부피로 플레이트하였다.

BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포의 증식을 mIL-3 유리 배지로 50, 10, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.13, 0.06ng/ml 농도로 희석한 IL-22-CEE 단백질을 사용하여 평가하였다. 100㎕의 희석된 단백질을 BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포에 첨가하였다. 총 분석 부피는 200㎕이다. 분석 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 3일 동안 인큐베이션하고, 그 후에 알라마르 블루 (Accumed, Chicago, IL)를 웰당 20㎕씩 첨가하였다. 플레이트를 다시 37℃, 5% CO₂에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 알라마르 블루는 살아있는 세포수를 토대로 한 형광계 판독값을 제공하므로, 네거티브 대조표준에 비교하여 직접적인 세포 증식 척도이다. 플레이트를 다시 37℃, 5% CO₂에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 Fmax^TM 플레이트 판독기 (Molecular Devices Sunnyvale, CA)상에서 SoftMax^TM Pro 프로그램을 사용하여 파장 544 (여기) 및 590 (방출)에서 판독하였다. 그 결과는 BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포의 IL-22-CEE에 대한 용량-의존성 증식 반응을 확증해 주었다. 측정된 바와 같이 반응은 상단에서 바탕값보다 대략 15배 이상이어서 50ng/ml이고, 하단에서 2배 유도되어 0.06ng/ml이었다. BaF3 야생형 세포와 BaF3/CRF2-4 세포는 IL-22-CEE에 대한 반응으로 증식하지 못하였는데, 그것은 IL-22가 CRF2-4/IL-22RA 이종이량체 수용체에 특이적임을 나타낸다.

IL-22RA2가 IL-22 활성을 길항할 수 있는 지를 측정하기 위하여, 상기에서 설명된 분석을 정제된 가용성 IL-22RA2/Fc4를 사용하여 반복하였다. IL-22를 IL-22RA2와 10㎍/ml로 조합했을 때, IL-22에 대한 반응은 모든 농도에서 바탕값으로 떨어졌다. 가용성 IL-22RA2의 존재가 IL-22의 증식 효과를 제거했다는 사실은 그것이 IL-22 리간드의 강력한 길항체라는 것을 증명한다. 이 분석은 본원에서 설명된 IL-22 활성의 다른 길항체, 예컨대 항-IL-22RA 항체를 시험하기 위해서도 사용할 수 있다.

실시예4

BHK 570 세포로부터 IL-22- CEE 의 정제

다른 언급이 없는 한 모든 조작을 4℃에서 수행하였다. 다음의 과정을 사용하여 C-말단 GluGlu (EE) 꼬리를 함유하는 IL-22 폴리펩티드 (SEQ ID NO:15 또는 SEQ ID NO:16)를 정제하였다. IL-22-CEE를 발현하는 BHK 세포로부터의 조절된 배지를 아미콘 S10Y3 나선형 카트리지를 사용하여 ProFlux A30 상에서 농축하였다. 프로테아제 억제제 용액을 농축된 조절 배지에, 최종 농도가 각각 2.5mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO), 0.003mM 로이펩틴 (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN), 0.001mM 펩스타틴 (Boehringer-Mannheim) 및 0.4mM Pefabloc (Boehringer-Mannheim) 이 되도록 첨가하였다. 분석을 위해 샘플을 제거하고, 벌크 부피를 -80℃에서 정제를 시작할 때까지 냉동시켰다. 농축된 조절 배지의 총 표적 단백질 농도를 SDS-PAGE와 항-EE HRP 포합된 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석을 통해 측정하였다.

항-EE G-세파로스 (아래에서 설명되는 바와 같이 제조함)의 약 100ml 칼럼을 Waters AP-5, 5cm×10cm 유리 칼럼에 부었다. 칼럼을 흐르게 한 다음, 인산염 완충 식염수 (PBS) pH 7.4를 사용하여 BioCad Sprint (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) 상에서 평형화하였다. 농축된 조절 배지를 해동하여, 0.2 미크론 멸균 필터로 여과하고, pH를 7.4로 조정한 후, 칼럼에 약 1ml/분의 유속으로 밤새 로딩하였다. 칼럼을 10 칼럼 부피 (CV)의 인산염 완충 식염수 (PBS, pH 7.4)로 세척한 다음, 0.5mg/ml의 EE 펩티드 (Anaspec, San Jose, CA)를 함유한 200ml의 PBS (pH 6.0)로 5ml/분의 유속으로 플러그 용출하였다. 사용한 EE 펩티드의 서열은 EYMPME (SEQ ID NO:15)였다. 칼럼을 10 CV의 PBS로 세척한 후, 5 CV의 0.2M 글리신, pH 3.0으로 용출하였다. 글리신-용출된 칼럼의 pH를 2 CV의 5X PBS로 7.0으로 조정한 후, PBS (pH 7.4)로 평형화하였다. 5ml의 분획을 전체 용출 크로마토그래피하는 동안 수집하였고, 280 및 215nM에서의 흡광도를 모니터하였다; 관통 및 세척 풀을 또한 보관하였고 분석하였다. EE-폴리펩티드 용출 피크 분획을 표적 단백질에 대하여, SDS-PAGE 은 염색 및 항-EE HRP 포합 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅을 통하여 분석하였다. 관심의 폴리펩티드 용출 분획을 모아서 10,000 달톤 분자량 컷오프 막 회전 농축기 (Millipore, Bedford, MA)를 제조업체의 지시에 따라 사용하여 60ml로부터 5.0ml로 농축하였다.

다른 보조-정제 단백질로부터 IL-22-CEE를 분리하기 위하여, 농축된 폴리펩티드 용출 수집 분획에 대해 POROS HQ-50 (강력한 음이온 교환 수지, PerSeptive BioSystems, Framingham, MA)을 pH 8.0에서 수행하였다. 1.0×6.0 cm 칼럼을 BioCad Sprint 상에서 붓고 흐르게 하였다. 칼럼을 대응 이온으로 하전시킨 다음 20mM TRIS pH 8.0 (Tris(히드록시메틸 아미노메탄))으로 평형화하였다. 샘플을 1:13으로 희석한 다음 (PBS의 이온 강도를 감소시키기 위하여) Poros HQ 칼럼에 5ml/분으로 로딩하였다. 칼럼을 10 CV의 20mM Tris pH 8.0으로 세척한 후 40 CV 구배의 20mM Tris/1M 염화 나트륨 (NaCl)으로 10ml/분의 속도에서 용출하였다. 전체 크로마토그래피하는 동안 1.5ml씩의 분획을 수집하여 280 및 215 nM에서의 흡광도를 모니터하였다. 용출 피크 분획을 SDS-PAGE 은 염색을 통해 분석하였다. 관심의 분획들을 모아서 10,000 달톤 분자량 컷오프 막 회전 농축기 (Millipore, Bedford, MA)를 제조업체의 지시에 따라 사용하여 1.5 내지 2ml로 농축하였다.

유리 EE 펩티드 및 어떠한 오염된 보조-정제 단백질로부터 IL-22-CEE 폴리펩티드를 분리하기 위하여, 모아진 농축된 분획에 대해 PBS로 평형되고 로딩된 1.5×90 cm 세파덱스 S200 (Pharmacia, Piscataway, NJ) 상에서, 1.0ml/분의 유속으로 BioCad Sprint를 사용하여 크기 축출 크로마토그래피를 수행하였다. 전체 크로마토그래피가 진행되는 동안 1.5ml씩의 분획을 수집하고, 280 및 215 nM에서의 흡광도를 모니터하였다. 피크 분획에 대해 SDS-PAGE 은 염색을 통해 특성을 확인하였고, 가장 순수한 분획들만을 모았다. 이 물질을 정제된 IL-22-CEE 폴리펩티드로 표시하였다.

이 정제된 물질에 대해 최종적으로 4ml의 ActiClean Etox (Sterogene) 칼럼을 수행하여 남아있을 어떠한 내독소를 제거하였다. 샘플을 PBS로 평형된 중력 칼럼을 4회 통과시킨 후 칼럼을 3 ml 부피의 PBS로 한 번 세척하고, 그것을 "세정된" 샘플로 모았다. 그런 다음 그 물질을 0.2 미크론 멸균 필터를 통해 여과하고, -80℃에서 분취할 때까지 보관하였다.

웨스턴 블롯팅, 쿠마찌 블루 및 은 염색된 SDS-PAGE 겔 상에서 IL-22-CEE 폴리펩티드는 하나의 큰 밴드로 나타났다. 정제된 물질의 단백질 농도는 BCA 분석 (Pierce, Rockford, IL)에 의해 수행하였고, 단백질을 분취하여 -80℃에서 표준 과정에 따라 보관하였다.

항-EE 세파로스를 제조하기 위하여 100ml의 베드 부피의 단백질 G-세파로스 (Pharmacia, Piscataway, NJ)를 500ml의 Nalgene 0.45 미크론 필터 유닛을 사용하여 0.02%의 소디움 아지드를 함유하고 있는 100ml의 PBS로 3회 세척하였다. 겔을 6.0 부피의 200mM 트리에탄올아민, pH 8.2 (TEA, Sigma, St. Louis, MO)로 세척하고, 900mg의 항체를 함유하고 있는 동일한 부피의 EE 항체 용액을 첨가하였다. 그것을 밤새 4℃에서 인큐베이션한 후 미결합 항체를, 상기에서 설명한 바와 같이 5 부피의 200mM의 TEA로 수지를 세척함으로써 제거하였다. 수지를 2 부피의 TEA에 재현탁한 다음, 적당한 용기에 옮기고, TEA에 녹인 디메틸피밀리미데이트-2HCl (Pierce, Rockford, IL)을 첨가하여 최종 농도가 36mg/ml 단백질 G-세파로스 겔이 되도록 하였다. 겔을 실온에서 45분 동안 진동시킨 다음, 액체를 상기에서 설명한 바와 같이 필터 유닛을 사용하여 제거하였다. 그런 다음 겔 상의 비특이적 부위를, 10분 동안 실온에서 5 부피의 200mM TEA 중의 20mM 에탄올아민과 함께 인큐베이션함으로써 차단하였다. 그런 다음 겔을 5 부피의 0.02% 소디움 아지드를 함유하는 PBS로 세척하고 이 용액 중에서 4℃에서 보관하였다.

실시예 5

IL-22 폴리펩티드의 생체내 영향

마우스들 (암컷, C57BL/6N, 생후 8주; Charles River Labs, Kingston, NY)을 세 그룹으로 나누었다. IL-22 폴리펩티드 (SEQ ID NO:6)를 발현하는 아데노바이러스를 표준 방법을 사용하여 사전에 제조하였다. 제0일에, 원래의 또는 IL-22 아데노바이러스를, 첫 번째 (n=8) 및 두 번째 (n=8) 그룹에, 각각 꼬리 정맥을 통하여, 각 마우스에게 ~0.1ml 부피 중에 ~1×10¹¹ 입자의 용량으로 투여하였다. 세 번째 그룹 (n=8)에게는 처리하지 않았다. 제12일에 마우스들의 체중을 재고 혈액을 채취하였다. 샘플을 완전한 혈구 수 (CBC) 및 혈청 화학에 대하여 분석하였다. 호중구와 혈소판 수의 통계학적으로 유의할만한 상승을, 원래의 아데노바이러스 처리 그룹에 비교하여 IL-22 아데노바이러스를 투여한 그룹에게서 채취한 혈액 샘플에서 검출하였다. 또한 림프구와 적혈구 수는 원래의 아데노바이러스 처리 그룹에 비교하여 IL-22 아데노바이러스를 투여한 그룹에서 상당히 감소하였다. 또한 IL-22 아데노바이러스로 처리한 마우스들은 체중의 감소를 보인 반면, 원래의 아데노바이러스로 처리한 그룹의 마우스들은 체중이 증가하였다. 또한 혈청 IL-22 수준은 제3일에 증가하였고, 글루코스 수준은 감소하였다. 요약하면, IL-22 아데노-마우스들은 다른 전-염증성 사이토킨, 예컨대 TNF-알파, IL-1베타, 및 gp130 사이토킨에 의해 개시될 수 있는 급성 상 반응을 나타냈다. 급성 상 반응은 패턴 인지 분자에 의해 개시되는 즉각적인 염증 반응 세트이다. 급성 상 단백질은 미생물에 대한 증강된 단백질 보호를 제공하고, 세포 교통 및 조절제 방출에 미치는 영향에 의해 염증 반응을 변형한다. 예를 들어 SAA는 화학주성의 유도, 내피세포에 대한 백혈구 고착의 증강, 및 증가된 식균 작용을 포함하는 강력한 백혈구 활성화 기능을 가진다. 급성 상 반응의 크기와 기간을 개시하고 변경시키는 인자들을 이해하는 것은 감염성 및 염증성 질병에 대한 새로운 치료법의 개발에서 중요한 단계를 나타낸다.

그 결과는 IL-22가 조혈작용에 영향을 미친다, 즉 생체 내에서의 혈구 형성에 영향을 미친다는 것을 시사한다. IL-22는 그것 자체로서 상이한 혈액 줄기세포에 영향을 주는 생물학적 활성을 가지고 있으므로, 특이한 계통의 분화된 특정 혈구의 증가 또는 감소를 초래한다. 예를 들어 IL-22는 림프구를 감소시키는 것으로 여겨지는데, 그것은 림프구를 발생시키는 전용 전구 세포의 억제에 기인하는 것 같다. IL-22는 또한 적혈구를 감소시키는데, 그것은 IL-22가 이들 과정에 포함된 혈구에 영향을 미침으로써 빈혈, 감염, 염증, 및/또는 면역 질병에서 중요한 역할을 할 수 있다는 개념을 지지한다. IL-22에 대한 길항체, 예컨대 항체 또는 그것의 가용성 수용체인 IL-22RA2는 이들 질병에서 치료제로서 사용될 수 있을 것이다.

더욱이, 이들 실험은 마우스에서 IL-22 아데노바이러스를 사용했는데, 그것은 IL-22 과잉-발현이 생체내의 호중구와 혈소판 수준을 증가시킨다는 것을 시사한다. 전 동물 시스템에서 IL-22에 대한 반응에는 다른 인자들 (예컨대 사이토킨 및 조절제 유전자)이 포함되어 있다고 생각할 수 있다. 그럼에도 이들 데이터는 조혈작용에 IL-22가 포함되어 있음을 강력하게 지지한다. 그러므로 IL-22 및 그것의 수용체는 다양한 장애, 예컨대 염증, 면역 장애, 감염, 빈혈, 조혈 및 다른 암, 등의 진단 및 치료에 적당한 시약/표적이다.

실시예 6

IL-22-발현 유전자도입 마우스

A. 마우스 IL-22를 발현하는 유전자도입 마우스의 생성

림프 특이적 EμLCK 프로모터의 5' 및 3' 플랭킹 서열, 마우스 IL-22 (SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:11에 제시된 폴리펩티드), 쥐 인슐린 II 인트론, IL-22 cDNA 및 사람 성장 호르몬 폴리 A 서열을 함유하는 유전자도입 벡터로부터의 DNA 단편을 표준 방법을 사용하여 제조하고, 그것을 사용하여 수정된 B6C3fl (Taconic, Germantown, NY) 쥐 난모세포에 표준 미소주사 프로토콜을 사용하여 미소주사하엿다 (Hogan, B. et al., Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994 참조).

154 마리의 새끼들 중에서 림프-특이적 EμLCK 프로모터가 포함된 마우스 IL-22에 대해 유전자도입된 25마리를 확인하였다. 유전자도입 새끼 중 11마리는 출생 후 수시간 내에 죽었고, 외관이 반질거리는 9마리의 유전자도입 새끼는 출생일에 죽었으며, 2마리가 성장하였다. 발현수준은 한 마리의 성인 마우스에서는 낮았다. 사체 새끼로부터의 조직을 준비하여 아래에서 설명하는 바와 같이 조직학적으로 조사하였다.

신생 새끼의 반질거리는 외관은 그것들이 건조되어서 그 결과 적절한 돌봄이 줄어든 것처럼, 피부의 뻣뻣해짐과 관련되는 것으로 여겨졌다. 그것들의 움직임은 대체로 뻤뻤해졌다.

B. 유전자도입 마우스로부터 유전자형 및 발현 분석

상기에서 설명된 EμLCK 프로모터에 의해 유도된 마우스 IL-22 유전자도입 라인으로부터 새로 태어난 새끼들을 제 1일 (태어난 날)에 이상 유무에 대해 관찰하고, 조직 수집을 위해 희생시켰다. 모든 새끼들에게 독특한 귀 꼬리 번호를 부여하고, 희생 시점에서 반질거리는 피부 표현형을 가지는 것으로 표시된 것들을 기록하였다. 12마리의 새끼 중에서 6마리는 반질거리는 피부 표현형을 가지는 것으로 관찰된 반면, 두 마리는 "심각한" 표현형을 나타냈다. 심각한 표현형은 피부가 특히 반질반질하고 매우 건조하며 움직임이 거의 없는 작은 새끼로 규정하였다. 각 새끼들의 좌측 피부를 수집하여 조직-Tek 삽입 배지에 넣어 냉동하였다.

유전자형 분류는, 비록 발현 데이터는 수집되지 않았지만 반질거리는 피부가 유전자도입 상태의 좋은 표시자임을 확증하였다. 냉동 피부 블록을 저온 유지 장치에서 7 미크론으로 절개하고 염색하여 CD3, CD4, CD8, 마우스 대식세포, B-세포, CD80, 및 MHC 클레스 II의 존재를 확인하였다. 염색 프로토콜에는 조직에 대한 시판중인 항체의 결합, 과산화효소 표지된 이차 항체를 사용한 검출, 및 염색을 가시화하기 위한 DAB 색원체 반응이 포함된다.

유전자도입 동물은 MHC 클래스 II 및 CD80이 더 높은 것으로 나타났는데, 이들은 각각 항원-제공 세포와 수지상 세포를 염색한다. 대식세포 마커는 또한 야생형 동물보다는 심각하거나 심각하지 않은 유전자도입 동물의 더 많은 세포에서 검출되었는데, 이들 세포의 분포는 상층 진피에서 매우 국소적이었다. 심각한 표현형으로 분류된 동물들은 이들 세 개의 마커로 모두 가장 강하게 염색되었는데, 그것은 야생형과 비교할 때 세포 밀도 및 수의 극적인 증가를 나타낸다. 이런 가변성은 이들 유전자도입 1세대 새끼들의 IL-22의 발현 수준의 차이에 기인하는 것일 수 있다. MHC 클래스 II 포지티브 세포는 느슨한 개방형 클러스터에 배열되어 있는 하층 진피에 위치하는 한편, CD80 포지티브 세포는 근육/지방층 위 또는 바로 위에 있는 진피 아래에 더 우세하게 존재하였다. 이들 두 세포 집단은 중첩되는 것으로 여겨지지는 않는다. 모든 다른 마커들은 모든 동물에서 동등하게 염색되었다. 비만 세포를 위한 톨루이딘 블루 염색은 야생형과 유전자도입 동물 사이에 약간의 차이도 나타내지 않았다.

C. 유전자도입 마우스 조직의 현미경 평가: Eμ LCK 프로모터를 포함하는 IL-22 TG는 신생아의 치명적 조직학을 가진다

출생한 날에, IL-22 유전자도입된 것으로 표시되어 있는 새끼들을 편안하게 안락사하고, 전신을 10% 완충 포르말린에 담가서 고정시켰다. 6마리의 유전자도입 새끼와 2마리의 비-유전자도입 새끼를 추가의 작업을 위해 분류해놓았다. 6마리의 유전자도입 마우스 중 4마리는 안락사 시점에 반질거리는 피부를 가지고 있는 것으로 주지되었다. 고정된 조직을 5 절개부로 트리밍하였다 (머리의 세로 절개선 및 상부 및 하부 흉부의 단면 및 상부 및 하부 복부의 단면). 조직을 파라핀에 넣고, 일상적으로 프로세스한 후, 5um에서 절개하고 (Jung 2065 Supercut microtome, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany), H&E로 염색하였다. 염색된 조직을 광현미경 (Nikon Eclipse E600, Nikon Inc., Melville, NY)하에서 위원회에서 인증받은 수의과 병리학자 (ACVP)에 의해 평가하였다.

현미경으로 조사할 때, 두 마리의 유전자도입 새끼의 표피가 대조표준을 포함한 다른 6마리의 쥐의 표피보다 더 두꺼워져 있음을 관찰하였다. 어떠한 마우스에서도 피부나 다른 조직에 다른 이상은 주지되지 않았다. 흉부나 복부의 상응하는 영역으로부터의 대표적인 부위를 40X 대물렌즈로 및 현미경에 부착되어 있는 CoolSnap 디지털 카메라 (Roper Scientific, Inc., San Diego, CA)를 사용하여 영상화하였다. 그런 다음 표피의 두께를 조직형태계측 소프트웨어 (Scion Image for Windows (NIH Image), Scion Corp., Frederick, MD, v.B4.0.2)를 사용하여 측정하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내며, 다음과 같다:

유전자형/표현형	평균 흉부 피부 두께 (㎛)	평균 복부 피부 두께 (㎛)
비-유전자도입/정상	5.2	5.4
유전자도입/반질거리지 않음	5.0	6.7
유전자도입/반질거림	8.2	7.4
유전자도입/전부	7.1	7.1

통계학적 유의성을 측정하기 위해서는 마우스의 수가 불충분하였다; 그러나 유전자도입, 특히 피부가 반질거리는 마우스들은 반질거리지 않는 유전자도입 및 비-유전자도입 대조표준보다 더 두꺼운 표피를 가지는 것 같다. 반질거리는 유전자도입 동물은 반질거리지 않는 유전자도입 동물보다 더 높은 IL-22 발현 수준을 가지는 것 같다; 그러나 발현 수준은 이들 마우스들에 대해서는 측정하지 않았다. 이것들은 건선, 건선성 관절염, 또는 다른 염증성 피부 질환 또는 다른 염증성 질병에서의 IL-22에 대한 역할을 시사한다.

실시예 7

IL-22 폴리펩티드의 생체 내 영향

A. IL-22 아데노바이러스로 감염된 마우스는 SAA 유도를 나타낸다.

마우스들 (암컷, C57BL/6N, 생후 8주; Charles River LAbs, Kingston, NY)을 세그룹으로 나누었다. IL-22 폴리펩티드 (SEQ ID NO:6)를 발현하는 아데노바이러스를 표준 방법을 사용하여 사전에 제조하였다. 제0일에, 원래의 또는 IL-22 아데노바이러스를, 첫 번째 (n=8) 및 두 번째 (n=8) 그룹에, 각각 꼬리 정맥을 통하여, 각 마우스에게 ~0.1ml 부피 중에 ~1×10¹¹ 입자의 용량으로 투여하였다. 세 번째 그룹 (n=8)에게는 처리하지 않았다. 제12일에 마우스들의 체중을 재고 혈액을 채취하였다. 연구한 지 20일째 되는 날에 마우스들을 희생시키고, 체중을 기록한 다음, 혈액과 조직을 분석을 위해 수집하였다.

모든 혈액 샘플을 완전한 혈구 수 (CBC) 및 혈청 화학에 대하여 분석하였다. 제12일과 20일에 호중구와 혈소판 수의 통계학적으로 유의할만한 상승이 원래의 아데노바이러스로 처리된 그룹에 비하여 IL-22 아데노바이러스가 투여된 그룹으로부터 취한 혈액 샘플에서 검출되었다. 또한 림프구 수는 제12일에는 원래의 아데노바이러스로 처리된 그룹에 비하여 IL-22 아데노바이러스가 투여된 그룹에서 상당히 감소하였지만, 제20일에는 그 반대의 효과가 관찰되었다. 또한, IL-22 아데노바이러스로 처리한 마우스들은 체중이 감소한 반면, 원래의 아데노바이러스로 처리한 마우스들의 체중은 증가하였다. 글루코스는 원래의 아데노바이러스로 처리된 그룹에 비하여 IL-22 아데노바이러스가 투여된 그룹으로부터의 혈청 샘플에서 두 시점에서 상당히 감소하였다. 혈청 알부민 또한 두 시점에서 상당히 감소하였다. 혈청 우레아 질소 수준은 제20일에 상당히 감소하였다. 혈청 글로불린 수준은 두 시점에 원래의 아데노바이러스로 처리된 그룹에 비하여 IL-22 아데노바이러스가 투여된 그룹에서 상당히 증가하였다. 현미경으로 살펴보았을 때 IL-22에 기원한 조직형태학적 변화는 신장의 세뇨관 재생이었음을 관찰하였다. 마우스에서는 보기 드문 것은 아니지만 이 그룹의 마우스들에게서는 발생률과 심각성이 증가하였다. 신장해는 피질 관상 상피 세포의 호염기성 세포들의 다중 병소 영역으로 나타나는 것이 특징이다.

상기에서 설명된 것과 동일하게 디자인된 추가의 실험을, 결과를 증명하고 추가의 샘플을 수집하기 위하여 수행하였다. 이 연구에서 체중을 매 3일마다 기록하였고, 혈액을 아데노바이러스를 주사한 지 3일 후에 마우스들로부터 수집하였으며, 마우스들을 제10일 (n=4/그룹)과 제20일 (n=4/그룹)에 희생하여서 혈액과 조직을 수집하였다. 원래의 아데노바이러스로 처리된 그룹에 비하여 IL-22 아데노바이러스가 투여된 그룹으로부터의 혈액 샘플에서 다시 한 번 호중구 및 혈소판 수의 증가를 관찰하였다. 이 효과는 호중구에 대해서는 제3일에 명백했지만, 혈소판 수는 제10일까지는 상당한 차이가 없었다. 또한 림프구 수는 제3일과 10일에는 원래의 아데노바이러스로 처리된 그룹에 비하여 IL-22 아데노바이러스가 투여된 그룹에서 상당히 감소하였지만, 제20일에는 앞에서의 연구와 같이 증가하지 않았다. 또 IL-22 아데노바이러스를 투여한 마우스들은 연구 과정 동안 체중이 감소한 반면, 대조 바이러스로 처리하였거나 처리하지 않은 마우스들은 체중이 증가하였다. 혈청 화학 매개변수들은 앞에서의 연구와 일치하였다. IL-22 아데노바이러스 처리와 관련된 신장에서의 세뇨관이 재생되는 조직학적 발견 또한 이 연구에서 확인되었다. 이것은 IL-22 아데노바이러스를 투여한 마우스들에서 추가로 발견되는 적당한 단백뇨의 발견과 일치하였다 (제20일).

상기 결과들은 IL-22가 조혈작용, 즉 생체내의 혈구 형성에 영향을 미친다는 것을 시사한다. IL-22는 그 자체로서 상이한 혈액 줄기세포에 영향을 주는 생물학적 활성을 가질 수 있으므로, 특이한 계통에서 특정한 분화된 혈구의 증가 또는 감소를 초래한다. 예를 들어 IL-22는 림프구를 감소시키는 것으로 여겨지는데, 그것은 림프양 세포를 발생시키는 전용 선구 세포의 억제에 기인하는 것 같고, 그것은 IL-22가 빈혈, 감염, 염증, 및/또는 면역 질병에서 이들 과정에 포함된 혈구에 영향을 미침으로써 중요한 역할을 감당할 것이라는 개념을 지지한다. IL-22에 대한 길항체, 예컨대 항체 또는 그것의 가용성 수용체 IL-22RA2는 이들 질병에서 치료제로서 사용될 수 있다.

더욱이 마우스에서 IL-22 아데노바이러스를 사용한 이들 실험은 IL-22 과잉-발현이 생체내의 호중구와 혈소판의 수준을 증가시킨다는 것을 시사한다. 전체 동물 시스템에서는 IL-22에 대한 반응에 다른 인자들 (예컨대 사이토킨 및 변형제 유전자)이 포함된다고 생각할 수 있다. 그럼에도 불구하고 이들 데이터는 조혈에 IL-22가 포함된다는 것을 강력하게 지지한다. 그러므로 IL-22, 항-IL-22 항체, IL-22RA 가용성 수용체 (예컨대 SEQ ID NO:3), 및 항-IL-22RA 항체는 다양한 장애, 예컨대 염증, 면역 장애, 감염, 빈혈, 조혈성 및 다른 암, 등의 진단 및 치료를 위한 적절한 시약/표적이다.

혈청 글루코스, 알부민 및 뇨소 질소의 감소에 의해 증명된 체중 감소, 급성 상 단백질 SAA의 출현, 및 대사 혼란과 IL-22와의 관련은 IL-22가 특정 염증성 반응에서 초기에 작용하는 사이토킨이라는 것을 시사한다. IL-22 아데노바이러스를 투여한 마우스들은 만성 염증 상태, 예컨대 IBD에서 관찰된 것과 같은 염증 상태, 궤양성 대장염, 관절염, 건선, 건선성 관절염, 천식 등을 나타낼 수 있다. 특정의 유해한 염증 과정은 IL-22에 대한 길항체, 예컨대 항-IL-22 항체, 및 그것의 수용체, 예컨대 IL-22RA 가용성 수용체 (예컨대 SEQ ID NO:3), 및 항-IL-22RA 항체 등의 사용에 의해 억제될 수 있다.

B. IL-22는 전-염증성 사이토킨이다 : 아데노 -IL-22 마우스에서 SAA 의 혈청 수준

아데노-IL-22 마우스에서 SAA의 혈청 수준을 측정하기 위하여, 마우스 SAA 면역검정 키트 및 프로토콜 (Biosource International, California, USA)을 사용하여 ELISA를 수행하였다. 희석된 표준 및 미지의 것을 항-마우스 SAA 항체로 예비-코팅된 분석 플레이트에 HRP-항-마우스 SAA와 함께 플레이트하였다. 플레이트를 한 시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후 키트 지시에 따라 세척하였다. 플레이트를 15분 동안 실온에서 TMB를 사용하여 전개하고, 2M H₂SO₄를 사용하여 중단한 후, 450nm에서 흡광도를 Spectromax 190 (Molecular Devices, California, USA)을 사용하여 판독하였다. 그 결과의 데이터를 Softmax Pro (Molecular Devices, California, USA) 및 Excel (Microsoft Corp., Washington, USA)을 사용하여 분석하였다.

IL-22 아데노바이러스로 감염된 마우스들은 원래의 아데노바이러스로 처리된 대조표준에 비해 10배 이상의 매우 증가한 mSAA 수준을 나타냈다.

C. IL-22 아데노바이러스로 감염된 마우스들의 유동 혈구 분석

생체 내에서 아데노바이러스에 의한 IL-22 발현의 효과를 분석하기 위하여, 본 발명자들은 IL-22-아데노바이러스 감염된 C57BL/6N 마우스에서 감염 후 제10일과 20일에 말초혈, 비장, 및 골수를 분리하였다. 헤파린처리된 관에서 대략 100㎕의 혈액을 수집한 후 저삼투성 용해에 의해 적혈구를 꺼내었다 (세포를 약 5초 동안 4.5ml의 dH₂O에서 용해시킨 후 1.5ml의 3.6% NaCl을 첨가하였다). 비장을 2개의 김서린 유리 슬라이드 사이에서 뭉개어서 방출된 세포를 Nytex 멤브레인 (세포 여과기)을 통과시킨 후 펠릿화하였다. 골수는 막자사발과 공이로 대퇴골 하나를 분쇄하여 세포를 세포 여과기 (Falcon)를 통과시킴으로써 얻었다. 세포를 FACS 세척 완충액 (WB=HBSS/1% BSA/10mM Hepes)에 재현탁하고, 트립판 블루로 계수한 다음, 각 유형마다 1×10⁶개의 생존 세포를 5ml의 폴리스티렌 튜브에 일정액씩 나누어 담았다. 세포를 세척하고 펠릿화한 후, 특별한 면역 세포 하위셋을 확인하기 위하여 사용된 다양한 세포 표면 마커를 인지하는 플루오레센틸-표지된 (FITC, PE, 및 CyChrome) 단클론성 항체 (PharMingen, San Diego, CA)의 칵테일과 함께 20분 동안 얼음위에서 인큐베이션하였다. 이들 마커로는 다음의 것들을 포함한다 (본 발명자들이 시험한 3 그룹에 열거됨): 혈액 염색을 위한 마커: CD3, Gr1, 및 B220; 비장 염색을 위한 마커: CD62L, CD44, 및 CD3; CD21, CD23, 및 B220; IgD, IgM, 및 B220; CD11b, Gr1, 및 CD8; 골수 염색을 위한 마커: CD11b, Gr1, CD3; IgD, IgM, 및 B220. 세포를 1.5ml의 WB로 세척하고 펠릿화한 후, 0.4ml의 WB에 재현탁하고, CellQuest 소프트웨어 (Becton Dickinson, Mountain View, CA)를 사용하는 FACScan 상에서 분석하였다.

본 발명자들은 IL-22-아데노바이러스로 처리된 마우스의 혈액에서 호중구 분획이 제10일에는 4 내지 13배, 그리고 제20일에는 2 내지 3배 더 증가하였음을 발견하였다. 제10일에서의 이 차이는 혈액 중의 림프구 및 단핵 세포 분획의 부수적인 감소를 초래하였다. 골수에서는 본 발명자들은 B 세포의 총 수가 약 1.5배 감소한 반면, 성숙한 재순환 B 세포의 백분율은 증가하였으며, 미성숙한 B 세포의 총 수는 제10일에 약간 감소하였다. 제20일에는 이들 차이가 상당 부분 나타나지 않았지만, 본 발명자들은 성숙한 재순환 B 세포의 분획이 약간 증가한 것을 발견하였다. 비장에서 B 세포의 총 수는 제10일과 제20일에 모두 약간 감소하였지만 (1.5 내지 2배), 제20일에는 주변 지역의 B 세포 (CD21+CD23-B220+)의 분획은 2배 증가하였고, 여포성 B 세포 (CD21+CD23+B220+)의 수는 2배 감소하였다. 주변 지역의 B 세포는 병원체에 대한 제 1 방어선인 것으로 여겨지는데, 왜냐하면 그것들은 보다 통상적인 여포성 B 세포보다 더 B 세포 미토겐 (예컨대 LPS)에 민감하고, 동족의 항원을 만날 때 매우 빠르게 항체-분비 세포로 분화하기 때문이다. IL-22가 여포성 B 세포가 말단 지역의 B 세포로 전환되는 것을 증가시키거나, 덜 성숙한 여포성 세포를 선택적으로 고갈하는 것이 가능하다. 골수에서 발견된 B 세포 수의 변화는 프레/프로 및/또는 미성숙한 B 세포의 증강된 분화, 또는 혈액/비장으로부터 재순환 B 세포의 증가된 유입, 및 아마도 동시적으로 발생하는 미성숙한 B 세포의 말단으로의 유출의 증가를 반영할 것이다. 성숙한 BM B 세포의 실제 수는 증가하지 않으므로, IL-22는 그것들의 증식을 증가시키지는 않을 것이다. 또는 달리 보면, IL-22는 미성숙한 B 세포를 차단, 감소 또는 억제할 수 있으며, 그로써 성숙한 B 세포의 상대적인 재현을 증가시킬 수 있다.

D. IL-22 RA2 - Fc4 는 생체내에서 IL-22 활성을 중화한다: IL-22에 의해 유도된 SAA 발현을 나타내는 SAA ELISA는 IL-22 RA2 - Fc4 주입에 의해 억제된다.

IL-22RA2가 IL-22에 의해 SAA 유도를 억제할 수 있는지를 평가하기 위하여, 마우스들 (암컷, C3H/HEJ, 생후 8주; Jackson Labs, Bar Harbor, ME)을 각 3마리씩 5그룹으로 나누고, 하기 표 6에서 제시하는 바와 같이 단백질을 IP 주사함으로써 처리하였다:

그룹 번호	IL-22	IL-22RA2
그룹 1	-	-
그룹 2	-	100㎍
그룹 3	3㎍	-
그룹 4	3㎍	20㎍
그룹 5	3㎍	100㎍

IL-22RA2는 IL-22 주사보다 15분 전에 주사하였다. 두 가지 단백질 주사는 복강내 경로를 통하여 제공하였다. 혈액 샘플을 각 마우스로부터 처리 전에 취한 후, 처리 후 2시간과 6시간에 취하였다. 혈청을 각 샘플로부터 준비하여 SAA와 IL-22를 측정하였다.

IL-22 및 본원에서 설명된 IL-22, IL-22RA2-Fc4에 대한 가용성 수용체로 처리한 마우스의 SAA 수준을 측정하기 위하여 ELISA를 위에서 설명한 바와 같이 수행하였다. 3㎍의 IL-22와 20 내지 100ug 농도의 IL-22RA2-Fc4로 함께 처리한 마우스들은 바탕값 수준에 비해 IL-22 단독에 의해 유도된 SAA 수준의 감소를 나타냈는데, 그것은 IL-22RA2가 생체내에서 IL-22의 SAA 유도 활성을 억제하였음을 증명한다.

실시예 8

염증성 장 질병 마우스 모델에서 IL-22의 발현

염증성 장 질병 (IBD)은 다중 병소형 질병으로, 2가지 유형, 궤양성 대장염 (UC)과 크론병 (CD)으로 나누어진다. 이들 질병의 병인학은 현재 알려져 있지 않으며, 임상적인 징후들은 다르다. UC는 결장에 한정되며, 증상으로는 혈액이 섞인 설사, 체중 감소 및 복부의 통증이 있다. 육안으로 보이는 UC의 특징은 구멍난 궤양과 짧아진 결장이다. 대조적으로 크론병은 또한 장의 다른 부분에도 영향을 미친다. 증상으로는 설사 (UC에서 나타나는 것보다는 혈액이 덜 섞인다), 미열 및 통증이 있다. 육안적 특징으로는 협착, 심한 궤양, 열창 및 루(fistula)가 있는 괴사성 및 협착성 장이 있다.

이들 사람 질병을 모방하는 여러 개의 동물 모델이 활용가능하다. 신약 스크리닝을 위해 통상적으로 사용되는 3개의 대장염 모델은 2,4,6-트리니트로벤젠 술폰산 (TNBS) 유도된 쥐 모델, 마우스 T-세포 전달 모델, 및 덱스트란 황산 나트륨, 또는 DSS-유도 마우스 모델이다. DSS 모델은 질병 활성 지수 기록 시스템을 사용하여 S. 머어씨 박사에 의한 모델로부터 유도되었다 (S.N.S. Murthy, Treatment of Dextran Sulfate Sodium-Induced Murine Colitis by Intracolonic Cyclosporin, Digestive Disease and Sciences, Vol. 38, No.9 (September 1993), pp.1722-1734).

본 연구로는 급성 대장염은 마우스들에게 그들의 음료수에 6일 동안 DSS가 공급되었을 때 발생하였다. 체중 감소와 혈액이 섞인 설사를 나타낸 동물들은 UC 환자의 증상을 모방하였다. DSS 손상의 메커니즘은 잘 알려져 있지 않지만, 그것이 비특이적인 염증성 면역 반응을 유도하고 장에 미치는 환경적 효과를 모방하는 것으로 여겨진다. 아마도 H₂S가 생성되고, 그것이 세포에 독성을 나타낼 것이다. 또한 루미날 박테리아 플로라의 변화가 일어난다. 단핵 세포, 대식세포 및 비만세포들이 결장에서 활성화되는 것으로 증명되었다. 세 가지 동물 모델 전부에 대한 조절제로는 염증성 프로스타글란딘, 류코트리엔 대사 산물 및 사이토킨이 있다.

A. 방법

대장염은 챨스 리버 실험실에서 얻은 스위스 웹스터 암컷 마우스에서 DSS 섭취에 의해 유도되었다. 마우스들은 연구를 시작할 때에 생후 10주 혹은 11주였다. 마우스들에게 6일 동안 음료수에 4%의 DSS를 섞어주거나 (처리 마우스), 정상적인 음료수만을 주었다 (대조 마우스). 질병 활성 지수 임상 기록 (DAI)을 사용하였는데, 그것은 대변의 질, 잠혈 및 체중 감소를 포함한 측정의 조합을 포함한다. DAI를 각 마우스에 대하여 DSS 처리한 후 첫날부터 시작하여 매일 얻었다. 6일 후에 DSS를 처리된 마우스들의 음료수로부터 제거하였다. 모든 마우스를 DAI 임상 스코어에 의해 희생시킬 때까지 연구를 시작한 지 2일, 7일 또는 10일에 모니터하였다. 2일과 7일에 각각 4마리의 DSS-처리한 마우스와 한 마리의 대조 마우스를 희생시켰다. 제10일에 4마리의 DSS-처리한 마우스와 두 마리의 대조 마우스를 희생시켰다. 희생시킨 모든 동물에 대하여 결장 길이를 측정하였다. 결장 절편을 조직학적 분석을 위해 10% 중성 완충된 포르말린에 고정시키거나 mRNA 추출을 위해 냉동하였다.

B. 조직학적 스코어링 및 질병 활성 지수 ( DAI ) 스코어링

조직학적 지수 스코어는 참조문헌 1의 방법을 따라 얻었다. 일반적으로 결장 절편을 크립트(crypt) 스코어, 과형성된 상피, 크립트 변형 및 염증에 대해 병리학자에 의해 검맹 기록하였다.

매일, 각 마우스를 체중 감소, 대변 농도 및 장 출혈에 대해 임상 스코어로서 등급을 매겼다. 체중 감소량, 설사 및 출혈이 증가할수록 더 높은 스코어를 주었다. 각 마우스에 대한 매일의 스코어는 3가지의 결과/관찰로부터 얻어진 평균 등급이었다.

C. 결과

DSS-처리한 마우스에 대한 결장 길이는 비-처리 대조표준에 대하여 제7일과 제10일에 다소 짧았지만, 그 결과는 중요하지 않았다 (통계학적 용도로 조사하지 않았다). 임상적인 DAI 스코어는 DSS-처리 마우스에서 과거 이 모델을 사용하여 연구했을 때 나타났던 것과 유사한 질병 증상의 발생을 반영하였다. 잠혈은 대략 4일이나 5일 후에 가장 크게 나타났고, 묽은 대변은 제6일과 제7일에 더 많이 나타났다. 조직병리학적 결과는 질병 스코어가 모든 희생 날, 즉 제7일 (피크)과 제10일에 대조표준과는 달랐음을 나타낸다. 조직병리학 스크리닝 스코어는 다음과 같았다: 대조표준=0.5, 제2일 DSS-처리 마우스=8.8, 제7일 DSS-처리 마우스=21, 제 10일 DSS-처리 마우스=18. 임상적 및 조직병리학 스코어는 DSS-처리 마우스가 비-처리 마우스에 비해 상당한 결장 질병을 가졌음을 나타낸다. 냉동된 조직 샘플을 사용하여 나중에 아래에서 설명되는 바와 같은 mRNA를 측정하였다.

D. 쥐 IBD 결장 샘플에서 RT- PCR 을 사용하는 IL-22 RNA의 조직 발현

염증성 장 질병 모델에서 마우스 IL-22 RNA (SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:11)의 상대적인 발현을 측정하기 위하여, DSS-처리된 마우스의 결장 말단부를 수집하여 액체 질소 중에 잠시 냉동시켰다. 이 실험에서 마우스들을 DSS로 처리하였고, 샘플은 처리 후 제2일, 7일, 10일에 얻었다. 정상적인 미처리 마우스로부터의 샘플도 마찬가지로 수집하였다. 그런 다음 RNA를 샘플로부터, 표준 RNeasy Midiprep^TM 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 제조업체의 지시대로 사용하여 분리하였다.

RT-PCR 반응은 'Superscript One-Step RT-PCR System with Platinum Taq' (Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 사용하였다. 각각의 25㎕ 반응액은 다음의 것들로 구성되었다: 12.5㎕의 2X 반응 완충액, 0.5㎕(20pmol/㎕)의 ZC39,289 (SEQ ID NO:17), 0.5㎕(20pmol/㎕)의 ZC39,290, 0.4㎕의 RT/Taq 중합효소 혼합물, 10㎕의 RNase-유리 물, 1.0㎕의 총 RNA (100ng/㎕). 증폭은 다음과 같이 수행하였다: 50°에서 30분 동안의 1주기에 이어 94°에서 30초 동안 35주기; 58°에서 30초 동안; 72°에서 6O초 동안; 그런 다음 72°에서 7분 동안 최종적으로 연장시킴으로써 종결한다. 8 내지 10㎕의 PCR 반응 생성물에 대해 2% 아가로스 겔을 사용하여 표준 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다. 정확하게 예상한 cDNA 단편의 크기는 다음과 같이 관찰되었다: 제2일에 두 샘플에서 희미한 밴드가 보였다. 제7일에는 3개의 샘플 중 2개에서 강력한 밴드가 나타난 반면, 세 번째 샘플은 제7일에 매우 강력한 밴드를 나타냈다. 제10일에는 세 개의 샘플이 강력한 밴드를 나타냈다. 결국, 2개의 '정상' 대조표준 샘플은 어떠한 밴드도 나타내지 않았다. 이들 결과는 IBD, UC, 및 CD와 관련된 것들을 포함하여, 어떤 유형의 결장의 염증성 반응에서는 IL-22가 상향조절될 수 있음을 시사한다. 데이터는 하기 표 7에 요약하며, 표에서 상대적 발현은 다음과 같이 기록하였다: 0=밴드가 나타나지 않음, 1=희미한 밴드, 2=강한 밴드, 3=매우 강한 밴드.

조직	상대적 발현 (0-3)
정상 결장	0
정상 결장	0
처리 후 제2일	1
처리 후 제2일	1
처리 후 제7일	3
처리 후 제7일	2
처리 후 제7일	2
처리 후 제10일	2
처리 후 제10일	2
처리 후 제10일	2

실시예 9

IL-22 RA2 는 마우스 콜라겐 유도된 관절염 (CIA) 모델에서 IL-6 및 SAA 수준을 감소시킨다.

A. 마우스 콜라겐 유도된 관절염 (CIA) 모델

생후 10주 된 수컷 DBA/1J 마우스 (Jackson Labs)들을 그룹당 13마리씩 3그룹으로 나누었다. 제21일에 마우스들에게 피하 주사로 완전 프로인트 보조액 (Chondrex사에 의해 제조, Redmond, WA)중에 1mg/ml로 제형된 병아리 타입 II 콜라겐을 50 내지 100㎕ 투여하고, 3주 후 제0일에 동결건조된 분취액 (Sigma, St. Louis, MO)으로부터 250㎍/ml로서 제조된, 대장균 0111:B4로부터의 100㎕ (25㎍)의 LPS 주사를 제공하였다. IL-22RA2를 복강내 주사로서 제0일로부터 제25일까지 4주 동안 일주일에 3회씩 투여하였다. 처음 두 그룹에게는 부형제 대조표준인 PBS (Life Technologies, Rockville, MD)를 투여하였다. 동물들은 LPS를 주사함에 따라 관절염의 증상들을 나타내기 시작했는데, 대부분의 동물이 2-3주 내에 염증을 나타냈다. 질병의 정도를 각각의 발에서, 발의 두께를 캘리퍼를 사용하여 측정하고, 각 발에 대한 임상적 스코어 (0-3)를 정함으로써 평가하였다: 0=정상, 0.5=발가락에 염증, 1=발에 약간의 염증, 2=발에 중간 정도의 염증, 3=발에 심각한 염증. 아래에서 상세하게 설명하기로 한다.

질병의 모니터링 :

동물들은 두 번째 콜라겐 주사 직후부터 발에 염증 신호를 나타내기 시작할 수 있고, 일부 동물은 두 번째 콜라겐 주사 전에도 발가락에 염증 신호를 나타내기 시작할 수 있다. 대부분의 동물은 추가 주사후 2-3주 이내에 관절염을 나타내지만 일부는 더 긴 시간을 필요로 할 수 있다. 이 모델에서 질병의 발생률은 전형적으로 95-100%이며, 전형적으로 0 내지 2마리의 비-반응 동물 (관찰을 시작하고 6주 후에 측정함)이 40마리의 동물을 사용하는 연구에서 나타날 수 있다. 염증이 시작될 때 미미한 정도의 가변적인 발 또는 발가락 염증의 통상적이고 일시적인 발생이 일어날 수 있음을 주지하여야 한다. 이런 이유로 동물은 현저하고 영구적인 발의 습진이 나타나기 전까지는 질병이 발생한 것으로 간주하지 않는다.

모든 동물을 매일 관찰하여 그들의 발의 질병 상태를 평가하였는데, 각 발에 대해 정성적인 임상적 스코어를 결정함으로써 평가를 수행하였다. 매일, 각 동물은 4개의 발에 대해 발의 임상적 질병 상태에 따라 스코어가 매겨졌다. 임상적 스코어를 측정하기 위하여 발을 3 영역, 즉 발가락, 발 자체 (manus 또는 pes), 및 발목 또는 복사뼈 관절로 나누어 생각할 수 있다. 이들 영역에 대한 염증의 정도 및 심각성을, 모든 발가락에 대하여 하나라도 보이는 관절 팽창, 찢어진 발톱, 또는 핏발에 대한 관찰, 어느 쪽 발이든지 습진 또는 핏발의 모든 증거의 표시, 및 힘줄 또는 뼈의 미세한 해부학적 경계가 하나라도 소실되었다는 표시, 및 발목 또는 복사뼈에 조금이라도 습진 또는 핏발을 나타내는 표시, 및 염증이 다리를 향해 확장되는 표시를 포함하여 주지하였다. 스코어 1, 2, 또는 3의 발은 처음에는 전체적인 심각도 인상을 토대로 하였고, 두 번째에는 얼마나 많은 지역이 포함되었는가를 토대로 하였다. 임상적 스코어링에 사용한 규모는 아래에 제시한다:

임상적 스코어:

0 = 정상

0.5 = 하나 또는 그 이상의 발가락이 포함되지만, 발가락만 염증이 있다.

1 = 발을 포함하여 경미한 염증이 있으며 발가락 또는 발가락들을 포함할 수 있다 (1 지역) .

2 = 발에 중간 정도의 염증이 있으며 몇 개의 발가락 및/또는 발목/복사뼈를 포함할 수 있다 (2 지역).

3 = 발, 발목/복사뼈, 및 일부 또는 전체 발가락에 심각한 염증이 있다 (3 지역).

질병의 수립은 밤새 지속되는 (연달아 이틀) 등급 2 이상의 발 염증의 정성적 스코어로서 규정된다. 일단 수립된 질병이 존재하면, 그 날을 기록하고, "질병이 수립된" 동물의 첫째 날로서 표시한다.

혈액을 전 실험과정을 통해 수집하여 항원-콜라겐 항체의 혈청 수준을 모니터하였다. 동물을 제21일에 마취하고, 혈액을 혈청 및 CBC에 대하여 수집하였다. 각 동물로부터, 발 하나는 10% NBF에 조직학을 위해 수집하고, 발 하나는 mRNA 분석을 위해 액체 질소 중에 냉동하여 -80℃에서 보관하였다. 또한 1/2 비장, 1/2 흉선, 1/2 장간막 림프절, 하나의 간엽 및 좌측 신장을 RNA 분석을 위해 RNAlater에 수집하였고, 1/2 비장, 1/2 흉선, 1/2 장간막 림프절, 및 나머지 간과 우측 신장을 조직학을 위해 10% NBF에 수집하였다. 혈액을 수집하여 면역글로불린과 사이토킨 분석을 위해 -80℃에서 냉동하였다.

발 스코어와 측정 데이터를 분석하였을 때 그룹들 사이에서 통계학적으로 유의할만한 차이는 발견되지 않았지만, IL-22RA2를 받은 한 처리 그룹이 발 염증의 개시 및 진전이 지연되었음을 시사하는 점이 있었다. 체중, CBC 매개변수, 또는 항-콜라겐 항체 수준의 변화에 대해 그룹 간에 유의할만한 차이는 없었다. 이들 초기 결과는 IL-22RA2가 체중, 적혈구 또는 백혈구, 또는 항체 생성에는 불리한 영향을 미치지 않지만, 염증을 유발할 수는 있음을 가리킨다. 투약, 작용 메커니즘, 및 효능에 대한 추가의 연구조사는 아래에서 설명된다 (예컨대 실시예 10).

B. 마우스 CIA 모델에서 항-콜라겐 ELISA 데이터

혈청 샘플을 콜라겐 유도된 관절염 (상기 실시예 9A)의 쥐 모델로부터 LPS 도전날 (제0일)에 비교하여 제0일, 7일, 14일, 21일 및 28일에 수집하였다. 혈청 샘플을 항-콜라겐 항체 역가에 대하여 ELISA에 의해 스크린하였다. PBS 대조표준과 비교하여 100㎍ 또는 10㎍ 처리 군에서의 항-콜라겐 항체 수준에 미치는 IL-22RA2 처리의 통계학적으로 유의할만한 효과는 없었다. 아래에 항-콜라겐 ELISA 방법 및 재료에 대해 설명한다.

항-콜라겐 ELISA에 대해 사용된 시약은 Maxisorp 96-웰 미소적정 플레이트 (NUNC, Rochester, NY), 병아리 타입-II 콜라겐 (Chondrex, Redmond, WA), Super Block (Pierce, Rockford, IL), 양고추냉이 과산화효소 (HRP)-포합된 염소 항-마우스 IgG+A+M (H+L)(Zymed, South San Francisco, CA) 및 o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드 기질 (Pierce, Rockford, IL)이다. 모든 분석에 사용한 완충액은 ELISA B 희석 완충액 (PBS+0.1% BSA+0.05% Tween (Sigma, St. Louis, MO)), ELISA C 세척 완충액 (PBS+0.05% Tween) 및 NovoD 전개 완충액 (0.063M 시트르산 나트륨, 0.037M 시트르산), H₂O₂ (Sigma) 및 1N H₂SO₄ (VWR, Tukwilla, WA)이다.

대략 100㎕의 말초 혈액을 안구-후방 출혈에 의하여 혈청 분리기 관 (Becton Dickinson)에 수집하였다. 혈청을 원심분리 (2-3분, 16,000×g, 4-6℃)에 의해 수집하고, -20℃에서 분석할 때까지 보관하였다. 항-콜라겐 Ig 항체 수준을 측정하기 위하여, NUNC 플레이트를 10㎍/ml의 병아리 타입-II 콜라겐 (Chondrex, Redmond WA)으로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 ELISA C로 세척하고, Super Block (Pierce, Rockford, IL)으로 차단한 후 (5분, 실온), ELISA C로 세척하였다. 희석된 혈청 샘플 (1:5000으로부터 1:625,000으로 ELISA B에 5배 희석함)을 ELISA 플레이트에 3개 한 벌로 첨가하고, 플레이트들을 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 ELISA C로 세척하고, 과산화효소-표지된 염소 항-마우스 Ig Fc (Zymed, ELISA B로 1:2000)를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 90분 동안 인큐베이션하고, 다시 ELISA C를 사용하여 씻은 다음, HRP 활성을 o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드 기질 (10mL의 NovoD+1 정제 OPD+10μL H₂O₂, Pierce)을 사용하여 전개하였다. 반응을 1N의 H₂SO₄를 사용하여 중단하였다. 1:25,000 희석률의 혈청 샘플의 상대적인 광학 밀도 측정치를 Spectra MAX 190 을 사용하여 490nm에서 취하고, 데이터를 SoftMax Pro 소프트웨어 (Molecular Devices Corporation, Palo Alto, CA)를 사용하여 분석하였다.

C. 마우스 CIA 모델에서 IL-6 및 SAA 분석

제0일에 혈청 샘플을 CIA 마우스 (상기 실시예 9A)로부터 25㎍의 LPS를 복강내로 투여하고 4시간 후에 수득하였다. 샘플을 IL-6 및 혈청 아밀로이드 A (SAA) 농도에 대하여 Biosource International (Camarillo, CA)사 제품인 시판되는 ELISA 키트에 의해 제조업자의 지시대로 스크린하였다.

IL-6 수준은 100㎍의 IL-22RA2, 10㎍의 IL-22RA2 및 PBS 대조표준을 받은 마우스 그룹에서 각각 9651+/-1563 pg/ml, 10,865+/-1478 pg/ml 및 15,006+/-2,099 pg/ml이었다. 100㎍ 용량의 IL-22RA2에 노출된 CIA 마우스 그룹에서 IL-6 농도는 PBS 대조 마우스와 비교할 때 상당히 더 낮아서, p=.0351이었다. 통계학적 유의성은 피셔의 PLSD를 사용하여 계산하였고, 유의성 수준은 5%였다 (ABACUS Concepts, INC, Berkeley, CA).

또한 SAA 농도는 100㎍의 IL-22RA2, 10㎍의 IL-22RA2 및 PBS 대조표준을 받은 마우스 그룹에서 각각 381+/-40㎍/ml, 348+/-37㎍/ml 및 490+/-50㎍/ml이었다. 10㎍ 용량의 IL-22RA2에 노출된 CIA 마우스 그룹에서 SAA 농도는 PBS 대조 마우스와 비교할 때 상당히 더 낮아서, p=.0257이었다. 통계학적 유의성은 피셔의 PLSD를 사용하여 계산하였고, 유의성 수준은 5%였다 (ABACUS Concepts, INC, Berkeley, CA).

실시예 10

항-IL-22RA mAb 또는 항-IL-22 mAb 는 마우스 CIA 모델에서 질병의 심각성을 억제한다.

콜라겐-유도된 관절염 (CIA) 모델은 사람에게서 볼 수 있는 질병을 크게 반영하는 류마티스성 관절염에 대한 마우스 모델이다 (Moore, Methods Mol . Biol . 225:175-179, 2003: Waksman, Scand . J. Immunol ., 56:12-34, 2002). 마우스들을 2 용량의 CFA에 유화된 콜라겐으로 꼬리 기부에 접종한다. 그 결과 시간이 지남에 따라 증가하고 육안으로 기록할 수 있으며 캘리퍼스를 이용해서도 측정할 수 있는 발의 팽창이 초래된다. 나아가 혈청 항-콜라겐 항체는 질병의 심각성과 상당히 상관관계가 있다. IL-20과 IL-22가 염증을 유도하는 것을 보여주는 데이터를 토대로 하여, 항-IL-22RA와 항-IL-22 mAb를 콜라겐-면역화된 마우스 그룹에 투여하고, 질병 스코어에 미치는 영향을 평가한다. 항-IL-22RA mAb 또는 항-IL-22 mAb의 투여 후에 발 스코어 및 발 두께의 감소는, IL-20과 IL-22가 자가면역 및 자가면역 장애를 억제할 수 있는 그것들의 기능의 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화에 대한 모델에서 면역 반응을 개시하는 것을 촉진한다는 것을 시사한다. 혈청 TNFa와 항-콜라겐항체의 억제는 또한 IL-22RA의 차단이 자가면역 질병에 유익할 수 있음을 시사한다.

그러므로 항-IL-22RA mAb 또는 항-IL-22 mAb가 자가면역에 영향을 미치는 지를 측정하기 위하여, 그것들을 류마티스성 관절염-콜라겐-유도된 관절염 (CIA)에 대한 마우스 모델에서 시험한다. 구체적으로, DBA1J 마우스들에게 류마티스-유사 관절염을 유도하기 위하여 콜라겐을 주사하였다. 제0일의 접종은 완전 프로인트 보조액 (CFA)과 타입 II 콜라겐 (50-100㎕, 2mg/ml 콜라겐으로 제조함)으로 구성된 균등물을 피하 주사하는 것이었다. 주사는 꼬리 기부 가까이에 놓는다. 제21일에, 두 번째 접종을 투여하는데, 첫 번째와의 차이는 단지 균등물을 CFA 대신에 불완전 프로인트 보조액 (IFA)을 사용하는 것이다. 발 스코어와 두께를 매일 측정한다. 마우스 그룹에 PBS, 20 내지 200㎍의 대조 아이소타입 매치된 단클론성 항체 또는 20 내지 200㎍의 항-IL-22RA mAb 또는 항-IL-22 mAb를 i.p로 주 2회 또는 3회로 두 번째 콜라겐 주사를 시작한 후 1 내지 4주 동안 투여한다. 마우스들을 30일 동안 매일 모니터한다. 마우스들을 제30일에 희생시키고, 혈청을 취하여 항-콜라겐 항체 분석과 혈청 사이토킨 분석 (TNF)을 한다.

발 스코어, 발 두께, 혈청 TNFa 및 혈청 항-콜라겐 항체의 항-IL-22RA 또는 항-IL-22 mAb의 투여에 의한 억제는 IL-22RA를 차단하는 것이 IL-22를 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화할 수 있으며, 자가면역에 대한 모델에서 면역 반응의 개시를 억제하고 자가면역 장애를 억제할 수 있음을 시사한다.

실시예 11

DSS 마우스 모델에서 IL-22 수용체, IL-22RA의 발현

DSS-유도된 IBD (실시예 8)를 보이는 마우스의 결장에서 마우스 IL-22RA의 발현 수준을 측정하기 위하여 정량적인 RT-PCR을 수행하였다. RNA를 정상 마우스 결장으로부터 및 DSS-처리된 마우스의 말단 결장으로부터 처리 후 제2일, 7일 및 10일에 분리하였다. RT-PCR을 Applied Biosystems 7700 TaqMan 기기 및 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 간단히 설명하자면, "프라이머 발현" 소프트웨어를 사용하여 마우스 IL-22RA 서열 (ZC39776 (SEQ ID NO:19) 및 ZC39777 (SEQ ID NO:20))에 대한 프라이머 및 FAM/TAMRA 표지된 TaqMan 프로브 (ZC38752 (SEQ ID NO:21))를 Applied Biosystems의 지침에 따라 디자인하였다. 25ng의 RNA를 PE/Applied Biosystems TaqMan EZ RT-PCR 코어 시약과 상기 언급된 프라이머 및 프로브와 함께 각 반응액에 첨가하였다. RT-PCR 반응을 다음 조건 하에서 이중으로 수행하였다: 50℃에서 2분, 60℃에서 30분, 95℃에서 5분, 94℃에서 20초를 40주기, 그리고 60℃에서 1분. 발현값을 합성 마우스 IL-22RA RNA 전사물의 공지수의 분자의 표준 곡선과 비교하고, 발현을 반응당 마우스 IL-22RA의 분자의 절대 수로서 기록한다. 예비 데이터는 마우스의 IL-22RA 발현이 정상적인 마우스 결장에서의 발현 수준과 비교할 때 DSS-유도된 IBD를 나타내는 제7일 및 제10일 마우스의 말단 결장에서 약간 하향-조절될 수 있음을 시사한다.

실시예 12

경미한 내독소증 모델에서 IL-22 및 전염증성 표시제: LPS -유도된 내독소증 마우스 모델

A. LPS -유도된 내독소증 마우스 모델: LPS -유도된 내독소증 마우스 모델에서 전염증성 사이토킨과 체온의 평가

경미한 내독소증의 마우스 LPS 모델에서 IL-22RA2의 효과 (IL-22RA2)를 조사하기 위해 생체 내 실험을 디자인하였다. 모델을 초기에 평가하기 위해서는 본 발명자들은 모델에 대한 참조 데이터를 수집하기 위하여 전염증성 사이토킨과 체온을 측정하였다.

간단하게 설명하자면, 생후 6개월 된 Balb/c (CRL) 암컷 마우스들을 멸균 PBS 중의 25㎍의 LPS (Sigma)로 복강내 (IP) 주사하였다. 혈청 샘플을 8마리 마우스의 그룹으로부터 0, 1, 4, 8, 16, 24, 48, 및 72시간에 각 시간 점마다 수집하였다. 혈청 샘플을 염증성 사이토킨 수준에 대하여 분석하였다. IL-1b, IL-6, TNFa, IL-10 및 혈청 아밀로이드 A 단백질 (SAA) 수준을 Biosource International (Camarillo, CA)사로부터 구입한 시판중인 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다.

TNFa 수준은 4000pg/ml에서 피크였고, IL-10 수준은 LPS 주사 후 1시간째에 341pg/ml이었다. LPS 주사 후 4시간째에 IL-6, IL-1b 및 IL-10은 각각 6,100pg/ml, 299pg/ml 및 229pg/ml이었다. 혈청의 SAA 수준은 LPS 주사 후 4시간째에 0.405mg/ml이었다. 혈청의 SAA 농도는 계속해서 LPS 주사 후 24시간에 3.9mg/ml로 증가하였지만, 혈청 중의 1 내지 2mg/ml보다 큰 SAA 수준은, SAA와 다른 혈청 성분들과의 상호작용 때문에 기존의 ELISA 키트로는 정확하게 또는 재생반복적으로 측정하기가 어렵다. 이들 결과는 IL-22 (실시예 11B)외에 전염증성 사이토킨들이 실제로 이 모델에서 생성되었음을 가리킨다. 그러므로 다음의 기준을 경미한 내독소증의 LPS 모델에 대한 생물학적 마커로서 수립하였다: LPS 주사 후 1시간째의 TNFa 혈청 수준, LPS 주사 후 4시간째의 IL-6 혈청 수준 및 LPS 주사 후 4시간 및 8시간째의 SAA 혈청 수준.

별도로 동물 그룹의 체온을 수술로 이식한 원격측정 장치에 의해 72시간의 실험 전 과정에 걸쳐 모니터하였다. 마우스들의 체온은 LPS를 주사하고 30분 후에 37.07℃에서 34.98℃로 최대 2℃ 떨어졌다.

LPS를 주사하기 30분 전에 100㎍의 IL-22RA2-Fc 융합 단백질을 주사하는 것은 4시간 및 8시간 점에서 SAA 유도를 약 50%나 크게 감소시킨 반면, 10㎍의 IL-22RA2-Fc는 유의할만한 효과를 나타내지 못하였다. TNF-알파나 IL-6 수준에는 유의할만한 변화가 없었다. IL-22RA2-Fc 주사는 1시간 점에서 순환중인 호중구 수를 감소시켰다. 그것은 IL-22RA2-Fc의 투여가 SAA 유도와 관련하여 IL-22 활성을 중화할 수 있음을 보여준다.

B. 알라마르 블루 증식 분석에서 BaF3 / CRF2 -4/IL-22RA 세포를 사용한 LPS -유도된 내독소증 마우스 모델로부터의 마우스 혈청 중의 IL-22 활성의 검출.

본원에서 설명된 BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포를 회전한 다음, PBS 2로 세척하여 mIL-3을 확실하게 제거한 후, 세 번째 회전한 후 mIL-3이 없는 완전 배지 (RPMI 1640, 10% FBS, 1% GlutaMAX, 1% 피루브산 나트륨)(이하 "mIL-3 유리 배지"로 언급함)에 재현탁하였다. 그런 다음 세포를 혈구 계산기로 계수하였다. 세포를 96-웰 포맷으로 웰당 5000세포로 mIL-3 유리 배지를 사용하여 웰당 100㎕의 부피로 플레이트하였다.

상기 실시예 11A에서 설명된 실험으로부터의 LPS-유도된 내독소증 마우스로부터 얻은 혈청을 플레이트의 상부 열에서 mIL-3 유리 배지로 2%로 희석한 후, 연속적으로 1:2로 희석하여 96-웰 플레이트상에 7열을 남기고, 이때 각 웰의 부피는 100㎕였다. 그런 다음 이것을 100㎕의 세포에, 최종 혈청 농도가 200㎕의 총 분석 부피에서 1%, 0.5%, 0.25%, 0.125%, 0.063%, 0.031%, 0.016%. 및 0.008%가 되도록 첨가하였다. 분석 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 4일 동안 인큐베이션하고, 그런 다음 알라마르 블루 (Accumed, Chicago, IL)를 20㎕/웰로 첨가하였다. 플레이트를 다시 37℃, 5% CO₂에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 알라마르 블루는 살아있는 세포수를 토대로 하여 형광 판독값을 제공하므로, 네거티브 대조표준에 비교하여 세포 증식에 대한 직접적인 척도가 된다. 플레이트를 Wallac Victor 2 1420 Multilabel 카운터 (Wallac, Turku, Finland)에서 530 파장 (여기) 및 590 파장 (방출)에서 판독하였다.

그 결과 0, 1, 8, 및 16시간 점에서는 바탕값 수준 이상의 유의할만한 증식이 나타나지 않았다. 4시간 점에서 취한 혈청 샘플은 바탕값보다 4배 이상에서 10배 더 큰 증식의 증가를 나타냈는데, 그것은 그 샘플에서 IL-22가 존재하는 것을 나타낸다.

C. LPS -유도된 내독소증 마우스 모델: IL-22 RA2 의 효과를 평가하기 위한 실험

IL-22RA2 처리가 마우스에서 단일 25 ㎍ LPS 용량의 IP 주사로 유도된 전염증성 표시제에 영향을 미치는 능력을 시험하였다. 모든 샘플을 SAA, IL-22 및 순환하는 호중구 수에 대하여 분석하였다. 각 그룹으로부터의 하위세트를 특정 사이토킨 수준에 대하여 분석하였다 (1시간 샘플을 TNF 알파에 대하여 스크린하였고, 4시간 샘플을 IL-6에 대해 분석하였다). 동물들을 하기 표 8에서 표시된 시간 점에서 희생시켜서 전혈과 혈청을 수집하여 분석을 위해 분취하였다.

72마리의 C57BL/6N 암컷 마우스들 (CRL)에게 단일 IP 용량의 IL-22RA2를 하기 표 8에서 설명한 바와 같이 제공하였다. 대조 마우스는 C57BL/6N (CRL)이었다.

30분 후에 그것들에게 다시 한 번 100㎕중의 25㎍의 LPS (Sigma)를 IP 주사하여 내독소증 캐스케이드를 개시하였다. 각 그룹의 마우스들을 하기 표 8에서 나타낸 바와 같이 상응하는 시간 점에서 희생시키고, 50㎕의 전혈을 수집하여 순환하는 호중구의 총 수를 측정하고, 나머지는 혈청을 위해 회전시킨 후 본원에서 설명되는 다양한 분석을 위해 분취하였다.

그룹	수	처리	LPS	희생	샘플
A	8	100㎍의 IL-22RA2 IP	tx후 30분 후 25㎍ IP	1시간	혈청 분취액CBC에 대한 혈액
B	8	10㎍의 IL-22RA2 IP	tx후 30분 후 25㎍ IP	1시간	혈청 분취액CBC에 대한 혈액
C	8	200㎕의 PBS IP	tx후 30분 후 25㎍ IP	1시간	혈청 분취액CBC에 대한 혈액
D	8	100㎍의 IL-22RA2 IP	tx후 30분 후 25㎍ IP	4시간	혈청 분취액CBC에 대한 혈액
E	8	10㎍의 IL-22RA2 IP	tx후 30분 후 25㎍ IP	4시간	혈청 분취액CBC에 대한 혈액
F	8	200㎕의 PBS IP	tx후 30분 후 25㎍ IP	4시간	혈청 분취액CBC에 대한 혈액
G	8	100㎍의 IL-22RA2 IP	tx후 30분 후 25㎍ IP	8시간	혈청 분취액CBC에 대한 혈액
H	8	10㎍의 IL-22RA2 IP	tx후 30분 후 25㎍ IP	8시간	혈청 분취액CBC에 대한 혈액
J	8	200㎕의 PBS IP	tx후 30분 후 25㎍ IP	8시간	혈청 분취액CBC에 대한 혈액
K	5	대조표준	없음	Pre LPS	혈청 분취액CBC에 대한 혈액

D. IL-22 RA2 - Fc4 는 생체 내에서 SAA 유도를 중화한다: LPS -유도된 내독소증 마우스 모델에서 LPS 에 의해 유도된 SAA 발현을 보이는 SAA ELISA는 IL-22 RA2 - Fc4 주입에 의해 억제된다.

IL-22RA2가 LPS-유도된 내독소증 마우스 모델에서 SAA 유도를 억제할 수 있을지를 평가하기 위하여, 마우스들에게 상기 실시예 11C의 표 8에서 나타낸 바와 같이 LPS 주사 전 30분 전에 IL-22RA2를 주사하였다.

4시간과 8시간 샘플의 SAA 수준을 측정하기 위하여 ELISA를 마우스 SAA 면역분석 키트 (Biosource International, California)를 제조업체의 지시대로 사용하여 수행하였다. 4시간 점에서 100㎍ 또는 10㎍의 IL-22RA2로 처리한 마우스들이 PBS 주사된 마우스들에 비교하여 SAA 수준이 용량-의존성으로, 통계학적으로 유의할 정도로 감소한 것으로 나타났다. 8시간 점에서는, 100㎍으로 처리한 마우스들이 계속해서 PBS 주사된 마우스들에 비교하여 SAA 수준이 통계학적으로 상당히 감소한 것으로 나타났다. 이것은 IL-22RA2의 존재가 생체 내에서 LPS에 의해 SAA의 유도를 억제할 수 있음을 가리킨다.

실시예 13

피부에 미치는 IL-22 폴리펩티드의 생체 내 효과

A. IL-22-유도된 흑색극세포증( acanthosis )

마우스들 (암컷, C3H/HEJ, 생후 8주; Jackson Labs, Bar Harbor, ME)을 6마리씩 3그룹으로 나누고 한 그룹은 4마리를 배정하였다. 사람 BHK-생성된 IL-22를 미니-삼투 펌프를 통하여 일정한 주입에 의해 투여하여, 펌프에 함유된 IL-22의 농도에 비례하는 국부적이고 꾸준한 상태의 혈청 농도를 만들었다. Alzet 미니-삼투 펌프 (모델 2002; Alza corporation Palo Alto, CA)를 멸균 조건하에서, 인산염 완충된 식염수 (pH 7.0)에 그룹 1에 대해서는 2mg/mL, 그룹 2에 대해서는 0.2mg/mL, 그룹 3에 대해서는 0.02mg/mL, 또는 그룹 4에 대해서는 0mg/mL (단지 희석만 함)의 펌프 내 농도로 희석된 IL-22 단백질 (A601F, 0.22mL)과 함께 로딩하였다. 펌프를 마우스의 등 피부를 1cm 절개하여 피하에 이식하고, 피부를 멸균된 상처 클로저로 닫았다. 이들 펌프는 14일의 기간 동안 0.5㎕/시간의 속도로 그 안의 내용물을 전달하기 위해 디자인한 것이다. 이런 공칭속도의 주입을 사용하여, 계산된 용량 수준은 1 내지 4그룹에 대하여 각각 24㎍/일, 2.4㎍/일, 0.24㎍/일, 및 0㎍/일이었다.

14일의 주기가 끝났을 때 마우스들을 안락사하고 펌프 영역을 둘러싸고 있는 대략 1cm²의 피부 샘플을 각 마우스로부터 수집하였다. 피부를 10% 중성 완충된 포르말린에 고정시켰다. 포르말린 고정된 피부 샘플을 파라핀에 넣고, 기본적으로 프로세스한 다음, 5um로 절개한 후, 헤마토크실린과 에오신으로 염색하였다. 조직을 ACVP 협회에서 인정한 수의 병리학자에 의해 맹검 방식으로 현미경으로 조사하였다. 조직학적 변화를 주지하였고, 흑색극세포증 (즉 표피의 두꺼워짐)의 심각성을 다음의 스코어링 시스템을 사용하여 주관적 방식으로 기록하였다: 0-정상, 1-최소 흑색극세포증, 2-경미한 흑색극세포증, 3-중간 흑색극세포증, 및 4-심각한 흑색극세포증. 또한 선택된 그룹의 피부를 CoolSnap 디지털 카메라 (Roper Scientific, Inc., San Diego, CA)를 사용하여 영상화하고 표피의 두께를 조직형태계측 소프트웨어 (Scion Image for Windows, v.4.02, Scion Corp., Frederick, MD)를 사용하여 측정하였다.

2.4 및 24㎍/일의 농도로 IL-22를 투여한 것은 대조 그룹 피부에서 관찰된 것보다 일관되게 더 큰 평균 흑색극세포증 스코어에 의해 알 수 있는 바와 같이 표피가 두꺼워지는 결과를 초래하였다. 더욱이 IL-22 처리 동물은 또한 표피에 단핵 세포 침윤이 있었다. 이 침윤물은 부형제로 처리된 대조표준에서는 관찰되지 않았다.

그룹별 표피 두께의 흑색극세포증 스코어와 피부 두께의 측정 (화소의 일반 단위로 표기)을 하기 표 9에 다음과 같이 나타낸다:

그룹 번호	수	펌프	평균 흑색극세포증	측정된 두께
1	6	24㎍의 IL-22/일	3.0	ND
2	6	2.4㎍의 IL-22/일	2.4	67.5
3	6	0.24㎍의 IL-22/일	2.2	ND
4	4	PBS 주입	1.8	45.6

B. IL-22-유도된 흑색극세포증에 미치는 IL-22 RA2 의 효과

마우스들 (암컷, C3H/HEJ, 생후 8주; Jackson Labs, Bar Harbor, ME)을 각각 8마리씩으로 8개의 그룹으로 나누었다. IL-22를 상기 실시예 12A에서 설명한 바와 같이, 미니-삼투 펌프를 통하여 일정하게 주입하는 방식으로 투여하였다. Alzet 미니-삼투 펌프 (모델 2001; Alza corporation Palo Alto, CA)를 멸군 조건하에서, 인산염 완충된 식염수 (pH 7.0)에 그룹 1-2 마우스들에 대해서는 0.22mg/mL, 그룹 3-4 마우스들에 대해서는 0.45mg/mL, 그룹 5-6 마우스들에 대해서는 0.9mg/mL, 또는 그룹 7-8 마우스들에 대해서는 0mg/mL (단지 희석만 함)의 펌프 내 농도로 희석된 IL-22 단백질 (A#601F, 0.22mL)과 함께 로딩하였다. 이들 펌프는 14일의 기간 동안 0.5㎕/시간의 속도로 그 안의 내용물을 전달하기 위해 디자인한 것이다. 이런 공칭속도의 주입을 사용하여, 계산된 용량 수준은 그룹 1-2에 대하여 10㎍/일, 그룹 3-4에 대하여 5㎍/일, 그룹 5-6에 대하여 2.5㎍/일, 그리고 그룹 7-8에 대하여 0㎍/일이었다. 각 그룹의 쌍에 대하여 IL-22의 주어진 용량 수준에서 한 그룹에는 복강내 경로에 의해 사람 IL-22RA2 Fc 단백질 (본원에서 설명됨) 0.1mg을 3회 (제1일, 3일, 및 5일) 주사하였다. 다른 그룹에게는 동일한 방식으로 부형제 (PBS)를 주사하였다.

연구의 8일째 되는 날, 마우스들을 안락사하고 펌프 영역을 둘러싸고 있는 대략 1cm²의 피부 샘플을 각 마우스로부터 수집하였다. 피부를 10% 중성 완충된 포르말린에 고정시켰다. 포르말린 고정된 피부 샘플을 파라핀에 넣고, 기본적으로 프로세스한 다음, 5um로 절개한 후, 헤마토크실린과 에오신으로 염색하였다. 조직을 ACVP 협회에서 인정한 수의 병리학자에 의해 맹검 방식으로 현미경으로 조사하였다. 이 연구는 앞의 실시예와는 다른 방식으로 스코어를 매겼다. 기저 층으로부터 과립구층까지 표피층의 수를 측정하였다. 그 결과를 토대로 절편을 다음과 같이 스코어링하였다: 0-정상 (2-3층), 1-경미한 두꺼워짐 (3-4층), 2-중간 두꺼워짐 (4-6층), 및 3-심각한 두꺼워짐 (>6층).

2.5, 5, 10㎍/일의 농도로 IL-22를 투여하는 것은 표피의 두꺼워짐을 초래하였다 (표 10 참조). 더욱이 IL-22 처리된 동물들은 표피에 단핵 세포 침윤이 있었다. 이들 침윤물은 부형제로 처리된 대조표준에서는 관찰되지 않았다. 100㎍의 IL-22RA2를 부수적으로 투여했을 때 (3회 주사) 5㎍의 IL-22/일로 처리한 마우스에서 표피 두꺼워짐의 정도가 감소하였다.

그룹별 표피 두께의 흑색극세포증 스코어를 다음과 같이 표 10에 표시한다.

그룹 번호	수	펌프	주입	평균 흑색극세포증
1	8	2.5㎍의 IL-22/일	100㎕의 부형제(3회 주사)	1.1
2	8	2.5㎍의 IL-22/일	100㎍의 IL-22RA2 (3회 주사)	0.8
3	8	5㎍의 IL-22/일	100㎕의 부형제(3회 주사)	2.0
4	8	5㎍의 IL-22/일	100㎍의 IL-22RA2 (3회 주사)	0.6
5	8	10㎍의 IL-22/일	100㎕의 부형제(3회 주사)	2.0
6	8	10㎍의 IL-22/일	100㎍의 IL-22RA2 (3회 주사)	1.9
7	8	부형제	100㎕의 부형제(3회 주사)	0.0
8	8	부형제	100㎍의 IL-22RA2 (3회 주사)	0.0

표피 두꺼워짐과 면역 침윤물을 또한 사람 건선 피부에서 관찰하였다. IL-22 피하 주사에서 관찰된 피부 표현형은 추가로 건선의 발병학에서 IL-22의 중요한 역할을 가리켰다. IL-22RA2-Fc가 IL-22 유도된 피부 표현형을 중화할 수 있다는 사실은 항-IL-22 중화 항체 또는 가용성 수용체와 같은 다른 IL-22 길항체를 건선 및 다른 IL-22 유도된 염증성 질병의 치료를 위해 사용할 수 있는 가능성을 시사한다.

C. IL-22 유도된 또는 IL-20-유도된 흑색극세포증에 미치는 IL-22RA 가용성 수용체, 및 항-IL-22RA 항체의 영향

IL-22 또는 IL-20의 생체 내 활성을 억제하는 IL-22RA 가용성 수용체, 또는 IL-22RA에 대한 항체의 활성을 유사한 방식으로, IL-22 또는 IL-20 단백질의 피하 주입에 의해 유발된 조직학적 종점을 사용하여 평가한다. 이 모델의 실례에서 C3H/HEJ 마우스들에게 상기 실시예 12(A) 및 12(B)에서 설명한 것과 같은 피하 미니-삼투 펌프를 이식한다. IL-22 또는 IL-20에 노출되는 기간 동안 마우스들을 IL-22에 대한 정제된 단클론성 항체를 주사함으로써 또는 대조표준으로서 부형제를 유사하게 주사함으로써 처리한다. IL-22 주입이 끝났을 때 피부를 펌프 영역으로부터 조직학적 분석을 위해 표본화한다. IL-22RA2 가용성 수용체 IL-22 길항체와 유사하게, 본 발명의 IL-22 또는 IL-20 길항체 IL-22RA 가용성 수용체, 또는 항-IL-22RA 항체는 IL-22 또는 IL-20에 의해 유발되는 표피 두꺼워짐과 면역 세포 침윤의 감소를 보일 것으로 예상되고, 따라서 건선 및 다른 IL-22 또는 IL-20 유도된 염증성 질병에 대한 치료제로서 IL-22 또는 IL-20 길항체로서 유용할 것이다.

실시예 14

IL-22는 사람 건선 피부 샘플에서 상향조절된다

A. RNA 샘플:

건선 환자로부터의 피부뿐만 아니라 정상 피부 샘플을 얻었다. 건선 환자로부터의 샘플은 안정한 플라크-형 건선으로부터의 피부와 인접한 미포함 피부로부터의 샘플을 포함한다. RNA를 사람 피부 샘플로부터 종래 방법을 사용하여 분리하였다. RNA 샘플의 보전성 및 품질을 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Waldbronn Germany)상에서 시험하였다.

B. 정량적인 RT- PCR 을 위한 프라이머 및 프로브

ABI PRISM 7700 서열 검출 시스템 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)을 사용하는 실시간 정량 RT-PCR은 이미 설명되어 있다 (Heid, C.A. et al., Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson, U.E.M. et al., Genome Research 6:995-1001, 1996; Sundaresan, S. et al., Endocrinology 139:4756-4764, 1998). 이 방법은 리포터와 진정제(quencher) 형광 염료 둘 다를 함유하는 유전자 특이적 프로브의 사용을 포함한다. 프로브가 무상일 때 리포터 염료 방출은 진정제 염료의 밀접한 근접성 때문에 무효로 된다. 추가의 유전자-특이적 전방 및 역 프라이머를 사용하는 PCR 연장 동안에, 프로브는 rTth DNA 중합효소의 5'에서 3' 방향 뉴클레오티드 분해 활성에 의해 절단되어 프로브로부터 리포터 염료가 방출됨으로써 결과적으로 형광 방출의 증가가 초래된다.

IL-22 발현의 실시간 정량 RT-PCR 분석에 사용된 프라이머와 프로브는 프라이머 디자인 소프트웨어 Primer Express^TM (PE Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 디자인하였다. 사람 IL-22에 대한 프라이머는 게놈 DNA의 증폭을 제거하기 위하여 인트론-엑손 접합부를 이어주도록 디자인하였다. 전방 프라이머, ZC42459 (SEQ ID NO:22)와 역 프라이머, ZC42458 (SEQ ID NO:23)을 800nM 농도에서 PCR 반응 (하기)에서 사용하여 72bp의 생성물을 합성하였다. 상응하는 IL-22 프로브, ZC42460 (SEQ ID NO:24)을 합성하고, ZymoGenetics에서 하우스에서 표지하였다. IL-22 프로브를 5' 단부에서 리포터 형광 염료 (6-카르복시-플루오레신)(FAM)(PE Applied Biosystems)로 표지하고, 3' 단부에서 진정제 형광 염료 (6-카르복시-테트라메틸-로다민)(TAMRA)(PE Applied Biosystems)로 표지하였다.

C. 실시간 정량 RT- PCR

IL-22 mRNA의 상대적인 수준을 TaqMan EZ RT-PCR 코어 시약 키트 (PE Applied Biosystems)를 사용하여 총 RNA 샘플을 분석함으로써 측정하였다. 런오프(runoff) IL-22 전사물을 제조하여 정량에 사용된 표준 곡선을 제작하였다. 곡선은 IL-22에 대한 전체 메시지 중 약 1e8부터 1e3의 총 복사물 범위의 10배 연속적인 희석으로 구성되며, 각 표준 곡선 점은 3개 한 벌로 분석된다. 피부로부터의 총 RNA 샘플을 또한 사람 IL-22 전사물 수준에 대하여 및 내인성 대조표준으로서 hGUS의 수준에 대하여 3개 한 벌로 분석하였다. 총 부피 25㎕에서, 각각의 RNA 샘플에 대하여 다음과 같은 것들을 함유하는 TaqMan EZ RT-PCR 반응 (PE Applied Biosystems)을 수행하였다: DEPC 처리된 물 (Dnase/Rnase 없음)중의 대략 25ng의 총 RNA; 적절한 프라이머 (대략 800nM의 ZC42459 (SEQ ID NO:22)와 ZC42458 (SEQ ID NO:23)); 적절한 프로브 (대략 100nM의 ZC42460 (SEQ ID NO:24)); 1X TaqMan EZ 완충액; 3mM의 아세트산 망간; 300μM의 각각의 d-CTP, d-ATP, d-GTP 및 600μM의 d-UTP, rTth DNA 중합효소 (0.1U/㎕); 및 AmpErase UNG (0.01 U/㎕). PCR 열 순환 조건은 다음과 같았다: 50℃에서 2분 동안의 한 주기의 초기 UNG 처리 단계; 이어서 60℃에서 30분 동안의 한 주기의 역 전사 단계(RT); 95℃에서 5분 동안의 한 주기의 UNG의 비활성화 단계; 94℃에서 20초 동안 및 60℃에서 1분 동안의 증폭의 40주기.

상대적인 IL-22 RNA 수준을 제조업체인 PE Biosystems에 의해 설명된 것과 같이 표준 곡선 방법을 사용함으로써 측정하였다 (User Bulletin #2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Relative Quantitation of Gene Expression, Secember 11, 1997). hGUS 측정을 사용하여 IL-22 수준을 기준화하였다. 그 데이터를 하기 표 11에 나타낸다.

피부 샘플	IL-22
정상	0
미포함	0
포함	1149

IL-22 mRNA는 정상 환자 또는 미포함 영역으로부터의 피부 샘플에서는 검출할 수 없었다. 대조적으로 건선 환자로부터의 포함된 피부에서는 IL-22 메시지에 대한 극적인 상향 조절이 있었다. 이들 데이터는 사람 건선에 대한 IL-22의 강력한 질병 관련을 지지한다.

IL-22의 과잉발현을 사람 건선 병변에서 볼 수 있었는데, 그것은 IL-22가 사람 건선에 포함되었음을 시사한다. 더욱이 본원에서 설명되는 바와 같이, 유전자도입 마우스에서 IL-22의 과잉 발현은 건선 표현형을 나타내는 표피 두꺼워짐과 면역 세포 포함을 나타냈으며, IL-22의 정상 마우스로의 추가 주입은 가용성 수용체 길항체 IL-22RA2에 의해 제거된 건선 표현형을 나타내는 표피 두꺼워짐과 면역 세포 포함을 나타냈다. 그러한 생체 내 데이터는 추가로 전-염증성 IL-22가 건선에 포함된다는 것을 시사한다. IL-22 활성에 대한 길항체, 예컨대 본 발명의 항-사람-IL-22 단클론성 항체, 및 그것에 대한 가용성 수용체 및 항체는 그 자체로서 염증성 질병의 치료적 치료제로서, 특히 건선의 치료에서 IL-22의 길항체로서 유용하다. 더욱이 IL-22 활성에 대한 길항체, 예컨대 본 발명의 항-사람-IL-22 단클론성 항체, 및 그것에 대한 가용성 수용체 및 항체는 다른 염증성 질병의 치료적 치료제로서, 예컨대 아토피성 피부염, IBD, 대장염, 내독소증, 관절염, 류마티스성 관절염, 및 건선성 관절염, 성인 호흡기 질병 (ARD), 패혈성 쇼크, 다중 기관 질환, 염증성 폐 손상, 예컨대 천식 또는 기관지염, 박테리아성 폐렴, 건선, 습진, 아토피성 및 접촉성 피부염, 및 염증성 장 질병, 예컨대 궤양성 대장염 및 크론병의 치료에서 IL-22에 대한 길항체로서 유용하다.

실시예 15

IL-22는 사람 아토피성 피부염 피부 샘플에서 상향조절된다

아토피성 피부염 환자 (n=4)로부터의 피부뿐만 아니라 정상 피부 샘플 (n=4)을 얻었다. RNA를 종래 방법을 사용하여 사람 피부 샘플로부터 분리하였다. RNA 샘플의 보전성 및 품질을 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Waldbronn Germany)상에서 시험하였다.

정량적인 RT- PCR 을 위한 프라이머 및 프로브

ABI PRISM 7700 서열 검출 시스템 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)을 사용하는 실시간 정량 RT-PCR은 이미 설명되어 있다 (Heid, C.A. et al., Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson, U.E.M. et al., Genome Research 6:995-1001, 1996; Sundaresan, S. et al., Endocrinology 139:4756-4764, 1998). 이 방법은 리포터와 진정제 형광 염료 둘 다를 함유하는 유전자 특이적 프로브의 사용을 포함한다. 프로브가 무상일 때 리포터 염료 방출은 진정제 염료의 밀접한 근접성 때문에 무효로 된다. 추가의 유전자-특이적 전방 및 역 프라이머를 사용하는 PCR 연장 동안에, 프로브는 rTth DNA 중합효소의 5'에서 3' 방향 뉴클레오티드 분해 활성에 의해 절단되어 프로브로부터 리포터 염료가 방출됨으로써 결과적으로 형광 방출의 증가가 초래된다.

IL-22 발현의 실시간 정량 RT-PCR 분석에 사용된 프라이머와 프로브는 프라이머 디자인 소프트웨어 Primer Express^TM (PE Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 디자인하였다. 사람 IL-22에 대한 프라이머는 게놈 DNA의 증폭을 제거하기 위하여 인트론-엑손 접합부를 이어주도록 디자인하였다. 전방 프라이머, ZC42459 (SEQ ID NO:22)와 역 프라이머, ZC42458 (SEQ ID NO:23)을 800nM 농도에서 PCR 반응 (하기)에서 사용하여 72bp의 생성물을 합성하였다. 상응하는 IL-22 프로브, ZC42460 (SEQ ID NO:24)을 합성하고, ZymoGenetics에서 하우스에서 표지하였다. IL-22 프로브를 5' 단부에서 리포터 형광 염료 (6-카르복시-플루오레신)(FAM)(PE Applied Biosystems)로 표지하고, 3' 단부에서 진정제 형광 염료 (6-카르복시-테트라메틸-로다민)(TAMRA)(PE Applied Biosystems)로 표지하였다.

C. 실시간 정량 RT- PCR

IL-22 mRNA의 상대적인 수준을 TaqMan EZ RT-PCR 코어 시약 키트 (PE Applied Biosystems)를 사용하여 총 RNA 샘플을 분석함으로써 측정하였다. 런오프 IL-22 전사물을 제조하여 정량에 사용된 표준 곡선을 제작하였다. 곡선은 IL-22에 대한 전체 메시지 중 약 1e8부터 1e3의 총 복사물 범위의 10배 연속적인 희석으로 구성되며, 각 표준 곡선 점은 3개 한 벌로 분석된다. 피부로부터의 총 RNA 샘플을 또한 사람 IL-22 전사물 수준에 대하여 및 내인성 대조표준으로서 hGUS의 수준에 대하여 3개 한 벌로 분석하였다. 총 부피 25㎕에서, 각각의 RNA 샘플에 대하여 다음과 같은 것들을 함유하는 TaqMan EZ RT-PCR 반응 (PE Applied Biosystems)을 수행하였다: DEPC 처리된 물 (Dnase/Rnase 없음)중의 대략 25ng의 총 RNA; 적절한 프라이머 (대략 800nM의 ZC42459 (SEQ ID NO:22)와 ZC42458 (SEQ ID NO:23)); 적절한 프로브 (대략 100nM의 ZC42460 (SEQ ID NO:24)); 1X TaqMan EZ 완충액; 3mM의 아세트산 망간; 300μM의 각각의 d-CTP, d-ATP, d-GTP 및 600μM의 d-UTP, rTth DNA 중합효소 (0.1U/㎕); 및 AmpErase UNG (0.01 U/㎕). PCR 열 순환 조건은 다음과 같았다: 50℃에서 2분 동안의 한 주기의 초기 UNG 처리 단계; 이어서 60℃에서 30분 동안의 한 주기의 역 전사 단계(RT); 95℃에서 5분 동안의 한 주기의 UNG의 비활성화 단계; 94℃에서 20초 동안 및 60℃에서 1분 동안의 증폭의 40주기.

상대적인 IL-22 RNA 수준을 제조업체인 PE Biosystems에 의해 설명된 것과 같이 표준 곡선 방법을 사용함으로써 측정하였다 (User Bulletin #2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Relative Quantitation of Gene Expression, Secember 11, 1997). hGUS 측정을 사용하여 IL-22 수준을 기준화하였다.

IL-22 mRNA는 정상 환자 또는 미포함 영역으로부터의 피부 샘플에서는 검출할 수 없었다. 대조적으로 아토피성 피부염 환자로부터의 4개의 피부 샘플 중 3개에서 IL-22 메시지에 대한 극적인 상향 조절이 있었다 (약 400 내지 2300 복사물). 이들 데이터는 사람 아토피성 피부염에 대한 IL-22의 강력한 질병 관련을 지지한다.

IL-22의 과잉발현을 사람 아토피성 피부염 피부에서 볼 수 있었는데, 그것은 IL-22가 사람 아토피성 피부염에 포함되었음을 시사한다. 더욱이 본원에서 설명되는 바와 같이, 유전자도입 마우스에서 IL-22의 과잉 발현은 아토피성 피부염 표현형을 나타내는 표피 두꺼워짐과 면역 세포 포함을 나타냈으며, 정상 마우스에 IL-22의 추가 주입은 가용성 수용체 길항체 IL-22RA2에 의해 제거된 아토피성 피부염 표현형을 나타내는 표피 두꺼워짐과 면역 세포 포함을 나타냈다. 그러한 생체 내 데이터는 추가로 전-염증성 IL-22가 아토피성 피부염에 포함된다는 것을 시사한다. IL-22 활성에 대한 길항체, 예컨대 본 발명의 항-사람-IL-22 단클론성 항체, 및 그것에 대한 가용성 수용체 및 항체는 그 자체로서 염증성 질병의 치료적 치료제로서, 특히 아토피성 피부염의 치료에서 IL-22의 길항체로서 유용하다. 더욱이 IL-22 활성에 대한 길항체, 예컨대 본 발명의 항-사람-IL-22 단클론성 항체, 및 그것에 대한 가용성 수용체 및 항체는 다른 염증성 질병의 치료적 치료제로서, 예컨대 아토피성 피부염, IBD, 대장염, 내독소증, 관절염, 류마티스성 관절염, 및 건선성 관절염, 성인 호흡기 질병 (ARD), 패혈성 쇼크, 다중 기관 질환, 염증성 폐 손상, 예컨대 천식 또는 기관지염, 박테리아성 폐렴, 아토피성 피부염, 습진, 아토피성 및 접촉성 피부염, 및 염증성 장 질병, 예컨대 궤양성 대장염 및 크론병의 치료에서 IL-22에 대한 길항체로서 유용하다.

실시예 16

사람 IL-22 다클론성 항체

항 IL-22 다클론성 항체를, 2마리의 암컷 뉴질랜드 백색 토끼를, BHK 세포 (IL-22-BHK)로부터 제조된 정제된 성숙한 재조합 사람 IL-22 폴리펩티드 (SEQ ID NO:6의 아미노산 잔기 22 (Ala)부터 167 (Ile)까지)로 면역시킴으로써 제조하였다. 각각의 토끼에게 초기에는 완전 프로인트 보조액 중의 정제된 단백질 200㎍을 복강내 (ip) 주사한 후, 불완전 프로인트 보조액 중의 100㎍의 펩티드를 추가로 매 3주마다 IP 주사하였다. 두 번째 추가 면역 주사를 투여한 후 (총 3회 주사) 7일 내지 10일이 경과한 후에 동물들을 출혈시켜서 혈청을 수집하였다. 그런 다음 동물을 추가 면역시키고 매 3주마다 출혈시켰다.

사람 IL-22-특이적 다클론성 항체를 면역 토끼 혈청으로부터, CNBr-SEPHAROSE의 그램당 10mg의 특이성 항원 정제된 재조합 단백질 사람 IL-22-BHK를 사용하여 제조한 후 PBS로 밤새 20X 투석함으로써 제조한 CNBr-SEPHAROSE 4B 단백질 칼럼 (Pharmacia LKB)을 사용하여 친화성 정제하였다. 사람 IL-22-특이적 항체는 항체 표적으로서 500ng/ml의 정제된 재조합 단백질 사람 IL-22-BHK를 사용하는 ELISA에 의해 특성을 확인하였다. 토끼 항-사람 IL-22 친화성 정제된 항체의 검출 하한선 (LLD)은 그것의 특이성 정제된 재조합 항원 사람 IL-22-BHK에 대해 280pg/ml이다.

사람 IL-22-특이적 다클론성 항체를 추가로 그것들의 BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포 (실시예 2 및 실시예 3)상에서 정제된 재조합 사람 IL-22-BHK의 세포-증식 활성을 차단하는 능력 ("중화 분석")에 대해 특성을 확인하였다. 50배 몰 과잉의 사람 IL-22-특이적 다클론성 항체는 세포 증식을 억제하기에 충분하였다.

실시예 17

항-사람 IL-22 단클론성 항체

단클론성 항체를, 4마리의 암컷 Sprague-Dawley 쥐 (Charles River Laboratories, Wilmington, MA)를, BHK 세포 (IL-22-BHK)로부터 제조된 정제된 성숙한 재조합 사람 IL-22 폴리펩티드 (SEQ ID NO:6의 아미노산 잔기 22 (Ala)부터 167 (Ile)까지)로 면역시킴으로써 제조하였다. 각각의 쥐에게 초기에는 완전 프로인트 보조액 중의 정제된 사람 재조합 IL-22 단백질 100㎍을 복강내 (IP) 주사한 후, 불완전 프로인트 보조액 중의 50㎍의 정제된 재조합 단백질을 추가로 매 2주마다 IP 주사하였다. 세 번째 추가 면역 주사를 투여한 후 7일 내지 10일이 경과한 후에 동물들을 출혈시켜서 혈청을 수집하였다.

사람 IL-22-특이적 쥐 혈청 샘플을 500ng/ml의 비오티닐화된 사람 IL-22-BHK 및 500ng/ml의 비오티닐화된 마우스 IL-22, 비오티닐화된 muIL-22-대장균 (R+D Systems, Minneapolis, MN) 항체 표적을 사용하여 ELISA에 의해 특성을 확인하였다. 3개의 쥐 혈청 샘플은 1:1E5의 희석에서 특이적 항체 표적 비오티닐화된 사람 IL-22-BHK에 대한 역가를 나타냈고, 1:1E4의 희석에서 특이적 항체 표적 비오티닐화된 muIL-22-대장균에 대한 역가를 나타냈다.

비장 세포와 림프절 세포를 2마리의 고-역가 쥐로부터 수득하여서 2개의 별도의 융합 과정으로 PEG 1500을 사용하여 SP2/0 (마우스) 골수종 세포에 융합하였다 (4:1 융합 비율, 비장 세포 대 골수종 세포, "Antibodies A Laboratory Manual, E. Harlow and D.Lane, Cold Spring Harbor Press). 융합 후 10일 동안 성장시킨 후에, 특이한 항체-생성 하이브리도마 풀을 ELISA에 의해, 비오티닐화된 재조합 단백질 사람 IL-22-BHK와 비오티닐화된 재조합 단백질 muIL-22-대장균을 별도의 항체 표적으로서 사용하여 확인하였다. 두 개의 ELISA 프로토콜에서 포지티브인 하이브리도마 풀을 추가로 그것들의 BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포 (실시예 2 및 실시예 3)상에서 정제된 재조합 muIL-22-대장균의 세포-증식 활성을 차단하는 능력 ("중화 분석")에 대해 분석하였다.

ELISA만에 의해 또는 ELISA와 "중화 분석"에 의해 포지티브 결과를 산출하는 하이브리도마 풀을 제한 희석에 의해 최소한 2회 클론 하였다.

조직 배양 배지로부터 정제된 단클론성 항체를, 마우스 및 사람 혈청 샘플에서 재조합 및 천연 사람 IL-22의 정량 측정에 대한 ELISA에서의 활용성에 대해 확인하였다. 선택된 2개의 항체는 정량 분석에서 100% 사람 혈청에서 대략 1ng/ml의 재조합 huIL-22-대장균의 검출 하한선을 나타냈다. 조직 배양 배지로부터 정제된 단클론성 항체를 BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포 (실시예 2 및 실시예 3)상에서 정제된 재조합 huIL-22-대장균 또는 muIL-22-대장균의 세포-증식 활성을 차단 또는 감소시키는 능력 ("중화 분석")에 대해 확인하였다. 6개의 "중화" 단클론성 항체를 이 방법으로 확인하였다. 상기에서 설명된 사람 IL-22에 대한 중화 단클론성 항체를 발현하는 하이브리도마를 부다페스트 조약 하에 원래의 기탁물로서 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션 (ATCC; Manassas VA) 특허 기탁기관에 기탁하였고, 다음의 ATCC 승인번호를 부여받았다: 클론 266.16.1.4.4.1 (ATCC 특허 기탁 표시 PTA-5035); 클론 266.5.1.2.2.3 (ATCC 특허 기탁 표시 PTA-5033); 클론 267.17.1.1.4.1 (ATCC 특허 기탁 표시 PTA-5038); 클론 267.4.1.1.4.1 (ATCC 특허 기탁 표시 PTA-5037); 클론 266.12.6.1.3.2.1 (ATCC 특허 기탁 표시 PTA-5034); 클론 266.19.1.10.5.2 (ATCC 특허 기탁 표시 PTA-5036); 및 클론 267.9.1.1.4.1 (ATCC 특허 기탁 표시 PTA-5353).

실시예 18

항-IL-22RA 단클론성 항체

단클론성 항체를, 4마리의 루이스 쥐 (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA)를 절단되고 정제된 재조합 융합 단백질, muIL-22RA-Fc (SEQ ID NO:4)로 면역시킴으로써 제조하였다. 각각의 쥐에게 초기에는 완전 프로인트 보조액 (Pierce, Rockford, IL)중의 정제된 재조합 융합 단백질 100㎍을 복강내 (IP) 주사한 후, 불완전 프로인트 보조액 중의 50㎍의 정제된 재조합 단백질을 추가로 매 2주마다 4주 동안 IP 주사하였다. 첫 번째 4주가 지난 후, 불완전 프로인트 보조액 중의 담체 단백질 키호울 림펫 헤모시아닌 (KLH, Pierce, Rockford, IL)에 결합된 절단된 정제 재조합 단백질 50㎍을 추가로 매 2주마다 4주 동안 IP 주사하였다. 네 번째 추가 면역 후 7일 내지 10일이 경과한 후에 동물들을 출혈시켜서 혈청을 수집하였다.

muIL-22RA-특이적 쥐 혈청 샘플을 ELISA에 의하여, 특이한 항체 표적으로서 500ng/ml의 정제된 재조합 융합 단백질 muIL-22RA-Fc와 비-특이적 항체 표적으로서 관련이 없는 융합 단백질을 사용하여 확인하였다.

비장 세포를 한 마리의 고-역가 쥐로부터 수득하여 최적화된 PEG-중재된 융합 프로토콜 (Rockland Immunochemicals)로 SP2/0 (마우스) 골수종 세포에 융합시켰다. 융합 후 12일 동안 성장시킨 후, 특이한 항체-생성 하이브리도마 풀을, 특이적 항체 표적으로서 500ng/ml의 각각의 정제된 재조합 융합 단백질 muIL-22RA-Fc-Bv와 비-특이적 항체 표적으로서 관련이 없는 융합 단백질을 사용하는 ELISA에 의하여 확인하였다. 특이한 항체 표적에 대해서만 포지티브인 하이브리도마 풀을 추가로 그것들의 BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포 (실시예 2 및 실시예 3)상에서 정제된 재조합 muIL-22-대장균의 세포-증식 활성을 차단 또는 감소하는 능력 ("중화 분석") 및 항체 표적으로서 BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포 (실시예 2 및 실시예 3)에 FACS 분석을 경유하여 결합하는 능력에 대해 분석하였다.

ELISA 분석에서 특이한 포지티브 결과를 산출하고 FACS 또는 "중화 분석" 중 어느 하나에서 포지티브 결과를 산출하는 하이브리도마 풀을 제한 희석에 의해 최소한 2회 클론 하였다.

조직 배양 배지 중의 단클론성 항체를, 정제된 재조합 단백질 muIL-22-대장균 또는 huIL-22-BHK의 존재하에 성장된, BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포 (실시예 2 및 실시예 3)의 증식을 차단 또는 감소시키는 능력에 대해 확인하였다. 14개의 "중화" 단클론성 항체를 확인하였고, 그 중에서 9개의 단클론성 항체를 클론하였다.

상기에서 설명된 마우스 IL-22RA에 대한 중화 단클론성 항체를 발현하는 하이브리도마를 부다페스트 조약 하에 원래의 기탁물로서 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션 (ATCC; Manassas VA) 특허 기탁기관에 기탁하였고, 다음의 ATCC 승인번호를 부여받았다: 클론 R2.1.1G11.1 (ATCC 특허 기탁 표시 PTA-6035); 클론 R2.1.5F4.1 (ATCC 특허 기탁 표시 PTA-6024); 클론 R2.1.5H8.1 (ATCC 특허 기탁 표시 PTA-6025); 클론 R2.1.12G7.1 (ATCC 특허 기탁 표시 PTA-6036); 클론 R2.1.13C8.1 (ATCC 특허 기탁 표시 PTA-6037); 클론 R2.1.15E2.1 (ATCC 특허 기탁 표시 PTA-6038); 클론 R2.1.16C11.1 (ATCC 특허 기탁 표시 PTA-6039); 클론 R2.1.18C8.1 (ATCC 특허 기탁 표시 PTA-6040); 및 클론 R2.1.21G8.2 (ATCC 특허 기탁 표시 PTA-6111).

사람 IL-22RA에 대한 중화 단클론성 항체를 발현하는 하이브리도마를 부다페스트 조약 하에 원래의 기탁물로서 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션 (ATCC; Manassas VA) 특허 기탁기관에 기탁하였고, 다음의 ATCC 승인번호를 부여받았다: 280. 46.3.4 (ATCC 특허 기탁 표시 PTA-6284); 클론 281.73.49.1.1 (ATCC 특허 기탁 표시 PTA-6285); 클론 283.4.1.2 (ATCC 특허 기탁 표시 PTA-6287); 클론 283.52.5.4 (ATCC 특허 기탁 표시 PTA-6311); 및 클론 283.108.2.3 (ATCC 특허 기탁 표시 PTA-6286).

실시예 19

두 개의 쥐-항-Ms-IL-22RA MAb 의 결합 친화력

염소-항-쥐 IgG-Fc 감마 특이적 항체 (Jackson)를 CM5 Biacore 칩상에 고정시켰다. 각 mAb를 항-쥐 캡처 표면에 결합하기 위하여 분석을 최적화한 후, IL-22RA의 농도 연속물을 mAb를 가로질러 주사함으로써 결합 (Ka) 및 분해 (Kd)를 관찰하였다. 예비 시험 후에, 융합 단백질과 칩상의 캡처 표면 사이에서 비-특이적 결합을 관찰하였다. 트롬빈에 의해 절단된 Fc4를 가지고 있는 IL-22RA의 바이알을 얻었고, 계속해서 바탕값 효과가 없음을 보기 위하여 시험하였다. 각각의 작동 후에 표면을 다시 항-쥐 항체에 대해 재생하고, 20mM의 HCl을 2회 주입하였다. 데이터를 각 MAb에 대해 얻고, 평가 소프트웨어 (BIA 평가 소프트웨어 버전 3.2, Pharmacia BIAcore, Uppsala, Sweden)를 사용하여 IL-22RA 단백질에 결합하는 항-IL-22RA 항체의 역학을 평가하였고, 그 결과는 다음 표 12에서와 같다:

클론 R2.1.5F4.1**		클론 R2.1.15E2.1**
ka (M-1s-1)	1.49E+06	ka (M-1s-1)	1.76E+06
kd (s-1)	1.70E-04	kd (s-1)	2.55E-04
KA (M-1)	8.76E+09	KA (M-1)	6.66E+09
KD (M)	1.14E-10	KD (M)	1.504E-10
Chi2	2.08	Chi2	1.5

** 각각의 항 IL-22RA MAB에 대한 평형 결합 (Ka) 및 분해 (Kd) 속도 상수가 표시되는데, 기계 한계 안에 속하는 값이다. Chi2는 결합 곡선과 평가 맞춤 곡선 사이의 잔여 부분의 눈금의 합을 말한다. 0에 가까울수록 데이터를 더 많이 신뢰할 수 있다.

상기 표 12에 의해 알 수 있는 바와 같이, 두 개의 항-IL-22RA MAb는 IL-22RA (트롬빈-절단된 Fc4 태그)에 대한 피코-몰 농도 수준의 결합에 의해 증명되는 바와 같이 IL-22RA 단백질에 강력하게 결합한다. 이 데이터는 낮은 Chi2 값을 토대로 양호한 신뢰도와 함께 제시되며, mAb 클론 R2.1.5F4.1이 IL-22RA 수용체에 대해 약간 더 강력한 친화성을 가지는 것을 나타낸다.

실시예 20

조직 샘플에서 생체 내 IL-22 단백질 발현의 면역조직화학적 분석

A. 요약

IL-22 단백질 발현 및 정위에 대한 면역조직화학적 (IHC) 분석을 항-사람 IL-22 (항-hIL-22) 단클론성 항체 (Mab 266.19.1.10.5.2)를 사용하여, 다음의 조직 샘플에서 수행하였다: 사람 다중-정상 격자 및 종양 격자; 사람 췌장염, 폐 및 신장 질병 샘플; 사람 건선 피부 샘플; INS IL-22 TG (쥐 인슐린 프로모터로부터 발현됨) 및 WT 마우스 췌장; muIL-22-EuLCK TG 및 WT 마우스 피부 샘플; 및 DSS (WT 및 IL-22 KO) 마우스 결장 샘플. 또한 항-hIL-22 단클론성 항체 MAB 266.19.1.10.5.2 (실시예 17) 대 다클론성 항체 (토끼 항-IL-22) (실시예 16)의 염색 패턴을 비교하였다.

쥐 항-사람 IL-22 단클론성 항체 MAb 266.16.1.4.4.1 및 MAb 266.19.1.10.5.2 (실시예 17)를 시험하였고, 그 결과 BHK/사람 IL-22의 대부분 (>50%)을 염색하지만 일부 BHK/마우스 IL-22 (1-5%)는 염색하지 못하는 것으로 나타났으며, 두 가지 사람 환자 및 동물 모델 샘플에서 IL-22의 조직 분포 및 발현을 연구하기 위해 사용하였고, 그 결과를 확인하기 위하여 다클론성 토끼 항체와 염색 패턴을 비교하기 위해 사용하였다.

B. 재료 및 방법

사람 및 마우스 동물 모델로부터 얻은 포르말린-고정된 및 파라핀-삽입된 세포 및 조직을 5㎛로 절개하였다. 세포는 포지티브 대조표준과 네거티브 대조표준으로서 각각 사람 또는 마우스 IL-22를 발현하는 BHK 세포 및 야생형을 포함하였다. 사람 조직은 다양한 정상 사람 조직 (예컨대 뇌, 뇌하수체, 부신선, 유방, 신장, 심장, 위, 소장, 대장, 태아 간, 간, 피부, 췌장, 폐, 편도선, 난소, 고환, 전립선, 자궁, 태반, 갑상선 및 비장)의 50 절편을 포함하는 다-조직 대조 슬라이드 (NormalGrid^TM; Biomeda, Foster City, CA); 다양한 사람 종양 (예컨대 폐 선암, 간 선암, 신장 선암, 결장 선암, 유방 선암, 갑상선 선암, 위 선암, 전립선 선암, 췌장 선암, 난소 선암, 림프종, 흑색종, 에윙스 육종, 상피 육종, MFH 육종, 라브도 육종, 암종, 미분화암, 중피암, 테레토마(teretoma) 및 세미노마(seminoma))의 50 절편을 포함하는 다-조직 대조 슬라이드 (TumorGrid^TM; Biomeda, Foster City, CA); CHTN (Cooperation Human Tissue Network, Cleveland, Ohio)으로부터의 폐 암종; 정상적인 췌장, 만성 췌장염에 걸린 췌장, 만성 말초혈관 염증이 있는 폐, NDRI (Ntional Disease Research Interchange, Philadelphia, PA)로부터 분류된 다중병소 신사구체 경화증, 메상기오 증식성 신사구체 경화증, 또는 경화성 신사구체 간질성 섬유증 중 어느 하나에 걸린 신장; 및 사람으로부터의 건선성 피부 샘플을 포함한다. 마우스 조직은 염증성 장 질병 동물 모델 (본원에서 설명되는 DSS 모델, Swiss Webster 암컷 마우스)로부터의 클론 및 부형제 또는 음료수중의 4% DSS로 7일 동안 처리된 IL-20 WT 및 KO 대장염 동물 모델 (DSS 마우스, 야생형 및 IL-20 (IL-20) 녹아웃 암컷 마우스)로부터의 클론; 및 mIL-22-EμLCK TG 및 mIL-22-INS 대조표준 및 TG 동물을 포함하는 유전자도입 (TG) 동물 모델로부터의 피부 샘플을 포함한다. 블록/슬라이드당 한 절편을 헤마토크실린과 에오신 (H&E)으로 염색하여 조직학적 조사에 사용하였고, 계속해서 절편을 IL-22 단백질 발현 및 정위를 위해 면역조직화학적으로 염색하였다.

면역조직화학을 위해, 세포와 조직 절편을 ChemMate^TM 모세관 갭 플러스 현미경 슬라이드 (BioTek, Winooski, Vermont)위에 놓고, 60℃ 오븐에서 60분 동안 건조시킨 후, 크실렌에서 3×5분, 100% EtOH에서 4분, 100% EtOH에서 3분, 및 95% EtOH에서 2분의 표준 조건을 사용하여 왁스를 제거하였다. 그런 다음 조직 절편을 펩신 (NeoMarkers Fremont CA)을 사용하여 37℃에서 20분 동안 효소-유도된 에피토프 회복 과정을 수행한 후, 제조업자 (Zymed, South San Francisco, CA)의 지시를 따라 아비딘/비오틴-차단 단계를 수행하였다. 염색을 위해서는 아비딘-비오틴-복합체 검출 시스템 (Ventana Biotek Systems, Tucson, AZ)을 사용하는 TechMate 500^TM 자동 면역염색기 및 면역과산화효소 (IP) 면역조직화학 프로토콜을 사용하였다. TechMate 500^TM 자동 면역염색기는 모세관 작용 원리를 사용하고, IP 프로토콜은 "샌드위치" 기법으로 불리는 면역염색 유형을 활용한다. 절편을 미리 PBS 중에서 5%의 정상 염소 혈청 (Vector, Burlingame CA)으로 10분 동안 차단하고, 완충액 1로 1회 세척한 후 (Signet,Dedham MA), 1:800으로 희석한 IL-22에 대한 일차 항체 (MAB 266.19.1.10.5.2)(실시예 17), 2.04mg/ml로 PAS 정제됨)와 함께 30분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 완충액 1로 5회 세척하였다. 일차 항체를 TechMate^TM 항체 희석 완충액 (Ventana)중에서 희석하였다. PBS중의 1:200으로 희석된 비오티닐화된 염소 항-쥐 IgG (Vector)와 5% 정상 염소 혈청 및 2.5% 탈지 분유를 이차-결합 항체로서 25분 동안 실온에서 사용한 후, 완충액 1로 1회 세척한 다음, 완충액 2&3으로 1회 세척하였다 (Signet). 그런 다음 조직 절편을 7분씩 3% 과산화수소 (HP)로 3회 차단 (Ventana)하고, 완충액 2&3으로 3회 세척하였다. 면역과산화효소 표지화를 과산화물 DAB 키트 (Ventana)로 수행하고, 아비딘-비오틴-복합체 (ABC)와 함께 30분 동안 인큐베이션한 후, 완충액 2&3으로 5회 세척하고, 디아미노벤지딘 (DAB)와 함께 4분씩 4회 인큐베이션한 후, 완충액 2&3으로 2회 세척하고 물로 1회 세척하였다 (Signet, Cat. No. 2340). 그런 다음 조직을 메틸 그린 (Dako, Cat. No. S1962)로 10분 동안 역 염색한 후 완충액 2&3으로 2회 세척하고 물로 3회 세척하였다. 대조표준은 일차 항체 대신 위 일차 항체 이소타입 대조표준 (Zymed)을 사용하는 비-면역 일차 혈청을 포함하였다.

면역염색을 올림퍼스 BH-2 현미경을 사용하여 관찰하였고, 영상을 CoolSNAP HQ 디지털 카메라 (Roper Scientific, Tucson, AZ)로 포착하였다.

C. 결과

포지티브 및 네거티브 대조 셀라인: 항-hIL-22 단클론성 항체인 MAB 266.19.1.10.5.2는 사람 IL-22 발현 BHL 세포(+++)와 쥐 IL-22 발현 BHK 세포(+)에서 포지티브로 염색되고, 야생형 BHK 세포(-)에서는 염색되지 않는 것으로 증명되었다. 모든 포지티브 및 네거티브 BHK 셀라인을 일차 항체를 대체하기 위해 쥐의 이소타입 네거티브 대조표준으로 염색한 결과, 염색되지 않는 것(-)으로 나타났는데, 그것은 항체가 IL-22 리간드에 특이적임을 나타낸다. 항체는 사람 및 마우스 IL-22 둘 다에 대하여 교차 면역반응성을 가졌다.

사람 조직: 사람 다-정상 격자 및 종양 격자; 췌장, 폐 및 신장 질병 샘플; 및 사람 건선 피부 샘플을 조사하였다. 이들 사람 조직은 1) 다-조직 대조 슬라이드 (NormalGrid^TM)/정상 사람 조직에 대하여 뇌, 뇌하수체, 부신선, 유방, 신장, 심장, 위, 소장, 대장, 태아 간, 간, 피부, 췌장, 폐, 편도선, 난소, 자궁, 고환, 태반, 갑상선 및 비장; 2) 다-조직 대조 슬라이드 (TumorGrid^TM)/사람 비정상 조직종양에 대하여 폐 선암, 간 선암, 신장 선암, 갑상선 선암, 위 선암, 전립선 선암, 췌장 선암, 난소 선암, 림프종, 흑색종, 에윙스 육종, 상피 육종, MFH 육종, 라브도 육종, 암종, 미분화암, 중피암, 테레토마 및 세미노마; 3) 정상적인 췌장, 만성 췌장염에 걸린 췌장, 만성 말초혈관 염증이 있는 폐, 폐암, CHTN 및/또는 NDRI로부터 분류된 다중병소 신사구체 경화증, 메상기오 증식성 신사구체 경화증, 또는 경화성 신사구체 간질성 섬유증 중 어느 하나에 걸린 신장; 4).를 포함한다.

마우스 조직: INS IL-22 TG와 WT 마우스 췌장을 조사하였다. INS IL-22 TG췌장의 전 샘을 통하여 산란된 세포들은 Mab MAB 266.19.1.10.5.2로 강력한 포지티브 염색 (+++)을 나타냈고, WT 췌장은 염색되지 않았다 (-).

다클론성 및 단클로성 항체의 비교: 항-IL-22 다클론성 항체 (실시예 16)는 민감한 반면, 단클론성 항체 MAB 266.19.1.10.5.2는 특이적인 것으로 밝혀졌다. 다클론성 항체는 사람 IL-22 발현 BHK 세포 (+++)상에서, 쥐 IL-22 발현 BHK 세포 (+)상에서, 다양한 사람 및 마우스 조직 샘플에서 (+), 그리고 INS mIL-22 TG 마우스의 샘에서 (+++) 포지티브로 염색되는 것으로 나타났다. 더 큰 백분율의 유전자 도입 동물 (대 야생형)의 샘이 포지티브 염색을 함유하였다. 유전자도입 동물의 샘에서의 염색은 일반적으로 샘 전체를 통해 분포한(+++) 반면, 야생형 샘에서의 염색은 대체로 샘의 주변에 한정된다 (+). 그러나 이 항체는 또한 WT BHK 네거티브 대조 세포(+)상에서 비-특이적인 염색을 나타냈다. MAB 266.19.1.10.5.2는 사람 IL-22 발현 BHK 세포 (+++)상에서, 쥐 IL-22 발현 BHK 세포 (+)상에서, 그리고 INS mIL-22 TG 마우스의 샘에서 (+++) 포지티브로 염색되는 것으로 나타났다. 유전자도입 동물의 샘에서의 염색은 일반적으로 샘 전체를 통해 분포한(+++) 반면, 야생형 샘은 네거티브 염색인 것으로 증명되었다 (-).

실시예 21

IL-20은 사람 건선 피부 샘플에서 상향조절된다

A. RNA 샘플:

건선 환자로부터의 피부뿐만 아니라 정상 피부 샘플을 얻었다. 건선 환자로부터의 샘플은 건선으로부터의 피부와 인접한 미포함 피부로부터의 샘플을 포함한다. RNA를 사람 피부 샘플로부터 종래 방법을 사용하여 분리하였다. RNA 샘플의 보전성 및 품질을 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Waldbronn Germany)상에서 시험하였다.

B. 정량적인 RT- PCR 을 위한 프라이머 및 프로브

ABI PRISM 7700 서열 검출 시스템 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)을 사용하는 실시간 정량 RT-PCR은 이미 설명되어 있다 (Heid, C.A. et al., Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson, U.E.M. et al., Genome Research 6:995-1001, 1996; Sundaresan, S. et al., Endocrinology 139:4756-4764, 1998). 이 방법은 리포터와 진정제 형광 염료 둘 다를 함유하는 유전자 특이적 프로브의 사용을 포함한다. 프로브가 무상일 때 리포터 염료 방출은 진정제 염료의 밀접한 근접성 때문에 무효로 된다. 추가의 유전자-특이적 전방 및 역 프라이머를 사용하는 PCR 연장 동안에, 프로브는 rTth DNA 중합효소의 5'에서 3' 방향 뉴클레오티드 분해 활성에 의해 절단되어 프로브로부터 리포터 염료가 방출됨으로써 결과적으로 형광 방출의 증가가 초래된다.

IL-20 발현의 실시간 정량 RT-PCR 분석에 사용된 프라이머와 프로브는 프라이머 디자인 소프트웨어 Primer Express^TM (PE Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 디자인하였다. 전방 프라이머, ZC40541 (SEQ ID NO:25)과 역 프라이머, ZC40542 (SEQ ID NO:26)을 800nM 농도에서 PCR 반응 (하기)에서 사용하여 71bp의 생성물을 합성하였다. 상응하는 IL-20 TaqMan^® 프로브, ZC40544 (SEQ ID NO:27)을 합성하고, PE Applied Biosystems에 의해 표지하였다. IL-20 프로브를 5' 단부에서 리포터 형광 염료 (6-카르복시-플루오레신)(FAM)(PE Applied Biosystems)로 표지하고, 3' 단부에서 진정제 형광 염료 (6-카르복시-테트라메틸-로다민)(TAMRA)(PE Applied Biosystems)로 표지하였다.

C. 실시간 정량 RT- PCR

IL-20 mRNA의 상대적인 수준을 TaqMan EZ RT-PCR 코어 시약 키트 (PE Applied Biosystems)를 사용하여 총 RNA 샘플을 분석함으로써 측정하였다. 런오프 IL-20 전사물을 제조하여 정량에 사용된 표준 곡선을 제작하였다. 곡선은 IL-20에 대한 전체 메시지 중 약 1e8부터 1e3의 총 복사물 범위의 10배 연속적인 희석으로 구성되며, 각 표준 곡선 점은 3개 한 벌로 분석된다. 피부로부터의 총 RNA 샘플을 또한 사람 IL-20 전사물 수준에 대하여 및 내인성 대조표준으로서 hGUS의 수준에 대하여 3개 한 벌로 분석하였다. 총 부피 25㎕에서, 각각의 RNA 샘플에 대하여 다음과 같은 것들을 함유하는 TaqMan EZ RT-PCR 반응 (PE Applied Biosystems)을 수행하였다: DEPC 처리된 물 (Dnase/Rnase 없음)중의 대략 25ng의 총 RNA; 적절한 프라이머 (대략 800nM의 ZC40541 (SEQ ID NO:25)과 ZC40542 (SEQ ID NO:26)); 적절한 프로브 (대략 100nM의 ZC40544 (SEQ ID NO:27)); 1X TaqMan EZ 완충액; 3mM의 아세트산 망간; 300μM의 각각의 d-CTP, d-ATP, d-GTP 및 600μM의 d-UTP, rTth DNA 중합효소 (0.1U/㎕); 및 AmpErase UNG (0.01 U/㎕). PCR 열 순환 조건은 다음과 같았다: 50℃에서 2분 동안의 한 주기의 초기 UNG 처리 단계; 이어서 60℃에서 30분 동안의 한 주기의 역 전사 단계(RT); 95℃에서 5분 동안의 한 주기의 UNG의 비활성화 단계; 94℃에서 20초 동안 및 60℃에서 1분 동안의 증폭의 40주기.

상대적인 IL-20 RNA 수준을 제조업체인 PE Biosystems에 의해 설명된 것과 같이 표준 곡선 방법을 사용함으로써 측정하였다 (User Bulletin #2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Relative Quantitation of Gene Expression, Secember 11, 1997). hGUS 측정을 사용하여 IL-20 수준을 기준화하였다. 그 데이터를 하기 표 13에 나타낸다.

피부 샘플	IL-20
정상	2903
미포함	7233
포함	27,695

IL-20 mRNA는 정상 환자 또는 미포함 영역으로부터의 피부 샘플에서 검출할 수 있었지만, 건선 환자로부터의 포함 피부에서는 IL-20 메시지에 대한 상향조절이 있었다. IL-20RA, IL-22RA (IL-22RA), 및 IL-20RB를 포함하여 IL-20에 대한 수용체 하위유닛은 사람 정상 및 질병이 있는 피부에서 발현되었다. 이들 데이터는 사람 건선에 대한 IL-20의 강력한 질병 관련을 지지한다.

IL-20의 과잉발현을 사람 건선 병변에서 볼 수 있었는데, 그것은 IL-20이 사람 건선에 포함되었음을 시사한다. 더욱이 본원에서 설명되는 바와 같이, 유전자도입 마우스에서 IL-20의 과잉 발현은 건선 표현형을 나타내는 표피 두꺼워짐과 면역 세포 포함을 나타냈다. 그러한 생체 내 데이터는 추가로 IL-20이 건선에 포함된다는 것을 시사한다. IL-20 활성에 대한 길항체, 예컨대 본 발명의 항-사람-IL-22RA 단클론성 항체 외에, 그것에 대한 가용성 수용체 및 항체, 및 항-IL-20 중화 및 단클론성 항체는 그 자체로서 염증성 질병의 치료시, 예컨대 건선 및 본원에 개시된 것과 같은 다른 징후의 치료에 IL-20에 대한 길항체로서 치료적으로 유용하다.

실시예 22

IL-20은 사람 아토피성 피부염 피부 샘플에서 상향조절된다.

A. RNA 샘플:

아토피성 피부염 환자로부터의 피부뿐만 아니라 정상 피부 샘플을 얻었다. RNA를 사람 피부 샘플로부터 종래 방법을 사용하여 분리하였다. RNA 샘플의 보전성 및 품질을 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Waldbronn Germany)상에서 시험하였다.

B. 정량적인 RT- PCR 을 위한 프라이머 및 프로브

ABI PRISM 7700 서열 검출 시스템 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)을 사용하는 실시간 정량 RT-PCR은 이미 설명되어 있다 (Heid, C.A. et al., Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson, U.E.M. et al., Genome Research 6:995-1001, 1996; Sundaresan, S. et al., Endocrinology 139:4756-4764, 1998). 이 방법은 리포터와 진정제 형광 염료 둘 다를 함유하는 유전자 특이적 프로브의 사용을 포함한다. 프로브가 무상일 때 리포터 염료 방출은 진정제 염료의 밀접한 근접성 때문에 무효로 된다. 추가의 유전자-특이적 전방 및 역 프라이머를 사용하는 PCR 연장 동안에, 프로브는 rTth DNA 중합효소의 5'에서 3' 방향 뉴클레오티드 분해 활성에 의해 절단되어 프로브로부터 리포터 염료가 방출됨으로써 결과적으로 형광 방출의 증가가 초래된다.

IL-20 발현의 실시간 정량 RT-PCR 분석에 사용된 프라이머와 프로브는 프라이머 디자인 소프트웨어 Primer Express^TM (PE Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 디자인하였다. 전방 프라이머, ZC40541 (SEQ ID NO:25)과 역 프라이머, ZC40542 (SEQ ID NO:26)를 800nM 농도에서 PCR 반응 (하기)에서 사용하여 71bp의 생성물을 합성하였다. 상응하는 IL-20 TaqMan^® 프로브, ZC40544 (SEQ ID NO:27)을 합성하고, PE Applied Biosystems에 의해 표지하였다. IL-20 프로브를 5' 단부에서 리포터 형광 염료 (6-카르복시-플루오레신)(FAM)(PE Applied Biosystems)로 표지하고, 3' 단부에서 진정제 형광 염료 (6-카르복시-테트라메틸-로다민)(TAMRA)(PE Applied Biosystems)로 표지하였다.

C. 실시간 정량 RT- PCR

IL-20 mRNA의 상대적인 수준을 TaqMan EZ RT-PCR 코어 시약 키트 (PE Applied Biosystems)를 사용하여 총 RNA 샘플을 분석함으로써 측정하였다. 런오프 IL-20 전사물을 제조하여 정량에 사용된 표준 곡선을 제작하였다. 곡선은 IL-20에 대한 전체 메시지 중 약 1e8부터 1e3의 총 복사물 범위의 10배 연속적인 희석으로 구성되며, 각 표준 곡선 점은 3개 한 벌로 분석된다. 피부로부터의 총 RNA 샘플을 또한 사람 IL-20 전사물 수준에 대하여 및 내인성 대조표준으로서 hGUS의 수준에 대하여 3개 한 벌로 분석하였다. 총 부피 25㎕에서, 각각의 RNA 샘플에 대하여 다음과 같은 것들을 함유하는 TaqMan EZ RT-PCR 반응 (PE Applied Biosystems)을 수행하였다: DEPC 처리된 물 (Dnase/Rnase 없음)중의 대략 25ng의 총 RNA; 적절한 프라이머 (대략 800nM의 ZC40541 (SEQ ID NO:25)과 ZC40542 (SEQ ID NO:26)); 적절한 프로브 (대략 100nM의 ZC40544 (SEQ ID NO:27)); 1X TaqMan EZ 완충액; 3mM의 아세트산 망간; 300μM의 각각의 d-CTP, d-ATP, d-GTP 및 600μM의 d-UTP, rTth DNA 중합효소 (0.1U/㎕); 및 AmpErase UNG (0.01 U/㎕). PCR 열 순환 조건은 다음과 같았다: 50℃에서 2분 동안의 한 주기의 초기 UNG 처리 단계; 이어서 60℃에서 30분 동안의 한 주기의 역 전사 단계(RT); 95℃에서 5분 동안의 한 주기의 UNG의 비활성화 단계; 94℃에서 20초 동안 및 60℃에서 1분 동안의 증폭의 40주기.

상대적인 IL-20 RNA 수준을 제조업체인 PE Biosystems에 의해 설명된 것과 같이 표준 곡선 방법을 사용함으로써 측정하였다 (User Bulletin #2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Relative Quantitation of Gene Expression, Secember 11, 1997). hGUS 측정을 사용하여 IL-20 수준을 기준화하였다.

IL-20 mRNA는 피부 샘플에서 낮은 수준으로 (약 800 복사물) 검출할 수 있었다. 대조적으로 아토피성 피부염 환자로부터의 피부에는 IL-20 메시지에 대한 상향조절이 있었다 (약 8600 복사물). IL-20RA, IL-22RA, 및 IL-20RB를 포함하여 IL-20에 대한 수용체 하위유닛은 사람 정상 및 질병이 있는 피부에서 발현되었다. 이들 데이터는 사람 아토피성 피부염에 대한 IL-20의 강력한 질병 관련을 지지한다. IL-20의 과잉발현을 사람 아토피성 피부염 피부에서 볼 수 있었는데, 그것은 IL-20이 사람 아토피성 피부염에 포함되었음을 시사한다. 더욱이 본원에서 설명되는 바와 같이, 유전자도입 마우스에서 IL-20의 과잉 발현은 아토피성 피부염 표현형을 나타내는 표피 두꺼워짐과 면역 세포 포함을 나타냈다. 그러한 생체 내 데이터는 추가로 IL-20이 아토피성 피부염에 포함된다는 것을 시사한다. IL-20 활성에 대한 길항체, 예컨대 본 발명의 항-사람-IL-22RA 단클론성 항체 외에, 그것에 대한 가용성 수용체 및 항체, 및 항-IL-20 중화 및 단클론성 항체는 그 자체로서 염증성 질병의 치료시, 예컨대 아토피성 피부염 및 본원에 개시된 것과 같은 다른 징후의 치료에 IL-20에 대한 길항체로서 치료적으로 유용하다.

실시예 23

IL-20에 의한 IL-8의 상향 조절

제 2세대에서 정상적인 사람 표피 신생 케라틴 생성 세포 (NHEK)(Clonetics로부터)를 12 웰 조직 배양 플레이트에 플레이트하고 집밀도에 이를 때까지 성장시켰다. KGM (케라틴 생성 세포 성장 배지)을 Clonetics에서 구입하였다. 세포가 집밀도에 이르렀을 때, 세포를 성장 인자를 뺀 KGM 배지 (=KBM 배지: 케라틴 생성 세포 기초 배지)로 세척하였다. 세포를 KBM에서 72시간 동안 혈청을 제거한 후 시험 화합물을 첨가하였다. 1 I.U./mL의 트롬빈과 25nM의 트립신을 포지티브 대조표준으로서 사용하였다. 웰당 1mL의 배지를 첨가하였다. KBM만을 네거티브 대조표준으로서 사용하였다.

IL-20을 KBM 배지에서 제조하였고, 첫 번째 실험에서는 2.5㎍/ml로부터 618ng/ml까지의 다양한 농도로, 두 번째 실험에서는 2.5㎍/mL로부터 3ng/mL까지의 다양한 농도로 첨가하였다.

세포를 37℃, 5% CO₂에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 상층액을 제거하고 -80℃에서 여러 날 동안 냉동하였다가 IL-8 및 GM-CSF 수준에 대하여 분석하였다. 사람 IL-8 면역분석 키트 #D8050 (RandD Systems, Inc.)과 사람 GM-CSF 면역분석 키트 #HSGMO (RandD Systems, Inc.)를 제조업자의 지시를 따라 사용하여 사이토킨 생성을 측정하였다.

그 결과는 IL-8 및 GM-CSF의 발현이 IL-20에 의해 유도되었음을 나타냈다.

실시예 24

IL-20에 의한 염증성 사이토킨의 상향-조절

사람 케라틴 생성 세포 셀라인, HaCaT를 37℃에서 T-75 조직 배양 플라스크에서 여러 날 동안 집밀도 이상으로 성장시켰다. 이 시점에서 정상적인 성장 배지 (DMEM+10% FBS)를 제거하고, 혈청이 없는 배지로 교체하였다. 그런 다음 세포를 37℃에서 2일 동안 인큐베이션하였다. 그런 후 DMEM을 제거하고 하나의 처리에 대해 4개의 세포 플라스크를 다음 조건 중 하나로 4시간 동안 37℃에서 처리하였다: 5ng/mL의 재조합 사람 (rh) IL-1 알파, 20ng/mL의 rh IL-1 알파, 5ng/mL의 rh IL-1 알파+1㎍/mL의 IL-20, 1㎍/mL의 IL-20, 또는 10ng/mL의 rh IL-10.

사이토킨 처리 후에 배지를 제거하고 세포를 구아니디움 티오시아네이트 용액을 사용하여 용해시켰다. 총 RNA를 세포 용해물로부터, 염화 세슘 구배 상에서 밤새 회전시킴으로써 분리하였다. 다음날, RNA 펠릿을 TE/SDS 용액에서 재현탁하고 에탄올로 침전하였다. 그런 다음 RNA를 분광계를 사용하여 정량하고, Clontech's Atlas^TM cDNA 발현 어레이 유저 매뉴얼 (version PT3140-1/PR9X390, 11/5/99 발표)의 Section V.B.대로 DNase로 처리하였다. RNA 샘플의 질은 명세서 판독을 토대로 한 순도 계산에 의해, 그리고 아가로스 겔 상에서의 가시화에 의해 증명하였다. 베타-악틴 유전자의 PCR 분석에 의한 RNA 샘플의 게놈 오염은 문제삼지 않았다.

폴리A⁺ 풍부화, 프로브 합성 및 Atlas^TM 어레이에 대한 클론텍(Clontech)의 프로토콜을 따랐다 (상기 참조, 또한 Atlas^TM Pure Total RNA 표지화 시스템 유저 매뉴얼, PT3231-1/PR96157, 6/22/99 발표). 간단히 설명하면, 폴리A+RNA를 50mg의 총 RNA로부터 스트렙트아비딘 코팅된 자기 비즈 (Clontech, Palo Alto, CA)와 자기 입자 분리기를 사용하여 분리하였다. 그런 다음 폴리A+RNA를 ^알파32P-dATP로 RT-PCR을 통하여 표지하였다. Atlas^TM 사람 사이토킨/수용체 어레이 (Cat. #7744-1) 상의 268 유전자에 특이적인 클론텍 CDS 프라이머를 반응에 사용하였다. 표지된 프로브를 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 분리하고, 신틸레이션 액으로 계수하였다.

Atlas^TM 어레이를 클론텍 ExpressHyb와 100mg/mL의 열 변성된 연어 정자 DNA로 최소한 30분 동안 68℃에서 연속적으로 교반하면서 예비-혼성화하였다. 그런 다음 멤브레인을 1.9×10⁶ CPM/mL (총 1.14×10⁷ CPM)로 밤새 68℃에서 연속적으로 교반하면서 혼성화하였다. 다음날, 멤브레인을 30분 동안 2X SSC, 1% SDS로 68℃에서 4회 세척하고, 30분 동안 0.1 SSC, 0.5% SDS로 68℃에서 1회 세척한 다음, 실온에서 5분 동안 2X SSC로 1회 세척하였다. 그런 다음 어레이 멤브레인을 밀봉된 코닥 플라스틱 파우치 위에 놓고 인 촬영기 스크린에 밤새 실온에서 노출시켰다. 다음날, 인 스크린을 인 촬영기에서 스캔하고, 클론텍의 AtlasImage^TM 1.0 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

IL-20에 의해 상향-조절된 유전자들:

1. 종양 괴사 인자 (TNF)는 IL-20에 의해 1.9 내지 2.4배 상향-조절되었다.

2. 태반 성장 인자 1&2 (PLGF)는 IL-20에 의해 1.9 내지 2.0배 상향-조절되었다.

3. 응고 인자 II 수용체는 IL-20에 의해 2.0 내지 2.5배 상향-조절되었다.

4. 칼시토닌 수용체는 IL-20에 의해 2.2 내지 2.3배 상향-조절되었다.

5. TNF-유도성 히알루로네이트-결합 단백질 TSG-6은 IL-20에 의해 2.1 내지 2.2배 상향-조절되었다.

6. 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 수용체-1 전구체, 티로신-단백질 키나제 수용체 (FLT-1)(SFLT)는 IL-20에 의해 2.1 내지 2.7배 상향-조절되었다.

7. MRP-8 (대식세포의 칼슘 결합 단백질, MIF-관련됨) 은 IL-20에 의해 2.9 내지 4.1배 상향-조절되었다.

8. MRP-14 (대식세포의 칼슘 결합 단백질, MIF-관련됨)는 IL-20에 의해 3.0 내지 3.8배 상향-조절되었다.

9. 릴랙신 H2는 IL-20에 의해 3.14배 상향-조절되었다.

10. 형질전환 성장 인자 베타 (TGFβ) 수용체 III 300 kDa는 IL-20에 의해 2.4 내지 3.6배 상향-조절되었다.

IL-20+IL-1 처리로 얻어지는 상승효과를 나타내는 유전자들:

1. 뼈 형태형성 단백질 2a는 IL-20 단독 처리로는 1.8배 상향-조절되었고, IL-1 단독 처리로는 2.5배 상향-조절되었으며, IL-20과 IL-1로 함께 처리하면 8.2배로 상향-조절되었다.

2. MRP-8은 IL-20 단독 처리로는 2.9배 상향-조절되었고, IL-1 단독 처리로는 10.7배 상향-조절되었으며, IL-20과 IL-1로 함께 처리하면 18.0배로 상향-조절되었다.

3. 적혈구 분화 단백질 (EDF)은 IL-20 단독 처리로는 1.9배 상향-조절되었고, IL-1 단독 처리로는 9.7배 상향-조절되었으며, IL-20과 IL-1로 함께 처리하면 19.0배로 상향-조절되었다.

4. MRP-14 (대식세포의 칼슘 결합 단백질, MIF-관련됨)는 IL-20 단독 처리로는 3.0배 상향-조절되었고, IL-1 단독 처리로는 12.2배 상향-조절되었으며, IL-20과 IL-1로 함께 처리하면 20.3배로 상향-조절되었다.

5. 헤파린-결합 EGF-유사 성장 인자는 IL-20 단독 처리로는 2.0배 상향-조절되었고, IL-1 단독 처리로는 14배 상향-조절되었으며, IL-20과 IL-1로 함께 처리하면 25.0배로 상향-조절되었다.

6. 베타-트롬보글로불린-유사 단백질은 IL-20 단독 처리로는 1.5배 상향-조절되었고, IL-1 단독 처리로는 15배 상향-조절되었으며, IL-20과 IL-1로 함께 처리하면 27배로 상향-조절되었다.

7. 뇌-유도 향신경성 인자 (BDNF)는 IL-20 단독 처리로는 1.7배 상향-조절되었고, IL-1 단독 처리로는 25배 상향-조절되었으며, IL-20과 IL-1로 함께 처리하면 48배로 상향-조절되었다.

8. 단핵 세포 주화성 및 활성화 인자 MCAF는 IL-20 단독 처리로는 1.3배 상향-조절되었고, IL-1 단독 처리로는 32배 상향-조절되었으며, IL-20과 IL-1로 함께 처리하면 56배로 상향-조절되었다.

실시예 25

IL-20 유전자도입 표현형

사람 및 마우스 IL-20은 둘 다 다양한 프로모터를 사용하여 유전자도입 마우스에서 과잉발현되었다. 사람 IL-20의 발현을 지시하는, 간-특이적 마우스 알부민 프로모터를, 단백질의 순환하는 수준을 이루기 위한 시도에서 처음 사용하였다. 후속적인 연구들은 주로 표피 및 층을 이룬 다른 비늘모양 상피에 대한 발현을 표적으로 하는 케라틴 14 (K14) 프로모터; 광범위한 발현 패턴을 제공하는 마우스 메탈로티오네인-1 프로모터; 및 림프종 계통의 세포에서 발현을 유도하는 EμLCK 프로모터를 사용하여 수행되었다. 유사한 결과를 모든 네 가지 경우에 얻었는데, 그것은 아마도 이들 프로모터가 모두 IL-20의 순환하는 수준을 발생시키기 때문일 것이다.

모든 경우에, IL-20 트랜스유전자를 발현하는 유전자도입 새끼들은 유전자도입되지 않은 한배새끼들보다 더 작았고, 단단하거나 주름진 피부를 포함하는 반질거리는 외관을 가지며, 태어난 지 처음 수일 이내에 죽었다. 위에 우유를 가지고 있는 새끼들은 젖을 빨 수 있음을 가리킨다. 이들 마우스는 사지, 꼬리, 콧구멍, 및 입 주변이 팽창되어 있고, 움직이는 것이 어렵다. 또한 마우스들은 연약하고, 눈에 보이는 지방 조직이 부족하며, 귀와 발가락의 발달이 지체되었다. 간에서의 낮은 발현 수준 (100mRNA 분자/세포보다 적음)은 신생아 치명도(lethality) 및 피부 비정상에는 충분하였다. 가시적인 표현형이 없는 유전자도입 마우스는 트랜스유전자를 발현하지 않거나, 발현하더라도 검출가능한 수준으로 발현하지 못하거나, 또는 모자이크였다.

IL-20 유전자도입 마우스의 피부에 대한 조직학적 분석 결과는 유전자도입되지 않은 한배 새끼에 비해 두꺼워진 표피, 각막 비후증 및 조밀한 각질층을 보였다. 혈청세포 크러스트 (scabs)를 때때로 관찰하였다. 유전자도입된 마우스로부터의 피부에 대한 전자 현미경 (EM) 분석은 미토콘드리아내 유지질 봉입, 얼룩덜룩한 케라토히알린 과립, 및 사람 건선 피부와 마우스 피부 질병 모델에서 관찰된 것과 유사한 상대적으로 희귀한 토노필라멘트를 보여주었다. 또한 많은 유전자도입된 마우스들이 아폽토시스성 흉선 림프구를 가졌다. 조직병리학적 분석에 의해서는 다른 비정상이 검출되지 않았다. 이들 조직학적 및 EM 결과는 관찰된 유리질 피부 변경을 지지 및 확장한다.

실시예 26

가용성 사람 IL-22RA- muFc 의 발현을 위한 발현 벡터의 제조

쥐의 감마 2a 중쇄 Fc 영역 (mG2a)에 융합된 IL-22RA의 세포외재성 도메인을 함유하는 사람 IL-22RA 가용성 수용체-muFc 융합물 (IL-22RA-C(mG2a)로 표시함)을 제조하였다. IL-22RA-C(mG2a)를 함유하는 발현 플라스미드를 동종 재조합을 통하여 2개의 별도의 DNA 단편과 발현 벡터 pZMP40을 사용하여 구성하였다. IL-22RA의 폴리뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:1)의 단편, 및 mGa SEQ ID NO:39를 다음의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 제조하였다: (a) IL-22RA 프라이머 ZC45,593 (SEQ ID NO:28), 및 ZC45,592 (SEQ ID NO:29); 및 (b) mG2a 프라이머 ZC45,591 (SEQ ID NO:30), 및 ZC45,594 (SEQ ID NO:31).

첫 번째 단편은 IL-22RA 세포외재성 도메인 코딩 영역을 함유하였는데, 그것은 주형으로서 IL-22RA 폴리뉴클레오티드 (예컨대 SEQ ID NO:1)를 사용하여 제조하였다. 첫 번째 단편은 부분적인 pZMP40 벡터 서열과 중첩되는 5' 부분, IL-22RA 절편, 및 링커 서열과 부분적인 mG2a 서열을 함유하는 3' 중첩부분을 포함하였다. PCR 조건: 94℃, 5분, 1주기; 94℃, 1분, 이어서 55℃, 2분, 이어서 72℃, 3분, 35주기; 72℃, 10분, 1주기.

두 번째 단편은 링커 서열 및 부분적인 IL-22RA 서열과 중첩하는 5' 부분, mG2a 절편, 및 부분적인 pZMP40 벡터 서열을 함유하는 3' 중첩부분을 포함하였다. 쥐 감마 2a 중쇄 Fc 영역 (mG2a) (SEQ ID NO:39)은 쥐 Ig 감마 2a 중쇄 cDNA의 클론으로부터 제조하였다. mG2a는 쥐 면역글로불린 감마 2a 중쇄 불변 영역의 힌지, C_H2 및 C_H3 도메인을 함유한다. PCR 조건: 94℃, 5분, 1주기; 94℃, 1분, 이어서 55℃, 2분, 이어서 72℃, 3분, 35주기; 72℃, 10분, 1주기.

PCR 반응 혼합물을 15 아가로스 겔 상에서 작동시키고 삽입물의 크기에 상응하는 밴드를 QIAquick^TM 겔 추출 키트 (Qiagen)를 사용하여 겔-추출하였다.

BglII로 절단한 플라스미드 pZMP40을 PCR 삽입 단편 중 2개로 3-방식 재조합하는 데 사용하였다. 플라스미드 pZMP40은 MPSV 프로모터와 코딩 서열의 삽입을 위한 다중 제한 부위; 대장균 복제 기원; SV40 프로모터, 인핸서 및 복제 기원, DHFR 유전자, 및 SV40 터미네이터를 포함하는 포유류 선택가능한 마커 발현 유니트; 및 맥주효모균에서의 선택 및 복제에 필요한 URA3 및 CEN-ARS 서열을 가지고 있는 발현 카세트를 함유하는 포유류 발현 벡터이다. 플라스미드 pZMP40을 pZMP21 (아메리칸 타입 컬춰 콜렉션, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209에 기탁함, 기탁 번호 PTA-5266)로부터 폴리링커에 여러 개의 제한 효소 부위를 첨가함으로써 제조하였다.

100㎕의 경합하는 효모 (맥주효모균) 세포를 독립적으로 10㎕의 삽입 DNA 및 100ng의 절단된 pZMP40 벡터와 조합하고, 그 혼합물을 0.2-cm 일렉트로포레이션 큐벳에 옮겼다. 효모/DNA 혼합물에 0.75 kV (5kV/cm), ∞오옴, 및 25μF의 동력 공급원 (BioRad Laboratories, Hercules, CA) 세팅을 사용하여 전기충격을 주었다. 600㎕의 1.2M 소르비톨을 큐벳에 첨가하고, 효모를 두 개의 URA-D 플레이트 위에 있는 100-㎕ 및 300㎕ 분취액에 넣고 30℃에서 인큐베이션하였다. 약 72시간 후에 단일 플레이트로부터의 Ura⁺ 효모 형질전환체를 1ml의 H₂O에 재현탁하고 간단히 회전시켜서 효모 세포를 펠릿화하였다. 세포 펠릿을 0.5ml의 용해 완충액 (2% 트리톤 X-100, 1% SDS, 100mM NaCl, 10mM Tris, pH 8.0, 1mM EDTA)에 재현탁하였다. 500㎕의 용해 혼합물을 250㎕의 산-세척된 유리 비즈와 300㎕의 페놀-클로로포름을 함유하고 있는 에펜도르프 튜브에 넣고, 그것을 3분 동안 와동시킨 후, 5분 동안 에펜도르프 원심분리기에서 최대 속도로 회전시켰다. 이들 수성 상 300㎕를 새로운 튜브에 옮기고, DNA를 600㎕의 에탄올 (EtOH) 및 30㎕의 3M 아세트산 나트륨으로 침전시킨 후, 30분 동안 최대 속도에서 원심분리하였다. 튜브를 기울여 액을 따라버리고 펠릿을 1mL의 70% 에탄올로 세척하였다. 튜브를 기울여 액을 따라버린 후 DNA 펠릿을 30㎕의 TE에 재현탁하였다.

전기 경합하는 대장균 숙주 세포 (DH12S)의 형질전환을 5㎕의 효모 DNA prep와 50㎕의 세포를 사용하여 수행하였다. 세포에 2.0kV, 25μF, 및 400 오옴의 전기충격을 주었다. 일렉트로포레이션을 한 후에 1ml의 SOC (2% Bacto^TM 트립톤 (Difco, Detroit, MI), 0.5% 효모 추출물 (Difco), 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl₂, 10mM MgSO₄, 20mM 글루코스)를 첨가한 다음, 세포를 두 개의 LB AMP 플레이트상의 50㎕ 및 200㎕의 분취액 (LB 육즙 (Lennox), 1.8% Bacto^TM 아가 (Difco), 100mg/L의 암피실린)에 플레이트하였다.

구성물에 대하여 세 클론의 삽입물에 대해 서열 분석을 수행하였고, 각 구성물에 대해 정확한 서열을 함유하는 한 클론을 선택하였다. 보다 큰 규모의 플라스미드 DNA는 시판중인 키트 (QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 제조업자의 지시를 따라 분리하였다.

실시예 27

사람 가용성 IL-22RA- muFc 폴리펩티드의 발현 및 정제

200㎍의 IL-22RA-C(mG2a) 구성물 (실시예 22)의 3 세트를 각각 200유니트의 Pvu I으로 37℃에서 3시간 동안 소화시킨 후, IPA로 침전시키고, 1.5mL 마이크로원심분리 튜브에서 회전하였다. 상층액을 펠릿으로부터 따라버리고 펠릿을 1mL의 70% 에탄올로 세척한 다음, 5분 동안 실온에서 방치하였다. 그 튜브를 마이크로원심분리기에서 10분 동안 14,000 RPM에서 회전시키고, 상층액을 펠릿으로부터 따라버렸다. 그런 다음 펠릿을 멸균 환경에서 750㎕의 PF-CH0 배지에 재현탁하고, 60℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 각 3개의 튜브에서 5E6 APFDXB11 세포를 회전시키고, DNA-배지 용액을 사용하여 재현탁하였다. DNA/세포 혼합물을 0.4cm 갭의 큐벳에 넣고, 다음 매개변수들을 사용하여 일렉트로포레이션하였다: 950μF, 고 전기용량, 및 300V. 그런 다음 큐벳의 내용물을 제거하고, 모아서 PF-CHO로 25mL로 희석한 다음 125mL의 진동 플라스크에 넣었다. 플라스크를 37℃, 6% CO₂에서 진동기 위에 있는 인큐베이터 안에 넣고, 120 RPM에서 흔들어주었다.

셀라인에 영양분 선택을 수행한 후, 100nM 메토트렉세이트 (MTX)로, 이어서 500nM MTX로, 그리고 마지막으로 1μM MTX로 단계 증폭을 하였다. 단계 증폭에 이어서 CD8 세포 분류를 하였다. CD8 세포 분류는 안정한 1μM MTS 증폭된 풀을 모아서 대략 5E6 세포를 단클론성 FITC 항-CD8 항체 (BD PharMingen, cat#30324X)로 제조업자가 권장한 농도를 사용하여 염색함으로써 수행하였다. 염색된 세포를 프로세스하고 FACS Vantage (BD) 유동 혈구계산기상에서 분류하였다. 세포의 상위 5%를 수집하고 더 성장시켰다. 발현을 웨스턴 블롯에 의해 확인하였고, 셀라인을 규모 확대하였고, 단백질 정제를 아래의 표준 방법을 사용하여 수행하였다.

실시예 28

huIL -22RA- mG2a 로 면역된 마우스로부터의 혈청에 의한 huIL -22RA의 중화

A. IL-20 및/또는 IL-22의 억제를 위한 시험에 대한 세포-기초 중화 분석

IL-22RA 및 IL-20RB로 공동-형질전환된 인자-의존성 프레-B 셀라인 BaF3 (pDIRS1)(BAF/IL-22RA/IL-20RB 세포; 실시예 38)를 사용하여 항-IL-22RA 항체의 중화 가능성을 IL-22RA/IL-20RB 수용체상의 IL-20을 길항함으로써 평가하였다. 유사하게, IL-22RA 및 IL-10RB (CRF2-4)로 공동-형질전환된 BaF3 (BAF/IL-22RA/CRF2-4 세포; 실시예 2)를 사용하여 항-IL-22RA 항체의 중화 가능성을 IL-22RA/IL-10RB 수용체상의 IL-22를 길항함으로써 평가하였다. IL-20 또는 IL-22의 존재하에 그것의 각각의 수용체-발현 셀라인상에서의 증식, 및 그러한 증식의 길항체 항체의 존재하에서의 억제를 실시예 3에서 설명한 것과 같은 알라마르 블루 분석을 사용하여 평가하였다. 이들 세포상에서 증식의 억제는 이 분석에서 중화 활성을 나타낸다.

B. 항-IL-22RA 혈청은 세포-기초 중화 분석에서 IL-20 및 IL-22 두 가지를 모두 중화한다.

실시예 28A에서 설명된 분석을 사용하여, huIL-22RA-muG2a (실시예 30(A)(1))로 면역된 IL-22RA 녹아웃 마우스로부터의 혈청을 1%, 0.5%, 0.25%. 0.13%, 0.06%, 0.03%, 0.02%, 및 0%의 일련의 희석액으로서 첨가하였다. 분석을 37℃, 5% CO₂에서 4일 동안 인큐베이션하고, 그 후에 알라마르 블루 (Accumed, Chicago, IL)를 20 ㎕/웰의 농도로 첨가하였다. 플레이트를 다시 37℃, 5% CO₂에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 알라마르 블루는 살아있는 세포 수를 토대로 한 형광계 판독값을 제공하므로, 네거티브 대조표준에 비교할 때 세포 증식의 직접적인 척도이다. 플레이트를 Wallac Victor 2 1420 Multilabel Counter (Wallac, Turku, Finland)에서 파장 530 (여기) 및 590 (방출)에서 판독하였다. 그 결과는 모든 7마리의 면역된 동물로부터의 혈청이 huIL-22RA를 통하여 huIL-22 및 huIL20 둘 다의 신호화를 중화할 수 있음을 보여주었다. 예를 들어 1% 농도에서 5 동물 (16517, 16518, 16519, 16520, 및 16527)로부터의 혈청은 huIL-22에 의해 유도된 증식을 완전히 중화시켰고, 이때 증식의 억제는 더 낮은 농도에서 용량 의존성 방식으로 감소하였다. 더욱이 1% 농도에서 다른 두 마리의 동물 (16471 및 16701)로부터의 혈청은 huIL-22에 의해 유도된 증식을 약 90% 억제하였고, 이때 증식의 억제는 더 낮은 농도에서 용량 의존성 방식으로 감소하였다. 유사하게, 1% 및 0.5% 농도에서 5 동물 (16517, 16518, 16519, 16520, 및 16527)로부터의 혈청은 huIL-20에 의해 유도된 증식을 완전히 중화시켰고, 이때 증식의 억제는 더 낮은 농도에서 용량 의존성 방식으로 감소하였다. 더욱이 1% 농도에서 동물 16701로부터의 혈청은 huIL-20에 의해 유도된 증식을 완전히 중화시켰고, 이때 증식의 억제는 더 낮은 농도에서 용량 의존성 방식으로 감소하였다. 1% 농도에서, 동물 16471로부터의 혈청은 huIL-20에 의해 유도된 증식을 약 95% 중화하였고, 이때 증식의 억제는 더 낮은 농도에서 용량 의존성 방식으로 감소하였다. 그러므로 7마리의 모든 동물로부터의 혈청은 huIL-22RA 수용체를 통하여 IL-20 또는 IL-22 중 어느 하나에 의해 유도된 증식을 중화할 수 있었다. 이들 결과는 나아가 IL-22RA에 대한 항체가 실제로 전-염증성 리간드, IL-20 및 IL-22의 활성을 낮은 농도에서도 길항할 수 있음을 증명하였다.

이들 결과는 IL-22RA 활성을 예를 들면 본 발명의 IL-22RA에 대한 단클론성 항체를 중화하는 것을 통하여 IL-20 또는 IL-22 활성 (개별적으로 또는 함께)을 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화시킴으로써 효과적으로 차단하는 것이 생체 내에서 IL-20 및 IL-22 (단독 또는 함께)의 효과를 감소시키는 데 유익할 수 있고, IL-20 및/또는 IL-22-유도된 염증, 예컨대 IL-20-유도된 피부 효과뿐만 아니라 IL-22-유도된 피부 효과, 예를 들면 건선, IBD, 대장염, 또는 IL-20, 및 또는 IL-22에 의해 유도된 다른 염증성 질병, 이를테면 IBD, 관절염, 천식, 건선성 관절염, 대장염, 염증성 피부 질환, 및 아토피성 피부염에서 볼 수 있는 것과 같은 염증을 감소시킬 수 있다는 추가의 증거를 제공하였다.

실시예 29

P815 / hIL -22RA 세포의 제조 및 마우스의 면역화

A. P815 / hIL -22RA 세포 생성 및 항- hIL -22RA 항체의 생성을 위한 마우스 안으로의 주입

WT P815 세포 (ATCC No. TIB-64)를 hIL-22RA cDNA 서열 (예컨대 SEQ ID NO:1)과 선택가능한 퓨로마이신-내성 마커를 함유하고 있는 플라스미드 벡터로, Fugene Reagent를 사용하여 제조업자의 프로토콜 (Roche, Indianapolis IN)을 따라 형질전환하였다. 세포를 형질전환한 후에 퓨로마이신 선택하에 48시간 동안 놓아두었다. 퓨로마이신-내성 형질전환체를 제한 희석에 의해 클론하고, 그것들의 hIL-22RA 세포 표면 발현 수준에 대하여 유동 혈구계에 의해, 비오티닐화된 사람 IL-22 (huIL-22-비오틴)을 사용하여 스크린하였다. 간단히 설명하면, 세포를 5ug/ml의 huIL-22-비오틴과 함께 30분 동안 얼음 위에서 인큐베이션한 후 세척하였다. 그런 다음 세포에 대한 huIL-22-비오틴의 결합을 1:500으로 PE-표지된 스트렙트아비딘을 사용하여 검출하였다. 세포를 Facscan 유동 혈구계 상에서 Cellquest 소프트웨어 (Becton Dickinson, San Jose, CA)를 사용하여 분석하였다.

선택된 P815/IL-22RA 세포 클론을 성장시킨 후 주입을 위해 수득하였다. 세포를 수집하고, PBS로 3회 세척한 후, 계수하고, 1×108 세포/ml의 농도로 재현탁한 다음, 10,000 rad로 조사하였다. 그런 다음 세포 현탁액을 1m의 주사기에 옮겨서 복강내 경로에 의하여 DBA/2 마우스에게 주사하였다. 마우스들에게 동일한 방식으로 3주 후에 추가 면역하고, hIL-22RA 형질전환 셀라인에 대한 결합에 대하여 혈청을 스크린하였다. 간단하게 설명하면, 혈청을 Facs 완충액 (HBSS, 2% BSA, .02% NaN₃)으로 1:100으로 희석한 후, hIL-22RA를 과잉-발현하는 Fc-차단된 293 사람 신장 세포와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포에 대한 항-IL-22RA 항체의 결합을 1:200으로 희석된 형광-포합된 염소-항-마우스 IgG (Southern Biotech, Birmingham, AL)를 사용하여 검출하였다. 세포를 앞에서 설명한 것과 같이 분석하였다. 마우스들에게 총 3회 더 추가 면역하고, 혈청을 설명한 바와 같이 스크린하였다. hIL-22RA 형질전환체에 대한 그것들의 혈청 결합 수준을 토대로, 단클론성 항체 (실시예 25)의 생성을 위해 당업계에 공지되어있는 표준 방법을 사용하여 하이브리도마 융합을 위해 2마리의 마우스를 선택하였다.

상기 방법은 또한 예를 들면 IL-22RA 및 IL-22RA-포함 이종이량체 수용체에 대한 단클론성 항체를 제조하기 위해 마우스들을 면역시키기 위해서 이종이량체 IL-22RA 수용체를 발현하는 P815 세포, 예컨대 IL-22RA/CRF2-4 발현 세포 (P815/IL-22RA/CRF2-4 세포), IL-22RA/pDIRS1 발현 세포 (P815/IL-22RA/pDIRS1 세포), 또는 IL-22RA/CRF2-4/pDIRS1 발현 세포 (P815/IL-22RA/CRF2-4/pDIRS1 세포)를 제조하는 데에 사용된다.

실시예 30

쥐의 항-사람 IL-22RA (IL-22RA) mAb 의 생성

A. 항-IL-22RA 항체의 생성을 위한 면역화

(1) 가용성 IL-22RA- muFc 를 사용하는 방법

생후 6 내지 12주 된 IL-22RA 녹아웃 마우스들 (실시예 26)을 Ribi 보조제 (Sigma)와 1:1 (v:v)로 혼합된 가용성 사람 IL-22RA-muFc 단백질 (실시예 23) 25 내지 50 ug으로 2주에 걸친 스케줄로 면역시켰다. 세 번째 면역화 후 7 내지 10일이 경과한 후에 혈액 샘플을 안구 출혈에 의해 취하고, 혈청을 수득한 다음 중화 분석으로, IL-22RA에 대한 IL-20 및 IL-22 둘 다 또는 IL-22의 결합을 억제하는 능력과 FACS 염색 분석에서 형질전환된 IL-22RA 대 형질전환되지 않은 293 세포를 염색하는 그것의 능력에 대해 평가하였다. 중화 역가가 평평하게 될 때까지 상술한 바와 같이 마우스들을 계속해서 면역하고, 혈액을 취하여 평가하였다. 그때 가장 높은 중화 역가를 보이는 마우스들에게 PBS 중의 25 내지 50ug의 가용성 IL-22RS-Fc 단백질을 혈관 내로 주사하였다. 3일 후에 이들 마우스로부터 비장과 림프절을 수득하여, 예컨대 마우스 골수종 (P3-X63-Ag8.653.3.12.11) 세포 또는 당업계에 알려져 있는 다른 적절한 셀라인을 사용하고, 당업계에 공지되어 있는 표준 방법을 사용하여 하이브리도마 생성을 위해 사용하였다 (Kearney, J.F. et al., J Immunol. 123:1548-50, 1979; Lane, R.D. J Immunol . Methods 81:223-8, 1985).

(2) IL-22RA 수용체를 발현하는 P815 형질전환체를 사용하는 방법

생후 6 내지 10주 된 암컷 DBA/2 마우스들을 1×10⁵의 살아있는 형질전환된 P815 세포, 예컨대 P815/IL-22RA 세포, P815/IL-22RA/CRF2-4, P815/IL-22RA/pDIRS1 또는 P815/IL-22RA/CRF2-4/pDIRS1 세포 (실시예 24)(예컨대 2×10⁵ 세포/ml의 세포 밀도의 0.5ml)로 복강내 주사에 의해 면역시킨다. 주사 전에 세포를 기하급수적인 성장 단계에서 유지시킨다. 주사를 위해 세포를 수득하고, PBS로 3회 세척한 다음, PBS에 2×10⁵ 세포/ml 밀도로 재현탁하였다. 이 모델에서 마우스는 2-3주 내에 복수 종양을 발생시키고 형질전환된 표적 항원에 대한 면역 반응이 갖춰지지 않는 한 4-6주 정도에 사망에 이르게 된다. 3주째에 외관상으로 복부 팽창 (복수를 나타냄)이 보이지 않는 마우스들을 상기와 같이 2-3주 간격으로 재-면역화한다. 두 번째 면역화 후 7 내지 10일이 지난 후에 혈청 샘플을 안구 출혈에 의해 얻고 혈청을 수득한 다음, 중화 분석 (예컨대 본원에서 설명된 것)으로 IL-22RA에 대한 IL-20 및 IL-22 둘 다 또는 IL-22의 결합을 억제하는 능력과 FACS 염색 분석에서 형질전환된 IL-22RA 대 형질전환되지 않은 293 세포를 염색하는 능력에 대해 평가하였다. 중화 역가가 평평하게 될 때까지 상술한 바와 같이 마우스들을 계속해서 면역하고, 혈액을 취하여 평가하였다. 그때 가장 높은 중화 역가를 보이는 마우스들에게 1×10⁵개의 살아있는 형질전환된 P815 세포를 복강내 주사하였다. 4일 후에 비장과 림프절을 이들 마우스로부터 수득하여 예컨대 마우스 골수종 (P3-X63-Ag8.653.3.12.11) 세포 또는 당업계에 알려져 있는 다른 적절한 셀라인을 사용하고, 당업계에 공지되어 있는 표준 방법을 사용하여 하이브리도마 생성을 위해 사용하였다 (Kearney, J.F. et al., 상기 동일; Lane, R.D. 상기 동일).

상기 살아있는 형질전환된 P815 세포를 사용하는 면역화 개략도에 대체할 수 있는 것은 1-5×10⁶개의 조사되고 형질전환된 세포를 매 2-3주마다 복강내 주사하는 것을 포함한다. 이 접근법에서는 어떠한 동물도 복수를 전개하거나 죽지 않는다. 실제로 동물을 IL-22RA에 대한 중화 면역 반응에 대하여 상기에서 개략적으로 설명한 바와 같이, 두 번째 면역화 후에 출혈을 시작으로 동물들의 혈청에서 모니터하였다. 일단 중화 역가가 최대 수준에 도달하면, 가장 높은 역가를 보이는 마우스들에게 프레-융합물을 제공하는데, 5×10⁶개의 조사된 세포를 복강내 주사하고, 4일 후에 비장과 림프절을 이들 마우스로부터 수득하여 예컨대 마우스 골수종 (P3-X63-Ag8.653.3.12.11) 세포 또는 당업계에 알려져 있는 다른 적절한 셀라인을 사용하고, 당업계에 공지되어 있는 표준 방법을 사용하여 하이브리도마 생성을 위해 사용하였다 (Kearney, J.F. et al., 상기 동일; Lane, R.D. 상기 동일).

B. IL-22RA에 결합하고 IL-22RA에 대한 IL-22의 결합을 억제하는 항체에 대한 하이브리도마 융합의 스크리닝

2개의 상이한 일차 스크린을 융합 후 8 내지 10일에 하이브리도마 상층액에 대하여 수행하였다. 첫 번째 분석에 대하여 상층액 중의 항체를 플레이트 결합된 가용성 사람 IL-22RA-muFc 단백질에 대한 결합 능력에 대하여, HRP-포합된 염소 항-마우스 카파 및 항-람다 경쇄 제 2 단계 시약을 사용하는 ELISA에 의하여 시험하여 결합된 마우스 항체를 확인하였다. IL-22RA-muFc 단백질의 IL-22RA 부분에 대한 특이성을 증명하기 위하여, 초기 분석의 포지티브 상층액을 동일한 쥐 Fc 영역 (mG2a)에 융합된 무관한 단백질에 대해 평가하였다. IL-22RA-muFc에는 결합하지만 무관한 muFc 함유 융합 단백질에는 결합하지 않는 그 상층액 중의 항체는 IL-22RA에 대해 특이적인 것으로 보였다. 두 번째 분석의 경우, 모든 하이브리도마 상층액 중의 항체를 ELISA에 의해, 그것들의 플레이트 결합된 IL-22RA-muFc에 대한 비오티닐화된 사람 IL-22의 결합을 억제하는 능력에 대해 평가하였다.

IL-22RA에 대하여 특이하게 결합한 항체를 함유하는 모든 상층액을, 그것들이 IL-22RA에 대한 IL-22의 결합을 억제하였든지 또는 ELISA에서는 그렇지 않았든지에 관계없이 계속해서 IL-22RA/IL-20RB 및IL-22RA/CRF2-4 형질전환된 BaF3 세포에 대한 IL-20 또는 IL-22의 각각의 결합 (및 동시에 전-증식성 효과)을 억제하는 능력에 대하여 시험하였다. IL-22 억제 분석에서 또는 IL-20 및 IL-22 억제 분석에서 중화 포지티브였던 모든 상층액에 대해 계속해서 그것들의 IL-22RA 형질전환된 대 형질전환되지 않은 Baf3 세포를 염색하는 능력에 대하여 FACS 분석에 의해 평가하였다. 이 분석은 IL-22RA/CRF2-4에 대한 IL-22의 결합, 또는 IL-22RA/IL-20RB에 대한 IL-20의 결합을 억제하는 것이 실제로는 IL-22RA에 특이하게 결합하는 항체 때문임을 확인하는 것이었다. 또한, FACS 분석이 항-IgG 제 2 단계 시약을 사용하여 수행되었기 때문에, 특이한 FACS 포지티브 결과는 중화 항체가 IgG 부류에 속하는 것인 것 같음을 나타낸다. 이들 수단에 의하여 마스터 웰 (master well)이 플레이트 결합된 ELISA에서 IL-22RA와 결합하고, ELISA 기초 억제 분석에서 IL-22RA에 대한 IL-22의 결합을 억제하며, IL-20 및 IL-22와 각각 IL-22RA/IL-20RB 및 IL-22RA/CRF2-4 형질전환된 Baf3 세포 (실시예 28)와의 상호작용을 차단하고, IL-22RA/IL-20RB 및 IL-22RA/CRF2-4 형질전환된 Baf3 세포를 항-마우스 IgG 제 2단계 시약으로 염색하는 데 강력하게 포지티브였음이 확인되었다.

D. 항-IL-22RA 특이적 항체를 생성하는 하이브리도마의 클로닝 :

적절하게 형질전환된 Baf3 세포에 대한 IL-20 및 IL-22의 결합을 교차-중화하는 항-IL-22RA mAb를 생성하는 하이브리도마를 표준 저-밀도 희석 (1 세포/웰 이하) 접근법에 의하여 클론하였다. 플레이팅 후 대략 5 내지 7일 후에, 클론을 ELISA에 의하여 플레이트 결합된 사람 IL-22RA-muFc 상에서 스크린한 후, 상기에서 설명한 것과 같이 무관한 muFc 함유 융합 단백질에 대해 ELISA에 의해 포지티브 웰을 재시험하였다. 그것의 상층액이 IL-22RA-muFc에는 결합했지만 무관한 muFc 함유 융합 단백질에는 결합하지 않은 선택된 클론을 추가로 특이한 항체 활성에 대해, 중화 분석뿐만 아니라 FACS 분석을 모두 반복함으로써 확인하였다. 선택된 모든 IL-22RA 항체 포지티브 클론을 최소 2회 클론하여 클론가능성을 확실히 하고 항체 생성의 안정성을 평가하는 것을 보조하였다. 추가 회수의 클로닝을 수행하고, 설명된 대로, 바람직하게는 최소한 95%의 생성된 클론이 항-IL-22RA 항체 생성을 중화하는 것에 대해 포지티브가 될 때까지 스크린하였다.

E. 항-IL-22RA mAb 에 의해 인지된 분자의 생화학적 특성확인

추정되는 항-IL-22RA mAb에 의해 인지된 표적 분자, IL-22RA가 실제로 IL-22RA라는 생화학적 확인은 표준 면역침전과, 이어서 SDS-PAGE 분석 또는 웨스턴 블롯팅 과정에 의해 수행하는데, 둘 다 IL-22RA 형질전환된 대 형질전환되지 않은 Baf3 세포로부터의 가용성 막을 사용한다. 더욱이 IL-22RA를 발현하는 형질전환되지 않은 셀라인의 가용성 막 제제는 사용될 때 mAb가 형질전환된 것뿐만 아니라 천연 수용체 사슬을 인지하는 것을 보여준다. 또는 달리 mAb를 가용성 IL-22RA-muFc 단백질을 특이하게 면역침전시키거나 웨스턴 블롯팅할 수 있는 능력에 대하여 시험한다.

실시예 31

huIL22RA 로 형질전환된 P815 세포를 주입한 마우스로부터의 혈청에 의한 huIL22RA의 중화

실시예 28에서 설명된 세포 기초 중화 분석을 사용하여, 살아있는 huIL-22RA 형질전환된 P815 세포 (실시예 30.A.2)를 주입한 마우스로부터의 혈청을 1%, 0.5%, 0.25%, 0.13%, 0.06%, 0.03%, 0.02%, 및 0%의 일련의 희석액으로서 첨가하였다. 분석 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 4일 동안 인큐베이션하고, 그 후 알라마르 블루 (Accumed, Chicago, IL)를 20l/웰로 첨가하였다. 플레이트를 다시 37℃, 5% CO₂에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 그 결과 4마리의 동물로부터 얻은 혈청이 huIL-22RA를 통하여 huIL-22 및 huIL-20의 신호화를 중화할 수 있는 것으로 나타났다.

1% 농도에서 6마리의 동물 (7125, 7127, 7128, 7118, 7124 및 7117)로부터의 혈청은 huIL-22에 의해 유도된 증식을 50% 내지 80% 중화시켰고, 이때 증식의 억제는 더 낮은 농도에서 용량 의존성 방식으로 감소하였다. 더욱이 1% 농도에서 4마리의 동물 (7125, 7127, 7118, 및 7117)로부터의 혈청은 huIL-20에 의해 유도된 증식을 40% 내지 70% 중화시켰고, 이때 증식의 억제는 더 낮은 농도에서 용량 의존성 방식으로 감소하였다. 이들 결과는 나아가 IL-22RA에 대한 항체가 실제로 전-염증성 리간드, IL-20 및 IL-22의 활성을 낮은 농도에서도 길항할 수 있음을 증명하였다.

이들 결과는 IL-22RA 활성을, 예를 들면 본 발명의 IL-22RA에 대한 단클론성 항체를 중화하는 것을 통하여 IL-20 또는 IL-22 활성 (개별적으로 또는 함께)을 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화시킴으로써 효과적으로 차단하는 것이 생체 내에서 IL-20 및 IL-22 (단독 또는 함께)의 효과를 감소시키는 데 유익할 수 있고, IL-20 및/또는 IL-22-유도된 염증, 예컨대 IL-20-유도된 피부 효과뿐만 아니라 IL-22-유도된 피부 효과, 예를 들면 건선, IBD, 대장염, 또는 IL-20, 및 또는 IL-22에 의해 유도된 다른 염증성 질병, 이를테면 IBD, 관절염, 천식, 건선성 관절염, 대장염, 염증성 피부 질환, 및 아토피성 피부염에서 볼 수 있는 것과 같은 염증을 감소시킬 수 있다는 추가의 증거를 제공하였다.

실시예 32

IL-22RA 녹아웃 마우스의 표현형

A. 유전자 변형을 운반하는 마우스들의 생성

1. 신생아 반질거림이 있는 쥐 IL-20을 발현하는 유전자도입 마우스의 생성

a) K14 프로모터로부터 쥐 IL-20을 발현하기 위한 구성물

IL-20의 생물학적 기능을 생체 내에서 연구하기 위하여, 쥐 IL-20이 사람 K14 프로모터 (실시예 21 참조)에 의해 구동되는 유전자도입 구성물을 제조하였다. 올리고뉴클레오티드를, 일치하는 Kozak 서열과 쥐 IL-20 코딩 영역을 함유하는 PCR 단편이 생성되도록 디자인하였다. 이들 올리고뉴클레오티드는 5' 단부에 FseI 부위와 3' 단부에 AscI 부위가 있도록 디자인되어서 사람 케라틴생성세포 및 상피 세포-특이적 프로모터를 함유하는 표준 유전자도입 벡터인 pRSK14에 클로닝되는 것을 용이하게 한다.

PCR 반응을 약 200ng의 쥐 IL-20 주형 (SEQ ID NO:33)과 전체 길이의 IL-20 을 증폭하기 위해 디자인된 올리고뉴클레오티드 (SEQ ID NO:34)를 사용하여 수행하였다. PCR 반응 조건은 당업계에 공지되어 있는 방법을 사용하여 결정하였다. PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하고 QiaQuick^TM (Qiagen) 겔 추출 키트를 사용하여 정제하였다. 분리된, 정확한 크기의 DNA 단편을 FseI 및 AscI (Boerhinger-Mannheim)으로 소화하고, 에탄올로 침전시킨 다음, 이미 FseI과 AscI으로 소화시켜놓은 pRSK14에 결찰시켰다. 유전자도입 마우스에서 케라틴생성세포와 상피에 관심의 유전자를 발현하기 위해 디자인된 pRSK14 플라스미드는 양 옆에 약 3Kb의 사람 케라틴 특이적 K14 프로모터가 있는 발현 카세트를 함유한다.

약 1㎕의 결찰 반응액을 DH10B ElectroMax^TM 경합 세포 (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD)에 제조업자의 지시대로 일렉트로포레이션하고, 100㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 플레이트상에 플레이트한 다음 밤새 인큐베이션하였다. 콜로니를 취하여서 100㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 배지에서 성장시켰다. Miniprep DNA를 선택한 클론으로부터 제조하여 쥐 IL-20 삽입에 대하여 FseI과 AscI 조합의 제한 소화 및 후속되는 아가로스 겔 전기영동에 의하여 스크린하였다. 정확한 cDNA가 삽입된 TG 구성물을 서열화 분석에 의해 확인하였다. 정확한 pRSK14-쥐 IL-20의 Maxiprep을 수행하였다.

b) K14 IL-20 유전자도입 마우스의 생성 및 특성확인

길이가 약 4Kb인 NotI 단편을 케라틴 특이적 K14 프로모터의 5' 및 3' 플랭킹 서열, 마우스 IL-20 (SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:34에서 볼 수있는 폴리펩티드), Gormon 인트론, IL-20 cDNA 및 사람 성장 호르몬 폴리A 신호 서열을 함유하고 있는 유전자도입 (TG) 벡터로부터 분리하였다. 그것을 사용하여 수정한 B6C3f1 (Taconic, Germantown, NY) 쥐 난모세포에 미소주입하였다. 미소주입 및 유전자도입 마우스의 제조는 문헌에 설명된 것과 같이 수행하였다 (Hogan, B. et al., Manipulating the Mouse Embryo, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1994).

트랜스유전자의 사람 성장 호르몬 폴리A 신호 부위에 특이적인 PCR 프라이머를 사용함으로써 TG RNA의 발현을 정량하기 위하여 TaqMan^TM RT-PCR 반응을 사용하였다.

IL-20을 발현하는 모든 TG 구성물은 고비율의 파라나탈(paranatal) 사망률을 나타내며, 태어난 TG 새끼들은 전형적으로 "반질거리는" 표현형을 나타낸다. 신생 새끼의 반질거리는 외관은 그것들이 건조해질 때 적절한 돌봄의 손길이 줄어들 수 있는 피부의 뻣뻣해짐과 관련이 있는 것 같다. 그것들의 움직임은 일반적으로 뻣뻣해진다. 조직병리학적으로 반질거리는 새끼들은 두꺼워진 표피를 가지며 케라틴층이 조밀해졌다. 이들 반질거리는 연약한 새끼의 대부분은 처음 5일 이내에 죽었고, 살아남았거나 젖을 뗀 새끼들은 대개는 트랜스유전자 (전사물 분석에 의해)를 발현하지 않거나, 키메릭이다 (트랜스유전자의 자손으로의 낮은 전달율).

K14 프로모터에 의해 구동된, 쥐 IL-20을 발현하는 하나의 라인을 수립하였다. 피부와 흉선에서의 발현 수준은 낮았으며, 모든 신생아들은 반질거리는 표현형을 가지고 태어났다. 일반적으로 이 라인은 TG 자손이 20%였는데, 그것은 유전자도입 새끼의 50 내지 60%가 자궁 안에서 죽었음을 나타낸다 (반접합(hemizygous) 짝짓기에서 자손의 50%는 TG여야 한다).

2. IL-22RA 발현이 제거된 마우스의 생성: IL-22RA 녹아웃 마우스

a). 쥐 IL-22RA에 대한 녹아웃 (KO) 마우스의 생성

IL-22RA의 생체 내에서의 생물학적 기능을 더 연구하기 위하여, IL-22RA 발현을 제거하기 위한 마우스 녹아웃 (KO) 스트레인을 제조하였다. 먼저 마우스 IL-22RA cDNA 프로브를 사용하여 마우스 129/SvJ 게놈 BAC 라이브러리를 스크린하였다. IL-22RA 게놈 유전자좌를 함유하는 클론을 확인하고 특성을 확인하였다. 쥐 IL-22RA 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:41에 표시되며 폴리펩티드는 SEQ ID NO:42에 표시된다.

IL-22RA가 제거된 녹아웃 구성물을 제조하기 위하여, 녹아웃 벡터를 ET 클로닝 기법을 사용하여 만들었다 (Zhang et al. 1998, A New logic for DNA engineering using recombination in E. coli. Nat. Genet. Vol. 20:123-8). 간단히 설명하면, KO 벡터는 IL-22RA 유전자의 1.8kb의 5' 아암 (짧은 아암), IRES-LacZ/MC1neo 선택가능한 마커, 및 10Kb의 3' 아암 (긴 아암)을 함유한다. KO 벡터에서 IL-22RA 게놈 서열의 엑손 2, 3, 및 4뿐만 아니라 인트론 2와 3은 IRES-LacZ/MC1neo 선택가능한 마커에 의해 대체됨으로써 약 4.4kb의 결실이 ES 세포에서의 동종 재조합에 의해 생성되었다.

제한 효소 PmeI으로 KO 벡터를 선형화한 후에 그것을 129/SvJ ES 세포에 일렉트로포레이션하였다. 동종 재조합 사건의 선택과, 재조합 ES 클론의 확인은 문헌에 설명되어 있는 것과 같이 수행하였다 (Robertson, E.J. et al. Tetracarcinomas and Emvryonic Stem Cells: A Practical Approach, 2^nd ed., IRL Press Limited, Oxforf, 1987).

b). IL-22RA 발현이 제거된 마우스의 생성 및 분석

IL-22RA 게놈 유전자좌의 엑손 2-4와 인트론 2-3이 결실된 포지티브 ES 클론을 확장시켰다. 그것들을 C57B1/6j 마우스의 낭포에 주입하였다. 주입된 낭포의 간단한 재-팽창이 있은 후에 그것들을 위-임신한 가짜 어머니에 도입하여 키메라를 생성시켰다. 낭포 주사, 키메라 양육 및 이어지는 돌연변이된 IL-2RA의 생식계열 전달은 문헌에 설명되어 있는 것과 같이 수행하였다 (Robertson, E.J. et al. Tetracarcinomas and Emvryonic Stem Cells: A Practical Approach, 2^nd ed., IRL Press Limited, Oxforf, 1987).

KO 돌연변이 마우스를 PCR 유전자형 분류 스트래티지에 의해 확인하였다. 세 개의 PCR 프라이머, ZC22901 (SEQ ID NO:35), ZC45039 (SEQ ID NO:36), ZC38573 (SEQ ID NO:37)을 야생형 대립형질과 돌연변이 대립형질을 검출하기 위한 다중 PCR 반응에 사용하였다. 야생형 (WT) 대립형질은 길이가 229bp인 DNA를 유발한 반면, 돌연변이 대립형질은 길이가 371bp인 DNA 단편을 생성하였다.

반접합체 마우스의 짝짓기는 정상적인 성 비율뿐만 아니라 정상 비율의 동질접합체 (HOM), 이질접합체 (Het), 및 야생형 (WR) 자손을 낳는다. 마우스를 PhysioScreen (체중, 조직 무게, 완전한 혈액 수 (CBC), 임상 화학, 광택 관찰, 및 조직병리학을 포괄적으로 봄)을 통하여 면밀하게 관찰하였고, HOM, Het, 및 WT 동물들 사이에 외관상의 차이는 없었다.

B. IL-22RA는 IL-22 유도된 SAA 에 필요하였다: SAA ELISA는 IL-22에 의해 유도된 SAA 발현이 IL-22RA 녹아웃 마우스에는 없음을 보여준다:

IL-22RA가 IL-22가 주입된 마우스에서 SAA 유도에 필요한지를 평가하기 위하여, IL-22RA KO 마우스에 5ug의 IL-22를 주입하고, 6시간 후에 출혈시켰다.

혈청 샘플 중의 SAA 수준을 측정하기 위한 ELISA를 마우스 SAA 면역분석 키트 (Biosource International, California)를 사용하여 제조업자의 지시를 따라 1:1000으로 희석된 혈청을 사용하여 수행하였다. 5마리의 WT 마우스 중 4마리에게서 IL-22 주입에 대한 반응으로 상승된 SAA 수준을 볼 수 있었고, 5마리의 HOM IL-22RA KO 마우스 중 4마리는 기본 수준의 SAA를 나타냈다. 시험한 Het IL-22RA KO 마우스는 둘 다 상승된 SAA 수준을 나타냈지만, 상승된 WT 마우스의 SAA 수준보다는 낮았다. 이것은 IL-22RA가 IL-22에 의한 SAA의 유도에 필요하였음을 나타낸다.

이들 결과는 예를 들어 IL-22RA 유전자 녹아웃 또는 유사하게 본 발명의 IL-22RA에 대한 단클론성 항체를 중화하는 것을 통하여 효과적으로 IL-22RA 활성을 차단하는 것이 IL-22-유도된 염증, 예컨대 건선, IBD, 대장염, 내독소증, 또는 IL-22에 유도되는 다른 염증성 질병을 유사하게 감소시킬 것이라는 증거를 제공하였다.

C. IL-22RA는 IL-22 유도된 상피 두꺼워짐에 필요하였다: 피하에 이식된 삼투성 미니-펌프를 통한 IL-22 순수 단백질의 투여는 IL-22R KO 마우스에서 표피의 두꺼워짐을 유발하지 않는다.

IL-22RA가 IL-22 유도된 상피 두꺼워짐에 필요한지를 평가하기 위하여, IL-22를 IL-22RA HOM과 WT KO 마우스에 삼투성 미니-펌프를 통해 피하 투여하였다. 펌프는 IL-22를 18.4μL/일의 속도로 7일 동안 전달하였다. 4마리의 HOM과 6마리의 WT IL-22RA KO 마우스에게 IL-22 단백질을 투여하였고, 3마리의 HOM과 1마리의 WT에게는 PBS를 투여하였다.

IL-22 처리된 마우스로부터의 혈청 샘플을 BaF3 증식 분석으로 시험하여 IL-22의 존재를 확인하였다. IL-22RA 및 CRF2-4로 형질전환된 BaF3 세포는 증식하기 위하여 IL-22 또는 쥐의 IL3를 필요로 한다. 이들 세포를 회전시켰고 mIL-3이 없는 완전배지 (10%의 열-비활성화 우태아 혈청, 2mM의 L-글루타Max-1^TM (Gibco BRL), 1mM의 피루브산 나트륨 (Gibco BRL), 및 PSN 항생물질 (GIBCO BRL)이 첨가된 RPMI 배지 (JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS))(이하 "mIL-3 유리 배지"로 언급함)로 세척하였다. 세포를 회전시키고 3회 세척하여 mIL-3을 완전히 제거하였다. 그런 다음 세포를 혈구 계산기에서 계수하고 96-웰 포맷으로 웰당 5000 세포로, mIL-3 유리 배지를 사용하여 웰당 200㎕의 부피로 플레이트하였다. 웰에 존재하는 마우스 혈청 농도는 1%, 0.55, 0.25% 또는 1.25%였다. 분석 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 3일 동안 인큐베이션하고, 그 후 알라마르 블루 (Accumed, Chicago, IL)를 웰당 20㎕씩 첨가하였다. 플레이트를 다시 37℃, 5% CO₂에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 알라마르 블루는 살아있는 세포 수를 토대로 하여 형광 판독값을 제공하므로, 네거티브 대조표준에 비교하여 세포 증식에 대한 직접적인 척도가 된다. 플레이트를 다시 37℃, 5% CO₂에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 Wallac Victor 2 1420 Multilabel 카운터 (Wallac, Turku, Finland)에서 530 파장 (여기) 및 590 파장 (방출)에서 판독하였다. 그 결과는 PBS 주입된 동물은 어느 것도 IL-22 활성을 나타내지 않았던 반면, HeT 동물 중 1마리, 4마리의 HOM 동물 중 2마리, 그리고 6마리의 WT 동물 중 3마리가 검출가능한 IL-22 활성을 나타냈음을 보여주었다. 이 혈청에 의해 유도된 증식은 1ug/ml의 IL-22BP에 의해 차단되었으며, 이것은 IL-22 특이적임을 증명한다.

IL-22 처리 및 미처리 IL-22RA HOM 및 Het 녹아웃 (KO) 및 WT 대조표준으로부터의 피부 샘플을 10%의 완충된 포르말린에 침지하여 고정시켰다. 조직을 트리밍하고 파라핀에 삽입한 다음, 기본적으로 프로세스처리한 후 5㎛로 절개하고 (Jung 2065 Supercut microtome, LeicaMicrosystems, Wetzlar, Germany) H&E 로 염색하였다. 염색된 조직을 광현미경 (Nikon Eclipse E600, Nikon Inc., Melville, NY)하에서 ACVP 협회 인증된 수의 병리학자에 의해 평가하였다.

각 피부 샘플을 진피의 펌프 이식 부위를 둘러싸고 있는 조직의 염증의 심각성에 대해 0 (없음)부터 4 (심각함)까지, 표피 두꺼워짐 (흑색극세포증)의 정도에 대하여 0 (없음)부터 3 (확산)까지 평가하였고, 상피층의 수를 표피의 가장 두꺼운 부분에서 계수하였다. PBS를 받은 HOM 마우스와 WT 마우스 사이에 차이는 발견되지 않았다. 이들 두 그룹으로부터의 결과를 PBS 그룹에 모아놓았다. 평균과 표준편차를 각 처리 그룹에 대하여 측정하였고, 그 결과를 하기 표 14에 나타낸다.

처리	PBS 대조표준	HOM KO:IL-22	WT:IL-22
마우스의 수	4	4	6
상피 두께	3.5±1.0	3.2±0.5	5.9±2.3
흑색극세포증의 정도	0.5±1.0	0.2±0.5	1.9±1.3
염증	1.5±1.0	1.2±1.0	2.0±1.0

결과는 IL-22에 노출되었을 때 IL-22로 처리된 WT 마우스에서 증가된 상피 두께 및 흑색극세포증 및 IL-22RA HOM 마우스에서 감소된 상피 두께 및 흑색극세포증으로의 경향을 나타냈다.

이들 결과는 예를 들어 IL-22RA 유전자 녹아웃 또는 유사하게 본 발명의 IL-22RA에 대한 단클론성 항체를 중화하는 것을 통하여 효과적으로 IL-22RA 활성을 차단하는 것이 IL-22-유도된 염증, 예컨대 건선, IBD, 대장염, 내독소증, 또는 IL-22에 유도되는 다른 염증성 질병을 유사하게 감소시킬 것이라는 증거를 제공하였다.

D. IL-22RA는 신생 새끼 피부의 IL-20 유도된 번질거림에 필요하였다: 쥐 IL-20을 발현하는 유전자도입 마우스의 IL-22RA KO 마우스와의 잡종은 반질거리지 않는 유전자도입 새끼를 낳는다

IL-22RA가 신생 TG 새끼의 IL-20 유도된 반질거림에 필요한지를 평가하기 위하여, K14 muIL-20 트랜스유전자를 IL-22RA KO 생식 계열에 교차시키고, 신생아들을 반질거리는 표현형에 대하여 관찰하였다.

69마리의 새끼가 멘델의 유전형 비율에 따라 태어났다. Het KO 배경의 모든 TG는 반질거린 반면, HOM KO 배경의 비-TG중 어느 것이든 TG든 반질거리지 않았다.

IL-20RA 및 IL-20RB를 발현하는 BaF3 세포를 사용하여 알라마르 블루 증식 분석을 수행함으로써 마우스 혈청 중의 IL-20의 존재를 평가하였다. 이들 세포는 IL-20 또는 쥐의 IL3에 대한 반응으로 증식할 것이다. 과정은 상기 C 단원에서 설명한 것과 같다. 분석 결과는 모든 TG 마우스들이 비교할만한 IL-20 활성을 가지고 있으며, 그것은 C57BL/6N 바탕값에 대해 IL-20 TG와 동일한 수준임을 나타냈다. 어떠한 반질거림도 없는 신생아 표현형은 신생아의 피부 표현형이 IL-22RA의 존재에 의존적임을 가리킨다.

산후 3일째에 IL-22RA KO 배경의 K14 muIL-20 TG를 함유하는 한배 새끼들을 안락사하고, 전체 혈액을 10% 완충 포르말린에 침지 고정시켰다. 고정된 조직을 트리밍하고 파라핀에 삽입한 다음, 기본적으로 프로세스처리한 후 5㎛로 절개하고 (Jung 2065 Supercut microtome, LeicaMicrosystems, Wetzlar, Germany) H&E 로 염색하였다. 염색된 조직을 광현미경 (Nikon Eclipse E600, Nikon Inc., Melville, NY)하에서 ACVP 협회 인증된 수의 병리학자에 의해 맹검 방식으로 평가하였다. 조직 비정상을 주지하였고, 등쪽의 흉부 정면의 표피의 상피층의 수를 계수하였다.

HOM IL-22RA KO 배경의 세 마리의 IL-20 TG (IL-20 TG/IL-22RA KO HOM)로부터의 조직과 IL-22RA HOM KO 배경의 3마리의 비-TG (비-TG/IL-22RA KO HOM) 마우스를 현미경으로 조사하였고, 비정상을 함유하지 않은 것으로 나타났다. 2마리의 Het IL-22RA KO 배경의 IL-20 TG (IL-20 TG/IL-22RA KO Het) 마우스를 또한 조사하였다. 표피의 상피층의 수는 모든 동물에서 비슷하였다. 그러나 2마리의 IL-20 TG/IL-22RA KO Het 마우스의 표피는 다른 동물과 비교했을 때 과민하게 호산성이었고, 과립층의 과립성이 사라진 것으로 나타났다. 어떠한 마우스에서도 피부나 다른 조직에서 다른 비정상은 주지되지 않았다.

이들 결과는, 예를 들면 IL-22RA 유전자 녹아웃 또는 유사하게 본 발명의 IL-22RA에 대한 단클론성 항체를 중화하는 것을 통하여 IL-22RA 활성을 효과적으로 차단하는 것이, 예를 들면 건선, IBD, 대장염, 또는 IL-20, 및 또는 IL-22에 의해 유도된 다른 염증성 질병, 이를테면 IBD, 관절염, 천식, 건선성 관절염, 대장염, 염증성 피부 질환, 및 아토피성 피부염에서 IL-20-유도된 피부 효과뿐만 아니라 IL-22-유도된 피부 효과를 감소시킬 것이라는 증거를 제공한다.

실시예 33

IL-22RA 녹아웃 마우스의 조직형태계측 영상 분석

k14 IL-20 m 유전자도입 (TG) 마우스의 라인을 수립하였고, TG 신생아는 반질거리는 표현형을 나타낸다. 트랜스유전자는 피부에서 케라틴 생성 세포에 대한 발현을 지시하는 k14 프로모터에 의해 발현된다. IL-22RA 녹아웃 (KO) 마우스의 라인을 또한 수힙하였고, 도전받지 않은 마우스에서는 유의할만한 변화가 관찰되지 않았다. 두 라인을 함께 교배하고, 다음의 4가지 상이한 유전자형을 가지는 신생아를 수집하였다: (1) TG-HOM: 배경으로는 k14 IL-20 m 트랜스유전자를 발현하지만 IL-22RA를 발현하지 않음; (2) TG/-Het: 배경으로는 k14 IL-20 m 트랜스유전자를 발현하며, IL-22RA 유전자의 한 복사물로부터 약간의 IL-22RA를 발현한다; (3) WT/HOM: 배경으로 k14 IL-20 m 트랜스유전자를 발현하지 않으며, IL-22RA를 발현하지 않음; (4) WT/Het: 배경으로 k14 IL-20 m 트랜스유전자를 발현하지 않으며, IL-22RA 유전자의 한 복사물로부터 약간의 IL-22RA를 발현함. 이들 다양한 유전형을 가지는 34마리의 신생 새끼를 대략 산후 48시간인 제3일에 안락사시켰다 (표 15):

	TG/-HOM* (그룹 1)	TG/-Het* (그룹 2)	WT/HOM* (그룹 3)	WT/Het* (그룹 4)
총	n=10	n=10	n=9	n=5

TG=유전자도입 ; WT=야생형 ; HOM=동질접합체 ; Het=이질접합체 ; 및 n=새끼들의 수.

각 새끼를 신체 전체를 통하여 세 부분 (두개골쪽 흉부, 미골쪽 흉부, 및 복부)으로 가로로 자르고 머리는 폐기하였다. 두께가 4.0 내지 5.0mm인 조직 표본을 10% 중성 완충된 포르말린에 고정시키고, 파라핀 블록으로 프로세스한 다음 헤마토크실린과 에오신 (H&E)으로 염색하여 조직학적 조사 및 조직형태계측 영상을 분석하였다. 각 조직 샘플의 척수의 등쪽 영역으로부터의 표피를 선택하여, Olympus BH-2 현미경, 비디오 카메라 (Dage-MTI, Michigan City, IN) 및 BioQuant True Color 윈도우 98 소프트웨어 (R&M Biometrics, Inc. Nashville, TN 37209)를 사용하여 다음 세팅으로 조직형태계측 영상을 분석하였다: 매개변수: mag. 10X, Z 오프 셋 0; 배열: 길이 ( m); 측정: 수동 및 부가 방식. 각 피부 샘플로부터 표피 및 각질층 또는 각질화된 층의 두께 ( m)를 개별적으로 10회 측정하였고, 각 측정 사이에 간격은 약 0.1mm였으며, 각각 10x 현미경 필드로 측정하고, 평균값, SD 및 SEM을 엑셀 계산에 의해 얻었다. 모든 절편을 랜덤화하고 맹검 방식으로 측정하였다. 측정 후, 절편을 분별하고, 그 결과를 처리 그룹과 매치시켰다. 처리 그룹에 의한 최종 결과를 다음과 같이 분류하였다: 1. 두개골쪽 흉부, 미골쪽 흉부 및 복부의 평균 표피 두께 ( m), 및 (a) 두개골쪽 흉부의 평균 표피 두께; (b) 미골쪽 흉부의 평균 표피 두께; 및 (c) 복부의 평균 표피 두께로 하위-분류한다. 2. 두개골쪽 흉부, 미골쪽 흉부 및 복부의 각질층의 평균 두께 (㎛), 및 (a) 두개골쪽 흉부의 각질층의 평균 두께; (b) 미골쪽 흉부의 각질층의 평균 두께; 및 (c) 복부의 각질층의 평균 두께로 하위-분류한다. 3. 두개골쪽 흉부, 미골쪽 흉부 및 복부의 표피와 각질층의 평균 두께. 그 결과의 데이터를 GraphPad InStat 소프트웨어 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA 92121)를 사용하여 분석하였다. 변화에 대한 원-웨이 분석 (ANOVA)을 적용하여 그룹 1부터 그룹 4의 평균 값의 차이의 통계학적 유의성을 조사하였다. Tukey-Kramer Multiple Comparisons Test를 사용하여 두 그룹 간의 평균값의 통계학적 차이를 측정하였다 (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001). 관찰 결과 P<0.05인 것을 중요한 것으로 간주하였다.

(1) 조직형태계측 결과

(a) 두개골쪽 흉부, 미골쪽 흉부 및 복부의 평균 표피 두께 (㎛)

표피 두께는 각각 IL-22RA 유전자의 한 복사물이 부족한 IL-20 유전자도입 새끼 (TG/-Het) 대 IL-22RA를 발현하지 않는 IL-20 유전자도입 새끼 (TG/-HOM, P=0.001***) 및 대 대조 한배 새끼 (WT/HOM, P=O.OO1*** 및 WT/Het, P=0.001***)에서 상당히 증가하였다 (표 16). TG/-Het 새끼는 아마도 케라틴생성세포 이상 발달로 인하여 케라틴화되지 않은 표피의 두께가 증가되는 것으로 나타났다. 이 증가는 세 개의 케라틴화되지 않은 층 (기저층, 유극층, 및 과립층)을 모두 포함하지만, 가장 영향을 받는 것은 유극층이다. TG/-Het 새끼의 표피는 두께가 약 25% 증가하였고, 유극층이 두드러지게 되었다. 반면에 TG/-HOM 새끼의 표피는 대조표준 (WT/HOM 및 WT/Het)보다 약간 더 두꺼웠으며, 통계학적 결과는 그룹들 사이에 유의할만한 차이가 없었음을 나타냈다 (P>0.05). 두개골쪽 흉부, 미골쪽 흉부 및 복부의 표피 두께를 또한 비교하였다. 정상적으로 얇은 복부의 표피는 미골쪽 흉부보다 두껍고, 미골쪽 흉부는 두개골쪽 흉부보다 더 두껍다 (표 16).

	TG/-HOM (N=28)	TG/-Het (N=30)	WT/HOM (N=27)	WT/Het (N=15)
평균	32.58±1.25	41.05±2.04	31.31±1.08	30.83±1.43

결과는 평균값±SEM을 나타낸다. N=측정한 절편의 수.

TG/-Het 새끼로부터의 두개골쪽 흉부의 피부의 비늘모양의 상피는 상피 세포 (케라틴생성세포)의 이상 발달에 의해 수반되는 두께의 증가를 나타냈다; 그러나 다른 그룹, TG/-HOM, WT/HOM 및 WT/Het과 비교하여 통계학적 차이는 없었다 (P=0.1565, 표 17). 이것은 조직학적 인공물로부터의 결과, 예컨대 절편-대-절편 가변성, 표피 본연의 구조의 결과인 것 같고, 또는 두개골쪽 흉부의 얇은 피부에서는 큰 영향이 없었다. 주: 두개골쪽 흉부의 조직학 과정 또는 조직 절편은 통계학적 유의성을 얻기 위한 조직형태계측 분석을 무력하게 만들 것이다.

	TG/-HOM (N=10)	TG/-Het (N=10)	WT/HOM (N=9)	WT/Het (N=5)
평균	29.18±1.24	33.20±2.24	27.28±0.62	29.38±1.77

결과는 평균값±SEM을 나타낸다. N=측정한 절편의 수.

IL-22RA 유전자 (Het)의 한 복사물을 포함한 IL-20 (TG/-)는 각각 TG/-HOM (P<0.05*), WT/HOM (P<0.001***), 및 WT/Het (P<0.01*)과 비교하여 표피 두께의 평균 값이 증가한 것으로 나타났다 (표 18). TG/-Het 표피는 WT/Het의 그것보다 약 29% 증가하였다. IL-22RA (HOM)이 없는 IL-20 (TG/-)의 표현형은 부분적으로는 대조 한배 새끼 (WT/HOM 및 WT/Het)의 그것보다 더 두꺼운 표피와 관련된 IL-22RA 유전자 (Het)의 한 복사물이 없는 새끼의 그것과 닮았지만, 대조표준과 비교하여 통계학적인 차이는 증명되지 않았다 (P>0.05). TG/-HOM 표피는 WT/HOM의 그것보다 약 14% 증가하였다. IL-20 TG/- 새끼들과는 달리, IL-2RAm 수용체-결핍 새끼 (WT/HOM 및 WT/Het)는 상대적으로 얇은 표피 두께를 가지고 있는 것으로 나타났다. 두드러진 것은 미골쪽 흉부의 표피 두께의 조직형태계측 결과가 두개골쪽 흉부, 미골쪽 흉부 및 복부의 평균 표피 두께와 상관관계가 있는 일치되는 발견이었고 (표 15), 그것은 미골쪽 흉부의 조직학적 과정과 조직 절편이 조직형태계측 영상 분석을 위해 가장 좋은 품질로 수행되었음을 나타냈다.

	TG/-HOM (N=10)	TG/-Het (N=10)	WT/HOM (N=9)	WT/Het (N=5)
평균	35.91±1.37	43.79±2.35	30.83±1.86	30.94±2.83

결과는 평균값±SEM을 나타낸다. N=측정한 절편의 수.

복부의 평균 표피 두께의 결과 (표 19)는 TG/-HOM이 대조 한배 새끼 (WT/HOM 및 WT/Het, P>0.05)와 비교하여 차이가 없었다는 것을 제외하면 미골쪽 흉부의 그것 (표 18)과 유사하였다. 조직 절편에는 약간의 변화가 있었고 또한 두 개의 절편이 빠져있었다. 즉 TG/-HOM 그룹에서 등쪽 영역을 담당하는 표피가 없었다.

	TG/-HOM (N=8)	TG/-Het (N=10)	WT/HOM (N=9)	WT/Het (N=5)
평균	32.35±1.44	46.33±3.10	35.81±1.90	32.16±2.97

결과는 평균값±SEM을 나타낸다. N=측정한 절편의 수.

(b) 두개골쪽 흉부, 미골쪽 흉부 및 복부의 각질층의 평균 두께 (㎛)

IL-22RA를 발현하지 않거나 (HOM) 유전자의 한 복사물을 발현하지 않는 (Het) 배경에 대해 IL-20 유전자도입 새끼 (TG/-)의 표피 두께가 증가했음에도 불구하고, 우세한 각질층 또는 각질화된 층 두께의 감소가 대조 한배 새끼 (WT/HOM 및 WT/Het)에 비교하여 TG/-HOM 및 TG/-Het 피부에서 관찰되었고, 통계학은 그룹들 중에서 매우 중요한 것으로 나타났다 (P<0.0001****, 표 20). TG/-Het 새끼들은 각각 TG/-HOM (P<0.01*), WT/HOM (P<0.001***), 및 WT/Het (P<0.001***)과 비교하여 표피의 표면에 약 36%, 50% 및 49%의 감소된 케라틴 양을 나타냈다. TG/-HOM 새끼들은 그것의 대조표준 (WT/HOM, P<0.05*)과 비교하여 각질층 두께가 약 22% 정도 상당히 감소한 것으로 나타났고, WT/Het에 대해서는 단지 17%의 감소를 보였으며, 그것은 통계학적으로 중요하지 않다 (P>0.05). 대조 새끼들, WT/HOM 및 WT/Het의 각질층의 두께는 거의 동일하였다. 외관상으로는 미골쪽 흉부의 각질이 복부의 그것보다 더 두껍고, 복부는 두개골쪽 흉부보다 더 두껍다.

	TG/-HOM (N=8)	TG/-Het (N=10)	WT/HOM (N=9)	WT/Het (N=5)
평균	33.26±2.69	21.41±1.27	42.54±2.01	40.31±3.82

결과는 평균값±SEM을 나타낸다. N=측정한 절편의 수.

두개골쪽 흉부의 각질층의 평균 두께 (표 21)는 두개골쪽 흉부, 미골쪽 흉부 및 복부의 그것 (표 20)을 닮았지만, 각질층의 상당한 감소는 오직 TG/-Het에서만 발견되고, 그에 반해 각각 TG/-HOM (P<0.05*) 및 WT/HOM (P<0.01**)이다. 평균의 표준 편차 및 표준 에러는 높은데, 그것은 불량한 절개, 피부 샘플의 생략, 표피의 근본적인 구조, 또는 두개골쪽 흉부에 큰 영향이 없어서일 것이다. 주: 두개골쪽 흉부의 조직학 과정 또는 조직 절편은 통계학적 유의성을 얻기 위한 조직형태계측 분석을 무력하게 만들 것이다.

	TG/-HOM (N=28)	TG/-Het (N=30)	WT/HOM (N=26)	WT/Het (N=14)
평균	34.96±3.53	18.14±3.99	40.47±4.38	32.96±8.11

결과는 평균값±SEM을 나타낸다. N=측정한 절편의 수.

미골쪽 흉부의 각질층의 평균 두께의 결과 (표 22)는 두개골쪽 흉부, 미골쪽 흉부 및 복부의 그것과 유사하지만 3가지의 예외가 있다: (1) TG/-HOM 대 TG/-Het 및 TG/-HOM 대 WT/HOM은 통계학적 차이를 나타내지 않았다 (P>0.05); (2) TG/-HOM 대 WT/Het는 상당한 차이를 나타냈다 (P<0.01**); (3) WT/Het의 각질층은 현저하게 두꺼워졌는데, 그것은 조직 프로세싱 인공물의 결과, 예컨대 그것이 저삼투 용액에 놓이거나 수조에 오랫동안 들어가 있을 때 팽윤 또는 팽창되는 케라틴의 결과일 것이다.

	TG/-HOM (N=10)	TG/-Het (N=10)	WT/HOM (N=8)	WT/Het (N=4)
평균	35.64±3.4	24.22±1.54	44.35±3.51	53.77±7.21

결과는 평균값±SEM을 나타낸다. N=측정한 절편의 수.

오직 TG/-HOM 대 WT/HOM 및 TG/-Het 대 WT/HOM만이 통계학적으로 상당한 차이를 나타냈고, 각각 P<0.05* 및 P<0.001***이다 (표 23). TG/- 새끼들은 그것의 대조 한배 새끼들 (WT/HOM 및 WT/Het)과 비교하여 복부의 각질층의 두께가 감소하였다.

	TG/-HOM (N=8)	TG/-Het (N=10)	WT/HOM (N=9)	WT/Het (N=4)
평균	28.84±4.36	21.86±1.30	42.45±3.15	33.25±3.96

결과는 평균값±SEM을 나타낸다. N=측정한 절편의 수.

(c) 두개골쪽 흉부, 미골쪽 흉부 및 복부의 표피와 각질층의 두께 (㎛)

TG/-Het 새끼들은 대조 한배 새끼들 (WT/HOM 및 WT/Het)과 비교하여 표피 두께에 상당한 증가를 나타냈고 각질의 두께는 상당히 감소하였고, TG/-HOM 새끼들은 유사한 결과는 나타냈지만 효과는 최소였다 (표 24).

	TG/-HOM (N=10)	TG/-Het (N=10)	WT/HOM (N=9)	WT/Het (N=4)
각질층	32.58	41.05	31.31	30.83
표피	33.26	21.41	42.54	40.31

결과는 평균값을 나타낸다. N=새끼의 수.

(d) IL-20RA와 IL-22RA 둘 다를 통한 IL-20의 신호화

표피는 세포 증식, 분화, 및 항상성을 향한 죽음 중에서 평형에 의존적인 층화되고, 연속적으로 재생되는 상피이다. 정상적인 표피에서, 유사분열적으로 활성인 기저층은 말단에서 분화하는 케라틴생성세포를 발생시키며, 그것은 바깥쪽으로 이동하여 궁극적으로는 피부 표면으로부터 각질층에 있는 핵이 없는 비늘, 케라틴 또는 각질화된 층으로서 떨어져 나간다. 많은 단백질이 표피 항상성을 유지하는 데 작용하는 것으로 알려져 있지만, 이들 사건의 분자상의 조정에 대해서는 거의 알려진 바 없다. IL-20은 새로운 수용체-상호작용 단백질이며, 그것은 케라틴생성세포의 증식과 관련된 피부 층에 발현된 IL-20RA 또는 IL-22RA 수용체 (IL-22RA)중 하나를 통하여 신호를 보낸다. IL-20 유전자도입 신생아들은 비정상적인 두꺼워지고 반질거리는 피부 표현형을 나타낸다. 마우스에서 IL-22RAm(HOM) 결핍은 IL-22 처리에 반응을 나타내지 않는 한편, IL-22RA 유전자가 있고 IL-22로 처리된 야생형 마우스들은 표피 두께가 상당히 증가한 것으로 증명되었다 (P<0.001***, IL-22RAm KO/IL-22 조직형태계측 영상 분석의 결과, PID 59.2 참조). IL-22RA의 부재가 K14 IL-20m TG 신생아에서 관찰된 반질거리는 표현형에 어떤 영향을 미치는 지를 연구하기 위하여, 정규 장소 외에서 IL-20을 발현하는 유전자도입 마우스를 IL-22RA 동질접합체 (HOM) 또는 IL-22RA 이질접합체 (Het) 결핍 마우스와 짝을 지었다. 표피 두께에 대한 정량적인 영상 분석을 소수의 새끼들에 대하여 이 연구로부터 미골쪽 흉부에서 수행하였지만 (즉 19마리 새끼, 새끼당 1개의 절편, 총 19개 절편), 연구된 동물의 제한된 수 및 그룹 내에서의 변화로 인해 통계학적인 유의성은 얻지 못하였다. 본 연구의 목적은 IL-20의 생물학을 탐색하고 믿을만한 정량적 결과를 얻기 위하여 동일한 연구의 각 새끼로부터 두개골쪽 흉부, 미골쪽 흉부 및 복부의 보다 많은 피부 샘플을 (즉 34마리, 한 마리당 3 절편, 총 102 절편) 조직형태계측적으로 정량하는 것이었다. 효과적인 영상 분석을 위하여 본 발명자들은 파라핀 블록에 있는 피부의 방향이 일치하도록 했고 피부 샘플을 모든 개별적이거나 그룹의 새끼들에서 동일한 각각의 위치로부터 측정하였다. 두 종류의 측정을 수행하였다: (1) 케라틴생성세포 증식 및 분화를 중재하는 데 IL-20의 역할을 조사하기 위하여, 표피의 두께를 각 피부 샘플의 10x 현미경 필드마다 각각 척수의 등쪽에서 10회 측정하였다; (2) 각질화된 층 또는 각질층의 두께를 동일한 방식으로 측정하여 IL-20 TG 신생아에서 반질거리는 피부 외관을 나타내는 결과와의 상관관계를 조사하였다.

표피 두께에 대한 조직형태계측 영상 분석 결과, 배경으로 k14 IL-20m 트랜스유전자를 발현하고 IL-22RA 유전자의 한 복사물로부터 약간의 IL-22RA를 발현하는 TG/-Het 신생아는 두꺼워진 표피를 나타냈고, 배경으로 k14 IL-20m 트랜스유전자를 발현하지만 IL-22RA를 발현하지 못하는 TG/-HOM 신생아들은 유의할만한 변화가 없었다. 표피 두께는 IL-22RA 유전자의 한 복사물이 없는 IL-20 유전자도입 새끼 (TG/-Het) 대 IL-22RA 유전자의 두 복사물이 없는 IL-20 유전자도입 새끼 (TG/-HOM, P=0.001***) 대 대조 한배 새끼 (WT/HOM, P=0.001*** 및 WT/Het, P=0.001***)로 증가하였다. TG/-Het 새끼는 주로 유극층의 케라틴생성세포의 이상 발달로 인하여 비-케라틴화된 표피의 두께가 증가한 것으로 나타났다. TG/-Het 새끼의 표피는 두께가 약 25% 증가한 반면, TG/-HOM 새끼의 표피는 대조표준 (WT/HOM 및 WT/Het)보다 아주 약간, 약 4-5% 정도 두꺼워졌으며, TG/- HOM과 그것의 대조표준인 WT/HOM 사이에 유의할만한 통계학적 차이는 없었다 (P>0.05).

각질층의 조직형태계측 결과는 TG/-Het 신생아에서 표피가 두꺼워짐에도 불구하고, 케라틴 또는 각질화된 층의 현저한 감소가 대조 한배 새끼들 (WT/HOM 및 WT/Het)보다 TG/-HOM 및 TG/-Het 피부에서 관찰되었고, 통계학은 그룹들 중에서도 매우 유의할만하였음을 나타냈다 (P<0.0001****). TG/-Het 새끼들은 각각 TG/-HOM (P<0.01**), WT/HOM (P<0.001***), 및 WT/Het (P<0.001***)과 비교하여 표피의 표면에 약 30%, 50% 및 49%의 감소된 케라틴 양을 나타냈다. TG/-HOM 새끼들은 그것의 대조표준 (WT/HOM, P<0.05*)과 비교하여 각질층 두께가 약 22%로 상당히 감소한 것으로 나타났고, WT/Het에 대해서는 단지 17%의 감소를 보였으며, 그것은 통계학적으로 중요하지 않다 (P>0.05). 대조 새끼, WT/HOM 및 WT/Het의 각질층의 두께는 거의 동일하였다. TG/-HOM과 TG/-Het 신생아에서 각질층의 평균 두께는 낭(sac)에서의 총 발견과 상관관계가 있는 것 같으며, 총 수준에서 IL-20 (TG)/IL-22RA (Het) 신생아는 소위 광택인 반질거림이 적어진 것 (예컨대 적어진 케라틴)으로 나타난 반면, IL-20 (TG)/IL-22RA (HOM) 신생아는 반질거리지 않았다 (예컨대 더 많은 케라틴). 조직학적으로 TG/- 새끼에서 각질층의 케라틴은 WT 새끼의 그것보다 더 조밀한 것으로 여겨진다. 이상 발달한 케라틴생성세포와 관련된 두꺼워진 표피는 IL-20 유전자도입 신생아의 각질층의 얇은 층과 함께 왜 그것들이 반질거리는 피부 표현형을 나타냈는지에 대한 설명이 될 것이다.

증가된 이상 발달 및 동요된 케라틴생성세포의 말단 분화는 IL-22RA 유전자의 한 복사물이 표적이 되어 녹아웃된 (Het) IL-20 유전자도입 신생아에게서 관찰되었다. 피부는 케라틴생성세포의 이상 발달을 나타냈지만, 케라틴 또는 각질층의 부족으로 완전히 분화하는 데에는 실패하였다. IL-22RA 유전자의 두 개의 복사물이 파괴된 (HOM) IL-20 유전자도입 신생아는 TG/-Het 피부와 닮았지만 덜 또는 최소 효과를 나타내는 표현형을 나타냈다 (도 12-15). IL-22RA (HOM)의 부재가 K14 IL-20m TG에서 관찰된 반질거리는 표현형에 부분적으로 영향을 미쳤고, IL-22RA(Het)의 부재가 반질거리는 표현형에 최소 효과를 미치거나 또는 전혀 효과를 미치지 못하는 것 같다. 달리 표현하자면, IL-20의 신호화, 즉 IL-20RA 또는 IL-22RA 수용체 (IL-22RA) 중 어느 하나를 통하여 신호를 보내는 신규한 수용체-상호작용 단백질은 아마도 IL-22RA 유전자의 한 복사물의 발현의 결핍 (Het)에 의해서는 방해되지 않지만 IL-22RA 유전자의 두 복사물의 발현의 결핍 (HOM)에 의해서는 부분적으로 방해된다.

이들 결과는 예를 들면 IL-22RA 유전자 녹아웃 또는 유사하게 본 발명의 IL-22RA에 대한 단클론성 항체를 중화하는 것을 통하여 IL-22RA 활성을 효과적으로 차단하는 것이, 예를 들면 건선, IBD, 대장염, 또는 IL-20, 및 또는 IL-22에 의해 유도된 다른 염증성 질병에서 IL-20-유도된 피부 효과뿐만 아니라 IL-22-유도된 피부 효과를 감소시킬 것이라는 증거를 제공한다.

실시예 34

IL-22RA 녹아웃 마우스에 미치는 IL-22의 효과

23마리의 IL-22RA KO (HOM) 및 13마리의 대조표준 (WT)을 포함하는 36마리의 마우스를 이식된 미니펌프 또는 튜브가 달린 미니펌프에 의해 IL-22 또는 PBS를 피하로 투여함으로써 처리하였다 (표 25):

	HOM/PBS (그룹 1)	HOM/IL-22 (그룹 2)	WT/PBS (그룹 3)	WT/IL-22 (그룹 4)
수컷	n=3	n=10	n=3	n=8
암컷	n=0	n=10	n=0	n=2
총	n=3	n=20	n=3	n=10

각 동물의 펌프 이식 부위로부터 길이가 1.5-2.5cm이고 두께가 4.0-5.0mm인 피부 샘플을 얻어서 기본적인 조직학적 조사와 조직형태계측 영상 분석을 하였다. 모든 조직 표본을 10% 중성 완충된 포르말린에 고정시키고 파라핀 블록으로 프로세스하였다. 두께가 5um이고 전체 표면을 덮는 상피와 인접한 절편과의 간격이 10um인 6개의 졀편을 동물마다 각 피부 샘플로부터 얻어서 헤마토크실린과 에오신 (H&E)으로 염색하였다. 피부 샘플의 조직형태계측 영상 분석은 Olympus BH-2 현미경, 비디오 카메라 (Dage-MTI, Michigan City, IN) 및 BioQuant True Color 윈도우 98 소프트웨어 (R&M Biometrics, Inc. Nashville, TN 37209)를 사용하여 다음 세팅으로 수행하였다: 매개변수: mag. 10X, Z 오프 셋 0; 배열: 길이 (um); 측정: 수동 및 부가 방식. 표피의 두께(um)는 각 피부 절편의 중심 0.4cm로부터 코착된 총 4 필드로부터 각 10x 현미경 필드에서 5회 측정하였다 (예컨대 하나의 10x 현미경 필드=0.1cm 및 4개의 10x 현미경 필드=0.4cm). 각 동물로부터 총 6개의 절편을 측정하였고, 평균값, SD 및 SEM을 엑셀 계산에 의해 얻었다. 모든 절편을 랜덤화하고 맹검 방식으로 측정하였다. 측정 후, 절편을 분별하고, 그 결과를 처리 그룹과 매치시켰다. 처리 그룹에 의한 최종 결과를 다음과 같이 분류하였다: 1. HOM 및 WT 수컷과 암컷 마우스로부터의 표피 두께. 2. HOM 및 WT 수컷 마우스로부터의 표피 두께. 그 결과의 데이터를 GraphPad InStat 소프트웨어 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA 92121)를 사용하여 분석하였다. 변화의 원-웨이 분석 (ANOVA)을 적용하여 그룹 1부터 그룹 4까지의 평균값의 차이의 통계학적 유의성을 조사하였다. Tukey-Kramer 다중 비교 시험과 잘못된 쌍-T 시험을 적용하여 두 그룹간의 평균값의 유의성을 분석하였다. P<0.05의 관찰을 중요한 것으로 간주하였다.

III. 조직형태계측 결과

(1) HOM 및 WT 수컷과 암컷 마우스로부터의 표피 두께 (㎛)

표피 두께는 WT/PBS 대조표준에 비해 IL-22 (WT/IL-22)로 처리한 WT 마우스 피부에서 상당히 증가하였다 (P=0.0001). IL-22로 처리된 IL-22RAm KO 마우스 피부 (HOM/IL-22)는 HOM/PBS 대조표준과 비교하여 표피 두께의 평균값이 증가하였지만, 통계학적으로는 두 그룹간에 유의할만한 차이가 없는 것으로 나타났다 (P>0.05). 표피 두께의 현저한 감소를 WT 마우스와 비교하여 IL-22RA KO 마우스에서 관찰하였다 (예컨대 HOM/IL-22 대 WT/IL-22: P<0.001)(표 26)

	HOM/PBS (N=3)	HOM/IL-22 (N=19)	WT/PBS (N=3)	WT/IL-22 (N=10)
평균	14.15±0.19	19.01±1.03	23.34±5.49	43.08±1.85

결과는 평균값±SEM을 나타낸다. N=동물의 수.

(2) HOM 과 WT 수컷 마우스로부터의 표피 두께 (㎛)

IL-22로 처리한 WT 수컷 마우스 피부 (WT/IL-22)의 표피 두께는 WT/PBS 수컷 마우스와 비교했을 때 약 2배 증가하였지만 (P=0.0001), IL-22로 처리된 IL-22RAm KO 수컷 마우스 (HOM/IL-22)의 표피는 HOM/PBS 수컷 대조표준과 비교했을 때 단지 약간 증가하였다 (P>0.05). 두드러지게는, IL-22RAm KO 마우스는 그것의 대조표준인 WT 수컷 마우스와 비교했을 때 표피 두께의 현저한 감소가 나타났다 (예컨대 HOM/PBS 대 WT/PBS: P<0.05; HOM/IL-22 대 WT/IL-22: P<0.001)(표 27).

	HOM/PBS (N=3)	HOM/IL-22 (N=9)	WT/PBS (N=3)	WT/IL-22 (N=8)
평균	14.15±0.19	15.86±0.75	23.34±5.49	41.41±1.71

결과는 평균값±SEM을 나타낸다.

(3) HOM 및 WT 마우스, 수컷 대 암컷으로부터의 표피 두께 (㎛)

암컷의 표피는 수컷 마우스의 그것보다 더 두꺼운 것으로 나타났다 (예컨대 HOM/IL-22/수컷 대 HOM/IL-2/암컷: P<0.01; WT/IL-22/수컷 대 WT/IL-22/암컷: P<0.05)(표 28).

	HOM/IL-22 (수컷, N=9)	HOM/IL-22 (암컷, N=10)	WT/IL-22 (수컷, N=8)	WT/IL-22 (암컷, N=2)
평균	15.86±0.75	21.85±1.3	41.41±1.71	49.75±4.82

결과는 평균값±SEM을 나타낸다.

(4) HOM 마우스, IL-22 펌프 대 IL-22 튜브 달린 펌프로부터의 표피 두께 (㎛)

IL-22 펌프 & 튜브로 처리한 IL-22RAm KO (HOM) 마우스로부터의 표피 두께는 펌프만으로 처리한 IL-22RAm KO (HOM) 마우스의 그것보다 더 상당히 두꺼운 것으로 나타났다 (P<0.0001, 잘못된 쌍-T 시험)(표 29).

	HOM w/IL-22 펌프(M=8 & F=2, N=10)	HOM m/IL-22 튜브 달린 펌프(M=2 & F=8, N=10)
평균	15.85±0.65	23.30±1.36

결과는 평균값±SEM을 나타낸다.

M: 수컷; F: 암컷; N: 총 마우스 수.

IV. 토론:

함께 생각해보면, 본 연구의 목적은 IL-22RAm KO 및 WT 마우스 둘 다로부터의 IL-22 처리된 피부의 표피 효과의 특성을 확인하고, 이들 발견을 임상적 표시와 연결짓는 것이다. H&E 염색된 피부 절편에서 표피의 두께를 측정하기 위하여 정량 영상 분석을 수행하였다. 각 동물로부터의 피부 샘플을 조직형태계측적으로 120회 측정하고 (즉 20회/각 절편 X 각 마우스로부터의 6개의 부분 절편=120회), 평균 표피 두께를 엑셀 계산에 의해 얻었다. 조직형태계측 연구 결과 IL-22가 특히 IL-22RA 수용체가 존재하는 WT 마우스에서 표피 두께가 상당히 증가한 것이 증명되었고, IL-22RA 수용체가 없는 IL-22RAm KO (HOM) 마우스에서는 그 효과가 적거나 최소였다 (P>0.05). IL-22 처리된 WT 마우스의 표피 두께는 PBS로 처리된 것보다 약 43% 증가한 반면 (예컨대 ET/PBS, P<0.001), IL-22 처리된 IL-22RAm KO (HOM) 마우스의 표피 두께는 대조표준 (HOM/PBS, P>0.05)과 비교하여 단지 26%만이 증가하였다. IL-22RAm KO 마우스는 WT 마우스와 비교하여 더 얇은 표피를 나타냈다 (P<0.001). 전체적으로, IL-22가 마우스에 미치는 생물학적 효과는 이 인자가 표피 성장 및 증식의 조절에 포함되어있을 것임을 시사한다.

실시예 35

항-사람 IL-20 단클론성 항체 (클론 #262.7.1.3.2.4)의 약리역학

시험 단클론성 항체, 항-사람 IL-20 mAb (클론 #262.7.1.3.2.4)를 1.08mg/mL 농도 (280nM에서의 UV 흡광도로 측정함)로 3mL씩의 분취액으로 3개를 준비하여 -80℃에서 사용할 때까지 보관하였다. 부형제는 1X PBS (50mM NaPO₄, 109mM NaCl), pH 7.3이었다. mAb를 사용 전에 실온에서 해동하고, 분취액 1과 2를 각각 100㎍의 IV 및 50㎍의 SC 투약 그룹에 대해 사용하였다. 분취액 3의 절반을 1X PBS로 1:2로 희석하여 50㎍의 SC 투약 그룹에 대해 사용하고, 나머지 분취액 3의 절반은 1X PBS로 1:10으로 희석하여 10㎍의 SC 투약 그룹에 대해 사용하였다. 암컷 SCID 마우스 (n=96)를 Charles River Labs로부터 제공받았다. 동물들의 건강을 도착시 체크하고 그룹별로 우리에 넣었다 (우리당 3마리). 마우스는 생후 12주로, 평균 체중은 연구를 시작할 때 22g이었다.

A. 투약 프로토콜

암컷 SCID 마우스 (n=24/투약 그룹)를 무작위로 4개의 투약 그룹으로 나누었다 (표 30 참조). 그룹 1에는 항-huIL-20mAb를 대략 93μL의 IV 주사를 통해 꼬리 정맥에 투여하고, 그룹 2, 3 및 4에는 mAb를 대략 93μL의 SC 주사를 통해 목덜미에 투여하였다.

B. 샘플 수집

혈액을 수집하기 전에 마우스들은 할로에탄 또는 이소플루오란으로 전신 마취시켰다. 혈액 샘플을 168 시간 지점을 제외한 모든 시점에서 심장 스틱을 통해 수집하였다 (눈 출혈을 통해 수집하고 동일한 동물을 504시간 지점에서 다시 심장 스틱을 통해 출혈하였다). 혈액을 혈청 분리 튜브에 수집하고, 15분 동안 응고되도록 놓아두었다. 샘플을 계속해서 3분 동안 14,000rpm에서 원심분리하였다. 원심분리 후에 125 내지 150μL의 분취액을 표지된 에펜도르프 튜브에 나누어 담고 즉시 -80℃에서 분석할 때까지 보관하였다 (표 30).

그룹 번호	투약 (ROA)	동물	PK 시간 점
1	100㎍ (IV)	3마리/시간 점*	0.25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336, 및 504시간
2	100㎍ (SC)	3마리/시간 점*	0.25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336, 및 504시간
3	50㎍ (SC)	3마리/시간 점*	0.25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336, 및 504시간
4	10㎍ (SC)	3마리/시간 점*	0.25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336, 및 504시간

* 동일한 동물을 168 및 504 시간 점에서 사용하였다.

C. ELISA에 의한 혈청의 항- huIL -20 mAb 농도의 정량

약리역학 연구 중에 항-IL-20mAb 267.7.1.3.2.4를 투약한 동물들로부터의 마우스 혈청 샘플을 분석하기 위하여 효소 결합 면역흡착 분석 (ELISA)을 전개하고 정성하였다. 이 분석은 시판중인 이차 항체 및 TMB를 사용한 열량측정 검출의 장점을 취하기 위해 디자인하였다. 표준 곡선을 위해 사용된 희석을 표준 곡선의 선형 부분의 규정을 개선하기 위하여 변형시켰다. 2배 희석을 사용한 100ng/mL 내지 0.231ng/mL 범위의 표준 곡선으로 마우스 혈청 샘플의 정량이 가능하였다. QC 샘플을 10% SCID 마우스 혈청으로 1:100, 1:1000 및 1:10000으로 희석하고, 표준 곡선으로부터 역계산하였다.

D. 약리역학 분석

혈청 농도 대 시간 데이터를 약리역학 분석을 위해 WinNonlin Professional 4.0 소프트웨어 (Pharsight, Inc.; Cary, NC)에 다운로드하였다. 각 시간 점에서 평균 데이터를 기초로 한 약리역학 매개변수를 측정하기 위하여 비구획 분석을 사용하였다.

E. 결과

100㎍의 IV와 100, 50, 및 10㎍의 SC 투여 후에 마우스 혈청 항-huIL-20mAb 농도를 다음 표 31에 나타낸다:

시간(시간)	100㎍ IV 농도(㎍/mL)	10㎍ SC 농도(㎍/mL)	50㎍ SC 농도(㎍/mL)	100㎍ SC 농도(㎍/mL)
0.25	196(12)	LTR	0.101(0.065)	0.481(0.485)
1	154(18)	0.356(0.146)	1.61(0.52)	3.48(1.72)
4	118(20)	2.42(0.53)	10.4(3.4)	19.7(4.7)
8	112(20)	3.41(0.30)	18.9(3.6)	40.2(6.4)
24	103(13)	4.95(0.05)	26.3(0.7)	50.1(6.2)
72	101(16)	4.27(0.79)	21.0(3.4)	43.4(2.7)
168	45.6(15.4)	2.92(0.53)	19.6(2.7)	37.6(3.4)
336	36.4(16.6)	3.60(0.31)	23.5(3.5)	34.4(5.8)
504	28.8(3.8)	2.74(0.39)	20.5(3.6)	25.7(2.1)

LTR: 기록할 수 있는 수치보다 작음

IV 투여 후에 mAb 농도 대 시간 프로필은 2방향으로 기하급수적으로 감소하였음이 증명되었다. SC 투여 후에 mAb는 느리게 흡수되는 상태인 것으로 나타났는데, 제거는 흡수 속도-제한적이었다. 혈청 약리역학 매개변수는 각 시간 지점에서의 평균 데이터를 토대로 표 32에 나타낸다:

매개변수	단위	100㎍ IV	10㎍ SC	50㎍ SC	100㎍ SC
C0(IV);Cmax(SC)	㎍/mL	212	4.95	26.3	50.1
Tmax	시간	N/A	24	24	24
t1 /2, λZ	시간	509	ND	ND	612
AUC(0-t)	시간ㆍ㎍/mL	27059	1730	10845	18110
AUC(0- inf )	시간ㆍ㎍/mL	48269	ND	ND	41561
AUC(% 외삽)	%	43.9	ND	ND	56.4
Vss(IV); VZ/F(SC)	mL	1.34	ND	ND	2.12
Cl(IV); Cl/F(SC)	mL/시간	0.002	ND	ND	0.002
F(생체내 활용성)	%	N/A	ND	ND	86.1

ND: 농도 대 시간 프로필의 말단 제거 상에서의 데이터 부족으로 측정할 수 없음.

IV 투여 후에, mAb는 매우 느리게 제거되고 (Cl=0.002mL/시간) 긴 제거 반감기 (t_{1 /2, λZ} = 약 21일)를 가지는 것으로 증명되었다. mAb는 마우스에서의 혈액 부피 (약 1.7mL)보다 적은 정지-상의 분포 부피 (V_ss=1.3mL)를 나타냈는데, 그것은 mAb가 실질적으로 혈관 구획 밖에는 분포하지 않았음을 시사한다. 역계산 최대 농도 (C₀)는 주사된 용량을 토대로 예상했던 것과 마우스에서의 혈액 부피보다도 높았다. 이것은 작은 V_ss와 함께, mAb가 대부분 혈액의 혈청 분획에 한정될 것임을 시사한다.

SC 투여 후에 Cmax 값은 용량에 따라 선형으로 증가하였다. 100㎍의 SC 투여시에, mAb는 제거되는 데 약 25일이 걸리는 t_{1 /2, λZ}를 나타냈고, IV 투여 후의 그것과 유사한 외관상의 부피 분포를 가진다. 생체내 활용성은 86%였다. 그것보다 낮은 농도의 SC 투여시에는, 대부분의 약리역학 매개변수들은 샘플이 504시간까지 유지되었음에도 불구하고, 측정가능한 말단 제거 상의 부족으로 인하여 평가할 수 없었다. SC 투약 후의 mAb의 흡수는 정지-상에 이르렀고, 연구 기간 내내 제거되었다.

실시예 36

CD4 ⁺ CD45RB ^hi ( CD25 ^- ) 대장염 및 건선 모델에서 IL-20 및 IL-22 길항체

A. 요약

CD4⁺CD45RB^hi 또는 CD4+CD25-T 세포의 동계 SCID 마우스로의 전달은 마우스에서 대장염을 유발한다. 조절 T 세포 (CD4+CD25+ 또는 CD4+CD45RB^lo)의 공동-전달은 이 대장염을 억제한다. CD4+CD25-T 세포를 마우스에 전달한 후에, 마우스에게 추가로 스타필로코쿠스 내독소 B (SEB)를 주사하면, 마우스는 대장염을 발병할 뿐만 아니라 건선도 발병한다. IL-22RA, IL-20, IL-22, IL-20R 및/또는 IL-22R에 대한 항체, 또는 가용성 IL-22RA 수용체를 세포 전달 후 0 내지 21일 후에 투여하고, 대장염 및 건선에 대한 증상을 모니터한다. 건선 스코어 또는 대장염 (조직학)의 억제는 IL-21이 이들 자가면역 질병을 억제할 수 있음을 나타낸다.

B. 연구 디자인

비장과 서혜부의 림프절을 B10.D2 마우스로부터 분리하였다. 단일 세포 현탁액을 형성하고 계수하였다. Miltenyi Bead 시스템을 사용하여, CD25+ 세포를 포지티브 선택에 의하여 분류한다. 세포를 CD25-PE (BD Pharmingen)로 1:100의 희석률로 염색하고 15분 동안 인큐베이션한다. 과잉 항체를 세척으로 제거하고 세포를 10㎕의 항-PE 비즈/10⁶ 세포와 함께 20분 동안 인큐베이션한다. 세포를 PBS로 세척하고 LS 칼럼 (Miltenyi Biotech)을 통과시킨다. 칼럼을 통과한 세포 (CD25-)를 추가의 분석을 위해 보관한다. CD4 풍부 칵테일 (Stem Cell Technologies)을 이들 CD25- 세포에 첨가하고 (1:100) 15분 동안 인큐베이션한다. 세포를 PBS로 세척한다. 항-비오틴 사량체의 1:10 희석액을 세포에 15분에 걸쳐 첨가한 후 자기 콜로이드 (60㎕/10⁶ 세포)를 15분에 걸쳐 첨가한다 (모두 Stem Cell Technologies사 제품). 세포를 네거티브 선택 칼럼 (0.5", Stem Cell Technologies)을 통해 통과시킨다. 통과한 세포는 CD4+CD25- 세포이다. 순도를 유동 혈구계산에 의해 분석한다. 0.4×10⁶ 세포를 투약하지 않은 CB-17 SCID 마우스에 총 부피가 200㎕가 되도록 i.v. 주사한다. 다음날 (d1) 마우스들에게 10㎍의 SEB를 i.p. 주사한다. 건선과 대장염에 대한 증상은 2 내지 5주 후에 나타난다. 마우스들을 건선 질병에 대하여 다음 기준에 따라 기록한다. 0-병변 없음, 1-목에 경미한 병변, 2-목과 등 (대동맥)에 심각한 병변, 3-마우스의 목, 등 및 배에 매우 심각한 병변. 귀의 두께를 또한 질병 심각성의 척도로서 측정한다. 마우스 그룹에 PBS, 100g의 대조 항체 또는 10 내지 100g의 IL-22RA, IL-20, IL-22, IL-20R 또는 IL-22R에 대한 항체, 또는 가용성 IL-22RA를 상이한 투약 요법에 따라 1 내지 30일 동안 i.p 주사한다 (3회/주 또는 2회/주).

C. 결과 및 토론

항체 처리된 마우스에서의 건선 및 대장염의 억제는 IL-20 및/또는 IL-22 기능의 억제가 건선과 대장염에 대한 이 모델에서 자가면역 증상을 억제할 수 있음을 나타낸다.

실시예 37

SCID - hu 이식 건선 모델에서 IL-20, 및 IL-22 길항체

SCID 마우스에 이식된 사람 건선 피부는 그것의 임상적, 광현미경적, 면역조직화학적 건선의 특징을 수주 동안 유지할 수 있다. 이 모델은 병변 조직을 정상적인 표현형으로 복원시키려는 목적을 띈 치료법을 평가하기 위한 시스템을 제공한다. 일단 사람 피부가 성공적으로 이식되면, IL-22RA, IL-20, IL-22, IL-20R 및/또는 IL-22R에 대한 항체, 또는 가용성 IL-22RA 수용체를 수주 동안 투여할 수 있고, 표피 두께를 분석하여 건선에 대해 미치는 이들 항체의 효과를 평가할 수 있다.

B. 연구 디자인

표피 전체와 수 mm의 진피로 구성된 전체 두께가 6mm인 펀치 생검편을 건강한 성인 지원자와 건선 병변이 있는 피부로부터 얻는다. 4 내지 6개의 생검편을 각 공여자로부터 얻는다. 각 공여자로부터의 하나의 펀치 생검편을 수용체인 SCID 마우스 (CB-17, Taconic)의 등 표면에 이식한다. 동물을 병원균이 없는 환경에서 유지시킨다. 치료는 이식이 성공한 후 (이식 후 2 내지 3주) 다음과 같이 개시한다: 한 생검편은 네거티브 대조표준 (PBS 또는 동위원소 mAb)을 위해서, 한 생검편은 포지티브 대조표준 (시클로스포린 A)을 위해, 2-3 생검편은 항-사람 IL-22RA, 항-사람 IL-20, 항-사람 IL-22 mAb 또는 IL-20 또는 IL-22에 대한 가용성 수용체를 사용한 처리를 위한 것이다 (복강내 주사, 일주일에 3회, 2-4주 동안, M-W-F 스케줄을 따름).

C. 정량 분석:

임상적 관찰 및 평가는 전 실험을 통하여 규칙적으로 이루어지고 기록될 것이다. 건선 병변의 심각성을 인상(scaliness), 경결 (induration), 및 홍반에 대하여 맹검 방식으로 평가한다. 매개변수들을 3-점 규모로 기록할 수 있다: 0=피부가 전혀 포함되지 않음; 1=약간 포함됨; 2=중간 정도 포함됨; 3=심각하게 포함됨. 투약 기간이 끝났을 때 각 동물을 안락사하고 조직을 수집하여 조직학 및 IHC를 살핀다. (1) 조직의 일부분을 10% 포르말린에 고정시키고 헤마토크실린과 에오신으로 염색한다. 표피 영역을 NIH 영상 소프트웨어를 사용하여 단위 길이당 표피 두께의 변화의 함수로서 측정한다. 각 이식편으로부터의 다중 영역을 정량하여 높은 n값과 평균 표피 영역을 얻는다. (2) 상부 진피의 고-주파 필드 (0.103×0.135mm)당 염증성 단핵세포의 수; (3) 파라케라토시스(parakeratosis)의 등급은 0부터 3의 임의의 규모로 등급을 매긴다; 0은 파라케라토시스 없음; 1은 절편의 1/3 미만에 파라케라토시스가 있음; 2는 절편의 1/3 이상에 파라케라토시스가 있지만 2/3보다는 적음; 3은 절편의 2/3 이상에 파라케라토시스가 있음. (4) 조직의 나머지를 Ki67 (케라틴생성세포 증식의 마커)로 염색하여 절편의 밀리미터 길이당 Ki67 순환하는 케라틴생성세포의 수를 평가한다. 표피 두께에 의해 측정되는 바와 같은 건선의 심각성의 감소는 IL-20 및 IL-22 기능의 중화가 이 건선 모델에서 이루어질 수 있음을 나타낸다. 건선의 감소된 심각성을 정량하기 위하여, 본 발명자들은 표피 두께, 상부 진피의 염증 세포의 수, Ki67 순환하는 케라틴생성세포의 수, 및 파라케라토시스의 등급을 측정하였다. 대조 마우스에 비하여 처리된 그룹에 대하여 상당히 감소된 4개의 모든 매개변수는 IL-20, IL-22 길항체의 가능한 치료적 용도를 나타낸다.

실시예 38

알라마르 블루 증식 분석을 사용하는 BaF3 /IL-22RA/IL-20 RB 세포를 사용한 IL-20 길항체 활성에 대한 스크리닝

인자-의존성 전-B 셀라인 BaF3를 IL-22RA와 IL-20RB (실시예 3의 방법 참조)로 공동 형질전환하고, 다양한 농도의 IL-20으로 처리하였다. 증식을 실시예 3에서 설명한 바와 같이 알라마르 블루 분석으로 평가하였다. 사이토킨을 제외한 다양한 농도에서 용량-의존 방식으로 IL-20 자극된 증식은 IL-20이 이질성 이량체인 IL-22RA/IL-20RB 수용체를 사이토킨을 제외한 농도에서 결합하고 활성화하는 것을 증명한다. 형질전환되지 않은 BaF3를 함유하는 네거티브 대조표준은 증식하지 않았다.

항-IL-22RA 항체가 IL-20 활성을 길항할 수 있는지를 측정하기 위하여, 상기에서 설명한 분석을 IL-20 활성에 대한 길항체로서 항-IL-22RA 항체를 사용하여 수행하였다. IL-20이 그런 길항체와 결합할 때 IL-20에 대한 반응은 바탕값 수준으로 떨어졌다. IL-20의 증식 효과를 제거 또는 감소시키는 길항체의 존재는 그것이 IL-20 리간드의 길항체라는 것을 증명하는 것이다. 이 분석은 본원에 설명된 IL-20 활성의 다른 길항체, 예컨대 가용성 IL-22RA 수용체를 포함하는 길항체 폴리펩티드를 시험하기 위해서도 사용할 수 있다.

실시예 39

항- hUIL22RA 단클론성 항체에 의한 IL-20 및 IL-22 활성의 중화

실시예 28에서 설명한 세포-기초 중화 분석을 사용하여, 정제된 마우스 항-huIL-22RA 단클론성 항체 (실시예30(D))를 일련의 희석액으로서, 예를 들면 10ug/ml, 5ug/ml, 2.5ug/ml, 1.25ug/ml, 625ng/ml, 313ng/ml, 156ng/ml, 및 78ng/ml에서 첨가하였다. 분석 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 4일 동안 인큐베이션하고, 그 후 알라마르 블루 (Accumed, Chicago, IL)를 20l/웰로 첨가하였다. 플레이트를 다시 37℃, 5% CO₂에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 그 결과는 정제된 항-huIL-22RA 단클론성 항체가 huIL-22RA를 통해 huIL-22 및 IL-20 두 가지의 신호화를 모두 중화시킬 수 있는 것으로 나타났다. 10ug/ml 농도에서 항체는 huIL-22 또는 huIL-20에 의해 유도된 증식을 완전히 중화하였고, 이때 증식의 억제는 더 낮은 농도에서 용량 의존 방식으로 감소한다. 이소타입과 짝을 이룬 네거티브 대조 마우스 mAb는 상술한 농도에서 시험하였을 때 어떤 사이토킨이든지 증식을 억제하지 못하였다. 이들 결과는 나아가 IL-22RA에 대한 단클론성 항체가 전-염증성 리간드, IL-20 및 IL-22의 활성을 낮은 농도에서도 실제로 길항할 수 있음을 증명한다.

이들 결과는 예를 들면 본 발명의 IL-22RA에 대한 단클론성 항체를 중화하는 것을 통하여 IL-22RA 활성을 효과적으로 차단하는 것이, 생체내에서 IL-20 및 IL-22,의 효과를 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 데 유익할 것이고 (단독으로 또는 함께), 아마도 IL-20 및/또는 IL-22-유도된 염증, 예컨대 건선, IBD, 대장염, 또는 IL-20, 및 또는 IL-22에 의해 유도된 다른 염증성 질병, 이를테면 IBD, 관절염, 천식, 건선성 관절염, 대장염, 염증성 피부 질환, 및 아토피성 피부염에서 IL-20-유도된 피부 효과에서 볼 수 있는 것과 같은 염증을 감소시킬 것이라는 증거를 제공한다.

실시예 40

항-IL-22RA 단클론성 항체를 중화를 이용한 임신한 IL-20 및 IL-22 유전자도입 마우스의 치료

쥐 항-마우스 IL-22RA 단클론성 항체 (mAb)의 생체내 중화 활성을 시험하기 위하여, 임신한 IL-20 유전자도입 (TG) 및 IL-22 TG 마우스들에게 항-마우스 IL-22RA mAb로 복강내 주사하였다. 그런 다음 새로 태어난 새끼들을 이들 스트레인의 마우스에게 특징적인 "반질거리는" 피부 표현형의 존재 유무에 대해 평가하였다.

특이하게도 수컷 IL-20 Tg (케라틴-14를 사용하여 생성됨) 또는 IL-22 Tg (인슐린 프로모터를 사용함) 마우스들을 발정기의 C57BL/6N 암컷과 교배하고 교배한 암컷을 다음날 질 플러그의 존재에 의해 확인하였다. 각각의 임신한 암컷을 별도의 우리에 떨어뜨려 놓고 매일 모니터하였다. 처리 그룹은 최소한 4마리의 임신한 암컷을 포함하였기 때문에, Tg 및 비Tg Tg 새끼들의 통계학적 유의성 분석이 가능하였다. 이들 Tg 마우스를 사용한 과거의 경험을 토대로 한배에서 대략 6 내지 8마리 범위로 새끼가 태어나고 이들 중 2 내지 3마리가 Tg+이다.

마우스가 교배한 후 7 내지 9일 후에 (배 나이 7-9; e7-9), 암컷에게 250 내지 500ug의 쥐 항-마우스 IL-22RA mAb (쥐 IgG2a 이소타입)를 200-250ul의 PBS에 넣어 복강내 주사하였다. 짧은 바늘을 사용하여 작은 주사 각도로 주사하여 직접 자궁에 주사하는 것을 피했다. 임신한 암컷에게 이런 방식으로 일주일에 3일 (월요일, 수요일, 및 금요일) 2주 동안 (출산 때까지) 주사하여 성공적으로 배가 발생하는 것을 도왔다. 대조 그룹 (각 4마리 이상의 임신한 암컷 마우스 포함)은 다음과 같다: 이소타입 대조 쥐 IgG2a mAb, 항-사람/마웃, IL-22 mAb (쥐 IgG1 이소타입), 및 이소타입 대조 쥐 IgG1 mAb. 쥐 IL-20의 중화를 위한 대조표준으로서 임신한 암컷에게 사람과 쥐의 IL-20에 결합하고 중화할 수 있는 가용성 IL-20R-Fc4 융합 단백질 또는 Fc4 대조 단백질 중 하나를 주사하였다.

출산 후 1일 내지 2일에 새끼들을 반질거리는 피부 표현형에 대하여 면밀하게 모니터하였다. 제2일에 새끼들을 안락사하고, 꼬리 일부를 수집하여 DNA를 분리하여 각 새끼들의 유전형 (Tg 또는 비Tg)을 측정하였다. 피부 샘플을 수집하여 조직학 분석을 함으로써 새끼들이 이들 Tg 마우스의 일반적인 특징인 두꺼워진 표피 세포층을 나타냈는지를 평가하였다. 대동맥 혈액을 또한 새끼들로부터 수집하여 (또한 출산 후 하루가 지난 어미의 눈을 출혈시켜 샘플을 수집함) ELISA를 통해 각 마우스의 혈청 중의 항-IL-22RA mAb 수준을 정량하였다. 이들 mAb가 생체내에서 IL-20 및/또는 IL-22의 잠재적인 억제제이므로, Tg 새끼들은 정상적인 피부를 가졌다 (즉 표피 두꺼워짐이나 "반질거리는" 외관이 없었다).

실시예 41

기관 배양 건선 모델에서 IL-20 및 IL-22 길항체

사람 건선 플라크 피부는 기관 배양물에서 유지될 수 있으며, 병변 피부의 비정상적인 조직학적 특징은 외인성 성장인자가 없어도 유지된다. IL-22RA, IL-20, IL-22, IL-20R 및/또는 IL-22R에 대한 항체, 또는 가용성 IL-20 또는 IL-22 수용체를 투여할 수 있고, 건선성 병변 피부의 조직학적 특징을 개선할 수 있다.

B. 연구 디자인

표피 전체와 수 mm의 진피로 구성된 전체 두께가 2mm인 펀치 생검편을 건강한 성인 지원자 또는 건선 병변이 있는 피부로부터 얻는다. 즉시 생검에 착수하여, 조직을 케라틴생성세포 기초 배지 (KBM) (Clonetics Inc, Walkersville, MD)로 이루어진 배양 배지에 담근다. 배양 배지에는 CaCl₂가 최종 Ca2⁺ 농도가 1.4mM이 되도록 첨가되어 있다 (Varani et al., 1993, 1994). 그런 다음 생검편을 200ul의 Ca2+ 보충된 KBM을 함유하며 추가로 사람 IL-20, IL-22, IL-22RA에 대한 항체, 또는 IL-20 또는 IL-22의 가용성 수용체로 처리되었거나 처리되지 않은 96-웰 디쉬의 각 웰에서 인큐베이션한다. 배양물을 37℃에서 및 95% 공기 및 5% CO₂의 대기에서 8일 동안 인큐베이션한다.

C. 정량 분석:

인큐베이션이 끝났을 때 조직을 10% 완충된 포르말린에 고정하고, 헤마토크실린과 에오신으로 염색한 후에 조직학적으로 조사하였다. 항체 또는 가용성 수용체에 노출된 건선성 조직의 외관은 정상 조직의 그것을 더 밀접하게 닮아있었고, 다음의 관찰사항도 포함되었다: 초기에 조직파괴되고, 비규칙적인 형상의 기저 상피 세포는 극성이 회복된 보다 원주에 가까운 외관을 나타냈다; 표피 망상의 높은 곳은 주저앉았으며, 더 적은 부분의 상피 세포가 표피 공간으로 팽창되었다; 상부 표피층에는 전체적으로 변질이 적었다. 기관 배양 모델은 특정 화합물이 항-과민증식제로서의 가능성을 가졌는지를 측정하기 위한 신속하고 민감한 수단을 제공한다. 비정상적인 조직학적 특징은 IL-20, IL-22 길항체의 존재하에 개선될 수 있으며, 그것은 건선 치료에 그러한 제제의 효능을 시사하는 것이다.

실시예 42

중화 mAb R2 .1.5F4.1 및 R2 .1.15 E2 .1에 결합하는 mIL22RA ( zCytoR11m ) 영역의 지도화

A. 중화 단클론성 항체가 결합하는 쥐 IL-22RA상의 에피토프

아래에서 설명하는 실험의 목적은 수용체 활성에 중요한, 또는 항체 결합을 길항하거나 중화하는 데 중요한 쥐의 IL-22RA 가용성 수용체 단백질의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:62)의 영역 또는 영역들을 확인하는 것이었다. Fc를 제거하기 위해 트롬빈으로 이미 절단해놓은 쥐의 IL-22RA-Fc 단백질을, 서열의 메티오닌 잔기의 C-말단쪽으로 시아노겐 브로마이드 (CNBr)와의 인큐베이션에 의해 절단하였다. CNBr-생성된 펩티드를 분획화하고, 분획을 결합 활성에 대해 ELISA에 의해 검출되는 바와 같이 시험하고, 중화 성질을 가지고 있는 단클론성 항체, 클론 R2.1.5F4.1 및 R2.1.15E.2.1을 사용한 웨스턴 분석에 의해 반응성을 시험하였다.

CNBr로 절단했을 때 다음의 펩티드를 비-환원 전체-길이의 mIL-22RA로부터 우선적으로 생성하였다 (표 33). 비-환원 조건하에서 시스테인은 이황화-결합을 하고, 그것은 펩티드 1에서의 내부 결합 및 펩티드 3과 5 사이의 결합을 초래할 수 있다. 굵은 활자의 잔기는 실시예 42B에서 설명한 바와 같이 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3의 리간드 결합에 잠재적으로 포함되는 사람 IL-22RA 잔기와 상응하는 리간드에 잠재적으로 포함된다. 구체적으로, SEQ ID NO:48은 SEQ ID NO:42의 아미노산 잔기 16(His)부터 83(Met)에 상응하고; SEQ ID NO:49는 SEQ ID NO:42의 아미노산 잔기 84(Glu)부터 109(Met)에 상응하며; SEQ ID NO:50은 SEQ ID NO:42의 아미노산 잔기 110(Thr)부터 137(Met)에 상응하고; SEQ ID NO:51은 SEQ ID NO:42의 아미노산 잔기 138(Leu)부터 177(Met)에 상응하며; 그리고 SEQ ID NO:52는 SEQ ID NO:42의 아미노산 잔기 163(His)부터 208(Pro) 또는 SEQ ID NO:62의 163(His)부터 212(Arg)에 상응한다.

펩티드 번호	시작	끝	서열
CNBr 펩티드 1	1	68	HTTVDTSGLLQHVKFQSSNFENILTWDGGPASTSDTVYSVEYKKYGERKWLAKAGCQRITQKFCNLTM (SEQ ID No:48)
비-환원: 펩티드 1의 시스테인이 결합됨
CNBr 펩티드 2	69	94	ETRNHTEFYYAKVTAVSAGGPPVTKM (SEQ ID NO:49)
CNBr 펩티드 3	95	122	TDRFSSLQHTTIKPPDVTCIPKVRSIQM (SEQ ID NO:50)
비-환원: 펩티드 3-5가 결합됨
CNBr 펩티드 4	123	162	LVHPTLTPVLSEDGHQLTLEIFHDLFYRLELHVNHTYQM (SEQ ID NO:51)
CNBr 펩티드 5	163	212	HLEGKQREYEFLGLTPDTEFLGSITILTPILSKESAPYVCRVKTLPLVPR (SEQ ID NO:52)

1. CNBr 절단 및 펩티드 분획의 분리

50㎍의 mIL22RA를 동결건조하고 180μL의 포름산(70%)에 재구성하였다. 거기에 아세토니트릴에 녹인 1μL의 5M CNBr을 첨가하였다. 샘플을 혼합하고 18시간 동안 실온에서 반응하도록 어두운 곳에 놓아두었다. 150μL의 반응 혼합물을 분석용 Zorbax SB300-C8 칼럼과 적합한 역-상 HPLC에 의해 분획화하였다. 피크를 25% 아세토니트릴 (0.085% TFA) 및 75% 물 (0.1% TFA)로 시작하여 95% 아세토니트릴 (0.085% TFA) 및 5% 물 (0.1% TFA)로 끝나는 구배를 사용하여 분리하였다. UV 분석 결과 세 개의 주요 피크와 두 개의 작은 피크가 나타났고, 그것들을 수집하였다. 각 분획을 반으로 나누었다; 절반은 ELISA를 수행하였고, 다른 절반은 동결건조하고, 150μL의 인산염-완충된 식염수용액 (PBS)에 재구성하였다. PBS 분획의 UV 분석 결과 분석용 칼럼으로부터 수집한 모든 피크가 회수되었음이 확인되었다. PBS 분획에 대해 웨스턴 분석을 수행하였다.

2. ELISA

CNBr로 절단된 IL-22RA로부터의 펩티드 서열을 함유하고 있는 HPLC 분획을 HPLC 완충액 (90% 아세토니트릴, 10% H₂O, 0.09% 트리플루오로아세트산)을 사용하여, 동일한 것으로 평가되는 농도로 희석하였다. 샘플을 96-웰 미소적정 플레이트의 4웰에 각각 웰당 100μL가 되도록 로딩하고 밤새 실온에서 건조되도록 훈증기 후드에 놓아두었다. 플레이트를 ELISA C 완충액 (PBS, 0.05% Tween-20)으로 세척한 후, ELISA B 완충액 (PBS, 0.1% BSA. 0.05% Tween-20)으로 2시간 동안 37℃에서 차단하였다. IL-22RA에 대한 두 개의 단클론성 항체 (mAb) (클론 R2.1.5F4.1 및 클론R2.1.15E2.1)를 ELISA B로 2μg/mL로 희석하였다. 각 mAb를 각 펩티드 서열 샘플에 웰당 100μL로 첨가하고 그것을 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하여 미결합 항체를 제거하고, 이차 항체 (양고추냉이 과산화효소 (Jackson)에 포합된 염소 항-쥐 IgG)를 ELISA B 완충액으로 1μg/mL로 희석하고, 모든 웰에 웰당 100μL로 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였따. 웰을 ELISA C 완충액으로 세척한 다음, TMB 1 성분 HRP 마이크로웰 기질 (BioFx)과 함께 5분 동안 인큐베이션하였다. 반응을 TMB 마이크로웰에 대한 450nm의 중지 시약 (BioFx)을 첨가함으로써 중단하고, 플레이트를 Dynatech ELISA 플레이트 판독기 (Mlecular Devices)에서 450nm에서 흡광도를 판독하였다.

그 결과 mAb R2.1.5F4.1은 mIL22RA CNBr 반응의 HPLC 분획 #4와 반응하였고, 또한 웨스턴 블롯팅 실험에서 밴드를 나타냈다.

3. 웨스턴

CNBr로 절단된 IL22RA로부터의 펩티드 서열을 함유하는 HPLC 분획을 밤새 실온에서 동결건조하고, PBS에 재구성하였다. 그런 다음 샘플을 비-환원 샘플 완충액 (Invitrogen)과 혼합하고, 10분 동안 끓였다. 샘플을 로딩하고 SDS-PAGE에 의해 4-12% Bis-Tris 겔 (Invitrogen)상에서 1xMES-SDS 작동 완충액 (Invitrogen)을 사용하여 전기영동한 다음, 20% 메탄올 전달 완충액중의 니트로셀룰로스 (0.2m; Bio-Rad)에 전달하였고, 이 모든 과정을 실온에서 하였다. 필터를 밤새 실온에서 건조시켰다. 필터를 완충액 A (50mM Tris, pH 7.4, 5mM EDTA, 0.05% Igepal CA-630, 150mM NaCl, 0.25% 젤라틴)중의 10%의 탈지 분유로 30분 동안 실온에서 차단하였다. IL22RA에 대한 단클론성 항체 (mAb)(클론 R2.1.5F4.1)를 2.5%의 탈지 분유를 함유하고 있는 완충액 A로 2 g/mL로 희석하였다. 블롯을 이 일차 항체중에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션후에 블롯을 완충액 A로 3회 세척하고, 1시간 동안 실온에서 2.5%의 탈지 분유가 첨가된 완충액 A 중의 1:5000으로 희석된 이차 항체 (염소 항-쥐 IgG-양고추냉이 과산화효소, Jackson, Inc)와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 블롯을 세척하고, 화학발광 기질 (Lumi-Light Western Blotting Substrate; Roche)으로 전개한 후, 발광 영상기 (Mannheim Boehringer Lumi-Imager)를 사용하여 노출시켰다.

30분 노출을 사용한 결과, 비-환원 겔은 분획 #4 및 #5에 대해 강력한 밴드를 나타냈고, 분획 #3에 대해서는 희미한 밴드를 나타냈다. 분획 #4는 또한 ELISA로 시험 결과 포지티브였다.

활성 분획 #4의 N-말단 서열화

분석용 역-상 칼럼으로부터 수집된 5개의 CNBr 펩티드 분획중에서 분획 #4가 ELISA에서 활성을 나타냈고, 또한 웨스턴 블롯팅에서도 포지티브로 나타났다. 활성 분획 #4에 존재하는 펩티드를 확인하기 위하여, 샘플에 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 에드만(Edman) 분해를 수행하였다. 활성 분획으로부터 다음과 같이 펩티드들과 일치하는 3개의 N-말단, 즉 펩티드 2 (SEQ ID NO:49), 펩티드 3 (SEQ ID NO:50), 및 펩티드 5 (SEQ ID NO:52)를 확인하였다.

에드만 분해	N-말단 서열	펩티드 확인
분획 #4로부터 얻어진 첫 번째 서열CNBr-생성된 mIL22RA 서열	HLEGK QREYE FLGLT PDTEF HLEGK QREYE FLGLT PDTEF LGSIT ILTPI LSKES APYVC RVKTL PLVLR (SEQ ID NO:53)	CNBr 펩티드 5 (SEQ ID NO:52)
분획 #4로부터 얻어진 두 번째 서열CNBr-생성된 mIL22RA 서열	ETRNH TEFYY AKVTA VSAGG ETRNH TEFYY AKVTA VSAGG PPV사 M (SEQ ID NO:54)	CNBr 펩티드 2 (SEQ ID NO:49)
분획 #4로부터 얻어진 세 번째 서열CNBr-생성된 mIL22RA 서열	TDRFS XLQHT XIXPX DXXXI TDRFS SLQHT TIKPP DVTCI PKVRS IQM (SEQ ID NO:55)	CNBr 펩티드 3 (SEQ ID NO:50)

토론

5개의 분획을 CNBr-절단된 mIL22RA 펩티드의 혼합물로부터 분리하였다. 이들 중에서 오직 분획 #4만이 ELISA에서 활성이었고, 웨스턴에 의해 포지티브였다. 에드만 분해로는 분획 #4에서 CNBr 펩티드 2 (SEQ ID NO:49), 3 (SEQ ID NO:50), 및 5 (SEQ ID NO:52)와 일치하는 3개의 N-말단을 확인하였다. 이들 영역 내에서 6개의 잔기가 잠재적으로 리간드 결합에 포함된다. 이들 잔기는 SEQ ID NO:42의 Y93, R112, K210, 및 E211이며, 그것들은 또한 SEQ ID NO:62의 잔기 Y78, R97, K195, 및 E196에 상응한다. SEQ ID NO:42의 잔기 Y60과 F164가 또한 리간드 결합에 포함된다.

B. 중화 단클론성 항체가 결합하는 사람 IL-22RA상의 에피토프

상술된 실험의 목적은 수용체 활성에 중요한, 또는 항체 결합을 길항하거나 중화하는 데 중요한 사람 IL-22RA 단백질의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:2)에 대한 세포외재성 도메인의 영역 또는 영역들을 확인하는 것이다. 사람 가용성 수용체 IL-22RA 단백질 (예컨대 SEQ ID NO:3을 포함, 예를 들면 Fc를 제거하기 위해 트롬빈으로 절단된 IL-22RA-Fc)을 시아노겐 브로마이드 (CNBr), 또는 당업계에서 사람 단백질을 규정된 단편으로 절단하는 것으로 알려져 있는 다른 제제와 함께 인큐베이션함으로써 서열의 메티오닌 잔기의 C-말단에서 절단한다. CNBr-생성된 펩티드를 분획화하고, 그 결과의 분획을 ELISA에 의해서는 결합 활성에 대해, 그리고 중화 성질을 가지는 단클론성 항체를 사용하는 웨스턴 분석에 의해서는 반응성에 대해 시험한다.

4개의 시스테인이 SEQ ID NO:2의 Cys71-Cys79 및 Cys204-Cys217의 결합 패턴으로 이황화-결합하는 것으로 예상된다. CNBr로 절단할 때 다음의 펩티드가 전체 길이의 비-환원 사람 IL-22RA로부터 잠재적으로 생성된다: 펩티드 6 (SEQ ID NO:56), 펩티드 7 (SEQ ID NO:57), 펩티드 8 (SEQ ID NO:58), 펩티드 9 (SEQ ID NO:59), 펩티드 10 (SEQ ID NO:60), 및 펩티드 11 (SEQ ID NO:61) (표 35). 시스테인은 이황화-결합하고, 그것은 펩티드 7 (SEQ ID NO:57)과 펩티드 10 (SEQ ID NO:60) 사이에 가능한 결합을 초래한다. 구체적으로, SEQ ID NO:56은 SEQ ID NO:3 의 아미노산 잔기 1(Pro)부터 92(Met)에 상응하고; SEQ ID NO:57은 SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 93(Thr)부터 120(Met)에 상응하며; SEQ ID NO:58은 SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 121(Ile)부터 160(Met)에 상응하고; SEQ ID NO:59는 SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 161(His)부터 185(Met)에 상응하며; SEQ ID NO:60은 SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 186(Ile)부터 199(Met)에 상응하고; 그리고 SEQ ID NO:61은 SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 200(Cys)부터 211(Thr)에 상응한다.

펩티드 번호	시작	끝	서열
CNBr 펩티드 6	1	92	Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln Ser Ser Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Ser Gly Pro Glu Gly Thr Pro Asp Thr Val Tyr Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr Gly Glu Arg Asp Trp Val Ala Lys Lys Gly Cys Gln Arg Ile Thr Arg Lys Ser Cys Asn Leu Thr Val Glu Thr Gly Asn Leu Thr Glu Leu Tyr Tyr Ala Arg Val Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser Ala Thr Lys Met (SEQ ID NO:56)
CNBr 펩티드 7	93	120	Thr Asp Arg Phe Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Leu Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys Ile Ser Lys Val Arg Ser Ile Gln Met (SEQ ID NO:57)
CNBr 펩티드 8	121	160	Ile Val His Pro Thr Pro Thr Pro Ile Arg Ala Gly Asp Gly His Arg Leu Thr Leu Glu Asp Ile Phe His Asp Leu Phe Tyr His Leu Glu Leu Gln Val Asn Arg Thr Tyr Gln Met (SEQ ID NO:58)
CNBr 펩티드 9	161	185	His Leu Gly Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Phe Gly Leu Thr Pro Asp Thr Glu Phe Leu Gly Thr Ile Met (SEQ ID NO:59)
CNBr 펩티드 10	186	199	Ile Cys Val Pro Thr Trp Ala Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Met (SEQ ID NO:60)
CNBr 펩티드 11	200	211	Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Asp Arg Thr Trp Thr (SEQ ID NO:61)

4. CNBr 절단 및 펩티드 분획의 분리, 웨스턴 및 ELISA, 및 N-말단 서열화

약 50㎍의 사람 IL22RA를 실시예 42A에서 설명된 바와 같이 동결건조하고, 재구성하고, 분획화하고, 수집하여 웨스턴 분석, 및 ELISA를 사용하여 분석함으로써, 항-IL-22RA 단클론성 항체를 함유하는 분획을 확인하고, ELISA 및 웨스턴 분석에 의해 알 수 있는 바와 같이 IL-22RA에 결합하는 분획을 확인하였다. 분석용 역-상 칼럼으로부터 수집한 CNBr 펩티드 분획을 ELISA로 활성에 대해 시험하고 웨스턴 블롯팅에 의해 포지티브로서 확인하였다. 포지티브 분획에 대해서는 펩티드를 잘 알려진 방법을 사용하여 에드만 분해에 의해 확인한다.

토론

마우스 CNBr 펩티드 #5 (SEQ ID NO:52)는 사람 CNBr 펩티드 #9, 및 #10 (SEQ ID NO:59 및 SEQ ID NO:60)에 상응하고; 마우스 CNBr 펩티드 #2 (SEQ ID NO:49)는 사람 CNBr 펩티드 #6 (SEQ ID NO:56)에 상응하며; 마우스 CNBr 펩티드 #3 (SEQ ID NO:50)은 사람 CNBr 펩티드 #7 (SEQ ID NO:57)에 상응한다. CNBr-절단된 사람 IL-22RA 펩티드의 혼합물로부터 분리된 분획 중에서 가능한 영역 안에 있는 6개의 잔기가 잠재적으로 리간드 결합에 포함된다: 리간드-수용체 결합에 중요한 SEQ ID NO:2의 잔기 (및 상응하는 SEQ ID NO:3의 잔기)는 SEQ ID NO:2의 Tyr-60, 및 Phe-164, Tyr-93, Arg-112, Lys-210 및 Glu-211 (및 상응하는 SEQ ID NO:3의 잔기)를 포함한다. 더욱이 리간드-수용체 결합을 지시하는 데 중요한 SEQ ID NO:2의 일차 잔기 (및 SEQ ID NO:3의 상응하는 잔기)는 SEQ ID NO:2의 Tyr-60, 및 Phe-164 (및 상응하는 SEQ ID NO:3의 잔기)를 포함하고, 이차 잔기는 SEQ ID NO:2의 Tyr-93, Arg-112, Lys-210 및 Glu-211 (및 상응하는 SEQ ID NO:3의 잔기)를 포함한다.

전술한 설명으로부터, 비록 본 발명의 구체적인 구체예가 설명을 목적으로 본원에서 설명되었지만, 다양한 변형이 본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않고 이루어질 수 있다는 것이 인지되어야 한다. 따라서 본 발명은 첨부되는 청구의 범위에 의한 것을 제외하고 제한되지 않는다.

SEQUENCE LISTING <110> ZymoGenetics, Inc. et al. <120> ANTI-IL-22RA ANTIBODIES AND BINDING PARTNERS AND METHODS OF USING IN INFLAMMATION <130> 04-14PC <150> <151> <150> <151> <160> 62 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 2831 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (34)...(1755) <400> 1 tagaggccaa gggagggctc tgtgccagcc ccg atg agg acg ctg ctg acc atc 54 Met Arg Thr Leu Leu Thr Ile 1 5 ttg act gtg gga tcc ctg gct gct cac gcc cct gag gac ccc tcg gat 102 Leu Thr Val Gly Ser Leu Ala Ala His Ala Pro Glu Asp Pro Ser Asp 10 15 20 ctg ctc cag cac gtg aaa ttc cag tcc agc aac ttt gaa aac atc ctg 150 Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln Ser Ser Asn Phe Glu Asn Ile Leu 25 30 35 acg tgg gac agc ggg cca gag ggc acc cca gac acg gtc tac agc atc 198 Thr Trp Asp Ser Gly Pro Glu Gly Thr Pro Asp Thr Val Tyr Ser Ile 40 45 50 55 gag tat aag acg tac gga gag agg gac tgg gtg gca aag aag ggc tgt 246 Glu Tyr Lys Thr Tyr Gly Glu Arg Asp Trp Val Ala Lys Lys Gly Cys 60 65 70 cag cgg atc acc cgg aag tcc tgc aac ctg acg gtg gag acg ggc aac 294 Gln Arg Ile Thr Arg Lys Ser Cys Asn Leu Thr Val Glu Thr Gly Asn 75 80 85 ctc acg gag ctc tac tat gcc agg gtc acc gct gtc agt gcg gga ggc 342 Leu Thr Glu Leu Tyr Tyr Ala Arg Val Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly 90 95 100 cgg tca gcc acc aag atg act gac agg ttc agc tct ctg cag cac act 390 Arg Ser Ala Thr Lys Met Thr Asp Arg Phe Ser Ser Leu Gln His Thr 105 110 115 acc ctc aag cca cct gat gtg acc tgt atc tcc aaa gtg aga tcg att 438 Thr Leu Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys Ile Ser Lys Val Arg Ser Ile 120 125 130 135 cag atg att gtt cat cct acc ccc acg cca atc cgt gca ggc gat ggc 486 Gln Met Ile Val His Pro Thr Pro Thr Pro Ile Arg Ala Gly Asp Gly 140 145 150 cac cgg cta acc ctg gaa gac atc ttc cat gac ctg ttc tac cac tta 534 His Arg Leu Thr Leu Glu Asp Ile Phe His Asp Leu Phe Tyr His Leu 155 160 165 gag ctc cag gtc aac cgc acc tac caa atg cac ctt gga ggg aag cag 582 Glu Leu Gln Val Asn Arg Thr Tyr Gln Met His Leu Gly Gly Lys Gln 170 175 180 aga gaa tat gag ttc ttc ggc ctg acc cct gac aca gag ttc ctt ggc 630 Arg Glu Tyr Glu Phe Phe Gly Leu Thr Pro Asp Thr Glu Phe Leu Gly 185 190 195 acc atc atg att tgc gtt ccc acc tgg gcc aag gag agt gcc ccc tac 678 Thr Ile Met Ile Cys Val Pro Thr Trp Ala Lys Glu Ser Ala Pro Tyr 200 205 210 215 atg tgc cga gtg aag aca ctg cca gac cgg aca tgg acc tac tcc ttc 726 Met Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Asp Arg Thr Trp Thr Tyr Ser Phe 220 225 230 tcc gga gcc ttc ctg ttc tcc atg ggc ttc ctc gtc gca gta ctc tgc 774 Ser Gly Ala Phe Leu Phe Ser Met Gly Phe Leu Val Ala Val Leu Cys 235 240 245 tac ctg agc tac aga tat gtc acc aag ccg cct gca cct ccc aac tcc 822 Tyr Leu Ser Tyr Arg Tyr Val Thr Lys Pro Pro Ala Pro Pro Asn Ser 250 255 260 ctg aac gtc cag cga gtc ctg act ttc cag ccg ctg cgc ttc atc cag 870 Leu Asn Val Gln Arg Val Leu Thr Phe Gln Pro Leu Arg Phe Ile Gln 265 270 275 gag cac gtc ctg atc cct gtc ttt gac ctc agc ggc ccc agc agt ctg 918 Glu His Val Leu Ile Pro Val Phe Asp Leu Ser Gly Pro Ser Ser Leu 280 285 290 295 gcc cag cct gtc cag tac tcc cag atc agg gtg tct gga ccc agg gag 966 Ala Gln Pro Val Gln Tyr Ser Gln Ile Arg Val Ser Gly Pro Arg Glu 300 305 310 ccc gca gga gct cca cag cgg cat agc ctg tcc gag atc acc tac tta 1014 Pro Ala Gly Ala Pro Gln Arg His Ser Leu Ser Glu Ile Thr Tyr Leu 315 320 325 ggg cag cca gac atc tcc atc ctc cag ccc tcc aac gtg cca cct ccc 1062 Gly Gln Pro Asp Ile Ser Ile Leu Gln Pro Ser Asn Val Pro Pro Pro 330 335 340 cag atc ctc tcc cca ctg tcc tat gcc cca aac gct gcc cct gag gtc 1110 Gln Ile Leu Ser Pro Leu Ser Tyr Ala Pro Asn Ala Ala Pro Glu Val 345 350 355 ggg ccc cca tcc tat gca cct cag gtg acc ccc gaa gct caa ttc cca 1158 Gly Pro Pro Ser Tyr Ala Pro Gln Val Thr Pro Glu Ala Gln Phe Pro 360 365 370 375 ttc tac gcc cca cag gcc atc tct aag gtc cag cct tcc tcc tat gcc 1206 Phe Tyr Ala Pro Gln Ala Ile Ser Lys Val Gln Pro Ser Ser Tyr Ala 380 385 390 cct caa gcc act ccg gac agc tgg cct ccc tcc tat ggg gta tgc atg 1254 Pro Gln Ala Thr Pro Asp Ser Trp Pro Pro Ser Tyr Gly Val Cys Met 395 400 405 gaa ggt tct ggc aaa gac tcc ccc act ggg aca ctt tct agt cct aaa 1302 Glu Gly Ser Gly Lys Asp Ser Pro Thr Gly Thr Leu Ser Ser Pro Lys 410 415 420 cac ctt agg cct aaa ggt cag ctt cag aaa gag cca cca gct gga agc 1350 His Leu Arg Pro Lys Gly Gln Leu Gln Lys Glu Pro Pro Ala Gly Ser 425 430 435 tgc atg tta ggt ggc ctt tct ctg cag gag gtg acc tcc ttg gct atg 1398 Cys Met Leu Gly Gly Leu Ser Leu Gln Glu Val Thr Ser Leu Ala Met 440 445 450 455 gag gaa tcc caa gaa gca aaa tca ttg cac cag ccc ctg ggg att tgc 1446 Glu Glu Ser Gln Glu Ala Lys Ser Leu His Gln Pro Leu Gly Ile Cys 460 465 470 aca gac aga aca tct gac cca aat gtg cta cac agt ggg gag gaa ggg 1494 Thr Asp Arg Thr Ser Asp Pro Asn Val Leu His Ser Gly Glu Glu Gly 475 480 485 aca cca cag tac cta aag ggc cag ctc ccc ctc ctc tcc tca gtc cag 1542 Thr Pro Gln Tyr Leu Lys Gly Gln Leu Pro Leu Leu Ser Ser Val Gln 490 495 500 atc gag ggc cac ccc atg tcc ctc cct ttg caa cct cct tcc ggt cca 1590 Ile Glu Gly His Pro Met Ser Leu Pro Leu Gln Pro Pro Ser Gly Pro 505 510 515 tgt tcc ccc tcg gac caa ggt cca agt ccc tgg ggc ctg ctg gag tcc 1638 Cys Ser Pro Ser Asp Gln Gly Pro Ser Pro Trp Gly Leu Leu Glu Ser 520 525 530 535 ctt gtg tgt ccc aag gat gaa gcc aag agc cca gcc cct gag acc tca 1686 Leu Val Cys Pro Lys Asp Glu Ala Lys Ser Pro Ala Pro Glu Thr Ser 540 545 550 gac ctg gag cag ccc aca gaa ctg gat tct ctt ttc aga ggc ctg gcc 1734 Asp Leu Glu Gln Pro Thr Glu Leu Asp Ser Leu Phe Arg Gly Leu Ala 555 560 565 ctg act gtg cag tgg gag tcc tgaggggaat gggaaaggct tggtgcttcc 1785 Leu Thr Val Gln Trp Glu Ser 570 tccctgtccc tacccagtgt cacatccttg gctgtcaatc ccatgcctgc ccatgccaca 1845 cactctgcga tctggcctca gacgggtgcc cttgagagaa gcagagggag tggcatgcag 1905 ggcccctgcc atgggtgcgc tcctcaccgg aacaaagcag catgataagg actgcagcgg 1965 gggagctctg gggagcagct tgtgtagaca agcgcgtgct cgctgagccc tgcaaggcag 2025 aaatgacagt gcaaggagga aatgcaggga aactcccgag gtccagagcc ccacctccta 2085 acaccatgga ttcaaagtgc tcagggaatt tgcctctcct tgccccattc ctggccagtt 2145 tcacaatcta gctcgacaga gcatgaggcc cctgcctctt ctgtcattgt tcaaaggtgg 2205 gaagagagcc tggaaaagaa ccaggcctgg aaaagaacca gaaggaggct gggcagaacc 2265 agaacaacct gcacttctgc caaggccagg gccagcagga cggcaggact ctagggaggg 2325 gtgtggcctg cagctcattc ccagccaggg caactgcctg acgttgcacg atttcagctt 2385 cattcctctg atagaacaaa gcgaaatgca ggtccaccag ggagggagac acacaagcct 2445 tttctgcagg caggagtttc agaccctatc ctgagaatgg ggtttgaaag gaaggtgagg 2505 gctgtggccc ctggacgggt acaataacac actgtactga tgtcacaact ttgcaagctc 2565 tgccttgggt tcagcccatc tgggctcaaa ttccagcctc accactcaca agctgtgtga 2625 cttcaaacaa atgaaatcag tgcccagaac ctcggtttcc tcatctgtaa tgtggggatc 2685 ataacaccta cctcatggag ttgtggtgaa gatgaaatga agtcatgtct ttaaagtgct 2745 taatagtgcc tggtacatgg gcagtgccca ataaacggta gctatttaaa aaaaaaaaaa 2805 aaaaaaaaaa atagcggccg cctcga 2831 <210> 2 <211> 574 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Thr Leu Leu Thr Ile Leu Thr Val Gly Ser Leu Ala Ala His 1 5 10 15 Ala Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln Ser 20 25 30 Ser Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Ser Gly Pro Glu Gly Thr 35 40 45 Pro Asp Thr Val Tyr Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr Gly Glu Arg Asp 50 55 60 Trp Val Ala Lys Lys Gly Cys Gln Arg Ile Thr Arg Lys Ser Cys Asn 65 70 75 80 Leu Thr Val Glu Thr Gly Asn Leu Thr Glu Leu Tyr Tyr Ala Arg Val 85 90 95 Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser Ala Thr Lys Met Thr Asp Arg 100 105 110 Phe Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Leu Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys 115 120 125 Ile Ser Lys Val Arg Ser Ile Gln Met Ile Val His Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Ile Arg Ala Gly Asp Gly His Arg Leu Thr Leu Glu Asp Ile Phe 145 150 155 160 His Asp Leu Phe Tyr His Leu Glu Leu Gln Val Asn Arg Thr Tyr Gln 165 170 175 Met His Leu Gly Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Phe Gly Leu Thr 180 185 190 Pro Asp Thr Glu Phe Leu Gly Thr Ile Met Ile Cys Val Pro Thr Trp 195 200 205 Ala Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Met Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Asp 210 215 220 Arg Thr Trp Thr Tyr Ser Phe Ser Gly Ala Phe Leu Phe Ser Met Gly 225 230 235 240 Phe Leu Val Ala Val Leu Cys Tyr Leu Ser Tyr Arg Tyr Val Thr Lys 245 250 255 Pro Pro Ala Pro Pro Asn Ser Leu Asn Val Gln Arg Val Leu Thr Phe 260 265 270 Gln Pro Leu Arg Phe Ile Gln Glu His Val Leu Ile Pro Val Phe Asp 275 280 285 Leu Ser Gly Pro Ser Ser Leu Ala Gln Pro Val Gln Tyr Ser Gln Ile 290 295 300 Arg Val Ser Gly Pro Arg Glu Pro Ala Gly Ala Pro Gln Arg His Ser 305 310 315 320 Leu Ser Glu Ile Thr Tyr Leu Gly Gln Pro Asp Ile Ser Ile Leu Gln 325 330 335 Pro Ser Asn Val Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ser Pro Leu Ser Tyr Ala 340 345 350 Pro Asn Ala Ala Pro Glu Val Gly Pro Pro Ser Tyr Ala Pro Gln Val 355 360 365 Thr Pro Glu Ala Gln Phe Pro Phe Tyr Ala Pro Gln Ala Ile Ser Lys 370 375 380 Val Gln Pro Ser Ser Tyr Ala Pro Gln Ala Thr Pro Asp Ser Trp Pro 385 390 395 400 Pro Ser Tyr Gly Val Cys Met Glu Gly Ser Gly Lys Asp Ser Pro Thr 405 410 415 Gly Thr Leu Ser Ser Pro Lys His Leu Arg Pro Lys Gly Gln Leu Gln 420 425 430 Lys Glu Pro Pro Ala Gly Ser Cys Met Leu Gly Gly Leu Ser Leu Gln 435 440 445 Glu Val Thr Ser Leu Ala Met Glu Glu Ser Gln Glu Ala Lys Ser Leu 450 455 460 His Gln Pro Leu Gly Ile Cys Thr Asp Arg Thr Ser Asp Pro Asn Val 465 470 475 480 Leu His Ser Gly Glu Glu Gly Thr Pro Gln Tyr Leu Lys Gly Gln Leu 485 490 495 Pro Leu Leu Ser Ser Val Gln Ile Glu Gly His Pro Met Ser Leu Pro 500 505 510 Leu Gln Pro Pro Ser Gly Pro Cys Ser Pro Ser Asp Gln Gly Pro Ser 515 520 525 Pro Trp Gly Leu Leu Glu Ser Leu Val Cys Pro Lys Asp Glu Ala Lys 530 535 540 Ser Pro Ala Pro Glu Thr Ser Asp Leu Glu Gln Pro Thr Glu Leu Asp 545 550 555 560 Ser Leu Phe Arg Gly Leu Ala Leu Thr Val Gln Trp Glu Ser 565 570 <210> 3 <211> 211 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln Ser Ser 1 5 10 15 Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Ser Gly Pro Glu Gly Thr Pro 20 25 30 Asp Thr Val Tyr Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr Gly Glu Arg Asp Trp 35 40 45 Val Ala Lys Lys Gly Cys Gln Arg Ile Thr Arg Lys Ser Cys Asn Leu 50 55 60 Thr Val Glu Thr Gly Asn Leu Thr Glu Leu Tyr Tyr Ala Arg Val Thr 65 70 75 80 Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser Ala Thr Lys Met Thr Asp Arg Phe 85 90 95 Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Leu Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys Ile 100 105 110 Ser Lys Val Arg Ser Ile Gln Met Ile Val His Pro Thr Pro Thr Pro 115 120 125 Ile Arg Ala Gly Asp Gly His Arg Leu Thr Leu Glu Asp Ile Phe His 130 135 140 Asp Leu Phe Tyr His Leu Glu Leu Gln Val Asn Arg Thr Tyr Gln Met 145 150 155 160 His Leu Gly Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Phe Gly Leu Thr Pro 165 170 175 Asp Thr Glu Phe Leu Gly Thr Ile Met Ile Cys Val Pro Thr Trp Ala 180 185 190 Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Met Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Asp Arg 195 200 205 Thr Trp Thr 210 <210> 4 <211> 541 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A Soluble IL-22RA-Fc Fusion Polypeptide <400> 4 Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln Ser Ser 1 5 10 15 Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Ser Gly Pro Glu Gly Thr Pro 20 25 30 Asp Thr Val Tyr Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr Gly Glu Arg Asp Trp 35 40 45 Val Ala Lys Lys Gly Cys Gln Arg Ile Thr Arg Lys Ser Cys Asn Leu 50 55 60 Thr Val Glu Thr Gly Asn Leu Thr Glu Leu Tyr Tyr Ala Arg Val Thr 65 70 75 80 Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser Ala Thr Lys Met Thr Asp Arg Phe 85 90 95 Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Leu Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys Ile 100 105 110 Ser Lys Val Arg Ser Ile Gln Met Ile Val His Pro Thr Pro Thr Pro 115 120 125 Ile Arg Ala Gly Asp Gly His Arg Leu Thr Leu Glu Asp Ile Phe His 130 135 140 Asp Leu Phe Tyr His Leu Glu Leu Gln Val Asn Arg Thr Tyr Gln Met 145 150 155 160 His Leu Gly Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Phe Gly Leu Thr Pro 165 170 175 Asp Thr Glu Phe Leu Gly Thr Ile Met Ile Cys Val Pro Thr Trp Ala 180 185 190 Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Met Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Asp Arg 195 200 205 Thr Trp Thr Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 210 215 220 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 225 230 235 240 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 245 250 255 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 260 265 270 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 275 280 285 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 290 295 300 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 305 310 315 320 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 325 330 335 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 340 345 350 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 355 360 365 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 370 375 380 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 385 390 395 400 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 405 410 415 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 420 425 430 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 435 440 445 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 450 455 460 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 465 470 475 480 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 485 490 495 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 500 505 510 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 515 520 525 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 530 535 540 <210> 5 <211> 1116 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (21)...(557) <400> 5 tcgagttaga attgtctgca atg gcc gcc ctg cag aaa tct gtg agc tct ttc 53 Met Ala Ala Leu Gln Lys Ser Val Ser Ser Phe 1 5 10 ctt atg ggg acc ctg gcc acc agc tgc ctc ctt ctc ttg gcc ctc ttg 101 Leu Met Gly Thr Leu Ala Thr Ser Cys Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu 15 20 25 gta cag gga gga gca gct gcg ccc atc agc tcc cac tgc agg ctt gac 149 Val Gln Gly Gly Ala Ala Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp 30 35 40 aag tcc aac ttc cag cag ccc tat atc acc aac cgc acc ttc atg ctg 197 Lys Ser Asn Phe Gln Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu 45 50 55 gct aag gag gct agc ttg gct gat aac aac aca gac gtt cgt ctc att 245 Ala Lys Glu Ala Ser Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile 60 65 70 75 ggg gag aaa ctg ttc cac gga gtc agt atg agt gag cgc tgc tat ctg 293 Gly Glu Lys Leu Phe His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu 80 85 90 atg aag cag gtg ctg aac ttc acc ctt gaa gaa gtg ctg ttc cct caa 341 Met Lys Gln Val Leu Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln 95 100 105 tct gat agg ttc cag cct tat atg cag gag gtg gtg ccc ttc ctg gcc 389 Ser Asp Arg Phe Gln Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala 110 115 120 agg ctc agc aac agg cta agc aca tgt cat att gaa ggt gat gac ctg 437 Arg Leu Ser Asn Arg Leu Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu 125 130 135 cat atc cag agg aat gtg caa aag ctg aag gac aca gtg aaa aag ctt 485 His Ile Gln Arg Asn Val Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu 140 145 150 155 gga gag agt gga gag atc aaa gca att gga gaa ctg gat ttg ctg ttt 533 Gly Glu Ser Gly Glu Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe 160 165 170 atg tct ctg aga aat gcc tgc att tgaccagagc aaagctgaaa aatgaataac 587 Met Ser Leu Arg Asn Ala Cys Ile 175 taaccccctt tccctgctag aaataacaat tagatgcccc aaagcgattt tttttaacca 647 aaaggaagat gggaagccaa actccatcat gatgggtgga ttccaaatga acccctgcgt 707 tagttacaaa ggaaaccaat gccacttttg tttataagac cagaaggtag actttctaag 767 catagatatt tattgataac atttcattgt aactggtgtt ctatacacag aaaacaattt 827 attttttaaa taattgtctt tttccataaa aaagattact ttccattcct ttaggggaaa 887 aaacccctaa atagcttcat gtttccataa tcagtacttt atatttataa atgtatttat 947 tattattata agactgcatt ttatttatat cattttatta atatggattt atttatagaa 1007 acatcattcg atattgctac ttgagtgtaa ggctaatatt gatatttatg acaataatta 1067 tagagctata acatgtttat ttgacctcaa taaacacttg gatatccta 1116 <210> 6 <211> 179 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Ala Leu Gln Lys Ser Val Ser Ser Phe Leu Met Gly Thr Leu 1 5 10 15 Ala Thr Ser Cys Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Val Gln Gly Gly Ala 20 25 30 Ala Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln 35 40 45 Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser 50 55 60 Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe 65 70 75 80 His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu 85 90 95 Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln 100 105 110 Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg 115 120 125 Leu Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn 130 135 140 Val Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu 145 150 155 160 Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn 165 170 175 Ala Cys Ile <210> 7 <211> 926 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (45)...(575) <221> variation <222> (188)...(188) <223> Nucleotide may be C or G at position 188 <400> 7 ctttgaattc ctagctcctg tggtctccag atttcaggcc taag atg aaa gcc tct 56 Met Lys Ala Ser 1 agt ctt gcc ttc agc ctt ctc tct gct gcg ttt tat ctc cta tgg act 104 Ser Leu Ala Phe Ser Leu Leu Ser Ala Ala Phe Tyr Leu Leu Trp Thr 5 10 15 20 cct tcc act gga ctg aag aca ctc aat ttg gga agc tgt gtg atc gcc 152 Pro Ser Thr Gly Leu Lys Thr Leu Asn Leu Gly Ser Cys Val Ile Ala 25 30 35 aca aac ctt cag gaa ata cga aat gga ttt tct gas ata cgg ggc agt 200 Thr Asn Leu Gln Glu Ile Arg Asn Gly Phe Ser Xaa Ile Arg Gly Ser 40 45 50 gtg caa gcc aaa gat gga aac att gac atc aga atc tta agg agg act 248 Val Gln Ala Lys Asp Gly Asn Ile Asp Ile Arg Ile Leu Arg Arg Thr 55 60 65 gag tct ttg caa gac aca aag cct gcg aat cga tgc tgc ctc ctg cgc 296 Glu Ser Leu Gln Asp Thr Lys Pro Ala Asn Arg Cys Cys Leu Leu Arg 70 75 80 cat ttg cta aga ctc tat ctg gac agg gta ttt aaa aac tac cag acc 344 His Leu Leu Arg Leu Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys Asn Tyr Gln Thr 85 90 95 100 cct gac cat tat act ctc cgg aag atc agc agc ctc gcc aat tcc ttt 392 Pro Asp His Tyr Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu Ala Asn Ser Phe 105 110 115 ctt acc atc aag aag gac ctc cgg ctc tgt cat gcc cac atg aca tgc 440 Leu Thr Ile Lys Lys Asp Leu Arg Leu Cys His Ala His Met Thr Cys 120 125 130 cat tgt ggg gag gaa gca atg aag aaa tac agc cag att ctg agt cac 488 His Cys Gly Glu Glu Ala Met Lys Lys Tyr Ser Gln Ile Leu Ser His 135 140 145 ttt gaa aag ctg gaa cct cag gca gca gtt gtg aag gct ttg ggg gaa 536 Phe Glu Lys Leu Glu Pro Gln Ala Ala Val Val Lys Ala Leu Gly Glu 150 155 160 cta gac att ctt ctg caa tgg atg gag gag aca gaa tag gaggaaagtg 585 Leu Asp Ile Leu Leu Gln Trp Met Glu Glu Thr Glu * 165 170 175 atgctgctgc taagaatatt cgaggtcaag agctccagtc ttcaatacct gcagaggagg 645 catgacccca aaccaccatc tctttactgt actagtcttg tgctggtcac agtgtatctt 705 atttatgcat tacttgcttc cttgcatgat tgtctttatg catccccaat cttaattgag 765 accatacttg tataagattt ttgtaatatc tttctgctat tggatatatt tattagttaa 825 tatatttatt tattttttgc tattaatgta tttaattttt tacttgggca tgaaacttta 885 aaaaaaattc acaagattat atttataacc tgactagagc a 926 <210> 8 <211> 176 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (48)...(48) <223> Amino acid at position 48 can be a D (Asp) or E (Glu) <221> VARIANT <222> 48 <223> Xaa = Any Amino Acid <400> 8 Met Lys Ala Ser Ser Leu Ala Phe Ser Leu Leu Ser Ala Ala Phe Tyr 1 5 10 15 Leu Leu Trp Thr Pro Ser Thr Gly Leu Lys Thr Leu Asn Leu Gly Ser 20 25 30 Cys Val Ile Ala Thr Asn Leu Gln Glu Ile Arg Asn Gly Phe Ser Xaa 35 40 45 Ile Arg Gly Ser Val Gln Ala Lys Asp Gly Asn Ile Asp Ile Arg Ile 50 55 60 Leu Arg Arg Thr Glu Ser Leu Gln Asp Thr Lys Pro Ala Asn Arg Cys 65 70 75 80 Cys Leu Leu Arg His Leu Leu Arg Leu Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys 85 90 95 Asn Tyr Gln Thr Pro Asp His Tyr Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu 100 105 110 Ala Asn Ser Phe Leu Thr Ile Lys Lys Asp Leu Arg Leu Cys His Ala 115 120 125 His Met Thr Cys His Cys Gly Glu Glu Ala Met Lys Lys Tyr Ser Gln 130 135 140 Ile Leu Ser His Phe Glu Lys Leu Glu Pro Gln Ala Ala Val Val Lys 145 150 155 160 Ala Leu Gly Glu Leu Asp Ile Leu Leu Gln Trp Met Glu Glu Thr Glu 165 170 175 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide Linker <400> 9 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 10 <211> 1050 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (5)...(589) <400> 10 aaca ggc tct cct ctc act tat caa ctt ttg aca ctt gtg cga tcg gtg 49 Gly Ser Pro Leu Thr Tyr Gln Leu Leu Thr Leu Val Arg Ser Val 1 5 10 15 atg gct gtc ctg cag aaa tct atg agt ttt tcc ctt atg ggg act ttg 97 Met Ala Val Leu Gln Lys Ser Met Ser Phe Ser Leu Met Gly Thr Leu 20 25 30 gcc gcc agc tgc ctg ctt ctc att gcc ctg tgg gcc cag gag gca aat 145 Ala Ala Ser Cys Leu Leu Leu Ile Ala Leu Trp Ala Gln Glu Ala Asn 35 40 45 gcg ctg ccc atc aac acc cgg tgc aag ctt gag gtg tcc aac ttc cag 193 Ala Leu Pro Ile Asn Thr Arg Cys Lys Leu Glu Val Ser Asn Phe Gln 50 55 60 cag ccg tac atc gtc aac cgc acc ttt atg ctg gcc aag gag gcc agc 241 Gln Pro Tyr Ile Val Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser 65 70 75 ctt gca gat aac aac aca gac gtc cgg ctc atc ggg gag aaa ctg ttc 289 Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe 80 85 90 95 cga gga gtc agt gct aag gat cag tgc tac ctg atg aag cag gtg ctc 337 Arg Gly Val Ser Ala Lys Asp Gln Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu 100 105 110 aac ttc acc ctg gaa gac att ctg ctc ccc cag tca gac agg ttc cgg 385 Asn Phe Thr Leu Glu Asp Ile Leu Leu Pro Gln Ser Asp Arg Phe Arg 115 120 125 ccc tac atg cag gag gtg gtg cct ttc ctg acc aaa ctc agc aat cag 433 Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Thr Lys Leu Ser Asn Gln 130 135 140 ctc agc tcc tgt cac atc agt ggt gac gac cag aac atc cag aag aat 481 Leu Ser Ser Cys His Ile Ser Gly Asp Asp Gln Asn Ile Gln Lys Asn 145 150 155 gtc aga agg ctg aag gag aca gtg aaa aag ctt gga gag agc gga gag 529 Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu 160 165 170 175 atc aaa gcg atc ggg gaa ctg gac ctg ctg ttt atg tct ctg aga aat 577 Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn 180 185 190 gct tgc gtc tga gcgagaagaa gctagaaaac gaagaactgc tccttcctgc 629 Ala Cys Val * cttctaaaaa gaacaataag atccctgaat ggactttttt actaaaggaa agtgagaagc 689 taacgtccac catcattaga agatttcaca tgaaacctgg ctcagttgaa agagaaaata 749 gtgtcaagtt gtccatgaga ccagaggtag acttgataac cacaaagatt cattgacaat 809 attttattgt cattgataat gcaacagaaa aagtatgtac tttaaaaaat tgtttgaaag 869 gaggttacct ctcattcctc tagaagaaaa gcctatgtaa cttcatttcc ataaccaata 929 ctttatatat gtaagtttat ttattataag tatacatttt atttatgtca gtttattaat 989 atggatttat ttatagaaaa attatctgat gttgatattt gagtataaag caaataatat 1049 t 1050 <210> 11 <211> 194 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Gly Ser Pro Leu Thr Tyr Gln Leu Leu Thr Leu Val Arg Ser Val Met 1 5 10 15 Ala Val Leu Gln Lys Ser Met Ser Phe Ser Leu Met Gly Thr Leu Ala 20 25 30 Ala Ser Cys Leu Leu Leu Ile Ala Leu Trp Ala Gln Glu Ala Asn Ala 35 40 45 Leu Pro Ile Asn Thr Arg Cys Lys Leu Glu Val Ser Asn Phe Gln Gln 50 55 60 Pro Tyr Ile Val Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu 65 70 75 80 Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe Arg 85 90 95 Gly Val Ser Ala Lys Asp Gln Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu Asn 100 105 110 Phe Thr Leu Glu Asp Ile Leu Leu Pro Gln Ser Asp Arg Phe Arg Pro 115 120 125 Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Thr Lys Leu Ser Asn Gln Leu 130 135 140 Ser Ser Cys His Ile Ser Gly Asp Asp Gln Asn Ile Gln Lys Asn Val 145 150 155 160 Arg Arg Leu Lys Glu Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu Ile 165 170 175 Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn Ala 180 185 190 Cys Val <210> 12 <211> 2149 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(693) <400> 12 atg atg cct aaa cat tgc ttt cta ggc ttc ctc atc agt ttc ttc ctt 48 Met Met Pro Lys His Cys Phe Leu Gly Phe Leu Ile Ser Phe Phe Leu 1 5 10 15 act ggt gta gca gga act cag tca acg cat gag tct ctg aag cct cag 96 Thr Gly Val Ala Gly Thr Gln Ser Thr His Glu Ser Leu Lys Pro Gln 20 25 30 agg gta caa ttt cag tcc cga aat ttt cac aac att ttg caa tgg cag 144 Arg Val Gln Phe Gln Ser Arg Asn Phe His Asn Ile Leu Gln Trp Gln 35 40 45 cct ggg agg gca ctt act ggc aac agc agt gtc tat ttt gtg cag tac 192 Pro Gly Arg Ala Leu Thr Gly Asn Ser Ser Val Tyr Phe Val Gln Tyr 50 55 60 aaa ata tat gga cag aga caa tgg aaa aat aaa gaa gac tgt tgg ggt 240 Lys Ile Tyr Gly Gln Arg Gln Trp Lys Asn Lys Glu Asp Cys Trp Gly 65 70 75 80 act caa gaa ctc tct tgt gac ctt acc agt gaa acc tca gac ata cag 288 Thr Gln Glu Leu Ser Cys Asp Leu Thr Ser Glu Thr Ser Asp Ile Gln 85 90 95 gaa cct tat tac ggg agg gtg agg gcg gcc tcg gct ggg agc tac tca 336 Glu Pro Tyr Tyr Gly Arg Val Arg Ala Ala Ser Ala Gly Ser Tyr Ser 100 105 110 gaa tgg agc atg acg ccg cgg ttc act ccc tgg tgg gaa aca aaa ata 384 Glu Trp Ser Met Thr Pro Arg Phe Thr Pro Trp Trp Glu Thr Lys Ile 115 120 125 gat cct cca gtc atg aat ata acc caa gtc aat ggc tct ttg ttg gta 432 Asp Pro Pro Val Met Asn Ile Thr Gln Val Asn Gly Ser Leu Leu Val 130 135 140 att ctc cat gct cca aat tta cca tat aga tac caa aag gaa aaa aat 480 Ile Leu His Ala Pro Asn Leu Pro Tyr Arg Tyr Gln Lys Glu Lys Asn 145 150 155 160 gta tct ata gaa gat tac tat gaa cta cta tac cga gtt ttt ata att 528 Val Ser Ile Glu Asp Tyr Tyr Glu Leu Leu Tyr Arg Val Phe Ile Ile 165 170 175 aac aat tca cta gaa aag gag caa aag gtt tat gaa ggg gct cac aga 576 Asn Asn Ser Leu Glu Lys Glu Gln Lys Val Tyr Glu Gly Ala His Arg 180 185 190 gcg gtt gaa att gaa gct cta aca cca cac tcc agc tac tgt gta gtg 624 Ala Val Glu Ile Glu Ala Leu Thr Pro His Ser Ser Tyr Cys Val Val 195 200 205 gct gaa ata tat cag ccc atg tta gac aga aga agt cag aga agt gaa 672 Ala Glu Ile Tyr Gln Pro Met Leu Asp Arg Arg Ser Gln Arg Ser Glu 210 215 220 gag aga tgt gtg gaa att cca tgacttgtgg aatttggcat tcagcaatgt 723 Glu Arg Cys Val Glu Ile Pro 225 230 ggaaattcta aagctccctg agaacaggat gactcgtgtt tgaaggatct tatttaaaat 783 tgtttttgta ttttcttaaa gcaatattca ctgttacacc ttggggactt ctttgtttat 843 ccattctttt atcctttata tttcatttta aactatattt gaacgacatt ccccccgaaa 903 aattgaaatg taaagatgag gcagagaata aagtgttcta tgaaattcag aactttattt 963 ctgaatgtaa catccctaat aacaaccttc attcttctaa tacagcaaaa taaaaattta 1023 acaaccaagg aatagtattt aagaaaatgt tgaaataatt tttttaaaat agcattacag 1083 actgaggcgg tcctgaagca atggtttttc actctcttat tgagccaatt aaattgacat 1143 tgctttgaca atttaaaact tctataaagg tgaatatttt tcatacattt ctattttata 1203 tgaatatact ttttatatat ttattattat taaatatttc tacttaatga atcaaaattt 1263 tgttttaaag tctactttat gtaaataaga acaggttttg gggaaaaaaa tcttatgatt 1323 tctggattga tatctgaatt aaaactatca acaacaagga agtctactct gtacaattgt 1383 ccctcattta aaagatatat taagcttttc ttttctgttt gtttttgttt tgtttagttt 1443 ttaatcctgt cttagaagaa cttatcttta ttctcaaaat taaatgtaat ttttttagtg 1503 acaaagaaga aaggaaacct cattactcaa tccttctggc caagagtgtc ttgcttgtgg 1563 cgccttcctc atctctatat aggaggatcc catgaatgat ggtttattgg gaactgctgg 1623 ggtcgacccc atacagagaa ctcagcttga agctggaagc acacagtggg tagcaggaga 1683 aggaccggtg ttggtaggtg cctacagaga ctatagagct agacaaagcc ctccaaactg 1743 gcccctcctg ctcactgcct ctcctgagta gaaatctggt gacctaaggc tcagtgcggt 1803 caacagaaag ctgccttctt cacttgaggc taagtcttca tatatgttta aggttgtctt 1863 tctagtgagg agatacatat cagagaacat ttgtacaatt ccccatgaaa attgctccaa 1923 agttgataac aatatagtcg gtgcttctag ttatatgcaa gtactcagtg ataaatggat 1983 taaaaaatat tcagaaatgt attggggggt ggaggagaat aagaggcaga gcaagagcta 2043 gagaattggt ttccttgctt ccctgtatgc tcagaaaaca ttgatttgag catagacgca 2103 gagactgaaa aaaaaaaaat gctcgagcgg ccgccatatc cttggt 2149 <210> 13 <211> 231 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Met Pro Lys His Cys Phe Leu Gly Phe Leu Ile Ser Phe Phe Leu 1 5 10 15 Thr Gly Val Ala Gly Thr Gln Ser Thr His Glu Ser Leu Lys Pro Gln 20 25 30 Arg Val Gln Phe Gln Ser Arg Asn Phe His Asn Ile Leu Gln Trp Gln 35 40 45 Pro Gly Arg Ala Leu Thr Gly Asn Ser Ser Val Tyr Phe Val Gln Tyr 50 55 60 Lys Ile Tyr Gly Gln Arg Gln Trp Lys Asn Lys Glu Asp Cys Trp Gly 65 70 75 80 Thr Gln Glu Leu Ser Cys Asp Leu Thr Ser Glu Thr Ser Asp Ile Gln 85 90 95 Glu Pro Tyr Tyr Gly Arg Val Arg Ala Ala Ser Ala Gly Ser Tyr Ser 100 105 110 Glu Trp Ser Met Thr Pro Arg Phe Thr Pro Trp Trp Glu Thr Lys Ile 115 120 125 Asp Pro Pro Val Met Asn Ile Thr Gln Val Asn Gly Ser Leu Leu Val 130 135 140 Ile Leu His Ala Pro Asn Leu Pro Tyr Arg Tyr Gln Lys Glu Lys Asn 145 150 155 160 Val Ser Ile Glu Asp Tyr Tyr Glu Leu Leu Tyr Arg Val Phe Ile Ile 165 170 175 Asn Asn Ser Leu Glu Lys Glu Gln Lys Val Tyr Glu Gly Ala His Arg 180 185 190 Ala Val Glu Ile Glu Ala Leu Thr Pro His Ser Ser Tyr Cys Val Val 195 200 205 Ala Glu Ile Tyr Gln Pro Met Leu Asp Arg Arg Ser Gln Arg Ser Glu 210 215 220 Glu Arg Cys Val Glu Ile Pro 225 230 <210> 14 <211> 699 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-Terminal Fc4 tag <400> 14 gagcccagat cttcagacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgag 60 ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc catcctccat cgagaaaacc 360 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa 699 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glu-Glu (CEE) Peptide Tag <400> 15 Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glu-Glu (CEE) Peptide Tag with spacer <400> 16 Gly Ser Gly Gly Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5 10 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC39289 <400> 17 tccgaggagt caatgctaag 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer ZC39290 <400> 18 tccaagcttt ttcactgtct 20 <210> 19 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer ZC39776 <400> 19 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Sequence <220> <223> IL-20 TaqMan�probe ZC40544 <400> 27 agaaggacct ccggctctgt catgc 25 <210> 28 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC45,593 <400> 28 caggaaatcc atgccgagtt gagacgcttc cgtagacacg cccctgagga cccctcg 57 <210> 29 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC45,592 <400> 29 tctgggctca ccgcttccag acccgcttcc agacccgctt cctgtccggt ctggcagtgt 60 ctt 63 <210> 30 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC45,591 <400> 30 gaccggacag gaagcgggtc tggaagcggg tctggaagcg gtgagcccag aggccccaca 60 atc 63 <210> 31 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC45,594 <400> 31 agagctgttt taaggcgcgc ctctagatta tttttattta cccggagtcc gggagaa 57 <210> 32 <211> 531 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)...(531) <400> 32 atg aaa ggc ttt ggt ctt gcc ttt gga ctg ttc tcc gct gtg ggt ttt 48 Met Lys Gly Phe Gly Leu Ala Phe Gly Leu 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Val Cys His Ser 115 120 125 cac atg gca tgt cat tgt ggg gaa gaa gca atg gag aaa tac aac caa 432 His Met Ala Cys His Cys Gly Glu Glu Ala Met Glu Lys Tyr Asn Gln 130 135 140 att ctg agt cac ttc ata gag ttg gaa ctt cag gca gcg gtg gta aag 480 Ile Leu Ser His Phe Ile Glu Leu Glu Leu Gln Ala Ala Val Val Lys 145 150 155 160 gct ttg gga gaa cta ggc att ctt ctg aga tgg atg gag gag atg cta 528 Ala Leu Gly Glu Leu Gly Ile Leu Leu Arg Trp Met Glu Glu Met Leu 165 170 175 tag 531 * <210> 33 <211> 176 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33 Met Lys Gly Phe Gly Leu Ala Phe Gly Leu Phe Ser Ala Val Gly Phe 1 5 10 15 Leu Leu Trp Thr Pro Leu Thr Gly Leu Lys Thr Leu His Leu Gly Ser 20 25 30 Cys Val Ile Thr Ala Asn Leu Gln Ala Ile Gln Lys Glu Phe Ser Glu 35 40 45 Ile Arg Asp Ser Val Gln Ala Glu Asp Thr Asn Ile Asp Ile Arg Ile 50 55 60 Leu Arg Thr Thr Glu Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ser Leu Asp Arg Cys 65 70 75 80 Cys Phe Leu Arg His Leu Val Arg Phe Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys 85 90 95 Val Tyr Gln Thr Pro Asp His 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atc acc cgg 288 Gly Glu Arg Asp Trp Val Ala Lys Lys Gly Cys Gln Arg Ile Thr Arg 85 90 95 aag tcc tgc aac ctg acg gtg gag acg ggc aac ctc acg gag ctc tac 336 Lys Ser Cys Asn Leu Thr Val Glu Thr Gly Asn Leu Thr Glu Leu Tyr 100 105 110 tat gcc agg gtc acc gct gtc agt gcg gga ggc cgg tca gcc acc aag 384 Tyr Ala Arg Val Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser Ala Thr Lys 115 120 125 atg act gac agg ttc agc tct ctg cag cac act acc ctc aag cca cct 432 Met Thr Asp Arg Phe Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Leu Lys Pro Pro 130 135 140 gat gtg acc tgt atc tcc aaa gtg aga tcg att cag atg att gtt cat 480 Asp Val Thr Cys Ile Ser Lys Val Arg Ser Ile Gln Met Ile Val His 145 150 155 160 cct acc ccc acg cca atc cgt gca ggc gat ggc cac cgg cta acc ctg 528 Pro Thr Pro Thr Pro Ile Arg Ala Gly Asp Gly His Arg Leu Thr Leu 165 170 175 gaa gac atc ttc cat gac ctg ttc tac cac tta gag ctc cag gtc aac 576 Glu Asp Ile Phe His Asp Leu Phe Tyr His Leu Glu Leu Gln Val Asn 180 185 190 cgc acc tac caa atg cac ctt gga ggg aag cag aga gaa tat gag ttc 624 Arg Thr Tyr Gln Met His Leu Gly Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe 195 200 205 ttc ggc ctg acc cct gac aca gag ttc ctt ggc acc atc atg att tgc 672 Phe Gly Leu Thr Pro Asp Thr Glu Phe Leu Gly Thr Ile Met Ile Cys 210 215 220 gtt ccc acc tgg gcc aag gag agt gcc ccc tac atg tgc cga gtg aag 720 Val Pro Thr Trp Ala Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Met Cys Arg Val Lys 225 230 235 240 aca ctg cca gac cgg aca gga agc ggg tct gga agc ggg tct gga agc 768 Thr Leu Pro Asp Arg Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 245 250 255 ggt gag ccc aga ggc ccc aca atc aag ccc tgt cct cca tgc aaa tgc 816 Gly Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys 260 265 270 cca gca cct aac ctc ttg ggt gga cca tcc gtc ttc atc ttc cct cca 864 Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 275 280 285 aag atc aag gat gta ctc atg atc tcc ctg agc ccc ata gtc aca tgt 912 Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys 290 295 300 gtg gtg gtg gat gtg agc gag gat gac cca gat gtc cag atc agc tgg 960 Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp 305 310 315 320 ttt gtg aac aac gtg gaa gta cac aca gct cag aca caa acc cat aga 1008 Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg 325 330 335 gag gat tac aac agt act ctc cgg gtg gtc agt gcc ctc ccc atc cag 1056 Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln 340 345 350 cac cag gac tgg atg agt ggc aag gag ttc aaa tgc aag gtc aac aac 1104 His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 355 360 365 aaa gac ctc cca gcg ccc atc gag aga acc atc tca aaa ccc aaa ggg 1152 Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly 370 375 380 tca gta aga gct cca cag gta tat gtc ttg cct cca cca gaa gaa gag 1200 Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu 385 390 395 400 atg act aag aaa cag gtc act ctg acc tgc atg gtc aca gac ttc atg 1248 Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met 405 410 415 cct gaa gac att tac gtg gag tgg acc aac aac ggg aaa aca gag cta 1296 Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu 420 425 430 aac tac aag aac act gaa cca gtc ctg gac tct gat ggt tct tac ttc 1344 Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe 435 440 445 atg tac agc aag ctg aga gtg gaa aag aag aac tgg gtg gaa aga aat 1392 Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn 450 455 460 agc tac tcc tgt tca gtg gtc cac gag ggt ctg cac aat cac cac acg 1440 Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 465 470 475 480 act aag agc ttc tcc cgg act ccg ggt aaa taa 1473 Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys * 485 490 <210> 40 <211> 490 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-22RA Extracellular domain with tPA leader and fused to murine gamma 2a heavy chain Fc region (mG2a) <400> 40 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg 20 25 30 Phe Arg Arg His Ala Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gln His Val 35 40 45 Lys Phe Gln Ser Ser Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Ser Gly 50 55 60 Pro Glu Gly Thr Pro Asp Thr Val Tyr Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr 65 70 75 80 Gly Glu Arg Asp Trp Val Ala Lys Lys Gly Cys Gln Arg Ile Thr Arg 85 90 95 Lys Ser Cys Asn Leu Thr Val Glu Thr Gly Asn Leu Thr Glu Leu Tyr 100 105 110 Tyr Ala Arg Val Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser Ala Thr Lys 115 120 125 Met Thr Asp Arg Phe Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Leu Lys Pro Pro 130 135 140 Asp Val Thr Cys Ile Ser Lys Val Arg Ser Ile Gln Met Ile Val His 145 150 155 160 Pro Thr Pro Thr Pro Ile Arg Ala Gly Asp Gly His Arg Leu Thr Leu 165 170 175 Glu Asp Ile Phe His Asp Leu Phe Tyr His Leu Glu Leu Gln Val Asn 180 185 190 Arg Thr Tyr Gln Met His Leu Gly Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe 195 200 205 Phe Gly Leu Thr Pro Asp Thr Glu Phe Leu Gly Thr Ile Met Ile Cys 210 215 220 Val Pro Thr Trp Ala Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Met Cys Arg Val Lys 225 230 235 240 Thr Leu Pro 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Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn 450 455 460 Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 465 470 475 480 Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 485 490 <210> 41 <211> 1834 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (43)...(1788) <400> 41 ttggtccaga gccgaggccc gaaggggccc tggagggacc ca atg aag aca cta 54 Met Lys Thr Leu 1 ctg acc atc ctg acg gtg gga tcc ctg gcc gct cac acc act gtg gac 102 Leu Thr Ile Leu Thr Val Gly Ser Leu Ala Ala His Thr Thr Val Asp 5 10 15 20 aca tcc ggt ctc ctt caa cac gtg aaa ttc cag tcc agc aac ttt gag 150 Thr Ser Gly Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln Ser Ser Asn Phe Glu 25 30 35 aac atc ttg acg tgg gat ggt ggg ccc gct agc acc tct gac acc gtc 198 Asn Ile Leu Thr Trp Asp Gly Gly Pro Ala Ser Thr Ser Asp Thr Val 40 45 50 tac agt gtg gaa tat aag aaa tac gga gag aga aag tgg ctg gcc aag 246 Tyr Ser Val Glu Tyr Lys Lys Tyr Gly Glu Arg Lys Trp Leu Ala Lys 55 60 65 gcg ggc tgc cag cgg atc acc cag aag ttc tgc aac ctg act atg gag 294 Ala Gly Cys Gln Arg Ile Thr Gln Lys Phe Cys Asn Leu Thr Met Glu 70 75 80 acc cgc aac cac act gag ttt tac tac gcc aag gtc acg gca gtc agc 342 Thr Arg Asn His Thr Glu Phe Tyr Tyr Ala Lys Val Thr Ala Val Ser 85 90 95 100 gca gga ggc cca cca gtc aca aag atg act gat cgt ttc agc tcg ctg 390 Ala Gly Gly Pro Pro Val Thr Lys Met Thr Asp Arg Phe Ser Ser Leu 105 110 115 cag cac act acc atc aaa ccg cct gat gtg acc tgt atc ccc aaa gtg 438 Gln His Thr Thr Ile Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys Ile Pro Lys Val 120 125 130 agg tcc att cag atg ctg gtc cac ccc aca ctc aca ccg gtc ctc tcg 486 Arg Ser Ile Gln Met Leu Val His Pro Thr Leu Thr Pro Val Leu Ser 135 140 145 gaa gat ggc cac cag cta acc ctg gag gag att ttc cat gac ctg ttc 534 Glu Asp Gly His Gln Leu Thr Leu Glu Glu Ile Phe His Asp Leu Phe 150 155 160 tac cgc tta gag ctc cac gtc aac cac acc tac cag atg cac ctt gaa 582 Tyr Arg Leu Glu Leu His Val Asn His Thr Tyr Gln Met His Leu Glu 165 170 175 180 ggc aaa cag aga gaa tac gag ttc ctt ggc ctg act ccc gac aca gag 630 Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Leu Gly Leu Thr Pro Asp Thr Glu 185 190 195 ttc ctc ggc tcc atc aca att ttg act ccg ata ttg tcc aag gaa agt 678 Phe Leu Gly Ser Ile Thr Ile Leu Thr Pro Ile Leu Ser Lys Glu Ser 200 205 210 gcc ccc tac gtg tgc cga gtg aag acg ctg ccc gat cgg acg tgg gcc 726 Ala Pro Tyr Val Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Asp Arg Thr Trp Ala 215 220 225 tac tcc ttc tcg ggc gcc gtg ctc ttt tcc atg ggt ttc ctc gtc ggc 774 Tyr Ser Phe Ser Gly Ala Val Leu Phe Ser Met Gly Phe Leu Val Gly 230 235 240 ttg ctc tgt tat ctg ggc tac aaa tac atc acc aag cca cct gta cct 822 Leu Leu Cys Tyr Leu Gly Tyr Lys Tyr Ile Thr Lys Pro Pro Val Pro 245 250 255 260 cct aac tcc ctg aac gtc caa cgt gtc ctg acc ttt caa ccc cta cgc 870 Pro Asn Ser Leu Asn Val Gln Arg Val Leu Thr Phe Gln Pro Leu Arg 265 270 275 ttc atc caa gaa cac gta ctg atc cct gtc ttg gac ctc agt ggc ccc 918 Phe Ile Gln Glu His Val Leu Ile Pro Val Leu Asp Leu Ser Gly Pro 280 285 290 agc agt ctg cct cag ccc atc cag tac tcc caa gtg gtg gtg tct ggg 966 Ser Ser Leu Pro Gln Pro Ile Gln Tyr Ser Gln Val Val Val Ser Gly 295 300 305 ccc agg gag cct cct gga gct gtg tgg cgg cag agc ctg tct gac ctc 1014 Pro Arg Glu Pro Pro Gly Ala Val Trp Arg Gln Ser Leu Ser Asp Leu 310 315 320 acc tac gta ggg cag tca gat gtc tcc atc ctg caa cct acc aac gtg 1062 Thr Tyr Val Gly Gln Ser Asp Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Asn Val 325 330 335 340 cca gct cag cag aca ctg tcc cca cca tcc tac gct ccg aag gct gtc 1110 Pro Ala Gln Gln Thr Leu Ser Pro Pro Ser Tyr Ala Pro Lys Ala Val 345 350 355 cct gag gtc cag ccc cct tcc tat gcg cct cag gta gcc tcg gat gcc 1158 Pro Glu Val Gln Pro Pro Ser Tyr Ala Pro Gln Val Ala Ser Asp Ala 360 365 370 aaa gct ctg ttc tac tca cca caa cag ggg atg aag acc agg cct gcc 1206 Lys Ala Leu Phe Tyr Ser Pro Gln Gln Gly Met Lys Thr Arg Pro Ala 375 380 385 acc tat gac ccg cag gac att ctg gac agc tgc cct gct tct tat gct 1254 Thr Tyr Asp Pro Gln Asp Ile Leu Asp Ser Cys Pro Ala Ser Tyr Ala 390 395 400 gtg tgt gtg gaa gac tct ggc aaa gac tct acc cca ggc atc ctc tcc 1302 Val Cys Val Glu Asp Ser Gly Lys Asp Ser Thr Pro Gly Ile Leu Ser 405 410 415 420 act ccc aaa tac ctc aag aca aaa ggt cag ctc cag gaa gac aca ctt 1350 Thr Pro Lys Tyr Leu Lys Thr Lys Gly Gln Leu Gln Glu Asp Thr Leu 425 430 435 gtt aga agc tgt ctc cca ggg gac ctt tct cta cag aaa gtc acc tcc 1398 Val Arg Ser Cys Leu Pro Gly Asp Leu Ser Leu Gln Lys Val Thr Ser 440 445 450 tta ggt gaa ggg gag aca cag aga cca aaa tca ctc ccc tca cct ctg 1446 Leu Gly Glu Gly Glu Thr Gln Arg Pro Lys Ser Leu Pro Ser Pro Leu 455 460 465 gga ttt tgc aca gac aga gga cct gac ctt cac aca ctg cgc agt gag 1494 Gly Phe Cys Thr Asp Arg Gly Pro Asp Leu His Thr Leu Arg Ser Glu 470 475 480 gaa cca gag aca cca cgg tac ctg aag ggg gcg ctg tct ctc ctg tcc 1542 Glu Pro Glu Thr Pro Arg Tyr Leu Lys Gly Ala Leu Ser Leu Leu Ser 485 490 495 500 tct gtg cag atc gag ggc cac cct gtc tcc ctc cct ttg cac gtc cat 1590 Ser Val Gln Ile Glu Gly His Pro Val Ser Leu Pro Leu His Val His 505 510 515 tct gtc tca tgt tcc ccc tca gac gag gga cca agt ccc tgg ggc ctg 1638 Ser Val Ser Cys Ser Pro Ser Asp Glu Gly Pro Ser Pro Trp Gly Leu 520 525 530 ctg gac tcc ctt gtg tgt cca aag gat gag ggt ccc gcg gtt gag act 1686 Leu Asp Ser Leu Val Cys Pro Lys Asp Glu Gly Pro Ala Val Glu Thr 535 540 545 gag gcc atg tgc ccc agt gct gca gcc tct gag ctg gag cag tcc aca 1734 Glu Ala Met Cys Pro Ser Ala Ala Ala Ser Glu Leu Glu Gln Ser Thr 550 555 560 gaa ctg gac tct ctt ttc aaa ggc ttg gcc ctg act gtg cag tgg gaa 1782 Glu Leu Asp Ser Leu Phe Lys Gly Leu Ala Leu Thr Val Gln Trp Glu 565 570 575 580 tcc tga agggagatcg gagcaagcag gcctaagttt cctcccgccc caccta 1834 Ser * <210> 42 <211> 581 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 42 Met Lys Thr Leu Leu Thr Ile Leu Thr Val Gly Ser Leu Ala Ala His 1 5 10 15 Thr Thr Val Asp Thr Ser Gly Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln Ser 20 25 30 Ser Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Gly Gly Pro Ala Ser Thr 35 40 45 Ser Asp Thr Val Tyr Ser Val Glu Tyr Lys Lys Tyr Gly Glu Arg Lys 50 55 60 Trp Leu Ala Lys Ala Gly Cys Gln Arg Ile Thr Gln Lys Phe Cys Asn 65 70 75 80 Leu Thr Met Glu Thr Arg Asn His Thr Glu Phe Tyr Tyr Ala Lys Val 85 90 95 Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly Pro Pro Val Thr Lys Met Thr Asp Arg 100 105 110 Phe Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Ile Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys 115 120 125 Ile Pro Lys Val Arg Ser Ile Gln Met Leu Val His Pro Thr Leu Thr 130 135 140 Pro Val Leu Ser Glu Asp Gly His Gln Leu Thr Leu Glu Glu Ile Phe 145 150 155 160 His Asp Leu Phe Tyr Arg Leu Glu Leu His Val Asn His Thr Tyr Gln 165 170 175 Met His Leu Glu Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Leu Gly Leu Thr 180 185 190 Pro Asp Thr Glu Phe Leu Gly Ser Ile Thr Ile Leu Thr Pro Ile Leu 195 200 205 Ser Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Val Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Asp 210 215 220 Arg Thr Trp Ala Tyr Ser Phe Ser Gly Ala Val Leu Phe Ser Met Gly 225 230 235 240 Phe Leu Val Gly Leu Leu Cys Tyr Leu Gly Tyr Lys Tyr Ile Thr Lys 245 250 255 Pro Pro Val Pro Pro Asn Ser Leu Asn Val Gln Arg Val Leu Thr Phe 260 265 270 Gln Pro Leu Arg Phe Ile Gln Glu His Val Leu Ile Pro Val Leu Asp 275 280 285 Leu Ser Gly Pro Ser Ser Leu Pro Gln Pro Ile Gln Tyr Ser Gln Val 290 295 300 Val Val Ser Gly Pro Arg Glu Pro Pro Gly Ala Val Trp Arg Gln Ser 305 310 315 320 Leu Ser Asp Leu Thr Tyr Val Gly Gln Ser Asp Val Ser Ile Leu Gln 325 330 335 Pro Thr Asn Val Pro Ala Gln Gln Thr Leu Ser Pro Pro Ser Tyr Ala 340 345 350 Pro Lys Ala Val Pro Glu Val Gln Pro Pro Ser Tyr Ala Pro Gln Val 355 360 365 Ala Ser Asp Ala Lys Ala Leu Phe Tyr Ser Pro Gln Gln Gly Met Lys 370 375 380 Thr Arg Pro Ala Thr Tyr Asp Pro Gln Asp Ile Leu Asp Ser Cys Pro 385 390 395 400 Ala Ser Tyr Ala Val Cys Val Glu Asp Ser Gly Lys Asp Ser Thr Pro 405 410 415 Gly Ile Leu Ser Thr Pro Lys Tyr Leu Lys Thr Lys Gly Gln Leu Gln 420 425 430 Glu Asp Thr Leu Val Arg Ser Cys Leu Pro Gly Asp Leu Ser Leu Gln 435 440 445 Lys Val Thr Ser Leu Gly Glu Gly Glu Thr Gln Arg Pro Lys Ser Leu 450 455 460 Pro Ser Pro Leu Gly Phe Cys Thr Asp Arg Gly Pro Asp Leu His Thr 465 470 475 480 Leu Arg Ser Glu Glu Pro Glu Thr Pro Arg Tyr Leu Lys Gly Ala Leu 485 490 495 Ser Leu Leu Ser Ser Val Gln Ile Glu Gly His Pro Val Ser Leu Pro 500 505 510 Leu His Val His Ser Val Ser Cys Ser Pro Ser Asp Glu Gly Pro Ser 515 520 525 Pro Trp Gly Leu Leu Asp Ser Leu Val Cys Pro Lys Asp Glu Gly Pro 530 535 540 Ala Val Glu Thr Glu Ala Met Cys Pro Ser Ala Ala Ala Ser Glu Leu 545 550 555 560 Glu Gln Ser Thr Glu Leu Asp Ser Leu Phe Lys Gly Leu Ala Leu Thr 565 570 575 Val Gln Trp Glu Ser 580 <210> 43 <211> 660 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(660) <400> 43 atg gcg tgg agt ctt ggg agc tgg ctg ggt ggc tgc ctg ctg gtg tca 48 Met Ala Trp Ser Leu Gly Ser Trp Leu Gly Gly Cys Leu Leu Val Ser 1 5 10 15 gca ttg gga atg gta cca cct ccc gaa aat gtc aga atg aat tct gtt 96 Ala Leu Gly Met Val Pro Pro Pro Glu Asn Val Arg Met Asn Ser Val 20 25 30 aat ttc aag aac att cta cag tgg gag tca cct gct ttt gcc aaa ggg 144 Asn Phe Lys Asn Ile Leu Gln Trp Glu Ser Pro Ala Phe Ala Lys Gly 35 40 45 aac ctg act ttc aca gct cag tac cta agt tat agg ata ttc caa gat 192 Asn Leu Thr Phe Thr Ala Gln Tyr Leu Ser Tyr Arg Ile Phe Gln Asp 50 55 60 aaa tgc atg aat act acc ttg acg gaa tgt gat ttc tca agt ctt tcc 240 Lys Cys Met Asn Thr Thr Leu Thr Glu Cys Asp Phe Ser Ser Leu Ser 65 70 75 80 aag tat ggt gac cac acc ttg aga gtc agg gct gaa ttt gca gat gag 288 Lys Tyr Gly Asp His Thr Leu Arg Val Arg Ala Glu Phe Ala Asp Glu 85 90 95 cat tca gac tgg gta aac atc acc ttc tgt cct gtg gat gac acc att 336 His Ser Asp Trp Val Asn Ile Thr Phe Cys Pro Val Asp Asp Thr Ile 100 105 110 att gga ccc cct gga atg caa gta gaa gta ctt gat gat tct tta cat 384 Ile Gly Pro Pro Gly Met Gln Val Glu Val Leu Asp Asp Ser Leu His 115 120 125 atg cgt ttc tta gcc cct aaa att gag aat gaa tac gaa act tgg act 432 Met Arg Phe Leu Ala Pro Lys Ile Glu Asn Glu Tyr Glu Thr Trp Thr 130 135 140 atg aag aat gtg tat aac tca tgg act tat aat gtg caa tac tgg aaa 480 Met Lys Asn Val Tyr Asn Ser Trp Thr Tyr Asn Val Gln Tyr Trp Lys 145 150 155 160 aac ggt act gat gaa aag ttt caa att act ccc cag tat gac ttt gag 528 Asn Gly Thr Asp Glu Lys Phe Gln Ile Thr Pro Gln Tyr Asp Phe Glu 165 170 175 gtc ctc aga aac ctg gag cca tgg aca act tat tgt gtt caa gtt cga 576 Val Leu Arg Asn Leu Glu Pro Trp Thr Thr Tyr Cys Val Gln Val Arg 180 185 190 ggg ttt ctt cct gat cgg aac aaa gct ggg gaa tgg agt gag cct gtc 624 Gly Phe Leu Pro Asp Arg Asn Lys Ala Gly Glu Trp Ser Glu Pro Val 195 200 205 tgt gag caa aca acc cat gac gaa acg gtc ccc tcc 660 Cys Glu Gln Thr Thr His Asp Glu Thr Val Pro Ser 210 215 220 <210> 44 <211> 220 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 44 Met Ala Trp Ser Leu Gly Ser Trp Leu Gly Gly Cys Leu Leu Val Ser 1 5 10 15 Ala Leu Gly Met Val Pro Pro Pro Glu Asn Val Arg Met Asn Ser Val 20 25 30 Asn Phe Lys Asn Ile Leu Gln Trp Glu Ser Pro Ala Phe Ala Lys Gly 35 40 45 Asn Leu Thr Phe Thr Ala Gln Tyr Leu Ser Tyr Arg Ile Phe Gln Asp 50 55 60 Lys Cys Met Asn Thr Thr Leu Thr Glu Cys Asp Phe Ser Ser Leu Ser 65 70 75 80 Lys Tyr Gly Asp His Thr Leu Arg Val Arg Ala Glu Phe Ala Asp Glu 85 90 95 His Ser Asp Trp Val Asn Ile Thr Phe Cys Pro Val Asp Asp Thr Ile 100 105 110 Ile Gly Pro Pro Gly Met Gln Val Glu Val Leu Asp Asp Ser Leu His 115 120 125 Met Arg Phe Leu Ala Pro Lys Ile Glu Asn Glu Tyr Glu Thr Trp Thr 130 135 140 Met Lys Asn Val Tyr Asn Ser Trp Thr Tyr Asn Val Gln Tyr Trp Lys 145 150 155 160 Asn Gly Thr Asp Glu Lys Phe Gln Ile Thr Pro Gln Tyr Asp Phe Glu 165 170 175 Val Leu Arg Asn Leu Glu Pro Trp Thr Thr Tyr Cys Val Gln Val Arg 180 185 190 Gly Phe Leu Pro Asp Arg Asn Lys Ala Gly Glu Trp Ser Glu Pro Val 195 200 205 Cys Glu Gln Thr Thr His Asp Glu Thr Val Pro Ser 210 215 220 <210> 45 <211> 199 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 45 Met Val Pro Pro Pro Glu Asn Val Arg Met Asn Ser Val Asn Phe Lys 1 5 10 15 Asn Ile Leu Gln Trp Glu Ser Pro Ala Phe Ala Lys Gly Asn Leu Thr 20 25 30 Phe Thr Ala Gln Tyr Leu Ser Tyr Arg Ile Phe Gln Asp Lys Cys Met 35 40 45 Asn Thr Thr Leu Thr Glu Cys Asp Phe Ser Ser Leu Ser Lys Tyr Gly 50 55 60 Asp His Thr Leu Arg Val Arg Ala Glu Phe Ala Asp Glu His Ser Asp 65 70 75 80 Trp Val Asn Ile Thr Phe Cys Pro Val Asp Asp Thr Ile Ile Gly Pro 85 90 95 Pro Gly Met Gln Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Leu His Met Arg Phe 100 105 110 Leu Ala Pro Lys Ile Glu Asn Glu Tyr Glu Thr Trp Thr Met Lys Asn 115 120 125 Val Tyr Asn Ser Trp Thr Tyr Asn Val Gln Tyr Trp Lys Asn Gly Thr 130 135 140 Asp Glu Lys Phe Gln Ile Thr Pro Gln Tyr Asp Phe Glu Val Leu Arg 145 150 155 160 Asn Leu Glu Pro Trp Thr Thr Tyr Cys Val Gln Val Arg Gly Phe Leu 165 170 175 Pro Asp Arg Asn Lys Ala Gly Glu Trp Ser Glu Pro Val Cys Glu Gln 180 185 190 Thr Thr His Asp Glu Thr Val 195 <210> 46 <211> 211 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Ser Asp Ala His Gly Thr Glu Leu Pro Ser Pro Pro Ser Val Trp Phe 1 5 10 15 Glu Ala Glu Phe Phe His His Ile Leu His Trp Thr Pro Ile Pro Asn 20 25 30 Gln Ser Glu Ser Thr Cys Tyr Glu Val Ala Leu Leu Arg Tyr Gly Ile 35 40 45 Glu Ser Trp Asn Ser Ile Ser Asn Cys Ser Gln Thr Leu Ser Tyr Asp 50 55 60 Leu Thr Ala Val Thr Leu Asp Leu Tyr His Ser Asn Gly Tyr Arg Ala 65 70 75 80 Arg Val Arg Ala Val Asp Gly Ser Arg His Ser Asn Trp Thr Val Thr 85 90 95 Asn Thr Arg Phe Ser Val Asp Glu Val Thr Leu Thr Val Gly Ser Val 100 105 110 Asn Leu Glu Ile His Asn Gly Phe Ile Leu Gly Lys Ile Gln Leu Pro 115 120 125 Arg Pro Lys Met Ala Pro Ala Asn Asp Thr Tyr Glu Ser Ile Phe Ser 130 135 140 His Phe Arg Glu Tyr Glu Ile Ala Ile Arg Lys Val Pro Gly Asn Phe 145 150 155 160 Thr Phe Thr His Lys Lys Val Lys His Glu Asn Phe Ser Leu Leu Thr 165 170 175 Ser Gly Glu Val Gly Glu Phe Cys Val Gln Val Lys Pro Ser Val Ala 180 185 190 Ser Arg Ser Asn Lys Gly Met Trp Ser Lys Glu Glu Cys Ile Ser Leu 195 200 205 Thr Arg Gln 210 <210> 47 <211> 201 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 47 Asp Glu Val Ala Ile Leu Pro Ala Pro Gln Asn Leu Ser Val Leu Ser 1 5 10 15 Thr Asn Met Lys His Leu Leu Met Trp Ser Pro Val Ile Ala Pro Gly 20 25 30 Glu Thr Val Tyr Tyr Ser Val Glu Tyr Gln Gly Glu Tyr Glu Ser Leu 35 40 45 Tyr Thr Ser His Ile Trp Ile Pro Ser Ser Trp Cys Ser Leu Thr Glu 50 55 60 Gly Pro Glu Cys Asp Val Thr Asp Asp Ile Thr Ala Thr Val Pro Tyr 65 70 75 80 Asn Leu Arg Val Arg Ala Thr Leu Gly Ser Gln Thr Ser Ala Trp Ser 85 90 95 Ile Leu Lys His Pro Phe Asn Arg Asn Ser Thr Ile Leu Thr Arg Pro 100 105 110 Gly Met Glu Ile Thr Lys Asp Gly Phe His Leu Val Ile Glu Leu Glu 115 120 125 Asp Leu Gly Pro Gln Phe Glu Phe Leu Val Ala Tyr Trp Arg Arg Glu 130 135 140 Pro Gly Ala Glu Glu His Val Lys Met Val Arg Ser Gly Gly Ile Pro 145 150 155 160 Val His Leu Glu Thr Met Glu Pro Gly Ala Ala Tyr Cys Val Lys Ala 165 170 175 Gln Thr Phe Val Lys Ala Ile Gly Arg Tyr Ser Ala Phe Ser Gln Thr 180 185 190 Glu Cys Val Glu Val Gln Gly Glu Ala 195 200 <210> 48 <211> 68 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 48 His Thr Thr Val Asp Thr Ser Gly Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln 1 5 10 15 Ser Ser Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Gly Gly Pro Ala Ser 20 25 30 Thr Ser Asp Thr Val Tyr Ser Val Glu Tyr Lys Lys Tyr Gly Glu Arg 35 40 45 Lys Trp Leu Ala Lys Ala Gly Cys Gln Arg Ile Thr Gln Lys Phe Cys 50 55 60 Asn Leu Thr Met 65 <210> 49 <211> 26 <212> PRT <213> mus musculus <400> 49 Glu Thr Arg Asn His Thr Glu Phe Tyr Tyr Ala Lys Val Thr Ala Val 1 5 10 15 Ser Ala Gly Gly Pro Pro Val Thr Lys Met 20 25 <210> 50 <211> 28 <212> PRT <213> mus musculus <400> 50 Thr Asp Arg Phe Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Ile Lys Pro Pro Asp 1 5 10 15 Val Thr Cys Ile Pro Lys Val Arg Ser Ile Gln Met 20 25 <210> 51 <211> 40 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 Leu Val His Pro Thr Leu Thr Pro Val Leu Ser Glu Asp Gly His Gln 1 5 10 15 Leu Thr Leu Glu Glu Ile Phe His Asp Leu Phe Tyr Arg Leu Glu Leu 20 25 30 His Val Asn His Thr Tyr Gln Met 35 40 <210> 52 <211> 50 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 52 His Leu Glu Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Leu Gly Leu Thr Pro 1 5 10 15 Asp Thr Glu Phe Leu Gly Ser Ile Thr Ile Leu Thr Pro Ile Leu Ser 20 25 30 Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Val Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Leu Val 35 40 45 Pro Arg 50 <210> 53 <211> 70 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 53 His Leu Glu Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Leu Gly Leu Thr Pro 1 5 10 15 Asp Thr Glu Phe His Leu Glu Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Leu 20 25 30 Gly Leu Thr Pro Asp Thr Glu Phe Leu Gly Ser Ile Thr Ile Leu Thr 35 40 45 Pro Ile Leu Ser Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Val Cys Arg Val Lys Thr 50 55 60 Leu Pro Leu Val Pro Arg 65 70 <210> 54 <211> 46 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 54 Glu Thr Arg Asn His Thr Glu Phe Tyr Tyr Ala Lys Val Thr Ala Val 1 5 10 15 Ser Ala Gly Gly Glu Thr Arg Asn His Thr Glu Phe Tyr Tyr Ala Lys 20 25 30 Val Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly Pro Pro Val Thr Lys Met 35 40 45 <210> 55 <211> 48 <212> PRT <213> mus musculus <220> <221> VARIANT <222> 6, 11, 13, <223> Xaa = Any Amino Acid <400> 55 Thr Asp Arg Phe Ser Xaa Leu Gln His Thr Xaa Ile Xaa Pro Xaa Asp 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Ile Thr Asp Arg Phe Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Ile 20 25 30 Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys Ile Pro Lys Val Arg Ser Ile Gln Met 35 40 45 <210> 56 <211> 92 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 56 Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln Ser Ser 1 5 10 15 Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Ser Gly Pro Glu Gly Thr Pro 20 25 30 Asp Thr Val Tyr Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr Gly Glu Arg Asp Trp 35 40 45 Val Ala Lys Lys Gly Cys Gln Arg Ile Thr Arg Lys Ser Cys Asn Leu 50 55 60 Thr Val Glu Thr Gly Asn Leu Thr Glu Leu Tyr Tyr Ala Arg Val Thr 65 70 75 80 Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser Ala Thr Lys Met 85 90 <210> 57 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Thr Asp Arg Phe Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Leu Lys Pro Pro Asp 1 5 10 15 Val Thr Cys Ile Ser Lys Val Arg Ser Ile Gln Met 20 25 <210> 58 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Ile Val His Pro Thr Pro Thr Pro Ile Arg Ala Gly Asp Gly His Arg 1 5 10 15 Leu Thr Leu Glu Asp Ile Phe His Asp Leu Phe Tyr His Leu Glu Leu 20 25 30 Gln Val Asn Arg Thr Tyr Gln Met 35 40 <210> 59 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 His Leu Gly Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Phe Gly Leu Thr Pro 1 5 10 15 Asp Thr Glu Phe Leu Gly Thr Ile Met 20 25 <210> 60 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Ile Cys Val Pro Thr Trp Ala Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Met 1 5 10 <210> 61 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Asp Arg Thr Trp Thr 1 5 10 <210> 62 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A murine IL-22RA soluble receptor with cleavage site (Leu Val Pro Arg) remaining on C-Terminus <400> 62 His Thr Thr Val Asp Thr Ser Gly Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln 1 5 10 15 Ser Ser Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Gly Gly Pro Ala Ser 20 25 30 Thr Ser Asp Thr Val Tyr Ser Val Glu Tyr Lys Lys Tyr Gly Glu Arg 35 40 45 Lys Trp Leu Ala Lys Ala Gly Cys Gln Arg Ile Thr Gln Lys Phe Cys 50 55 60 Asn Leu Thr Met Glu Thr Arg Asn His Thr Glu Phe Tyr Tyr Ala Lys 65 70 75 80 Val Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly Pro Pro Val Thr Lys Met Thr Asp 85 90 95 Arg Phe Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Ile Lys Pro Pro Asp Val Thr 100 105 110 Cys Ile Pro Lys Val Arg Ser Ile Gln Met Leu Val His Pro Thr Leu 115 120 125 Thr Pro Val Leu Ser Glu Asp Gly His Gln Leu Thr Leu Glu Glu Ile 130 135 140 Phe His Asp Leu Phe Tyr Arg Leu Glu Leu His Val Asn His Thr Tyr 145 150 155 160 Gln Met His Leu Glu Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Leu Gly Leu 165 170 175 Thr Pro Asp Thr Glu Phe Leu Gly Ser Ile Thr Ile Leu Thr Pro Ile 180 185 190 Leu Ser Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Val Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro 195 200 205 Leu Val Pro Arg 210

Claims (73)

1. (a) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 1(Pro)부터 아미노산 번호 6(Asp)까지로 구성된 폴리펩티드;

   (b) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 26(Ser)부터 아미노산 번호 32(Pro)까지로 구성된 폴리펩티드;

   (c) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 41(Lys)부터 아미노산 번호 47(Asp)까지로 구성된 폴리펩티드;

   (d) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 아미노산 번호 49(Val)부터 아미노산 번호 62(Cys)까지로 구성된 폴리펩티드;

   (e) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 41(Lys)부터 아미노산 번호 62(Cys)까지로 구성된 폴리펩티드;

   (f) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 84(Ala)부터 아미노산 번호 97(Ser)까지로 구성된 폴리펩티드;

   (g) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 103(Thr)부터 아미노산 번호 108(Asp)까지로 구성된 폴리펩티드;

   (h) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 130(Arg)부터 아미노산 번호 135(His)까지로 구성된 폴리펩티드;

   (i) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 164(Gly)부터 아미노산 번호 166(Lys)까지로 구성된 폴리펩티드;

   (j) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 175(Tyr)부터 아미노산 번호 179(Glu)까지로 구성된 폴리펩티드;

   (k) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 193(Lys)부터 아미노산 번호 196(Ala)까지로 구성된 폴리펩티드;

   (l) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 203(Lys)부터 아미노산 번호 209(Thr)까지로 구성된 폴리펩티드; 및

   (m) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; 및

   (n) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드

   로 구성되는 군에서 선택되는, 동물에서 면역반응을 도출하여 항체를 생산하는 폴리펩티드를 동물에 접종하는 단계; 및

   동물로부터 항체를 분리하는 단계를 포함하며, 이때 항체는 IL-22RA 폴리펩티드(SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3)과 특이적으로 결합하여, IL-20(SEQ ID NO:8) 또는 IL-22(SEQ ID NO:6)의 활성을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드에 대한 항체 생산 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 방법에 의해 생산된 항체는 IL-20(SEQ ED NO:8) 또는 IL-22(SEQ ID NO:6) 중 하나의 전-염증 활성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 방법에 의해 생산된 항체는 IL-20(SEQ ED NO:8) 또는 IL-22(SEQ ID NO:6) 중 하나와 IL-22RA(SEQ ID NO:2)의 상호작용을 중화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 항체에 의한 중화는 시험관내 세포-기반 중화 분석에서 IL-20(SEQ ED NO:8) 또는 IL-22(SEQ ED NO:6) 중 하나의 중화를 나타냄으로써 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 방법에 의해 생산된 항체는 IL-20(SEQ ED NO:8) 및 IL-22(SEQ ID NO:6) 둘 다의 전-염증 활성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 방법에 의해 생산된 항체는 IL-20(SEQ ED NO:8) 및 IL-22(SEQ ID NO:6) 둘 다와 IL-22RA(SEQ ID NO:2)의 상호작용을 중화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 항체에 의한 중화는 시험관내 세포-기반 중화 분석에서 IL-20(SEQ ED NO:8) 및 IL-22(SEQ ED NO:6) 둘 다의 중화를 나타냄으로써 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. SEQ ID NO:2 또는 SEQ TD NO:3의 폴리펩티드에 결합하는 제 1 항의 방법에 의해 생산된 항체.
9. 제 2 항에 있어서, 항체는 (a) 폴리클로날 항체, (b) 쥐과 모노클로날 항체, (c) (b)로부터 유래된 사람화 항체, (d) 항체 단편, 또는 (e) 사람 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
10. 제 2 항에 있어서, 항체는 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩티드 태크, 자기 입자, 또는 독소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
11. 제 9 항에 있어서, 항체는 PEG화를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
12. 제 5 항에 있어서, 항체는 (a) 폴리클로날 항체, (b) 쥐과 모노클로날 항체, (c) (b)로부터 유래된 사람화 항체, (d) 항체 단편, 또는 (e) 사람 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
13. 제 5 항에 있어서, 항체는 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩티드 태크, 자기 입자, 또는 독소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
14. 제 12 항에 있어서, 항체는 PEG화를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
15. SEQ ID NO:3에 나타낸 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 폴리펩티드와 결합하고; IL-20(SEQ ID NO:8) 또는 IL-22(SEQ ID NO:6) 중 하나의 전-염증 활성을 감소시키는 항체 또는 항체 단편.
16. 제 15 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편은 IL-20(SEQ ID NO:8) 및 IL-22 (SEQ ID NO:6) 둘 다의 전-염증 활성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 단편.
17. 제 15 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편은 (a) 폴리클로날 항체, (b) 쥐과 모노클로날 항체, (c) (b)로부터 유래된 사람화 항체, (d) 항체 단편, 또는 (e) 사람 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 단편.
18. 제 15 항에 있어서, 항체는 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩티드 태크, 자기 입자, 또는 독소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 단편.
19. 제 17 항에 있어서, 항체는 PEG화를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
20. 제 16 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편은 (a) 폴리클로날 항체, (b) 쥐과 모노클로날 항체, (c) (b)로부터 유래된 사람화 항체, (d) 항체 단편, 또는 (e) 사람 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 단편.
21. 제 16 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편은 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩티드 태크, 자기 입자, 또는 독소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 단편.
22. 제 20 항에 있어서, 항체는 PEG화를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
23. 항체 없이 배양된 골수 또는 말초혈 세포와 비교하여, 골수 또는 말초혈 세포에서 조혈세포의 증식 또는 분화를 감소시키기에 충분한 양의 제 3 항에 따른 항체를 포함하는 조성물과 함께 골수 또는 말초혈 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 조혈세포 및 조혈세포 전구체의 IL-22-유도 또는 IL-20-유도 증식 또는 분화를 감소 또는 억제하는 방법.
24. 제 23 항에 있어서, 조혈세포 및 조혈세포 전구체는 림프양 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제 24 항에 있어서, 림프양 세포는 대식세포 또는 T 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
26. 염증을 가진 포유동물에게 염증을 감소시키기에 충분한 양으로 제 3 항에 따른 항체 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, IL-22-유도 또는 IL-20-유도 염증을 감소시키는 방법.
27. 항체 없이 배양된 골수 또는 말초혈 세포와 비교하여, 골수 또는 말초혈 세포에서 조혈세포의 증식 또는 분화를 감소시키기에 충분한 양의 제 5 항에 따른 항체를 포함하는 조성물과 함께 골수 또는 말초혈 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 조혈세포 및 조혈세포 전구체의 IL-22-유도 및 IL-20-유도 증식 또는 분화를 감소 또는 억제하는 방법.
28. 제 27 항에 있어서, 조혈세포 및 조혈세포 전구체는 림프양 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제 28 항에 있어서, 림프양 세포는 대식세포 또는 T 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
30. 염증을 가진 포유동물에게 염증을 감소시키기에 충분한 양으로 제 5 항에 따른 항체 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, IL-22-유도 또는 IL-20-유도 염증을 감소시키는 방법.
31. 항체 또는 항체 단편 없이 배양된 골수 또는 말초혈 세포와 비교하여, 골수 또는 말초혈 세포에서 조혈세포의 증식 또는 분화를 감소시키기에 충분한 양의 제 15 항에 따른 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물과 함께 골수 또는 말초혈 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 조혈세포 및 조혈세포 전구체의 IL-22-유도 및 IL-20-유도 증식 또는 분화를 감소 또는 억제하는 방법.
32. 제 31 항에 있어서, 조혈세포 및 조혈세포 전구체는 림프양 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
33. 제 32 항에 있어서, 림프양 세포는 대식세포 또는 T 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
34. 염증을 가진 포유동물에게 염증을 감소시키기에 충분한 양으로 제 15 항에 따른 항체 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, IL-22-유도 또는 IL-20-유도 염증을 감소시키는 방법.
35. 항체 단편 없이 배양된 골수 또는 말초혈 세포와 비교하여, 골수 또는 말초혈 세포에서 조혈세포의 증식 또는 분화를 감소시키기에 충분한 양의 제 16 항에 따른 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물과 함께 골수 또는 말초혈 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 조혈세포 및 조혈세포 전구체의 IL-22-유도 및 IL-20-유도 증식 또는 분화를 감소 또는 억제하는 방법.
36. 제 35 항에 있어서, 조혈세포 및 조혈세포 전구체는 림프양 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
37. 제 36 항에 있어서, 림프양 세포는 대식세포 또는 T 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
38. 염증을 가진 포유동물에게 염증을 감소시키기에 충분한 양으로 제 16 항에 따른 항체 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, IL-22-유도 또는 IL-20-유도 염증을 감소시키는 방법.
39. (1) 혈청 아밀로이드 A 단백질의 수준을 측정하는 단계;

    (2) 허용되는 약학적 부형제 중에 제 3 항에 따른 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계;

    (3) 혈청 아밀로이드 A 단백질의 투여 후 수준을 측정하는 단계;

    (4) 단계 (1)에서의 혈청 아밀로이드 A 단백질 수준과 단계 (3)에서의 혈청 아밀로이드 A 단백질 수준을 비교하는 단계를 포함하며,

    이때 혈청 아밀로이드 A 단백질 수준이 증가하지 않거나 감소하는 것은 염증 반응이 억제된 표시인 것을 특징으로 하는, 염증을 가진 포유동물에서 염증 반응을 억제하는 방법.
40. (1) 혈청 아밀로이드 A 단백질의 수준을 측정하는 단계;

    (2) 허용되는 약학적 부형제 중에 제 5 항에 따른 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계;

    (3) 혈청 아밀로이드 A 단백질의 투여 후 수준을 측정하는 단계;

    (4) 단계 (1)에서의 혈청 아밀로이드 A 단백질 수준과 단계 (3)에서의 혈청 아밀로이드 A 단백질 수준을 비교하는 단계를 포함하며,

    이때 혈청 아밀로이드 A 단백질 수준이 증가하지 않거나 감소하는 것은 염증 반응이 억제된 표시인 것을 특징으로 하는, 염증을 가진 포유동물에서 염증 반응을 억제하는 방법.
41. (1) 혈청 아밀로이드 A 단백질의 수준을 측정하는 단계;

    (2) 허용되는 약학적 부형제 중에 제 15 항에 따른 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계;

    (3) 혈청 아밀로이드 A 단백질의 투여 후 수준을 측정하는 단계;

    (4) 단계 (1)에서의 혈청 아밀로이드 A 단백질 수준과 단계 (3)에서의 혈청 아밀로이드 A 단백질 수준을 비교하는 단계를 포함하며,

    이때 혈청 아밀로이드 A 단백질 수준이 증가하지 않거나 감소하는 것은 염증 반응이 억제된 표시인 것을 특징으로 하는, 염증을 가진 포유동물에서 염증 반응을 억제하는 방법.
42. (1) 혈청 아밀로이드 A 단백질의 수준을 측정하는 단계;

    (2) 허용되는 약학적 부형제 중에 제 16 항에 따른 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계;

    (3) 혈청 아밀로이드 A 단백질의 투여 후 수준을 측정하는 단계;

    (4) 단계 (1)에서의 혈청 아밀로이드 A 단백질 수준과 단계 (3)에서의 혈청 아밀로이드 A 단백질 수준을 비교하는 단계를 포함하며,

    이때 혈청 아밀로이드 A 단백질 수준이 증가하지 않거나 감소하는 것은 염증 반응이 억제된 표시인 것을 특징으로 하는, 염증을 가진 포유동물에서 염증 반응을 억제하는 방법.
43. 포유동물에 IL-22 또는 IL-20의 길항제를 투여하여 염증을 감소시키는 단계를 포함하며, 여기서 길항제는 (i) IL-22RA(SEQ ID NO:3)의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편과 특이적으로 결합하는 항체, 항체 단편 또는 결합 폴리펩티드, 또는 (ii) IL-22RA(SEQ ID NO:3)의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 포함하고, IL-22 (SEQ ID NO:6) 또는 IL-20(SEQ ID NO:8) 중 하나의 염증 활성이 감소하는 것을 특징으로 하는, IL-22 또는 IL-20이 어떤 역할을 하는 염증 질환으로 고생하는 포유동물의 치료 방법.
44. 제 43 항에 있어서, 질환은 만성 염증성 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
45. 제 44 항에 있어서, 질환은 염증성 장 질환, 궤양성 결장염, 크론병, 관절염, 아토피 피부염 또는 건선을 포함하는 만성 염증성 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
46. 제 43 항에 있어서, 질환은 급성 염증성 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
47. 제 46 항에 있어서, 질환은 내독소혈증, 패혈증, 독성쇼크 증후군 또는 감염성 질환을 포함하는 급성 염증성 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
48. 제 43 항에 있어서, 항체, 항체 단편, 또는 결합 폴리펩티드는 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩티드 태크, 자기 입자, 또는 독소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
49. 포유동물에 IL-22 또는 IL-20의 길항제를 투여하여 염증을 감소시키는 단계를 포함하며, 여기서 길항제는 (i) IL-22RA(SEQ ID NO:3)의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편과 특이적으로 결합하는 항체, 항체 단편 또는 결합 폴리펩티드, 또는 (ii) IL-22RA(SEQ ID NO:3)의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 포함하고, IL-22 (SEQ ID NO:6) 및 IL-20(SEQ ID NO:8) 둘 다의 염증 활성이 감소하는 것을 특징으로 하는, IL-22 또는 IL-20이 어떤 역할을 하는 염증 질환으로 고생하는 포유동물의 치료 방법.
50. 제 49 항에 있어서, 질환은 만성 염증성 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
51. 제 50 항에 있어서, 질환은 염증성 장 질환, 궤양성 결장염, 크론병, 관절염, 아토피 피부염 또는 건선을 포함하는 만성 염증성 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
52. 제 49 항에 있어서, 질환은 급성 염증성 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
53. 제 52 항에 있어서, 질환은 내독소혈증, 패혈증, 독성쇼크 증후군 또는 감염성 질환을 포함하는 급성 염증성 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
54. 제 49 항에 있어서, 항체, 항체 단편, 또는 결합 폴리펩티드는 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩티드 태크, 자기 입자, 또는 독소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
55. (a) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 1(Pro)부터 아미노산 번호 6(Asp)까지로 구성된 폴리펩티드;

    (b) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 26(Ser)부터 아미노산 번호 32(Pro)까지로 구성된 폴리펩티드;

    (c) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 41(Lys)부터 아미노산 번호 47(Asp)까지로 구성된 폴리펩티드;

    (d) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 아미노산 번호 49(Val)부터 아미노산 번호 62(Cys)까지로 구성된 폴리펩티드;

    (e) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 41(Lys)부터 아미노산 번호 62(Cys)까지로 구성된 폴리펩티드;

    (f) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 84(Ala)부터 아미노산 번호 97(Ser)까지로 구성된 폴리펩티드;

    (g) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 103(Thr)부터 아미노산 번호 108(Asp)까지로 구성된 폴리펩티드;

    (h) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 130(Arg)부터 아미노산 번호 135(His)까지로 구성된 폴리펩티드;

    (i) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 164(Gly)부터 아미노산 번호 166(Lys)까지로 구성된 폴리펩티드;

    (j) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 175(Tyr)부터 아미노산 번호 179(Glu)까지로 구성된 폴리펩티드;

    (k) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 193(Lys)부터 아미노산 번호 196(Ala)까지로 구성된 폴리펩티드;

    (l) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 아미노산 번호 203(Lys)부터 아미노산 번호 209(Thr)까지로 구성된 폴리펩티드; 및

    (m) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; 및

    (n) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드

    로 구성되는 군에서 선택되는 사람 IL-22RA(SEQ ID NO:3)의 항원성 에피토프에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 포함하는, 사람 IL-22(SEQ ID NO:6) 또는 IL-20(SEQ ID NO:8) 중 하나의 활성을 감소 또는 중화시키는 항체.
56. 제 55 항에 있어서, 항체는 사람 IL-22(SEQ ID NO:6) 및 IL-20(SEQ ID NO:8) 둘 다의 활성을 감소 또는 중화시키는 것을 특징으로 하는 항체.
57. 제 55 항에 있어서, 항체는 (a) 폴리클로날 항체, (b) 쥐과 모노클로날 항체, (c) (b)로부터 유래된 사람화 항체, (d) 항체 단편, 또는 (e) 사람 모노클로날 항체로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 항체.
58. 제 57 항에 있어서, 항체는 PEG화를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
59. 제 56 항에 있어서, 항체는 (a) 폴리클로날 항체, (b) 쥐과 모노클로날 항체, (c) (b)로부터 유래된 사람화 항체, (d) 항체 단편, 또는 (e) 사람 모노클로날 항체로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 항체.
60. 제 59 항에 있어서, 항체는 PEG화를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
61. 제 55 항의 항체의 유효량을 투여함으로써 병원성 상태를 치료하는 것을 포함하는, IL-22RA 활성과 관련된 피험자에서 병원성 상태의 치료 방법.
62. 제 61 항에 있어서, 상기 병원성 상태는 만성 염증성 상태인 것을 특징으로 하는 방법.
63. 제 62 항에 있어서, 상기 만성 염증성 상태는 염증성 장 질환, 궤양성 결장염, 크론병, 관절염, 아토피 피부염 또는 건선을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
64. 제 61 항에 있어서, 상기 병원성 상태는 급성 염증성 상태인 것을 특징으로 하는 방법.
65. 제 64 항에 있어서, 상기 급성 염증성 상태는 내독소혈증, 패혈증, 독성쇼크 증후군 또는 감염성 질환을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
66. 포유동물에 IL-22RA의 길항제를 투여하여 염증을 감소시키는 단계를 포함하며, 여기서 길항제는 IL-22RA(SEQ ID NO:3)의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편과 특이적으로 결합하는 항체, 항체 단편, 또는 결합 폴리펩티드를 포함하고, 염증 활성이 감소하는 것을 특징으로 하는, IL-22RA가 어떤 역할을 하는 염증 질환으로 고생하는 포유동물의 치료 방법.
67. 제 66 항에 있어서, 질환은 만성 염증성 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
68. 제 67 항에 있어서, 질환은 염증성 장 질환, 궤양성 결장염, 크론병, 관절염, 아토피 피부염 또는 건선을 포함하는 만성 염증성 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
69. 제 66 항에 있어서, 질환은 급성 염증성 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
70. 제 69 항에 있어서, 질환은 내독소혈증, 패혈증, 독성쇼크 증후군 또는 감염성 질환을 포함하는 급성 염증성 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
71. 제 66 항에 있어서, 항체, 항체 단편, 또는 결합 폴리펩티드는 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩티드 태크, 자기 입자, 또는 독소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
72. 제 66 항에 있어서, 항체, 항체 단편, 또는 결합 폴리펩티드는 PEG화를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
73. 염증을 가진 포유동물에 염증을 감소시키는데 충분한 양의 제 55 항에 따른 항체 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 염증 감소 방법.