JP4898691B2 - 抗il−22ra抗体および結合パートナー、ならびに炎症における使用法 - Google Patents
抗il−22ra抗体および結合パートナー、ならびに炎症における使用法 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2004年10月22日に提出された米国特許仮出願第60/621,553号の恩典を主張するものであり、前記の出願は参照として本明細書に組み入れられる。
サイトカインは、多くの細胞タイプの増殖および分化の調節を含む多様な生物作用を媒介する可溶性の小さいタンパク質である(例えば、Araiら、Annu. Rev. Biochem. 59:783(1990)(非特許文献1);Mosmann、Curr. Opin. Immunol. 3:311(1991)(非特許文献2);Paul and Seder, Cell 76:241(1994)(非特許文献3)を参照されたい)。サイトカイングループを構成するタンパク質には、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、および他の調節分子が含まれる。例えば、ヒトインターロイキン-17は、インターロイキン-6、細胞内接着分子1、インターロイキン-8、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、およびプロスタグランジンE2の発現を刺激するサイトカインであり、CD34+造血前駆細胞の好中球への選択的成熟において役割を有する(Yaoら、J. Immunol. 155:5483(1995)(非特許文献4);Fossiezら、J. Exp. Med. 183:2593(1996)(非特許文献5))。
1.概要
他の発明の中でも、本発明は、「Zcytor 11」または「IL-22RA」と命名される可溶性受容体およびIL-22RAサイトカイン受容体に対する中和抗体の新規使用を提供する。本発明はまた、ヒト炎症および自己免疫疾患において用いるための可溶性IL-22RAポリペプチド断片および融合タンパク質を提供する。本発明の中和性抗IL-22RA抗体を含む本発明の抗IL-22RA抗体および可溶性のIL-22RA受容体は、乾癬、乾癬性関節炎、関節炎、内毒素血症、炎症性腸疾患(IBD)、大腸炎、および本明細書において開示される他の炎症病態のような特定のヒト疾患の治療においてIL-22、IL-20、またはIL-20とIL-22の双方の活性を遮断、阻害、減少、拮抗、または中和するために用いることができる。
以下の説明において、多くの用語が広く用いられている。以下の定義は、本発明の理解を促進するために提供される。
ヒトIL-22RA遺伝子をコードする核酸分子は、配列番号:1に基づくポリヌクレオチドプローブを用いて、ヒトcDNAまたはゲノムライブラリをスクリーニングすることによって得ることができる。これらの技術は標準的であって十分に確立され、市販のクローニングキットを用いて行ってもよい。例えば、Ausubelら(編)、「Short Protocols in Molecular Biology」、第三版、John Wiley&Sons、1995;Wuら、Methods in Gene Biotechnology、CRC出版 Inc.、1997;Aviv and Leder、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408(1972);Huynhら、表題「Constructing and Screening cDNA Libraries in λgt10 and λgt11」、書籍名「DNA Cloning:A Practical Approach」第I巻、Glover(編)、49頁(IRL Press、1985);Wu(1997)、47〜52頁を参照されたい。
本発明は、本明細書に開示のIL-22RAポリペプチドをコードするDNAおよびRNA分子を含む、多様な核酸分子を提供する。当業者は、遺伝子コードの縮重を考慮して、これらのポリヌクレオチド分子においてかなりの配列の変動が起こりうることを容易に認識するであろう。その上、本発明はまた、配列番号:3の受容体ポリペプチドと実質的に相同である少なくとも1つのIL-22RA受容体サブユニットを含む単離された可溶性単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、および多量体受容体ポリペプチドを提供する。このように、本発明は、配列番号:1の縮重ヌクレオチドを含むIL-22RAポリペプチドコード核酸分子、およびそのRNA同等物を企図する。
完全長のポリペプチド;可溶性の単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、および多量体受容体;完全長の受容体;受容体断片(例えば、リガンド結合断片および抗原性エピトープ)、機能的断片、および融合タンパク質を含む本発明のポリペプチドは、通常の技術に従って組換え型宿主細胞において産生することができる。IL-22RA遺伝子を発現するために、ポリペプチドをコードする核酸分子を、発現ベクターにおける転写発現を制御する調節配列に機能的に結合させて、次に宿主細胞に導入しなければならない。プロモーターおよびエンハンサーのような転写調節配列の他に、発現ベクターには、翻訳調節配列および発現ベクターを有する細胞の選択にとって適したマーカー遺伝子が含まれうる。
IL-22RA類似体の一つの一般的なクラスは、本明細書に開示のアミノ酸配列の変異であるアミノ酸配列を有する変種である。もう一つの一般的なクラスのIL-22RA類似体は、下記のように、抗イディオタイプ抗体、およびその断片によって提供される(例えば、Monfardiniら、Proc. Assoc. Am. Physicians 108:420(1996)を参照されたい)。抗イディオタイプIL-22RA抗体の可変ドメインは、IL-22RAを模倣することから、これらのドメインはIL-22RA結合活性を提供することができる。抗イディオタイプ触媒抗体を産生する方法は当業者に既知である(例えば、Joronら、Ann. N.Y. Acad. Sci. 672:216(1992)、Fribouletら、Appl. Biochem. Biotechnol. 47:229(1994)およびAvalleら、Ann. N.Y.Acad. Sci. 864:118(1998)を参照されたい)。
本発明のポリペプチドは、混入高分子、特に他のタンパク質および核酸に関して純度少なくとも約80%、純度少なくとも約90%、純度少なくとも約95%、または96%、97%、98%のような95%より高い、または純度99%より高くなるように精製することができ、感染因子および発熱性物質を含まない。本発明のポリペプチドはまた、薬学的に純粋な状態、すなわち純度99.9%より高くなるまで精製してもよい。特定の調製物において、精製ポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。
IL-22RAに対する抗体は、例えばIL-22RA発現ベクターの産物、または天然起源から抗原として単離されたIL-22RAを用いて得ることができる。特に有用な抗IL-22RA抗体は、IL-22RAに「特異的に結合する」。抗体は、抗体が以下の二つの特性の少なくとも一つを示す場合、特異的に結合すると見なされる:(1)抗体が結合活性の閾値レベルでIL-22RAに結合する;および(2)抗体がIL-22RAに近縁のポリペプチドと有意に交叉反応しない。
本明細書において有用な抗体を産生または選択するためのもう一つの技術には、リンパ球を、可溶性のIL-22RA受容体ポリペプチドまたは抗原性エピトープのようなその断片にインビトロで曝露すること、ファージまたは類似のベクターにおける抗体ディスプレイライブラリを選択すること(例えば、固定または標識された可溶性のIL-22RA受容体ポリペプチドまたは抗原性エピトープのようなその抗体断片を用いることによって)が含まれる。可溶性IL-22RA受容体ポリペプチドまたは抗原性エピトープのようなその断片のような、可能性がある結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ(ファージディスプレイ)または大腸菌のような細菌上で示されるランダムペプチドライブラリをスクリーニングすることによって得ることができる。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ランダム変異誘発およびランダムポリヌクレオチド合成のような多様な方法で得ることができる。これらのランダムペプチドディスプレイライブラリを用いてリガンドまたは受容体のようなタンパク質またはポリペプチド、生体または合成高分子、または有機もしくは無機物質となりうる既知の標的と相互作用するペプチドに関してスクリーニングすることができる。そのようなランダムペプチドディスプレイライブラリを作製およびスクリーニングする技術は当技術分野で既知であり(Ladnerら、米国特許第5,223,409号;Ladnerら、米国特許第4,946,778号;Ladnerら、米国特許第5,403,484号およびLadnerら、米国特許第5,571,698号)、ランダムペプチドディスプレイライブラリおよびそのようなライブラリをスクリーニングするためのキットは、例えば、Clontech(パロアルト、カリフォルニア州)、Invitrogen Inc.(サンジエゴ、カリフォルニア州)、New England Biolabs Inc.(ビバリー、マサチューセッツ州)、およびPharmacia LKB Biotechnology Inc.(ピスカタウェイ、ニュージャージー州)から市販されている。ランダムペプチドディスプレイライブラリは、IL-22RAを含む受容体ポリペプチドに結合するタンパク質を同定するために本明細書に開示の抗原性エピトープポリペプチド配列のような、可溶性IL-22RA受容体ポリペプチドまたはその断片を用いてスクリーニングすることができる。可溶性のIL-22RAを含む受容体ポリペプチドと相互作用するこれらの「結合ポリペプチド」は、細胞をタグ付けするために;アフィニティ精製によって相同体ポリペプチドを単離するために用いることができる;それらは薬物、毒素、放射性核種等に直接または間接的に結合させることができる。これらの結合ポリペプチドも同様に、例えばIL-22リガンドおよび受容体に結合する、その相互作用、または受容体に対するウイルスの結合を遮断、阻害、減少、拮抗、または中和するか否かに関して、発現ライブラリおよび中和抗体をスクリーニングするためのような分析法において用いることができる。結合ポリペプチドも同様に、可溶性IL-22RAを含む受容体ポリペプチドの循環中のレベルを決定するために;基礎となる病態または疾患のマーカーとして可溶性または非可溶性IL-22RA含有受容体を検出または定量するために、診断アッセイにおいて用いることができる。これらの結合ポリペプチドはまた、可溶性もしくは膜結合型IL-22RA単量体受容体、またはIL-22RAホモ二量体、ヘテロ二量体、または多量体ポリペプチド結合(例えばリガンドに対する)、ならびにインビトロおよびインビボでのシグナル伝達を遮断または阻害するために「アンタゴニスト」として作用することができる。この場合も、これらの結合ポリペプチドは抗IL-22RA単量体受容体または抗IL-22RAホモ二量体、ヘテロ二量体、または多量体ポリペプチドとして作用し、IL-22またはIL-20およびIL-22活性の双方のみならず、受容体活性またはタンパク質結合を阻害するために有用である。本発明の天然の受容体複合体に対する抗体、IL-22RAエピトープ結合抗体、および抗IL-22RA中和性モノクローナル抗体は、それらがIL-22RAに対して特異的に作用する可能性があり、IL-22またはIL-20およびIL-22の双方を阻害することができることから、好ましい態様であるかも知れない。その上、本発明の抗体のアンタゴニストおよび結合活性は、IL-20またはIL-22、およびIL-22RA含有可溶性受容体の存在下でIL-20またはIL-22増殖、シグナルトラップ、ルシフェラーゼ、または結合アッセイ、および本明細書に記載の他の生物学的または生化学的アッセイにおいてアッセイすることができる。
可溶性IL-22RA活性を有するアミノ酸配列を用いて、IL-22RAリガンドであるIL-20およびIL-22(単独または共に)に結合して、このように内因性のIL-22RA受容体とIL-22RAリガンドとの結合を防止することによって、免疫系を調節することができる。抗IL-22RA抗体のようなIL-22RAアンタゴニストも同様に、内因性のIL-22RA受容体とIL-22RAリガンドとの結合を阻害することによって免疫系を調節することができる。したがって、本発明には、IL-22RA活性を有するタンパク質、ポリペプチド、およびペプチド(可溶性のIL-22RAポリペプチド、IL-22RAポリペプチド断片、IL-22RA類似体(例えば、抗IL-22RA抗イディオタイプ抗体)、およびIL-22RA融合タンパク質)を、このポリペプチドの適当量を欠損する、またはIL-22RAリガンドの過剰量を産生する被験体に用いることが含まれる。IL-22RAアンタゴニスト(例えば、抗IL-22RA抗体)も同様に、IL-22RAリガンドまたはIL-22RAのいずれかの過剰量を産生する被験体を治療するために用いることができる。例えば、そのようなIL-22RAポリペプチドおよび抗IL-22RA抗体は、乾癬、アトピー性皮膚炎、炎症性皮膚疾患、乾癬性関節炎、関節炎、内毒素血症、喘息、炎症性腸疾患(IBD)、大腸炎、および本明細書に開示の他の炎症病態の治療において、IL-20およびIL-22(単独または共に)に結合、遮断、阻害、減少、拮抗、または中和するために有用である。
変形性関節炎、リウマチ性関節炎、損傷の結果としての関節炎関節等を含む関節炎は、本発明のIL-22RAポリペプチドのような抗炎症タンパク質の治療的使用によって利益が得られるであろう一般的な炎症疾患である。例えば、リウマチ性関節炎(RA)は、全身に罹患する全身性の疾患であり、関節炎の最も一般的な型の一つである。これは、疼痛、こわばり、暖かさ、発赤、および腫脹を引き起こす関節の内側の膜の炎症を特徴とする。炎症細胞は、骨および軟骨を消化する酵素を放出する。リウマチ性関節炎の結果として、炎症を起こした関節の内層、すなわち滑膜が、骨および軟骨に浸潤して損傷を与え、関節の悪化および他の生理的作用の中でも重度の疼痛が起こる。罹患した関節はその形状および配置を失い、疼痛および運動不能が起こる。
内毒素血症は、細菌および他の感染性疾患物質のような感染因子、敗血症、毒性ショック症候群に一般的に起因する、または日和見感染を受ける免疫無防備患者において起こる重度の病態である。本発明のIL-22RAポリペプチドおよび抗体のような治療的に有用な抗炎症性タンパク質は、ヒトおよび動物において内毒素血症を予防および治療するために役立ちうる。IL-22RAポリペプチド、抗IL-22RA抗体、または抗IL-22抗体もしくは結合パートナーは、内毒素血症において炎症および病理作用を減少させるために貴重な治療物質として役立ちうる。
米国において、約500,000人の人が、結腸および直腸(潰瘍性大腸炎)またはその双方、小腸および大腸(クローン病)に影響を及ぼしうる炎症性腸疾患(IBD)を有する。これらの疾患の発病は不明であるが、それらは罹患組織の慢性の炎症を伴う。IL-22RAポリペプチド、抗IL-22RA抗体、または抗IL-22抗体もしくは結合パートナーは、IBDおよび関連疾患における炎症および病理作用を減少させるために重要な治療物質として役立ちうるであろう。
乾癬は、700万人より多いアメリカ人が罹患する慢性皮膚疾患である。乾癬は、新しい皮膚細胞が異常に増殖する際に起こり、皮膚の炎症、腫脹、および鱗片様小片が起こり、乾癬部位では古い皮膚が速やかに剥がれ落ちない。最も一般的な型である斑状乾癬は、銀白色の鱗片が上部に存在する皮膚の炎症小片(「病変」)を特徴とする。乾癬は、少数の斑に限定される、または中等度から広汎な領域の皮膚に罹患する可能性があり、頭皮、膝、肘、および躯幹において最も一般的に認められる。乾癬は非常によく目につくが、感染性の疾患ではない。疾患の発病は、罹患組織の慢性炎症を伴う。IL-22RAポリペプチド、抗IL-22RA抗体、または抗IL-22および抗IL-20抗体もしくは結合パートナーは、乾癬、他の炎症性皮膚疾患、皮膚および粘膜アレルギー、ならびに関連疾患における炎症および病理作用を減少させるために重要な治療物質として役立つであろう。
IL-20およびIL-22はいずれもヒトアトピー性皮膚炎(AD)患者の試料においてアップレギュレートされている。ADは、ヘルパーT細胞サブセット2(Th2)の高度活性化サイトカインを特徴とする一般的な慢性炎症疾患である。ADの正確な病因は不明であるが、活動亢進Th2免疫応答、自己免疫、感染症、アレルゲン、および遺伝的素因を含む多数の要因が関与している。疾患の重要な特徴には、乾皮症(皮膚の乾燥)、そう痒症(皮膚の痒み)、結膜炎、炎症性皮膚病変、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)感染症、血液好酸球増加症の増加、血清IgEおよびIgG1の上昇、ならびにT細胞、肥満細胞、マクロファージ、好酸球浸潤を伴う慢性的な皮膚炎が含まれる。黄色ブドウ球菌による定着または感染症は、ADを悪化させて、この皮膚疾患の慢性性を持続させることが認識されている。
IL-20およびIL-22の双方の過剰発現は、ヒト乾癬病変において示されており、IL-20およびIL-22の双方がヒト乾癬に関与していることを示唆している。その上、本明細書に記述するように、トランスジェニックマウスにおけるIL-20およびIL-22の過剰発現は、乾癬表現型を示す表皮の肥厚および免疫細胞の関与を示し、さらにIL-22を正常マウスに注射すると、乾癬表現型を示す表皮の肥厚および免疫細胞の関与が示され、これは可溶性受容体アンタゴニストzcytor16(IL-22RA2)によって消失した。そのようなインビボデータはさらに、炎症誘発性IL-22が乾癬に関与していることを示唆している。そのため、本発明の抗ヒトIL-22RA中和およびモノクローナル抗体のようなIL-22活性に対するアンタゴニストと共に、可溶性のIL-22RA受容体は、炎症疾患、特にIL-22およびIL-20に対するアンタゴニストとして乾癬の治療において有用である。その上、本発明の抗ヒトIL-22RA中和およびモノクローナル抗体のようなIL-22またはIL-20およびIL-22に結合、その双方の活性を遮断、阻害、減少、拮抗、または中和する物質は、可溶性IL-22RA受容体と共に、他の炎症疾患の治療的治療において、例えばアトピー性皮膚炎、IBD、大腸炎、内毒素血症、関節炎、リウマチ性関節炎、および乾癬性関節炎、成人呼吸器疾患(ARD)、敗血症ショック、多臓器不全、喘息または気管支炎のような炎症性肺損傷、細菌性肺炎、湿疹、アトピー性および接触性皮膚炎、ならびに潰瘍性大腸炎およびクローン病のような炎症性腸疾患等の治療において、IL-22またはIL-20およびIL-22の双方に対するアンタゴニストとして有用である。
トランスフェクトしたBHK 570細胞からのIL-22RA2-Fc4ポリペプチドの精製
特に明記していなければ、操作は全て4℃で行った。IL-22RA2-Fc4と命名されるヒトFc4(配列番号:14)とのC-末端融合体を含むIL-22RA2ポリペプチド(配列番号:13の残基23〜231位の成熟可溶性受容体ポリペプチド;配列番号:12に示されるポリヌクレオチド)を精製するために、以下の技法を用いた。IL-22RA2-Fc4をトランスフェクトしたBHK 570細胞からの条件培地約16,500 mlを0.2 μmの濾過滅菌フィルターを通して濾過した後、最終濃度0.001 mMロイペプチン(Boerhinger-Mannheim、インジアナポリス、インジアナ州)、0.001 mMペプスタチン(Boerhinger-Manheim)、および0.4 mMペファブロック(Boerhinger-Manheim)のプロテアーゼ阻害剤溶液を加えた。多孔性タンパク質A50カラム(床容積20 ml、Applied Biosystems)を充填して、PBS(Gibco/BRL)400 mlによって洗浄した。添加した条件培地を流速15 ml/分でカラムを通過させた後、PBS(BRL/Gibco)800 mlによって洗浄した。IL-22RA2-Fc4を、0.1 Mグリシン、pH 3.0によってカラムから溶出させて、5 ml分画を2 Mトリス、pH 7.8 0.5 mlに直接回収して、分画の最終的なpHを7.4に調節した。
CRF2-4受容体を発現するBaF3細胞(BaF3/CRF2-4細胞)およびIL-22RA受容体と共にCRF2-4受容体を発現するBaF3細胞(BaF3/CRF2-4/IL-22RA細胞)の構築
完全長のCRF2-4受容体を発現するBaF3細胞を、CFR2-4発現ベクター30 μgを用いて以下のように構築した。CFR2-4受容体を発現するBaF3細胞をBaF3/CFR2-4と命名した。これらの細胞を対照として用いて、完全長のIL-22RA受容体をさらにトランスフェクトして(米国特許第5,965,704号)、下記のようにIL-22活性に関するスクリーニングを構築するために用いた。
CRF2-4(Genbankアクセッション番号Z17227)の完全長のcDNA配列をDaudi細胞株cDNAライブラリから単離して、発現ベクターpZP7Pにクローニングした。
完全長のIL-22RA受容体を発現するBaF3/CRF2-4細胞を、IL-22RA発現ベクター30 μgを用いて先に記述した通りに構築した。回復後、200 μg/mlゼオシンおよび2 μg/mlピューロマイシンを用いてトランスフェクタントを選択した。IL-22RA受容体を発現するBaF3/CRF2-4細胞を、BaF3/CRF2-4/IL-22RA細胞と命名した。これらの細胞を用いて、IL-22活性に関してスクリーニングすると共に本明細書に記述のIL-22RA2アンタゴニスト活性に関してスクリーニングした。
Alamar Blue増殖アッセイを用いてBaF3/CRF2-4/IL-22RA細胞を用いたIL-22アンタゴニスト活性のスクリーニング
A.Alamar Blue増殖アッセイを用いてBaF3/CRF2-4/IL-22RA細胞を用いたIL-22活性のスクリーニング
精製IL-22-CEE(実施例4)を用いて下記のように増殖活性の有無を試験した。精製IL-22RA2-Fc4(実施例1)を、下記のように本アッセイにおけるIL-22の増殖反応に拮抗させるために用いた。
BHK570細胞からのIL-22CEEの精製
特に明記していなければ、操作は全て4℃で行った。C-末端GluGlu(EE)タグ(配列番号:15または配列番号:16)を含むIL-22ポリペプチドを精製するために以下の技法を用いた。IL-22-CEEを発現するBHK細胞からの条件培地を、ProFlux A30においてAmicon S10Y3スパイラルカートリッジによって濃縮した。濃縮した条件培地に、最終濃度2.5 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA、Sigma Chemical、セントルイス、ミズーリ州)、0.003 mMロイペプチン(Boehringer-Mannheim、インジアナポリス、イリノイ州)、0.001 mMペプスタチン(Boehringer-Mannheim)、および0.4 mMペファブロック(Boehringer-Mannheim)となるようにプロテアーゼ阻害剤溶液を加えた。試料を分析のために採取して、精製を開始するまで、バルク容積を-80℃で凍結した。濃縮した条件培地の総標的タンパク質濃度を、抗EE- HRP結合抗体を用いてSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析によって決定した。
IL-22ポリペプチドのインビボ作用
マウス(雌性、C57BL/6N、8週齢;Charles River Labs、キングストン、ニューヨーク州)を三つの群に分けた。IL-22ポリペプチド(配列番号:6)を発現するアデノウイルスを、標準的な方法を用いて既に作製した。0日目に、親またはIL-22アデノウイルスを第一(n=8)および第二(n=8)の群に尾静脈より投与して、それぞれのマウスに〜1×1011粒子の用量を〜0.1 mlの容量で投与した。第三の群(n=8)には処置を行わなかった。12日目に、マウスの体重を測定して血液をマウスから採取した。試料を全血球計算(CBC)および血清化学に関して分析した。親アデノウイルス処置群と比較してIL-22アデノウイルス投与群の血液試料において、好中球および血小板数の統計学的に有意な上昇を検出した。同様に、リンパ球および赤血球数は、IL-22アデノウイルス投与群では親アデノウイルス処置群と比較して有意に減少した。さらに、IL-22アデノウイルス処置マウスは体重が減少したが、親アデノウイルス処置群は体重が増加した。同様に、血清IL-22レベルは増加し、グルコースレベルは3日目に減少した。要約すると、IL-22アデノマウスは急性期反応を示し、これはTNF-α、IL-1β、およびgp130サイトカインのような、炎症誘発性サイトカインによって開始されうる。急性期反応は、パターン認識分子によって開始される一連の即時型炎症反応である。急性期タンパク質は、微生物に対する保護の増強を提供し、細胞の物資移動およびメディエータの放出に及ぼす作用によって炎症反応を改変する。例えば、SAAは、化学走性の誘導、内皮細胞に対する白血球接着の増強、および貪食の増加を含む、強力な白血球活性化機能を有する。急性期反応を開始させ、その程度および持続を変化させる要因を理解することは、感染および炎症疾患にとって新しい治療を開発するための重要な段階となる。
IL-22発現トランスジェニックマウス
A.マウスIL-22を発現するトランスジェニックマウスの作製
リンパ様特異的EμLCKプロモーター、マウスIL-22(配列番号:10;配列番号:11に示されるポリペプチド)、ラットインスリンIIイントロン、IL-22 cDNAおよびヒト成長ホルモンポリA配列の5'および3'隣接配列を含むトランスジェニックベクターからのDNA断片を、標準的な方法を用いて調製して、これを用いて受精B6C3f1(Taconic、ジャーマンタウン、ニューヨーク州)マウス卵母細胞に、標準的なマイクロインジェクションプロトコールを用いてマイクロインジェクションした。Hogan, B.ら、「Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1994を参照されたい。
上記のEμLCKプロモーターによって促進されるマウスIL-22トランスジェニックマウス系統から、新生児を1日目(出生日)に異常に関して観察して、組織採取のために屠殺した。仔は全て独自の耳タグ番号を与えられ、屠殺時に光沢のある皮膚表現型を有すると指定されたマウスを記録した。仔マウス12匹中、6匹が光沢のある皮膚表現型を有することが認められ、2匹は、「重度の」表現型を有すると指定された。重度の表現型は、その皮膚が特に光って非常に乾燥し、運動性がほとんどない小さい仔マウスであると定義された。皮膚をそれぞれの仔の左側から採取してTissue-Tek抱埋培地において凍結した。
出生日にIL-22トランスジェニックマウスを含む同腹子を人道的に安楽死させて、10%緩衝ホルマリンに全身を沈めて固定した。トランスジェニックマウス6匹および非トランスジェニックマウス2匹をさらなる研究に供した。トランスジェニックマウス6匹中4匹は、安楽死の時点で光沢のある皮膚を有することが認められた。固定した組織を切片5個に切断した(頭部の縦方向断面、上位および下位胸部の断面、ならびに上位および下位腹部の断面)。組織をパラフィンに抱埋して通常のように処理して、5 μmの切片(Jung 2065 Supercutミクロトーム、Leica Microsystems、ウェツラー、ドイツ)を作製してH&Eによって染色した。染色した組織を光学顕微鏡(Nikon Eclipse E600、Nikon Inc.、メルビル、ニューヨーク州)下で、委員会によって認定された(ACVP)獣医病理学者が評価した。
IL-22ポリペプチドのインビボ作用
A.IL-22アデノウイルスを感染させたマウスはSAAの誘導を示す
マウス(雌性、C57BL/6N、8週齢;Charles River Labs、キングストン、ニューヨーク州)を三つの群に分けた。IL-22ポリペプチド(配列番号:6)を発現するアデノウイルスを、標準的な方法を用いて既に作製した。0日目に、親またはIL-22アデノウイルスを第一(n=8)および第二(n=8)の群のそれぞれのマウスに〜1×1011粒子の用量を〜0.1 mlの容量で尾静脈より投与した。第三の群(n=8)には処置を行わなかった。12日目に、マウスの体重を測定して血液をマウスから採取した。試験の20日目に、マウスを屠殺して、体重を記録し、血液および組織を分析のために採取した。
マウスSAAイムノアッセイキットおよびプロトコール(Biosource International、カリフォルニア州、アメリカ)を用いて、IL-22アデノマウスにおけるSAAレベルを決定するために、ELISAアッセイを行った。希釈した標準物質および未知物質をHRP-抗マウスSAAと共に、予め抗マウスSAA抗体をコーティングしたアッセイプレートに播種した。プレートを37℃で1時間インキュベートした後、キットの説明書に従って洗浄した。TMBを用いてプレートを室温で15分間展開させて、2 M H2SO4を用いて停止させた。450 nmでの吸光度をSpectromax 190(Molecular Devices、カリフォルニア州、アメリカ)を用いて読み取った。得られたデータをSoftmax Pro(Molecular Devices、カリフォルニア州、アメリカ)およびエクセル(Microsoft Corp. 、ワシントン州、アメリカ)を用いて分析した。
アデノウイルスによるインビボでのIL-22発現の作用を分析するために、本発明者らは、感染後10日および20日目にIL-22アデノウイルス感染C57BL/6Nマウスからの末梢血、脾臓、および骨髄を単離した。血液約100 μlをヘパリン加試験管に採取した後、低張溶解によって赤血球を枯渇した(細胞をdH2O 4.5 mlにおいて〜5秒間溶解した後、3.6%NaCl 1.5 mlを加えた)。脾臓を2枚のすりガラスのスライドガラスのあいだでつぶして、放出された細胞をNytexメンブレン(細胞濾過器)に通過させて、沈降させた。骨髄は、大腿骨1本を乳鉢と乳棒においてつぶして、細胞を細胞濾過器(Falcon)に通過させることによって得た。細胞をFACS洗浄緩衝液(WB=HBSS/1%BSA/10 mM hepes)に浮遊させて、トリパンブルーによって計数し、各タイプの生存細胞1×106個を5 mlポリスチレンチューブに加えた。細胞を洗浄して沈降させた後、特定の免疫細胞サブセットを同定するために用いられる様々な細胞表面マーカーを認識する蛍光標識(FITC、PE、およびサイクロム)モノクローナル抗体(PharMingen、サンジエゴ、カリフォルニア州)のカクテルと共に氷中で20分間インキュベートした。これらのマーカーには、以下が含まれる(本発明者らが調べた3群に分けて記載する)。血液の染色の場合:CD3、Gr1、およびB220;脾臓の染色の場合:CD62L、CD44、およびCD3;CD21、CD23、およびB220;IgD、IgM、およびB220;CD11b、Gr1、およびCD8;骨髄染色の場合:CD11b、Gr1、CD3;IgD、IgM、およびB220。細胞をWB 1.5 mlによって洗浄して沈降させた後、WB 0.4 mlに浮遊させてCellQuestソフトウェア(Becton Dickinson、マウンテンビュー、カリフォルニア州)を用いてFACScanによって分析した。
IL-22RA2がIL-22によるSAA誘導を阻害できるか否かを評価するために、マウス(雌性、C3H/HEJ、8週齢;Jackson Lab.、バーハーバー、メイン州)を各群3匹の5群に分けて、下記の表6に示すようにタンパク質のIP注射によって処置した。
炎症性腸疾患マウスモデルにおけるIL-22の発現
炎症性腸疾患(IBD)は、二つのタイプ、すなわち潰瘍性大腸炎(UC)とクローン病(CD)に分けられる多因子性疾患である。これらの疾患の病院は現在のところわかっておらず、臨床所見は異なる。UCは、結腸に限定され、症状には、血便、体重減少、および腹痛が含まれる。UCの肉眼的所見は、穿孔性潰瘍および結腸短縮が含まれる。対称的に、クローン病は、腸の他の部分に罹患しうる。症状には、下痢(UCにおいて認められる血便はしばしば少ない)、微熱および疼痛が含まれる。肉眼的所見には、狭窄、深部潰瘍、裂およびそうを伴う線維性および狭窄性腸が含まれる。
DSSの摂取によって、Charles River LaboratoriesのSwiss Webster系雌性マウスに大腸炎を誘導した。マウスは試験開始時10〜11週齢であった。マウスに飲料水において4%DSSを6日間投与した(処置マウス)、または通常の飲料水のみを与えた(対照マウス)。便の性質、潜血、および体重減少を含む複合測定値を含む疾患活動度指数臨床スコア(DAI)を用いた。DAIは、DSS処置後1日目から開始して各マウスに関して毎日得た。6日後、DSSを処置マウスの飲料水から除去した。マウスを全て、試験開始後2、7、または10日後に屠殺するまでDAI臨床スコアによってモニターした。2および7日目のそれぞれにおいて、DSS処置マウス4匹および対照マウス1匹を屠殺した。10日目に、DSS処置マウス4匹および対照マウス2匹を屠殺した。屠殺後全ての動物に関して結腸の長さを測定した。結腸の断面を組織学分析のために10%中性緩衝ホルマリンにおいて固定するか、またはmRNA抽出のために凍結した。
組織学指数スコアは、参考文献1の方法に従って得た。一般的に病理学者が、結腸断面の陰窩スコア、過形成上皮、陰窩の歪みおよび炎症に関して盲検的に採点した。
DSS処置マウスの結腸の長さは7および10日目では、無処置対照より幾分短かったが、結果は有意ではない可能性がある(統計法の適用によってチェックしていない)。臨床DAIスコアは、DSS処置マウスにおいて、このモデルを用いて過去の研究において認められたものと類似の疾患症状の増加を反映した。潜血は、およそ4および5日目で最大であったが、軟便は6および7日目により多く認められた。組織病理学の結果から、疾患のスコアが全ての屠殺日、特に7日目(ピーク)および10日目に対照とは異なることが示された。組織病理学スクリーニングスコアは以下の通りであった:対照=0.5、2日目のDSS処置マウス=8.8、7日目のDSS処置マウス=21、10日目のDSS処置マウス=18。臨床および組織病理学スコアは、DSS処置マウスが、無処置対照と比較して有意な結腸疾患を有することを示している。凍結組織試料を下記のようにmRNA測定のために後に用いた。
炎症性腸疾患モデルにおけるマウスIL-22 RNA(配列番号:10;配列番号:11)の相対的発現を決定するために、DSS処置マウスの遠位結腸を採取して、液体窒素において瞬間凍結した。本実験において、マウスをDSSによって処置して、試料を処置後2、7、および10日目に採取した。正常な無処置マウスからの試料も同様に採取した。次に、RNAを標準的なRNeasy Midiprep(商標)キット(Qiagen、バレンシア、カリフォルニア州)を用いて、製造元の説明書に従って試料から単離した。
IL-22RA2はマウスコラーゲン誘発関節炎(CIA)モデルにおいてIL-6およびSAAレベルを減少させる
A.マウスコラーゲン誘導関節炎(CIA)モデル
10週齢の雄性DBA/1Jマウス(Jackson Labs.)をマウス13匹/群の3群に分けた。−21日目、動物に、フロイントの完全アジュバント(Chondrex、レッドモンド、ワシントン州)と共に調製した1 mg/mlニワトリII型コラーゲン50〜100 μlを皮下注射して、3週間後の0日目に、凍結乾燥試料(Sigma、セントルイス、ミズーリ州)から250 μg/mlとして調製した大腸菌0111:B4からのLPS 100 μl(25 μg)を注射した。IL-2RA2は、週に3回、0日目から25日目まで4週間、腹腔内注射として投与した。最初の2群には、IL-22RA2を100または10 μg/動物/用量のいずれかを与えて、第三の群には、溶媒対照、PBS(Life Technologies、ロックビル、メリーランド州)を投与した。動物は、LPS注射後関節炎の症状を示し始め、ほとんどの動物が2〜3週間以内に炎症を発症した。疾患の程度を、足の厚みを測定するためにキャリパーを用いて、各足に対して臨床スコア(0〜3)を割付することによって、それぞれの足において評価した:0=正常、0.5=足指の炎症、1=軽度の足の炎症、2=中等度の足の炎症、および3=下記に詳細に示されるような重度の足の炎症。
動物は、2回目のコラーゲン注射後まもなく、足の炎症の兆候を示し始めるが、動物によっては、2回のコラーゲン注射前に足指の炎症の兆候を示し始めるものもある。ほとんどの動物は追加免疫の2〜3週間以内に感染症を発症するが、より長い期間を必要とする動物もある。このモデルにおける疾患の発生率は典型的に、95〜100%であり、動物40例を用いる研究では、典型的に非反応体0〜2例を認める(観察の6週間後に判定)。炎症が始まると、足または足先に多様な軽度の炎症が一般的に一過性に発生しうる。この理由から、動物は、顕著な持続的な足の腫脹を発症するまで確立された疾患を有すると見なされない。
0=正常
0.5=一つまたはそれ以上の足先が罹患しているが、足先のみが炎症を有する
1=足を含む軽度の炎症(一つの領域)および足先または複数の足先が含まれてもよい
2=足における中等度の炎症であって、足先および/または手首/足首の何らかが含まれてもよい(二つの領域)
3=足、手首/足首、および足先の一部または全体における重度の炎症(三つの領域)。
マウスコラーゲン関節炎モデルでは、LPSチャレンジ日(0日)に対して0、7、14、21、および28日目に血清試料を採取した(先の実施例9A)。血清試料を抗コラーゲン抗体力価に関してELISAによってスクリーニングした。100 μgまたは10 μg処置群ではPBS対照と比較してIL-22RA処置の抗コラーゲン抗体レベルに対して統計学的に有意な作用を認めなかった。下記に、抗コラーゲンELISA法および材料を説明する。
0日目の血清試料を、LPS 25 μgの腹腔内投与の4時間後にCIAマウスから採取した(上記の実施例9A)。試料を、IL-6および血清アミロイドA(SAA)濃度に関して、Biosource International(カマリロ、カリフォルニア州)から購入した市販のELISAキットによって製造元の説明書に従ってスクリーニングした。
抗IL-22RA mAbまたは抗IL-22 mAbsは、マウスCIAモデルにおいて疾患の重症度を阻害する
コラーゲン関節炎(CIA)モデルは、ヒトにおいて認められる疾患の大部分を反映するリウマチ性関節炎のマウスモデルである(Moore、Methods Mol. Biol. 225:175〜179、2003;Waksman、Scand. J. Immunol. 56:12〜34、2002)。マウスをCFAにおいて乳化したコラーゲン2用量によって尾根部で免疫した。これによって、経時的に増加する足の腫脹が起こり、キャリパーを用いてこれを肉眼的に採点および測定することができる。さらに、血清抗コラーゲン抗体は疾患の重症度によく相関する。IL-20およびIL-22による炎症を示すデータに基づいて、抗IL-22RAおよび抗IL-22 mAbをコラーゲン免疫マウスの群に投与して、疾患のスコアに及ぼす作用を評価する。抗IL-22RA mAbsまたは抗IL-22 mAbsの投与後に足のスコアおよび足の厚さが減少したことは、IL-20およびIL-22が自己免疫モデルにおいて存在する免疫応答を促進すること、そしてその機能を遮断、阻害、減少、拮抗、または中和はすれば、自己免疫障害を阻害する可能性があることを示唆している。血清中TNFαおよび抗コラーゲン抗体の阻害も同様に、IL-22RAの遮断が自己免疫疾患において有用である可能性があることを示唆している。
DSSマウスモデルにおけるIL-22受容体、IL-22RAの発現
DSS誘導IBDマウスの結腸におけるマウスIL-22RAの発現レベルを測定するために、定量的RT-PCRを行った(実施例8)。正常マウス結腸および処置2、7、および10日目でのDSS処置マウスの遠位結腸からRNAを単離した。Applied Biosystems 7700 TaqMan機器およびプロトコールを用いてRT-PCRを行った。簡単に説明すると、「プライマーエクスプレス」ソフトウェアを用いて、Applied Biosystemsのガイドラインに従って、マウスIL-22RA配列に対するプライマー(ZC39776(配列番号:19)およびZC39777(配列番号:20))ならびにFAM/TAMRA標識TaqManプローブ(ZC 38752(配列番号:21))をデザインした。RNA 25 ngを、PE/Applied Biosystems TaqMan EZ RT-PCRコア試薬ならびに上記のプライマーおよびプローブと共に各反応物に加えた。RT-PCR反応は、以下の条件で1試料あたり2個ずつ行った:50℃で2分間、60℃で30分間、95℃で5分間、94℃で20秒間および60℃で1分間を40サイクル。発現値を、合成マウスIL-22RA RNA転写物の既知の分子数の標準曲線と比較して、発現を反応あたりのマウスIL-22RA分子の絶対数として報告する。予備データは、マウスIL-22RA発現が、正常マウス結腸における発現レベルと比較した場合、DSS誘導IBDマウスの7日および10日での遠位結腸においてわずかにダウンレギュレートされる可能性があることを示唆している。
軽度内毒素血症モデルにおけるIL-22および炎症誘発性指標:マウスLPS誘導内毒素血症モデル
A.LPSによるマウス内毒素血症モデル:LPSによるマウス内毒素血症モデルにおける炎症誘発性サイトカインおよび体温の評価
マウスLPS軽度内毒素血症モデルにおけるIL-22RA2(IL-22RA2)の作用を調べるために、インビボ実験をデザインした。最初にモデルを評価するために、本発明者らは、モデルに関する参照データを収集するために炎症誘発性サイトカインおよび体温を測定した。
本明細書において記述したBaF3/CRF2-4/IL-22RA細胞を、遠心沈降させてPBSによって2回洗浄し、mIL-3を確実に除去した後、3回目の遠心沈降を行って、mIL-3を含まない完全な培地(RPMI 1640、10%FBS、1%GlutaMAX、1%ピルビン酸ナトリウム)(以降「無mIL-3培地」と呼ぶ)に浮遊させた。細胞を血球計算盤において計数した。無mIL-3培地を用いて、細胞を96ウェルフォーマットで5000個/ウェルで100 μl/ウェルの容積で播種した。
IL-22RA2処置が、LPS 25 μg用量のマウスへの1回腹腔内注射によって誘導された炎症誘発性指標に影響を及ぼすか否かを調べた。全ての試料を、SAA、IL-22および循環中の好中球数に関して分析した。各群のサブセットを特定のサイトカインレベルに関して分析した(1時間試料をTNFαに関してスクリーニングし、4時間試料をIL-6に関して分析した)。動物を下記の表8における表記の時点で屠殺して、全血および血清を分析のために採取して少量に分けた。
IL-22RA2がマウスLPS内毒素血症モデルにおいてSAA誘導を阻害するか否かを評価するために、先の実施例11Cにおける表8に示すように、LPS注射の30分前にマウスにIL-22RA2を注射した。
皮膚に及ぼすIL-22ポリペプチドのインビボ作用
A.IL-22によるアカントーシス
マウス(雌性、C3H/HEJ、8週齢;Jackson Labs、バーハーバー、メイン州)を1群6匹の3群および4匹の1群に分けた。ヒトBHK産生IL-22をミニ浸透圧ポンプによってマウスに持続的注入によって投与すると、ポンプに含まれるIL-22の濃度に比例して局所および定常状態血清濃度が得られた。Alzetミニ浸透圧ポンプ(モデル2002;Alza Corporation、パロアルト、カリフォルニア州)に、滅菌条件で、燐酸緩衝生理食塩液(pH 7.0)によってポンプ内濃度が1群のマウスに関して2 mg/ml、2群のマウスに関して0.2 mg/ml、3群のマウスに関して0.02 mg/ml、または4群のマウスに関して0 mg/ml(希釈液のみ)となるように希釈したIL-22タンパク質(A601F、0.22ml)を充填した。ポンプを背側皮膚の1 cm切開部を通してマウスの皮下に埋め込んで、皮膚を滅菌縫合糸によって閉じた。これらのポンプは、14日間にわたって0.5 μl/時間の速度でその内容物を輸送するように設計されている。この名目上の注入速度を用いると、用量レベルは1〜4群に関してそれぞれ、24 μg/日、2.4 μg/日、0.24 μg/日、および0 μg/日であると計算された。
マウス(雌性、C3H/HEJ、8週齢;Jackson Labs、バーハーバー、メイン州)を1群8匹の8群に分けた。IL-22を実施例12Aに記述するようにミニ浸透圧ポンプによる持続的注入によって投与した。Alzetミニ浸透圧ポンプ(モデル2001;Alza Corporation、パロアルト、カリフォルニア州)に、滅菌条件で、燐酸緩衝生理食塩液(pH 7.0)によってポンプ内濃度が1〜2群のマウスに関して0.22 mg/ml、3〜4群のマウスに関して0.45 mg/ml、5〜6群のマウスに関して0.9 mg/ml、または7〜8群のマウスに関して0 mg/ml(希釈液のみ)となるように希釈したIL-22タンパク質(A#601F、0.22 ml)を充填した。これらのポンプは、14日間にわたって0.5 μl/時間の速度でその内容物を輸送するように設計されている。この名目上の注入速度を用いると、用量レベルは、1〜2群に関して10 μg/日、3〜4群に関して5 μg/日、5〜6群に関して2.5 μg/日、および7〜8群に関して0 μg/日であると計算された。IL-22の所定の用量レベルでの群のそれぞれの対に関して、群の一つに、ヒトIL-22RA2 Fcタンパク質(本明細書において記述の)0.1 mgの腹腔内経路による3回注射(1、3、および5日)を行った。他の群には溶媒(PBS)を同じように注射した。
IL-22またはIL-20のインビボ活性を阻害するIL-22RA可溶性受容体またはIL-22RAに対する抗体の活性を、IL-22またはIL-20タンパク質の皮下注射によって引き起こされたアカントーシスの組織学的エンドポイントを用いて同様に評価する。このモデルの例において、先の実施例12(A)および12(B)に記述されたミニ浸透圧ポンプを、C3H/HEJマウスの皮下に埋め込む。IL-22またはIL-20に対する曝露期間に、マウスをIL-22に対する精製モノクローナル抗体の注射によって処置するか、または対照として溶媒を同様に注射した。IL-22注入期間の終了時、皮膚を組織学的分析のためにポンプ領域から採取する。IL-22RA2可溶性受容体IL-22アンタゴニストと同様に、本発明のIL-22またはIL-20アンタゴニストIL-22RA可溶性受容体または抗IL-22RA抗体は、IL-22またはIL-20によって引き起こされた表皮の肥厚および免疫細胞の浸潤の減少を示すと予想され、したがって、乾癬および他のIL-22またはIL-20による炎症疾患の治療薬としてIL-22またはIL-20アンタゴニストとして有用である。
IL-22はヒト乾癬皮膚試料においてアップレギュレートされる
RNA試料
正常皮膚試料と共に乾癬患者からの皮膚を得た。後者には、安定な斑状乾癬および隣接する無関係な皮膚からの皮膚が含まれた。RNAを、通常の方法を用いてヒト皮膚試料から単離した。RNA試料の完全性および品質をAgilent 2100バイオアナライザー(Agilent Technologies、ワルドブロン、ドイツ)において試験した。
ABI PRISM 7700配列検出システム(PE Applied Biosystems, Inc.、フォスターシティ、カリフォルニア州)を用いるリアルタイム定量的RT-PCRは、既に記述されている(Heid, C.A.ら、Genome Research 6:986〜994、1996;Gibson, U.E.M.ら、Genome Research 6:995〜1001、1996;Sundaresan, S.ら、Endocrinology 139:4756〜4764、1998を参照されたい)。この方法は、レポーターおよびクエンチャー蛍光色素の双方を含む遺伝子特異的プローブを用いることを取り入れている。プローブが無傷の場合、レポーター色素の放出は、クエンチャー色素が近位に存在することにより打ち消される。さらなる遺伝子特異的フォワードおよびリバースプライマーを用いるPCR伸長の際に、プローブは、rTth DNAポリメラーゼの5'から3'ヌクレオチド溶解活性によって切断され、これによってプローブからレポーター色素が放出されて、蛍光の放出が増加する。
IL-22 mRNAの相対的レベルを、TaqMan EZ RT-PCRコア試薬キット(PE Applied Biosystems)を用いて総RNA試料を分析することによって決定した。ランオフ(runoff)IL-22転写物を作製して、定量のために用いる標準曲線を作製した。曲線は、1試料あたり3個ずつ分析したそれぞれの標準曲線の点を有するIL-22の全メッセージの約1e8〜1e3の総コピーに及ぶ10倍連続希釈からなった。皮膚からの総RNA試料も同様にヒトIL-22転写物レベルに関しておよび内因性の対照としてhGUSのレベルに関して1試料あたり3個ずつ分析した。全量25 μlにおいて、各RNA試料に、以下を含むTaqMan EZ RT-PCR反応(PE Applied Biosystems)を行った:DEPC処置水(DNAse/RNase不含)における総RNA約25 ng;適当なプライマー(約800 nM ZC42459(配列番号:22)およびZC42458(配列番号:23));適当なプローブ(約100 nM ZC42460(配列番号:24));1×TaqMan EZ緩衝液;3 mM酢酸マンガン;300 μM各d-CTP、d-ATP、およびd-GTPおよび600 μM d-UTP;rTth DNAポリメラーゼ(0.1 U/μl);ならびにAmpErase UNG(0.01 U/μl)。PCRサーマルサイクリング条件は以下の通りであった:最初のUNG処置段階、50℃で2分を1サイクル;その後逆転写(RT)段階、60℃で30分を1サイクル;その後UNGの脱活性化段階、95℃で5分を1サイクル;その後94℃で20秒および60℃で1分の増幅を40サイクル。
IL-22はヒトアトピー性皮膚炎皮膚試料においてアップレギュレートされる
正常皮膚試料(n=4)と共に、アトピー性皮膚炎患者(n=4)からの皮膚を得た。RNAを通常の方法を用いてヒト皮膚試料から単離した。RNA試料の完全性および性質は、Agilent 2100バイオアナライザー(Agilent Technologies、ワルドブロン、ドイツ)において試験した。
ABI PRISM 7700配列検出システム(PE Applied Biosystems, Inc.、フォスターシティ、カリフォルニア州)を用いるリアルタイム定量的RT-PCRは既に記述されている(Heid, C.A.ら、Genome Research 6:986〜994、1996;Gibson, U.E.M.ら、Genome Research 6:995〜1001、1996;Sundaresan, S.ら、Endocrinology 139:4756〜4764、1998を参照されたい)。この方法は、レポーターおよびクエンチャー蛍光色素の双方を含む遺伝子特異的プローブを用いることを取り入れている。プローブが無傷の場合、レポーター色素の放出は、クエンチャー色素が近位に存在することにより打ち消される。さらなる遺伝子特異的フォワードおよびリバースプライマーを用いるPCR伸長の際に、プローブは、rTth DNAポリメラーゼの5'から3'ヌクレオチド溶解活性によって切断され、これによってプローブからレポーター色素が放出されて、蛍光の放出が増加する。
IL-22 mRNAの相対的レベルを、TaqMan EZ RT-PCRコア試薬キット(PE Applied Biosystems)を用いて総RNA試料を分析することによって決定した。ランオフIL-22転写物を作製して、定量のために用いる標準曲線を作製した。曲線は、1試料あたり3個ずつ分析したそれぞれの標準曲線の点を有するIL-22の全メッセージの約1e8〜1e3の総コピーに及ぶ10倍連続希釈からなった。皮膚からの総RNA試料も同様にヒトIL-22転写物レベルに関しておよび内因性の対照としてhGUSのレベルに関して1試料あたり3個ずつ分析した。総容積25 μlにおいて、各RNA試料に、以下を含むTaqMan EZ RT-PCR反応(PE Applied Biosystems)を行った:DEPC処置水(DNAse/RNase不含)における総RNA約25 ng;適当なプライマー(約800 nM ZC42459(配列番号:22)およびZC42458(配列番号:23));適当なプローブ(約100 nM ZC42460(配列番号:24));1×TaqMan EZ緩衝液;3 mM酢酸マンガン;300 μM各d-CTP、d-ATP、およびd-GTPおよび600 μM d-UTP;rTth DNAポリメラーゼ(0.1 U/μl);およびAmpErase UNG(0.01 U/μl)。PCRサーマルサイクリング条件は以下の通りであった:最初のUNG処置段階、50℃で2分を1サイクル;その後逆転写(RT)段階、60℃で30分を1サイクル;その後UNGの脱活性化段階、95℃で5分を1サイクル;その後94℃で20秒および60℃で1分の増幅を40サイクル。
ヒトIL-22ポリクローナル抗体
抗IL-22ポリクローナル抗体は、BHK細胞によって産生される精製成熟組換え型ヒトIL-22ポリペプチド(配列番号:6のアミノ酸番号22(Ala)〜167(Ile))(IL-22-BHK)によって雌性ニュージーランドホワイトウサギ2羽を免疫することによって調製した。ウサギにそれぞれ、最初に精製タンパク質200 μgと共にフロイントの完全アジュバントを腹腔内注射した後、3週間毎にフロイントの不完全アジュバントと共にペプチド100 μgの腹腔内注射によって追加免疫した。2回目の追加免疫(全体で3回の注射)の注射後7〜10日目に、動物から採血して血清を回収した。動物を追加免疫してさらに3週間毎に採血した。
抗ヒトIL-22モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、雌性Sprague-Dawley系ラット(Charles River Laboratories、ウィルミントン、マサチューセッツ州)4匹を、BHK細胞によって産生された精製成熟組換え型ヒトIL-22ポリペプチド(配列番号:6のアミノ酸番号22(Ala)〜167(Ile))(IL-22-BHK)によって免疫することによって調製した。ラットに精製ヒト組換え型IL-22タンパク質100 μgをフロイントの完全アジュバントと共に最初に腹腔内注射した後、2週間毎にフロイントの不完全アジュバントと共に精製組換え型タンパク質50 μgの腹腔内注射による追加免疫を行った。3回目の追加免疫の注射後7〜10日目に、動物から採血して血清を採取した。
抗IL-22RAモノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Lewisラット(Rockland Immunochemicals、ギルバーツビル、ペンシルバニア州)を切断型および精製型組換え型融合タンパク質muIL-22RA-Fc(配列番号:4)によって免疫することによって調製した。ラットにそれぞれ、精製組換え型融合タンパク質100 μgをフロイントの完全アジュバント(Pierce、ロックフォード、イリノイ州)と共に最初に腹腔内注射した後、フロイントの不完全アジュバントと共に精製組換え型タンパク質50 μgの腹腔内注射による追加免疫を2週間毎に4週間行った。最初の4週間の免疫の後、フロイントの不完全アジュバントと共に担体タンパク質キーホールリンペットヘモシアニン(KLH、Pierce、ロックフォード、イリノイ州)に共役させた切断型精製組換え型タンパク質50 μgの腹腔内注射による追加免疫を2週間毎に4週間行った。4回目の追加免疫注射後7〜10日目に、動物から採血して血清を採取した。
二つのラット抗Ms-IL-22RA mAbに対する結合親和性
ヤギ抗ラットIgG-Fcγ特異的抗体(Jackson)をCM5 Biacoreチップに固定した。アッセイは、各mAbが抗ラット捕獲表面に結合するように最適にされ、結合定数(Ka)および解離定数(Kd)を調べるためにmAbに対して一連の濃度のIL-22RAを注射した。予備試験の後、非特異的結合を融合タンパク質とチップ上の捕獲表面とのあいだに認めた。トロンビンによって切断したFc4タグを有するIL-22RAのバイアルを獲得してその後バックグラウンド作用を示さないことを調べた。各試験後、表面を20 mM HClの2回注入によって抗ラット抗体に対して再度再生した。データをそれぞれのmAbについて作製して、評価ソフトウェア(BIA評価ソフトウェア、バージョン3.2;Pharmacia BIA core、ウプサラ、スウェーデン)を用いて、下記の表12に示すようにIL-22RAタンパク質に対する抗IL-22抗体結合の動態を評価した。
組織試料におけるインビボIL-22タンパク質発現の免疫組織化学分析
A.概要
IL-22タンパク質発現および局在に関する免疫組織化学(IHC)分析を、抗ヒトIL-22(抗hIL-22)モノクローナル抗体(Mab 266.19.1.10.5.2)を用いて以下の組織試料において行った:ヒトmulti-Normal GridおよびTumor Grid;ヒト膵炎、肺、および腎疾患試料;ヒト乾癬皮膚試料;INS IL-22 TG(ラットインスリンプロモーターから発現)およびWTマウス膵臓;muIL-22-EuLCK TGおよびWTマウス皮膚試料;ならびにDSS(WTおよびIL-22KO)マウス結腸試料。その上、抗hIL-22モノクローナル抗体MAB 266.19.1.10.5.2(実施例17)対ポリクローナル抗体(ウサギ抗hIL-22)(実施例16)の染色パターンを比較した。
ヒト起源およびマウス動物モデルからのホルマリン固定およびパラフィン抱埋細胞および組織を5 μmの切片にした。細胞には、ヒトまたはマウスIL-22のいずれかを発現するBHK細胞ならびに陽性対照および陰性対照としての野生型が含まれた。ヒト組織には、様々な正常ヒト組織の切片50個(例えば、脳、下垂体、副腎、乳腺、腎臓、心臓、胃、小腸、大腸、胎児肝臓、肝臓、皮膚、膵臓、肺、扁桃、卵巣、精巣、前立腺、子宮、胎盤、甲状腺、および脾臓)を有する多組織対照スライドガラス(Normal Grid(商標);Biomeda、フォスターシティ、カリフォルニア州);様々なヒト腫瘍の切片50個(例えば、肺腺癌、肝腺癌、腎腺癌、結腸腺癌、乳腺癌、甲状腺腺癌、胃腺癌、前立腺腺癌、膵臓腺癌、卵巣腺癌、リンパ腫、黒色腫、ユーイング肉腫、類上皮細胞肉腫、MFH肉腫、横紋肉腫、カルチノイド、未分化癌、中皮腫、奇形腫、および精上皮腫)を有する多組織対照スライドガラス(Tumor Grid(商標);Biomeda、フォスターシティ、カリフォルニア州);CHTN(共同ヒト組織ネットワーク、クリーブランド、オハイオ州)からの肺癌;NDRI(国立疾患研究インターチェンジ、フィラデルフィア、ペンシルバニア州)からの正常膵臓、慢性膵炎を有する膵臓、慢性血管周囲炎を有する肺炎、多病巣性糸球体硬化症、膜性増殖性糸球体腎炎、または硬化性糸球体間質性線維症のいずれかを有する腎臓;およびヒトの乾癬皮膚試料が含まれた。マウス組織には、炎症性腸疾患動物モデルの結腸(本明細書に開示のDSSモデル、Swiss Webster系雌性マウス)ならびに溶媒または4%DSSを飲料水において7日間処置したIL-20 WTおよびKO大腸炎動物モデルの結腸(DSSマウス、野生型およびIL-20(IL-20)ノックアウト雌性マウス);ならびにmIL-22-EuLCK TGおよびmIL-22-INS対照およびTG動物を含むトランスジェニック(TG)動物モデルからの皮膚試料が含まれた。ブロック/スライドあたり切片1枚を、組織学検査のためにヘマトキシリン-エオジン(H&E)によって染色して、その後の切片は、IL-22タンパク質発現および局在に関して免疫組織化学的に染色した。
陽性および陰性対照細胞株:
抗hIL-22モノクローナル抗体であるMAB266.19.1.10.5.2は、ヒトIL-22発現BHK細胞(+++)およびマウスIL-22発現BHK細胞(+)の双方に関して陽性の染色を示したが、野生型BHK細胞に関して染色を示さなかった(-)。一次抗体を交換するためにラットアイソタイプ陰性対照によって染色した陽性および陰性BHK細胞株は全て、染色を示さず(-)このことは、抗体がIL-22リガンドに対して特異的であることを示した。抗体は、ヒトおよびマウスIL-22の双方に対して交叉免疫反応性を有した。
ヒトmulti-Normal GridおよびTumor Grid;膵臓、肺、および腎疾患試料;ならびにヒト乾癬皮膚試料を調べた。これらのヒト組織には、多組織対照スライドガラス(Normal/Grid(商標))/正常ヒト組織における1)脳、下垂体、副腎、乳腺、腎臓、心臓、胃、小腸、大腸、胎児肝臓、肝臓、皮膚、膵臓、肺、扁桃、卵巣、子宮、精巣、胎盤、甲状腺、および脾臓;2)多組織対照スライドガラス(TumorGrid(商標)/ヒト異常組織/腫瘍)における肺腺癌、肝腺癌、腎腺癌、甲状腺腺癌、胃腺癌、前立腺腺癌、膵臓腺癌、卵巣腺癌、リンパ腫、黒色腫、ユーイング肉腫、類上皮細胞肉腫、MFH肉腫、横紋肉腫、カルチノイド、未分化癌、中皮腫、奇形腫、および精上皮腫;3)CHTNおよび/またはNDRIからの正常膵臓、慢性膵炎を有する膵臓、慢性血管周囲炎を有する肺、肺癌、多病巣性糸球体硬化症を有する腎臓、膜性増殖性糸球体腎炎を有する腎臓、硬化性糸球体間質性線維症を有する腎臓が含まれた;4)。
INS IL-22 TGおよびWTマウス膵臓を調べた。INS IL-22 TG膵臓において島全体に散在する細胞は、Mab MAB 266.19.1.10.5.2によって強い陽性染色(+++)を示したが、WT膵臓は染色を示さなかった(-)。
抗IL-22ポリクローナル抗体(実施例16)は、感受性が高いことが示されたが、モノクローナル抗体MAB 266.19.1.10.5.2は特異的であった。ポリクローナル抗体は、ヒトIL-22発現BHK細胞(+++)、マウスIL-22発現BHK細胞(+)、様々なヒトおよびマウス組織試料(+)、ならびにINS mIL-22 TGマウスの島(+++)に対して陽性染色を示した。トランスジェニック動物(野生型と比較して)の島のより大きい割合が陽性染色を含んだ。トランスジェニック島における染色は一般的に、島(+++)全体に分布するが、野生型島における染色は一般的に、島の辺縁部に限定された(+)。しかし、この抗体はまた、WT BHK陰性対照細胞において非特異的染色を示した(+)。MAB 266.19.1.10.5.2は、ヒトIL-22発現BHK細胞(+++)、マウスIL-22発現BHK細胞(+)、およびINC mIL-22 TGマウスの島(+++)において陽性染色を示した。トランスジェニック島における染色は、島全体を通して一般的に分布したが(+++)、野生型島は陰性染色を示した(-)。
IL-20はヒト乾癬皮膚試料においてアップレギュレートされる
A.RNA試料
正常皮膚試料と共に乾癬患者からの皮膚を得た。後者には、乾癬に罹患した皮膚および隣接する非罹患皮膚が含まれた。通常の方法を用いてヒト皮膚試料からRNAを単離した。RNA試料の完全性および品質は、Agilent 2100バイオアナライザー(Agilent Technologies、ワルドブロン、ドイツ)において試験した。
ABI PRISM 7700配列検出システム(PE Applied Biosystems, Inc.、フォスターシティ、カリフォルニア州)を用いるリアルタイム定量的RT-PCRは既に記述されている(Heid, C.A.ら、Genome Research 6:986〜994、1996;Gibson, U.E.M.ら、Genome Research 6:995〜1001、1996;Sundaresan, S.ら、Endocrinology 139:4756〜4764、1998を参照されたい)。この方法は、レポーターおよびクエンチャー蛍光色素の双方を含む遺伝子特異的プローブを用いることを取り入れている。プローブが無傷の場合、レポーター色素の放出は、クエンチャー色素が近位に存在することにより打ち消される。さらなる遺伝子特異的フォワードおよびリバースプライマーを用いるPCR伸長の際に、プローブは、rTth DNAポリメラーゼの5'から3'ヌクレオチド溶解活性によって切断され、これによってプローブからレポーター色素が放出されて、蛍光の放出が増加する。
IL-20 mRNAの相対的レベルを、TaqMan EZ RT-PCRコア試薬キット(PE Applied Biosystems)を用いて総RNA試料を分析することによって決定した。ランオフIL-20転写物を作製して、定量のために用いる標準曲線を作製した。曲線は、1試料あたり3個ずつ分析したそれぞれの標準曲線の点を有するIL-20の全メッセージの約1e8〜1e3の総コピーに及ぶ10倍連続希釈からなった。皮膚からの総RNA試料も同様にヒトIL-20転写物レベルに関しておよび内因性の対照としてhGUSのレベルに関して1試料あたり3個ずつ分析した。総容積25 μlにおいて、各RNA試料に、以下を含むTaqMan EZ RT-PCR反応(PE Applied Biosystems)を行った:DEPC処置水(DNAse/RNase不含)における総RNA約25 ng;適当なプライマー(約800 nM ZC40541(配列番号:25)およびZC40542(配列番号:26));適当なプローブ(約100 nM ZC40544(配列番号:27));1×TaqMan EZ緩衝液;3 mM酢酸マンガン;300 μM各d-CTP、d-ATP、およびd-GTP、および600 μM d-UTP;rTth DNAポリメラーゼ(0.1 U/μl);ならびにAmpErase UNG(0.01 U/μl)。PCRサーマルサイクリング条件は以下の通りであった:最初のUNG処置段階、50℃で2分を1サイクル;その後逆転写(RT)段階、60℃で30分を1サイクル;その後UNGの脱活性化段階、95℃で5分を1サイクル;その後94℃で20秒および60℃で1分の増幅を40サイクル。
IL-20はヒトアトピー性皮膚炎皮膚試料においてアップレギュレートされる
C.RNA試料
正常な皮膚試料と共にアトピー性皮膚炎患者からの皮膚を得た。RNAは通常の方法を用いてヒト皮膚試料から単離した。RNA試料の完全性および品質は、Agilent 2100バイオアナライザー(Agilent Technologies、ワルドブロン、ドイツ)において試験した。
ABI PRISM 7700配列検出システム(PE Applied Biosystems, Inc.、フォスターシティ、カリフォルニア州)を用いるリアルタイム定量的RT-PCRは既に記述されている(Heid, C.A.ら、Genome Research 6:986〜994、1996;Gibson, U.E.M.ら、Genome Research 6:995〜1001、1996;Sundaresan, S.ら、Endocrinology 139:4756〜4764、1998を参照されたい)。この方法は、レポーターおよびクエンチャー蛍光色素の双方を含む遺伝子特異的プローブを用いることを取り入れている。プローブが無傷の場合、レポーター色素の放出は、クエンチャー色素が近位に存在することにより打ち消される。さらなる遺伝子特異的フォワードおよびリバースプライマーを用いるPCR伸長の際に、プローブは、rTth DNAポリメラーゼの5'から3'ヌクレオチド溶解活性によって切断され、これによってプローブからレポーター色素が放出されて、蛍光の放出が増加する。
IL-20 mRNAの相対的レベルを、TaqMan EZ RT-PCRコア試薬キット(PE Applied Biosystems)を用いて総RNA試料を分析することによって決定した。ランオフIL-22転写物を作製して、定量のために用いる標準曲線を作製した。曲線は、1試料あたり3個ずつ分析したそれぞれの標準曲線の点を有するIL-20の全メッセージの約1e8〜1e3の総コピーに及ぶ10倍連続希釈からなった。皮膚からの総RNA試料も同様に、ヒトIL-20転写物レベルに関しておよび内因性の対照としてhGUSのレベルに関して1試料あたり3個ずつ分析した。総容積25 μlにおいて、各RNA試料に、以下を含むTaqMan EZ RT-PCR反応(PE Applied Biosystems)を行った:DEPC処置水(DNAse/RNase不含)における総RNA約25 ng;適当なプライマー(約800 nM ZC40541(配列番号:25)およびZC40542(配列番号:26));適当なプローブ(約100 nM ZC40544(配列番号:27));1×TaqMan EZ緩衝液;3 mM酢酸マンガン;300 μM各d-CTP、d-ATP、およびd-GTP、および600 μM d-UTP;rTth DNAポリメラーゼ(0.1 U/μl);ならびにAmpErase UNG(0.01 U/μl)。PCRサーマルサイクリング条件は以下の通りであった:最初のUNG処置段階、50℃で2分を1サイクル;その後逆転写(RT)段階、60℃で30分を1サイクル;その後UNGの脱活性化段階、95℃で5分を1サイクル;その後94℃で20秒および60℃で1分の増幅を40サイクル。
IL-20によるIL-8のアップレギュレーション
継代2代目の正常ヒト表皮新生児ケラチノサイト(NHEK)(Clonetics)を12ウェル組織培養プレートに播種してコンフルエンシーまで増殖させた。KGM(ケラチノサイト増殖培地)をCloneticsから購入した。細胞がコンフルエンシーに達すると、細胞を増殖因子を含まないKGB培地=KBM(ケラチノサイト基本培地)によって洗浄した。細胞をKBMにおいて72時間血清を枯渇してから試験化合物を添加した。トロンビン1 I.U./mlおよびトリプシン25 nMを陽性対照として用いた。培地1 ml/ウェルを加えた。KBMのみを陰性対照として用いた。
IL-20による炎症性サイトカインのアップレギュレーション
ヒトケラチノサイト細胞株HaCaTを、T-75組織培養フラスコにおいてコンフルエンス後37℃で数日間増殖させた。この時点で正常増殖培地(DMEM+10%FBS)を除去して無血清培地に交換した。次に、細胞を37℃で2日間インキュベートした。次に、DMEMを除去して処置あたり4本のフラスコを以下の条件のそれぞれの一つによって37℃で処置した:5 ng/ml組換え型ヒト(rh)IL-1α、20 ng/ml rhIL-1α、5 ng/ml rhIL-1α+1 μg/ml IL-20、1 μg/ml IL-20、または10 ng/ml rhIL-10。
1.腫瘍壊死因子(TNF)はIL-20によって1.9〜2.4倍アップレギュレートされた。
2.胎盤増殖因子1&2(PLGF)はIL-20によって1.9〜2.0倍アップレギュレートされた。
3.凝固因子II受容体は、IL-20によって2.0〜2.5倍アップレギュレートされた。
4.カルシトニン受容体は、IL-20によって2.2〜2.3倍アップレギュレートされた。
5.TNF誘導型ヒアルロネート結合タンパク質TSG-6は、IL-20によって2.1〜2.2倍アップレギュレートされた。
6.血管内皮増殖因子(VEGF)受容体-1前駆体、チロシン-タンパク質キナーゼ受容体(FLT-1)(SFLT)は、IL-20によって2.1〜2.7倍アップレギュレートされた。
7.MRP-8(マクロファージにおけるカルシウム結合タンパク質、MIF関連)は、IL-20によって2.9〜4.1倍アップレギュレートされた。
8.MRP-14(マクロファージにおけるカルシウム結合タンパク質、MIF関連)は、IL-20によって3.0〜3.8倍アップレギュレートされた。
9.リラキシンH2は、IL-20によって3.14倍アップレギュレートされた。
10.トランスフォーミング増殖因子β(TGFβ)受容体III 300 kDaは、IL-20によって2.4〜3.6倍アップレギュレートされた。
1.骨形態形成タンパク質2aは、IL-20処置単独によって1.8倍、IL-1処置単独によって2.5倍、およびIL-20とIL-1の併用処置によって8.2倍アップレギュレートされた。
2.MRP-8は、IL-20処置単独によって2.9倍、IL-1処置単独によって10.7倍、およびIL-20とIL-1の併用処置によって18.0倍アップレギュレートされた。
3.赤血球分化タンパク質(EDF)は、IL-20処置単独によって1.9倍、IL-1処置単独によって9.7倍、およびIL-20とIL-1の併用処置によって19.0倍アップレギュレートされた。
4.MRP-14(マクロファージにおけるカルシウム結合タンパク質、MIF関連)は、IL-20処置単独によって3.0倍、IL-1処置単独によって12.2倍、およびIL-20とIL-1の併用処置によって20.3倍アップレギュレートされた。
5.ヘパリン結合EGF様増殖因子は、IL-20処置単独によって2.0倍、IL-1処置単独によって14倍、およびIL-20とIL-1の併用処置によって25.0倍アップレギュレートされた。
6.β-トロンボグロブリン様タンパク質は、IL-20処置単独によって1.5倍、IL-1処置単独によって15倍、およびIL-20とIL-1の併用処置によって27倍アップレギュレートされた。
7.脳由来神経栄養因子(BDNF)は、IL-20処置単独によって1.7倍、IL-1処置単独によって25倍、およびIL-20とIL-1の併用処置によって48倍アップレギュレートされた。
8.単球化学走性および活性化因子MCAFは、IL-20処置単独によって1.3倍、IL-1処置単独によって32倍、およびIL-20とIL-1の併用処置によって56倍アップレギュレートされた。
IL-20トランスジェニック表現型
ヒトおよびマウスIL-20はいずれも、多様なプロモーターを用いてトランスジェニックマウスにおいて過剰発現された。最初にタンパク質の循環中のレベルを得る試みで、ヒトIL-20の発現を指示する肝臓特異的マウスアルブミンプロモーターを用いた。その後の研究は、主に表皮および他の層状扁平上皮に対する発現を標的とするケラチン14(K14)プロモーター;広い発現パターンを生じるマウスメタロチオネイン-1プロモーター;および類リンパ系列の細胞における発現を促進するEμLCKプロモーターを用いて行った。おそらくこれらのプロモーターは全て循環中IL-20レベルを増加させることから、類似の結果が四つ全ての場合において得られた。
可溶性ヒトIL-22RA-muFcの発現のための発現ベクターの構築
マウスγ2a重鎖Fc領域(mG2a)と融合させたIL-22RAの細胞外ドメインを含むヒトIL-22RA可溶性受容体-muFc融合体(IL-22RA-C(mG2a))を調製した。IL-22RA-C(mG2a)を含む発現プラスミドを、二つの異なるDNA断片および発現ベクターpZMP40を用いて相同的組換えによって構築した。IL-22RA(配列番号:1)およびmG2a(配列番号:39)のポリヌクレオチド配列の断片を、以下のプライマーを用いるPCR増幅によって作製した:(a)IL-22RAプライマーZC45,593(配列番号:28)およびZC45,592(配列番号:29)、ならびに(b)mG2aプライマーZC45,591(配列番号:30)、およびZC45,594(配列番号:31)。
ヒト可溶性IL-22RA-muFcポリペプチドの発現および精製
三組のIL-22RA-C(mG2a)構築物200 μg(実施例22)をPvu I 200単位によって37℃で3時間消化した後、IPAによって沈殿させて、1.5 ml微量遠心管において遠心した。上清をデカントして、沈降物を70%エタノール1 mlによって洗浄し、室温で5分間インキュベートした。チューブを微量遠心機において14,000 rpmで10分間遠心して、上清を沈降物から捨てた。次に沈降物を、滅菌環境でPF-CHO培地750 μlに浮遊させて、60℃で30分間インキュベートした。5E6 APFDXB11細胞を三つのチューブのそれぞれにおいて遠心沈降させ、DNA-培地溶液を用いて浮遊させた。DNA/細胞混合物を0.4 cmギャップキュベットに入れて、以下のパラメータを用いて電気穿孔した:950μF、高い静電容量、および300 V。キュベットの内容物を採取してプールし、PF-CHO培地によって25 mlに希釈して、125 ml振とうフラスコに入れた。フラスコをシェーカーに載せて37℃、6%CO2のインキュベーターに入れて、120 RPMで振とうさせた。
huIL-22RA-mG2aによって免疫したマウスからの血清によるhuIL-22RAの中和
A.IL-20および/またはIL-22の阻害に関して試験するための細胞に基づく中和アッセイ
IL-22RAおよびIL-22RB(pDIRS1)を同時トランスフェクトした因子依存的プレB細胞株BaF3(BaF/IL-22RA/IL-20RB;実施例38)を用いて、IL-22RA/IL-20RB受容体上でIL-20に拮抗することによって、抗IL-22RA抗体の中和能を評価した。同様に、IL-22RAおよびIL-10RB(CRF2-4)を同時トランスフェクトしたBaF3細胞(BAF/IL-22RA/CRF2-4細胞;実施例2)を用いて、IL-22RA/IL-10RB受容体上でIL-22に拮抗することによって抗IL-22RA抗体の中和能を評価した。そのそれぞれの受容体発現細胞株におけるIL-20またはIL-22の存在下での増殖、およびアンタゴニスト抗体の存在下でのそのような増殖の阻害を、実施例3に記述したようにAlamar blueアッセイを用いて評価した。これらの細胞に及ぼす増殖阻害はこのアッセイにおける中和活性を示している。
実施例28Aに記述したアッセイを用いて、huIL-22RA-muG2a(実施例30(A)(1))によって免疫したIL-22RAノックアウトマウスの血清を1%、0.5%、0.25%、0.13%、0.06%、0.03%、0.02%、および0%の連続希釈液として加えた。アッセイプレートを37℃、5%CO2で4日間インキュベートして、Alamar Blue(Accumed、シカゴ、イリノイ州)を20 □l/ウェルで加えた。プレートを再度37℃、5%CO2で16時間インキュベートした。Alamar Blueは、生存細胞数に基づいて蛍光測定読み取り値を生じ、このように、陰性対照と比較して細胞増殖の直接測定である。プレートをWallac Victor 2 1420マルチラベルカウンター(Wallac、ツルク、フィンランド)において波長530(励起)および590(放出)で読み取った。結果は、免疫動物7匹全てからの血清が、huIL-22RAを通してhuIL-22およびhuIL-20の双方のシグナル伝達を中和できることを示した。例えば、1%濃度では、動物5匹(16517、16518、16519、16520、および16527)からの血清は、huIL-22によって誘導される増殖を完全に中和して、増殖の阻害は、濃度が低くなれば用量依存的に減少した。その上、1%濃度では、他の動物2匹(16471および16701)からの血清は、huIL-22によって誘導される増殖を約90%阻害して、増殖の阻害は、濃度が低くなれば用量依存的に減少した。同様に、1%および0.5%濃度では、動物5匹(16517、16518、16519、16520、および16527)からの血清は、huIL-20によって誘導される増殖を完全に中和して、増殖の阻害は、濃度が低くなれば用量依存的に減少した。その上、1%濃度では、動物16701からの血清は、huIL-20によって誘導される増殖を完全に中和して、増殖の阻害は、濃度が低くなれば用量依存的に減少した。1%濃度では、動物16471からの血清は、huIL-20によって誘導される増殖を約95%中和して、増殖の阻害は、濃度が低くなれば用量依存的に減少した。このように、動物7匹全てからの血清は、huIL-22RA受容体を通してIL-20またはIL-22のいずれかによって誘導される増殖を中和できることを示した。これらの結果は、IL-22RAに対する抗体が実際に、炎症誘発性リガンドIL-20およびIL-22の活性に低濃度で拮抗できることを示した。
P815/hIL-22RA細胞の作製とマウスの免疫
A.P815/hIL-22RA細胞の作製および抗hIL-22RA抗体を作製するためにマウスへの注射
WT P815細胞(ATCC番号TIB-64)に、hIL-22RA cDNA配列(例えば、配列番号:1)および選択可能なピューロマイシン抵抗性マーカーを含むプラスミドベクターを、Fugene試薬を用いて製造元(Roche、インジアナポリス、インジアナ州)のプロトコールに従ってトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクション後ピューロマイシン選択下で48時間培養した。ピューロマイシン抵抗性のトランスフェクタントを限界希釈によってクローニングして、ビオチン化ヒトIL-22(huIL-22-ビオチン)を用いるフローサイトメトリーによって、そのhIL-22RA細胞表面発現レベルに関してスクリーニングした。簡単に説明すると、細胞を5 μg/ml huIL-22-ビオチンと共に氷中で30分間インキュベートした後、洗浄した。細胞に対するhuIL-22-ビオチンの結合を、1:500希釈のPE-標識ストレプトアビジンを用いて検出した。細胞を、CellQuestソフトウェア(Becton Dickinson、サンノゼ、カリフォルニア州)を用いてFACscanフローサイトメーターによって分析した。
マウス抗ヒトIL-22RA(IL-22RA)mAbの作製
A.抗IL-22RA抗体を作製するための免疫
(1)可溶性IL-22RA-muFcを用いる
6〜12週齢のIL-22RAノックアウトマウス(実施例26)を、Ribiアジュバント(Sigma)と1:1(v/v)混合した可溶性ヒトIL-22RA-muFcタンパク質(実施例23)25〜50 μgの週に2回の腹腔内注射によって免疫した。3回目の免疫後7〜10日目に血液試料を眼窩後方から採取して、血清を回収し、IL-22またはIL-20およびIL-22のIL-22RAに対する結合の阻害能に関して中和アッセイ(例えば、本明細書に記述される)において評価して、FACS染色アッセイにおいてIL-22RAトランスフェクト対非トランスフェクト293細胞を染色した。マウスを免疫し続けて、血液試料を採取して、中和力価が平衡に達するまで上記のように評価した。その時点で、最高の中和力価を有するマウスの血管内に可溶性IL-22RA-Fcタンパク質25〜50 μgのPBS溶液を注射した。3日後、これらのマウスから脾臓およびリンパ節を採取して、例えばマウス骨髄腫(P3-X63-Ag8.653.3.12.11)細胞または当技術分野における他の適当な細胞株を用いて、当技術分野で既知の標準的な方法(例えば、Kearney, J.F.ら、J. Immunol. 123:1548〜50、1979、およびLane R.D.、J. Immunol. Methods 81:223〜8、1995を参照されたい)を用いて、ハイブリドーマ作製のために用いた。
6〜10週齢の雌性DBA/2マウスを、生存トランスフェクトP815細胞、例えばP815/IL-22RA細胞、P815/IL-22RA/CRF2-4、P815/IL-22RA/pDIRS1、またはP815/IL-22RA/CRF2-4/pDIRS1細胞(実施例24)1×105個(例えば、細胞密度2×105個/mlを0.5 ml)の腹腔内注射によって免疫する。注射の前に、細胞を指数増殖期に維持する。注射のために細胞を回収して、PBSによって3回洗浄した後、PBSにおいて2×105個/mlの密度に浮遊させた。このモデルにおいて、マウスは2〜3週間以内に腹水腫瘍を発症して、トランスフェクトした標的抗原に対する免疫応答が開始されなければ、4〜6週間までに死亡する。3週目に、明らかな腹部腫脹(腹水を示す)を認めないマウスを上記のように2〜3週間の間隔で再度免疫する。2回目の免疫の7〜10日後、血液試料を眼窩後方からの採血によって採取して血清を回収し、中和アッセイ(例えば、本明細書に記述の)においてIL-22またはIL-20およびIL-22の双方のIL-22RAに対する結合の阻害能に関して、およびFACS染色アッセイにおいてIL-22RAトランスフェクト対非トランスフェクト293細胞の染色能に関して評価した。マウスを免疫し続けて、血液試料を採取し、中和力価が平衡に達するまで上記のように評価した。その時点で、最高の中和力価を有するマウスの腹腔内に生存トランスフェクトP815細胞1×105個を注射した。4日後、これらのマウスから脾臓およびリンパ節を採取して、例えばマウス骨髄腫(P3-X63-Ag8.653.3.12.11)細胞または当技術分野における他の適当な細胞株を用いて、当技術分野で既知の標準的な方法(例えば、Kearney, J.F.ら、上記、およびLane R.D.、上記を参照されたい)を用いて、ハイブリドーマ作製のために用いた。
融合後8〜10日目のハイブリドーマ上清に関して異なる二つの主なスクリーニングを用いた。第一のアッセイに関して、上清における抗体を、結合したマウス抗体を同定するために、HRP-結合ヤギ抗マウスκおよび抗λ軽鎖第二段階試薬を用いるELISAによって、プレートに結合したヒトIL-22RA-muFcタンパク質に対する結合能に関して試験した。IL-22RA-muFcタンパク質のIL-22RA部分に対する特異性を証明するために、最初のアッセイにおける陽性上清を同じマウスFc領域(mG2a)に融合させた無関係なタンパク質に関して評価した。IL-22RA-muFcに結合した上清における抗体は、IL-22RAに対して特異的であるように思われたが、無関係なmuFc含有融合タンパク質は特異的ではないように思われた。第二のアッセイに関して、全てのハイブリドーマ上清における抗体を、プレートに結合したIL-22RA-muFcに対するビオチン化ヒトIL-22の結合の阻害能に関してELISAによって評価した。
おおよそトランスフェクトしたBaF3細胞に対するIL-20およびIL-22の結合を交叉中和する抗IL-22RA mAbを産生するハイブリドーマを、標準的な低密度希釈(細胞1個未満/ウェル)アプローチによってクローニングした。播種した約5〜7日後、クローンをプレート結合ヒトIL-22RA-muFc上でのELISAによってスクリーニングした後、上記のように陽性ウェルを無関係なmuFc含有融合タンパク質に関するELISAによって再度試験した。その上清がIL-22RA-muFcに結合するが、無関係なmuFc含有融合タンパク質には結合しない選択したクローンを、FACS分析と共に双方の中和アッセイを繰り返すことによって特異的抗体活性に関してさらに確認した。選択したIL-22RA抗体陽性クローンは全て、クローン性を保証するために役立つように、および抗体産生の安定性を評価するために少なくとも2回クローニングした。好ましくは得られたクローンの少なくとも95%が中和性の抗IL-22RA抗体産生に関して陽性となるまで、さらなるラウンドのクローニングを行って、記述のようにスクリーニングした。
推定の抗IL-22RA mAbsによって認識される標的分子であるIL-22RAが実際にIL-22RAであることの生化学的確認を、いずれもIL-22RAトランスフェクト対非トランスフェクトBaF3細胞からの可溶性膜調製物を用いて、標準的な免疫沈降法の後にSDS-PAGE分析またはウェスタンブロッティング技法によって行う。その上、IL-22RAを発現する非トランスフェクト細胞株の可溶性膜調製物は、mAbsがトランスフェクト細胞株と共に天然の受容体鎖を認識することを示している。または、mAbsを、可溶性IL-22RA-muFcタンパク質を特異的に免疫沈降またはウェスタンブロットするか否かに関して試験する。
huL-22RAをトランスフェクトしたP815細胞を注射したマウスからの血清によるhuL-22RAの中和
実施例28に記述される細胞に基づく中和アッセイを用いて、生存huIL-22RAトランスフェクトP815細胞(実施例30.A.2)を注射したマウスからの血清を、1%、0.5%、0.25%、0.13%、0.06%、0.03%、0.02%、および0%の連続希釈液として加えた。アッセイプレートを37℃、5%CO2で4日間インキュベートして、Alamar Blue(Accumed、シカゴ、イリノイ州)を20 □l/ウェルで加えた。プレートを再度37℃、5%CO2で16時間インキュベートした。結果は、動物4匹からの血清が、huIL-22RAを通してhuIL-22およびhuIL-20の双方のシグナル伝達を中和できることを示した。
IL-22RAノックアウトマウスの表現型
A.遺伝子改変を有するマウスの作製
1.マウスIL-20を発現する光沢のある新生児トランスジェニックマウスの作製
a)K14プロモーターからマウスIL-20を発現する構築物
インビボでIL-20の生物機能を調べるために、マウスIL-20がヒトK14プロモーターによって促進されるトランスジェニック構築物を作製した(同様に、実施例21を参照されたい)。コンセンサスコザック配列およびマウスIL-20コード領域を含むPCR断片を作製するようにオリゴヌクレオチドをデザインした。これらのオリゴヌクレオチドは、標準的なトランスジェニックベクターであるpRSK14へのクローニングを容易にするために5'末端でFseI部位、および3'末端でAscI部位を有するようにデザインした。
長さ約4 kbのNotI断片を、ケラチン特異的K14プロモーターの5'および3'隣接配列、マウスIL-20(配列番号:33;ポリペプチドを配列番号:34に示す)、Gormonイントロン、IL-20 cDNAおよびヒト成長ホルモンポリAシグナル配列を含むトランスジェニック(TG)ベクターから単離した。これを受精B6C3f1(Taconic、ジャーマンタウン、ニュージャージー州)マウス卵母細胞のマイクロインジェクションのために用いた。トランスジェニックマウスのマイクロインジェクションおよび産生は、Hogan, B.ら、「Manipulating the Mouse Embryo」、第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州、1994に記述されている。
a)マウスIL-22RAに関するノックアウト(KO)構築物の作製
インビボでIL-22RAの生物機能をさらに調べるため、IL-22RA発現を消失させるためにマウスノックアウト(KO)系統を作製した。第一に、マウスIL-22RA cDNAプローブを用いてマウス129/SvJゲノムBACライブラリをスクリーニングした。IL-22RAゲノム座を含むクローンを同定して特徴を調べた。マウスIL-22RAポリヌクレオチドを配列番号:41に示し、ポリペプチドを配列番号:42に示す。
IL-22RAゲノム座のエキソン2〜4およびイントロン2〜3の欠失が起こる陽性ESクローンを増殖させた。それらをC57Bl/6jマウスの胚盤胞に注入した。注入した胚盤胞を短期間増殖させた後、それらを偽妊娠仮親の雌性動物に導入してキメラを作製した。胚盤胞の注射、キメラの交配、およびその後の変異IL-22RAの生殖系列伝幡は、Robertson, E.J.ら、「Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach」、第二版、IRL Press Limited.、オックスフォード、1987に記述されるとおりに実施した。
IL-22RAがIL-22を注射したマウスにおいてSAA誘導のために必要であるか否かを評価するために、IL-22RA KOマウスにIL-22 5 μgを注射して6時間後に採血した。
IL-22RAがIL-22による上皮肥厚にとって必要であるか否かを評価するために、IL-22をIL-22RA HOMおよびWT KOマウスに、浸透圧ミニポンプによって皮下投与した。ポンプはIL-22を流速18.4 μl/日で7日間輸送した。HOMマウス4匹およびWT IL-22RA KOマウス6匹にIL-22タンパク質を投与して、HOMマウス3匹およびWTマウス1匹にPBSを投与した。
IL-22RAが新生児TGの仔マウスのIL-20による光沢にとって必要であるか否かを評価するために、K14 muIL-20トランスジーンをIL-22RA KO系統と交配させて、新生児マウスを光沢のある表現型に関して観察した。
IL-22RAノックアウトマウスの組織形態計測画像分析
K14 IL-20mトランスジェニック(TG)マウスの系統を確立して、TG新生児は光沢のある表現型を示す。トランスジーンは、皮膚におけるケラチン産生細胞に対する発現を指示するK14プロモーターによって発現される。IL-22RAノックアウト(KO)マウスの系統も同様に確立し、非チャレンジマウスでは有意な変化を認めなかった。二つの系統を互いに交配して、以下の四つの異なる表現型を有する新生児マウスを採取した:(1)TG/-HOM:IL-22RAを発現しないバックグラウンドにおいてk14 IL-20 mトランスジーンを発現する;(2)TG/-Het:IL-22RA遺伝子1コピーからいくつかのIL-22RAを発現するバックグラウンドにおいてk14 IL-20 mトランスジーンを発現する;(3)WT/HOM:IL-22RAを発現しないバックグラウンドにおいてk14 IL-20 mトランスジーンを発現しない;および(4)WT/Het:IL-22RA遺伝子1コピーからいくつかのIL-22RAを発現するバックグラウンドにおいてk14 IL-20 mトランスジーンを発現しない。これらの様々な遺伝子型の新生児マウス34匹を3日目、生後約48時間で安楽死させた(表15)。
(a)頭側胸部、尾側胸部、および腹部における表皮の厚さの平均値(μm)
表皮の厚さは、IL-22RA遺伝子1コピーを欠損するIL-20トランスジェニック仔マウス(TG/-Het)では、IL-22RAを発現しないIL-20トランスジェニック仔マウス(TG/-HOM、P=0.001***)および対照同腹子(WT/HOM、P=0.001***およびWT/Het、P=0.001***)と比較して有意に増加した(表16)。TG/-Het仔は、おそらくケラチノサイトの過栄養により角化表皮の厚さの増加を示した。この増加は、三つ全ての非角化層(基底、有棘、および顆粒)を巻き込むが、最もしばしば有棘細胞層に罹患する。TG/-HOM仔マウスの表皮の厚さは約25%増加し、棘はより顕著となった。TG/-Het仔マウスの表皮は対照よりわずかに厚かったが(WT/HOMおよびWT/Het)、統計学は群のあいだに有意差を示さなかった(P>0.05)。頭側胸部、尾側胸部、および腹部における表皮の厚さも同様に比較した。腹部の通常の薄い表皮は、尾側胸部より厚く、尾側胸部は頭側胸部より厚い(表16)。
IL-22RA(HOM)を発現しない、または遺伝子(Het)1コピーを発現するいずれかのバックグラウンドのIL-20トランスジェニック仔マウス(TG/-)では表皮の厚さが増加したにもかかわらず、TG/-HOMおよびTG-/Het皮膚では、対照同腹子(WT/HOMおよびWT/Het)と比較して角質層または角化層の厚さの顕著な減少を認め、統計学は群の差が極めて有意であることを示した(P<0.0001****、表20)。TG/-Het仔マウスは、TG/-HOM(P<0.01**)、WT/HOM(P<0.001***)、およびWT/Het(P<0.001***)と比較して、表皮表面上のケラチンの量のそれぞれ、約36%、50%、および49%減少を示した。TG/-HOM仔マウスは、その対照(WT/HOM、P<0.05*)と比較して角質層の厚さの約22%の有意な減少を示したが、WT/Hetと比較すると17%の減少を示したに過ぎず、これは統計学的有意ではなかった(P>0.05)。対照群であるWT/HOMおよびWT/Hetにおける角質層の厚さはほぼ同じであった。明らかに、尾側胸部における角質層は腹部より厚く、腹部は頭側胸部の角質層より厚い。
TG/-Het仔マウスは、対照同腹子(WT/HOMおよびWT/Het)と比較して表皮の厚さの有意な増加および角質層の厚さの有意な減少を示し、TG/-HOM仔マウスは、類似の結果を生じたがその作用は小さかった(表24)。
表皮は、恒常性のために細胞増殖、分化、および細胞死のバランスに依存して絶えず再生する階層化上皮である。正常な表皮において、分裂活性の高い基底層は最終分化ケラチノサイトを生じ、これは外側に遊走して、最終的に除核された鱗屑として皮膚表面から脱落し、ケラチンまたは角化層は角質層に存在する。多くのタンパク質が表皮の恒常性を維持するために機能することが知られているが、これらの事象に関する分子の協調はあまり理解されていない。IL-20は新規受容体-相互作用タンパク質であり、これはケラチノサイトの増殖に関連する皮膚の層において発現されるIL-20RAまたはIL-22RA受容体(IL-22RA)のいずれかを通してシグナルを伝達する。IL-20トランスジェニック新生児マウスは、異常な肥厚した光沢のある皮膚表現型を示す。マウスにおけるIL-22RAm(HOM)欠損は、IL-22処置に対する反応を示さなかったが、IL-22RA遺伝子を有する野生型マウスをIL-22によって処置すると、表皮の厚さの有意な増加を示した(P<0.001***、IL-22RAm KO/IL-22組織形態計測画像分析の結果を参照されたい、PID 59.2)。IL-22RAが非存在しないことがK14 IL-20m TG新生児マウスにおいて認められた光沢のある表現型に影響を及ぼすか否かを調べるために、IL-20を異所発現するトランスジェニックマウスをIL-22RAホモ接合(HOM)またはIL-22RAヘテロ接合(Het)欠損体と交配させた。表皮の厚さの定量的画像分析は、本試験からの尾側胸部においてより少ない仔マウスにおいて既に行われた(すなわち、仔マウス19匹、1切片/仔、全体で切片19個)が、調べた動物数が限られていたために、そして群間の変動のために統計学的有意差が得られなかった。本試験の目的は、IL-20の生物学を調べるために、および信頼できる定量的結果を得るために、同じ試験のそれぞれの仔マウスからの頭側胸部、尾側胸部、および腹部におけるより多くの皮膚試料を組織形態計測的に定量することであった(すなわち、仔マウス34匹、切片3個/仔、全体で切片102個)。有効な画像分析のために、本発明者らは、確実に、パラフィンブロックにおける皮膚の方向が一貫している、および皮膚試料が全ての個体および仔の群において同じそれぞれの位置から測定されるようにした。二種類の測定を行った:(1)ケラチノサイト増殖および分化の媒介におけるIL-20の役割を調べるために、表皮の厚さは、脊髄の背側のそれぞれにおける各皮膚試料において、顕微鏡の倍率10倍の視野において10回測定する;(2)角化層または角質層の厚さはIL-20 TG新生児マウスにおける光沢のある皮膚外観と結果を相関させるために同じように測定した。
IL22RAノックアウトマウスに及ぼすIL-22の影響
IL-22RA KO(HOM)23匹および対照(WT)13匹を含むマウス36匹に、IL-22またはPBのいずれかを、チューブを備えたミニポンプまたはミニポンプのみを埋め込むことによって皮下投与によって処置した(表25)。
IL-22(WT/IL-22)を処置したWTマウス皮膚における表皮の厚さはWT/PBS対照と比較して有意に増加した(P=0.0001)。IL-22を処置したIL-22RAm KOマウス皮膚(HOM/IL-22)は、HOM/PBS対照と比較して表皮の厚さの平均値の増加を示したが、二つの群のあいだに統計学的有意差を認めなかった(P>0.05)。IL-22RA KOマウスでは、WTマウスと比較して表皮の厚さの顕著な減少を認めた(例えば、HOM/IL-22対WT/IL-22;P<0.001)(表26)。
表皮の厚さは、WT/PBS雄性対照と比較してIL-22(WT/IL-22)処置したWT雄性マウス皮膚では約2倍増加した(P=0.0001)が、IL-22を処置したIL-22RAm KO雄性マウスの表皮(HOM/IL-22)は、HOM/PBS雄性対照と比較してごくわずかな増加を示したに過ぎなかった(P>0.05)。特に、IL-22RAm KOマウスは、対照のWT雄性マウス(例えば、HOM/PBS対WT/PBS:P<0.05;HOM/IL-22対WT/IL-22:P<0.001)(表27)と比較すると、表皮の厚さの顕著な減少を示した。
雌性マウスの表皮は雄性マウスより厚いことが判明した(例えば、HOM/IL-22雄性対HOM/IL-22雌性:P<0.01;WT/IL-22雄性対WT/IL-22雌性:P<0.05)(表28)。
IL-22ポンプ&チューブを有するIL-22RAm KO(HOM)マウスの表皮は、ポンプのみを埋め込んだIL-22RAm KO(HOM)マウスより有意に厚いことが判明した(P<0.0001、対応のないT検定による)(表29)。
併せて考慮すると、本研究の目的は、IL-22RAm KOおよびWTマウスの双方からのIL-22処置皮膚における表皮の作用の特徴を調べて、これらの知見を臨床での適応に関連させることである。定量的画像分析を行って、H&E染色皮膚切片における表皮の厚さを決定した。各動物からの皮膚試料を組織形態計測によって120回測定して(すなわち、各マウスからの6区画切片のそれぞれ20回測定=120測定)、表皮の厚さの平均値をエクセル計算によって得た。組織形態計測試験から、IL-22によってIL-22RA受容体の存在下で特にWTマウスにおいて表皮の厚さの有意な増加が起こり(ANOVAによってP<0.0001、極めて有意であると見なされる)、IL-22RA受容体の非存在下でIL-22RAm KO(HOM)マウスに対してほとんどまたは全く作用を示さなかった(P>0.05)ことが示された。IL-22処置WTマウスにおける表皮の厚さはPBSを処置したマウスより約43%増加したのに対し(例えば、WT/PBS、P<0.001)、IL-22処置IL-22RAmKO(HOM)マウスは、対照と比較して表皮の厚さの26%増加を示したに過ぎなかった(HOM/PBS、P>0.05)。IL-22RAm KOマウスはWTマウスと比較してより薄い表皮を示した(P<0.001)。全体として、マウス皮膚に及ぼすIL-22の生物作用は、この因子が表皮の成長および増殖の調節に関係する可能性があることを示唆している。
抗ヒトIL-20モノクローナル抗体(クローン#262.7.1.3.2.4)の薬物動態
試験モノクローナル抗体、抗ヒトIL-20 mAb(クローン#262.7.1.3.2.4)を濃度1.08 mg/ml(280 nmでのUV吸光度によって決定)で3×3 mlに分けて、使用するまで-80℃で保存した。溶媒は1×PBS(50 mM NaPO4、109 mM NaCl)、pH 7.3であった。mAbを使用前に室温で融解して少量1および2をそれぞれ100 μg IVおよびSC投与群のために用いた。少量3の半分を1×PBSによって1:2倍希釈して50 μg SC投与群とし、少量3のもう半分を1×PBSによって1:10倍希釈して10 μg SC投与群とした。雌性SCIDマウス(n=96)はCharles River Labsから得た。到着時に動物の健康状態をチェックして群毎に収容した(動物3匹/ケージ)。マウスは試験開始時12週齢であり、平均体重は22 gであった。
雌性SCIDマウス(n=24/用量群)を四つの投与群に無作為に割付した(表30を参照されたい)。群1には、抗huIL-20 mAb約93 μlを尾静脈からIV注射によって投与し、群2、3および4には、首筋にmAb約93 μlをSC注射によって投与した。
採血の前に、マウスをハロタンまたはイソフルオランによって十分に麻酔した。血液試料を168時間の時点(眼窩採血によって採取し、同じ動物を504時間では心穿刺によって採血した)を除く全ての時点で心穿刺によって採取した。血液を血清分離用試験管に採取して15分間凝固させた。その後試料を14,000 rpmで3分間遠心した。遠心後、125〜150 μlの少量を、ラベルを付けたエッペンドルフチューブに分配して、分析するまで−80℃で直ちに保存した(表30)。
酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)を開発して、薬物動態研究において抗IL-20 mAb 267.7.1.3.2.4を投与した動物からのマウス血清試料を分析するために適合させた。このアッセイは、市販の二次抗体およびTMBを用いる比色検出を利用するようにデザインされた。標準曲線のために用いられる希釈液は、標準曲線の直線部分の定義を改善するように改変された。100 ng/ml〜0.231 ng/mlの範囲の2倍希釈の標準曲線によってマウス血清試料を定量することが可能であった。QC試料を、10%SCIDマウス血清において1:100、1:1000および1:10000倍希釈して、標準曲線から逆計算した。
血清濃度対時間データを、薬物動態分析のためにWinNonlinプロフェッショナル4.0ソフトウェア(Pharsight, Inc.、キャリー、ノースカロライナ州)にダウンロードした。ノンコンパートメント分析を用いて、各時点での平均データに基づく薬物動態パラメータを決定した。
100 μg IV、ならびに100、50、および10 μg SC投与後の血清中抗ヒトIL-20 mAb濃度の平均値を表31に示す。
CD4+CD45RBhi(CD25)大腸炎および乾癬モデルにおけるIL-20およびIL22アンタゴニスト
A.概要
CD4+CD45RBhiまたはCD4+CD25-T細胞を同系SCIDマウスに移入すると、マウスに大腸炎が起こる。調節性T細胞(CD4+CD25+またはCD4+CD45RBlo)を同時移入すると、大腸炎を阻害する。CD4+CD25-T細胞をマウスに移入した後、マウスにブドウ球菌のエンドトキシンB(SEB)をさらに注射すると、マウスは大腸炎を発症するのみならず、乾癬を発症する。IL-22RA、IL-20、IL-22、IL-20Rおよび/またはIL-22Rに対する抗体、または可溶性IL-22RA受容体を、細胞移入後0〜21日目に投与して、大腸炎および乾癬の症状をモニターする。乾癬スコアまたは大腸炎(組織学)が阻害されれば、IL-21がこれらの自己免疫疾患を阻害できることを示している。
脾臓および鼠径リンパ節をB10.D2マウスから単離した。単細胞浮遊液を作製して計数する。Miltenyiビードシステムを用いて、CD25+細胞を陽性選択によってソーティングする。細胞をCD25-PE(BD Pharmingen)の1:100倍希釈液によって染色し、15分間インキュベートする。過剰量の抗体を洗浄して、細胞を10μlの抗PEビーズ/細胞106個と共に20分間インキュベートした。細胞をPBSによって洗浄し、LSカラムに通過させる(Miltenyi Biotech)。カラムを通過する細胞(CD25-)をさらなる分析のために保持する。CD4濃縮カクテル(Stem Cell technologies)をこれらのCD25-細胞に加え(1:100倍)、15分間インキュベートする。細胞をPBSによって洗浄する。抗ビオチン四量体の1:10倍希釈液を細胞に15分間加えた後、磁気コロイド(60 μl/106個)を15分間加える(全て、Stem Cell technologies)。細胞を負の選択カラム(0.5"、Stem Cell technologies)に通過させる。通過した細胞はCD4+CD25-である。純度はフローサイトメトリーを用いて分析する。未投薬のCB-17 SCIDマウスに細胞0.4×106個を全量200 μlでi.v.注射する。マウスにSEB 10 μgを翌日(d1)にi.p.注射する。乾癬および大腸炎の症状を2〜5週間追跡する。マウスを以下の基準で乾癬疾患に関して採点する。0−病変なし、1−頚部の軽度の病変、2−頚部および背部(体躯)での重度の病変、3−頚部、背部、および腹部における非常に重度の病変。耳の肥厚も同様に疾患の重症度の測定として測定する。マウスの群に、PBS、対照抗体100 μg、またはIL-22RA、IL-20、IL-22、IL-20R、またはIL-22R、または可溶性IL-22RAに対する抗体10〜100 □gを異なる投与レジメで1〜30日間i.p.注射する(3回/週、または2回/週)。
抗体処置マウスにおいて乾癬および大腸炎の症状が阻害されたことは、IL-20および/またはIL-22を阻害すると、乾癬および大腸炎のこのモデルにおける自己免疫症状を阻害できることを示している。
SCID-hu移植乾癬モデルにおけるIL-20およびIL-22アンタゴニスト
SCIDマウスに移植したヒト乾癬皮膚は、その臨床的、光学顕微鏡、および免疫組織化学的乾癬特徴を数週間維持することができる。このモデルは病変組織を正常な表現型まで回復させることを意図する治療を評価するための系を提供する。ヒト皮膚の移植に成功した後、IL-22RA、IL-20、IL-22、IL-20R、および/またはIL-22Rに対する抗体、または可溶性IL-20もしくはIL-22受容体を数週間投与することができ、表皮の厚さを分析して乾癬に対するこれらのアンタゴニストの作用を評価することができる。
表皮全体および数mmの真皮からなる6 mmの完全な厚みの穿孔生検を、健康な成人ボランティアおよび乾癬病変皮膚から得る。生検4〜6個を各ドナーから得る。各ドナーからの穿孔生検1個をレシピエントSCIDマウスの背側表面に移植する(CB-17、Taconic)。動物を病原体を含まない環境において維持する。処置は、以下のように移植の成功後(移植後2〜3週間)開始する:陰性対照のために生検1個(PBSまたはアイソタイプmAb)、陽性対照のために生検1個(シクロスポリンA)、および抗ヒトIL-22RA、抗ヒトIL-20、抗ヒトIL-22 mAb、またはIL-20もしくはIL-22に対する可溶性受容体による処置のために生検2〜3個(腹腔内注射、M-W-Fスケジュールで週に3回を2〜4週間)。
臨床観察および評価は実験を通して定期的に行い、記録されるであろう。乾癬病変の重症度を、鱗屑、硬化、および紅斑に関して盲検的に評価する。パラメータは3点尺度を用いて採点することができる:0=皮膚の罹患が完全にないこと;1=わずかな罹患;2=中等度の罹患;3=重度の罹患。投与期間終了時、各動物を安楽死させて、組織学およびIHCのために組織を採取する。(1)組織の一部を10%ホルマリンにおいて固定して、ヘマトキシリン-エオジンによって染色する。表皮領域を、NIH画像ソフトウェアを用いて単位長さあたりの表皮の厚さの変化の関数として測定する。各移植体からの多数の領域を定量して高いn値および表皮面積の平均値を提供する。(2)上部真皮において高倍率(0.103×0.135 mm)での炎症性単核球数;(3)錯角化症の等級を0〜3までの任意の尺度で採点し、0は錯角化症なし、1は、切片の3分の1未満における錯角化症、2は切片の3分の1を超えるが3分の2未満における錯角化症、および3は切片の3分の2を超える錯角化症である。(4)組織の残りをKi67(増殖しつつあるケラチノサイトのマーカー)に関して染色して、切片のKi67循環中ケラチノサイト数/長さmmを評価する。表皮の厚さによって測定した乾癬の重症度の減少は、IL-20およびIL-22機能の中和がこの乾癬モデルにおいて有効となりうることを示している。乾癬の重症度の減少を定量するために、本発明者らは、上部真皮における炎症細胞数、Ki67循環中ケラチノサイト数、および錯角化症の等級を測定する。対照マウスと比較して治療群に関する四つ全てのパラメータが有意に減少すれば、IL-20、IL-22アンタゴニストの治療的利用の可能性を示している。
Alamar Blue増殖アッセイを用いてBaF3/IL-22RA/IL-20RB細胞を用いるIL-20アンタゴニスト活性のスクリーニング
因子依存的プレB細胞株であるBaF3に、IL-22RAおよびIL-20RBを同時トランスフェクトして(実施例3を参照されたい)、様々な濃度のIL-20を処置した。増殖は、実施例3に記述したようにAlamar Blueアッセイを用いて評価した。IL-20はサイトカインに関して期待される濃度で用量依存的に増殖を刺激し、IL-20がサイトカインに関して期待される濃度でヘテロ二量体IL-22RA/IL-20RB受容体に結合して活性化することを示している。非トランスフェクトBaF3細胞を含む陰性対照は増殖しなかった。
抗huL-22RAモノクローナル抗体によるIL-20およびIL-22活性の中和
実施例28に記述される細胞に基づく中和アッセイを用いて、精製マウス抗huIL-22RAモノクローナル抗体(実施例30(D))を連続希釈液、例えば10 μg/ml、5 μg/ml、2.5 μg/ml、1.25 μg/ml、625 ng/ml、313 ng/ml、156 ng/ml、および78 ng/mlとして加えた。アッセイプレートを37℃、5%CO2で4日間インキュベートして、Alamar Blue(Accumed、シカゴ、イリノイ州)を20 □l/ウェルで加えた。プレートを再度37℃、5%CO2で16時間インキュベートした。結果は、精製抗huIL-22RAモノクローナル抗体が、huIL-22RAを通してhuIL-22およびhuIL-20の双方のシグナル伝達を中和できることを示した。10 μg/ml濃度では、抗体はhuIL-22またはhuIL-20によって誘導される増殖を完全に中和したが、増殖の阻害は濃度が低くなれば用量依存的に減少した。アイソタイプマッチ陰性対照マウスmAbは上記の調べた濃度でいずれのサイトカインの増殖阻害も示さなかった。これらの結果は、IL-22RAに対するモノクローナル抗体が、低濃度で炎症誘発性リガンドであるIL-20およびIL-22の活性に実際に拮抗できることをさらに証明している。
中和性抗IL-22RAモノクローナル抗体による妊娠IL-20およびIL-22トランスジェニックマウスの処置
インビボで中和抗体に関するラット抗マウスIL-22RAモノクローナル抗体(mAb)を調べるために、妊娠IL-20トランスジェニック(Tg)およびIL-22 Tgマウスに抗マウスIL-22RA mAbを腹腔内注射する。新生児マウスをこれらの系統のマウスの通常の特徴である「光沢のある」皮膚表現型の有無を評価する。
臓器培養乾癬モデルにおけるIL-20およびIL-22アンタゴニスト
ヒト乾癬斑の皮膚を臓器培養において維持して、異常な組織学特徴を有する病変皮膚を外因性の増殖因子の非存在下で維持する。IL-22RA、IL-20、IL-22、IL-20R、および/またはIL-22Rに対する抗体、または可溶性IL-20もしくはIL-22受容体を投与して、乾癬病変皮膚の組織学特徴を改善することができる。
完全な表皮および数mmの真皮からなる完全な厚みの2 mm穿孔生検を、健康な成人ボランティアまたは乾癬病変皮膚から得る。生検直後、組織を、ケラチノサイト基本培地(KBM)(Clonetics Inc.、ウォーカースビル、メリーランド州)からなる培養培地に沈める。培養培地にCaCl2を添加して、最終的なCa2+濃度を1.4 mMにする(Varaniら、1993、1994)。次に、生検を、ヒトIL-20、IL-22、IL-22RAに対する抗体、またはIL-20もしくはIL-22の可溶性受容体によるさらなる処置を行う、または行わずに、Ca2+添加KBM 200 μlを含む96ウェル培養皿のウェルにおいてインキュベートする。培養物を95%空気および5%CO2の大気中で37℃で8日間インキュベートする。
インキュベーション期間の終了時、組織を10%緩衝ホルマリンにおいて固定し、ヘマトキシリン-エオジンによって染色後組織学的に調べた。抗体または可溶性受容体に曝露した乾癬組織の外観は、以下の知見を含む正常組織の外観に非常によく類似している:最初の無秩序な不規則的な基底上皮細胞は、極性を回復してより柱状の外観を示した;上皮網の隆起は退縮して、上皮細胞が真皮空間に侵入している領域はより少ない;および上部上皮層の全体的な変性はより少なかった。臓器培養モデルは、特定の化合物が抗過増殖物質としての可能性を有するか否かを決定するための迅速かつ感度のよい手段を提供する。異常な組織学特徴は、IL-20、IL-22アンタゴニストの存在下で改善される可能性があり、乾癬の治療におけるそのような物質の有効性を示唆している。
中和性mAb R2.1.5F4.1およびR2.1.15E.2.1に結合するmIL-22RA(zCytoR11m)領域のマッピング
A.中和性モノクローナル抗体が結合するマウスIL-22RA上のエピトープ
下記の実験は、マウスIL-22RA可溶性受容体タンパク質(配列番号:62)のアミノ酸配列における、受容体活性またはアンタゴニストもしくは中和性抗体結合にとって重要な領域または複数の領域を同定することを目的とした。Fcを除去するために予めトロンビンによって切断したマウスIL-22RA-Fcタンパク質を、臭化シアン(CNBr)と共にインキュベートすることによって、配列におけるメチオニン残基に対するC-末端で切断した。CNBrによって産生されたペプチドを分画して、分画をELISAによって検出される結合活性に関して、および中和特性を有するモノクローナル抗体、クローンR.2.1.5F4.1およびR2.1.15E2.1を用いるウェスタン分析による反応性に関して調べた。
mIL 22RA 50 μgを凍結乾燥して蟻酸(70%)180 μlに溶解する。アセトニトリルに溶解した5 M CNBr 1 μlを加えた。試料を混合して、室温の暗所で18時間反応させた。反応混合物150 μlを、分析的Zorbax SB300-C8カラムを備えた逆相HPLCによって分画した。25%アセトニトリル(0.085%TFA)および75%水(0.1%TFA)から開始して95%アセトニトリル(0.085%TFA)および5%水(0.1%TFA)で終了する勾配を用いてピークを分離した。UV分析は、三つの主要なピークと二つの小さいピークとを示し、これらを回収した。各分画を半分に分割した;一つの部分にELISAを行い、他の部分を凍結乾燥して、燐酸緩衝生理食塩液(PBS)150 μlに溶解した。PBS分画のUV分析によって、分析カラムから回収した全てのピークが回収されたことを確認した。PBS分画にウェスタン分析を行った。
CNBrによって切断されたIL-22RAからのペプチド配列を含むHPLC分画を、HPLC緩衝液(90%アセトニトリル、10%H2O、0.09%トリフルオロ酢酸)を用いてほぼ等濃度に希釈した。試料を96ウェルマイクロタイタープレートに各4ウェルずつ100 □l/ウェルで加えて換気フード内で室温で一晩乾燥させた。プレートをELISA C緩衝液(PBS、0.05%ツイーン20)によって洗浄した後、ELISA B緩衝液(PBS、0.1%BSA、0.05%ツイーン20)によって37℃で2時間ブロックした。IL 22RAに対する二つのモノクローナル抗体(クローンR2.1.5F4.1およびクローンR2.1.15E.2.1)をELISA Bにおいて2 □g/mlに希釈した。各mAbを各ペプチド配列試料に100 □l/ウェルで加えて、プレートを37℃で60分間インキュベートした。プレートを洗浄して未結合抗体を除去し、二次抗体(西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ラットIgG(Jackson))をELISA B緩衝液において1 □g/mlに希釈して、全てのウェルに100 □l/ウェルで加えた。プレートを37℃で1時間インキュベートした。ウェルをELISA C緩衝液によって洗浄した後、TMB 1成分HRPマイクロウェル基質(BioFx)と共に5分間インキュベートした。TMBマイクロウェル(BioFx)用450 nm停止試薬を加えて反応を停止させて、Dynatech ELISAプレートリーダー(Molecular Devices)において450 nmでの吸光度を読み取った。
CNBrによって切断したIL-22RAからのペプチド配列を含むHPLC分画を室温で一晩凍結乾燥して、PBSに溶解した。次に試料を非還元試料緩衝液(Invitrogen)と混合して、10分間沸騰させた。試料を全て室温で、1×MES-SDS泳動用緩衝液(Invitrogen)を用いて4〜12%ビストリスゲル(Invitrogen)上にローディングしてSDS-PAGEによって電気泳動し、20%メタノール転写緩衝液においてニトロセルロース(0.2 □m;Bio-Rad)に転写した。フィルターを室温で一晩乾燥させた。フィルターを10%脱脂粉乳の緩衝液A(50 mMトリス、pH 7.4、5 mM EDTA、0.05%Igepal CA-630、150 mM NaCl、0.25%ゼラチン)溶液によって室温で30分間ブロックした。IL-22RAに対するモノクローナル抗体(mAb)(クローンR.2.1.5F4.1)を2.5%脱脂粉乳を含む緩衝液Aにおいて2□g/mlに希釈した。ブロットをこの一次抗体と共に室温で1時間インキュベートした。インキュベーション後、ブロットを緩衝液Aにおいて3回洗浄して1:5000倍希釈の二次抗体(ヤギ抗ラットIgG-西洋ワサビペルオキシダーゼ;Jackson Inc.)の2.5%脱脂粉乳を含む緩衝液A溶液と共に室温で1時間インキュベートした。ブロットを洗浄して、化学発光基質(Lumi-Lightウェスタンブロッティング基質;Roche)によって展開して、発光イメージャー(Mannheim Boehringer Lumi-Imager)を用いて露出した。
分析的逆相カラムから採取したCNBr ペプチドの中で、分画#4はELISAにおいて活性を示し、同様にウェスタンブロッティング陽性であった。活性分画#4に存在するペプチドを同定するために、周知の方法を用いて試料にEdman分解を行った。三つのN末端を活性分画から同定し、これらはペプチド2(配列番号:49)、3(配列番号:50)および5(配列番号:52)と一致した。これらの結果は、抗体がペプチド2(配列番号:49)、3(配列番号:50)および5(配列番号:52)に結合したことを示した。
CNBr-切断mIL22RAペプチドの混合物から五つの分画を単離した。これらの中で分画#4のみがELISAにおいて活性であり、ウェスタン分析陽性であった。エドマン分解によって、CNBrペプチド2(配列番号:49)、3(配列番号:50)および5(配列番号:52)に一致する三つのN末端が同定された。これらの領域において、残基6個はおそらくリガンド結合に関係している。これらの残基は、配列番号:42のY93、R112、K210、およびE211であり、同様に配列番号:62の残基Y78、R97、K195、およびE196に対応する。配列番号:42の残基Y60およびF164も同様にリガンド結合に関与している。
下記の実験は、ヒトIL-22RAタンパク質(配列番号:2)のアミノ酸配列の細胞外ドメインにおける、受容体活性またはアンタゴニストもしくは中和性抗体結合にとって重要な領域または複数の領域を同定することを目的とした。ヒト可溶性受容体IL-22RAタンパク質(例えば、Fcを除去するためにトロンビンによって切断したIL-22RA-Fcのような、配列番号:3を含む)を、臭化シアン(CNBr)、または既定の断片にヒトタンパク質を切断する当技術分野で既知の他の試薬と共にインキュベートすることによって、配列におけるメチオニン残基に対してC-末端で切断する。CNBr生成ペプチドを分画して、得られた分画をELISAによって検出されるように結合活性に関して試験して、ELISAによって検出される結合活性に関して、および中和特性を有するモノクローナル抗体を用いるウェスタン分析による反応性に関して試験した。
ヒトIL-22RA約50 μgを凍結乾燥して、溶解、分画、回収して、抗IL-22RAモノクローナル抗体を含む分画、およびELISAおよびウェスタン分析によって示されるようにIL-22RAに結合する分画を同定するために、実施例42Aに記述されるようにウェスタン分析およびELISAを用いて分析する。次に、分析的逆相カラムから採取したCNBrペプチド分画を、ELISAにおいて活性に関して試験し、ウェスタンブロッティングによって陽性であると確認する。陽性分画に関して、ペプチドを周知の方法を用いてエドマン分解によって同定する。
マウスCNBrペプチド#5(配列番号:52)は、ヒトCNBrペプチド#9、および#10(配列番号:59および配列番号:60)に対応する;マウスCNBrペプチド#2(配列番号:49)はヒトCNBr #6(配列番号:56)に対応する;およびマウスCNBrペプチド#3(配列番号:50)はヒトCNBr #7(配列番号:57)に対応する。CNBr-切断ヒトIL-22RAペプチドの混合物から単離した分画の中で、可能性がある領域内の6個の残基がおそらくリガンド結合に関与している:リガンド受容体結合にとって重要である配列番号:2の残基(および配列番号:3の対応する残基)は、配列番号:2のTyr-60およびPhe-164、Tyr-93、Arg-112、Lys-210、およびGlu-211(ならびに配列番号:3の対応する残基)を含む。その上、直接リガンド-受容体結合にとって重要である配列番号:2の一次残基(および配列番号:3の対応する残基)は、配列番号:2(および配列番号:3の対応する残基)のTyr-60、およびPhe-164を含み、二次残基は配列番号:2のTyr-93、Arg-112、Lys-210、およびGlu-211(および配列番号:3の対応する残基)を含む。
Claims (19)
- 以下の群由来のいずれかのハイブリドーマによって発現される、抗体またはその抗原結合性断片:
(a) ハイブリドーマ・クローン280.46.3.4(ATCC特許寄託指定番号PTA-6284)
(b) ハイブリドーマ・クローン281.73.49.1.1(ATCC特許寄託指定番号PTA-6285)
(c) ハイブリドーマ・クローン283.4.1.2(ATCC特許寄託指定番号PTA-6287)
(d) ハイブリドーマ・クローン283.52.5.4(ATCC特許寄託指定番号PTA-6311)および
(e) ハイブリドーマ・クローン283.108.2.3(ATCC特許寄託指定番号PTA-6286)。 - 配列番号:2または配列番号:3に結合する、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
- 配列番号:6に示されたポリペプチドまたは配列番号:8に示されたポリペプチドの炎症誘発性活性を減少または中和させる、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
- PEG化されている、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
- 放射性核種、酵素、基質、共因子、蛍光マーカー、化学発光マーカー、ペプチドタグ、磁気粒子、薬物、または毒素をさらに含む、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
- 請求項1に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、薬学的組成物。
- 以下の群由来のいずれかのハイブリドーマによって発現されるモノクローナル抗体を含む、免疫結合体:
(a) ハイブリドーマ・クローン280.46.3.4(ATCC特許寄託指定番号PTA-6284)
(b) ハイブリドーマ・クローン281.73.49.1.1(ATCC特許寄託指定番号PTA-6285)
(c) ハイブリドーマ・クローン283.4.1.2(ATCC特許寄託指定番号PTA-6287)
(d) ハイブリドーマ・クローン283.52.5.4(ATCC特許寄託指定番号PTA-6311)
(e) ハイブリドーマ・クローン283.108.2.3(ATCC特許寄託指定番号PTA-6286)。 - 配列番号:2または配列番号:3に結合する、請求項7に記載の免疫結合体。
- 配列番号:6に示されたポリペプチドまたは配列番号:8に示されたポリペプチドの炎症誘発性活性を減少または中和させる、請求項7に記載の免疫結合体。
- PEG化されている、請求項7に記載の免疫結合体。
- 放射性核種、酵素、基質、共因子、蛍光マーカー、化学発光マーカー、ペプチドタグ、磁気粒子、薬物、または毒素をさらに含む、請求項7に記載の免疫結合体。
- 請求項7に記載の免疫結合体を含む、薬学的組成物。
- 以下の群由来のいずれかのハイブリドーマ:
(a) ハイブリドーマ・クローン280.46.3.4(ATCC特許寄託指定番号PTA-6284)
(b) ハイブリドーマ・クローン281.73.49.1.1(ATCC特許寄託指定番号PTA-6285)
(c) ハイブリドーマ・クローン283.4.1.2(ATCC特許寄託指定番号PTA-6287)
(d) ハイブリドーマ・クローン283.52.5.4(ATCC特許寄託指定番号PTA-6311)
(e) ハイブリドーマ・クローン283.108.2.3(ATCC特許寄託指定番号PTA-6286)。 - 請求項13に記載のハイブリドーマによって発現される、モノクローナル抗体。
- IL-22RAが役割を果たす炎症性疾患を減少させることにより、該炎症に罹患する哺乳動物の治療するための医薬の製造における、以下の群由来のいずれかのハイブリドーマによって発現される抗体または抗原結合性断片の使用:
(a) ハイブリドーマ・クローン280.46.3.4(ATCC特許寄託指定番号PTA-6284)
(b) ハイブリドーマ・クローン281.73.49.1.1(ATCC特許寄託指定番号PTA-6285)
(c) ハイブリドーマ・クローン283.4.1.2(ATCC特許寄託指定番号PTA-6287)
(d) ハイブリドーマ・クローン283.52.5.4(ATCC特許寄託指定番号PTA-6311)
(e) ハイブリドーマ・クローン283.108.2.3(ATCC特許寄託指定番号PTA-6286)。 - 疾患が慢性炎症疾患である、請求項15記載の使用。
- 疾患が、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節炎、乾癬性関節炎、リウマチ性関節炎、および乾癬の群由来の慢性炎症疾患である、請求項16に記載の使用。
- 疾患が急性炎症疾患である、請求項15記載の使用。
- 疾患が、内毒素血症、敗血症、毒性ショック症候群、および感染疾患急性炎症疾患の群由来の急性炎症疾患である、請求項18に記載の使用。
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