JP3769189B2 - T細胞誘導性因子(tif)をコードする単離された核酸分子、コードされたタンパク質およびその使用 - Google Patents
T細胞誘導性因子(tif)をコードする単離された核酸分子、コードされたタンパク質およびその使用 Download PDFInfo
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Description
(関連出願)
本出願は特許出願第09/354,243号(1999年7月16日出願)の一部継続出願であり、これは特許出願第09/178,973号(1998年10月26日出願)の一部継続出願である。これらの出願はともに、その全体が参考として援用される。
【0002】
(技術分野)
本発明は、新たに単離された核酸分子およびその使用に関する。本発明の核酸分子は、サイトカインのインターロイキン−9(「IL−9」)によってアップレギュレーションされることが明らかにされている。本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質もまた開示される。それらはT細胞由来誘導性因子(「TIF」)として記載される。このような核酸分子は、STATの活性化を細胞内で誘導するタンパク質をコードする。そのようなタンパク質は、例えば、標的化組織の再生を刺激する際に使用することができる。さらに、その阻害剤またはアンタゴニストを使用して、他の組織の分化を遅らせ、妨げ、または阻害することができる。
【0003】
(背景技術)
この10年間に、免疫系およびその調節の知識が目覚ましく拡大していることが認められる。特に注目される1つの領域は、免疫系を調節するタンパク質および糖タンパク質に対する研究の領域である。このような分子の最もよく知られている1つのファミリーがサイトカインである。サイトカインは、細胞間の「情報伝達」に関与している分子である。サイトカインファミリーの個々のメンバーが、ガンおよびアレルギーなどの広範囲の病理学的状態に関わっていることが見出されている。サイトカインがそのような状態の病理学に関わっているとしても、サイトカインはまた、治療的に有用であるとして知られている。
【0004】
インターロイキンはサイトカインの1つのタイプである。インターロイキンに関する文献は膨大である。この領域における特許の例示的ではあるが、決して完全ではない列挙には、米国特許第4,778,879号(Mertelsmannら);米国特許第4,490,289号(Stern);米国特許第4,518,584号(Markら);および米国特許第4,851,512号(Miyajiら)が含まれる(これらはすべて、インターロイキン−2、すなわち「IL−2」を含む)。インターロイキン−1(「IL−1」)に関するさらなる特許が発行されている(米国特許第4,808,611号(Cosman)など)。これらのすべての特許の開示は、参考として本明細書中に援用される。異なるインターロイキンに関するより最近の特許には、米国特許第5,694,234号(IL−13);同第5,650,492号(IL−12);同第5,700,664号、同第5,371,193号および同第5,215,895号(IL−11);同第5,728,377号、同第5,710,251号、同第5,328,989号(IL−10);同第5,580,753号、同第5,587,302号、同第5,157,112号、同第5,208,218号(IL−9);同第5,194,375号、同第4,965,195号(IL−7);同第5,723,120号、同第5,178,856号(IL−6)、および同第5,017,691号(IL−4)が含まれる。このような特許文献の通り一遍の総説でさえ、インターロイキンファミリーのメンバーの性質が多様であることを示している。これより大きなサイトカインファミリーはさらに大きな多様性を示すと考えられ得る。例えば、Aggarwalら編、Human Cytokines:Handbook For Basic And Clinical Research(Blackwell Scientific Publications、1992年)、Paul編、Fundamental Immunology(Raven Press、1993年)、763頁〜836頁、「T細胞由来サイトカインおよびそのレセプター」および「前炎症性サイトカインおよび免疫性」を参照のこと。引用されたすべての参考文献は参考として援用される。
【0005】
様々なサイトカイン間の関係は複雑である。本明細書中に引用されている参考文献から理解されるように、特定のサイトカインのレベルが増大または低下すると、これにより、被験体によって産生される他の分子のレベルが直接的または間接的のいずれかで影響を受けることがある。影響を受ける分子の中には、他のサイトカインが含まれる。
【0006】
以前には「P40」と呼ばれていたリンホカインIL−9は、抗原非依存的なT4細胞株の永久成長を持続させる因子として最初に同定されたT細胞由来の分子である。例えば、Uyttenhoveら、Proc.Natl.Acad.Sci.85:6934(1988)、およびVan Snickら、J.Exp.Med.169:363(1989)を参照のこと。これらの開示は、Simpsonら、Eur.J.Biochem.183:715(1989)の開示と同様に参考として援用される。
【0007】
IL−9の活性は、CTLまたは新しく単離されたT細胞に対する活性を示すことができない制限されたT4細胞株に対して最初に発見された。例えば、Uyttenhoveら(上記)、およびSchmittら、Eur.J.Immunol.19:2167(1989)を参照のこと。この活性範囲は、IL−9およびT細胞成長因子III (「TCGFIII 」)と示される分子が、骨髄由来肥満細胞のIL−3に対する増殖応答を高める因子であるMEA(肥満細胞成長増強活性)と同一であることが実験により示されたときに広がった。このことは、Hultnerら(Eur.J.Immunol.)および米国特許出願第498,182号(1990年3月23日出願)に記載されている(両方の開示は参考として本明細書中に援用される)。ヒト型のIL−9が巨核芽球白血病の増殖を刺激することもまた見出された。Yangら、Blood、74:1880(1989)を参照のこと。IL−9に関する最近の研究により、IL−9はまた、赤芽球コロニー形成を支持すること(Donahueら、Blood、75(12):2271〜2275(6−15−90));骨髄性赤芽球バースト形成の増殖を促進すること(Williamsら、Blood、76:306〜311(9−1−90));および成人起源または胎児起源のBFU−Eのクローン成熟を支持すること(Holbrookら、Blood、77(10):2129〜2134(5−15−91))も明らかにされている。IL−9の発現は、また、ホジキンス病および大細胞未分化リンパ腫における関わりも示されている(Merzら、Blood、78(8):1311〜1317(9−1−90))。気管支過敏性の発症に対する感受性または耐性を有するマウスの遺伝子分析により、IL−9遺伝子との連鎖、ならびにこのモデルにおけるIL−9産生と感受性との相関が解明されている(Nicolaidesら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、94、13175〜13180、1997)。ヒトの遺伝子研究もまた、喘息の原因と考えられるものとしてIL−9およびIL−9R遺伝子を指摘している(Doullら、Am.J.Respir.Crit.Care Med.153、1280〜1284、1996;Holroydら、Genomics、52、233〜235、1998)。次に、IL−9遺伝子導入マウスは、増大したIL−9発現により、肺の肥満細胞過剰増殖、過好酸球増加症、気管支過敏性および高レベルのIgEをもたらすことが明らかにした(Temannら、J.Exp.Med.188、1307〜1320、1998;Godfraindら、J.Immunol.160、3989〜3996、1998;McLaneら、Am.J.Resp.Cell.Mol.19:713〜720(1999))。まとめると、これらの結果は、IL−9がこれらの疾患において重要な役割を果たしていることを強く示唆している。さらなる研究により、喘息およびアレルギーにおけるIL−9およびこのサイトカインのムテインの関わりが示されている。例えば、PCT国際特許出願US96/12757(Levittら)およびPCT国際特許出願US97/21992(Levittら)を参照のこと(これらはともに参考として援用される)。
【0008】
IL−9は、被験体における他の分子のレベルに影響を及ぼすことが知られている。Louahedら、J.Immunol.154:5061〜5070 (1995);Demoulinら、Mol.Cell.Biol.16:4710〜4716(1996)を参照のこと(これらはともに参考として援用される)。影響を受ける分子は生物学的システムにおいてそれ自身の機能を有していることが認識されている。例えば、Demoulinらは、IL−9の知られている活性の多くがSTAT転写因子の活性化により媒介されることを示している。そのため、その存在および/またはレベルがサイトカインなどの他の分子によって影響を受ける分子を同定しようとすることが引き続き注目されている。
【0009】
下記の開示にはそのような分子が記載されている。本発明のタンパク質をコードする核酸分子は、IL−9の存在下で発現するが、その非存在下では発現しないことが見出された。従って、このような分子は、特に、被験体におけるIL−9の発現または作用の「マーカー」である。そのような分子は、下記においてはT細胞由来誘導性因子または「TIF」として示される。本発明のこれらの特徴および他の特徴は下記の開示において理解される。
【0010】
(好適な実施態様の詳細な説明)
実施例1
ネズミのリンパ腫細胞株BW5147は、サイトカインをその培養培地に加えることを全く必要とすることなくインビトロで成長し得る細胞株としてよく知られている。IL−9によって誘導される遺伝子を同定するために、BW5147の試料を、IL−9の存在下(200U/ml)または非存在下のいずれかで24時間培養した。その後、全RNAを、イソチオシアン酸グアニジン溶解およびCsCl勾配遠心分離を使用して単離した。これらの技術はこの分野ではよく知られている。この後、ポリアデニル化RNAを、オリゴ(dT)セルロースカラムを使用することによって全RNAから精製した。その後、単離されたポリA RNAを使用して、二本鎖cDNAを作製した。市販のオリゴ(dT)プライマーを使用した。3〜5μgの任意の量のポリA RNAを1μgのオリゴdTとともに70℃に10分間加熱し、その後、5x第一鎖緩衝液(250mMのHCl(pH8.3)、375mMのKCl、15mMのMgCl2 )、10mMジチオスレイトール、500uMの各デオキシヌクレオチド三リン酸、および800Uの逆転写酵素とともにインキュベーションした。反応混合物の総容量は20μlであり、反応を37℃で1時間行った。これにより、cDNAの第一鎖が合成された。第二鎖の合成を、30μlの5第二鎖緩衝液(100mMのTris−HCl(pH6.9))、450mMのKCl、23mMのMgCl2 、0.75mMのβ−NAD+ 、50mMの(NH4 )2 SO4 を、60Uの大腸菌由来DNAポリメラーゼI、2Uの大腸菌RNaseH、10Uの大腸菌DNAリガーゼ、および250uMの各デオキシヌクレオチド三リン酸とともに加え、150μlの最終容量にすることによって行った。混合物を16℃で2時間インキュベーションした。
【0011】
生成物を、フェノール−クロロホルムを使用して抽出し、エタノールで沈殿させた。その後、この最終cDNA生成物を200μlのTEに再懸濁した。
【0012】
これらの工程を、刺激されたBW5147細胞(以降、「テスター」)、および並行して、未刺激のBW5147細胞(以降、「ドライバー」)の両方について行った。
【0013】
実施例2
次に、実施例1で調製されたcDNAを、よく知られている方法に従ってサブトラクションクローニングに供した。このために、下記の6個のオリゴヌクレオチドを調製した:
5' −AGCACTCTCC AGCCTCTCAC CGCA−3' (配列番号:1);
5' −GATCTGCGGT GA−3' (配列番号:2);
5' −ACCGACGTCG ACTATCCATG AACA−3' (配列番号:3);
5' −GATCTGTTCA TG−3' (配列番号:4);
5' −AGGCAACTGT GCTATCCGAG GGAA−3' (配列番号:5);および
5' −GATCTTCCCT CG−3' (配列番号:6)。
【0014】
これらを、本明細書中に説明されているように使用した。二本鎖cDNA(2μg)を制限エンドヌクレアーゼDpnIIで消化し、フェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、20μlのTE(10mMのTris−HCl(pH7.5);1mMのEDTA)に再懸濁した。12μl(1.2μg)の切断されたcDNAを、4μlの脱塩された配列番号:1(2mg/ml)、4μlの脱塩された配列番号:2(1mg/ml)、10μlの5Xアダプター緩衝液(330mMのTris−HCl(pH7.6)、50mMのMgCl2 、5mMのATP)、7μlのDTT(100mM)および28μlのH2 Oを含む混合物中で二本鎖の配列番号:1および2に連結した。オリゴヌクレオチドを、混合物を50℃に加熱し、その後、混合物を10℃まで1時間かけて冷却することによって、互いに、そして試料DNAにアニーリングさせた後、5μlのT4DNAリガーゼを加えて、12℃〜16℃で12時間〜14時間インキュベーションした。混合物を、140μlのTEを加えることによって希釈した。その後、PCRを、下記に記載されているように200μlの試料で行った。
【0015】
実施例3
PCRを行うために、まず、66mMのTris−HCl(pH8.8)、4mMのMgCl2 、16mMの(NH4 )2 SO4 、33μg/mlのBSA、0.3mMの各dNTP(濃度:500μM)、および2μgの配列番号:2からなる緩衝液に2μlの連結産物を含む200μlの試料を72℃で3分間加熱して、実施例2の生成物にハイブリダイゼーションする配列番号:1を除いた。その後、3' 末端を、5UのTaqポリメラーゼを使用することによって埋めた(5分、72℃)。20サイクルの増幅を行った(1サイクル:95℃で1分、および72℃で3分)。その後、生成物を一緒にし、フェノール抽出およびエタノール沈殿を行い、TE緩衝液に0.5μg/μlの濃度で再懸濁した。下記において、これは提示物と呼ばれる。
【0016】
実施例4
次に、提示物を、DpnIIを用いた消化により配列番号:1をそれから除くことによってサブトラクティブハイブリダイゼーションのために調製した。得られた消化物をフェノール抽出してエタノール沈殿した。未刺激の試料の場合、これによりドライバーが得られ、一方、刺激された試料によりテスターが得られた。テスターの一部(20μg)を1.2%アガロースゲルでゲル精製して単離した。試料(2μg)を、上記に記載されているように、配列番号:1および2が連結された同じ方法で配列番号:3および4に連結した。
【0017】
サブトラクティブハイブリダイゼーションの最初のサイクルにおいて、配列番号:3および4が連結されたテスターの0.4μg試料を40μgのドライバーcDNAと混合した。混合物をフェノール抽出し、エタノール沈殿して、2μlの3XEE緩衝液(30mMのEPPS、pH8.0)、3mMのEDTA;pH8.0、3mMのEDTAに溶解した。これに30μlのミネラルオイルを重層し、98℃で5分間変性させた。5MのNaCl溶液(0.5μl)を加えて、DNAを67℃で20時間ハイブリダイゼーションさせた。反応混合物をTEで200μlに希釈し、tRNAキャリアを加えた。この試料を72℃で3分間インキュベーションして、配列番号:4を融解解離させた後、4つのPCR反応物(200μl)を調製した。これらは、プライマーを含まない20μlの希釈したハイブリダイゼーション混合物を含み、これにより、再アニーリングしたテスターの両端を埋め、その後、配列番号:3の試料を加えた後、10サイクルの増幅を行った(1サイクル:95℃で1分、70℃で3分)。その後、生成物を一緒にして、フェノール抽出し、エタノール沈殿して、40μlの0.2XTE緩衝液に再懸濁した。一本鎖DNAを、40μlの総容量で、20Uのマングビーンヌクレアーゼで20μlのこの物質を30分間処理することによって分解した。試料を50mMのTris−HCl(pH8.9)で希釈(1:5)した後、98℃で5分間加熱して、酵素を不活性化した。別のPCRを、20μlの上記に記載される生成物、2μlの配列番号:3(1mg/ml)、および1μl(5U)のTaq DNAポリメラーゼを使用して行った。合計で18サイクルを行った(1サイクル:95℃で1分、70℃で3分)。生成物を一緒にして、フェノール抽出し、エタノール沈殿して、0.5〜1μg/μlで再懸濁した。この生成物は、「DP1」または第1の差生成物と呼ばれる。
【0018】
実施例5
次に、DP1を、上記に記載されているようにエンドヌクレアーゼDpnIIで消化し、配列番号:1、2、3および4に関して記載されている同じ手法に従って配列番号:5および6に連結した。サブトラクティブハイブリダイゼーションおよび選択的増幅を、実施例4に記載されているように繰り返して、第2の差生成物または「DP2」を作製した。これらの実験では、50ngのDP1がテスターであった。ドライバー(40μg)は、上記に記載されている通りであった。このプロセスを、第3の差生成物を作製するために、アダプターとして配列番号:3および4を使用して繰り返した。この第3の生成物を作製するために、100pgのテスターを40μgのドライバーと混合した。上記のプロトコルの全工程を繰り返したが、最後の増幅を22サイクル行った。この場合の1サイクルは、95℃での1分および70℃での3分であった。これにより、最後の差生成物が得られた。
【0019】
実施例6
最後の差生成物をDpnIIで消化し、その後、市販のベクター(すなわち、ptZ19R)のBamHI部位にクローニングした。二本鎖DNAプラスミドを調製し、その後、標準的な方法を使用して配列決定した。その配列を、BLAST検索プログラムを使用して、GenBankおよびEMBLのデータベースにおいて知られている配列と比較した。
【0020】
このサブトラクション手順の終わりに、短いcDNAフラグメントが同定された(すなわち、長さが約200塩基対のフラグメント)。このフラグメントを使用して、BW5147細胞から得られたcDNAライブラリーをスクリーニングした。最大長のクローンを配列決定した。これは下記で議論される。このクローンは、知られているどの配列にも相当しない。
【0021】
ヌクレオチド配列(配列番号:7)は、1121塩基長であり、179アミノ酸長のタンパク質をコードする537塩基対のオープンリーディングフレームを含む。タンパク質の予想される分子量は20、093である。開始コドンとして作用した場合に、172アミノ酸および167アミノ酸の長さを有し、それぞれの分子量が19,335ダルトンおよび18,770ダルトンであるタンパク質を生成する2つのさらなるATGコドンが存在する。タンパク質の各形態は、成熟タンパク質をもたらすために小胞体によって分子から切断される疎水性アミノ酸の配列を特徴とする。
【0022】
配列分析により、3つのATリッチモチーフ(TTATTTAT)が明らかにされる。このようなモチーフは、サイトカインおよびガン遺伝子の5' 非翻訳領域に見出されることが多い。Kruysら(Science、245:852 (1989))は、この反復がTIFのmRNAの安定性を調節していることを明らかにしている。
【0023】
実施例7
次に、上記の実施例6で単離および分析されたcDNAを、TIFαのゲノムDNAを同定するためのプローブとして使用した。
【0024】
マウス系統129から調製されたゲノムライブラリーを、標準的な方法に従って配列番号:7でスクリーニングした。陽性クローンから得られたEcoRIフラグメントをプラスミドpZEROにサブクローニングして、その一部を配列決定した。この部分配列は配列番号:8として示されている。
【0025】
実施例8
上記の実施例7に記載される陽性クローンから得られる別のEcoRIフラグメントもまたサブクローニングした。非常に大きな相同性があったが、その配列は同一ではなかった。詳しくは、この配列のイントロン1は配列番号:8と98%の同一性を有し、イントロン2は100%の同一性を有し、イントロン3は92%の同一性を有していた。
【0026】
これらの配列について驚くべきことは、それらのプロモーターが全く相同的ではないことである。このことにより、独立した調節が示唆される。それらの5' 非翻訳領域は92%の同一性を有する。TIFαの第1エキソンは、エキソン1αおよびエキソン1βに分かれている。第1のコードエキソン(TIFαではエキソン1bであり、TIFβではエキソン1である)は99.5%の同一性を有しているが、第2エキソンは100%の同一性を有し、第3エキソンは97%の同一性を有し、第4エキソンは98.5%の同一性を有し、第5エキソンは96%の同一性を有している。3' 非翻訳領域では、相同性が96%である。
【0027】
実施例9
上記の実施例8に記載される情報を使用して、TIFβと名付けられた第2のクローンのcDNA配列を求めた。これは配列番号:9として示されている。ゲノムDNA配列もまた、上記に記載されている同じ方法で確認した。これは配列番号:29として示されている。
【0028】
TIFαのコード領域と比較した場合、TIFβのコード領域には6つのサイレント型変化が存在する。重要でないアミノ酸の変化をもたらす変化が2つ存在している(36位および113位の両方において、TIFαにおけるValがTIFβではIleになっている)。また、より重要な変化が112位に存在している。この場合、GlnがArgになっている。
【0029】
実施例10
TIF類の発現を調べるための実験を行った。BW5147細胞を、組換えネズミIL−9(200U/ml)を用いて様々な時間(0.2時間、0.5時間、1時間、2時間&24時間)にわたって刺激した。その後、全RNAを、標準的な方法および試薬を使用して単離した。その後、5μgの全RNAおよびオリゴ(dT)プライマーを使用して逆転写を行った。その後、20ngの全RNAに対応するcDNA試料を、種々のプライマーを使用して25サイクル増幅した(1サイクルは、94℃で4分、57℃で1分、および72℃で2分であった)。下記のTIFプライマーを使用した:
5' −CTGCCTGCTT CTCATTGCCC T−3' (配列番号:10)および
5' −CAAGTCTACC TCTGGTCTCA T−3' (配列番号:11)
(それぞれ、センスおよびアンチセンス)。
【0030】
これらは、それぞれ、配列番号:7のヌクレオチド106〜126およびヌクレオチド764〜784に対応する。コントロールとして、β−アクチンを同様に18サイクル増幅した(最初のサイクル:94℃で4分、60℃で1分、72℃で2分。その後のサイクルは、94℃で1分、60℃で1分、72℃で2分であった)。
【0031】
増幅後、PCR後の生成物を1%アガロースゲルで分析し、特異的な増幅を、内部の放射性プローブを使用してブロッティング後に確認した。TIFのプローブは、
5' −GACGCAAGCA TTTCTCAGAG−3' (配列番号:12)
であった。示された条件およびプローブは、TIFの1つまたはそれ以外の形態に特異的ではなかった。しかし、TIFαの増幅産物はKpnI制限部位を含み、一方、TIFβにはその制限部位は含まれない。増幅産物をKpnIで消化することによって、IL−9により誘導されたTIFのmRNAの大部分(すべてではない)がTIFαであることが示された。このことは、TIFαの発現がIL−9を介して迅速に誘導されたことを示唆している。TIFαのmRNAは刺激の30分後に検出することができ、1時間〜24時間でプラトーに達した。
【0032】
実施例11
次に、上記に記載されているIL−9によるTIFのmRNA誘導はタンパク質合成を必要としないことが明らかにされた実験を行った。この実験において、全RNAを、実施例10に記載されているように24時間刺激し、しかし、タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミドの10μg/mlの存在下または非存在下で4.5時間で処理した細胞から抽出した。比較用の実験群では、細胞を刺激しなかった。全RNAを抽出して、RT−PCR増幅を、実施例10に記載されているように行った。PCR後の生成物を、臭化エチジウム染色した1%アガロースゲルで分析した。タンパク質合成が阻止されたときに、IL−9による誘導が依然として生じていることが認められた。従って、IL−9の作用は、タンパク質媒介因子の合成を必要としない直接的な作用である。
【0033】
実施例12
この実験において、TIFのmRNA誘導におけるSTATタンパク質の役割を細胞株BW5147の誘導体で調べた。最初の株BWh9Rは、野生型のヒトIL−9レセプターを発現する。BW−Phe116株は、レセプターがSTAT転写因子を活性化することができなくなっている1つの変異を(116位に)有するトランスフェクタントである。さらに別の細胞株BW−mut6は、レセプターがSTAT5を活性化することができなくなっている変異を有するが、STAT1およびSTAT3を活性化する能力は保持されている。最後に、細胞株BW−mut7は、IL−9レセプターがSTAT1およびSTAT3を活性化することができなくなっている1つの変異を有するが、STAT5を活性化する能力は保持されている。
【0034】
細胞刺激、全RNAの単離、逆転写およびcDNAの増幅はすべて、実施例10に記載されているように行った(細胞を24時間刺激した。ヒトおよびネズミの両方の組換えIL−9を使用した)。PCR産物を、上記に記載されているように、臭化エチジウム染色した1%アガロースゲルで分析した。
【0035】
分析により、ヒトIL−9はBW−Phe116において発現を誘導しないことが明らかにされた。このことは、STAT転写因子の関与を示唆している。IL−9は、BW−mut6変異体においてTIFの発現を誘導したが、mut7変異体では誘導しなかったことが見出された。このことは、STAT1またはSTAT3が関与し、STAT5は関与していないことを示唆している。
【0036】
実施例13
次に、正常なマウス脾臓細胞におけるTIFのmRNA発現を調べた。
【0037】
10週齢〜12週齢のBalb/cマウスの脾臓細胞を、コントロール培地、あるいは20μg/mlの(Bリンパ球およびマクロファージを活性化する)LPS、または(T細胞を活性化する)ConA、またはConAおよび1%のネズミIL−9に対する阻止抗血清を補充したコントロール培地で24時間培養した。βアクチンをコントロールとして使用した。RNAの精製、RT−PCR分析を、上記に記載されているように行った。
【0038】
結果は、TIFは、最もよいときでも、休止脾臓細胞で非常に弱く発現し、LPSによって誘導されないが、ConAによって強く誘導されることを示している。抗IL−9抗血清は、ConAによる誘導に影響しなかった。このことは、その作用は、IL−9によって媒介されないこと、すなわち、他のサイトカインによって媒介されることを示唆している。
【0039】
ConAで活性化された脾臓細胞を、RT−PCR産物の配列を使用して分析した場合、これらの細胞がTIFαを優勢に発現しているか、またはTIFαを独占的に発現していることが見出された。
【0040】
実施例14
さらなる実験により、TIFのmRNAが、IL−9による誘導がない場合でも発現していることが明らかにされた。
【0041】
5週齢のFVBマウスの脾臓細胞を、ナイロンウールカラムを使用してT細胞を濃縮した。その後、細胞を、IL−9の存在下または非存在下のいずれかで、ConA(T細胞活性化因子)またはPMA(大部分の細胞においてPKCを活性化する)を補充した培地で24時間刺激した。
【0042】
全RNAを、標準的な技術を使用して単離し、その後、10マイクログラムの試料を、2.2Mホルムアルデヒドを含む1.3%アガロースゲルで電気泳動して分画した。その後、分画物をニトロセルロースメンブランに移して、標識し、Van Snickら、J.Exp.Med.169:363(1989)(参考として援用される)に従ってハイブリダイゼーションアッセイでアッセイした。
【0043】
その結果は、ConAによるTIFの誘導は変化しないこと、およびIL−9は、PMAで活性化された脾臓細胞においてTIFのRNAを誘導しないことを示していた。
【0044】
実施例15
様々な細胞株におけるTIFのmRNA発現を調べた。この実験では、ネズミの細胞株を特定のサイトカインで少なくとも1日間刺激した。詳しく記載すると、9T7はT細胞リンパ腫であり、IL−2、IL−4またはIL−9に応答する。TS3およびTS6の細胞株はTヘルパー細胞クローンから得られ、IL−2またはIL−9のいずれかの存在下で増殖する。MC9およびLI38は肥満細胞株であり、IL−3またはIL−9のいずれかの存在下で増殖する。
【0045】
刺激後、全RNAを、標準的なイソチオシアン酸グアニジウム溶解およびCsCl勾配遠心分離を使用して調製した。
【0046】
その後、9T7株を、実施例14に記載されているようにノーザンブロッティングによって分析したが、それ以外の株は、上記に記載されているようにRT−PCR分析を使用してアッセイした。
【0047】
IL−9はTヘルパー細胞および肥満細胞においてTIFの発現をアップレギュレーションするが、IL−2およびIL−3はしないことが見出された。しかし、9T7細胞株は、サイトカインに関わらず、ほぼ同じレベルの発現を示した。このことは、IL−9はTIFの発現に必須でないことを示している。
【0048】
実施例16
次に、B細胞におけるTIFのmRNA発現を調べた。A20、70Z/3およびBCL−1の細胞株はB細胞白血病細胞株であり、サイトカインの非存在下においてインビトロで成長する。これらの細胞をIL−4およびIL−9で24時間刺激し、全RNAを標準的な方法を使用して単離した。発現を、上記に記載されているように、35サイクル行われたRT−PCR、その後のブロッティングおよびハイブリダイゼーションによって分析した。
【0049】
その結果は、TIFの発現がB細胞で検出可能であるが、IL−9およびIL−4の存在下では、最もよいときでも弱くアップレギュレーションされることを示していた。
【0050】
実施例17
次に、実験を、Tヘルパー細胞株における本発明の分子の発現を調べるために行った。TS2およびTS1は、Tヘルパー細胞クローンに由来する公知のTヘルパー細胞株であり、IL−9またはIL−2のいずれかの存在下で増殖し(TS2)、そしてIL−9またはIL−4のいずれかの存在下で増殖する(TS1)。詳細に記載すると、TS1細胞またはTS2細胞を、列記されたサイトカインの存在下で少なくとも10日間成長させ、その後、RNAを、公知の方法を使用して抽出した。本発明の分子の発現を、上記に記載されているプロトコルを使用してRT−PCR(35サイクル)によって調べた。TS1細胞の場合、IL−4およびIL−9はともにTIFの発現を誘導するが、TS2細胞では、IL−2はTIFの発現を誘導しない。
【0051】
実施例18
様々なマウス器官におけるTIFのmRNA発現を調べた。全RNAを、肝臓、腎臓、心臓、脳、腸、脾臓、胸腺、肺、筋肉および骨髄から、標準的なイソチオシアン酸グアニジウム法およびCsCl勾配遠心分離を使用して調製した。40サイクルのRT−PCRを、上記に記載されているプロトコルを使用して行った。最も強い発現が胸腺組織で見出されたが、脳組織ではシグナルはほとんど見出されず、残りの組織ではより弱い発現が見出された。
【0052】
実施例19
下記の実験は、TIFαが293−EBNA細胞で産生されることを記載する。
【0053】
TIFαの相補的DNAは上記に記載された。相補的DNAを、CMVプロモーターと機能的に連結して市販の発現ベクターpCEP−4にサブクローニングした。得られたプラスミドを、標準的なリポフェクタミン法を使用して293−EBNA細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞を、35S標識メチオニンを補充したメチオニン不含有培地で24時間インキュベーションした。上清を集め、アクリルアミドゲルで電気泳動した。その後、ゲルを乾燥してオートラジオグラフィーに1日曝した。その後、コントロールを、cDNAがアンチセンス方向でクローニングされた同じプラスミドで細胞をトランスフェクションすることによって処理した。
【0054】
約25キロダルトン〜30キロダルトンの異種バンドが、センス方向のTIFでトランスフェクションされた細胞で見出された。予想される分子量とシステムにおける実際の分子量との不一致および異種性は、グリコシル化のためと考えられる。一連の並行した実験において、ヒトTIFをコードするcDNAを、ネズミcDNAを発現させたのと同じ方法で発現させた。cDNAの違いを除いて、すべての実験パラメーターは同じであった。
【0055】
実施例20
さらなる実験を、COS細胞におけるTIFαの産生を調べるために行った。詳細に記載すると、TIFαのcDNAを、EF−1αプロモーターと機能的に連結して、Demoulinら(上記)によって記載されるプラスミドpEF−BOS.puroにサブクローニングした。プラスミドcDNAを、上記に記載される同じリポフェクタミン法を使用してCOS細胞にトランスフェクションした。細胞を、35Sメチオニンを補充したメチオニン不含有培地で24時間インキュベーションした。その後、上清を、上記の実施例20に記載されているように処理した。再度ではあるが、25キロダルトン〜30キロダルトンの異種バンドが、本発明の分子の非グリコシル化形態を表すと考えられる18キロダルトンのバンドと同様に認められた。
【0056】
実施例21
この実験において、TIFが、メサンギウム細胞、神経細胞メラノーマ細胞および肝腫瘍細胞においてSTATの活性化を誘導することが発見された。サイトカインによってSTAT因子が活性化されたとき、該因子はダイマー化して、細胞質から核に移行し、プロモーター内の標的配列に結合することが知られている。実験の細部を下記に示す。
【0057】
上記に記載されているトランスフェクションされた293−EBNA細胞を、コントロール(これもまた上記に記載されている)から得られる上清である正常な培地中で48時間インキュベーションした後に使用した。マウスの腎臓メサンギウム細胞株(以降、「MES13」)、ラットのクロム親和性細胞腫細胞株 (以降、「PC12」)、4種の異なるヒトメラノーマ(SK23、AUMA、NA−8melおよびMULL)、ヒト肝腫瘍(HepG3)およびラット肝腫瘍(H−4−II−K)の試料を使用した。細胞試料(0.5x106 )を1%の上清の存在下で5分間〜10分間刺激した。その後、核抽出物を、Demoulinら、Mol.Cell.Biol.16:4710(1996)(これは参考として援用される)に従って調製した。簡単に記載すると、細胞をPBSで洗浄し、その後、1mlの氷冷した低張液に15分間再懸濁した(緩衝液は、10mMのKCl、1mMのMgCl2 、5%グリセロール、0.5mMのEDTA、0.1mMのEGTA、0.5mMのジチオスレイトール、および1mMのPefablocを含む10mMのHEPES(pH7.5)、1mMのNa3 V4 、ならびに5mMのNaFであった)。その後、細胞を、65μlのNP−40を加えた後に激しく攪拌することによって溶解した。核を、14,000rpmで30秒間激しく攪拌し、その後、HEPES(20mM)、グリセロール(20%)およびNaCl(420mM)を補充した緩衝液で抽出することによってペレット化した。核破砕物を2分間遠心分離することによって除いた。DNA結合活性を、FcγRI遺伝子プロモーターのSTAT結合部位を含む 「GRR」と呼ばれる下記の32P標識の二本鎖オリゴヌクレオチドを使用して、Demoulinら(上記)に従って測定した:
5' −ATGTATTTCC CAGAAA−3' (配列番号:13)
および
5' −CCTTTTCTGG GAAATAC−3' (配列番号:14)。
【0058】
これらは、GRRプローブ内の結合部位の上部鎖および下部鎖に対応する。簡単に記載すると、5μl容量の核抽出物を結合緩衝液(12mMのHEPES(pH7.6)、10mMのKCl、0.5mMのEDTA、2.5%グリセロール、0.1mg/mlのポリ(dI−dC))中で5分間インキュベーションした。放射能標識したGRRプローブ(105 cpm;約0.5ng)を加えて、インキュベーションを25分間続けた後、非変性ポリアクリルアミドゲルに負荷した。
【0059】
上記に記載されるMES13細胞で認められる複合体は、一部が抗STAT5抗体および抗STAT3抗体の両方によって過度に移動したこともまた注目された。このことは、(i)試験中の細胞はTIFの標的であったこと、ならびに (ii)STAT3およびSTAT5は、TIFにより活性化される複合体の主要成分であることを示している。上記の実施例12におけるプロフィールと比較すると、STATのプロフィールの差は細胞源の差(ヒト対マウス)に起因し得る。ヒトTIFがネズミ細胞で機能すること、およびその逆の場合も機能することもまた認められた。
【0060】
実施例22
本実施例は、ヒトTIFをコードする核酸分子の単離およびクローニングを詳述する。最初に、ヒト末梢血単核細胞を標準的な密度勾配遠心分離によって調製した。この調製後、試料を抗CD3モノクローナル抗体の存在下または非存在下のいずれかにおいて3x106 細胞/mlで24時間培養した(抗体は市販のOKT3mAbであり、1/500に希釈した腹水の形態で使用した)。一般に、T細胞由来サイトカインは、例えばCD3に特異的な抗体によって活性化されたときにのみ発現することから、この抗体を使用した。
【0061】
全RNAを、標準的なイソチオシアン酸グアニジウム/CsCl勾配超遠心分離技術を使用してこのような細胞から単離した。単離後、RNAの10μg試料を、オリゴ(dT)15プライマーを使用して逆転写した。
【0062】
上記に概略されているようにしてcDNAを調製した後、100ngの全RNAに対応する試料を、下記のプライマーを使用してPCRにより増幅した:
5' −AGCTGCTCAA CTTCACCCTG GA−3' (配列番号:15)
5' −CCACTCTCTC CAAGCTTTTT CA−3' (配列番号:16)
これらはネズミのcDNA配列(すなわち、配列番号:7)に基づく。PCR条件は、1サイクルが94℃で1分、その後、42℃で1分、次いで72℃で2分として規定される30サイクルの増幅を含んだ。増幅産物を、標準的な方法を使用してアガロースゲルで分離した後に配列決定した。その結果は、cDNAのフラグメントが増幅されたことを示していた。従って、2回目の反応を、配列番号:16を下記の配列番号:17に代えたことを除いて、同じ物質を使用して行った:
5' −CAAGTCTACC TCTGGTCTCA T−3'
この2回目のPCR反応を25サイクル行った。1サイクルは、94℃で1分、その後、45℃で1分、次いで72℃で2分として規定される。増幅産物を、1回目の場合と同じ工程に供した。再度ではあるが、cDNAのフラグメントが増幅された。
【0063】
実施例23
増幅産物を調製した後、cDNAの5' 末端を、標準的な5' −RACE技術を使用して単離した。簡単に記載すると、第一鎖cDNAを、下記の配列番号:18をプライマーとして使用して調製した:
5' −TGGCCAGGAA GGGCACCACC T−3'
このプライマーは、実施例22に従って得られた配列情報に基づいた。簡単に記載すると、5' −RACE法を、上記に記載されているようにして調製された全RNAの1μg、2.5pmolの配列番号:18、逆転写酵素、逆転写酵素緩衝液、2.5μlのdNTP混合物(10mM)、2.5μlのMgCl2 (25mM)、および2.5μlのジチオスレイトール(0.1M)を一緒にすることによって行った。反応を行い、終了後、元のRNAを、RnaseHおよびRnaseTIを加えることによって除いた。取り込まれなかった各dNTPならびにプライマーおよびタンパク質を除いた。cDNAに、ターミナルトランスフェラーゼ(すなわち、「TdT」)を使用してテイルを付加させた。この酵素は、下記に記載されているように、短縮アンカープライマーに対する3' −結合部位をもたらす。テイル付加を、精製された第一鎖cDNA、TdT、緩衝液(10mMのTris−HCl、25mMのKCl、1.5mMのMgCl2 )、および200μMのdCTPを一緒にすることによって行った。
【0064】
テイル付加反応の後、PCRを、下記のプライマーを使用して行った:
5' −TGGCCAGGAA GGGCACCACC T−3' (配列番号:19)
および5' −RACE短縮アンカープライマー:
5' −GGCCACGCGT CGACTAGTAC GGGIIGGGII GGGIIG−3' (配列番号:20)
増幅は35サイクルを含んだ(1サイクルは、94℃で1分、56℃で1分、および72℃で2分として規定された)。この後、ネスティッド増幅を、5μlの1/100希釈した増幅生成物で、配列番号:19および下記の短縮ユニバーサル増幅プライマーを使用して行った:
5' −GGCCACGCGT CGACTAGTAC−3' (配列番号:21)
増幅は30サイクルを含んだ(1サイクルは、94℃で1分、56℃で1分、および72℃で2分として規定された)。得られたPCR産物を、標準的な手順に従ってクローニングして配列決定した。
【0065】
これらの3つのプロトコル、すなわち、フラグメントが得られた上記に記載される2つの実験、および同様に上記に記載される5' −RACE PCRは、配列決定された増幅産物の配列比較により、完全な配列の作製を可能にした。
【0066】
配列比較の後、推定されるオープンリーディングフレームに隣接する下記のオリゴヌクレオチドを作製した:
5' −CCTTCCCCAG TCACCAGTTG−3' (配列番号:22)
および
5' −TAATTGTTAT TCTTAGCAGG−3' (配列番号:23)
これらのプライマーは、上記に記載されているように、CD3に特異的なmAbで刺激された細胞から得られたmRNAを使用してオープンリーディングフレーム全体を増幅するために使用された。増幅は25サイクルであった(1サイクルは、94℃で1分、56℃で1分、および72℃で2分として規定された)。
【0067】
ヒトcDNAの完全な配列は、配列番号:24に示されている。
【0068】
ネズミの配列の場合のように、開始コドンと考えられるコドンが、アミノ酸1および13に相当する配列番号:24の位置に存在し、そしてメチオニンに対応するコドンがアミノ酸58、85および92の位置に存在する。この可能な開始コドンは、それぞれ、19,998ダルトンおよび18,735ダルトンの計算された分子量を有するタンパク質(それぞれ、176アミノ酸または167アミノ酸))に対応する。ネズミ型のタンパク質の場合のように、約20アミノ酸〜約40アミノ酸のN末端シグナル配列を示す疎水性のリーダー配列が認められる。
【0069】
実施例24
この実験は、上記に記載されたcDNAに対応するヒトゲノムDNAの単離に関する研究を詳述する。
【0070】
cDNA配列に基づいて、配列番号:24のヌクレオチド51〜70とヌクレオチド631〜650の相補体とに対応するプライマーを作製した。PCRを、標準的な方法を使用して行った。詳細に記載すると、100ngのゲノムDNAをテンプレートとして使用し、33サイクルの増幅を行った(1サイクルは、94℃で30秒、50℃で30秒、および72℃で5分として規定された)。配列が単離されると、配列決定を行った。これは配列番号:25として示されている。この配列は、長さが約4.8キロベースであり、TIF分子をコードするが、5' 隣接領域、プロモーターおよび3' 末端を有しないだけのゲノム配列全体を含むと考えられる。
【0071】
実施例25
上記に議論されたゲノムDNAがヒトゲノムに存在するかどうかを同定することが注目された。この確認のために、2つの異なる方法を取った。第1に、上記に議論された配列(すなわち、配列番号:25)を蛍光標識で標識し、その後、標準的な方法を使用する蛍光in situハイブリダイゼーション(「FISH」)によってヒトゲノムを調べるために使用した。
【0072】
第2の方法では、一連の放射性ハイブリッドクローンを、配列番号:24のヌクレオチド51〜70および5' −ATCAGATGGATTACTGAATG−3' (配列番号:26)からなるプローブを使用してスクリーニングした。PCRを、25ngのゲノムDNAをテンプレートとして使用して35サイクル行った。この場合、1サイクルは、94℃で1分、55℃で1分、および72℃で2分として規定された。
【0073】
両方の方法により、遺伝子が染色体12q15に存在することが示された。いくつかの研究は、喘息関連疾患をこの部位に関連させている。例えば、Nat.Genet.15:389〜392(1997);Oberら、Hum.Mol.Genet.7(9):1393〜1398(1998);Nickelら、Genomic、46(1):159〜162(1997);Takahashiら、Genomics、44(1):150〜2(1997);Barnesら、Genomics、37(1):41〜50(1996)を参照のこと(これらはすべて参考として援用される)。
【0074】
実施例26
この実験は、TIFタンパク質に結合する抗体の製造を記載する。抗体を作製するために、配列番号:7によってコードされるアミノ酸40〜61からなるペプチドを、標準的な技術および1mgのキャリアタンパク質に対して1mgのペプチドの比を使用してKLHキャリアタンパク質に結合させた。被験動物(ウサギ)に、150μgの複合体とともに2週間間隔で3回免疫化した。免疫原は、最初の注射の場合には完全フロイントアジュバントで乳化し、その後の2回の場合には不完全フロイントアジュバントで乳化した。
【0075】
最初の採血を、最後の注射を行った1ヶ月後に行い、知られている方法に従って血清を調製した。
【0076】
その後、血清を標準的なウエスタンブロットで調べた。簡単に記載すると、配列番号:7または配列番号:24のいずれかでトランスフェクションされた細胞から得られた10μlの上清をSDS−PAGE電気泳動で分離し、その後、PVDF膜にブロッティングした。抗血清を1:500に希釈して、標準的なウエスタンブロットプロトコルで、二次抗体としての抗ウサギ抗体および市販の検出キットと一緒に使用した。
【0077】
血清が、実際にTIFタンパク質を認識することが見出された。
【0078】
図1には、ネズミTIFおよびヒトTIFの推定アミノ酸配列が示されている。大きな相同性が、四角で囲まれた領域で認められる。
【0079】
前記の実施例により本発明が説明されている。本発明の1つの側面は、配列番号:7、24または25のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質などのTIFタンパク質をコードする単離された核酸分子である。遺伝子コードの縮重により、配列番号:7、24または25のヌクレオチド配列と同一ではないが、同じタンパク質をコードするヌクレオチド配列を調製できることが当業者により理解される。当然のことではあるが、配列番号:7、24および25は本発明の好ましい実施形態であるが、他の実施形態もまた本発明の一部である。ゲノムDNA、相補的DNA、およびメッセンジャーRNAなどのRNAは、すべて本発明に含まれるものとする。他の哺乳動物を含む他の動物種からの単離された核酸分子もまた本発明の一部である。本発明の好ましい側面は、相補体が、ストリンジェントな条件のもとで、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9または配列番号:24にハイブリダイゼーションする単離された核酸分子である。本明細書中で使用されている「ストリンジェントな条件」は、例えば、緩衝液(3.5xSSC)、0.02%Ficoll、0.02%ポリビニルピロリドン、0.02%ウシ血清アルブミン、25mMのNaH2 PO4 (pH7)、0.1%のSDS、2mMのEDTAにおける65℃でのハイブリダイゼーション、その後の洗浄を室温において2xSSCで行い、次いで、例えば、約65℃もの高温において0.1xSSC/0.2xSDSで行うことをいう。0.1xSSCなどのよりストリンジェントな条件もまた使用することができる。これらの核酸分子は、SDS−PAGEで決定されたときに約17kD〜22kDのタンパク質で、STAT1、STAT3および/またはSTAT5などのSTATタンパク質を活性化するタンパク質をコードする。グリコシル化形態において、これらのタンパク質は、SDS−PAGEで決定されたときに約17kDから約30kDまで変化し得る。
【0080】
DNAの発現を容易にするようにプロモーターに機能的に連結された本発明の核酸分子を含む発現ベクターも、また本発明の一部である。そのようなベクターを調製することは当業者の範囲に含まれる。
【0081】
ベクター、ならびに核酸分子自体は、真核生物または原核生物である組換え細胞を調製するために使用することができる。この場合、発現ベクターまたは核酸分子自身のいずれかが取り込まれる。大腸菌、COS細胞、CHO細胞などが、本発明のこの側面に従って使用され得る細胞タイプの例である。
【0082】
上記の核酸分子によってコードされるタンパク質(好ましくは、単離された形態のそのようなタンパク質)は、本発明の別の特徴である。「タンパク質」は、核酸分子の発現直後の生成物およびそのグリコシル化形態の両方、ならびに二量体、三量体などの多量体形態などを意味する。少なくとも1つの本発明のタンパク質分子と、少なくとも1つの異なるタンパク質分子とを含む二量体などの多量体もまた本発明の一部である。好ましくは、この異なるタンパク質分子は、IL−10などのサイトカインである。本発明の特徴として、融合タンパク質などの構築物も含まれる。この場合、上記に記載されたタンパク質のすべてまたは一部が、融合タンパク質などの特定の様式で、少なくとも1つのさらなるタンパク質またはペプチド(すなわち、アミノ酸配列)に連結される。「融合パートナー」は、例えば、認識可能なシグナルを直接的または間接的のいずれかで提供する分子とすることができ、例えば、FLAGペプチド、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどである。このような融合パートナーは、好ましくは、タンパク質のN末端および/またはC末端において、上記に記載されている分子と結合させられる。しかし、多数の技術が分子をアミノ酸に結合させるために知られていることを理解しなければならない。このような方法のいずれかおよびすべてによって、本発明の一部である構築物を作製することができる。
【0083】
上記に記載されているように、本発明の個々のタンパク質分子は、好ましくは、SDS−PAGEで決定されたときに約17キロダルトン〜約30キロダルトンの分子量を有する。多量体形態の場合、当然のことではあるが、複合体の分子量は変化する。しかし、それに含まれるTIF分子は、それぞれが、SDS−PAGEで決定されたときに約17キロダルトン〜約30キロダルトンの分子量を有する。
【0084】
タンパク質は、好ましくは、少なくとも約120アミノ酸、そして約200以下のアミノ酸からなる。好ましくは、そのアミノ酸配列は、配列番号:7、8、9、24または25によってコードされるアミノ酸配列のすべてまたは一部からなるか、あるいはそのようなアミノ酸配列のすべてまたは一部を含む。より好ましくは、アミノ酸配列は、上記の配列番号によってコードされる最初の約40アミノ酸を除くすべてを含む。さらにより好ましくは、アミノ酸配列は、これらの配列によってコードされる最初の約20アミノ酸を除くすべてを含む。最も好ましくは、タンパク質は、配列番号:27または28で示されるアミノ酸を含む。
【0085】
上記に示された核酸分子によってコードされるタンパク質は本発明の特徴であり、標準的なプロトコルに従って抗体を作製するために使用できることが当業者により理解される。モノクローナル形態およびポリクローナル形態のそのような抗体は本発明のさらなる特徴を構成する。そのような抗体のフラグメント、キメラ形態、ヒト化形態、組換え形態なども本発明の特徴を構成する。また、本発明の特徴は、本発明のタンパク質分子のアミノ酸配列のすべてまたは一部を含む免疫原であり、好ましくは、完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバントなどのアジュバントと組み合わせたそのような免疫原である。タンパク質配列の一部をキーホールリンペットヘモシアニンンなどの他の分子に結合させて、免疫原性をより大きくすることができる。このような抗体を使用して、例えば、本発明のタンパク質が存在するかどうかを明らかにすることができる。これは、次に説明されているように、本発明のさらなる特徴である。本発明の核酸分子がIL−9の存在下で発現したことは、実施例において明らかにされている。従って、本発明のさらなる特徴は、IL−9が存在するか、または存在しているかどうかを決定する方法である。この場合、本発明のタンパク質が、例えば、抗体を使用して、あるいは本発明の核酸分子をプローブとして使用し、mRNAを使用して検出される。mRNAは、直接的に、あるいはcDNAの形態で決定することができる。そのようなプローブは、使用者の選択肢として、標識してもよく、あるいは標識しなくてもよい。従って、例えば、IL−9の投与後、サイトカインが依然として有効であるかどうかを、本発明の核酸分子が存在するかどうかを明らかにすることによって決定することができる。このタイプのアッセイは、定量的研究のために適合させることができる。この場合、例えば、細胞がIL−9に感受性であるかどうかが決定され、そして細胞がIL−9に感受性である場合には、感受性がどの程度であるかが決定される。また、本発明のタンパク質を使用して、STAT1、STAT3および/またはSTAT5などのSTATタンパク質をリン酸化することができる。これにより、STATタンパク質の二量体化が生じ、その後、核に移行して、これらのSTATタンパク質が細胞に対して有する作用を引き起こす。
【0086】
これらの分子を使用して、リンパ腫、アレルギー、後天性免疫不全症候群、自己免疫性糖尿病、甲状腺炎などの免疫系の疾患、または例えば、米国特許第5,830,454号;同第5,824,551号および係属中の特許出願第08/925,348号(1997年9月8日出願、現在、特許査定)(これらはすべて参考として援用される)に記載されるそれ以外の症状のいずれかに罹っている患者などの患者に投与されたときにIL−9のアゴニストまたはアンタゴニストの効力を調べることもできる。このような分子はまた、上記の状態および他の状態におけるIL−9の役割を媒介させるために使用することができる。詳述すると、IL−9は様々なTIFを誘導するため、そのようなTIFはIL−9活性の媒介因子として有用である。従って、本発明のさらなる側面は、喘息、アレルギーおよびリンパ腫などの過剰なIL−9活性が関与している状況などにおいて内因性のIL−9活性を決定する方法である。また、例えば、アンチセンス分子、TIFに結合する抗体、またはこのような分子の他のアンタゴニストを使用してTIFまたはTIF活性を阻止または阻害することによってIL−9活性を阻止または阻害することもできる。例えば、TIFレセプターに結合するが、TIFレセプターを活性化せず、それによってIL−9誘導活性を阻害するTIFのムテインは本発明の特徴である。そのようなTIFムテインの使用によって処置され得る症状の例は、アレルギーおよび喘息などである。本発明によるムテインは、例えば、Weigelら、Eur.J.Biochem.180(2):295〜300(1989)およびEppsら、Cytokine、9(3):149〜156(1997)に従って作製することができる(これらはともに参考として援用される)。そのようなムテインは、喘息、アレルギーまたはその両方の処置において使用することができる。さらに、上記に記載されたモデルもまた適切なムテインをスクリーニングするために使用できることは当業者には明らかである。IL−9活性を調節できることは、上記に列記された症状などの症状、ならびにコルチゾール誘導アポトーシスを含むアポトーシス、BCL−3の核発現を含む症状において重要である。それは、IL−9がそのような発現などを誘導することが知られているからである。本明細書中で使用されている「抗体」は、キメラ抗体およびヒト化抗体を含む、TIFに結合する抗体の任意の部分をいう。
【0087】
本発明の別の特徴は、本発明のTIF型分子によって、当該分子が活性である組織タイプの再生を促進させることができること、あるいはそのような組織タイプの分化を阻害することができることに関する。上記に示されているように、TIF分子は様々なガン細胞株および正常な細胞株(すなわち、メサンギウム細胞およびニューロン細胞、ならびにメラノーマ細胞および肝腫瘍細胞)を標的とする。従って、例えば、TIF分子によって作用を受ける組織の再生が必要な試料に所定量のTIF型分子を加えることによって組織の再生を刺激することができる。この方法は、インビトロおよびインビボの両方で使用することができる。同様に、状況が、メラノーマまたは肝腫瘍などの特定タイプの組織の分化を阻害することが目的である状況である場合にはTIFのアンタゴニストを加えることができる。
【0088】
上記の実施例25に記されているように、TIFをコードする遺伝子は第12染色体に位置している。この染色体は、この分野で知られているように喘息と関連している。従って、本発明のさらなる実施形態は、多型、欠失、付加などの異常がTIF遺伝子の部位に存在しているかどうかを決定することによって、喘息などの状態に対する感受性または喘息に関連する感受性を決定する方法である。そのような異常は、喘息、アレルギー状態、あるいは1つまたは複数の関連する状態の感受性またはそれらが存在することの指標であり得る。DNA配列における異常を検出し得ることはこの分野ではよく知られており、そのような方法をここで示す必要はない。好ましくは、そのような異常(1つまたは複数)は、上記に示された方法およびプライマーを使用してPCRなどの標準的な技術によって検出される。
【0089】
本発明の他の特徴は当業者には明らかであり、さらに説明する必要はない。
【0090】
用いられている用語および表現は、説明の意味で使用されており、限定の意味では使用されていない。そのような用語および表現の使用には、示された特徴および記載された特徴またはその一部の任意の均等物を除外するという意図はなく、従って、様々な改変が本発明の範囲内で可能であることが認識される。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、ネズミTIFおよびヒトTIFの推定アミノ酸配列(それぞれ、配列番号:27および28)を比較する。
【配列表】
Claims (35)
- T細胞由来の誘導性因子をコードする単離された核酸分子であって、その相補的配列は、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:29、配列番号:24または配列番号:25の少なくとも1つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子。
- 前記単離された核酸分子が配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:29、配列番号:24または配列番号:25によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする請求項1に記載の単離された核酸分子。
- 前記分子がcDNAである請求項1に記載の単離された核酸分子。
- 前記分子がゲノムDNAである請求項1に記載の単離された核酸分子。
- 請求項2に記載の単離された核酸分子であって、そのヌクレオチド配列が配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:29、配列番号:24または配列番号:25のヌクレオチド配列からなる核酸分子。
- 配列番号:25のヌクレオチド配列を有する請求項4に記載の単離された核酸分子。
- 請求項1に記載の単離された核酸分子によりコードされたタンパク質をコードする単離された核酸分子。
- プロモーターに操作可能に連結された請求項1に記載の単離された核酸分子を含有する発現ベクター。
- プロモーターに操作可能に連結された請求項2に記載の単離された核酸分子を含有する発現ベクター。
- プロモーターに操作可能に連結された請求項3に記載の単離された核酸分子を含有する発現ベクター。
- プロモーターに操作可能に連結された請求項4に記載の単離された核酸分子を含有する発現ベクター。
- プロモーターに操作可能に連結された請求項5に記載の単離された核酸分子を含有する発現ベクター。
- プロモーターに操作可能に連結された請求項6に記載の単離された核酸分子を含有する発現ベクター。
- 請求項1に記載の単離された核酸分子を含有する組換え細胞。
- 請求項2に記載の単離された核酸分子を含有する組換え細胞。
- 請求項8に記載の発現ベクターを含有する組換え細胞。
- 請求項9に記載の発現ベクターを含有する組換え細胞。
- 請求項10に記載の発現ベクターを含有する組換え細胞。
- 請求項11に記載の発現ベクターを含有する組換え細胞。
- 請求項1に記載の単離された核酸分子によりコードされた単離されたタンパク質。
- 核酸分子によりコードされた単離されたタンパク質であって、少なくとも120アミノ酸を含有し、前記核酸分子の相補的配列は、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:29、配列番号:24または配列番号:25の少なくとも1つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、T細胞由来の誘導性因子である単離されたタンパク質。
- 配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:29、配列番号:24または配列番号:25によりコードされた、40個のN末端アミノ酸を除くすべてを少なくとも含有する請求項21に記載の単離されたタンパク質。
- 配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:29、配列番号:24または配列番号:25によりコードされた、20個のN末端アミノ酸を除くすべてを少なくとも含有する請求項22に記載の単離されたタンパク質。
- 請求項20に記載の単離されたタンパク質に特異的に結合する抗体。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項24に記載の抗体。
- (i)配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:29、配列番号:24または配列番号:25のヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列のタンパク質をコードする単離された核酸分子、および
(ii) 配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:29、配列番号:24または配列番号:25のヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列のタンパク質、
のうちの少なくとも一つに特異的な作用剤を細胞と接触させる工程、ならびに
前記細胞でのインターロイキン−9の効果の決定としての前記作用剤と(i)もしくは(ii) との相互作用を決定する工程
を含む、細胞におけるインターロイキン−9の効果を決定する方法。 - 前記作用剤が(ii) に特異的に結合する抗体である請求項26に記載の方法。
- 前記作用剤が前記(i)に特異的である請求項26に記載の方法。
- 試料をTIFまたはTIFをコードする核酸分子に結合する作用剤と接触させること、および前記試料中のTIFの決定としての前記結合を決定することを含む、試料中のTIFの存在を決定する方法。
- 前記作用剤が抗体である請求項29に記載の方法。
- 前記作用剤が核酸分子である請求項29に記載の方法。
- IL−9の存在下でTIF産生細胞の試料に物質を加えること、およびTIFの産生を決定することを含む、前記物質がIL−9活性に影響するかどうかを決定するためのスクリーニング方法であって、前記物質ではなくIL−9の存在下での前記細胞によるTIFの産生と比較して、前記細胞によるTIFの産生における差は、前記物質がIL−9活性に影響することを示唆する方法。
- 前記物質がIL−9阻害剤またはアンタゴニストであり、前記方法が前記物質の非存在下と比べて存在下での前記細胞による低レベルのTIFの産生を決定することをさらに含む、請求項32に記載の方法。
- 前記物質がIL−9活性化剤であり、前記方法が前記物質の非存在下と比べて存在下での前記細胞による高レベルのTIFの産生を決定することをさらに含む、請求項32に記載の方法。
- 喘息またはアレルギーを緩和するのに十分な量のTIFムテインを含有する、喘息またはアレルギーに罹っている患者を治療するための医薬。
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