JPS62151182A - 遺伝子及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は遺伝子工学に関し、特にリンホトキシン活性を
有するポリペプチドをコードする遺伝子（ＤＮＡ）及び
その製造に関する。

〔従来の技術〕

リンホトキシン（以下ＬＴと略）はリンパ球及びリンパ
系株化細胞から特異的又は非特異的に放出される細胞障
害活性を有するリンホカインの１種として知られている
。ＬＴは種々の癌細胞に対して障害性があるばかりでな
く、ある種の抗癌剤又はインターフェロンの細胞障害効
果を増強することから抗＋１ｉＴｉ　１ｇＩ剤として医
薬への応用が期待されている。〔グレンジャー　（Ｇｒ
ａｎｇｅｒ　Ｇ、Ａ、）ら、第１４回国際化学療法学会
、京都、１９８５年６月２３〜２８日、アブストラクツ
、第１５頁（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｇｒ
ｅｓｓｏｆ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、　Ｋｙｏｔｏ
、　Ｊａｐａｎ、　Ｊｕｎｅ　２３−２８、　Ａｂｓｔ
ｒａｃｔｓ　ｐ１５）；　マツナガ（Ｍａｔｓｕｎａｇ
ａ　Ｋ、）ら。

同上アブストラクツ１第３５２頁〕 ヒト由来細胞によるＬＴ産生については、扁桃細胞また
は末梢血リンパ球をフィトヘムアグルチニン（以下ＰＩ
ＩＡと略）と共に培養し、その培養上清から取得する方
法〔ピータ−（Ｐｅｔｅｒ　Ｊ、Ｂ、）　　ら、ジャー
ナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１１１７７０（１９７３）；　　ウォーカーら（Ｗａｌ
ｋｅｒ　Ｓ、Ｍ、　ａｎｄしｕｃａｓ　Ｚ、Ｊ、）、ジ
ャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ
、　１０９１２３３（１９７２）　）　、リンパ系株化
細胞をＰＭＡの存在下に培養し、その培養上清から取得
する方法〔ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｒ，Ｓ、）ら
：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・レスポンス・モ
ディファイアーズ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅ５ｐｏｎｓ
ｅ　Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）　３７６（１９８４）　）　
、ヒトＴ細胞ハイブリドーマをホルボールミリステート
アセテート（以下ＰＭＡと略）及び／又はコンカナバリ
ンＡ（以下Ｃｏｎ　Ａと略）の存在下に培養する方法〔
浅田ら：セルラー・イムノロジー（Ｃｅ１１．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、　７７１５０　（１９８３））〕等が知られて
いる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

然し、これらの方法は、生産量が少なく、又培地に高価
な栄養源（例えば牛胎児血清）を必要とする等ＬＴを高
純度かつ経済的に取得することは非常に困難である。

ＬＴを大量に得るための他の方法として、いわゆる遺伝
子操作の手法を用い、ＬＴに対応する遺伝子をベクター
に組込み細菌、カビ、酵母又は動物細胞内で複製、転写
、翻訳せしめてこれら細胞により生産させることが考え
られ、ＬＴに対応する遺伝子の取得が待望されていた。

本発明者らは、先にエメチンーアクチノマイシンＤ法を
用い細胞融合を行いＬＴを産生するヒ）Ｔ細胞ハイブリ
ドーマクローンＡ−Ｃ５−８株を取得した〔浅田ら；セ
ルラー・イムノロジー（Ｃｅ１１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

７７１５０（１９８３））　）　、しかし、Ａ−Ｃ５−
８株をＣｏｎ　Ａ、ＰＭＡの存在ＴＬＴ最適産生条件（
培養時間３０時間以上）で培養してもＬＴに対応するメ
ツセンジャーＲＮＡ（以下ｍＲＮＡと略）を取得できず
、従ってＬＴに対応する遺伝子も取得できなかった。

そこで、本発明者らはＬＴに対応するｍＲＮＡの取得条
件を種々検討した結果、Ａ−Ｃ５−８株をＰＭＡ及び／
又はＣｏｎ　Ａと共に２４時間以内（特に４時間以内）
培養することにより、細胞内に生成したＬＴポリペプチ
ドに対応するｍＲＮＡを取得できることを見出し、更に
このｍＲＮＡより遺伝子組換え技術を応用することによ
り、ＬＴポリペプチドをコードする新規な遺伝子をクロ
ーン化することに成功し本発明を完成した。

〔問題点を解決するための手段〕

即ち、本発明はＬＴ’活性を有するポリペプチドをコー
ドする遺伝子及びその製造方法を提供するものである。

更に詳しくはＰＭＡ及び／又はＣｏｎ＾を加えた培養液
中で２４時間以内で培養して得たリンホカイン産生ヒト
Ｔ細胞ハイブリドーマより分離されるショ糖密度勾配遠
心法による分画により１２．６Ｓ〜１４゜６Ｓ画分とし
て得られるｍＲＮＡより３Ｊ１　＝することを特徴とす
るＬＴ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子又
は対立遺伝子変異、遺伝子コードの縮重もしくは一部の
修飾を含む該遺伝子の変異体及びその製造法に関する。

本遺伝子は、以下のポリペプチドをコードするものであ
り、以下の塩基配列を有する。

ポリペプチド ＭＥＴ　ＴＨＲＰＲＯＰＲＯＧＬＵ　ＡＲＧ　ＬＥＤ　
ＰＩＥ　ＬＥＩＩ　ＰＲＯ八Ｒへ　　ＶＡＬ　　ＣＹＳ
　　ＧＬＹ　　ＴＨＲＴＨＲＬＥｔｌ　　ＨＩＳ　　Ｌ
ＥＵ　　ＬＥＬＩしＥＩ　　ＬＥ［Ｉ　　ＧＬＹ　　Ｌ
Ｅｔｌ　　ＬＥＵ　　ＬＥＤ　　ＶＡＬ　　ＬＥＵ　　
ＬＥＵ　　Ｐｌ？０ＧＬＹ　　ＡＬＡ　　ＧＬＮ　　Ｇ
ＬＹ　　ＬＥＤ　　ＰＲＯＧＬＹ　　ＶＡＬ　　ＧＬＹ
　　ＬＥＵＴ）ＩＲＰＲＯＳＥＲＡＬＡ　　ＡＬＡ　　
ＧＬＮ　　ＴＩＩＲＡＬＡ　　ＡＲＧ　　ＧＬＮＩＩＩ
ｓ　　ＰＲＯＬＹＳ　　ＭＥＴ　　ＨＩＳ　　ＬＥＵ　
　ＡＬＡ　　ｌｌｌ５　　ＳＥＲＡＳＮＬＥＵ　　ＬＹ
Ｓ　　ＰＲＯ＾ＬＡ　　ＡＬＡ　　ｌｌｌ５　　ＬＥＤ
　　ＩＬＥ　　ＧＬＹ　　ＡＳＰＰｌ？ＯＳＥＲＬＹＳ
　　ＧＲＮ　　ＡＳＮ　　ＳＵＲＬＥＤ　　ＬＥＤ　　
ＴＲＰ　　ＡＲＧ八Ｌへ　　ＡＳＮ　　ＴＨＲＡＳＰ　
　ＡＲＧ　　ＡＬＡ　　Ｐ）ＩＦ　　ＬＥＤ　　ＧＲＮ
　　ＡＳＰＧＬＹ　　ＰＨＥ　　ＳＥＲＬＥＤ　　ＳＥ
ＲＡＳＮ　　ＡＳＮ　　ＳＥＲＬＥＵ　　ＬＥＵＶＡＬ
　　ＰＲＯＴＨＲＳＥＲＧＬＹ　　ＩＬＥ　　ＴＹＲＰ
ＩＥ　　ＶＡＬ　　ＴＹＲ３ＥＲＧＬＮ　　ＶＡＬ　　
ＶＡＬ　　ＰＨＥ　　ＳＥＲＧＬＹ　　Ｌｖｓ　　ＡＬ
Ａ　　ＴＹＲ５ＥＲＰＲＯＬＹＳ　　ＡＬＡ　　ＴＩＩ
ＲＳＥＲ５ＩＥＲＰＲＯＬＥＤ　　ＴＹＲＬＥＵ　　Ａ
ＬＡ　　ＨＩＳ　　ＧＬＵ　　ＶＡＬ　　ＧＬＮ　　Ｉ
ＪＵ　　ＰＩＩＥ　　ＳＥＲ５ＵＲＧＲＮ　　ＴＹＲＰ
ＲＯＰＨＥ　　ｌｌｌ５　　ＶＡＬ　　ＰＲＯＬＥＵ　
　ＬＥＤ　　５ＥＲ５ＥＲＧＲＮ　　ＬＹＳ　　ＭＥＴ
　　ＶＡＬ　　ＴＨＲｐＲｏ　　ＧＬＹ　　ＬＥＤ　　
ＧＬＮＧＬＵ　　ＰＲＯＴＲＰ　　ＬＥＩＩ　　ｌｌｌ
５　　ＳＥＲＭＩＥＴ　　ＴＹＲＨＩＳ　　ＧＬＹＡＬ
Ａ　　ＡＬＡ　　ＰＨＩＥ　　ＧＬＮ　　ＬＥＤ　　Ｔ
ＩＩＲＧＬＮ　　ＧＬＹ　　ＡＳＰ　　ＧＬＮＬＥｔｌ
　　ＳＥＲＴＩＩＲＨＩＳ　　ＴＨＲＡＳＰ　　ＧＬＹ
　　ＩＬＥ　　ＰＲＯｌｌｌ５ＬＥＤ　　ＶＡＬ　　Ｌ
ＥＵ　　ＳＵＲＰＲＯＳＥＲＴＩＩＲＶＡＬ　　ＰＨＥ
　　ＰＩＩＥＧＬＹ　　ＡＬＡ　　ＰＨＥ　　ＡＬＡ　
　ＬＥ［Ｉ塩基配列 （５′　）−ＡＴＧ　　ＡＣＡ　　ＣＣＡ　　ＣＣＴ　
　ＧＡＡ　　ＣＧＴ　　ＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣＡ　　
ＡＧＧ　　ＧＴＧ　　ＴＧＴ　　ＧＧＣＡＣＣＡＣＣＣ
ＴＡ　　ＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴ　ＣＴＧ　ＧＧＧ　
ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＴＴ　ＣＴＧ　ＣＴＧＣＣ
Ｔ　　ＧＧＧ　　ＧＣＣＣＡＧ　　ＧＧＧ　　ＣＴＣＣ
ＣＴ　　ＧＧＴ　　ＧＴＴ　　ＧＧＣＣＴＣＡＣＡ　　
ＣＣＴ　　ＴＣＡ　　ＧＣＴ　　ＧＣＣＣＡＧ　　ＡＣ
Ｔ　　ＧＣＣＣＧＴＣＡＧ　　ＣＡＣＣＣＣＡＡＧ　　
ＡＴＧ　　ＣＡＴ　　ＣＴＴ　　ＧＣＣＣＡＣＡＧＣＡ
ＡＣＣＴＣＡＡＡ　　ＣＣＴ　　ＧＣＴ　　ＧＣＴ　　
ＣＡＣＣＴＣＡＴＴ　　ＧＧＡＧＡＣＣＣＣＡＧＣＡＡ
Ｇ　　ＣＡＧ　　ＡＡＣＴＣＡ　　ＣＴＧ　　ＣＴＣＴ
ＧＧＡＧＡ　　ＧＣＡ　　ＡＡＣＡＣＧ　　ＧＡＣＣＧ
Ｔ　　ＧＣＣＴＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＴ　　ＧＧＴ　　
ＴＴＣＴＣＣＴＴＧ　　ＡＧＣＡＡＣＡＡＴ　　ＴＣＴ
　　ＣＴＣＣＴＧ　　ＧＴＣＣＣＣＡＣＣＡＧＴ　　Ｇ
ＧＣＡＴＣＴＡＣＴＴＣＧＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧ　　
ＧＴＧ　　ＧＴＣＴＴＣＴＣＴ　　ＧＧＧ　　ＡＡＡ　
　ＧＣＣＴＡＣＴＣＴ　　ＣＣＣＡＡＧ　　ＧＣＣＡＣ
ＣＴＣＣＴＣＣＣＣＡ　　ＣＴＣＴＡＣＣＴＧ　　ＧＣ
ＣＣＡＴ　　ＧＡＧ　　ＧＴＣＣＡＧ　　ＣＴＣＴＴＣ
ＴＣＣＴＣＣＣＡＧ　　ＴＡＣＣＣＣＴＴＣＣＡＴ　　
ＧＴＧ　　ＣＣＴ　　ＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧ
　　ＡＡＧ　　ＡＴＧ　　ＧＴＧ　　ＴＡＴ　　ＣＣＡ
　　ＧＧＧ　　ＣＴＧＣＡＧ　　ＧＡＡ　　ＣＣＣＴＧ
Ｇ　　ＣＴＧ　　ＣＡＣＴＣＧ　　ＡＴＧ　　ＴＡＣＣ
ＡＣＧＧＧ　　ＧＣＴ　　ＧＣＧ　　ＴＴＣＣＡＧ　　
ＣＴＣＡＣＣＣＡＧ　　ＧＧＡ　　ＧＡＣＣＡＧ　　Ｃ
ＴＡ　　ＴＣＣＡＣＣＣＡＣＡＣＡ　　ＧＡＴ　　ＧＧ
ＣＡＴＣＣＣＣＣＡＣＣＴＡ　　ＧＴＣＣＴＣＡＧＣＣ
ＣＴ　　ＡＧＴ　　ＡＣＴ　　ＧＴＣＴＴＣＴＴＴ　　
ＧＧＡ　　ＧＣＣＴＴＣＧＣＴ　　ＣＴＧ−（３’　−
）上述のポリペプチドおよび塩基配列中の符号は以下の
略号である。

ＡＬＡ　：　　アラニン、　　　ＡＲＧ：　　アルギニ
ン、ＡＳＮ　：　　アスパラギン、　ＡＳＰ：　　アス
パラギン酸、ＣＹＳ：　　システィン、　　ＧＬＮ　：
　　グルタミン、ＧＬＵ：　　グルタミン酸、　ＧＬＹ
　：　　グリシン、１１１５：　　ヒスチジン、　　Ｉ
ＬＥ：　　イソロイシン、ＬＥＤ　：　　ロイシン、　
　　ＬＹＳ　：　　リジン、ＭＥＴ　：　　メチオニン
、ＰＨＥ：　　フェニルアラニン、ＰＩ？Ｏ：　　プロ
リン、　　　　ＳＥＲ：　　セリン、ＴＨＲ：　　スレ
オニン、　　　ＴＲＰ：　　ｌ−リブトファン、ＴＹＲ
：　　チロシン、　　　　νへＬ：　バリン、へ二　　
アデニン、　　　Ｃ：　　シトシン、Ｇ：　　グアニン
、　　　　Ｔ：　　チミン、尚、ヒ）ＬＴ活性を有する
ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列及びポリペ
プチドのアミノ酸配列に関しては、グレイ（Ｐ、Ｗ、Ｇ
ｒａｙ）らの報告がある〔ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ
）　３１２７２１（１９８４））が、本発明者らは遺伝
子の塩基配列及びポリペプチドのアミノ酸配列の異なる
遺伝子を見出した。すなわち、グレイらのアミノ酸配列
の２６番目のアミノ酸がＴｈｒであるのに対し本発明で
はＡｓｎであり対応する遺伝子もＡＣＣであるのに対し
、本発明ではＡＭＣである。又遺伝子の製造法に関して
は、グレイらがヒト末梢血リンパ球の非接着細胞をＰＭ
Ａ、スタフィロコッカスエンテロトキシン及びサイモシ
ンα１の存在下４８時間培養して得た細胞から＋ＩＩＲ
Ｎ＾を抽出、精製、このｍＲＮＡから遺伝子を製造して
いるが、本発明ではＬＴ産生ヒトＴ細胞ハイブリドーマ
をＰＭＡ及び／又はＣｏｎ　Ａの存在下に０．５〜５時
間培養して得た細胞よりｍＲＮ八を抽出、精製、このａ
＋ＲＮ＾から遺伝子を製造した。

以下に本発明の詳細な説明する。

■ＬＴ高産生産生細胞択 ＬＴ産生細胞としては、正常ヒトリンパ球、ＣＣＲＦ−
ＣＥＭ、　ＭＯＬＴ−４Ｆ、　ＪＵＲＫＡＴ等ヒトＴリ
ンパ系株化細胞及びそのクローニング株、ＲＰＭＩ−１
’７８８等ヒトＢリンパ系株化細胞を用いることができ
るが、ＬＴ産生量が高く細胞の継代が可能であることか
ら、正常ヒトＴリンパ球とヒトＴリンパ系株化細胞とを
細胞融合して得たＬＴ産生ヒトＴ細胞ハイブリドーマを
用いることが好ましい。ＬＴ産生ヒトＴ細胞ハイブリド
ーマは親細胞であるヒトＴリンパ系株化細胞よりＬＴ産
生量が高く、従って、細胞から抽出、分離されるｍＲＮ
Ａの量も多く好適に用いられる。

なお、ＬＴの活性測定に用いた分析法は、コバヤシ（Ｋ
ｏｂａｙａｓｈｉ　Ｙ、）らの方法〔ジャーナル・オブ
・イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　１２２７９
Ｈ１９７９））を用いて行った。すなわち、細胞培養上
清又は細胞抽出物試料のマウスＬＰ３細胞（Ｌ細胞の単
株）に対する障害活性を指標として測定した。ＬＴの１
単位／ｍｌは、５０χの標的細胞を障害する濃度で表わ
した。

ＬＴ産生ヒトＴ細胞ハイブリドーマは公知の方法（特開
昭５８−７２５２０）により製造することができる。

すなわちヒトＴリンパ球系腫瘍細胞を蛋白質合成阻害剤
又はこれとＲＮＡ合成阻害剤との併用により処理し、ヒ
トＴリンパ球をマイト−ジエン又は抗原で刺激し、両者
を融合促進剤（ポリエチレングリコール等）の存在下で
融合させ、得られた融合細胞（ヒトＴ細胞ハイブリドー
マ）だけを分離して取得することができる。ヒトＴ細胞
ハイブリドーマを培養液（例えば基礎培地ＲＰＭＩ−１
６４０培地に１０χ牛脂児血清、５　Ｘｌ０−’Ｍの２
−メルカプトエタノール、２　ｍＭのグルタミンを添加
した培養液（以下、ＲＰＭＩ培地と略）中、３７℃、Ｃ
０２５Ｘ−空気９５χの雰囲気下で培養し、前述のＬＴ
産生ヒＩ−Ｔ細胞ハイブリドーマのみをスクリーニング
する。

■細胞培養 ＬＴ産生ヒトＴ細胞ハイブリドーマからｍＲＮＡを取得
するためには、最低１０’個以上の細胞が必要であり、
それらは細胞培養によって取得することが一般的である
。すなわち、細胞を栄養培地中１０’〜１０７個７ｍ１
ｌに調製したものを、シャーレ、組織培養用フラスコ回
転培養器（スピナーフラスコ）内でＣＯ□５ｚ−空気９
５χの雰囲気下、３７℃で培養する。

培養時間は、培地組成、初期細胞濃度により異なるが１
〜５日間が適当である。培＠液を遠心分離し細胞を取得
する。

栄養培地は、ｌＪ！類、アミノ酸、ビタミン類、ホルモ
ン頚、蛋白質、抗生物質、成長因子類及び無機塩類等か
ら選ばれた一種以上を含有する基礎培地、又は基礎培地
に動物血清を添加した培地から適宜選択して用いる。

基礎培地としては、市販されているＲＰＭＩ−１６４０
培地、ＭＥＭ培地、ダルベツコ変法ＭＥＭ培地等も使用
できる。

動物血清としては、牛胎児血清、新生牛血端、馬血清、
ヒト血清等を基礎培地に対し、１〜２０％添加すること
ができる。

又、細胞をヌードマウス、ハムスター等のヒト以外の温
血動物内で繁殖させて用いることもできる。

０ｍＲＮＡの増幅 ■で取得したＬＴ産生ヒトＴ細胞ハイブリドーマを栄養
培地中１０６〜１０’／ｍ　ｌに調整し、更にＰＭＡ及
び／又はＣｏｎ　Ａを加えて培養することにより、ＬＴ
に対応するｍＲＮＡを多量に含む細胞を取得することが
できる。ＰＭＡの好適濃度は２０〜２００■／ｌｌ１１
、Ｃｏｎ　Ａの好適濃度は５〜５０μｇｅｒｍ　１の範
囲である。

培養時間は２４時間以内特に８時間以内が適当である。

その理由は、培養細胞のリンホトキシン活性に対応する
ｍＲＮＡの含量が、時間の経過と共に減少するからであ
る。特に２４時間を超える場合、ＬＴ産生ヒトＴ細胞ハ
イプリドーマを培養し、培養上清からＬＴを回収するた
めの最適時間２４〜７２時間では細胞内のＬＴに対応す
るｍＲＮＡ量は極めて微量でありｍＲＮＡを回収するこ
とは困難である。

■細胞より全ＲＮＡの抽出 ■で取得した細胞から全ＲＮＡの抽出は塩酸グアニジン
法〔ディーツ−（Ｄｅｅｌｅｙ　Ｒ，Ｇ、）ら、ザ・ジ
ャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２５２　８３１０　（１９７７
））等公知の方法で実施できる。

すなわち、■で取得した細胞（１０９個以上）を、ホモ
ジネート緩衝液（８Ｍ塩酸グアニジン、５−ジチオスレ
イトール、２０ｍＭ酢酸ナトリウム含有、ＮａＯＨでｐ
Ｈ５に調整）に懸濁し、ホモジナイザー等で破壊する。

破壊物よりエタノール沈殿、フェノール抽出により全核
酸を抽出後、塩化リチウム沈殿により全ＲＮＡを回収す
る。抽出操作はＲＮａｓｅによるＲＮＡの分解を防ぐた
め、器具は乾熱又はジエチルピロカーボネート処理後オ
ートクレーブ減面し、操作中はビニル手袋を着用するこ
とが好ましい。

■全１２Ｎ八よりｍＲＮＡの分離 全ＲＮＡから目的とするｍＲＮＡの分離は、シーＩｔＪ
！密度勾配遠心法、ゲル濾過法、電気泳動による方法、
メンブランフィルタ−法、オリゴｄＴカラムを用いる方
法等公知の方法、又はこれらを組合わせることによって
実施できる。

ここに得られたｍＲＮＡが目的とするＬＴをコードする
ものであることを確認するためには、ｍＲＮＡを蛋白質
に翻訳させてその生物活性を調べればよい。

例えばアフリカッメガエル〔キセノブス・レビス（Ｘｅ
ｎｏｐｕｓ　１ａｅｖｉｓ））の卵母細胞、網状赤血球
ライゼート、小麦胚芽のような適当な蛋白合成系にｍＲ
ＮＡを注入又は添加して蛋白質に翻訳させ、その蛋白質
がマウスＬＰ、３細胞に対して細胞障害活性を示すごと
を確認することにより行われる。尚、アフリカッメガエ
ルの卵母細胞を用いる方法は例えば次のようにして行な
われる。

卵母細胞１個当り約５０〜１００　ｎｇのｍＲＮＡをマ
イクロインジェクション法で注入し、その２０個をモデ
ィファイド・パース・ソルト液（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｂ
ｉｒｔｈＳａｌｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）　（ＮａＣ１０
，１３ｇ　、　ＭＣＩ　０．０７５ｇ、　ＮａＨＣＯａ
　０．２ｇ　、　Ｍｇ５Ｏ４Ｈ７Ｈｚ００．２ｇ　、　
Ｃａ（ＮＯ：＋）ｚ　・４Ｈ２００，０８ｇ　、　　Ｃ
ａＣ１ｚ　・６Ｈ２００，０９ｇ、　ＩＩＥＰＥｓ’　
２．３８ｇ　。

ストレプトマイシン１００ｇ　、ペニシリンＧ（１０万
単位）をＩＮに溶解；ｐＨ７，４、以下ＭＢＳと略）〕
２００μβ中２３℃で４８時間培養する。この培養上清
を試料として、ＬＰ、３細胞障害活性を指標としてＬＴ
活性を測定する。

本発明のＬＴをコードするｍＲＮＡは次の性質により特
徴づけられる。

■１２．６３−１４．６５のＳ値を有する。

■３′末端にポリアデニル酸構造を有する。

■ＬＴのポリペプチドをコードする。

■リンホトキシンｃＤＮＡのクローニング■の操作で得
られたｍＲＮＡを鋳型とし、オリゴ（ｄＴ）をブライマ
ーとして、ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴ
ＴＰの存在下で逆転写酵素（例えばトリ骨髄性白血病ウ
ィルス由来逆転写酵素）によりｍＲＮＡと相補的な単鎖
ｃＤＮＡを合成し、熱処理で鋳型ｍＲＮＡを変性させる
。次いで、この単鎖ｃＤＮＡを鋳型にして、大腸菌ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ　（フレノウフラグメント）を用いて
二重鎖ＤＮＡを合成する。この二重鎖ＤＮＡをアルカリ
処理及びフェノール抽出を行い、変性ｍＲＮＡ及び蛋白
から分離する。この二重鎖ＤＮＡに逆転写酵素を作用さ
せ、さらに完全な二重鎖ＤＮＡを合成する。ここに得ら
れたＤＮＡはヘアピン構造を有するのでＳｌヌクレアー
ゼ〔アスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ　ｏｒｙｚａｅ）：米麹菌由来Ｓ１ヌクレアーゼ〕に
よりヘアピン構造を切断し、完全な二重鎖構造のＤＮＡ
を得る。ここで得られたＤＮＡをポリ（ｄＧ）−ポリ（
ｄＣ）又はポリ（ｄ＾）−ポリ（ｄＴ）ホモポリマー伸
長法〔ノダ（Ｎｏｄａ　Ｍ、）　ら、ネイチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ）　　２９５２０２（１９８２）；マニアチス
（［ａｌｉａｔｉｓＴ、）ら、「モレキュラー・クロー
ニング（ア・ラボラトリ−・マニュアル）　Ｊ　　”Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　（ａ　１ａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ）−ηユ（１９８２）コール
ド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇ　１（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）
　ニューヨーク〕のような常法に従って、例えばプラス
ミドｐＢＲ３２２の制限酵素Ｐｓｔｌ切断部位に組み込
ませる。得られた組換えプラスミドを、例えばペルパル
（ＰｅｒｂａｌＢ、）の「ア・プラクチカル・ガイド・
トウ・モレキュラー・クローニング」　”八Ｐｒａｃｔ
ｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ”　２６８（１９８４）　、ジョン・ウィリ
ー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５
ｏｎｓＩｎｃ、）カナダ、の方法に準じて、例えばイー
・コリ（Ｌｃｏｌｉ）　）ＩＢ　１０１株のような宿主
に導入して形質転換させ、テトラサイクリン耐性株を選
択してｃＤＮ＾ライブラリーを作製する。

このｃＤＮＡライブラリーについて合成プローブを利用
したコロニー・ハイブリダイゼーション試験〔モントゴ
メリー（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ　Ｄ、Ｌ、）　　ら、セ
ル（Ｃｅｌｌ）　１４　６７３　（１９７Ｂ）　；ゲデ
ル（Ｇｏｅｄｄｅｌ　Ｄ、Ｖ、）ら、ニュークレイツク
・アシソズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ、）　８４０５７　（１９８０））により目的の
クローンをスクリーニングする。即ち、グレイらがネイ
チャ（Ｎａｔｕｒｅ）　３１２７２１　（１９８４）に
報告しているリンホトキシンの４０４から４２１番目の
１８塩基並びに５００から５１７番目の１８塩基に対応
する相補的な塩基配列を化学合成し、ポリヌクレオチド
キナーゼ（Ｔ４ファージが感染した大腸菌由来Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ）でプローブの５′末端の水酸基
γノ２Ｐ−ＡＴＰのリン酸を転移させ、ｚｚｐ標識した
２種のプローブを作製する。前述のｃＤＮＡライブラリ
ーの中から両プローブに強く結合するクローンを選択す
る。ここで得られたクローンからプラスミドＤＮＡを分
離し、加熱又はアルカリ変゛　性にヨリ単１￥ＤＮＡと
しニトロセルロースフィルターに固定する。これにリン
ホトキシンｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ画分を加えハイブリ
ダイズさせた後、結合したｍＲＮＡを溶出回収し、これ
をアフリカッメガエルの卵母細胞に注入し、回収された
ｍＲＮＡがリンホトキシンをコードしているか否かを検
討する（以下、ハイブリダイゼーション・トランスレー
ション試験という）。以上の方法によりリンホトキシン
のｍＲＮＡと相補性のある塩基配列を含むＤＮＡ断片を
組込んだクローン化ＤＮＡを得ることができる。

更に、この形質転換株のクローン化ＤＮ＾断片を適当な
制限酵素で切出し、３２ｐで標識したものをプローブと
して用い、前述のｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニ
ングすることにより、より大きなサイズのｃＤＮ＾断片
を選択してもよい。

このようにして得られた、クローン化ＤＮＡ断片につい
て、制限酵素地図を作製し、Ｍ１３ファージによりクロ
ーニングし、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ　Ｆ、）ら〔プロ
シーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイアンシーズ・オブ・ザ・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　　７
４５４６３（１９７７）　）のジデオキシシーフェンス
法に従って塩基配列を解析し、既に明らかになっている
リンホトキシンのアミノ酸配列をコードする塩基配列を
探し、最終的にリンホトキシンの全翻訳領域に対応する
塩基配列〔前記において（１）で示された塩基配列〕を
含むｃＤＮＡを選び出すことにより、すンホトキシンの
アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする塩基配列
を有するクローン化ＤＮへを得ることができる。

本発明のクローン化ＤＮＡを適当に処理した後、適当な
形質発現ベクターに組込んでリンホトキシン生産用ベク
ターを得ることができる。例えばプラスミド（大腸菌プ
ラスミドｐＢＲ３２２など）、ファージ（ラムダファー
ジ誘導体など）ウィルス（ＳＶ４０など）が挙げられる
。これらは単独で、又はそれらの組合せ、例えばｐＢＲ
３２２−ＳＶ４０ハイブリッドプラスミドなどの形で用
いてもよい。そのＤＮＡの組込み部位も任意に選択する
ことができる。即ち、適当な形質発現ベクターの適当な
位置を常法により適当な制限酵素を作用させて開裂させ
、その開裂部位に該クローン化ＤＮＡを適当な長さに処
理して組込むことができる。

上記クローン化ＤＮＡを組込んだベクターを常法により
適当な宿主に作用させて形質転換させることにより形質
発現宿主が得られる。形質発現用オペロンとしては、例
えばトリプトファン、β−ガラクトシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼ、β−ラクタマーゼなどのオペロンが挙
げられる。更に、形質転換に用いられる宿主としては、
例えば大腸菌、枯草菌、酵母などの微生物及びコス細胞
などの培養細胞が挙げられる。

本発明のクローン化ＤＮＡは、リンホトキシン生産微生
物又は細胞を作るための材料となる。

以下実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

〔実施例〕

の調製 ヒト末梢血リンパ球（以下ＰＢＬと略）１０ｂ個７ｍｌ
をＲＰＭＩ培地中、コンカナバリンＡ（以下Ｃｏｎ　Ａ
と略）２０μｇ／ｒｎｌにより２日間処理後、０．２Ｍ
のα−メチル−〇−マンノシドにて細胞に結合したＣｏ
ｎ　Ａを可及的に除去した。

他方、ＲＰＭＩ培地中で増殖期にあるヒトＴリンパ球系
腫瘍細胞ＣＣＲＦ−ＣＥ旧以下ＣＥＭと略）を遠心分離
で回収し、ＲＰＭＩ　１６４０−１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ
培地中に２×１０６個／ｍｉｔに懸濁し、エメチン塩酸
塩（半井化学社）及びアクチノマイシンＤ　（ＰＬバイ
オケミカルズ社）をそれぞれ５×１０−謝及び０．２５
μｇ７ｍｌとなるように添加し、３７℃、２時間処理し
た後、培養液中のエメチン塩酸塩及びアクチノマイシン
Ｄを遠心除去した。

以上のように調製したＰＢＬとＣＥｌ’ｌを１０：１の
割合で混合後、遠心分離して得た細胞ペレットに０．５
ｍｌの４６χポリエチレングリコール（ＰＥＧ−１５４
０、和光純薬社）、５μｇ／ｍ　１のポリ−し一アルギ
ニン及び１５χジメチルスルホキシド含存ＭＥＭ培地を
加え、３７℃、４５秒間ゆっくり攪拌して融合させ、１
０ｍ６の２５ｍＭ　ＩＩＥＰＥｓ　（ｐＨ７，２）で緩
衝化したＭＥＭ培地Ｉｏｎ７！をゆっくり添加し、遠心
した。

細胞ベレットにＲＰＭ　Ｉ培地を加え、細胞数を１０ｂ
個７ｍｌとし、その１００　μｌとフィーダー・セル（
ｆｅｅｄｅｒ　ｃｅｌｌ）としてマイトマイシンＣ処理
したＣＥＭ　（４ＸＩＱ５個／ｍ＃）含有ＲＰ旧培地１
００μｌとを混合し、９６穴カルチヤープレートに加え
、ＣＯ２５χ−空気９５χの雰囲気下、３７℃で約３〜
４週間培養後、増殖した融合細胞を上記マイトマイシン
Ｃ処理ＯＥＭをフィーダー・セルとして限界稀釈法によ
りクローン化し、各クローンの増殖後、リンホトキシン
活性の測定を行った。

なお、培養条件については特に限らない限り、ＣＯ□５
χ〜空気９５χの雰囲気下、３７℃で行った。

本発明に用いるリンホトキシン産生クローン化ヒトＴ細
胞ハイブリドーマＡ−Ｃ５〜８株を、２．５×ｌＯｓ個
／ｍｌの細胞濃度でＣｏｎ　Ａ　２０μｇ／ｍｊ２及び
門Ａ　２０μｇ／ｎｕで刺激し、６０時間培養して得た
リンホトキシン活性は２５単位７ｍｌ！であった。他方
未刺激のＡ−Ｃ５−８株のリンホトキシン活性は４単位
／ｍｌであった。

（１）リンホトキシン産生ヒトＴ綱胞ハイブリドーマ（
Ａ−Ｃ５−８）の培養 Ａ−Ｃ５−８株を５×１０６〜１０７個／ｍｌの細胞濃
度で、ＰＭＡ及びＣｏｎ＾をそれぞれ終濃度１００　ｎ
ｇ／ｍ　ｌ　、　２０Ｍｇ／ｍ　１で添加して２．４．
８．２４．４８時間培養した。

（２）全ＲＮＡの調製 Ａ−Ｃ５−８株の全ＲＮＡを抽出する方法は主に塩酸グ
アニジン法で行った。すなわち、実施例２−＋１１の各
々の培養時間後のＡ−Ｃ５−８細胞を１００Ｏｒｐｍ、
５分間遠心して集め、ＰＢＳ（５ｍＭのリン酸緩衝液、
０．１５台のＮａＣｌ含有、ｐＨ７，４）に懸濁して後
、更に１１０００ｒｐで５分間遠心して細胞を洗浄した
。

この細胞〔実施例２−（１１の各々の培養時間でそれぞ
れ４　Ｘ　１０＠、６Ｘ１０”　、３．２　ＸＩＯ”　
、１．８　Ｘ１０９及び２Ｘ１０’　）をホモジネート
緩衝液に懸濁し、ホモジナイズした。このホモジネート
に０．０２５等量の１４　酢酸及び１．５倍量の冷エタ
ノール（−２０℃）を加え混合後、−２０℃に３時間以
上放置した。これを−１０℃で１５０００ｒｐｎ＋（Ｒ
ＰＲ１８−２０−ター、日立製作所製）で３０分遠心分
離し、生じた沈殿にウオツシング緩衝液（ホモジネート
緩衝液に２０台Ｍ　ＥＤＴＡ−２Ｎａを更に含有してい
るもの、以下間と略）を加えてピペッティングで均一に
溶解後１Ｍ酢酸を加えてｐＨ５とし、更に冷エタノール
を１．５倍量加え、−２０℃に３時間以上放置した。こ
れを−１Ｑ℃で１５００Ｏｒｐｍで３０分間遠心分離し
、沈殿を■に溶解、１Ｍ酢酸によるｐＨ調整、冷エタノ
ール沈殿を３回繰返した。

エタノール沈殿物に少量の０．　ｌＸ５ＤＳを加えて懸
濁し、等量のエクストラクション緩衝液（０，５χＳＤ
Ｓ　、０．ＩＭ　ＮａＣｌ　、　５０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、５ｍＭ　ＥＤＴＡ２Ｎｍ含有、ｐＨ５，２）と２等
量の水飽和フェノール（０，Ｉ　＄　８−キ／’Ｊ／−
／Ｌ／含を、１１００ＩＩＩトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８
，０）飽和〕−クロロホルムーイソアミルアルコール溶
ｔｆＬ（体積比５Ｑ：５Ｑ：１）を加え、１０分間振盪
した後、３０００ｒｐｍ　、１０分間遠心分離した。

三層に分離した下層を除去し、上層と中間層に等量のク
ロロホルム−イソアミルアルコール溶液（体積比５０：
１）を加え、１０分間振盪した後、３０００ｒｐｍで１
０分間遠心分離し、下層を除去した。このクロロホルム
−イソアミルアルコール溶液にヨル抽出操作を三回繰返
した。ＤＮＡ　、　ＲＮＡ　、　Ｗ等を含む上層に３Ｍ
酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）を０．１等量加え、２等
量の冷エタノールを加え一２０℃で３時間以上放置後、
１５０００ｒｐｍ（ＲＰＲ１８−２ローター）で３０分
間遠心分離した。生じた沈殿に少量の滅菌蒸留水を加え
て溶解した後、等量の冷４Ｍ塩化リチウムを加え、０℃
に一夜放置し、１５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し
、沈殿を少量の２Ｍ塩化リチウムで洗浄後、滅菌蒸留水
を加えて溶解し、ｌ／１０ｔの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ５，２）を加えた後、２等量の冷エタノールを加え、
−２０℃で３時間以上放置した。１５０００ｒｐｍで３
０分間遠心分離し、沈殿を０．ＯＩＭ　　トリス塩酸緩
衝液（０，５Ｍ　ＮａＣ１，０，１χＳＤＳ　、　１ｍ
Ｍ　ＥＤＴＩｈＮ−含有、ｐＨ７，５）に溶解した。次
いで、あらかじめ同緩衝液で緩衝化したオリゴ（ｄＴ）
　＋□−，モー。−ス（ＰＬバイオケミカルズ社）３ｍ
ｊ２を直径ｌ　ｃｍのカラムに充填し、全ＲＮＡを供給
した。同緩衝液で２６０ｎｍの吸光度が０．０５以下に
なるまで洗浄後、更に０゜０１Ｍのトリス塩酸緩衝液（
０，ＩＭ　ＮａＣ１，０，１χＳＯＳ、１　ｍＭ　ＥＤ
Ｔ＾３ｏ含有、ｐｉ４７．５）で溶出を開始し、２６０
ｎｍの吸光度が０．０５以下になるまで洗浄した。最後
に０．０１Ｍ　ｌ−リス塩酸緩衝液（０，１χＳＤＳ、
１ｍＭ　ＥＤＴ八３へｍ含有、ｐＨ７，５）でポリアデ
ニル酸結合ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）をカラムから溶出し、
フラクションコレクターで分取し、２６０ｎｍの吸光度
が検出される画分を集合した。２．４．８．２４．４８
時間の各時間培養した＾−０５−８細胞からそれぞれ５
８．１３０．１８０．１２０．２５８μｇのｍＲＮＡを
回収した。

（３）ＬＴに対応するｍＲＮＡが卵母細胞で翻訳される
ことの確認 約２年令のアフリカッメガエル（メス、体重５０ｇ以上
、日本動物材料センターより購入）に、血清性性腺刺激
ホルモン〔獣医用ビーメソクス注射剤（三層）　）　２
０００／匹の割合で大腿部に筋注した。

翌日、氷水中につけて麻酔した後、腹部を切開して卵母
細胞を採取し、ＭＢＳ中で単離した。直径ｌ龍以上の卵
母細胞を１個につき実施例２−（２＋で得たｍＲＮＡを
滅菌蒸留水に溶解（ｆｇ／ｍ　１　）　　Ｌ、５Ｑｎ　
Ｃｌ（５０台ｇ）づつマイクロキャピラリーとマイクロ
インジェクター〔（株）成茂科学器械研究所製〕を使用
して実体顕微鏡下に注入した２０個の卵母細胞を０．２
ｍｌのＭＢＳ中２３℃で培養した。又、同時に滅菌蒸留
水のみ５０ｎβずつ注入した。卵母細胞２０個も０．２
ｎｊ２のＭＢＳ中２３℃で培養した。

（コントロール） ２４時間又は４８時間培養後の培養上清のＬＴ活性を測
定した結果、４８時間培養が卵母細胞の最適培養時間で
あることが判明した。更に、Ａ−Ｃ５−８細胞のＣｏｎ
＾とＰＭＡの刺激下での培養時間は、２．４．８゜２４
、４８時間培養細胞のそれぞれのｍＲＮＡの翻訳された
ＬＴ活性が、それぞれ７゜８．４．６ｉ　４．１．２．
７．　Ｏ単位７ｍｌとなることより、ｍＲＮＡを取得す
るためには、２時間培養がＡ−Ｃ５−８細胞の最適培養
時間であることが判明した。コントロールではＬＴ活性
が検出されないことから、ＬＴのｍＲＮ八が卵母細胞中
で翻訳されることを確認した。

＋４１　Ａ−Ｃ５−８胞の　　上点　とｍＲＮＡの　′
尋実施例２−（３）で決定したＣｏｎ　Ａ及びＰＭＡ刺
激刺激量適培養条件でＡ−Ｃ５−８細胞を培養し３　Ｘ
　１０’個の細胞を集めた。この細胞から実施例２−＋
２）の方法に準じてｍＲＮＡを単離精製し、５１２μｇ
のｍＲＮＡ画分を得た。

全ｍＲＮへ５１２７　μｇを０．ＯＩＭ　　トリス塩酸
緩衝液（０゜０１Ｍ　ＥＤＴ八２へ−，０，２χＳＤＳ
含有、ｐＨ７，５）に溶解し、それを同緩衝液に溶解し
た５〜３０χのショ糖密度勾配溶液５ｍβ上に重層し、
ＲＰＲ５５Ｔ−２０８０−ター（日立製作所製）を使用
して２８０００ｒｐｍで１６時間、１５℃下に遠心した
。次いで内容物を２５本（各２１６μｍ）に分画した。

各分画に３Ｍ酢酸ナトリウムを１１１Ｏ量、冷エタノー
ルを２等量加えて一２０℃で一夜放置し、ｍＲＮＡを沈
殿回収した。

回収したｍＲＮＡを滅菌蒸留水で溶解（０，５■／ｍ　
ｌ　）し、１００ｎ　ｌを実施例２−（３１の方法に準
じて卵母細胞２０個に注入し、９．２ｍｊ２のＭＢＳで
４８時間培養後、培養上滑中のＬＴ活性を測定した。そ
の結果、分画阻１３が最大のＬＴ活性を示し、沈降定数
の標準マーカー（５Ｓ、　１８Ｓ、　２ＲＳ）を用いた
検ｆｆｉ線から、ＬＴに対応するｍＲＮＡの沈降定数は
１２．６Ｓ〜１４．６Ｓであることが判明した。

ここで得られた精製ｍＲＮＡを、以下の実験に用いた。

実施例３ 世戚旦立金底 精製ｍＲＮＡ　５μｇを使用し、逆転写酵素システム（
”Ｐ）（二ニー・イングランド・ニュークリア社）を一
部変更してｃＤＮＡを合成した。逆転写酵素反応緩衝液
２０μｌ、デオキシヌクレオシド・トリフオスフェート
混合物１０ｐＨ、リボヌクレアーゼＡインヒビター２０
単位、オリゴ（ｄＴ）＋ｚ−＋ａ　１０Ｍｇ　１６００
ｍＭのβ−メルカプトエタノール５μ１１３２ｐ標識ｄ
ＣＴＰ　（比活性８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ　（１００ｐ　
Ｃｉ）　）、ｍＲＮＡ　５μｇ　、５０単位トリ骨髄性
白血病ウィルス由来逆転写酵素の系で１００μｌの容量
で、４２℃、１時間反応させた後、氷冷して反応を停止
し、遠心後ｍＲＮ八とｃＤＮへのハイブリッドを、沸騰
水浴中で３分間の熱処理で分離し、氷水浴中で５分間急
冷した。

変性した蛋白を１２０００　Ｘ　ｇ、２分間の遠心でペ
レットとし、再度氷冷した。この反応終了液９９μｉに
水冷下で１６．２μｌの滅菌蒸留水、ＤＮＡポリメラー
ゼＩ反応緩衝液４６．８μｌ、デオキシヌクレオシド・
トリフオスフェート混合物１Ｏ０４μ１１３ｔｐ標識ｄ
ＣＴＰ　（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ（１００ＨＣＩ）　）
及び１５．６μｌのイー・コリ由来ＤＮ＾ポリメラーゼ
■（８０００単位／ｍｌ）を加え、１９８／１７Ｊとし
て、よく攪拌、遠心後、１５℃で２００時間反応せた。

この反応終了液１９７μｌに０．２Ｍ　ＥＤＴＡｚＮ−
（３９，４μＮ）を加え反応を停止後、Ｉ　Ｎ　Ｎａ０
Ｈ（４９，２５，ｃｚ　ｌ　）を加え、６５℃で１時間
アルカリ加温処理を行い、ｍＲＮ八を分解し、水冷、遠
心後にＩＭ）ＩＪス塩酸緩衝液（４９゜２５μＲ、ｐＨ
８，０）及びＩＮ　ＨＣＩ（４９，２５μｌ）を加えて
中和した。

これに１７２等量の水飽和フェノールと１７２等量のク
ロロホルム−イソアミルアルコール（５０：１）で抽出
し、遠心後の上層を分取し、下層に等量の１０ｍＭ）リ
ス塩酸緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ２Ｎ−含有、ｐＨ８，０）を加えて再抽出を行い、そ
の上層も分取した。分取した両上層を等量のクロロホル
ムーイソアミルアルコールで抽出し、遠心分離後下層（
有機層）を除去した。この抽出操作を４回行った後に等
量の水飽和エチルエーテルで３回抽出を行い、有機層を
除去後、６０℃水浴で加温処理して混在するエチルエー
テルを除去した。

この水層を第２ブタノールで濃縮し、終濃度０゜０１Ｍ
のＭｇＣｌ２と２等量の冷エタノール（−２０℃）を加
え、−８０℃で一夜放置した。１２０００　Ｘｇで１０
分間遠心後の沈殿を減圧下で乾燥した後、滅菌蒸留水５
０μｌに溶解し、逆転写酵素反応緩衝液２０μρ、６０
０ｍＭ　β−メルカプトエタノール５μ１１デオキシヌ
クレオシド・トリフオスフェート混合物ｌＯμｌ及び３
Ｚｐ標識ｄＣＴＰ　（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ（１００μ
Ｃｉ）　）を加えよく攪拌遠心後５μｌの前述の逆転写
酵素を添加後、４２℃１時間反応させた。水冷下で反応
を停止し、ヘアピン構造を持つｃＤＮＡを得た。

上記反応液９９μｌに滅菌蒸留水９２．１μｌ、前述の
ＤＮＡポリメラーゼ■反応緩衝液２３．４μＺ、Ｓ、ヌ
クレアーゼ反応緩衝液５５μ２、アスペルギルス・オリ
ーゼ（＾ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）由来Ｓ
１ヌクレアーゼ（５０単位／ｍ１＞　５．５　ｐ　ｌを
加え３７℃、３０分間反応し、ヘアピン構造を切断して
２重鎖ｃＤＮＡを得た。この溶液に０．１μｌ−リス塩
酸緩衝液（０，１Ｍ　ＥＤＴ八２８ｍ含有、ｐＨ７，５
）を４６μ！加え、ベッド容量２０ｍ１のセファクリル
Ｓ−２００カラム（１，ＯＸ　２５ｃｍ）に供給し、１
０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（０，１Ｍ　ＮａＣ１，１ｍ
ＭＥＤＴＡ、□含有、ｐＨ７，５）にて溶出した。３０
０μβずつ分画し、空隙率付近に溶出した分画を第２ブ
タノールで濃縮を行い、エタノール沈殿によりｃＤＮ八
を回収した。

（２）オリゴ（ｄＣ）テール付加ｃＤＮへの調製上記に
より得られた二重鎖ｃＤＮＡに次の組成の反応緩衝液１
６０ＩＩβを加え３７℃で５分間反応させ二重鎖ｃＤＮ
Ａにオリゴ（ｄＣ）テールを付加させた。

反応緩衝液は、２ｍＭのＤＴＴ　、５ｍＭのＣｏＣ１ｚ
、０゜２５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ　、　５　μＭのｄＣＴ
Ｐ、　’Ｈ標識ｄＣＴＰ　（２５Ｃｉ／ｎｎ＋ｏｌｅ　
（１５μＣｉ）　）及び３０単位ターミナルデオキシヌ
クレオチジルトランスフェラーゼを含有する０、２Ｍの
カコジル酸カリウム−２５ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，９）である。

反応は水冷下で停止させ、等量の水飽和フェノール−ク
ロロホルム−イソアミルアルコール（５０：５０：１）
を加えて抽出し、再度クロロホルム−イソアミルアルコ
ール（５０：１）で抽出し、４０Ｍｇの大腸菌由来リボ
ゾームＲＮＡ及び１１５０ｉｉの５Ｍ　ＮａＣ１を加え
、２等量の冷エタノールを加え、−８０℃で一夜放置し
た。遠心分離でオリゴ（ｄＣ）テール付加ｃＤＮＡを回
収し、滅菌蒸留水に溶解し、０．５　ｎｇ／μ２の濃度
とした。

（３）組Ｉえ体プラスミドの作−１ オリゴ（ｄＣ）テール付加ｃＤＮＡ　１．３７５　ｎｇ
をオリゴ（ｄＧ）＋ｏ−２ｏテール付加ｐＢＲ３２２Ｏ
ＮＡ　Ｌｏｎｇ　（アマジャム社製）とをアニール溶液
（１００ｍＭ　ＮａＣＩＨ０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ２Ｎ１
１を含有する１０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，８
））　２５μβ中で６５℃、１５分間インキュベート後
インキュベーターを４５°Ｃに設定し、４５℃になった
後さらに２時間インキュベート後、水冷してアニーリン
グを行い、組換え体プラスミド溶液を調製した。

（４）形　転換体の選択 上記で得られた組換体プラスミド溶液を用い、イー・３
９８８１０１株を形質転換させた。即ち、イー・３９８
８１０１株を、０．１χグルコースを含むし一ブロス１
０ｍ！中、３７℃で吸光度（６５０ｎｍ）が０．０５と
なるまで培養し、この５ｍｌを０．１！グルコースを含
むし一ブロス５００ｍ　ｌに加え、２５℃で吸光度（６
５０ｎｍ）が０．３となるまで培養した。３０分間水冷
後、３０００ｒｐｍ（ＲＰＲ９−２０−ター；日立製作
所型）、４°Ｃで５分間遠心して集菌した。この菌体を
冷５０ｍＭ　ＣａＣ１ｚ　２５０ｍ１に分散し、１５分
間氷冷した。４℃、５分間、２５０Ｏｒｐｍ　（ＲＰＲ
９−２０−ター）で集菌し、２０χグリセロールを含有
する５０ｍＭ　ＣａＣ１□２５ｍ　Ｅに分散し、Ｌｒｎ
１ｌずつ分注し、ドライアイス粉末で凍結後−８０℃に
保存した。この保存菌体分散液を水冷下で解凍し、その
０．３ｍ　ｊ！に前述の組換え体プラスミド溶液０．１
５ｍ　ｌ及び２０＋＋＋Ｍ　ＣａＣ１ｚ−６０ｍＭ　Ｍ
ｎＣ１ｚ−２０ｍＭ　ＲｈＣｌ溶液０．１５ｍ／を混合
し、０℃、２０分間静置し、更に室温で１０分間静置後
、あらかじめ３７°Ｃに温めた０、　１′Ａグルコース
含有し一ブロス２．４ｍ４を添加混合し、３７℃、１時
間振盪培養を行った。この培養液の一部を取り、前述の
成分の他にテトラサイクリン１５μｇ／ｍｊ！を含有し
たし一プロス寒天平板に広げ３７℃で約１２時間培養し
、テトラサイクリン耐性菌を選択してｃＤＮＡライブラ
リーを作製した。

（５）ハイブリダイゼーション試験 前記のｃＤＮへライブラリーについて、ＬＴをコードす
るｃＤＮＡを含むプラスミドを持つ形質転換体をスクリ
ーニングするために、３２ｐ標識合成ｃＤＮＡプローブ
を用いるコロニー・ハイブリダイゼーション試験を行っ
た。合成ｃＤＮＡプローブは、既知のＬＴのアミノ酸配
列７５〜８０番目に対応する塩基配列、ならびに１０７
〜１１２番目に対応する塩基配列の相補配列を合成し、
その１６．６ｐ　ｍｏ＋を５単位Ｔ４ファージ惑染イー
・コリ由来Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとｒ−”Ｐ　
ＡＴＰ　（５ｐｃｉ／ｐｍｏｌｅ（２０μＣｉ）　）を
用いて、５０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（１０ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｈ、５ｍＭＤＴＴ　Ｓ　０．１ｍＭスペルミジン、０
．１ｍＭ　ＥＤＴｌｌｚＮ−含有、ｐＨ７，６３中、３
７℃、３０分間反応させた。

反応はＥＤＴＡ溶液を添加し、０°Ｃに氷冷することで
停止した。この２種の３ｔｐ標識ｃＤＮＡプローブの両
方に弱い条件で、ハイブリダイズする組換え体プラスミ
ドを有する形質転換体を選別した。約１万個のコロニー
から６個のコロニーが選び出された。

次にこの選択された６つの菌株から組換え体プラスミド
を分離し、制限酵素器ｎｄｌＩ［で、切断し、アガロー
スゲル電気泳動を行い、ニトロセルロースフィルターに
トランスファーし、再度’　２ｐ　標ｓ６合成ｃＤＮＡ
プローブと厳しい条件でハイブリダイズした。その結果
、１個のクローンが選択された。

次にこの選択された菌株についてハイブリダイゼーショ
ントランスレーション試験を、マンラティス（Ｍａｎｌ
ａｔｉｓ　Ｔ、）　らのモレキュラー・クローニング（
”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”　３２９（１
９８０）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラト
リ−）に記載の方法に従って行った。この形質転換体よ
りプラスミドＤＮＡ　ｌｄ＋出し、ニトロセルロースフ
ィルター上に加熱変性させた後に固定し、これに実施例
２−（４１で得たＬＴｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ画分を加
え５０℃で３時間反応させ、ハイブリダイゼーションを
行った。結合したｍＲＮＡを溶出回収した後、実施例２
−（３）の方法に従って卵母細胞に注入し、回収された
ｍＲＮＡがＬＴｍＲＮＡであるか否かを検定した。

その結果、ｐＬＴ１３の場合は１００／ｍｌのＬＴが検
出されたが、ｐＢＲ３２２を共用したコントロールでは
ＬＴ活性が認められなかった。

このｃＤＮＡを制限酵素器ｎｄｎ［で切断し、アガロー
スゲル電気泳動でその大きさを調べたところ、約１．３
５ＫｂｐのｃＤＮＡ部分を有していた。

このｃＤＮＡを含む形質転換体（菌体番号：　ＬＴ１３
、クローン化ＤＮＡ番号：ｐＬＴ１３）について、クロ
ーン化ＤＮＡを単離し後述の方法で塩基配列を決定した
。

失止皿土 実施例３−（５）で得られた菌株（ＬＴ１３）を０．１
χグルコース及び１５μｇ７ｍｌテトラサイクリン含有
し一ブロスで培養して菌体を得た。この菌体からプラス
ミドＤＮＡを回収し、次項で述べるＭＬ３　ｍＰ８．９
に導入できる制限酵素ＥｃｏＲＩ、　５ｔｎａ　Ｔ、　
Ｂａｍ　Ｈｌ、　ＰｓｔＩ、　Ｓａｌ　Ｉ、　ｌ１ｉｎ
ｄｌ［［の制限酵素地図を作製した。第１図参照。

（２）クローン化ＤＮＡの塩　配列の決定クローン化Ｄ
ＮＡの塩基配列の決定はメソシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）
　　らの方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ）　１９　２６９（１
９８２）〕に従ってｃＤＮＡ断片をＭ１３　ｍｐ８また
はｍｐ９でサブクローニングした後、サンガー（Ｓａｎ
ｇｅｒ）らの方法〔プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイアンシズ・オブ・ザ
・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、　ＵＳＡ）７４５４６３（１９７７）ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　
Ｂｉｏｌ、）１６２７２９（１９８２））のジデオキシ
・チェイン・ターミネーション法により、プライマーの
アニール、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメン
トによる相補鎖合成（３２Ｐ標識ｄＣＴＰ　［８００Ｃ
４／ｍｍｏｌ　（２０ｐ　Ｃｉ）　）で標識）ゲル電気
泳動及びオートラジオグラフィーから決定した。

第２図に塩基配列の決定に用いた制限酵素切断部位と塩
基配列を決定した方向及び範囲を矢印で示す。矩形で描
いた部分はＬＴの翻訳領域をコードする部分を示す。

その塩基配列は第１表の通りである。第１番目のＣの上
流に１６個のＣ連鎖テール、第１３１０番目のＴの下流
に１８個のＣ連鎖テールがあり、ベクターと付加すると
きに合成したホモポリ１マーである。

第６３ないし６７７番目はＬＴの前駆体を構成するに必
要なポリペプチドをコードすると推定される塩基配列で
ある。

このうち第１６５番目からがＬＴをコードしていると考
えられ、グレイ（Ｇｒａｙ　Ｐ、Ｗ、）　　らが〔ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）　３１２７２０１９８４）　）
に報告したＬＴとは、２６番目のアミノ酸がＴｈｒ　（
ＡＣＣ）であるのに対し、Ａｓｎ　（ＡＭＣ）である点
が異なっている。Ｃ末端アミノ酸（ロイシン）のコドン
に続いて、終始コドン（ＴＡＧ）がある。またペプチド
コード部位以外に第１〜４番目ＧＣＴＣがＣＧＧＧに、
第８６２〜８６５番目ＣＡＣＡがＡＣＡＣに第１３０６
〜１３１０番目ＴＧＡＡＡがＣＣＣＣＴにおいて異なっ
ている。

ス財１肌ｉ 全ｃＤＮＡの構造から考えられる制限酵素の中でＰｖｕ
　Ｕ　（１９０番目）並びにＥｃｏＲＩ　（８３８番目
）を使用し、常法に従ってｐＬＴ１３を切断し、１．５
χアガロースゲル電気泳動を行い、約６５０ｂｐのｃＤ
Ｎ＾断片をアガロースゲルから抽出し、水飽和フェノー
ル抽出、クロロホルムイソアミルアルコール抽出を行い
、エタノール沈殿によりｃＤＮＡ断片を回収した。

このｃＤＮ八断へはＬＴのＮ末端アミノ酸Ｌｅｕのコド
ンＣＴＣの最初の塩基であるＣから２８塩基Ｎ末端側を
欠いたところからストップコドンの下流１６４塩基まで
を含む断片である。

ｐＫＫ２２３−３（４５８５ｂｐ）のポリリンカ一部位
を先ずＥｃｏＲＩで完全に切断後Ｂａａ＋旧で部分切断
し、１゜５χアガロースゲル電気泳動によりＢａｍ旧で
完全に切断されたと考えられるｐＫＫ２２３−３のＤＮ
Ａ断片とを分離し、アガロースゲルより抽出、フェノー
ル抽出、ＣＩＡ抽出後エタノール沈殿を行って、、　Ｂ
ａｍ　Ｈｌで部分切断されたプラスミドと、Ｂａｍ　Ｈ
Ｉで切断されなかったベクターを回収した。更に両者の
混合されたプラスミドをＳｍａ　Ｉで完全に切断し、切
断部位がＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ　ＩＩサイトのものとＥｃ
ｏＲＩ−Ｓｍａ　Ｉサイトのものとした。

実施例５−（２１で得たｐＫＫ２２３−３のＥｃｏＲＩ
−Ｒａｍ　ＩＩサイト切断ベクターと、あらかじめトッ
プ鎖とボトム鎖を０．０１Ｍ　　）リス塩酸緩衝液（０
，ＩＭ　ＮａＣ１，０゜１ｍＭ　ＥＤＴ＾含有、ｐＨ７
，８）中で６５℃、５分間加熱後水浴を３７℃にセット
して、さらに１時間放置し、室温で２０分間放置し、ア
ニールさせた後に一２０℃に保存したＰＴＩＳをＴ４−
感染イー・コリ由来のＤＮＡリガーゼを用いて５０Ｉｌ
１Ｍトリス塩酸緩衝液（１０ｍＭＭｇＣ１ｚ　、１０ｍ
Ｍジチオスレイトール、１ｍＭ　ＡＴＰを含有、ｐＨ７
，６）中で１４℃にて一夜反応させ、再度環状構造をも
つベクターを作製した。この再構築プラスミドを常法に
従ってイー・コリのＪＭ１０５に形質転換し、アンピシ
リン含有ＬＢ寒天培地に播き、アンピシリン耐性菌とし
て、この再構築プラスミドを含む菌体を選択し、常法に
従ってプラスミドを調製した。このプラスミドをＰＰ−
３と命名した。

まず実施例５−（３）で得たＰＰ−３をＢａｍ　Ｈｌで
部分切断し、ウシ腸粘膜由来アルカリフォスファターゼ
（ファルマシア製）を用いて５０ｍＭ　）リス塩酸緩衝
液（１ｍＭ　ＭｇＣＬｚ　、０．１ｍＭ　ＺｎＣ１ｚ　
、１ｍＭスペルミジン含有、ｐＨ９，０）中３７℃、３
０分間反応させ、５　′末端の脱リン酸化を行い、水飽
和フェノール抽出、ＣＩＡ抽出を行い、エタノール沈殿
で開環プラスミドを回収後、ＤＮＡポリメラーゼ！（タ
レノウフラグメント）を用いて接着末端を平滑末端にし
、水飽和フェノール抽出、ＣＩＡ抽出後エタノール沈殿
にて回収した。

一方、実施例５−（１）で得たｐＬＴ１３のＥｃｏＲＩ
−Ｐｖｕ■−フラグメントをＤＮＡポリメラーゼＩ　（
タレノウフラグメント）で平滑末端とし、フェノール抽
出、ＣＩＡ抽出後エタノール沈殿で回収し、上記の平滑
末端をもつ開環プラスミドと、ＤＮＡリガーゼ存在下１
６℃、２０時間で平滑末端ライゲーションを行った。反
応後、閉環したプラスミドを水飽和フェノール抽出、Ｃ
ＩＡ抽出、エタノール沈殿で回収し、イー・コリＪＭ１
０５株に常法に従って形質転換し、アンピシリン耐性に
より、５３００個のりコンビナンドＪＭ１０５を選択し
た。

（５）ＡｃＤＮ＾プローブによるスクリーニング実施例
５−（４）で得たりコンビナンドＪＭ１０５を実施例３
−ｆ５）に示した方法に従って３２ｐ標識した合成ｃＤ
ＮＡＤＮＡリガーゼロニーハイフ゛リダイゼーションｉ
ＥＭによりスクリーニングし、１００個のコロニーを選
択した。このコロニーの２０個から、常法に従ってプラ
スミドを調製し、制限酵素（Ｂａｍ　）ＩＩ、ｔｌｉｎ
ｄＤＩ）によって切断後、アガロースゲル電気泳動を行
い、目的とする約５ｓｏｂｐと約２５０ｂｐのＯＮ＾フ
ラグメントを含むプラスミドを検索した。その結果、目
的とする３個のコロニーを選択した。

（６１ＬＴの大腸菌内における発現 実施例５−ｆ５１で得た３つの形質転換体のうちのひと
つを用いて、ＬＴ発現を行った。この菌体に組み込まれ
たプラスミドのｔａｃプロモーターは宿主であるイー・
コリＪＭ１０５株内では抑制されているが、イソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトシド（以下ＩＰＴＧと略）の
添加で抑制を解除できる。そこで、この形質転換体をＩ
ＰＴＧ　０〜１ｍＭを含むＬＢ培地で０．Ｄ。

５５０ｎｍが１．１〜１．２になるまで培養した。遠心
にて集菌後、リン酸緩衝液で緩衝化した生理食塩水（以
下ＰＢＳと略）で洗浄し、遠心にて集菌した後再度ＰＢ
ＳでＯ，０，５５０ｎｍが１．０となる様に懸濁した。

この懸濁液の超音波処理を行い菌体を破砕した。

この菌体破砕画分の無菌濾過を行い、ＬＴ活性を測定し
た。Ｉ　ＰＴＧ無添加の場合０．２６　Ｘ　１０’Ｕ／
ｍ　１のＬＴ活性が認められ、ＩＰＴＧ　０．０１ｍＭ
　、０．１ｍＭ　、１ｍＭ添加の場合、それぞれ１１Ｘ
’ｌＯ’　、ｌ０ＸＩＯ’　、１５Ｘ１０’１１／ｍ　
１の活性を認めた。一方、コントロールとしてｐｋｋ２
２３−３を組み込んだ菌体に対して同様の操作を行った
がＬＴ活性は検出されず、組換体プラスミドに由来する
ＬＴ活性の発現であることを確認した。

ここで使用した形質転換体の菌体番号をＬＴ１３ｔａｃ
６、組み込んだプラスミドをｐＬＴ１３ｔａｃ６と命名
した。

ここで発現したＬＴ活性を有するポリペプチドは実際の
ＬＴのＮ末端アミノ酸ＬｅｕからＡｌａまで１０個のア
ミノ酸が、Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏに変わったものと考
えられる。しかし、ＬＴのＮ末端アミノ酸２３残基が欠
けてもＬＴ活性に差がないこと〔ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）３１２７２１（１９８４）　、ザ・ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、）２５９６８６（１９８４）　）を考慮すれ
ばＬＴ遺伝子が発現したと思われる。

〔発明の効果〕

本発明の新規遺伝子はリンホＩ・キシン活性を有するポ
リペプチドをコードすることからリンホトキシンの遺伝
子操作法による大量生産が可能になり、医薬への応用の
道が開かれる。又、従来取得が困難であった本遺伝子は
リンホトキシン高産生ヒトＴ細胞ハイブリドーマより容
易に取得できる。

本発明のリンホトキシン活性を有するポリペプチドをコ
ードする遺伝子はリンホトキシンを大量に生産するため
に重要なものであり、適当なベクターに組込み、適当な
宿主例えば微生物、カビ、酵母、動物細胞に導入し、こ
れを培養することにより高純度のリンホトキシンを大量
に製造することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明実施例による制限酵素地図を示す概略
線図、 第２図は、本発明実施例による塩基配列の決定に用いた
制限酵素切断部位と塩基配列を決定した方向および範囲
を示す概略線図である。 Ｂ　−Ｂａｍ　８１　　　Ｅ　−ＥｃｏＲＩ　　　Ｐ　
−Ｐｓｔ　１第１１コ 篤２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、以下のポリペプチドをコードする部分を含むリンホ
   トキシン活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
   。 【遺伝子配列があります】 ２、リンホトキシン活性を有するポリペプチドをコード
   する遺伝子が下記の塩基配列を有する部分を含むもので
   ある特許請求の範囲第１項記載の遺伝子。 【遺伝子配列があります】 ３、リンホトキシン活性を有するポリペプチドをコード
   する遺伝子がリンホトキシン産生ヒトＴ細胞ハイブリド
   ーマから分離されショ糖密度勾配遠心法による分画によ
   り１２．６Ｓ〜１４．６Ｓ画分として得られるメッセン
   ジャーＲＮＡより調製されたものである特許請求の範囲
   第１項記載の遺伝子。 ４、リンホトキシン活性を有するポリペプチドをコード
   する遺伝子の変異体が対立遺伝子変異、遺伝子コードの
   縮重もしくは一部の修飾を含む特許請求の範囲第１項記
   載の遺伝子。 ５、ホルボールミリステートアセテート及びコンカナバ
   リンＡのうち少なくとも１種を加えた培養液中で、リン
   ホトキシン産生ヒトＴ細胞ハイブリドーマを培養し、得
   られた細胞からショ糖密度勾配遠心法による分画により
   １２．６Ｓ〜１４．６Ｓ画分として得られるメッセンジ
   ャーＲＮＡを分離し、このメッセンジャーＲＮＡからリ
   ンホトキシン活性を有するポリペプチドをコードする遺
   伝子を調製することを特徴とする遺伝子の製造方法。