JPS638398A - 生理活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規な生理活性ポリペブチｒ更に詳しくはリン
ホトキシン活性を有する新規なポリペブチｐに関する。

〔従来の技術〕

リンホトキシン（以下ＬＴと略）はリンパ球及びリンパ
球系株化細胞から特異的又は非特異的に放出される細胞
障害活性を有するリンホカインの１種として知られてい
る。ＬＴは種々の癌細胞に対して障害性があるばかりで
なく、ある種の抗癌剤又はインターフェロンの細胞障害
効果を増強することから抗腫瘍剤として医薬への応用が
期待されている。〔グレンジャー（Ｇｒａｎｇｅｒ　Ｇ
、Ａ、）ら、第１４回国際化学療法学会、京都、１９８
５年６月２３〜２８日、アブストラクツ、第１５頁（工
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＣｏｎｇｒｅｓｓｏｆＣｈ
ｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、　Ｋｙｏｔｏ、　Ｊａｐａｎ、
　Ｊｕｎｅ　２３−２８、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｐ　１
５　）　：　？ツナガ（Ｍａｔｓｕｎａｇａ　Ｋ、　）
ら、同上アブストラクツ、第３５２頁〕ヒト由来細胞に
よるＬＴ産生については、扁桃細胞または末梢血リンパ
球をフイトヘムアグルチニン（以下ＰＨＡと略）と共に
培養し、その培養上清から取得する方法〔ビータ−（Ｐ
θｔａｒ　Ｊ、Ｂ、　）ら、ジャーナル０オプφイムノ
ロジー（Ｊ。

工ｍｍｕｎｏ１．１１１　７７０　（１９７３）　：ウ
ォーカーら（Ｗａｌｋｅｒ　８．Ｍ、　ａｎｄ　Ｌｕｃ
ａｓ　ｚ、、ｒ、　）　Ｘ　ジャーナル・オプ・イムノ
ロジー（Ｊ、工ｍｍｕｎｏｌ。

１０９　１２３３（１９７２）］、リンパ球系株化細胞
をＰＭＡの存在下に培養し、その培養上清から取得する
方法〔ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｒ，Ｓ、　）ら；
ジャーナル・オプ・バイオロジカル・レスポンス・モデ
イファイアーズ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｓｐｏｎｓｅ
Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ　）　３　７６　（１９８４）　）
、ヒトＴ細胞ハイプリドーマをホルボールミリステート
アセテート（以下ＰＭＡと略）及び／又はコンカナバリ
ンＡ（以下Ｃｏｎ　Ａと略）の存在下に培養する方法〔
浅田ら：セルラー・イムノロジー（Ｃｅ１１゜Ｉｍｍｕ
ｎＯ’ｌ、７７　１５０（１９８３））Ｅ等が知られて
いる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

然し、これらの方法は、生産量が少な（、又培地に高価
な栄養源（例えば牛胎児血清）を必要とする等ＬＴを高
純度かつ経済的に取得することは非常に困難である。

ＬＴを大量に得るための他の方法として、いわゆる遺伝
子操作の手法を用い、ＬＴに対応する遺伝子をベクター
に組込み細菌、カビ、酵母又は動物細胞内で複製、転写
、翻訳せしめてこれら細胞により生産させることが考え
られ、ＬＴに対応する遺伝子の取得が待望されていた。

本発明者らは、先にエメチンーアクチノマイシンＤ法を
用い細胞融合を行いＬＴを産生するヒトＴ１１ｆｌ胞ハ
／ｆ　フＩＪ　Ｐ−？　りｏ−７Ａ　　Ｏ５−８株ヲ取
得した〔浅田ら；セルラー・イムノロジー（Ｃｅ１１．
工ｍｍｕｎｏＬ　７７　１５０　（１９８３）））。

しかし、Ａ−０５−８株をＣ！ｏｎ　Ａ　、　　ＰＭＡ
の存在下ＬＴ最適産生条件（培養時間３０時間以上）で
培養してもＬＴに対応するメツセンジャーＲＮＡ　（以
下ｍＲＮＡと略）を取得できず、従ってＬＴＫ対応する
遺伝子も取得できなかった。

そこで本発明者らはＬＴに対応するｍＲＮＡの取得条件
を種々検＃’ｔ　ｔ、た結果、Ａ−０５−８株をＰＭＡ
及び／又はＣｏｎ　Ａと共に２４時間以内（特に４時間
以内）培養することにより、細胞内に生成したＩ、Ｔポ
リペプチドに対応するｍＲＮＡを取得できることを見出
し、更にこのｍＲＮＡより遺伝子組換え技術を応用する
ことにより、ＬＴポリペブチｒをコーｒする新規な遺伝
子をクローン化した（特願昭６０−２８９２４９号明細
書）。

更に、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、ＬＴポリペ
ゾチＶをコードするクローン化遺伝子（ｃＤＮＡ　）を
組込んだ形質発現ベクターで形質転換された微生物中で
ＬＴポリペフ０チげを生産させることに成功し、更にこ
のようにして生産されたヒトＬＴポリペブチｒ含有生産
物から、実質的に不純物を含まないヒ）　Ｌ　Ｔ　ＸＪ
ｅＩＪペゾチドを得ることに成功し本発明を完成した。

遺伝子組換え技術を用いてＬＴを生産する方法に関し、
グレイらの報告ＣＰ、Ｗ、　Ｇｒａｙ　ｅｔ　ａｌ：ネ
イチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　３１２　７２１　（１９
８４））がある。

グレイらは、ヒト末梢血リンパ球の非接着細胞ヲＰＭＡ
　、スタフイロコツカルエンテロトキシンＢ及びサイモ
シンα〕と共に４８時間培養後、細胞よりｍＲＮＡを取
得しｃ　ＤＮＡを作成、制限酵素で切断後合成オリゴヌ
クレオチドとライプ−ジョン後、大腸菌内でＬＴを発現
させている。この報告から推定されるＬＴはアミノ酸残
基数１７１又は１７２、分子量１８，６００を有する。

本発明において、ｍＲＮＡはヒ）Ｔ細胞ハイデリド−ｉ
より取得していること、ｍＲＮＡより誘導したｃ　ＤＮ
Ａの塩基配列が異なること（実施例４）などの相違があ
る他、本発明のＬＴ献リすプチドのアミノ酸残基数が１
６４であり分子量が異なると共にアミノ酸配列でも１〜
３番目及び１９番目のアミノ酸が異なる。

Ｌ′！′の等電点はｐＨ５，８と報告〔アガワルら（Ｂ
、Ｂ、　Ａｇｇａｗａｌ　ａｔ　ａｌ　）　：　ｆ　＊
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ
、　Ｂｌｏｌ。

Ｏｈｅｍ、　）、２５９　６８６（１９８４）］されて
富±［Ｊ、５と甲注憤城にある。

〔問題点を解決するための手段〕

即ち本発明はＬτ活性を有する新規なポリペブチＶを提
供するものである。

更に詳しくは特願昭６０−２８９２４９号明細書で得た
ＬＴ−リペプチドをコーＰ−ｊるｃＤＮＡ（第１表）を
制限酵素で切断し、別に翻訳開始部位を導入した形質発
現ベクターを同じ制限酵素で切断したものとライプ−ジ
ョンしてＬＴポリペブチρ生産用の形質発現ベクターを
得、この形質発現ベクターを適当な宿主例えば大腸菌な
どに導入することにより形質転換体を得て、該形質転換
体を培養して得た培養物から抽出、精裏して得た不純物
を実質的に含まないヒトＬＴポリペプチドに関する。

以下余白 ヒ）ＬＴポリペゾチドは次式（Ｉ）のアミノ酸配列を有
する。

式（１） ％式％ 上述のポリペプチド及び第１表の塩基配列中の符号は以
下の略号である。

ＡＬＡ　：　　アラニン、　　　ＡＲＧ　：　　アルギ
ニン、ＡＳＮ：　　アスパラギン、ＡＳＰ：　　アスパ
ラギン酸、ａｙｓ　：　　システィン、　　ＧＬＮ　：
　　グルタミン、ＧＬ［Ｔ　：　　グルタミン酸、ＧＩ
、Ｙ：　　グリシン、ＨＩＳ：　　ヒスチジン、　工Ｌ
Ｅ：　　インロイシン、ＬＫＵ　：　　ロイシン、　　
　ＬＹＳ：　　リジン、ＭＥＴ　：　　メチオニン、Ｐ
ＨＥ：　　フェニルアラニン、ＰＲＯ：　　プロリン、
　　　ＳＸＲ：　　セリン、ＴＨＲ：　　スレオニン、
　　ＴＲＰ：　　）リプトファン、ＴＹＲ：　　チロシ
ン、　　　ＶＡＬ　：　　バリン、Ａ：　　アデニン、
　　　Ｃ：　　シトシン、Ｇ：　　グアニン、　　　Ｔ
：　　チミン、尚、ヒトＬＴ活性を有するポリペプチド
のアミノ酸配列に関してはヒ）　ＩＪンパ芽球細胞株Ｒ
ＰＭ工１７８８由来の分子量２０，０００と２５．００
０のＬＴに関しアガワル（Ｂ、Ｂ、　Ａｇｇａｒｗａｌ
）らの報告〔デ・ジャーナル・オプφバイオロジカルφ
ケミストリーＪ、　Ｅｉｏユ、　ｃｈｅｍ、、　２６０
２３３４（１９８５）］があるが、本発明のポリペプチ
ドとは上記アミノ酸配列中１〜３番目及び１９番目のア
ミノ酸が異なる。

以下に本発明の詳細な説明する。

■　ＬＴ高産生細胞の選択 ＬＴ産生細胞としては、正常ヒ）　ＩＪンパ球、ＣＯＲ
Ｐ−ＯＥＭ　、　ＭＯＬＴ−４Ｆ　、　　、ＴＵＲＫＡ
Ｔ等ヒトＴリンパ球系株化細胞及びそのクローニング株
、ＲＰＭニー１７８８等ヒ）　Ｂ　ＩＪンパ球系株化細
胞を用いることができるが、ＬＴ産生量が高く細胞の継
代が可能であることから、正常ヒトＴリンパ球とヒトＴ
リンパ球系株化細胞とを細胞融合して得たＬＴ産生ヒ）
Ｔ細胞ハイプリドーマを用いることが好ましい。

ＬＴ産生ヒ）Ｔ細胞ハイブリドーマは親細胞であると）
　Ｔ　ＩＪンパ球系株化細胞よりＬＴ産生量が高く、従
って、細胞から抽出、分離されるｍＲＮＡの量も多く好
適に用いられる。

なお、ＬＴの活性測定に用いた分析法は、小林（Ｋｏｂ
ａｙａｅｈｉ　Ｙ、　）らの方法〔ジャーナル・オブ・
イムノロジー（Ｊ、工ｍｍｕｎｏｌ　）　１２２　７９
１（１９７９））を用いて行った。すなわち、細胞培養
土浦又は細胞抽出物試料のマウスＬ−Ｐ３細胞（Ｌ細胞
の単株）に対する障害活性を指標として測定した。ＬＴ
の１ｊＩｉ位／　ｍｌは、５０係の標的細胞を障害する
濃度で表わした。

ＬＴ産生ヒトＴ細胞ハイブリドーマは公知の方法（特開
昭５８−７２５２０号公報）Ｋより製造することができ
る。

すなわちヒトＴ　ＩＪンパ球系腫瘍細胞を蛋白質合成阻
害剤又はこれとＲＮＡ合成阻害剤との併用により処理し
、ヒトＴリンパ球をマイト−ジエン又は抗原で刺激し、
両者を融合促進剤（ポリエチレングリコール等）の存在
下で融合させ、得られた融合細胞（ヒトＴ細胞ハイブリ
ドーマ）だけを分離して取得することができる。ヒトＴ
細胞ノ・イプリげ一マを培養液（例えば基礎培地ＲＰＭ
工〜１６４０培地に１０俤牛脂児血清、５Ｘ１０−’Ｍ
の２−メルカプトエタノール、２ｍＭのグルタミンを添
加した培養ｇ、（以下、ＲＰＭ工培地と略）中、３７℃
、ＣＯ□５％−空気９５幅の雰囲気下で培養し、前述の
ＬＴ産生ヒ）Ｔ細胞ノ・イブリＶ−マをスクリーニング
する。

■　細胞培養 ＬＴ産生ヒトＴ細胞ハイプリドーマからｍＲＮＡを取得
するためには、最低１０９個以上の細胞が必要であり、
それらは細胞培養によって取得することが一般的である
。すなわち、細胞を栄養培地中１０５〜１０７個／ゴに
調製したものを、シャーレ、組織培養用フラスコ回転培
養器（スぎナーフラスコ）内でＣｏ２５　％−空気９５
壬の雰囲気下、３７℃で培養する。

培養時間は、培地組成、初期細胞濃度により異なるが１
〜５日間が適当である。培＊ａを遠心分離し細胞を取得
する。

栄養培地は、糖類、アミノ酸、ビタミン類、ホルモン類
、蛋白質、抗生物質、成長因子類及び無機塩類等から選
ばれた一種以上を含有する基礎培地、又は基礎培地に動
物血清を添加した培地から適宜選択して用いる。

基礎培地としては、市販されて℃・るＲＰＭニー１６４
０培地、ＭＢＭ培地、ダルベツコ変法ＭＥＭ培地等も使
用できる。

動物血清としては、牛脂児面清、新生牛血清、馬血清、
ヒト血清等を基礎培地に対し、１〜２０係添加すること
ができる。

又、細胞をヌーげマウス、ハムスター等のヒト以外の温
血動物内で増殖させて用いることもできる。

■　ｍＲＮＡの増幅 ■で取得したＬＴ産生ヒトＴ細胞ノ・イプリ１−マを栄
養培地中１０６〜１０７／Ｉｎｌに調整し、更ＫＰＭＡ
及び／又はＣｏｎ　Ａを加えて培養することにより、Ｌ
Ｔに対応するｍＲＮＡを多量に含む細胞を取得すること
ができる。ＰＭＡの好適濃度は２０〜２００　ｎｊｑ／
ｍｌ、　Ｃｏｎ　Ａの好適濃度は５〜５０μｓ〜の範囲
である。

培養時間は２４時間以内特に８時間以内が適当である。

その理由は、培養細胞のリンホトキシン活性に対応する
ｍＲＮＡの含量が、時間の経過と共に減少するからであ
る。特に２４時間を超える場合、ＬＴ産生ヒ）Ｔ細胞ハ
イブリドーマを培養し、培養上清からＬＴを回収するた
めの最適時間２４〜７２時間では細胞内のＬＴに対応す
るｍＲＮＡ量は］全めて微量でありｒｎＲＮＡを回収す
ることは困難である。

■　細胞より全ＲＮＡの抽出 ■で取得した細胞から全ＲＮＡの抽出は塩酸グアニジン
法〔ディー９−（Ｄｅｅｌｅｙ　Ｒ，Ｇ、　）ら、デ・
ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（：
ｒ、Ｂｌｏｌ、Ｏｈｅｍ、　）　２５２　８３１０（１
９７７）３等公知の方法で実施できる。

すなわち、■で取得した細胞（１０９個以上）を、ホモ
ジネート緩衝ｉ（８Ｍ塩酸グアニジン、５　ｍＭジチオ
スレイトール、２０”Ｍ酢酸ナトリウム含有、ＮａＯＨ
でｐｉ−１７に調整）に懸濁し、ホモジナイザー等で破
壊する。破壊物よりエタノール沈殿、フェノール抽出に
より全核酸を抽出後、塩化リチウム沈殿により全ＲＮＡ
を回収する。抽出操作はＲＮａＳｅによるＲＮＡの分解
を防ぐため、器具は乾熱又はジエチルピロカーボネート
処理後オートクレーブ滅菌し、操作中はビニル手袋を着
用することが好ましい。

■　全ＲＮＡよりｍＲＮＡの分離 全ＲＮＡから目的とするｍＲＮＡの分離は、ショ糖密度
勾配遠心法、ケ９ル濾過法、電気泳動による方法、メン
ブランフィルタ−法、オリゴｄＴカラムを用いる方法等
公知の方法、又はこれらを組合わせることによって実施
できる。

ここに得られたｍＲＮＡが目的とするＬＴをコードする
ものであることを確認するためには、ＤＩＩＲＮＡを蛋
白質に翻訳させてその生物活性を調べればよい。例えば
アフリカッメガエル〔ゼノパス・レビス（Ｘｅｎｏｐｕ
ｓ　１ａｅｖｉｓ　）　〕の卵母細胞、網状赤血球ライ
ゼート、小麦胚芽のような適当な蛋白合成系にｍＲＮＡ
を注入又は添加して蛋白質に翻訳させ、その蛋白質がマ
ウスＬ−Ｐ３細胞に対して細胞障害活性を示すこと、ケ
確認することにより行われる。

尚、アフリカッメガエルの卵母細胞を用いる方法は例え
ば次のようにして行なわれる。

卵母細胞１個当り約５０〜１００ｎ、９のｍＲＮＡを７
フイクロインジエクシヨン法で注入し、その２０個をモ
ディファイド・バース・ツル）　ｉ　（Ｍｏｄｉｆｉｅ
ｄＢａｒｔｈ　５ａｌｔ　５ｏ１ｕｔｉｏｎ　）ＣＮａ
１ｌ　０．１　３９　％　　ＫＯｌｏ、０７５　ｊ！Ｘ
ＮａＨＯＯ３０，−２１、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，２
、！ｉｌ、０ａ（ＮＯ３）２　ａ　４Ｈ２００，０８Ｉ
Ｘｃａ（！１２・６Ｈ２００，０９、！７　、ＨＥＰＫ
Ｓ　２．３８　ｉ　％ストレプトマイシン１００Ｎ、ペ
ニシリンＧ（１０万単位）を１１に溶解：　ｐＨ７，４
、以下ＭＢＳと略）〕２００μｌ中２６℃で４８時間培
養する。この培養上清を試料として、Ｌ−Ｐ３細胞障害
活性を指標としてＬＴ活性を測定する。

本発明のＬＴをコー−するｍＲＮＡは次の性質により特
徴づけられる。

■　１２．６　Ｓ〜１４．６８のＳ値を有する。

■　３′末鴻にポリアデニル酸構造を有する。

■　ＬＴのポリペプチドをコーげする。

■　リンホトキシンｃＤＮＡのクローニング■の操作で
得られたｍＲＮＡを鋳型とし、オリが（ｄＴ）をプライ
マーとして、ｄＡＴＰ　、　ｄＧＴＰ　。

ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰの存在下で逆転写酵素（例えはト
リ骨髄性白血病ウィルス由来逆転写酵素）によりｍＲＮ
Ａと相補的な単鎖ｃＤＮＡを合成し、熱処理で鋳型ｍＲ
ＮＡを変性させる。次いで、この単９　（！ＤＩＪＡ　
ヲ鋳型にして、大腸菌ＤＮＡポリ゛メラーゼＩ（フレノ
ウフラグメント）を用いて二重鎖ＤＮＡを合成する。

この二重１１ＪＤＮＡをアルカリ処理及びフェノール抽
出を行い、変性ｍＲＮＡ及び蛋白から分離する。この二
重鎖ＤＮＡに逆転写酵素を作用させ、さらに完全な二重
鎖ＤＮＡを合成する。ここに得られたＤＮＡはヘアピン
構造を有するので８１ヌクレアーゼ〔アスペルギルス−
オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ　）　
：米麹菌由来Ｓ】ヌクレアーゼ〕によりヘアピン構造を
切断し、完全な二重鎖構造のＤＮＡを得る。ここで得ら
れたＤＮＡをポｌｊ　（ｄ　Ｇ　）−ポリ（ａａ）又は
ポリ（ｄＡ）−ポリ（ｄＴ）ホモポリマー伸長法〔ノダ
（Ｎｏｄａ　Ｍ、　）ら、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ
　）　２９５　２０２　（１９８２）　：マニアチス（
ＭａｎｉａｔｉθＴ、　）ら、「モレキュラー・クロー
ニング（ア・ラボラトリ−φマニュアル）」Ｘ′Ｍｏ１
．ｅｃｕｌａｒ　Ｏｌｏｎｉｎｇ　（ａ　１ａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ）“２１７（１９８２）コール
ド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏ１ｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　）
ニューヨーク〕のような常法に従って、例えばプラスミ
ドｐＢＲ３２２の制限酵素Ｐ’ｓｔ　ｌ切断部位に組み
込ませる。得られた組換えプラスミｒを、例えばペルパ
ル（Ｐｅｒｂａｌ　Ｂ、　）の「ア・プラクチカル・ガ
イド・トウーモレキュラり書クローニングＪ　’　Ａ　
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔ。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　’　２６８　（
１９８４）、ジョン・ウィリー・アンＨ＋　、サンズ社
（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｇθｙ主に導入して形質転換させ、テ
トラサイクリン耐性株を選択してｃ　ＤＮＡライブラリ
ーを作製する。

このｃ　ＤＮＡライブラリーについて合成プローブを利
用したコロニー・ハイブリダイゼーション試験〔モント
ゴメリー（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ　Ｄ、Ｌ、　）ら、セ
ル（Ｃｏ１１）１４　６７３（１９７８）：デデル（Ｇ
ｏｅｄｄθＩ　Ｄ、Ｖ、　）ら、ニュークレイツク・ア
シツズ働リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
ｓ、　）　８４０５７　（１９８０）］により目的のク
ローンをスクリーニングする。即ち、グレイらがネイチ
ャー　（Ｎａｔｕｒｅ　）　３１２　７２１　（１９８
４）に報告しているリンホトキシンの４０４から４２１
番目の１８塩基並びに５００から５１７番目の１８塩基
に対応する相補的な塩基配列を化学合成し、ポリヌクレ
オチドキナーゼ（Ｔ４ファージが感染した大腸菌由来Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼ）でプローブの５′末端の
水酸基にｒ−３２Ｐ−ＡＴＰのリン酸を転移させ　３２
Ｆ：標識した２種のプローブを作製する。前述のｃＤＮ
Ａライブラリーの中から両プローブに強く結合するクロ
ーンを選択する。

ここで得られたクローンからプラスミＩＦ　ＤＮＡを分
離し、加熱又はアルカリ変性により単鎖ＤＮＡとしニト
ロセルロースフィルターに固定する。これにリンホトキ
シンｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ画分を加えハイブリダイズ
させた後、結合したｍＲＮＡを溶出回収し、これをアフ
リカッメガエルの卵母細胞に５人し、回収されたｍＲＮ
Ａがリンホトキシンをコードしているか否かを検討する
（以下、ハイブリダイゼーション・トランスレーション
試験といつ）。

以上の方法によりリンホトキシンのｍＲＮＡ　ト相補性
のある塩基配列を含むＤＮＡ断片を組込んだクローン化
ＤＮＡを得ることができる。

更Ｋ、この形質転換株のクローン化ＤＮＡ断片を適当な
制限酵素で切出し、３２ｐで標識したものをプローブと
して用い、前述のｃ　ＤＮＡライブラリーを再スクリー
ニングすることにより、より大きなサイズのｃＤＮＡ　
Ｉｌｆ＋片を選択してもよい。

このようにして得られた、クローン化ＤＮＡ断片につい
て、制限酵素地図を作製し、Ｍ１３ファージによりクロ
ーニングし、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ　Ｆ、）う〔フロ
シーディンゲス・オプΦデ・ナショナノいアカデミ−・
オプ・サイアンシーズ−オデφデ・Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　
）　７４５４６３（１９７７））のジデオキシシーフェ
ンス法に従って塩基配列を解析し、既に明らかになって
いるリンホトキシンのアミノ酸配列をコードする塩基配
列を探し、最終的にリンホトキシンの全翻訳領域に対応
する塩基配列（第１表において１６５番めから６７７番
めまでの塩基配列）を含むｃＤＮＡを選び出すことによ
り、リンホトキシンのアミノ酸配列を含むポリペプチド
をコードする塩基配列を有するクローン化ＤＮＡを得る
ことができる。

■　ＬＴボリペゾチドのアミノ酸配列をコードするｃ　
ＤＮＡの制限酵素による切断 本発明のアミノ酸配列をコーｒするＤＮＡの作製のため
Ｋは第１表に示す全ｃＤＮＡを制限酵素Ｐｖｕ　ｌ［並
びにＫｃｏＲＩを使用し常法に従回収する。このｃＤＮ
Ａ断片は第１表に示す全ｃＤＮＡの１９６番目から８４
０番目までを含む。

＠　形質発現ベクターのボＩＪ　ＩＪンカ一部位の制限
酵素による切断 形質発現ベクターｐＫＫ　２２３−３　（ファルマシア
社）のポリリンカ一部位を先ずＫｃｏＲ（で完全に切断
後ＢａｍＨｌで部分切断し、アガロースデル電気泳動に
よりＢａｍＨＩで部分切断されたベクターとＢａｍＨＩ
で切断されなかったベクターを回収する。更に両者の混
合したベクターをＳｍａ　ｌで完全に切断し、切断部位
がＫｃｏＲｌ　−Ｂａｍ１（ｌサイトのものとＫｃｏＲ
ｌ　−Ｓｍａ　ｌサイトのベクターを作製する。

Ｏ翻訳開始部位とＦｉｃｏＲｌ　−ＢａｍＨｌサイト切
断ｐＫＫ　２２３−３のライプ−ジョンｐＫＫ　２２３
−３のＥｃｏＲｌ　−ＢａｍＨｌサイト切断ベクターと
下記構造のポータプル翻訳開始部位〔末端にＢｃｏＲ１
部位を有するトップ鎖、ＢａｍＨ１部位を有するボトム
鎖（共にファルマシア社より購入）をアニ下ルして作製
〕とをＴ　４　ＤＮＡ　ＩＪガーぜの存在下で反応させ
、再度環状構造をもつベクターを作製する。この再構築
ベクターを大腸菌に形質転換し、アンビシクン耐性菌と
してこの再構築ベクターを含む菌株を選択し、培養菌体
より再構築ベクターを回収する。

［相］　Ｏで作製した再構築ベクターへ■で作製したＬ
　Ｔ　ｃＤＮＡ断片の挿入 Ｏで作製した再構築ベクターをＢａｍＨ■で部分切断後
ウシ腸粘膜由来アルカリフォスファターゼで５′末端の
脱リン酸化を行い更にＤＮＡポリメラーゼ■（フレノウ
フラグメント）で接着末端を平滑末端とする。一方、■
で作製したＬ　Ｔ　ｃＤＮＡのＰｖｕ　ｌ　−ＢｃｏＲ
ｌ断片を平滑末端とし、上記の平滑末端をもつ開環ベク
ターと平滑末端ライダ９−ジョンを行う。反応後閉環し
たベクターを常法に従って回収し大腸菌に形質転換する
。

■　合成オリがヌクレオチドプローブによるスクリーニ
ング ■に示した３２ｐ標識した合成オリゴヌクレオチープロ
ーブと＠で作表した大腸菌の形質転換株とをコロニーハ
イブリダイゼーションし、合成オリゴヌクレオチープロ
ーブとノ飄イブリダイズする菌株を選択する。次いでこ
のコロニーからベクターを調製し、制限酵素により切断
後アガロースデル電気泳動法により目的とする約６５０
　ｂｐと約２５０　’ｂｐのｃＤＮＡ７ラグメントを含
むベクターを取得する。

■で取得した大腸菌の形質転換体をイソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトシド（以下工ＰＴＧと略）培養する。

集菌後、超音波処理で菌体を破砕、Ｔｒｉｓ−ＨＯＩバ
ッファー（−８，０）で抽出、無菌濾過後Ｌ−Ｔ活性を
測定し最もＬＴポリペプチド発現量の多い形質転換体を
スクリーニングする。

■　ＬＴポリペプチド産生大腸菌の培養及び精製■で取
得した形質転換体（ＬＴ産生大腸菌）を工ＰＴＧを含む
培地中でＬＴポリペプチドが十分に産生されるまで培養
する。次いで培養物をリゾチーム消化と凍結融解、超音
波破砕、フレンチプレス、ダイノーミルなどにより破砕
した後遠心分離又は濾過により抽出液を集める。この抽
出液を硫安塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフ
ィー、疎水クロマトグラフィー、デル濾過−ＳＤＳ　−
ポリアクリルアミド電気泳動等の組合せにより精製しＬ
　Ｔ　ＩＩｅＩＪペゾチｒを実質的に純品として得るこ
とができる。

Ｏ■で得たＬＴポリペブチｒに関し、アミノ酸組成及び
Ｎ末端アミノ酸配列を測定した結果実施例に示すように
式（１）から推定される値と一致した。又、等電点は７
．６±０．３であった。

以下実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。

〔実施例〕

実施例１ の調製 ヒト末梢血リンパ球（以下ＰＢＬと略）　１０６４５Ｖ
ｍｌをＲＰＭ工培地中、コンカナバリンＡ（以下Ｃｏｎ
　Ａと略）２０μｙ／ゴにより２日間処理後、０．２Ｍ
のα−メチル−Ｄ−マンノシドにて細胞に結合したＣｏ
ｎ　Ａを可及的に除去した。

他方、ＲＰＭ工培地中で増殖期にあるヒトＴリンパ球系
鹿瘍細胞ｃｃｐｙ−ｃｗｙ　（以下ＯＥＭと略）を遠心
分離で回収し、ＲＰＭ工１６４０−１０　ｍＭ　ＨＥＰ
Ｉ！Ｓ培地中に２×１０６個／Ｍに懸濁し、エメチン塩
酸塩（半井化学社）及びアクチノマイシンＤ（ｐｂバイ
オケミカルズ社）をそれぞれ５　Ｘ　１０”−５Ｍ及び
０．２５μｉ／ｍｌとなるように添加し、６７℃、２時
間処理した後、培養液中のエメチン塩酸塩及びアクチノ
マイシンＤを遠心除去した。

以上のように調製したＰＢＬとＣＥＭを１０：１の割合
で混合後、遠心分離して得た細胞ペレットにＱ、５ｉＪ
の４６％ｇリエチレンクリコール（ＰＥＧ　−１５４０
、和元純薬社）、５　μ９／ｍｌのポリーＬ−アルイニ
ン及び１５係ジメチルスルホキシド含有ＭＫＭ培地を加
え、６７℃、４５秒間ゆっくり攪拌して融合させ、１０
属の２５　ｍＭ　ＨｚＰＥ８（ｐＨ７，２）で緩衝化し
たＭＥＭ培地１０Ｍをゆつくり添加し、遠心した。

細胞ベレットＫ　ＦｊＰＭ工培地全培地、細胞数を１０
６個／ｒ／Ｌｔとし、その１００μｊとフィーダー・セ
ル（ｆｅθｄｅｒ　ｃｅｌｌ　）としてマイトマイシ、
。処理したＣＫＭ　（４Ｘ　１０’個／属）含有ＲＰＭ
工培地１００μｇとを混合し、９６穴カルチヤープレー
トに加え、ＣＯ□５係−空気９５チの雰囲気下、３７℃
で約３〜４週間培養後、増殖した融合細胞を上記マイト
マイシンＣ処理（ＪＭをフィーダー・セルとして限界稀
釈法によりクローン化し、各クローンの増殖後、リンホ
トキシン活性の測定を行った。

なお、培養条件については特に限らない限り、ＣＯ□５
壬−空気９５壬の雰囲気下、３７℃で行った。

本発明に用いるリンホトキシン産生クローン化ヒ）Ｔ細
胞ハイブリドーマＡ−ｃ５−８株を、２．５×１０５個
／′ＩＬｌの細胞濃度でＣｏｎ　Ａ　２０１１＆Ａｌ及
びＰＭＡ　’ｌ　Ｑ　ｎｉ／ｍｌで刺激し、２４時間培
養して得たリンホトキシン活性は２５．０単位／ａであ
つた。他方未刺激のＡ−Ｃｓ−ｓ株のリンホトキシン活
性は４車位／ゴであった。

実施例２ （１）リンホトキシン産生ヒトＴ細胞ノ・イブリドーマ
（Ａ−０５−８）の培養 Ａ−０５−８株を５Ｘ１０’〜１０７個／ｄの細胞濃度
で、ＰＭＡ及び０ＯｎＡをそれぞれ終濃度１００　ｎ、
ｌｉ’／ｄ、　　２０　ｔ４／ｍｌで添加して２．４．
８．２４．４８時間培養した。

（２１全ＲＮＡの調製 Ａ−ｃ５−８株の全ＲＮＡを抽出する方法は主に塩酸グ
アニジン法で行った。すなわち、実施例２−（１）の各
々の培養時間後のＡ−ｃ５−８細胞を１０００　ｒｐｍ
ｚ　　Ｓ分間遠心して集め、ＰＢＳ（５ｍＭのリン酸緩
衝液、３．１５ＭのＮａ１ｌ含有、ｐ！−１７，４）に
懸濁した後、更に１０００　ｒｐｍで５分間遠心して細
胞を洗浄した。

この細胞〔実施例２−（１）の各々の培養時間でそれぞ
れ４ｘ１Ｑ８．６Ｘ１０”、３．２　Ｘ　１０８．１・
８ｘ１０’及び２Ｘ１０９）をホモジネート緩衝液に懸
濁し、ホモジナイズした。このホモジネートに０．０２
５等量の１Ｍ酢酸及び１．５倍量の冷エタノール（−２
０℃）を加え混合後、−２０℃に３時間以上放置した。

これを−１０℃で１５０００　ｒｐｍ　（ＲＰＲ１８−
２ローター、日立製作新製）で３０分遠心分離し、生じ
た沈殿にウオツシング緩衝液（ホモジネート緩衝液１ｃ
　２０　ｎＭＥＤＴＡ４Ｎａ ｎ詰呻拠を更に含有しているもの、以下ＷＢと略）を加
えてピペッティングで均一に溶解後１Ｍ酢酸を加えてｐ
Ｈ５とし、更に冷エタノールを１．５倍量加え、−２０
°ＣＫ３時間以上放置した。これを−１０℃で１５００
　Ｏｒｐｍで３０分間遠心分離し、沈殿をＷ　Ｂに溶解
、１Ｍ酢酸によるＰＨ調整、冷エタノール沈殿を６回繰
返した。

エタノール沈殿物に少量の０．１　％　ＳＤＳを加えて
懸濁し、等量のエクストラクション緩衝液（０，５（１
）　ＳＤＳ　、　０．１　Ｍ　Ｎａ１ｌ、５　Ｑ　ｍＭ
酢酸ナトリウム、５　ｍＭ　肋＃ヰ九含有、ＰＨ５，２
）と２等量の水飽和フェノール［０，１１ｓ−キノリツ
ール含有、１００　ｍＭ　）リス塩酸緩衝１（ｐＨ８，
０）飽和〕−クロロホルムーイソアミルアルコール溶ａ
（体積比５０：５０：１）を加え、１０分間振盪した後
、３０００　ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。三層に分
離した下層を除去し、上層と中間層に等量のクロロホル
ム−イソアミルアルコール溶′１４！Ｌ（体積比５１１
：１）を加え、１０分間振盪した後、３０００　ｒｐｍ
で１０分間遠心分離し、下層を除去した。このクロロホ
ルム−イソアミルアルコール溶液による抽出操作を三回
繰返した。ＤＮＡ、　ＲＮＡ。

糖等を含む上層に３Ｍ酢酸す）　ＩＪウム（ｐ）（５，
２）を０゜１等量加え、２等量の冷エタノールを加え一
２０℃で６時間以上放置後、１５０００　ｒｐｍ（ＲＰ
Ｒ１８−２０−ター）で３０分間遠心分離した。生じた
沈殿に少量の滅菌蒸留水を加えて溶解した後、等量の冷
４Ｍ塩化リチウムを加え、０℃に一夜放置し、１５００
０　ｒｐｍで６０分間遠心分離し、沈殿を少量の２Ｍ塩
化リチウムで洗浄後、滅菌蒸留水を加えて溶解し、１／
１０量の３Ｍ酢明細この浄書（内容に変更なし１ 酸ナトリウム（ｐＨ５，２）を加えた後、２等量の冷エ
タノールを加え、−２０℃で６時間以上放置した。１５
０００　ｒｐｎｎで６０分間遠心分離し、沈殿を０．０
１　Ｍ　）リス塩酸緩衝液（０，５Ｍ　ＮａＣ１，０，
１％ＳＤＳ　、　　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ・３Ｎａ含有、
ｐ）（７−５）に溶解した。欠いで、あらかじめ同緩衝
液で緩衝化したオリゴ（ｄＴ）１２−１８セルロース（
ＰＬバイオケミカルズ社）３！ｊを直径１Ｃ７ｒＬのカ
ラムに充填１−１全ＲＮＡを供給した。同緩衝液で２６
０　ｎｍの吸光度が０．０５以下になるまで洗浄後、更
に０．０１　ｋｉのトリス塩酸緩衝Ｑ　（０，１Ｍ　Ｎ
ａＣ１，０，１％ＳＤＳ　。

１ｍＭ　ＥＤＴＡ・ろＮａ含有、ｐＨ７，５）で貯量を
開始し、２６０　ｎｍの吸光度が０．０５以下になるま
で洗浄した。最後に０．０１　Ｍ　トリス塩酸緩衝ｅ、
（０，１係ＳＤＳ　、　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ・３Ｎａ含
有、ｐＨ７，５）でポリアデニルｅｌｆｓ　合ＲＮＡ　
（ｍＲＮＡ　）　２カラムから溶出し、フラクションコ
レクターで分取し、２６０ｎｍの吸光度が検出される両
分を集合した。２．４．８．２４．４８時間の各時間培
養したＡ−Ｃ５−８！ｊをからそれぞれ５８．１６０．
１８０，１２０、２５８　μＥのｍＲＮＡを回収した。

（３）ＬＴに対応するｍＲＮＡが卵母細胞で翻訳される
ことの確認 約２年令のアフリカッメガエル（メス、体重５０ｇ以上
、日本生物材料センターより購入）に、血清性性腺刺激
ホルモン〔獣医用ビーメツクス注射剤（三共）〕２００
σ／匹の割合で大腿部に筋注した。翌日、氷水中につけ
て麻酔した後、腹部を切開して卵母細胞を採取し、ＭＢ
Ｓ中で単離した。

直径１ｉｒｍ以上の卵母細胞を１個につき実施例２−（
′２Ｊで得たｍＲＮＡをｖｍ蒸留水に溶解（１タ／ｄ　
）Ｌ、５０ｎＡ’（５０ｎｇ）づつマイクロキャピラリ
ーとマイクロインジェクター〔（株）成茂科学器械研究
所製〕を使用して実体顕微鏡下に注入した２０個の卵母
細胞を０．２コのＭＢＳ中２３°Ｃで培養した。又、同
時に滅菌蒸留水のみ５０　ｎ７ずつ注入した卵母細胞２
０個も０．２ＮのＭＢＳ中２３℃で培養した（コントロ
ール）。

２４時間又は４８時間培養後の培養上清のＬＴ活性を測
定した結果、４８時間培養が卵母細胞の最適培養時間で
あることが判明した。更に、Ａ−Ｃ！５−８細胞のＣｏ
ｎ　ＡとＰＭＡの刺激下での培養時間は、２．４．８．
２４．４８時間培培養胞のそれぞれのｍＲＮＡの翻訳さ
れたＬＴ活性が、それぞれ７．８．４．６．４．１．２
．７．０単位／ｒｎ！！となることより、ｍＲＮＡを取
得するためには、２時間培養がＡ−Ｃ５−８細胞の最適
培養時間であることが判明した。コントロールではＬＴ
活性が検出されないことから、ＬＴのｍＲＮＡが卵母細
胞中で翻訳されることを確認した。

実施例２−（３）で決定したＣｏｎ　Ａ及びＰＭＡ刺激
下の最適培養条件でＡ−０５−８細胞を培養し３Ｘ１０
９個の細胞を集めた。この細胞から実施例２−（２）の
方法に潴じてｍ１ｔＮＡを阜離精製し、５１２μｙのｍ
ＲＮＡ画分を得た。

全ｌｌｌＲＮＡ　５１２　μｉをＯ，［ｌ　Ｉ　Ｍ　）
リス塩酸緩衝液上ＤＴＡ・２Ｎ蝿 （Ｑ、Ｑ　ｉ　Ｍ　ｌｉｊＭ情　、０．２係ＳＤＳ含有
、…７．５）会凍か に溶解し、それを同緩衝液に溶解した５〜３０係のシヨ
糖密度勾配溶′ｇＬ！Ｌ５ｍ上に重層し、ＲＰＲ５５Ｔ
−２０８０−ター（日立製作所Ｍ）を使用して２８００
　Ｏｒｐｍで１６時間、１５℃下に遠心した。次いで内
容物を２５本（各２１６μりに分画した。各分画に３Ｍ
酢酸ナトリウムを１／１０量、冷エタノールを２等量加
えて一２０℃で一夜放置し、ｍＲＮＡを沈殿回収した。

回収したｍＲＮＡを滅菌蒸留水で溶解（０，５〜／コ）
し、１００　ｎＪを実施例２−（３１の方法に憔じて卵
母細胞２０個に注入し、０．２麻のＭＢＳで４８時間培
養後、培養上溝中のＬＴ活性を測定した。その結果、分
画Ａ６１３が最大のＬＴ活性を示し、沈降定数の積重マ
ーカー（５８，１８８，２８８）を用いた検量線から、
ＬＴに対応するｍＲＮＡの沈降定数は１２．６Ｓ〜１４
．６８であることが判明した。

ここで得られた精製ｍＦＬＮＡを、以下の実験に用いた
。

精製ｍＲＮＡ　５μｇを使用し、逆転写酵素システム（
３２ｐ　）　にューユイングランド・ニュー　りＩＪア
社）を一部変更してｃＤＮＡを合成した。逆転写酵素反
応緩衝液２０μ１１デオキシヌクレオシｒ・トリ７オス
フ工−ト混合物１０μｌい　りざヌクレアーゼＡインヒ
ビター２０単位、オリゴ（（ｄＴ’　）１２−１８１０
ｔｔｊｉ−、６００ｍＭのβ−メルカプトエタノール５
μ、ｇ、３２ｐ標識ｄＣＴＰ〔比活性８０００１／ｍｍ
ｏｌ　（１００μｏｉ　）、　］、ｍＲＮＡ　５１１＃
。

５０単位トリ骨髄性白血病ウィルス由来逆転写酵素の系
で１００μｌの容量で、４２℃、１時間反応させた後、
氷冷して反応を停止し、遠心後ｍＲＮＡとｃＤＮＡのハ
イブリッドを、沸騰水浴中で３分間の熱処理で分離し、
氷水浴中で５分間急冷した。

変性した蛋白を１２０００Ｘ、！９，２分間の遠心でペ
レットとし、再度氷冷した。この反応終了液９９μｌに
水冷下で１６．２μｌの滅菌蒸留水、ＤＮＡポリメラー
ゼ■反応緩衝ｆｉ４６．８μ１１デオキシヌクレオシド
・トリフオスフェート混合物明細書の汀ｌ；（内容に変
更なし） １０．４μ７，３２ｐ標識ｄｃＴＰ　（８００Ｃｉ　／
　ｍｍｏｌ（１００μＣ１）〕及び１５．６μｌの大腸
菌由来ＤＮＡポリメラーゼＩ　（８［］００単立／ｍｌ
）を加え、１９８μｌとして、よく攪拌、遠心後、１５
℃で２０時間反応させた。この反応終了ｇ！Ｌ１９７μ
ｇに０．２　Ｍ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ　（３９，４μｌ）
を加え反応を停止後、１Ｎ　ＮａＯＨ（４９，２５μｌ
）を加え、６５°Ｃで１時間アルカリ加温処理を行い、
ｍＲＮＡを分解し、水冷、遠心後に１Ｍトリス塩ぼ緩衝
液（４９，２５μ＃、ｐ）１８．０）及び１Ｎ　ＨＣＩ
（４９，２５μｌ）を加えて中和した。

これを１／２等量の水飽和フェノールと１／２等量のク
ロロホルム−イソアミルアルコール（５０：１）で抽出
し、遠心後の上層を分取し、下層に等量の１０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液Ｃ１００ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ・２Ｎａ含有、ｐＨ８，［］　］を加えて再抽出を行
い、その上層も分取した。分取した両上層を等量のクロ
ロホルム−イソアミルアルコールで抽出し、遠心分離後
下層（有機層）を除去した。この抽出操作を４回行った
後に等量の水飽和エチルエーテルで３回抽出を行い、有
機層な除去後、６０℃水浴で加温処理して混在するエチ
ルエーテルを除去した。

この水層を第２ブタノールで濃縮し、終濃度０．０１　
ＭのＭｇＣ！１２と２等量の冷エタノール（−２０℃）
を加え、−８０°Ｃで一夜放置した。

１２０００Ｘ、９で１０分間遠心後の沈殿を減圧下で乾
燥した後、滅菌蒸留水５０μｌに溶解し、逆転写酵素反
応緩衝Ｍ２０μＪ、６００ｍＭβ−メルカプトエタノー
ル５μ１１デオキシヌクレオシド・トリフオスフェート
混合物１０μｌ及び３２ｐ襟ＲｄｃＴＰ　（８０［］　
Ｏ１／ｍｍｏ’ｌ　（１ｆｌ　Ｏμｃ１）　Ｊを加えよ
く攪拌遠心後５μｌの前述の逆転写酵素を添加後、４２
℃１時間反応させた。水冷下で反応を停止し、ヘアぎン
構造を持つｃ　ＤＮＡを得た。

上記反応／ＶＬ９９μｌｌＩｃ滅菌蒸留水９２，１μ１
１前述のＤＮＡポリメラーゼＩ反応緩衝ｆｉ２３．４μ
１１Ｓ１ヌクレア一ゼ反応緩衝孜５５μ１１アスペルギ
ルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａ
ｅ　）由来Ｓ〕ヌクレアーゼ（５０単位／Ｉｌｌ　）　
５．５μｌを加え３７℃、３０分間反応し、ヘアピン構
造を切断して２重鎖ｃＤＮＡを得た。この溶液に０．１
　Ｍ　）　’Ｊスε１）ＴＡ・２−＆ 塩酸緩衝液〔０，１Ｍｇｆ肉ｉＮｔ含有、ＰＩ−１７，
５］を４６μｌ加え、ベラげ容量２０ｄのセファクリル
Ｓ−２００カラム（１，０ｘ２５ｃｍ）に供給し、１０
祉トリス塩酸緩衝１ａ　ＣＯ，Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１，１ｍ
Ｍずつ分画し、空隙元付近に溶出した分画を第２ブタノ
ールで濃縮を行い、エタノール沈殿によりｃＤＮＡを回
収した。

上記により得られた二重鎖ｃＤＮＡに次の組成の反応緩
衝液１６０μｌを加えろ７°Ｃで５分間反応させ二重ｄ
Ｊ　ｃＤＮＡにオリゴ（ａＣ）テールを付加させた。

反応緩衝液は、２ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭの０ｏＯ１２、
ＯＩ’２５　ｍ９７　ｍ／！のＢＳＡ、５μＭのａＯＴ
Ｐ、　　３Ｈ標識ｄＯＴＰ　Ｃ２５Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ　
（１５μｃｉ、　）　）及び３０単位ターミナルデオキ
シヌクレオチジルトランスフエラーゼを含有する０、２
Ｍのカコジル酸カリウム−２５ｍＭ　トリス塩酸緩衝Ｑ
　（ｐＨ６，９）である。

反応は水冷下で停止させ、等量の水飽和フェノール−ク
ロロホルム−イソアミルアルコール（５０：５０：１）
を加えて抽出し、再度クロロホルム−イソアミルアルコ
ール（５０：１）で抽出し、４０μｙの大腸菌由来リボ
ゾームＲＮＡ及び１１５０ｆｔの５　Ｍ　ＮａＣ！ｌを
加え、２等量の冷エタノールを加え、−８０℃で一夜放
置した。遠心分離でオリゴ（ａＣ）テール付加ｃＤＮＡ
を回収し、滅菌蒸留水に溶解し、０．５ｎｇ／μｌの濃
度とした。

オリゴ（ａａ）テール付加（！ＤＮＡ　１．３７５　ｎ
ｆｉをオリゴ（ｄ　Ｇ　）１０−２０テール付加ｐＢＲ
３２２ＤＮＡ１０　ｍＭ　トリス塩酸緩衝Ｑ　（ｐＨ７
，８）　〕２５μｌ中で６５℃、１５分間インキュベー
ト後インキュベーターを４５℃に設定し、４５℃になっ
た後さらに２時間インキュベート後、氷冷してアニーリ
ングを行い、組換え体シラスミド溶成を調製した。

（４）形質転換体の選択 上記で得られた組換体プラスミド溶成を用い、−、ｌ、
、％ａ”＋嘩ＨＢ１０１株を形質転換させた。即ち、尺
Ｐ４１Ｌ ノ曹＝：ｑピＪＨＢ１０１株を、０．１係グルコースを
含むＬ−プロス１Ｑｍｌ中、３７℃で吸光度（６５０ｎ
ｍ　）が０．０５となるまで培養し、この５ｍｌ’ｌＯ
Ａ％グルコースヲ含ｂ　Ｌ　−フロス５００　ｍｌに加
え、２５℃で吸光度（６５０ｎｍ　）が０゜３となるま
で培養した。３０分間水冷後、３０００　ｒｐｍ　（Ｒ
ＰＲ９−２ｏ−ター；日立製作新製）、４℃で５分間遠
心して集菌した。この菌体を冷５　Ｑ　ｍＭ　０ａＣ１
２２５Ｑ　ｍｅに分散し、１５分間氷冷した。４℃、５
分間、２５０　Ｏｒｐｍ　（ＲＰＲ９−２０−ター）で
集菌し、２０チグリセロールを含有する５　Ｑ　ｍＭ　
ＣａＣｌ２２５　ｍｌに分散し、１ゴずつ分注し、ドラ
イアイス粉末で凍結後−８０℃に保存した。この保存菌
体分散液を水冷下で解凍し、その肌３ｍ７！に前述の組
換え体シラスミド溶敲０．１５７ｄ及び２　Ｑ　ｍＭ　
ＣａＣｌ２−６０　ｍＭ　ＭｎＣｌ２−２０　ｍＭ　Ｒ
ｂ０１　％　孜０．１５　ｍｌを混合し、０°Ｃｌ２Ｏ
分間靜重し、更に室温で１０分間靜置後、あらかじめ３
７℃に温めた０、１幅グルコース含有し−ブロス２゜４
ｄを添加混合し、３７℃、１時間振盪培養を行った。こ
の培養液の一部を取り、前述の成分の他にテトラサイク
リン１５μ、！、Ｉ　／ｍｌを含有したＬ−ブロス寒天
平板に広げ３７℃で約１２時間培養し、テトラサイクリ
ン耐性菌を選択してｃＤＮＡライブラリーを作製した。

前記のｃＤＮＡライブラリーについて、ＬＴをコーｒす
るｃＤＮＡを含むデラスミｒを持つ形質転換体をスクリ
ーニングするために、３２ｐ標識合成ｃＤＮＡプローブ
を用いるコロニー・ノ・イブリダイゼーション試験を行
った。合成ｃ　ＤＮＡプローブは、クレイらがネイｆ　
’ｔ’　−Ｃ（Ｎａｔｕｒｅ）Ｌ上ｌ　７２１（１９８
４））に報告しているＬＴ遺伝子の４０４から４２１番
目の１８塩基 （５’−ＧＴＣＴＡＯＴＣＣＣＡＧＧＴＧＧＴＯ−３’
　）並びに５００から５１７番目の１８塩基に対応する
相補的な塩基配列（５’　−ＣＡＣＡＴＧＧＡＡＧＧＧ
ＧＴＡＣＴＧ−３’　）を化学合成し、；＃由来Ｔ４ポ
リヌクレオチドキナーゼとγ−３２ｐＡＴＰ　Ｃ５μｏ
ｉ／ｐｍｏｌｅ　（２０μＣ１）〕を用いて、５０　ｍ
Ｍ　）リス塩酸緩衝ｉ’［ｉ　ｒ　１０　ｍＭ　ＭｇＣ
ｌ２．５　ｍＭ　ＤＴＴ　、　　０．１　ｍＭスペルミ
ジン、３．１ｍＭＥＤＴへ・２Ｎａ 加力時り含有、ｐ）１７．６）中、３７℃、３０分間反
応させた。

反応はＥＤＴＡ溶蔽を添加し、０℃に氷冷することで停
止した。この２種の３２ｐ標識ｃＤＮＡ　７″ローブの
両方に弱い条件で、ノ・イブリダイズする組換え体シラ
スミドを有する形質転換体を選別した。

約１万個のコロニーから６個のコロニーが選び出された
。

次にこの選択された６つの菌株から組換え体プラスミ１
を分離し、制限酵素Ｈ１ｎｄ　ＩＩＩで、切断し、アガ
ロ−スケ９ル電気泳動を行い、ニトロセルロースフィル
ターにトランスファージ、再度３２ｐｓｉ合成ｃＤＮＡ
プローブと厳しい条件でハイブリダイズした。その結果
、１個のクローンが選択された。

次にこの選択された菌株についてノーイブリダイゼーシ
ョントランスンーション試験を、マニアチス（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ　Ｔ、　）らのモＬ／　＊　ニラ−’　り０−
　ユング（’　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｏｌｏｎｉｈｇ　
／／３２９　（１９８０）、コール−・スプリング・ハ
ーバ−・ラボラトリ−）に記載の方法に従って行った。

この形質転換体よりプラスミドＤＮＡヲ抽出シ、ニドｏ
　セルＯ−スフイルター上に加熱変性させた後に固定し
、これに実施例２−（４）で得たＬ　Ｔ　ｍＲＮＡを含
むｍＲＮＡ画分を加え５０℃で３時間反応させ、ハイブ
リダイゼーションを行った。結合したｍＲＮＡを溶出回
収した後、実施例２−（３）の方法に従って卵母細胞に
注入し、回収されたｍＲＮＡがＬ　Ｔ　ｍＲＮＡである
か否かを検定した。

その結果、ｐＬＴ　１３の場合は１０Ｕ／ゴのＬＴが検
出されたが、ｐＢＲ３２２を使用したコントロールでは
ＬＴ活性が認められなかった。

このｃ　ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ　Ｉｌｌで切断し、
アガロ−スケ９ル電気泳動でその大きさを調べたところ
、約１．３５　Ｋｂｐのｃ　ＤＮＡ部分を有していた。

このｃＤＮＡを含む形質転換体（菌体査号：ＬＴ１３、
クローン化ＤＮＡ番号：　ｐＬＴ　１３　）について、
クローン化ＤＮＡを単離し後述の方法で塩基配列を決定
した。

実施例４ （１）制限酵素地図の作表 実施例３−（５）で得られた菌株（ＬＴ１３）を０．１
チグルコース及び１５μｇ／ｍｌテトラサイクリン含有
Ｌ−プロスで培養して菌体を得た。この菌体からプラス
ミドＤＮＡを回収し、次項で述べる限酵素地図を作製し
た。第１図参照。

クローン化ＤＮＡの塩基配列の決定はメッシング（Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ　）らの方法〔ジーン（Ｇｏｎｅ　）　１９
２６９、（１９８２）］に従ってｃＤＮＡ断片をＭ１３
、］１ｐ８またはｍｐ　９でサブクローニングした後、
サンガー（Ｓａｎｇθｒ）らの方法〔グロシーディング
ス・オブ・すゞ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイ
アンシズｅオブ・デ・ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　）　７４　５４６３　
（１９７７）ジャーナル・オブ・モレキュラー費バイオ
ロジー（１，Ｍｏｌ　Ｂｉｃ＋１．　）　１６２　７２
９　（１９８２）］のジデオキシ・チェイン・ターミネ
ーション法により、プライマーのアニール、ＤＮＡポリ
メラーセ゛Ｉのフレノウフラグメントによる相補釦合成
（３２Ｐ標識ｄｃ！ＴＰ　ｒ　８Ｑ　Ｑ　Ｏ１／ｍｍｏ
１　（２０μｃｉ　）　〕で標識）ｒルミ気泳動及びオ
ートラジオグラフィーから決定した。

第２図に塩基配列の決定に用いた制限酵素切断部位と塩
基配列を決定した方向及び範囲を矢印で示す。矩形で描
いた部分はＬ　Ｔの翻訳領域をコードする部分を示す。

その塩基配列は第１表の通りである。第１番目のＣの上
流に１６個のＧ連動テール、第１６１０番目のＴの下流
に１８個のＣ連鎖テールがあり、ベクターと付加すると
きに合成したホそポリマーである。第６６から６７７７
７番目　Ｔの前駆体乞構成するに必要なポリペプチドを
コードすると推定される塩基配列である。

このうち第１６５番目からがＬＴをコードしていると考
えられ、グレイ（Ｇｒａｙ　Ｐ、Ｗ、　）らがＣネイチ
ャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　３１２　７２１　（１９８４
））に報告したＬＴとは、２６番目のアミノ酸がＴｈｒ
（ＡＣ！Ｏ）であるのに対し、Ａｓｎ　（ＡＡＣ！　）
である点が異なっている。Ｃ末為アミノ酸（ロイシン）
のコドンに続いて、終止コドン（ＴＡＧ　）がある。ま
たベプチげコーＶ部位以外に第１〜４番目ＧＯＴＯがＣ
ＧＧＧに、第８６２〜８６５番目０ＡＯＡがＡＣＡＣに
第１３０６〜１３１０番目ＴＧＡＡＡがＣＣＣＣＴにお
いて異なっている。

実施例５ （１）　ｐＩ、’ｒ　１３のｃＤＮＡ断片の制限酵素に
よる切断部ｃＤＮＡの構造から考えられる制限酵素の中
でＰｖｕ■（１９０９０番目びにＫｃｏＲＩ　（８３８
番目）を使用し、常法に従ってｐＬＴ　１３を切断し、
１．５％アガロースデル電気泳動を行い、約６５０　ｂ
ｐのｃＤＮＡ断片をアガロ−スケゞルから抽出し、水飽
和フェノール抽出、クロロホルムイソア図面の浄書（内
容に変更なし） ミルアルコール抽出を行い、エタノール沈最によりｃ　
ＤＮＡ断片を回収した。このｃＤＮＡ断片はｆ−ＴのＮ
末端アミノ酸ＬｅｕのコＦ　７　ＣＴＣの最初の塩基で
あるＣから２８塩基Ｎ末端側を欠いたところからストッ
プコドンの下流１６４塩基までを含む断片である。

ｐＫＫ　２２３−３　（４５８５ｂｐ　）のポリリンカ
一部位を先ずＥｃｏＲｌで完全に切１析後ＢａｍＨｌで
部分切断し、１．５％アガロ−スケ゛ル電気水動ンζよ
りＢａｍＨｌで完全に切１＠されたと考えられる１）Ｋ
Ｋ　２２３−３のＤＮＡ断片と全分離し、アガロースデ
ルヨリ抽出、フェノール抽出、クロロホルムインアミル
アルコール抽出後エタノール沈殿を行って、ＢａｍＨｌ
で部分切断されたプラスミドと、ＢａｍＨｌで切断され
なかったベクター全回収した。

更に両者の混合されたプラスミドｆ　Ｓｍａ　ｌで完全
に切１所し、切１所部位がＥｃｏＲｌ　−ＢａｒｎＨｌ
サイトのものとＥｃｏＲｌ　−Ｓｍａ　ｌサイトのもの
とした。

実施例５ｉ２）で得たｐＫＫ　２２３−３のＥｃｏＲ１
−ＢａｍＦ（Ｉサイト切断ベクターと、あらかじめトッ
プ鎖とボトム鎖を肌０１　Ｍ　）　ＩＪス塩酸緩衝液（
０，１Ｍ　ＮａＣ１，０，１、ｍＭ　ＥＤＴＡ含有、ｐ
Ｈ７，８〕中で６５°Ｃ，５分間加熱後水浴を３７℃に
セットして、さらに１時間放置し、室温で２０分間放置
し、アニールさせた後に一２０°ＯＫ保存したＰＴＩＳ
をＴ４ファージ感染大腸菌由来のＤＮＡ　ＩＪガーゼを
用いて５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（１１］ｍＭＭｇＣ１
２，１０ｍＭジチオスレイトール、ｌ　ｍＭ　ＡＴＰ全
含有、ｐＨ７，６Ｅ中で１４°Ｃにて一夜反応させ、再
度環状構造をもつベクターを作製した。この再溝渠プラ
スミドを常法に従って大腸菌のＪＭ１０５株に形質転換
し、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地に播き、アンぎシリ
ン耐性菌として、この再構築プラスミドを含む菌体を選
択し、常法に従ってシラスミドを調製した。このシラス
ミドをＰＰ−３と命名した。

まず実施例５−（３１で得たＰＰ−３をＢａｍＨｌで部
分切断し、ウシ腸、粘膜由来アルカリフォスファターゼ
（ファルマシア製）を用いて５３　ｍＭ　トリス塩酸緩
衝’ｆ４　Ｃ１ｍＭ　ＭｇＣｌ２．０．１　ｍＭ　Ｚｎ
Ｃｌ２．１ｍＭスペルミジン含有、ｐＨ９，０Ｅ中ろ７
°Ｃ１６０分間反応させ、５′末端の脱リン酸化を行い
、水飽和フェノール抽出、ＣＩＡ（クロロボルム・イソ
アミルアルコール）抽出を行い、エタノール沈殿で開環
プラスミドを回収後、ＤＮＡポリメラーゼＩ（フレノウ
フラグメント）を用いて接着末端を平滑末端にし、水飽
和フェノール抽出、ｃ工人抽出後エタノール沈殿にて回
収した。

一方、実施例５−（１］で得たｐＬＴ　１３のＥｃｏＲ
１−Ｐｖｕ　ＩＩ　−７ラグメントをＤＮＡポリメラー
ゼ１（フレノウフラグメント）で平滑末端とし、フェノ
ール抽出、ＣＩＡ抽出後エタノール沈殿で回収し、上明
細書の浄書（内容に変更なし） 記の平滑末端全もっ開環プラスミドと、ＤＮＡ　１．Ｉ
　Ｎ−ゼ存在下１６°Ｃｌ２Ｏ時間で平滑末端ライヶ嗜
−ンヨンを行った。反応後、閉環したシラスミドを水飽
和フェノール抽出、ＣＩＡ抽出、エタノール沈殿で回収
し、大腸菌ＪＭＩ　口５株に常法に従って形質転換し、
アンビンリン耐性により、５３［］０個の形質転換体を
選択した。

実施例５−（４）で得た形質転換体を実施例３−（５１
に示した方法に従って３２Ｐ標械した合成ｃＤＮＡプロ
ーフとコロニーハイブリダイゼーンヨン試験によりスク
リーニングし、１００個のコロニーを選択した。このコ
ロニーの２０個から、常法に従ってシラスミドを調製し
、制限酵素（ＢａｍＨＩ　。

Ｈｉｎｄ　Ｉ■）Ｋよって切断後、アガロ−スケゞル電
気体動を行い、目的とする約６５０　ｂｐと約２５０ｂ
ｐ　ノＤＮＡフラグメントを含むプラスミドを検索した
。その、′＠果、目面とする３１固のコロニーを選択し
た。

明細書の浄、誤内容に変更なし） 実施例５−（５で得た３つの形質転換体のうちのひとつ
を用いて、ＬＴ発現を行った。この菌体に組み込まれた
プラスミドのｔａｃプロモーターは宿主である大腸菌Ｊ
Ｍ１０５株内では抑制されてぃ〜るが、工ＰＴ（）の添
加で抑制全解除できる。そこで、この形質転換体をＩＰ
ＴＧ　Ｑ〜１１１ＩＭを含むＬＢ培地（組成：１１当シ
バクト一トリプトン１０ｇ１バクトー酵母エキス５ｇＮ
ａＣ１１０９：ｐＨ７〜７．５；アンピシリン２５ｍ９
を含む）で０、Ｄ、５５０　ｎｍが１．１〜１．２にな
るまで培養シタ。

遠心にて集菌後、リン酸緩衝液で緩衝化した生理食塩水
（以下ＰＢＳと略）で洗浄し、遠心にて集菌した後再度
ＰＢＳでＯ，Ｄ、　５５０　ｎｍが１．０となる様に懸
濁した。この懸濁液の超音波処理を行い菌体を破砕した
。この菌体破砕画分の無窮濾過を行い、ＬＴ活性を測定
した。ＩＰＴＧ無添加の場合０．２６　Ｘ　１０’　Ｕ
／ｒｎｌのＬＴ活性が認められ、ＩＰＴＧｏ、０１　ｍ
Ｍ、　０．１　ｍＭ、　　１　ｍＭ添加の場合、それぞ
れ１１Ｘ１０’、１０　Ｘ　１０’、１５　Ｘ　１０’
　Ｕ／ｍｌの活性を認めた。一方、コントロールとじて
ｐｘｘ　２２３−３を組み込んだ菌体に対して同様の操
作を行ったがＬＴ活性は検出されず、組換体プラスミｒ
に由来するＬＴ活性の発現であることを確認した。ここ
で使用した形質転換体の菌体番号をＬ　Ｔ　１３　ｔａ
ｃ　ｔ５、組み込んだプラスミドをｐＬＴ１３ｔａｃ　
（５と命名した。第３図はｐＬＴ　１６ｔａｃ　６の構
築工程を示す； 実施例６ 形質転換体Ｌ　Ｔ　１３　ｔａｃ　６株を７’ｏリンを
除く１９種類の必須アミノ酸を含むＭ９ｆｔｋ小培地で
一夜培養し、この培養液を１０倍量のＬＢ培地に接種し
、２．５時間後に工ＰＴＧを最終濃度３．１ｍＭになる
ように加え、更に３時間培養を継続したのち限外濾過及
び遠心分離により菌体を集めた。菌体９０．９　（ｗｅ
ｔ　）を３　Ｑ　ｍＭ　Ｎａ１ｌ及び０．０１　ｍＭｐ
−ＡＰＭＳＦ　Ｃ（ｐ−Ａｍ１ｄｉｎａｐｈｅｎｙｌ　
）　ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　Ｆｌｕｏｒｉｄ
ｅ　Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ　：　　（ｐ−アミジ
ノフェニル）メタンスルホニルフルオライド塩酸塩；和
光純薬裂〕を含む５　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＭＯＬ　（
ｐＨ８，０）　３０　［１ゴに懸濁し、超音波処理によ
り破砕後、遠心分離により菌体残置を除いた上溝液を粗
抽出液とした。粗抽出＆３４７．５７ｄの全ＬＴ活性は
１２．２ｘ　１０８　Ｕ、比活性は９　ｘ　１０’　Ｕ
／ｍ９ｐンパクであった。

実施例７　　ＬＴポリペプチドの精製 （１）硫安塩析 粗抽出ｉ３４７ｍＪｉｃ硫酸アンモニウムを５℃で４０
係飽和になるように添加し、３０分彼達心分離し、沈殿
部を５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７，４”）Ｃ以下Ｆ
Ｂと略〕１００属に溶解し、４１のＦＢに対し４回透析
し、透析後順を硫安塩析試料とした。硫安塩析試料１１
７ｒｎｌの全ＬＴ活性はｆ　１．７ｘｌ　０８Ｕ、比活
性は４．６Ｘ　Ｉ　Ｃ１”　Ｕ　／１ｎｙタンパクであ
った。

（２）陰イオン交換クロマトグラフィー５ｍＭＰＢ（ｐ
）（７，４）であらかじめ平衡化したＤＪ！ＡＫ−セフ
ァローズＯＬ−６Ｂ　（ファルマシア社）のカラム（２
，６ｘ３４ｃｎＬ）に硫安塩析試料１１６ｍｌを付し、
次いで５ｍＭＦＢ（ｐＨ７，４）４ＤＯｍｌでカラムを
洗浄したのち食塩濃度を０から０．６Ｍまで連続的に上
昇させ溶出した。溶出級は２５Ｍずつに分画し、各画分
のＬＴ活性を測定し活性を有する画分を回収した。回収
成約１０００ｄを分画分子量１０，０００の限外濾過膜
（ミリボア社製）を用いて８８ＮＫ＠縮した。

この濃縮液をｎＫＡＫ分画液とした。ＤＥｉＡＥ分画液
の全ＬＴ活性は４．４　Ｘ　１口８Ｕ１比活性は８．２
７Ｘ１０６Ｕ／■タンパクであった。

（３）疎水クロマトグラフィー ＦＢ８であらかじめ平衡化したフェニルセファローズ０
Ｌ−６Ｂ（ファルマシア社）のカラム（２，６Ｘ　１４
ｃＩｒＬ）　Ｋ　ＤＦｊＡＥ分画液８分画液８教せ、次
いでエチレングリコール６０係を含む１　０ｍｎｐ：ｓ
　（ｐＨ７．４）　１　５０′ＩＬＩ！で洗浄した後、
エチレングリコール濃度を３０係から７０係まで連続的
に上昇させ溶出した。溶出液は１５ｄずつに分画し、Ｐ
ＢＳに対し透析後各両分のＬＴ活性を測定し活性を有す
る両分を回収した。回収液６０８ゴを上記限外濾過法で
９．４ｍｔＫ濃縮、この濃縮液をフェニル分画液とした
。フェニル分画液の全ＬＴ活性は３．９４Ｘ１０８Ｕ，
比活性は５、６　３　Ｘ　１　０７単位／ｍ９タンパク
であった。このフェニル分画液を０．１％ＳＤＳ　７含
むポリアクリルアミｒデル電気泳動（　５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ　）で分析した。

〔レムクー（　Ｕ．に、　Ｌａｅｍｍｌｉ　）　；ネイ
チャー（　Ｎａｔｕｒｅ　）　２　２　７　　６　８　
０　（　１　９　７　０　）　］　。分分子的１７，５
００のタンパクビーフ（銀染色で位置確認）にＬＴ活性
が存在した。（尚、５ＤＳ−ＰＡＧＥの分子量マーカー
は次のとおり。Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙ）ａθθＢ　：　Ｍ
　Ｗ　９　４，０　０　０、ＢＳＡ　：　Ｍ　Ｗ　６　
７．０　０　［］Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ　：　Ｍ　Ｗ　４
　３＋０　０口、（：！ａｒｂｏｎｉｃＡｎｈｙｄｒａ
ｓｅ　：　Ｍ　Ｗ　３　０＋Ｏ　Ｏ　０１Ｓｏｙｂｅａ
ｎ　Ｔシｙｐｓｉｎ工ｎｈｉｂｉｔｏｒ　　：　　ｙｔ
　　ｗ　　２　　０，０　　０　　０　　、　　ａ　　
−　　Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ：ＭＷ１４，４００） 夾遍ｊ」 フェニル分画液を更に限外濾過で４倍に′ａ縮し、その
０．５ｍｌを５ＤＳ−１−ＰＡＧＥ　（デル平板：１、
５朋Ｘ１６ｃｍＸ１４α）を用いて分画後、分子　　１
量１　７，５　０　０に相当するｒル断片を切り出し、
μり又−７でチー１１番鑓・クー ＃１轄。　　　　　　−−＝（　ｐＨ　８．６　）で抽
出したこの操作をくり返して抽出液を集め分画分子量５
，０００の限外濾過膜（アミコン社製）で濃縮し、次い
で透析した。これをａ製ＬＴポリペプチドとした。この
精製ＬＴポリペプチドに関しアミノ酸組成、Ｎ末端アミ
ノ酸配列、等電点を測定した。

梢製ＬＴポリペプチドを減圧乾固後６Ｎ　ＨＯＩを加え
て１１０℃、６時間加水分解した。次いでフェニルイン
チオシアネートと反応させＰＴＯ−アミノ酸とした後、
アミノ酸分析計（逆相分配法、ウォーターズ社製）にて
組成分析を行った。トリプトファン及びシスティンはイ
ングリス（Ａ、Ｓ。

工ｎｇｌｉＢ）の方法〔メンツズ　イン　エンディモロ
シイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　
）、ｖｏｗ　９１、ｐ　２ｔ５　ｅｄ、　ｂｙ　Ｏ，Ｈ
，Ｗ、　Ｈｌｒｓ　ｅｔ　ａｌ、　ＡｃａｄｅｍｉｃＰ
ｒｏθθ、１９８３）に従って定量した。結果ケ第２表
に示す。

第２表　　ＬＴポリペブチげのアミノ酸組成工ＬＥ　　
　　　　　　２．８　　　　　　　　３ＶＡＬ　　　　
　　　　９．１　　　　　　　　９ＬＥＵ　　　　　　
　２１．５　　　　　　　２１ｐＨｚ　　　　　　　　
９．９　　　　　　　１００ＹＳ　　　　　　　＜０．
１　　　　　　　　０ＭＰＴ　　　　　　　　３．９　
　　　　　　　４ＡＬＡ　　　　　　　１５．０　　　
　　　　１５ＧＬＹ　　　　　　　　８　、６　　　　
　　　　９ＴＨＲ７，７８ ＴＲＰ　　　　　　　　Ｌ６　　　　　　　　２ｓｐＲ
２０，５２０ ＴＹＲ６，８７ ＰＲＯ１２，４１３ Ｈ工Ｓ　　　　　　　１０．３　　　　　　　１０ＬＹ
Ｓ　　　　　　　　６．１　　　　　　　　６ＡＲＧ　
　　　　　　　２．７　　　　　　　　３分析値は、Ｌ
Ｔポリペプチドをニー）’　ｆ　ルＤＮＡの塩基配列か
ら推測されたアミノ酸組成と良く一致した。

Ｎ末端アミノ酸配列はニーマン（Ｅｄｍａｎ　）法’；
：　Ｐ、　Ｅｄｍａｎ　ｒアーキテクチュア　バイオケ
ミストリイ　アンド　バイオフイソックス（Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　）　　、　
　２　２　　　４　７　５（１９４９）］により測定し
た。

ＬＴポリペブチｒ（約１００μｇ）をフェニルインチオ
シア坏−トとカップリング反応させ、次いでＮ末端アミ
ノ酸を２−アニＩＪノー５−チアゾリノン誘導体として
切断し、更にフェニルチオヒダントイン−アミノ酸に変
換し、これを０１８逆相カラムを用いたＨＰＬＯ（ウォ
ーターズ社Ｍ）により同定しＮ末端部分のアミノ酸を決
定した。さらに、この操作を順次くり返すことにより、
Ｎ末端部分のアミノ酸配列を決定した。この結果、ＬＴ
ポリペプチドのＮ末端部分のアミノ酸配列はＭＥＴ−Ａ
ＳＰ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＧＬＮ−Ｔ）ｉＲ−ＡＬＡ−Ａ
ＲＧ−ＧＬＮ−Ｈ工Ｓ−ＰＲＯ−Ｌｙｓ−ＭＥＴ−ａｌ
５−ＬＥｔｙ　　ＡＬＡ　　Ｈ工Ｓ−８ＦＪｔ−ＡＳＮ
−ＩＪＵ−ＬＹＳ−であった。

ＬＴポリペブチげの等電点を…範囲５．０〜８．０のフ
ァルマライト（ファルマシア社）と５冬ポリアクリルア
ミドを含むフラットデルを用いた等電泳動は２０００ボ
ルト、４゜５時間で行った。ケ０ルを３ｎ間隔に切り出
し、ＰＢＳ　（ｐＨ７，４）　テ抽出し、ＬＴ活性を測
定した結果ｐＨ，７，６±０．５にＬＴ活性を認めた。

尚ＰＨママ−−として、β−ラクトグロブリンＡ　（ｐ
工５．２０　）ウシ力ルポニックアンヒρラーゼＢ（ｐ
工５．８５　）　、ヒトカルボニックアンヒドラーゼＢ
（ｐ工６．５５　）ウマミオグロビン−酸性側バンド（
ｐ工６．８５　）　、ウマミ゛万グロビンー塩基性側バ
ンド（ｐエフ、３５　）を用いて検量線を作成した。

〔発明の効果〕

以上に説明した様に、得られた本発明の生理活性ポリペ
ブチｒは、リンホトキシン活性をもち、実質的に不純物
を含まない新規な生理活性ポリペブチＶである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明実施例による制限酵素地図を示す概略
線図、 第２図は、本発明実施例による塩基配列の決定に用いた
制限酵素切断部位と塩基配列を決定した方向および範囲
を示す概略線図である。 ｋ−１４１ＥｃｏＲＬ Ｂ・・・叶？鼠　Ｅ・・・−叫　Ｐ・・・Ｐｓｔ　Ｉ第
３図は実施例５のｔａｃプロモーター付形質発現プラス
ｉ　Ｖ　ｐＬＴ　１３　ｔａｃ　６の構築工程を示す。 矢印はプロモーターの動く方向を示す。 特許出願人　　電気化学工業株式会社 第１図 第２図 図面の浄書（内容に変更なし） 第３図 ｐＬＴ１３ｔａｃ６ 手続補正書 昭和６１年８月２１８

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）次式 【遺伝子配列があります】 で表されるアミノ酸配列を有する生理活性ポリペプチド
   。