KR910000460B1 - 인간의 콜로니 자극인자(CSFs)에 대한 유전자 암호화 - Google Patents

Abstract

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Description

인간의 콜로니 자극인자(CSFs)에 대한 유전자 암호화

제1도는 λcM5의 cDNA의 제한효소에 대한 도면.

제2도는 (제2a도∼제2d도)는 M13파지를 사용한 다이데옥시뉴클레오타이드 사슬 종지법과 맥삼-길버트(Maxam-Gilbert) 화학적 변이법으로 측정한 cDNA의 뉴클레오타이드의 서열도.

제3도는 (제3a도와 제3b도)는 cDNA에 의하여 암호화된 M-CSF 전구 단백질의 1차 구조도.

제4도는(제4a도∼제4d도)는 λcM11의 cDNA의 뉴클레오타이드의 서열도.

제5도는(제5a도∼제5c도)는 λcM11 cDNA에 의하여 암호화된 M-CSF 전구 단백질의 1차 구조도.

제6도는 COS 세포 표시 벡터(Vector)pcDE를 제조하는 방법을 나타내는 도표.

제7도는 M-CSF 표시 플라스미드(plasmid)pCMD, CSF를 제조하는 방법을 나타내는 도표.

제8도는 M-CSF 표시 플라스미드 pcDM, CSF11-185를 제조하는 방법을 나타내는 도표.

제9도는(제9a도∼제9c도)M-CSF 표시 플라스미드 pIN-III(1ppP-5)-OmpA-MCSF11-NV151를 제조하는 방법을 나타내는 도표.

제10도는 M-CSF 표시 플라스미드 pIN-III(1ppP-5)-OmpA-MCSF11-NV151에 의하여 암호화된 아미노산의 서열도.

제11도는 M-CSF 표시 플라스미드 pIN-III(1ppp-5)-OmpA-MCSF11-NV143에 의하여 암호화된 아미노산의 서열도.

제12도는 (제12a도와 제12b도)M-CSF 표시 플라스미드 pcDM,CSF11-dhfr을 제조하는 방법을 나타내는 도표.

본 발명은 의약품으로서 유용하게 사용될 수 있는 인간의 콜로니-자극인자(human colony-stimulating factors:M-CSFs)에 대한 신규의 유전자 암호화에 관한 것이다.

일반적으로, 조혈 세포들의 증식 및 분화에는 특이전인 증식 및 분화인자들을 필요로 한다.

이러한 여러 인자들은 적혈구, 과립구, 대식 세포, 호산구, 혈소판, 임파구와 같은 다양한 종류의 혈액 세포가 되는 조혈 세포의 분화 및 증식에 참여한다.(야스사다 미우라, "블러드 스템 쎌스(Blood Stem Cells)" 추가이 이가쿠 사, 1983).

이들 인자들 중에서 CFSs는 대식 세포의 전구 세포와 과립구의 전구 세포의 증식과 분화를 자극하는 인자로 알려져 있다.

이러한 CFSs로서는, 과립구의 생성에 특이적인 G-CSF와 대식 세포의 생성에 특이적인 M-CSF, 과립구와 대식 세포 양자의 생성에 특이적으로 작용하는 GM-CSF 및 많은 잠재능력을 갖고 있는 간 세포(Stem cells)를 자극하는 것으로 알려진 멀티-CSF(IL-3)가 지금까지 알려져 있다.

상기의 CFSs는 그 생물학적 활성 때문에, 암에 대한 화학적 요법과 방사선 요법이 초래하는 이들 요법이 일반적인 결점인 백혈구 감소증을 완화시키는 작용이 있다고 생각되어져 왔으며, CFSs에 대한 임상조사도 이러한 견지에서 수행되고 있다. CSFs는 또한, 백혈구의 기능을 증진시키는 활성이 있는 것으로 알려져 있으며(로페즈(Lopez,A.F.)등, 저널 오브 임뮤놀러지(J.Immunol.),131,2983(1983), 핸덤(Handam,E.)등, 저널 오브 임뮤놀러지, 122,1134(1979)과 베이더스(Vadas,M.A.)등, 저널 오브 임뮤놀러지, 130,795(1983)), 따라서 여러 가지 전염병의 예방과 치료제로서 효과적이라는 것도 알게 되었다.

더욱이, CSFs는 분화 유발 활성을 가지고 있으므로, 골수성 백혈병의 치료에 효과적이라는 사실도 알려져 있다.(메칼프(Metcalf,D.)등, 인터내이셔날 저널 오브 캔서(Int.J.Cancer),30,773(1982))

태아 세포, 비장 세포등의 배양물이나 인간의 소변, 그리고, 각종의 배양된 쎌 라인(Cell Lines)의 배지는 CSFs의 활성을 나타내므로 활성을 갖는 부분들을 분리하여 사용하고 있다. 그러나 어떠한 종류의 CSF는 외래로부터 도입된 유사한 물질을 다량함유하고 있거나 출발물질로부터 유래한 유사한 물질을 함유하며, 또 그 농도가 낮으므로, CSF를 제조하기 위해서는 이러한 제반 문제들을 해결하여야만 한다. 균질성, 수율, 조작의 용이성 등의 관점에서 볼 때, 의약품으로서 CSFs를 상업적으로 제조하기 위해서는 종래의 방법들은 많은 해결하여야 할 문제점들을 가지고 있다.

그러나, 본 발명자들은 인간의 백혈병 T 세포로부터 유도한 쎌 라인(Cell Line)인 "AGR-ON"을 이미확보하고 있었으며, 이것은 항상 균질한 상태로 CSF를 다량 생산할 수 있는 능력을 가지고 있다. 따라서, 본 발명자들은 이 쎌 라인(Cell Line)과 관련된 발명을 특허출원하고 있다(일본 특허공개번호 소59-169489).

본 발명자들은 AGR-ON으로 생산한 CSF의 정제에 대한 실험을 반복한 끝에 높은 수율로 CSF의 순수한 형태를 제조하는 방법을 개발하였으며, 이 CSF의 생화학적 특성 및 구조적 특성을 규명하여 특허출원하였다. (일본 특허공개번호 소61-12850).

상기의 발명에서 개시된 CSF 는 정상적인 골수 세포에 작용하여 대식 세포의 분화 및 증식을 촉진시키는 당단백질인 M-CSF이며, 다음같은 물리화학적 특성을 갖고 있다.

이 M-CSF는 "AGR-ON·CSF"라 칭하였다.

a) 분자량

비환원 상태하에서, SDS 폴리아크릴아마이드젤 전기영동법으로 측정하니 33000-43,000달톤(daltons)이었으며, SDS 존재하의 비환원 상태하에서, 젤 여과법으로 측정한 결과는 23000-40000달톤(daltons)이었다.

b) 단백질 부분의 N-말단의 아미노산 서열은 다음과 같은 1차 구조를 갖는다.

Val-Ser-Glu-Tyr-Cys-Ser-His-Met-Ile-Gly-Ser-Gly-His-Leu-Gln-Ser-Leu-Gln-Arg-Leu-Ile-Asp-Ser-Gln-Met-Glu-Thr

본 발명의 주 목적은 유전공학기술에 의하여 용이하게 인간의 M-CSF을 대량으로 제조 공급하는 기술 및 이 기술에 유용한 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 전술한 연구 결과에 따라 연구를 계속하였으며, AGR-ON·CSF를 유도하는 AGR-ON으로부터 전령 RANs(mRNAs)를 추출하여, 이 전령 RNAs에 상보적인 DNAs(cDNAs)를 제조하고, AGR-ON·CSF 의 아미노산 순서에 대한 정보에 근거하여 원하는 M-CSF에 대한 cDNA 암호문을 선발한 다음, 이 cDNA 암호문을 포함하는 벡터(Vector)를 제조하고, 이 벡터를 숙주 세포에 도입하여 전형물(transformant)을 얻은후, 원하는 생리적 활성을 갖는 M-CSF 생성된 배양물을 얻기 위하여 이 전형물을 배양하는 것으로 본 발명을 완성하였다.

더욱 상세히는 본 발명은 생물학적으로 활성을 갖는 인간의 M-CSF 분자의 유전자 암호문이 다음식(1)의 아미노산 순서로 특징 지워져 있는 유전자를 제공하는 것이다.

여기서 X는 Tyr 또는 Asp 이다.

펩타이드와 아미노산은 이 분야에서 통상적으로 사용되는 기호나 이유팩(IUPAC)에서 채택한 아미노산 명명법에 따른 기호를 사용하였다.

뉴클레오타이드의 순서와 헥산들도 유사하게 표현하였다. 인간의 M-CSF는 본 발명의 유전자를 사용한 유전 공학적 방법으로 용이하게 대량으로 생산될 수 있다. 이렇게 얻어진 M-CSF는 앞에서 언급한 바와 같이 그 생물학적 활성이 강하므로, 백혈구 감소증과 같은 질병의 예방과 치료제로서, 골수이식에 대한 보조제로서, 각종 전염병의 예방과 치료제로서, 또 항암제등으로서 의약분야에서 특히 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 유전자를 다음에서 더욱 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 유전자는, 예를 들면 M-CSF를 생성할 수 있는 능력을 갖고 있는 인간의 세포들로부터 제조될 수 있으나, 더욱 유리한 것은 AGR-ON으로부터 분리한 mRNA를 사용하여 제조하는 것이다.

본 발명의 유전자를 제조하는 방법은 AGR-ON 이외의 다른 세포들로부터도 유사하게 제조될 수 있기는 하지만, AGR-ON을 사용하는 방법에 관하여 지금부터 설명하기로 한다.

AGR-ON은 인간의 백혈병 T 세포로부터 유도된 인간의 쎌 라인(Cell Line)이며, 일본 특허공개번호 소59-169489에 그 특징이 개시되어져 있다. 이 쎌 라인(Cell Line)은 ATCC 기탁번호 CRL-8199로서 아메리칸 타입 컬취콜렉션(American Type Culture Collection:ATCC)에 기탁되어 있다.(KFCC-10538, 1988.2.8)

mRNA는 기본적으로 일상적인 추출방법에 의하여 AGR-ON으로부터 분리된다. 더욱 상세히는 필요하다면 태아 송아지 혈청(FCS)등이나 알부민등과 같은 혈청 성분을 가한 CEM 배지, CMRL-1066배지, DM-160배지, 이골의 최소 필수 배지(Eagle's MEM), 피셔 배지, F-10배지, F-12배지, L-15배지, NCTC-109배지, RPMI-1640배지 등과 같은 배지중에서 AGR-ON을 배양한다.

AGR-ON을 1×10⁴-1×10⁷세포/ml의 농도로 배지에 접종하고, 30-40℃로, 바람직하게는 37℃로 1-5일간 CO₂배양기 중에서 배양하는 방법과 같은 통상적인 방법으로 배양한다. CSF가 생성 축적되면, 배양된 세포들을 SDS, NP-40, 트리톤×100, 데옥시콜린산등과 같은 적당한 계면활성제를 사용하여 부분적으로 또는 완전히 용해시키거나, 균질기(homogenizer)나 동결-해빙 반복법과 같은 물리적인 방법으로 세포를 파쇄한다.

그다음, 염색체 DNA를 폴리토론(POLYTORON, 스위스의 키네마티카 제)이나 믹서, 주사기등으로 어느정도까지 절단한다. 그후, DNA 전체를 추출하기 위하여 헥산 단편으로부터 단백질을 제거한다. 일반적으로 이 절차를 위해서는 CsCl 초원심 분리법이나 페놀-클로로포름 추출법(쉬그윈(Chirgwin,J.M.)등, 바이오 케미스트리, 18,5294(1979))을 사용한다.

RN 아제(RNase)에 의한 RNA의 감성(degradation)을 방지하기 위하여, 상기의 방법과 절차는 헤파린, 폴리비닐설페이트, 다이에틸 파이로카보네이트, 바나딜-리보뉴클레오사이드 복합체, 벤토나이트, 마칼로이드(macaloid)등과 같은 RN 아제 억제인자의 존재하에서 수행한다.

mRNA을 추출된 RNA로부터 분리하고, 올리고 dT-셀룰로오스(콜라보레이티브 리서취사 제품), 폴리-u-세파로스(파마시아 화인 케미칼스사 제품), 세파로스 2B(파마시아 화인 케미칼스사 제품)등과 같은 컬럼법이나 배치법(batch method)으로 정제한다.

원하는 M-CSF에 상응하는 mRNA는 위에서 정제된 mRNA로부터 분리되고 농축된 다음 확인되는데, 예를들면 수크로스 농도 구배 원심분리로 mRNA를 단편들로 나누고 제노퍼스 래비스(Xenopus laevis)의 난모 세포나 토끼의 망상 적혈구 용해질, 밀의 배아 추출물등의 세포-유리계(cell-free system)와 같은 단백질 해독계(translation system)로 이 프렉션을 도입하여 단백질로 해독되도록 하고, 이 단백질의 M-CSF 활성을 조사하는 것으로, 원하는 mRNA의 존재를 식별할 수 있다. 원하는 mRNA를 확인하기 위하여 M-CSF의 활성을 측정하는 것 대신에, M-CSF 에 대하여 항체를 사용한 면역 검정법(immunoassay)을 사용할 수도 있다.

이렇게 얻어진 불안정한 mRNA는 안정한 cDNA로 전환되고, 원하는 유전자를 증폭시키기 위하여 미생물로부터 유도된 레플리콘(replicon)과 결합하여 한쌍이 되도록 한다. mRNA의 cDNA로의 전환, 즉 본발명의 유전자를 합성하는 것은 통상적으로 다음의 방법에 따라 행하여진다.

프라이머(primer)로서는 올리고 dT(유리된 올리고 dT 또는 벡터 프라이머에 부착된 올리고 dT)를 사용하고, 주형(template)으로서 mRNA를 사용하여, mRNA에 상보적인 일본쇄(single-standed)의 cDNA는 리버스트랜스크립타제(reverse transcriptase)를 사용하여 dNTP(dATP,dGTP,dCTP 또는 dTTP)의 존재하에서 합성된다. 다음 단계는, 유리된 올리고 dT와 벡터 프라이머에 부착된 올리고 dT 중 어느것을 사용하느냐에 따라 다음과 같이 다르다.

유리된 올리고 dT를 사용할 경우에는 주형으로서 사용된 mRNA는 알칼리 가수분해로 제거되고, 이본쇄(double-stranded)의 DNA는 리버스트랜스크립타제나 DNA 폴리머라제를 사용하여, 주형으로 제공된 일본쇄의 DNA로부터 합성된다.

이어서, 이본쇄의 DNA의 양끝은 엑소뉴클레아제로 처리되고, 적당한 연결자 DNA나 어닐링(annealing)에 따른 염기들의 조합물이 각 끝에 부착되며, 이렇게 만들어진 DNA는 EK-형 플라스미드 벡터나 λgt 파지 벡터와 같은 적당한 벡터안에 삽입된다.

벡터 프라이머에 부착된 올리고 dT를 사용할 경우에는, 앞의 경우에서와 같은 위치에 부착된 연결자를 갖는 개환 플라스미드와 연결자 DNA(이렇게 사용되는 연결자 DNA는 종종, 동물 세포내에서 자발적으로 복제될 수 있는 부분을 갖는 DNA 절편과 mRNA 전사 촉진자이다.)는 주형인 mRNA의 존재하에, 폐환으로 어닐링된다. 이 mRNA는 완전한 플라스미드 DNA를 얻기 위하여 RN 아제와 DNA 폴리머라제, dTNP의 존재하에서 DNA 사슬로 교체된다.

이렇게 얻어진 DNA는 전형(transformation)되기 위하여 에스케리챠 콜리(E.coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 사카로 마이세스 쎄레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 적당한 숙주내로 도입된다. 이것은 통상적인 방법으로 행하여지며, 예를들면 주로 대수기의 균체들을 집적시키고, 이 균체들이 쉽게 DNA를 받아들일 수 있도록 CaCl₂로 처리하여 균체들의 플라스미드내로 도입시킨다.

이 방법은 또한, 전형 효율을 향상시키는 것으로 알려진 MgCl₂나 RbCl의 존재하에서 수행될 수도 있다. 숙주 세포는 전형전에 원형질체나 구형질체로 변환시킬수도 있다.

이렇게하여 제조된 전형자 중에서, 원하는 M-CSF에 대한 cDNA를 품고 있는 것을 다음 방법들 중의 어느 하나를 사용하여 선발한다.

(1) 합성 올리고뉴클레오타이드 탐침(probe)을 사용한 스크린닝

원하는 단백질의 아미노산 순서가 전체적으로나 부분적으로 밝혀졌을때(즉, 단백질의 어느 부위의 몇 개의 아미노산의 특이적인 순서가 알려졌을 때), 그 아미노산들에 상응하는 올리고뉴클레오타이드는 숙주 세포의 코돈(codon)사용법을 고려하여 합성될 수 있다. 이렇게 합성된 올리고뉴클레오타이드는 하나 혹은 혼합된 탐침으로서 사용될 수 있다. 혼합된 탐침으로서 사용될 경우, 그 조합의 수는 이노신을 결합시키는 것으로 줄일 수 있다.

이 올리고뉴클레오타이드를³²P 또는³⁵S 로 표시하고, 전형자의 DNA를 고착시킨 니트로셀룰로오스필터에 잡종화(hybridization)시킨다. 원하는 전형자는 얻어진 양성의 잡종물로부터 선발된다.

(2) M-CSF를 생성하는 동물 세포의 스크린닝 전형자들은 원하는 유전자를 증폭시키기 위하여 배양되고, 동물 세포들은 증폭된 유전자들로 트랜스팩태이션(transfectation)된다.(이 경우에 사용되는 플라스미드는 자발적으로 복제가능하고, mRNA 전사 촉진자를 갖는 것이거나 동물 세포 염색체와 통합할 수 있는 것이다)

이렇게하여, 이 세포들은 각각의 유전자들에 의하여 암호화된 단백질을 생산할 수 있게 된다. 이러한 세포들의 각 배양물의 상등액 또는 세포 추출물의 M-CSF 활성에 대하여 분석하거나 또는 M-CSF에 대한 항체를 사용하여 M-CSF를 검출하는 것으로, M-CSF에 특이적인 cDNA를 갖고 있는 원하는 전형물을 선발할 수 있다.

(3) M-CSF에 대한 항체를 사용한 선발 단백질을 생산하도록 발현된 전형자를 수용할 수 있는 벡터속으로 cDNA를 도입한다. M-CSF를 생산하는 바람직한 전형자는 M-CSF에 대한 항체와 이 항체에 대한 2차 항체를 사용하여 검출된다.

(4) 선택적인 잡종화-해독(hybridization-translation)계의 사용

M-CSF를 생산하는 세포들로부터의 mRNA를 니트로셀룰로오스 필터에 사전 흡수시킨 전형물로부터 유도된 cDNA와 잡종화시켜서, cDNA에 상응하는 mRNA를 회수한다. 이렇게 회수된 mRNA는 제노퍼스래비스(Xenopus laevis)의 난모 세포나 토끼의 망상 적혈구 용해질, 밀의 배아 추출물등의 세포-유리계(Cell-free system)와 같은 단백질 해독계(translation system)에 도입도어 단백질로 해독된다. 원하는, 전형물인지의 여부를 확인하기 위하여 이 단백질의 M-CSF 활성을 분석하거나 또는 M-CSF에 대한 항체를 사용하여 M-CSF의 존재여부를 조사한다. M-CSF에 대한 DNA 암호문은 공지의 방법을 사용하여 전형물로부터 얻게되는데, 예를 들면 세포로부터 플라스미드 DNA에 해당되는 단편을 분리해내고, 이 플라스미드 DNA로부터 cDNA 부위를 분리해내는 것이다.

제5도에 나타낸 554개의 아미노산의 순서나 또는 제3도에 나타낸 372개의 아미노산의 순서로 정의된 인간의 M-CSF 전구체는 본 발명의 유전자 암호문의 일예이다.

본 발명의 유전자를 사용한 유전공학기술로 얻어진 인간의 M-CSF의 생물학적 활성을 나타내는 물질에 있어서, 그 유전자는 위에서 언급한 DNA, 즉 인간의 M-CSF 전구체의 전체 아미노산 순서가 같을 필요는 없다. 예를들면, 유전자가 인간의 M-CSF의 생물학적 활성을 나타내는한, 그 유전자의 아미노산 순서의 일부에 대한 DNAs 암호문은 본 발명의 유전자에 역시 포함된다.

식(I)로 표시되는 완전한 아미노산 서열이 인간의 M-CSF의 생물학적 활성의 발현에 필수적이 아니라는 사실은 제3도의 순서를 갖는 전구체가 그 C-말단에 식(I)의 372번째 아미노산(Pro)를 갖는다는 사실, AGR-ON,CSF가 그 N-말단에 35번째 아미노산(Val)을 갖는다는 사실, AGR-ON,CSF를 제조할 때, 그 N-말단에 33번째 아미노산(Glu)나 37번째 아미노산(Glu)을 갖으며, 생물학적으로도 활성을 갖는 M-CSF 인 부산물이 산출된다는 사실등으로부터 명백하다.

더욱이, 헤모포이어틴들(hemopoietins)사이의 1차 구조에 있어서의 유사성에 관한 발견들은 천연적으로 생성되는 M-CSF는 그 N-말단에 27번째 아미노산(Ala)을 갖는다는 것을 지적하고 있는 것 같다.(슈라더(J.W.Schrader)등, 프로세스 오브 내셔날 아카데믹 사이엔스(Proc, Natl.Acad.Scl.), 미국, 83권, p2458-2462(1986))

관련된 실시예에서 나타내고 있지만, 식(I)의 아미노산 서열의 일부인 178번째 아미노산(Cys)으로부터 그 C-말단까지의 아미노산들은 인간의 M-CSF의 생물학적 활성의 발현에 항상 필수적인 것은 아니라는 것이 확인되었다.

따라서, 본 발명의 유전자는 생물학적으로 활성을 갖는 인간의 M-CSF 분자에 대하여 상세히 수록하고 있으며, 식(I)로 표시된 아미노산 순서에 대한 정보에 근거한 신규의 DNA 서열로 되어 있다.

더욱 상세히 설명하면, 본 발명의 유전자는 식(I)로 표시되는 완전한 아미노산 순서로된 DNA 암호문과 N-말단쪽에 인접한 일부, 예를들면 1-26번째, 1-32번째, 1-34번째 또는 1-36번째 아미노산들이나, C-말단쪽에 인접한 일부, 예를들면 178번째 아미노산으로부터 C-말단까지의 일부 또는 전부가 결핍된 식(I)의 아미산 서열로된 DNA 암호문을 모두 포함하며, 전자의 DNAs는 본질직으로 후자의 DNAs들과 같은 것이다.

본 발명의 유전자는, 위와 같은 사항에 근거하여 포스페이트 트리에스테르 방법(내이쳐(nature),310,105(1984))과 같은 통상적인 핵산의 화학적 합성법으로 제조될 수도 있다. 그러나, 본 발명의 유전자는 통상적인 방법으로 제5도에 나타낸 554개의 아미노산 서열이나 제3도에 나타낸 372개의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드에 대한 DNA 암호문으로 제조하는 것이 대단히 편리하며 실용적이다.

554개 또는 372개의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드에 대한 DNA 암호문으로부터 본 발명의 유전자를 제조할 때 사용하는 방법은 DNA 일부의 화학적 합성, DNA 사슬의 결찰, 첨가, 제거 또는 절단등의 효소적 처리와 원하는 DNA의 분리와 경제 또는 복제와 선발등의 통상적인 방법을 사용한다.

따라서, 본 발명에서 사용된 방법들 이외에도 유전자나 DNA 사슬을 다루는 해당기술분야에서 통상적으로 사용되는 다양한 공지의 방법들도 사용될 수 있다.

예를들면, 원하는 DNA는 아가로스젤 전기영동법으로 분리, 정제될 수 있으며, 헥산순서에 있어서의 코돈들은 국소에 특이적인 돌연변이에 의해서 변이될 수 있다.(프로세스 오브 내셔날 아카데믹 사이엔스, 81,5662-5666(1984))

바람직한 아미노산을 도입하기 위하여 선택되는 코돈은 특별히 제한되지는 않으며, 사용하는 숙주 세포의 코돈 사용법을 고려하여 통상적인 방법에 따라 결정된다.

상기와 같은 방법으로 얻어진 본 발명의 유전자의 DNA 순서는, 예를 들면 맥삼-길버트의 화학적변이방법(메쓰, 엔자임, 65,499-560(1980))이나 M13 파지를 사용한 다이데옥시뉴클레오타이드 사슬 종지법(메싱(Messing,J.)과 바이에라(Vieira,J.), 젠, 19,269-276(1982))으로 측정되고 확인될 수 있다.

따라서, 인간의 M-CSF는 본 발명의 유전자를 사용한 재조합 DNA 기술로, 대량으로 용이하게 제조될 수 있다.

본 발명의 유전자를 사용하는 것 외에도, 인간의 M-CSF는 공지의 통상적인 유전자 재조합 기술로도 제조될 수 있다(몰레큘라 클로닝(Molecular Cloning), 매니아티스 저, 콜드 스프링 하버 래보레터리(Cold Spring Harbor Laboratory)(1982): 사이엔스(Science),224,1431(1984): 바이오케미스트리 앤드 바이오피직스(Biochem.Biophys.Res.Comm.),130,692(1985); 프로세스 오브 내셔날 아카데믹 사이엔스(Proc, Natl.Acad.Sci.), 미국, 70,5990(1983): 유럽특허원 공개번호 187991)

더욱 상세히는 숙주 세포내에서 본 발명의 유전자들을 표현할 수 있는 재조합 DNA를 제조하고, 숙주 세포내로 이 DNA를 전형시킨 다음 이 전형물을 배양하는 것으로, 인간의 M-CSF를 생산할 수 있다.

유용하게 사용할 수 있는 숙주 세포로는 진핵동물과 원핵동물 모두 사용될 수 있다. 진핵동물로는 척수동물의 세포, 효모등이 있다. 척추동물의 세포로서 일반적으로 사용되는 것은 예를들면, 원숭이의 세포인 COS 세포(글루즈만(Y.Gluzman), 셀,23,175-182(1981), 다이하이드로폴레이트 리덕타제 결핍종인 중국산 햄스터(hamster)의 난소 세포(울라우브와 체신(G.Urlaub and L.A.Chasin), 프로세스 오브 내셔날 아카데믹 사이엔스(Proc.Natl.Acad.Sci), 미국, 77,4216-4220(1980)등이며, 그 외에도 다른 세포들도 사용될 수 있다. 척추동물 세포의 유용한 발현벡터는 발현될 유전자의 상부 방향에 위치한 촉진자, RNA 접착부위, 폴리아데닐레이션부위, 전사 종지 서열등을 갖고 있는 것들이다. 이들 벡터들은 필요하다면, 복제원을 갖고 있을수도 있다. 유용한 발현벡터의 예로서는 초기 촉진자 SV 40을 갖고 있는 pSV 2dhfr이 있으나 (사브라마니(S.Sabramani), 뮬리간(Mulligan)과 베르그(P.Berg.), 뮬레큘라 셀 바이올러지(Mol.Cell.Biol.),1,854-764), 한정적인 것은 아니다.

효모는 진핵 미생물로서 널리 사용되며, 그중에서도 사카로마이쎄스(Saccharomyces)속의 것이 일반적으로 유용하게 사용된다. 효모등의 진핵미생물에 대한 통상적인 발현벡터의 예로서는, 산 포스파타제 유전자에 대한 촉진자를 보유하고 있는 pAM82가 있다(미야노하라등,프로세스 오브 내셔날 아카데믹 사이엔스(Proc.Acad.Sci.), 미국, 80,1-5(1983)).

에스케리챠 콜리(E.Coli)와 바실러스 서브틸리스(Bacillus Subtilis)는 원핵 숙주로서 보편적으로 사용된다. 본 발명은 예를 들면 숙주내에서 복제가 가능한 플라스미드 벡터를 사용한다. 벡터내에서 본 발명의 유전자를 발현시키기 위하여, 단백질합성 착수에 필요한 ATG와 본 발명의 유전자 상부에 촉진자 및 SD(Shine-Dalgarno)서열을 갖고 있는 발현 플라스미드를 사용할 수 있다.

숙주로서 널리 사용되는 대장균은 에스케리챠 콜리 K12 균주이다. pBR322는 일반적으로 사용되는 벡터이다. 그러나 이것은 제한적이지 않으며, 다양한 공지의 균주들과 벡터들도 사용될 수 있다.

또한, 사용 가능한 촉진자의 예로서는 트립토판 촉진자, PL 촉진자, lac 촉진자, lpp 촉진자등이 있다. 본 발명의 유전자는 상기의 촉진자중 어느것에 의해서도 발현될 수 있다.

숙주로서 COS 세포가 사용되는 경우에는 사용되는 발현벡터는 SV40 복제원을 보유하며, COS 세포내에서 자발적으로 복제가능하고, 전사 촉진자, 전사 종결암호와 RNA 접착부위등을 갖고 있는 벡터이다.

예를 들면, 다음의 실시예에서 나타낸 바와 같은 플라스미드 pcDE 가 사용될 때에는 본 발명의 유전자는 SV40 초기 촉진자로부터 하부 방향에 위치한 제한효소 EcoRI의 부위에서 플라스미드와 부착되며, 이렇게 하여 원하는 발현 플라스미드가 얻어지게 된다.

이렇게 얻어진 원하는 재조합 DNA는 통상적인 방법에 따라 숙주 세포내로 도입된다.

예를 들면, 플라스미드 pcDE내로 유전자를 삽입시켜 제조한 발현 플라스미드는 DEAE-텍스트란법이나 칼슘 포스페이트-DNA 공침(coprecipitation)법으로 COS 세포내로 도입되며, 이렇게하여 원하는 전형물을 용이하게 얻을 수있다.

이 전형물은 통상적인 방법으로 배양되고, 이렇게하여 생물학적으로 활성을 갖는 인간의 M-CSF가 생산 축적되어진다. 배양에 사용되는 배지는 숙주 세포에 대하여 통상적으로 사용되는 것중에서 적절히 선택하여 사용한다.

COS 세포에 대하여 사용가능한 배지의 예로서는 RPMI-1640 배지, 둘베코의 변이 이글배지(Dulbecco's modified Eagle's MEM)등이며, 필요하다면 태아의 송아지 혈청(FCS)과 같은 혈청 성분을 보충할 수도 있다. 세포내 또는 세포의 전형물에 의하여 생산된 M-CSF는 생성물의 물리적 또는 화학적 특성들을 이용한 분리방법들로 분리되어 정제된다.((주)토쿄 카가꾸도진에서 발간한 "바이올러지칼 데이터 북II" p, 1175-1259, 초판), 사용되는 방법들로서는 통상적인 단백질 침전제 사용, 초여과(Ultrafiltration), 분자체 크로마토그라피(젤여과), 흡착크로마토그라피, 이온교환크로마토그라피, 친화크로마토그라피, 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC)등과 같은 액체크로마토그라피, 투석등이 있으며, 이러한 방법들을 조합으로 사용한다. 적절한 방법으로 분리하기 위하여, 원하는 물질은 배양상등액으로부터 부분적으로 정제된다.

이러한 부분적인 정제는 예를들면 암모니움 설페이트, 소디움설페이트 또는 소디움포스페이트와 같은 염석제를 사용한 처리와 투석막을 사용한 초여과, 평판막, 통공섬유막(hollow fiber membrane)과 같은 막으로 행하여진다.

이러한 처리는 통상적인 조건하에 통상적인 방법으로 행하여진다. 이렇게 얻어진 대충 정제된 생성물은 흡착크로마토그라피, 친화크로마토그라피, 젤여과, 이온교환크로마토그라피, 역상크로마토그라피, 등과 같은 이와 같은 방법들을 조합한 방법으로 처리되며, 이렇게하여 원하는 균질한 물질을 얻는다.

흡착크로마토그라피는 예를들면 페닐-세파로스, 옥틸-세파로스 또는 이와같은 담체를 사용하여 수행된다. 친화크로마토그라피는, 원한다면 ConA-세파로스, 렌틸렉틴-세파로스(Lentil lectin-Sepharose: 파마시아사 제품)등의 수지를 이용한 크로마토그라피로 수행된다.

젤 여과는 덱스트란 젤, 폴리아크릴아마이드 젤, 아가로스젤, 폴리아크릴아마이드-아가로스젤, 셀룰로오스등으로 된 것을 사용하여 수행된다. 상업적으로 유용한 것의 예로는 세파덱스 G형, 세파로스형, 세파크릴형(모두 파마시아사 제품), 셀룰로화인(씨소사 제품), 바이오젤 P형, 바이오젤 A형(양자 모두 바이오래드 연구소 제품), 울트로젤 AcA(LKB 제품), TSK-G 형(토요 소다사 제품)등을 들수 있다. 이온교환 크로마토그라피는, 예를 들면 다이에칠아미노에칠(DEAE)등과 같은 교환그룹으로서 제공되는 음이온 교환물질을 사용하는 크로마토그라피로 수행된다.

역상크로마토그라피는 실리카 젤 기질을 포함하는 담체나 C₁,C₃또는 C₄알킬, 시아노프로필 또는 페닐과같은 작용기가 부착된 담체를 사용하여 수행된다.

더욱 상세히는 이 크로마토그라피는 용출액으로서 아세토니트릴, 트리플루오로아세트산(TFA), 증류수 또는 이러한 용매의 혼합물을 사용하여 C₄하이포역상 HPLC 컬럼(C₄Hi-Pore Reverse-Phase HPLC Column:RP-304, 바이오-래드연구소)을 사용하여 수행된다.

상술한 바와 같은 과정에 의해서, 원하는 M-CSF는 고도로 정제된 형태로서, 높은 수율로 상업적으로 생산될 수 있다.

의약품으로 사용하기 위하여, 이렇게 제조된 M-CSF는 효과적인 양으로 M-CSF을 함유함과 동시에 약리학적으로 받아들여질 수 있는 무독성의 담체를 함유하는 약리학적 조성물로 제조된다.

이 조성물은 조성물의 형태에 알맞는 투약경로로 투여되게 된다. 이러한 조성물은 예를들면 용액, 현탁액, 유화액등과 같은 액체 제제의 형태로 하여 경구, 정맥내, 피하, 피내 또는 근육내로 투여된다.

이러한 투약의 방법이나 형태는 특별히 한정적이지는 않으며, 이 M-CSF 조성물은 경구나 그 이외의 보편적인 투여를 위하여 통상적으로 사용되는 적절한 형태로 제조될 수 있다.

이 조성물은 적당한 담체를 첨가하여 액체제제를 재구성시킨 건조한 제제로서 제공될 수도 있다.

어떠한 형태로 제조하는가에 관계없이, 이 조성물의 투여량은 특별한 제한은 없지만, 질병의 종류, 환자의 연령과 성별, 원하는 약리학적인 효과등에 따라 적절하게 결정될 수 있으며, 이 조성물은 활성을 갖는 성분인 M-CSF 단백질의 양으로 계산하여 통상적으로 0.01-1mg/kg/1일의 양으로 투여된다. 이 일일 투여량은 한번으로 또는 나누어서 투여될 수 있다.

본 발명의 유전자를 제조하는 과정과 이 유전자를 사용하여 M-CSF를 제조하는 과정 그리고 본 발명의 특징들을, 다음의 실시예들에 따라 상세히 설명하기로 한다.

실시예들에서 제조된 검체들은 다음의 방법에 따라 CSF 활성을 검정하였다.

CSF 활성 측정방법

태아 송아지 혈청(FCS, 20ml), 30ml의 α-배지와 2배 농도의α-배지 20ml을 함께 혼합하고, 용액을 37℃로 유지한다. 이 용액으로부터 23.3ml을 취한 다음 미리 50℃로 유지한 10ml의 1% 한천 용액(디프코제품)을 가하여 한천 배지를 제고하고, 37℃로 유지한다.

BALB/C계 쥐의 대퇴골로부터 채취한 골수 세포(BMC)를 헹크액(Hank's solution)으로 두차례 씻어내고, 그후 10⁷세포/ml의 농도로 α-배지에 현탁시킨다. 그리고 이 현탁액 1ml을 한천 배지에 가하고, 37℃로 유지한다. 이 혼합액을 철저히 교반하고, 37℃로 유지한다. 이 혼합액 0.5ml을 검정 표본 50㎕을 사전에 담고 있는 웰(Well)(조직배양 클루스터 12, 코스타사 제품)들 속에 넣고, 이 혼합물을 신속히 교반한 다음 실온에 방치한다. 각 웰속의 혼합물이 고체화하기 시작하는 즉시, 각 웰들을 CO₂배양기에 넣고 37℃로 7일간 배양한다.

CSF 활성에 대한 지표로 삼기 위하여 광학 현미경하에서 생성된 플로니의 수를 계측한다. 형태학적으로 관찰한바, 형성된 콜로니들은 모두 대식 세포의 콜로니였다.

[실시예 1]

본 발명의 유전자의 제조

(1) AGR-ON 세포의 배양

배양된 인간의 T 쎌라인 AGR-ON(ATCC 기탁번호 CRL-8199)을 10%의 갓태어난 송아지 혈청(NCS), 20mM의 N-2-하이드록시에칠 파이퍼라진-N'-2-에탄술폰산(HEPES),100㎍/ml의 스트렙토마이신, 100단위/ml의 페니실린G, 50㎍/ml 의 젠타마이신, 5×10^-5M의 2-머켑토에탄올과 1mM의 글루타민이 포함된 RPMI-1640배지(플로우-래브사 제품)에 약 10⁵세포/ml의 농도로 현탁시킨다.

현탁액 1ℓ을 다섯 개의 조직배양용 플라스크(코닝사 제품)에 넣고, 37℃로 72시간 동안 배양한다.

(2) mRNA의 추출

4M 구아니딘 티오아이소시아네이트 용액(4M guanidine isothiocyanate, 50mM 트리스-HCl(pH 7.6), 10mM EDTA, 2% 사코실(Sarkosyl), 140mM 의 2-머캡토에탄올)을 60℃로 가열하면서 절차(1)로부터 얻은 약 5×10⁸AGR-ON 세포들을 가하여 용해시키고, G18G 분사침을 갖고 있는 50ml의 주사기를 사용하여 DNA를 절단시킨다.

이 용액 1부피부(one part by volume)에 대하여, 페놀 1부피부, 100mM 소디움아세테이트(pH 5.2)-10mM 트리스-HCl(pH 7.4)-1mM EDTA 용액 0.5부피부 그리고 클로로포름-아이소아밀알콜(24:1) 혼합용액 1부피부를 60℃로 가열하면서 가한다.

이 혼합액을 60℃의 수조속에서 10분간 진탕한 다음, 4℃에서 3000r.p.m.으로 15분간 원심분리 시킨다.

수용액층을 분리해내고, 페놀-클로로포름으로 두차례 추출한 다음, 클로로포름으로 2차례 더 추출한다. 이 혼합된 추출물에 이 추출물의 2배 부피의 냉각된 에탄올을 가한다. 이 혼합액을 -20℃로 60분간 유지한 다음 4℃에서 3000r.p.m.으로 20분간 원심분리 시킨다.

이렇게 얻어진 RNA 침전물을 50ml의 100mM 트리스-HCl(pH 7.4)-50mM NaCl-10mM EDTA-0.2% SDS의 용액에 용해시키고, 프로테인아제 K(먹크사 제품)를 200㎍/ml의 농도로 위의 용액에 가한 다음, 37℃에서 60분간 반응시킨다. 60℃에서 이 반응혼합물을 페놀-클로로포름으로 두차례 추출하고, 클로로포름으로 두차례 더 추출한다.

이 혼합된 추출물에 추출물 부피의1/10 부피로 3M 소디움아세테이트(pH 5.2)와 추출물 부피의 2배 부피로 냉각된 에탄올을 가한다. 이 혼합물을 -70℃에서 60분간 방치한 다음 4℃에서 3000r.p.m.으로 20분간 원심분리한다.

이렇게 하여 얻어진 RNA 침전물을 냉각된 70% 에탄올로 씻어낸 다음, TE 액(10mM 트리스-HCl(pH 7.5)과 1mM EDTA)에 용해시킨다.

이와같이 하여, 5×10⁸AGR-ON 세포들로부터 총량 5mg의 RNA를 얻는다. 이 RNA로부터 mRNA를 얻기위하여 RNA를 올리고(dT)-셀룰로오스(콜라보레이티드 리서취사 제품)을 사용한 컬럼크로마토그라피에 적용시킨다. 흡착시키기 위하여, 10mM 트리스-HCl(pH7.5)-1mM EDTA-0.5M NaCl 용액을 사용한다.

이 컬럼을 같은 용액으로 씻어내고, 10mM 트리스-HCl(pH 7.5)-1mM EDTA-0.1M NaCl 용액으로 또 씻어낸 다음, 10mM 트리스-HCl(pH 7.5)-1mM EDTA로 RNA를 용출시킨다.

상기와 같은 절차로 약 110㎍의 mRNA를 얻는다.

(3) cDNA 라이브러리 (cDNA library)의제조

cDNA 합성계(아메샴사 제품)를 사용하여, 절차(2)에서 얻어진 mRNA 중 5㎍으로부터 cDNA를 제조한다. 얻어진 cDNA(약 0.6㎍)을 진공하에서 건조시키고, 50mM 트리스-HCl(pH 7.5)-10mM EDTA-50mM DTT-40㎍S-아데노실-L-메티오닌 용액 20㎍에 용해시킨다.

16단위(unit)의 EcoRI 메틸라제(뉴 잉글랜드 바이오래브사 제품)을 가하고, 이 용액을 37℃에서 15분간 반응시킨다. 이 반응 혼합물을 70℃로 10분간 가열하여 반응을 종결시키고, 페놀-클로로포름으로 추출한다.

이 추출물에 3M 소디움아세테이트(pH 5.2)를 추출물에 대하여 1/10의 부피로 가하고, 에탄올을 추출물에 대하여 2.5배 부피로 가한후, 이 혼합물을 -70℃에서 15분간 방치한다. 이 혼합물을 4℃에서 1500r.p.m.으로 15분간 원심분리하고, 침전된 DNA를 EcoRI 연결자(5'-GGAATTCC-3', 다까라 슈조사 제품)가 100μG/ml 로 용해되어 있는 10㎍의 50mM 트리스-HCl(pH 7.5)-10mM MgCl₂-10mM DTT-1mM ATP 용액에 용해시킨후, 350단위의 T₄DNA 리가제(다까라 슈조사 제품)를 이 용액에 가하고, 이 혼합물을 14℃에서 16시간 동안 반응시킨다.

이렇게 얻어진 반응혼합물을 70℃로 10분간 가열하여 반응을 종결시킨다. 이 혼합물에 16㎕의 100mM NaCl-50mM 트리스-HCl(pH 7.5)-7mM MgCl₂-10mM DTT 용액과 40단위의 제한효소 EcoRI(다까라 슈조사 제품)을 가하고, 이 혼합물을 37℃로 3시간동안 온침(digestion)시킨다.

이 반응 혼합물에 0.8㎕의 0.5M EDTA(pH 8.0)을 가하여 반응을 종결시키고, 과량의 EcoRI 연결자를 바이오젤A 50m(바이오-래드라보라터리 제품)컬럼크로마토그라피를 사용하여 제거한다.

이 cDNA 단편에 제한효소-EcoRI를 소화시키는 λgt11DNA(프로토클론 GT, 프로메가 바이오 테크사) 1㎕을 가하고, 5'-인산기를 제거하기 위하여 알칼린 포스파타제로 처리한다.

그후, 이 단편에 3M의 소디움아세테이트(pH 5.2)를 이 단편의 부피에 대하여 1/10부피로 가하고, 또 에탄올을 단편의 부피에 대하여 2.5배 부피로 가한다. 이 혼합물을 -70℃에서 30분간 방치하고, 4℃에서 1500r.p.m.으로 15분간 원심분리한다.

침전된 dna를 70% 에탄올로 씻어낸 다음 진공하에서 건조시키고, 7㎕의 증류수에 용해시킨다. 2㎕의 500mM 트리스-HCl(pH7.5)-100mM MgCl₂를 가한후, 이 용액을 42℃로 15분간 유지한 다음, 실온으로 냉각시킨다. 이 용액 1㎕의 100mM DTT, 1㎕의 10mM ATP의 175단위의 T₄DNA 리가제를 가한다. 이 혼합물을 14℃로 16시간 동안 보온한다.

이 반응혼합물 10㎕에 λ파지 충전 추출물(Packagen System, 프로메가 바이오테크사 제품)을 가하고, 이 혼합물을 22℃로 2시간 동안 방치하는 것으로 재조합 파지 DNA 는 세포외(in vitro)에서 충전(package)된다. 0.5ml의 파지 희석 완충용액(100mM NaCl-10mM 트리스-HCl(pH 7.9)-10mM MgSO₄·7H₂O)과 25㎕의 클로로포름을 가한후, 이 용액을 4℃에서 저장한다.

(4) cDNA 라이브러리(cDNA library)의 스크린닝

(4) -1, 합성탐침(Probe)의 제조.

다음의 서열은 AGR-ON 배양 상등액으로부터 정제된 AGR-ON·CSF 의 아미노산 말단 서열(27잔기)의 정보에 근거한 합성탐침에 대한 것이다.

Val-Ser-Glu-Tyr-Cys-Ser-His

5' GTG TCG GAG TAC TGT AGC CAC 3'

3' CAC AGC CTC ATG ACA TCG GTG 5'

전술한 구조식의 서열에 상보적인 핵산 서열(바로 위에 나타낸)은 M-CSF에 대한 암호와 cDNA를 갖는 재조합 파지를 선별하기위한 탐침으로서 사용하기 위하여, 다음의 절차에 따라 합성된다.

원하는 완벽하게 보호된 DNA는 고체상 포스피트 트리에스테르 방법(solid-phase phosphite triester process)으로 자동합성기(380A DNA 합성기, 어플라이드 바이오시스템사)를 사용하여 합성되며(내이쳐 310,105(1984)), 여기서 N,N-다이알킬메칠포스포로아미다이트(N,N-dialkylmethyl phosphoroamidite) 유도체가 축합 단위로서 사용된다.

이 완벽하게 보호된 DNA는 28%의 암모니아수로 55℃에서 10시간 동안 처리되며, 이렇게 하여 5'-말단에 위치한 수산기에 부착되어 보호기로서 제공된 DMTr(다이메톡시트리틸(이외의 보호기들(예를들면 A,G,C의 아미노기에 대한 아실기들)이 제거되며, 부분적으로 보호된 DNA("DMTr 단위"라 칭한다)로 된다. 이 DMTr 단위는 ODS 컬럼(일본 야마우라 켄큐쇼사 제품)을 사용하여 역상 고성능 액체크로마토그라피로 정제되고, 본래 그대로의 올리고뉴클레오타이드를 얻기 위하여 80%의 초산으로 실온에서 20분간 처리한다. 이 생성물로부터 원하는 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위하여, ODS 칼럼을 사용하여 역상 HPLC로 더욱 정제한다.

이렇게 얻어진 DNA (0.8㎍)는³²P로 DNA의 5'-말단을 표시하기 위하여, 100㎕의 반응 배지(50mM 트리스-HCl(pH 7.6), 10MgCl₂, 10mM 2-머캡토에탄올, 20μCi[r-³²P]-ATP)을 사용하여 37℃에서 1시간 동안 18단위의 T₄폴리뉴클레오타이드키나제(다까라 슈조사 제품)와 반응시킨다. 반응되지 않은[r-³²P]ATP 로부터 표시된 DNA를 분리하기 위하여 반응 혼합물을 바이오겔 P-30(바이오-래드 라보라터리스)을 사용하여 젤 여과시킨다.

이렇게 표식된 DNA 단편들을 모아서, -20℃에서 보존한다. 이렇게하여 얻어진 탐침(probe)은 비방사능(specific radioactivity)이 최소 10⁸cpm/㎍ DNA 였다.

(4) -2, 파지반 잡종화(Plaque hybridzation)대장균 Y1090 균주를 50㎍/ml 의 암피실린과 0.2의 맥아당이 함유된 40ml의 LB 배지(10g의 박토-트립톤, 5g의 박토-효모 추출물과5g/ℓ의 NaCl)에 접종하고, 300ml의 플라스크 속에서 37℃로 하룻밤 동안 배양한다.

배양액을 4℃에서 3000r.p.m.으로 15분간 원심분리하여 균체들을 모은다. 집적된 균체의 작은 덩어리들을 20ml의 SM 배지(100mM NaCl-50mM 트리스-HCl(pH 7.5)-10mM MgSO₄·7H₂O-0.01% 젤라틴)에 현탁시키고, 4℃에서 보관한다.

0.3ml의 균체 현탁액에 절차(3)으로부터 얻어진 재조합 파지액 0.1ml을 가하고, 3.5×10⁵pfu(반점형성단위)/ml이 되도록 SM 배지로 희석한후, 이 혼합물을 37℃에서 15분간 배양시킨다. 이어서, 47℃로 미리 가온한 LB 연질 한천 배지(10g의 박토-트립톤, 5g의 효모 추출물, 5g의 NaCl과 7g/ℓ의 아가로스)를 이 혼합물에 가하고, 이렇게 혼합된 혼합물을 LB 한천 평판(10g의 박토-트립톤, 5g의 박토-효모 추출물, 5g의 NaCl과 15g/ℓ의 박토 한천)에 부어 겹층으로 만든 다음, 42℃로 하룻밤 동안 배양한다. 각기 20개의 사례에 같은 절차를 반복한다. 레플리카, 필터(replica filter)를 제조하기 위하여, 파지반이 형성된 각각의 한천 평판상에 지름 132mm의 나일론 필터(BNRG 132, 팔울트라 화인 필트레이션사 제품)을 위치시킨다.

이 한천 평판을 마스터 평판으로서 4℃로 보존한다. 이 필터들을 0.5M NaOH-1.5M NaCl로 처리하고, 0.5M 트리스-HCl(pH 7.5)-1.5M NaCl로 처리한후, 0.3M NaCl-0.2M NaH₂PO₄(pH 7.4)-0.002M EDA(pH 7.4)로 처리한다. 그 다음, 공기중에서 건조시키고 진공하에서 80℃로 1시간 동안 굽는다. 이 구워진 필터를 0.75M NaCl-0.075M 소디움 시트레이트-100mg/ml의 피콜-10mg/ml의 폴리비닐 피롤리던-10mg/ml BSA-10mM 소디움 포스페이트(oH 6.5)-0.2% SDS -0.1mg/ml의 연어 절충 DNA의 혼합용액50ml 속에서 42℃로 6시간 동안 부드럽게 교반시킨다. 이어서 이 필터를 앞에서 제조한 탐침이 10⁶cpm/ml의 농도로 가해진 위의 용액속에 넣고, 42℃로 20시간 동안 부드럽게 교반하여 잡종화 시킨다.

잡종화후 이 필터를 용액으로부터 꺼내어, 실온에서 0.9M NaCl-0.09M 소디움 시트레이트 용액으로 세차례 씻어내고, 56℃에서 5분동안 같은 용액으로 씻어낸다.

필터를 공기중에서 건조시킨후, 감광지를 사용하여 -70℃로 2일간 X-선 필름(XR5, 이스트만 코닥사제품)위에 자동방사선 투과사진(Autoradiograph)을 찍는다. 필름을 현상한후, 암호부위에 해당하는 마스터 평판상의 파지반을 긁어내고, 양성의 암호를 갖는 파지반을 정제하기 위하여 상기의 절차를 반복한다.

이렇게하여, 양성의클론 λcM5와 λcM11을 최종적으로 분리해낸다.

(5) cDNA 클론(clone)의 구조 분석

λcM5의 제한효소 분석을 행하였으며, 제1도에 그 결과를 나타냈다. 제1도에 나타낸 바와 같이 이 cDNA 는 전체길이가 약 2.5kb이고, BstEII(뉴 잉글랜드 바이오래브 제품), NcoI(다까라 슈조사 제품), SmaI(다까라), KpnI(다까라), EcoRI(다까라), NdeI(뉴 잉글랜드 바이오래브 제품)의 각각에 대하여 한 개의 절단부위를 갖고 있으며, ScaI, StuI, BamHI(모두 다까라 슈조사 제품)의 각각에 대하여는 두 개의 절단부위를 갖고 있다.

다음에, cDNA의 뉴클레오타이드 서열을 맥삼-길버트 화학적 변이법과 M13파지를 사용한 다이데옥시뉴클레오타이드 사슬 종지법을 사용하여 결정하였다.

제2도(제2a도∼제2d도)는 결과를 나타내고 있다. 제2도는 5'-말단으로부터 227번째에서 247번째까지의 부위(밑줄친 부분)이 합성탐침과 상보적이라는 것을 보여주고 있다.

가장 긴 해석 구조를 λcM의 cDNA로 탐색한바, 5'-말단으로부터 227번째에서 247번째까지의 부위(밑줄친 부분)이 합성탐침과 상보적이라는 것을 보여주고 있다.

가장 긴 해석 구조를 λcM의 cDNA 로 탐색한바. 5'-말단으로부터 125번째에서 1240번째까지의 부위가 본 구조임이 판명되었다. 227번째로부터 307번째 염기의 서열과 이것으로부터 코돈에 의하여 암호화된 아미노산 서열은 AGR-ON, CSF 의 N-말단부에 있는 27개의 아미노산과 완전히 일치하였다. 이것은 λcM5의 cDNA가 M-CSF 전구 단백질에 대한 cDNA 암호문이라는 것을 가르키고 있다.

제3도(제3a도와 제3b도)는 이러한 결과들로부터 예견된 M-CSF 전구 단백질의 일차 구조를 나타내고 있다.

제4도(제4a도∼제4d도)는 상기와 같은 방법으로 결정된 λcM5의 M-CSF의 뉴클레오타이드 서열을 나타내고 있으며, 제5도(제5a도∼제5c도는 cDNA 전구 단백질에 대한 암호문과 이로부터 예견된 일차 구조를 나타내고 있다.

[실시예 2]

COS 세포내에서의 재조합 M-CSF (r-MCSF)의 제조

본 실시예에서 사용한 COS-1 세포는 전형된 원숭이의 신장 쎌 라인 CV1에 의하여 얻어진 쎌 라인이며, 복제원(Ori)-결핍 SV40을 가지고 있고, 이것에 의해 SV40 초기 유전자를 발현하며, T 항원 양성(Tantigen positive: 쎌 23,175-182(1981))으로 된다.

(1) COS 세포 발현 벡터 pcDE 의 제조

플라스미드 pcDE1(오카야마와 베르그(H.Okayama and P.Berg), 몰레큘라 쎌 바이올러지(Mol, Cell,Biol), 3,280-289(1983))을 우선 제한효소 Kpnl으로 절단하고, 그 5'와 3'-말단의 돌출부를 무딘 말단(Blunt end)으로 만들기 위하여 T4 DNA 폴리머라제(BRL 제품)로 처리하여 제거한다.

한편으로, EcoRI 연결자(5'-GGAATTCC-3')(다까라 슈조사 제품)의 5'-말단을 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 인산화시키고, T4 DNA 리가제를 사용하여 말단부위를 무디게한 DNA 절편과 결찰시킨다.

이렇게 만들어진 결찰은 제한효소 EcoRI 와 HindIII 로 절단된다. 이렇게 얻어진 반응혼합물을 아가로스겔 전기영동법으로 처리하여, 2590bp EcoRI-HindIII DNA 절편을 분리정제한다. 플라스미드 pL1(오카야마와 베르그(H.Okayama and P.Berg), 몰레큘라 쎌 바이올러지(Mol,Cell,Biol),3,280-289(1983)을 제한효소 Pst1(다까라 슈조사 제품)으로 절단시키고, 그 5'와 3'-말단을 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 무단 말단으로 변환시킨다.

상기에서 같은 방법으로, EcoRI 연결자를 DNA 절편에 결찰시키고, 이렇게 만들어진 DNA 절편을 제한효소로 절단하고, 이 반응생성물을 아가로스젤 전기영동법으로 처리하여 580bp의 EcoRI-HindIII DNA 절편을 분리 정제한다.

얻어진 DNA 절편을 T4 DNA 리가제를 사용하여, 사전에 준비한 EcoRI-HineIII DNA 절편에 결찰시켜 원하는 플라스미드 pcDE를 생성시킨다.

제6도는 상기의 절차를 도식적으로 나타내고 있다.

(2)M-CSF 발현 플라스미드 pcDM, CSF의 제조

λcM5 DNA를 제한효소 EcoRI로 부분적으로 소화시키고, 부분적으로 소화된 EcoRI 절편들을 아가로스젤을 사용하여 크기별로 분획하여 약 2.5kb의 cDNA 절편들을 분리정제해 낸다.

절차(1)로부터 얻어진 COS 세포 발현 벡터 pcDE를 제한효소로 절단시키고, T4 DNA 리가제를 사용하여 위에서 준비한 cDNA 절편에 결찰시켜 원하는 플라스미드 pcDM, CSF를 얻는다. 이렇게 얻어진 플라스미드를 대장균 HB101균주내로 전형시켜 도입하였다. 원하는 전형자를 알칼린 용해법(매니아티스등(T.Maniatiset al), 몰레큘라클로닝(Molecular Cloning),p,90, 콜드 스프링 하버 라보라터리(Cold Spring Harvor Laboratory)(1982)에 따라 얻어진 플라스미드 DNA의 제한효소 분석으로 선발하였다.

제7도는 상기의 절차를 도식적으로 나타내고 있다.

(3) r-MCSF 의 제조

COS-1 세포를 DEAE-덱스트란법(프로쎄스 오브 내셔날 아카데믹 사이엔스(Proc, Natl, Acad,Sci), 미국, 81권, p,1070(1984))으로 절차(2)에서 제조한 pcDM, CSF 로 트랜스팩트(transfect)시켰다. COS-1 세포를 우선, 10% 태아 송아지 혈청(FCS)를 가한 RPMI-1640배지에 약 2.5×10⁵세포/ml의 농도로 현탁시켰다.

이 현탁액을 조직배양용 클루스터-6(코스타사 제품)의 각 웰(Well)속에 2ml 씩 넣고, CO₂배양기에서 37℃로 하룻밤 동안 배양하였다. 이어서 배지를 제거하고, 세포들을 RPMI-1640 배지로 두차례 씻어낸후, 절차(2)로부터 얻어진 10㎍의 pcDM, CSF를 포함하는 1ml의 RPMI-1640(50mM 트리스-HCl(pH 7.4)과 400㎍/ml DEAE-덱스트란(파마시아 제))을 세포들에 가하고, 이 혼합물을 4시간동안 CO₂배양기속에 방치한다.

배지를 제거한후, 세포들을 RPMI-1640 배지로 2차례 씻어낸 다음, 150㎛ 클로로퀸(chloroguine)이 포함된 3ml 의 RPMI-1640 배지를 가하여 3시간동안 배양한다.

이어서, 배지를 제거하고, 세포들을 RPMI-1640 배지중에서 37℃로 27시간동안, CO₂배양기 중에서 배양한다. 배양 상등액과 그 추출물들은 각 희석비율에 따라 CSF 활성을 검정하였다.

그 결과를 표 1에 나타냈으며, pcDM, CSF 대신에 기준으로 pcDE를 사용하여 상기와 같은 절차로 얻어진 결과도 함께 나타냈다.

[표 1]

표 1에 기재된 각 수치는 평판당 콜로니의 수이며, CSF 활성을 나타낸 이후의 표들도 이와같다.

(4) M-CSF 발현 플라스미드 pcDM, CSF-185의 제조

절차(2)에 의하여 얻어진 플라스미드 pcDE, CSF를 사용하여 원하는 M-CSF 발현 플라스미드 pcDE, CSF-185는 제3도의 186번째 아미노산(Lys)에 대한 암호코돈(AAG)를 종지 코돈(TAG)로 바꾸는 국소-특이적 변이유발법(프로세스 오브 내셔날 아카데믹 사이엔스(Prock,Natl,Acad,3ci),81,5662-5666(1984))으로 제조될 수 있으며, 따라서 이 발현 플라스미드는 C-말단에 제3도의 185번째 아미노산(Thr)을 갖는다.

이 절차를 더욱 상세히 설명하기로 한다.

EcoRI-EcoRI DNA 절편(크기 1.8kb)를 플라스미드 pcDM,CSF 로부터 제거하고, 일본쇄의 (SS)DNA(M13-CSF)를 얻기위하여 EcoRI 부위에 M13 mp11 파지(RF)를 클로운(clone) 시킨다. 한편 합성올리고 뉴클레오타이드[5'-GTGGTGACCTAGCCTGATT-3'(프라이머)]를 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 인산화시키고, SSDNA(M13-CSF)로 잡종화시킨다.

어닐링(annealing)후에 이 잡종을, dNTP의 존재하에서 DNA 폴리머라제 1(Klenow 절편)과 T4 DNA 리가제로 처리하고, 15℃로 18시간 동안 배양한다. 이렇게 처리한 DNA를 JM105 컴피텐트 세포(JM 105 competent cells)내로 도입하고, 형성된 반점들중 50개의 반점을 한천 평판상에 접종한 다음 37℃로 18시간 동안 배양한다. 콜로니들을 포함하고 있는 필터를 통상적인 방법에 따라 알카리-변성시키고, 건조시킨 다음, 80℃로 2시간동안 굽는다. 이 필터를 사전 혼성화 시킨후, 실온에서 프라이머[r-³²P]ATP의 5'-말단이 표시된³²P-탐침으로 잡종화시킨다.

이렇게 잡종화된 필터를 우선 실온에서 6×SSC(Saline sodium Citrate)로 10분 동안 씻어내고, 그 다음 56℃로 4분간 씻어낸 다음 건조시키고, -70℃에서 18시간 동안 자동방사선 투과사진(autoradiograph)을 찍는다. M13-CSF-185를 변이 클론중에서 선발하고, SSDNA와 RFDNA를 제조하기위해서 JM105에트랜스팩태이션 시킨다. 변이된 서열의 정확성은 다이데옥시뉴클레오타이드 사슬 종지법으로 SSDNA를 서열시키는 것으로 확인될 수있다.

원하는 플라스미드 pcDM, CSF-185는, JM105내에서 증폭된 RFDNA로부터 EcoRI-EcoRI 절편을 제조하고, 절차(3)에서와 같은 방법으로 발현 플라스미드내로 이 절편을 삽입시켜서 얻어진다. 이 플라스미드를 사용하여, COS-1 세포가 절차(3)에서와 같은 방법으로 r-MCSF를 발현하도록 한다.

[표 2]

(5) M-CSF 발현 플라스미드 pcDM, CSF-177의 제조

프라이머로서 5'-GCTGAATGATCCAGCCAA-3'를 사용하여, 원하는 M-CSF 발현 플라스미드 pcDM, CSF-177은 제3도의 178번째 아미노산(Cys)에 대한 암호 코돈(TGC)를 종지코돈(TGA)로 바꾸는 절차(4)에서와 같은 방법으로 제조될 수 있으며, 따라서 이 발현 플라스미드는 C-말단에 제3도의 177번째 아미노산(Glu)을 갖는다.

이 플라스미드를 사용하여, COS-1 세포가 절차(3)에서와 같은 방법으로 r-MCSF를 발현하도록 한다.

그 결과를 표 3에 나타냈다.

[표 3]

표 2와 3에 나타난 결과들은 M-CSF 활성을 갖는 원하는 r-MCSF 는 본 발명의 유전자를 보유시킨 pcDM, CSF-185와 pcDM, CSF-177에 의하여 발현될 수 있다는 사실을 나타내고 있다.

이것은 제3도에 나타낸 178번째 아미노산으로부터 C-말단까지의 아미노산 서열의 부위는 원하는 생물학적 활성을 갖는 M-CSF 분자의 발현에 근본적으로 어떠한 영향도 미치지 않는다는 사실을 나타내고 있는 것이다.

(6) 플라스미드 pcDM, CSF11을 λcM5 cDNA 대신에 λcM5 cDNA를 사용하여 절차(2)에 따른 방법으로 얻었다.

r-MCSF 는 플라스미드를 사용하여 절차(3)에 의하여 제조되는데 이미 얻는 결과들과 기본적으로 같았다.

더욱 상세히 설명하면, λcM11 DNA를 제한효소 EcoRI 로 부분적으로 소화시키고 아가로스젤 전기영동법으로 처리하여 부분적으로 소화된 EcoRI 절편(약2.5kb)을 정제한다.

절차(1)에 의하여 얻어진 COS 세포 발현 벡터 peDE를 제한효소 EcoRI 로 절단시키고, T4 DNA 리가제를 사용하여 제조한 cDNA 절편에 결찰시켜서 원하는 플라스미드 pcDM, CSF11을 얻는다. 이렇게 얻어진 플라스미드를 대장균 HB101 균주내로 전형시켜서 도입한다. 원하는 전형물을 알칼리 용해법(매니아티스등(T.Maniatiset al), 몰레큘라 클로닝(Molecular Cloning),p,90, 콜드 스프링 하버 라보라터리(Cold Spring Harvor Laboratory)(1982)에 따라 그것의 플라스미드 DNA를 제한효소 분석법으로 선발한다.

λcM11 DNA 의 cDNA(EcoRI 로 부분 소화시킨 절편)를 EcoRI 클로닝 부위에서 클로닝 벡터 puc19 DNA (다까라 슈조사 제품)내로 도입하여, 플라스미드 pucMCSF, 11을 얻는다.

대장균 HB101 균주내로 이 플라스미드를 도입하여 얻은 전형물은, 1987년 7월 16일자로 에이전시 오브 인더스트리알 사이엔스 앤드 테크놀러지의 퍼먼테이션 리서치 인스티튜트(Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Scinece ＆ Technology)에 기탁번호:FERM BP-1409, 균명:에스케리챠콜리(Escherichia coli)HB101/pucMCSF,11로 기탁되어 있다.(KFCC-10533,1988.2.8)

(7) 약 670bp의 EcoRI-BstIIDNA 절편을 분리 정제하기위하여, 플라스미드 pcDMCSF11을 제한효소 EcoRI와 BstEII로 소화시킨 이 DNA 절편의 BstEII 말단에 다음의 합성 연결자를 결찰시킨다.

5'-GTGACCTGATAAGGATCCG-3'

3'-GACTATTCCTAGGCTTAA-5'

원하는 플라스미드 pcDM, CSF11-185를 얻기 위하여, 위에서 얻은 DNA 저편을 T4 DNA 리가제를 사용하여 EcoRI 로 전술한 플라스미드 pcDE에 결찰시킨다. 이 플라스미드는 합성 연결자의 부위에 해독종지 코돈 TGATAA를 갖으며, 따라서 이것의 C-말단에 제5도의 185번째 아미노산(Thr)을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다.

제8도는 상기의 절차를 도식적으로 나타내고 있다. 표4는 이 플라스미드를 사용하여 절차(3)과 같은 방법으로 얻어진 결과들을 나타낸다.

[표 4]

(8) 절차(7)로부터 얻은 플라스미드 pcDM·CSF11-185를 사용하여 제5도의 178번째 아미노산(Cys)에 대한 암호 코돈(TGC)를 절차(5)에 따른 종지 코돈(TGA)를 바꾸는 것에 의하여 원하는 M-CSF 발현 플라스미드 pcDM·CSF11-177은 제조될 수 있으며, 이 발현 플라스미드는 그 C-말단에 제5도의 177번째 아미노산(Glu)을 갖는다. 이 플라스미드를 절차(3)과 같은 방법으로 발현시켰으며, 그 결과를 표 5에 나타냈다.

[표 5]

(9) 플라스미드는 pcDM·CSF11-185 DNA를 EcoRI 와 BamHI 로 소화시킨후, EcoRI-BamHI DNA 절편(약 680bp)을 분리 정제하고, 플라스미드 pIN-III-OmpA3-MCSF11-185를 얻기 위하여, 이것을 분비표현 벡터(secretory expr e s sion vector) pIn-III-OmpA3(엠보(EMBO J.), 3-2437-2442(1984))의 E c o R I-BamHI 클로닝 부위에 삽입시킨다. XbaI-BamHI DNA 절편(약 770bp)을 분리 정제해내기 위하여, 이 플라스미드 DNA를 Xba I 와 BamHI 로 소화시킨 후, 일본쇄의 DNA를 제조하기 위하여 클로닝벡터 pUC118 DNA(다까라 슈조사 제품)의 XbaI-BamHI 클로닝 부위로 삽입시켜서 플라스미드 pUC118-OmpA3-MCSF11-185를 얻는다. 이 플라스미드를 사용하여, pUC118-OmpA-MCSF11-NV151은 제5도에 나타낸 폴리펩타이드의 35번째 아미노산(Val)에 대한 암호코돈(GTG)가 OmpA 신호 펩타이드의 C-말단 아미노산(Ala)에 대한 암호코돈(GCC)으로 교체되는 앞에서 언급한 국소-특이적 변이유발법에 의하여 얻어질 수 있다.

더욱 상세히 설명하면, 플라스미드 pUC-118-OmpA3-MCSF11-185 DNA 에 의하여 전형된 대장균 JM 105를 구원파지 K07(다까라 슈조사 제품)로 감염시키고 이어서 37℃로 14시간 동안 배양하여, 일본쇄(SS)의 pUC118-OmpA3-MCSF11-185 DNA를 얻는다. 변이유발을 위한 주형으로서 이 DNA를 사용하고 또한 프라이머로서 5'-TACCGTAGCGCAGGCCGTGTCGGAGTACTGTAGC-3'을 사용하여, 원하는 플라스미드 PUC118-OmpA-MCSF11-NV151을 절차(4)에서와 같은 방법으로 얻는다. XbaI-BamHI DNA 절편(약 540bp)을 분리정제해 내기 위하여, 이 플라스미드 DNA를 XbaI 와 BamH I로 소화시킨다. 이렇게 하여 얻어진 DNA 절편을 발현벡터 PIN-III(1ppP-5)-A3의 XbaI-BamH I 내로 삽입시키고, 이렇게 하여 원하는 분비발현플라스미드 PIN-III(1ppP-5)-OmpA-MCSF11-NV151은 제5도의 35번째 아미노산(Val)으로부터 185번째 아미노산(Thr)까지의 서열부위를 포함하고 있는 폴리펩타이드를 발현시켜 제조한다.

제9a도∼제9c도는 위의 절차를 도식적으로 나타내고 있다. 제10도는 분비발현 플라스미드(secretory expression plasmid)내에 암호화된 아미노산 서열을 나타내고 있다. 제10도에서 OmpA 신호 펩타이드는 서열중에 밑줄친 부분으로 나타냈으며, 진행부위는 ↓표로 나타냈다.

(10) 절차(9)에서 얻은 pIN-III(1ppP-5)-OmpA-MCSF11-NV151을 대장균 HB101과 JM109내로 도입하여 외질(periplasm)내로 폴리펩타이드를 분비 생산하도록 한다음, CSF 활성을 갖는 외질분액을 모은다. 더욱 상세히 설명하면, M-CSF 분비 발현벡터를 품고 있는 균주를, 50㎍/ml의 암피실린을 포함하고 있는 LB 배지 500ml이 들어있는 용량 21의 플라스크내에서 37℃로 14시간 동안 진탕배양한다.

그후, 실온에서 5000r.p.m.으로 5분동안 원심분리한다. 집적된 세포의 작은 덩어리를50ml의 50mM 트리스-HCl(pH8.0)-25% 설탕용액에 현탁시키고, 1.25ml 의 250mM EDTA(pH 8.0)를 가한 후, 이 현탁액을 부드럽게 교반하면서 실온에 30분 동안 유지한다. 그후, 집적된 세포의 덩어리를 얻기 위하여 원심분리 하고 다시 얼음으로 냉각시킨 증류수 25ml 에 현탁시킨다. 이 현탁액을 간헐적으로 부드럽게 교반하면서 30분동안 얼음으로 냉각시킨 후, 외질 분액인 상등액을 모으기 위하여 4℃에서 1000r.p.m으로 5분간 원심분리한다.

(11) 원하는 M-CSF 분비 발현 플라스미드인 pIN-III(1ppP-5)-OmpA-MCSF11-NV143은 pcDM·CSF11-177 대신에 pcDM·CSF11-185를 사용하여 절차(5)에 따라 제5도의 35번째 아미노산(Val)으로부터 177번째 아미노산(Glu)까지의 서열부분을 포함하는 폴리펩타이드를 발현시켜 얻어진다.

제11도는 플라스미드내에 암호화된 아미노산 서열을 나타낸다. 제11도에서 서열중 밑줄친 부분은 OmpA 신호 펩타이드를 나타내며, ↓표는 진행부위를 나타낸다. 절차(10)에서와 같은 방법으로, 플라스미드는 대장균내로 도입되고 CSF 활성을 나타내는 상등액으로 얻어지게 되는데 이 부분이 외질 분액이다.

(12) 절차(6),(7),(8)과 (10)에 의하여 얻어진 상등액은 다음과 같은 조건하에 HPLC 로 처리한다.

컬럼:TSK 젤 G3000SW(60cm×7.5mm(지름)), 토교 소다 메뉴팩쳐링사.

용출액:PBS-함유 0.005% 폴리에치렌글리콜과 0.15M Nacl

유속:0.8ml/min

분액부피:0.8ml/tube/min

분자량 조사계(molecular weight markers)(글구타메이트 데하이드로게나제:290,000, 락테이트 데하이드로게나제:1420,000, 에놀라제:670,000, 아데닐레이트키나아제:320,000, 시토크롬 C:12,400)로 시료들에 대하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

시료: 절차(6)에 의해서 얻어진 4ml의 배양상등액을 센트리콘-10(아미콘사제품)을 사용하여 150㎕로 농축시킨다. CSF 활성은 분자량 범위 320,000-700,000(평균 480,000)에 해당되는 분액에서 발견되었다.

시료:절차(7)에 의해서 얻어진 4ml의 배양상등액을 위에서와 같은 방법으로 처리하였다. CSF 활성은 분자량 범위 66,000-86,000(평균 76,000)에 해당되는 분액에서 발견되었다.

시료: 절차(8)에 의해서 얻어진 4ML의 배양상등액을 위에서와 같은 방법으로 처리하였다. CSF 활성은 분자량 범위 52,000-86,000(평균 67,000)에 해당되는 분액에서 발견되었다.

시료: 절차(10)에 의해서 얻어진 외절단편의 분액 2ml의 위에서와 같은 방법으로 약 110㎕로 농축하였다. CSF 활성은 분자량 범위 30,000-40,000(평균 35,000)에 해당되는 분액에서 발견되었다.

(13) 절차(6),(7),(8)에 의해서 얻어진 배양상등액 10ml을 1ml의 ConA-세파로스를 충전한 컬럼을 통과시키고, 5ml의 PBS로 씻어낸 다음, 0.5M 메틸-β-D-만노사이드를 함유하는 PBS(10ml)로 용출시킨다.

이렇게 얻어진 용축액 4ml을 센트리콘-10으로 농축시키고, 다음에 설명하는 SDS-PAGE 로 농축물을 처리한다. 절차(10)에 의해서 얻어진 외질상등액은 다른 시료로서 사용된다. M-CSF 는, SDS-PAGE의 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 교질화 한후에, 통상적인 방법으로 제조한 M-CSF에 대하여 토끼의 항혈청을 사용하여 검출한다. 더욱 상세히 설명하면, SDS-PAGE 는 미니-수직평판세포(mini-vertical slab cell: 젤 농도 15%)를 사용하는 레믈리법(영국, Baemmli, 내이쳐(Nature), 277, 680(1979))에 따라 수행하였다. 웨스턴 블로팅은 트랜스볼트세포(Transbolt Cell: 바이오-래드 라보라터리사 제품)을 사용하여 수행하였다. 원하는 물질이 전가된 니트로셀룰로오스 필터를 송아지 혈청알부민(BSA)이 1% 함유된 PBS 로 차단시키고, M-CSF를 토끼의 항혈청과 반응시킨 다음, 퍼록시다제로 표시된 염소의 항토끼항체(바이오-래드 라보라터리스 제품)와 반응시킨다. 이렇게 처리한 니트로셀룰로오스필터를 M-CSF 띠의 검출을 위한 색상전개물질로서 사용되는 4-클로로-1-나프톨용액과 반응시킨다.

[표 6]

(14) 플라스키드 pSV2-dhfr(몰레큘라 쎌 바이올러지(Mol, Cell, Biol), 1, 854(1981))을 제한 효소 HindIII 와 BamHI를 사용하여 2개의 절편으로 절단하고, 다이하이드로폴레이트 리덕타 제(dihye: DHFR)을 유전자를 포함하는 절편을 분리 정제한다. 다음에, 플라스미드 pRSV-CAT(프로쎄스 오브 내셔날 아카데믹 사이엔스(Proc.Natl.Acad.Sci.) 미국, 79, 6777(1981))를 HindIII 와 BamHI를 사용하여 절단시키고, 로스사코마 바이러스(Rous Sarcom a Virus: RSV)의 LTR(long terminal repeat)를 포함하고 있는 절편을 분리 정제한다. 이 두 개의 정제된 절편들을 T4 DNA 리가제를 사용하여 결찰시킨다. 대장균 HB101이 컴피텐트 세포(E.Coli Hb101 Competent Cells)에 위의 결찰생성물을 가하여 전형시킨다. 플라스미드 DNAs를 항 암피실린 콜로니로부터 제조하고, 제한 효소로 소화시킨다. 예측된 제한 효소도를 나타내는 원하는 플라스미드 pRSV-dhfr을 얻는다. 이 플라스미드는 RSV 의 LTR 부분, DHFR 유전자, SV40으로부터 유도된 게재 서열(intervening sequence), 폴리아데닐레이션 신호, 복제원, 대장균 플라스미드 pBR322로부터 유도된 항 암피실린 유전자를 포함하고 있으며, LTR 부분에 포함되어 있는 촉진자의 조절하에서 DHFR을 발현시킨다.

이 플라스미드는 pRSV-dhfr을 NdeI와 BamHI를 사용하여 2개의 절편으로 절단시키고, DHFR 유전자를 포함하고 있는 절편을 분리 정제한다. 얻어진 DNA 절편을 DNA 폴리머라제 I(Klenow 절편)으로 처리하여 결합력이 있는 말단을 무딘 말단으로 변화시킨다.

한편, 절차(6)으로부터 얻어진 플라스미드 pcDM·CSF11을 Sal I을 사용하여 절단시키고, 절단된 말단을 DNA 폴리머라제 I으로 처리하여 무딘 말단으로 변환시킨다. 얻어진 2개의 절편을 T4 DNA 리가제를 사용하여 서로 결찰시키고, 이 결찰물을 대장균 JM-109 컴피텐트 세포에 전형시킨다. 플라스미드 DNAs는 얻어진 항 암피실린 콜로니로부터 제조되며, 제한 효소도를 작성하여, M-CSF와 DHFR 유전자 모두를 발현시킬 수 있는 원하는 pcDM·CSF11-dhfr을 얻는다. 이 플라스미드는, SV40가 촉진자, SV40으로부터 유도된 게재서열, M-CSF 유전자와 폴리아데닐레이션 신호등의 M-CSF 유전자 발현에 관한 서열들과 RSV로부터 유도된 LTR,DHFR 유전자, SV40 초기촉진자와 폴리아데닐레이션 신호등의 DHFR 유전자 발현에 관한 서열들을 포함하고 있다. 그외에, 이 플라스미드는 복제원과 대장균 플라스미드 pBR322로부터 유도된 항 암피실린 유전자도 포함하고 있다. 제12a도와 제12b도는 위의 절차를 도식적으로 나타내고 있다.

(15) 이렇게 얻어진 플라스미드 pcDM·CSF11-dhfr을 사용하여, r-MCSF를 절차(3)에 의하여 제조한다. 얻어진 배양상등액의 CSF 활성은 평판당 콜로니 수(평균)로 환산하여 68이었다(기준으로 삼은 플라스미드 pcDE 에 대한 것은 0이다).

(16) 75-㎠ 희배양 플라스크(코스타사 제품)에서 배양한 중국산 햄스터(hamster)의 난소 dhfr-결핍세포(CHO-DUK dhfr-세포:프로쎄스 오브 내셔날 아카데믹 사이엔스(Proc, Natl, Acda, Sci), 미국 77, 4216(1980))를 통상적인 방법에 따라 트립신(플로우 래브 제품)으로 처리하고, 10%의 투석된 FCS(GIBCO 제품)를 보충한 둘베코의 변이 최소 필수 배지(Dulbeccoo's modified minimum essential medium(DMEM), GIBCO 라보라터리 라이프 테크놀러지스 제품)에 현탁시킨 다음, 같은 배지로 씻어내고, 배지로부터 분리해낸다.

그다음, 이 세포들을 DNA 주입액(0.25M 만니톨-0.1mM CaCl₂, 2H₂O-0.1mM MgSO₄, 7H₂O-0.2mM 트리스-HCl(pH 7.2), 와코 퓨어 케미칼 인더스트리스(Wako Pure Chemical Industries Ltd. 제품)에 현탁시킨다.

절차(14)에 의하여 얻는 M-CSF 발현 플라스미드 pcDM·CSF11-dhfr을 Cla I에 의하여 선형으로 절단시키고, DNA 주입액에 용해한다.

세포 현탁액 (200㎕, 2×10⁶세포)과 DNA 용액(200㎕, 30㎍의 DNA)을 서로 혼합하고, 이 혼합액을 퓨전체임버 CH-2(시마쯔 세이사규소 제품)에 넣고, 일렉트릭 퓨전 디바이스 SSH-1(시마쯔 세이사꾸쇼 제품)에 연결시킨다.

세포내로 이 DNA를 전기적으로 트랜스팩트시키기 위하여, 1초에 두차례씩 이 혼합물에 4.2KV/㎠의 펄스를 가한다. 이 DNA가 트랜스펙트된 세포들을 10%의 투석된 FCS-1%의 비필수 아미노산 용액(플로우 래브제품)-2%의 HT 용액(플로우래브 제품)-DMEM 배지의 혼합용액에 현탁시키고, 24-웰평판(코스타사 제품)상에서 배양시킨다.

48시간 동안 배양시킨후, 배지를 선발 배지(10%의 투석된 FCS 와 1%의 비필수 아미노산 용액이 포함된 DMEM 배지)로 교체한다. 그후, 이 배지를 3-4일마다 신선한 배지로 교체해 준다. 이렇게 10-14일 동안 배양하여 얻은 전형된 세포 20클론 중에서, 50클론을 선발하고, 통상적인 방법에 따라 트립신으로 처리한다음 새로운 24-웰 평판으로 옮긴다.

DHFR 유전자의 증폭은 높은 농도의 메토트레제트(MTX:methotrexate)에 대하여 내성을 나타내며(J.B.C., 253, 1357(1987)), 또한 DHFR 유전자를 트랜스팩트시킨 유전자는 MTX에 의해서 증폭된다.(저널오브 뮬레큘라 바이올러지(J.Mol.Biol), 159, 601(1982)).

전형된 세포들중의 50클론을 20nM MTX를 포함하는 선발 배지에서 배양한다.

증식된 내성을 갖는 클론들을 트립신으로 처리하고, 50nM MTX를 포함하는 선발 배지에 현탁시킨 다음 배양한다. 마찬가지로, 이렇게 하여 증식된 내성을 갖는 클론을 100nM MTX를 함유하는 선발 배지에서 배양시켜, 궁극적으로 400nM MTX 에 대하여도 내성을 갖는 클론을 산출한다.

다음의 표 7은 이들 내성을 갖는 클론의 배양 상등액에 대한 CSF 활성치를 나타내고 있다.

[표 7]

상기와 같은 절차에 의해서 제조된 CHO 세포의 배양 상등액은 SDS-PAGE 에 대한 시료로서 직접 사용되며, 절차(13)에서와 같은 방법으로 분자량을 측정한다. M-CSF의 띠는, 비환원 상태하에서는 90,000에 해당되는 위치에서, 환원 상태하에서는 44,000에 해당되는 위치에서 검출되었다.

Claims (15)

1. 하기의 식(1) 또는 일부분의 뉴클레오타이드 서열에 의거한, 생물학적 활성을 갖는 인간의 M-CSF를 암호화하는 것을 특징으로하는 유전자.

   

   

   
2. 제1항에 있어서, 최소한 35번째 아미노산 Val을 암호화하는 코돈 GTG에서 177번째 아미노산 Glu을 암호화하는 코돈 GAA 까지의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 유전자.
3. 제2항에 있어서, 35번째 아미노산 Val을 암호화하는 코돈 GTG에서 177번째 아미노산 Glu을 암호화하는 코돈 GAA 까지의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 유전자.
4. 제1항에 있어서, 36번째 아미노산 Val을 암호화하는 코돈 GTG에서 185번째 아미노산 Tht을 암호화하는 코돈 ACC까지의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 유전자.
5. 제1항에 있어서, 첫번째 아미노산 Met을 암호화하는 코돈 ATG에서 177번째 아미노산 Glu을 암호화하는 코돈 GAA까지의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 유전자.
6. 제1항에 있어서, 첫번째 아미노산 Met을 암호화하는 코돈 ATG에서 185번째 아미노산 Thr을 암호화하는 코돈 ACC까지의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 유전자.
7. 제1항에 있어서, 35번째 아미노산 Val을 암호화하는 코돈 GTG에서 554번째 아미노산 Val을 암호화하는 코돈 GTG까지의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 유전자.
8. 제1항에 있어서, 첫번째 아미노산 Met을 암호화하는 코돈 ATG에서 372번째 아미노산 Pro을 암호화하는 코돈 CCC까지의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 유전자.
9. 제1항에 있어서, 식(1)의 전체 뉴클레오타이드 서열을 갖는 유전자.
10. 제1항에 있어서, 제10도 또는 제11도에 나타난 뉴클레오타이드 서열을 갖는 유전자.
11. 생물학적 활성을 갖는 인간의 M-CSF를 발현시킬 수 있는 제1항에서 정의된 유전자를 포함하는 발현벡터.
12. 생물학적 활성을 갖는 인간의 M-CSF를 생성시킬 수 있는 제11항에서 정의된 발현벡터를 품고 있는 전형물.
13. 제1항 내지 제10항중의 어느 한 항에서 정의된 유전자를 포함하고 생물학적으로 활성을 갖는 인간의 M-CSF를 발현시킬 수 있는 발현벡터를 품고 있는 전형물을 배양하고, 이전형물로부터 얻어진 M-CSF를 모으는 것으로 이루어지는 인간의 재조합 M-CSF를 제조하는 방법.
14. 플라스미드 pcDM·CSF, 플라스미드 pcDM·CSF-185, 플라스미드 플라스미드 pcDM·CSF-177, 플라스미드 pcDM·CSF11, 플라스미드 pcDM·CSF11-185. 플라스미드 pcDM·CSF11-177, 플라스미드 pIN-III(1ppP-5)-OmpA-MCSF11-NV151, 플라스미드 pIN-III(1ppP-5)-OmpA-MCSF11-NV143 및 pcDM·CSF11-dhfr 로 구성된 그룹으로부터 선택되고, 생물학적으로 활성을 갖는 인간의 M-CSF를 발현시킬 수 있는 발현벡터를 품고있는 전형물을 배양하고, 이 전형물로부터 얻어진 M-CSF를 모으는 것으로 이루어지는 인간의 재조합 M-CSF를 제조하는 방법.
15. 제13항 또는 제14항에서 정의된 방법으로 제조한 인간의 재조합 M-CSF.

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