JPH08131178A - 還元能を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 分子中に配列番号２のアミノ酸番号１〜５２
６のアミノ酸配列を含み、ジクロロフェノール・インド
フェノールおよび酸化型グルタチオンを還元する活性を
有するタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、
該タンパク質に対するモノクローナル抗体等を提供する
ことを課題とする。 【解決手段】 動脈硬化症、糖尿病、虚血障害（再かん
流障害、虚血性心疾患、脳虚血、虚血性腸炎など）など
の病態、疾患の予防、治療において、単独又は他の治療
薬との併用投与で用いうる、ジクロロフェノール・イン
ドフェノールおよび酸化型グルタチオンの還元活性を有
するタンパク質を提供した。また、該タンパク質の精製
等に用いられる該タンパク質に対するモノクローナル抗
体を提供した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ジクロロフェノー
ル・インドフェノールおよび酸化型グルタチオンを還元
する活性を有する新規なタンパク質に関し、かつ該タン
パク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むことからな
る組換えＤＮＡベクター、該組換えＤＮＡベクターで形
質転換せしめた宿主、および該タンパク質の有効量を含
有するタンパク質組成物、該タンパク質に対するモノク
ローナル抗体及び該モノクローナル抗体を利用した該タ
ンパク質の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞内で酸化剤として、代謝エネルギー
に利用された酸素は、自らは還元されて、スーパーオキ
シド(O^2-) 、過酸化水素(H₂O₂)またはヒドロキシラジカ
ル(・OH) などの活性酸素やフリーラジカルを経て、水(H
₂O) になる。ここでいう活性酸素とは、大気中の酸素よ
りも活性化された酸素、およびその関連分子の総称であ
り、一方、フリーラジカルとは、不対電子を一つ、また
はそれ以上有する分子や原子のことをいう。これらは、
一般に不安定で、脂質、蛋白質、および核酸を変性させ
る活性を有する。そのため、生物は、活性酸素やフリー
ラジカルをできるだけ遊離させないように制御してい
る。しかし、生体内でのそれらの生成は避けることがで
きず、しかもその反応性が高いため、極めて少量であっ
ても障害を生じ、生物はそれらを防御する機構なしに生
存できない。すなわち、これら活性酸素やフリーラジカ
ルが正常な生理的条件下で発生する場合、その生成の
場、量、時ともにうまくコントロールされており、自ら
が有する抗酸化剤、あるいは抗酸化酵素による防御メカ
ニズムによって、細胞内でバランスよく代謝される（こ
こでいう「抗酸化剤」とは、油脂の自動酸化を防止する
作用を持つ天然の物質の総称であり、「抗酸化酵素」と
は、活性酸素を消去する反応を触媒する作用を持つ酵素
の総称である。また、これらの示す作用を「抗酸化作
用」という。） しかしながら、例えば、生体が精神的ストレスを受けた
場合、喫煙を行った場合、薬物を接種された場合、手術
を受けた場合、臓器を移植された場合又は脳・心筋梗塞
にて虚血状態にさらされた場合等においては、過剰に発
生した活性酸素やフリーラジカルは消去されきれずに残
り、正常な細胞に重篤な障害を与えることがある。それ
ゆえ、活性酸素やフリーラジカルを原因とした、いわゆ
る酸化的ストレスを原因とした疾患も多く存在する。

【０００３】例えば、動脈硬化症においては、活性酸素
やフリーラジカルにより酸化された低比重リポ蛋白の出
現が発症の原因の一つであると考えられている（Steinb
erg,D.(1983) Arteriosclerosis 3,283-301 ）。また、
糖尿病においても、酸化的ストレスが、発症機構、代謝
異常、血管合併症の成因と密接に関連しているといわれ
ている（近藤元治編集，“最新医学からのアプローチ
(4) フリーラジカル”メジカルビュー社138-146 ）。そ
の他にも虚血障害（再かん流障害、虚血性心疾患、脳虚
血、虚血性腸炎など）、浮腫、血管透過性亢進、炎症、
胃粘膜障害、急性膵炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、肝
障害、パラコート病、肺気腫、化学発癌、癌転移、成人
呼吸窮迫症候群、汎発性血管内血液凝固症候群(DIC) 、
白内障、未熟児網膜症、自己免疫疾患、ポルフィリー血
症、溶血性疾患、地中海性貧血、パーキンソン病、アル
ツハイマー病、てんかん発作、紫外線障害、放射線障
害、凍傷、熱傷などの病態、疾患に活性酸素やフリーラ
ジカルが関与しているものと考えられている。

【０００４】生理的に発生する活性酸素やフリーラジカ
ルを処理する目的で、細胞の内外には、発生した活性酸
素やフリーラジカルを消去するいくつかの防御システム
が存在する。

【０００５】細胞内においては、以下に示す抗酸化剤、
または抗酸化酵素が活性酸素やフリーラジカルを消去す
る働きをもつことが知られている。例えば、ペルオキシ
ゾームに存在するカタラーゼは、過酸化水素を還元除去
する。グルタチオンペルオキシダーゼは、細胞質とミト
コンドリアに認められ、還元型グルタチオン存在下で過
酸化水素や過酸化脂質を還元し無毒化する。トランスフ
ェリン、フェリチン、およびラクトフェリン等は、鉄イ
オンを、セルロプラスミンは、銅イオンを安定化させる
ことにより、活性酸素の発生を抑える。また、細胞質、
ミトコンドリアの存在するスーパーオキシドディスムタ
ーゼは、スーパーオキシドを還元し、過酸化水素を産生
する反応を触媒することにより、スーパーオキシドを消
去する。この他、ビタミンＣ、Ｅ、および還元型グルタ
チオンなどの低分子化合物にも、活性酸素を還元除去す
る活性がある。

【０００６】一方、細胞外においては、細胞外型スーパ
ーオキシドディスムターゼ、細胞外型グルタチオンペル
オキシダーゼ、および還元型グルタチオン等が存在し、
同様に活性酸素や過酸化脂質を還元的に消去する。但
し、細胞外の抗酸化剤、または抗酸化酵素は、細胞内ほ
ど種類が豊富でなく、細胞外において抗酸化作用を示す
と考えられているものは、ごくわずかである。

【０００７】細胞内外で還元状態を保つために重要な働
きをもつグルタチオンは、下記式で示される化合物であ
り、1888年に de-Rey-Pailhadeによって酵母で初めて発
見され、1921年に Hopkinsにより化合物として分離され
グルタチオンと命名された。

【０００８】

【化１】

【０００９】このグルタチオンは、グルタミン酸、シス
テイン、およびグリシンの三つのアミノ酸からなり、チ
オール基を持ち、酸化物が存在すると二分子のグルタチ
オンがジスルフィド結合をつくり、容易にその酸化物を
還元する。グルタチオンは、主に肝臓で作られ、血漿中
を介して体内循環している。正常な体内では、そのほと
んどが還元型として存在しており、酸化型グルタチオン
が増加すると、グルタチオン還元酵素により、ニコチン
アミドアデニン・ジヌクレオチドリン酸(NADPH) から水
素が受け渡されて、還元型のグルタチオンへと変換され
る。こうして生成された還元型グルタチオンが、細胞膜
を酸化的障害から防御したり、活性酸素やフリーラジカ
ルを消去する還元剤として働く。その抗酸化作用によ
り、還元型グルタチオンは、放射線防御剤、および白内
障に対する治療薬でもある。最近では、エイズ感染者に
おいて、全身レベルで還元型グルタチオン量が減少して
いることも報告されており、還元型グルタチオンの体内
における役割は、非常に大きい。

【００１０】細胞内外で還元活性を介して様々な生理作
用を示す物質の第二の例としては、成人Ｔ細胞白血病細
胞株に対してインターロイキン２レセプター(IL-2R) 誘
導因子としてクローニングされた、ヒト型チオレドキシ
ン(ADF:Adult T cell leukemia Derived Factor)が挙げ
られる。このADF は、チオール依存性還元酵素であり、
その活性部位に二つのシステイン残基を持ち、活性酸素
またはフリーラジカルに対して、還元活性を有する。

【００１１】このADF は、IL-2R 誘導活性以外にも、EB
V(Epstein-Barr virus) 感染Ｂ細胞株3B6 に対する細胞
増殖促進作用、単球由来細胞株U937の腫瘍壊死因子(TN
F:tumor necrosis-factor) に対する防御作用、およ
び、好中球による血管内皮細胞障害に対する防御作用な
どを示す。また、細胞内においても、その還元活性を介
して転写因子NFkB、Jun およびFos などに作用しＤＮＡ
結合活性を促進し、転写活性を増加させる働きを持つ。
現在、ADF は、その還元活性を介した細胞障害防御能な
どから、放射線障害の予防薬、再かん流障害、リウマチ
性関節炎、および炎症などの治療薬として開発がなされ
ている。

【００１２】以上記載したように、活性酸素やフリーラ
ジカルを消去して、細胞内外を還元状態に保つことは生
理的に非常に重要である。細胞内外には、まだ知られて
いない多くの抗酸化剤、あるいは抗酸化酵素が存在し、
活性酸素やフリーラジカルを除去する役割を果たしてい
ると思われる。そこで、こうした、活性酸素やフリーラ
ジカルを除去する活性を持つ新たな抗酸化剤、あるいは
抗酸化酵素を得られれば、活性酸素やフリーラジカルを
原因とする各種疾患の新しい治療薬の一つとなりうる。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、活性酸素や
フリーラジカルの消去に関与する新規な抗酸化酵素をコ
ードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクター
で形質転換された宿主細胞、活性酸素やフリーラジカル
の消去に関与する新規な抗酸化酵素、該酵素に対するモ
ノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を利用した
該酵素の精製方法を提供することを課題とする。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ジクロロ
フェノール・インドフェノールおよび酸化型グルタチオ
ンを還元する活性を有する新規なタンパク質をコードす
るＤＮＡを見出し、該タンパク質を遺伝子操作の手法を
用いて大量に取得して本発明を完成した。本発明によっ
てジクロロフェノール・インドフェノールおよび酸化型
グルタチオンを指標とした還元活性を有するタンパク質
を大量に得ることが可能となり、各種酸化的ストレスに
よる細胞障害、さらには、先に示した活性酸素が原因と
なる種々の疾患に該タンパク質を適用できるようになっ
た。

【００１５】更に、本発明者らは、該タンパク質で動物
を免疫し、該タンパク質に対するモノクローナル抗体を
取得した。該抗体は、該タンパク質の詳細な機能を解析
するために重要であり、該タンパク質の機能、組織分布
などを検索したり、該タンパク質の定量などをする上で
有用である。また、本発明者らは、該モノクローナル抗
体を利用して該タンパク質を精製する方法を提供した。
該方法によって、簡単に該タンパク質の精製をすること
ができるようになった。

【００１６】具体的には、本発明は、(1) 分子中に配列
番号２のアミノ酸番号１〜５２６のアミノ酸配列を含
み、ジクロロフェノール・インドフェノールおよび酸化
型グルタチオンを還元する活性を有するタンパク質、ま
たは、分子中に該アミノ酸配列の一つもしくは二つ以上
のアミノ酸残基が欠失、挿入若しくは置換されているア
ミノ酸配列を含み、該還元活性を有するタンパク質をコ
ードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、(2) 分子中に
配列番号２のアミノ酸番号１〜５２６のアミノ酸配列を
含み、ジクロロフェノール・インドフェノールおよび酸
化型グルタチオンを還元する活性を有するタンパク質を
コードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、(3) 分子中
に配列番号１のヌクレオチド番号７０〜１６４７のヌク
レオチド配列を含む、(1) 又は(2) 記載のＤＮＡ、(4)
分子中に配列番号１のヌクレオチド番号７０〜１６４７
のヌクレオチド配列と７０％以上のヌクレオチド配列相
同性を有する配列を含み、ジクロロフェノール・インド
フェノールおよび酸化型グルタチオンを還元する活性を
有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む
ＤＮＡ、(5) 分子中に配列番号１のヌクレオチド番号７
０〜１６４７のヌクレオチド配列と５５％以上のヌクレ
オチド配列相同性を有する配列を含み、ジクロロフェノ
ール・インドフェノールおよび酸化型グルタチオンを還
元する活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチ
ド配列を含むＤＮＡ、(6) (3) 記載のＤＮＡとハイブリ
ダイズし、ジクロロフェノール・インドフェノールおよ
び酸化型グルタチオンを還元する活性を有するタンパク
質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、(7)
(3) 記載のＤＮＡと、６０〜７０℃、６×SSC 条件下で
ハイブリダイズし、ジクロロフェノール・インドフェノ
ールおよび酸化型グルタチオンを還元する活性を有する
タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、(6)
記載のＤＮＡ、(8) (1),(2),(3),(4),(5),(6) または
(7) いずれかに記載のＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクタ
ー、(9) (8) 記載の組換えＤＮＡベクターにより形質転
換された宿主細胞、(10)(9) 記載の細胞が産生するタン
パク質、(11)分子中に配列番号２のアミノ酸番号１〜５
２６のアミノ酸配列を含み、ジクロロフェノール・イン
ドフェノールおよび酸化型グルタチオンを還元する活性
を有するタンパク質、または、分子中に該アミノ酸配列
の一つもしくは二つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入若
しくは置換されているアミノ酸配列を含み、該還元活性
を有するタンパク質、(12)分子中に配列番号２のアミノ
酸番号１〜５２６のアミノ酸配列を含み、ジクロロフェ
ノール・インドフェノールおよび酸化型グルタチオンを
還元する活性を有するタンパク質、(10)〜(12)のいずれ
かに記載のタンパク質に対するモノクローナル抗体、(1
3)のモノクローナル抗体と試料を接触させ、該モノクロ
ーナル抗体と結合したタンパク質を分離することを特徴
とする、タンパク質の精製方法、を提供するものであ
る。

【００１７】すなわち、本発明は、ジクロロフェノール
・インドフェノール、および酸化型グルタチオン還元活
性を有する新規タンパク質をコードするＤＮＡを提供す
るものである。

【００１８】本発明はまた、上記ＤＮＡを含む組換えベ
クターを提供するものである。該ベクターは、宿主細胞
内で自己増殖可能であること、すなわち自己増殖するの
に必要な塩基配列を含むことを要する。

【００１９】本発明は更に、上記ＤＮＡを含み微生物細
胞内で自己増殖可能な組換えベクターにより形質転換さ
れた宿主細胞を提供するものである。

【００２０】本発明は更に、ジクロロフェノール・イン
ドフェノール、および酸化型グルタチオン還元活性を有
する新規タンパク質を提供するものである。

【００２１】本発明は更に、ジクロロフェノール・イン
ドフェノール、および酸化型グルタチオン還元活性を有
する新規タンパク質に対するモノクローナル抗体を提供
するものである。

【００２２】本発明は更に、上記モノクローナル抗体を
用いたジクロロフェノール・インドフェノール、および
酸化型グルタチオン還元活性を有する新規タンパク質の
精製方法を提供するものである。

【００２３】

【発明の実施の形態】本発明のＤＮＡは、例えば、哺乳
類細胞などから、ジクロロフェノール・インドフェノー
ルおよび酸化型グルタチオンの還元活性を有する新規タ
ンパク質をコードするmRNAを調製した後、既知の方法に
より二本鎖のcDNAに変換することによって得られる。前
記mRNAの供給源となる動物細胞は、本発明においては、
ヒト骨髄間質由来の細胞株KM-102（Harigaya, K and Ha
nda, H. (1985) Proc. Natl.Acad.Sci.USA, 82, 3447-3
480 ）が好適であるが、哺乳動物から分離できる細胞、
および組織、あるいは樹立した他の細胞株を使用するこ
ともできる。

【００２４】mRNAの抽出にあたっては、グアニジン・チ
オシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チ
オシアネート・グアニジン・塩酸法なども採用しうる
が、グアニジン・チオシアネート・塩化セシウム法が好
適である。

【００２５】真核細胞の細胞質に存在するmRNAの多く
は、その３′末端にポリＡ配列をもつことが知られてい
るので、この特徴を利用してオリゴ(dT)セルロースのカ
ラムにmRNAを吸着させて、つぎにこれを溶出して精製す
ることができる。さらにショ糖密度勾配遠心法などによ
り、mRNAをさらに分画することもできる。

【００２６】上記のごとくして得られたmRNAが、ジクロ
ロフェノール・インドフェノールおよび酸化型グルタチ
オン還元活性をもつタンパク質をコードするものである
ことを確認するためには、mRNAをタンパク質に翻訳させ
酵素活性を調べるか、該タンパク質に特異的な抗体を用
いてそのタンパク質を同定する等の方法で行い得る。例
えば、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)の卵母細胞
にmRNAを注入して翻訳させたり（Gardon,J.B.et al.(19
72) Nature 233,177-182）、あるいは、ウサギ網状赤血
球系や小麦胚芽系を利用した翻訳反応が行い得る（Schl
eif,R.F.and Wensink,P.C.(1981): “Practical Method
s in Molecular Biology”,Springer-Verlag,NY.）。

【００２７】ジクロロフェノール・インドフェノールお
よび酸化型グルタチオンの還元活性の測定は、以下のよ
うに実施できる。

【００２８】i)ジクロロフェノール・インドフェノール
還元活性の測定(Beinert,H.(1962)“Methods in Enzymo
logy ”5,546) ジクロロフェノール・インドフェノール（シグマ社製）
を２０mMリン酸緩衝液0.5 M NaCl(pH7.8) で５０μM に
調製後、１mlをキュベット（SARSTEDT社製、10×4 ×45
mm）に添加し、ついで測定試料を加える。反応は、室温
下、同緩衝液で１mMに調製したNADPH （ベーリンガーマ
ンハイム社製）１５μl をキュベットに添加することで
開始する。６００nmにおける酸化型ジクロロフェノール
・インドフェノールの吸収の減少、または３４０nmにお
けるNADPH の吸収の減少を追跡することで、還元酵素活
性が測定できる。

【００２９】ii) 酸化型グルタチオン還元活性の測定
（中島 暉躬ら、“新基礎生化学実験法(6) 生物活性を
用いる測定法”3-34） 酸化型グルタチオン（ベーリンガーマンハイム社製）を
２０mMリン酸緩衝液、0.5 Ｍ NaCl(pH7.8) で１０mMに
調製後、あらかじめ試料を添加したキュベット(10 ×4
×45 mm)に１５μl 加える。反応は、室温下、同緩衝液
で１mMに調製したNADPH を１５μl キュベットに添加す
ることで開始する。３４０nmにおけるNADPH の吸収の減
少を追跡することで、グルタチオン還元酵素活性の測定
が可能である。

【００３０】前述のごとき方法で得たmRNAを鋳型とし
て、逆転写酵素を用いて一本鎖cDNAを合成した後、この
一本鎖cDNAから二本鎖cDNAを合成することができる。そ
の方法としては、Slヌクレアーゼ法（Efstratiadis,A.e
t al.(1976) Cell 7,279-288）、Land法（Land,H.et a
l.(1981) Nucleic Acids Res.9,2251-2266 ）、O.Joon
Yoo法（Yoo,O.J.et al.(1983) Proc.Natl.Acad.Sci.USA
79,1049-1053）なども採用し得るが、本発明の目的に
は、Okayama-Berg法（Okayama,H.and Berg,P.(1982) Mo
l.Cell.Biol.2,161-170 ）が好適である。

【００３１】つぎに、得られた組換えプラスミドを大腸
菌、例えばDH5 α株に導入し形質転換させて、テトラサ
イクリン耐性、あるいは、アンピシリン耐性を指標とし
て組換え体を選択することができる。宿主細胞の形質転
換は、例えば宿主細胞が大腸菌の場合には、Hanahan の
方法（Hanahan,D.(1983) J.Mol.Biol.166,557-580 ）、
すなわちCaCl₂ やMgCl₂ 、またはRbClを共存させて調製
したコンピテント細胞に、該組換えＤＮＡ体を加える方
法により実施することができる。なお、ベクターとして
は、プラスミド以外に、ラムダ系などのファージベクタ
ーも用いることができる。

【００３２】上記により得られる形質転換株から、目的
のジクロロフェノール・インドフェノールおよび酸化型
グルタチオン還元活性を有するタンパク質をコードする
ＤＮＡを有する株を選択する方法としては、例えば以下
に示す各種方法のいずれかを採用する。

【００３３】(1) 合成オリゴヌクレオチドプローブを用
いるスクリーニング法 目的のタンパク質のアミノ酸配列の全部、または一部が
解明されている（該配列は、複数個連続した特異的配列
であれば、目的のタンパク質のどの部分でも良い）場
合、該アミノ酸に対するオリゴヌクレオチドを合成し
（この場合、コドン使用頻度を用いて導いたヌクレオチ
ド配列、または、考えられるヌクレオチド配列を組み合
わせた複数個のヌクレオチド配列のどちらでも良く、ま
た、後者の場合、イノシンを含ませてその種類を減らす
こともできる）、これをプローブ（³²P 、または、³⁵S
で標識する）として、形質転換株ＤＮＡを変性固定した
ニトロセルロースフィルターまたはナイロンフィルター
とハイブリダイズさせ、得られたポジティブ株を検索し
て、これを選択する。

【００３４】(2) ポリメラーゼ連鎖反応により作製した
プローブを用いるスクリーニング法 目的のタンパク質のアミノ酸配列の全部、または、一部
が解明されている場合、該アミノ酸の一部に対応するセ
ンスストランドとアンチセンスストランドのオリゴヌク
レオチドを合成し、ポリメラーゼ連鎖反応（Saiki,R.K.
et al.(1988) Science 239,487-491）を行い、目的のジ
クロロフェノール・インドフェノールおよび酸化型グル
タチオン還元活性を有するタンパク質をコードするＤＮ
Ａ断片を増幅する。ここで用いる鋳型ＤＮＡとしては、
ジクロロフェノール・インドフェノールおよび酸化型グ
ルタチオン還元活性を有するタンパク質を産生する細胞
のmRNAより逆転写反応にて合成したcDNA、またはゲノム
ＤＮＡを用いることができる。このようにして調製した
ＤＮＡ断片を³²P または、³⁵S で標識し、これをプロー
ブとして用いてコロニーハイブリダイゼーション、また
は、プラークハイブリダイゼーションを行うことによ
り、目的のクローンを選択する。

【００３５】(3) 他の動物細胞株でジクロロフェノール
・インドフェノールおよび酸化型グルタチオン還元活性
を有するタンパク質を産生させてスクリーニングする方
法 形質転換株を培養し、遺伝子を増幅させ、その遺伝子を
動物細胞にトランスフェクトし（この場合、自己複製可
能で、転写プロモーター領域を含むプラスミド、もしく
は動物細胞の染色体に組み込まれ得るようなプラスミド
のいずれも使用し得る）、遺伝子にコードされたタンパ
ク質を産生させ、その培養上清または動物抽出物のジク
ロロフェノール・インドフェノールおよび酸化型グルタ
チオン還元活性を測定するか、または、ジクロロフェノ
ール・インドフェノールおよび酸化型グルタチオン還元
活性を有するタンパク質に対する抗体を用いて、ジクロ
ロフェノール・インドフェノールおよび酸化型グルタチ
オン還元活性を有するタンパク質を検出することによ
り、元の形質転換株より目的のジクロロフェノール・イ
ンドフェノールおよび酸化型グルタチオン還元活性を有
するタンパク質をコードするcDNAを有する株を選択す
る。

【００３６】(4) ジクロロフェノール・インドフェノー
ル及び酸化型グルタチオン還元活性を有するタンパク質
に対する抗体を用いて選択する方法 あらかじめ、cDNAを発現ベクターに組み込み、形質転換
株内でタンパク質を産生させ、ジクロロフェノール・イ
ンドフェノールおよび酸化型グルタチオン還元活性を有
するタンパク質に対する抗体、および該抗体に対する二
次抗体を用いて、所望のジクロロフェノール・インドフ
ェノールおよび酸化型グルタチオン還元活性を有するタ
ンパク質を検出し、目的の株を選択する。

【００３７】(5) セレクティブ・ハイブリダイゼーショ
ン・トランスレーションの系を用いる方法 形質転換株から得られるcDNAを、ニトロセルロースフィ
ルターまたはナイロンフィルターなどにブロットし、ジ
クロロフェノール・インドフェノールおよび酸化型グル
タチオン還元活性を有するタンパク質産生細胞からのmR
NAをハイブリダイズさせた後、cDNAに結合したmRNAを解
離させ、回収する。回収したmRNAを蛋白翻訳系、例え
ば、アフリカツメガエルの卵母細胞への注入や、ウサギ
網状赤血球ライゼートや、小麦胚芽などの無細胞系でタ
ンパク質に翻訳させ、そのタンパク質のジクロロフェノ
ール・インドフェノールおよび酸化型グルタチオン還元
活性を調べるか、またはジクロロフェノール・インドフ
ェノールおよび酸化型グルタチオン還元活性を有するタ
ンパク質に対する抗体を用いて検出し、目的の株を選択
する。

【００３８】なお、実施例で後述するように、上記の各
種方法を適用する前に、サイトカイン類のmRNAに共通し
て存在するAUUUA モチーフ（Shaw,G.and Kamen,R.(198
6) Cell 46,659-667 ）を参考にして設計した合成オリ
ゴヌクレオチド・プローブを用いて一次スクリーニング
を行った後、選択された陽性株について上述した(3) の
方法、すなわち、他の動物細胞のジクロロフェノール・
インドフェノールおよび酸化型グルタチオン還元活性を
有するタンパク質を産生させてスクリーニングする方法
を適用することにより、目的の株を選択することも可能
である。

【００３９】得られた目的の形質転換株よりジクロロフ
ェノール・インドフェノールおよび酸化型グルタチオン
還元活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの採取
は、公知の方法（Maniatis,T.et al.(1982):“Molecula
r Cloning A Laboratory Manual ”Cold Spring Harbor
Laboratory,NY）に従い実施できる。例えば、細胞より
プラスミドＤＮＡに相当する画分を分離し、該プラスミ
ドＤＮＡよりcDNA領域を切り出すことにより行い得る。

【００４０】このようにして得られるＤＮＡの配列決定
は、例えばマキサム−ギルバートの化学修飾法（Maxam,
A.M. and Gilbert,W.(1980):“Methods in Enzymology
”65, 499-559 ）やM13 ファージを用いるジデオキシ
ヌクレオチド鎖終結法（Messing,J.and Vieira,J.(198
2) Gene 19,269-276 ）などにより行うことができる。
近年、ＤＮＡの塩基配列を決定するために、従来使用し
ていたラジオアイソトープの代わりに蛍光色素を用い
て、コンピューターの制御下でロボットにジデオキシヌ
クレオチド鎖終結法を行わせ、電気泳動後の塩基配列の
解読も、コンピューターで行うシステムが普及している
（例えば、（株）パーキンエルマー・ジャパン・アプラ
イドバイオシステムズ社製、シークエンスロボット“CA
TALYST 800”、および373A DNAシークエンサー等）。こ
うしたシステムを利用することで、ＤＮＡ塩基配列決定
操作を能率よく、しかも安全に行うことが可能である。

【００４１】このようにクローン化されたジクロロフェ
ノール・インドフェノールおよび酸化型グルタチオン還
元活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む断
片は、適当なベクターＤＮＡに組み込むことにより、他
の原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換させ
ることができる。さらにこれらのベクターに適当なプロ
モーター、および形質発現に関わる配列を導入すること
により、それぞれの宿主において遺伝子を発現させるこ
とが可能である。

【００４２】原核細胞の宿主としては、例えば大腸菌
（Escherichia coli）や枯草菌（Bacillus subtilis ）
などが挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内
で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプ
リコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラ
スミドベクターで宿主細胞を形質転換させれば良い。ま
た、ベクターは、形質転換細胞に表現形質（表現型）の
選択性を付与することができる配列を持つものが望まし
い。

【００４３】例えば、大腸菌としては、E.coli K12株な
どがよく用いられ、ベクターとしては、一般にpBR322や
pUC 系のプラスミドが用いられるが、これらに限定され
ず、公知の各種の菌株、およびベクターがいずれも使用
できる。

【００４４】プロモーターとしては、大腸菌において
は、トリプトファン(trp) プロモーター、ラクトース(l
ac) プロモーター、トリプトファン・ラクトース(tac)
プロモーター、 リポプロテイン(lpp) プロモーター、 バ
クテリオファージ由来のラムダ（λ）PLプロモーター、
ホリペプチド鎖伸長因子Tu(tufB)プロモーター等が挙げ
られ、どのプロモーターも本発明のジクロロフェノール
・インドフェノールおよび酸化型グルタチオン還元活性
を有するタンパク質の産生に使用することができる。

【００４５】枯草菌としては、例えば207-25株が好まし
く、ベクターとしてはpTUB228 （Ohmura,K.et al.(198
4) J.Biochem. 95,87-93 ）などが用いられるが、これ
に限定されるものではない。

【００４６】プロモーターとしては、枯草菌のα−アミ
ラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列
を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能とな
る。

【００４７】真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆
虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、
例えばサルの細胞であるCOS 細胞（Gluzman,Y.(1981) C
ell 23,175-182）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞
(CHO) のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Urlaub,G.and C
hasin,L.A.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77,4216-422
0 ）などがよく用いられているが、これに限定されな
い。

【００４８】脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通
常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモータ
ー、RNA のスプライス部位、ポリアデニル化部位、およ
び転写終結配列等を有するものを使用でき、さらにこれ
は必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクター
の例としては、SV40の初期プロモーターを有するpSV2dh
fr（Subramani, S.et al.(1981) Mol.Cell.Biol.1,854-
864 ）などを例示できるが、これらに限定されない。

【００４９】また、真核微生物としては、酵母が一般に
よく知られており、その中でもサッカロミセス属酵母、
例えばSaccharomyces cerevisiaeが好ましい。該酵母な
どの真核微生物の発現ベクターとしては、例えばアルコ
ール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Bennetzen,J.L.
and Hall,B.D.(1982) J.Biol.Chem.257,3018-3025 ）や
酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Miyanoha
ra,A.et al.(1983) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,1-5 ）
などを好ましく利用できる。

【００５０】宿主細胞として、COS 細胞を用いる場合を
例に挙げると、発現ベクターとしては、SV40複製起点を
有し、COS 細胞において自律増殖が可能であり、さら
に、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびRNA
スプライス部位を備えたものを用いることができる。該
発現ベクターは、DEAE−デキストラン法（Luthman,H.an
d Magnusson,G.(1983) Nucleic Acids Res,11,1295-130
8 ）、リン酸カルシウム−DNA 共沈澱法（Graham,F.L.a
nd van der Eb,A.J.(1973) Virology 52,456-457）、お
よび電気パルス穿孔法（Neumann,E.et al.(1982) EMBO
J.1,841-845 ）などによりCOS 細胞に取り込ませること
ができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができ
る。また、宿主細胞としてCHO 細胞を用いる場合には、
発現ベクターと共に、G418耐性マーカーとして機能する
neo 遺伝子を発現し得るベクター、例えばpRSVneo （Sa
mbrook,J.et al.(1989):“Molecular Cloning A Labora
toryManual ”Cold Spring Harbor Laboratory,NY）
や、pSV2-neo（Southern,P.J.and Berg,P.(1982) J.Mo
l.Appl.Genet.1,327-341 ）などをコ・トランスフェク
ションし、G418耐性のコロニーを選択することにより、
ジクロロフェノール・インドフェノールおよび酸化型グ
ルタチオン還元活性を有するタンパク質を安定に産生す
る形質転換細胞を得ることができる。

【００５１】上記で得られる所望の形質転換体は、常法
に従い培養することができ、該培養により細胞内、また
は細胞外にジクロロフェノール・インドフェノールおよ
び酸化型グルタチオン還元活性を有するタンパク質が産
生される。該培養に用いられる培地としては、採用した
宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択で
き、例えば、上記COS 細胞であれば、RPMI-1640 培地や
ダルベッコ修正イーグル最小必須培地(DMEM)などの培地
に、必要に応じ牛胎児血清(FBS) などの血清成分を添加
したものを使用できる。

【００５２】上記より、形質転換体の細胞内、または細
胞外に生産されるジクロロフェノール・インドフェノー
ルおよび酸化型グルタチオン還元活性を有するタンパク
質は、該タンパク質の物理的性質や化学的性質など利用
した各種の公知の分離操作法により、それらより分離・
精製することができる。該方法としては、具体的には例
えば、通常の蛋白沈澱剤による処理、限外濾過、分子ふ
るいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグ
ラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィ
ー(HPLC)などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、
これらの組み合わせなどを例示できる。上記方法によ
り、容易に高収率、高純度で所望のジクロロフェノール
・インドフェノールおよび酸化型グルタチオン還元活性
を有するタンパク質を大量に製造できる。このようにし
て得られる本発明の組換えジクロロフェノール・インド
フェノールおよび酸化型グルタチオン還元活性を有する
タンパク質の諸性質は下記実施例に詳述する通りであ
り、このタンパク質は、それが有する酵素活性より、前
記した各種の分野で有用である。

【００５３】このようにして本発明ＤＮＡを利用して、
遺伝子工学的手法により得られる物質が、ジクロロフェ
ノール・インドフェノールおよび酸化型グルタチオン還
元活性を発現するためには、必ずしも配列番号２のアミ
ノ酸番号−２３〜５２６のアミノ酸配列の全てを有する
ものである必要はなく、例えばその部分配列であって、
それがジクロロフェノール・インドフェノールおよび酸
化型グルタチオン還元活性を示す限り、それらのアミノ
酸配列もまた本発明のタンパク質に包含される。また、
該タンパク質をコードするＤＮＡも本発明に含まれる。

【００５４】このようなジクロロフェノール・インドフ
ェノールおよび酸化型グルタチオン還元活性を示すタン
パク質としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列の
アミノ酸番号１のVal 残基をＮ末端とする５２６個のア
ミノ酸からなるタンパク質、すなわちジクロロフェノー
ル・インドフェノールおよび酸化型グルタチオン還元活
性を有するタンパク質を例示できる。

【００５５】また、該ジクロロフェノール・インドフェ
ノールおよび酸化型グルタチオン還元活性を有するタン
パク質をコードするＤＮＡも本発明におけるＤＮＡとし
て例示することができる。好適には、配列番号１に示さ
れるヌクレオチド配列の７０番目から１６４７番目まで
のヌクレオチド配列に表されるＤＮＡである。

【００５６】一般に真核生物の遺伝子は、インターフェ
ロン遺伝子などで知られているように、多型現象(polym
orphism)を示すと考えられ（例えば、Nishi,T.et al.(1
985)J.Biochem.97,153-159を参照）、この多型現象によ
って、一個またはそれ以上のアミノ酸が置換される場合
もあれば、ヌクレオチド配列の置換はあってもアミノ酸
は全く変わらない場合もある。

【００５７】配列番号２で示されるアミノ酸配列のアミ
ノ酸番号−２３〜５２６からなるジクロロフェノール・
インドフェノールおよび酸化型グルタチオン還元活性を
有する前駆体タンパク質、および配列番号２で示される
アミノ酸配列のアミノ酸番号１〜５２６からなるジクロ
ロフェノール・インドフェノールおよび酸化型グルタチ
オン還元活性を有する成熟体タンパク質のアミノ酸配列
の中の、一つもしくは二つ以上の部位において、一つも
しくは二つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入もしくは置
換されているタンパク質でも、ジクロロフェノール・イ
ンドフェノールおよび酸化型グルタチオン還元活性を有
することが多い。［天然型のアミノ酸配列が置換したア
ミノ酸配列を有するタンパク質が、天然型タンパク質と
同等の活性を有する例として、例えば、インターロイキ
ン２(IL-2)遺伝子のシステインに相当するヌクレオチド
配列をセリンに相当するヌクレオチド配列に変換して得
られたタンパク質が、IL-2活性を保持することが知られ
ている（Wang,A.et al.(1984)Science 224,1431-143
3）。］これらのタンパク質を本発明においては、ジク
ロロフェノール・インドフェノールおよび酸化型グルタ
チオン還元活性を有するタンパク質の同効物とよぶ。即
ち、それら天然に存在するか、あるいは人工合成された
タンパク質が、ジクロロフェノール・インドフェノール
および酸化型グルタチオン還元活性を有する限り、それ
らのタンパク質は、全て本発明に含まれる。また、これ
らのタンパク質をコードする、同効のヌクレオチド配列
からなるＤＮＡも全て本発明に含まれる。

【００５８】このような各種の本発明のＤＮＡは、上記
ジクロロフェノール・インドフェノールおよび酸化型グ
ルタチオン還元活性を有する因子の情報に基づいて、例
えばホスファイト・トリエステル法(Hunkapiller,M.et
al.(1984) Nature 310,105-111) などの常法に従い、核
酸の化学合成により製造することもできる。

【００５９】尚、所望アミノ酸に対するコドンは、その
選択も任意でよく、例えば利用する宿主のコドン使用頻
度を考慮して常法に従い決定できる（Grantham,R.et a
l.(1981) Nucleic Acids Res.9,143-174 ）。さらにこ
れらヌクレオチド配列のコドンの一部改変は、常法に従
い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドか
らなるプライマーを利用した、部位特異的変異導入法
（site specific mutagenesis ／Mark,D.F.et al.(198
4) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,5662-5666 ）などに従
うことができる。また、任意の一つもしくは二つ以上の
アミノ酸残基を欠失させた改変体を作製するためには、
エキソヌクレアーゼBal31 等を用いてＤＮＡを末端から
削る方法（岸本 利光ら、”続生化学実験講座１・遺伝
子研究法II”335-354 ）、カセット変異法（岸本 利
光、”新生化学実験講座２・核酸III 組換えＤＮＡ技
術”242-251 ）などに従うことができる。

【００６０】なお、所望のアミノ酸に対するコドンはそ
れ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば利用
する宿主のコドン使用頻度を考慮して定法に従い決定で
きる。

【００６１】また、あるＤＮＡが(3) 記載のＤＮＡとハ
イブリダイズするか否かは、例えば目的とするＤＮＡを
ランダムプライマー法（Anal. Biochem.,132:6-13 (198
3)）やニックトランスレーション法（Maniatis,T.et a
l.(1982) in“Molecular Cloning A Laboratory Manual
”Cold Spring Harbor Laboratory,NY. ）等に従い、
α- ³²P]dCTP等で標識したプローブを用いてハイブリダ
イゼーションを行い調べることができる。ハイブリダイ
ゼーションに用いるＤＮＡは、公知の方法、例えば、ニ
トロセルロース膜やナイロン膜等に吸着させ、加熱ある
いは紫外線等により固相化させる。その後、６×SSC と
５％ Denhardt 溶液、0.1 ％ＳＤＳを含むプレハイブリ
ダイゼーション溶液に浸し、５５℃で４時間以上保温す
る。その後先に作成したプローブを同様のプレハイブリ
ダイゼーション溶液に最終比活性１×10⁶ cpm/mlとなる
ように加え、６０℃で一晩保温する。その後、室温下で
６×SSC で５分間の洗浄を５回繰り返し、その後５７℃
で２０分間洗浄し、オートラジオグラフィーを行うこと
により、ハイブリダイズしたか否かを判定することがで
きる。この方法を利用して、任意のｃＤＮＡライブラリ
ーまたはゲノムライブラリーから、本発明のＤＮＡとハ
イブリダイズするＤＮＡを単離することができる（Mani
atis,T.et al.(1982) in“Molecular Cloning A Labora
tory Manual ”Cold Spring Harbor Laboratory,NY.
）。

【００６２】本発明のＤＮＡを用いて生産されるジクロ
ロフェノール・インドフェノールおよび酸化型グルタチ
オンの還元活性を有するタンパク質は、動脈硬化症、糖
尿病、虚血障害（再かん流障害、虚血性心疾患、脳虚
血、虚血性腸炎など）、浮腫、血管透過性こう進、炎
症、胃粘膜障害、急性膵炎、クローン病、潰瘍性大腸
炎、肝障害、パラコート病、肺気腫、化学発癌、癌転
移、成人呼吸窮迫症候群、汎発性血管内血液凝固症候群
(DIC) 、白内障、未熟児網膜症、自己免疫疾患、ポルフ
ィリー血症、溶血性疾患、地中海性貧血、パーキンソン
病、アルツハイマー病、てんかん発作、紫外線障害、放
射線障害、凍傷、熱傷などの病態、疾患の予防、治療に
おいて、単独又は他の治療薬との併用投与で用いられ
る。

【００６３】上記の症状を処置するために用いる本発明
の組成物は、医学的に許容される担体と治療上有効な量
のジクロロフェノール・インドフェノールおよび酸化型
グルタチオンの還元活性を有するタンパク質との混合物
からなる。本組成物は、種々の形態で投与することがで
き、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆
粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、または、注
射剤、点滴剤、坐薬などによる非経口投与をあげること
ができる。

【００６４】注射剤又は点滴剤として投与される場合、
該タンパク質は発熱物質を含まず、非経口的に許容可能
な水溶液の態様で用いられる。pH、等張性、及び安定性
を考慮して調製される上記の非経口的に許容されうる該
タンパク質溶液の調剤は、当業者の技術範囲内にある。

【００６５】上記症状の処置における投与量及び投与法
は、本薬剤の作用に影響を及ぼし得る要因、例えば、患
者の症状、体重、性、年令、食餌、何らかの感染の重
度、投与の時間及びその他の臨床上影響を与える要因を
考慮して診察する医師によって決定されうる。通常、経
口投与では成人に対して１日約0.01mg乃至1000mgであ
り、これらを１回又は数回に分けて投与することができ
る。また、非経口投与では、１回約0.01mg乃至100mg を
皮下注射、筋肉注射、又は静脈注射によって投与するこ
とができる。ここで使用されるタンパク質は、いずれも
生体由来のものまたは、遺伝子組換え体であるので、そ
れらの毒性は低い。

【００６６】一般的に、モノクローナル抗体の製造にあ
たっては、下記のような作業工程を経る。すなわち、
(a) 抗原として使用する生体高分子を精製、(b) マウス
への抗原の注射による免疫、および血液を採取しアッセ
イして脾臓摘出の時期を決定することにより成る抗体産
生細胞の調製、(c) 骨髄腫細胞( ミエローマ) の調製、
(d) 脾臓摘出、および脾細胞とミエローマの場合、(e)
目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、
(f) 単一細胞クローンへの分割( クローニング) 、(g)
場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造する
ためのハイブリドーマの培養、またはハイブリドーマを
移植したマウスの飼育、(h) このようにして製造された
モノクローナル抗体の生理活性、あるいは標識試薬とし
ての特性の検定等の作業工程を経る。

【００６７】本発明のモノクローナル抗体も上記工程に
そって製造することが可能であるが、これに制限され
ず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞、ミエローマ、他
の哺乳動物の抗体産生細胞、ミエローマが使用できるこ
とは言うまでもない。

【００６８】(a) 抗原の精製 抗原としては、(10)(11)または(12)のタンパク質であれ
ばいかなるものでもよいが、本発明のＤＮＡを大腸菌に
導入し発現させ、精製することによって得られる融合タ
ンパク質、本発明のＤＮＡでCOS-1 細胞をトランスフェ
クトして得られる無血清培養上清から精製されたタンパ
ク質などが抗原として有効である。

【００６９】(b) 抗体産生細胞の調製 本発明のＤＮＡを大腸菌へ導入し発現させ、精製した融
合蛋白とフロインドの完全、または不完全アジュバン
ト、またはカリミョウバンのような助剤とを混合し、免
疫原として実験動物に免疫する。実験動物としては、BA
LB/cマウスを使用することが望ましく、これは多様され
るマウス由来のミエローマがすべてBALB/cマウスを起源
にしており、しかもその性質が比較的詳しく研究されて
おり、さらに抗体産生細胞とミエローマがともにBALB/c
マウス由来であれば、得られるハイブリドーマがBALB/c
マウス腹腔内で増殖できるため、複雑な手順なしに腹水
よりモノクローナル抗体が得られるという利点があるた
めである。しかし、本発明がこれに制限されないことは
上記の通りである。

【００７０】免疫の際の免疫原投与法は、皮下注射、腹
腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射いずれで
もよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。

【００７１】免疫は、一回または適当な間隔で、好まし
くは1 週間から5 週間間隔で複数回繰返し行ってもよ
い。免疫した動物の血清中の該抗原に対する抗体価を測
定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供
給原として用いれば、その後の操作の効果を上げること
ができる。融合には最終免疫後3 〜5 日後の動物由来の
抗体産生細胞を用いることが好ましい。

【００７２】ここで用いる抗体価の測定法としては、放
射性同位元素免疫定量法(RIA法) 、固相酵素免疫定量法
(ELISA法) 、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法など種々
の公知技術があげられるが、感度、迅速性、正確性、お
よび自動化の可能性などの観点から、RIA 法、およびEL
ISA 法が好ましい。

【００７３】本発明による抗体価の測定は、例えばELIS
A 法によれば、以下のような手順により行うことができ
る。すなわち、抗原を固相に吸着させ、さらに抗原が吸
着していない固相表面を抗原と無関係な蛋白質、例えば
牛血清アルブミン(BSA) により覆い、該表面を洗浄後、
第一抗体として段階希釈した試料( 例えばマウス血清)
に接触させ、上記抗原に試料中の抗体を結合させ、さら
に第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗
体を加え、マウス抗体に結合させ、洗浄後該酵素の基質
を加え、基質分解に基づく発色などを測定することによ
り、抗体価算出を行うことができる。

【００７４】(c) 骨髄腫細胞の調製工程 骨髄細胞としては、一般的にはマウスから得られた株化
細胞、例えば8-アザグアニン耐性マウス(BALB/c 由来)
骨髄腫細胞株P3-X63 Ag8-U1(P3-U1)（CurrentTopics in
Microbiology and Immunology,81,1-7(1978)）、P3-NS
I/1-Ag4.1(NS-1)（European J.Immunology,6,511-519(1
976) ）、SP2/O-Ag14(SP-2)（Nature,276,269-270(197
8)）、P3-X63-Ag8.653(653) （J.Immunology,123,1548-
1550(1979)）、P3-X63-Ag8(X63) （Nature,256,495-497
(1975)）などを用いることが好ましい。これらの細胞株
は、適当な培地、例えば8-アザグアニン培地［RPMI-164
0培地にグルタミン(1.5mM) 、2-メルカプトエタノール
(5×10^-5M)、ゲンタマイシン(10 μg/ml) 、および牛胎
児血清(FCS 10%) を加えた培地に8-アザグアニンを加え
た培地］、Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMD
M)、またはDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)で
継代培養するが、細胞融合の3 〜4 日前に正常培地［GI
T 培地( 和光純薬工業)500mlに5.5mlMEM NON-ESSENTIAL
AMINO ACIDSSOLUTION(NEAA,GIBCO社) 、27.5ml NCTC10
9(GIBCO社) 、6ml PENICILLIN-STREPTOMYCIN SOLUTION
(SIGMA社) 、11ml GLUTAMINE 200mM SOLUTION(SIGMA
社) を加えた培地（以下「complete GIT」と称する）］
で継代培養し、融合当日2 ×10⁷以上の細胞数を確保す
る。

【００７５】(d) 細胞融合 抗体産生細胞は、形質細胞、およびその前駆細胞である
リンパ球であり、これは個体のいずれの部位から得ても
よく、一般には脾、リンパ節、末梢血、またはこれらの
適宜の組み合わせから得ることができるが、脾臓細胞が
最も一般に用いられる。

【００７６】最終免疫後、所定の抗体価が得られたマウ
スから抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出
し、抗体産生細胞である脾細胞を調製する。この脾細胞
と工程(c) で得られた骨髄腫細胞を融合させる手段とし
て現在最も一般的に行われているのは、細胞毒性が比較
的少なく融合操作も簡単なポリエチレングリコールを用
いる方法である。この方法は以下の手順よりなる。

【００７７】脾細胞と骨髄腫細胞を培地、またはリン酸
緩衝液(PBS) でよく洗浄し、脾細胞と骨髄腫細胞の比が
5 〜10:1程度になるように混合し、遠心分離にかける。
上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、撹拌し
ながらポリエチレングリコール(PEG、分子量1000〜400
0) と培地との混液を加え数分後に遠心分離する。再び
上清を捨て、沈澱した細胞を適量の5 〜10ng/ml のマウ
スIL-6を含むcomplete GITで懸濁して培養用プレート上
の穴に分注する。各穴において細胞の増殖が確認された
ら、HAT 培地(5〜10ng/ml のマウスIL-6を含むcomplete
GITに、ヒポキサンチン10^-6〜10^-3M 、アミノプテリン
10^-8〜10^-7M 、チミジン10^-6〜10^-4M を加えた培地) に
置き換える。

【００７８】(e) ハイブリドーマ群の選択 培養用プレートは、CO₂ インキュベーター中、35〜40℃
で培養する。以後、1〜3 日ごとに培地の半量相当のHAT
培地を加え、CO₂ インキュベーター中、35〜40℃で10
〜14日間培養する。

【００７９】上記ミエローマ細胞は、8-アザグアニン耐
性株であり、該ミエローマ細胞、およびミエローマ細胞
どうしのハイブリドーマは、HAT 培地中では生存できな
い。しかしながら、抗体産生細胞どうし、あるいは、抗
体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマは生存
することができ、さらに抗体産生細胞どうしのハイブリ
ドーマには寿命があるため、HAT 培地での培養によって
ハイブリドーマの選択が可能となる。

【００８０】コロニー状に生育してきたハイブリドーマ
の認められる穴について、HT培地（HAT 培地からアミノ
プテリンを除いた培地）への変換を行う。以後、培養上
清の一部をとり、例えば、ELISA 法により抗体価を測定
する。

【００８１】以上、8-アザグアニン耐性の細胞株を用い
たが、その他のものもハイブリドーマの選択に応じて使
用することができ、その場合当然使用する培地組成も変
化する。

【００８２】(f) クローニング 上記抗体価の測定により特異的抗体を産生することが判
明したハイブリドーマを、別のプレートに移しクローニ
ングを行う。このクローニング法としては、限界希釈に
より1 穴に1 個のハイブリドーマが含まれるように希釈
してまきこむ方法、軟寒天培地中にまきこみコロニーを
とる軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって1 個
の細胞を取りだしまきこむ方法、セルソーターによって
1 個の細胞を分離する「ソータクローン」などが挙げら
れるが、限界希釈法が簡単でありよく用いられる。

【００８３】抗体価の認められた穴について、例えば限
界希釈法によりクローニングを2 〜4 回繰返し、安定し
て抗体価の認められたものを本発明のモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ株として選択する。

【００８４】(g) ハイブリドーマ培養によるモノクロー
ナル抗体の調製 クローニングを完了したハイブリドーマは、HT培地より
通常の培地に換えて培養される。大量培養は、大型培養
瓶を用いた回転培養、あるいはスピナー培養で行われ
る。この大量培養における上清に、ゲル濾過などを行い
IgG 画分を集め精製することにより本発明のモノクロー
ナル抗体を得ることができる。また、同系統のマウス(
例えば、上記のBALB/c) 、あるいはNu/Nu マウスの腹腔
内でも増殖させることが可能である。

【００８５】また簡便な方法としては、モノクローナル
抗体精製キット（例えば、ファルマシア社のMAbTrap GI
I ）を利用することもできる。

【００８６】(h) モノクローナル抗体の同定 かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ、
サブクラスの決定は以下のように行う。同定法としては
オクテルロニー(Ouchterlony) 法、ELISA 法、またはRI
A 法がある。オクテルロニー法は、簡単ではあるがモノ
クローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮しなければな
らない。ELISA 法、またはRIA 法を用いれば、培養上清
をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第二次抗体
として各種IgG サブクラスに対応する抗体を用いること
が可能である。また、さらに簡便な方法としてアイソタ
イピング用のキット( 例えば、アマシャム社製、マウス
モノクローナル抗体アイソタイピングキット) を利用す
ることもできる。

【００８７】さらに、蛋白質の定量は、フォーリンロウ
リー法、および280nm での吸光度[1.4(OD₂₈₀)=イムノグ
ロブリン1mg/ml] より算出することができる。

【００８８】なお、本発明のモノクローナル抗体を高濃
度、かつ安定的に産生するハイブリドーマクローンは、
MKM150-2と命名され、工業技術院生命工学工業研究所に
寄託番号FERM BP-5086として寄託されている。

【００８９】かくして得られたモノクローナル抗体は、
本発明のタンパク質に対して高い特異性を持っており、
さらに上記ハイブリドーマの培養によって均一に得られ
るため、本発明のタンパク質の単離、精製に用いること
ができる。例えば、抗原抗体反応を利用した免疫沈降法
により、該モノクローナル抗体で本発明のタンパク質の
単離、精製が可能である。すなわち、本発明の蛋白質を
含む溶液中に該モノクローナル抗体を添加し、室温で保
存した後、これにプロテインG セファロース（ファルマ
シア社製）を混入し、さらに室温で保存する。遠心操作
で沈殿を取得し、0.1% Tween20を含むPBS 等で数回洗浄
して、再び遠心して得られた沈殿物は、該蛋白質、該モ
ノクローナル抗体、およびプロテインG セファロースの
複合体である。この沈殿物を適当な緩衝液に懸濁後、熱
処理することにより該複合体を各成分に解離させてか
ら、遠心を行い上清を回収する。この上清から、分子ふ
るいクロマトグラフィー（ゲルろ過）等により、該蛋白
質を容易に単離、精製することが可能である。

【００９０】また、該モノクローナル抗体は、該蛋白質
の単離、精製用のアフィニティークロマトグラフィー法
におけるリガンドとしても用いることができる。アフィ
ニティークロマトグラフィー法は、混合物から担体に特
異的に結合する物質のみを単離精製する場合、極めて効
果的な方法であり、混合物のゲルろ過と比較して、必要
な精製過程を大幅に減少することができる。このアフィ
ニティークロマトグラフィーにおいて有用な固定化モノ
クローナル抗体の作成は、各種酵素の固定化方法に準じ
て行なうことができ、例えば、CNBr活性化担体を使用す
る方法が一般に利用でき、またこのような担体としては
クロマトグラフィーに一般的に使用されている各種材
料、例えばセルロース、アガロース、架橋デキストラ
ン、ポリアクリルアミド、多孔性ガラス、あるいはこれ
らの担体にスペーサーを導入したもの、特にセファロー
ス 4B （ファルマシア社製）、アフィゲル10（バイオラ
ッド社製）などが好ましい例として挙げられる。この固
定化モノクローナル抗体を用いて実際に該蛋白質を精製
するには、これらをカラムに充填した後、これに該蛋白
質を含む溶液を通塔する。この操作で該蛋白質がカラム
に吸着する。溶媒、例えば、グリシン−塩酸緩衝液（pH
2.5 ）、塩化ナトリウム溶液、プロピオン溶液、ジオキ
サン、エチレングリコール、カオトロピック塩、塩酸グ
アニジン、または尿素などで溶出することにより、吸着
した該蛋白質が高純度で溶出する。

【００９１】なお、本発明のモノクローナル抗体は、マ
ウス由来のものに限られず、本発明のタンパク質と結合
性を有する限り、ヒトを含むいかなる哺乳動物由来の抗
体でも構わない。また、本発明のモノクローナル抗体
は、ハイブリドーマが産生するものに限られず、遺伝子
工学の手法によって作成されたものでもよい。例えば、
キメラ抗体、ヒト化抗体なども、本発明のタンパク質と
結合性を有する限り、本発明のモノクローナル抗体の範
疇に含まれる。そのような抗体は、例えば、ManSung Co
らの方法（Man Sung Co, et al. (1992) J. Immunol.
148, 1149-1154）などに準じて作成することができる。

【００９２】

【実施例】以下に実施例を記載し、本発明を詳細に説明
するが、本発明はこれに限定されない。

【００９３】［実施例１］KM-102細胞からのポリ(A)⁺RN
A の抽出 KM-102細胞を直径15cmのプラスチック製培養ディッシュ
36枚で10%FBSを含有するイスコフの修正最小必須培地
（ベーリンガー・マンハイム社製）にて培養し、コンフ
ルエントに達するまで増殖させた後、ホルボール・ミリ
ステート・アセテート(PMA) とカルシウム・イオノフォ
アA23187を、それぞれ10ng/ml と0.2 μMになるように
添加し、培養を続け、3 、6 、14時間培養後に12枚ずつ
の細胞を、グアニジンチオシアネート溶液（4Mのグアニ
ジンチオシアネート、1%サルコシル、20mMのエチレンジ
アミン四酢酸(EDTA)、25mMのクエン酸ナトリウム(pH7.
0) 、100mM の2-メルカプトエタノール、0.1%のアンチ
フォームA ）で溶解し、溶液を回収した。

【００９４】ポリ(A)⁺RNA の単離は本質的に“Molecula
r Cloning A Laboratory Manual"（Maniatis,T.et al.
(1982) pp.196-198）に記載されているようにして実施
した。 具体的には、以下の手順で行った。

【００９５】回収した細胞溶解液は、各々21G の注射針
を装填した10ml容の注射筒を用いて、数回吸入排出を繰
り返した。日立工機（株）製RPS40-T ローター・バケッ
トにあうポリアロマー製の遠心チューブに3ml の5.7M C
sCl-0.1M EDTA(pH7.5)を先に加えておき、その上に上記
細胞溶解液を重層してテューブを満たした。これを30,0
00r.p.m.、20℃で18時間遠心した後、得られたペレット
を400 μl の蒸留水に溶かし、エタノール沈澱を行っ
た。得られたペレットを再び400 μl の蒸留水に溶解し
た後、等量のクロロホルム-1- ブタノール(4:1) を加え
撹拌し、遠心分離により水層を回収した。これを再度エ
タノール沈澱した後、600 μl の蒸留水に溶解し、全RN
A を得た。PMA-A23187刺激3 時間、6 時間、14時間の各
サンプルより各々約4.5mg の全RNA が得られた。

【００９６】このようにして得られた3 種類の全RNA を
600 μg ずつ混合し、オリゴ(dT)セルロースカラム・ク
ロマトグラフィーを行うことにより、ポリ(A)⁺RNA を精
製した。すなわち、全 RNAを吸着緩衝液（0.5M NaCl 、
20mM Tris-HCl(pH7.5)、1mMEDTA、0.1%ドデシル硫酸ナ
トリウム(SDS) ）に溶解し、65℃で5 分間加熱した後、
同溶液にて充填されたオリゴ(dT)セルロースカラム（フ
ァルマシア社製、タイプ7 ）に供与し、溶出溶液（10mM
Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.05%SDS）でポリ(A)⁺RN
A を溶出し、回収した。このような操作により100 μg
のポリ(A)⁺RNAを得た。

【００９７】［実施例２］cDNAライブラリーの作製 cDNAライブラリーの作製は、Okayama-Berg法に従って行
った。すなわち、5 μg のポリ(A)⁺RNA 、および24ユニ
ットの逆転写酵素を20μl の反応液（50mM Tris-HCl(pH
8.3)、8mM MgCl₂ 、30mM KCl、0.3mM ジチオスレイトー
ル(DTT) 、2mMdATP、2mM dGTP、2mM dTTP、10μCi[ α-
³²P]dCTP 、1.4 μg ベクタープライマーDNA(3'-oligo
(dT)-tailed pcDV-1( ファルマシア社製) ）中で42℃、
1 時間反応させた。

【００９８】2 μl の0.25M EDTAと1 μl の10%SDSを加
えて反応を止めた後、20μl のフェノール−クロロホル
ム(1:1) で除蛋白を行った。遠心後回収した水層に、20
μl4M酢酸アンモニウムと80μl のエタノールを加え、-
70 ℃、15分間冷却した。ついで、遠心分離により沈澱
を集め、75% エタノールで沈澱を洗った後、減圧乾燥し
た。

【００９９】つぎに、乾燥された沈澱を15μl のターミ
ナルトランスフェラーゼ反応液（140mM カコジル酸カリ
ウム、30mM Tris-HCl(pH6.8)、1mM CoCl₂ 、0.5mM DTT
、0.2 μg poly(A) 、100mM dCTP）に溶かした。この
反応液を37℃で3 分間保温した後、18ユニットのターミ
ナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを加
え、5 分間反応させた。つぎに、1 μl の0.25M EDTA、
および0.5 μl の10%SDSを加え、反応を止めた後、フェ
ノール−クロロホルムで除蛋白を行った。反応液を遠心
後、水層を回収し、15μl の4M酢酸アンモニウム、60μ
l のエタノールを加えよく混合した。-70 ℃で15分間冷
却した後、遠心して沈澱を集めた。

【０１００】この沈澱を10μl の制限酵素用緩衝液（50
mM NaCl 、10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl₂、1mM DT
T ）に溶かし、2.5 ユニットの制限酵素HindIII を加
え、37℃で約1 時間消化した。つぎに、フェノール- ク
ロロホルムで除蛋白後、エタノール沈澱を行った。-70
℃で15分間冷却した後、遠心によって沈澱を集め、10μ
l のTE緩衝液（10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA）に溶
かした。この溶液の1 μl をオリゴ(dG)付きリンカーDN
A （3'-oligo(dG)tailed pL-1 HindIII linker、ファル
マシア社製）10ngを加えた反応液（10mM Tris-HCl(pH7.
5)、1mM EDTA、100mM NaCl）に加え、65℃で5 分間加熱
し、ついで42℃で30分間保温した。氷水中で反応を冷却
した後、10μl の10倍リガーゼ緩衝液（10mM ATP、660m
M Tris-HCl(pH7.5) 、66mM MgCl₂、100mM DTT ）、78μ
l の蒸留水、8 ユニットのT4DNA リガーゼを加え、12℃
で一晩保温した。

【０１０１】つぎに、10μl の1M KCl、1 ユニットのリ
ボヌクレアーゼH 、33ユニットのDNA ポリメラーゼI 、
4 ユニットのT4DNA リガーゼ、0.5 μl のヌクレオチド
溶液（20mM dATP 、20mM dCTP 、20mM dGTP 、20mM dTT
P ）、0.1 μl の50μg/mlの濃度の牛血清アルブミン(B
SA) を加え、12℃で1 時間、ついで25℃で1 時間保温し
た。この反応液を蒸留水で5 倍に希釈した後、直ちにHa
nahan の方法(Hanahan,D.(1983) J.Mol.Biol.166,557-5
80) によって、大腸菌DH5 αを形質転換し、KM-102細胞
cDNAライブラリーを作製した。

【０１０２】［実施例３］オリゴヌクレオチド・プロー
ブの作製 サイトカイン類のmRNAの3'非翻訳領域に保存されている
AUUUA 配列に基づき、ATT-3 と名付けた15塩基のオリゴ
ヌクレオチド 5'-TAAATAAATAAATAA-3' （配列番号３） を化学合成した。合成は、( 株) パーキンエルマー・ジ
ャパン・アプライドバイオシステムズ社製の自動DNA 合
成機380Bを用いて、そのマニュアルに従って行った。こ
の方法は、Caruthers らの記載した原理(Matteucci,M.
D. and Caruthers,M.H.(1981) J.Am.Chem.Soc.103,3185
-3191) に基づいており、ホスホアミダイト法と称され
ている。15個のヌクレオチドを合成した後、それを支持
体から開裂させ脱保護を行い、得られた溶液を凍結乾燥
することによりオリゴヌクレオチドを粉末状にした。こ
れを蒸留水に溶解し、使用するまで-20 ℃で凍結保存し
た。

【０１０３】［実施例４］cDNAライブラリーのスクリー
ニング 上述のKM-102細胞のcDNAライブラリーのうち、6,500 株
の組換え菌のDNA をGrunstein,M.とHogness,D.S.の方法
（Grunstein,M. and Hogness,D.S.(1975) Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 72,3961-3965 ）によってニトロセルロース
フィルター上に固定した。つぎに、プローブ(ATT-3) を
常法（”Molecular Cloning A Laboratory Manual ”を
参照）に従って、³²P で5'標識した後、コロニーハイブ
リダイゼーションを行った。6 ×SSC （1 ×SSC の組成
は、150mM NaCl、15mMクエン酸三ナトリウム）、1 ×De
nhardt溶液、0.25%SDS、0.05% ピロリン酸ナトリウム、
100 μg/mlの変性サケ精子DNA を含む溶液中で、37℃、
3 時間プレハイブリダイゼーションを行った後、³²P で
放射標識化したプローブ(ATTT-3)を含む、6 ×SSC、1
×Denhardt溶液、17μg/mlの酵母tRNA、0.05% ピロリン
酸ナトリウムの反応液中で、31℃、一夜ハイブリダイゼ
ーションを行った。反応終了後、ニトロセルロースフィ
ルターを室温下で、0.05% ピロリン酸ナトリウムを含む
6 ×SSC 溶液で2 時間洗浄した後、オートラジオグラフ
ィーを行った。その結果、33個の陽性クローンが得られ
た。これらのクローンについて、常法によりプラスミド
DNA を抽出したのち、無作為に数クローン選び、cDNAの
部分的なヌクレオチド配列をジデオキシ法により決定し
た。そして、それらの配列について、パーソナルコンピ
ューターを用いて、EMBL、またはGenBank データベース
に登録されているヌクレオチド配列との相同性を検索し
た。その結果、ATT-3 プローブがハイブリダイズした領
域は、Alu 反復配列（Schmid,C.W. and Jelinek,W.R.(1
982) Science 216,1065-1070）の一部のメンバーに相同
性があることが、明らかになった。

【０１０４】そこで、ヒトのゲノムDNA より調製した、
Alu 反復配列を含むDNA 断片を³²P標識し、これをプロ
ーブに用いて上記33クローンのコロニーハイブリダイゼ
ーションを行ったところ、12クローンがAlu 反復配列を
有することが明らかとなった。残りの21クローンについ
て、cDNAインサートの長さを調べたところ、50から3,60
0 塩基にわたっており、様々であった。上記21クローン
のcDNAの制限酵素マッピングを行った後、部分的にヌク
レオチド配列を決定した。それらのヌクレオチド配列に
ついて、データベースとの相同性検索を行い、データベ
ースに登録されていない新規な配列を有するクローンを
選択した。

【０１０５】［実施例５］クローンNo.31 のノーザンハ
イブリダイゼーション そのうちの一つ、クローンNo.31(pcD-31) は、およそ56
0bp のcDNAインサートを有していた。まず、pcD-31のmR
NAの完全長を知る目的で、このcDNAインサートよりPstI
-AatI 断片(292bp) を³²P で標識化してプローブとして
用いて、KM-102細胞より調製したポリ(A)⁺RNA （実施例
１参照）に対して、ノーザンハイブリダイゼーションを
行った。方法は、KM-102細胞より調製したポリ(A)⁺RNA
5.5μg を、1Mグリオキサール、50% ジメチルスルホキ
シド(DMSO)、0.01M リン酸水素二ナトリウム(pH7.0)
中、50℃で1 時間保温した後、泳動用色素（50% グリセ
ロール、0.01M リン酸水素二ナトリウム(pH7.0) 、0.4%
ブロモフェノールブルー）を4μl 添加して、1%アガロ
ースゲルで、1 ×TAE （0.04M Tris-acetate、0.001M E
DTA ）中、泳動した。その後、キャピラリートランスフ
ァー法（“Molecular Cloning A Laboratory Manual ”
を参照）に準じて、アガロースゲル上のRNA を、ナイロ
ンメンブレンフィルター（バイオラッド社製、Zeta-Pro
be）に20×SSC にて、一夜かけて転写した。転写後フィ
ルターは、2xSSC で軽く洗った後、風乾させ、さらに80
℃で2 時間乾燥させて、mRNAを固定した。pcD-31のPstI
-AatI 断片は、アマシャム社製の「Multiprime DNA lab
elling system 」を用いて、³²P にて標識した。フィル
ターを続いて、5 ×SSCP（1 ×SSCPの組成は、120mM Na
Cl、15mMクエン酸ナトリウム、13mMリン酸二水素カリウ
ム、1mM EDTA）、2.5 ×Denhardt溶液、50% ホルムアミ
ド、10mMリン酸水素二ナトリウム(pH7.0) 、0.5%SDS、1
00 μg/mlの変性サケ精子DNA を含む溶液中で、37℃、3
時間プレハイブリダイゼーションした後、³²P 標識し
たプローブを含む、5 ×SSCP、1 ×Denhardt溶液、50%
ホルムアミド、10mMリン酸水素二ナトリウム(pH7.0) 、
0.1%SDS 、100μg/mlの変性サケ精子DNA を含む溶液中
で、42℃、一夜ハイブリダイゼーションを行った。反応
終了後、フィルターを37℃下で、50% ホルムアミド、5
×SSC 、0.1%SDS を含む溶液で1 時間、さらに40% ホル
ムアミド、5 ×SSC 、0.1%SDS を含む溶液で2 時間、そ
して、室温下、2 ×SSC 溶液で15分間洗浄した後、オー
トラジオグラフィーを行った。その結果、クローンpcD-
31の持つcDNAは、完全長ではなく、完全長に相当するmR
NAの長さは、分子量マーカーによる検量線より、3.9kb
であることが明らかとなった。

【０１０６】［実施例６］クローンNo.31cDNA をスクリ
ーニングするためのライブラリーの調製 アマシャム社製、cDNA合成システム・プラス、およびcD
NAクローニング・システム（λgt10、アダプター法）を
用いてcDNAライブラリーを新たに作製した。すなわち、
KM-102細胞より抽出したポリ(A)⁺RNA （実施例１参照）
5 μg 、および、100 ユニットの逆転写酵素を、50μl
の反応液（1 ×ファーストストランド合成緩衝液、5%ピ
ロリン酸ナトリウム、100 ユニットのリボヌクレアーゼ
インヒビター、1mM dATP、1mM dGTP、1mM dTTP、0.5mM
dCTP、3.75μg オリゴ(dT)プライマー、以上キットに添
付）中で、42℃、40分間反応した。この反応液に20μCi
[α- ³²P]dCTP、93.5μl セカンドストランド緩衝液、4
ユニットのリボヌクレアーゼH1、15ユニットのDNA ポ
リメラーゼI(全てキットに添付) を加え、12℃、1時
間、ついで、22℃、1 時間保温した。この反応液を70℃
で10分間処理した後、10ユニットのT4DNA ポリメラーゼ
（キットに添付）を加えて、37℃、10分間反応させた。
反応後、フェノール- クロロホルムで除蛋白を行った。
反応液を遠心後、水層を回収し、250 μl の4M酢酸アン
モニウム、1ml のエタノールを加えてよく混合した。-2
0 ℃で一晩冷却した後、遠心して沈澱を集めた。この沈
澱を30μl の滅菌水に溶かし、そのうち10μl をとり2
μl のLigase/Kinase 緩衝液、250pmole EcoRIアダプタ
ー、5 ユニットのT4DNA リガーゼ（以上、キットに添
付）を加え、15℃で一夜保温した。つぎに、EcoRI アダ
プターの除去を行うために、反応液を全量、キット添付
のサイズフラクショネーションカラムにかけた。200μl
の0.25×TE緩衝液により、120 μl ずつプールして、
フラクションの10番目から17番目までを集めて、全量12
0 μl になるまでブタノールで濃縮した。この反応液12
0 μl に、55μl の滅菌水、20μl のLigase/Kinase 緩
衝液、40ユニットのT4ポリヌクレオチドキナーゼ（キッ
トに添付）を加え、37℃、30分間保温した。反応後、フ
ェノール- クロロホルム処理を三回行い、エタノール沈
澱を行った。-20 ℃で一晩冷却した後、遠心により沈澱
を集め、10μl の滅菌水に溶解した（cDNAサンプル）。
このcDNAサンプル2 μl 、または4 μl に1 μg のλgt
10EcoRI アーム（キット添付）、1 μl のLigase/Kinas
e 緩衝液、2.5 ユニットのT4DNA リガーゼを加えて、15
℃で一晩保温した。この反応溶液10μl 全て使用して、
10μl のエクストラクトA （キット添付）、15μl のエ
クストラクトB （キット添付）を順に加え、20℃にて20
分間保温して、in vitro パッケージング反応を行っ
た。その後、この反応液に、470 μl のSM緩衝液（100m
M NaCl、8mMMgSO₄ ・7H₂O、50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.0
1% ゼラチン）を加えて、4 ℃に保存した。10mMのMgSO₄
で処理した大腸菌NM514 株に感染させて、KM-102細胞
のcDNAライブラリーを作製した。

【０１０７】［実施例７］cDNAライブラリーのスクリー
ニング 上述のKM-102細胞のcDNAライブラリーのうち、2 ×10⁵
プラークのDNA をナイロンフィルター（Hybond N、アマ
シャム社製）に固定した。すなわち、KM-102細胞cDNAラ
イブラリーを有する大腸菌を、直径9cm のプレートあた
り1 〜2 × 10⁴個のプラークが形成されるように分散さ
せた。ナイロンフィルターは、プレートにのせて、ファ
ージプラークを移しとった後、18G の注射針で3 ヶ所フ
ィルター上に印を付けた。4 ℃にて5 〜10分間放置した
後、フィルターを剥がして、アルカリ溶液(0.1N NaOH、
1.5M NaCl)で20秒間、中性溶液(0.2M Tris-HCl(pH7.5)
、2 ×SSCP) で20秒〜1 分間処理した後、室温で2 時
間風乾した。風乾後、80℃にて2 時間乾燥させた。

【０１０８】［実施例８］プローブの作製、およびハイ
ブリダイゼーション プローブは上述のpcD-31、PstI-AatI 断片、またはEcoT
22I-AatI断片(223bp)をMultiprime DNA labelling syst
em を使用して作製後、プラークハイブリダイゼーショ
ンを行った。50% ホルムアミド、5 ×SSCP、2.5 ×Denh
ardt、0.01M リン酸水素二ナトリウム(pH7.0) 、0.5%SD
S 、100 μg/mlの変性サケ精子DNA を含む溶液中で、37
℃、2 時間プレハイブリダイゼーションを行った後、³²
P で放射標識化したプローブを含む50% ホルムアミド、
5 ×SSCP、1 ×Denhardt、0.01Mリン酸水素二ナトリウ
ム(pH7.0) 、0.1%SDS 、100 μg/mlの変性サケ精子DNA
を含む反応液中で、37℃、一夜ハイブリダイゼーション
を行った。反応終了後、フィルターを、50% ホルムアミ
ド、5 ×SSC 、0.1%SDS を含む溶液で、室温で3 時間、
さらに2 ×SSC で室温で5 分間洗浄し、オートラジオグ
ラフィーを行った。その結果、一次スクリーニングで80
ヶの陽性クローンが得られた。上述の手法を繰り返すこ
とにより、四次スクリーニングまで行い、最終的に17ヶ
の陽性クローンを得た。個々の陽性クローンについて、
クローンDNA を単離し、EcoRI で切断後、cDNAインサー
トの長さをアガロースゲル電気泳動にて調べたところ、
完全長に相当する3.9kbpのcDNAインサートを持つ、クロ
ーンNo.31-7 を単離した。

【０１０９】［実施例９］クローンNo.31-7 の制限酵素
地図の作製 クローンNo.31-7 をEcoRI で消化し、cDNAインサートを
含む3.9kb の断片を単離、精製し、pUC18 へT4DNA リガ
ーゼを用いた反応により連結した。このDNA で大腸菌DH
5 αを形質転換し、得られた形質転換株について、それ
が保有するプラスミドDNA の解析を行い、3.9kbpのcDNA
を持つクローンpUCKM31-7 を得た。このpUCKM31-7 にク
ローニングされているcDNAの制限酵素地図を作製するた
め、プラスミドpUCKM31-7 を制限酵素HindIII 、SacI、
XbaI、SmaI、BglII 、EcoT22I 、AatI、それぞれ、ある
いは二種類の組み合わせにより切断した後アガロースゲ
ル電気泳動を行い、λHindIII/φX174HaeIIIマーカーを
指標にして、各断片の長さを測定した。このようにして
作製した制限酵素地図を図１に示した。

【０１１０】［実施例１０］クローンNo.31-7 の塩基配
列の決定 pUCKM31-7 に挿入されているcDNAの全ヌクレオチド配列
をM13 ファージを用いたジデオキシ法により決定した。
尚、一部配列は、（株）パーキンエルマー・ジャパン・
アプライドバイオシステムズ社製、373A DNAシークエン
サーにて解析した。その結果、配列番号１に示すヌクレ
オチド配列が得られた。pUCKM31-7 に挿入されているcD
NAは、3815塩基から成り、メチオニンで始まる549 個の
アミノ酸からなるオープン・リーディング・フレーム(O
RF) を持つことが明らかとなったが、ポリ(A) テイルは
見あたらなかった。そこでクローンpcD-31の3'末端の塩
基配列を決定し、クローンpUCKM31-7 の配列と比較した
ところ、pUCKM31-7 は、ポリ(A) テイル部分をちょうど
欠失していることが判明した（図２）。また、ORFにコ
ードされているアミノ酸配列について、EMBL、およびGe
nBank のヌクレオチドデータベース、NBRF、およびSWIS
S プロテインデータベースを検索したところ、ヒトグル
タチオン還元酵素と35.3% の相同性を持つが、pUCKM31-
7 に挿入されているcDNAに含まれるORF は、新規なタン
パク質をコードすることが明らかとなった。このORF に
コードされるアミノ酸配列を配列番号２に示す。（以後
の実施例において、本ORF にコードされるアミノ酸配列
を有するタンパク質を「KM31-7」称する。） ［実施例１１］高発現ベクターの作成とCOS-1 細胞での
発現 pUCKM31-7 をHindIII で消化し、cDNAインサートを含む
3003bpの断片を単離、精製しDNA blunting kit（宝酒造
( 株) 製）を使用して、末端を平滑化した。一方、高発
現ベクターpcDL-SR α296 （Takebe,Y.et al.(1988) Mo
l.Cell.Biol.8,466-472 ）をPstI、およびKpnIで消化
し、同様にDNA blunting kitにより末端を平滑化した
後、上記のcDNA断片とT4DNA リガーゼを用いた反応によ
り連結した。このDNA で大腸菌を形質転換し、得られた
形質転換株について、それが保有するプラスミドDNA の
解析を行い、cDNAの転写方向がSRαプロモーターの方向
と同一の株を選択し、このプラスミドをpSR α31-7と命
名した（図３）。尚、SRαプロモーターは、SV40初期プ
ロモーターとHTLV-1のロング・ターミナル・リピート(L
TR) のR-U5配列から成り、SV40初期プロモーターよりも
10〜100 倍強いプロモーター活性を示す。つぎに、得ら
れたプラスミドpSR α31-7でCOS-1 細胞をトランスフェ
クトした。COS-1 細胞のトランスフェクションは、
（株）島津製作所製の遺伝子導入装置GTE-1 を用いて、
電気穿孔法により行った。すなわち、まずCOS-1 細胞を
セミコンフルエントになるまで増殖させたフラスコよ
り、トリプシン-EDTA 処理により細胞を回収し、PBS(-)
緩衝液（日水製薬( 株) 製）で二回洗浄した。つぎにそ
の細胞をPBS(-)緩衝液で6 × 10⁷細胞/ml に懸濁した。

【０１１１】一方、塩化セシウム法で調製した各プラス
ミドDNA をPBS(-)緩衝液で200 μg/mlに調製した。上記
細胞懸濁液とDNA 溶液を20μl づつ混合し、これを電極
間隔2mm のチャンバーに入れ、600V-30 μsec のパルス
を1 秒間隔で2 回与えた。そのチャンバーを4 ℃で5 分
間冷却した後、中の細胞-DNA混合液を10%FBSを含むDMEM
10mlに加え、シャーレに移して37℃で一夜、5%CO₂ 下に
培養した。その後、培養上清を除き、無血清培地(DMEM)
で細胞を洗浄し、DMEM10mlを加えて3 日間培養した。こ
のようにして得られた細胞培養物より、培養上清を回収
した。cDNAを含まないネガティブコントロールプラスミ
ドpcDL-SR α296 、およびpSR α31-7でトランスフェク
トして得たCOS-1 細胞の無血清培養上清1ml を、それぞ
れトリクロロ酢酸(TCA) 処理して蛋白を沈澱させ、遠心
分離により沈澱を得た。この沈澱を氷冷したアセトンで
洗浄し、風乾後、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動(SDS
-PAGE)用の2-メルカプトエタノールを含むサンプル緩衝
液に溶解し、12.5% ゲルを用いて還元条件下でのSDS-PA
GEを行った。泳動後のバンドの検出は、第一化学薬品(
株) 製の銀染色試薬「第一」を用いて銀染色法にて行っ
た。その結果、pSRα31-7でトランスフェクトしたCOS-1
細胞の培養上清において、特異的な数本のバンドが検
出された（分子量約60,000）。

【０１１２】pSR α31-7にコードされるタンパク質の分
子量は、約60,000であり、アミノ酸配列から糖鎖の付加
はないと考えられることから、この特異的な数本のバン
ドは、pSR α31-7のcDNAにコードされるタンパク質であ
ると推定された。

【０１１３】［実施例１２］発現産物の精製、およびN
末端アミノ酸配列の分析（その１） pSR α31-7でトランスフェクトしたCOS-1 細胞の培養上
清において検出された特異的な数本のバンドが、pSR α
31-7のcDNAにコードされるタンパク質であるということ
を証明すること、およびそのN 末端アミノ酸配列を同定
するために、pSR α31-7のcDNAにコードされるタンパク
質の C末端に相当する部分、すなわち終始コドン直前
に、His 残基を6 ヶ導入したクローンを作製した。His
残基は、Ni²⁺と高い親和性を持つことから、ヒスチジン
・ヘキサマー(6×His)を有するタンパク質を発現させた
のち、Ni²⁺でチャージしたアフィニティーレジンカラム
を用いて精製することが目的である。まず、C 末端に相
当するタンパク質に基づき、66塩基のオリゴヌクレオチ
ド 5'-CTAGCGCTCTGGGGCAAGCATCCTCCAGGCTGGCTGCCACCACCACC
ACCACCACTGATCTAGACT-3'（配列番号４） およびそれに相捕する66塩基のオリゴヌクレオチドを、
（株）パーキンエルマー・ジャパン・アプライドバイオ
システムズ社製の自動DNA 合成機394 にて合成し、精製
した。両オリゴヌクレオチドを70℃で3 分間保温後、37
℃で30分間さらに保温して、アニーリングさせた。その
後、T4ポリヌクレオチドキナ−ゼにより末端をリン酸化
した。この断片を、Eco47IIIで消化したpUCKM31-7 へ、
T4DNA リガーゼを用いた反応により連結した（図４）。
このDNA で大腸菌DH5 αを形質転換し、得られた形質転
換株について、それが有するプラスミドDNA の解析を行
い、pUCKM31-7Hisを得た。このpUCKM31-7Hisの一部塩基
配列の解析より、断片を挿入した部分に変異はないこと
を確認した。COS-1 細胞に導入して発現させることを目
的として、つぎに、pcDL-SR α296 へサブクローニング
することを試みた。まず、pUCKM31-7Hisを、XbaI、およ
びHindIII で消化後、断片を精製して、1 ユニットのkl
enowフラグメントを用いて、2mM dATP、2mM dCTP、2mM
dGTP、2mM dTTP、50mM Tris-HCl(pH7.2)、10mM MgSO₄、
0.1mM DDT 、50μg/ml BSA存在下で、末端の平滑化を行
った。一方、高発現ベクターpcDL-SR α296 をPstI、お
よびＫｐｎＩで消化し、ＤＮＡ ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｋ
ｉｔで末端を平滑化した後、先の断片をT4DNA リガーゼ
を用いた反応により連結した。このDNA で大腸菌DH5 α
を形質転換し、得られた形質転換株より、それが保有す
るプラスミドDNA の解析を行い、cDNAの転写方向が、SR
αプロモーターの方向と同一の株を選択し、このプラス
ミドをpSR α31-7His 命名した。得られたプラスミドpS
R α31-7His でCOS-1 細胞をトランスフェクトし、同様
にして無血清培養上清を得た。

【０１１４】この無血清培養上清600ml を、17倍量の透
析緩衝液（20mMリン酸緩衝液(pH7.8) 、0.5M NaCl ）に
対して、4 ℃で15時間透析を行った後、新しい17倍量の
透析緩衝液にて4 ℃で4 時間透析を行った。その後、フ
ァルマシア社製のFPLCを用いたアフィニティークロマト
グラフィーを以下の条件により実施した。

【０１１５】カラム: ProBond^TM Resin （Invitrogen社
製）をXK16/20 （φ2.0 ×20cm、ファルマシア社製）に
20ml充填。

【０１１６】溶離緩衝液: A)200mM イミダゾールを含む20mMリン酸緩衝液(pH7.8)
、0.5M NaCl B)300mM イミダゾールを含む20mMリン酸緩衝液(pH7.8)
、0.5M NaCl 流速: 1ml/分 フラクション溶液: 5ml/チューブ 溶出条件:A) 液で4 フラクション回収後、B)液で16フラ
クション回収通し番号としてNO.1〜No.20 とした。

【０１１７】得られたフラクションサンプルについて、
各々300 μl とり、TCA 沈澱処理し、還元条件下で12.5
% ゲルを用いたSDS-PAGEに供した。電気泳動後のバンド
の検出は、銀染色法で行った。その結果、フラクション
No.10 を中心にして3 本のバンドが検出された。このこ
とは、pSR α31-7His のコードするcDNAのタンパク質
は、N 末端が異なる３種類の長さのペプチドが存在する
ことを示す。フラクションNo.7〜No.14 までの残り全量
をTCA 沈澱処理により濃縮し、還元条件下で１０％ゲル
を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、ポリ
アクリルアミドゲルから、蛋白バンドを転写緩衝液（0.
02%SDS、20% メタノール、25mMトリス- ホウ酸(pH9.5)
）中で、ゲルメンブラン転写装置（マリソル社製、KS-
8441 ）を用いて、4 ℃、2.5 時間、19V の条件でポリ
ビニリデン・ジフルオライド(PVDF)膜（アプライドバイ
オシステムズ社製、ProBrott^TM）に転写した。転写後の
膜を、0.2%ナフトールブルーブラック（シグマ社製）で
染色し、先述した3 本のバンド部分を切出し、気相プロ
テインシークエンサー（( 株) 島津製作所製、PPSQ-10
）にて、N末端より6 アミノ酸までの配列を決定した。
その結果、3 種のうち分子量が2 番目に大きいバンド(
分子量約60,000) のN 末端は、Val-Val-Phe-Val-Lys-Gl
n （配列番号２のアミノ酸番号 1〜6 に相当する）であ
った。

【０１１８】この6 アミノ酸は、pSR α31-7His 、また
はpSR α31-7のcDNAがコードする前駆体タンパク質のN
末端より24番目のアミノ酸（Val ）から始まる6 つのア
ミノ酸配列に相当することから、この前駆体タンパク質
のN 末端23個のアミノ酸が切り落とされて、Val 残基か
ら始まるタンパク質が、成熟体の１つの型として分泌さ
れてくることが判明した。

【０１１９】［実施例１３］発現産物の精製、およびN
末端アミノ酸配列の分析（その２） 実施例１２で述べたように、pSR α31-7His でCOS-1 細
胞をトランスフェクトし、得られた無血清培養上清をア
フィニティーカラムで精製した結果、pSR α31-7His の
コードするポリペプチドは、3 種類のN 末端を持つこと
が明らかとなった。一方、pMAL31-7を導入した大腸菌よ
り回収した融合蛋白をウサギに免疫して得られた抗KM31
-7ポリクローナル抗体によるウエスタンブロッティング
の結果より、pSR α31-7でCOS-1 細胞をトランスフェク
トして得られた無血清培養上清中にも、pSR α31-7His
をトランスフェクトした場合と同様に３種類のバンドが
検出されることが明らかとなった。そこで次に、pSR α
31-7でCOS-1 細胞をトランスフェクトし、大量に無血清
培養上清を回収してそこからKM31-7蛋白を精製し、N 末
端のアミノ酸配列を解析することを試みた。まず、pSR
α31-7でCOS-1 細胞をトランスフェクトし、10リットル
の無血清培養上清を回収し、10mM Tris-HCl(pH9.0)で一
晩透析した後、8 回に分けてファルマシア社製のFPLCを
用いたイオン交換クロマトグラフィーを以下の条件によ
り実施した。

【０１２０】カラム：DEAE Sepharose Fast Flow（ファ
ルマシア社製）をXK16/20 （φ2.0 ×20cm、ファルマシ
ア社製）に20ml充填。

【０１２１】溶離緩衝液： A) 10mM Tris-HCl(pH9.0) B) 10mM Tris-HCl(pH9.0)-0.5M NaCl 流速：1ml/分 フラクション溶液：3ml/チューブ 溶出条件：溶離液A →溶離液B(直線濃度勾配、60分間) 得られたフラクションについて、各々0.1 〜0.4M NaCl
濃度で溶出されてくる画分を回収した後、まとめて0.1M
Tris-HCl 、5mM EDTA(pH7.6) 、1mM 2-メルカプトエタ
ノールにて一晩透析を行い、次ぎに2' 5'ADP Sepharose
4B を用いたアフィニティークロマトグラフィーを実施
した。

【０１２２】カラム：2' 5'ADP Sepharose 4B （ファル
マシア社製）をXK16/20 （φ2.0 ×20cm、ファルマシア
社製）に20ml充填。

【０１２３】溶離緩衝液： A) 0.1M Tris-HCl、5mM EDTA(pH7.6) 、1mM 2-メルカプ
トエタノール B) 0.1M Tris-HCl、5mM EDTA(pH7.6) 、1mM 2-メルカプ
トエタノール -10mM NADPH 流速：0.5ml/分 フラクション溶液：2ml/チューブ 溶出条件：溶離液A →溶離液B(直線濃度勾配、120 分
間) 得られたフラクションサンプルについて各々100 μl と
りTCA 沈澱処理し、還元条件下で12.5% ゲルを用いたSD
S-PAGEに供した。電気泳動後のバンドの検出は、銀染色
で行った。その結果、フラクション#11 以降に求める3
本のバンドが溶出されていることが判明した。そこでフ
ラクション#11 から#14 までの残りの全量をTCA 沈澱処
理により濃縮し、還元条件下で12.5% ゲルを用いたSDS-
PAGEを行った。電気泳動後、ポリアクリルアミドからPV
DF膜に転写して、0.2%ナフトールブルーブラックで染色
後、先述した3 本のバンド部分を切り出して、気相プロ
テインシークエンサーにてN 末端配列の解析を試みた。
その結果、3 種のうち分子量の一番小さいものと思われ
るバンドのN 末端は、 Lys-Leu-Leu-Lys-Met であることが明らかとなった。この5 つのアミノ酸は、
pSR α31-7のcDNAがコードするポリペプチドのN 末端よ
り49番目から始まる5 つのアミノ酸に相当することか
ら、N 末端48個のアミノ酸が切り落とされてLys 残基か
ら始まるタンパク質も、成熟体の1 つの形として分泌さ
れてくることが判明した。

【０１２４】［実施例１４］還元活性の測定 １）発現ベクターの構築 上記のようにして精製したタンパク質は微量であるた
め、活性の測定などの他の目的に使用することが困難で
ある。そこで、pSR α31-7のcDNAのコードするタンパク
質を大腸菌で発現させて精製することを試みた。まず、
pUCKM31-7 をHindIII で消化し、cDNAインサートを含む
3003bpの断片を単離、精製した後、DNA blunting kitに
より末端を平滑化した。その断片をさらに、XbaIで消化
した。一方、融合型発現ベクターpMAL-c（Guan,C.et a
l.(1987) Gene.67,21-30 ）をXbaI、およびStuIで消化
し、これに上記のcDNAを含むHindIII(修復)-XbaI断片
を、T4DNA リガーゼを用いた反応により連結した（図
５）。このDNA で大腸菌TB-1株を形質転換し、得られた
形質転換株について、それが保有するプラスミドの解析
を行い、cDNAの転写方向がプロモーターの方向と同一の
株を選択し、このプラスミドをpMAL31-7と命名した。

【０１２５】２）融合蛋白の精製 pMAL31-7を保持する大腸菌を50μg/mlのアンピシリンを
含むLB培地3ml で、37℃、一晩振とう培養した。つい
で、新しいLB培地100ml(同量のアンピシリンを含む)
に、1ml の一晩振とう培養液を加え、37℃下、OD_600nm
が0.5 になるまで振とう培養した。OD_600nm が0.5 に達
した培養液に、IPTGを最終濃度0.1mM となるように添加
し、さらに37℃で一晩振とう培養した。一晩振とう培養
した培養液は、4 ℃、6500r.p.m.、20分間の遠心分離に
より菌体を回収し、10mlのカラム緩衝液（10mM Tris-HC
l(pH7.4)、200mM NaCl、1mM EDTA）に菌体を懸濁した。
菌体は、超音波破砕機で処理し破砕した。破砕液を、0
℃、8800r.p.m.、30分間遠心分離し、上清を可溶性蛋白
画分とした。得られた可溶性画分をアミロースレジンカ
ラム(1ml、New England BioLabs 社製) を用いたクロマ
トグラフィーにかけた。溶離緩衝液は、10mlのカラム緩
衝液に10mMのマルトースを添加した溶液で行った。ネガ
ティブコントロールとして、何も組み込んでいないpMAL
-cベクターを大腸菌へ導入して、同様にしてIPTG添加に
て発現を誘導した後、アミロースレジンカラムにて精製
した。このようにして得られた融合蛋白を用いて、還元
活性の測定を行った。

【０１２６】３）還元活性の測定 還元活性の測定は、ジクロロフェノール・インドフェノ
ール（DCIP）および酸化型グルタチオン（GSSG）を用い
て、キュベット(SARSTEDT 社製、10×4 ×45mm) 内で行
った。

【０１２７】a) DCIP を用いた還元活性の測定 50μM DCIP( シグマ社製)1mlに、２）で精製したpMAL-
c、およびpMAL31-7蛋白を各90.4μg 加え、1mM NADPH
(ベーリンガーマンハイム社製) を15μl 添加後、OD
_600nm 、およびOD_340nm の吸収の値を時間を追って測定
した。その結果、図６に示すように、時間を追って両波
長の吸収が減少することから、pMAL31-7は、DCIPを還元
させる活性を持つことが明らかとなった。

【０１２８】b) GSSG を用いた還元活性の測定 10mM GSSG(ベーリンガーマンハイム社製)15 μl を、キ
ュベットに添加したpMAL-c、およびpMAL31-7精製蛋白各
90.4μg に加え、1mM NADPH を15μl 添加後、OD_340nm
の吸収を時間を追って測定した。その結果、図７に示す
ように、pMAL31-7精製蛋白は、GSSGを還元させる活性を
持つことが明らかとなった。一方、この反応において、
GSSGを添加しない場合、NADPH の消費は見られないこと
から、pMAL31-7精製蛋白は、NADPH を用いてGSSGを還元
することが示唆された。 ［実施例１５］モノクローナル抗体の調製 (a) 抗原蛋白質の調製 pMAL31-7を保持する大腸菌を50μg/mlのアンピシリンを
含むLB培地3ml で、37℃、一晩振とう培養した。つい
で、新しいLB培地100ml （同量のアンピシリンを含む）
に、1ml の一晩振とう培養液を加え、37℃で、OD_600nm
が0.5 になるまで振とう培養した。OD_600nm が0.5 に達
した培養液にIPTGを終濃度0.1mM となるように添加し、
さらに37℃で一晩振とう培養した。一晩振とう培養した
培養液は、4 ℃、6500r.p.m.、20分間の遠心分離により
菌体を回収し、10mlのカラム緩衝液（10mM Tris-HCl(pH
7.4)、200mM NaCl、1mM EDTA）に菌体を懸濁した。菌体
は、超音波破砕機で処理し破砕した。破砕液を、0 ℃、
8800r.p.m.、30分間遠心分離し、上清を可溶性蛋白画分
とした。得られた可溶性画分をアミロースレジンカラム
1ml を用いたクロマトグラフィーにかけた。溶離緩衝液
は、10mlのカラム緩衝液に10mMのマルトースを添加した
溶液で行った。このようにして得られた融合蛋白を抗原
に用いた。

【０１２９】(b) 免疫マウス脾細胞の調製 8 週令のBALB/c雄マウス3 匹にアジュバントとしてフロ
インド完全アジュバント2ml をa)で精製した抗原2ml(20
0 μg 相当) に加えて、5ml のガラス製ジャンクション
付注射筒内でエマルジョンを形成させ、皮下注射して免
疫した。2 回目以降の免疫ではアジュバントとしてフロ
インド不完全アジュバントを用いた。免疫は、約2 週間
おきに4 回行い、2 回目の免疫以降、免疫する直前に眼
底静脈叢より採血し、血清中の抗KM31-7抗体価を以下に
述べる固相法による酵素免疫測定法(ELISA法) で調べ
た。

【０１３０】（固相酵素免疫法）96穴のELISA 用プレー
ト(Nunc 社製、Nunc-Immuno Plate,MaxiSorp) にpSR α
31-7でCOS-1 細胞をトランスフェクトして得られた無血
清培養上清150 〜200 μl 、または抗原として使用した
融合蛋白200ng を各穴に分注し、4 ℃で一晩放置して抗
原をプレート穴底面にコートさせた。プレートを0.1% T
ween20/PBSで3 回洗浄した後、PBS で10μg/mlに調製し
たBSA を100 μl/穴で添加し、室温で1 時間放置した。
さらに0.1%Tween20/PBS で3 回洗浄して、これに第一抗
体として段階希釈した試料（マウス血清）を30〜100 μ
l/穴分注し、室温で1 時間放置した。その後、0.1% Twe
en20/PBSで3 回洗浄し、第二抗体としてヤギ抗マウスIg
- パーオキシダーゼ結合物( アマシャム社製) の3000倍
希釈液、またはヤギ抗マウスIgG-アルカリフォスファタ
ーゼ結合物(BIO-RAD社製) の3000倍希釈液を100 μl/穴
分注し、室温で1 〜2 時間放置する。0.1%Tween20/PBS
で3 回洗浄後、パーオキシダーゼ基質液(BIO-RAD社製、
Peroxidase Substrate Kit ABTS)、または10%ジエタノ
ールアミン、0.001%パラニトロフェニルフォスフェート
溶液を100 μl/穴添加し、室温で15〜30分放置後、マイ
クロプレートリーダー(BIO-RAD社製) で415nm 、または
405nm の吸収を測定し、抗体価を算出した。

【０１３１】(c) マウス骨髄腫細胞の調製 8-アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞P3-X63-Ag8.653(6
53) を正常培地(complete GIT)で培養し、2x10⁷以上の
細胞を得た。

【０１３２】(d) ハイブリドーマの作製 DMEM（日水製薬社製）でよく洗浄した免疫マウス脾細胞
1.4 ×10⁸ 個とマウス骨髄腫細胞P3-X63-Ag8.653(653)
1.5 ×10⁷ 個を混合し、800r.p.m. で6 分間遠心分離に
かけた。沈澱として得られた脾細胞、およびP3-X63-Ag
8.653(653) を混合した細胞群をよくほぐした後、あら
かじめDMEMで50% に調製したポリエチレングリコール40
00(PEG4000) 溶液を2ml/分となるように一滴ずつ撹拌し
ながら1 分間添加した。次にDMEMを2ml/分で1 分間、同
様にして添加し、この操作をもう一度繰り返した。さら
に16mlのDMEMを3 分間で添加して、800r.p.m. で6 分間
遠心分離した。遠心分離後上清を捨て、35mlの5 〜10ng
/ml のマウスIL-6を含むcomplete GITで懸濁した。

【０１３３】(e) ハイブリドーマ群の選別 懸濁液を96穴プレート（COSTAR社製）に100 μl/穴ずつ
分注し、7.5%のCO₂ インキュベーター中、37℃で培養し
た。7 日後、50μl/穴でHAT 培地を添加した。さらに4
日後、同様にして同量のHAT 培地を添加した。その3 日
後、コロニー状に生育してきた融合細胞のみられる穴に
ついて培養上清の一部を採取し、抗KM31-7抗体価を上記
(b) と同様の固相酵素免疫測定法により測定し、それと
同時にHT培地へ置き換えた。

【０１３４】(f) クローニング 抗体価の認められた穴については、限界希釈法によりク
ローニングを3 回繰返し、安定して抗体価の認められた
クローンを抗KM31-7モノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマ株として選択した。ここで得られたハイブリドーマ
クローンの１つは、MKM150-2と命名され、工業技術院生
命工学工業研究所に寄託番号FERM BP-5086として寄託さ
れている。特にこのクローニングの際、pSR α31-7でCO
S-1 細胞をトランスフェクトして得られた無血清培養上
清とネガティブコントロールとしてpcDL-SR α296 でCO
S-1 細胞をトランスフェクトして得られた無血清培養上
清の両者に対してELISA を行い、前者に反応するが、後
者には反応しない株をクローニングの対象とした。

【０１３５】(g) モノクローナル抗体の精製 抗KM31-7モノクローナル抗体産生ハイブリドーマMKM150
-2株の培養上清を回収して、0.22μm のフィルター(MIL
LIPORE社製) にて濾過滅菌した後、MAbTrap GII(ファル
マシア社製) を用いて抗体を精製した。

【０１３６】(h) モノクローナル抗体の検定 i)モノクローナル抗体の抗原特異性 pSR α31-7でCOS-1 細胞をトランスフェクトして得られ
た無血清培養上清を用いた免疫沈降実験により、モノク
ローナル抗体がKM31-7蛋白に特異的であることを確認し
た。

【０１３７】ii) モノクローナル抗体の分類 マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット( ア
マシャム社製) を用いて解析した結果、この抗体は、Ig
G ₁ サブクラスの抗体であると同定された。

【０１３８】［実施例１６］抗原抗体反応を利用したKM
31-7蛋白の単離、精製 pSR α31-7でCOS-1 細胞をトランスフェクトして得られ
た無血清培養上清、およびpcDL-SR α296 でCOS-1 細胞
をトランスフェクトして得られた無血清培養上清と該モ
ノクローナル抗体との間で抗原抗体反応を利用した免疫
沈降反応を行った。上記培養液、各1.7ml に対して、実
施例１５の抗KM31-7モノクローナル抗体を1.4 μg 加
え、2.2ml の微量遠心チューブ中で20r.p.m.で回転させ
ながら1 時間、室温で反応させた。この時、モノクロー
ナル抗体を添加しない、pSR α31-7でCOS-1 細胞をトラ
ンスフェクトして得られた培養上清についても同様な操
作を行った。

【０１３９】次に、あらかじめ0.1%Tween20/PBS で洗浄
したProtein G Sepharose 4 Fast Flow （ファルマシア
社製）を30μl ずつ添加し、再び室温で30分間、20r.p.
m.の速度で回転させながら抗体を吸着させた。30分後、
微量遠心機で10000r.p.m. 、数秒間遠心して沈澱物をと
らないように注意深く上清を捨て、0.1%Tween/PBS で洗
浄した。この操作を5 回繰り返した後、沈澱物を10μl
のSDS-ポリアクリルアミド電気泳動用(SDS-PAGE)の2-メ
ルカプトエタノールを含むサンプル緩衝液に懸濁し、90
℃で2 分間熱処理した後に12.5% ゲルを用いた還元条件
下でのSDS-PAGEを行った。泳動後、ポリアクリルアミド
からニトロセルロース膜(BIO-RAD社製）へ転写を行っ
た。実施例１５（ａ） で示した抗原で免疫したウサギ
から得られた抗KM31-7ポリクローナル抗体を用いてウエ
スタンブロッティングを行ったところ、抗KM31-7モノク
ローナル抗体は、pSR α31-7をCOS-1 細胞にトランスフ
ェクトして得られた無血清培養上清から特異的にKM31-7
蛋白を沈降させていることが判明した。

【０１４０】

【発明の効果】本発明のＤＮＡを使用することにより生
産される、ジクロロフェノール・インドフェノールおよ
び酸化型グルタチオン還元活性を有するタンパク質は、
動脈硬化症、糖尿病、虚血障害（再かん流障害、虚血性
心疾患、脳虚血、虚血性腸炎など）、浮腫、血管透過性
こう進、炎症、胃粘膜障害、急性膵炎、クローン病、潰
瘍性大腸炎、肝障害、パラコート病、肺気腫、化学発
癌、癌転移、成人呼吸窮迫症候群、汎発性血管内血液凝
固症候群(DIC) 、白内障、未熟児網膜症、自己免疫疾
患、ポルフィリー血症、溶血性疾患、地中海性貧血、パ
ーキンソン病、アルツハイマー病、てんかん発作、紫外
線障害、放射線障害、凍傷、熱傷などの病態、疾患の予
防、治療において、単独又は他の治療薬との併用投与で
用いられる。

【０１４１】また、本発明のタンパク質に対するモノク
ローナル抗体は、該タンパク質の詳細な機能を解析する
ため、特に該タンパク質の機能、組織分布などを検索し
たり、該タンパク質の定量などをする上で有用である。
また、該モノクローナル抗体を利用して簡単に該タンパ
ク質の精製をすることができるようになった。

【０１４２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１６５０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ホモ・サピエンス（Homo sapiens） 配列の特徴： 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..1647 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：mat_peptide 存在位置：70..1647 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：1..69 特徴を決定した方法：E 配列 ATG TCA TGT GAG GAC GGT CGG GCC CTG GAA GGA ACG CTC TCG GAA TTG 48 Met Ser Cys Glu Asp Gly Arg Ala Leu Glu Gly Thr Leu Ser Glu Leu -23 -20 -15 -10 GCC GCG GAA ACC GAT CTG CCC GTT GTG TTT GTG AAA CAG AGA AAG ATA 96 Ala Ala Glu Thr Asp Leu Pro Val Val Phe Val Lys Gln Arg Lys Ile -5 1 5 GGC GGC CAT GGT CCA ACC TTG AAG GCT TAT CAG GAG GGC AGA CTT CAA 144 Gly Gly His Gly Pro Thr Leu Lys Ala Tyr Gln Glu Gly Arg Leu Gln 10 15 20 25 AAG CTA CTA AAA ATG AAC GGC CCT GAA GAT CTT CCC AAG TCC TAT GAC 192 Lys Leu Leu Lys Met Asn Gly Pro Glu Asp Leu Pro Lys Ser Tyr Asp 30 35 40 TAT GAC CTT ATC ATC ATT GGA GGT GGC TCA GGA GGT CTG GCA GCT GCT 240 Tyr Asp Leu Ile Ile Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Leu Ala Ala Ala 45 50 55 AAG GAG GCA GCC CAA TAT GGC AAG AAG GTG ATG GTC CTG GAC TTT GTC 288 Lys Glu Ala Ala Gln Tyr Gly Lys Lys Val Met Val Leu Asp Phe Val 60 65 70 ACT CCC ACC CCT CTT GGA ACT AGA TGG GGT CTT GGA GGA ACA TGT GTG 336 Thr Pro Thr Pro Leu Gly Thr Arg Trp Gly Leu Gly Gly Thr Cys Val 75 80 85 AAT GTG GGT TGC ATA CCT AAA AAA CTG ATG CAT CAA GCA GCT TTG TTA 384 Asn Val Gly Cys Ile Pro Lys Lys Leu Met His Gln Ala Ala Leu Leu 90 95 100 105 GGA CAA GCC CTG CAA GAC TCT CGA AAT TAT GGA TGG AAA GTC GAG GAG 432 Gly Gln Ala Leu Gln Asp Ser Arg Asn Tyr Gly Trp Lys Val Glu Glu 110 115 120 ACA GTT AAG CAT GAT TGG GAC AGA ATG ATA GAA GCT GTA CAG AAT CAC 480 Thr Val Lys His Asp Trp Asp Arg Met Ile Glu Ala Val Gln Asn His 125 130 135 ATT GGC TCT TTG AAT TGG GGC TAC CGA GTA GCT CTG CGG GAG AAA AAA 528 Ile Gly Ser Leu Asn Trp Gly Tyr Arg Val Ala Leu Arg Glu Lys Lys 140 145 150 GTC GTC TAT GAG AAT GCT TAT GGG CAA TTT ATT GGT CCT CAC AGG ATT 576 Val Val Tyr Glu Asn Ala Tyr Gly Gln Phe Ile Gly Pro His Arg Ile 155 160 165 AAG GCA ACA AAT AAT AAA GGC AAA GAA AAA ATT TAT TCA GCA GAG AGA 624 Lys Ala Thr Asn Asn Lys Gly Lys Glu Lys Ile Tyr Ser Ala Glu Arg 170 175 180 185 TTT CTC ATT GCC ACT GGT GAA AGA CCA CGT TAC TTG GGC ATC CCT GGT 672 Phe Leu Ile Ala Thr Gly Glu Arg Pro Arg Tyr Leu Gly Ile Pro Gly 190 195 200 GAC AAA GAA TAC TGC ATC AGC AGT GAT GAT CTT TTC TCC TTG CCT TAC 720 Asp Lys Glu Tyr Cys Ile Ser Ser Asp Asp Leu Phe Ser Leu Pro Tyr 205 210 215 TGC CCG GGT AAG ACC CTG GTT GTT GGA GCA TCC TAT GTC GCT TTG GAG 768 Cys Pro Gly Lys Thr Leu Val Val Gly Ala Ser Tyr Val Ala Leu Glu 220 225 230 TGC GCT GGA TTT CTT GCT GGT ATT GGT TTA GAC GTC ACT GTT ATG GTT 816 Cys Ala Gly Phe Leu Ala Gly Ile Gly Leu Asp Val Thr Val Met Val 235 240 245 AGG TCC ATT CTT CTT AGA GGA TTT GAC CAG GAC ATG GCC AAC AAA ATT 864 Arg Ser Ile Leu Leu Arg Gly Phe Asp Gln Asp Met Ala Asn Lys Ile 250 255 260 265 GGT GAA CAC ATG GAA GAA CAT GGC ATC AAG TTT ATA AGA CAG TTC GTA 912 Gly Glu His Met Glu Glu His Gly Ile Lys Phe Ile Arg Gln Phe Val 270 275 280 CCA ATT AAA GTT GAA CAA ATT GAA GCA GGG ACA CCA GGC CGA CTC AGA 960 Pro Ile Lys Val Glu Gln Ile Glu Ala Gly Thr Pro Gly Arg Leu Arg 285 290 295 GTA GTA GCT CAG TCC ACC AAT AGT GAG GAA ATC ATT GAA GGA GAA TAT 1008 Val Val Ala Gln Ser Thr Asn Ser Glu Glu Ile Ile Glu Gly Glu Tyr 300 305 310 AAT ACG GTG ATG CTG GCA ATA GGA AGA GAT GCT TGC ACA AGA AAA ATT 1056 Asn Thr Val Met Leu Ala Ile Gly Arg Asp Ala Cys Thr Arg Lys Ile 315 320 325 GGC TTA GAA ACC GTA GGG GTG AAG ATA AAT GAA AAG ACT GGA AAA ATA 1104 Gly Leu Glu Thr Val Gly Val Lys Ile Asn Glu Lys Thr Gly Lys Ile 330 335 340 345 CCT GTC ACA GAT GAA GAA CAG ACC AAT GTG CCT TAC ATC TAT GCC ATT 1152 Pro Val Thr Asp Glu Glu Gln Thr Asn Val Pro Tyr Ile Tyr Ala Ile 350 355 360 GGC GAT ATA TTG GAG GAT AAG GTG GAG CTC ACC CCA GTT GCA ATC CAG 1200 Gly Asp Ile Leu Glu Asp Lys Val Glu Leu Thr Pro Val Ala Ile Gln 365 370 375 GCA GGA AGA TTG CTG GCT CAG AGG CTC TAT GCA GGT TCC ACT GTC AAG 1248 Ala Gly Arg Leu Leu Ala Gln Arg Leu Tyr Ala Gly Ser Thr Val Lys 380 385 390 TGT GAC TAT GAA AAT GTT CCA ACC ACT GTA TTT ACT CCT TTG GAA TAT 1296 Cys Asp Tyr Glu Asn Val Pro Thr Thr Val Phe Thr Pro Leu Glu Tyr 395 400 405 GGT GCT TGT GGC CTT TCT GAG GAG AAA GCT GTG GAG AAG TTT GGG GAA 1344 Gly Ala Cys Gly Leu Ser Glu Glu Lys Ala Val Glu Lys Phe Gly Glu 410 415 420 425 GAA AAT ATT GAG GTT TAC CAT AGT TAC TTT TGG CCA TTG GAA TGG ACG 1392 Glu Asn Ile Glu Val Tyr His Ser Tyr Phe Trp Pro Leu Glu Trp Thr 430 435 440 ATT CCG TCA AGA GAT AAC AAC AAA TGT TAT GCA AAA ATA ATC TGT AAT 1440 Ile Pro Ser Arg Asp Asn Asn Lys Cys Tyr Ala Lys Ile Ile Cys Asn 445 450 455 ACT AAA GAC AAT GAA CGT GTT GTG GGC TTT CAC GTA CTG GGT CCA AAT 1488 Thr Lys Asp Asn Glu Arg Val Val Gly Phe His Val Leu Gly Pro Asn 460 465 470 GCT GGA GAA GTT ACA CAA GGC TTT GCA GCT GCG CTC AAA TGT GGA CTG 1536 Ala Gly Glu Val Thr Gln Gly Phe Ala Ala Ala Leu Lys Cys Gly Leu 475 480 485 ACC AAA AAG CAG CTG GAC AGC ACA ATT GGA ATC CAC CCT GTC TGT GCA 1584 Thr Lys Lys Gln Leu Asp Ser Thr Ile Gly Ile His Pro Val Cys Ala 490 495 500 505 GAG GTA TTC ACA ACA TTG TCT GTG ACC AAG CGC TCT GGG GCA AGC ATC 1632 Glu Val Phe Thr Thr Leu Ser Val Thr Lys Arg Ser Gly Ala Ser Ile 510 515 520 CTC CAG GCT GGC TGC TGA 1650 Leu Gln Ala Gly Cys 525 配列番号：２ 配列の長さ：５２６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ser Cys Glu Asp Gly Arg Ala Leu Glu Gly Thr Leu Ser Glu Leu -23 -20 -15 -10 Ala Ala Glu Thr Asp Leu Pro Val Val Phe Val Lys Gln Arg Lys Ile -5 1 5 Gly Gly His Gly Pro Thr Leu Lys Ala Tyr Gln Glu Gly Arg Leu Gln 10 15 20 25 Lys Leu Leu Lys Met Asn Gly Pro Glu Asp Leu Pro Lys Ser Tyr Asp 30 35 40 Tyr Asp Leu Ile Ile Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Leu Ala Ala Ala 45 50 55 Lys Glu Ala Ala Gln Tyr Gly Lys Lys Val Met Val Leu Asp Phe Val 60 65 70 Thr Pro Thr Pro Leu Gly Thr Arg Trp Gly Leu Gly Gly Thr Cys Val 75 80 85 Asn Val Gly Cys Ile Pro Lys Lys Leu Met His Gln Ala Ala Leu Leu 90 95 100 105 Gly Gln Ala Leu Gln Asp Ser Arg Asn Tyr Gly Trp Lys Val Glu Glu 110 115 120 Thr Val Lys His Asp Trp Asp Arg Met Ile Glu Ala Val Gln Asn His 125 130 135 Ile Gly Ser Leu Asn Trp Gly Tyr Arg Val Ala Leu Arg Glu Lys Lys 140 145 150 Val Val Tyr Glu Asn Ala Tyr Gly Gln Phe Ile Gly Pro His Arg Ile 155 160 165 Lys Ala Thr Asn Asn Lys Gly Lys Glu Lys Ile Tyr Ser Ala Glu Arg 170 175 180 185 Phe Leu Ile Ala Thr Gly Glu Arg Pro Arg Tyr Leu Gly Ile Pro Gly 190 195 200 Asp Lys Glu Tyr Cys Ile Ser Ser Asp Asp Leu Phe Ser Leu Pro Tyr 205 210 215 Cys Pro Gly Lys Thr Leu Val Val Gly Ala Ser Tyr Val Ala Leu Glu 220 225 230 Cys Ala Gly Phe Leu Ala Gly Ile Gly Leu Asp Val Thr Val Met Val 235 240 245 Arg Ser Ile Leu Leu Arg Gly Phe Asp Gln Asp Met Ala Asn Lys Ile 250 255 260 265 Gly Glu His Met Glu Glu His Gly Ile Lys Phe Ile Arg Gln Phe Val 270 275 280 Pro Ile Lys Val Glu Gln Ile Glu Ala Gly Thr Pro Gly Arg Leu Arg 285 290 295 Val Val Ala Gln Ser Thr Asn Ser Glu Glu Ile Ile Glu Gly Glu Tyr 300 305 310 Asn Thr Val Met Leu Ala Ile Gly Arg Asp Ala Cys Thr Arg Lys Ile 315 320 325 Gly Leu Glu Thr Val Gly Val Lys Ile Asn Glu Lys Thr Gly Lys Ile 330 335 340 345 Pro Val Thr Asp Glu Glu Gln Thr Asn Val Pro Tyr Ile Tyr Ala Ile 350 355 360 Gly Asp Ile Leu Glu Asp Lys Val Glu Leu Thr Pro Val Ala Ile Gln 365 370 375 Ala Gly Arg Leu Leu Ala Gln Arg Leu Tyr Ala Gly Ser Thr Val Lys 380 385 390 Cys Asp Tyr Glu Asn Val Pro Thr Thr Val Phe Thr Pro Leu Glu Tyr 395 400 405 Gly Ala Cys Gly Leu Ser Glu Glu Lys Ala Val Glu Lys Phe Gly Glu 410 415 420 425 Glu Asn Ile Glu Val Tyr His Ser Tyr Phe Trp Pro Leu Glu Trp Thr 430 435 440 Ile Pro Ser Arg Asp Asn Asn Lys Cys Tyr Ala Lys Ile Ile Cys Asn 445 450 455 Thr Lys Asp Asn Glu Arg Val Val Gly Phe His Val Leu Gly Pro Asn 460 465 470 Ala Gly Glu Val Thr Gln Gly Phe Ala Ala Ala Leu Lys Cys Gly Leu 475 480 485 Thr Lys Lys Gln Leu Asp Ser Thr Ile Gly Ile His Pro Val Cys Ala 490 495 500 505 Glu Val Phe Thr Thr Leu Ser Val Thr Lys Arg Ser Gly Ala Ser Ile 510 515 520 Leu Gln Ala Gly Cys 525 配列番号：３ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TAAATAAATA AATAA 15 配列番号：４ 配列の長さ：６６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTAGCGCTCT GGGGCAAGCA TCCTCCAGGC TGGCTGCCAC CACCACCACC ACCACTGATC 60 TAGACT 66

【図面の簡単な説明】

【図１】 pUC KM 31-7の制限酵素地図

【図２】 pUC KM 31-7とpcD-31における3'末端のヌクレ
オチド配列の比較図

【図３】 pSRα31-7の構築図

【図４】 pUC KM 31-7へのヒスチジンヘキサマーの導入
図

【図５】 pMAL 31-7の構築図

【図６】 ジクロロフェノール・インドフェノール還元
活性の測定図

【図７】 酸化型グルタチオン還元活性の測定

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 16/44 Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 5/10 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9358−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＡＢ ＡＡＦ ＡＡＭ ＡＢＡ ＡＢＥ ＡＢＬ ＡＢＲ ＡＢＸ ＡＢＹ ＡＣＣ ＡＣＤ ＡＣＪ ＡＣＳ ＡＤＡ ＡＤＤ ＡＤＰ ＡＤＵ 38/44 ＡＢＳ 39/395 Ｎ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/573 Ａ 33/577 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＢ ＡＡＦ ＡＡＭ ＡＢＡ ＡＢＥ ＡＢＬ ＡＢＲ ＡＢＸ ＡＢＹ ＡＣＣ ＡＣＤ ＡＣＪ ＡＣＳ ＡＤＡ ＡＤＤ ＡＤＰ ＡＤＵ 37/50 ＡＢＳ

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 分子中に配列番号２のアミノ酸番号１〜
   ５２６のアミノ酸配列を含み、ジクロロフェノール・イ
   ンドフェノールおよび酸化型グルタチオンを還元する活
   性を有するタンパク質、または、分子中に該アミノ酸配
   列の一つもしくは二つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入
   若しくは置換されているアミノ酸配列を含み、該還元活
   性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を
   含むＤＮＡ。
2. 【請求項２】 分子中に配列番号２のアミノ酸番号１〜
   ５２６のアミノ酸配列を含み、ジクロロフェノール・イ
   ンドフェノールおよび酸化型グルタチオンを還元する活
   性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を
   含むＤＮＡ。
3. 【請求項３】 分子中に配列番号１のヌクレオチド番号
   ７０〜１６４７のヌクレオチド配列を含む、請求項１又
   は２記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 分子中に配列番号１のヌクレオチド番号
   ７０〜１６４７のヌクレオチド配列と７０％以上のヌク
   レオチド配列相同性を有する配列を含み、ジクロロフェ
   ノール・インドフェノールおよび酸化型グルタチオンを
   還元する活性を有するタンパク質をコードするヌクレオ
   チド配列を含むＤＮＡ。
5. 【請求項５】 分子中に配列番号１のヌクレオチド番号
   ７０〜１６４７のヌクレオチド配列と５５％以上のヌク
   レオチド配列相同性を有する配列を含み、ジクロロフェ
   ノール・インドフェノールおよび酸化型グルタチオンを
   還元する活性を有するタンパク質をコードするヌクレオ
   チド配列を含むＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項３記載のＤＮＡとハイブリダイズ
   し、ジクロロフェノール・インドフェノールおよび酸化
   型グルタチオンを還元する活性を有するタンパク質をコ
   ードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ。
7. 【請求項７】 請求項３記載のＤＮＡと、６０〜７０
   ℃、６×SSC 条件下でハイブリダイズし、ジクロロフェ
   ノール・インドフェノールおよび酸化型グルタチオンを
   還元する活性を有するタンパク質をコードするヌクレオ
   チド配列を含む、請求項６記載のＤＮＡ。
8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれかに記載のＤＮＡ
   を含む組換えＤＮＡベクター。
9. 【請求項９】 請求項８記載の組換えＤＮＡベクターに
   より形質転換された宿主細胞。
10. 【請求項１０】 請求項９記載の細胞が産生するタンパ
    ク質。
11. 【請求項１１】 分子中に配列番号２のアミノ酸番号１
    〜５２６のアミノ酸配列を含み、ジクロロフェノール・
    インドフェノールおよび酸化型グルタチオンを還元する
    活性を有するタンパク質、または、分子中に該アミノ酸
    配列の一つもしくは二つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿
    入若しくは置換されているアミノ酸配列を含み、該還元
    活性を有するタンパク質。
12. 【請求項１２】 分子中に配列番号２のアミノ酸番号１
    〜５２６のアミノ酸配列を含み、ジクロロフェノール・
    インドフェノールおよび酸化型グルタチオンを還元する
    活性を有するタンパク質。
13. 【請求項１３】 請求項１０〜１２のいずれかに記載の
    タンパク質に対するモノクローナル抗体。
14. 【請求項１４】 請求項１３記載のモノクローナル抗体
    と試料を接触させ、該モノクローナル抗体と結合したタ
    ンパク質を分離することを特徴とする、タンパク質の精
    製方法。