JP2000502903A - インターフェロンγ誘導因子―２をコードする核酸 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、アデノイド、脳、腎、肝臓、肺、皮膚、滑膜、及びＴリンパ球で発現された新規なインターフェロンγ誘導因子−２（ＩＧＩＦ−２）を同定し、コードするポリヌクレオチド（ｉｇｉｆ−２）を提供するものである。また、本発明は、そのアンチセンス分子もその範囲に含む。更に本発明は、精製ＩＧＩＦ−２の産生のための遺伝子工学的処理をなされた発現ベクター及び宿主細胞；抗体、アンタゴニスト、及びインヒビター；及び医薬品組成物や、このポリペプチド、及びその抗体、アンタゴニスト、及びインヒビターに基づく疾病の治療方法を提供する。本発明は、特に、免疫無防備状態の患者の治療薬として、成いはＩＧＩＦ−２の異常発現や白血球やリンパ球の活性の変化を検出するための診断的アッセイにおけるポジティブコントロールとして、このポリペプチドの利用することも、その範囲に含む。

Description

【発明の詳細な説明】 インターフェロンγ誘導因子−２をコードする核酸技術分野 本発明は、新規なサイトカイン、インターフェロンγ誘導因子−２（interfer on gamma inducing factor-2）の核酸配列及びアミノ酸配列、及び疾病の診断、 研究、予防、及び治療におけるこれらの配列の利用に関するものである。背景技術 サイトカインは、細胞の増殖、分化、移動の際、ピコモルからナノモル単位の 濃度で活性となり、白血球の遊走及び機能、造血細胞数、体温調節、感染に対す る急性の反応、組織再構築や、細胞残存のような作用に影響を及ぼす。サイトカ インは、特定の剌激又は疾病によってグループ単位で及びある特徴のパターンを もって産生されるため、特定のサイトカインの活性を変化させる抗体や他の薬物 を用いた研究により、個々のサイトカインの病理学的及び生理学的な役割が解明 され始めた。その例として、炎症に反応して素速く発現される２種類のサイトカ イン、即ちインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）及びインターロイキン−１２（Ｉ Ｌ−１２）について説明する。 ＩＦＮ−γは、免疫の調節や炎症反応に関与する多面作用性のサイトカインで ある。この ＩＦＮ−γは、抗原や分裂促進因子に応じて、ＣＤ４⁺、ＣＤ８⁺、 及びＴｈ１リンパ球及びナチュラルキラー細胞によって産生される。ＩＦＮ−γ は、短い非螺旋配列によって互いに結びつけられている６つのαヘリックスをそ れぞれが備えた２つのサブユニットの逆平行結合によって形成されたホモニ量体 である。この４０〜７０ｋＤ二量体の全体の構造は、球状で、２つの潜在性Ｎ− グリコシル化部位 を含む。ＩＦＮ−γをコードするこの１つの遺伝子は、染色体１２の長いアーム に位置しており、他の種の配列との同性は小さく、これは種特異的活性を説明し ている。ＩＦＮ−γはＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、及び内皮細胞、 マクロファージ、及び繊維芽細胞の活性化、増殖、及び分化に関与している。Ｉ ＦＮ−γによって、ＩｇＧ２αの産生が可能となり、ＩＦＮα／βの抗ウィルス 性及び抗増殖性の活性を増強し、Ｂ細胞及びマクロファージでのクラスＩＩ主要 組織適合複合体分子の発現を増やし、且つＩｇＧ１及びＩｇＥの産生、Ｔｈ２細 胞の増殖、及び骨髄細胞におけるＩＬ−３、ＩＬ−４、顆粒球−単球コロニー刺 激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びＴＮＦ−αのこ効果を抑制する。敗血症及び大脳マ ラリアのモデル研究において、ＩＦＮ−γは、ＴＮＦ−αの毒性レベルを増やす ことにより、病理学的な疾病状態を増悪させた。 ＩＬ−１２は、生物学的に活性なヘテロ二量体を形成する３５ｋＤと４０ｋＤ の２本のジスルフィド結合した鎖から成る。いずれの鎖も、既知のタンパタ質と 近縁関係を有していない。４０ｋＤの鎖は、ヒトとマウスのそれぞれのもので７ ０％の相同性を示し、種特異性を有しており、受容体のヘマトポイエチンファミ リー及びＩｇスーパーファミリーに存在する配列モチーフを含む。ＩＬ−１２の 既知の機能は、細胞障害性リンパ球の活性化、Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞 によるＩＦＮ−γ合成の誘発、抗原の作用に応じたＴｈ−１の媒介、活性化ＣＤ ４⁺Ｔ細胞、ＣＤ８⁺Ｔ細胞、及びナチュラルキラー細胞の増殖因子様刺激、及び ナチュラルキラー細胞及びリンバ球又はリンホカイン活性化キラー細胞の溶解性 の活性化の促進が含まれる。 ＩＦＮ−γ誘導因子（ＩＧＩＦ）は、マウスの肝臓で最近発見されたサイトカ インである（Ｏｋａｍｕｒａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３ ７８：８８−９１）。ＩＧＩＦ遺伝子は、グリコシル 化部位を含まない１５７個のアミノ酸から成る成熟タンパク質及び１９２個のア ミノ酸から成る前駆体タンパク質を一義的にコードする。ＩＧＩＦのｍＲＮＡは クッパー細胞及び活性化マクロファージにおいて見いだされ、この組換えタンパ ク質は、ＩＬ−１２より強力なＩＦＮ−γの誘導物質である。ＩＬ−１２及びＩ ＧＩＦの発見により、これらのタンパク質がＩＦＮ−γのＴｈ−１産生を誘発す べく相乗的に作用しうることが示唆されたが、抗体の研究により、ＩＧＩＦ及び ＩＬ−１２がこの誘発を行うために異なる経路を用いていることが具体的に分か った。更に、上述のＯｋａｍｕｒａの論文では、バクテリアで処理され毒素ショ ックを引き起こすべくリポ多糖類を負荷されたマウスにおける肝臓の損傷が抗Ｉ ＧＩＦ抗体の投与により予防されたことが具体的に示されている。Ｏｋａｍｕｒ ａ等によればＩＧＩＦが肝臓の組織損傷により発動される白血球を減らし得るこ と、及びＩＧＩＦの変調により、ＡＩＤＳ、肺結核、及びライ病のような炎症性 の疾病において他の用途を有しうることを示唆している。 炎症組織又は疾患組織における異常の診断のための現在の技術は、その大部分 を臨床的な観察や体液や組織のホルモン、ポリペプチド又は様々な代謝産物の血 清学的分析に依存している。しかし、ほ乳類は、炎症や疾病プロセスの初期にお いては臨床的な症状を表さないことがあり、血清学的分析では、侵襲性の疾病と 遺伝性の症候群とを、それらが類似した又は重複した範囲を有する場合常に区別 できるわけではない。従って、炎症又は疾病状態の検出のための新たな診断方法 の開発が、初期の段階における正確な診断、分子病原の理解、効果的な治療法の 開発を行うために重要である。 サイトカインについては、特に、Ｃａｌｌａｒｄ ＲＥ ａｎｄＡＪＨＧｅａ ｒｉｎｇ（１９９４）Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｆａｃｔ ｓｂｏｏｋ ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ．Ｇｕｙ ｔｏｎ，ＡＣ（１９９１）Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓ ｉｏｌｏｇｙ ，ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．ＰｈｏｌａｄｅｌｐｈｉａＰＡ ．ａｎｄ Ｐａｕｌ ＷＥ（１９９３）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏ ｌｏｇｙ ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ．に記載されてお り、これを参照されたい。発明の開示 本発明は、ヒトアデノイド、脳、腎臓、肝臓、肺、皮膚、滑膜、及びＴリンパ 球からつくられたｃＤＮＡライブラリーにおいて見いだされた新規なサイトカイ ン、インターフェロンγ誘発因子−２（ＩＧＩＦ−２）に関し、又、炎症又は疾 病の研究、診断、予防及び治療におけるこの新規なサイトカインの核酸配列及び アミノ酸配列の利用に関する。 ここに開示するＩＧＩＦ−２は、初めにアミノ酸配列アライメントのコンピュ ータ検索によりインサイト社クローン６３１７９６で同定された。本発明のアミ ノ酸配列は１９３アミノ酸の長さを有し、インターフェロンγ誘発因子（ＩＧＩ Ｆ）のマウスのアミノ酸配列に約６０％のアミノ酸配列類似性を有する（Ｏｋａ ｍｕｒａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７８：８８−９１； ＧＩ １０６４８２３）。この核酸配列（ｉｇｉｆ−２で表される）が配列番号 ：１として、アミノ酸配列（ＩＧＩＦ−２で表される）が配列番号：２としてこ こに開示される。 又、ここには配列番号：１のヌクレオチド６２２での点突然変異（アミノ酸配 列では１４０番目の残基が置換される）を含むＩＧＩＦ−２変異体も開示されて いる。Ｔリンパ球ｃＤＮＡライブラリーから得られたｉｇｉｆ−２は、アルギニ ンをコードする配列番号：１のヌクレオチド の６２２番目の位置にグアニン（Ｇ）を有し、肝臓ｃＤＮＡライブラリーから得 られたｉｇｉｆ−２は、アミノ酸残基１４０のイソロイシンをコードするヌクレ オチドの６２２番目の位置にチミン（Ｔ）を有する。又ここには、炎症性アデノ イドにおいて見いだされた、長さが４２アミノ酸で、ＩＧＩＦ−２とＮ末端アミ ノ酸残基を共通のものとし、追加のアミノ酸残基（文字コードで）ＧＫＶＥＭＮ ＬＦＦＦＡＮ（配列番号：３）であるＩＧＩＦ−２変異体も開示されている。こ のｉｇｉｆ−２変異体は、ポリＡの尾部を有し、別形態でスプライシングされた ｉｇｉｆ−２の転写物を表し得る。 ＩＧＩＦはＩＦＮ−γ、即ち免疫反応の調節に関与するサイトカインを誘導し 、ＴＮＦ−αの毒性レベルを作り出すことによって一定の病理学的状態を増悪さ せるものであることがわかっている。抗ＩＧＩＦを投与することによって、バタ テリアにより処理され、敗血症を誘発すべくリポ多糖類を負荷されたマウスにお ける肝臓障害を予防できることが確認された。従って、本発明の核酸配列及びア ミノ酸配列は、ＩＧＩＦ−２の発現か、炎症、或いはその両方が関係する疾病状 態及び条件の初期段階での正確な検出及び治療のための診断方法及び治療方法を 開発するための基礎となる。更に、ここに開示する核酸配列及びアミノ酸配列は 、ＩＧＩＦ−２の発現や炎症、或いはその両方が関係する疾病状態や条件の検出 や治療のための診断的及び治療的組成物を作り出すための基礎となる。 ＩＧＩＦ−２又はその変異体をコードするここに開示するポリヌクレオチド配 列は、ＩＧＩＦ−２の発現又は炎症、或いはその両方が関係する疾病や条件の診 断用のオリゴヌクレオチドプローブを設計するための基礎となる。このようなプ ローブを、重症の臨床的症状が発症する前に細胞や組織の炎症及び組織損傷を診 断するために用いてもよい。本発明 は又、ｉｇｉｆ−２アンチセンス分子も提供している。このアンチセンス分子を 、アレルギーや喘息のような過剰な又は不十分な免疫反応を煩う個人におけるゲ ノムのｉｇｉｆ−２ヌクレオチド配列の発現を減らしたり０にしたりするために 用いることができる。本発明は又、ＩＧＩＦ−２のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでの産生のためのｉｇｉｆ−２を含む発現ベクター及び宿主細胞もその 範囲に含んでいる。 更に本発明は、白血球及びリンパ球の増殖、分化、及び成熟のＩＧＩＦ−２誘 導を防止するための治療用として使用され得る、ＩＧＩＦ−２のアンタゴニスト 又はインヒビターをスクリーニングしたり、抗ＩＧＩＦ−２抗体を産生するため に、ＩＧＩＦ−２、又はそのフラグメントや変異体を利用することにも関係して いる。このようなアンタゴニスト又はインヒビターを用いて、免疫反応をダウン レギュレートし、深在性の組織損傷を引き起こしうるタンパク分解性酵素の分泌 を防止することができる。 本発明は更に、ＨＩＶに感染した患者のような免疫障害の患者に対して、精製 ＩＧＩＦ−２やその変異体を含む組成物を投与することにも関係している。この 投与の目的は、ＩＦＮ−γのような内性の抗ウイルス性分子を誘発したり、白血 球やリンパ球の増殖、分化、及び成熟を誘導することである。 本発明は又、ｉｇｉｆ−２の異常発現や白血球又はリンパ球活性の変化を伴う 遺伝性又は後天性の疾病の診断、予防又は治療のための、抗ＩＧＩＦ−２抗体や 多のアンタゴニストやインヒビターを含む組成物にも関係する。このような疾病 には、ウィルス性感染症（ＡＩＤＳや肝炎）、細菌性感染症（敗血症）、真菌性 感染症（ヒストプラスマ症）や、寄生虫様の感染症や、アレルギー又は喘息や、 例えばアスベスト、石炭の粉塵等にさらされることによる機械的損傷や外傷、動 脈硬化症、アテロー ム発生、膠原病、或いは自己免疫性溶血性貧血や、胆汁性肝硬変や、若年性糖尿 病や、エリテマトーデスや、多発性硬化症や、重傷筋無力症や、慢性関節リウマ チのような遺伝病、白血病、リンパ種或いは癌腫、クローン病や他の炎症性腸疾 患、或いは白血球又はリンパ球の異常活性を伴う他の疾患が含まれる。 ここに開示するｉｇｉｆ−２ポリヌクレオチド配列、又はそのオリゴヌクレオ チド、フラグメント、部分、或いはアンチセンス分子を、細胞及び組織における ｉｇｉｆ−２ｍＲＮＡの検出や計量のための診断的アッセイに用いることができ る。例えば、ｉｇｉｆ−２ポリヌクレオチド配列を、遺伝子発現の異常を診断す るための溶液性、膜性、又は組織性アッセイで用いて、近縁な或いは同一の配列 を検出することができる。更に本発明は、精製ＩＧＩＦ−２及び抗ＩＧＩＦ−２ 抗体を含む細胞及び組織におけるＩＧＩＦ−２の検出のための診断的アッセイ及 びキットを提供する。ここでＩＧＩＦ−２はポジティブコントロールとして用い ることができる。このような抗体を、ＩＧＩＦ−２の異常発現又は白血球やリン パ球活性の変化が関係する病状や状態を検出するための溶液性、膜性、又は組織 性の技術において用いることができる。 ｉｇｉｆ−２アンチセンス分子、抗ＩＧＩＦ−２抗体、ＩＧＩＦ−２のアンタ ゴニストやインヒビターを、例えば、肝炎や膵臓炎を煩う患者における、炎症を 伴うＩＧＩＦ−２の過剰発現を抑制したり中和するための治療的な目的で用いる ことができる。本発明は、ｉｇｉｆ−２の異常発現や白血球又はリンパ球活性の 変化を伴う疾病状態の治療のための医薬品組成物も提供する。このような医薬品 組成物は、ゲノムのポリヌクレオチド配列の転写や翻訳、或いはその両方を抑制 しうるアンチセンス分子、抗ＩＧＩＦ−２抗体、又はＩＧＩＦ−２のアンタゴニ ストやインヒビターを効果的な量だけ含む。この他、本発明は、ＨＩＶに感染し た患者のような免疫不全の患者の治療のため、又はＩＦＮ−γのような内性抗ウ ィルス分子の誘発のため、及び白血球及びリンパ球の増殖、分化、及び成熟のた めの、ＩＧＩＦ−２ポリペプチド、又はその変異体を効果的な量だけ含む医薬品 組成物も提供する。 本発明は又、免疫反応が関係する疾病や状態を煩う患者に対する、本発明のヌ クレオチド配列の導入のための遺伝子治療方法の使用もその範囲に含む。 図面の簡単な説明 第１Ａ図及び第１Ｂ図は、インターフェロンγ誘導因子−２の核酸配列及びア ミノ酸配列を示す図面である。配列アライメントは、ＭａｃＤＮＡＳＩＳ ＰＲ Ｏ（商標）ソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅ ｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｓａｎ Ｂｒｕｎｏ，ＣＡ）を用いて作成された 。 第２図に示すのは、ＩＧＩＦ−２（６３１７９６；配列番号：２）とＩＧＩＦ （ＧＩ １０６４８２３；配列番号：４）との間のアミノ酸配列の類似性を示す 図である。図示した配列は、ＤＮＡＳＴＡＲ（商標）ソフトウェア（ＤＮＡＳＴ ＡＲ Ｉｎｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）のマルチシーケンスアライメントプログ ラムを用いて作成された。 第３図に示すのは、ＩＧＩＦ−２の実験室内でのノーザン分析の像である。像 の左側に示されているのは、標準サイズのマーカーであり、像の下部に示されて いるのは、（１）脾臓、（２）リンパ節、（３）胸腺、（４）虫垂、（５）末梢 血、（６）骨髄、及び（７）胎児の肝臓から抽出された核酸を含む番号を付され たレーンである。ＩＧＩＦ−２のバンドは、１．３５標準分子量マーカーとの同 一レベルの像上の位置にある様々なレーンに現れている。 第４図に示すのは、インサイト社クローン６３１７９６及びＬＩＦＥＳＥＱ（ 商標）データベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて作成された、ＩＧＩＦ−２の電子ノー ザン分析の結果を示した図である。発明の実施の形態 （Ｐ６Ｂ）本発明は、「インターフェロンγ誘導因子−２」として開示されてい る新規なサイトカインに関する。このインターフェロンγ誘導因子−２は、ヒト の腎臓、肝臓、Ｔリンパ球及び炎症性アデノイドから作られたｃＤＮＡライブラ リーにおいて発現されているのが見いだされた。本明細書においては、この新規 なンターフェロンγ誘導因子−２の小文字で表した記号（ｉｇｉｆ−２）は、核 酸配列を表し、大文字で表されたもの（ＩＧＩＦ−２）は、アミノ酸配列を表す ものとする。 本明細書において、「核酸配列」とは、オリゴヌタレオチドの配列、ヌクレオ チド配列、ポリヌクレオチド配列、そのフラグメントや部分の配列、或いは、セ ンス鎖かアンチセンス鎖の何れかを表現する二本鎖または一本鎖の、ゲノムの、 または合成のＤＮＡやＲＮＡの配列を意味する。同様に本明細書において「アミ ノ酸配列」とは、ペプチドやタンパク質、またはその部分の配列を忌みする。 本明細書において、ＩＧＩＦ−２とは、任意の種（例えば、ウシ、ヒツジ、ブ タ、ウマ、好ましくはヒト）から得られたものか、若しくは天然、合成、半合成 、または組換え体の任意の源から得られた、自然発生のまたは変異体のＩＧＩＦ −２を意味する。好適なＩＧＩＦ−２変異体は、第１図に示すＩＧＩＦ−２アミ ノ酸配列（配列番号：２）と、少なくとも８０％のアミノ酸配列の類似性を有す るものであり、他の好適なＩＧＩＦ−２変異体は、少なくとも９０％の類似性を 有し、別の好適な ＩＧＩＦ−２は９５％以上の類似性を有するものである。本発明の好適なＩＧＩ Ｆ−２変異体は、配列番号：２の１４０番目のアミノ酸をイソロイシンで置換し たものである。別の好適なＩＧＩＦ−２の変異体は、配列番号：２の初めの３０ のアミノ酸に、アミノ酸ＧＫＶＥＭＮＬＦＦＦＡＮを加えて、４２番目のアミノ 酸残基で終わるもの（配列番号：３）である。 ＩＧＩＦ−２は、第２図のコンセンサス配列に示されるような、ＩＧＩＦとア ミノ酸レベルで６０％の相同性を有するサイトカインである（ＧＩ１０６４８２ ３；Ｏｋａｍｕｒａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７８：８ ８−９１）。サイトカインは、白血球及びリンパ球細胞の増殖、分化、及び遊走 に関与し、造血細胞数、体温調節、感染に対する速やかな反応、組織再構築及び 細胞生存に影響を及ぼし、免疫系の細胞からからだけでなく、損傷やストレスを 受けた細胞からも産生されることが知られている。 本明細書で用いられる「自然発生」なる用語は、天然に見出されるｍＲＮＡ配 列を有するＩＧＩＦ−２を意味する。同様に「生物学的活性」なる用語は、自然 発生ＩＧＩＦ−２の構造の、調節の、或いは生化学的機能を有するＩＧＩＦ−２ を意味する。同様に「免疫学的活性」なる用語は、適切な動物或いは細胞におけ る特定の免疫反応を誘発する、さらには特定の抗体と結合する、天然ＩＧＩＦ− ２、組換えＩＧＩＦ−２、或いは合成ＩＧＩＦ−２、またはその任意のオリゴペ プチドの能力として定義される。 ここで用いられる用語「誘導体」は、ｉｇｉｆ−２、即ちコード化されたＩＧ ＩＦ−２を化学的に修飾したものを意味する。そのような修飾の例としては水素 を、アルキル基、アシル基或いはアミノ基で置換したものがある。ｉｇｉｆ−２ 誘導体は、例えば単球の分化のようなＩＧＩ Ｆ−２の本質的な生物学的特性を保有するポリペプチドをコードする。 ここで用いられる用語「精製」は、自然環境から取り除かれ、単離された、即 ち天然には結合している少なくとも１つの他の成分から分離された核酸配列或い はアミノ酸配列の分子を意味する。ＩＧＩＦ−２コード化配列 ＩＧＩＦ−２の核酸配列（配列番号：１）及び予測アミノ酸配列（配列番号： ２）を第１図に示す。本発明により、ＩＧＩＦ−２のアミノ酸配列をコードする 任意のヌクレオチド配列は、ＩＧＩＦ−２を発現する組換え分子を生成するため に用いることができる。ｉｇｉｆ−２のヌタレオチド配列は、腎臓ｃＤＮＡラン ブラリーに由来するインサイト社クローンＮｏ．６３１７９６から予測されたＮ 末端アミノ酸配列のＢＬＡＳＴ分析により、同定された。配列番号：１の核酸配 列は、腎臓ｃＤＮＡライブラリー（ＫＩＤＮＮＯＴ０５）から得られたインサイ ト社クローンＮｏ．６３１７９６、Ｔリンパ球ｃＤＮＡライブラリー（ＴＬＹＭ ＮＯＴ０２）から得られたインサイト社クローンＮｏ．４５０２０２、及び肝臓 ｃＤＮＡライブラリー（ＬＩＶＲＮＯＴ０１）から得られたインサイト社クロー ンＮｏ．８９９０８を用いて構築された。炎症性アデノイドライブラリー（ＡＤ ＥＮＩＮＢ０１）から作られたインサイト社クローンＮｏ．１５９９３９は、ヌ クレオチド３０〜２９４がインサイト社クローンＮｏ．６３１７９６と正確に一 致しており、ポリＡ＋の尾部を有する。このクローンは、別のスプライシングさ れたＩＧＩＦ−２転写物を表現したものであり得る。Ｔリンパ球ｃＤＮＡライブ ラリーからのＩＧＩＦ−２では、核酸配列の６２２番目のヌクレオチドがＧであ り、これはアミノ酸配列の１４０番目の位置にあるアルギニンをコードする。し かし、肝臓ｃＤＮＡライブラリーに由来するＩＧＩＦ−２の同 じ位置については、ヌクレオチドの６２２番目がＴであり、対応するアミノ酸は イソロイシンである。これらの変化の何れもマウスのヌクレオチドの６２２番目 の位置に見出されるリジンを生成せず、多型コドンを表すものではない。 ＤＮＡ配列決定法は当技術分野ではよく知られており、ＤＮＡポリメラーゼＩ のクレノウフラグメント、すなわちＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）（ＵＳ Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）、Ｔａｑポリメ ラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）、熱安 定性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｃｈｉｃａｇｏ ＩＬ）或いは組 換えポリメラーゼとＧｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）に より販売されるＥＬＯＮＧＡＳＥ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ のようなプルーフリーディングエキソヌクレアーゼとの組み合わせのような酵素 を用いる。対象のＤＮＡテンプレートにアニールしたオリゴヌクレオチドプライ マーからＤＮＡを延長する方法が、一本鎖と二本鎖のテンプレート双方のために 開発された。連鎖停止反応生成物は電気泳動を用いて分離され、それらの組み込 まれ、標識された先駆物質を介して検出された。機械化された反応調製法、配列 決定及び配列解析における最近の改善により、一日あたりに決定できる配列の数 が増えた。好適には、その機械による配列決定プロセスはＨａｍｉｌｔｏｎ Ｍ ｉｃｒｏ Ｌａｂ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ ＮＶ），Ｐｅｌｔ ｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＰＴＣ２００；ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）及びＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃ ｉｔｙ ＣＡ）Ｃａｔａｌｙｓｔ８００及び３７７、さらには３７３ＤＮＡシー ケンサーのような装置を用いて自動化される。 任意の特定ｃＤＮＡライブラリの品質は、ｃＤＮＡｓのパイロットス ケール解析を行い、ベクター、λファージ或いはＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡ、ミトコ ンドリアＤＮＡ或いは反復ＤＮＡを含むクローンのパーセンテージ、及び公開デ ータベースの配列と正確に一致或いは相同性を有するクローンのパーセンテージ を検査することにより判定できる。ｉｇｉｆ−２ポリヌクレオチド配列の延長 ｉｇｉｆ−２のポリヌクレオチド配列は、部分的なヌクレオチド配列と、プロ モータや調節エレメントのような上流の配列を獲得するための周知の様々な方法 を利用して延長され得る。Ｇｏｂｉｎｄａ ｅｔ ａｌ（１９９３； ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ ２：３１８−２２）の論文には、既知の部位に 隣接する未知の配列を検索するための一般的なプライマーを利用する直接的な方 法として、「制限サイト」ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）が開示されている 。この方法では、初めにゲノムのＤＮＡの増幅が、リンカー配列に対するプライ マー及びプライマーに特異的な既知の領域の存在の下で行われる。増幅された配 列は、同じリンカープライマー及び一回目より内部の部位に特異的な別のプライ マの存在の下で、２回目のＰＣＲ処理を受ける。各ＰＣＲ処理の産物は、適当な ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、逆転写酵素を用いて配列決定される。 逆ＰＣＲ法は、既知の領域に基づいて多岐したプライマを用いて配列を増幅ま たは延長するために利用される（Ｔｒｉｇｌｉａ Ｔ ｅｔａｌ （１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １６：８１８６）。このプライマーの 設計は、ＯＬＩＧＯ（登録商標）４．０（１９９２； Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉ ｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ ＭＮ）や、他の適当なプロ グラムを用いて行われ、２２〜３０ヌクレオチドの長さでＧＣを５０％以上含み 、約６８〜７２ ℃の温度で標的配列にアニールするように設計され得る。この方法では、いくつ かの制限酵素を用いて、遺伝子の既知の領域にある適当なフラグメントを生成す る。フラグメントは、分子内連鎖反応により環状にされ、ＰＣＲ用の鋳型として 使用される。 キャプチャＰＣＲ法（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ Ｍ ｅｔ ａｌ （１９９１） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ １：１１１−１９）は、ヒト及びイ ースト菌の人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡにおける既知の配列に隣接するＤＮＡフ ラグメントをＰＣＲ増幅するための方法である。キャプチャＰＣＲ法でも、多数 の制限酵素による切断及びＰＣＲの前にＤＮＡ分子の未知の部分に工学的処理を なされた二鎖の配列を入れるライゲーションが必要である。 Ｐａｒｋｅｒ ＪＤ ｅｔ ａｌ（１９９１； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：３０５５−６０）による歩行（walking）ＰＣＲ法は、未知の 配列の検索を可能にする標的とされた遺伝子の歩行のための方法である。Ｐｒｏ ｍｏｔｅｒＦｉｎｄｅｒ（商標）というＣｌｏｎｔｅｃｈ社（Ｐａｌｏ Ａｌｔ ｏ ＣＡ）製の新しいキットは、ＰＣＲ、入れ子状態のプライマー及びＰｒｏｍ ｏｔｅｒＦｉｎｄｅｒライブラリーを用いて、ゲノムのＤＮＡにおいて歩行を起 こさせる。この方法では、ライブラリーのスタリーニングが不要であり、イント ロンーエキソンの接合部を見つけるのに有用である。 別のＰＣＲ法は、１９９６年６月７日出願のＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ Ｍｅｔ ｈｏｄ ｆｏｒ Ｏｂｔａｉｎｉｎｇ Ｆｕｌｌ Ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ Ｓ ｅｑｕｅｎｃｅなる名称のＧｕｅｇｌｅｒ他による米国特許第０８／４８７，１ １２号に記載されており、ここではこれを参照されたい。このＰＣＲ方法はＸＬ −ＰＣＲ（商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ） を用いて、ヌクレオチド 配列を増幅し、延長する。 完全長ｃＤＮＡのスクリーニングのための好適なライブラリは、より大きいｃ ＤＮＡを含むようにサイズ選択されたものである。また、ランダムに初回刺激を 受けたライブラリは、それが遺伝子の５'及び上流の領域を含む配列をより多く 含んでいるという点で好適である。ランダムに初回刺激を受けたライブラリは、 オリゴｄ（Ｔ）ライブラリでは完全長ｃＤＮＡが作れないような場合に特に役立 つものであり得る。ゲノムのライブラリは、５'の翻訳されない調節領域に向か って延長する場合に役立つ。 サイズの大小の分析、配列決定のヌクレオチド配列の確認、若しくはＰＣＲ生 成物のヌクレオチド配列の確認のための新しい方法は、キャピラリ電気泳動法で ある。高速シークエンシング用のシステムは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｂ ｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ ＣＡ）及び他の 会社で発売されている。キャピラリシークエンシングでは、電気泳動による分離 のための流動性のポリマー、レーザーで活性化される４つの異なる蛍光性の染料 （それぞれが各ヌクレオチドに対応している）、及びＣＣＤカメラによる放出さ れた光の波長の検出が利用される。アウトプット／光強度は、適当なソフトウェ ア（例えばＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＧｅｎｏｔｙｐｅｒ（商標）及びＳｅ ｑｕｅｎｃｅ Ｎａｖｉｇａｔｏｒ（商標））を用いて電気信号に変換され、サ ンプルを負荷するところからコンピュータ分析、電子的なデータの表示に至るま でのプロセス全体はコンピュータで制御される。キャピラリ電気泳動法は、特定 のサンプルにおいて僅かにしか存在し得ない小さなＤＮＡ断片の配列決定を行う のに特に適している。再現可能な配列決定としてＭ１３ファージＤＮＡの最大３ ５０塩基対を３０分で配列決定したことが報告されている（Ｒｕｉｚ−Ｍａｒｔ ｉｎｅｚ Ｍ Ｃ ｅｔ ａｌ （１９９３） Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ６５：２８５１−８）。ｉｇｉｆ−２の発現 本発明によれば、ＩＧＩＦ−２、及びそのポリペプチドの断片、溶解タンパク 質あるいはその機能的な等価物をコードするｉｇｉｆ−２ポリヌクレオチド配列 が、適切な宿主細胞でＩＧＩＦ−２の発現をもたらす組換えＤＮＡ分子を作り出 すために使用される。遺伝暗号固有の同義性のために、同一の、及び機能的に等 価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列も 適切な宿主細胞におけるＩＧ ＩＦ−２のクローニングや発現のために用いられ得る。当業者には理解されよう が、自然発生のコドンには含まれていないＩＧＩＦ−２をコードするヌクレオチ ド配列を作り出すことも有益であり得る。特定の原核細胞あるいは真核細胞の宿 主において好適なコドン（Ｍｕｒｒａｙ Ｅ等（１９８９）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ１７：）、例えば、ＩＧＩＦ−２発現速度を増加させるような、あるい は自然発生の配列からの転写物より長い半減期のような望ましい特性を有する組 換えＲＮＡ転写物が生成されるようなコドンを選択することができる。 同様に、本発明の範囲には、中程度から最高度の厳格な条件のもとで、図１の ヌクレオチド配列にハイブリッド形成可能なポリヌクレオチド配列が含まれる。 ハイブリッド形成条件は、ＷａｈｌとＢｅｒｇｅｒ（１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５２：３９９−４０７）やＫｉｍｍｅｌ（１９８７、Meｔ ｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５２：５０７−１１）が教えるように、核酸複合 体の溶解温度（Ｔｍ）に基づく。そして「厳格性」の定義は以下のように与えら れる。 「最大の厳格性」は、Ｔｍが−５℃（プローブのＴｍが５℃未満）の 場合に、「高い厳格性」はＴｍが５〜１０℃の場合に、「中程度の厳格性」はＴ ｍが１０〜２０℃の場合に、「低い厳格性」はＴｍが２０〜２５℃の場合に通常 要求される。当業者には理解されようが、最大の厳格性でのハイブリダイゼーシ ョンは、同一のポリヌタレオチド配列を識別するか、あるいは検出するために使 われるが、中程度（か、あるいは低い）厳格性でのハイブリダイゼーションは、 類似か、あるいは近縁なポリヌクレオチド配列を識別するか、あるいは検出する ために使われる。 「ハイブリッド形成（ハイブリダイゼーション）」なる用語は、本明細書におい ては、「核酸鎖が塩基対により相補的な鎖と結合するプロセス」を意味する（Ｃ ｏｏｍｂｓ Ｊ （１９９４） Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ） 。また増幅プロセスはＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ＣＷ ａｎｄ ＧＳ Ｄｖｅｋ ｓｌｅｒ（１９９５，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ ａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａ ｉｎｖｉｅｗ ＮＹ）に記載されているようにＰＣＲ法を用いて実行される。こ れらの文献を参照されたい。 本明細書において、「欠失」なる用語は、それぞれ、１または２以上のヌクレ オチドあるいはアミノ酸残基が欠落しているヌクレオチドあるいはアミノ酸配列 の変化と定義される。 本明細書において、「挿入」あるいは「付加」なる用語は、自然発生ｉｇｉｆ −２を比較したとき、１または２以上のヌクレオチドやアミノ酸残基が追加され ているようなヌクレオチドやアミノ酸配列の変化を意味する。 本明細書において、「置換」なる用語は、１または２以上のヌクレオチドまた はアミノ酸残基が、それぞれ異なるヌクレオチドやアミノ酸残 基と置き換わるような変化を意味する。 変異体ｉｇｉｆ−２ポリヌクレオチド配列は本発明により用いることができ、 これは、同一物若しくは機能的に等しいｉｇｉｆ−２をコードするポリヌクレオ チドを結果としてもたらすような、異なるヌクレオチド残基の削除、挿入、若し くは置換部位を含む。変異体ＩＧＩＦ−２タンパク質も本発明により用いること ができ、これも、その結果物が機能的に等価なＩＧＩＦ−２である限り、アミノ 酸残基の削除、挿入、若しくは置換部分を含んでいてもよい。 アミノ酸の置換は、ＩＧＩＦ−２の生物学的な活性が保持される限り、残基の 、極性、変化、可溶性、疎水性、親水性、及び／若しくは両親媒性の性質の共通 性に基づいて行うことができる。例えば、負に帯電したアミノ酸には、例えばア スパラギン酸とグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸には、例えばリジン とアルギニンがあり、同じ親水性値を有する帯電していない極性基を備えたアミ ノ酸としては、例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラリン 、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチ ロシンがある。 本発明の範囲には、ｉｇｉｆ−２のアレルが含まれる。本明細書中の記載に用 いられている「アレル」若しくは「アレル配列」なる用語は、ｉｇｉｆ−２の変 化した形である。アレルは、突然変異、即ち、核酸配列の変化から生じ、一般に 、その構造若しくは機能が変化した、或いは変化していない変形したｍＲＮＡ若 しくはポリペプチドを作り出す。任意の与えられた遺伝子は、対位形式を、持た ないか、１つ持つか、または複数個持つ。アレルを生じさせる共通の突然変異は 、通常、アミノ酸の削除、挿入、若しくは置換に起因する。これらのタイプの変 化の各々は、単独で、若しくは、他のものと組み合わされて、１つの与えられた 配列内で１回若しくは複数回生ずる。 本発明のヌクレオチド配列は、これらに限定はされないが、遺伝子生成物のク ローニング、プロセシング、及び／又は発現を変化させる変更を含む様々な理由 によって、ｉｇｉｆ−２をコードする配列を変化させるために開発される。例え ば、突然変異は、当業者に良く知られた、例えば、部位特異的な突然変異誘発と いった技術を用いて導入されて、新たな制限部位を挿入し、グリコシル化パター ンを変更し、コドンの優先順位を変えるために用いられても良い。 本発明の他の実施例では、ｉｇｉｆ−２の自然発生の、変形された、若しくは 遺伝子組換えによる配列が、合成タンパク質をコードするために、非相同の配列 と結合されても良い。例えば、ＩＧＩＦ−２活性のインヒビターに対するペプチ ドライブラリーをスタリーニングするために、商業的に利用できる抗体によって 認識される異種エピトープを発現するキメラＩＧＩＦ−２タンパク質をコードす るようにすることは有益である。合成タンパク質は、ＩＧＩＦ−２配列と、非相 同タンパク質配列との間に配置された切断部位を含むように製造され、ＩＧＩＦ −２が、非相同部分の半分（片割れ）から切断されて精製されても良い。 本発明の更に他の実施例では、ｉｇｉｆ−２のコード配列が、当業者に良く知 られた化学的な方法を用いて、全体若しくは一部が合成される（Ｓｅｅ Ｃａｒ ｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｓｙｍ ｐ Ｓｅｒ ７：２１５−２３３：Ｃｒｅａ ａｎｄ Ｈｏｒｎ（１９８０）Ｎ ｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ９：２３３１；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ａｎｄ Ｃａ ｒｕｔｈｅｒｓ（１９８０）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２１：７１９ ；ａｎｄ Ｃｈｏｗ ａｎｄ Ｋｅｍｐｅ（１９８１）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ ｅｓ ９：２８０７−２８１７）。代わりに、タンパク質それ自身が、化学的な 方 法を用いて、生み出されて、ＩＧＩＦ−２アミノ酸配列を全体若しくは部分的に 合成することもできる。例えばペプチドは、固相技術を用いて合成され、分離用 の高速液体クロマトグラフィによって樹脂から切断され、精製される（ｅｇ，Ｃ ｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ａｎ ｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎ ｄ Ｃｏ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。合成ペプチドの組成物は、アミノ酸分析 若しくはシークエンシングによって確認される（ｅｇ， ｔｈｅ Ｅｄｍａｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，ｓｕｐｒ ａ）。 直接ペプチド合成が、様々な固相技術を用いて実行され、（Ｒｏｂｅｒｇｅ ＪＹ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２−２０４）、 例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの４３ＩＡペプチドシンセサイザ を製造業者によって提供された指示に基づいて用いて、合成を自動的に行っても 良い。加えて、ＩＧＩＦ−２若しくはその任意の部分のアミノ酸配列が、直接合 成、及び／若しくは、その他のサイトカイン配列若しくはその任意の部分と化学 的な方法によって組み合わされる合成の間に、変形されて、変異体ポリペプチド が生成される。発現系 生物学的に活性なＩＧＩＦ−２を発現させるために、ＩＧＩＦ−２若しくは機 能的に等価なものに対するヌクレオチド配列コードが、適切な発現ベクター、即 ち挿入されたコード配列の転写及び翻訳のために必要なエレメントを含むベクタ ー内に挿入される。 当業者に良く知られた方法が用いられて、ＩＧＩＦ−２コード配列及び適切な 転写若しくは翻訳コントロールを含む発現ベクターが構築され る。これらの方法には、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、 及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え若しくは遺伝子組換えがある。このような技術は、Ｍ ａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ ｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ ｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹに記載されている。 様々な発現ベクター／宿主系が用いられて、ｉｇｉｆ−２コード配列を含み且 つ発現するために用いられる。これらには、限定を意図するものではないが、組 換えバクテリオファージ、プラスミド若しくはコスミドＤＮＡ発現ベクターと共 に変換されたバタテリアや、イースト菌発現ベクターと共に変換されたイースト 菌や、ウィルス発現ベクター（例えばバキュロウィルス）によって感染させられ た昆虫細胞系や、ウィルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウィルス ：ＣａＭＶ、タバコモザイタウィルス：ＴＭＶ）が移入された植物細胞系若しく はバクテリア発現ベクター（例えば、Ｄｉ若しくはｐＶＲ３２２プラスミド）と 共に変換された植物細胞系、若しくは動物細胞系などが含まれている。 これらの系の「制御エレメント」若しくは「調節シーケンス」は、それらの長 さ及び特異性が変化し、ベクター、エンハンサー、プロモーター、及び３’非翻 訳領域の、転写及び翻訳を実行するために宿主細胞のタンパク質と相互作用を起 こす翻訳されていない領域、である。用いられたベクター系及び宿主に応じて、 構成性及び誘導性のプロモータを含む、任意の個数の適切な転写及び翻訳エレメ ントが、用いられても良い。例えば、バクテリア系をクローニングする時、誘導 性プロモーターｐＢ ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌ ｌａ ＣＡ）のハイブリッドｌａｃＺプロモータ、ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッ ド及びそれらに類似するもの等の、誘導性プロモータが用いられる。バキュロウ ィルス・ポリヘドリン・プロモーターが、昆虫の細胞で用いられる。植物の細胞 のゲノム（例えば、熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ、及び、貯蔵タンパク質遺伝子 ）から導かれた、若しくは、植物ウィルス（例えば、ウィルスプロモータ若しく はリーダー配列）から導かれたプロモータ若しくはエンハンサが、ベクター内に クローニングされる。ほ乳類の細胞系では、ほ乳類遺伝子からの、若しくは、ほ 乳類ウィルスからのプロモータが、最も適している。ｉｇｉｆ−２の複数のコピ ーを含む株細胞を生み出す必要がある場合には、ＳＶ４０若しくはＥＢＶに基づ くベクターが適切な選択可能なマーカーと共に用いられても良い。 バクテリア系では、多くの発現ベクターが、ＩＧＩＦ−２に対して意図された 使用目的に応じて選択される。例えば、大量のＩＧＩＦ−２が抗体の誘発のため に必要とされるとき、容易に精製される融合タンパク質の高いレベルでの発現を もたらすベクターが望ましい。その様なベクターには、限定を意図するものでは ないが、Ｅ−ｃｏｌｉクローニング及び発現ベクターＰｂｌｕｅｓｃｒｐｉｒｉ ｐｔ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）があり、その中では、ｉｇｉｆ−２をコ ードする配列がフレーム内のベクターへ、アミノ末端Ｍｅｔと、後続のβ−ガラ クトシダーゼの７個の残基とに対する配列を伴って結合され、ハイブリッドタン パク質が産生され、ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅ ｒ （１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：５５０３−５５０９）、及 び、それらに類似するものが含まれている。また、ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍ ｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）が、グルタ チオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を伴った融合タンパク質として、異な るポリペプチドを発現するために用いられる。一般的に、そのような融合タンパ ク質は可溶性であり、吸収によって溶解された細胞から容易に精製されて、グル タチオン−アガローズビーズとなり、次に、自由なグルタチオンの存在下で溶出 される。その様な系で作られたタンパク質は、ペパリン、トロンビン若しくはＸ Ａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されていて、注目されているクロ ーニングされたポリペプチドが、ＧＳＴの半分から必要に応じて切断されるよう になっている。 イースト菌サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）では、、 多くの、アルファ因子、アルコールオキシターゼ、及びＰＢＨ等の構成型若しく は誘導性プロモータを含むベクターが用いられる。参考のために、「Ａｕｓｕｂ ｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｓｕｐｒａ）ａｎｄＧｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９８７ ）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４」が参照されたい 。 植物の発現ベクターが用いられる場合、ＩＧＩＦ−２コード配列の発現が、多 数のプロモータの任意のものによって促進れる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ及び １９Ｓプロモータ等のウィルスプロモータ（Ｂｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１ ９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１−５１４）が、単独で、若しくはＴＭＶ からのオメガリーダー配列と組み合わされて、用いられる（Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ ６：３０７−３１１）。他には、Ｒ ＵＢＩＳＣＯの小さいサブユニットの様な植物プロモータ（Ｃｏｒｕｚｚｉ ｅ ｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ ３：１６７１−１６８０；Ｂｒｏｇｌｉ ｅｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８−８４３）、若し くは熱ショックプロモータ（Ｗｉｎｔｅｒ Ｊ ａｎｄ Ｓｉｎｉ ｂａｌｄｉ ＲＭ（１９９１）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉ ｆｆｅｒ １７：８５−１０５）が用いられる。これらの構成は、直接のＤＮＡ トランスフォーメーション若しくは病原体仲介移入によって植物細胞内へ導入さ れる。これらの記述を復習するために、「Ｈｏｂｂｓ Ｓ ｏｒ Ｍｕｒｒｙ ＬＥ ｉｎ ＭｃＧｒａｗ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒ ｋ ＮＹ，ｐｐ１９１−１９６ ｏｒ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓ ｓｂａｃｈ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ Ｙ，ｐｐ４２１−４６３」を参照されたい。 ｉｇｉｆ−２を発現するために用いることのできる他の発現系は、昆虫の系で ある。その様な系のあるもののうちで、「Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏ ｒｎｉｃａ」核酸ポリヘドロシスウィルス（ＡｃＮＰＶ）が、ベクターとして用 いられて、「Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ」細胞若しくは「Ｔ ｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ」の幼生内の異なる遺伝子を発現するために用いられる 。ｉｇｉｆ−２コーディング配列は、ポリヘドリン遺伝子等のウィルスの本質的 でない領域内にクローニングされ、ポリヘドリンプロモーターのコントロールの もとで配置される。ｉｇｉｆ−２を成功裏に挿入することにより、ポリヘドリン 遺伝子が不活性的となり、コートタンパク質コートを持たない組換えウィルスを 作り出すことができる。次にこの組換えウィルスが、ＩＧＩＦ−２が発現された 「Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ」細胞若しくは「Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ」幼生 を感染させるのに用いられる（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ Ｖｉ ｒｏｌ ４６：５８４；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ ＥＫ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａ ｄ Ｓｃｉ ９１：３２２４−７）。 ほ乳類の宿主細胞では、多くのウィルスベースの発現系が用いられる。 アデノウィルスが発現ベクターとして用いられる場合では、ｉｇｉｆ−２コーデ ィンク配列が、遅いプロモータ及び３分節系リーダー配列から成るアデノウィル ス転移／翻訳コンプレックス内に結合される。ウィルスゲノムの本質的でないＥ １若しくはＥ３領域内への挿入によって、感染させられた宿主細胞内のＩＧＩＦ −２を発現することのできる生存可能なウィルスが達成される（Ｌｏｇａｎ ａ ｎｄ Ｓｈｅｎｋ（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１： ３６５５−３６５９）。加えて、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）エンハンサ等の 転移エンハンサを、ほ乳類の宿主細胞内での発現を増加させるために用いても良 い。 特異的開始シグナルも、挿入されたｉｇｉｆ−２コード配列の効率の良い翻訳 のために必要とされる。これらの信号には、ＡＴＧ開始コドンと隣接する配列と が含まれている。その開始コドン及び上流の配列と、ｉｇｉｆ−２とが適切な発 現ベクター内に挿入されている場合では、更に翻訳制御信号を必要とすることは ない。しかしながら、コーディング配列のみ、若しくはそのタンパク質のみが挿 入されている場合には、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の転移制御信号が必要と される。更に、開始コドンは、全体の挿入の転移を確実にするため、正しい読み 出しフレーム内になければならない。外因性の転移エレメントと開始コドンとは 、様々な由来源からのものであって良く、自然発生したもの及び合成されたもの の何れであっても良い。細胞系に適したエンハンサを含めることによって発現の 効率を強化されても良い（Ｓｃｈａｒｆ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｒｅｓｕｌ ｔｓ Ｐｒｏｂｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ ２０：１２５−６２；Ｂｉｔｔｎ ｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅ ｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５３：５１６−５４４）。 更に、宿主細胞の系統は、挿入された配列の発現を変更する能力に応じて、若 しくは、所望の形に発現されたタンパク質を処理する能力に応じて、選択されて も良い。その様なポリペプチドの変更は、限定を意図するものではないが、アセ チル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、アシル化が含まれ る。タンパク質の「プレプロ」形状を切断するポスト・トランスレーションプロ セスは、正しい挿入、折り曲げ、及び／若しくは、機能に対して、重要である。 ＣＨＯ，ＨｅＬａ，ＭＤＣＫ，２９３，ＷＩ３８等の異なる宿主細胞は、特定の セル機構及びそのポスト・トランスレーション活性に対する特性機構を有し、導 入された異質のタンパク質を正しく変更及び処理するすることを確実にするよう に選択される。 組換えタンパク質の長期間に渡る高い収率の産生のためには、安定した発現が 好ましい。例えば、安定してｉｇｉｆ−２を発現する株細胞は、複製若しくは内 因性発現エレメントと、選択可能なマーカー遺伝子のウィルスの源とを含む発現 ベクターを用いて転換される。ベクターの導入に続き、細胞は栄養価の高い培地 において１日から２日の間成長させられ、その後、選択的な培地に切り替えられ る。選択可能なマーカーは、選択に対する耐性をもたらし、導入された配列をそ のＤＮＡへ安定して結合させた細胞の特定を可能とする。細胞の耐性凝集塊は、 その細胞のタイプに適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。 任意の数の選択系が、転換された株細胞を修復するために用いることができる 。これらには、限定を意図するものではないが、ヘルペスシンプレックスウイル スチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｃｅｌｌ １１ ：２２３）と、アデニンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅ ｔ ａｌ．（１９８０）Ｃｅｌｌ ２２：８１７）遺伝子が含まれ、これらの遺伝子は、各々ｔｋ−若しくはａｐｒ ｔ−細胞内で用いられる。更に、代謝拮抗物質、抗生物質、若しくは除草剤に対 する耐性が、選択の基準として用いることができ、例えば、ｄｈｆｒは、メトト レキセートに対する耐性をもたらし（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８０） Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ７７：３５６７）、ｎｐｔはアミノグリコシド・ ネオマイシン及びＧ−４１８に対する耐性をもたらし（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａ ｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １５０：１）、 ａｌｓ及びｐａｔは、クロスルフロン及びフォスフィノトリシン・アセチル・ト ランスフェラーゼに対する耐性をもたらす（Ｍｕｒｒｙ ｓｕｐｒａ）。更に別 の選択できる遺伝子が記載され、例えば、ｔｒｐＰは、トリプトファン又はｈｉ ｓＤの代わりにインドールを細胞が用いることを可能とし、ヒスチジンの代わり にヒスチノールを細胞が用いることを可能にする（Ｈａｒｔｍａｎ ａｎｄ Ｍ ｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８５：８ ０４７）。最近では、目に見えるマーカーを用いることが一般的になりつつあり 、その理由は、βグルクロニダーゼ、アントシアニン、及びルシフェリンが、形 質転換体を特定するためのみに用いられるだけでなく、特定のベクター系の特徴 である過渡的なタンパク質の発現若しくは安定なタンパク質の発現の量を測定す るためにも用いられるからである（Ｒｈｏｄｅｓ ＣＡ ｅｔ ａｌ．（１９９ ５）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ５５：１２１−３１）。ｉｇｉｆ−２を含む形質転換体の同定 マーカー遺伝子の発現の有無が、注目されている遺伝子の存在をも表すのであ るが、その存在及び発現が確認されなければならない。例えば、 ｉｇｉｆ−２がマーカー遺伝子配列内に挿入されている場合、組換え細胞（ｉｇ ｉｆ−２を含む）が、マーカー遺伝子の機能が存在しないことによって同定され る。代わりに、マーカー遺伝子が、信号プロモータの制御のもとで、ＩＧＩＦ− ２シーケンスとタンデムに配置されても良い。マーカー遺伝子の導入若しくは選 択に対応する発現は、通常、十分にｉｇｉｆ−２の発現を表す。 代わりに、ｉｇｉｆ−２及び発現ＩＧＩＦ−２に対するコーディング配列を含 む宿主細胞が、当業者に良く知られた様々な手続きによって、同定されても良い 。これらの手順は、限定を意図するものではないが、核酸若しくはタンパク質の 検出及び／若しくは測定に対する技術に対するメンブレン、溶液、若しくはチッ プベースの技術を含む、免疫検定技術、ＤＮＡ−ＤＮＡ若しくはＤＮＡ−ＲＮＡ ハイブリダイゼーション及びタンパク質バイオ検定を含む。 ｉｇｉｆ−２ポリヌクレオチド配列の存在は、ＤＮＡ−ＤＮＡ若しくはＤＮＡ −ＲＮＡハイブリダイゼーション若しくは増幅（プローブ、タンパク質、若しく はｉｇｉｆ−２のフラグメントを用いる）によって検出できる。検定に基づく核 酸増幅には、ｉｇｉｆ−２ＤＮＡ若しくはＲＮＡを含む形質転換体を検出するた めのｉｇｉｆ−２配列に基づくオリゴヌクレオチド若しくはオリゴマーを用いる ことが含まれている。本明細書中で用いられている「オリゴヌクレオチド」若し くは「オリゴマー」は、少なくとも約１０個のヌクレオチド、多くの場合約６０ 個のヌクレオチドの核酸配列を表し、より好ましくは約１５から３０のヌクレオ チド、更により好ましくは約２０から２５個のヌタレオチドを、プローブ若しく はアンプリマとして用いることのできる核酸配列を表している。 ＩＧＩＦ−２タンパク質生成物の発現は、走化性若しくはＣａイオン移動度検 定によって生物学的に、若しくはウエスタンブロット、酵素結 合免疫検定（ＥＬＩＳＡ）等において免疫学的に、評価することができる。 「Ｆａｌｋ ＷＲ ｅｔ ａｌ．」（１９８０，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔ ｈｏｄｓ ３３：２３９）は、最初に４８穴のマイクロケモタキシスチャンバを 用いて、走化性の活性の評価に関して説明した。この検定では、発現されたサイ トカインは、ポリカーボネートフィルタの一方のサイドの媒体内に配置され、特 定の集団の細胞が、このフィルターの反対のサイドの同じ媒体内に懸濁された。 十分なインキュベート時間によって、細胞は、サイトカインの濃度勾配に応じて フィルタを移動した。このフィルタが、各穴から回収され、サイトカインに面す るフィルタのサイドに張り付いた細胞が、分類され、計量された。 その様な検定で用いられる細胞の集団は、静脈穿刺によって得られる血球細胞 、若しくは、望まれない集団の表面の分子に特異的な抗体を用いた濃度勾配遠心 分離及び／若しくは負の選択によって得られた好中球、末梢血液の単核細胞、及 び、リンバ球の栄養価の高い集団、を含む。例えば、ＣＤ４＋を伴うＴ細胞の集 団のインキュベートと、ＣＤ４＋と結合したＴ細胞の分離とが、ＣＤ８＋の栄養 価の高いＴ細胞の集団を結果としてもたらす。 好中球及び単球の非走化性の活性を検定するための試験には、アクチン重合化 、呼吸バーストの活性の増加、アズール親和性顆粒の脱顆粒、若しくはＣａ＋＋ の動員の測定が含まれ、且つそれらの測定の結果を標準的な値と比較することが 含まれている。シグナル変換経路の一部としてのＣａ＋＋の動員に対する検定で は、その発光特性がＣａ＋＋結合によって変更された蛍光プローブを伴った好中 球を予め負荷することを必要とする。細胞が活性化刺激にさらされたとき、Ｃａ ＋＋の流動性が、蛍光計内の細胞の観察によって求められる。Ｃａ＋＋の動員の 測定は、 「Ｇｒｙｎｋｉｅｖｉｃｚ Ｇ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ Ｂｏｉｌ Ｃｈ ｅｍ ２６０：３４００，ａｎｄ ＭｃＣｏｌｌ Ｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３ ）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５０：４５５０−４５５５」に記載されており、この 文献はここで言及したことにより本明細書の一部とされる。 脱顆粒及び呼吸バースト反応は、単球内でも同じように測定される（Ｚａｃｈ ａｒｉａｅ ＣＯＣ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７１： ２１７７−８２）。更に、単球の活性の測定は、リンパ球内の接着分子の発現の 調節である（Ｊｉａｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：２４２３−８；ＴａｕｂＤ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：３５５−３５８）。 タンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体 のいずれかを用いた、ＩＧＩＦ−２の発現を検出し測定するためのプロトコルと しては、様々なプロトコルが当業者には良く知られている。具体例が、酵素結合 免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍光表示 式細胞分取（ＦＡＣＳ）を含んでいる。ＩＧＩＦ−２の２つの非干渉エピトープ に対して反応するモノクローナル抗体を用いた、二部位、モノクローナルベース のイムノアッセイが実行されるが、競合的結合検定が用いられても良い。これら の及びその他の検定法は、「Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０，Ｓ ｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ ａｌ．ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ ，Ｓｔ Ｐａｕｌ ＭＮ）と、「Ｍａｄｄｏｘ Ｄ Ｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １５８：１２１１）に記載 されている。 様々なラベリング及び接合技術が当業者に知られており、且つ、様々 な核酸及びアミノ酸検定で用いられる。ｉｇｉｆ−２に関連する配列を検出する ための、標識されたハイブリダイゼーション若しくはＰＣＲプローブを作り出す ための手段には、例えば、オリゴラベリング、ニックトランスレーション、エン ドラベリング、若しくは、標識されたヌタレオチドを用いるＰＣＲ法による増幅 がある。この他、ｍＲＮＡプローブを作り出すために、ｉｇｉｆ−２配列、若し くはそのある部分をベクターに挿入してクローニングしても良い。この様なベク ターは、当業者に知られており、市販されており、Ｔ７、Ｔ３、若しくはＳＰ６ の様な適切なＲＮＡポリメラーゼと、標識されたヌクレオチドとを加えることに よって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いることができ る。「Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）」 、「Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）」及び、「ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｃａｌ Ｃｏｒｐ （ＣｌｅｖｅｌａｎｄＯＨ）」の様な多くの会社が、市販 されているキット及びそれらを使うためのプロトコルを供給している。適切なリ ポーター分子若しくは標識は、それらの放射性核種、酵素、蛍光体、化学的ルミ ネッセント、若しくは発色剤と、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子等を 含む。そのようなラベルの使用方法を開示する特許として、米国特許第３，８１ ７，８３７；３，８５０，７５２；３，９３９，３５０；３，９９６，３４５； ４，２７７，４３７；４，２７５，１４９；４，３６６，２４１号がある。更に 、組換え免疫グロブリンは、米国特許第４，８１６，５６７号に開示されいるよ うに作ることができ、この米国特許はここで言及したことにより本出願の一部と されたい。ＩＧＩＦ−２の精製 ｉｇｉｆ−２ヌクレオチド配列と共に転換された宿主細胞は、細胞培 地からコードされたタンパク質を発現し回収するのに適した条件の元で培養され る。組換え細胞によって作り出されたタンパク質は、分泌されても、細胞内に含 まれていても良く、これは、用いられた配列及び／若しくはベクターに応じて変 えられる。当業者には良く分かることであるが、ｉｇｉｆ−２を含む発現ベクタ ーは、特定の真核細胞若しくは原核細胞の細胞膜を通したＩＧＩＦ−２の分泌を 司るシグナル配列によって設計される。他の組換え体合成でも、ｉｇｉｆ−２を 、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドのドメインをコードするヌ クレオチド配列に接合する（Ｋｒｏｌｌ ＤＪ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＤＮ Ａ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２：４４１−５３）。 ＩＧＩＦ−２は、タンパク質の精製を容易にするために加えられた１つ若しく は複数の追加のポリペプチドドメインを備えた組換えタンパタ質として発現され ても良い。その様な精製はドメインを容易にし、限定を意図するものではないが 、固定化された金属に対する精製を可能とするヒスチジン−トリプトファンのよ うな金属キレート化べプチド、固定化された免疫グロブリンに対する精製を可能 とするタンパク質Ａドメイン、及び、ＦＬＡＧＳ拡張／親和性精製システム（Ｉ ｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ，Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）で用いられるドメインを含む 。精製ドメインとＩＧＩＦ−２との間のファクターＸＡ若しくはエンテロキナー ゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）の様な切断可能なリン カ配列を含むことは、精製を容易にするのに有効である。ＩＧＩＦ−２の使用 ＩＧＩＦ−２は、そのアミノ酸配列のＩＧＩＦに対する類似性や、リンパ球、 白血球、及び炎症やがん腫を患う組織で発現する点で、全身性防御において或る 役割を果たしているように見える。従って、ＩＧＩＦ −２の異常発現や、白血球やリンパ球の活性の変化、或いは免疫反応の変化にに 起因する疾患の治療に、ＩＧＩＦ−２の活性を直接間接に調整（modulate）する 抗ＩＧＩＦ−２抗体、又はその他のポリペプチド、タンパク質或いは有機分子を 用いることができる。 ＩＧＩＦ−２を含む治療用組成物は、免疫系を損なうよう疾患を患う患者の治 療や、その予防に適用することができる。このような疾患には、例えばＨＩＶ感 染などがあり、ＩＧＩＦ−２はＩＦＮ−γのような内生の抗ウイルス分子を誘発 することによって効果をもたらす。ＩＧＩＦ（Ｏｋｕｍｕｒａ上述）とＩＧＩＦ −２との間の所与の相同性のために、ＩＧＩＦ−２がＩＦＮ−γの誘発を刺激し たり、Ｔｈ１細胞の発生に影響を及ぼしたり、ＨＩＶ感染者のＴｈ１細胞、ＣＤ ４−Ｔ細胞、及びＣＤ８−Ｔ細胞の反応を良い方向に調節することが予想される 。同様に、不適切なＴｈ２反応やＩＦＮ−γの誘発を調節、即ちダウンレギュレ ートすることによって、アレルギー、特に過敏症の患者を治療するのに役立つこ とがある。 本発明の別の実施例によれば、ＩＧＩＦ−２発現と他のサイトカインの発現と が結びつくことに起因する組織損傷を伴う、敗血症や喘息のような状態や疾患の 予防又は治療に、ＩＧＩＦ−２の活性を中性化し得る抗ＩＧＩＦ−２抗体を用い ることができる。抗体やリガンドがＩＧＩＦ−２の効果を調整する能力は、上記 したマイクロケモタキシス或いはＣａ＋＋フラックスアッセイを用いることによ り測定することができる。 ＩＧＩＦ−２の抗体の製造のためには、本技術分野に於いてよく知られた手順 を用いることができる。このような抗体には、例えば、ポリクローナル抗体、モ ノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖、Ｆａｂフラグメント及びＦａｂ発現ライ ブラリにより生成したフラグメントがある。中性化用抗体、すなわちＩＧＩＦ− ２の生物学的活性を抑制するものが、 治療及び診断用として適している。 抗体の製造に際しては、ヤギ、ウサギ、ラット、マウスなどのさまざまな宿主 を、ＩＧＩＦ−２または免疫原性特性を保持するその一部、フラグメントまたは オリゴペプチドを注入することによって免疫化する。宿主の種に応じて、免疫学 的な反応を増大させるためにさまざまなアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）を用 いることができる。このようなアジュバントとしては、例えば、フロイントのア ジュバント、水酸化アルミニウムなどの鉱物性ゲル、リゾレシチン、プルオニッ ク・ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘ モシアニン及びジニトロフェノールなどの界面活性剤などがある。白血球の増殖 を剌激するために免疫不全の人に精製ＩＧＩＦ−２を投与する場合、ＢＣＧ（ba cilli Calmette-Guerin）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒｖｕｍは 、利用可能な潜在的に有用なヒト用アジュバントである。 培養体内に於ける連続的な株細胞による抗体分子の製造のためのあらゆる技術 を用いてＩＧＩＦ−２に対するモノクローナル抗体を生成することができる。こ れらの方法としては、限定的ではないが、元々はＫｅｏｈｌｅｒら（１９７５Ｎ ａｔｕｒｅ ２５６；４９５−４９７）によるヒブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍ ａ）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，１９８５ Ｊ Ｉ ｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１；３１−４２； Ｃｏｔｅら，１９８３ Ｐ ｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８０：２０２６−２０３０）及びＥＢＶ ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，１９８４Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ６２ ；１０９−１２０）が含まれる。さらに、「キメラ抗体」を製造するために開発 された技術、マウス抗体遺伝子を、人の抗体遺伝子にスプライシングして、適切 な抗体特異性及び生物学的活性を備えた分子を得る方法などを用いることができ る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，１９８４ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１； ６８５１−６８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，１９ ８４ Ｎａｔｕｒｅ ３１２； ６０４−６０８； Ｔａｋａｄａら，１９８５ Ｎａｔｕｒｅ ３１４； ４５２−４５４）。或いは、単鎖抗体を製造するため に記述された技術（ＵＳＰ ４，９４６，７７８）を適合させて、ＩＧＩＦ−２ 特異的単鎖抗体を製造するために用いることができる。 Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８６ ；３８３３−３８３７）或いはＷｉｎｔｅｒ Ｇ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ（１ ９９１； Ｎａｔｕｒｅ ３４９； ２９３−２９９）などによって開示されるよ うな高度に特異的な結合試薬の組換え型免疫グロブリンライブラリまたはパネル を選別することにより、抗体を製造することもできる。 ＩＧＩＦ−２に対する特異的結合部位を含む抗体フラグメントを製造すること もできる。例えば、そのようなフラグメントとしては、限定的ではないが、抗体 分子のぺプシン消化により生成されるＦ（ａｂ'）₂フラグメントや、Ｆ（ａｂ' ）₂フラグメントのジスルフィドブリッジを還元して製造され得るＦａｂフラグ メントがある。Ｆａｂ発現ライブラリは、所望の特異性を有するモノクローナル Ｆａｂフラグメントを迅速かつ容易に同定することができるように構成すること ができる（Ｈｕｓｅら，１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６；１２７５−１２８ １）。 ＩＧＩＦ−２特異的抗体は、ＩＧＩＦ−２の発現が関連する状態或いは疾患の 診断のために有用である。当該技術分野に於いては、すでに確立された特異性を もってポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いて競合的結合アッセイ或 いは免疫放射定線測定法を行うさまざまなプロトコルが知られている。このよう なアッセイは、通常ＩＧＩＦ−２とその特異性抗体（又は類似したＩＧＩＦ−２ 結合分子）との複合体の形 成及び複合体の形成量の測定を伴う。特異性ＩＧＩＦ−２タンパク質上に於ける ２つの互いに干渉しないエピトープに対して反応する２−部位モノクローナル抗 体に基づくアッセイを行うことが好ましいが、競合的結合アッセイを用いること もできる。このようなアッセイがＭａｄｄｏｘ ＤＥら（１９８３， Ｊ Ｅｘ ｐ Ｍｅｄ １５８；１２１１）に記載されている。ＩＧＩＦ−２特異性抗体を用いた診断的アッセイ ＩＧＩＦ−２の異常な発現により特徴づけられる症状、障害或いは疾病の診断 のために特定のＩＧＩＦ−２抗体が役立つ。ＩＧＩＦ−２のための診断用アッセ イは、人の体液、細胞、組織またはそのような組織からの抽出物に於いて、ＩＧ ＩＦ−２を検出するために標識及び抗体を用いる方法を含む。本発明のポリペプ チド及び抗体は、変更を加えずに用いることができる。多くの場合、ポリペプチ ド及び抗体は、リポーター分子と共有結合で、或いは非共有結合で結合すること により標識される。さまざまなリポーター分子が知られており、そのいくつかに ついては前に説明した。 特定のタンパタ質について特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体 を用いたＩＧＩＦ−２を測定するためのさまざまなプロトコルが知られている。 そのような例としては、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫検定法（ ＲＩＡ）、蛍光表示式分取法（ＦＡＣＳ）がある。特異性ＩＧＩＦ−２タンパタ 質上に於ける２つの互いに干渉しないエピトープに対して反応する２部位モノク ローナル抗体に基づくアッセイを行うことが好ましいが、競合的結合アッセイを 用いることもできる。このようなアッセイがＭａｄｄｏｘ ＤＥら（１９８３， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １５８；１２１１）に記載されている。 疾病の診断の基礎を提供するために、通常のまたは標準的なＩＧＩＦ−２発現 値を確立しなければならない。標準値は、動物またはまたはヒトの通常の対象か ら得られた体液または細胞を、よく知られた複合体形成に適する条件下に於いて ＩＧＩＦ−２に対する抗体と混合することにより得られる。標準的な複合体形成 量は、既知の濃度を有する精製ＩＧＩＦ−２と既知の量の抗体とが結合する一連 の希釈量のポジティブコントロールと比較することにより定量化される。このよ うにして、通常のサンプルから得られた標準値を、ＩＧＩＦ−２の発現に関連す る疾病や免疫不全に冒された被験者から得られたサンプルの値と比較する。標準 値と対象から得られた値との偏差から、疾病状態の有無を判定することができる 。薬剤のスクリーニング ＩＧＩＦ−２、その触媒的または抗体学的フラグメントまたはオリゴぺプチド を、さまざまな薬剤スクリーニング技術のいずれに於いても、治療用の化合物を スクリーニングするために用いることができる。このようなテストに用いられる フラグメントは、溶液内に遊離していたり、固体の担体に固定されていたり、細 胞面に担持されていたり、或いは細胞内に存在するものであってよい。ＩＧＩＦ −２とテストされる薬剤との間の結合複合体の形成または触媒的活性の消滅を測 定することができる。 薬物スクリーニングのための他の技術で、ＮＣＰポリペプチドに対する適切な 結合アフィニティを有する化合物の高スループットのスクリーニングが可能とな るが、これについては１９８４年９月１３日に公開されたヨーロッパ特許出願第 ８４／０３５６４号に詳細に記載されており、ここではこれを参照されたい。簡 単に説明すると、多数の異なる小さな ペプチドテスト化合物が、プラスチックピンまたは他の表面のような固体基質上 で合成される。このペプチドテスト化合物は、ＩＧＩＦ−２フラグメントと反応 させられた上で洗浄される。次いで結合されたＮＣＰフラグメントの検出が周知 の方法を用いて行われる。精製ＩＧＩＦ−２を、上述の薬物スクリーニング技術 で利用するためにプレート上に直接コーティングしてもよい。更に、非中和性の 抗体を用いてペプチドを捕捉し、それを固体の担体上に固定化することもできる 。 ＩＧＩＦ−２と結合し得る中和抗体がＩＧＩＦ−２フラグメントに結合するテ スト化合物と競合する競合的薬物スクリーニングアッセイの利用も本発明の範囲 に含まれる。この方法においては、ＩＧＩＦ−２と１又は２以上の抗原決定基を 共有する任意のペプチドの有無を検出するために抗体が用いられる。ｉｇｉｆ−２ポリヌクレオチドの利用 ポリヌクレオチドｉｇｉｆ−２またはその任意の部分を、診断及び／または治 療の目的で使用することができる。診断用としては、本発明のｉｇｉｆ−２が、 ＩＧＩＦ−２の活性が明らかとなるような疾病や状態における異常な遺伝子発現 の検出や定量のために用いられる。このような疾病には、ウィルス性感染症（Ａ ＩＤＳや肝炎）、細菌性感染症（敗血症）、真菌性感染症（ヒストプラスマ症） や、寄生虫様の感染症や、アレルギー又は喘息や、例えばアスベスト、石炭の粉 塵等にさらされることによる機械的損傷や外傷、動脈硬化症、アテローム発生、 膠原病、或いは自己免疫性溶血性貧血や、胆汁性肝硬変や、若年性糖尿病や、エ リテマトーデスや、多発性硬化症や、重傷筋無力症や、慢性関節リウマチのよう な遺伝病、白血病、リンパ種或いは癌腫、クローン病や他の炎症性腸疾患、或い は白血球又はリンパ球の異常活性を伴う他の疾患が含 まれる。 本発明の範囲には、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ 分子、及びリボザイムが含まれ、これらはＩＧＩＦ−２の翻訳を抑制する機能を 有する。本発明の別の形態では、ＩＧＩＦ−２をコードするゲノムの配列または 近縁関係を有する分子を含むポリヌクレオチド配列が検出できるＰＣＲプローブ 及びハイブリダイゼーションプローブが提供される。プローブの特異性は、その プローブが高度に特異的な領域、例えば５′調節領域における１０個の独特なヌ クレオチドから作られたものであっても、特異性のあまり高くない領域、例えば ３′領域から作られたものであってもよく、ハイブリダイゼーションまたは増幅 の厳密性（最高レベル、高レベル、中レベル、または低レベル）により、このプ ローブが自然発生ｉｇｉｆ−２のみを同定しているか、それに近縁な配列や他の サイトカイン分子をも同定しているかが決定される。近縁な核酸配列の検出のた めのプローブは、保存的な、或いは高度に保存的なｉｇｉｆ−２の配列から選択 され、このようなプローブは、同義プローブ（degenerate probes）のプールで 用いてもよい。同一な核酸配列の検出用、または最大限の特異性が要求される場 合には、核酸プローブは、ｉｇｉｆ−２の非保存的ヌクレオチド領域や、独特の 領域から選択される。ここで「非保存的ヌクレオチド領域」なる用語は、ｉｇｉ ｆ−２独特のヌクレオチド領域を意味し、ＩＧＩＦや他のサイトカインでは発生 しないものである。ｉｇｉｆ−２ポリヌクレオチドの診断のための利用 ＩＧＩＦ−２をコードするポリヌクレオチド配列を、ｉｇｉｆ−２の異常発現 を伴う疾病状態の診断に用いることができる。例えば、ＩＧＩＦ−２をコードす るポリヌタレオチド配列を、ｉｇｉｆ−２発現を検出 するための生体組織検査または死亡組織検査で採取された組織や体液のハイブリ ダイゼーションまたはＰＣＲアッセイにおいて使用することができる。このよう な定量的または定性的方法の形態は、サザン法による分析またはノーザン法によ る分析、ドットブロット、または他のメンブランを用いる技術、ＰＣＲ技術、浸 漬スティック、ピン、チップ及びＥＬＩＳＡ技術に含まれる。このような技術は 全て周知のものであり、多くの市販の診断キットの技術的基礎である。 このようなアッセイを、動物実験、臨床的治験、または個々の患者の治療のモ ニタにおいて特定の治療的処置の効率を評価するのに用いてもよい。疾病診断の ための基準を提供するために、ｉｇｉｆ−２発現の通常のまたは標準のプロフィ ールが確立されていなければならない。これは、ヒトまたは動物の何れかである 通常の被験者から得られた体液または細胞の抽出物と、ｉｇｉｆ−２またはその 部分とを、ハイブリッド形成または増幅に適した条件の下で結合するとによって 達成される。標準ハイブリダイゼーションは、通常の治験者から得られた値と、 既知の量の精製ｉｇｉｆ−２が用いられる同じ実験で得られる一連の希釈ポジテ ィブコントロールからえられる値のそれぞれとを比較することにより定量される 。通常のサンプルから得られた標準値は、ｉｇｉｆ−２発現が関与するような疾 病を患う患者のサンプルから得られた値と比較される。標準値と被験者の値の差 が、疾病の有無を示すことになる。 ひとたび疾患の存在が確認されると、治療薬が投与され、治療プロフィールが 作成される。このようなアッセイは定期的に反復して行うことにより、プロフィ ールの進行に際して値が通常のまたは標準のパターンに向かっている、若しくは 回復しているか否かを評価することができる。うまくいった治療のプロフィール を用いて、数日または数ケ月の期間に亘る治療の効果を示すことができる。 米国特許第４，６８３，１９５号、第４，８００，１９５号、及び第４，９６ ５，１８８号明細書に記載のＰＣＲ法を用いて、ｉｇｉｆ−２配列に基づくオリ ゴヌクレオチドの追加の利用法が得られる。このようなオリゴマーは、一般的に 化学的に合成されるが、このようなオリゴマーを酵素を利用して作り出したり、 組み換え体を起源として産生してもよい。オリゴマーは一般に一方はセンス方向 （５′→３′）、もう一方はアンチセンス（３′←５′）である２つのヌクレオ チド配列を含み、特定の遺伝子の同定または特定の状態の同定のために最適化さ れた条件の下で利用される。この２つのオリゴマーは入れ子になったオリゴマー の組若しくは縮退したオリゴマーのプールであって、厳密性の高くない条件の下 で近縁関係にあるＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出及び／または定量のために利用 される。 更に、特定の分子の発現の定量のための方法としては、ヌクレオチドの放射標 識（Ｍｅｌｂｙ ＰＣ ｅｔ ａｌ １９９３ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ｏｄｓ １５９：２３５−４４）またはビオチン標識（Ｄｕｐｌａａ Ｃ ｅｔ ａｌ １９９３ Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２２９−３６）、対照標準の核 酸との同時増幅（coamplification）、及び実験結果を補間した標準的な曲線を 用いる方法がある。多数のサンプルの定量では、興味の対象であるオリゴマーが 様々な希釈液の中に存在し、分光光度的若しくは比色定量的な反応によって高速 の定量が行えるＥＬＩＳＡ形式のアッセイを行うことによって定量のスピードを 速くすることができる。例えば、ｉｇｉｆ−２のアップレギュレートの結果、炎 症反応が生じたり、膨潤や不快感が生ずる。同様に、ｉｇｉｆ−２の過小発現に より、免疫反応が不十分になることがある。何れの場合においても、決定的な診 断によって、医療従事者が、患者を治療したり病状が悪化するのを防ぐことが可 能となる。同様に、当業者に周知のアッセ イにより、ｉｇｉｆ−２関連疾病を患う患者の治療中の病状の進行をモニタする ことが可能である。ｉｇｉｆ−２ポリヌクレオチドの治療的利用 ｉｇｉｆ−２配列は、例えばＨＩＶ感染による免疫不全の場合のように内生の 抗ウイルス分子を誘発することが必要な、種々の異常状態や疾患の治療に役立つ 。細胞にｉｇｉｆ−２配列を導入することによって、ＩＦＮ−γを誘導し、Ｔ細 胞集団を刺激することができる。このような例では、ＩＧＩＦ−２をコードする 配列が、内生のサイトカインの活性を補うことが意図されている。 ｉｇｉｆ−２アンチセンス作成物は、ｉｇｉｆ−２の異常発現や、他の免疫系 の分子によって特徴づけられる様々な疾患の治療に役立つことがある。このよう な配列をそのような患者にうまく供給し発現させることによって、ｉｇｉｆ−２ ｍＲＮＡの転写を低下または抑制し、炎症に起因する組織損傷を少なくすること ができる。 、組換えｉｇｉｆ−２や、センス分子またはアンチセンス分子を目標の細胞集 団に供給するために、レトロウィルス、アデノウイルス、ヘルペスあるいは バ クシニアウイルスか、あるいは種々のバクテリアのプラスミドに由来する発現ベ クターを用いることができる。また、当業者に周知の方法を用いて、ｉｇｉｆ− ２を含む組換えベクターを作ることができる。例えば、上述のＭａｎｉａｔｉｓ 等の論文やＡｕｓｕｂｅｌ等の論文に記載された技術を参照されたい。この他、 組換えｉｇｉｆ−２をリポソームで標的細胞に供給することができる。 完全長ｃＤＮＡ配列及び／またはその調節エレメントを含むポリヌクレオチド を、研究者が、遺伝子機能のセンス調節（Ｙｏｕｓｓｏｕｆｉａｎ Ｈ ａｎｄ ＨＦ Ｌｏｄｉｓｈ １９９３ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３：９８−１０４）またはアンチセンス調節（Ｅｇｕｃｈｉ ｅ ｔ ａｌ （１９９１） Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６０：６３１− ６５２）の調査用の道具として利用することが可能である。ゲノムＤＮＡから得 られたｃＤＮＡや調節配列から設計されたオリゴヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒ ｏやｉｎ ｖｉｖｏで用いて、発現を抑制することができる。このような技術は 現在周知であり、センスまたはアンチセンスオリゴマー、またはより大きい断片 が、コード領域または調節領域に沿った様々な位置に配置されるようにデザイン することができる。 ｉｇｉｆ−２は、所望のｉｇｉｆ−２フラグメントを高いレベルで発現する発 現ベクターで、細胞または組織を形質移入することによって、その発現を調節す ることができる。このような構造物は、翻訳不能のセンス配列またはアンチセン ス配列を備えたフラッド（flood）細胞であり得る。このようなベクターは、Ｄ ＮＡに組み込まれなくても内在性のヌクレアーゼにより全てのコピーが機能を失 うまでＲＮＡ分子の転写を継続する。過渡的な発現は、非複製ベクターと共に１ ヶ月以上継続し（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｉ， ｐｅｒｓｏｎａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｃ ａｔｉｏｎ）、適当な複製エレメントがベクター系の一部である場合には、更に 継続し得る。 他方、適切な生殖系列の細胞、好ましくは接合体を、ｉｇｉｆ−２フラグメン トを含むベクターで安定的に形質転換することによって、遺伝子組換え生物体（ 米国特許第４，７３６，８６６号）を作り出すことができる。この生物体は、内 生ｉｇｉｆ−２遺伝子の活性を、完全に排除するか、著しく損なうに十分なセン スあるいはアンチセンス配列のコピーを作り出す。多くの場合、このような遺伝 子の分裂は、炎症反応の減少や白血球増殖の低下のような挙動を観察することに より確認できる。 上述のように、ｉｇｉｆ−２の調節領域、即ちプロモータ、エンハンサ、及び イントロンに対するアンチセンス配列をデザインすることによって遺伝子の発現 を変化させることができる。転写開始部位、例えばリーダー配列の−１０から＋ １０の間の領域に由来するオリゴヌクレオチドが好適である。アンチセンスＲＮ Ａ及びＤＮＡ分子は、転写物のリボゾームへの結合を妨げることによりｍＲＮＡ の翻訳をブロックするようにも設計され得る。同様に、「トリプルヘリックス」 塩基対法としても知られている、Ｈｏｇｅｂｏｏｍ塩基対法を用いて抑制を達成 することもできる。トリプルヘリックス対合は、二重螺旋がポリメラーゼ、転写 因子、または調節分子が結びつくだけ十分にほどける能力を損なう。 リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素性のＲＮＡ分子である。 リボザイムの作用の仕組みは、リボザイム分子と相補的な標的ＲＮＡとの配列特 異的ハイブリダイゼーションの後、ヌタレオチド鎖切断が行われる。本発明の範 囲には、ｉｇｉｆ−２ＲＮＡ配列のヌクレオチド鎖切断を特異的かつ効率的に触 媒し得る工学的処理をなされたハンマーへッドモチーフリボザイム分子が含まれ ている。 標的となり得る任意のＲＮＡ上にある特異的リボザイム切断部位は、以下の配 列、ＧＵＡ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位を標的の分子でスキ ャンすることによって初めに同定された。ひとたび同定がなされると、その切断 部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌタレオチドの短いＲＮ Ａ配列がオリゴヌタレオチドの作動不可能にし得る疑似構造の特徴が評価される ことになる。標的として適切な候補がどの程度適切かは、リボヌクレアーゼ防護 アッセイを用いて相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する接触性を 試験することによっても評価され得る。 本発明のアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ、及びリボザイムは、周知の ＲＮＡ分子合成法を用いて調製され得る。このような方法には、固相ホスホラミ ダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドの化学的な合成技術が含まれる。こ の他、ＲＮＡ分子は、ＩＧＩＦ−２をコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ 及びｉｎ ｖｉｖｏの転写によって作ることができる。このようなＤＮＡ配列は 、Ｔ７またはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモータを有する様々 なベクターに組み込まれ得る。この他、アンチセンスＲＮＡを構成的にまたは誘 導的に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構成物も細胞系、細胞または組織に導入す ることができる。 ＤＮＡ分子は、細胞内安定性及び半減期を長くするように変えることができる 。可能な変更としては、分子の５′末端及び／または３′末端にフランキング配 列を追加することや、分子のバックボーンの内部でホスホジエステラーゼ結合で はなく２′Ｏ−メチルやホスホロチオネートを用いることが挙げられるが、これ らに限定されない。 ベクターを細胞または組織に導入する方法としては、後に説明する方法があり 、この方法はｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの治療に対 しても同様に適切なものである。ｅｘ ｖｉｖｏの治療法では、ベクターは患者 から取られた幹細胞の中に導入され、同じ患者に戻す自家移植のためクローンと して増殖されるという方法は、米国特許第５，３９９，４９３号及び米国特許第 ５，４３７，９９４号明細書に記載されており、ここではこれを参照されたい。 更に、ここに開示したｉｇｉｆ−２ポリヌクレオチド配列をまだ開発されてい ない分子生物学の技術に、その新しい技術はトリプレット遺伝暗号や特異的塩基 対相互作用のような特徴等を含む現在周知のヌクレオチド配列の特性に基づいた ものであるならば、その技術にこれを適用することができる。近縁なポリヌクレオチド配列の検出とマッピング ｉｇｉｆ−２に対する核酸配列は、前述のように自然発生ゲノム配列のマッピ ング用のハイブリダイゼーションプローブを作り出すためにも使用することがで きる。この配列を、特定の染色体または染色体の特定の領域へ、周知の技術を用 いてマッピングすることができる。このような技術では、例えば、染色体のスプ レッド（spread）へのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、フローソートさ れた（flow-sorted）染色体の調製、またはＹＡＣｓのような人工染色体、細菌 性人工染色体（ＢＡＣｓ）、細菌性Ｐ１構造体、またはＰｒｉｃｅ ＣＭ（１９ ９３；Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ ７：１２７−３４）やＴｒａｓｋ ＢＪ（１９９１ ；Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ ７：１４９−５４）において研究されているよう な単染色体ｃＤＮＡライブラリのような人工染色体が用いられる。 染色体調製物のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び確立された染色体 マーカーを用いる連関分析のような物理的マッピング技術は、遺伝地図の延長に おいて非常に重要である。ヒトゲノムのＳＴＳベースの地図の最近の例には、ｔ ｈｅ Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ−ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｈｕｄｓｏｎ ＴＪ ｅｔ ａｌ（１９９５） Ｓｃｉｅｎ ｃｅ ２７０：１９４５−１９５４）から最近出版されたものがある。マウスの ような他のほ乳類の染色体上の遺伝子の配置から、たとえ特定のヒト染色体の数 またはアーム（arm）が未知の場合でも、関連のあるマーカーがわかることが多 い（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅａｓｅａｒｃｈ， Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｐ ｏｆ ｔｈ ｅ Ｍｏｕｓｅ， Ｄａｔａｂａｓｅ Ｒｅｌｅａｓｅ １０． Ａｏｒｉｌ ２８． １９９５）。物理的マッピングにより 新たな配列を染色体アーム、またはその部分に割り当てることができる。これに よって、位置的なクローニングまたは他の遺伝子発見技術を用いる疾病遺伝子の 調査を研究者が行う際の有益な情報が得られる。血管拡張性失調症（ＡＴ）のよ うな疾病または症候群が、例えばＡＴと１１ｑ２２−２３（Ｇａｔｔｉ ｅｔ ａｌ（１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３６：５７７−５８０）との連関のような 特定のゲノム領域との遺伝子の連関により大体の位置が求められると、その領域 に対する配列マッピングが、他の調査用の関連する遺伝子または調節遺伝子を表 すことになる。本発明のヌクレオチド配列を、健常者、キャリア若しくは罹患者 における転位や逆位によって生じた染色体の位置の相違を検出するのにも用いる ことができる。医薬品組成物 本発明の活性な組成物には、ＩＧＩＦ−２の全体あるいはその部分や、抗体や アゴニストを含むＩＧＩＦ−２に結合するインヒビターが含まれる。このような 組成物は、単体で用いられるか、若しくはそれに安定化剤化合物のような他の薬 剤を少なくとも１種類組み合わせて用いられる医薬品組成物であって、滅菌され た生体適合性の医薬品用の担体に入れて投与され得る。このような担体には、生 理食塩水、緩衝剤で処理された生理食塩水、ブドウ糖及び水などが含まれる。 ＩＧＩＦ−２は、単体で、または他のサイトカイン、薬剤、薬物またはホルモ ンと組み合わせて、賦形剤または薬学的に許容される担体に混合された医薬品組 成物の形態で患者に投与され得る。本発明の一実施例では、この薬学的に許容さ れる担体は、薬学的に不活性なものである。 治療される病状や疾患や疾病によって、これらの医薬品組成物は配合され、局 所的に、あるいは全身に投与される。このような配合及び投与 のための技術の詳細は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ， Ｅａ ｓｔｏｎ ＰＡ）の最新版に記載されている。適当な投与経路には、例えば、経 口投与、経膣投与、経粘膜投与等があり、非経口的な投与方法には、例えば筋肉 内投与、皮下投与、髄内投与、くも膜下腔内投与、脳室内投与、静脈内投与、腹 腔内投与、鼻腔内投与がある。ＩＧＩＦ−２やそのインヒビターの投与経路とし て好適なのは、静脈内投与である。 注射による投与のため、本発明の医薬品組成物は、水溶液、好ましくはハンク 溶液、リンガー溶液、または病理学的に緩衝剤で処理された生理食塩水のような 病理学的に適合性の緩衝液に配合される。組織や細胞への投与のため、浸透され る特定のバリアに対する適切な浸透剤を配合しても良い。このような浸透剤は従 来より周知である。 経口投与用の医薬品組成物は、周知の薬学的に許容性の担体を用いて経口投与 に適した投与量で配合される。このような単体により、医薬品組成物が錠剤、丸 剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等の形態で患 者が経口摂取できるように配合される。 本発明における使用に適切な医薬品組成物は、意図した目的を達成するために 効果的な量だけ活性成分が含まれた組成物を含む。効果的な投与量の決定法は当 業者に周知である。 これらの医薬品組成物は、活性成分のほか適当な薬学的に許容性の担体を含み 得る。このような担体には、賦形剤及び活性化合物を薬学的に使用可能な調製物 に変える処理を促進する補助剤が含まれる。経口投与のために配合された医薬品 組成物が錠剤、糖衣錠、カプセル、液体の形態でありうる。 本発明の医薬品組成物は、従来より周知の方法、例えば従来の混合、 溶解、粉砕、糖衣形成（dragee-making）、湿式粉砕、乳化、カプセル化、包入 または親液化処理によって製造され得る。 非経口性投与のための医薬品製剤は、活性化合物の水溶液を含む。更に、活性 化合物の懸濁液は、適当な油性の注射懸濁液として調合される。適切な親油性溶 剤または溶媒は、ごま油のような脂肪油、オレイン酸工チルまたはトリグリセリ ド、またはリポゾームのような合成脂肪酸エステルを含む。液体注射懸濁液は、 懸濁液の粘性を高める物質、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソ ルビトール、またはデキストリンを含み得る。所望に応じて、この懸濁液が化合 物の可溶性を高め、高濃度の溶液の調合物ができるようにするための適切な安定 化剤が加えられる。 経口的に使用するための薬学的製剤は、活性化合物と固体の賦形剤とを配合し たり、所望に応じて得られた混合物を粉砕し、顆粒剤の混合物を処理することに よって得られるが、この前に必要ならば錠剤や糖衣錠のコアを得るために適切な 補助剤が加えられる。適当な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトール 、またはソルビトールを含む糖、コーンスターチ、コムギ、コメ、ジャガイモ、 または他の植物、及びメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース 、またはナトリウムカルボキシメチルセルロース、及びアラビアゴム及びトラガ カントゴムを含むゴム、及びゼラチンやコラーゲンのようなタンパク質のような 炭水化物またはタンパク質賦形剤である。必要ならば、架橋されたポリビニル− ピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸 の塩のような崩壊剤または可溶化剤が添加される。 糖衣錠のコアは、濃縮された糖の溶液のような適切なコーティングで被覆され るが、このようなコーティングにはアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリド ン、カルボポルゲル（Carbopol gel）、ポリエチレン グリコール、及び／または二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機溶媒また は溶媒混合物が含まれ得る。色素またはピグメントが、生産物の識別のため、ま たは活性化合物の量、即ち投与量を明示するために錠剤または糖衣錠のコーティ ングに添加される。 経口的に使用され得る医薬品製剤には、ゼラチン製のプッシュフィットカプセ ルや、ゼラチン製の密閉カプセル及びグリセロールまたはソルビトールのような コーティングが含まれる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースまたはスタ ーチのような賦形剤若しくは結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムの ような潤滑剤、及び所望に応じて安定化剤と共に混合された活性化成分を含み得 る。ソフトカプセルの場合は、活性化合物が適当な液体、例えば脂肪油、液体パ ラピン、または液体ポリエチレングリコールに、安定化剤を所望に応じて加えた ものに分解または懸濁される。 薬学的に許容される担体に配合された本発明の化合物を含む組成物は、調製さ れて、適当なコンテナに入れられ、指定された状態の治療のためにラベル付けさ れる。ＩＧＩＦ−２インヒビターの場合は、ラベルに表示された指定の状態には 、炎症の治療が含まれる。 この医薬品組成物は、塩として提供され、様々な酸と共に形成され得る。この ような酸の例には、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等が あるがこれらに限定されない。塩は、水または他の対応する遊離塩基形態である プロトニッタ溶媒においてより可溶性を高める傾向がある。他の場合、好適な製 剤は、４．５〜５．５のｐＨ値の範囲で、１〜５０ｍＭヒスチジン、０．１〜２ ％スクロース、２〜７％マニトールに未使用の緩衝液に結合された形態の親液性 粉末であり得る。 任意の化合物において、治療的に効果的な投与量は、初めに細胞培地のアッセ イで推定され得る。次いで好ましくは動物モデルにおいて、Ｉ ＧＩＦ−２レベルの調節に望ましい循環濃度の範囲を達成するための投与量が配 合されうる。このようにして得られた情報を用いて、ヒトに対する効果的な投与 量及び投与経路が決定され得る。ＩＧＩＦ−２または、そのインヒビターの治療 的投与の研究において有用な動物モデルの例は、Ｈｕｔｚ （１９８９） Ｂｉ ｏｌ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ４０：７０９−７１３： Ｈｕｔｚ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ Ｍｅｄ Ｐｒｉｍａｔｏｌ １９：５５３−５７１ ’Ｋｉｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ ２６８：１９１−Ｉ ９６； ａｎｄ Ｑｕａｎｄｔ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ４８：１０８８−１０９４に記載され ている。 治療に効果的な投与量とは、症状または状態を寛解するようなＩＧＩＦ−２ま たはそのインヒビターの量を指す。治療的な効果及びこのような化合物の毒性決 定は、細胞培地での標準的な薬学的手順または実験動物によって行われ、例えば ＥＤ５０（集団の５０％に治療的な効果をもたらす投与量）及びＬＤ５０（集団 の５０％が死に至る投与量）が決定される。治療的効果をもたらす投与量と毒作 用を与える投与量との比は治療係数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０として表 わされる。医薬品組成物は大きな治療係数を示すものが好ましい。細胞培地アッ セイ及び実験動物の研究から得られたデータは、ヒトに投与される投与量の範囲 を計算するのに用いられる。このような化合物の許容量は、毒性がごくわずか若 しくは全くないＥＤ５０の投与量だけを含む循環濃度の範囲内にあるのが好まし い。投与量は、使用される薬用量、患者の感受性、及び投与経路に応じてこの範 囲内で様々に変えられる。 正確な投与量は、患者の治療に当たっている外科医個人によって選択される。 投与量及び投与方法は、十分なレベルの活性成分を与えるよう に、または望ましい効果を維持するように調節される。追加の考慮されるべき要 因には、疾病状態の重症度（例えば腫瘍の大きさ及び位置）、患者の年齢、体重 及び性別、食事、投与の回数及び頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性、及び治 療に対する耐性及び反応などが含まれる。長時間作用する医薬品組成物は、その 特定の配合の半減期及びクリアランス速度に応じて、３〜４日に１回、１週間に １回、または２週間に１回投与される。 通常の投与量は、投与経路に応じて、０．１〜１００，０００μｇの範囲であ り、最大投与量は約１ｇである。特定の投与及び薬物の供給方法についてのガイ ダンスは文献に記載されている。米国特許第４，６５７，７６０号明細書、米国 特許第５，２０６，３４４号明細書または米国特許第５，２２５，２１２号明細 書を参照されたい。当業者は、ＩＧＩＦ−２対してはＩＧＩＦ−２のインヒビタ ーとは異なる配合を採用できる。同様に、肺への投与方法は、腎臓や胃への投与 方法とは異なるものであることが必要である。 ここに開示する核酸やアミノ酸配列で治療され得る免疫系が関与する疾患には 、ウィルス性感染症（ＡＩＤＳや肝炎）、細菌性感染症（敗血症）、真菌性感染 症（ヒストプラスマ症）や、寄生虫様の感染症や、アレルギー又は喘息や、例え ばアスベストや石炭の粉塵等にさらされることによる機械的損傷や外傷、動脈硬 化症、アテローム発生、膠原病、或いは自己免疫性溶血性貧血や、胆汁性肝硬変 や、若年性糖尿病や、エリテマトーデスや、多発性硬化症や、重傷筋無力症や、 慢性関節リウマチのような遺伝病、白血病、リンパ種或いは癌腫、クローン病や 他の炎症性腸疾患、或いは白血球又はリンパ球の異常活性を伴う他の疾患が含ま れ、これらの疾患は前述のアッセイにより特異的に診断できることがある。 以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲をこれに限 定しようとするものではない。 産業的応用性 １．ｃＤＮＡライブラリの構築 説明のため、腎臓ｃＤＮＡライブラリーの調製を例にとって説明する。ＩＧＩ Ｆ−２やその変異体が見出される他の組織からのｃＤＮＡライブラリーは、当業 者に周知の同様な方法で調製された。 腎臓ライブラリーは、生後２日目のスペイン系の女性の腎臓組織（Ｌｏｔ ＃ ９５−０４−０２７４；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆ ｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｅｘｏｎ ＰＡ）から作製された 。この組織はグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解され、溶解産物は、 ５．７Ｍ塩化セシウムクッションと共に、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｌ８−７０Ｍ Ｕｌ ｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅのＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ２８ローター（Beckman In struments）によって、環境温度で１８時間かけて２５０００ｒｐｍで遠心分離 された。このＲＮＡはＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＲＮＡ単離プロトコルに従って酸 性フェノール（ｐＨ４．０）で１回抽出され、０．３Ｍ酢酸ナトリウム及び２． ５ｖｏｌのエタノールを用いて沈殿させられ、水に再懸濁され、３７℃で１５分 間ＤＮアーゼ処理された。ポリＡ＋ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ Ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ ＣＡ）を用いて単 離された。 ポリＡ＋ＲＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎ ｉｎｇ（ｃａｔａｌｏｇ ＃１８２４８−０１３；Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）の推奨 プロトコルに従って取り扱われた。一本目 の鎖ｃＤＮＡ合成は、オリゴｄ（Ｔ）プライマーを用いて行われた。二本目の鎖 合成は、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ、及びＲＮアーゼＨの組 み合せを用いて行われた。このｃＤＮＡは、Ｔ４ポリメラーゼを用いて末端を平 滑化され、このｃＤＮＡの平滑末端にＳａｌ Ｉリンカーが付加された。Ｓａｌ Ｉを付加された二鎖ｃＤＮＡはＮｏｔ Ｉで消化され、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣ Ｌ４Ｂカラム（ｃａｔｌｏｇ＃２７５１０５；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で分画され た。４００ｂｐを超える長さのｃＤＮＡは、ｐＳｐｏｒｔ Ｉにリゲートされた 。このプラスミドｐＳｐｏｒｔ ＩはＤＨ５ａ（商標）コンピテント細胞（ｃａ ｔｌｏｇ＃１８２５８−０１２； Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）に形質転換のため導入 された。 ２．ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定 プラスミドＤＮＡは、細胞から放出され、次いでＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ｃ ａｔａｌｏｇ＃７７４６８；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｉｅｓ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ） を用いて精製された。このキットは９６穴ブロックと９６０回の精製用の試薬か らなるものである。キットの推奨プロトコルを採用したが、以下の点を変更した 。（１）９６個の穴は、それぞれ滅菌Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ｃａｔａ ｌｏｇ ＃２２７１１，ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（商標）Ｇａｉｔ ｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）を、カルベニシリン２５ｍｇ／Ｌ及びグリセロール０ ．４％と共に満たした。（２）細菌を穴に接種し、６０μｌの溶解バッファに溶 解した後、２４時間培養した。（３）Ｂｅｃｋｍａｎ ＧＳ−６Ｒを用いて２９ ００ｒｐｍで５分間遠心分離するステップの後、ブロックの内容物を一次フィル タプレートに添加した。（４）ＴＲＩＳバッフ ァにイソプロパノールを添加するオプションステップは、定例的に実施しなかっ た。このプロトコルの最終ステップが実施された後、サンプルを保存のためＢｅ ｃｋｍａｎ９６穴ブロックに移した。 このｃＤＮＡの配列決定は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｌａｂ ２２０ ０（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ ＮＶ）を、４つのＰｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅ ｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒｓ（ＰＴＣ２００ ｆｒｏｍ ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７または３７３ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｅｒ ｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）と共に用いてＳａｎｇｅｒ Ｆ及びＡＲ Ｃｏｕｌｓｏｎ （１９７５； Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ９４：４４１ｆ）の方法によって行われ 、リーディングフレームが決定された。 ３．ｃＤＮＡクローン及びその予測タンパク質配列の相同性検索 各ｃＤＮＡは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって開発された検 索アルゴリズムをＩＮＨＥＲＩＴ（商標） ６７０ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａ ｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍに組み込んで用いてＧｅｎＢａｎｋの配列と比較され た。このアルゴリズムでは、Ｐａｔｔｅｒｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｌ ａｎｇｕａｇｅ（ＴＲＷ Ｉｎｃ， Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ ＣＡ）が相同領 域の決定のために用いられた。配列比較をどのように行うかを決定する３つのパ ラメータは、ウィンドウサイズ、ウィンドウオフセット、及び誤差許容度であっ た。これら３つのパラメータの組み合わせを用いて、調査対象である配列に対し て相同性を有する領域を含む配列をＤＮＡデータベースから検索し、適当な配列 に対して初期値と共にスコアが付けられた。続けて、これらの相同な領域を、ド ットマトリクス相同性プロット法を用いて検定し、偶 然の一致と真の相同領域とを区別した。相同性検索の結果を表示するためにＳｍ ｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎのアライメントが用いられた。 ペプチド及びタンパク質配列の相同性はＩＮＨＥＲＩＴ（商標）６７０ Ｓｅ ｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを、ＤＮＡ配列の相同性の過程 に用いるのと同じ方法で用いて確認された。ｐａｔｔｅｒｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｔｉｏｎ Ｌａｎｇｕａｇｅ及びパラメータウィンドウを用いて、相同性領域 を含むタンパク質配列のデータベースを検索し、相同性領域は初期値と共にスコ アを付けられて表示された。ドットマトリタス相同性プロット法により検定を行 い、有意な相同性領域を偶然の一致と区別した。 ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ（１９９３） Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３ ６：２９０−３００； Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ＳＦ ｅｔ ａｌ（１９９０） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−１０））を用いて、局部的な配列の一 致を検索した。ＢＬＡＳＴは、ヌクレオチド及びアミノ酸配列双方のアライメン トを検出して、配列の類似性を決定する。アライメントが局部的であることから 、ＢＬＡＳＴは、正確な一致の決定、またはホモログの同定において特に有用で ある。ＢＬＡＳＴはギャップを含まない一致の検索に有用である。ＢＬＡＳＴア ルゴリズム出力の基本的な単位は、Ｈｉｇｈ−ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｅｇｍｅｎｔ Ｐａｉｒ（ＨＳＰ）である。 ＨＳＰは、アライメントが局部的に最大となる部分の長さが等しく、アライメ ントスコアがユーザが設定したカットオフスコアまたは閾値のスコア以上である ような２つの任意の範囲の断片からなる。ＢＬＡＳＴ法では、調査対象のデータ ベース配列との間のＨＳＰを探し、発見された一致の統計的有意性を評価し、ユ ーザが選択した有意性の閾値を超え る一致のみを報告する。パラメータＥはデータベース配列との一致を報告するた めの統計的有意性の閾値を設定するパラメータである。Ｅは、データベース検索 全体の文脈の中で、ＨＳＰ（またはＨＳＰの組）の偶然の一致の発生する予定頻 度の上限と解釈される。Ｅを満たすデータベース配列は、プログラムの出力で報 告される。 ４．ノーザン法による分析 免疫学的組織のｍＲＮＡのなかのｉｇｉｆ−２転写物の存在を検出するために ノーザン法を用いた（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．上述）。ｉｇｉｆ−２配 列（配列番号：１）のフラグメントに、放射性標識されたプライマーでランダム に初回刺激を与えた（Ｅｘａｍｐゥｅ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ ｔｏ ａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ（ＭＴＮ； Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）参照）。 第３図に示すのは、ｉｇｉｆ−２のノーザン分析の結果の像である。ｉｇｉｆ− ２の発現は、リンパ組織（脾臓、リンパ節、胸腺、及び骨髄）のほか、虫垂や末 梢血液に由来するＲＮＡを含むレーン上の、標準タンパク質分子量マーカー１． ３５と位置の合ったバンドとして明示されている。ｉｇｉｆ−２転写物は、この 実験で用いられた厳密性をもって、胎児の肝臓のＲＮＡでは検出されなかった。 類似の電子的ノーザン分析ではＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ １９９ ３ ａｎｄ １９９０， ｓｕｐｒａ）を用いて、ＧｅｎＢａｎｋまたはＬＩＦ ＥＳＥＱ（商標）データベース（Ｉｎｃｙｔｅ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ） のようなデータベースにおける同一のまたは近縁な分子を検索した。コンピュー タ検索の感度は、検索の基準値であるプロダクトスコア５０に設定した。プロダ クトスコアは以下の式で定義されるものである。 （配列の一致（％）×最大ＢＬＡＳＴスコア（％））／１００ このプロダクトスコアは、２つの配列間の類似性の度合い、及び配列の長さの 一致を考慮している。例えば、プロダクトスコアが４０の場合は、一致は誤差が １〜２％の範囲で正確であり、スコアが７０の場合は正確に一致している。相同 な分子は、通常プロダクトスコアとして１５〜４０を示すものを選択することに より同定されるが、スコアの低いものは近縁関係にある分子として同定される。 第４図に示すのは電子的ノーザン分析の結果であり、分析結果が、相同性の高 いもの、またはＩＧＩＦをコードする転写物が生じたライブラリーのリストとし て示されている。転写物の量やそのパーセンテージも示されている。転写物の量 は、ｃＤＮＡライブラリーにおける特定の転写の回数を直接反映し、そのパーセ ンテージは、ｃＤＮＡライブラリーで検査された配列の総数に対する割合である 。 ５．ｉｇｉｆ−２の調節エレメントを回復するまでの延長 完全長ｉｇｉｆ−２の核酸配列（配列番号：１）を用いて、部分的なヌクレオ チド配列を完全長まで延長するための若しくはゲノムライブラリから５′配列を 得るためのヌクレオチドプライマーをデザインする。プライマーの一方はアンチ センス方向（ＸＬＲ）の延長を開始するために合成され、他方はセンス方向（Ｘ ＬＦ）に配列を延長するために合成される。これらのプライマーにより、既知の ｉｇｉｆ−２配列を「外向きに」延長し、新規な、未知の興味の対象となる領域 に対するヌクレオチド配列を含む単位複製配列を生成することが可能となる（１ ９９５年６月７日出願の米国特許出願第０８／４８７，１１２号明細書を参照） 。この初回刺激プライマーは、ＯＬＩＧＯ（登録商標）（４．０６ Ｐｒｉｍｅ ｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））、または他の適当なプログラムを用いて、長さが２ ２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ群５０％以上、また約６８〜７２℃で目的の配列に アニールするように設計された。ヘアピン構造を形成したり、プライマー−プラ イマー二量体化するような任意のヌクレオチドストレッチは取り除かれる。 ヒトゲノムライブラリを用いて配列を延長し、５′上流領域を増幅する。必要 ならば、既知の領域を更に延長するための第２のプライマーの組がデザインされ る。ＸＬ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の指示に従い、酵素と 反応混合物とを徹底的に混合することによって、忠実度の高い増幅が達成される 。各プライマーの４０ｐｍｏｌ及び推奨された濃度のキットの他の全ての成分を 用いて開始されたＰＣＲは、Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ ＰＴＣ２００；ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）を用い て以下のパラメータで実行される。 ステップ１ ９４℃で１分間（初期変性） ステップ２ ６５℃で１分間 ステップ３ ６８℃で６分間 ステップ４ ９４℃で１５秒間 ステップ５ ６５℃で１分間 ステップ６ ６８℃で７分間 ステップ７ ステップ４〜６を更に１５回反復 ステップ８ ９４℃で１５秒間 ステップ９ ６５℃で１分間 ステップ１０ ６８℃で７分１５秒間 ステップ１１ ステップ８〜１０を更に１２回反復 ステップ１２ ７２℃で８分間 ステップ１３ ４℃（この温度を維持） ５〜１０μ１の反応混合物のアリコットが低濃度（約０．６〜０．８％）アガ ロースミニゲル上での電気泳動により分析され、配列の延長の反応がうまくいっ たか否かが決定する。まず、最も大きい生成物を含むと考えられるバンドを選択 してゲルから切り取る。更に精製を行うため、例えばＱＩＡＱｕｉｃｋ（商標） （ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ）のような市販のゲル延長法が用いられる。ＤＮＡを回 収した後、クレノウ酵素を用いて一本鎖のヌクレオチドの末端の突出をトリムし 、再連結及びクローニングが容易な平滑末端を形成した。 エタノール沈殿の後、生成物は１３μｌの連結バッファに再度溶解され、１μ ｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナ ーゼが添加され、この混合物は室温で２〜３時間、または１６℃で一晩インキュ ベートされた。（１０ｐｌの適当な培養液に入った）コンピテントＥ．ｃｏｌｉ 細胞が３μｌのリゲーション混合物で形質転換され、８０μｌのＳＯＣ ｍｅｄ ｉｕｍ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ， ｓｕｐｒａ）で培養される。３ ７℃で１時間のインキュベーションの後、形質転換混合物全ては、２×Ｃａｒｂ を含むＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）−ａｇａｒ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ， ｓｕｐｒａ）上にプレートされる。後日、各プレートからいく つかのコロニーをランダムに取り出し、適当な市販の滅菌９６穴マイクロタイタ ープレートの個々の穴に入れられた１５０μｌの液体ＬＢ／２×Ｃａｒｂ培養液 内で培養される。翌日、５μ１の各一晩培養した培養液は、非滅菌９６穴プレー トに送られ、１：１０に水で希釈された後、５μｌの各サンプルがＰＣＲ用のア レイに移される。 ＰＣＲ増幅のために、４単位のｒＴｔｈ ＤＭＡポリメラーゼを含む１８μｌ の濃縮ＰＣＲ反応混合物（３．３×）、ベクタープライマー、 及び延長反応に用いられる遺伝子特異的プライマーの１または２以上が各穴に添 加される。増幅は以下の条件を用いて行われる。 ステップ１ ９４℃で６０秒間 ステップ２ ９４℃で２０秒間 ステップ３ ５５℃で３０秒間 ステップ４ ７２℃で９０秒間 ステップ５ ステップ２〜４を更に２９回反復 ステップ６ ７２℃で１８０秒間 ステップ７ ４℃（この温度を維持） ＰＣＲ反応のアリコットは、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で泳動さ せられる。ＰＣＲの生成物のサイズは、元の部分的ｃＤＮＡと比較され、適当な クローンが選択されプラスミドにリゲートされて配列決定される。 ６．ハイブリダイゼーションプローブの標識 配列番号：１の配列から作られたハイブリダイゼーションプローブは、ｃＤＮ Ａ、ゲノムのＤＮＡまたはｍＲＮＡをスクリーニングするのに利用される。約２ ０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識化については前述したが、より大き いｃＤＮＡ断片に対しても同じ手順が適用される。オリゴヌクレオチドは、５０ ｐｍｏｌの各オリゴマーと２５０ｍＣｉの［γ−³²Ｐ］アデノシン三リン酸（Ａ ｍｅｒｓｈａｍ， Ｃｈｉｃａｇｏ ＩＬ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ （ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ（登録商標），Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）を結合することに よって標識される。この標識されたオリゴヌクレオチドは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ｓｕｐｅｒ ｆｉｎｅ ｒｅｓｉｎ ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ）を用いて概ね精製される。１分あたり１０⁷カウントの各セ ンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む部分が、以下のエンドヌクレア ーゼ（Ａｓｅ Ｉ， Ｂｇｌ ＩＩ， Ｅｃｏ ＲＩ， Ｐｓｔ Ｉ， Ｘｂａ １， ｏｒ Ｐｖｕ ＩＩ； ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ（登録商標））の１つで 消化されるヒトゲノムＤＮＡの一般的なメンブランを用いるハイブリダイゼーシ ョンにおいて使用される。 消化されたＤＮＡのそれぞれは、０．７％アガロースゲル上で分画され、ナイ ロンメンブラン（Ｎｙｔｒａｎ Ｐ１ｕｓ， Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃ ｈｕｅｌｌ， Ｄｕｒｈａｍ ＮＨ）に移される。ハイブリダイゼーションは４ ０℃で１６時間かけて行われる。非特異的なシグナルを取り除くため、ブロット は、厳密性を高めた条件の下で、最大０．１×塩類クエン酸ナトリウム（ｓａｌ ｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウム により、室温で続けて洗浄される。ＸＯＭＡＴ ＡＲ（商標） ｆｉｌｍ（Ｋｏ ｄａｋ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ）がＰｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ ｃａｓ ｓｅｔｔｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）上のブロットに数時間露出された後、ハイブリダイゼーションパターンが 視覚的に比較される。 ７．アンチセンス分子 ｉｇｉｆ−２配列、またはその部分は、内生ｉｇｉｆ−２のｉｎ ｖｉｖｏま たはｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現の抑制のために使用される。約２０塩基対を含む アンチセンスオリゴヌタレオチドの利用については前述したが、より大きいｃＤ ＮＡフラグメントに対しても同じ手順が利用される。ｉｇｉｆ−２のコード配列 に基づくオリゴヌクレオチドを用いて、内生ｉｇｉｆ−２の発現が抑制される。 Ｏｌｉｇｏ４．０６を用いて、相補的なオリゴヌクレオチドが、保存的な５’配 列からデザインさ れて転写を抑制するために用いられたり、或いは３’配列からデザインされてリ ボゾームがｍＲＮＡの翻訳をしないようにするために用いられる。 ８．ＩＧＩＦ−２のクローニング及び発現 Ｋｏｚａｋ配列に対するヌクレオチドは、開始ＡＴＧの上流の工学的処理をな された部分であり、ヒスチジンタグの６残基をコードするヌクレオチドが、配列 番号：２の３’末端に付加された。ＩＧＩＦ−２をコードする最適化されたヌク レオチド配列は、ｐＣＥＰベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入されてクロ ーニングされた。リポフェクタミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて、ｐＣＥＰを 、前もってＥＢＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で形質転換された２９３細胞に入 れて形質転換した。次いで３００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを用いて、安定 な形質転換体を選択した。ＩＧＩＦの天然シグナル配列により、ＩＧＩＦ−２活 性の試験で用いられる増殖培地へのタンパタ質の分泌が行われる。 ９．ＩＧＩＦ−２の活性 サイトカインの走化性活性は、通常４８穴ケモタキシスチャンバで測定される 。各穴はフィルタにより２つの区画に仕切られ、またこのフィルタは化学勾配に 応じて、一方の区画から他方へ細胞が透過できるようなフィルタである。ＩＧＩ Ｆ−２が分泌された細胞培地を、ポリカーボネートフィルタの一方の区画に入れ 、末梢血液が同じ培養液に懸濁されて、フィルタの反対側の区画に入れられる。 十分なインキュベート時間をかけると、細胞は、拡散によりフィルタを移動し、 ＩＧＩＦ−２の濃度勾配が生ずる。このフィルタが各穴から回収され、サイトカ インに面するフィルタのサイドに張り付いた単球等の細胞が、同定され、計量さ れた。 密度勾配遠心分離によって単球やリンパ球の高濃度の集塊のような細胞集団を 分画化して、それを検定することによって、走化性の特異性が決定される。特定 のＴ細胞集団は、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋特異的抗体を用いてネガティブ選択する ことにより更に精製された。 １０．ＩＧＩＦ−２特異的抗体の生成 ＰＡＧＥ電気泳動法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｓｕｐｒａ）を用いて精製された ＩＧＩＦ−２は、ウサギの免疫化や、標準的なプロトコルを用いた抗体の産生の ために使用され得るが、より一般に用いられるのはモノクローナル法である。ｉ ｇｉｆ−２から翻訳されたアミノ酸配列を、ＤＮＡＳｔａｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ （ＤＮＡＳｔａｒ Ｉｎｃ）を用いて分析し、高度に免疫原性の領域を決定し、 対応するオリゴポリペプチドが合成され、当業者には周知の方法で抗体を産生す るのに用いられる。Ｃ末端の近傍または親水性の領域（第４図及び第５図参照） のような適当なエピトープを選択するための分析についてはＡｕｓｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ（上述）に記載されている。 典型的には、約１５の残基を有する長さのこのオリゴポリペプチドは、ｆｍｏ ｃ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを用いるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅ ｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ４３１Ａを用いて合成され 、Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（M-male imidobenzoyl-N-hydroxysuccinimideester）（ＭＢＳ； Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ， ｓｕｐｒａ）と反応させることによってキーホールリンペットヘモシア ニン（ＫＬＨ， Ｓｉｇｍａ）に結合される。ウサギは、フロイント完全アジュ バントのペプチド−ＫＬＨ複合体と共に免疫化される。得られた抗血清は、ペプ チ ドとプラスチックを結合し、１％のウシの血清アルブミンでブロックし、抗血清 と反応させ、洗浄し、かつ放射性ヨウ素標識されたヤギの抗ウサギＩｇＧと反応 させることによって抗ぺプチド活性がテストされる。 １１．特異的抗体を用いるＩＧＩＦ−２の精製 内生または組換えＩＧＩＦ−２の精製は、ＩＧＩＦ−２に対して特異的な抗体 を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーにより行われる。イムノアフ ィニティーカラムは、ＩＧＩＦ−２抗体をＣｎＢｒアクチベイテッドセルファロ ース（ＣｎＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような活性化クロマトグラフィー樹脂と共有結合させ ることにより構築される。結合の後、メーカーの指示に従って樹脂がブロックさ れ洗浄される。 ＩＧＩＦ−２を含む溶液はイムノアフィニティーカラムを通され、このカラム はＩＧＩＦ−２の優先的な吸収が可能な条件の下で洗浄される（例えば界面活性 剤の存在のもと４強度の高い緩衝液で洗浄される）。このカラムは、抗体−ＩＧ ＩＦ−２結合を分裂させるような条件（例えばｐＨ２〜３の緩衝液または尿素や チオシアン酸塩イオンのような高濃度のカオトロープ）のもとで処理され、ＩＧ ＩＦ−２が捕集される。 １２．ＩＧＩＦ−２と相互作用する分子の同定 ＩＧＩＦ−２または生物学的に活性なその断片は、¹²⁵Ｉボルトンハンター試 薬（Ｂｏｌｔｏｎ， ＡＥ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ， ＷＭ（１９７３）Ｂｉｏ ｃｈｅｍ Ｊ １３３：５２９）で標識される。以前に９６穴プレートの穴に配 列された候補の分子は、標識されたＩＧＩＦ−２と共にインキュベートされ、洗 浄されて、標識されたＩＧＩＦ−２の複合体を有する穴が検定される。異なる濃 度のＩＧＩＦ−２を用いて得 られたデータは、ＩＧＩＦ−２と候補の分子との結合、アフィニティー、その数 を表す数値の計算に用いられる。 上述の説明の中に記載された全ての文献及び特許明細書は、本明細書と一体に 組み込まれたものとして参照されたい。ここに開示した本発明の方法及びシステ ムを本発明の範囲及び精神を逸脱することなく様々に変更を加えることは当業者 には明らかであろう。本発明は特定の好適実施例に関連して説明したが、本発明 の範囲がここに開示した特定の実施例のみに限定されるものではないということ を理解されたい。実際、分子生物学またはその関連分野の専門家にとって明らか な、ここに開示した本発明の実施例の様々な変更は、請求の範囲に記載の発明の 範囲内に含まれるものとして意図されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡＦ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/566 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＲ，ＣＡ ，ＣＨ，ＣＮ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＩＬ， ＪＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＵ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＵＳ (72)発明者 ホーキンズ、フィリップ・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州94304・ マウンテンビュー・シォアラインブルバー ド＃96 750―エヌ 【要約の続き】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号：２のインターフェロンγ誘導因子−２（ＩＧＩＦ−２）をコード する核酸配列を含む精製ポリヌクレオチド。 ２．前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号：１の配列からなることを特徴とす る請求項１に記載の精製ポリヌクレオチド。 ３．ポリペプチドの１４０番目の残基がイソロイシンとなることを特徴とする請 求項１に記載の精製ポリヌクレオチド。 ４．ポリペプチドの６２２番目の残基がチミンとなることを特徴とする請求項３ に記載の精製ポリヌクレオチド。 ５．配列番号：２の１番目乃至３０番目のアミノ酸残基と、それに後続する配列 番号：３のアミノ酸残基とを有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む精 製ポリヌクレオチド。 ６．請求項２のポリヌクレオチド、またはその一部分に対して相補的な配列を含 むアンチセンス分子。 ７．請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。 ８．請求項７の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 ９．配列番号：２のアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド。 １０．１４０番目の残基がイソロイシンであることを特徴とする請求項９に記載 の精製ポリペプチド。 １１．請求項９の１番目乃至３０番目のアミノ酸残基と、それに後続する配列番 号：３のアミノ酸残基とを有する精製ポリペプチド。 １２．効果的な量の請求項６のアンチセンス分子及び薬学的に許容される賦形剤 を含む医薬品組成物。 １３．請求項１２の医薬品組成物を効果的な量だけ患者に投与する過程を含む、 ｉｇｉｆ−２の発現の変化を伴う疾患を患う患者の治療方法。 １４．請求項２のポリヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプローブを含 む診断用組成物。 １５．生物学的サンプルにおけるＩＧＩＦ−２をコードするヌクレオチド配列を 検出するための診断試験方法であって、 ａ）核酸ハイブリダイゼーション複合体の形成に適切な条件下で、前記生物学 的サンプルと、請求項２のヌクレオチド配列、若しくはそのフラグメントを含む 第１のヌクレオチド配列とを結合する過程と、 ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記ハイブ リダイゼーション複合体の存在が、前記生物学的サンプルにおけるＩＧＩＦ−２ をコードする第２のヌクレオチド配列の存在と相関性を有する、該過程と、 ｃ）前記第２のヌクレオチド配列の量と、標準値とを比較して、前記第２のヌ クレオチド配列の量の標準値との差を求める過程とを含むことおを特徴とし、 前記第２のヌクレオチド配列の異常レベルの存在が、炎症やＩＧＩＦ−２の異 常発現と正の相関を有することを特徴とする生物学的サンプルにおけるＩＧＩＦ −２をコードするヌクレオチド配列を検出するための診断試験方法。 １６．ＩＧＩＦ−２及びその一部分に対する特異的結合親和性で複数の化合物を スクリーニングする方法であって、 ａ）複数の化合物を準備する過程と、 ｂ）請求項９のポリペプチドと前記複数の化合物のそれぞれとを、適切な条件 下で、結合するに十分な時間をかけて結合する過程と、 ｃ）前記複数の化合物のそれぞれに対するＩＧＩＦ−２の結合を検出し、ＩＧ ＩＦ−２に特異的に結合する化合物を同定する過程とを含むことを特徴とするＩ ＧＩＦ−２及びその一部分に対する特異的結合親和性で複数の化合物をスクリー ニングする方法。 １７．ＩＧＩＦ−２の生成方法であって、 ａ）ＩＧＩＦ−２ポリペプチドの発現に適切な条件下で、請求項８の宿主細胞 を培養する過程と、 ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ＩＧＩＦ−２ポリペプチドを回収する過程と を含むことを特徴とするＩＧＩＦ−２の生成方法。 １８．請求項９のポリペプチドまたはその一部分に特異的に結合するアンタゴニ スト。 １９．請求項１８のアンタゴニスト及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬品 組成物。 ２０．請求項１９の医薬品組成物を効果的な量だけ患者に投与する過程を含む、 ＩＧＩＦ−２の発現の変化を伴う疾患を患う患者の治療方法。