JPH11504212A

JPH11504212A - 新規なカテプシンｃホモログ

Info

Publication number: JPH11504212A
Application number: JP8531970A
Authority: JP
Inventors: コールマン、ロジャー; ブラクストン、スコット・マイケル; シールヘイマー、ジェフリー・ジェイ
Original assignee: Incyte Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Incyte Corp
Priority date: 1995-04-19
Filing date: 1996-04-19
Publication date: 1999-04-20
Also published as: EP0826055A1; US6066488A; WO1996033278A1; MX9708030A; US5637462A; AU5561096A; CA2217010A1; AU720749B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＴＨＰ−１細胞で発現される新規なカテプシンＣホモログ（ＲＰＣ）を同定し、コードするヌクレオチド配列及びアミノ酸配列に関する。本発明には、ＲＣＰをコードするヌクレオチド配列に対するアンチセンス分子、精製ＲＣＰの産生のための発現ベクター、ＲＣＰと特異的に結合し得る抗体、ＲＣＰをコードするヌクレオチド配列を検出するためのハイブリダイゼーションプローブまたはオリゴヌクレオチド、ＲＣＰの発現のための生物工学的処理をされた宿主細胞、ＲＰＣをコードする核酸分子に基づく単球／マクロファージの活性化に対する診断テスト方法、該タンパク質に特異的に結合し得る抗体の産生のための該タンパク質の使用及び阻害剤のスクリーニングのための該タンパク質の使用が含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】新規なカテプシンＣホモログ技術分野本発明は分子生物学の分野に属する。特に、本発明は、活性化ＴＨＰ−１細胞に由来する新規なカテプシンＣホモログの核酸配列及びアミノ酸配列について記述している。背景技術カテプシンＣカテプシンＣまたはジペプチジルアミノペプチダーゼＩ、またはジペプチジルトランスフェラーゼは、タンパク質基質及びペプチドのアミノ末端から継続的にジペプチドを除去しうる、細胞タンパク質の分解に関与するリソゾームのシステインプロテアーゼである。カテプシンＣは、消化管、細胞増殖及びノイラミニダーゼ活性化の機能に関連している（Ｋｕｒｉｂａｙａｓｈｉ１９９３Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：４４１−４４９）。カテプシンＣの活性は、細胞傷害性リンパ球及び骨髄性細胞において高いレベルで存在し、細胞傷害性エフェクター細胞の誘導、活性、または分化に関連を示す（Ｔｈｉｅｌｅｅｔａｌ１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：８３−８７）。コミナミ等（１９９２，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７３：３６７−３７３）は、ほとんど全てのラット組織におけるラットカテプシンＣｍＲＮＡの存在を報告した。大量に転写物が存在するのは、肝臓、脾臓、小腸及び大腸、肺、及び腎臓であり、中程度に存在するのは食道、胃、及び心臓であり、少量存在するのは脳、脾臓、副腎、及び精巣であった。転写物の存在量は、通常の組織機能において期待される単球／マクロファージの存在量及び活性度に増加を有しているように見える。培養されたマクロファージは、カテプシンＣを、ポリペプチドとして合成したものから成熟オリゴマー酵素へとプロセシングする研究を行うために用いられた。成熟カテプシンＣと前駆体の双方は、リン酸化されてグリコシル化され、またそのオリゴマー化はそれがリソゾームに入る前に起こっているようである（ＭｕｎｏＤｅｔａｌ（１９９３）ＡｒｃｈＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙ３０６：１０３−１０）。合成基質を使用する研究においては、カテプシンＣは内細胞蛋白質分解におけるエンドペプチダーゼとしての機能、及び細胞増殖及びノイラミニダーゼ活性化におけるエキソペプチダーゼ（ジペプチジルアミノペプチダーゼ）としての機能を示した（ＫｕｒｉｂａｙａｓｈｉＭ等上述）。カテプシンＣはコラーゲン、ラミニン、エラスチン、及び骨の外細胞マトリクスを含む他の構造タンパク質の分解においてその役目を果たす。ひとたび骨が弱化すると、それは骨の吸収、腫瘍浸潤及び転移をいっそう受けやすくなる。カテプシンＣは約２００ｋＤａのオリゴマー構造を形成し、８個のサブユニットからなる。カテプシンＣのジペプチジルアミノペプチダーゼの活性化にはハロゲン化物イオンと共にスルフヒドリル基が必要である（Ｋｕｒｉｂａｙａｓｈｉｓｕｐｒａ）。ヒトの脾臓に由来するヒトジペプチジルペプチダーゼＩに対するヌクレオチド配列は、１９９３年２月９日に公開された国際出願番号ＷＯ９３／２４６３４−Ａに開示されている。ＷＯ９３／２４６３４−Ａ明細書には、シグナル配列及び全タンパク質配列を欠くヒト・ペプチジルペプチダーゼＩ配列が開示されており、炎症状態を阻害するための方法及び組成物が記載されている。上述のコミナミは、システインプロテアーゼが成熟酵素の切断により作り出される二本鎖形態で存在しうることを論じており、各鎖のＮ末端配列を恐らくは表す、Ｎ末端の２つの異なる配列で示される、生成ラットカテプシンＣのＮ末端分析について報告している。ＴＨＰ−１細胞ＴＨＰ−１は、急性単球性白血病を患う１歳の男子の血液に由来する、明確な単球性の特徴を持つヒト白血球細胞形である（ＴｓｕｃｈｉｙａＳｅｔａｌ（１９８０）ＩｎｔＣａｎｃｅｒ２６：１７１−１７６）。ＴＨＰ− １の単球性は、α−ナフチルブチラートエステラーゼ活性によって同定されたが、この活性はＮａＦ（フッ化ナトリウム）、リゾチームの産生、ラテックス粒予及び感作されたヒツジ赤血球細胞の食作用（外細胞物質の巻き込み）、及びマイトマイシンＣで処理されたＴＨＰ−１細胞のコンカナバリンＡで処理する前のＴ細胞を活性化する能力によって阻害される。形態学的には、細胞質は小さなアズール好性顆粒を含有し、核はくぼみが形成され深いフォールドで不規則に成形されており、また細胞膜は、恐らく食作用で機能を発揮するＦｃ及びＣ３ｂ受容体を有していた。典型的な単球は単芽球から骨髄中の前単球を通して発生し、成熟形態では、約３日間の半減期を有する。循環単球プールの概ね７５％は、血管壁に沿って見いだされるが、これらの細胞はランダムに組織内に移動し、抗原提示能を示したり、または食作用を示すようになる。抗原提示単球は、リンパ節及び皮膚の指状突起嵌合をなす細網状及び小胞性樹状突起細胞を含む。食作用単球は肝臓のクッパー細胞として、及び肺胞や骨髄において多数見いだされる。多くのヒト骨髄性細胞形及びヒト骨髄単球細胞形は、様々な内部刺激及び外部作用因子に応じてより多くの成熟表現型に分化する能力をいくらか備えている。上述の内部刺激には、増殖因子、リンフォカイン、サイトカイン、ビタミンＤ誘導体及び腫瘍プロモータが含まれている。上述の外部作用因子には、例えば外傷、喫煙、ＵＶ照射、アスベストにさらされること、及びステロイドなどがある。腫瘍プロモータ１２−Ｏ―テトラデカノイル―ホルボール−１３アセテート（ＴＰＡ）で処理されたＴＨＰ−１細胞は、誘導されて増殖し、形態学的に及び生理学的に天然単球由来マクロファージを真似たマクロファージ様細胞に分化する。単球−マクロファージ様細胞は、Ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎの共誘発及びｃ−ｍｙｂのダウンレギュレーションのような遺伝子発現の変化を示し（ＡｕｗｅｒｘＪ（１９９１）Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ４７：２２−３１）、補体Ｃ３ｂ受容体の密度の増加を示し、かつＦｃＲ及び接着分子ＣＤ４双方の減少を示す。更に、ＴＨＰ−１細胞は、アテローム硬化症による損傷に関与するリポタンパク質リパーゼ及びアポリポタンパク質Ｅを産生し、ＩＬ−１β及びＴＮＦ（ＣｏｃｈｒａｎＦＲａｎｄＦｉｎｃｈ−ＡｒｉｅｔｔａＭＢ（１９８９）ＡｇｅｎｔｓａｎｄＡｃｔｉｏｎｓ２７：２７１−２７３）を含む前炎症性サイトカインを何種類か分泌し、かつ強力なオキシダント及びカテプシンのような組織破壊プロテアーゼを合成しうる。慢性関節リュウマチは、単球／マクロファージ疾患の単なる一例であり、他にもマクロファージは様々な疾病に関与している。例えば、動脈硬化症においては、マクロファージが血液リポタンパク質からコレステロールを集積し、ヒト動脈硬化症による損傷の泡沫細胞となる。反逆活性化単球も、感染症、内蔵損傷、骨粗鬆症、トキシックショック症候群、及び全身性エリテマトーデスに対する不完全な防衛を示した。発明の開示本発明は、１００ｎｇ／ｍｌのホルボールエステル（ＰＭＡ）と共に４８時間培養され、次いでＬＰＳを１μｇ／ｍｌ含有する培地において４時間培養されたＴＨＰ−１細胞から単離されたＲＮＡから作られたｃＤＮＡライブラリにおいて初めに見いだされた新規なカテプシンＣホモログの新規なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列に関する。ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣＴＩＢ２０２）は、急性単球性白血病（ｒｅｆ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ２６（１９８０）：１７１）を患う１歳の男子の末梢血液に由来するヒト前単球細胞型である。この新たな遺伝子はｒｃｐ（インサイト社クローンＮｏ．１４２８４）なる記号で示され、ＲＣＰで表される新規なカテプシンＣのポリペプチドをコードする。本発明は疾病状態の診断及び治療、研究におけるＲＣＰのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の使用にも関連する。上述の疾病状態は、炎症疾患、自己免疫疾患、及び動脈硬化症、白血病、全身性エリテマトーデス、骨粗鬆症、慢性関節リュウマチ及びトキシックショック症候群のような疾病状態、あるいは移植拒絶反応及び移植片対宿主病のような疾病状態における骨髄細胞源の悪性腫瘍に関連する疾病状態である。本発明は、ＲＣＰとラットの腎臓から単離されたラットのカテプシンＣとが共有するアミノ酸相同性に部分的基礎をおき、カテプシンＣに共通な親水性領域におけるＮＮＳグリコシル化部位や触媒性三構造の保存性残基、即ち２５８番目のＣｙｓ、４０５番目のＨｉｓ、及び４２７番目のＡｓｎの存在にも部分的基礎をおき、また、単球性白血病のソースから作られたＴＨＰ−１ｃＤＮＡライブラリーにおけるＲＣＰに対するヌクレオチド配列の存在にもその部分的基礎をおいている。従って、本発明は異常な、単球に関連する新規なカテプシンＣホモログの発見にその基礎を置いている。ＲＣＰとそれをコードするヌクレオチド配列及びオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、そのフラグメント、部分またはアンチセンス分子は、炎症疾患、自己免疫疾患、及び動脈硬化症、白血病、全身性エリテマトーデス、骨粗鬆症、慢性関節リュウマチ及びトキシックショック症候群のような疾病状態、あるいは移植拒絶反応及び移植片対宿主病のような疾病状態における骨髄細胞源の悪性腫瘍に関連するＲＣＰの早期の正確な検出及び／または定量に対する診断方法の基礎を提供する。例えば、ここに開示するＲＣＰをコードするヌクレオチド配列またはそのフラグメントを、組織診された細胞または組織または体液のハイブリダイゼーションアッセイに用いて、炎症を有している可能性のある個人の異常を診断することができる。生物学的治療におけるＲＣＰをコードするヌクレオチド配列の異常レベルは、核酸欠失または突然変異のような染色体異常を反映しうる。従って、ＲＣＰをコードするヌクレオチド配列は、ＲＣＰをコードする遺伝子における欠失、突然変異または染色体の転移のような染色体異常を診断的に検出するのに使用され得るプローブの基礎を提供する。ｒｃｐ遺伝子の発現はこのような疾病によって変化することがあるが、そうでなければＲＣＰをコードする遺伝子の領域において染色体異常が存在することもある。本発明はまた、タンパク質分解をブロックすることが望ましい炎症のような状態において、ＲＣＰの活性、即ちプロテアーゼ活性をブロックするのに使用され得るｒｃｐアンチセンス分子またはＲＣＰアンタゴニストを提供する。本発明はまた、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏでのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の作成のためのｒｃｐヌクレオチド配列を含む生物工学的に処理された宿主細胞及び発現ベクターに関する。更に、本発明は、疾病状態におけるＲＣＰタンパク質レベルを診断的に検出し定量するのに使用され得るＲＣＰポリペプチドの阻害剤またはアンタゴニストのスクリーニングを行うため、及び抗ＲＣＰ抗体を作り出すための、ＲＣＰポリペプチドまたはフラグメントまたは変異体の使用にも関連している。本発明はまた、例えば炎症や他の疾病の治療における、ここに開示するヒト・カテプシンＣの活性を低下させることが必要な状態において使用される、ＲＣＰアンチセンス核酸やＲＣＰタンパク質の阻害剤またはアンタゴニストを効果的な量だけ含む医薬品組成物にも関連する。本発明は、更に、抗ＲＣＰ抗体、及び正の制御として使用され得る精製ＲＣＰを含む細胞及び組織におけるＲＣＰの検出のための診断アッセイ及びキットを提供する。このような抗体は、溶液ベース、膜ベース、または組織ベース技術において使用され、タンパク質の発現またはその欠失したものまたは変異体の発現に関連する疾病状態または条件を検出することができる。図面の簡単な説明第１ａ図及び第１ｂ図は、ｒｃｐのヌクレオチド配列（配列番号：１）、及びＲＣＰポリペプチドの予測アミノ酸配列（配列番号：２）を示した図である。第２ａ図及び第２ｂ図は、ＲＣＰポリペプチドとラット・カテプシンｃとのアミノ酸アライメントを示した図である。第２図及び第４図に示すアライメントは、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアのマルチシーケンスアライメントプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲＩｎｃ，ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）を用いて作られた。第３図は、予測アミノ酸配列及び組成に基づくＲＣＰ疎水性分析を示した図である。第４図は、ＲＣＰとＷＯ９３／２４６３４とのアミノ酸アライメントを示した図である。発明の実施の形態本発明は、１００ｎｇ／ｍｌのホルボールエステル（ＰＭＡ）と共に４８時間培養され、次いでＬＰＳを１μｇ／ｍｌ含有する培地において４時間培養されたＴＨＰ−１細胞から単離されたＲＮＡから作られたｃＤＮＡライブラリにおいて初めに見いだされた新規なカテプシンＣホモログの新規なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列に関する。ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣＴＩＢ２０２）は、急性単球性白血病（ｒｅｆ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ２６（１９８０）：１７１）を患う１歳の男子の末梢血液に由来するヒト前単球細胞型である。本発明は疾病状態の診断及び治療、研究におけるＲＣＰのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の使用にも関連する。上述の疾病状態は、炎症疾患、自己免疫疾患、及び動脈硬化症、白血病、全身性エリテマトーデス、骨粗鬆症、慢性関節リュウマチ及びトキシックショック症候群のような疾病状態、あるいは移植拒絶反応及び移植片対宿主病のような疾病状態における骨髄細胞源の悪性腫瘍に関連する疾病状態である。本発明は、ＲＣＰを発現する生物工学的処理をなされた宿主細胞及びＲＣＰの、ＲＣＰ活性を調節する物質や化合物を評価し、スクリーニングするための使用にも関連する。本発明は、１００ｎｇ／ｍｌのホルボールエステル（ＰＭＡ）と共に４８時間培養され、次いでＬＰＳを１μｇ／ｍｌ含有する培地において４時間培養されたＴＨＰ−１細胞から作られたｃＤＮＡライブラリの２２１４の使用可能なランダムサンプルにおける、ＲＣＰをコードするヌクレオチド配列の存在に部分的基礎をおいている。本発明は、更に、第２図に示すように、ＲＣＰとラットの腎臓から単離されたラットのカテプシンＣとが共有するアミノ酸相同性に部分的基礎をおいている。上述のコミナミの論文に開示されたラットのカテプシンＣ配列に基づき、第３図に開示された疎水性分析のグラフに加えて、第１ａ図及び第１ｂ図のカテプシンＣホモログに対するシグナル配列は、２１番目のアミノ酸残基（Ａｌａ）と２２番目のアミノ酸残基（Ｖａｌ）との間の領域、及び２８番目のアミノ酸残基（Ａｌａ）と２９番目のアミノ酸残基（Ａｓｎ）との間の領域から始まるようである。従って、第１ａ図及び第１ｂ図のヒト・カテプシンＣホモログのプロタンパク質領域は、２２番目と２９番目のアミノ酸残基の間から始まり、２３０番目のアミノ酸残基（Ｈｉｓ）で終わっているようである。ラットのカテプシンＣ配列に基づき、第１ａ図及び第１ｂ図のヒト・カテプシンＣホモログの成熟タンパク質配列は、２３１番目のアミノ酸残基２３１（Ｌｅｕ）から始まり、４６３番目のアミノ酸残基（Ｌｅｕ）で終わる。上述のコミナミは、システインプロテアーゼが成熟酵素の切断により作り出される二本鎖形態で存在しうることを論じており、各鎖のＮ末端配列を恐らくは表す、Ｎ末端の２つの異なる配列で示される、生成ラットカテプシンＣのＮ末端分析について報告している。更に、Ｈｅｐａｔｏｍａ（肝細胞癌）７７７７細胞からのカテプシンＣは合成されて、１８ｋＤａ及び６ｋＤａの成熟形態にプロセシングされる。ラットのカテプシンＣに対する相同性により、第１ａ図及び第１ｂ図に開示された成熟ヒトカテプシンＣホモログは、二本鎖のそれぞれのＮ末端配列を表わし得る２つの異なるＮ末端配列を含んでいるようである。従って、本発明は、炎症及び疾病が関与する新規なカテプシンＣホモログＲＰＣの同定に基礎をおいている。ここに開示する特定の実施例において、２２番目と２９番目の間のアミノ酸残基から始まり、２３０番目のアミノ酸残基で終わる、ヒト・カテプシンＣホモログのプロタンパク質領域は、該ヒト・カテプシンＣホモログの活性をブロックすることが望ましい状態において、ヒト・カテプシンＣホモログのアンタゴニストとして投与される。上記のような状態とは、炎症疾患、自己免疫疾患、及び動脈硬化症、白血病、全身性エリテマトーデス、骨粗鬆症、慢性関節リュウマチ及びトキシックショック症候群のような疾病状態、あるいは移植拒絶反応及び移植片対宿主病のような疾病状態における骨髄細胞源の悪性腫瘍に関連する疾病状態である。本明細書において、“核酸配列”なる用語は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列、及びそのフラグメントまたは部分を意味するか、あるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表わすものの何れであれ、二本鎖または一本鎖のゲノムのまたは合成の核酸源から得られるＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。本明細書において、“アミノ酸配列”は、ペプチドまたはタンパク質配列、若しくはその部分を意味する。本明細書において、“ｒｃｐ”は、核酸配列を意味し、“ＲＣＰ”は、タンパク質配列を意味する。本明細書において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、分子が、対応するオリゴヌクレオチドよりも高いアフィニティ及び特異性を持って相補的なＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリッド形成可能にせしめる、ヌクレオベースを備えた中性“ペプチド様”バックボーンを有する情報分子のクラスを意味する（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ１−８００−８９９−５８５８）。本明細書において、ＲＣＰは、自然発生形態あるいは変異体形態のヒト・ソースに由来するＲＣＰであって、天然のもの、合成のもの、半合成のもの、または組み換え体のものが包含される。本明細書において、“活性化単球”なる用語は、免疫学的に活性の組織において見出される活性化、成熟単球を意味する。本明細書において、“単球／マクロファージ疾患”なる用語には、動脈硬化症、白血病、全身性エリテマトーデス、骨粗鬆症、慢性関節リュウマチ及びトキシックショック症候群のような疾病状態が含まれるが、これらに限定されるものではない。本明細書において、“自然発生”なる用語は、天然に見いだされるアミノ酸配列を有するＲＣＰを意味し、“生物学的活性”なる用語は、免疫活性を含む、自然発生ＲＣＰの構造的、調節または生化学的機能を有するＲＣＰを意味する。自然発生ＲＣＰは、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、及びアシル化を含む（これらに限定されない）翻訳後修飾されたポリペプチドに由来するＲＣＰを含む。本明細書において、“免疫学的活性”は、天然、組み換え、または合成ＲＣＰまたはその任意のオリゴペプチドが、適切な動物または細胞において特異的免疫反応を誘発し、特異的抗体に結合する能力として定義される。本明細書において、“誘導”なる用語は、ＲＣＰの化学的修飾を意味する。このような修飾の例としては、アルキル基、アシル基、またはアミノ基による水素の置換がある。ＲＣＰポリペプチド誘導体は、自然発生ＲＣＰの生物学的特性を必ず維持している。ＲＣＰ誘導体は、ユビキチン化、ラベリング（例えば放射性核種や、様々な酵素修飾による標識付け）、ペジレーション（ポリエチレングリコールによる誘導体化）のような化学的修飾、若しくは例えばオルギチンのような通常はヒトタンパク質において自然発生しないアミノ酸の化学合成による挿入、置換によって得られた自然発生ＲＣＰに由来するＲＣＰポリペプチドを意味する。本明細書において、“精製”なる用語は、その天然の環境から取り出され、それらが通常結合している少なくとも１つの他の物質から単離または分離された核酸またはアミノ酸配列の分子を意味する。本明細書において、“組換え変異体ＲＣＰ”なる用語は、組換えＤＮＡ技術を用いて生成されるアミノ酸の挿入、除去、及び／または置換により自然発生ＲＣＰとは異なるものとなった任意のポリペプチドを意味する。興味の対象となる活性を損なわずに置換、付加、あるいは除去され得るアミノ酸残基を決定するためには、特定のＲＣＰの配列と相同体のサイトカインの配列とを比較し、相同性の高い領域でのアミノ酸配列の変化の数を最小にすればよい。アミノ酸の“置換”では、例えばロイシンからイソロイシンまたはバリンへの置換、アスピレートからグルタメートへの置換、スレオニンからセリンへの置換、即ち保存的アミノ酸置換のような１個のアミノ酸が構造的及び／または化学的特性がそれに類似した他の１個のアミノ酸で置換されるのが好ましい。アミノ酸の“挿入”または“除去”は、通常１〜５個のアミノ酸の範囲で行われる。組換えＤＮＡ技術を用いてＲＣＰ分子の挿入、除去、または置換を大系的に行い、得られた組換え変異体の活性を検定することにより、許容される変異体が実験的に決定され得る。必要ならば、“シグナル配列またはリーダー配列”を細胞膜を通してポリペプチドに向けることができる。このような配列は、本発明のポリペプチド上に自然に存在するか、あるいは組換えＤＮＡ技術により異種タンパク質源から得られる。本明細書において、ＲＣＰ“フラグメント（断片）”、“部分”、または“セグメント”なる用語は、生物学的及び／または免疫学的活性を示すに十分な長さを有するアミノ酸の伸展（ストレッチ）を意味する。好適実施例では、このＲＣＰ断片は少なくとも約５個のアミノ酸、少なくとも約７個のアミノ酸、または少なくとも約８〜１３個のアミノ酸を含み、別の実施例では約１７個またはそれ以上のアミノ酸を含む。本明細書において、“オリゴヌクレオチド”またはポリヌクレオチド“フラグメント”、“部分”、または“セグメント”なる用語は、同一の、若しくは近縁関係にある核酸を同定、若しくは増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法や、当業者には周知の様々なハイブリッド形成法におけるプライマーとして使用するのに十分な長さを有するＲＣＰをコードする核酸の任意のストレッチを意味する。本発明には、ＲＣＰをコードする組換え核酸分子で形質転換された宿主細胞、ベクター、及び天然または組換えソースから得られた精製ＲＣＰポリペプチドが含まれる。ＲＣＰポリペプチドを単離するための様々な方法は、当業者の周知となっている。例えばこのようなポリペプチドの精製のために、本発明の提供する抗体を用いたイムノアフィニティクロマトグラフィーを利用することができる。タンパク質精製のための他の様々な方法は、例えば、“ＤｅｕｔｓｃｈｅｒＭ（１９９０）ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＶｏｌ１８２，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ”及び“ＳｃｏｐｅｓＲ（１９８２）ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹＣ”に記載されており、これらの文献を本明細書と共に参照されたい。本明細書において、“組換え”なる用語は、組換えＤＮＡ技術を用いて調製されるＲＣＰをコードするポリヌクレオチドを意味する。ＲＣＰをコードするＤＮＡも対立形質の変異体または組換え変異体、及びその突然変異体を含み得る。本明細書において、“プローブ”または“核酸プローブ”または“オリゴヌクレオチドプローブ”なる用語は、所望の標的配列とハイブリッド形成し得るｒｃｐの部分、フラグメント、またはセグメントを意味する。分子生物学における従来の技術を用いることにより、ＲＣＰをコードするｃＤＮＡまたは内生核酸を検出し、増幅し、または定量するのにこのプローブが使用され得る。プローブの長さは様々であり、好ましくは、約１０から最大約数１００ヌクレオチドの長さを有するものである。当業者には理解されようが、ハイブリッド形成条件及びプローブの設計は、使用目的に応じて変化する。例えば、ＰＣＲでの使用を目的としたプローブは、長さが１５〜６０ヌクレオチドであり、縮重プローブのプールの一部分であり得る。即ちＰＣＲ用プローブは、ヌクレオチドのミスマッチに対する許容性を有し、未知の配列に対する結合に適合するオリゴヌクレオチドである得るのに対して、サザンハイブリダイゼーションまたはノーザンハイブリダイゼーション用のプローブは、長さが数１００ヌクレオチドの、１つの特定のヌクレオチド配列である得る。核酸プローブは、約６ｋｂより少ない塩基対数の、通常は約１ｋｂ未満の配列の部分からなり得る。本発明のオリゴヌクレオチド及び核酸プローブは、細胞または組織内にＲＣＰをコードする核酸が存在するか否かを判定するため、または“ＷａｌｓｈＰＳｅｔａｌ（１９９２）ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＡｐｐｌ．１：２４１−２５０”に記載のように染色体ＤＮＡから類似した核酸配列を分離するのに使用され得る。従って、ｒｃｐを特異的に検出するためのプローブで好適なものは、配列番号：１の配列の非保存ヌクレオチド領域から得られるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドフラグメントであり得る。本明細書において、“非保存的ヌクレオチド領域”なる用語は、配列番号：１に一義的に存在し、かつカテプシンＣにおける保存される領域を含まないヌクレオチド領域を意味する。プローブは一本鎖または二本鎖で、ｉｎｓｉｔｕハイブリッド形成及びＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫検定法）のような技術を含む膜ベースのハイブリダイゼーション、溶液、細胞、組織において特異性を有し得る。本発明の核酸プローブは、自然発生核酸、組換え一本鎖または二本鎖核酸から誘導されるか、若しくは化学的に合成され得る。プローブの標識化は、ニックトランスレーション法、クレノウフィルイン反応法、ＰＣＲ法、または当分野において周知の他の方法を用いて行われ得る。本発明のプローブを調製し、標識する方法は、“ＳａｍｂｒｏｏｋＪｅｔａｌ（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｄＥｄ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ”または“ＡｕｓｕｂｅｌＦＭｅｔａｌ（１９８９）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ２，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ”に詳しく述べられており、これらの文献を本明細書と共に参照されたい。別の形態として、本発明のポリペプチドをコードする組換え変異体のヌクレオチド配列は、当業者に周知の技術を用いて、遺伝暗号の“重複性”を利用することにより合成、または同定され得る。様々な切断部位を作り出すサイレント変化のような、様々なコドン置換を導入することで、プラスミドやウィルスベクターへのクローニング、または特定の原核細胞系または真核細胞系における発現を最適化することができる。また、突然変異を導入することによって、ポリペプチドの特性を変え、リガンド結合親和力、鎖間親和力、またはポリペプチド変性またはターンオーバー速度を変えることもできる。発明の詳細な説明ＲＣＰをコードする配列ヒトＲＰＣのヌクレオチド配列（配列番号：１）は第１図に示されている。ＲＣＰのコード領域は、ＰＭＡ及びＬＰＳで処理されたＴＨＰ−細胞から作られたｃＤＮＡライブラリ（インサイト社ｃＤＮＡライブラリＴＨＰ１ＰＬＢ０１）内で初めに同定された。該ライブラリーでは約２２１４個の使用可能な配列のうち１個から見いだされた。本明細書において、“使用可能な配列”なる用語は、ｃＤＮＡライブラリーから、ベクター、ヌクレオチド反復、コンタミ、ミトコンドリアＤＮＡを除去した後に得られるクローンの総数を指す。ＢＬＡＳＴｓｅａｒｃｈ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ；ＡｌｔｓｃｈｕｌＳＦ（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００；ＡｌｔｓｃｈｕｌＳＦｅｔａｌ（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）で、ＴＨＰ１ＰＬＢ０１ライブラリのｃＤＮＡとＧｅｎＢａｎｋの霊長類データベースとを比較して、カテプシンＣとしてインサイト社クローンＮｏ．１４２８４を同定した。ＲＣＰをコードするヌクレオチド配列は、膀胱組織（インサイト社ライブラリーＢＬＡＤＮＯＴ０１）、スタンフォード血液銀行から得られた軟膜ユニットから単離された可塑性接着（２時間培養）単核細胞（インサイト社ライブラリーＭＰＨＧＮＯＴ０３）、リュウマチ様股関節滑膜組織（インサイト社ライブラリーＳＹＮＯＲＡＢ０１）、通常の胎盤（インサイト社ライブラリーＰＬＡＣＮＯＢ０１）、混合白血球（ＭＬＲ）の培地から１日後に回収された可塑性接着性単核細胞（インサイト社ライブラリーＭＭＬＲ２ＤＴ０１）、１００ｎｇ／ｍｌホルボールエステル（ＰＭＡ）と共に４８時間培養されたＴＨＰ−１細胞（インサイト社ライブラリーＴＨＰ１ＰＥＢ０１）、リュウマチ様肘関節滑膜組織（インサイト社ライブラリーＳＹＮＯＲＡＴ０１）、ＲＮＡの単離の前に１０μｍのレチン酸で２４時間処理された、活性の初期段階でニューロン前駆物質の特性を示す、ヒト・テトラ癌腫に由来するｈＮＴ２細胞型（インサイト社ライブラリーＨＮＴ２ＲＡＴ０１）、白血性ソースから得られたＴ／Ｂリンパ芽球（インサイト社ライブラリーＴＢＬＹＮＯＴ０１）、脚の皮膚に由来する新生児の角質細胞（インサイト社ライブラリーＫＥＲＡＮＯＴ０１）、９６時間混合リンパ球反応（ＭＬＲ）、非接着性及び接着性末梢血液単核細胞（インサイト社ライブラリーＴＭＬＲ３ＤＴ０１）、ヒト・テトラ癌腫に由来するｈＮＴ２細胞型（インサイト社ライブラリーＨＮＴ２ＮＯＴ０１）、肺組織（インサイト社ライブラリーＬＵＮＧＮＯＴ０１）、過好酸性症候群と診断された４８歳の男性患者から除去された末梢血液細胞（インサイト社ライブラリーＥＯＳＩＨＥＴ０１）、フィコルハイパーク遠心分離処理及び７２時間のｉｎｖｉｖｏの培養の後のプールされたドナー集団に由来する接着単核細胞（インサイト社ライブラリーＭＭＬＲ３ＤＴ０１）、及びクローン病を患う患者のＳ字結腸組織（インサイト社ライブラリーＣＯＬＮＮＯＴ０５）から作られたｃＤＮＡライブラリーにおいて見いだされた。ＲＣＰは、ＴＨＰ−１細胞、即ち単球性白血病の単球、過好酸性症候群を患う患者の血液、クローン病を患う患者の結腸組織、ヒト・テトラ癌腫に由来する細胞、白血病及びリュウマチ用滑膜から得られたＴ／Ｂ細胞において発現されることから、核酸（ＲＣＰ）、ポリペプチド（ＲＣＰ）、ＲＣＰに対する抗体は、炎症及び疾病に関連するＲＣＰのアミノ酸配列またはヌクレオチドの検出のための診断アッセイにおいて有用であり、診断及び適切な治療を促進しうるものである。ＤＮＡ配列決定の方法は従来より周知であり、ＤＮＡポリメラーゼＩクレノーフラグメントＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）（ＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ，ＣｌｅｖｅｌａｎｄＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＮｏｒｗａｌｋＣＮ）、耐熱性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＣｈｉｃａｇｏＩＬ）のような酵素を用いるか、若しくはＥＬＯＮＧＡＳＥＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＧａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇＭＤ）のような校正エキソヌクレアーゼの組合せを用いる。目的のＤＮＡ鋳型にアニーリングされたオリゴヌクレオチドプライマーからＤＮＡを延展する方法は、一本鎖鋳型用の方法と二本鎖鋳型用の方法の双方が開発された。チェーンターミネーション反応の生成物は、電気泳動法を用いて分離され、それらに一体に組み込まれた標識された前駆物質を介して検出された。反応調製、配列決定、及び分析の最近の進歩と機械化により、一日当たりに決定されうる配列数が伸びた。好ましくは、このプロセスは、ＨａｍｉｌｔｏｎＭｉｃｒｏＬａｂ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＲｅｎｏＮＶ）、ＰｅｌｔｉｅｒＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ（ＰＴＣ２００；ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ，ＷａｔｅｒｔｏｗｎＭＡ）及びＡＢＩＣａｔａｌｙｓｔ８００、３７７及び３７３ＤＮＡシーケンサ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＮｏｒｗａｌｋＣＮ）のような機械により自動化される。ＲＣＰをコードするポリヌクレオチドが見いだされる特定のｃＤＮＡライブラリの品質は、ｃＤＮＡのパイロットスケール分析を実行し、クローン含有ベクター、ラムダまたはＥ．ｃｏｌｉＤＮＡ、ミトコンドリアまたは反復ＤＮＡ、及び法的データベースに対する正確な一致または相同性一致を有するクローンをチェックすることにより決定されうる。ＲＣＰをコードするヌクレオチド配列（またはその相補的配列）は、分子生物学の分野における当業者には周知の技術において数多くの用途を有する。これらの技術には、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用、ＰＣＲ用オリゴマーの構築における使用、染色体及び遺伝子マッピングにおける使用、ＲＣＰの組換え体生成における使用、及びアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡの、またはこれらの化学的類似体等の生成における使用が含まれる。ここに開示するＲＣＰをコードするヌクレオチドの使用方法は、周知の技術の一例であり、当業者に周知の何らかの技術にその使用を限定しようとするものではない。更に、未だ開発されていない分子生物学的技術であっても、それが例えばトリプレット遺伝暗号及び特異的な塩基対相互作用のような既知のポリヌクレオチド配列の特性に基づく技術である限り、ここに開示するヌクレオチド配列を使用することができる。遺伝暗号の縮重（degeneracy）の結果、そのヌクレオチド配列がＲＣＰをコードするもので限り、既知のヌクレオチド配列及び自然発生遺伝子のヌクレオチド配列に対する相同性を有する最小限のヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む、様々なＲＣＰをコードするヌクレオチド配列が産生され得る、ということは当業者には理解されよう。本発明は、より具体的には可能なコドン選択に基づいて組合せを選択することにより生成され得る全ての可能なヌクレオチド配列を、その範囲に含んでいる。これらの組合せは、自然発生ＲＣＰのヌクレオチド配列に対して適用されるような標準的なトリプレット遺伝暗号に基づいて作られる。また、このような全ての変異体は、具体的にここで開示されたものと考えられたい。ＲＣＰ及び／またはＲＣＰ変異体をコードするヌクレオチド配列は、厳格な条件の下で自然発生ＲＣＰ遺伝子のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能なものであるのが好ましいが、実質的に異なるコドン使用頻度をプロセシングするＲＣＰまたはＲＣＰ誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。コドンの選択は、特定の原核細胞または真核細胞の発現宿主におけるペプチドの発現速度を高めるように選択することができ、このときこの発現速度は、その宿主における特定のコドンの使用頻度に基づいて決まる。本発明のＲＣＰ及び／またはＲＣＰ誘導体をコードするヌクレオチド配列を、このコードされたアミノ酸配列を変えることなく実質的に変化させる他の理由は、より望ましい特性、例えば自然発生ヌクレオチド配列から産生されたものより長い半減期を有するＲＮＡ転写物を作り出すためである。ＲＣＰをコードするヌクレオチド配列は、完全に確立された組換えＤＮＡ技術（“ＳａｍｂｒｏｏｋＪｅｔａｌ．（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｄＥｄ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ”参照）により様々な他のヌクレオチド配列と結合してもよい。ｒｃｐに結合するのに有用なヌクレオチド配列には、例えば従来より周知のプラスミド、コスミド、λファージ誘導体、ファージミド等のクローニングベクターの組合せが含まれる。興味の対象であるベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ産生ベクターシークエンシングベクター等が含まれる。一般に、興味の対象となるベクターは、少なくとも１つの生物において複製起点機能を発揮する便利な制限エンドヌクレアーゼ検知サイト、及び宿主細胞用として選択可能なマーカーを含み得る。ＲＣＰの正しい完全なｃＤＮＡ配列を知ることにより、遺伝子機能の調査でのアンチセンス技術に、これを適用することが可能になる。ＲＣＰをコードするポリヌクレオチド配列のアンチセンス鎖を含むゲノムのまたはｃＤＮＡのフラグメントをｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで用いて、特定のタンパク質の発現を阻害することができる。このような技術は周知であり、ヌクレオチド配列の様々な部位に付くプローブをデザインすることができる。細胞または実験動物の全体をこのようなアンチセンス配列で処理することより、興味の対象である遺伝子の機能を効果的に遮断することができる。多くの場合、細胞レベル、組織レベル、若しくは生物体全体のレベルでの挙動（例えば死亡率、分化した機能の消失、形態の変化等）を観察することにより、その遺伝子の機能を確認することができる。開放された読み枠の転写を妨害するように構築された配列を用いることに加えて、イントロン領域、プロモータ／エンハンサー要素、またはトランス作用調節遺伝子に対するアンチセンス配列をデザインすることにより、遺伝子発現を修飾することかできる。同様に、“三重らせん体（トリプルヘリックス）”塩基対として知られるＨｏｇｅｂｏｏｍ塩基対を用いて阻害を達成することができる。本発明の別の実施例では、ＲＣＰをコードする自然発生ヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能なｒｃｐ特異的核酸ハイブリダイゼーションプローブが提供される。ＲＣＰをコードする配列の検知のためのこのようなプローブは、配列番号：１の非保存領域から得られるヌクレオチドフラグメントを含むのが好ましい。類似するカテプシンをコードする配列の検出のためのこのようなプローブは、配列番号：１の配列をコードする配列のヌクレオチドの少なくとも５０％を含むのが好ましい。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、配列番号：１のヌクレオチド配列、または自然発生ｒｃｐのプロモータ、エンハンサー要素、及びイントロンを含むゲノムの配列に由来するものであり得る。ハイブリダイゼーションプローブは、様々なリポーターグループにより標識され得るが、このリポーターグループには、³²Ｐまたは³⁵Ｓのような放射性核種、若しくはアルカリホスファターゼのような酵素標識が含まれ、これらはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合する。この他当業者に周知の技術を用いてプローブを標識することができる。米国特許第４，９６５，１８８号、第４，６８３，１９５号、及び第４，８００，１９５号明細書に記載されているようなＰＣＲ法の実施において、ＲＣＰをコードするヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドの別の使用方法がある。このようなＰＣＲにおいて使用されるプローブは、組換えにより得られたものであるか、化学的に合成されたものであるか、若しくは両者の混合であり得、また、診断的な使用に供される分散したヌクレオチドまたは近縁関係にあるゲノム配列の同定に用いられる可能な変性配列のプールを含み得る。ＲＰＣＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブを産生するための他の方法には、ｍＲＮＡプローブの産生のためのベクターへの、ＲＣＰ及びＲＣＰ誘導体をコードする核酸配列のクローニングが含まれる。このようなベクターは従来より周知であり、または市販されており、例えばＴ７またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのような適当なＲＮＡポリメラーゼ及び適当な放射性の標識をなされたヌクレオチドを添加することによりｉｎｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するのに使用することができる。現在完全に化学合成によりＲＣＰ及びＲＣＰ誘導体をコードするＤＮＡ配列、またはその部分を産生することが可能であり、合成の後、従来より周知の試薬、ベクター、及び細胞を用いて様々な市販のＤＮＡベクターに挿入することができる。更に化学合成を用いて、ｒｃｐ配列若しくはその部分に突然変異を起こさせることも可能である。このヌクレオチド配列を用いて、ＲＣＰの発現レベルの異常に関連する炎症及び疾病の検出のためのアッセイを構築することができる。このヌクレオチド配列は、従来より周知の方法で標識した上で、ハイブリッド形成条件の下で患者の体液または組織の試料に添加することができる。インキュベーション時間の経過後、ヌクレオチドが酵素で標識されていた場合には、所望に応じて染料（または他の展開剤を必要とする標識）を含有する適合性の液体で試料が洗浄される。この適合性の液体を洗い流した後、染料を定量し、標準値と比較する。染料の量が著しく多い場合には、このヌクレオチド配列は試料とハイブリッド形成したことになる。ｒｃｐが異常なレベルで存在している場合には、このアッセイにより炎症及び／または疾病の存在が確認されたことになる。ｒｃｐのヌクレオチド配列を用いて、その遺伝子のマッピングのためのハイブリダイゼーションプローブを構築することができる。ここに開示するヌクレオチド配列の染色体及び染色体の特定の領域へのマッピングを、周知の遺伝子及び／または染色体マッピング技術を用いて行うこともできる。このような技術には、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対するリンケージ分析、既知の染色体に対して特異的なライブラリまたはフローソートされた染色体調合物を用いたハイブリダイゼーションスクリーニング等が含まれる。染色体延展（chromosome spread）の蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術については、他の文献、即ち“Ｖｅｒｍａｅｔａｌ（１９８８）ＨｕｍａｎＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ＡＭａｎｕａｌｏｆＢａｓｉｃＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ，ＮＹＣ”に記載されている。染色体調合物の蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び他の物理的染色体マッピング技術は、追加的な遺伝子地図データと関連付けられ得る。遺伝子地図データの例としては、“ｔｈｅ１９９４ＧｅｎｏｍｅＩｓｓｕｅｏｆＳｃｉｅｎｃｅ（２６５：１９８１ｆ）”がある。物理的染色体地図上でのｒｃｐをコードする遺伝子の位置と特定の疾病（若しくは特定の疾病に対する素因）との間の相関関係は、この遺伝病に関連するＤＮＡの領域の範囲を特定するための助けとなる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、健常者の遺伝子配列と、キャリアまたは遺伝病の保因者の遺伝子配列との相違を検出することができる。ＲＣＰの発現ＲＣＰをコードするヌクレオチド配列を用いて、周知の組換えＤＮＡ技術を利用して精製ＲＣＰを作り出すことができる。一実施例では成熟ＲＣＰをコードする核酸が発現され、別の実施例ではプロタンパク質及び成熟ＲＣＰをコードする核酸が発現され、更に別の実施例ではプロタンパク質配列をコードする核酸が発現される。遺伝子を単離した後、その遺伝子を発現させる方法を記載した文献は数多くあるが、その例としては、“Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ１８５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ”がある。ＲＣＰは、原核細胞または真核細胞の何れかの様々な宿主細胞内において発現され得る。宿主細胞は、ｒｃｐヌクレオチド配列が内生である種と同一の種、あるいは異なる種の何れからでも得ることができる。組換えＤＮＡ技術によってＲＣＰを産生することの利点には、精製用として高濃度に濃縮されたタンパク質源が得られること、及び精製のための簡単な手順が利用できるようになることがある。ｒｃｐの発現は、ｃＤＮＡを適当な発現ベクターにサブクローニングし、このベクターを適切な発現宿主に感染させることによりなされ得る。実施例７に記載されているように、ＲＣＰの発現及び精製のための好適な発現ベクターは、ＲＣＰを含む融合タンパク質の発現用として使用でき、かつ６個のヒスチジン残基、次いでチオレドキシン及びエンテロキナーゼ切断サイトをコードする核酸を含むものである。ヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー“Ｐｏｒａｔｈｅｔａｌ．（１９９２）ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ３：２６３：２８１”に記載）上での精製を促進し、一方エンテロキナーゼ切断サイトは、融合タンパク質からのケモカインの精製のための手段となる。組織ライブラリーの作成のために従来より用いられてきたクローニングベクターによっても、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｒｃｐ配列を発現させられる。ｃＤＮＡクローン挿入断片は、必ずランダムプロセスにより産生されることから、含まれたｃＤＮＡが適切な翻訳のための正しい読み枠に存在する可能性は３つに１つである。ｃＤＮＡが適切な読み枠に存在しない場合には、ｉｎｖｉｔｒｏ突然変異を含む周知の方法による適切な数の塩基の除去または挿入や、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたは大豆ヌクレアーゼを用いた消化、若しくはオリゴヌクレオチドリンカーの混入により、正しい読み枠に存在するものを得ることができる。ｒｃｐのｃＤＮＡは、特定の宿主におけるタンパク質源の発現のために有用であることが知られているベクターにシャトルされ得る。クローニングサイトと共に、目標ｃＤＮＡ（２５塩基）の両端における伸展部分とハイブリッドを形成するのに十分なＤＮＡのセグメントを含むオリゴヌクレオチドアンプリマーは、標準的な方法で化学的に合成され得る。次いで、これらのプライマーを用いて、ＰＣＲ法により所望の遺伝子セグメントを増幅することができる。得られた新たな遺伝子セグンメントは、標準的な条件の下で適当な制限酵素で切断し、ゲル電気泳動法により単離することができる。別の形態として、適当な制限酵素を用いてヌクレオチド配列を切断し、欠失した遺伝予セグメントに化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを埋め込むことにより、類似の遺伝子セグメントを産生することができる。更に、複数の遺伝子から得られた配列をコードするセグメントを相互に結合し、適当なベクターにクローニングして、組換え配列の発現を最適化することができる。このようなキメラ分子用の適切な発現宿主には、チャイニーズハムスターの卵巣及びヒト２９３細胞のような哺乳類の細胞、Ｓｆ９細胞のような昆虫の細胞、サッカロミセスセルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のような酵母菌細胞、及びＥ．ｃｏｌｉのような細菌が含まれるが、これらに限定されるものではない。このような細胞系のそれぞれに対して有用な各発現ベクターも、細菌内での増殖を可能にする複製起点、及びβ−ラクタマーゼ抗抗生物質遺伝子のような細菌内での選択を可能にする選択可能なマーカーを含み得る。更に、このベクターは、感染された真核宿主細胞群における選択を可能にする、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のような第２の選択可能なマーカーを有し得る。真核細胞の発現宿主において使用するためのベクターは、３′ポリアデニル化配列のようなＲＮＡプロセシング要素を、それが興味の対象であるｃＤＮＡに含まれていない場合には必要とすることがある。更に、ベクターは遺伝子発現を増加させるプロモータまたはエンハンサーを含み得る。このようなプロモータは宿主特異的であって、ＭＭＴＶ、ＳＶ４０、またはＣＨＯ細胞用のメタロチオネインプロモータや、細菌宿主用のｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｃ、またはＴ７プロモータや、酵母菌用のα因子、アルコール酸化酵素、またはＰＧＨプロモータが含まれる。ＲＳＶエンハンサーのような転写エンハンサーは、哺乳類の宿主細胞において使用され得る。ひとたび標準的な培養法により均一な組換え細胞の培養物が得られると、組換え体により産生されたＲＣＰが大量に条件培地から得られ、当技術分野において周知のクロマトグラフィー法により分析できることになる。ＲＣＰをコードするＤＮＡによって形質転換された細胞は、ＲＣＰの発現及び細胞培地からのタンパク質の回収に適切な条件の下で培養され得る。組換え細胞により産生されたＲＣＰは、使用される特定の遺伝子構造に応じて、分泌されるか、あるいは細胞内に保持され得る。一般に、組換えタンパク質は、分泌される形態で準備しておくのがより便利である。精製のステップは、使用される産生プロセスの性質及び産生される特定のＲＣＰの性質に基づいて決まる。ＲＣＰは、タンパク質精製を容易にするべく添加された１または２以上の追加のポリペプチドを有するキメラタンパク質として発現され得る。このような精製促進ドメイン（分子内領域）には、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン―トリプトファンモジュールのような金属キレート化ペプチド固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、及びＦＬＡＧＳ伸展／アフィニティ精製システム（ＩｍｍｕｎｅｘＣｏｒｐ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）において利用されるドメイン等があるが、これらに限定されるものではない。切断可能なリンカー配列（例えばＸＡ因子またはエンテロキナーゼ）が精製ドメインと、ｒｃｐ配列との間に含まれていると、ＲＣＰの発現を促進するのに役立つ。組換え体による産生に加えて、固相技術を用いた直接のペプチド合成によりＲＣＰフラグメントを産生することもできる。（“ＳｔｅｗａｒｔｅｔａｌＢ（１９６９）Ｓｏｌｉｄ−ＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＷＨＦｒｅｅｍａｎＣｏ．ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ；ＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄＲ（１９６３）ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ８５：２１４９−２１５４”参照）。ｉｎｖｉｔｒｏタンパク質合成は、手作業、あるいは機械により自動的に行うことができる。自動的な合成は、例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３１ＡＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を製造業者の指示に従って用いることにより行うことができる。ＲＣＰの様々なフラグメントを個別に化学合成し、化学的な方法により結合することによってＲＣＰの全体を産生することもできる。ＲＣＰ抗体抗体の誘発において使用するためのＲＣＰは、生物学的活性を有している必要はないが、免疫活性を有していなければならない。ＲＣＰ特異的抗体の誘発において使用するためのペプチドは、少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含む。このペプチドは、タンパク質の一部分を模しており、ＲＣＰのような自然発生分子の全アミノ酸配列を含んでいてもよい。ＲＣＰのアミノ酸配列の短いストレッチは、ヒザラガイヘモシアニン（ＫＬＨ）や抗体産生に使用されるキメラ分子のような他のタンパク質のストレッチと融合され得る。ＲＣＰに対して特異的な抗体は、適当な動物にＲＣＰ配列を接種することにより産生され得る。本発明においては、ポリペプチドは成熟ＲＣＰ配列、プロタンパク質配列、またはプロタンパク質及び成熟ＲＣＰ配列、もしくはシグナル配列、プロタンパク質配列及び成熟配列を含むポリペプチドであり得る。抗体が、自然発生または組換えタンパク質の少なくとも一部分に対して産生され、そのタンパク質の全体または一部分に結合するならば、その抗体はＲＣＰに対して特異的であると言える。抗体の誘発は、動物への注射により生ずる免疫反応の刺激作用によるもののみならず、合成抗体、または組換え免疫グロブリンライブラリ（“Ｏｒｌａｎｄｉｅｔａｌ（１９８９）ＰＮＡＳ８６：３８３３−３８３７またはＨｕｓｅｅｔａｌ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：１２７５− １２８１”参照）またはリンパ球集団のｉｎｖｉｔｒｏ刺激作用によっても起こる。現在の技術（“ＷｉｎｔｅｒａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３４９：２９３−２９９”）では、抗体形成の原理に基づき、高度に特異的に結合する多数の試薬を提供することができる。このような技術は、ＲＣＰに特異的に結合し得る分子の産生に容易く適用することができる。ＲＣＰに対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を調製するための方法は、様々なものが当業者の知るところであろう。その方法の１つは、逆相ＨＰＬＣ分離から変性ＲＣＰを得て、これを用いて当業者に周知の技術でマウスまたはウサギを免疫化する方法である。マウスの免疫化には変性ＲＣＰ約１００μ ｇで十分であり、ウサギの免疫化には最大１ｍｇを用いることができる。マウスハイブリドーマを同定するために、変性タンパク質を放射性要素で標識し、これを用いて潜在性ネズミＢ細胞ハイブリドーマをスクリーニングして、抗体を産生するものを分離することができる。この方法では、必要なタンパク質の量はわずかであり、数１０００のクローンを標識しスクリーニングするためには２０ｍｇで十分である。別の方法では、ＲＣＰのアミノ酸配列はｃＤＮＡ配列から推論されるように、その分析により免疫抗原性の高い領域が決定される。これらの領域を含むポリペプチドを合成し、適切な免疫化プロトコルで使用して抗体を産生する。適切なエピトープを選択するための分析方法は、“ＡｕｓｕｂｅｌＦＭｅｔａｌ（１９８９，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ２．ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）”に記載されている。免疫化のための最適なアミノ酸配列は、通常、そのタンパク質が自然のコンフォーメーションをなしているときに外部環境にさらされやすいポリペプチドのＣ末端、Ｎ末端、及びその間に介在する親水性領域に存在する。典型的には、約１５残基の長さを有する選択されたポリペプチドは、ｆｍｏｃ化学を用いるＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＰｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒｍｏｄｅｌ４３１Ａを用いて合成され、Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ；上述のＡｕｓｕｂｅｌＦＭｅｔａｌ参照）と反応させることによりヒザラガイヘモシアニンまたはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ；Ｓｉｇｍａ）と結合される。必要ならば、ＫＬＨに結合できるようにペプチドのＮ末端にシステインを挿入してもよく、動物は、フロイント完全アジュバントによりペプチド−ＫＬＨ複合体で免疫化される。得られた抗血清は、ペプチドをプラスチックに結合し、１％のＢＳＡでブロックし、抗血清と反応させ、その後洗浄し、（放射性または蛍光性の）標識をなされたアフィニティ精製された特異的ヒツジ抗ウサギＩｇＧと反応させることにより、抗ペプチド活性をテストすることができる。ハイブリドーマも標準的な技術を用いて調製される。興味の対象となるハイブリドーマは、標識化ＲＣＰでスクリーニングし、所望の特異性を有するモノクローナル抗体を産生するそれらの融合体を同定することにより検出される。例えば、典型的なプロトコルでは、プレート（ＦＡＳＴ，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）の穴が、アフィニティ精製された特異的ウサギ抗マウス（または適当な抗種Ｉｇ）抗体約１０ｍｇ／ｍｌでコーティングされる。コーティングされた穴は１％のＢＳＡでブロックされ、洗浄されて、ハイブリドーマの上清液にさらされる。インキュベーションの後、この穴は約１ｍｇ／ｍｌの濃度の標識化ＲＣＰにさらされる。抗体を産生するクローンは、上述のような条件の下で検出可能な量の標識化ＲＣＰと結合する。このようなクローンは、増殖された上で、限界希釈（１細胞／３穴）で２サイクルのクローニングをなされる。クローニングされたハイブリドーマは、プリスタン処置を受けたマウスに注射され、マウスの復水が作り出される。モノクローナル抗体は、プロテインＡを用いるアフィニティクロマトグラフィーにより、マウスの復水から精製される。少なくとも１０⁸Ｍ^-1、好ましくは１０⁹〜１０¹⁰以上の親和力を有するモノクローナル抗体は、典型的には、“ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ”または“Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，２ｄＥｄ．ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＮｅｗＹｏｒｋＣｉｔｙ”に記載の標準的な手順により作られる。これらの文献を本明細書と共に参照されたい。ＲＣＰのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の使用ＲＣＰの抗体、阻害剤、アンタゴニスト（若しくは他の過剰なＲＣＰ産生の治療薬）は、炎症疾患、自己免疫疾患、及び動脈硬化症、白血病、全身性エリテマトーデス、骨粗鬆症、慢性関節リュウマチ及びトキシックショック症候群のような疾病状態、あるいは移植拒絶反応及び移植片対宿主病のような疾病状態における骨髄細胞源の悪性腫瘍に関連する疾病状態の治療において、治療的に投与されたときそれぞれ異なる効果を与え得る。このＲＣＰの抗体、阻害剤、アンタゴニストのような過剰なＲＣＰ産生の治療薬は、無毒性で、不活性で薬化学的に適格な水性担体媒質でありそのｐＨは約５〜８、より好適には６〜８のである。但しこのｐＨ値は、調合される抗体、阻害剤、アンタゴニストの特性や、治療される病状に応じて変わってくる。ここに開示された特定の実施例においては、アンタゴニストは、配列番号：２のアミノ酸残基２２と２９との間から始まり、アミノ酸残基２３０で終わるプロタンパク質配列である。このような治療薬の特性には、分子の可溶性、半減期、及び抗原性／免疫抗原性が含まれ、効果的な担体を決定するのに役立ち得る。天然ヒトタンパク質はＴＥＣとして好適であるが、薬物スクリーニングによって得られた有機分子も特定の状態の下では同様に効果的であり得る。過剰なＲＣＰ産生の治療薬は、局所塗布用クリームまたはゲル、粘膜透過性スプレーまたはエーロゾル、皮膚透過性パッチまたは包帯、注射可能な静脈内または洗浄調合物及び経口投与液若しくは錠剤を含む周知の投与経路によって与えられ得るが、投与の仕方は以上挙げたものに限定されない。特定の配合、正確な投与量、及び投与経路は、病院所属医師により決定され、それぞれの状況に応じて変わってくる。このような決定は、治療を受ける条件、投与される治療薬、及び特定の治療薬の薬動力学的プロフィールのような様々な変量を考慮してなされる。考慮され得る他の因子には、病状、患者の年齢、体重、性別、食事、投与の回数、薬物の組合せ、反応感受性及び治療に対する耐性／反応が含まれる。長時間作用する調剤の投与の頻度は、特定のＴＥＣの半減期及び消失速度に応じて、３日から４日に１回、１週間に１回、または２週間に１回であり得る。通常の投与量は、投与経路に応じて０．１〜１００，０００μｇ、最大１ｇの間で変化し得る。ＴＥＣの特定の投与量に関しての説明は以下の文献、即ち米国特許第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号、または第５，２２５，２１２号明細書に記載されている。ＴＥＣの種類に応じて効果的な配合も変わり、また好酸球を標的にする投与と、他の器官または組織を標的にする場合では、投与方法も異なってくることが予測される。以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。産業的応用性１．ｍＲＮＡの単離及びｃＤＮＡライブラリの構築ｒｃｐヌクレオチド配列は、ヒトＴＨＰ−１ライブラリーを含む配列の中から同定された。ＴＨＰ−１は、急性単球性白血病を患う１歳の男児の血液に由来するヒト白血病細胞型である。ＰＭＡ＋ＬＰＳライブラリー用として使用される細胞はＤＭＳＯにおける１００ｎｍのＰＭＡと共に４８時間、１μｇ／ｍｌのＬＰＳと共に４時間培養された。ＴＨＰ−１ライブラリーは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，１１０９９Ｍ．ＴｏｒｒｅｙＰｉｎｅｓＲｄ．，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ９２０３７）により、後に説明するようにカスタムメイドで構築された。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社は、オリゴｄ（Ｔ）プライミングを利用してｃＤＮＡライブラリーを調整した。合成アダプタオリゴヌクレオチドはｃＤＮＡ分子に結合され、それがＵｎｉ−ＺＡＰ（商標）ベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に挿入しうるようにされた。これによって、高い効率の一方向性（センス方向）のラムダライブラリー構築が可能となり、ｃＤＮＡ挿入断片を有するクローンを検出するのに青／白色選択を備えたファージミド系を使用できるという利点が得られる。ｃＤＮＡライブラリーの品質は、ＤＮＡプローブを用いてスクリーニングされ、次いでｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が切除された。このファージミドにより、融合ポリペプチドの一方向性欠質及び発現の生成、部位特異的突然変異誘発、配列決定、及び挿入断片の特徴付けを容易に行うためのプラスミドシステムの使用が可能となる。次いで、カスタムメイドで構築されたライブラリーのファージ粒子がＥ．ｃｏｌｉ宿主型のＸＬ１−Ｂｌｕｅ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に感染させられた。菌株の形質変換が高い効率となることにより、ｃＤＮＡライブラリーが頻度の少ない過小表現型の（under-represented）クローンを含む確率が高められる。別の一方向性ベクターとしては、ｐｃＤＮＡＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ）及びｐＳＨｌｏｘ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）が含まれうるが、これらに限定されない。２．ｃＤＮＡクローンの単離個々のｃＤＮＡクローンのファージミド形態は、ｉｎｖｉｖｏ切除プロセスにより得られた。このプロセスでは、宿主Ｅ．ｃｏｌｉ株（ＸＬ１−ＢＬＵＥ（登録商標）ＭＲＦ）が、ｆ１ヘルパーファージと共感染された。ラムダファージ及びｆ１ヘルパーファージの双方から誘導されたタンパク質は、ラムダ標的ＤＮＡ上の定められた配列から新たなＤＮＡ合成を開始し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド及びｃＤＮＡ挿入断片の全てのＤＮＡ配列を含む小型の１本鎖環状ファージミドＤＮＡ分子を作り出す。このファージミドＤＮＡは、細胞から放出され、精製されて、次いで新鮮な細菌性宿主細胞（ＳＯＬＲ）に再感染するのに使用されて、重鎖のファージミドＤＮＡが産生された。ファージミドがβ−ラクタマーゼに対する遺伝子を保有していることから、新たに形質転換された細菌がアンピシリンを含む培地上で選択された。ファージミドＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ社（９２５９ＥｔｏｎＡｖｅ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ９１３１１）のＱＩＡＷＥＬＬ−８ファスミド精製システムを用いて精製された。この技術は、細菌細胞を溶解し、高度に精製されたファージミドＤＮＡを単離するための高速で信頼性が高く高スループットの方法である。精製樹脂から溶離されたこのＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定及び他の分析走査に適したものである。ＴＨＰ−１ライブラリーのランダム分離により得られたｃＤＮＡ挿入断片は、部分的に配列決定された。このｃＤＮＡは、ＨａｍｉｌｔｏｎＭｉｃｒｏＬａｂ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＲｅｎｏＮＶ）、及び４台のＰｅｌｔｉｅｒＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒｓ（ＰＴＣ２００ｆｒｏｍＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ，ＷａｔｅｒｔｏｗｎＭＡ）、及びＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３７７ｏｒ３７３ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、ＳａｎｇｅｒＦ及びＡＲＣｏｕｌｓｏｎの論文（１９７５；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，９４：４４１ｆ）に記載の方法により配列決定され、ＤＮＡの読み枠が決定された。４．ｃＤＮＡクローン及び演繹されたタンパク質の相同性検索各ｃＤＮＡはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の検索アルゴリズムを、ＩＮＨＥＲＩＴ（商標）６７０配列分析システムに組み込んで用いて、ＧｅｎＢａｎｋの配列と比較を行った。このアルゴリズムにおいては、ＰａｔｔｅｒｎＳｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎＬａｎｇｕａｇｅ（ＴＲＷ社製，ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓＣＡ）を用いて、相同領域の決定を行った。配列比較をどのように行うかを定める３つのパラメータは、ウィンドウサイズ、ウィンドウオフセット、及び誤差許容度であった。これら３つのパラメータの組合せを用いて、問題の配列に対して相同性を有する領域を含む配列をＤＮＡデータベースから検索し、適当な配列に対して初期値と共に点数が付けられた。続いて、これらの相同領域を、ドットマトリクス相同性プロット法を用いて検定し、偶然の一致と真の相同領域とを区別した。相同性検索の結果を表示するのにＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアラインメントを用いた。ペプチド及びタンパク質配列の相同性は、ＩＮＨＥＲＩＴ（商標）６７０配列分析システムを用いてＤＮＡ配列の相同性の検査と似た方法で確認された。ＰａｔｔｅｒｎＳｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎＬａｎｇｕａｇｅ及びパラメータウィンドウを用いて、相同性領域を含むタンパク質配列のデータベースを検索し、相同領域は初期値と共にスコアを付けられて表示された。ドットマトリクス相同性プロット法により検定を行い、有意な相同性領域を偶然の一致から区別した。ＢＬＡＳＴ（ベーシック局部的一致検索ツール）（“ＡｌｔｓｃｈｕｌＳＦ（１９９３）ＪＭｏｌＥｖｏｌ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＳＦｅｔａｌ（１９９０）ＪＭｏｌＢｉｏｌ２１５：４０３−１０”参照）を用いて、局部的な配列の一致を検索した。ＢＬＡＳＴはヌクレオチド及びアミノ酸配列双方の一致をチェックして、配列の類似性を決定する。一致の局部的な性質のために、ＢＬＡＳＴは正確な一致を求めたり、あるいは相同性を同定するのに特に有用である。ＢＬＡＳＴは、ギャップを含まない一致を求めるのに有用なのである。ＢＬＡＳＴアルゴリズム出力の基本ユニットは、Ｈｉｇｈ−ｓｃｏｒｉｎｇＳｅｇｍｅｎｔＰａｉｒ（ＨＳＰ）である。ＨＳＰは、任意の、長さが等しく互いの一致部分が局部的に最大で、一致スコアがユーザがセットしたカットオフスコアまたは閾値スコアに達するかそれを超えるような２つの配列フラグメントからなる。ＢＬＡＳＴを用いる方法により、問題の配列とデータベース配列とのＨＳＰを捜し、発見された一致の統計的な有意性を評価し、ユーザが選択した有意性の閾値を満たす一致のみを知ることができる。パラメータＥはデータベース配列との一致で報告されるものを選択するための統計的有意性の閾値を設定する。Ｅは、データベース検索全体の前後関係の中でのＨＳＰ（若しくはＨＳＰの組）の偶然の一致の期待される頻度上限と解釈される。Ｅを満たすデータベース配列はプラグラムの出力において報告される。ヒト・カテプシンＣホモログＲＰＣの全コード領域のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、第１図に示されている。５．遺伝子の同定及び完全長配列決定ＴＨＰライブラリーのクローンの中からランダムにピックアップし配列決定すると、既知のカテプシンＣ分子に相同性を有するが、明らかに異なっているｒｃｐ配列が見つけられた。ｒｃｐの完全なヌクレオチド配列は翻訳され、枠内の翻訳は第１図に示されている。この配列の予測される全ての可能な３つの翻訳物をスイスプロット及びＰＩＲのようなタンパク質データベースから検索したが、ｒｃｐの可能な翻訳と完全に一致するものは見つけられなかった。第２図に示すのは、ＲＣＰアミノ酸配列と他のラット・カテプシンＣの配列との比較である。これらの分子の実質的な相同領域は、システインプロテアーゼの中で共通のＮＮＳグリコシル化部位_276-278及び触媒三連構造残基Ｃ₂₅₈、Ｈ₄₀₅及びＮ₄₂₇を含む。ＲＣＰの疎水性分析のグラフは第３図に示されている。６．アンチセンス分析ＲＣＰ配列、またはその一部分は、内生ＲＣＰのｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏ発現を阻害するのに用いられる。約２０塩基対からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することについては詳細に説明したが、より大きいｃＤＮＡフラグメントについても同一の手順を用いる。ＲＣＰコード配列に基づくオリゴヌクレオチドは、内生ＲＣＰの発現を阻害するのに用いられる。オリゴ４．０を用いて、相補的オリゴヌクレオチドを保存的５’配列からデザインし、これを用いてプロモータが上流の非翻訳領域に結合するのを防止することにより、転写を阻害するか、またはリボソームがｍＲＮＡに結合するのを防止することによりＲＣＰ転写物の翻訳を阻害する。７．ＥＣ特異的抗体を用いた診断テスト特定のＲＣＰ抗体は、前病状態の診断や、ＲＣＰの量または分布の差によって特徴付けられる慢性または急性の疾病に対する診断において有用である。ＲＣＰはＴＨＰ−１細胞系において初めに発見されたもので、単球を活性化する異常や病状の診断に使用できる。ＲＣＰに対する診断テストにおいては、抗体や、ヒトの体液、組織及びそのような組織からの抽出物においてＲＣＰを検出するための標識を利用する。本発明のポリペプチド及び抗体は、修飾した上で使用されることもあれば、修飾せずに使用されることもある。ポリペプチド及び抗体は、検出可能なシグナルを与える物質と共有結合または非共有結合でそれらに結合させることにより標識される。標識及び接合技術は様々なものが知られており、化学文献あるいは特許明細書の双方において広く記載されている。適当な標識には、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光剤、化学ルミネセンス剤、磁性粒子等がある。このような標識を使用した特許には、例えば米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，３５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号、第４，３６，２４１号等がある。また、組換え免疫グロブリンの産生については、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載されており、本明細書と共に参照されたい。可溶性または膜結合型ＲＣＰを測定するための、該タンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる様々なプロトコールが周知となっている。その例を挙げると、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細胞分析分類法（ＦＡＣＳ）等がある。好適なのは、ＥＣ上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用した２つの部位のモノクローナルベースの免疫検定法であるが、競合的結合検定法を用いてもよい。これらの検定法は“Ｍａｄｄｏｘ，ＤＥｅｔａｌ（１９８３）ＪＥｘｐＭｅｄ１５８：１２１１”他の文献に記載されている。８．特異的抗体を用いた未変性ＲＣＰの精製未変性ＲＣＰまたは組み換えＲＣＰは、ＲＣＰ特異的抗体を用いたイムノアフィニティクロマトグラフィーにより精製される。イムノアフィニティカラムは、抗ＲＣＰ抗体と活性化クロマトグラフィー樹脂を共有結合させることにより構築される。ポリクローナル免疫グロブリンは、免疫血清から硫酸アンモニウム沈殿または固定化プロテインＡ上でのクロマトグラフィーにより免疫血清から調製される（ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。部分的に精製された免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ活性化セファロース（ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のようなクロマトグラフィー樹脂に共有結合で付けられる。抗体は樹脂に結合され、樹脂はブロックされて、誘導体樹脂が製造者の指示に従って洗浄される。このようなイムノアフィニティカラムは、可溶型のＲＣＰを含む細胞から分画を調製することによって行われるＲＣＰの精製において使用される。この調製では、細胞全体または界面活性剤の添加または他の周知の方法により遠心分離法を用いて得られた細胞成分分画を可溶化することによって調製が誘導される。別の形態として、シグナル配列を含む可溶ＲＣＰは、細胞が増殖される培地に使用に供される量だけ分泌される。可溶ＲＣＰを含む調製物は、イムノアフィニティカラムを通されて、このカラムは、ＲＣＰの優先吸収が可能な（例えば界面活性剤が高イオン強度緩衝液の中に存在しているような）条件の下で洗浄される。次いで、このカラムは抗体とＲＣＰとの結合を分裂させるような条件（例えばｐＨが２から３の緩衝液、または高濃度の尿素またはチオシアネートイオンのようなカオトロープ）の下で溶離され、このＲＣＰが収集される。９．ＲＣＰ活性生成されたまたは発現されたＲＣＰの活性は、一定時間の間にＲＣＰがコラーゲンを消化できるように既知の量の酵素と、コラーゲンのような基質材料とを生物学的に許容できる培地の中で混合することによって試験され得る。ＲＣＰのザイモグラフは様々な濃度、好ましくは１０〜１００ｎｇ／μｌでコラーゲンに吸収された非変性ポリアクリルアミドゲルからなり、これはスポットされ、ＲＣＰ活性を示すのに用いられ得る。消化の後、タンパク質に対してゲルを染色することにより、コラーゲンの濃度が減少した（軽くなった）または完全に失われたスポットが示される（Ｐｅａｃｈｅｔａｌ（１９９３）ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ２０８：２４９−５４）。１３．薬物スクリーニング本発明のＲＣＰ及びその生物学的に活性なフラグメントは、様々な薬物スクリーニング技術における化合物のスクリーニングにおいて有用である。このようなテストにおいて用いられるＲＣＰポリペプチドまたはフラグメントは、溶液の中に遊離しているものか、固体の支持体に付着しているものか細胞の表面に支持されているか、あるいは細胞内に存在するものの何れかである。薬物スクリーニングの一方法では、ポリペプチドまたはそのフラグメントを発現する組換え核酸で安定に形質転換される真核細胞または原核細胞の宿主細胞を利用する。薬物は、競合的結合検定法においてこのような形質転換された細胞に対してスクリーニングされる。このような細胞は、生存型であれ固定型であれ標準的な結合実験に使用される。これを用いて例えば、ＲＣＰと試験される薬剤との複合体の形成を測定したり、あるいはＲＣＰと試験される薬剤によって生じた単球等の標的細胞との複合体の削減を検査することができる。従って、本発明は炎症及び疾病を発症し得る任意の薬剤または薬物のスクリーニング方法を提供するものである。これらの方法は、ＲＣＰポリペプチド若しくはそのフラグメントをこのような薬剤に接触させる過程と、（ｉ）ＥＣポリペプチド若しくはフラグメントと薬剤との間の複合体の存在、若しくは（ｉｉ）ＲＣＰポリペプチド若しくはそのフラグメントと細胞との複合体の存在を、周知の方法により検定する過程とを含む。このような競合的結合検定法においては、ＲＣＰポリペプチドまたはそのフラグメントは、当業者に周知の方法により標識される。適当なインキュベーションの後、遊離したＲＣＰポリペプチドまたはフラグメントが、結合した形態で存在するものから分離される。そして遊離した標識または複合体を形成していない標識の量が、特定の薬剤がＲＣＰに結合する能力、またはＲＣＰ／薬剤複合体に干渉する能力の尺度となる。薬物スクリーニングのための他の技術として、ＲＣＰポリペプチド、若しくはそのフラグメントに対する適切な結合親和性を有する複合体を高スループットでスクリーニングすることができるものがあり、その詳細はＧｅｙｓｅｎによる欧州特許出願第８４／０３５６４号明細書（公開１９８４年９月１３日）に記載されており、本明細書と共にこれを参照されたい。この方法を簡単に述べると、たくさんの異なる小さなペプチドのテスト化合物が、固体基板、例えばプラスチックピンまたは他のものの表面上で合成される。ペプチドテスト化合物は、ＥＣポリペプチドと反応させられて、洗浄される。結合されたＲＣＰポリペプチドは次いで周知の方法により検出される。精製ＲＣＰは上述の薬物スクリーニング技術において使用するためのプレート上に直接コーティングされ得る。更に、非中和性抗体を用いてペプチドを捕捉し、それを固体支持体の上に固定化することができる。ＲＣＰポリペプチド、若しくはそのフラグメントへの結合について、テスト化合物とＲＣＰに特異的に結合し得る中和性抗体とが競合する競合的薬物スクリーニングアッセイの利用も本発明の企図するところである。このようにして、この抗体を用いて、１または２以上の抗原決定基がＲＣＰと共通な任意のペプチドの存在を検出することができる。本発明の別の実施例は、請求項８に記載のポリペプチドへの特異的結合親和性（アフィニティ）で複数の化合物をスクリーニングする方法であって、複数の化合物を準備する供給する過程と、ＲＣＰと、複数の化合物のそれぞれを、適切な条件の下で結合できるだけの十分な時間をかけて結合する過程と、ＲＣＰと複数の化合物のそれぞれとの結合を検出して、ＲＣＰに特異的に結合する化合物を同定する過程とを有する。１４．合理的薬物デザイン合理的薬物デザインの目標は、興味の対象である生物学的に活性のポリペプチドの構造的類自体や、例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、若しくは阻害剤のような、それらのポリペプチドが相互作用する小さな分子の構造的な類似体を作り出すことである。ここに例として挙げたものは何れも、ポリペプチドのより活性または安定な形態のものであるか、またはｉｎｖｉｖｏでポリペプチドの機能を強化するか、または阻害する薬剤を形成するのに用いることができる（“ＨｏｄｇｓｏｎＪ（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：１９−２１”参照）。１つの方法においては、目的のタンパク質、またはタンパク質−阻害剤複合体の三次元的構造を、Ｘ線結晶解析、コンピュータによるモデル化、若しくは最も典型的には２つの方法の組合せにより決定する。構造を解明し、分子の活性部位を決定するためにポリペプチドの形状及び電荷が確認されなければならない。ポリペプチドの構造に関する有用な情報は、相同タンパク質の構造に基づいたモデリングにより得ることが可能である。何れの場合においても、構造情報を用いて、カテプシンＣ様の分子の類似体をデザインしたり、あるいは効果的な阻害剤を同定している。合理的薬物デザインの有用な例としては、“ＢｒａｘｔｏｎＳａｎｄＷｅｌｌｓＪＡ１９９２Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３１：７７９６−７８０１”により示された改良活性または安定性を有する分子、または “ＡｔｈａｕｄａＳＢｅｔａｌ１９９３ＪＢｉｏｃｈｅｍ１１３：７４２−７４６”よって示された自然発生ペプチドの阻害剤、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用する分子があり、ここでは上述の両文献を参照されたい。機能的アッセイにより選択された標的特異的抗体を上述のように単離し、次いでその結晶構造を解明することも可能である。この方法では、原則として、続けて行われる薬物デザインにおける基礎となり得るファーマコア（pharmacore）が生み出される。機能的な、薬理学的に活性の抗体に対する抗イデオタイプの抗体（抗ｉｄ）を精製することにより、タンパク質の結晶を精製することにより、タンパク質の結晶解析をバイパスすることが可能である。鏡像の鏡像のように、抗ｉｄの結合部位は、もとの受容体の類似体であることが期待される。次いで、抗ｉｄを用いて、化学的または生物学的に産生されたペプチドのバンクからペプチドを同定し単離することができる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして役立つ。本発明により、Ｘ線結晶解析のような分析的研究を行うのに使用できる十分なポリペプチドが作られ得る。更に、ここに開示したＲＣＰアミノ酸配列の知識を、Ｘ線結晶解析の代わりまたはそれと共に用いられるコンピュータによるモデリング技術に応用することができる。上述の明細書の記載の中で引用された全ての文献及び特許明細書は、本明細書と一体に組み込まれる。上述な方法及びシステムの様々な改変、変更を、請求の範囲の項に記載の本発明の範囲を逸脱することなく当業者は行うことができるであろう。本発明の特定の実施例について説明したが、これは本発明をそのような特定の実施例に限定しようとするものでないことを理解されたい。実際、以下の請求の範囲に記載の本発明の範囲内で、当業者は上述の実施例を様々に変更を加えて実行することができるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ 33/53 33/53 Ｄ 33/566 33/566 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者シールヘイマー、ジェフリー・ジェイアメリカ合衆国カリフォルニア州94022・ロスアルトスヒルズ・ラクレスタ 12555 【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号：２に示す酸配列またはその相補的配列を有するポリペプチドをコードする核酸を含む精製ポリヌクレオチド。２．前記核酸配列が、配列番号：１の配列であることを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．配列番号：２の配列の２２番目と２９番目との間の残基から始まり、３０番目の残基で終わる配列、若しくはその相補的配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む精製ポリヌクレオチド。４．配列番号：２の配列の２２番目と２９番目との間の残基から始まり、４６３番目の残基で終わる配列、若しくはその相補的配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む精製ポリヌクレオチド。５．配列番号：２の配列の２３１番目の残基から始まり、４６３番目の残基で終わる配列、若しくはその相補的配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む精製ポリヌクレオチド。６．請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。７．請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。８．請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。９．請求項６に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。１０．請求項７に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。１１．請求項８に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。１２．請求項２に記載のポリヌクレオチドの非保存フラグメントを含む核酸プローブ。１３．配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成する方法であって、ａ）前記ポリペプチドの発現に適切な条件の下で、請求項６に記載の宿主細胞を培養する過程と、ｂ）前記宿主細胞培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むことを特徴とする配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成する方法。１４．配列番号：２に示すアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド。１５．配列番号：２に示すアミノ酸配列の２２番目と２９番目との間のアミノ酸残基から始まり、２３０番目のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する精製ポリヌクレオチド。１６．配列番号：２に示すアミノ酸配列の２２番目と２９番目との間のアミノ酸残基から始まり、４６３番目のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する精製ポリヌクレオチド。１７．配列番号：２に示すアミノ酸配列の２３１番目のアミノ酸残基から始まり、４６３番目のアミノ酸残基で終わるアミノ酸配列を有する精製ポリヌクレオチド。１８．請求項１４に記載の精製ポリペプチドに対して特異的な抗体。１９．請求項１７に記載の精製ポリペプチドに対して特異的な抗体。２０．請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む、カテプシンＣをコードする核酸配列を検出するための診断的組成物。２１．生物学的試料において、ＲＣＰをコードする核酸配列を検出するための診断テスト方法であって、ａ）配列番号：１の核酸配列と相補的核酸配列との核酸ハイブリダイゼーション複合体を前記試料内で形成するのに適切な条件の下で、配列番号：１の核酸配列、またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチドと前記生物学的試料とを結合する過程と、ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程と、ｃ）前記ハイブリダイゼーション複合体の量と標準値とを比較する過程とを有することを特徴とし、前記ハイブリダイゼーション複合体の異常レベルの存在が炎症に関連する状態と正の相関を有することを特徴とする診断テスト方法。２２．生物学的試料において、ＲＣＰをコードするヌクレオチド配列を検出するための診断テスト方法であって、ａ）核酸増幅に適切な条件の下で、前記生物学的試料とＰＣＲプライマーとを結合する過程であって、前記プライマーが配列番号：１のヌクレオチド配列の非保存領域のフラグメントを含む、該過程と、ｂ）増幅されたヌクレオチド配列を検出する過程と、ｃ）前記生物学的試料における増幅されたヌクレオチド配列の量と標準値とを比較することにより、前記ヌクレオチド配列の量が前記標準値から偏移しているか否かを判定する過程であって、前記ヌクレオチド配列の異常レベルの存在が炎症に関連する状態と正の相関を有している、該過程とを有することを特徴とする診断テスト方法。２３．請求項１４のポリペプチドまたはその一部分に対する特異的結合親和性により複数の化合物をスクリーニングする方法であって、ａ）複数の化合物を準備する過程と、ｂ）適切な条件の下で結合し得るだけの十分な時間をかけて前記複数の化合物のそれぞれとＲＣＰとを結合する過程と、ｃ）前記ＲＣＰが前記複数の化合物のそれぞれに結合したことを検出し、前記ＲＣＰに特異的に結合する化合物を同定する過程とを有することを特徴とする複数の化合物のスクリーニング方法。