JPH10512154A - 膵臓で発現する新規なケモカイン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト膵臓細胞に由来する新規な発現型ケモカイン（ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２）を同定し、コードするアミノ酸配列及びヌクレオチドを提供する。本発明には、ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２をコードするヌクレオチド配列に対するアンチセンス分子、精製ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２を作るための発現ベクター、ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２に特異的に結合し得る抗体、ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２をコードするヌクレオチド配列の検出のためのハイブリダイゼーションプローブまたはオリゴヌクレオチド、ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２の発現のための生物工学的処理をなされた宿主細胞、ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２に特異的に結合し得る抗体またはＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２をコードする核酸分子に基づく、炎症または疾病の診断テスト方法も含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】 膵臓で発現する新規なケモカイン背景技術 膵臓は、胃の裏側の下にある細長い形状の器官で、エキソクリン組織とエンド クリン組織とからなる。下側方向に順番に、エキソクリン部分は、葉、小葉、小 胞として知られている機能的腺房ユニットに分かれている。全ての腺房は最終的 に、十二指腸に流れ込む前に、肝臓からの胆管と結合する主膵管の中に流れ込む 、腺房細胞は膵臓の８０％を占め、消化を助ける酵素の不活性型及び活性型の何 れかを分泌する。小導管の上皮細胞は、タンパク質、炭水化物及び脂肪の消化の ための酵素と共に、大量の重炭酸イオン及び水を分泌し、これらが胃から十二指 腸に入るときに酸性キームスを中性化する。 最も重要で、かつ量の多いタンパタ質分解酵素は、トリプシン、キモトリプシ ン、及びカルボキシペプチダーゼである。セリンプロテアーゼ、トリプシン、及 びキモトリプシンは、もとのタンパク質及び部分的に消化されたタンパク質を異 なる大きさのポリペプチドに分け、更に、カルボキシペプチダーゼがポリペプチ ドをアミノ酸に分解する。核酸を分解するヌクレアーゼ及びセリンプロテアーゼ でもあるエラスターゼのいくつかは、膵液にも含まれている。 腸内で炭水化物を消化するための主たる酵素は、膵臓アミラーゼである。これ は、デンプン、グリコーゲン、及び他の非セルロース系炭水化物を加水分解して 、二糖類及び三糖類を形成する。脂肪の消化のための主たる酵素は、膵臓リパー ゼ、コレステロールエステラーゼ、及びホスホリパーゼである。膵臓リパーゼは 、中性脂肪を脂肪酸及びモノグリセ リドに加水分解する。コレステロールエステラーゼは、コレステロールエステル を加水分解し、ホスホリパーゼは、リン脂質から脂肪酸分子を取り除く。 腺房の分泌を制御する４つの分子は、アセチルコリン及び種々のホルモン、ガ ストリン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、及びセクレチンである。アセチルコリ ンは副交感神経の迷走神経及び他のコリン作動する神経終末から分泌され、ガス トリンは胃の細胞から分泌され、ＣＣＫとセクレチンは上側小腸から分泌される 。消化管ホルモン（ＧＩホルモン）は、血液に吸収されて膵臓に運ばれ、そこで 腺房を刺激して酵素を分泌させ、また腺管細胞を刺激して炭化水素ナトリウムと 水を分泌させる。この水により膵臓の酵素は十二指腸に流される。 エンドクリン膵臓はランゲルハンス島からなり、ランゲルハンス島の細胞は、 エキソクリン小胞から分離され、膵臓全体に分布している。島を構成する様々な タイプのエンドクリン細胞の機能は、タンパク質、炭水化物、及び脂肪の代謝に 関与するホルモンを分泌する。 主なエンドクリン細胞はα、β、及びδ細胞であり、その他の細胞として、Ｃ 細胞、ＥＣ細胞、及びＰＰ細胞がある。島細胞集団の約１５％はα細胞で、これ は島の周辺部に存在しており、ホルモンであるグルカゴンを分泌する。島細胞集 団の約７０％を占めるのはβ細胞で、これは島の中央部に存在しており、ホルモ ンであるインスリンを分泌する。δ細胞は集団の約１０％を占め、細胞の近傍に 存在し、二種類のホルモン、ソマトスタチン及び血管作用性腸ペプチド（ＶＩＰ ）を分泌する。Ｃ細胞、ＥＣ細胞、及びＰＰ細胞は、島細胞集団の残りの５％を 構成する、Ｃ細胞の機能は未知であり、ＥＣ細胞及びＰＰ細胞は各々、セロトニ ン及び膵ポリペプチドを分泌する。 膵臓の炎症及び膵臓炎は、臨床的な診断基準により急性と、慢性の何 れかに分類され得る。急性膵臓炎は治療することにより治癒可能なことが多く、 その機能も完全に回復させることが可能である。慢性膵臓炎の場合には、永久に 障害が残る事が多い。急性の炎症を引き起こす機構は正確にはわかっていない。 しかし、その原因となるものを挙げると、重要な順にアルコール摂取、胆管の病 気、手術による障害、及び遺伝性膵臓炎がある。理論の一つでは、自己消化、即 ち十二指腸内でなく膵臓内でのタンパク質分解酵素の早発性の活性化により、膵 臓炎が引き起こされる。内毒素、外毒素、ウイルス感染、虚血、酸素欠乏症、及 び直接の外傷を含む他の何れの因子によってもプロ酵素の活性化はなされ得る。 更に、膵管の内部またな外部の封鎖によっても膵臓内での膵液の蓄積が起こり、 細胞を傷つけることになる。 他の組織の炎症の場合同様に、単球、マクロファージ、好中球、及び好酸球を 含む白血球が、膵臓の炎症を起こした領域に浸潤する。それらの主な役割は炎症 部位を浄化することであるが、マクロファージは、組織の破壊に寄与する強力な 酸化剤及びタンパク質分解酵素を産生し得る。また、白血球は他の細胞をその部 位に動員するサイトカイン類も分泌する。 白血球が適切な目的地に進み他の細胞と相互作用する際の重要な調節プロセス の研究は目下進行中である。血液から損傷組織または炎症組織への白血球の移動 を説明するモデルは、現在以下のようなものとされている。第１ステップは、白 血球が血管壁の内皮細胞をローリングし接着する。この動きは、セレクチンとそ のリガンドとの過渡的な相互作用により媒介されている。第２ステップは、イン テグリン及びそのリガンドにより媒介される、より安定的な白血球−内皮細胞相 互作用を促進する細胞の活性化である。このより強力でより安定な接着により、 白血球の血管外遊出及び組織への移入という最終ステップが促進される。 ポリペプチドサイトカインのケモカインファミリーは、異なる炎症若しくは疾 病状態における白血球動員を説明するために必要不可欠の細胞特異性を有してい る。第１に、ケモカインは内皮細胞上の特定の接着分子の発現を媒介する。第２ に、ケモカインは、特定の細胞タイプを活性化する化学誘因物質因子の勾配を作 り出す。更に、ケモカインは特定の細胞タイプの増殖を刺激し、特定のレセプタ を保有する細胞の活性化を調節する。これらの作用の何れもが、標的細胞に対す る高い特異性を説明している。 ケモカインは、一般に長さ約７０〜１００アミノ酸、分子量８〜１１ｋＤで、 １〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲で活性な小型のポリペプチドである。初めに、ケモ カインは炎症組織から単離、精製され、その生物活性に対して特徴づけられた。 最近では、ケモカインは、分子クローニング技術を通して発見されてきており、 機能分析と構造分析の両面から特徴づけられている。 各ケモカインは、成熟細胞における４−システインモチーフを通して近縁関係 を有し、この近縁関係は主として初めの２つのシステイン残基の間隔に基づいて いる。現在、各種ケモカインは２つのファミリー、即ちＣ−Ｘ−Ｃケモカイン（ α）及びＣ−Ｃケモカイン（β）の何れか一方に割り当てられている。例外は存 在するが、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインは、好中球及び繊維芽細胞を活性化し、Ｃ−Ｃ ケモカインは単球／マクロファージ、好塩基球、好酸球、Ｔ細胞他を含むより多 様な標的細胞のグループに作用する。これらのケモカインの両ファミリーは多種 多様なタイプの細胞により合成され、その概要は“Ｔｈｏｍｓｏｎ Ａ．（１９ ９４）Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， ２ｄ Ｅｄ． Ａｃａ ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ．”に記載されている。ケモカインのこの２つ のグループについては後に再び説明する。 現在、Ｃ−Ｃケモカインについて書かれたものは比較的少なく、また、そのＮ 末端プロセシングの数は、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインより少ないようである。既知の ヒト及び／またはネズミのＣ−Ｃケモカインについて、以下説明する。マクロフ ァージ炎症性タンパク質α及びβ（ＭＩＰ−１α及びβ）は、初めに、刺激され たマウスのマクロファージ株細胞から精製され、通常の組織に注入されると炎症 反応を誘発した。そして、少なくとも３つの異なる非対立遺伝子が、ヒトＭＩＰ −１αをコードし、異なる７つの遺伝子がＭＩＰ−１βをコードする。 ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βは６８〜６９アミノ酸からなり、これらのアミ ノ酸の約７０％が、その酸性、成熟分泌型について同一である。これらのタンパ ク質は双方共に、刺激されたＴ細胞、Ｂ細胞、及び単球においてミトゲン、抗− ＣＤ３、及び内毒素に応じて発現され、また両ポリペプチドはヘバリンを結合す る。両分子は単球を剌激し、ＭＩＰ−１αはＴ細胞のＣＤ８サブセット及び好酸 球を化学誘因し、ＭＩＰ−１βはＴ細胞のＣＤ４サブセットを化学誘因する。マ ウスにおいては、これらのタンパク質が骨髄造血を刺激することが知られている 。 Ｉ−３０９はヒトγ−δＴ細胞株からクローニングされ、マウスからクローニ ングされたＴ細胞活性化遺伝子３（ＴＣＡ３）と４２％のアミノ酸同一性を示し ている。これらの２つのタンパク質の５′フランキング領域の間には、かなりの レベルのヌクレオチド相同性が存在しており、他のケモカインにおいては見られ ない特別なシステイン残基の対を共通に持っている。このような類似性は、Ｉ− ３０９とＴＣＡ３とが、時間の経過のうちに配列及び機能が分かれた種のホモロ グであることを示唆している。 ＲＡＮＴＥＳは、Ｃ−Ｃケモカインの一種であって、発現されるのはＴ細胞（ Ｂ細胞では発現されない）、血小板、ある種の腫瘍細胞株、及 び刺激されたリウマチ滑膜線維芽細胞においてである。後者においては、ＩＬ（ インターロイキン）１及びＩＬ４、形質転換神経因子及びインターフェロンγに より調節される。Ｔ細胞からクローニングされたｃＤＮＡは、Ｎ結合型グリコシ ル化を欠いた基本的な８ｋＤのタンパク質をコードし、白血球、単球、好塩基球 、及び好酸球に影響を与え得る。ＲＡＮＴＥＳのｍＲＮＡの発現は、Ｔ細胞刺激 により実質的に低減する。 単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１）は、７６アミノ酸のタンパク質であって 、様々な媒介物の刺激に応じてほとんど全ての細胞及び組織において発現される ようである。しかし、ＭＣＰ−１の標的は、単球及び好塩基球に限定されており 、そこでＭＣＰ−１は、ＭＣＰ−１レセブタ、Ｇタンパク質結合カルシウム流動 （flux）を誘発する（Ｃｈａｒｏ Ｉ， ｐｅｒｓｏｎａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｃ ａｔｉｏｎ参照）。他の２つの近縁関係にあるタンパク質、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ −３は、ヒト骨肉腫細胞株から精製された。ＭＣＰ−２及びＭＣＰ−３はＭＣＰ −１とそれぞれ６２％及び７３％のアミノ酸配列の同一性を有し、単球に対する その化学誘因物質特異性を共通のものとしている。 炎症組織または患部組織における異常の診断のための現在の技術は、主に臨床 的な症状の観察、若しくは人体組織または体液の、ホルモン、ポリペプチドまた は様々な代謝物質についての血清学的な分析に大きく依存している。患者は、病 気または腫瘍形成の初期の段階では何の症状も示さないことが多い。更に、血清 学的な分析では、侵入性の疾病の症状と、それと重複または非常に類似した範囲 を有する遺伝子症状との区別が、必ずしもつくわけではない。従って本発明のケ モカインの使用を含む新たな診断技術の開発により、早期の正確な診断が可能に なり、分子病原（melecular pathogenesis）に対する理解が進み、それを用いた より効果的な治療法の開発がもたらされることになろう。 膵臓について説明している文献には、“Ｇｕｙｔｏｎ ＡＣ（１９９１） Ｔ ｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， ＷＢ Ｓａ ｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ”及び“Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｍｅ ｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｒａｈｗａｙ， Ｎ Ｊ”がある。ケモカイン分子について説明している文献には、“Ｓｃｈａｌｌ ＴＪ （１９９４） Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ： Ｔａｒ ｇｅｔｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｉｎ ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ ＭＡ ｐｐ １８０−２７０”及び“Ｐａｕｌ ＷＥ（１９９３）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ Ｅｄ． Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ ｐｐ ８２２−８２６”がある。発明の開示 本発明は、二種類の新規なヒト膵臓タンパク質をコードする独特のヌクレオチ ド配列を提供する。この新たな遺伝子は、膵臓で発現されることから膵臓発現型 ケモカイン、または符号でｐａｎｅｃ−１及びｐａｎｅｃ−２（インサイト社ク ローンＮｏ．２２３１８７及びＮｏ．２２６１５２）と称するものであり、Ｃ− Ｃケモカインファミリーに属し、符号ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２で表さ れるポリペプチドをコードする。 また本発明は、ｐａｎｅｃ−ＩＤＮＡ及びｐａｎｅｃ−２ＤＮＡ、またはその フラグメント、またはオリゴマーによる、試料またはその抽出物のテスト過程を 有する生理学的または病理学的損傷状態（compromise)の診断テスト方法を含む 。更に、本発明には、ｐａｎｅｃ−１及びｐａ ｎｅｃ−２に対するアンチセンスＤＮＡ、ｐａｎｅｃ−１及びｐａｎｅｃ−２を 含むクローニングベクターまたは発現ベクター、ｐａｎｅｃ−１及びｐａｎｅｃ −２を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞または生物、精製ＡＤＥＣ、 宿主細胞からの精製ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２の産生及び回収方法、及 び精製タンパク質ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２そのものも含まれる。図面の簡単な説明 第１図は、ｐａｎｅｃ−１のヌクレオチド配列、及び膵臓発現型ケモカインＰ ＡＮＥＣ−１の予測アミノ酸配列を示した図である。 第２図は、ｐａｎｅｃ−２のヌクレオチド配列、及び膵臓発現型ケモカインＰ ＡＮＥＣ−２の予測アミノ酸配列を示した図である。 第３図は、Ｃ−Ｃファミリーの他のヒトケモカインとＰＡＮＥＣ−１及びＰＡ ＮＥＣ−２とのアミノ酸アラインメントを示した図である。ここに示したアライ ンメントは、ＤＮＡｓｔａｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ社（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）の 多重配列アラインメントプログラム（multisequence alignment program）を用 いて作製されたものである。 第４図は、予測アミノ酸配列及び組成に基づくＰＡＮＥＣ−１の疎水性の分析 結果を示した図である。 第５図は、予測アミノ酸配列及び組成に基づくＰＡＮＥＣ−２の疎水性の分析 結果を示した図である。 第６図は、ヒトＣ−Ｃケモカインの近縁関係樹形図である。系統樹は、ＰＡＭ ２５０残基重量表を利用したＣｌｕｓｔａｌ法を用いるＤＮＡＳＴＡＲ ｓｏｆ ｔｗａｒｅ系統樹プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｉｎｃ． Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）により作製された。発明の実施の形態 用語の定義 本明細書において、“膵臓発現型ケモカイン”またはＰＡＮＥＣなる用語は、 配列番号：１及び配列番号３のｃＤＮＡから転写されたｍＲＮＡによりコードさ れるポリペプチド、自然発生ＰＡＮＥＣ若しくはその活性フラグメントを意味す る。 本明細書において、“活性”なる用語は、自然発生ＰＡＮＥＣの生物学的及び ／または免疫学的活性を保持しているＰＡＮＥＣの形態を意味する。 本明細書において、“自然発生ＰＡＮＥＣ”なる用語は、生物工学的処理を受 けていないヒト細胞により生成されたＰＡＮＥＣを意味し、より具体的には、ア セチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（lipidation）及 びアシル化を含む翻訳語修飾されたポリペプチドから生成される様々なＰＡＮＥ Ｃの形態を表現する用語である。 本明細書において、“誘導体”なる用語は、ユビキチン化、ラベリング（例え ば放射性核種や、様々な酵素修飾による標識付け）、ペジレーション（ポリエチ レングリコールによる誘導体化）のような化学的修飾、若しくは例えばオルニチ ンのような通常はヒトタンパク質において自然発生しないアミノ酸の化学合成に よる挿入、置換によって得られた自然発生ＰＡＮＥＣに由来するポリペプチドを 意味する。 本明細書において、“組換え変異体”なる用語は、組換えＤＮＡ技術を用いて 生成されるアミノ酸の挿入、除去、及び／または置換により自然発生ＰＡＮＥＣ とは異なるものとなった任意のポリペプチドを意味する。興味の対象となる活性 、例えば細胞接着性、走化性を損なわずに置換、付加、あるいは除去され得るア ミノ酸残基を決定するためには、特定のＰＡＮＥＣの配列と相同体のサイトカイ ンの配列とを比較し、相同性の高い領域でのアミノ酸配列の変化の数を最小にす ればよい。 アミノ酸の置換では、例えばロイシンからイソロイシンまたはバリン への置換、アスパルテートからグルタメートへの置換、スレオニンからセリンへ の置換、即ち保存的アミノ酸置換のような１個のアミノ酸が構造的及び／または 化学的特性がそれに類似した他の１個のアミノ酸で置換されるのが好ましい。ア ミノ酸の挿入または除去は、通常１〜５個のアミノ酸の範囲で行われる。組換え ＤＮＡ技術を用いてＰＡＮＥＣのアミノ酸の挿入、除去、または置換を体系的に 行い、得られた組換え変異体の活性を検定することにより、許容される変異体が 実験的に決定され得る。 必要ならば、“シグナル配列またはリーダー配列”を細胞膜を通してポリペプ チドに向けることができる。このような配列は、本発明のポリペプチド上に自然 に存在するか、あるいは組換えＤＮＡ技術により異種タンパク質源から得られる 。 本明細書において、ポリペプチド“フラグメント（断片）”、“部分”、また は“セグメント”なる用語は、少なくとも約５個のアミノ酸、多くは約７個のア ミノ酸、典型的には約８〜１３個のアミノ酸、実施例によっては約１７個または それ以上のアミノ酸からなるアミノ酸の伸展（ストレッチ）を意味する。活性に するためには、ＰＡＮＥＣ断片は、生物学的及び／または免疫学的活性を示すに 十分な長さを有するものでなければならない。 本明細書において、“オリゴヌクレオチド”またはポリヌクレオチド“フラグ メント”、“部分”、または“セグメント”なる用語は、近縁関係にあるｍＲＮ ＡまたはＤＮＡ分子を増幅、若しくは単に明らかにするための、ポリメラーゼ連 鎖反応（ＰＣＲ）法や、当業者には周知の様々なハイブリッド形成法におけるプ ライマーとして使用するのに十分な長さを有するヌクレオチド残基のストレッチ を意味する。 本発明には、ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２をコードする組換え 核酸分子で形質転換された細胞、及び天然または組換えポリペプチド源から得ら れた精製ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２が含まれる。ＰＡＮＥＣ−１及びＰ ＡＮＥＣ−２ポリペプチドを単離するための様々な方法は、当業者の周知となっ ている。例えばこのようなポリペプチドの精製のために、本発明の提供する抗体 を用いたイムノアフィニティクロマトグラフィーを利用することができる。タン パク質精製のための他の周知の方法は、例えば、“Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ Ｍ （ １９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ １８２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ”及び“Ｓｃｏｐｅｓ Ｒ （１９８２） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎ ｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ ， ＮＹＣ”に記載されており、これらの文献を本明細書と共に参照されたい。 本明細書において、“組換え”なる用語は、組換えＤＮＡ技術を用いて調製さ れるＰＡＮＥＣ−１またはＰＡＮＥＣ−２をコードするポリヌクレオチドを意味 する。ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２をコードするＤＮＡも対立形質の変異 体または組換え変異体、及びその突然変異体を含み得る。 “オリゴヌクレオチド”または“核酸プローブ”は、本発明のＰＡＮＥＣ−１ 及びＰＡＮＥＣ−２をコードするｃＤＮＡ配列に基づいて調製される。オリゴヌ クレオチドは、少なくとも約１５個のヌクレオチド、通常は約２０ヌクレオチド からなるＤＮＡ配列の部分を含む。核酸プローブは、約６ｋｂより少ない塩基対 数の、通常は約１ｋｂ未満の配列の部分からなる。偽陽性を除去するべく適当な テストを行った後、これらのプローブは、細胞または組織内にＰＡＮＥＣ−１及 びＰＡＮＥＣ−２をコードするｍＲＮＡが存在するか否かを判定するため、また は“Ｗａ ｌｓｈ ＰＳ ｅｔ ａｌ（１９９２）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ． １：２４１−２５０”に記載のように染色体ＤＮＡから類似した核酸配列を単離 するのに使用され得る。 プローブは、自然発生の、または組換えの一本鎖または二本鎖核酸から誘導さ れるか、若しくは化学的に合成され得る。プローブの標識化は、ニックトランス レーション法、クレノウフィルイン反応法、ＰＣＲ法、または当分野において周 知の他の方法を用いて行われ得る。本発明のプローブを調製し、標識する方法は 、“Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ Ｅｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ”または“Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ ２， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ”に詳しく述べられており、これらの文献を本明細書と共に参照 されたい。 別の形態として、本発明のポリペプチド、またはそれと近縁関係にあるポリペ プチドをコードする組換え変異体は、当業者に周知の技術を用いて、遺伝暗号の “冗長性”を利用することにより合成、または同定され得る。様々な切断部位を 作り出すサイレント変化のような、様々なコドン置換を導入することで、プラス ミドやウィルスベクターへのクローニング、または特定の原核細胞形または真核 細胞形における発現を最適化することができる。また、突然変異を導入すること によって、ポリペプチドの特性を変更し、リガンド結合親和力、鎖間親和力、ま たはポリペプチド変性またはターンオーバー速度を変えることもできる。発明の詳細な説明 本発明は、膵臓内で高度に発現される新規なＣ−Ｃケモカインファミ リーＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２を同定する独特なヌクレオチド配列を提 供する。ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２は膵臓において特異的に発現するの で、核酸（ｐａｎｅｃ１及びｐａｎｅｃ２）、ポリペプチド（ＰＡＮＥＣ−１及 びＰＡＮＥＣ−２）及びＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２に対する抗体は、膵 臓に影響を及ぼす疾病や炎症がおきた場合のケモカインの産生に基づく診断アッ セイにおいて使用することができる。ＰＡＮＥＣ−１かＰＡＮＥＣ−２の何れか が過剰に発現することにより、タンパク質分解酵素及び組織の損傷または破壊を もたらし得る他の分子の産生によって、単球、マクロファージ、好中球、好酸球 、Ｔ細胞、及び／またはケモカインに応答して活性化する他の細胞の活性化を引 き起こすことがある。従って、ＰＡＮＥＣの過剰な発現に対する診断テストを行 うことにより、診断が速やかになり、ウイルスやバクテリア感染、外傷による機 械的障害、膵臓に発症する遺伝病、胆道の疾病、白血病やリンパ腫のような浸潤 性の疾病、または器官の機能に影響する他の生理学的及び病理学的問題によって 引き起こされる異常な状態の適切な治療を行うことができる。 ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２（またはその相補配列）をコードするヌク レオチド配列は、分子生物学の分野における当業者には周知の技術において数多 くの用途を有する。これらの技術には、ハイブリダイゼーションプローブとして の使用、ＰＣＲ用オリゴマーとしての使用、染色体及び遺伝子マッピングにおけ る使用、ＰＡＮＥＣ-１及びＰＡＮＥＣ-２の組換え体産生における使用、及びア ンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡの、またはこれらの化学的類似体等の産生におけ る使用が含まれる。ここに開示するＰＡＮＥＣ-１及びＰＡＮＥＣ-２をコードす るヌクレオチドの使用方法は、周知の技術の一例であり、当業者に周知の何らか の技術にその使用を限定しようとするものではない。更に、未だ開発され ていない分子生物学的技術であっても、それが例えばトリプレット遺伝暗号及び 特異的な塩基対相互作用のような既知のヌクレオチド配列の特性に基づく技術で ある限り、ここに開示するヌクレオチド配列を使用することができる。 遺伝暗号の同義性（degeneracy）の結果、そのヌクレオチド配列がＰＡＮＥＣ をコードするもので限り、既知のヌクレオチド配列及び自然発生遺伝子のヌクレ オチド配列に対する相同性を有する最小限のヌクレオチド配列を有するヌクレオ チド配列を含む、様々なＰＡＮＥＣをコードするヌクレオチド配列が産生され得 る、ということは当業者には理解されよう。本発明は、より具体的には可能なコ ドン選択に基づいて組合せを選択することにより作られ得る全ての可能なヌクレ オチド配列をその範囲に含んでいる。これらの組合せは、自然発生ＰＡＮＥＣの ヌクレオチド配列に対して適用されるような標準的なトリプレット遺伝暗号に基 づいて作られる。また、このような全ての変異体は、具体的にここで開示された ものと考えられたい。 ＰＡＮＥＣ-１及びＰＡＮＥＣ-２及び／またはそれらの変異体をコードするヌ クレオチド配列は、厳格な条件の下で自然発生ＰＡＮＥＣ遺伝子のヌクレオチド 配列とハイブリッド形成可能なものであるのが好ましいが、実質的に異なるコド ン使用頻度をプロセシングするＰＡＮＥＣ-１及びＰＡＮＥＣ-２またはそれらの 誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。コドン の選択は、特定の原核細胞または真核細胞の発現宿主におけるペプチドの発現速 度を高めるように選択することができ、このときこの発現速度は、その宿主にお ける特定のコドンの使用頻度に基づいて決まる。本発明のＰＡＮＥＣ-１及びＰ ＡＮＥＣ-２及び／またはそれらの誘導体をコードするヌクレオチド配列を、こ のコードされたアミノ酸配列を変えることなく実質的に変化させる他 の理由は、より望ましい特性、例えば自然発生ヌクレオチド配列から産生された ものより長い半減期を有するＲＮＡ転写物を産生するためである。 ＰＡＮＥＣ-１及びＰＡＮＥＣ-２をコードするヌクレオチド配列は、完全に確 立された組換えＤＮＡ技術（“Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ． （１９８ ９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ ａｎｕａｌ， ２ｄ Ｅｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ ”参照）により様々な他のヌクレオチド配列と結合してもよい。ｐａｎｅｃに結 合するのに有用なヌクレオチド配列には、例えば従来より周知のプラスミド、コ スミド、λファージ誘導体、ファージミド等のクローニングベクターの組合せが 含まれる。興味の対象であるベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プロ ーブ産生ベクターシークエンシングベクター等が含まれる。一般に、興味の対象 となるベクターは、少なくとも１つの生物において複製起点機能を発揮する便利 な制限エンドヌクレアーゼ検知サイト、及び宿主細胞用として選択可能なマーカ ーを含み得る。 本発明の別の実施例では、ＰＡＮＥＣ-１及びＰＡＮＥＣ-２をコードする自然 発生ヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能なｐａｎｅｃ１またはｐａｎｅｃ ２特異的核酸ハイブリダイゼーションプローブが提供される。このようなプロー ブは、ケモカインをコードする配列に類似した配列を検出するのに用いることも でき、Ｃ−Ｃをコードする配列のヌクレオチドの少なくとも５０％を含むのが好 ましい。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、配列番号：１のヌクレオ チド配列、または自然発生ｐａｎｅｃのプロモータ、エンハンサー要素、及びイ ントロンを含むゲノムの配列に由来するものであり得る。ハイブリダイゼーショ ンプローブは、様々なリポーターグルーブにより標識され得るが、この リポーターグループには、³²Ｐまたは³⁵Ｓのような放射性核種、若しくはアルカ リホスファターゼのような酵素標識が含まれ、これらはアビジン／ビオチン結合 系を介してプローブに結合する。 米国特許第４，６８３，１９５号、第４，８００，１９５号、及び第４，９６ ５，１８８号明細書に記載されているようなＰＣＲ法の実施において、ＰＡＮＥ Ｃ-１及びＰＡＮＥＣ-２をコードするヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオ チドの別の使用方法がある。このようなＰＣＲにおいて使用されるブローブは、 組換えにより得られたものであるか、化学的に合成されたものであるか、若しく は両者の混合であり得、また、診断的な使用に供される分散したヌクレオチドま たは近縁関係にあるゲノム配列の同定に用いられる可能な変性配列のプールを含 み得る。 ｐａｎｅｃＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブを産生す るための他の方法には、ｍＲＮＡプローブの産生のためのベクターへの、ＰＡＮ ＥＣ-１及びＰＡＮＥＣ-２及びＰＡＮＥＣ-１及びＰＡＮＥＣ-２誘導体をコード する核酸配列のクローニングが含まれる。このようなベクターは従来より周知で あり、または市販されており、例えばＴ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの ような適当なＲＮＡポリメラーゼ及び適当な放射性の標識をなされたヌクレオチ ドを添加することによりｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するのに使用 することができる。 現在完全に化学合成によりＰＡＮＥＣ-１及びＰＡＮＥＣ-２及びＰＡＮＥＣ- １及びＰＡＮＥＣ-２誘導体をコードするＤＮＡ配列、またはその部分を産生す ることが可能であり、その後、従来より周知の試薬、ベクター、及び細胞を用い て様々な市販のＤＮＡベクターに挿入することができる。化学合成を用いて、ｐ ａｎｅｃポリヌクレオチド配列若しくはその部分に突然変異を起こさせることも 可能である。 このヌクレオチド配列を用いて、ＰＡＮＥＣ-１及びＰＡＮＥＣ-２の発現レベ ルの異常に関連する炎症及び疾病の検出のためのアッセイを構築することができ る。このヌクレオチド配列は、従来より周知の方法で標識した上で、ハイブリッ ド形成条件の下で患者の体液または組織の試料に添加することができる。インキ ュベーション時間の経過後、ヌクレオチドが酵素で標識されていた場合には、所 望に応じて染料（または他の展開剤を必要とする標識）を含有する適合性の液体 で試料が洗浄される。この適合性の液体を洗い流した後、染料を定量し、標準値 と比較する。染料の量が著しく多い場合には、このヌクレオチド配列は試料とハ イブリッド形成したことになる。ｐａｎｅｃが異常なレベルで存在している場合 には、このアッセイにより炎症及び／または疾病の存在が確認されたことになる 。 ｐａｎｅｃ−１またはｐａｎｅｃ−２のヌクレオチド配列を用いて、その遺伝 子のマッピングのためのハイブリダイゼーションプローブを構築することができ る。ここに開示するヌクレオチド配列の染色体及び染色体の特定の領域へのマッ ピングを、周知の遺伝子及び／または染色体マッピング技術を用いて行うことも できる。このような技術には、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、既知の 染色体マーカーに対するリンケージ分析、既知の染色体に対して特異的なライブ ラリまたはフローソートされた染色体調合物を用いたハイブリダイゼーションス クリーニング等が含まれる。染色体延展（chromosome spread）の蛍光ｉｎ ｓ ｉｔｕハイブリダイゼーション技術については、他の文献、即ち“Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ （１９８８） Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ： Ａ Ｍａ ｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐ ｒｅｓｓ， ＮＹＣ”に記載されている。 染色体調合物の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイセーション及び他の 物理的染色体マッピング技術は、追加的な遺伝子地図データと関連付けられ得る 。遺伝子地図データの例としては、“ｔｈｅ １９９４ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｓｓ ｕｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２６５：１９８１ｆ）”がある。物理的染色体地 図上でのｐａｎｅｃをコードする遺伝子の位置と特定の疾病（若しくは特定の疾 病に対する素因）との間の相関関係は、この遺伝病に関連するＤＮＡの領域の範 囲を特定するための助けとなる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、健常者の 遺伝子配列と、キャリアまたは遺伝病の保因者の遺伝子配列との相違を検出する ことができる。 ＰＡＮＥＣ-１及びＰＡＮＥＣ-２をコードするヌクレオチド配列を用いて、周 知の組換えＤＮＡ技術を利用して精製ＰＡＮＥＣ-１及びＰＡＮＥＣ-２を作り出 すことができる。遺伝子を単離した後、その遺伝子を発現させる方法を記載した 文献は数多くあるが、その例としては、“Ｇｏｅｄｄｅｌ （１９９０） Ｇｅ ｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎ ｄ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ． Ｖｏｌ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ ｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ”がある。ＰＡＮＥＣ-１及びＰＡＮＥＣ-２は、原核 細胞または真核細胞の何れかの様々な宿主細胞内において発現され得る。宿主細 胞は、ｐａｎｅｃヌクレオチド配列が内生である種と同一の種、あるいは異なる 種の何れからでも得ることができる。組換えＤＮＡ技術によってＰＡＮＥＣ-１ 及びＰＡＮＥＣ-２を産生することの利点には、精製用として高濃度に濃縮され たタンパク質源が得られること、及び精製のための簡単な手順が利用できるよう になることがある。 ＰＡＮＥＣ-１及びＰＡＮＥＣ-２をコードするＤＮＡによって形質転換された 細胞は、ケモカインの発現及び細胞培地からのタンパク質の回収に適切な条件の 下で培養され得る。組換え細胞により産生されたＰＡ ＮＥＣ-１またはＰＡＮＥＣ-２は、使用される特定の遺伝子構造に応じて、分泌 されるか、あるいは細胞内に保持され得る。一般に、組換えタンパク質は、分泌 される形態で準備しておくのがより便利である。精製のステッブは、使用される 産生プロセスの性質及び産生される特定のタンパク質の性質に基づいて決まる。 組換え体の産生に加えて、固相技術を用いた直接のペプチド合成によりＰＡＮ ＥＣ-１またはＰＡＮＥＣ-２フラグメントを産生することもできる。（“Ｓｔｅ ｗａｒｔ ｅｔ ａｌ （１９６９） Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄ ｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ． Ｓａｎ Ｆｒａｎ ｃｉｓｃｏ； Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｒ （１９６３） Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ８５：２１４９−２１５４”参照）。ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合 成は、手作業、あるいは機械により自動的に行うことができる。自動的な合成は 、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ） を製造業者の指示に従って用いることにより行うことができる。ＰＡＮＥＣ-１ 及びＰＡＮＥＣ-２の様々なフラグメントを個別に化学合成し、化学的な方法に より結合することによってＰＡＮＥＣの全体を形成することもできる。 抗体の誘発において使用するためのＰＡＮＥＣ-１またはＰＡＮＥＣ-２は生物 学的活性を有する必要はないが、免疫活性を有していなければならない。ＰＡＮ ＥＣ特異的抗体の誘発において使用するためのペプチドは、そのペプチドが、自 然発生ＰＡＮＥＣの一部分の三次元的構造を保持しているような少なくとも５個 、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含み、タンパ ク質のアミノ酸配列の部分を模しているものであるべきであり、ＰＡＮＥＣ-１ 及びＰＡＮＥＣ-２ の類似した小さい自然発生分子の全アミノ酸配列を含んでいてもよい。 ＰＡＮＥＣのアミノ酸配列の短いストレッチは、ヒザラガイヘモシアニン（ＫＬ Ｈ）や抗体産生に使用されるキメラ分子のような他のタンパク質のストレッチと 融合され得る。 ＰＡＮＥＣ-１及びＰＡＮＥＣ-２に対して特異的な抗体は、適当な動物にポリ ペプチドまたは抗原性の断片を接種することにより産生され得る。抗体が、ポリ ペプチドのエピトープに対して産生され、そのタンパク質の全体または一部分に 結合するならば、その抗体はＰＡＮＥＣ-１及びＰＡＮＥＣ-２に対して特異的で あると言える。抗体の誘発は、動物への注射により生ずる免疫反応の刺激作用に よるもののみならず、合成抗体、または組換え免疫グロブリンライブラリ（“Ｏ ｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ （１９８９） ＰＮＡＳ ８６：３８３３−３８３ ７またはＨｕｓｅ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１２ ７５−１２８１”参照）またはリンパ球集団のｉｎｖｉｔｒｏ刺激作用によって も起こる。現在の技術（“Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅiｎ （１９９ １） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９”）では、抗体形成の原理に基づ き、高度に特異的に結合する多数の試薬を提供することができる。このような技 術は、ＰＡＮＥＣに特異的に結合し得る分子の産生に容易く適用することができ る。 本発明の別の実施例では、ＰＡＮＥＣ-１及びＰＡＮＥＣ-２特異的抗体、阻害 剤、レセプタまたはそれらの類似体を、対生物活性を有する薬剤として用いて、 膵臓の炎症や疾病を治療する。この膵臓の疾病には、ウイルスやバクテリア感染 、外傷による機械的障害、膵臓に発症する遺伝病、胆道の疾病、白血病やリンパ 腫のような浸潤性の疾病、または器官の機能に影響する他の生理学的及び病理学 的問題が含まれる。 ＰＡＮＥＣ-１及びＰＡＮＥＣ-２のアゴニスト、アンタゴニスト、レ セプタまたは阻害剤を含む、対生物活性を有する組成物は、最大許容投与量を決 定するための哺乳類を用いた臨床実験、及び安全投与量を決定するためのヒトを 被験者とする臨床実験を含むいくつかの方法論によって決定された適切な治療的 投与量で投与され得る。更に、対生物活性を有する薬剤は、半減期のような薬理 学的特性や安全性を強化する、様々な確立された化合物や組成物で合成され得る 。治療的、対生物活性を有する組成物は、静脈内注射による血流への注入や、膵 臓の問題を治療するために用いられ得る他の効果的な手段により投与され得る。 以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明を限定するもの ではない。 実施例 １．ｍＲＮＡの単離及びｃＤＮＡライブラリの構築 ｐａｎｅｃ−１及びｐａｎｅｃ−２のｃＤＮＡ配列は、ヒト膵臓ライブラリを 含むポリヌクレオチド配列の中から同定された。このライブラリに用いられる通 常の膵臓は、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｓｋｉｎ Ｂａｎｋ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ ａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｄｖｅｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｅｘｏｎ，ＰＡ）から得られた。５６才の白人男性から得ら れた通用の膵臓（Ｌｏｔ ＨＤＳ３３０）は、フラッシュ冷凍され、、乳鉢と乳 棒ですりつぶされ、すぐにグアニジウムイソチオシアナーテを含有する緩衝液に 溶解された。溶解に続けて、セノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈殿が 数回行われた。ポリ（Ａ＋）ｍＲＮＡは、常磁性粒子に結合されたストレプトア ビジンとビオチン化オリゴｄ（Ｔ）を用いて単離され（“Ｐｏｌｙ（Ａ） Ｔｒ ａｃｔ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ； Ｐｒｏｍ ｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ”）、貯蔵所に送られた。 ファージミドを精製する他の方法が、最近利用できるようになった。この方法 では、ミニプレップキット（miniprep kit）（カタログ番号７７４６８、Ａｄｖ ａｎｃｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社， １９２１２ Ｏ ｒｂｉｔ Ｄｒｉｖｅ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）を 用いる。このキットは９６穴型で、９６０回の精製に十分は試薬が付属している 。各キットには推奨プロトコルがあり、このプロトコルは以下の点を変えて採用 された。第１に、９６穴は、２５ｍｇ／Ｌのカルベニシリン及び０．４％のグリ セロールを含む無菌強力液体培地１ｍｌのみで満たされる。穴に接種された後、 バクテリアは２４時間培養され、６０μｌの溶解緩衝液に溶解された。遠心分離 処理（２９００ｒｐｍで５分間）が行われた後に、ブロックの内容物は主フィル タ板に加えられる。ＴＲＩＳ緩衝液にイソプロパノールを添加する選択的な処理 は、定例的に行わない。プロトコルの最終ステップの終了後、試料は貯蔵のため Ｂｅｃｋｍａｎ９６穴ブロックに送られる。 Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社は、オリゴｄ（Ｔ）プライマーを用いてｃＤＮＡライ ブラリーを調製した。合成アダプタオリゴヌクレオチドはＵＮＩ−ＺＡＰ（商標 ） ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）に挿入 することができるようにｃＤＮＡの末端に結合された。これにより高い効率で一 方向性（センス方向）のλライブラリ構築が可能となり、ｃＤＮＡ挿入体を有す るクローンを検出するための青−白の色による選択ができるプラスミド系の利点 を利用できるようになった。 各ｃＤＮＡライブラリの品質は、ＤＮＡプローブと抗体プローブの何れかを用 いてスクリーニングされ、次いでｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商 標登録）ファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）が生細胞の中で手早 く切り取られた。このファージミドにより、簡単に挿入断片の特徴付け、配列決 定、部位指定突然変異誘発、一方向性の形質の形成及び融合タンパク質発現のた めに、プラスミド系を使用することが可能となる。各ライブラリからのファージ 粒子は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞株ＸＬ１−ＢＬＵＥ（商標登録）（Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）に感染させられた。ＸＬ１−ＢＬＵＥの形質転換効率が高 いために、少ない比率で表現されたクローンをｃＤＮＡライブラリから得られる 可能性が高められる。別の一方向性ベクターには、ｐｃＤＮＡＩ（Ｉｎｖｉｔｒ ｏｇｅｎ社）及びｐＳＨｌｏｘ−１などがあるが、これらに限定されるものでは ない。 ２．ｃＤＮＡクローンの単離 ファージミド形態の個々のｃＤＮＡクローンは、ｉｎ ｖｉｖｏ切除プロセス により得られた。このプロセスでは、ＸＬ１−ＢＬＵＥが、ｆ１ヘルパーファー ジと同時に感染された。λファージ及びｆ１ヘルパーファージの双方に由来する タンパク質は、λ標的ＤＮＡ上の定められた配列から新たなＤＮＡ合成を開始し 、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド及びｃＤＮＡ挿入断片の全てのＤＮＡ配列 を含む小さな一本鎖環状ファージミドＤＮＡ分子を形成した。このファージミド ＤＮＡは、細胞から放出され、精製されて、更に新鮮な細菌性宿主細胞（ＳＯＬ Ｒ， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）に再感染するのに使用されて、ここで 二本鎖のファージミドＤＮＡが産生された。ファージミドがβ−ラクタマーゼに 対する遺伝子を保有していることから、新たに形質転換された細菌が、アンピシ リンを含有する培地上で選択された。 ファージミドＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ（商標登録） ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃ ａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．， ９ ２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅ．， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ ９１３１１） のＱＩＡＷＥＬＬ−８ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔ ｅｍを用いて精製された。この技術は、細菌細胞を溶解し、高度に精製されたフ ァージミドＤＮＡを単離するための、高速で信頼性が高く高スループットの方法 である。精製樹脂から溶離されたこのＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定及び他の分析的 操作に適したものであった。 ファージミドを精製する他の方法が、最近利用できるようになった。この方法 では、ミニプレップキット（miniprep kit）（カタログ番号７７４６８、Ａｄｖ ａｎｃｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社， １９２１２ Ｏ ｒｂｉｔ Ｄｒｉｖｅ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）を 用いる。このキットは９６穴型で、９６０回の精製に十分は試薬が付属している 。各キットには推奨プロトコルがあり、このプロトコルは以下の点を変えて採用 された。第１に、９６穴は、２５ｍｇ／Ｌのカルベニシリン及び０．４％のグリ セロールを含む無菌強力液体培地１ｍｌのみで満たされる。穴に接種された後、 バクテリアは２４時間培養され、６０μｌの溶解緩衝液に溶解された。遠心分離 処理（２９００ｒｐｍで５分間）が行われた後に、ブロックの内容物は主フィル タ板に加えられる。ＴＲＩＳ緩衝液にイソプロパノールを添加する選択的な処理 は、定例的に行わない。プロトコルの最終ステップの終了後、試料は貯蔵のため Ｂｅｃｋｍａｎ９６穴ブロックに送られる。 ３．ｃＤＮＡクローンの配列決定 ヒト膵臓ライブラリのランダム分離により得られたｃＤＮＡ挿入断片は、部分 的に配列決定された。ＤＮＡ配列決定の方法は、従来より周知である。従来の酵 素を用いる方法では、ＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメント、ＳＥＱＵＥＮ ＡＳＥ（登録商標） （ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ． Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， ＯＨ）またはＴａｑポリメラ ーゼを用いて、興味の対象のＤＮＡ鋳型にアニーリングされたオリゴヌクレオチ ドプライマーからＤＮＡ鎖を延長する。この方法は、一本鎖及び二本鎖の双方の 鋳型を用いるのに開発されたものである。チェーンターミネーション反応の生成 物は、通常ユリアアクリルアミドゲル上で電気泳動処理され、オートラジオグラ フィ（放射性核種で標識された前駆体の検出）、または蛍光体（蛍光体で標識化 された前駆体の検出）の何れかにより検出される。機械を用いた反応調製、蛍光 体検出を利用した分析及び配列決定の技術の近年の進歩により、１日当たりに決 定され得る配列数は増加した（ここでは、例えばＣａｔａｌｙｓｔ ８００及び Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ３７３ＤＮＡシーケンサのような機械を 用いる）。 ４．ｃＤＮＡクローン及び演繹されたタンパク質の相同性検索 このようにして得られた各ｃＤＮＡの配列は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｍｓ社製の検索アルゴリズムを、ＩＮＨＥＲＩＴ（商標） ６７０ Ｓｅｑ ｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍに組み込んで用いて、ＧｅｎＢａ ｎｋの配列と比較された。このアルゴリズムでは、Ｐａｔｔｅｒｎ Ｓｐｅｃｉ ｆｉｃａｔｉｏｎ Ｌａｎｇｕａｇｅ （ＴＲＷ Ｉｎｃ．， Ｌｏｓ Ａｎｇ ｅｌｅｓ ＣＡ）を用いて、相同性領域を決定した。配列比較をどのように行う かを定める３つのパラメータは、ウィンドウサイズ、ウィンドウオフセット、及 び誤差許容度であった。これら３つのパラメータの組合せを用いて、興味の対象 である配列に対して相同性を有する領域を含む配列を、ＤＮＡデータベースから 検索し、適当な配列に対して初期値と共にスコアが付けられた。続いて、これら の相同領域を、ドットマトリクス相同性プロット法を用いて検定し、偶然の一致 と真の相同領域とを区別した。相同性検索の結 果を表示するためにＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアラインメント用いた。 ペプチド及びタンパク質配列の相同性は、ＩＮＨＥＲＩＴ（商標）６７０ Ｓ ｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、ＤＮＡ配列の相同 性の検査に類似した方法で確認された。Ｐａｔｔｅｒｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔ ｉｏｎ Ｌａｎｇｕａｇｅ及びパラメータウィンドウを用いて、相同性領域を含 むタンパク質配列のデータベースを検索し、相同性領域は初期値と共にスコアを 付けられて表示された。ドットマトリクス相同性プロット法により検定を行い、 有意な相同性領域を偶然の一致と区別した。 本発明の請求の範囲に記載の膵臓現型ケモカイン、ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮ ＥＣ−２に対するヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、第１図に示されている 。 ５．遺伝子の同定及び全長さにわたる配列決定 ヒト膵臓ライブラリのクローンの中からランダムにピックアッブし配列決定す ると、既知のＣ−Ｃケモカイン分子との相同性を有するが、明らかに異なってい るｐａｎｅｃ配列が見つけられた。ｐａｎｅｃ−１及びｐａｎｅｃ−２に対する 完全なヌクレオチド配列は翻訳され、同定されたインフレーム翻訳は、それぞれ 第１図及び第２図に示されている。予測される全ての可能な３つのこの配列の翻 訳物について、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ及びＰＩＲのようなタンパク質データベース を検索したが、ｐａｎｅｃ−１及びｐａｎｅｃ−２の可能な翻訳物と完全に一致 するものは見つけられなかった。第３図に示すのは、ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮ ＥＣ−２のアミノ酸と他のβケモカイン分子のアミノ酸との比較であって、Ｃ− Ｃモチーフを含む実質的な相同領域が白ヌキで示されている。ＰＡＮＥＣ−１及 びＰＡＮＥＣ−２の疎水性分析の結果は第４図及び第 ５図にそれぞれ示されている。系統分析（第６図）では、ｐａｎｅｃ−１及びｐ ａｎｅｃ−２が、他のよく特徴付けられたヒトＣ−Ｃケモカインとどの程度近縁 関係にあるかが示されている。これらの分子の最も近縁なものは、図面の右側に 集まっている。 ６．アンチセンス分析 新規な発現されたケモカイン遺伝子の正しい完全なｃＤＮＡ配列を知ることに より、遺伝子機能の調査でのアンチセンス技術に、これを適用することが可能に なる。ｐａｎｅｃ−１またはｐａｎｅｃ−２のアンチセンス鎖を含むオリゴヌク レオチド、ゲノムのまたはｃＤＮＡのフラグメントをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉ ｎ ｖｉｖｏで用いて、特定のタンパク質の発現を阻害することができる。この ような技術は周知であり、ヌクレオチド配列の様々な部位に付くプローブをデザ インすることができる。細胞または実験動物をこのようなアンチセンス配列で処 理することより、興味の対象である遺伝子の機能を効果的に遮断することができ る。多くの場合、細胞レベル、組織レベル、若しくは生物体全体のレベルでの挙 動（例えば死亡率、分化した機能の消失、形態の変化等）を観察することにより 、その遺伝子の機能を確認することができる。 開放された読み枠の転写を妨害するように構築された配列を用いることに加え て、イントロン領域、プロモータ／エンハンサー要素、またはトランス作用調節 遺伝子に対するアンチセンス配列をデザインすることにより、遺伝子発現を修飾 することかできる。同様に、“三重らせん体（トリプルヘリックス）”塩基対と して知られるＨｏｇｅｂｏｏｍ塩基対を用いて阻害を達成することができる。 ７．ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２の発現 ｐａｎｅｃ−１及びｐａｎｅｃ−２の発現は、そのｃＤＮＡを発現ベクターに サブクローニングし、このベクターを適当な発現宿主に感染さ せることによりなされ得る。この特定の場合において、組織ライブラリの生成の ために以前に用いたクローニングベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉに含まれたｐａｎｅ ｃ−１及びｐａｎｅｃ−２の直接の発現のためにも用いることができる。クロー ニング部位の上流には、この発現ベクターは、βガラクトシダーゼのためのプロ モータと、アミノ末端Ｍｅｔ及びそれに続くβガラクトシダーゼの７つの残基を 含む配列とを含んでいる。この８つの残基の直後には、人工的プライミング及び 転写に有用な工学的処理されたバクテリオファージプロモータと、Ｅｃｏ ＲＩ を含む、クローニングのための多数の独特な制限部位がある。 ＩＰＴＧを有する単離された菌株を、標準的な方法で導入することにより、β −ガラタシトシダーゼの７つの残基に始まり、リンカーの約１５個の残基、及び ｃＤＮＡ内部でコードされたペプチドに対応する融合タンパク質が産生される。 ｃＤＮＡクローン挿入断片は、必ずランダムプロセスにより産生されることから 、含まれたｃＤＮＡが適切な翻訳のための正しい読み枠に存在する可能性は３つ に１つである。ｃＤＮＡが適切な読み枠に存在しない場合には、ｉｎ ｖｉｔｒ ｏ突然変異誘発を含む周知の方法による適切な数の塩基の除去または挿入や、エ キソヌタレアーゼＩＩＩまたは大豆ヌクレアーゼを用いた消化、若しくはオリゴ ヌクレオチドリンカーの混入により、正しい読み枠に存在するものを得ることが できる。 ｐａｎｅｃ−１またはｐａｎｅｃ−２は、特定の宿主におけるタンパク質源の 発現のために有用であることが知られている他のベクターに移入され得る。クロ ーニングサイトと共に、目標ｃＤＮＡ（２５塩基）の両端における伸展部分とハ イブリッドを形成するのに十分なＤＮＡのセグメントを含むオリゴヌクレオチド アンブリマーは、標準的な方法で化学的に合成され得る。次いで、これらのプラ イマーを用いて、ＰＣＲ法 により所望の遺伝子セグメントを増幅することができる。得られた新たな遺伝子 セグンメントは、標準的な条件の下で適当な制限酵素で切断し、ゲル電気泳動法 により単離することができる。別の形態として、適当な制限酵素を用いてヌクレ オチド配列を切断し、欠失した遺伝子セグメントに化学的に合成されたオリゴヌ クレオチドを埋め込むことにより、類似の遺伝子セグメントを産生することがで きる。更に、複数の遺伝子から得られた配列をコードするセグメントを相互に結 合し、適当なベクターにクローニングして、組換え配列の発現を最適化すること ができる。 このようなキメラ分子用の適切な発現宿主には、チャイニーズハムスターの卵 巣（ＣＨＯ）及びヒト２９３細胞のような哺乳類の細胞、Ｓｆ９細胞のような昆 虫の細胞、サッカロミセスセルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のような酵 母菌細胞、及びＥ．ｃｏｌｉのような細菌が含まれるが、これらに限定されるも のではない。このような細胞系のそれぞれに対して有用な各発現ベクターも、細 菌内での増殖を可能にする複製起点、及びβ−ラクタマーゼ抗抗生物質遺伝子の ような細菌内での選択を可能にする選択可能なマーカーを含み得る。更に、この ベクターは、感染された真核宿主細胞群における選択を可能にする、ネオマイシ ンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のような第２の選択可能なマーカーを有し得 る。真核細胞の発現宿主において使用するためのベクターは、３′ポリアデニル 化配列のようなＲＮＡプロセシング要素を、それが興味の対象であるｃＤＮＡに 含まれていない場合には必要とすることがある。 更に、このベクターは遺伝子発現を増加させるプロモータまたはエンハンサー を含み得る。このようなプロモータは宿主特異的であって、ＭＭＴＶ、ＳＶ４０ 、またはＣＨＯ細胞用のメタロチオネインプロモータや、細菌宿主用のｔｒｐ、 ｌａｃ、ｔａｃ、またはＴ７プロモータや、 酵母菌用のα因子、アルコール酸化酵素、またはＰＧＨプロモータが含まれる。 ＲＳＶエンハンサーのような転写エンハンサーは、哺乳類の宿主細胞において使 用され得る。ひとたび標準的な培養法により均一な組換え細胞の培養物が得られ ると、組換えにより産生されたＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２が大量に条件 培地から得られ、当技術分野において周知のクロマトグラフィー法により分析で きることになる。 ８．組換えＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２の単離 ＰＡＮＥＣは、タンパク質精製を促進するために追加された１又は２以上の追 加的なポリペプチド領域を有するキメラタンパク質として発現され得る。このよ うな精製促進ドメイン（分子内領域）には、固定化金属上での精製を可能にする ヒスチジン−トリプトファンモジュールのような金属キレート化ペプチド固定化 免疫グロブリン上での精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、及びＦＬＡＧＳ 伸展／アフィニティ精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ， Ｓｅａｔｔｌ ｅ， ＷＡ）において利用されるドメイン等があるが、これらに限定されるもの ではない。ＸＡ因子またはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）のような切断可能なリンカー配列が、精製ドメインとｐａｎ ｅｃ配列との間に含まれていると、ＰＡＮＥＣの精製を促進するのに役立つこと がある。 ９．ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２特異的抗体の産生 ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２ＡＤＥＣに対する抗体を産生するための方 法には２つの方法があり、何れの方法もモノクローナル抗体及びポリクローナル 抗体を調製するために用いることができる。その方法の１つは、逆相ＨＰＬＣ分 離から変性タンパク質を得て、これを用いて当業者に周知の技術でマウスまたは ウサギを免疫化する方法である。マウスの免疫化には変性タンパク質約１００μ ｇで十分であり、ウサギの 免疫化には最大１ｍｇを用いることがある。マウスハイブリドーマを同定するた めに、変性タンパク質を放射性要素で標識し、これを用いて潜在性ネズミＢ細胞 ハイブリドーマをスクリーニングして、抗体を産生するものを分離することがで きる。この方法では、必要なタンパク質の量はわずかであり、数１０００のクロ ーンを標識しスクリーニングするためには２０ｍｇで十分である。 もう一つの方法では、ＰＡＮＥＣ−１またはＰＡＮＥＣ−２のアミノ酸配列は ｃＤＮＡ配列から推論されるように、その分析により免疫抗原性の高い領域が決 定される。第４図及び第５図に示すように、適当な親水性領域を含むオリゴペプ チドを合成し、適切な免疫化プロトコルで使用して抗体を産生する。適切なエピ トープを選択するための分析方法は、“Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ （ １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ ２． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）” に記載されている。免疫化のための最適なアミノ酸配列は、通常、そのタンパク 質が自然のコンフォーメーションをなしているときに外部環境にさらされやすい ポリペプチドのＣ末端、Ｎ末端、及びその間に介在する親水性領域に存在する。 典型的には、約１５残基の長さを有する選択されたポリペプチドは、ｆｍｏｃ 化学を用いるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎ ｔｈｅｓｉｚｅｒ ｍｏｄｅｌ ４３１Ａを用いて合成され、Ｍ−マレイミドベ ンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ；上述のＡｕｓｕｂ ｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ参照）と反応させることによりヒザラガイヘモシアニン またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ；Ｓｉｇｍａ）と結合される 。必要ならば、ＫＬＨに結合できるようにペプチドのＮ末端にシステインを挿入 してもよ く、動物は、フロイント完全アジュバントによりペプチド−ＫＬＨ複合体で免疫 化される。得られた抗血清は、ペプチドをプラスチックに結合し、１％のＢＳＡ でブロックし、抗血清と反応させ、その後洗浄し、（放射性または蛍光性の）標 識をなされたアフィニティ精製された特異的ヒツジ抗ウサギＩｇＧと反応させる ことにより、抗ペプチド活性をテストすることができる。 ハイブリドーマも標準的な技術を用いて調製される。興味の対象となるハイブ リドーマは、標識化ＰＡＮＥＣ−１またはＰＡＮＥＣ−２でスクリーニングし、 所望の特異性を有するモノクローナル抗体を産生するそれらの融合体を同定する ことにより検出される。例えば、典型的なプロトコルでは、プレート（ＦＡＳＴ ， Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）の穴 が、アフィニティ精製された特異的ウサギ抗マウス（または適当な抗種Ｉｇ）抗 体約１０ｍｇ／ｍ１でコーティングされる。コーティングされた穴は１％のＢＳ Ａでブロックされ、洗浄されて、ハイブリドーマの上清液にさらされる。インキ ュベーションの後、この穴は約１ｍｇ／ｍｌの濃度の標識化ＰＡＮＥＣ−１また はＰＡＮＥＣ−２にさらされる。抗体を産生するクローンは、上述のような条件 の下で検出可能な量の標識化ＰＡＮＥＣ−１またはＰＡＮＥＣ−２と結合する。 このようなクローンは、増殖された上で、限界希釈（１細胞／３穴）で２サイク ルのクローニングをなされる。クローニングされたハイブリドーマは、プリスタ ン処置を受けたマウスに注射され、マウスの復水が作り出される。モノクローナ ル抗体は、タンパク質Ａを用いるアフィニティクロマトグラフィーにより、マウ スの復水から精製される。少なくとも１０⁸Ｍ^-1、好ましくは１０⁹〜１０¹⁰以上 の親和力を有するモノクローナル抗体は、典型的には、“Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＮＹ”または“Ｇｏｄｉｎｇ （１９８６） Ｍｏ ｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ２ｄ Ｅｄ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ”に記載の標準的な手順により作られる。これらの文献を本 明細書と共に参照されたい。 １０．ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２特異的抗体を用いた診断テスト 特定のＰＡＮＥＣ−１またはＰＡＮＥＣ−２抗体を、前病状態の診断、及びＰ ＡＮＥＣ−１またはＰＡＮＥＣ−２の量または分布の差によって特徴付けられる 慢性または急性の疾病に対する診断に用いることができる。そもそも、ＰＡＮＥ Ｃ−１及びＰＡＮＥＣ−２は、ヒト膵臓ライブラリにおいてのみ見られ、従って 、膵臓の異常または病状に対して特異的である。 ＰＡＮＥＣに対する診断テストには、ヒトの体液、組織またはこのような組織 の抽出物においてＰＡＮＥＣを検出するために抗体及び標識を用いる方法が含ま れる。本発明のポリペプチド及び抗体は、修飾した上で使用されることもあれば 、修飾せずに使用されることもある。多くの場合ポリペプチド及び抗体は、検出 可能なシグナルを提供する物質と共有結合または非共有結合で結合させることに より標識される。標識及び接着技術には様々なものが知られており、化学的な文 献あるいは特許明細書の双方において広く記載されている。適当な標識としては 、放射線核種、酵素、気質、補因子、阻害剤、蛍光剤、化学ルミネセンス剤、磁 性粒子等が有る。このような標識の使用について記載されている特許明細書には 、例えば米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７ ５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４ ３７号、第４，２７５，１４９号、第４，３６６，２４１号の明細書がある。ま た組換え免疫グロブリンの産生方法は、米国特許第４，８１６，５７６号明細書 に記載されている方法を用いることができ、本明細書と共に参照されたい。 可溶性または膜結合型ＰＡＮＥＣ−１またはＰＡＮＥＣ−２を測定するための 、書くタンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗 体の何れかを用いる様々なプロトコルが周知となっている。その例を挙げると、 固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、及び蛍光活 性化細胞分析分類法（ＦＡＣＳ）等が有る。好適なのは、ＰＡＮＥＣ−１または ＰＡＮＥＣ−２上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を利 用した２つの部位のモノクローナルベースの免疫検定法であるが、競合的結合検 定法を用いてもよい。これらの検定法は、“Ｍａｄｄｏｘ， ＤＥ ｅｔ ａｌ （１９８３， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １５８：１２１１）”他の文献に記載さ れている。 １１．特異的抗体を用いる未変性ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２の精製 未変性または組換えＰＡＮＥＣ−１またはＰＡＮＥＣ−２は、ＰＡＮＥＣ−１ またはＰＡＮＥＣ−２のそれぞれに対する特異的抗体を用いたイムノアフィニテ ィクロマトグラフィーにより精製され得る。一般に、イムノアフィニティカラム は、抗ＰＡＮＥＣ−１抗体または抗ＰＡＮＥＣ−２抗体と活性化クロマトグラフ ィー樹脂が共有結合で結びつくことによって構成される。 ポリクローナル免疫グロブリンは、硫安沈殿または固定化タンパク質Ａ（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉ ｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上での精製により免疫血清から調製される。同様にモ ノクローナル抗体は硫安沈殿または固定化タンパク質Ａ上でのクロマトグラフィ ーによりマウスの復水から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、 ＣｎＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ）のようなクロマトグラフィー樹脂に共有結合によって付着す る。抗体は樹脂に結合し、製造者の指示に従いこの樹脂をブロックした後、誘導 体樹脂を洗浄する。 このようなイムノアフィニティカラムは、可溶型のＰＡＮＥＣ−１またはＰＡ ＮＥＣ−２を含む細胞から分画を調製することによってＰＡＮＥＣ−１及びＰＡ ＮＥＣ−２の精製において用いられる。可溶化ＰＡＮＥＣは、界面活性剤の添加 または従来より周知の他の方法により遠心分離法を用いて得られた細胞成分分画 、若しくは細胞全体を可溶化することによって誘導される。別の形態として、シ グナル配列を含む可溶化ＰＡＮＥＣ−１またはＰＡＮＥＣ−２は、細胞が増殖す る培地に有用な量だけ分泌され得る。 可溶化ＰＡＮＥＣ−１またはＰＡＮＥＣ−２含有調合物は、イムノアフィニテ ィカラムを通されて、このカラムはケモカインの優先的な吸収が可能となる条件 の下で（即ち、界面活性剤の存在の下、高イオン強度の緩衝液の中で）洗浄され た。次いで、カラムは、抗体／こもカイン結合を分裂させる条件（例えば、ｐＨ ２〜３の緩衝液または高濃度の尿素またはチオシアネートイオンのようなカオト ロープの中）の下で溶離され、ＰＡＮＥＣ−１またはＰＡＮＥＣ−２が回収され た。 １２．ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２誘発走化性または細胞活性化の判定 ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２の走化性の活性は、４８穴マイクロケモタ キシスチャンバ（“Ｆａｌｋ ＷＲ ｅｔ ａｌ （１９８０） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３３：２３９”参照）で測定される。 各穴はフィルタによって２つの区画に分割されており、細胞が化学的勾配に応じ てこのフィルタを通過できるようになっている。発現ケモカインを含むＲＭＰＩ １６４０（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）のような細胞培養地は、通常 はポリカーボネート製のフィルタの一方の側に配置され、同じ媒地内で懸濁され た細胞がフィルタの他方の区画に配置される。十分なインキュベーション時間が 経過すると、フィルタ前後の濃度勾配に応じて細胞がフィルタを通過する。その 後、フィルタは各穴から取り出され、フィルタのケモカインがある側に付着した 細胞が分類され定量される。 特異的な細胞集団に対してケモタキシスアッセイを実施することにより、化学 誘因物質の特異性が判定される。初めに、静脈穿刺で得られた血液細胞が密度勾 配遠心分離法により分画され、好中球、末梢血単球細胞、単球及びリンパ球の濃 縮された集団に対して、特定のＰＡＮＥＣ−１またはＰＡＮＥＣ−２の走化性（ ケモタキシス）の活性がテストされる。所望に応じて、このような濃縮細胞集団 は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋濃縮Ｔ細胞集団のネガティブ選択のために、ＣＤ８＋ 及びＣＤ４＋特異的抗体を用いてそれぞれ更に分画される。 別の実験（アッセイ）により、活性化Ｔ細胞に対するＰＡＮＥＣ−１またはＰ ＡＮＥＣ−２の走化性効果が解明される。この実験では、未分画のＴ細胞または 分画されたＴ細胞サブセットが、ＣＤ−３抗体でコーティングされた組織培養容 器内で６〜８時間培養される。このＣＤ３活性化の後、ＰＡＮＥＣの走化性の活 性が上述のようにテストされる。また、濃縮細胞集団を得るための方法は、他に も様々なものが従来より周知である。 ケモカインの中には、好中球及び単球の非走化性細胞活性化作用を示 すものもある。これは、アクチン重合、呼吸バースト作用の増加、アズール親和 性顆粒の脱顆粒、及びシグナル伝達経路の一部としてのＣａ²⁺動員のような好中 球活性化作用の標準的な測定基準を媒介にして検定される。Ｃａ²⁺の動員の検定 法には、Ｃａ²⁺の結合によって放射特性が変化する蛍光プローブを好中球に前負 荷する処理過程が含まれる。細胞が活性化刺激にさらされたとき、蛍光光度計に より細胞を観測することにより、Ｃａ²⁺の流れを知ることができる。Ｃａ²⁺動員 の測定については、“Ｇｒｙｎｋｉｅｖｉｃｚ Ｇ ｅｔ ａｌ． （１９８５ ） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６０：３４４０， ａｎｄ ＭｃＣｏｌｌ Ｓ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５０：４５５０−４５ ５５”に記載されており、これを本明細書と共に参照されたい。 脱顆粒及び呼吸バースト反応は、単球においても測定される（“Ｚａｃｈａｒ ｉａｅ ＣＯＣ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７１： ２１７７−８２”参照）。更に、単球活性化作用の測定基準には、接着分子発現 及びサイトカインの産生の調節を利用することができる（“Ｊｉａｎｇ Ｙ ｅ ｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：２４２３−８”参照 ）。接着分子の発現は、リンパ球の活性にも応じて変化する（“Ｔａｕｂ Ｄ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０： ３５５−３５８”参 照）。 １３．薬物スクリーニング ＰＡＮＥＣ−１またはＰＡＮＥＣ−２ポリペプチド、若しくはその結合フラグ メントを用いて様々な薬物スクリーニング技術で化合物をスクリーニングする際 に本発明は有用である。このようなテストにおいて用いられるケモカインポリペ プチドまたはフラグメントは、溶液の中に遊離している形態のものか、固体の支 持体に付着している形態のものか、細胞の表面に支持されている形態のものか、 あるいは細胞内に存在する 形態のものの何れかである。薬物スクリーニングの一方法では、宿主細胞として 、そのポリペプチドまたはそのフラグメントを発現する組換え核酸で安定的に形 質転換される真核細胞または原核細胞を利用する。薬物は、競合的結合実験にお いて形質転換された細胞からスクリーニングされる。このような細胞は、生存型 であれ固定型であれ標準的な結合実験に使用することができる。これを用いて、 例えば、ＰＡＮＥＣ−１またはＰＡＮＥＣ−２またはそのフラグメントと試験さ れる薬剤との複合体形成を測定したり、あるいは試験される薬剤によって生じた ＰＡＮＥＣ−１またはＰＡＮＥＣ−２またはそのフラグメントと好中球または繊 維芽細胞との複合体の減少を検査することができる。 従って、本発明は、炎症及び疾病に作用する薬剤または薬物のスクリーニング 方法を提供するものである。これらの方法は、本発明のＰＡＮＥＣ−１またはＰ ＡＮＥＣ−２ポリペプチド、若しくはそのフラグメントをこのような薬剤に接触 させる過程と、（ｉ）ＰＡＮＥＣ−１またはＰＡＮＥＣ−２ポリペプチド若しく はそのフラグメントとその薬剤との複合体の存在、若しくは（ｉｉ）ＰＡＮＥＣ −１またはＰＡＮＥＣ−２ポリペプチドまたはそのフラグメントと細胞との複台 体の存在を、周知の方法により検定（アッセイ）する過程とを含む。このような 競合的結合検定法においては、ケモカインポリペプチドまたはそのフラグメント は通常標識される。適当なインキュベーションの後、遊離したＰＡＮＥＣ−１ま たはＰＡＮＥＣ−２ポリペプチドまたはそのフラグメントが、結合した形態で存 在するそれから分離され、遊離した複合体を形成していない標識の量が、特定の 薬剤がＰＡＮＥＣ−１またはＰＡＮＥＣ−２に結合する能力またはＰＡＮＥＣ− １またはＰＡＮＥＣ−２／細胞複合体に干渉する能力の尺度となる。 薬物スクリーニングのための他の技術では、本発明のＰＡＮＥＣ−１ またはＰＡＮＥＣ−２ポリペプチドに対する適切な結合親和性を有する複合体を 高スループットでスクリーニングすることができ、その技術の詳細は１９８４年 ９月１３日公開の欧州特許出願第８４／０３５６４号明細書に記載されており、 本明細書と共にこれを参照されたい。この方法を簡単に述べると、たくさんの異 なる小さなペプチドのテスト化合物が、例えばプラスチックピンまたは他の物質 でできた固体基板の表面上で合成される。ペプチドテスト化合物は、ＰＡＮＥＣ −１またはＰＡＮＥＣ−２ポリペプチドと反応させられたた上で、洗浄される。 次いで、結合ＰＡＮＥＣ−１またはＰＡＮＥＣ−２ポリペプチドが、周知の方法 により検出される。上述の薬物スクリーニング技術において使用するために、精 製ＰＡＮＥＣ−１またはＰＡＮＥＣ−２をプレート上に直接コーティングするこ ともできる。更に、非中和性抗体を用いて、固体支持体上にペプチドを捕捉若し くは固定化することができる。 ケモカインポリペプチド若しくはそのフラグメントに結合するテスト化合物と 、ＰＡＮＥＣ−１またはＰＡＮＥＣ−２に結合できる中和性抗体とが特異的に競 合する競合的薬物スクリーニングアッセイの利用も本発明の企図するところであ る。このようにして、この抗体を用いて、１または２以上の抗原決定基がＰＡＮ ＥＣ−１またはＰＡＮＥＣ−２と共通な任意のペプチドの存在を検出することが できる。 １４．合理的薬物デザイン 合理的薬物デザインの目標は、興味の対象の生物学的に活性のポリペプチド、 若しくは、例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、または阻害剤のような、その ポリペプチドが相互作用する小分子の構造的な類似体を作り出すことである。こ こに例として挙げたものは何れも、より活性の高いまたは安定な形態のポリペプ チドである薬剤、またはｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドの機能を強化、または阻 害する薬剤を作り出すのに 用いることができる（“Ｈｏｄｇｓｏｎ Ｊ （１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ ９：１９−２１”を本明細書とともに参照されたい）。 １つの方法では、目的のタンパク質またはタンパク質−阻害剤複合体の三次元 構造の決定を、Ｘ線結晶解析、コンピュータによるモデル化、若しくは最も典型 的にはこの２つの手段を組合せて行う。構造を解明し、分子の活性部位を決定す るために、ポリペプチドの形状及び電荷を確認しなければならない。ポリペプチ ドの構造に関する有用な情報が、相同タンパク質の構造に基づいたモデリングに より得られることもある。何れの場合においても、対象物の構造の情報を用いて 、類似体ケモカイン様分子をデザインしたり、あるいは効果的な阻害剤を同定し ている。合理的薬物デザインの有用なものの例としては、Ｂｒａｘｔｏｎ Ｓ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ ＪＡ（１９９２ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：７７ ９６−７８０１）により提示されたような、活性または安定性が改善された分子 、若しくは、Ａｔｈａｕｄａ ＳＢ等（１９９３ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１３ ：７４２−７４６）によって提示された自然発生ペプチドの阻害剤、アゴニスト またはアンタゴニストとして作用する分子があり、ここでは両文献を参照された い。 上述のように、機能検定により選択された標的特異的抗体を単離し、次いでそ の結晶構造を解明することも可能である。通常この方法により、続けて行われる 薬物デザインにおける基礎となり得るファーマコア（pharmacore）が得られる。 機能的な、薬理学的に活性の抗体に対する抗イデオタイプの抗体（抗ｉｄ）を産 生することにより、タンパク質の結晶解析をバイパスすることが可能である。鏡 像の鏡像と同様の意味で、抗ｉｄの結合部位は、もとのレセプタの類似体である ことが期待される。次いで、抗ｉｄを用いて、化学的または生物学的に作られた ペプチドの バンク（bank）から、ペプチドを同定し単離することができる。単離されたペプ チドは、ファーマコアとして役立つ。 本発明により、Ｘ線結晶解析のような分析的研究を行うのに使用できる十分な 量のポリペプチドを作ることができる。更に、ここに開示したＰＡＮＥＣアミノ 酸配列の知識を、Ｘ線結晶解析の代わり、またはそれと共に用いられるコンピュ ータによるモデル化技術に応用することができる。 １５．ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２レセプタの同定 精製ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２を、特異的細胞表面レセプタ及び他の 結合分子を特徴付け、精製に利用することができる。走化性若しくは他の特異的 反応によりＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２に反応する細胞は、ＰＡＮＥＣ− １及びＰＡＮＥＣ−２それぞれに対するレセプタを発現しやすい。ＰＡＮＥＣ− １及びＰＡＮＥＣ−２に放射性標識を組み込むためには、様々な周知の方法を用 いることができる。好適実施例では、ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２の主た るアミノ基を、¹²⁵Ｉボルトンハンター試薬（“Ｂｏｌｔｏｎ， ＡＥ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ， ＷＭ （１９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ １３３：５２９ ”参照）で標識する。この試薬は、他のケモカインについても、その生物学的活 性を損なうことなく標識するために用いられてきた（“Ｈｅｂｅｒｔ ＣＡ ｅ ｔ ａｌ （１９９１） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６： １８９８９； ＭｃＣｏｌｌ Ｓ ｅｔ ａｌ （１９９３） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５０： ４５５０−４５５５”参照）。レセプタ保有細胞は、標識化ケモカイン分子と共 にインキュベートされる。次いで、この細胞は洗浄されて非結合ケモカインが除 去され、次いでレセプタ結合標識化分子が定量される。異なる濃度のＰＡＮＥＣ −１またはＰＡＮＥＣ−２を用いて得られたデータから、レセプタの数及び親和 性 を表す数値を計算することができる。 標識化ＰＡＮＥＣ−１またはＰＡＮＥＣ−２は、その特異的レセプタの精製の ための試薬として有用である。ケモカインはクロマトグラフィカラムに共有結合 で結合される。レセプタ保有細胞が抽出され、その抽出物がカラムに通される。 レセプタは、そのリガンドとの生物学的親和性のためにカラムに結合する。レセ プタはカラムから回収され、Ｎ末端タンパク質シークエンシング（配列決定）を 受ける。得られたアミノ酸配列は、そのレセプタ遺伝子のクローニングのための 変性オリゴヌクレオチドブローブのデザインに使用される。 別の実施例においては、ｍＲＮＡがレセプタ保有細胞から得られ、それからｃ ＤＮＡ発現ライブラリが形成される。このライブラリは、細胞集団へのトランス フェクションがなされ、レセプタを発現する細胞集団は蛍光標識化ＰＡＮＥＣ− １またはＰＡＮＥＣ−２を用いて選択される。ＰＡＮＥＣ−１またはＰＡＮＥＣ −２特異的レセプタは、高度に標識された細胞から組換えＤＮＡを回収し配列決 定することにより同定される。 別の方法では、レセプタ保有細胞の表面に対する抗体、好ましくはモノタロー ナル抗体が産生され、更にスクリーニングによりこのうち標識化ＰＡＮＥＣ−１ またはＰＡＮＥＣ−２の結合を阻害するものが同定される。このモノクローナル 抗体は、アフィニティ精製またはレセプタの発現クローニングのために用いられ る。 可溶性レセプタ、若しくは他の可溶性結合分子の同定も類似した方法で行われ る。標識化ＰＡＮＥＣ−１またはＰＡＮＥＣ−２を、抽出物、または炎症性アデ ノイド由来の他の適切な材料と共にインキュベートする。インキュベーションの 後、（精製ケモカイン分子より大きいサイズの）ＰＡＮＥＣ−１またはＰＡＮＥ Ｃ−２複合体を、例えば、サイズ排除タロマトグラフィまたは密度勾配遠心分離 法のような分子の大きさに よって分離するサイジング技術を用いて同定し、従来より周知の方法で精製する 。可溶性レセプタまたは結合タンパク質はＮ末端シークエンシングを受けて、そ の可溶性タンパク質が既知である場合にはデータベースによる同定のため、その 可溶性タンパク質が未知である場合にはクローニングのための十分な情報が獲得 される。 １６．ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２の使用と投与 ＰＡＮＥＣ−１及びＰＡＮＥＣ−２の抗体、阻害剤、レセプタ、若しくはアン タゴニスト（過剰なケモカイン産生に対する処理剤、以下略して“ＴＥＣ”と称 する）は、治療的に投与されたときそれぞれ異なる効果を与え得る。このＴＥＣ は、無毒性で、不活性で薬化学的に適格な水性担体媒質でありそのｐＨは約５〜 ８、より好適には６〜８のである。但し、このｐＨ値は、調合される抗体、阻害 剤、レセプタ、またはアンタゴニストの特性や治療される病状に応じて変わって くる。ＴＥＣの特性には、分子の可溶性、半減期、及び抗原性／免疫抗原性が含 まれ、効果的な担体を決定するのに役立ち得る。自然発生ヒトタンパク質はＴＥ Ｃとして好適であるが、薬物スクリーニングによって得られた有機分子も特定の 状態の下では同様に効果的であり得る。 ＴＥＣは、局所塗布用クリームまたはゲル、粘膜透過性スプレーまたはエーロ ゾル、皮膚透過性パッチまたは包帯、注射可能な静脈内または洗浄調合物及び経 口投与液若しくは錠剤を含む周知の投与経路によって与えられ得るが、投与の仕 方は以上挙げたものに限定されない。特定の配合、正確な投与量、及び投与経路 は、病院所属医師により決定され、それぞれの状況に応じて変わってくる。 このような決定は、治療を受ける条件、投与されるＴＥＣ、及び特定のＴＥＣ の薬動力学的プロフィールのような様々な変量を考慮してなされる。考慮され得 る他の因子には、患者の病状（例えば重症）、年齢、 体重、性別、食事、投与の回数、薬物の組合せ、反応感受性及び治療に対する耐 性／反応が含まれる。長時間作用するＴＥＣ調剤の投与の頻度は、特定のＴＥＣ の半減期及び消失速度に応じて、３日から４日に１回、１週間に１回、または２ 週間に１回であり得る。 通常の投与量は、投与経路に応じて０．１〜１００，０００μｇ、最大１ｇの 間で変化し得る。ＴＥＣの特定の投与量に関しての説明は以下の文献、即ち米国 特許第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号、または第５，２２５， ２１２号明細書に記載されている。ＴＥＣの種類に応じて効果的な配合も変わり 、また膵臓を標的にする投与と、他の器官または組織を標的にする場合とでは、 投与方法も異なってくることが予測される。 単球、マクロファージ、好中球、好酸球または他の白血球を活性化する膵臓の 疾病または状態は、ＴＥＣで治療され得ると考えられる。これらの状態若しくは 病気は、上述の診断テストにより詳しく診断され得る。このような診断テストは 、例えばウイルスやバクテリア感染、外傷による機械的障害、膵臓に発症する遺 伝病、胆道の疾病、白血病やリンパ腫のような浸潤性の疾病、または器官の機能 に影響する他の生理学的及び病理学的問題の疑いがある場合に行われる。 上述の明細書の記載の中で引用された全ての文献及び特許明細書は、本明細書 に一体に組み込まれる。上述の本明細書の内容は、当業者が本発明を実行するの に十分なものであると考えられる。実際、当業者は、以下の請求の範囲に記載の 本発明の範囲内で、上述の実施例に様々に変更を加えて実施することができるで あろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ， ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ワイルド、クレイグ・ジー アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・ サニーベイル・マンダリンドライブ 1239

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号：１に示すヌクレオチド配列を有する、膵臓発現型ケモカイン（ｐ ａｎｅｃ−１）遺伝子を含むことを特徴とする組換えＤＮＡ分子。 ２．膵臓の活性化または炎症状態を診断するための診断テスト方法であって、 ａ）生物学的試料を準備する過程と、 ｂ）前記生物学的試料と、請求項１に記載のＤＮＡ分子またはそのフラグメン トとを結合する過程とを有することを特徴とする診断テスト方法。 ３．前記活性化状態が膵臓炎を含むことを特徴とする請求項２に記載の診断テス ト方法。 ４．請求項１に記載のＤＮＡ分子のアンチセンスＤＮＡ。 ５．請求項１に記載のＤＮＡ分子を含むことを特徴とする発現ベクター。 ６．請求項５に記載の前記発現ベクターて形質転換されたことを特徴とする宿主 細胞。 ７．膵臓発現型ケモカインポリペプチド（ＰＡＮＥＣ−１）を産生する方法であ って、 ａ）ＰＡＮＥＣ−１の発現に適切な条件の下で、請求項６に記載の前記宿主細 胞を培養する過程と、 ｂ）細胞培地から前記ＰＡＮＥＣ−１を回収する過程とを含むことを特徴とす る膵臓発現型ケモカインポリペプチド（ＰＡＮＥＣ−１）の産生方法。 ８．配列番号：２に示すアミノ酸配列を有することを特徴とする精製ＰＡＮＥＣ −１ポリペプチド。 ９．請求項８に記載のポリペプチドに対して特異的な抗体。 １０．膵臓の活性化または炎症状態を診断するための診断テスト方法であって、 ａ）生物学的試料を準備する過程と、 ｂ）前記生物学的試料と、請求項９に記載の抗体とを結合する過程とを有する ことを特徴とする診断テスト方法。 １１．請求項９に記載の抗体及び製薬学的に許容可能な賦形剤を含むことを特徴 とうする医薬品組成物。 １２．膵臓の活性化または炎症状態を治療するための方法であって、 前記膵臓の活性化または炎症状態を患っている患者に、請求項１１に記載の前 記医薬品組成物を、効果的な投与量で投与する過程を含むことを特徴とする膵臓 の活性化または炎症状態の治療方法。 １３．配列番号：３に示すヌクレオチド配列を有する、膵臓発現型ケモカイン（ ｐａｎｅｃ−２）遺伝子を含むことを特徴とする組換えＤＮＡ分子。 １４．膵臓の活性化または炎症状態を診断するための診断テスト方法であって、 ａ）生物学的試料を準備する過程と、 ｂ）前記生物学的試料と、請求項１３に記載のＤＮＡ分子またはそのフラグメ ントとを結合する過程とを有することを特徴とする診断テスト方法。 １５．前記活性化状態が膵臓炎を含むことを特徴とする請求項１４に記載の診断 テスト方法。 １６．請求項１３に記載のＤＮＡ分子のアンチセンスＤＮＡ。 １７．請求項１３に記載のＤＮＡ分子を含むことを特徴とする発現ベクター。 １８．請求項１７に記載の前記発現ベクターで形質転換されたことを特 徴とする宿主細胞。 １９．膵臓発現型ケモカインポリペプチド（ＰＡＮＥＣ−２）を産生する方法で あって、 ａ）ＰＡＮＥＣ−２の発現に適切な条件の下で、請求項１８に記載の前記宿主 細胞を培養する過程と、 ｂ）細胞培地から前記ＰＡＮＥＣ−２を回収する過程とを含むことを特徴とす る膵臓発現型ケモカインポリペプチド（ＰＡＮＥＣ−２）の産生方法。 ２０．配列番号：４に示すアミノ酸配列を有することを特徴とする精製ＰＡＮＥ Ｃ−２ポリペプチド。 ２１．請求項２０に記載のポリペプチドに対して特異的な抗体。 ２２．膵臓の活性化または炎症状態を診断するための診断テスト方法であって、 ａ）生物学的試料を準備する過程と、 ｂ）前記生物学的試料と、請求項２１に記載の抗体とを結合する過程とを有す ることを特徴とする診断テスト方法。 ２３．請求項２１に記載の抗体及び製薬学的に許容可能な賦形剤を含むことを特 徴とうする医薬品組成物。 ２４．膵臓の活性化または炎症状態を治療するための方法であって、 前記膵臓の活性化または炎症状態を患っている患者に、請求項２３に記載の前 記医薬品組成物を、効果的な投与量で投与する過程を含むことを特徴とする膵臓 の活性化または炎症状態の治療方法。