JPH11507513A - Ｃ５ａ様７膜貫通受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトのマスト細胞で発現する新規なＣ５ａ様７膜貫通受容体（ＣＡＬＲ）を同定し、コードするヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。本発明には、ＣＡＬＲをコードするヌクレオチド配列に対するアンチセンス分子、精製ＣＡＬＲの産生のための発現ベクター、ＣＡＬＲに特異的に結合し得る抗体、ヌクレオチド配列をコードするＣＡＬＲの誘発を検出するためのハイブリダイゼーションプローブまたはオリゴヌクレオチド、ＣＡＬＲをコードする核酸分子に基づいた診断テスト方法、ＣＡＬＲの発現のための生物工学的処理をなされた宿主細胞、及びポリペプチドＣＡＬＲのアンタゴニスト及びインヒビターが含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｃ５ａ様７膜貫通受容体 技術分野 本発明は分子生物学の分野に属し、特に本発明はＣ５ａ様７膜貫通受容体の核 酸配列及びアミノ酸配列について記述したものである。 背景技術 補体は肝臓で産生され、血液及び細胞外体液内を循環して、感染症と闘う細胞 及び抗体を刺激する。補体５（Ｃ５）は、補体系が活性化されると常にタンパク 分解性に切断されてＣ５ａ及びＣ５ｂが産生される。Ｃ５ａは血液から異物や異 種生物を浄化する機能を発揮する１３個の血漿タンパクの１つである。更に、７ ４アミノ酸ペプチドであるヒトＣ５ａは免疫系細胞に対する化学誘因物質として の役目を果たす。 Ｃ５ａ様受容体は７膜貫通受容体（Ｔ７Ｇ）に結合したＧタンパク質であり、 Ｔ７Ｇは好中球、マクロファージ、及びマスト細胞上に存在し、Ｇ_q−／Ｇ₁₁− タンパク質に結合してホスホイノシトールシグナル伝達経路を活性化する物と信 じられている。この受容体は３５０個のアミノ酸を含み、Ａｓｎ５の部位でグリ コシル化されて５２〜５５ｋＤａのタンパク質を産生する。ジスルフィド結合に より第１外部ループにおけるＣｙｓ¹⁰⁹と第２外部ループにおけるＣｙｓ¹⁸⁸とが リンクされる。Ｃ５ａ受容体はクローニングされた（Ｂｏｕｌａｙ ｅｔ ａｌ （１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍ ３０：２９９３−９９； Ｇｅｒａｒｄ （ １ ９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：６１４−１７； ａｎｄ Ｇｅｒａｒｄ ｅ ｔ ａｌ （１９９２） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４９：２６００−０６）。Ｃ ５ａ受容体のＮ末端における６つのＡｓｐ残基は、Ｃ５ａリガンドにおけるＡｒ ｇ及びＬｙｓ残基に結合する物と考えられる。ペプチドリガンドに対するその親 和性及び短い第３細胞内ループを有している点で、Ｃ５ａ受容体はニューロキニ ンＴ７Ｇ受容体に最も近縁な物であるといえる。 Ｔ７Ｇは原形質膜を横断する７つの疎水性ドメインを特徴的に含み、逆平行α 螺旋の束を形成する。これらの膜貫通セグメントはＩ−ＶＩＩによって示され、 これは受容体の構造的及び機能的特徴を説明している。多くの場合、この束は結 合ポケットを形成するが、結合部位が最も嵩高い分子に適合する物でなければな らない場合、細胞外Ｎ末端セグメントまたは３つの細胞外ループの１若しくは２ 以上が結合に関与し（Ｗａｔｓｏｎ Ｓ ａｎｄ Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ Ｓ （１９９４） Ｔｈｅ Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅ ｇｏ ＣＡ）、その後受容体の細胞内タンパク質の立体配置の変化の誘発に関与 する。活性化された受容体は細胞内Ｇタンパク質複合体と相互作用するが、この 複合体は更に細胞内シグナル伝達活性、一般にサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ） 、ホスホリパーゼＧ、イノシトール三リン酸、またはイオンチャネルタンパク質 のような二次メッセンジャーの産生を媒介する。 ニューロキニン型受容体には、タキキニン（ＴＫ）、ホルミルペプチド（ｆＭ ＬＰ）ＧｎＲＨ、及びプロスタグランジンＥ受容体が含まれる。このような受容 体は大半がペプチドである大型のリガンドで、Ｔ７Ｇの結合ポケットには適合し ない。Ｎ末端及び第１細胞外ループは共通のタ キキニンモチーフ認識部位を有し、第２及び第３細胞外ループは受容体の中で異 なっているホルモン特異的配列に結合する。全てのイソ型に共通なＣ末端は膜貫 通螺旋に結合し受容体を活性化する。第３細胞内ループはこのグループの中で極 めて短い物で、ｆＭＬＰでは、１５アミノ酸の長さしかない。このような受容体 の多くは短いＣ末端を有し、ＧｎＲＨでは完全にＣ末端ドメインを欠いている（ Ｂｏｌａｎｄｅｒ ＦＦ （１９９４） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉ ｎｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ ）。 新規なＣ５ａ用受容体の同定により、このような受容体が発現されたり、そう でなければそれに積極的に関与する生理学的または病理学的条件の診断や介入の 機会が得られることになる。 発明の開示 本発明は、ＣＡＬＲと略称される新規なヒトＣ５ａ様受容体ホモログを一義的 にコードするヌクレオチド配列を提供するものである。また、ｃａｌｒなる符号 で表されるｃＤＮＡは、インサイト社クローンＮｏ．８１１８を用いて、ヒトマ スト細胞ｃＤＮＡライブラリーから同定され、クローニングされた。 また、本発明は，ＣＡＬＲの発現に関連するやシグナル伝達活性に関連する状 態や疾病の診断や治療におけるＣＡＬＲまたはその変異体のヌクレオチド配列や アミノ酸配列の使用にも関連する。本発明の実施形態として、ｃａｌｒのアンチ センスＤＮＡ、ｃａｌｒを含むクローニングベクターまたは発現ペクター、ｃａ ｌｒを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞または生物、宿主細胞からの 精製ＣＡＬＲタンパク質の産生及び回収方法がある。また、診断または治療のた めの抗体、アンタ ゴニスト、またはインヒビターを産生するのに、精製タンパク質ＣＡＬＲが用い られ得る。 図面の簡単な説明 第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図は、ヌクレオチド配列（配列番号：１）と ＣＡＬＲのアミノ酸配列（配列番号：２）とのアライメントを示した図である。 部分的ヌクレオチド配列を完全長にまで延長するのに用いられるオリゴマーは、 ＸＬＲ＝ＧＡＡＡＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＧ及びＸＬＦ＝ＡＧＡ ＡＡＧＣＡＡＧＧＣＡＧＴＣＣＡＴＴＣＡＧＧであった。 第２図に示すのは、ＣＡＬＲと、イヌ由来のＣ５Ａアナフィラトキシン受容体 ＣＦＯＭＣ５ＡＭとのアライメントである。枠で囲んで示された残基が一致する ものである。 発明の実施の形態 本明細書において、ＣＡＬＲとは、配列番号：２に開示された配列を有する、 自然発生のものであるか、または化学的に合成された形態のＣ５ａ様受容体ホモ ログ、またはその活性フラグメントを意味する。一実施例においては、ポリペプ チド（大文字のＣＡＬＲで表される）は、配列番号：１のｃＤＮＡ（小文字のｐ ｎｒで表される）から転写されたｍＲＮＡによりコードされるものである。 本明細書において、“活性”なる用語は、自然発生ＣＡＬＲの生物学的及び／ または免疫学的活性を保持しているＣＡＬＲの形態を意味する。 本明細書において、“自然発生ＣＡＬＲ”なる用語は、生物工学的処 理を受けていない細胞により生成されたＣＡＬＲを意味し、より具体的には、ア セチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（lipidation）及 びアシル化を含む翻訳後修飾されたポリペプチドから生成される様々なＣＡＬＲ の形態を表現する用語である。 本明細書において、“誘導体”なる用語は、ユビキチン化、ラベリング（例え ば放射性核種や、様々な酵素修飾による標識付け）、ペジレーション（ポリエチ レングリコールによる誘導体化）のような化学的修飾されたＣＡＬＲ、及び例え ばオルニチンのような通常はヒトタンパク質において自然発生しないアミノ酸の 化学合成による挿入断片または置換体によって得られるＣＡＬＲを意味する。 本明細書において、“組換え変異体”なる用語は、組換えＤＮＡ技術を用いて 生成されるアミノ酸の挿入、除去、及び／または置換により自然発生ＣＡＬＲと は異なるものとなった任意のポリペプチドを意味する。酵素活性のような、興味 の対象となる活性を損なわずに置換、付加、あるいは除去され得るアミノ酸残基 を決定するためには、特定のＣＡＬＲの配列と相同な分子の配列とを比較し、高 度に保存的な領域でのアミノ酸配列の変化の数を最小にすればよい。 アミノ酸“置換”は、例えばロイシンからイソロイシンまたはバリンへの置換 、アスピレートからグルタメートへの置換、スレオニンからセリンへの置換、即 ち保存的アミノ酸置換のような１個のアミノ酸が構造的及び／または化学的特性 がそれに類似した他の１個のアミノ酸で置換されたものであるのが好ましい。ア ミノ酸の“挿入”または“除去”は、通常１〜５個のアミノ酸の範囲で行われる 。組換えＤＮＡ技術を用いてＣＡＬＲ分子のアミノ酸の挿入、除去、または置換 を体系的に行い、得られた組換え変異体の活性を検定することにより、許容され る変異体が実験的に決定され得る。 必要ならば、ＣＡＬＲポリペプチドを細胞膜を通さしめる“シグナル配列また はリーダー配列”を含むようにすることができる。当業者には理解されようが、 このような配列は、本発明のポリペプチド上に自然に存在するか、あるいは組換 えＤＮＡ技術により異種タンパク質源から得られる。 本明細書において、ポリペプチド“フラグメント（断片）”、“部分”、また は“セグメント”なる用語は、少なくとも約５個のアミノ酸、少なくとも約７個 のアミノ酸、または少なくとも約８〜１３個のアミノ酸からなり、別の実施例で は約１７個またはそれ以上のアミノ酸をからなるアミノ酸残基の伸展（ストレッ チ）を意味する。活性であるためには、ＣＡＬＲペプチドは、生物学的及び／ま たは免疫学的活性を示すに十分な長さを有していなければならない。 本明細書において、“オリゴヌクレオチド”またはポリヌクレオチド“フラグ メント”、“部分”、“プローブ”、または“セグメント”なる用語は、ポリメ ラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）や様々なハイブリッド形成法において使用するの に十分な長さを有するヌクレオチド残基の任意のストレッチを意味する。オリゴ ヌクレオチドは、本発明により提供されたＣＡＬＲをコードするｃＤＮＡ配列に 基づいて調整され、近縁関係にあるＲＮＡまたはＤＮＡ分子を増幅したり、また は単に明らかにするために使用される。オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１ ０ヌクレオチドから約３５ヌクレオチド、好ましくは約２５ヌクレオチドの長さ を有するＤＮＡ配列の部分を含む。核酸プローブは約６ｋｂより少ない塩基対数 の、通常は約１ｋｂ未満の大きさのｃａｌｒ配列の部分を含む。 偽陽性を除去するための適切な試験の後、オリゴヌクレオチドプローブ及び核 酸プローブの双方を、ＣＡＬＲをコードするメッセンジャーＲＮＡが細胞または 組織内に存在するか否かを判定したり、Ｗａｌｓｈ ＰＳ ｅｔ ａｌ （１９９２， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ １：２ ４１−５０）に記載のように染色体ＤＮＡからの天然核酸配列に類似したものを 単離するために用いることができる。 プローブは、自然発生核酸、組換え一本鎖または二本鎖核酸に由来するものか 、若しくは化学的に合成されたものであり得る。プローブの標識化は、ニックト ランスレーション法、クレノウフィルイン反応法、ＰＣＲ法、または当分野にお いて周知の他の方法を用いて行われ得る。本発明のプローブを調製し、標識する 方法は、“Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ Ｅ ｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ”または“Ａｕｓｕｂｅ ｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｌｓ ｉ ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ ２， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ ｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ”に詳しく述べられており、これらの文献を本明細書と共に 参照されたい。 Ｔ７Ｇをコードする組換え変異体は、遺伝暗号の“重複性”を利用することに より合成、または選択され得る。様々な切断部位を作り出すサイレント変化のよ うな、様々なコドン置換を導入することで、プラスミドやウィルスベクターへの クローニング、または特定の原核細胞系または真核細胞系における発現を最適化 することができる。また、コドン使用特定突然変異（codon usage-specific mut ations）を導入することによって、それがＣＡＬＲポリペプチドまたはＣＡＬＲ ポリペプチドに付加された他のペプチドのドメインにおいて反映され得ることに なり、ポリペプチドの特質を修正したり、リガンド結合親和力、鎖間親和力、ま たは変性／ターンオーバー速度のような特性を変えることもできる。 本発明は、初めにヒトマスト細胞において同定された新規なヒトＣ５ ａ様受容体のホモログを一義的に同定するヌクレオチド配列を提供するものであ る。ｃａｌｒの配列は配列番号：１に示されており、ＧｅｎＢａｎｋのイヌのＣ ５ａアナフィラトキシン受容体配列ＣＦＣＯＭＣ５ＡＭに対して相同性を有する 。インサイト社Ｎｏ．８１１８はＣ５ａ受容体とアミノ酸配列が４５％一致して おり、Ｎ末端にカルボキシレート残基を３つだけ（うち二つはＡｓｐでなくＧｌ ｕ）有する点で異なっている。更に、インサイト社Ｎｏ．８１１８のＮ末端は、 公表されたＣ５ａ受容体のそれより短く、異なる結合特異性を有していることが 予想される。 ＣＡＬＲは免疫活性の細胞において発現されることから、核酸（ｃａｌｒ）、 ポリペプチド（ＣＡＬＲ）、及びＣＡＬＲに対する抗体は、免疫におけるマスト 細胞の役割に関連する正常な、及び異常な生理学的及び病理学的プロセスにおけ る介入及び調査において有用である。従って、ＣＡＬＲのアップレギュレイトさ れた発現の検定により、アナフィラキシー性または過敏性反応、全身性または局 部的感染症、外傷及び他の組織損傷、高血圧に関与する遺伝的または環境的な疾 病、ガン腫、及び他の生理学的または病理学的問題を原因とする異常なシグナル 伝達事象により起きる状態の診断及び適切な治療を促進することができる。 ＣＡＬＲをコードするヌクレオチド配列（またはその相補的配列）は、分子生 物学の当業者に周知の技術への他の様々な用途を有する。このような技術には、 サザーン分析またはノーザン分析のためのハイブリダイゼーションプローブとし ての使用、ＰＣＲのためのオリゴマーとしての使用、染色体または遺伝子マッピ ングのための使用、ＣＡＬＲの組換体産生のための使用、アンチセンスＤＮＡま たはＲＮＡ、その化学的類似体等の作成における使用、及びドメイン特異的治療 的分子のデザインのためアゴニスト、インヒビターまたはアンタゴニストの選択 のためのキ メラ分子の生成における使用が含まれる。ここに開示したＣＡＬＲをコードする ヌクレオチドの使用方法は、周知技術の一例であり、当業者に周知の何らかの技 術にその使用方法を限定しようとするものではない。更に、未だ開発されていな い分子生物学上の技術であっても、それが例えばトリプレット遺伝暗号及び特異 的塩基対相互作用等の既知のポリヌクレオチド配列の特性に基づく技術である限 り、ここに開示するヌクレオチド配列を使用することができる。 遺伝暗号の縮重（degeneracy）の結果、そのヌクレオチド配列がＣＡＬＲをコ ードするもので限り、既知のヌクレオチド配列及び自然発生遺伝子のヌクレオチ ド配列に対する相同性を有する最小限のヌクレオチド配列を有するヌクレオチド 配列を含む、様々なＣＡＬＲをコードするヌクレオチド配列が産生され得る、と いうことは当業者には理解されよう。本発明は、より具体的には可能なコドン選 択に基づいて組合せを選択することにより生成され得る全ての可能なヌクレオチ ド配列を、その範囲に含んでいる。これらの組合せは、自然発生ＣＡＬＲのヌク レオチド配列に対して適用されるような標準的なトリプレット遺伝暗号に基づい て作られる。また、このような全ての変異体は、具体的にここで開示されたもの と考えられたい。 ＣＡＬＲ及び／またはＣＡＬＲ変異体をコードするヌクレオチド配列は、厳格 な条件の下で自然発生ＣＡＬＲ遺伝子のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可 能なものであるのが好ましいが、実質的に異なるコドン使用頻度をプロセシング するＣＡＬＲまたはＣＡＬＲ誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すこ とは有益であり得る。コドンの選択は、特定の原核細胞または真核細胞の発現宿 主におけるペプチドの発現速度を高めるように選択することができ、このときこ の発現速度は、その宿主における特定のコドンの使用頻度に基づいて決まる。本 発明のＣ ＡＬＲ及び／またはＣＡＬＲ誘導体をコードするヌクレオチド配列を、このコー ドされたアミノ酸配列を変えることなく実質的に変化させる他の理由は、より望 ましい特性、例えば自然発生ヌクレオチド配列から産生されたものより長い半減 期を有するＲＮＡ転写物を作り出すためである。 ＣＡＬＲをコードするヌクレオチド配列は、完全に確立された組換えＤＮＡ技 術（“Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．上述）により様々な他のヌクレオチ ド配列と結合してもよい。ｃａｌｒに結合するのに有用なヌクレオチド配列には 、例えば従来より周知のプラスミド、コスミド、λファージ誘導体、ファージミ ド等のクローニングベクターの組合せが含まれる。興味の対象であるベクターに は、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、シークエンシングベ クター、ＹＡＣ及びＢＡＣマッピングベクター等が含まれる。一般に、興味の対 象となるベクターは、少なくとも１つの生物において複製起点機能を発揮する便 利な制限エンドヌクレアーゼ検知サイト、及び宿主細胞用として選択可能なマー カーを含み得る。 本発明の別の実施例では、ＣＡＬＲをコードする自然発生ヌクレオチド配列と ハイブリッド形成可能なｃａｌｒ特異的核酸ハイブリダイゼーションプローブが 提供される。ＣＡＬＲをコードする配列の検知のためのこのようなプローブは、 配列番号：１の非保存領域から得られるヌクレオチドフラグメントを含むのが好 ましい。類似するカテプシンをコードする配列の検出のためのこのようなプロー ブは、配列番号：１の配列をコードする配列のヌクレオチドの少なくとも５０％ を含むのが好ましい。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、配列番号： １のヌクレオチド配列、または自然発生ｃａｌｒのプロモータ、エンハンサー要 素、及びイントロンを含むゲノムの配列に由来するものであり得る。ハ イブリダイゼーションプローブは、様々なリポーターグループにより標識され得 るが、このリポーターグループには、³²Ｐまたは³⁵Ｓのような放射性核種、若し くはアルカリホスファターゼのような酵素標識が含まれ、これらはアビジン／ビ オチン結合系を介してプローブに結合する。 米国特許第４，９６５，１８８号、第４，６８３，１９５号、及び第４，８０ ０，１９５号明細書に記載されているようなＰＣＲ法の実施において、ＣＡＬＲ をコードするヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドの別の使用方法があ る。このようなＰＣＲにおいて使用されるプローブは、組換えにより得られたも のであるか、化学的に合成されたものであるか、若しくは両者の混合であり得、 また、診断の用に供される分散したヌクレオチドまたは近縁関係にあるゲノム配 列の同定に用いられる可能な変性配列のプールを含み得る。 完全長遺伝子は、１９９５年６月７日に出願された米国特許出願第０８／４８ ７，１１２号明細書に記載の新規な方法を用いて既知の配列からクローニングさ れ得る。この出願の明細書は本明細書と共に参照されたい。ここに記載の方法で は長いＤＮＡ断片を増幅するためにＸＬ−ＰＣＲ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用いている。この方法が開発されたこと により、１人の研究者が多数の遺伝子（最大２０以上）を１度にプロセシングし 、６〜１０日以内に延長（場合によっては完全長）配列を得ることが可能となっ た。この方法は、ライブラリーをスクリーニングするのに標識されたプローブを 利用し、１人の研究者が約３〜５個の遺伝子のみを１４〜４０日かけてプロセシ ングすることができる現在の方法に取って代わるものである。 約２日間で実行され得る第１ステップにおいて、プライマーは既知の部分的配 列に基づいてデザインされ合成される。約６〜８時間かけて行われる第２ステッ プにおいて、この配列は選択されたライブラリーのＰ ＣＲ増幅により延長される。約１日かかるステップ３及び４では、増幅されたｃ ＤＮＡの訂正、及びその適切なベクターへの連結が行われる。約１日かかるステ ップ５では、宿主細菌の形質転換と成長が行われる。約５時間かけられるステッ プ６においては、ＰＣＲ法を用いて、延長された配列の細菌によるクローンのス クリーニングが行われる。約１日かかる最終ステップにおいては、選択されたク ローンの調整と配列決定が行われる。完全長ｃＤＮＡが得られなかった場合には 、元のライブラリーか他の好適なライブラリーを用いて手順全体が繰り返される 。好適なライブラリーは大きいｃＤＮＡのみを含むようにサイズ選択されたもの で、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ ＭＤ）から購入された市販 の胚、肝臓、心臓、及び脳のライブラリーを単体若しくは結合したものからなり 得る。ｃＤＮＡライブラリーはオリゴｄ（Ｔ）またはランダムプライマーと共に 調整されたものであり得る。ランダムプライミングされたライブラリーを利用す ることの利点は、それが遺伝子の５′末端を含む配列をより多く含んでいるから である。ランダムプライミングされたライブラリーは、オリゴｄ（Ｔ）ライブラ リーが完全な遺伝子を生み出さない場合に特に有用であり得る。また、タンパク 質が大きくなるほど、完全な遺伝子が１つのプラスミドの中から見いだされる可 能性は低くなることは明らかである。 近縁関係にある配列に対するハイブリダイゼーションプローブを生成するため の他の方法には、ｍＲＮＡプローブの産生のためのベクターへの、ＣＡＬＲ及び ＣＡＬＲ誘導体をコードする核酸配列のクローニングが含まれる。このようなベ クターは従来より周知であり、または市販されており、例えばＴ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのような適当なＲＮＡポリメラーゼ及び適当な標識をなさ れたヌクレオチドを添加することによりｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合 成するのに使用す ることができる。 現在完全に化学合成によりＣＡＬＲ及びＣＡＬＲ誘導体をコードするＤＮＡ配 列、またはその部分を産生することが可能であり、合成の後、従来より周知の試 薬、ベクター、及び細胞を用いて様々な市販のＤＮＡベクターに挿入することが できる。更に化学合成を用いて、ｃａｌｒ配列若しくはその部分に突然変異を起 こさせることも可能である。 このヌクレオチド配列を用いて、ＣＡＬＲの発現レベルの異常に関連する炎症 及び疾病の検出のためのアッセイを構築することができる。このヌクレオチド配 列は、従来より周知の方法で標識した上で、患者の体液または組織の試料に添加 することができる。ハイブリッド形成がなされるだけの十分なインキュベーショ ン時間の経過後、ヌクレオチドが酵素で標識されていた場合には、目に見えるマ ーカー、染料または他の適当な分子を含有する適合性の液体で試料が洗浄される 。この適合性の液体を洗い流した後、染料を定量し、標準値と比較する。染料の 量が著しく多い場合（別の形態で少ない場合）には、このヌクレオチド配列は試 料とハイブリッド形成したことになる。そして、このアッセイにより炎症及び／ または疾病のような異常状態が確認されたことになる。 ｃａｌｒのヌクレオチド配列を用いて、その遺伝子のマッピングのためのハイ ブリダイゼーションプローブを構築することができる。ここに開示するヌクレオ チド配列の染色体及び染色体の特定の領域へのマッピングを、周知の遺伝子及び ／または染色体マッピング技術を用いて行うこともできる。このような技術には 、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対するリン ケージ分析、既知の染色体に対して特異的なライブラリまたはフローソートされ た染色体調合物を用いたハイブリダイゼーションスクリーニング等が含まれる。 染色体延展（chromosome spread）の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーショ ン 技術については、他の文献、即ち“Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ （１９８８） Ｈ ｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ”に記載されている。 染色体調合物の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び他の物理的染 色体マッピング技術は、追加的な遺伝子地図データと関連付けられ得る。遺伝子 地図データの例としては、“ｔｈｅ １９９４ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｓｓｕｅ ｏ ｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２６５：１９８１ｆ）”がある。物理的染色体地図上での ｃａｌｒをコードする遺伝子の位置と特定の疾病（若しくは特定の疾病に対する 素因）との間の相関関係は、この遺伝病に関連するＤＮＡの領域の範囲を特定す るための助けとなる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、健常者の遺伝子配列 と、キャリアまたは遺伝病の保因者の遺伝子配列との相違を検出することができ る。 ＣＡＬＲをコードするヌクレオチド配列を用いて、周知の組換えＤＮＡ技術を 利用して精製ＣＡＬＲを作り出すことができる。一実施例では成熟ＣＡＬＲをコ ードする核酸が発現され、別の実施例ではプロタンパク質及び成熟ＣＡＬＲをコ ードする核酸が発現され、更に別の実施例ではプロタンパク質配列をコードする 核酸が発現される。遺伝子を単離した後、その遺伝子を発現させる方法を記載し た文献は数多くあるが、その例としては、“Ｇｏｅｄｄｅｌ （１９９０） Ｇ ｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ａ ｎｄ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ． Ｖｏｌ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ ｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ”がある。ＣＡＬＲは、原核細胞または真核細胞の 何れかの様々な宿主細胞内において発現され得る。宿主細胞は、ｃａｌｒヌクレ オチド配列が内生である種と同一の種、あるいは異なる種の何れからでも得るこ とができる。組換えＤＮＡ技術によってＣＡＬ Ｒを産生することの利点には、精製用として高濃度に濃縮されたタンパク質源が 得られること、及び精製のための簡単な手順が利用できるようになることがある 。 ＣＡＬＲをコードするＤＮＡによって形質転換された細胞は、ＣＡＬＲの発現 及び細胞培地からのタンパク質の回収に適切な条件の下で培養され得る。組換え 細胞により産生されたＣＡＬＲは、使用される特定の遺伝子構造に応じて、分泌 されるか、あるいは細胞内に保持され得る。一般に、組換えタンパク質は、分泌 される形態で準備しておくのがより便利である。精製のステップは、使用される 産生プロセスの性質及び産生される特定のＣＡＬＲの性質に基づいて決まる。 ＣＡＬＲポリペプチドを単離するための様々な方法は、当業者の周知となって いる。例えば、このようなポリペプチドの精製のために、本発明の提供する抗体 を用いたイムノアフィニティクロマトグラフィーを利用することができる。タン パク質精製のための他の周知の方法は、例えば、“Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ Ｍ （ １９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ １８２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ”及び“Ｓｃｏｐｅｓ Ｒ （１９８２） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎ ｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ”に記載されており、これ らの文献を本明細書と共に参照されたい。 組換え体による産生に加えて、固相技術を用いた直接のペプチド合成によりＲ ＣＰフラグメントを産生することもできる。（“Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ Ｂ（１９６９） Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ ｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ． Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ； Ｍｅｒ ｒｉｆｉｅｌｄ Ｒ （１９６３） Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ８５：２１４９−２１５４”参照）。ｉｎ ｖ ｉｔｒｏタンパク質合成は、手作業、あるいは機械により自動的に行うことがで きる。自動的な合成は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１ Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃ ａｌｉｆｏｒｎｉａ）を製造業者の指示に従って用いることにより行うことがで きる。ＣＡＬＲの様々なフラグメントを個別に化学合成し、化学的な方法により 結合することによって完全長ＣＡＬＲを産生することもできる。 抗体の誘発において使用するためのＣＡＬＲは、生物学的活性を有している必 要はないが、免疫活性を有していなければならない。ＣＡＬＲ特異的抗体の誘発 において使用するためのペプチドは、少なくとも５個、好ましくは少なくとも１ ０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含む。このペプチドは、タンパク質の一 部分を模しており、ＣＡＬＲのような自然発生分子の全アミノ酸配列を含んでい てもよい。ＣＡＬＲのアミノ酸配列の短いストレッチは、ヒザラガイヘモシアニ ン（ＫＬＨ）や抗体産生に使用されるキメラ分子のような他のタンパク質のスト レッチと融合され得る。 ＣＡＬＲに対して特異的な抗体は、適当な動物にＣＡＬＲ配列を接種すること により産生され得る。本発明においては、ポリペプチドは成熟ＣＡＬＲ配列、プ ロタンパク質配列、またはプロタンパク質及び成熟ＣＡＬＲ配列、もしくはシグ ナル配列、プロタンパク質配列及び成熟配列を含むポリペプチドであり得る。抗 体が、自然発生または組換えタンパク質の少なくとも一部分に対して産生され、 そのタンパク質の全体または一部分に結合するならば、その抗体はＣＡＬＲに対 して特異的であると言える。抗体の誘発は、動物への注射により生ずる免疫反応 の刺激作用によるもののみならず、合成抗体、または組換え免疫グロブリンライ ブラリ（“Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ （１９８９） ＰＮＡＳ ８６：３８ ３３−３８３７またはＨｕｓｅ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１２７５−１２８１”参照）またはリンパ球集団のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺 激作用によっても起こる。現在の技術（“Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅ ｉｎ （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９”）では、抗体形 成の原理に基づき、高度に特異的に結合する多数の試薬を提供することができる 。このような技術は、ＣＡＬＲの特定のドメインに特異的に結合し得る分子の生 成に容易く適用することができる。 本発明の別の実施例では、ＣＡＬＲ特異的抗体を、アナフィラキシー性または 過敏性反応、全身性及び局部的感染症、外傷及び他の組織損傷、高血圧に関連す る遺伝性または環境性疾病、ガン腫、及び他の生理学的若しくは病理学的問題に 関連する異常なシグナル伝達を治療するための生理活性薬剤として使用すること である。 ＣＡＬＲのアゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビターを含む生理活性 組成物は、最大許容投与量を決定するためのほ乳類種に対する臨床研究、及び安 全投与量を決定するための通常のヒトの被験者に対する臨床学的研究を含むいく つかの方法論の何れかによって決定された適切な治療的投与量で投与される。更 に、この生理活性薬剤は、安定性や、半減期のような薬理学的な特性を強化する 様々な十分に確立された化合物または組成物と合成され得る。また、この治療的 生理活性組成物は、静脈注射による血流への供給か、若しくは治療に用いられ得 る他の効果的な手段によって投与され得る。 以下の実施例は、本発明を例示するために提供されている。これらの実施例は 、例示を意図するものであり、本発明の限定を意図するものではない。 産業的応用性 １．ｍＲＮＡの単離及びｃＤＮＡライブラリの構築 本出願のＣＡＬＲ配列は、ヒトマスト細胞ライブラリーを含む配列の中のイン サイト社クローンＮｏ．８１１８（配列番号：１）において初めに同定された。 ヒトマスト細胞ライブラリーを調製するのに用いられるこの細胞はＭａｙｏ Ｃ ｌｉｎｉｃのガン患者から得られた。マスト細胞ｃＤＮＡライブラリーの調製は 、ポリＡ⁺ｍＲＮＡを精製し、二本鎖の相補的ＤＮＡを酵素を用いて合成するこ とによって行われた。合成アダプターは平滑末端を有するｃＤＮＡにリゲートさ れ、ついでこれがファージラムダ由来Ｕｎｉ−ＺＡＰ（商標）ベクター（Ｓｔｒ ａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）にリゲートされた。これによって 高度に効率的な一方向性（センス方向）ラムダライブラリーを構築し、ｃＤＮＡ を挿入したクローンを検出するための青−白色選択を備えたプラスミド系を利用 する利点を得ることが可能となる。 ｃＤＮＡライブラリーの品質は、ＤＮＡプローブを用いてスクリーニングされ 、次いでｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅ ｎｅ）が切除された。このファージミドによって、容易にインサートの特徴づけ 、シークエンシング、部位特異的突然変異誘発、一方向性欠失、融合ペプチドの 発現ができるようにするプラスミド系の使用が可能になる。次いで、カスタムメ イドで構築されたライブラリーのファージ粒子がＥ． ｃｏｌｉ宿主型のＸＬ１ −Ｂｌｕｅ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に感染させられた。別の一方向性 ベクターとしては、ｐｃＤＮＡＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇ ｏ）及びｐＳＨｌｏｘ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗ Ｉ）が含まれうるが、これらに限定されない。 ２．ｃＤＮＡクローンの単離 個々のｃＤＮＡクローンのファージミド形態は、ｉｎ ｖｉｖｏ切除プロセス により得られた。このプロセスでは、宿主細菌株が、ライブラリーファージとｆ １ヘルパーファージとの双方に共感染された。ラムダファージ及びｆ１ヘルパー ファージの双方から誘導されたタンパク質は、ラムダ標的ＤＮＡ上の定められた 配列から新たなＤＮＡ合成を開始し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラ スミド及びｃＤＮＡ挿入断片の全てのＤＮＡ配列を含む小型の一本鎖環状ファー ジミドＤＮＡ分子を作り出す。このファージミドＤＮＡは、細胞から放出され、 精製されて、次いで新鮮な細菌性宿主細胞（ＳＯＬＲ）に再感染するのに使用さ れて、重鎖のファージミドＤＮＡが産生された。ファージミドがβ−ラクタマー ゼに対する遺伝子を保有していることから、新たに形質転換された細菌がアンピ シリンを含む培地上で選択された。 ファージミド精製には、ＱＩＡＧＥＮ社（９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅ．， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ ９１３１１）のＱＩＡＷＥＬＬ−８ファスミド 精製系を用いる。この技術は、細菌細胞を溶解し、高度に精製されたファージミ ドＤＮＡを単離するための高速で信頼性が高く高スループットの方法である。こ のＤＮＡは精製樹脂から溶離され、ＤＮＡ配列決定及び他の分析走査のために調 製された。 ３．ｃＤＮＡクローンの配列決定 これらのマスト細胞ライブラリからランダム単離されたｃＤＮＡ挿入断片は、 部分的に配列決定された。従来の酵素を用いた方法では、ＤＮＡポリメラーゼク レノウフラグメントＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（登録商標）（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｃａｌ Ｃｏｒｐ． Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， ＯＨ）またはＴａｑポリメラーゼ のような酵素を使用して、目的のＤ ＮＡ鋳型にアニールされたオリゴヌクレオチドプライマーからＤＮＡ鎖を伸展さ せる。このような方法は一鎖若しくは二鎖の鋳型の双方を使用するために開発さ れてきた。鎖終結反応生成物は、電気泳動及び尿素アクリルアミドゲルを用いて 分離され、オートラジオグラフ法（放射性核種で標識された前駆物質を用いる場 合）、若しくは蛍光剤（蛍光剤で標識された前駆物質を用る場合）の何れかによ って検出される。反応調製、配列決定、及び蛍光検出法を用いた分析において、 最近の機械化により、１日に決定される配列の数を増やすことが出来るようにな った（ｔｈｅ Ｃａｔａｌｙｓｔ ８００、またはＨａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒ ｏＬａｂ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ ＮＶ）、を４台のＰｅｌ ｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＰＴＣ２００； ＭＪ Ｒｅｓｅａ ｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）及びｔｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ ｙｓｔｅｍｓ ３７７及び３７３ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓを用いる）。 ４．ｃＤＮＡクローン及び演繹されたタンパク質の相同性検索 各ｃＤＮＡはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の検索アルゴリズム を、ＩＮＨＥＲＩＴ（商標）６７０配列分析システムに組み込んで用いて、Ｇｅ ｎＢａｎｋの配列と比較を行った。このアルゴリズムにおいては、Ｐａｔｔｅｒ ｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｌａｎｇｕａｇｅ（ＴＲＷ社製， Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ ＣＡ）を用いて、相同領域の決定を行った。配列比較をどのよ うに行うかを定める３つのパラメータは、ウィンドウサイズ、ウィンドウオフセ ット、及び誤差許容度であった。これら３つのパラメータの組合せを用いて、問 題の配列に対して相同性を有する領域を含む配列をＤＮＡデータベースから検索 し、適当な配列に対して初期値と共に点数が付けられた。続いて、これらの相同 領域を、ドットマトリクス相同性プロット法を用いて検定し、 偶然の一致と真の相同領域とを区別した。相同性検索の結果を表示するのにＳｍ ｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアラインメントを用いた。 ペプチド及びタンパク質配列の相同性は、ＩＮＨＥＲＩＴ（商標）６７０配列 分析システムを用いてＤＮＡ配列の相同性の検査と似た方法で確認された。Ｐａ ｔｔｅｒｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｌａｎｇｕａｇｅ及びパラメータウ ィンドウを用いて、相同性領域を含むタンパク質配列のデータベースを検索し、 相同領域は初期値と共にスコアを付けられて表示された。ドットマトリクス相同 性プロット法により検定を行い、有意な相同性領域を偶然の一致から区別した。 別の方法としてＢＬＡＳＴ（ベーシック局部的一致検索ツール）（“Ａｌｔｓ ｃｈｕｌ ＳＦ （１９９３） Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００ ； Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ＳＦ ｅｔ ａｌ （１９９０） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉ ｏｌ ２１５：４０３−１０”参照）を用いて、局部的な配列の一致を検索した 。ＢＬＡＳＴはヌクレオチド及びアミノ酸配列双方の一致をチェックして、配列 の類似性を決定する。一致の局部的な性質のために、ＢＬＡＳＴは正確な一致を 求めたり、あるいは相同性を同定するのに特に有用である。ＢＬＡＳＴは、ギャ ップを含まない一致を求めるのに有用なのである。ＢＬＡＳＴアルゴリズム出力 の基本ユニットは、Ｈｉｇｈ−ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｅｇｍｅｎｔ Ｐａｉｒ（Ｈ ＳＰ）である。 ＨＳＰは、任意の、長さが等しく互いの一致部分が局部的に最大で、一致スコ アがユーザがセットしたカットオフスコアまたは閾値スコアに達するかそれを超 えるような２つの配列フラグメントからなる。ＢＬＡＳＴを用いる方法により、 問題の配列とデータベース配列とのＨＳＰを捜し、発見された一致の統計的な有 意性を評価し、ユーザが選択した有意性の閾値を満たす一致のみを知ることがで きる。パラメータＥはデー タベース配列との一致で報告されるものを選択するための統計的有意性の閾値を 設定する。Ｅは、データベース検索全体の前後関係の中でのＨＳＰ（若しくはＨ ＳＰの組）の偶然の一致の期待される頻度上限と解釈される。Ｅを満たすデータ ベース配列はプラグラムの出力において報告される。 ５．同定、完全長クローニング、配列決定、及び翻訳 マスト細胞ライブラリーからランダムに釣り上げられ、配列決定されたクロー ンの一部をＩＮＨＥＲＩＴ（商標）により分析した結果、イヌのＣ５ａ様受容体 のホモログＣＦＯＭＣ５ＡＭとしてインサイト社クローンＮｏ．８１１８が同定 された。インサイト社クローンＮｏ．８１１８を含むｃＤＮＡ挿入断片は、完全 に配列決定され、完全長ｃＤＮＡのクローニングのための基礎として用いられた 。 インサイト社Ｎｏ．８１１８のｃＤＮＡは１９９５年６月７日に出願されたＧ ｕｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．による米国特許出願第０８／４８７，１１２号明細 書に記載の変更型ＸＬ−ＰＣＲ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）手順を用いて完全 長まで延長された。この明細書は本明細書と共に参照されたい。プライマーは既 知の配列に基づいて設計された。プライマーの１つはアンチセンス方向（ＸＬＲ ＝ＧＡＡＡＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＧ）への延長を開始するため のものとして合成され、他方はセンス方向（ＸＬＦ＝ＡＧＡＡＡＧＣＡＡＧＧＣ ＡＧＴＣＣＡＴＴＣＡＧＧ）に配列を延長するためのものとして合成された。こ のプライマーにより、配列を“外向きに”延長させ、目的の遺伝子に対する新た な未知のヌクレオチド配列を含む単位複数配列を生成することが可能となる。こ のプライマーはオリゴ４．０（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎ ｃ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ ＭＮ）を用いて２２〜３０のヌクレオチドからなる長 さを有し、５０％以上のＧＣコンテ ントを有し、約６８〜７２℃の温度でターゲット配列にアニールするように設計 され得る。ヘアピン構造で、プライマー−プライマー二量体形成を引き起こすよ うな任意のヌクレオチドのストレッチの生成は回避される。 マスト細胞ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用いて、目的の遺伝子を含む配 列を増幅するためにＸＬＲ及びＸＬＳプライマーが用いられた。ＸＬ−ＰＣＲキ ットの指示に従うことで、そのキットの要素の忠実度の高い増幅が達成される。 各プライマーの２５ｐＭｏｌ及び推奨された濃度のキットの他の全ての成分を用 いてで開始されたＰＣＲは、ＭＪ ＰＴＣ２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）を用いて以下のパラメータで実行された。 ステップ１ ９４℃で６０秒間（初期変性） ステップ２ ９４℃で１５秒間 ステップ３ ６５℃で１分間 ステップ４ ６８℃で７分間 ステップ５ ステップ２〜４を更に１５回反復 ステップ６ ９４℃で１５秒間 ステップ７ ６５℃で１分間 ステップ８ ６８℃で７分１５秒／サイクル ステップ９ ステップ６〜８を更に１１回反復 ステップ１０ ６８℃で７分１５秒間 ステップ１１ ４℃（この温度を保持） ２８サイクル目の終わりに、５０μｌの混合反応物が取り除かれ、残りの反応 混合物に対して追加の１０サイクルが実施される。その概要を以下に示す。 ステップ１ ９４℃で１５秒間 ステップ２ ６５℃で１分間 ステップ３ ６８℃で（１０分間＋１５秒間）／サイクル ステップ４ ステップ１〜３を更に９回反復 ステップ５ ７２℃で１０分間 反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを、ミニゲル上で分析し、反応が成功 したか否かを決定した。どの延長反応生成物も完全長遺伝子を含んでいる可能性 はあるが、最も大きい生成物が選択され、低濃度（約０．６〜０．８％）アガロ ースゲル上で電気泳動を行うことによってテンプレートから分離した。目的の遺 伝子を表現するバンドは、ゲルから切り取られ、ＱＩＡＱｕｉｃｋ（商標）ゲル 抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ ＣＡ）のような 方法を用いて生成された。クレノウ酵素を用いて、末端部の張り出しを、生成物 の再連結及びクローニングが容易な平滑末端にトリムした。 エタノール沈殿の後、生成物を１３μｌの連結反応緩衝液に再び溶解した。つ いで、１μｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレ オチドキナーゼを添加し、その混合物は、室温で２〜３時間、または１６℃で一 晩インキュベーションされた。競合的（competent）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（４０μ ｌ適当な媒質）を、３μｌの連結反応混合物で形質転換し、８０μｌのＳＯＣ培 地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ 等， ｓｕｐｒａ）において培養された。３７℃で １時間のインキュベーションの後、形質転換混合物の全てを２５ｍｇ／Ｌのカル ベニシリンを含むＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）−ａｇａｒ （Ｓａｍｂ ｒｏｏｋ Ｊ 等， ｓｕｐｒａ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ 等， ｓｕｐｒａ） にプレート（plated）した。後日、各プレートから１２個のコ ロニーをランダムに取り出し、適当な市販の無菌９６穴マイクロタイタープレー トの各穴において１５０μｌの液体ＬＢ／カルベニシリン媒質で培養した。後日 一晩培養された各５μｌを非無菌型９６穴プレートに移し、水で１：１０に希釈 した後、５μｌの各試料をＰＣＲアレイに移した。 ＰＣＲ法による増幅のため、０．７５単位のＴａｑポリメラーゼベクタープラ イマー、及び延長反応に使用される遺伝子特異的プライマーの１つもしくは複数 を含む濃縮ＰＣＲ反応混合物（１．３３Ｘ）の１５μｌを、各穴に添加した。増 幅は以下のような条件のもとで実行された。 ステップ１ ９４℃で６０秒間 ステップ２ ９４℃で２０秒間 ステップ３ ５５℃で３０秒間 ステップ４ ７２℃で９０秒間 ステップ５ ステップ２〜４を更に２９回反復 ステップ６ ７２℃で１８０秒間 ステップ７ ４℃（その温度を保持） ＰＣＲ反応のアリコットは、アガロースゲルの上で分子量マーカーとともに反 応させた。ＰＣＲ生成物のサイズを元の部分ｃＤＮＡと比較し、適当なクローン を選択してプラスミドに連結し、配列決定を行った。 ヒトＣＡＬＲのｃＤＮＡ配列（配列番号：１）及びアミノ酸配列（配列番号： ２）は第１Ａ図〜第１Ｃ図に示されている。インサイト社のｃａｌｒはＣ５ａ受 容体配列と比較したときＢＬＡＳＴスコアで４１２をマークし、偶然の配列の類 似性の発生の蓋然性は１．８^-50であった。このｃａｌｒホモログは、ＢＬＡＳ Ｔスコアで３８１〜３６３をマークし偶然の一致の可能性が７．４^-46〜３．２^{- 43} となるような様々なＮホル ミルペプチド受容体にも類似している。ＣＡＬＲの翻訳を、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ やＰＩＲのようなタンパク質データベースで検索したが、完全に一致するものは 見いだされなかった。第２図に示すのは、ヒトｃａｌｒ配列とイヌのＣ５ａ受容 体の配列ＣＦＯＭＣ５ＡＭとの比較である。 ６．アンチセンス分析 ＣＡＬＲの正しい完全なｃＤＮＡ配列を知ることにより、遺伝子機能の調査に おけるアンチセンス技術に、これを応用することが可能になる。オリゴヌクレオ チド、即ちｃａｌｒのアンチセンス鎖を含むゲノムのまたはｃＤＮＡのフラグメ ントをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで用いて、ｃａｌｒのｍＲＮＡの 発現を阻害することができる。このような技術は周知であり、ヌクレオチド配列 の様々な部位に付くプローブをデザインすることができる。細胞または実験動物 の全体をこのようなアンチセンス配列で処理することより、ｃａｌｒ遺伝子の機 能を効果的に遮断することができる。多くの場合、細胞レベル、組織レベル、若 しくは生物体全体のレベルでの挙動（例えば死亡率、分化した機能の消失、形態 の変化等）を観察することにより、ｃａｌｒ遺伝子の機能を確認することができ る。 開放された読み枠の転写を妨害するように構築された配列を用いることに加え て、イントロン領域、プロモータ／エンハンサー要素、またはトランス作用調節 遺伝子に対するアンチセンス配列をデザインすることにより、遺伝子発現を修飾 することができる。同様に、“三重らせん体（トリプルヘリックス）”塩基対と して知られるＨｏｇｅｂｏｏｍ塩基対を用いて阻害を達成することができる。 ７．ＣＡＬＲの発現 ｃａｌｒの発現は、ｃＤＮＡを適当な発現ベクターにサブクローニングし、そ のベクターを適当な発現宿主に導入させることにより達成され る。このような特定の場合では、以前に組織ライブラリの生成のために使用され たクローニングベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔまたはｐＳｐｏｒｔ ＩもＥ ．ｃｏｌｉにおけるｃａｌｒ配列の直接的発現をなさしめる。例えば、クローニ ングサイトの上流において、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔはβガラクトシダーゼのプ ロモータを有し、それに続けてアミノ末端Ｍｅｔ及び次に続くβガラクトシダー ゼの７つの残基を含む配列を含む。これらの８つの残基のすぐ後に、人為的プラ イミング及び転写に役立つ工学的処理をなされたバクテリオファージプロモータ 、及びクローニングのための、Ｅｃｏ ＲＩを含む多数の独特な制限サイトを有 する。 標準的方法を用いて、単離された、ＩＰＴＧのトランスフェクションをなされ た菌種の誘発により、βガラクトシダーゼの始めの７つの残基とリンカーの約１ ５個の残基に対応する融合タンパク質、及びｃＤＮＡにコードされたペプチドが 生成される。ｃＤＮＡクローン挿入体は必ずランダムプロセスによって生成され ることから、含まれたｃＤＮＡが適切な翻訳のための正しい読み枠内に存在する 機会は３つに１つだけである。ｃＤＮＡが適当な読み枠内にない場合には、それ は周知の方法で適切な数の塩基の削除若しくは挿入を行うことによって得られる 。このような方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発、エキソヌクレアー ゼＩＩＩ若しくは大豆ヌクレアーゼによる消化、若しくはオリゴヌクレオチドリ ンカー混入などがある。 別の形態として、ｃａｌｒのｃＤＮＡは、特異的宿主におけるタンパク質の発 現のために有用であると知られている他のベクター内にシャトルされる。標的ｃ ＤＮＡ（約２５個の塩基）の両端のストレッチに対してハイブリッド形成するの に十分なＤＮＡのセグメントとクローニングサイトを含むオリゴヌクレオチドア ンプリマーは、標準的方法によって 化学的に合成され得る。次いでこれらのプライマーを用いて、ＰＣＲにより所望 の遺伝子セグメントが増幅される。得られた新たな遺伝子セグメントは、標準状 態のもとで適当な制限酵素で消化され、ゲル電気泳動法によって単離される。こ れとは別の方法では、類似する遺伝子セグメントを、ｃＤＮＡを適当な制限酵素 と共に消化し、欠失した遺伝子セグメントを化学的に合成されたオリゴヌクレオ チドで埋めることによって生成する。１以上の遺伝子からのコーディング配列の セグメントを互いに連結し、適切なベクターにクローニングすることにより、組 換え配列の発現が最適化される。 このようなキメラ分子のための適切な発現宿主にはチャイニーズハムスターの 卵巣（ＣＨＯ）及びヒト２９３細胞のようなほ乳類の細胞や、Ｓｆ９細胞のよう な昆虫の細胞や、サッカロミセスセレビシエのような酵母菌細胞や、Ｅ．ｃｏｌ ｉのような細菌があるが、これらに限定されるものではない。このような細胞系 のそれぞれに対して有用な発現ベクターは、バクテリア内での増殖を可能にする 複製起点、及び細菌内での選択を可能にするβラクタマーゼ抗生物質抵抗性遺伝 子のような選択可能なマーカーを含んでいる。更に、このベクターは、真核生物 の宿主細胞へのトランスフェクションに役立つネオマイシンホスホトランスフェ ラーゼ遺伝子のような第２の選択可能なマーカーを含む。真核生物の発現宿主に おいて使用するために、ベクターは、それが目的のｃＤＮＡの一部分でない場合 には、３’ポリアデニル化配列のようなＲＮＡプロセシング要素を必要とするこ とがある。 更にこのベクターは、遺伝子発現を増加させるエンハンサまたはプロモータを 含む。このようなプロモータは宿主特異的であって、ＣＨＯ細胞に対してはＭＭ ＴＶ、ＳＶ４０、及びメタロチオネインプロモータ、細菌宿主に対してはｔｒｐ 、ｌａｃ、ｔａｃ、及びＴ７プロモータ、ま た酵母菌に対してはα因子、アルコールオキシダーゼ、及びＰＧＨプロモータ等 がある。ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）エンハンサのような転写エンハンサは、 ほ乳類宿主細胞において使用される。標準的な培養方法により、組換え細胞の均 質な培養物がひとたび得られたならば、組換えにより生成された大量のＣＡＬＲ が条件培地から回収され、周知のクロマトグラフィー法を用いて分析される。 ８．組換えＣＡＬＲの単離 ＣＡＬＲは、タンパク質精製を促進するべく添加された１または２以上の付加 的ポリペプチドドメインを有するキメラタンパク質として発現される。このよう な精製促進ドメインには、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジントリプ トファンモジュールのような金属キレートペプチド、固定免疫グロブリン上での 精製を可能にするプロテインＡドメイン、及びＦＬＡＧＳ延長／アフィニティ精 製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ． Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）において使 用されるドメインなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。精製ド メインとｃａｌｒ配列との間のＸＡ因子またはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｔｒｏ ｇｅｎ）のような切断可能なリンカー配列を含むことが、融合タンパク質からの 精製を促進するのに役立っている。 ９．キメラＴ７Ｇの試験 機能的キメラＴ７Ｇは、新たなアイソフォームの細胞外受容的配列と、既知の アイソフォームの膜貫通及び細胞内セグメントとの結合によって構築される。こ のようなキメラ分子は試験用として有用である。この考え方は、Ｋｏｂｉｌｋａ （１９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１３１０−１３１６）によって証明さ れたもので、より多い量のα２−ＡＲ膜貫通配列をβ２−ＡＲに挿入することに よって一連のキメラα２−β２アドレナリン受容体（ＡＲ）を作り出すものであ る。分子がβ２より α２を多く有するコンフォメーションからシフトしたとき既知のアゴニストの結 合活性は変化し、中間体は証明された混合特異性を構築する。しかし、アンタゴ ニストに結合する特異性とドメインＶＩＩのソースとの間に相関関係があった。 リガンド認識についてのＴ７ＧドメインＶＩＩの重要性も、２つの酵母菌α因子 受容体を用いてキメラ上で見いだされ、これは酵母菌受容体が種々雑多の受容体 として分類されていることから重要である。従って、特異的ドメインの機能的な 役割は、そのカテゴリーによらずＴ７Ｇファミリー全体を通して保存されている ように見える。 平行な形態において、特定のアイソフォームからの内部セグメントまたは細胞 質ドメインは、既知のＴ７Ｇの類似ドメインと交換され、受容体と三量体のＧタ ンパク質とを結びつける構造的決定器を同定するのに用いられる（Ｄｏｈｌｍａ ｎ ｅｔ ａｌ （１９９１） Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６０：６ ５３−８８）。ドメインＶ、ＶＩ、及びβ２−ＡＲからの細胞内結合ループがα ２−ＡＲに置換されたキメラ受容体は、リガンドとα２−ＡＲとを特異的に結合 するが、β２−ＡＲと同様にアデニル化シクラーゼを刺激することが見いだされ た。このことはアドレナリン作動型受容体のために、Ｇタンパク質認識部位がド メインＶ及びＶＩ及びその結合ループに存在していることを示している。逆の状 態も予測され、α１−ＡＲからのＶ→ＶＩループがβ２−ＡＲ上の対応するドメ インで置換され、得られた受容体がリガンドとβ２−ＡＲを特異的に結合し、α １−ＡＲと同様にＧタンパク質依存型フォスファチジルイノシトールターンオー バーを活性化したキメラに対して観察された。最後に、ムスカリン受容体から構 築されたキメラも、Ｖ→ＶＩループがＧタンパク質活性の特異性に対する主たる 決定基あることが立証された（Ｂｏｌａｎｄｅｒ ＦＦ， 上述）。 キメラまたは修飾されたＴ７Ｇで細胞外及び膜貫通領域に置換体を含むものは 、受容体の両部分がリガンド結合特異性を決定していることを示していた。例え ば、２つのＳｅｒ残基はアドレナリン作動性及びＤカテコールアミン作動性の受 容体の全てのドメインＶに保存され、アゴニスト活性を発揮するのに必要不可欠 である。これらのセリンはＴ７Ｇ結合部位にあり、アゴニストの糧コール部分に 結合する水素結合を形成する。同様に、生体アミンに結合する全てのＴ７Ｇのド メインＩＩＩに存在するＡｓｐ残基は、Ｔ７Ｇ結合部位に存在し、リガンドアミ ン基とイオン対を形成すると考えられている。 機能的に、クローニングされたＴ７Ｇは異種発現系において発現され、その生 物学的活性が評価された（Ｍａｒｕｌｌｏ ｅｔ ａｌ （１９８８） Ｐｒｏ ｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８５：７５５１−５５； Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０：１２１−２３）。異種系の１つ は、ほ乳類のＴ７Ｇ及びほ乳類のＧタンパク質の遺伝子を酵母菌細胞に導入する 。このＴ７Ｇは適切なリガンド特異性及びアフィニティを有していることを示し 、酵母菌細胞の適切な生物学的活性化−増殖停止及び形態学的変化−の引き金に なることを示した。Ｔ７Ｇドメインに対するインサイト社の配列は同様に試験さ れた。 １０．ＣＡＬＲ特異的抗体の生成 ＣＡＬＲに対する抗体を生成するのに２つの方法が用いられる。それぞれの方 法はポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の何れかを生成するために有用 なものである。その方法の１つでは、逆相ＨＰＬＣ分離により、変性タンパク質 が最大７５ｍｇ得られる。変性タンパク質は標準的なプロトコルを用いてマウス 若しくはウサギを免疫化するのに用いられる。即ちマウスの免疫化に対しては約 １００μｇが適切であり、 ウサギの免疫化には最大１ｍｇが用いられ得る。マウスハイブリドーマの同定の ためには、変性タンパク質が放射性沃素で標識して、抗体を産生し得るネズミの Ｂ細胞ハイブリドーマのスクリーニングを行うのに用いる。この手順で必要とな るタンパク質はごく少量で、即ち数千のクローンの標識付け及びスクリーニング のためには２０ｍｇで十分である。 第２の方法においては、ｃＤＮＡの転写から演繹されるＣＡＬＲのアミノ酸配 列が分析されて、免疫抗原性の高い領域が決定される。適当な親水性領域を含む オリゴペプチドが合成され、抗体を産生するための適切な免疫化プロトコルにお いて使用される。適当なエピトープを選択するための分析は、Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ等（上述）によって説明されている。免疫化のための最適なアミノ酸配列が 通常存在するのは、Ｃ末端、Ｎ末端、及びそれらの間に挟まれた、タンパク質が その自然な配座にあるとき外部環境にさらされることの多いポリペプチドの親水 性領域である。 典型的には、約１５個の残基を有する長さの選択されたペプチドは、ｆｍｏｃ −ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを用いるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐ ｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ４３１Ａを用いて合成され、 Ｍ−メイルイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（M-male imidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester）と反応（ＭＢＳ； Ａｕｓｕｂｅ ｌ ＦＭ 等，上述）させることによってキーホールリンペットヘモシアニン（ ＫＬＨ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）に結合される。必要ならば、Ｋ ＬＨと結合できるようにするため、システインがペプチドのＮ末端に挿入される 。ウサギは、フロイント完全アジュバントのペプチド−ＫＬＨ複合体と共に免疫 化される。得られた抗血清は、ペプチドとプラスチックを結合し、１％のウシの 血清アルブミンでブロックし、抗血清と反応させ、洗浄し、 かつ（放射性またはけい光剤により）標識されたアフィニティ精製された特異的 ヤギ抗ウサギｌｇＧと反応させることによって抗ペプチド活性がテストされる。 ハイブリドーマは標準的な技術を用いて調製されスクリーニングされる。目的 のハイブリドーマは、標識されたＣＡＬＲと共にスクリーニングを行うことによ って検出され、所望の特異性を有するモノクローナル抗体を産生する融合体が同 定される。典型的なプロトコルにおいては、プレートの穴（ＦＡＳＴ； Ｂｅｃ ｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）が、１０ｍｇ／ ｍｌの、アフィニティ精製された特異的ウサギ抗マウス（または適当な抗−種ｌ ｇ）抗体によってコーティングされる。コーティングされた穴は１％のＢＳＡで ブロックされ、洗浄されて、ハイブリドーマからの上澄みに曝される。インキュ ベーションの後、穴は１ｍｇ／ｍｌの標識されたＣＡＬＲに曝される。抗体を産 生するクローンは、上述のバックグラウンドにおいて検出され得る量の標識され たＣＡＬＲと結合する。このようなクローンはが拡大され、限界希釈（１細胞／ ３穴）で２サイクルのクローニングを受ける。クローン化されたハイブリドーマ はプリスタン処理されたマウスに注射されて、それが腹水を生成し、プロテイン Ａ上のアフィニティクロマトグラフィーによってマウスの腹水からモノクローナ ル抗体が生成される。少なくとも１０⁸／Ｍ、好ましくは１０⁹〜１０¹⁰またはそ れ以上の親和性を有するモノクローナル抗体は、典型的には、Ｈａｒｌｏｗ ａ ｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ及びＧｏｄｉｎｇ（ １９８６） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐ ｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙに記載されて いるような標準的な手順によって生成される。ここではこの２つの資料を参照さ れたい。 １１．ＣＡＬＲ特異的抗体を用いる診断テスト 特定のＣＡＬＲ抗体は、ＣＡＬＲや活性シグナリングカスケードの下流生成物 の量若しくは分布の差によって特徴付けられる感染症や遺伝病の診断やシグナル 伝達の調査に役立つ。ＣＡＬＲが特定のヒトｃＤＮＡライブラリで見出されたこ とから、主として免疫や防衛に関連する細胞タイプにおいてアップレギュレート されていると思われる。 ＣＡＬＲに対する診断テスト方法には、人体の体液、膜、細胞、組織、若しく はそのような組織の抽出物におけるＣＡＬＲを検出するべく抗体及び標識を使用 する方法が含まれる。本発明のポリペプチド及び抗体は修飾して使用されるか、 または修飾することなく使用される。このポリペプチド及び抗体は、多くの場合 、検出可能なシグナルを伝達する物質と共有結合、若しくは非共有結合の何れか で結合することによって標識される。さまざまな標識及びその関連技術が知られ ており、科学文書及び特許明細書の双方において広く報告されてきた。適切な標 識としては、放射性核種、酵素、基質、共同因子（cofactors）、インヒビター 、蛍光剤、化学ルミネセンス剤、磁性粒子等がある。このような標識の使用方法 は、米国特許出願第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９ ３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２ ７５，１４９号、及び第４，３６６，２４１号明細書に記載されている。また組 換え免疫グロブリンは、米国特許出願第４，８１６，５６７号明細書に記載の方 法により生成することができる。これらの明細書を本明細書とともに参照された い。 該タンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体、若しくはモノク ローナル抗体の何れかを用いた可溶性ＣＡＬＲまたは膜結合ＣＡＬＲの測定のた めのプロトコルは、様々なものが周知となっている。この例を挙げると、酵素結 合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）、 及び蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）等がある。好適なのは、ＣＡＬＲ上の２ つの非干渉エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を用いる二点（two sites）モノクローナル免疫アッセイであるが、競合的結合アッセイを用いても よいる。これらのアッセイは例えばＭａｄｄｏｘ， ＤＥ 等（１９８３， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １５８：１２１１）のような他の文書に記載されている。 １２．特異的抗体を用いた天然ＣＡＬＲの精製 天然ＣＡＬＲまたは組換えＣＡＬＲは、ＣＡＬＲに対して特異的な抗体を用い る免疫性アフィニティクロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫ア フィニティカラムは、抗ＣＡＬＲ抗体と活性化クラマトグラフィー樹脂とを共有 結合することによって構成される。 ポリクローナル免疫グロプリンは、硫酸アンモニウムとともに沈殿させるか、 固定プロテインＡ上で精製させることによって免疫血清から調製される（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿か固定プロテイ ンＡ上でのクロマトグラフィーによって、マウスの腹水から調製される。部分的 に精製された免疫グロプリンは、ＣｎＢｒ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のようなクロマトグラフ ィー樹脂に共有結合される。製造者の指示に従った処理により、抗体は樹脂に結 合し、この樹脂はブロックされた上で、誘導体樹脂が洗浄される。 このような免疫アフィニティカラムは、ＣＡＬＲを含む細胞の分画を調製する ことによってＣＡＬＲの精製を行うときに使用される。この調 製は、全ての細胞の可溶化を行い、異なる遠心分離法を用いて得られる細胞小分 画の単離を行う方法か、若しくは周知の他の方法によって誘導される。別の方法 では、シグナル配列を含む可溶性ＣＡＬＲが、細胞が成長する媒質に有用な量だ け分泌される。 沈殿物を含む分画のＣＡＬＲは免疫アフィニティカラムを通され、このカラム がＣＡＬＲの優先吸収が可能な条件（即ち、洗剤が存在する高イオン強度の緩衝 液を使用）のもとで洗浄される。次いで、このカラムは抗体／ＣＡＬＲ結合を切 断するような条件（即ち、尿素またはチオシアネートイオンのような高濃度のカ オトロープまたはｐＨ２〜３の緩衝液を使用）の下で溶離され、ＣＡＬＲが回収 される。 １３．薬物スクリーニング 本発明は、様々な薬物スクリーニング技術でＣＡＬＲまたはその結合フラグメ ントを用いた治療的な化合物のスクリーニングにおいて特に役立つ。このような テストで使用されるポリペプチドまたはフラグメントは、溶質に遊離しているか 、個体の担体に固着しているか、細胞の表面や細胞内に存在しているかのいずれ かである。薬物スクリーニング方法の１つでは、ＣＡＬＲを発現する組換え核酸 またはそのフラグメントで安定に形質転換された真核生物もしくは原核生物の宿 主細胞を用いる。薬物は、競合的結合アッセイにおいて、このような形質転換さ れた細胞に対してスクリーニングされる。このような細胞は、生細胞であっても 固定された細胞であっても、標準的な結合アッセイ用として用いられる。例えば 、ＣＡＬＲとテストされる作動薬との複合体の形成が測定される。別の例では、 テストする薬物が、ＣＡＬＲと受容体との複合体形成に与える影響を検定するこ ともできる。 従って、本発明は、シグナル伝達に影響を及ぼす他の薬剤のスクリーニング方 法を提供するものである。この方法は、このような薬物をＣＡ ＬＲポリペプチドまたはそのフラグメントに接触させる過程と、（ｉ）薬物とＣ ＡＬＲポリペプチドまたはフラグメントとの複合体の存在、もしくは（ｉｉ）Ｃ ＡＬＲポリペプチドまたはフラグメントと細胞との複合体の存在を周知の方法を 用いて検定する過程とを含む。このような競合的結合アッセイにおいては、ＣＡ ＬＲポリペプチドまたはフラグメントは通常標識される。適当なインキュベーシ ョンの後、遊離ＣＡＬＲポリペプチドまたはフラグメントは結合された形態にあ るものから分離されて、遊離もしくは非複合化標識の量が、特定の薬物がＣＡＬ Ｒと結合する能力や、ＣＡＬＲ及び作動薬複合体に干渉する能力の測定基準とな る。 薬物スクリーニングのための他の技術で、ＣＡＬＲポリペプチドに対する適切 な結合アフィニティを有する化合物のスクリーニングの高スループットが得られ るが、これについては１９８４年９月１３日に公開されたヨーロッパ特許第８４ ／０３５６４号に詳細に記載されており、ここではこれを参照されたい。簡単に 説明すると、多数の異なる小さなペプチドテスト化合物が、プラスチックピンま たは他の表面のような固体基質上で合成される。このペプチドテスト化合物は、 ＣＡＬＲポリペプチドと反応させられた上で洗浄される。結合されたＣＡＬＲポ リペプチドは、ついで周知の方法を用いて検出される。精製されたＣＡＬＲが、 上述の薬物スクリーニング技術において使用するべくプレート上に直接コーティ ングされてもよい。更に、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、それを固体の 担体上に固定化することもできる。 本発明には、ＣＡＬＲと結合し得る中和抗体がＣＡＬＲポリペプチドまたはそ のフラグメントに結合するテスト化合物と競合する競合的薬物スクリーニングア ッセイの使用も含まれる。この方法においては、抗体がＣＡＬＲと１または２以 上の抗原決定基を共有する任意のペプチドの 存在を検出するために用いられる。 １４．合理的薬物デザイン 合理的薬物デザインの目的は目的の生物学的に活性のポリペプチドの、もしく はそれらが相互作用する小さい分子、即ち、アゴニスト、アンタゴニスト、もし くは阻害剤の構造的類似体を生成することである。これらの例の何れにおいても 、ポリペプチドの活性及び安定性がより勝っている薬物、もしくはｉｎ ｖｉｖ ｏでポリペプチド機能に干渉する薬物を形成するために用いられる。（Ｈｏｄｇ ｓｏｎ Ｊ（１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｎｏｌｏｇｙ ９：１９−２１参照） １つの方法では、目的のタンパク質、もしくはタンパク質−インヒビター複合 体の三次元構造が、Ｘ線結晶法、コンピュータによるモデル化、もしくは最も典 型的にはこの二つの方法を組み合わせることによって決定される。ポリペプチド の形状及び電荷は、構造を明瞭にし分子の活性サイトを決定するため、双方とも に確認されなければならない。ポリペプチドの構造に関する有用な情報は、相同 タンパク質の構造に基づいてモデル化することによって得られることもある。ど ちらの場合においても、得られる構造情報が、効果的な阻害剤をデザインするの に用いられる。合理的薬物デザインの有用な例には、Ｂｒａｘｔｏｎ Ｓ ａｎ ｄ Ｗｅｌｌｓ ＪＡ（１９９２ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：７７９６ −７８０１）によって示されたような活性及び安定性を改善した分子、もしくは Ａｔｈａｕｄａ ＳＢ等（１９９３ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１３：７４２−７ ４６）によって示されたような天然ペプチドの阻害剤、アゴニスト、もしくはア ンタゴニストとして機能する分子があり、ここではこれらの資料を参照されたい 。 上述のような機能的アッセイによって選択された標的特異的抗体を単離し、つ いでその結晶構造を解明することも可能である。この方法は、 原則として、次の薬物デザインのベースとなるファーマコア（pharmacore）を形 成する。機能的で、薬理学的に活性な抗体に対する坑イデオタイプ抗体（ａｎｔ ｉ−ｉｄｓ）を生成することによってタンパク質結晶分析を飛ばすことも可能で ある。鏡像の鏡像という関係で、ａｎｔｉ−ｉｄｓの結合サイトは、もとの受容 体の類似体であると予想される。次いでこのａｎｔｉ−ｉｄｓは、化学的に若し くは生物学的に生成されたペプチドのＢａｎｋからペプチドを同定し単離するの に用いられる。単離されたペプチドはファーマコアとして機能する。 本発明によって、十分な量のポリペプチドが形成され、これはＸ線結晶学のよ うな分析研究を行うのに使用することができる。更に、ここで用いられたＣＡＬ Ｒアミノ酸配列を知ることによって、それをＸ線結晶分析の代わりに用いたり、 更にそれに加えてコンピュータによるモデル化技術を用いる場合の手引きが得ら れる。 １５．シグナル伝達複合体の他のメンバーの同定 精製されたＣＡＬＲは、Ｇタンパク質、ホスホリパーゼＣ、アデニル化シクラ ーゼ、または他のシグナル伝達経路タンパク質の相互作用の同定、特徴付け、及 び精製のための研究用のツールである。放射性標識が周知の様々な方法によって 選択されたＣＡＬＲに組み込まれ、相補作用分子を捕捉するためにｉｎ ｖｉｔ ｒｏで用いられる。好適な方法は、ＣＡＬＲにおける一時アミノ基に、¹²⁵Ｉボ ルトンハンター試薬（Ｂｏｌｔｏｎ， ＡＥ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ， ＷＭ （１９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ １３３：５２９）で標識する過程を含む。 この試薬は、生物学的活性の随伴性損失を引き起こすことなく様々な分子を標識 するために用いられてきた（Ｈｅｂｅｒｔ ＣＡ ｅｔ ａｌ （１９９１） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６：１８９８９； ＭｃＣｏｌｌ Ｓ ｅｔ ａ ｌ （１９９３） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５０：４５ ５０−４５５５）。 標識されたＣＡＬＲは、それが相互作用する分子の精製ための試薬としても有 用である。アフィニティ精製の一実施例においては、膜結合ＣＡＬＲがクロマト グラフィーカラムと共有結合される。推定上の標的細胞に由来する細胞遊離抽出 物は、カラムを通され、適切な親和性を有する分子がＣＡＬＲに結合する。ＣＡ ＬＲ複合体はカラムから回収され、乖離されて、回収された分子はＮ末端タンパ ク質シークエンシングを受ける。このアミノ酸配列を用いて、捕捉された分子を 同定したり、適切なＤＮＡライブラリーから目的の遺伝子をクローニングするた めの変性オリゴヌクレオチドプローブがデザインされる。 別の方法においては、ＣＡＬＲに対する抗体、特にモノクローナル抗体が上述 のように産生される。このモノクローナル抗体はスクリーニングされて、リガン ドとＣＡＬＲとの結合を阻害するものが同定される。このようなモノクローナル 抗体は治療的に使用される。 １６．ＣＡＬＲの抗体、インヒビター、またはアンタゴニストの使用及び投与 ＣＡＬＲの抗体、インヒビター、またはアンタゴニスト（または他のシグナル 伝達を制限する処理剤、ＬＳＴ）は、治療的に投与されたとき異なる効果を発揮 する。ＬＳＴは、非中毒性、不活性、薬学的な許容範囲にある水性担体媒質で配 合される。媒質のｐＨは、好ましくは約５〜８、特に好ましくは６〜８である。 しかし、このｐＨは配合される抗体、インヒビター、またはアンタゴニストの特 性、及び他の条件によって変化しうる。ＬＳＴの特性には、分子の溶解度、半減 期及び抗原性／免疫抗原性が含まれ、これらの特性及び他の特性が効果的な担体 を決める助けとなる。ＬＳＴとしては天然のヒトタンパク質も好適であるが、薬 物スクリーニングによって得られた有機分子または合成分子も、特定の状 況においては同様に効果的である。 ＬＳＴは周知の投与経路で投与される。この投与経路には、局所的クリーム及 びゲル、経粘膜スプレー及びエアロゾル、経皮パッチ及び帯具、注射可能な静脈 の潅注配合物、及び液体及び錠剤の経口薬であって胃酸及び酵素に対して抵抗性 を有するように配合されたもの等があるが、これらに限定されない。特定の配合 、正しい投与量、及び投与経路は病院所属医師によって決定されるが、状況に応 じて様々に変化し得る。 このような決定は、治療条件、投与されるＬＳＴ、及び特定のＬＳＴの薬動力 学的プロファイルのようなさまざな要素を考慮することによってなされる。考慮 に入れるべき他の因子には、患者の病状（例えば重症であるかどうか）、年齢、 体重、性別、食事、時間、及び投与の頻度、薬物の組合せ、反応感受性及び治療 に対する耐性／反応性などがある。長時間作用するＬＳＴの配合物の投与頻度に は、３〜４日に１回の投与、毎週１回の投与、若しくは２週間に１回の投与程度 であるが、この頻度は特定のＬＳＴの半減期及びクリアランス速度によって決ま る。 通常の投与量は０．１〜１００，０００μｇの間であり、総投与量の上限は約 １ｇであるが、これは投与経路によって異なる。特定の投与量及び投与方法に関 する手引きは、米国特許出願第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号 または第５，２２５，２１２号明細書に記載されている。当業者は異なるＬＳＴ に対しては異なる配合が効果的であり、神経細胞への投与には血管内皮細胞のよ うな他の細胞の場合とは異なる投与方法が求められることが予想される。 また、ＬＳＴで治療可能な障害を誘発させ得る状態または疾病や、異常なシグ ナル伝達が考えられる。これらの状態または疾病は上述の診断テストによって診 断されるが、このようなテストは、全身性または局所性の感染症、外傷によるま たは他の組織損傷、高血圧、癌腫、嚢胞性線 維症、及び他の生理学的及び病理学的問題が生じたことが疑われる場合に行われ るべきである。 本明細書に記載した全ての文献及び特許明細書は、本明細書と一体に参照され たい。上述の本発明の方法及びシステムの様々な修正及び変更が、本発明の範囲 及び精神を逸脱することなく行われ得ることは、当業者には明らかであろう。本 発明の特定の実施例について説明したが、これが本発明をこのような特定の実施 例に限定しようとするものではない。実際、本発明の実施においては、当業者に は明らかな上述の実施例の様々な変更が、請求項に記載の本発明の範囲を逸脱す ることなく行われることが意図されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＥＤ Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 16/28 16/28 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＡ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 バンドマン、オルガ アメリカ合衆国カリフォルニア州94043・ マウンテンビュー・ロックストリート 2309 (72)発明者 シールヘイマー、ジェフリー・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94022・ ロスアルトスヒルズ・ラクレスタ 12555 【要約の続き】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号：２に示すアミノ酸配列を備えたポリペプチドをコードする精製ポ リヌクレオチド。 ２．核酸配列が配列番号：１の配列またはその相補的配列を含むことを特徴とす る請求項１に記載のポリヌクレオチド。 ３．生物学的試料におけるヒトＣ５ａ様受容体（ｃａｌｒ）の発現に関連する状 態または疾病に対する診断テスト方法であって、 （ａ）ハイブリダイゼーション複合体形成のための適切な条件の下で、前記生 物学的試料と請求項１のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントとを結合する 過程と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを有することを特 徴とし、 前記ハイブリダイゼーション複合体の存在が前記生物学的試料における請求項 １のポリヌクレオチドの発現と相関関係を有することを特徴とする診断テスト方 法。 ４．請求項１のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。 ５．請求項４の前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 ６．配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成する方法であっ て、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に適切な条件の下で請求項５の宿主細胞を培養 する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むことを 特徴とするポリペプチドの生成方法。 ７．請求項１のポリヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的な核酸配列 を含むアンチセンス分子。 ８．請求項７のアンチセンス分子及び薬学的に許容される賦形剤を含む 薬学的組成物。 ９．ヒトＣ５ａ様受容体の変質した発現に関連する状態または疾病を患う患者を 治療する方法であって、 請求項１２の前記薬学的組成物を効果的な量だけ前記患者に投与する過程を含 むヒトＣ５ａ様受容体の変質した発現に関連する状態または疾病を患う患者の治 療方法。 １０．配列番号：２のアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド。 １１．請求項１０のポリペプチドのアゴニスト。 １２．請求項１１のアゴニスト及び薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成 物。 １３．ヒトＣ５ａ様受容体の変質した発現に関連する条件または疾病を患う患者 の治療方法であって、 請求項１２の前記薬学的組成物を効果的な量だけ前記患者に投与する過程を含 むことを特徴とするヒトＣ５ａ様受容体の変質した発現に関連する状態または疾 病を患う患者の治療方法。 １４．請求項１０のポリペプチドのインヒビター。 １５．請求項１４のインヒビター及び薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組 成物。 １６．ヒトＣ５ａ様受容体ホモログの変質した発現に関連する条件または疾病を 患う患者の治療方法であって、 請求項１５の前記薬学的組成物を効果的な量だけ前記患者に投与する過程を含 むヒトＣ５ａ様受容体ホモログの変質した発現に関連する状態または疾病を患う 患者の治療方法。 １７．請求項１０の精製ポリペプチドに対して特異的な抗体。 １８．生物学的試料におけるヒトＣ５ａ様受容体の発現に関連する状態または疾 病に対する診断テスト方法であって、 （ａ）請求項１７の抗体がポリペプチドに結合し、抗体−ポリペプチド複合体 を形成するのに適切な条件の下で前記生物学的試料と前記請求項１７の抗体とを 結合する過程と、 （ｂ）前記抗体−ポリペプチド複合体を検出する過程とを有することを特徴と し、 前記抗体−ポリペプチド複合体の存在が前記生物学的試料における前記ポリペ プチドの発現と相関関係を有することを特徴とする診断テスト方法。 １９．請求項１７の抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。 ２０．ヒトＣ５ａ様受容体の変質した発現に関連する条件または疾病を患う患者 の治療方法であって、 請求項１９の前記薬学的組成物を効果的な量だけ前記患者に投与する過程を含 むことを特徴とするヒトＣ５ａ様受容体の変質した発現に関連する状態または疾 病を患う患者の治療方法。