JPH11514876A

JPH11514876A - 新規なヒトシステインプロテアーゼ

Info

Publication number: JPH11514876A
Application number: JP9516725A
Authority: JP
Inventors: ディープ、ディン; ブラクストン、スコット・マイケル; デレジーン、アンジェロ・エム
Original assignee: Incyte Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Incyte Corp
Priority date: 1995-10-23
Filing date: 1996-10-23
Publication date: 1999-12-21
Also published as: EP0857175A1; AU7466796A; CA2235575A1; WO1997015592A1; AU728088B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、副腎及びヒトの臍静脈内皮の両方の細胞内で発現された新規なシステインプロテアーゼ（ＮＣＰ）を同定しかつコードするポリヌクレオチドを提供するものである。本発明は、更に、ヌクレオチド配列若しくはその相補配列から設計されたアンチセンス分子を提供する。更に、本発明は、ＮＣＰ及びＮＣＰに結合する分子に基づく医薬品組成物に特異的に結合する、精製されたＮＣＰ、抗体、及びその他の分子、を産生するための遺伝子工学による発現ベクター及び宿主細胞を提供する。本発明は、特に、変形されたｎｃｐ発現に基づき、そのような状態の同定を可能にする、診断的アッセイを提供する。これらの検定法は、ＮＣＰコード核酸配列若しくは特異的なＮＣＰ結合抗体から設計されるプローブを用いる。

Description

【発明の詳細な説明】新規なヒトシステインプロテアーゼ技術分野本発明は、新規なヒトシステインプロテアーゼ、及び、自己免疫疾病若しくは退行性疾病の診断、研究、予防、及び治療におけるその核酸及びアミノ酸配列の利用に関する。背景技術システインプロテアーゼは、前駆タンパク質の処理から細胞内分解までの多様な細胞プロセスに含まれている。システインプロテアーゼは、カリクレイン／キニン経路の活性化を通した血管性透過率を誘導し、様々なヘマグリチニンと錯化し、複合体成分を活性化し、及びセルピンを破壊することがある。それらのエンドペプチダーゼ活性及び「トリプシン類似の」特異性は、それらが、様々なヒトの細胞及び組織内で見いだされる多くの分化したシステインプロテアーゼ分子であることを推測させる。システインプロテアーゼは、単核細胞、マクロファージ、免疫系のその他の細胞によって、産生されることが知られている。これらの細胞は、感染部位へ移動し、それらの防御的な役割として、損傷を受けた組織を除去する様々な分子を分泌する。その他の条件においては、これらの同じ細胞が、同じ分子を過剰に産生し、組織の破壊を引き起こすこともある。これは、リウマチ関節炎などの自己免疫疾病における場合であり、システインプロテアーゼ、カテプシンＣの分泌が、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、及びその他の骨の細胞外マトリクスで見いだされる構造タンパク質を分解する。そのような分解によって弱められた骨は、腫瘍の侵入及び転移をより受け入れ易くなる。本件出願の新規なヒトシステインプロテアーゼは、ヒトの副腎から作られたｃＤＮＡライブラリーの配列から最初に同定された。ヒトの副腎は、それぞれの腎臓の上に配置された帽子のような形をした構造を有する。各副腎は、副腎髄質と、副腎皮質とから成る。副腎は、クロム親性組織から作られており、かつ、主に、ノルエピネフリン（ＮＥ）と、エピネフリン（Ｅ）とを分泌する。交感神経の副腎に対する刺激は、これら２つのカテコールアミンを血液内へ放出する。ＮＥは、血管を収縮させ、心臓の活性を刺激し、胃腸管を抑制し、目の瞳孔を広げる。Ｅは、上記とほぼ同じ反応を引き起こすが、心臓の活性に対してはより強い効果を有し、血管に対してはより弱い効果を有する。ＮＥおよびＥは、交感神経系の効果を補うものであり、その機能に対してはほとんど影響を及ぼさないことが明らかにされている。副腎皮質は、コレステロールを用いて、ホルモンの活性を表す大量のコルチコステロイドを産生する。副腎の外側の層は、主に、ミネラルコルチコイド、アルドステロンを産生する。アルドステロンの分泌による刺激性の調節及び抑制性の調節が、カリウムのレベル、レニン−アンギオテンシン相互作用、及び副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、ドーパミン、セロトニン、及びβ−エンドルフィンの分泌、によって行われている。アルドステロンは、腎臓、唾液腺、及び腸粘膜などの目的の組織内のタイプ１のミネラルコルチコイドレセプタと相互作用することによって、細胞外の流体の体積と、ナトリウム／カリウムのバランスとを調節する。副腎の内側の層は、グルココルチコイド及びアンドロゲンの部位、エストロゲン、及びプロゲステロンの生合成である。主なグルココルチコイドは、コルチゾールであり、これは、タンパク質、炭水化物、糖質、及び核酸の代謝の調節において、抗炎症として働き、内分泌機能における生体フィードバックの役割を果たす。アンドロゲンはＡＣＴＨの調節のもとで分泌され、二次性徴の（オスびメスの）、及びオスの生殖器官の発達を開始させ、一生の精子形成の維持を司る。副腎の状態疾病及び疾患には、クロム親性の細胞の腫瘍（これは内分泌の腫瘍形成症候群の１つ）と、シップル症候群（これは、単独で見いだされるか、髄質の甲状腺癌腫及び副甲状腺アデノマーと共に見いだされる）と、副腎性多毛症と、クッシング症候群と、コン症候群と、アジソン病（これは、一次アドレノコルチコ不全症である）と、二次アドレノコルチコ不全症と、副腎アデノマー（これは良性副腎嚢種と、非機能性副腎癌腫と、副腎の結核とを含む）とが含まれる。副腎と、その疾病は、とりわけ、以下の著書に、すなわち、ＧｕｙｔｏｎＡＣ（１９９１）ＴｅｘｔｂｏｏｋｏｆＭｅｄｉｃａｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ＷＢＳａｕｎｄｅｒｓＣｏ，ＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａＰＡと、Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ．ＫＪｅｔａｌ（１９９４）Ｈａｒｒｉｓｏｎ'ｓＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＭｃＧｒａｗ−ＨｉｌｌＮｅｗＹｏｒｋＮＹ」と、「ＴｈｅＭｅｒｃｋＭａｎｕａｌｏｆＤｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄＴｈｅｒａｐｙ（１９９２）ＭｅｒｃｋＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＲａｈｗａｙＮＪ」と、「ＧｏｏｄｍａｎＡＧｅｔａｌ．（１９９３）ＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢａｓｉｓｏｆＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮｅｗＹｏｒｋＮＹ．とに、説明されている。発明の開示本発明は、ヒト副腎及びヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）から単離された新規なシステインブロテアーゼ（ＮＣＰ）、及びそのタンパク質及びその核酸配列の診断、研究、免疫病特に自己免疫性で対抗性の疾病の予防及び治療における使用に関する。本発明は、新規なヒトシステインブロテアーゼを一義的にコードするヌクレオチド配列（配列番号：１）を提供する。このシステインブロテアーゼ（ｎｃｐ）は、初めに部分的ヌクレオチド配列、インサイト社クローンＮｏ．１００８７７として、副腎ライブラリのｃＤＮＡの中からコンピュータによる局部的配列アライメントの検索を行うことによって同定された。この分子をシステインブロテアーゼとして特徴づける適切なアミノ酸残基はＱ₄₈、Ｃ₅₂、及びＨ₁₅₀である。部分的ヌクレオチド配列も、ヒト臍静脈内皮細胞ｃＤＮＡライブラリーに由来するインサイト社クローンＮｏ．６６９３１（配列番号：４）において同定された。インサイト社クローンＮｏ．１００８７７及び６６９３１を延長して完全長配列を得るために、改良されたＸＬ−ＰＣＲプロシージャ、特別に設計されたオリゴヌクレオチド、及び副腎ライブラリーやＨＵＶＥＣライブラリーが使用された。ここに開示された部分的ヌクレオチド配列（配列番号：３及び５〜２４）は、ある特徴を共有しているいくつかの他のライブラリーにおいて同定された。このような特徴には、不死の株細胞又は組織（リンパ種及び白血病株細胞）、炎症性である株細胞又は組織（アデノイド及びリウマチ様滑膜ライブラリー）、単球やマクロファージのような細胞の生成物や付着物を通しての全身性クリーンアップ又は防衛に関与する株細胞又は組織（骨髄、腎、肺、胎盤、又は小腸ライブラリ）が含められる。第１図に示すヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、新規なヒトシステインブロテアーゼである。ここに開示された新規なシステインブロテアーゼのアミノ酸配列の局部的な配列アライメントの追加のコンピュータ検索により、最も近縁関係にある分子、即ち概ね５０％のアミノ酸配列の類似性を有するものは、日本住血吸虫から得られたヘモグロビナーゼである（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＸ７０９６７；ＭｅｒｃｋｅｌｂａｃｈＡｅｔａｌ（１９９４）ＴｒｏｐＭｅｄＰａｒａｓｉｔｏｌ４５：１９３１９８）。本出願のシステインブロテアーゼは、日本住血吸虫に由来するヘモグロビナーゼと５０％のアミノ酸配列の類似性を示す。触媒領域の保存的なシステインブロテアーゼ残基即ちＱ₄₈、Ｃ₅₂、及びＨ₁₅₀ や、近緑関係にある分子、即ちヘモグロビナーゼに対する類似性や、不死の、炎症性の又は全身性クリーンアップや全身性防衛に関与する細胞及び組織における新規なシステインブロテアーゼの存在に基づいて、この新規なシステインブロテアーゼは、全身性クリーンアップ（clean up）及び防衛、及びタンパク質分解に関係し、従って自己免疫に関する、退行性の疾病の診断、研究、予防及び治療において役立つものである。更に、本発明の様相は、遺伝子ヌクレオチド配列の発現を消滅若しくは減少させるのに便利なｎｃｐのアンチセンス分子を含む。本発明は、更に、部分的に、ポリヌクレオチド配列、及び発現ベクターコーディングＮＣＰと、宿主細胞からのＮＣＰの産生及び回収の方法に関する。本明細書に開示されたｎｃｐ核酸配列は、細胞及び組織内のｎｃｐｎＲＮＡの検出及びレベルの定量のための診断アッセイで用いられる。例えば、ｎｃｐ核酸配列は、免疫疾患に関連する遺伝子発現の異常を診断するために、生検流体若しくは組織のＰＣＲ若しくはハイブダイゼーションアッセイで用いられる。本発明は、更に、ＮＣＰ、ＮＣＰを有する核酸配列コーディングＮＣＰ、及び、ＮＣＰ若しくは核酸配列コーディングＮＣＰに対して特異的な抗体、を検出のための診断キットにも関連する。その様な診断キットは、任意の状態、疾患、若しくはＮＣＰの異所性の発現に関連する疾病の状態を検出するために用いることができ、更に、限定を意図するものではないが、貧血、動脈硬化症、喘息、気管支炎、癌、肺気腫、歯肉炎、炎症性腸疾患、インシュリン依存性糖尿病、白血病、骨関節症、骨粗鬆症、肺繊維症、慢性関節リウマチ、敗血症、及び全身性エリテマトーデスなどの診断に用いられる。ｎｃｐヌクレオチド配列若しくは精製されたＮＣＰタンパク質に対して産生された抗体に基づくヌクレオチドプローブを用いた生物学的サンプルをテストするための方法が提供される。抗体は、診断の目的と同様に、治療のためにも用いられ、例えば、慢性関節リウマチなどの免疫疾患に関連するＮＣＰの活性を中性化するために用いられても良い。本発明は、また、ＮＣＰの異常発現に関連する疾病状態の治療において、治療の目的で用いられるＮＣＰの活性を変更することのできるタンパク質、ペプチド、及び有機分子に部分的に関連している。本発明は、また、ＮＣＰを備えたｎｃｐの異所性の発現、核酸配列コーディングＮＣＰ、抗ＮＣＰ抗体、抗ＮＣＰ若しくはその他のタンパク質、ＮＣＰの発現を変更することのできるペプチド又は有機分子に関連する疾病状態の治療のための薬剤組成物に関する。図面の簡単な説明第１図は、ｎｃｐのコード領域を包むｃＤＮＡ配列の配列を表している。この図の例示された配列及び以下の図面に例示された配列は、マルチシーケンスプログラムＤＮＡＳＴＡＲ（商標）ソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲＩｎｃ，ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）を用いて生成された。第２Ａ図、第２Ｂ図、第２Ｃ図、及び第２Ｄ図は、ＮＣＰの核酸及びアミノ酸配列を表している。第３Ａ図及び第３Ｂ図は、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｊａｐｏｎｉｃｕｍ（ＧｅｎＢｎａｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＸ７０９６７）からのＮＣＰとヘモグロビナーゼとの間の核酸配列を表している。第４図は、予測されたアミノ酸配列及び組み合わせに基づく、ＮＣＰa領域（Ａ）、b領域（Ｂ）、ターン領域（Ｔ）、コイル領域（Ｃ）、親水性プロット（Ｈ）、a両親媒性領域（ＡＡ）、b両親媒性領域（ＢＡ）、抗原性インデックス（ＡＩ）、及び表面可能性プロット（Ｓ）のＤＮＡＳＴＡＲによる分析を表している。発明の実施の形態定義本発明は、副腎、ヒト臍静脈内皮細胞、リンパ腫及び白血病株細胞、アデノイド、リウマチ様骨膜、骨髄、腎、肺、胎盤、及び小腸において発現する新規なシステインブロテアーゼに関する。本明細書において、この新規なシステインブロテアーゼの小文字の略称（ｎｃｐ）は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、又は核酸配列を指し、大文字のもの（ＮＣＰ）は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、オリゴペプチド、又はアミノ酸配列を意味する。本明細書においてＮＣＰは、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、マウス、好ましくはヒトを含む任意の種に由来するＮＣＰを意味する。ＮＣＰは自然発生のものか又は変異体形態のものであって、天然の、半合成の、合成の、又は組換え体のソースに由来するＮＣＰである。好適なＮＣＰは、第１図に示すＮＣＰアミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列の類似性を有するものであり、より好ましい変異体は９０％のアミノ酸配列の類似性を有するものであり、最も好ましいのは９５％のアミノ酸配列の類似性を有する変異体である。「オリゴヌクレオチド」又は「オリゴマー」は、ＰＣＲにおいて使用されるのに十分な数の塩基数を有するヌクレオチド残基のストレッチである。これらの短い配列は、ゲノム配列又はｃＤＮＡ配列に基づくもの、若しくはそれから設計されたものであり、特定の細胞又は組織における同一の、類似した、又は相補的なＤＮＡ又はＲＮＡを増幅したり、その存在を確認したりするのに用いられる。オリゴヌクレオチド又はオリゴマーは少なくとも約１０ヌクレオチドから最大約５０ヌクレオチド、好ましくは約１５〜３０ヌクレオチドのＤＮＡ配列の一部分を含む。これらの配列は化学的に合成され、プローブとして用いられる。「プローブ」は、様々な長さ、好ましくは少なくとも１０から最大約６，０００ヌクレオチドの核酸配列である。このプローブは同一の、類似した、又は相補的な核酸配列の検出に用いられる。長いプローブは、通常天然の又は組換え体のソースから得られ、オリゴヌクレオチドと比較して高度に特異的でありハイブリッド形成に時間がかかる。これらのプローブは１鎖又は２鎖のものであり、ＰＣＲ法や膜ベースのハイブリダイゼイション又はＥＬＩＳＡ様技術において高度な特異性を発揮するように注意深く設計される。「リポーター」分子は、核酸又はアミノ酸配列に標識するために用いられる化学的な成分である。このリポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光性の薬剤、化学発行性の薬剤、又は色素生産性の薬剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。特定の核酸配列又はアミノ酸配列に関係するリポーター分子により、その存在が証明され、定量が可能となる。ポリヌクレオチド又は核酸の「部分」又は「フラグメント」は、プローブとして使用されうる約６ｋｂ、好ましくは約１ｋｂより小さいヌクレオチドを有するヌクレオチド配列の全て又は任意の一部分である。このようなプローブは、ニックトランスレーション法、クレノウフィルイン反応、ＰＣＲ法又は従来より周知の他の方法により標識され得る。反応条件を最適化し、偽の陽性を取り除くための予備試験の後、核酸プローブをサザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション又はｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて用いて、このタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡが生物学的サンプル、細胞タイプ、組織、器官又は生物において存在するか否かが決定される。「組換えヌクレオチド変異体」は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。この組換えヌクレオチド変異体は、遺伝暗号の「重複性」を利用することによって合成されうる。様々なコドン置換、例えば特異的制限部位又はコドン使用特異的突然変異を作り出すサイレント変化のようなコドン置換が導入されて、プラスミド又はウイルスベクターへのクローニング又は特定の真核細胞又は原核細胞の宿主系における発現が最適化される。「リンカー」は、選択された遺伝物質を様々なベクターと結合してクローニングするのを容易にする内部制限エンドヌクレアーゼ部位を作る合成パリンドローム核酸配列である。「ポリリンカー」は、多数の制限酵素部位を含むように工学的処理をなされており、例えばＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＫｐｎＩ、及びＨｉｎｄＩＩＩの様な５末端又は３末端にオーバーハングを残すような酵素、又はＥｃｏＲＶ，ＳｎａＢＩ、及びＳｔｕＩのような平滑末端を作る酵素の双方を使用できるようにする。「制御エレメント」又は「調節配列」は、複製、転写、及び翻訳を実行するために細胞のタンパク質と相互作用するエンハンサ、プロモータ、イントロン及び３’非翻訳領域のような遺伝子又はＤＮＡの非翻訳領域である。これらの配列は、境界配列として生成するか、若しくは遺伝子を分割することもありうる。これらの配列の分子レベルでの調節遺伝子と共に発揮する機能は、発生、成長、分化、及びエイジングプロセスにおいて非常に重要である。「キメラ」分子は、本発明のヌクレオチド配列（又はそれらの部分）の１又は２以上と、追加の核酸配列とを結合することによって生成される。このような結合された配列は、適当なベクターに導入されて、節減され、以下の特性の内の１又は２以上の点で天然の分子とは異なるのが予想されるヒメラポリペプチドを生成する。上述の特性とは、細胞位置、分布、リガンド結合親和性、鎖間親和性、分解／ターンオーバー速度、シグナル伝達等の特性である。「アクティブ」なる用語は、自然発生ペプチドの生物学的活性か免疫学的活性のいずれか又は両方を呈するアミノ酸配列の形態、フラグメント、又は領域を意味する。「自然発生ＮＣＰ」とは、生物工学的処理をなされていない細胞、又は天然に産生されるものと同一の配列を産生するような生物工学的処理をなされた細胞により産生されるポリペプチドを意味する。翻訳後修飾によって生ずる様々なポリペプチドが具体的に予測されている。このようなポリペプチドの修飾は、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、アシル化などがあるが、これらに限定されない。「誘導体」は、ユビキチン化、ラベリング（上述を参照）、ペジレイション（ポリエチレングリコールによる誘導体化）、及び通常１つのタンパク質においては発生し得ないオルニチンのようなアミノ酸の化学的な挿入及び置換のような技術により、化学的に修飾されたポリペプチドを意味する。「組換えポリペプチド変異体」なる用語は、組み換えＤＮＡ技術を用いて生成されるアミノ酸の挿入、除去、及び／又は置換により自然発生ＮＣＰとは異なるものとなった任意のポリペプチドを意味する。興味の対象となる特性を損なわずに置換、付加、或いは除去とれうるアミノ酸残基を決定するためには、ＮＣＰの配列と関連のポリペプチドとの配列とを比較し、高度に保存的な領域でのアミノ酸配列の変化の数を最小にすればよい。アミノ酸「置換」は、１個のアミノ酸が他の１個のアミノ酸で鍛えられることとして定義される。これらの置換部分は、置換アミノ酸が類似した構造及び／又は化学的特性を有しているとき本来保存的である。保存的な置換の例には、ロイシンからイソロイシン又はバリンへの置換、アスピレートからグルタメートへの置換、スレオニンからセリンへの置換がある。アミノ酸「挿入」又は「欠失」は、アミノ酸配列を変化させたり、アミノ酸配列内での変化を生じさせる。このような挿入及び欠失は約１〜５アミノ酸の範囲内で生ずるのが一般的である。特定のアミノ酸配列において生じうる変位は、合成によりペプチドを出すことにより、又は組換えＤＮＡ技術を用いてｎｃｐ配列における分子に挿入、削除、又は置換を体系的に生じさせることによって実験的に決定されうる。「シグナル配列又はリーダー配列」は、ポリペプチドを細胞膜を通して移動させることが必要な場合に使用されうる短いアミノ酸配列である。このような配列は、本発明のポリペプチドのなかに初めから存在するか、組換えＤＮＡ技術により１種のソースから供給される。「オリゴペプチド」は、アミノ酸残基の短いストレッチであり、オリゴヌクレオチドから発現されうる。オリゴペプチドはポリペプチドの「フラグメント」、「部分」、又は「セグメント」と同程度の長さであるか或いはかなり短いものでありえ機能的に等価である。このような配列は、少なくとも約５アミノ酸残基のストレッチ、多くの場合約１７以上のアミノ酸から成るアミノ酸残基のストレッチ、典型的には少なくとも約９〜１３アミノ酸から成るアミノ酸残基のストレッチを含み、生物学的或いは免疫学的達成を示すに十分な長さを有するものである。「インヒビタ」は、化学的又は生理学的反応を遅らせたり除外する物質である。一般的なインヒビタには、アンチセンス分子、抗体、アンタゴニスト、及びそれらの誘導体があるが、これらに限定されない。「標準」とは、定量的又は定性的な測定において比較のために使用される。好ましくは、この標準は、統計的に適切な数のサンプルに基づいており、診断的アッセイを実行したり、臨床的な治験を行ったり、患者の治療プロフィールをなぞるときに比較の基準として使用するために生成される。本明細書において「動物」とは、ヒト、家畜（ネコイヌ等）、農業用の動物（ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、サカナ等）又は実験動物（カエル、マウス、ラット、ウサギ、サル等）を含むものとして定義されうる。「状態」には、ｎｃｐ活性が関係する癌腫、障害、又は疾病を含む。このような状態には、貧血、動脈硬化症、喘息、気管支炎、肺気腫、歯肉炎、炎症性腸疾患、インシュリン依存性糖尿病、白血病、多発性内分泌腫瘍症骨関節炎、骨粗鬆症、肺繊維症、慢性関節リウマチ、敗血症、及び全身性エリテマトーデスがあるが、これらに限定されない。これらの技術用語及び科学用語のリストはその全てを包含し得ないことから、定義されていない用語は本発明の当業者に一般的に理解されるもの同じ意味を有するものとして用いられている。更に、前後関係で明らかにされていない限り、ａやａｎやｔｈｅのような冠詞は複数の指示物を含むことがある。例えば「制限酵素」又は「高忠実度の酵素」との記述は、基準を満たすような酵素の混合物や他の酵素も含みうる。又は方法なる用語も、当業者に周知の、又は当業者が本明細書を読んで理解されるようなＤＮＡ配列を得るための１又は２以上の方法を指すものとする。本発明を作りだし、及び利用するための方法や本発明の配列、変異体、製剤について説明する前に、本発明はここに開示する特定の配列、変異体、製剤、又は方法に限定されないということを理解されたい。これらの配列、変異体、製剤、及び方法論は、様々なものがありえ、ここで使用する用語法は特定の実施例を記述するためのものである。この用語法及び定義は、本発明の範囲を限定しようとするものではない。本発明の範囲は最終的にはクレームによって定義される。発明の説明本発明は、ヒトの細胞又は組織において発現される新規なシステインブロテアーゼホモログをコードする精製ポリヌクレオチドを提供するものである。この新規なシステインブロテアーゼ（ｎｃｐ；ＩｎｃｙｔｅＣｌｏｎｅ１００８７７）は、初めに副腎ｃＤＮＡライブラリーが得られたｃＤＮＡにおいて同定された。この分子がシステインブロテアーゼとして特徴づけられるようにするアミノ酸残基は、Ｑ₄₈、Ｃ₅₂、及びＨ₁₅₀である。この新規なシステインブロテアーゼにおいてＱ残基とＣ残基とを分割するヌクレオチドの数は、パパインのような他のシステインブロテアーゼにおいて見いだされるものよりも少ない。更に、この新規なシステインブロテアーゼはヒトの臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において発現される。完全長ｎｃｐ配列は、副腎及びＨＵＶＥＣｃＤＮＡライブラリーの双方からのクローンをシークエンシングすることにより得られた。このシステインブロテアーゼと最も近縁な分子は、血液吸虫である日本住血吸虫（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＸ７０９６７）からクローニングされたヘモグロビナーゼである（ＭｅｒｃｋｅｌｂａｃｈＡｅｔａｌ（１９９４）ＴｒｏｐＭｅｄＰａｒａｓｉｔｏｌ４５：１９３１９８）。本出願のｎｃｐは、ヘモグロビナーゼが活性であることが多い脾臓や肝臓のライブラリーのいずれかからは見いだされなかったがヒトヘモグロビナーゼであると言っても差し支えない。しかし、このｎｃｐは全身性クリーンアップ又は防衛が活性化されるヘモグロビナーゼ又はＮＣＰが損傷を受けた又は死にかけた赤血球細胞内容物をクリーンアップするべく科学分解作用を発揮することが期待されうる様な多数の組織において見いだされた。ｎｃｐ分子のある部分に対する転写物は、他のインサイト社のｃＤＮＡライブラリーにおいて見いだされた。異なるインサイト社のクローンからのｃＤＮＡの３２個のセグメントは第１図において重ねられた形で示されている。Ｕ９３７細胞、ＴＨＰ−１細胞、リウマチ様骨膜、骨髄、腎臓、肺、炎症性アデノイド、胎盤、小腸ライブラリーからのｃＤＮＡを含むこれらの２３個のインサイト社製クローンは、配列表に示されている。実際、ｎｃｐは、通常の組織がその機能を発揮し、分子の役割タンパク分解活性が全身性のクリーンアップ及び防衛に関連しているように見えるようなライブラリーにおいてかなり共通に見られる。ｎｃｐの様な精製ヌクレオチド配列は、分子生物学の専門家には周知の技術において様々な用途を有する。このような技術には、ＰＣＲプローブ又はハイブリダイゼイションプローブとしての利用、染色体及び遺伝子マッピングのための使用、センス又はアンチセンス核酸の酸性における利用、新たな治療的分子のスクリーニングにおける利用等がある。これらの例は良く知られたものであり用途をこれに限定するものではない。更にここに開示する核酸配列は、まだ開発されていない技術であっても、その新規な技術が現在知られているヌクレオチド配列の性質、例えばトリプレット遺伝暗号及び特異的塩基対のような性質（これに限定されない）に依存するものである限り分子生物学的技術において使用されうるものである。遺伝暗号の同義性の結果、多種多様なＮＣＰをコードするヌクレオチド配列が生成されるが、そのうちのいくつかは既知の及び自然発生のシステインブロテアーゼ配列内在性配列と最小限の相同性しか有していない。本発明は、可能なコドン選択に基づいた組み合わせを選択することにより作り出されるヌクレオチド配列の全ての可能なバリエーションのそれぞれを具体的に意図したものである。これらの組み合わせは、自然発生ＮＣＰのヌクレオチド配列に適応されるような標準的なトリプレット遺伝暗号に基づいて作り出され、このようなバリエーションは全て本発明において具体的に開示されたものと考えられたい。ｎｃｐヌクレオチド配列及びその誘導体又は変異体は、好ましくは最適条件のもとで自然発生ＮＣＰのヌクレオチド配列を同定することが可能であるが、実質的に異なるコドン使用を有するＮＣＰをコードするヌクレオチド配列を酸性することは有益であり得る。コドン選択では、特定のコドンの使用頻度に基づいて特定の原核細胞の又は真核細胞の発現宿主におけるペプチドの発現の速度を高めるような選択にすることもできる。ＮＣＰをコードするヌクレオチド配列を、このコードされたアミノ酸配列を変えることなく実質的に変える他の理由は、より望ましい特性、例えば自然発生配列から作り出される転写物より長い半減期を有するＲＮＡ転写物を作り出すためである。ＮＣＰをコードするヌクレオチド配列を、完全に確立された組換えＤＮＡ技術（ＳａｍｂｒｏｏｋＪｅｔａｌ（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｔｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＮＹ；ｏｒＡｕｓｕｂｅｌＦＭｅｔａｌ（１９８９）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋＣｉｔｙ）によって様々な他のヌクレオチド配列と結合することもできる。ｎｃｐに結合するのに役立つヌクレオチド配列には、例えば従来より周知のプラスミド、コスミド、ラムダファージ誘導体、ファージミド等のような各種クローニングベクタが含まれる。興味の対象となるベクタには、発現ベクタ、複製ベクタ、プローブ生成ベクタ、及びシークエンシングベクタ等が含まれる。一般に興味の対象となるベクタは、少なくとも１つの生物において複製機転機能を発揮する便利な制限エンドヌクレアーゼ見知部位群、及び１又は２以上の宿主細胞系に対する選択可能なマーカーを含みうる。米国特許第４，６８３，１９５号、第４，８００，１９５号、及び第４，９６５，１８８号明細書に記載されているようなＰＣＲ法の実施において、ｎｃｐヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドの別の使用方法がある。このようなオリゴマーは、通常化学的に合成されたものであるか、組換えにより得られたものであるか、若しくは両者の混合であり得る。オリゴマーは通常２つのヌクレオチド配列を含んでおり、１つはセンス方向（５'→３'）で、もう一方はアンチセンス（３'→５'）のもので、特定の遺伝子の同定又は診断のための快適かされた条件のもとで用いられる。同じ２つのオリゴマー、即ち入れ子になったオリゴマーの組、又はオリゴマーの縮重プール（degenerate pool）が、近縁関係にあるＤＮＡ又はＲＮＡの配列の同定や定量のためのより厳格性の低い条件のもとで用いられ得る。完全長遺伝子は、部分的なヌクレオチド配列及び様々な周知の方法を用いてクローニングされる。Ｇｏｂｉｎｄａｅｔａｌ（１９９３；ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＡｐｐｌｉｃ２：３１８−２２）は、既知の配座に隣接する未知の配列を検索するために汎用プライマーを用いる直接的な方法として「制限サイトＰＣＲ法」を開示している。初めに、ゲノムのＤＮＡをリンカーに対するプライマー及び既知の領域に対して特異的なプライマーの存在のもとで増幅する。増幅された配列は、同じリンカープライマーと初めのものの内部にある他の特異的プライマーと共に第２回目のＰＣＲを受ける。各ＰＣＲ処理の生成物は、適当なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、逆転写構想を用いて配列決定される。Ｇｏｂｉｎｄａｅｔａｌは、遺伝子の３'非コード領域における２０個のヌクレオチドからなる保存的ステレッチを同定した、ＩＸ因子に対するデータを提供している。逆ＰＣＲは、既知の領域に関するプライマーからスタートする未知の配列をうまく獲得したことを報告する第１の方法である（ＴｒｉｇｌｉａＴｅｔａｌ（１９８８）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ１６：８１８６）。この方法では、いくつかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知の領域にある適当なフラグメントを生成する。次いでこのフラグメントは、分子内連結により環状にされ、ＰＣＲ用の鋳型として用いられる。多岐したプライマーは、既知の領域から設計される。ＰＣＲを行う前に制限酵素による消化とライゲーションが多数回必要であることから、この手順には時間がかかりコストもかさむことになる（Ｇｏｂｉｎｄａｅｔａｌ上述）。キャプチャＰＣＲ法（ＬａｇｅｒｓｔｒｏｍＭｅｔａｌ（１９９１）ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＡｐｐｌｉｃ１：１１１−１９）は、ヒト及びＹＡＣのＤＮＡにおける既知の配列に隣接するＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のための方法である。Ｇｏｂｉｎｄａｅｔａｌ（上述）が言及しているように、キャプチャＰＣＲ法もＰＣＲ処理の前にＤＮＡ分子の未知の部分に光学的処理を成された二者の配列を挿入するために多数回の制限酵素による消化とライゲーションを必要とする。制限及びライゲーション反応は同時に実行させるが、延長のために必要なこと、移動及び２回のＰＣＲ処理、及びシークエンシング前の精製によってこの手順は厄介なものとなり時間のかかるものとなっている。ＰａｒｋｅｒＪＤｅｔａｌ（１９９１；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ１９：３０５５−６０）による歩行ＰＣＲ法は、未知の配列の検索を可能にする標的とされた遺伝子の歩行のための方法である。ＰｒｏｍｏｔｅｒＦｉｎｄｅｒ（商標）というＣｌｏｎｒｅｃｈ社（ＰａｌｏＡｌｔｏＣＡ）社製の新しいキットは、ＰＣＲ及びｐ５３に由来するプライマーを用いてゲノムのＤＮＡにおいて歩行を起こさせる。入れ子状態のプライマー及び特殊なＰｒｏｍｏｔｅｒＦｉｎｄｅｒライブラリーは、プロモータや調節エレメントのような上流の配列を検出するのに用いられる。このプロセスによりライブラリーをスクリーニングする必要がなくなり、イントロン／エキソンの接合部を見つけるのに役だつ。別の新規なＰＣＲ法はＧｕｅｇｌｅｒｅｔａｌによる１９９５年６月７日出願の米国特許出願第０８／４８７，１１２号の"ＩｍｐｒｏｖｅｄＭｅｔｈｏｄｆｏｒＯｂｔａｉｎｉｎｇＦｕｌｌＬｅｎｇｔｈｃＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｓ "なる名称の方法であり、この方法ではＸＬ−ＰＣＲ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙＣＡ）を用いて部分的なヌクレオチド配列を増幅しＤＮＡのより長い断片に延長する。この方法が開発されたことにより一人の研究者が一度に多数の遺伝子（最大２０以上）を処理し、６〜１０日以内に延長された（場合によっては完全長）配列を得ることができるようになった。この新たな方法は、プラスミドライブラリーをスクリーニングするために標識されたプローブを使用し、一人の研究者が１４〜４０日かけて約３〜５個の遺伝子しか処理できない従来の方法に取って代わるものである。約２日間かけて行われうる第１ステップでは、複数のプライマーの内の任意の２つが既知の部分的配列に基づいて設計され合成される。約６〜８時間かけて行われる第２ステップでは、この配列が転宅されたライブラリーのＰＣＲ増幅により延長される。約１日かけて行われる第３ステップ及び第４ステップでは、増幅されたｃＤＮＡの精製、及び適切なベクタへのライゲーションが行われる。約１日かけて行われる第５ステップでは、宿主の細菌の性質転換及び増殖が行われる。約５時間かけて行われる第６ステップでは、ＰＣＲ法を用いてバクテリアのクローンにおける延長された配列をスクリーニングする。約１日かけて行われる最終ステップでは、選択されたクローンの調製及び配列決定が行われる。完全長ｃＤＮＡが得られなかった場合には、もとのライブラリー又はいくつかの他の好適なライブラリーのいずれかを用いて手順の全体が繰り返される。好適なライブラリーは大きなｃＤＮＡのみを含むようにサイズ選択されたものであるか、例えばＧｉｂｃｏ／ＢＲＬ（ＧａｉｔｈｅｒｂｕｒｇＭＤ）から市販されている肺、肝臓、心臓、及び脳のライブラリーのような市販のライブラリー単体であるか又はそれらを結合したものであり得る。このｃＤＮＡライブラリーはオリゴｄ（Ｔ）を用いて調製されるか、ランダムに初回刺激をうける。ランダムに初回刺激を受けたライブラリーは、それが遺伝子の５'末端を含む配列をより多く含んでいるという点で好適である。ランダムに初回刺激を受けたライブラリーは、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーが完全な遺伝子を作り出させない場合に特に役立つものであり得る。タンパク質がより大きくより複雑になると１つのプラスミドにおいて見いだされる完全な遺伝子が少なくなるということに注意しなければならない。ＰＣＲ法の生成物のヌクレオチド配列かサイズのいずれかを分析するための新たな方法はキャピラリー電気誘導法である。即配列決定のためのシステムはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙＣＡ）、ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ＦｕｌｌｅｒｔｏｎＣＡ）及び他の会社から市販されている。キャピラリー配列決定では、電気誘導分離のための流動性ポリマ、レーザーで活性化される４つの異なる蛍光性染料（それぞれが各ヌクレオチドに対応）、及びＣＣＤカメラによる放射された波長の検出を利用している。出力即ち光強度は、適当なソフトウェア（例えばＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製のＧｅｎｏｔｙｐｅｒ（商標）及びＳｅｑｕｅｎｃｅＮａｖｉｇａｔｏｒ（商標））を用いて電気信号に変換され、資料の負荷からコンピュータ分析及び電子的データの表示などの全プロセスはコンピュータで制御される。キャピラリー電気誘導法により分解能が高められ、標準的なゲルベースの方法に比べて何倍もの速度で分析が行えるようになった。この方法は特定のサンプル内に限られた量しか存在し得ない小さなＤＮＡの断片の配列決定に特に適している。再現可能な配列決定としてＭ１３ファージＤＮＡの最大３５０塩基対を３０分で配列決定したことが報告されている（Ｒｕｉｓ−ＭａｒｔｉｎｅｚＭＣｅｔａｌ（１９９３）ＡｎａｌＣｈｅｍ６５：２８５１−８）。本発明の別の側面は、ＮＣＰをコードする自然発生ヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能なｎｃｐハイブリダイゼイションプローブを提供する。ハイブリダイゼイション条件の厳格性がそのプローブがｎｃｐの天然のヌクレオチド配列のみを同定するか、他の近縁関係にあるシステインブロテアーゼ分子の配列も同定するかを決定する。本発明の縮重ｎｃｐヌクレオチド配列が近縁なシステインブロテアーゼをコードする配列の検出に使用される場合には、その配列はここに開示する配列のヌクレオチドを少なくとも５０％含んでいるのが好適である。本発明のハイブリダイゼイションプローブは、配列番号：１のヌクレオチド配列に由来するか、又はプロモータ、エンハンサ及びイントロンのような非翻訳領域を含む周りのゲノムの配列に由来するものであり得る。このようなハイブリダイゼイションプローブは適当なレポーター分子で標識されうる。システインプロティアーゼに特異的なハイブリダイゼーションプローブを生成するための手段には、オリゴラベリング、ニックトランスレーション法、エンドラベリング、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅がある。これとは別に、ｍＲＮＡプローブを生成するためにｃＤＮＡ配列をクローニングしてベクターに挿入してもよい。このようなベクターは周知のもので、市販されており、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメラーゼと標識されたヌクレオチドを添加することによりｉｎｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために使用され得る。多くの会社（例えばＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，ＰｉｓｃａｔａｗａｙＮＪ；Ｐｒｏｍｅｇａ，ＭａｄｉｓｏｎＷＩ；ＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ；等）がこれらのプロシージャのための市販のキット及びプロトコルを提供している。ＤＮＡ配列またはその部分を完全に化学合成により作り出すことも可能である。この配列を作り出すための情報源は、近縁な生物に由来する既知の異種配列から得られることもある。合成の後、不拡散配列は単体で用いることも既存の配列と結合させて用いることもでき、多くの市販のＤＮＡベクターの１つに挿入し、その宿主細胞に既知の技術を用いて導入することもできる。更に、化学合成のよりこのヌクレオチド配列の特定の突然変異を誘導することもできる。これとは別に、突然変異が必要な配列の部分を合成し既存のゲノムの配列や組換え配列の一部分で組換えることもできる。ｎｃｐヌクレオチド配列を診断テストやｎｃｐ発現の異常レベルが関係する障害や疾病の形質のためのアッセイに個別に用いることもできる。このヌクレオチド配列はハイブリッド形成条件のもとで患者から得られたサンプル（体液、細胞または組織）に加えられる。インキュベーション時間の後、このサンプルは所望に応じて特定のヌクレオチドに結合するレポータ分子を含む適合性の液体で洗浄される。この適合性の液体を洗い流した後、レポータ分子が定量されこの体液、細胞または組織に対する標準値と比較される。ｎｃｐ発現が標準値と著しく異なっている場合には、このアッセイにより障害または疾病の存在が示されたことになる。このような定性的なまたは定量的な方法の形態にはノーザン分析、ドットブロット、または他の膜ベースの技術、ディップスティック（dip stic k）、ピンまたはチップ技術、ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡまたは他の多数のサンプルを用いる技術を含み得る。サンプルとこのヌクレオチド配列とを結合する同じアッセイは、特定の治療法の効率を評価するのにも用いることができる。これは動物の研究や臨床試験または個人の患者の治療のモニタにおいても使用することができる。初めに、比較の基準となる標準的な発現レベルを確認しなければならない。第二に、障害または疾病を煩う動物または患者から得られたサンプルにヌクレオチド配列が結合されて、標準的または通常のプロヒィールからのずれが評価される。第三に、既存の病薬が投与され、治療プロファイルが作成される。アッセイを評価して、治療プロファイルが標準的パターンに向かっているか否かを判定することができる。上手くいった治療プロファイルは数日間または数ヶ月間の期間に亘る治療の効果を示すために用いることができる。ｎｃｐに対するヌクレオチド配列を用いて、天然のゲノム配列のマッピングのためのプローブを作り出すこともできる。この配列は周知の技術を用いて特異の染色体、或いは染色体の特定の領域にマッピングされ得る。このような技術には染色体スプレッドに対するｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｖｅｒｍａｅｔａｌ（１９８８）ＨｕｍａｎＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ；ＡＭａｎｕａｌｏｆＢａｓｉｃＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋＣｉｔｙ）、フローソートされた染色体調製物、または酵母菌人工染色体（ＹＡＣ）、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリアＰ１構成物、または単体の染色体ｃＤＮＡライブラリーのような人工染色体合成物を用いるものが含まれる。染色体調製物のｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び確立された染色体マーカを用いるリンケージ分析のような物理的マッピング技術は、遺伝子地図の拡張において非常に重要である。遺伝子地図の例は、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４；２６５：１９８１ｆ）による。別の哺乳類種の染色体上の遺伝子の置換は、特定のヒト染色体の数またはアームが未知である場合であっても関連するマーカを知るための手段となる。物理的マッピングにより新たな配列が染色体のアームまたはその一部分に割り当てられ得る。これにより研究者が位置クローニングまたは他の遺伝子発見技術を用いて疾病遺伝子を探すための貴重な情報が得られる。血管拡張性失調症（ＡＴ）のような疾病または症候群が特定のゲノム領域例えばＡＴについて言えば１１ｑ２２−２３（Ｇａｔｔｉｅｔａｌ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３６：５７７−５８０）に対する遺伝子の連鎖によって粗く位置決めされたならば、その領域への配列のマッピングが更に調査を進めるための関連するまたは衝突の遺伝子を表し得ることになる。本発明のヌクレオチド配列は、転座、逆位等によって生ずる健常者とキャリアまたは患者との間の遺伝子配置の違いを検出するのにも用いることができる。ＮＣＰをコードするヌクレオチド配列は、周知の組換えＤＮＡ技術を用いるアミノ酸配列の生成にも用いることができる。Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０，ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ１８５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏＣＡ）は、隔離され精製されたヌクレオチド配列の発現について述べている文献の中の１つである。このアミノ酸まはたペプチドは、原核細胞または真核細胞何れかの様々な宿主細胞において発現され得る。宿主細胞はヌクレオチド配列が生み出されたもとの同じ種から、または異なる種に由来するものであり得る。組換えＤＮＡ技術によりアミノ酸配列またはペプチドを生み出すことの利点には、簡単な精製のための手順を用いたり精製のために十分な量のアミノ酸を得ることができる点である。ｎｃｐヌクレオチド配列へ形質転換された細胞は、発現や細胞培地からのペプチドの回収に適切な条件のもとで培養され得る。組換え体細胞により作り出されたペプチドは、配列が使用されるベクター或いはその両方に応じて分泌されるか細胞内に含まれた形で存在する。一般に分泌された形態の組換えタンパク質を調製するのがより便利であり、これはｎｃｐと特定の原核細胞または真核細胞の細胞膜を通して移動させられる組換えヌクレオチド配列を結合することにより決定される。他の組換え合成物は、ｎｃｐとタンパク質の生成を促進させるポリペプチド溶液をコードするヌクレオチド配列とを結合し得る（ＫｒｏｌｌＤＪｅｔａｌ（１９９３）ＤＮＡＣｅｌｌＢｉｏｌ１２：４４１−５３）。固相技術を用いる直接的なペプチド合成（Ｓｔｅｗａｒｔｅｔａｌ（１９６９）Ｓｏｌｉｄ−ＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＷＨＦｒｅｅｍａｎＣｏ，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏＣＡ；ＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄＪ（１９６３）ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ８５：２１４９−２１５４）は組換えまたはキメラのペプチド生成の代用となる。自動的な合成は、例えば（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３１ＡＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を製造者の指示に従って用いることにより行われ得る。更に、ＮＣＰまたはその任意の部分は、直接的な合成の間に突然変異を起こしたり、化学的な方法により他のシステインプロテアーゼ配列またはその部分と結合され得る。抗体誘発のために用いられるアミノ酸配列またはオリゴペプチドは生物学的達成がなくてもよいが、免疫原性でなければならない。特定の抗体の誘発に用いられるＮＣＰは、少なくとも５つのアミノ酸、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有し得る。アミノ酸配列の短いストレッチはキーホールリンペットヘモシアニンのような他のタンパク質の配列と融合されて、キメラペプチドが抗体の誘発に使用される。これとは別の形態で、このペプチドが領域全体を含むだけの十分な長さを有し得る場合もある。ＮＣＰに対して特異的な抗体は、ペプチドの抗原性のフラグメントを適当な動物に接種することにより産生され得る。抗体がポリペプチドのエピトープに対して産生され、天然または組換えのタンパク質の少なくとも一部分に結合する場合その抗体はＮＣＰに対して特異的である。抗体産生の方法は、動物への注射による免疫反応の刺激によるもののみならず、合成抗体の生成や、特異的に結合する分子を組換え免疫グロブリンライブラリーからスクリーニングする方法（ＯｒｌａｎｄｉＲｅｔａｌ（１９８９）ＰＮＡＳ８６：３８３３−３８３７，ｏｒＨｕｓｅＷＤｅｔａｌ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：１２７５−１２８１）や、またはリンパ球集団のｉｎｖｉｔｒｏへの刺激のような類似したプロセスも含まれる。現在の技術（ＷｉｎｔｅｒＧａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎＣ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３４９：２９３−２９９）では、抗体形成の原理に基づく多数のコードに特異的に結合する試薬を提供する。これらの技術はＮＣＰに特異的に結合する分子の生成に適合され得る。抗体または特定の免疫原性ペプチドフラグメントまたはオリゴペプチドに対して生成される他の適当な分子をウェスタン分析、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）または通常の、疾病を患う、または治療された細胞または組織における活性なＮＣＰの定量や存在の確認のための類似したテストに利用することができる。以下の実例は、本発明の説明のためのものである。これらの実例は説明のためのものであり、本発明をこの実例に限定しようとするものではない。産業的応用性１．副腎ｃＤＮＡライブラリーの構築副腎の及びヒト臍静脈内皮細胞のｃＤＮＡライブラリーの双方が完全長遺伝子のクローニングのために用いられたが、説明のため、副腎ｃＤＮＡライブラリーの構築について以下説明する。副腎ｃＤＮＡライブラリーは、１０歳から４６歳の白人男性及び女性の健常者の副腎から得られた５個のサンプルから構築された。ポリＡ⁺ＲＮＡは、ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ＃６５７１−２；ＰａｌｏＡｌｔｏＣＡ）から得られた。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａＣＡ）は、このポリＡ⁺ＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを作った。このｃＤＮＡ合成は、オリゴＤ（Ｔ）及びランダム六量体双方を用いて初回刺激を受け、この２つのｃＤＮＡライブラリーは別々に取り扱われた。合成用アダプタオリゴヌクレオチドをｃＤＮＡの末端にリゲートして、それをＵｎｉ−ＺＡＰ（商標）ベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に挿入できるようにした。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｃＤＮＡクローンは、ｉｎｖｉｎｏ切除プロセスによって得られ、この２つのｃＤＮＡライブラリーからのファージミドは、同じ数のバクテリオファージを混合することにより１つのライブラリーに結合された。後者のライブラリーはＥ．ｃｏｌｉ宿主菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するのに用いられた。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔと同時形質転換されたｆ１ヘルパーファージの双方から得られた酵素はＤＮＡに切り込みを入れ、新たなＤＮＡ合成を開始させ、より小さい一本差の環状ファージミドＤＮＡ分子を生成した。このＤＮＡ分子にはｃＤＮＡインサートが含まれている。ファージミドＤＮＡは放出され、精製されて、新しい宿主細胞に再感染するのに用いられた（ＳＯＬＲ（商標）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。ファージミド上にβラクタマーゼ遺伝子が存在することにより、アンピシリンを含む媒地上で形質転換されたバクテリアが増殖可能となった。２．ｃＤＮＡクローンの単離ｃＤＮＡインサートを含むファージミドＤＮＡはＱＩＡＧＥＮ（ＣｈａｔｓｗｏｒｔｈＣＡ）製のＱＩＡＷＥＬＬ−８（商標）プラスミド精製システムを用いて精製されうる。この高スループットの方法により多数の穴を有する形態の３Ｍ（ＭｉｎｎｅａｐｏｌｉｓＭＮ）製のＥＭＰＯＲＥ（商標）膜技術及びＱＩＡＧＥＮアニオン交換樹脂粒子を用いて溶解されたバクテリア細胞から高度に精製されたファージミドＤＮＡが管理される。このＤＮＡはＤＮＡ配列決定や他の分析操作のために溶離され調製された。３．ｃＤＮＡクローンの配列決定副腎ライブラリーのランダムに管理したものから得られたｃＤＮＡインサートは、部分的に配列決定された。ＤＮＡ配列決定の方法は周知のものであり、ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメントをＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（登録商標）（ＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ）やＴａｑポリメラーゼのような酵素を用いる。不適のＤＮＡ鋳型にアニールされたオリゴヌクレオチドプライマーからＤＮＡを拡張する方法は、一本差の鋳型用のものと二本差の鋳型用のものの双方が開発されている。鎖終結反応の生成物は、電気誘導を用いて分離され、それに組み込まれた標識された前駆物質を介して検出された。最近の反応調製、配列決定及び分析における機械化により、１日に配列決定できるその数を増やすことが可能となった。好ましくは、このプロセスはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＣａｔａｌｙｓｔ８００及び３７３ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓのような機械を用いて自動的に行われる。特定のｃＤＮＡライブラリーの検出は、ｃＤＮＡのパイロットスケール分析を実行し、ベクター、ラムダ又はＥ．ｃｏｌｉＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ又は反復性ＤＮＡを含むクローンのパーセンテージ、及び公的なデータベースの配列との完全な一致部分相同性を有するクローンのパーセンテージをチェックすることにより決定されうる。利用可能なデータベースに一致するものがない独特の配列の数が記録される。４．ｃＤＮＡクローン及びその推定タンパク質配列の相同性検索このようにして得られた各配列はＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより開発された検索アルゴリズムをＩＮＨＥＲＩＴ（商標）６７０ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍに組み込んで用いてＧｅｎＢａｎｋ配列と比較された。このアルゴリズムでは、ＰａｔｔｅｒｎＳｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎＬａｎｇｕａｇｅ（ＴＲＷＩｎｃ，ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓＣＡ）が相同領域の決定のために用いられた。配列比較をどのように行うかを定める３つのパラメータは、ウィンドウサイズ、ウィンドウオフセット、及び誤差許容度であった。これら３つのパラメータの組み合わせを用いて、調査対象である配列に対して相同性を有する領域を含む配列をＤＮＡデータベースから検索し、適当な配列に対して初期値と共にスコアが付けられた。続けて、これらの相同な領域を、ドットマトリクス相同性プロット法を用いて検定し、偶然の一致と真の相同領域とを区別した。相同性検索の結果を表示するためにＳｍｉｔｈ−Ｗａｒｗｅｍａｎのアライメントが用いられた。ペプチド及びタンパク質配列の相同性の確認は、ＩＮＨＥＲＩＴ（商標）６７０ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍを、ＤＮＡ配列の相同性の決定に用いるのと同じ方法で用いて行われた。ＰａｔｔｅｒｎＳｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎＬａｎｇｕａｇｅ及びパラメータウィンドを用いて、相同性領域を含むタンパク質配列のデタベースを検索し、相同性領域は初期値と共にスコアを付けられて表示された。ドットマトリクス相同性プロット法により検定を行い、有意な相同性領域を偶然の一致と区別した。別の形態としてＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌを意味する）を用いて、局部的な配列の一致を検索した（ＡｌｔｓｃｈｕｌＳＦ（１９９３）ＪＭｏｌＥｖｏｌ３６：２９０− ３００ＡｌｔｓｃｈｕｌＳＦｅｔａｌ（１９９０）ＪＭｏｌＢｉｏｌ２１５：４０３−１０）。ＢＬＡＳＴは、ヌクレオチド及びアミノ酸配列双方のアライメントを検出して、配列の類似性を決定する。アライメントが局部的であることから、ＢＬＡＳＴは正確な一致の決定、又はホモログの同定において特に有用である。ＢＬＡＳＴはギャップを含まない一致の検索に役立つ。ＢＬＡＳＴアルゴリズム出力の基本的な単位は、Ｈｉｇｈ−ｓｃｏｒｉｎｇＳｅｇｍｅｎｔＰａｉｒ（ＨＳＰ）である。ＨＳＰはアライメントが局部的に最大となる部分の長さが等しく、アライメントスコアがユーザが設定したカットオフスコア又は閾値のスコア以上であるような２つの任意の範囲の配列断片から成る。ＢＬＡＳＴ法では、調査対象のデータベース配列との間のＨＳＰｓを探し、発見された一致の統計的有意性を評価し、ユーザが選択した有意性の閾値を越える一致のみを報告する。パラメータＥはデータベース配列との一致を報告するための統計的優位性の閾値を決定するパラメータである。Ｅは、データベース検索全体の文脈の中で、ＨＳＰ（又はＨＳＰの組）の偶然の一致を発生する予定頻度の上限と解釈される。Ｅを満たすデータベース配列は、プログラムの出力で報告される。本明細書において提示され又はクレームに記載された部分的ｎｃｐ分子の全て上述の基準を用いて同定された。この提示された部分的ｎｃｐ分子には、Ｕ９３７（組織球性リンパ種株細胞）ライブラリーから得られたインサイト社クローンＮｏ．１０９８（配列番号：３）、ＴＨＰ−１（白血病性単球株細胞）ライブラリーから得られたインサイト社クローンＮｏ．７５８４８（配列番号：５）、リウマチ様滑膜ライブラリーから得られたインサイト社クローンＮｏ．７７０１５（配列番号：６）、７７４２４（配列番号：７）、７７６４５（配列番号：８）、７７６５１（配列番号：９）、及び７８５４７（配列番号：１０）、骨髄ライブラリーから得られたインサイト社クローンＮｏ．１０４２８６（配列番号：１１）、腎臓ライブラリーから得られたインサイト社クローンＮｏ．１１５５６５（配列番号：１２）、肺ライブラリーから得られたインサイト社クローンＮｏ．１２５５６９（配列番号：１３）及び１２５８３０（配列番号：１４）、炎症性アデノイドライブラリーから得られたインサイト社クローンＮｏ．１５８８６８（配列番号：１５）及び１６２１９９（配列番号：１６）、骨髄ライブラリーからえられたインサイト社クローンＮｏ．１７２４４９（配列番号：１７）及び１７４６９０（配列番号：１８）、胎盤ライブラリーから得られたインサイト社クローンＮｏ．１８０５９４（配列番号：１９）及び１８０９３５（配列番号：２０）、リウマチ様滑膜ライブラリーから得られたインサイト社クローンＮｏ．１９０２９９（配列番号：２１）、腎臓ライブラリーから得られたインサイト社クローンＮｏ．１９５５４１（配列番号：２２）及び１９７６１７（配列番号：２３）、及び小腸ライブラリーから得られたインサイト社クローンＮｏ．２３８９７０（配列番号：２４）がある。この新規なヒトシステインブロテアーゼに対する完全長核酸配列及びアミノ酸配列は第２図に示されている。第３図に示すのはｎｃｐに対する翻訳されたアミノ酸配列と日本住血吸虫から得られた近縁関係にあるシステインブロテアーゼ、ヘモグロビナーゼとのアライメントである（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＸ７０９６７；ＭｅｒｃｋｅｌｂａｃｈＡｅｔａｌ（１９９４）ＴｒｏｐＭｅｄＰａｒａｓｉｔｏ１４５：１９３１９８）。前述したように、第４図に示すのは酵素の様々なパラメータ（例えば親水性）である。５．ｃＤＮＡの完全長への延長ここに開示したインサイト社のクローンを用いてｃＤＮＡを完全長まで延長するためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができ、又それを実際に行った。プライマーは既知の配列に基づいて設計されるが、プライマーの一方は、アンチセンス方向（ＸＬＲ）の延長を開始するために合成され、プライマーのもう一方はセンス方向（ＸＬＦ）に配列を延長するために合成される。これらのプライマーにより、この配列を「外向きに」延長し、調査対象の遺伝子に対する新規で未知なヌクレオチド配列を含む単位複製配列を生成することが可能となる。プライマーは、Ｏｌｉｇｏ４．０（ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ，ＰｌｙｍｏｕｔｈＭＮ）、又は他の適当なプログラムを用いて行われ、長さが２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ群５０％以上、又は約６８〜７２℃で目的の配列にアニールするように設計される。ヘアピン構造を形成したり、プライマー− プライマー二量体化するような任意のヌクレオチドストレッチは取り除かれる。副腎ｃＤＮＡライブラリーは、ＸＬＲ＝ＧＧＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＧＧＣＡＴＧＧ及びＸＬＦ＝ＡＡＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＴＣのプライマーと共に用いて、インサイト社クローンＮｏ．１００８７７を延長し増幅するために用いられた。第２のプライマーの組、ＸＬＲ＝ＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＡＣＡＧＧＣＴＴＣＡＡＴＧ及びＸＬＦ＝ＧＧＧＧＡＣＴＧＧＴＡＣＡＧＣＧＴＣＡＡＣＴＧを、ＨＵＶＥＣｃＤＮＡライブラリーと共に用いて、インサイト社クローンＮｏ．６６９３１が延長され、システインプロテアーゼ配列の残りの部分が得られた。ＸＬ−ＰＣＲＫｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）の指示に従い、酵素と反応混合物とを徹底的に混合することによって、忠実度の高い増幅が達成される。各プライマーの４０ｐｍｏｌ及び推奨された濃度のキットの他の全ての成分を用いて開始されたＰＣＲは、ＰｅｌｔｉｅｒＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ（ＰＴＣ２００；ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ，ＷａｔｅｒｔｏｗｎＭＡ）を用いて以下のパラメータで実行される。ステップ１９４℃で１分間（初期変性）ステップ２６５℃で１分間ステップ３６８℃で６分間ステップ４９４℃で１５秒間ステップ５６５℃で１分間ステップ６６８℃で７分間ステップ７ステップ４〜６を更に１５回反復ステップ８９４℃で１５秒間ステップ９６５℃で１分間ステップ１０６８℃で７分１５秒間ステップ１１ステップ８〜１０を更に１２回反復ステップ１２７２℃で８分間ステップ１３４℃（この温度を維持）５〜１０μｌの反応混合物のアリコットが低濃度（約０．６〜０．８％）アガロースミニゲル上での電気泳動により分析され、配列の延長の反応がうまくいったか否かが決定される。最も大きい生成物を含むと考えられるバンドが選択されてゲルから切り取られる。更に精製を行うため、例えばＱＩＡＱｕｉｃｋ（商標）（ＱＩＡＧＥＮＩｎｃ）のような市販のゲル延長法が用いられる。ＤＮＡを回収した後、クレノウ酵素を用いて一本鎖、ヌクレオチドの末端の突出をトリムし、再連結及びクローニングが容易な平滑末端を形成した。エタノール沈殿の後、生成物は１３μｌの連結バッファに再度溶解され、１μ ｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼが添加され、この混合物は室温で２〜３時間、または１６℃で一晩インキュベートされた。（１０μｌの適当な培養液に入った）コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞が３μｌのライゲーション混合物で形質転換され、８０μｌのＳＯＣｍｅｄｉｕｍ（ＳａｍｂｒｏｏｋＪｅｔａｌ，ｓｕｐｒａ）で培養される。３７℃で１時間のインキュベーションの後、形質転換混合物全ては、２×Ｃａｒｂを含むＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）−ａｇａｒ（ＳａｍｂｒｏｏｋＪｅｔａｌ，ｓｕｐｒａ）上にプレートされる。後日、各プレートからいくつかのコロニーをランダムに取り出し、適当な市販の滅菌９６穴マイクロタイタープレートの個々の穴に入れられた１５０μｌの液体ＬＢ／２×Ｃａｒｂ培養液内で培養される。翌日、５μｌの各一晩培養した培養液は、非滅菌９６穴プレートに送られ、１：１０に水で希釈された後、５μｌの各サンプルがＰＣＲアレイに移される。ＰＣＲ増幅のために、４単位のｒＴｔｈＤＭＡポリメラーゼを含む１８μｌの濃縮ＰＣＲ反応混合物（３．３×）、ベクタープライマー、及び延長反応に用いられる遺伝子特異的プライマーの１または２以上が各穴に添加される。増幅は以下の条件を用いて行われる。ステップ１９４℃で６０秒間ステップ２９４℃で２０秒間ステップ３５５℃で３０秒間ステップ４７２℃で９０秒間ステップ５ステップ２〜４を更に２９回反復ステップ６７２℃で１８０秒間ステップ７４℃（この温度を維持）ＰＣＲ反応のアリコットは、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で泳動させられる。ＰＣＲの生成物のサイズは、元の部分的ｃＤＮＡと比較され、適当なクローンが選択されプラスミドにリゲートされて配列決定される。６．ＮＣＰ特異的オリゴマーを用いた診断アッセイｎｃｐの量の変化を伴う特定の状態または病状（上述の定義参照）が疑われる場合に生物学的サンプルにおいて発現されたｍＲＮＡの存在及び量、或いはそのいずれかを確認するためのオリゴマーを設計することができる。現在、特定の分子の発現を定量するために用いられる方法には幾つかある。これらの方法では、たいてい放射標識された（ＭｅｌｂｙＰＣｅｔａｌ１９９３ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ１５９：２３５−４４）またはビオチン標識された（ＤｕｐｌａａＣｅｔａｌ１９９３ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ２２９−３６）ヌクレオチド、対照標準の核酸の同時増幅、実験結果をプロットを補完することにより作成される標準グラフ曲線が用いられる。目的のオリゴマーが様々な希釈度で存在し、比色反応で定量が速やかになるようなＥＬＩＳＡ形式のアッセイを実行することにより定量がスピードアップされ得る。例えば、ＮＣＰ欠乏症は、前炎症性インターロイキン分子の量の増加、腫脹や不快感の増大をもたらす。同様に、ＮＣＰの過剰発現は、アポトーシスや腫瘍組織の損傷をもたらす。いずれの場合にも、早期に診断により、医療の専門家がその状態を治療したり、病状が更に悪化することを予防することが可能となる。同じアッセイを用いて、治療中に患者の病理学的状態が健常な状態に向かって進行していく経過をモニタすることもできる。７．センス分子またはアンチセンス分子この新規なシステインプロテアーゼまたはその調節エレメントの正確なＤＮＡ配列を知ることにより、それを、遺伝子発現の調査や改変のためのセンス技術（ＹｏｕｓｓｏｕｆｉａｎＨａｎｄＨＦＬｏｄｉｓｈ１９９３）ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ１３：９８−１０４）またはアンチセンス技術（Ｅｇｕｃｈｉｅｔａｌ（１９９１）ＡｎｎｕＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ６０：６３１−６５２）用のツールとして使用することができる。ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏでのｎｃｐの発現を抑制するために、Ｏｌｉｇｏ４．０（ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ）を用いて設計されたｎｃｐのフラグメントのコーディング配列に基づくオリゴヌクレオチドを使用することができる。別の形態として、ｎｃｐコード配列をＩｎｈｅｒｉｔＡｎａｌｙｓｉｓＳｏｆｔｗａｒｅ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて特定の切断部位においてｎｃｐを切断するように選択された制限酵素を用いて消化することにより、生成されたｎｃｐのフラグメントを用いてｎｃｐの発現を抑制することができる。更に、アンチセンス分子を、上流の非翻訳領域のリーダー配列またはｎｃｐコード領域に沿った様々な部位に結合するプロモータを抑制するように設計することもできる。別の形態として、コード配列の５’末端において約−１０〜＋１０ヌクレオチドにわたる領域に結合するオリゴマーまたはフラグメントを調製することにより、ｍＲＮＡのポリペプチドへの転写を抑制するアンチセンス分子を設計することができる。これらの技術は周知の技術である。読み枠の転写を妨害するように構築されたフラグメントを用いることに加えて、エンハンサー、イントロン、またはトランス作用調節遺伝子に対するアンチセンス配列を設計して遺伝子発現の修飾を行うことができる。同様に、「三重螺旋体（トリプルヘリックス）」塩基対法としても知られるＨｏｇｅｂｏｏｍ塩基対法を用いて抑制を達成することもできる。三重螺旋体は、二重螺旋体におけるポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結合のために螺旋が十分に開かれる能力を損なうものである。これらのタイプのアンチセンス分子は、発現ベクターに挿入され、好適な細胞または組織の形質転換のために用いられる。これには、過渡的なまたは短期間の治療のための滑膜孔への発現ベクターの導入が含まれ得る。アンチセンス配列の発現は、細胞が抑制分子であふれ、ベクターのコピーの全てが内性のヌクレアーゼにより機能を失うまで継続する。このような一過性の発現は非複製ベクターを用いた場合１ヶ月以上持続し、適当な複製エレメントが形質転換体または発現系において用いられた場合には３か月以上持続し得る。アンチセンス分子を含むベクターで、適切に分裂する細胞を安定的に形質転換することにより、遺伝子組み換え細胞株、組織または生物体を作り出すことができる（例えば、ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１１：１５５−２１５（１９９３）ａｎｄＵＳＰａｔｅｎｔＮｏ．４，７３６，８６６１２Ａｐｒｉｌ１９８８）。十分なベクターのコピーを同化または複製し、安定的な組み込みを可能にするこれらの細胞によって、ｎｃｐの通常の活性を完全に失わせる、または損なうに十分なアンチセンス分子を作り出すこともできる。多くの場合、ｎｃｐの機能は、細胞、組織または生物体レベルでの行動、例えば死亡率、病理学的経路の欠損、生態学的な変化を観察することにより確認することができる。８．ＮＣＰの発現ＮＣＰの発現は、そのｃＤＮＡを適当な発現ベクターにサブクローニングし、そのベクターを適当な発現宿主に導入させることにより達成される。この場合、以前に組織ライブラリの生成のために使用されたクローニングベクターもＥ．ｃｏｌｉにおけるｎｃｐ配列を直接発現させる。このベクターは、クローニングサイトの上流にβガラクトシダーゼのプロモータを有し、それに続けてアミノ末端Ｍｅｔ及び次に続くβガラクトシダーゼの７つの残基を含む配列を含む。これらの８つの残基のすぐ後に、転写に役立つバクテリオファージプロモータ及び多数の独特な制限サイトを有するリンカーを含む。標準的方法を用いて、単離され、ＩＰＴＧのトランスフェクションをなされた菌株の誘発により、ｎｃｐのｃＤＮＡ内部のβガラクトシダーゼの始めの７つの残基、リンカーに対応する約５〜１５個の残基に対応する融合タンパク質、及びｎｃｐのｃＤＮＡ内にコードされたペプチドが生成される。ｃＤＮＡクローンのインサートは必ずランダムプロセスによって生成されることから、入れられたｃＤＮＡが適切な翻訳のための正しい読み枠内に存在する機会は３つに１つだけである。ｃＤＮＡが適当な読み枠内にない場合には、それは周知の方法で適切な数の塩基の削除若しくは挿入を行うことによって得られる。このような方法としては、ｉｎｖｉｔｒｏ突然変異誘導、エキソヌクレアーゼＩＩＩ若しくは大豆ヌクレアーゼによる消化、若しくはオリゴヌクレオチドリンカー混入などがある。このｃＤＮＡは、特異的宿主におけるタンパク質の発現のために有用であると知られている他のベクター内にもシャトルされ得る。標的ｃＤＮＡ（２５個の塩基）の両端のストレッチに対してハイブリッド形成するのに十分なＤＮＡのセグメントとクローニングサイトを含むオリゴヌクレオチドアンプリマーは、標準的方法によって化学的に合成され得る。次いでこれらのプライマーを用いて、ＰＣＲにより所望の遺伝子セグメントが増幅される。得られた新たな遺伝子セグメントは、標準状態のもとで適当な制限酵素で消化され、ゲル電気泳動法によって単離される。これとは別の方法では、類似する遺伝子セグメントを、ｃＤＮＡを適当な制限酵素と共に消化し、欠失した遺伝子セグメントを化学的に合成されたオリゴヌクレオチドで埋めることによって生成する。１又は２以上の遺伝子からのコーディング配列のセグメントを互いに連結してクローニングし、適切なベクターに挿入することにより、組換え配列の発現が最適化される。このようなキメラ分子のための適切な発現宿主にはチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）及びヒト２９３細胞のようなほ乳類の細胞や、Ｓｆ９細胞のような昆虫の細胞や、サッカロミセスセレビシエのような酵母菌細胞や、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌があるが、これらに限定されるものではない。このような細胞系のそれぞれに対して有用な発現ベクターは、バクテリア内での増殖を可能にする複製起点、及び細菌内での選択を可能にするβラクタマーゼ抗生物質抵抗性遺伝子のような選択可能なマーカーを含んでいる。更に、このベクターは、真核生物の宿主細胞へのトランスフェクションに役立つネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のような第２の選択可能なマーカーを含む。真核生物の発現宿主において使用するために、ベクターは、それが目的のｃＤＮＡの一部分でない場合には、３’ポリアデニル化配列のようなＲＮＡプロセシングエレメントを必要とすることがある。天然のプロモータがこのｃＤＮＡの一部に含まれていない場合には、他の宿主特異的プロモータが、ｎｃｐのコーディング領域に特異的に結合されうる。このようなプロモータとしては、ＣＨＯ細胞に対してはＭＭＴＶ、ＳＶ４０、及びメタロチオネインプロモータ、細菌宿主に対してはｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｃ、及びＴ７プロモータ、また酵母菌に対してはα因子、アルコールオキシダーゼ、及びＰＧＨプロモータ等がある。ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）エンハンサのような転写エンハンサは、ほ乳類宿主細胞において使用される。標準的な培養方法により、ひとたび組換え細胞の均質な培養物が得られたならば、組換えにより生成された大量のペプチドが条件培地から回収され、周知の方法を用いて分析される。９．組換えＮＣＰの単離ＮＣＰは、タンパク質精製を促進するべく添加された１または２以上の付加的ポリペプチドドメインを有するキメラタンパク質として発現される。このような精製促進ドメインには、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュールのような金属キレートペプチド、固定免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、及びＦＬＡＧＳ伸展／アフィニティ精製システム（ＩｍｍｕｎｅｘＣｏｒｐ．ＳｅａｔｔｌｅＷＡ）において使用されるドメインなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。精製ドメインとｎｃｐ配列との間のＸＡ因子またはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）のような切断可能なリンカー配列を含むことが、ＮＣＰの発現を促進するのに役立っている。１０．ＮＣＰの活性生成または発現されたＮＣＰの活性の試験は、既知の量の酵素とタンパク質系の基質材料（例えばコラーゲン）とを生物学的に許容される培地の中で混合し、適切な時間でＮＣＰが消化されるようにすることによって行われ得る。様々な濃度、好ましくは１０〜１００ｎｇ／μｌのＮＣＰがスポットされるタンパク質系の材料に吸収された非変成ポリアクリルアミドゲルからなるザイモグラムを用いてＮＣＰの活性を検証する。３０〜６０分経過の後、このゲルはＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｌｕｅ染色される。活性の酵素は、タンパク質の濃度が低下したまたは完全に消失したスポットを形成する（Ｐａｅｃｈｅｔａｌ（１９９３）ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ２０８：２４９−５４）。１１．ＮＣＰ特異的抗体の同定または生成精製ＮＣＯは、既存の抗体ライブラリーのスクリーニングや、ポリクローナル法かモノクローナル法の何れかを用いた抗体の産生のために用いられる。ポリクローナル法では、逆相ＨＰＬＣ分離により、変性タンパク質が最大７５ｍｇ得られる。変性タンパク質は標準的なプロトコルを用いてマウス若しくはウサギを免疫化するのに用いられる。即ちマウスの免疫化に対しては約１００μｇが適切であり、ウサギの免疫化には最大１ｍｇが用いられ得る。マウスハイブリドーマの同定のためには、変性タンパク質を放射性ヨウ素で標識して用いて、抗体を産生し得るネズミのＢ細胞ハイブリドーマのスクリーニングを行う。この手順で必要となるタンパク質はごく少量で、即ち数千のクローンの標識付け及びスクリーニングのためには２０ｍｇで十分である。モノクローナル法では、ｃＤＮＡの転写物から推定されるＮＣＰのアミノ酸配列が分析されて、免疫抗原性の高い領域が決定される。第３図に示すように適当な親水性領域を含むオリゴペプチドが合成され、抗体を生成するための適切な免疫化プロトコルにおいて使用される。適当なエピトープを選択するための分析は、ＡｕｓｕｂｅｌＦＭ等（上述）によって説明されている。免疫化のための最適なアミノ酸配列が通常存在するのは、Ｃ末端、Ｎ末端、及びそれらの間に挟まれた、タンパク質がその自然な配座にあるとき外部環境にさらされることの多いポリペプチドの親水性領域である。典型的には、約１５個の残基を有する長さの選択されたペプチドは、ｆｍｏｃ −ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを用いるＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒＭｏｄｅｌ４３１Ａを用いて合成され、Ｍ−メイルイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（M-male imidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester）と反応（ＭＢＳ；ＡｕｓｕｂｅｌＦＭ等，上述）させることによってキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、Ｓｉｇｍａ）に結合される。必要ならば、ＫＬＨと結合できるようにするため、システインがペプチドのＮ末端に挿入される。ウサギは、フロイント完全アジュバントのペプチド−ＫＬＨ複合体と共に免疫化される。得られた抗血清は、ペプチドとプラスチックを結合し、１％のウシの血清アルブミンでブロックし、抗血清と反応させ、洗浄し、かつ（放射性または蛍光剤により）標識されたアフィニティ精製された特異的ヤギ抗ウサギ１ｇＧと反応させることによって抗ペプチド活性がテストされる。ハイブリドーマは標準的な技術を用いて調製されスクリーニングされる。目的のハイブリドーマは、標識されたＮＣＰと共にスクリーニングを行うことによって検出され、所望の特異性を有するモノクローナル抗体を産生する融合体が同定される。典型的なプロトコルにおいては、プレートの穴（ＦＡＳＴ；Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）が、１０ｍｇ／ｍｌの、アフィニティ精製された特異的ウサギ抗マウス（または適当な抗−種１ｇ）抗体によってコーティングされる。コーティングされた穴は１％のＢＳＡでブロックされ、洗浄されて、ハイブリドーマからの上澄みに曝される。インキュベーションの後、穴は１ｍｇ／ｍｌの標識されたＮＣＰに曝される。抗体を産生するクローンは、上述のバックグラウンドにおいて検出され得る量の標識されたＮＣＰと結合する。このようなクローンはが拡大され、限界希釈（１細胞／３穴）で２サイクルのクローニングを受ける。クローン化されたハイブリドーマはプリスタン処理されたマウスに注射されて、それが腹水を生成し、プロテインＡ上のアフィニティクロマトグラフィーによってマウスの腹水からモノクローナル抗体が生成される。少なくとも１０⁸／Ｍ、好ましくは１０⁹〜１０¹⁰またはそれ以上の親和性を有するモノクローナル抗体は、典型的には、ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ及びＧｏｄｉｎｇ（１９８６）ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋＣｉｔｙに記載されているような標準的な手順によって生成される。ここではこの両資料を参照されたい。１２．ＮＣＰ特異的抗体を用いる診断テスト特定のＮＣＰ抗体は、ＮＣＰの量若しくは分布の差によって特徴付けられる慢性または急性の疾病や前病状態の診断に役立つ。さかのぼって考えると、ＮＣＰは、主として器官の機能、炎症、または生体防衛が関係する多くのライブラリーにおいて見出された。ＮＣＰに対する診断テスト方法には、人体の体液、組織、若しくはそのような組織の抽出物に存在するＮＣＰを検出するべく抗体及び標識を使用する方法が含まれる。本発明のポリペプチド及び抗体は修飾して使用されるか、または修飾することなく使用される。このポリペプチド及び抗体は、多くの場合、リポーター分子と共有結合、若しくは非共有結合の何れかで結合することによって標識される。さまざまな標識及びその関連技術が知られており、科学文書及び特許明細書の双方において広く報告されてきた。適切な標識としては、放射性核種、酵素、基質、共同因子（cofactors）、インヒビター（阻害剤）、蛍光剤、化学ルミネセンス剤、磁性粒子等がある。このような標識の使用方法は、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号、及び第４，３６６，２４１号の明細書に記載されている。また組換え免疫グロブリンは、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載の方法により生成することができる。これらの明細書を本明細書とともに参照されたい。該タンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体、若しくはモノクローナル抗体の何れかを用いる、可溶性ＰＤＳまたは膜結合ＰＤＳの測定のためのプロトコルは、様々なものが周知となっている。この例を挙げると、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）等がある。好適なのは、ＰＤＳ上の２つの非干渉エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を用いる二点（two sites）モノクローナル免疫アッセイであるが、競合的結合アッセイを用いてもよい。これらのアッセイは例えばＭａｄｄｏｘ，ＤＥ等（１９８３，ＪＥｘｐＭｅｄ１５８：１２１１）のような他の文書に記載されている。１３．特異的抗体を用いた未変性ＮＣＰの精製未変性（native）ＮＣＰまたは組換えＮＣＰは、特定のＮＣＰに対して特異的な抗体を用いる免疫性アフィニティクロマトグラフィーによって精製され得る。一般に、免疫アフィニティカラムは、抗ＮＣＰ抗体と活性化クラマトグラフィー樹脂とを共有結合することによって構成される。ポリクローナル免疫グロプリンは、硫酸アンモニウムとともに沈殿させるか、固定プロテインＡ上で精製させることによって免疫血清から調製される（ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＰｉｓｃａｔａｗａｙＮＪ）。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿か固定プロテインＡ上でのクロマトグラフィーによって、マウスの腹水から調製される。部分的に精製された免疫グロプリンは、ＣｎＢｒ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のようなクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。製造者の指示に従った処理により、抗体は樹脂に結合し、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂が洗浄される。このような免疫アフィニティカラムは、可溶性のＮＣＰを含む細胞の分画を調製することによってＮＣＰの精製を行うときに使用される。この調製は、全ての細胞の可溶化を行い、（洗剤を添加して行われる、または洗剤無添加での）分画遠心分離を用いて得られる小細胞分画の単離を行う方法か、若しくは周知の他の方法によって誘導される。別の方法では、シグナル配列を含む可溶性ＮＣＰが、細胞が成長する媒質に有用な量だけ分泌される。可溶性ＮＣＰ含有調製物は免疫アフィニティカラムを通され、このカラムがＮＣＰの優先吸収が可能な条件（即ち、洗剤が存在する高イオン強度の緩衝液を使用）のもとで洗浄される。次いで、このカラムは抗体／ＮＣＰ結合を切断するような条件（即ち、尿素またはチオシアネートイオンのような高濃度のカオトロープまたはｐＨ２〜３の緩衝液を使用）の下で溶離され、ＮＣＰが回収される。１４．薬物スクリーニング本発明のＮＣＰは、様々な薬物スクリーニング技術において、ＮＣＰの結合フラグメントを利用することによって、治療効果を有する化合物のスクリーニングに役立つ。このようなテストで使用されるペプチドフラグメントは、溶質に遊離しているか、固体の担体に固着しているか、細胞の表面や細胞内に存在している。例えば、ＮＣＰとテストされる薬剤との複合体の形成が測定される。別の例では、テストする薬物がＮＣＰと受容体との複合体形成に与える影響を検定する。マクロファージ活性に影響を与え得る薬物または他の作用薬をスクリーニングする方法は、このような薬物をＮＣＰフラグメントに接触させる過程と、薬物とＣＢポリペプチドまたはフラグメントとの複合体の存在を検定する過程とを含む。このようなアッセイにおいては、ＮＣＰフラグメントは通常標識される。適当なインキュベーションの後、遊離ＮＣＰフラグメントは結合された形態で存在するものから分離されて、遊離もしくは非複合化標識の量が、特定の薬物がＮＣＰと結合する能力の測定基準となる。薬物スクリーニングのための他の技術で、ＮＣＰポリペプチドに対する適切な結合アフィニティを有する化合物の高スループットのスクリーニングが可能となるが、これについては１９８４年９月１３日に公開されたヨーロッパ特許出願第８４／０３５６４号に詳細に記載されており、ここではこれを参照されたい。簡単に説明すると、多数の異なる小さなペプチドテスト化合物が、プラスチックピンまたは他の表面のような固体基質上で合成される。このペプチドテスト化合物は、ＮＣＰフラグメントと反応させられた上で洗浄される。次いで結合されたＮＣＰフラグメントの検出がは周知の方法を用いて行われる。精製されたＮＣＰを、上述の薬物スクリーニング技術で利用するためにプレート上に直接コーティングしてもよい。更に、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、それを固体の担体上に固定化することもできる。ＮＣＰと結合し得る中和抗体がＮＣＰフラグメントに結合するテスト化合物と競合する競合的薬物スクリーニングアッセイの利用も本発明の範囲に含まれる。この方法においては、ＮＣＰと１又は２以上の抗原決定基を共有する任意のペプチドの存在を検出するために抗体が用いられる。１５．ＮＣＰと相互作用する分子の同定本発明の精製ＮＣＰは、それと相互作用する分子の同定、特性付け及び精製のための研究用のツールである。周知のさまざまな方法によって適当な標識がＮＣＰに組み込まれ、標識されたＮＣＰは、溶解した分子若しくは膜結合分子を捕捉するのに用いられる。好適な方法は、ＮＣＰの一級アミノ基に¹²⁵Ｉボルトンハンター（Bolton-Hunter）試薬で標識する過程を含む（Ｂｏｌｔｏｎ，ＡＥａｎｄＨｕｎｔｅｒ，ＷＭ（１９７３）ＢｉｏｃｈｅｍＪ１３３：５２９）。この試薬は、生物学的活性の随伴性損失を引き起こすことなくさまざまな分子に標識するのに使用されてきた（ＨｅｂｅｒｔＣＡ等（１９９１）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６６：１８９８９；ＭｃＣｏｌｌＳ等（１９９３）ＪＩｍｍｕｎｏｌ１５０：４５５０−４５５５）。膜結合分子は、標識されたＮＣＰ分子と共にインキュベートされ、洗浄されて結合していない分子が除去され、ＮＣＰ複合体が定量される。異なる濃度のＮＣＰを用いて得られたデータは、ＮＣＰの数、アフィニティ及び会合度（associatlon）の値を計算するのに用いられる。標識されたＮＣＰは、ＮＣＰが相互作用する分子、特にインヒビターを精製するための試薬としても役立つ。アフィニティ精製の一実施例においては、ＮＣＰはクロマトグロフィーカラムと共有結合される。細胞及びその細胞膜を抽出して、ＮＣＰを除去し、さまざまなＮＣＰから遊離さらた小成分をカラムに通過させる。分子は、そのＮＣＰに対する親和性によってカラムに結合する。ＮＣＰ複合体は、カラムから回収され、解離されて、回収された分子はＮ末端タンパク質シークエンシングまたは他の同定のための処理を受ける。捕捉された分子がアミノ酸配列を有している場合には、適当なｃＤＮＡライブラリからその遺伝子をクローニングするための縮重オリゴヌクレオチドプローブの設計にそれを用いることができる。別の方法では、ＮＣＰに対して産生されたモノクローナル抗体がスクリーニングされて、標識されたＮＣＰの結合を阻害するものが同定される。次いで、これらのモノクローナル抗体は、関連分子の発現クローニングまたはアフィニティ精製において使用される。他の可溶性結合分子も同様に同定される。標識されたＮＣＰは、活性化単球またはマクロファージを含む肺、腎臓、または他の組織に由来する適当な物質または抽出物と共にインキュベートされる。インキュベーションの後、（ＮＣＰフラグメント単体より大きい）ＮＣＰ複合体は、サイズ除外クロマトグラフィーまたは濃度勾配遠心法のようなサイジング技術によって同定され、周知の方法によって精製される。可溶性結合タンパク質は、Ｎ末端シークエンシングを受けて、可溶性タンパク質が既知の場合にはデータベース上での同定のために十分な情報、可溶性タンパク質が未知の場合でもクローニングのための十分な情報が得られる。１６．ＮＣＰに対する抗体、インヒビター使用及び投与ＮＣＰの抗体及びインヒビターは、治療的に投与されたとき異なる効果を発揮する。この抗体及びインヒビターは、アップレギュレートされたＮＣＰの発現に関係する障害や疾病によって引き起こされる過度の損傷を少なくしたり、或いはなくすために用いられる。これらの分子または治療薬（ＴＳＴ）のそれぞれは、非中毒性、不活性、薬学的な許容範囲にある水性担体媒質で配合される。媒質のｐＨは、好ましくは約５〜８、特に好ましくは６〜８である。しかし、このｐＨは配合されるペプチド、抗体またはインヒビターの特性の違いや、治療条件の違いによって変わってくる。ＴＳＴの特性には、分子の溶解度、半減期及び抗原性／免疫抗原性、及びインヒビターは標的に達する能力が含まれ、これらの特性及び他の特性が効果的な担体を決める助けとなる。ＴＳＴとしては天然のヒトタンパク質も好適であるが、薬物スクリーニングによって得られた有機分子または合成分子も、特定の状況においては同様に効果的である。ＴＳＴは周知の投与経路で投与される。この投与経路には、局所的クリーム及びゲル、経粘膜スプレー及びエアロゾル、経皮パッチ及び帯具、注射可能な静脈の潅注配合物、及び液体及び錠剤の経口薬であって胃酸及び酵素に対して抵抗性を有するように配合されたもの等があるが、これらに限定されない。特定の配合、正しい投与量、及び投与経路は病院所属医師によって決定されるが、状況に応じて様々に変化し得る。このような決定は、治療条件、投与されるＴＳＴ、及び特定のＴＳＴの薬動力学的プロファイルのようなさまざな要素を考慮することによってなされる。考慮に入れるべき他の因子には、患者の病状（例えば重症であるかどうか）、年齢、体重、性別、食事、時間、及び投与の頻度、薬物の組合せ、反応感受性及び治療に対する耐性／反応性などがある。長時間作用するＴＳＴ配合物の投与頻度は、３〜４日に１回の投与、毎週１回の投与、若しくは２週間に１回の投与程度であるが、この頻度は特定のＴＳＴの半減期及びクリアランス速度によって決まる。通常の投与量は０．１〜１００，０００μｇの間であり、総投与量の上限は約１ｇであるが、これは投与経路によって異なる。特定の投与量及び投与方法に関する手引きは、米国特許第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号または第５，２２５，２１２号明細書に記載されている。当業者は異なるＴＳＴに対しては異なる配合を用いることができる。肺細胞への投与には腎臓や他の細胞の場合とは異なる投与方法が必要となる可能性がある。ＮＣＰ発現の変化を伴う状態は、ＴＳＴで治療可能であると考えられる。このような状態には、詳述すると、貧血症、気管支炎、肺気腫、歯肉炎、炎症性腸疾患、インシュリン依存性糖尿病、白血病、多発性内分泌腫瘍症、骨関節炎、骨粗鬆症、肺繊維症、慢性関節リウマチ、敗血性ショック症候群、及び全身性エリテマトーデス等があるがこれらに限定されない。このような状態は、上述のテストによって診断され得る。更に、このようなテストを治療のモニタのために利用することもできる。上述の説明の中に記載された全ての文献及び特許明細書は、本明細書と一体に組み込まれたものとして参照されたい。ここに開示した本発明の方法及びシステムに対して、本発明の範囲及び精神を逸脱することなく加えられる様々な変更は当業者には明らかであろう。本発明は特定の好適実施例によって説明したが、本発明の範囲がここに開示した特定の実施例のみに限定されるものではないということを理解されたい。実際、分子生物学またはその関連分野の専門家にとって明らかな、ここに開示した本発明の実施例の様々な変更は、請求の範囲に記載の発明の範囲内に含まれるものとして意図されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 31/00 ６１１Ａ６１Ｋ 31/00 ６１１６１１Ｃ６１９６１９Ａ６１９Ｅ６２９６２９Ａ６２９６３１６３１６３５６３５Ａ６３５ 38/46 39/395 Ｐ 39/395 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/40 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 9/64 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 9/64 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｐ 21/08 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/37 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＧ０１Ｎ 33/573 Ａ６１Ｋ 37/54 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＵ，ＳＥ，ＳＧ (72)発明者デレジーン、アンジェロ・エムアメリカ合衆国カリフォルニア州94544・ヘイウォード・オークモントウェイ 30474

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号：２のアミノ酸配列、又はそのフラグメントを含むことを特徴とする概ね精製された新規なシステインブロテアーゼ（ＮＣＰ）。２．請求項１に記載の前記新規なシステインブロテアーゼをコードする単離され且つ精製されたポリヌクレオチド配列。３．配列番号：１又はそのフラグメントを含むことを特徴とする単離され且つ精製されたポリヌクレオチド配列。４．請求項３の前記ポリヌクレオチド配列に対して厳格な条件の下でハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列。５．請求項３に記載のポリヌクレオチドのオリゴヌクレオチド。６．ｎｃｐ発現の変化を伴う状態を診断する診断テスト方法であって、（ａ）生物学的サンプルを準備する過程と、（ｂ）前記生物学的サンプルと請求項５に記載の前記オリゴヌクレオチドとを溶液内で結合する過程と、（ｃ）前記ｎｃｐ配列を増幅する過程と、（ｄ）前記ｎｃｐ発現を測定する過程と、（ｅ）測定された発現レベルと標準的な発現レベルとを比較し、前記状態の存在を確認する過程とを有することを特徴とする診断テスト方法。７．前記状態が、貧血症、気管支炎、喘息、歯肉炎、炎症性腸疾患、インシュリン依存性糖尿病、白血病、多発性内分泌腫瘍症、骨関節炎、骨粗鬆症、肺繊維症、慢性関節リウマチ、敗血症、及び全身性エリテマトーデスからなるグループから選択された状態であることを特徴とする請求項６に記載の診断テスト方法。８．請求項３のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。９．請求項８の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。１０．生物学的活性又は免疫原性のポリペプチドを生成し且つ精製するための方法であって、（ａ）前記ポリペプチドの発現に適切な条件の下で、請求項９の前記宿主細胞を培養する過程と、（ｂ）前記宿主細胞の媒地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むことを特徴とする生物学的活性又は免疫原性のポリペプチドを生成し且つ精製するための方法。１１．請求項１のペプチド及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬品組成物。１２．請求項１１の医薬品組成物を適切に投与することによりＮＣＰ発現の変化を伴う疾病の治療のための方法。１３．請求項１の精製ポリペプチドに対して特異的な抗体。１４．ＮＣＰ発現の変化を伴う状態に対する診断テスト方法であって、（ａ）生物学的サンプルを準備する過程と、（ｂ）請求項１３の抗体と前記生物学的サンプルとを結合する過程と、（ｃ）前記抗体とＮＣＰとの複合体形成のレベルを測定する過程と、（ｄ）前記発現レベルと標準的な発現レベルとを比較することにより、前記状態の存在を確認する過程とを含むことを特徴とする診断テスト方法。１５．前記状態が、貧血症、気管支炎、喘息、歯肉炎、炎症性腸疾患、インシュリン依存性糖尿病、白血病、多発性内分泌腫瘍症、骨関節炎、骨粗鬆症、肺繊維症、慢性関節リウマチ、敗血症、及び全身性エリテマトーデスからなるグループから選択された状態であることを特徴とする請求項１４に記載の診断テスト方法。１６．請求項１３の抗体及び薬学的に許容可能な賦形剤を含むことを特徴とする医薬品組成物。１７．請求項１６の医薬品組成物を投与する過程を含むことを特徴とするＮＣＰ発現の変化を伴う状態の治療のための方法。１８．請求項１のポリペプチドに対する特異的結合アフィニティによって複数の化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）複数の化合物を準備する過程と、（ｂ）前記ポリペプチドと前記化合物をＮＣＰに結合するに十分な方法と時間をかけて結合する過程と、（ｃ）結合したＮＣＰを検出し回収して、その化合物を同定する過程とを含むことを特徴とする請求項１のポリペプチドに対する特異的結合アフィニティによって複数の化合物をスクリーニングする方法。１９．請求項１８の化合物及び薬学的に許容可能な賦形剤を含むことを特徴とする医薬品組成物。２０．請求項１７の医薬品組成物を治療が必要な患者に投与する過程を含むことを特徴とするＮＣＰ発現の変化を伴う状態の治療方法。