MXPA98003196A - Proteasa de cisteina humana novedosa - Google Patents
Proteasa de cisteina humana novedosaInfo
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Abstract
La presente invención provee un polinucleótido el cual identifica y codifica una proteasa de cisteína novedosa (PCN) expresada en células tanto en la glándula adrenal como el endotelio de vena umbilical humana. La presente invención también provee moléculas de contrasentido diseñadas a partir de la secuencia de nucleótidos o su complemento. La invención además provee vectores de expresión genéticamente y células huésped para la producción de PCN u otras moléculas que se unen específicamente a PCN y composiciones farmacéuticas basadas en moléculas que se unen a PCN. La invención provee específicamente análisis de diagnóstico basados en la expresión de PCN alterada y que permite la identificación de dicha condición. Estos análisis utilizan sondas diseñadas a partir de las secuencias deácidos nucleicos que codifican PCN o anticuerpos que se unen específicamente.
Description
PROTEASA DE CISTEINA HUMANA NOVEDOSA *
CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a una novedosa proteasa de 5 cisteína humana y el uso de sus secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos en el diagnóstico, estudio, prevención y tratamiento de enfermedades autoinmunes o degenerativas.
ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA 10 Las proteasas de cisteína están involucradas en diversos procesos celulares que varían desde el procesamiento de proteínas de precursor hasta degradación intracelular. Pueden inducir permeabilidad vascular a través de la activación de la ruta de "kallikrein/kinin", complejo con varias hemoglutininas, activan los componentes de complemento y destruyen
serpinas. Su actividad de endopeptidasa y especificidad "similar a la tripsina" conducen a la especulación de que existen muchas moléculas de proteasa de cisteína especializadas encontradas en varias células y tejidos humanos. Las proteasas de cisteína son conocidas por ser producidas por
monocitos, macrófagos y otras células del sistema inmune. Las células migran a los sitios de inflamación y en su papel protector secretan varias moléculas las cuales limpian el tejido dañado. Bajo otras condiciones, estas mismas células pueden producir en exceso las mismas moléculas y provocar destrucción de tejido. Este es el caso de enfermedades
autoinmunes tal como artritis reumatoide, cuando la secreción de la proteasa de cisteína, catepsina C, degrada colágeno, laminina, elastina y otras proteínas estructurales encontradas en la matriz extracelular de los huesos. El hueso debilitado por tal degradación es más susceptible de invasión por tumor y metástasis. La proteasa de cisteína humana novedosa de esta solicitud fue identificada primero entre las secuencias de una genoteca de cDNA hecha de glándulas adrenales humanas. Las glándulas adrenales humanas son estructuras similares a tapas ubicadas sobre cada riñon. Cada glándula consiste de la médula adrenal y la corteza adrenal. La médula adrenal está hecha de tejido de cromafina y principalmente secreta norepinefrina (NE) y epinefrina (E). La estimulación de los nervios simpáticos a la médula adrenal libera estas dos catecolaminas en la sangre. La NE contrae los vasos sanguíneos, estimula la actividad cardiaca, inhibe el tracto gastrointestinal y dilata las pupilas de los ojos. La E dispara casi las mismas respuestas, pero tiene un efecto más fuerte sobre la actividad cardiaca y un efecto más débil sobre los vasos sanguíneos. La NE y la E complementan los efectos del sistema nervioso simpático pero parecen tener un pequeño efecto sobre su función. La corteza adrenal usa colesterol para producir un gran número de corticoesteroides los cuales exhiben actividad hormonal . La capa exterior de la glándula adrenal produce principalmente la mineralocorticoide, aldosterona. La regulación estimulante e inhibidora de secreción de aldosterona es gobernada por nivel de potasio, interacciones de renina-angiotensina y secreción de hormona adrenocorticotrófica (ACTH), dopamina, serotonina, y ß-endorfina. La aldosterona regula el volumen de fluido extracelular y balance de sodio/potasio al interactuar con receptores de mineralocorticoides tipo I en tejidos objetivo tal como el riñon, glándula salival y mucosidad intestinal. Las capas internas de la glándula adrenal son sitios de biosíntesis de glucocorticoide y andrógeno, estrógeno y progesterona. El glucocorticoide principal es cortisol, el cual funciona en la regulación del metabolismo de proteínas, carbohidratos, lípidos y ácidos nucleicos, actúa como un anti-inflamatorio, y juega un papel de bioretroalimantación para suprimir funciones endocrinas. El andrógeno, secretado bajo la regulación de ACTH ; es responsable de iniciar el desarrollo de características sexuales secundarias (en ambos sexos), de los órganos sexuales en el macho y de mantener espermatogénesis vitalicia. Condiciones de enfermedades y desórdenes de la glándula adrenal incluyen tumores de células de cromafina, los cuales son parte de los síndromes de neoplasia endocrina múltiple; síndrome de Sipple, el cual puede encontrarse solo o asociado con carcinoma de tiroide medular y adenomas paratiroideos; virilismo adrenal; síndrome de Cushing; síndrome de Conn; enfermedad de Addison , la cual es una insuficiencia adrenocortical primaria; insuficiencia adrenocortical secundaria, y adenomas adrenales, los cuales incluyen quistes adrenales benignos, carcinoma adrenal no funcional, y tuberculosis de la glándula adrenal. La glándula adrenal y sus enfermedades son revisadas, inter alia, en Guyton AC (1991 ) Textbook of Medical Physiology, WB Saunders Co-. , Philadelphia PA; Isselbacher, KJ et al (1994) Harrison's Principies of Interna! Medicine, McGraw-Hill Nueva York NY; The Merck Manual of Diagnosis and Therapy (1992) Merck Research Laboratories, Rahway NJ; y
* Goodman AG et al. (1993) The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nueva York NY.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una proteasa de cisteína novedosa (PCN) aislada de glándula adrenal humana y células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) y al uso de esta proteína novedosa y
¿fe sus secuencias de ácidos nucleicos en el diagnóstico, estudio, prevención
y tratamiento de enfermedades inmunes, particularmente enfermedades autoinmunes y degenerativas. La invención en cuestión proporciona una secuencia de nucleótidos única (SEQ ID NO 1 ), la cual codifica una proteasa de cisteína humana novedosa. Esta proteasa de cisteína (pcn) se identificó primero como una
secuencia de nucleótidos parcial, Clon Incyte 100877, vía investigación por computadora para alineamientos de secuencia local entre los cDNAs de una genoteca de glándulas adrenales. Los residuos de aminoácidos pertinentes, los cuales permiten que esta molécula esté caracterizada como una proteasa de cisteína son Q48, Cs2 y H .50. La secuencia de
nucleótidos parcial también fue identificada como Clon Incyte 66931 (SEQ ID NO 4) de una genoteca de cDNA de células endoteliales de vena umbilical humana. Un procedimiento XL-PCR modificado, oligonucleótidos especialmente diseñados y genotecas adrenales y H UVEC fueron usados para extender los Clones Incyte 100877 y 66931 para obtener la secuencia
de longitud completa. Las secuencias de nucleótidos parciales (SEQ I D NO:3 y 5-24) descritas en la presente, han sido identificadas en varias genotecas diferentes, las cuales parecen compartir ciertas características. Estas características incluyen líneas de células o tejidos los cuales son inmortales (líneas de células de leucemia y linfoma), inflamados (genotecas de sinovio reumatoide y adenoide), o involucradas en limpieza sistemática o defensa a través de ya sea el albergue o producción de células tal como monocitos o macrófagos (genotecas de hueso medular, riñon, pulmón, placenta e intestino delgado). Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos congregadas mostradas en la Figura 1 representan una nueva proteasa de cisteína humana. Una investigación por computadora adicional para alineamientos de secuencia local de la secuencia de aminoácidos de la proteasa de cisteína novedosa descrita en la presente, mostró que la molécula más estrechamente relacionada, aproximadamente 50% de similitud de aminoácidos, es la hemoglobinasa de Schistosoma ¡aponicum (Acceso GenBank X70967; Merckelbach A et al (1994) Trop Med Parasitol 45: 193 198). La proteasa de cisteína de esta solicitud muestra 50% de similitud de la secuencia de aminoácidos con hemoglobinasa de S. japonicum . Basado en los residuos de proteasa de cisteína conservados, Q48, C52 y H 150, de la región catalítica; similitud a la molécula estrechamente relacionada, hemoglobinasa; y la presencia de la proteasa de cisteína novedosa en células y tejidos, los cuales son inmortales, inflamados o involucrados en limpieza sistemática o defensa; la proteasa de cisteína novedosa está involucrada en la proteólisis, en limpieza sistemática y defensa, y por lo tanto es útil en el diagnóstico, estudio, prevención y tratamiento de enfermedades autoinmunes o degenerativas. Aspectos adicionales de la presente invención incluyen moléculas de contrasentido de pcn, las cuales son útiles para disminuir o eliminar la expresión de la secuencia genómica de nucleótidos. La presente invención también refiere, en parte, las secuencias de polinucleótidos y vectores de expresión codificando PCN y métodos para la producción y recuperación de PCN de células huésped. Las secuencias de ácidos nucleicos de pcn descritas en la presente pueden usarse en ensayos de diagnóstico para detectar y cuantificar niveles de mRNA de pcn en células y tejidos. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de pcn puede usarse en ensayos de PCR o hidridación de fluidos o tejidos sometidos a biopsias para diagnosticar anormalidades en expresión de genes asociadas con un desorden inmune. La invención se refiere además a conjuntos de diagnóstico para la detección de PCN o secuencias de ácidos nucleicos que codifican PCN comprendiendo PCN , anticuerpos específicos para PCN o secuencias de ácidos nucleicos que codifican PCN . Tales conjuntos de diagnóstico pueden usarse para la detección de cualquier condición, desorden o estado de enfermedad relacionado a la expresión aberrante de PCN , incluyendo pero no limitando a: anemia, arterioesclerosis, asma, bronquitis, cánceres, enfisema, gingivitis, enfermedad inflamatoria de intestino, diabetes mellitus dependiente de insulina, leucemia, osteoartritis, osteoporosis, fibrosis pulmonar, artritis reumatoide, síndromes de choque séptico, y lupus eritematoso sistemático. Pasos para probar una muestra biológica con sondas de nucleótidos basadas en la secuencia de nucleótidos de pcn o anticuerpos producidos contra la proteína PCN purificada son proporcionados. Los anticuerpos pueden ser usados para fines terapéuticos así como diagnósticos, por ejemplo, para neutralizar la actividad de una PCN asociada con un desorden inmune tal como artritis reumatoide. La presente invención también se refiere en parte a proteínas, péptidos, y moléculas orgánicas capaces de modular la actividad de PCN, las cuales pueden usarse terapéuticamente en el tratamiento de estados de enfermedad asociados con la expresión aberrante de una PCN. La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas para el tratamiento de estados de enfermedad asociados con la expresión aberrante de pcn comprendiendo PCN , secuencias de ácidos nucleicos que codifican PCN, anticuerpos anti-PCN, anti PCN u otras proteínas, péptidos u moléculas orgánicas capaces de modular la expresión de PCN .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 exhibe un alineamiento de secuencias cDNA, el cual abarca la región de codificación de pcn. Los alineamientos mostrados en esta y las siguientes figuras fueron producidos usando el programa de alineamiento multisecuencia del programa de computadora DNASTARMR
(DNASTAR Inc, Madison Wl). Las Figuras 2A, 2B, 2C y 2D muestran los alineamientos de aminoácidos y ácidos nucleicos de PCN .
Las Figuras 3A y 3B muestran los alineamientos de aminoácidos entre PCN y hemoglobinasa de Schistosoma ¡aponicum (Acceso GenBank X70967). La Figura 4 exhibe el análisis de DNASTAR de PCN regiones a (A), regiones ß (B), regiones de vuelta (T), regiones de bobina (C), gráfica de hidrofilicidad (H), regiones antipáticas a (AA), regiones antipáticas ß (BA), índice antigénico (Al) y gráfica de probabilidad de superficie (S) basada en la secuencia de aminoácidos predicha y composición.
MODOS PARA REALIZAR LA INVENCIÓN Definiciones La presente invención se refiere a una proteasa de cisteína novedosa, la cual es expresada en la glándula adrenal, células endoteliales de vena umbilical humana, líneas de células de leucemia y linfoma, adenoide, sinovio reumatoide, hueso medular, riñon, pulmón, placenta e intestino delgado. Como se usa en la presente, la abreviatura para la proteasa de cisteína novedosa en el caso inferior (pcn) se refiere a un gene, cDNA, RNA o secuencia de ácidos nucleicos, mientras que la versión del caso superior (PCN) se refiere a una proteína, polipéptido, péptido, oligopéptido, o secuencia de aminoácidos. Como se usa en la presente, PCN es un término el cual se refiere a PCN de cualquier especie, incluyendo bovina, ovina, porcina, equina, de murino y de preferencia humana. Se refiere a una forma de variante o que ocurre de manera natural y PCN de cualquier fuente sea natural, semi-sintética, sintética o recombinante. Una PCN preferida es una que tiene por lo menos 80% de similitud de secuencia de aminoácidos, una variante más preferida es una que tiene 90% de similitud de secuencia de aminoácidos, y una variante más preferida es una que tiene 95% de similitud de secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos de
PCN ilustrada en la Figura 1. Un "oligonucleótido" u "oligómero" es un tramo de residuos de nucleótidos el cual tiene un número suficiente de bases a ser usadas en una reacción en cadena de polimerasa (PCR). Estas secuencias cortas se
" ^ basan en (o son diseñadas de) secuencias de cDNA o genómico y son ?o usadas para amplificar, confirmar, o revelar la presencia de un DNA idéntico, similar o complementario o RNA en una célula o tejido particular. Los oligonucleótidos u oligómeros comprenden porciones de una secuencia de DNA que tiene por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos y no menos de aproximadamente 50 nucleótidos, de pref.erencia
aproximadamente 15 a 30 nucleótidos. Son químicamente sintetizados y pueden ser usados como sondas. Las "sondas" son secuencias de ácidos nucleicos de longitud variable, de preferencia entre por lo menos aproximadamente 10 y no menos de aproximadamente 6,000 nucleótidos. Se usan en la detección de
secuencias de ácidos nucleicos idénticas, similares o complementarias. Sondas de longitud mayor generalmente son obtenidas de una fuente natural o recombinante, son altamente específicas y mucho menores para hibridar que los oligonucleótidos. Pueden ser de filamento simple o doble y son cuidadosamente diseñadas para tener especificidad en tecnologías
de PCR, basadas en membrana de hibridación o similares a ELISA.
Las moléculas "reportadoras" son porciones químicas usadas para marcar una secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos, incluyen, pero no están limitadas a, radionuclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimiluminiscentes, o cromogénicos. Las moléculas reportadoras asociadas con, establecen la presencia de, y pueden permitir la cuantificación de una secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos particular. Una "porción" o "fragmento" de un polinucleótido o ácido nucleico comprende toda o parte de la secuencia de nucleótidos teniendo menos nucleótidos que aproximadamente 6 kb, de preferencia menos que aproximadamente 1 kb, los cuales pueden usarse como una sonda. Tales sondas pueden marcarse con moléculas reportadoras usando traslación de corte, reacción de llenado de Klenow, PCR u otros métodos bien conocidos en la técnica. Después de la prueba preliminar para optimizar las condiciones de reacción y para eliminar las sondas de ácidos nucleicos positivas falsas, pueden usarse en Southern, northern o hibridaciones in situ para determinar si DNA o RNA codificando la proteína está presente en una muestra biológica, tipo de célula, tejido, órgano u organismo. Las "variantes de nucleótidos recombinantes" son polinucleótidos los cuales codifican una proteína. Pueden sintetizarse al hacer uso de la "redundancia" en el código genético. Varias substituciones de codones, tal como cambios silenciosos los cuales producen sitios de restricción específicos o mutaciones específicas de uso de codón , pueden introducirse para optimizar la clonación en un plásmido o vector viral o expresión en un sistema huésped procariótico o eucariótico particular, respectivamente.
Los "enlazadores" son secuencias de nucleótidos palindrómicas sintetizadas las cuales crean sitios de endonucleasa de restricción interna para facilitar la clonación del material genético de elección en varios vectores. Los "polienlazadores" son diseñados para incluir sitios de enzimas de restricción múltiples y proporcionan el uso de ambas de aquellas enzimas, las cuales dejan las proyecciones 5' y 3' tal como BamHI, EcoRI, Pstl, Kpnl y Hind I I I, o las cuales proporcionan una terminación directa tal como EcoRV, SnaBI y Stul . Los "elementos de control" o "secuencias reguladoras" son aquellas regiones no trasladadas del gene o DNA tal como intensificadores, promotores, intrones y regiones no trasladadas 3', las cuales interactúan con proteínas celulares para realizar la replicación, transcripción y traslación. Pueden ocurrir como secuencias de límite o incluso separar el gene. Funcionan en el nivel molecular y junto con los genes reguladores son muy importantes en los procesos de desarrollo, crecimiento, diferenciación y envejecimiento. Las moléculas "quiméricas" son polinucleótidos o polipéptidos los cuales son creados al combinar una o más de las secuencias de nucleótidos de esta invención (o sus partes) con secuencia(s) de ácidos nucleicos adicional(es). Tales secuencias combinadas pueden introducirse en un vector apropiado y expresado para dar aumento a un polipéptido quimérico, el cual puede esperarse que sea diferente de la molécula original en una o más de las siguientes características: ubicación celular, distribución, afinidades ligando-ligadura, afinidades intercadena, proporción de degradación/recambio, señalización, etc.
"Activa" se refiere a aquellas formas, fragmentos, o dominios de una secuencia de aminoácidos la cual exhibe la actividad inmunogénica y/o biológica característica del péptido que ocurre de manera natural. "PCN que ocurre de manera natural" se refiere a un polipéptido producido por células las cuales no han sido genéticamente diseñadas o las cuales han sido genéticamente diseñadas para producir la misma secuencia como se produce de manera natural. Están específicamente contemplados varios polipéptidos, los cuales surgen de modificaciones post-traslacionales. Tales modificaciones del polipéptido incluyen pero no están limitadas a acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. "Derivados" se refiere a esos polipéptidos los cuales han sido químicamente modificados mediante tales técnicas como ubiquitinación, marcado (ver antes), peguilación (derivación con polietilenglicol), e inserción química o substitución de aminoácidos tal como ornitina la cual no ocurre de manera normal en proteínas humanas. "Variante de polipéptido recombinante" se refiere a cualquier polipéptido el cual difiere de la PCN que ocurre de manera natural mediante inserciones, supresiones y/o substituciones de aminoácidos, creadas usando técnicas de DNA recombinante. La guía para determinar cuales residuos de aminoácidos pueden ser reemplazados, adicionados o suprimidos sin abolir las características de interés puede encontrarse al comparar la secuencia de PCN con aquélla de polipéptidos relacionados y minimizar el número de cambios de secuencia de aminoácidos hechos en las regiones altamente conservadas.
Las "substituciones" de aminoácidos son definidas como reemplazos de un aminoácido por otro. Son conservadoras en naturaleza cuando el aminoácido substituido tiene propiedades estructurales y/o químicas similares. Ejemplos de reemplazos conservadores son la substitución de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, o una treonina con una serina. Las "inserciones" o "supresiones" de aminoácidos son cambios a o dentro de una secuencia de aminoácidos. Típicamente caen en el rango de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida en una secuencia de aminoácidos particular puede determinarse experimentalmente al producir el péptido sintéticamente o al hacer sistemáticamente inserciones, supresiones o substituciones de nucleótidos en la secuencia de pcn usando técnicas de DNA recombinante. Una "secuencia líder o de señal" es una secuencia corta de aminoácidos la cual es o puede ser usada, cuando se desea, para dirigir el polipéptido a través de una membrana de una célula. Tal secuencia puede estar presente de manera natural en los polipéptidos de la presente invención o proporcionarse de fuentes heterólogas mediante técnicas de DNA recombinante. Un "oligopéptido" es un tramo corto de residuos de aminoácidos y pueden expresarse a partir de un oligonucleótido. Puede ser funcionalmente equivalente a y ya sea tener la misma longitud como o considerablemente más corto que un "fragmento", "porción", o "segmento" de un polipéptido. Tales secuencias comprenden un tramo de residuos de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 5 aminoácidos y frecuentemente alrededor de 17 o más aminoácidos, típicamente por lo menos aproximadamente 9 a 13 aminoácidos, y de suficiente longitud para exhibir actividad biológica y/o inmunogénica. Un "inhibidor" es una substancia la cual retarda o evita una respuesta o reacción química o fisiológica. Los inhibidores comunes incluyen pero no están limitados a moléculas de contrasentido, anticuerpos, antagonistas y sus derivados. Un "estándar" es una medición cuantitativa o cualitativa usada para comparación. De preferencia, se basa en un número estadísticamente apropiado de muestras y es creado para usarse como una base de comparación cuando se realizan ensayos diagnósticos, se corren pruebas clínicas, o se siguen perfiles de tratamiento del paciente. Las muestras de un estándar particular pueden ser normales o similarmente anormales. "Animal" como se usa en la presente puede definirse para incluir humanos, animales domésticos (gatos, perros, etc), agrícolas (vacas, caballos, borregos, cabras, pollos, peces, etc) o especies de prueba (ranas, ratones, ratas, conejos, simios, etc.). "Condiciones" incluye cánceres, desórdenes o enfermedades en las cuales la actividad de pcn puede estar implicada. Específicamente incluyen, pero no están limitadas a, anemia, arterioesclerosis, asma, bronquitis, enfisema, gingivitis, enfermedad inflamatoria del intestino, diabetes mellitus dependiente de insulina, leucemia, neoplasias endocrinas múltiples, osteoartritis, osteoporosis, fibrosis pulmonar, artritis reumatoide, síndromes de choque séptico, y lupus eritematoso sistemático.
Ya que la lista de términos técnicos y científicos no puede estar toda incluida, cualquier término sin definir deberá ser interpretado por tener el mismo significado como es entendido comúnmente por alguien de habilidad en la técnica a la cual pertenece esta invención. Además, las formas singulares "un" y "el" incluyen los plurales referentes a menos que el contexto lo dicte claramente de otra manera. Por ejemplo, la referencia a una "enzima de restricción" o una "enzima de alta fidelidad" puede incluir mezclas de tales enzimas y cualquier otra enzima que se ajuste al criterio declarado, o referencia al método incluye la referencia a uno o más métodos para obtener secuencias de cDNA, los cuales serán conocidos por aquéllos expertos en la técnica o se volverán conocidos para ellos sobre ia lectura de esta especificación. Antes de que las presentes secuencias, variantes, formulaciones y métodos para hacer y usar la invención sean descritas, se entenderá que la invención no estará limitada solo a las secuencias, variantes, formulaciones o métodos particulares descritos. Las secuencias, variantes, formulaciones y metodologías pueden variar, y la terminología , usada en la presente es para el fin de describir modalidades particulares. La terminología y definiciones no pretenden ser limitantes ya que el alcance de protección dependerá finalmente de las reivindicaciones.
Descripción de la invención La presente invención proporciona un polinucleótido purificado el cual codifica un novedoso homólogo de proteasa de cisteína, el cual es expresado en tejido o células humanas. La novedosa proteasa de cisteína (pcn; Clon Incyte 100877) se identificó primero entre los cDNAs de una genoteca de cDNA de glándula adrenal. Los residuos de aminoácidos que permiten que esta molécula sea caracterizada como una proteasa de cisteína son Q 8, CS2 y H150. El número de nucletótidos que separan los residuos Q y C en esta novedosa proteasa de cisteína es menor que el encontrado en otras proteasas de cisteína, tal como papaína. Además, la novedosa proteasa de cisteína es expresada en células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). La secuencia de pcn de longitud completa fue obtenida al secuenciar clones tanto de genotecas de cDNA de HUVEC y adrenal. Las moléculas más estrechamente relacionadas a esta proteasa de cisteína es la hemoglobinasa clonada de duela sanguínea, Schistosoma japonicum, Acceso GenBank X70967 (Merckelbach A et al (1994) Trop Med Parasitol 45: 193 198). La pcn de la presente solicitud bien puede ser hemoglobinasa humana aún cuando no se ha encontrado ya sea en genotecas de bazo o hígado, donde una hemobloginasa posiblemente estaría activa. Sin embargo, se encontró en numerosos tejidos en los cuales la defensa o limpieza sistemática ha sido activada y donde la hemoglobinasa o una PCN pudiera esperarse que actuara proteolíticamente para limpiar los contenidos de células de glóbulos rojos dañadas o moribundas. Las copias que se alinearon con alguna porción de la molécula fueron encontradas en otras genotecas de cDNA Incyte. Treinta y dos segmentos de cDNAs de diferentes Clones Incyte se muestran como una congregación que se traslapa en la Figura 1 . Veintitrés de estos Clones Incyte incluyendo cDNAs de genotecas de célula U937, célula TH P-1 , sinovio reumatoide, hueso medular, riñon, pulmón, adenoide inflamada,
* placenta e intestino delgado se presentan en el Listado de Secuencias. De hecho, pcn es bastante común en genotecas donde las funciones de tejido normal en, y el papel de la molécula, actividad proteolítica, parecerían 5 estar asociadas con limpieza y defensa sistemática. Las secuencias de nucleótidos purificadas, tal como pcn, tienen numerosas aplicaciones en técnicas conocidas por aquéllos expertos en la técnica de la biología molecular. Estas técnicas incluyen su uso como sondas de hibridación o PCR, para trazado de genes o cromosomas, en la
producción de ácidos nucleicos de sentido o contrasentido, para clasificar nuevas moléculas terapéuticas, etc. Estos ejemplos son bien conocidos y no pretenden ser limitantes. Adicionalmente, las secuencias de nucleótidos descritas en la presente pueden usarse en técnicas de biología molecular que todavía no han sido desarrolladas, ya que las nuevas
técnicas recaen en propiedades de secuencias de nucleótidos que son conocidas actualmente, incluyendo pero no limitando a tales propiedades
• como la terna de código genético e interacciones de pares de bases específicas. Como un resultado de la degeneración del código genético, una
multitud de secuencias de nucleótidos que codifican PCN pueden producirse y algunas de éstas sostendrán solo homología mínima con la secuencia endógena de cualquier secuencia de proteasa de cisteína que ocurre de manera natural y conocida. Esta invención ha completado específicamente cada una de las posibles variaciones de la secuencia de
nucleótidos que pudieran hacerse al seleccionar combinaciones basadas en elecciones de codones posibles. Estas combinanciones se hacen de acuerdo con la terna de código genético estándar como se aplica a la secuencia de nucleótidos de PCN que ocurre de manera natural y todas esas variaciones serán consideradas por ser descritas específicamente. Aunque la secuencia de nucleótidos pcn y sus derivados o variantes de preferencia son capaces de identificar la secuencia de nucleótidos de la PCN que ocurre de manera natural bajo condiciones optimizadas, puede ser conveniente producir secuencias de nucleótidos que codifican PCN poseyendo un uso de codón substancialmente diferente. Los codones pueden seleccionarse para aumentar la proporción a la cual la expresión del péptido ocurre en un huésped de expresión procariótico o eucariótico particular de acuerdo con la frecuencia con la cual los codones particulares son utilizados por el huésped. Otras razones para alterar substancialmente la secuencia de nucleótidos que codifican la PCN sin alterar la secuencia de aminoácidos codificada, incluyen la producción de copias de RNA teniendo más propiedades deseables, tal como vida media más larga, que las copias producidas a partir de la secuencia que ocurre de manera natural. Las secuencias de nucleótidos que codifican PCN pueden unirse a una variedad de otras secuencias de nucleótidos por medio de técnicas de DNA recombinantes bien establecidas (Sambrook J et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY; o Ausubel FM et al (1989) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Nueva York). Las secuencias útiles para unir a pcn incluyen un surtido de vectores de clonación tales como plásmidos, cósmidos, derivados de fagos lambda, fagomidos, y similares. Los vectores de interés incluyen vectores para replicación, expresión, generación de sondas, secuenciación, y similares. En general, los vectores de interés pueden contener un origen de replicación funcional en por lo menos un organismo, sitios sensibles de endonucleasa de restricción convenientes, y marcadores seleccionables para uno o más sistemas de células huésped. La PCR como es descrita en las patentes estadounidenses Nos. 4,683, 195; 4,800,195; y 4,965, 188, proporciona usos adicionales para oligonucléotidos basados sobre la secuencia de nucleótidos de pcn. Tales oligómeros generalmente se sintetizan químicamente, pero pueden ser de origen recombinante o una mezcla de ambos. Los oligómeros generalmente comprenden dos secuencias de nucleótidos, una con orientación de sentido (5'->3') y una con contrasentido (3' a 5') empleadas bajo condiciones optimizadas para la identificación de un gene específico o uso diagnóstico. Los mismos dos oligómeros, juegos anidados de oligómeros, o aún un depósito degradado de oligómeros pueden emplearse bajo condiciones menos severas para la identificación y/o cuantificación de secuencias de RNA o DNA estrechamente relacionadas. Genes de longitud completa pueden clonarse utilizando la secuencia de nucleótidos parcial y varios métodos conocidos en la técnica. Gobinda et al (1993; PCR Methods Applic 2:318-22) describen "PCR de sitio de restricción" como un método directo el cual usa iniciadores universales para recuperar secuencias desconocidas adyacentes a un lugar conocido. Primero, el DNA genómico es amplificado en la presencia del iniciador a enlazador y un iniciador específico para la región conocida. Las secuencias amplificadas son sometidas a una segunda ronda de PCR con el mismo iniciador enlazador y otro iniciador específico interno para el primero. Los productos de cada ronda de PCR son transcritos con una polimerasa de RNA apropiada y secuenciados usando una transcriptasa inversa. Gobinda et al presentan datos concernientes al Factor IX para el cual identificaron un tramo conservado de 20 nucleótidos en la región no codificadora 3' del gene. La PCR inversa es el primer método para reportar adquisición exitosa de secuencias desconocidas empezando con iniciadores basados en una región conocida (Triglia T et al (1988) Nucleic Acids Res 16:8186). El método usa varias enzimas de restricción para generar un fragmento adecuado en la región conocida de un gene. El fragmento se hace circular entonces mediante ligación intramolecular y es usado como una plantilla de PCR. Iniciadores divergentes son diseñados a partir de la región conocida. Las múltiples rondas de ligaciones y digestiones de enzima de restricción que son necesarias antes de PCR, hacen que el procedimiento sea lento y costoso (Gobinda et al, supra). La PCR de captura (lagerstrom M et al (1991 ) PCR Method Applic 1 : 1 1 1 -19) es un método para la amplificación de PCR de fragmentos de DNA adyacentes a una secuencia conocida en humanos y DNA de YAC. Como se notó por Gobinda et al (supra), PCR de captura también requiere ligaciones y digestiones de enzimas de restricción múltiples para colocar una secuencia de doble filamento diseñada en una porción desconocida de la molécula de DNA antes de PCR. Aunque las reacciones de restricción y ligación son realizadas simultáneamente, los requerimientos para extensión, inmovilización y dos rondas de PCR y purificación antes de la secuenciación hacen al método molesto y tardado. Parker JD et al (1991 ; Nucleic Acids Res 19:3055-60), muestran PCR ambulante, un método para un gene objetivo ambulante, el cual permite la recuperación de la secuencia desconocida. En esta misma vena, PromoterFinderMR un nuevo conjunto disponible de Clontech (Palo alto CA) usa PCR e iniciadores derivados de p53 para entrar en DNA genómico. Los iniciadores anidados y genotecas de PromoterFinder especiales son usadas para detectar secuencias corriente arriba tal como promotores y elementos reguladores. Este proceso evita la necesidad de clasificar las genotecas y es útil para encontrar uniones intrón/exón . Otro nuevo método de PCR, "Improved Method for Obtaining Full Length cDNA Sequences" por Guegler et al, Solicitud de Patente Serial No. 08/487, 1 12, presentada el 7 de junio de 1995 e incorporada en la presente por referencia, emplea XL-PCRMR (Perkin-Elmer, Foster City CA) para amplificar y extender la secuencia de nucleótidos parcial en piezas más largas de DNA. Este método fue desarrollado para permitir a un solo investigador procesar múltiples genes (hasta 20 o más) al mismo tiempo y obtener una secuencia extendida (posiblemente de longitud completa) dentro de 6-10 días. Este nuevo método reemplaza métodos, los cuales usan sondas marcadas para clasificar genotecas de plásmidos y permitir a un investigador procesar solo aproximadamente 3-5 genes en 14-40 días. En el primer paso, el cual puede realizarse en aproximadamente dos días, cualquiera de dos de una pluralidad de iniciadores son diseñados y sintetizados basados en una secuencia parcial conocida. En el paso 2, el cual toma aproximadamente seis a ocho horas, la secuencia es extendida mediante amplificación por PCR de una genoteca seleccionada. Los pasos 3 y 4, los cuales toman aproximadamente un día, son purificación del cDNA amplificado y su ligación en un vector apropiado. El paso 5, el cual toma aproximadamente un día, involucra la transformación y crecimiento de la bacteria huésped. En el paso 6, el cual toma aproximadamente cinco horas, PCR es usada para clasificar clones bacterianos para la secuencia extendida. Los pasos finales, los cuales toman aproximadamente un día, involucran la preparación y secuenciación de los clones seleccionados. Si el cDNA de longitud completa no ha sido obtenido, el procedimiento completo es repetido usando ya sea la genoteca original o alguna genoteca preferida diferente. La genoteca preferida puede ser una que ha sido seleccionada por tamaño para incluir solo cDNAs mayores o puede consistir de genotecas disponibles comercialmente simples o combinadas, por ejemplo, pulmón, hígado, corazón, y cerebro de Gibco/BRL (Gaithersburg MD). La genoteca de cDNA puede haber sido preparada con iniciadores oligo d(T) o aleatorios. Las genotecas de iniciadoras aleatorias son preferidas porque contendrán más secuencias las cuales contienen terminaciones 5' de genes. Una genoteca iniciada aleatoriamente puede ser particularmente útil si una genoteca oligo d(T) no produce un gene completo. Se debe notar que mientras más grande y más compleja sea la proteína, es menos probable que el gene completo sea encontrado en un plásmido simple.
Un nuevo método para analizar ya sea el tamaño o la secuencia de nucleótidos de productos de PCR es la electroforesis capilar. Los sistemas para secuenciación rápida están disponibles de Perkin Elmer (Foster City CA), Beckman Instruments (Fullerton CA), y otras compañías. La secuenciación capilar emplea polímeros capaces de fluir para separación electroforética, cuatro colorantes fluorescentes diferentes (uno para cada nucleótido), los cuales son activados por láser, y detección de longitudes de onda emitidas mediante una cámara de dispositivo acoplado de carga. La salida/intensidad de luz es convertida a señal eléctrica usando el programa de computadora apropiado (por ejemplo GenotyperMR y Sequence NavigatorMR de Perkin Elmer) y el proceso completo desde la carga de muestras hasta el análisis de computadora y exhibición de datos electrónicos es controlado por computadora. La electroforesis capilar proporciona mayor resolución y es mucho más rápida que los procedimientos basados en geles estándares. Es particularmente adecuado para la secuenciación de pequeñas piezas de DNA, las cuales pudieran estar presentes en cantidades limitadas en una muestra particular. La secuenciación reproducible de hasta 350 bp (pares de bases) de DNA de fago M13 en 30 min ha sido reportado (Ruiz-Martinez MC et al (1993) Anal Chem 65:2851 -8). Otro aspecto de la invención en cuestión es proporcionar sondas de hibridación de pcn las cuales sean capaces de hibridar con secuencias de nucleótidos que ocurren de manera natural codificando PCN . La severidad de las condiciones de hibridación determinarán si la sonda identifica solo la secuencia de nucleótidos naturales de pcn o secuencias de otras moléculas de proteasa de cisteína estrechamente relacionadas. Si secuencias de nucleótidos de pcn degeneradas de la invención en cuestión son usadas para la detección de secuencias codificadoras de proteasa de cisteína relacionadas, de preferencia deberían contener por lo menos 50% de los nucleótidos de las secuencias presentadas en la presente. Las sondas de hibridación de la invención en cuestión pueden derivarse de las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 y 5-24 o de las secuencias genómicas del medio comprendiendo regiones sin trasladar tal como promotores, intensificadores e intrones. Tales sondas de hibridación pueden marcarse con moléculas reportadoras apropiadas. Los medios para producir sondas de hibridación específicas para proteasas de cisteína incluyen oligomarcado, traslación de corte, marcado terminal o amplificación de PCR usando un nucleótido marcado. De manera alternativa, la secuencia de cDNA puede clonarse en un vector para la producción de una sonda de mRNA. Tales vectores son conocidos en la técnica, están comercialmente disponibles, y pueden usarse para sintetizar sondas de RNA in vitro mediante adición de una polimerasa de RNA apropiada tal como T7, T3 o SP6 y nucléotidos marcados. Un número de compañías (tal como Pharmacia Biotec, Piscataway NJ ; Promega, Madison Wl; US Biochemical Corp, Cleveland, OH ; etc.) suministran conjuntos comerciales y protocolos para estos procedimientos. También es posible producir una secuencia de DNA, o porciones de la misma, enteramente mediante química sintética. Algunas veces, la fuente de información para producir esta secuencia viene de la secuencia homologa conocida a partir de los organismos estrechamente relacionados.
Después de la síntesis, la secuencia de ácido nucleico puede usarse sola o unida con una secuencia pre-existente e insertada en uno de los muchos vectores de DNA disponibles y sus respectivas células huésped, usando técnicas bien conocidas en la técnica. Más aún, la química sintética puede usarse para introducir mutaciones específicas en la secuencia de nucleótidos. De manera alternativa, una porción de secuencia en la cual una mutación es deseada puede sintetizarse y recombinarse con una porción de una secuencia recombinante o genómica existente. Las secuencias de nucleótidos de pcn pueden usarse individualmente en una prueba o ensayo diagnóstico para detectar procesos de enfermedad o desorden asociados con niveles anormales de expresión de pcn. La secuencia de nucleótidos es adicionada a una muestra (fluido, célula o tejido) de un paciente bajo condiciones de hibridación. Después de un periodo de incubación, la muestra es lavada con un fluido compatible, el cual contiene opcionalmente una molécula reportadora la cual ligará el nucleótido específico. Después de que el fluido compatible es enjuagado, la molécula reportadora es cuantificada y comparada con un estándar para ese fluido, célula o tejido. Si la expresión de pcn es significativamente diferente del estándar, el ensayo indica la presencia del desorden o enfermedad. La forma de tales métodos cualitativos o cuantitativos puede incluir análisis northern, dot blot u otras tecnologías basadas en membrana, tecnologías "dip stick", gancho u hojuela, PCR, ELISAs u otras tecnologías de formato de muestras múltiples.
~ Este mismo ensayo, combinando una muestra con la secuencia de nucleótidos, es aplicable para evaluar la eficiencia de un régimen de tratamiento terapéutico particular. Puede usarse en estudios en animales, en pruebas clínicas, o para verificar el tratamiento de un paciente 5 individual. Primero, la expresión estándar debe establecerse para usarse como una base de comparación. Segundo, las muestras de los animales o pacientes afectados por un desorden o enfermedad son combinadas con la secuencia de nucleótidos para evaluar la desviación del perfil normal o estándar. Tercero, un agente terapéutico existente es administrado, y un
, perfil de tratamiento es generado. Este ensayo es evaluado para determinar si el perfil progresa hacia ó regresa al patrón estándar. Perfiles de tratamiento sucesivos pueden usarse para mostrar la eficiencia del tratamiento sobre un periodo de varios días o varios meses. La secuencia de nucleótidos para pcn también puede usarse para
generar sondas para trazar la secuencia genómica natural. La secuencia puede trazarse para un cromosoma particular o para una región específica del cromosoma usando técnicas bien conocidas. Estas incluyen hibridación in situ para extensiones cromosomales (Verma et al (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press,
Nueva York), preparaciones cromosomales de tipo de flujo, o construcciones de cromosomas artificiales tales como construcciones de cromosomas artificiales de levadura (YACs), cromosomas artificiales bacterianos (BACs), P1 bacterianas o genotecas de cDNA de cromosoma simple.
"? i La hibridación in situ de preparaciones cromosomales y técnicas de trazado físico tal como análisis de enlaces usando marcadores cromosomales establecidos son invaluables para extender mapas genéticos. Ejemplos de mapas genéticos pueden encontrarse en Science 5 (1994; 265: 1981f). Frecuentemente la colocación de un gene en el cromosoma de otra especie mamífera puede revelar marcadores asociados aún si el número o brazo de un cromosoma humano particular no es conocido. Nuevas secuencias pueden asignarse a brazos cromosomales, o partes de los mismos, mediante trazado físico. Esto proporciona
información valiosa a investigadores buscando genes de enfermedades usando clonación de posición u otra técnica de descubrimiento de gene. Una vez que una enfermedad o síndrome, tal como ataxia telangiectasia (AT) ha sido ubicada crudamente mediante enlace genético a una región genómica particular, por ejemplo, AT a 1 1 q22-23 (Gatti et al (1988) Nature
336:577-580), cualquier secuencia trazando a esa área puede representar genes asociados o reguladores para investigación adicional. La secuencia de nucleótidos de la presente invención también puede usarse para detectar diferencias en la ubicación cromosomal debido a la trasiocación, inversión, etc. entre individuos normales y portadores o afectados. 20 La secuencia de nucleótidos codificando PCN puede usarse para producir una secuencia de aminoácidos usando métodos bien conocidos de tecnología recombinante de DNA. Goeddel (1990, Gene Expression Technology. Methods and Enzymology, Vol 185, Academic Press, San Diego CA) es una entre muchas publicaciones las cuales muestran la
expresión de una secuencia de nucleótidos purificada, aislada. El "jÉB1 aminoácido o péptido puede expresarse en una variedad de células huésped, ya sea procariótica o eucariótica. Las células huésped pueden ser desde la misma especie de la cual se derivó la secuencia de nucleótidos o de una especie diferente. Ventajas de producir una 5 secuencia de aminoácidos o péptido mediante tecnología de DNA recombinante incluyen obtener cantidades adecuadas para la purificación y la disponibilidad de procedimientos de purificación simplificados. Las células transformadas con secuencia de nucleótidos de pcn
*§tp pueden cultivarse bajo condiciones adecuadas para la expresión y
recuperación de péptido del cultivo de la célula. El péptido producido mediante una célula recombinante puede secretarse o puede contenerse intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o el vector usado. En general, es más conveniente preparar proteínas recombinantes en forma secretada, y esto se puede lograr al ligar pcn a una secuencia de
nucleótidos recombinante, la cual dirige su movimiento a través de una membrana celular procariótica o eucariótica particular. Otras mtr- construcciones recombinantes pueden unir pcn a la secuencia de nucleótidos codificando un dominio de polipéptido, el cual facilitará la purificación de proteína (Kroll DJ et al (1993) DNA Cell Biol 12:441 -53) . 20 La síntesis de péptido directa usando técnicas de fase sólida
(Stewart et al (1969) Solid-Phase Peptide Svnthesis, WH Freeman Co, San
Francisco CA; Merrifield J (1963) J Am Chem Soc 85:2149-2154) es una alternativa para producción de péptido recombinante o quimérico. La síntesis automatizada puede lograrse, por ejemplo, usando el Sintetizador
de Péptidos de Applied Biosystems 431A de acuerdo con las instrucciones -Étf proporcionadas por el fabricante. Adicionalmente, PCN o cualquier parte de la misma puede someterse a mutación durante la síntesis directa y combinarse usando métodos químicos con otras secuencias de proteasa de cisteína o cualquier parte de las mismas. 5 Aunque una secuencia de aminoácidos u oligopéptido usado para inducción de anticuerpos no requiere actividad biológica, debe ser inmunogénico. La PCN usada para inducir anticuerpos específicos puede tener una secuencia de aminoácidos consistiendo de por lo menos cinco aminoácidos y de preferencia por lo menos 10 aminoácidos. Tramos
cortos de secuencia de aminoácidos pueden fusionarse con aquéllos de otra proteína tal como hemocianina de lapa de bocallave, y el péptido quimérico usado para la producción de anticuerpo. De manera alternativa, el péptido puede ser de suficiente longitud para contener un dominio entero. 15 Los anticuerpos específicos para PCN pueden producirse mediante inoculación de un animal apropiado con un fragmento antigénico del péptido. Un anticuerpo es específico para PCN si es producido contra un epitope del polipéptido y se liga a por lo menos parte de la proteína natural o recombinante. La producción de anticuerpos incluye no solo la
estimulación de una respuesta inmune mediante inyección en animales, sino también procesos análogos tal como la producción de anticuerpos sintéticos, la clasificación de genotecas de inmunoglobulinas recombinantes para moléculas de ligadura específica (Orlandi R et al (1989) PNAS 86:3833-3837, o Huse WD et al (1989) Science 256: 1275- 25 1281 ), o la estimulación in vitro de poblaciones de linfocitos. La tecnología actual (Winter G y Milstein C (1991 ) Nature 349:293-299) proporciona un número de reactivos de ligadura altamente específica basados en los principios de formación de anticuerpos. Estas técnicas pueden adaptarse para producir moléculas las cuales ligan específicamente PCN. Los anticuerpos u otras moléculas apropiadas generadas contra un oligopéptido o fragmento de péptido inmunogénico específico pueden usarse en análisis Western, ensayos inmunoabsorbentes enlazados a enzimas (ELISA) o pruebas similares para establecer la presencia de o para cuantificar cantidades de PCN activa en tejidos o células normales, enfermas o terapéuticamente tratadas. Los ejemplos a continuación son proporcionados para ilustrar la invención en cuestión. Estos ejemplos se proporcionan a manera de ilustración y no están incluidos para el fin de limitar la invención.
APLICABILIDAD INDUSTRIAL
I Construcción de genoteca de cDNA de glándula adreanal Aunque tanto las genotecas de cDNa de células endoteliales de vena umbilical humana y de glándula adrenal fueron empleadas para clonar el gene de longitud completa, para fines del ejemplo, la construcción de genoteca de cDNA de glándula adrenal será descrita. La genoteca de cDNA de glándula adrenal fue construida desde una muestra depositada de cinco, glándulas adrenales normales, completas de hembras y machos caucásicos que variaban en edad desde 10 hasta 46 años. El poli A+RNA fue obtenido de Clontech Laboratoires Inc (Catalogue #6571 -2; Palo Alto CA).
Stratagene (La Jolla CA) hizo la genoteca de cDNA usando este poli A+RNA. La síntesis de cDNA se inició usando tanto hexámeros aleatorios como oligo d(T), y las dos genotecas de cDNA fueron tratadas por separado. Los oligonucleótidos de adaptador sintéticos fueron ligados 5 sobre los extremos de los cDNAs permitiendo su inserción en el sistema de vector Uni-ZAP R (Stratagene). Los clones de cDNA de fagomido pBluescript R (Stratagene) fueron obtenidos mediante el proceso de excisión in vivo, y los fagomidos de las ßr dos genotecas de cDNA fueron combinados en una genoteca simple al
mezclar números iguales de bacteriófagos. Los últimos fueron usados para transformar la especie de huésped de E. coli XL1 -BlueMR
(Stratagene). Enzimas tanto de pBluescript como de un fago ayudante f1 cotransformado cortaron el DNA, iniciaron una nueva síntesis de DNA, y crearon las moléculas de DNA de fagomido circulares de filamento simple,
más pequeñas, las cuales contenían la inserción de cDNA. El DNA de fagomido fue liberado, purificado y usado para reinfectar células huésped
# frescas (SOLRMR, Stratagene). La presencia del gene de ß-lactamasa en el fagomido permitió que las bacterias transformadas crecieran en medio conteniendo ampicilina. 20 II Aislamiento de Clones de cDNA Los DNAs de fagomido conteniendo la inserción de cDNA pueden purificarse usando el sistema de purificación de plásmidos QIAWELL-8MR de QIAGEN (Chatsworth CA). Este método de alto rendimiento aisla DNA
de fagomido altamente purificado de células bacterianas usadas usando partículas de resina de intercambio aniónico QUIAGEN y tecnología de membrana EMPOREMR de 3M (Minneapolis MN) en un formato de multicavidades. El DNA fue extraído y preparado para secuenciación de DNA y otras manipulaciones analíticas.
III Secuenciación de Clones de cDNA Las inserciones de cDNA de aislamientos aleatorios de la genoteca de glándula adrenal fueron secuenciados en parte. Los métodos para secuenciación de DNA son bien conocidos en la técnica y emplean tales enzimas como el fragmento Klenow de la polimerasa I de DNA, SEQU ENASE® (US Biochemical Corp) o polimerasa Taq. Los métodos para extender el DNA de un iniciador de oligonucléotidos templado a la plantilla de DNA de interés han sido desarrollados tanto para plantillas de filamento simple como de filamento doble. Los productos de reacción de terminación de cadena fueron separados usando electroforesis y fueron detectados vía sus precursores marcados, incorporados. Las recientes mejoras en la preparación de reacción mecanizada, secuenciación y análisis han permitido la expansión en el número de secuencias que pueden ser determinadas por día. De preferencia, el proceso es automatizado con máquinas tales como los secuenciadores de DNA 373 y Applied Biosystems Catalyst 800. La calidad de cualquier genoteca de cDNA particular puede determinarse al realizar un análisis de escala piloto de los cDNAs y al verificar porcentajes de clones conteniendo DNA de E. coli, lambda o vector, DNA repetitivo o mitocondrial, y clones con copias exactas u homologas a las bases de datos públicas. El número de secuencias únicas, aquéllas que no tienen copia conocida en ninguna base de datos disponible, son registradas entonces.
IV Buscando homología de clones de cDNA y sus proteínas deducidas Cada secuencia obtenida de esa manera fue comparada con secuencias el GenBank usando un algoritmo de búsqueda desarrollado por
~4p> Applied Biosystems e incorporadas al Sistema de Análisis de Secuencia
I NHERITMR 670. En este algoritmo, se usó Pattern Specification Language
(Lenguaje de Especificación de Patrón) (TRW Inc, Los Angeles CA) para determinar las regiones de homología. Los tres parámetros que determinan como corren las comparaciones de las secuencias fueron tamaño de ventana, equivalente de ventana y tolerancia de error. Usando
una combinación de estos tres parámetros, la base de datos de DNA fue buscada para secuencias conteniendo regiones de homología con la
W secuencia en cuestión, y las secuencias apropiadas fueron registradas con un valor inicial. Subsecuentemente, estas regiones homologas fueron examinadas usando gráficas de homología de matriz de puntos para
distinguir las regiones de homología de equivalentes casuales. Los alineamientos de Smith-Waterman fueron usados para exhibir los resultados de la búsqueda de homología. Las homologías de secuencias de proteínas y péptidos fueron indagadas usando el Sistema de Análisis de Secuencia INHERITMR 670 en
una manera similar a la usada en homologías de secuencias de DNA. Ei Pattern Specification Language y ventanas de parámetros fueron usados para buscar bases de datos de proteínas para secuencias conteniendo regiones de homología, las cuales fueron registradas con un valor inicial. Gráficas de homología de matriz de puntos fueron examinadas para distinguir las regiones de homología importante de los equivalentes casuales. De manera alternativa, BLAST, que significa Basic Local Alignment Search Tool (Herramienta de Búsqueda de Alineamiento Local Básico), es usado para buscar alineamientos de secuencias locales (Altschul SF (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, SF et al (1990) J Mol Biol 215:403-10). BLAST produce alineamientos tanto de secuencias de nucieótidos como de aminoácidos para determinar la similitud de secuencia. Debido a la naturaleza local de los alineamientos, BLAST es especialmente útil para determinar los equivalentes exactos o para identificar homólogos. Mientras que es útil para equivalentes los cuales no contengan aberturas, es inapropiado para realizar búsqueda de estilo motivo. La unidad fundamental de la salida del algoritmo BLAST es el High-scoring Segment Pair (HSP) (Par de Segmento de Alto Registro). Un HSP consiste de dos fragmentos de secuencias de longitudes arbitrarias pero iguales, cuyo alineamiento es localmente máximo y para el cual el registro de alineamiento cumple o excede un registro de corte o umbral establecido por el usuario. La aproximación de BLAST es para buscar HSPs entre una secuencia en cuestión y una secuencia de base de datos, para evaluar la importancia estadística de cualquier equivalente encontrado, y para reportar solo aquellos equivalentes los cuales satisfacen el umbral de importancia seleccionado por el usuario. El parámetro E establece el umbral estadísticamente significativo para reportar equivalentes de secuencia de base de datos. E es interpretado como el límite superior de la frecuencia esperada de la ocurrencia casual de un HSP (o conjunto de HSPs) dentro del contexto de la búsqueda de base de datos completa. Cualquier secuencia de base de datos cuyo equivalente satisface E es reportado en la salida del programa. Todas las moléculas de pcn parciales presentadas y reclamadas en esta solicitud— Clon Incyte 1098 (SEQ ID NO 3) de la genoteca U937 (una línea de célula de linfoma histiocítico), clone Incyte 75848 (SEQ ID NO 5) de la genoteca TH P-1 (una línea de célula de monocito de leucemia), Clones Incyte 77015 (SEQ ID NO 6), 77424 (SEQ ID NO 7), 77645 (SEQ I D NO 8), 77651 (SEQ ID NO 9), y 78547 (SEQ ID NO 10) de la genoteca de sinovio reumatoide, Clon Incyte 104286 (SEQ ID NO 1 1 ) de la genoteca de hueso medular, Clone Incyte 1 15565 (SEQ ID NO 12) de la genoteca de riñon, Clones Incyte 125569 (SEQ ID NO 13) y 125830 (SEQ ID NO 14) de la genoteca de pulmón, Clones Incyte 158868 (SEQ ID NO 15) y 162199 (SEQ ID NO 16) de la genoteca de adenoide inflamada, Clones Incyte 172449 (SEQ ID NO 17) y 174690 (SEQ ID NO 18) de la genoteca de hueso medular, Clones Incyte 180594 (SEQ ID NO 1 9) y 180935 (SEQ I D NO 20) de la genoteca de placenta, Clone Incyte 1 90299 (SEQ I D NO 21 ) de la genoteca de sinovio reumatoide, Clones Incyte 195541 (SEQ ID NO 22) y 197617 (SEQ I D NO 23) de la genoteca de riñon, e Clone Incyte 238970 (SE ID NO 24) de la genoteca de intestino delgado - fueron identificados usando los criterios anteriores. Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de longitud completa para esta novedosa cisteína humana se muestran en la Fig. 2. La Fig 3 muestra el alineamiento entre la secuencia de aminoácidos trasladados para pcn y la proteasa de cisteína estrechamente relacionada, hemoglobinasa de Schistosoma japonicum (Acceso GenBank X70967; Merckelbach A et al (1994) Trop Med Parasitol 45: 193 198). Como se describió previamente, la Fig 4 muestra varios parámetros (hidrofilicidad, etc) de la enzima.
V Extensión de cDNAs a longitud completa Los clones Incyte presentados aquí pueden ser y fueron usados para diseñar iniciadores de oligonucleótidos para extensión de los cDNAs a longitud completa. Los iniciadores son diseñados basados en la secuencia conocida; un iniciador es sintetizado para empezar la extensión en la dirección de contrasentido (XLR) y el otro para extender la secuencia en la dirección de sentido (XLF). Los iniciadores permiten que la secuencia se extienda "hacia fuera" generando "amplicones" conteniendo nueva secuencia de nucleótidos desconocida para el gene de interés. Los iniciadores pueden ser diseñados usando Oligo 4.0 (National Biosciences Inc, Plymouth MN), u otro programa apropiado, para ser 22-30 nucleótidos en longitud, para tener un contenido GC de 50% o más, y para templar a la secuencia objetivo a temperaturas aproximadamente de 68°-72°C. Cualquier tramo de nucleótidos el cual resultaría en estructuras de horquilla y dimerizaciones iniciador-iniciador fue evitada. La genoteca de cDNA adrenal fue usada con iniciadores XLR = GGT GAA TGA ACT GGT AGG CAT GG y XLF = AAT CCC ACT CCA GGA ATT ~É GTG ATC para extender y amplificar el Clon Incyte 100877. Usando un segundo conjunto de iniciadores, XLR = ACC CAG ACT CAC AGG CTT
CAÁ TG y XLF = GGG GAC TGG TAC AGC GTC AAC TG y la genoteca de cDNA de HUVEC, el Clon Incyte 66931 fue extendido para obtener la 5 porción remanente de la secuencia de proteasa de cisteína. Al seguir las instrucciones para el conjunto XL-PCR y mezclando vigorosamente la mezcla de reacción y enzima, la amplificación de alta fidelidad es obtenida. Empezando con 40 pmol de cada iniciador y las
"HP concentraciones recomendadas de todos los demás componentes del
conjunto, se realiza PCR usando el Peltier Thermal Cycler (Formador de
Ciclos Térmicos Peltier) (PTC200; MJ Research, Watertown MA) y los siguientes parámetros: Paso 1 94°C durante 1 min (desnaturalización inicial) Paso 2 65°C durante 1 min 15 Paso 3 68°C durante 6 min Paso 4 94°C durante 15 seg * Paso 5 65°C durante 1 min Paso 6 68°C durante 7 min Paso 7 Repetir pasos 4-6 por 15 ciclos adicionales 20 Paso 8 94°C durante 15 seg Paso 9 65°C durante 1 min Paso 10 68°C durante 7: 15 min Paso 11 Repetir los pasos 8-10 por 12 ciclos Paso 12 72°C durante 8 min 25 Paso 13 4°C (y mantenimiento) 'é Una alícuota de 5-10 µl de la mezcla de reacción es analizada mediante electroforesis en una baja concentración (aproximadamente 0.6- 0.8%) de mini-gel de agarosa para determinar cuales reacciones fueron exitosas para extender la secuencia. Aunque todas las extensiones 5 contienen potencialmente un gene de longitud completa, algunos de los productos o bandas mayores son seleccionados y cortados del gel. La purificación adicional involucra usar un método de extracción de gel comercial tal como QIAQuick R (QIAGEN Inc). Después de la recuperación del DNA, la enzima Klenow es usada para arreglar las proyecciones de
nucleótidos de filamento simple, creando extremos directos los cuales facilitan la religación y clonación. Después de la precipitación con etanol, los productos se vuelven a disolver en 13 µl de amortiguador de ligación. Entonces, 1 µl de ligasa T4- DNA (15 unidades) y 1 µl de cinasa de polinucleótido T4 son adicionados,
y la mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 2-3 horas o durante la noche a 16°C. Las células de E. coli competentes (en 40 µl de medio
# apropiado) son transformadas con 3 µl de mezcla de ligación y cultivadas en 80 µl de medio SOC (Sambrook J et al, supra). Después de la incubación durante una hora a 37°C, la mezcla de transformación completa
es platinada en agar Luria Bertani (LB) (Sambrook J et al, supra) conteniendo 2x Carb. El siguiente día, 12 colonias son tomadas al azar de cada placa y cultivadas en 150 µl de medio líquido LB/2x Carb colocado en una cavidad individual de una placa de microtítulo de 96 cavidades estéril, comercialmente disponible, apropiada. El siguiente día, 5 µl de cada
cultivo durante la noche son transferidos a una placa de 96 cavidades no estéril y después de la dilución 1 : 10 con agua, 5 µl de cada muestra son ™*- transferidos a un arreglo de PCR. Para la amplificación de PCR, 18 µl de mezcla de reacción PCR concentrada (3.3x) conteniendo 4 unidades de polimerasa rTth DNA, un 5 iniciador de vector y uno o ambos de los iniciadores específicos de gene usados para la reacción de extensión son adicionados a cada cavidad. La amplificación es realizada usando las siguientes condiciones: Paso 1 94°C durante 60 seg Paso 2 94°C durante 20 seg 10 Paso 3 55°C durante 30 seg Paso 4 72°C durante 90 seg Paso 5 Repetir pasos 2-4 por 29 ciclos adicionales Paso 6 72°C durante 180 seg Paso 7 4°C (y mantenimiento) 15 Las alícuotas de las reacciones de PCR se corren en geles de agarosa junto con marcadores de peso molecular. Los tamaños de los productos de PCR se comparan con los cDNAs parciales originales, y los clones apropiados son seleccionados, ligados a plásmido y secuenciados.
VI Ensayo de diagnóstico usando oligómeros específicos de PCN En aquellos casos donde se espera que una condición específica
(ver las definiciones supra) involucre cantidades alteradas de pcn, los oligómeros pueden ser diseñados para establecer la presencia y/o cantidad de mRNA expresado en una muestra biológica. Existen varios métodos
actualmente usados para cuantificar la expresión de una molecular particular. La mayoría de estos métodos usa nucleótidos radiomarcados (Melby PC et al 1993 J Immunol Methods 159:235-44) o biotinilados (Duplaa C et al 1993 Anal Biochem 229-36), coamplificación de un ácido nucleico de control, y curvas estándares sobre las cuales los resultados experimentales son interpolados. La cuantificación puede acelerarse al correr el ensayo en un formato ELISA, donde el oligómero de interés es presentado en varias diluciones y una respuesta colorimétrica da una cuantificación rápida. Por ejemplo, la deficiencia de PCN puede resultar en una abundancia de las moléculas "interleukin" proinflamatorias, mucha hinchazón e incomodidad. En una manera similar, la sobre-expresión puede causar apoptosis y mayor daño de tejido. En cualquier caso, un diagnóstico rápido puede permitir que profesionales de la salud traten la condición y prevengan el empeoramiento de la condición. Este mismo ensayo puede usarse para verificar el progreso del paciente conforme su situación fisiológica se mueva hacia el rango normal durante la terapia.
Vil Moléculas de sentido o contrasentido El conocimiento de la secuencia de cDNA correcta de esta proteasa de cisteína novedosa o sus elementos reguladores permiten su uso como una herramienta en tecnologías de sentido (Youssoufian H y HF Lodish (1993) Mol Cell Biol 13:98-104) o contrasentido (Eguchi et al (1991 ) Annu Rev Biochem 60:631 -652), para la investigación o alteración de la expresión de genes. Para inhibir la expresión de pcn in vivo o in vitro, un oligonucleótido basado en la secuencia de codificación de un fragmento de una pcn diseñada usando Oligo 4.0 (National Biosciences Inc) puede ser b usada. De manera alternativa, un fragmento de una pcn producida al digerir la secuencia de codificación de pcn con enzimas de restricción seleccionadas para digerir la pcn en sitios de restricción específicos usando el programa de computadora de Análisis Inherit (Applied 5 Biosystems) puede usarse para inhibir la expresión de pcn. Adicionalmente, las moléculas de contrasentido pueden ser diseñadas para inhibir la ligadura del promotor en el líder no trasladado corriente arriba o en varios sitios a lo largo de la región de codificación de pcn. De manera tß^ alternativa, las moléculas de contrasentido pueden diseñarse para inhibir
la traslación de un mRNA en polipéptido al preparar un oligómero o fragmento, el cual se ligará en la región extendida aproximadamente de - 10 a +10 nucleótidos en el extremo 5' de la secuencia de codificación. Estas tecnologías son ahora bien conocidas en la técnica. Además de usar fragmentos construidos para interrumpir la
transcripción del marco de lectura abierto, las modificaciones de la expresión de genes pueden obtenerse al diseñar secuencias de
# contrasentido para intensificadores, intrones o incluso para genes reguladores trans-actores. De manera similar, la inhibición puede lograrse usando metodología de formación de pares de bases de Hogeboom,
también conocida como formación de pares de bases de "triple hélice". La formación de pares de triple hélice compromete la capacidad de la doble hélice para abrirse suficientemente para la ligadura de polimerasas, factores de transcripción o moléculas reguladoras. Cualquiera de estos tipos de moléculas de contrasentido pueden
colocarse en vectores de expresión y usarse para transformar células o tejidos preferidos. Esto puede incluir la introducción del vector de
* expresión en una cavidad sinovial para terapia de plazo corto o transiente. La expresión de la secuencia de contrasentido continuaría inundando la célula con moléculas inhibidoras hasta que todas las copias del vector 5 fueran incapacitadas mediante nucleasas endógenas. Tal expresión transiente puede durar durante un mes o más con un vector no replicador y tres meses o más si se usan los elementos de replicación apropiados en la transformación o sistema de expresión. La transformación estable de células divisoras apropiadas con un
# 10 vector conteniendo la molécula de contrasentido puede producir una línea de célula transgénica, tejido u organismo (ver, por ejemplo, Trends en Biotechnol 1 1 : 155-215 (1993) y la patente estadounidense no. 4,736,866, 12 de abril de 1988). Aquellas células las cuales asimilan o replican suficientes copias del vector para permitir la integración estable, también
producirán suficientes moléculas de contrasentido para comprometer o eliminar completamente la actividad normal de la pcn. Frecuentemente, la
# función de una pcn puede ser indagada al observar comportamiento tales como letalidad, pérdida de una ruta fisiológica, cambios en morfología, etc, a nivel celular de tejido o de organismo. 20 VIII Expresión de PCN La expresión de la PCN puede lograrse al sub-clonar los cDNAs en vectores apropiados y transfectar los vectores en células huésped. En este caso, el vector de clonación previamente usado para la generación de
la genoteca de tejido también proporciona expresión directa de ia secuencia de pcn en E. coli. Corriente arriba del sitio de clonación, este vector contiene un promotor para ß-galactosidasa, seguido por la secuencia que contiene la Met amino-terminal y los 7 residuos subsecuentes de ß-galactosidasa. Inmediatamente siguiendo estos ochos residuos está un promotor bacteriófago útil para la transcripción y un enlazador conteniendo un número de sitios de restricción únicos. La inducción de una especie bacteriana transfectada, aislada con IPTG usando métodos estándares, producirá una proteína de fusión correspondiente a los primeros siete residuos de ß-galactosidasa, aproximadamente 5 a 15 residuos los cuales corresponden a enlazador, y el péptido codificado dentro del cDNA de pcn. Ya que las inserciones de clon de cDNA son generadas mediante un proceso esencialmente aleatorio, existe una posibilidad en tres de que el cDNA incluido yacerá en el marco correcto para la traslación apropiada. Si el cDNA no está en el marco de lectura apropiado, puede obtenerse mediante supresión o inserción del número apropiado de bases mediante métodos bien conocidos incluyendo mutagénesis in vitro, digestión con exonucleasa I I I o nucleasa de frijol de mung o inclusión de enlazador de oligonucleótidos. El cDNA puede ser movido en otros vectores conocidos por ser útiles para la expresión de proteína en huéspedes específicos. Los enlazadores de oligonucléotidos conteniendo sitios de clonación así como un tramo de DNA suficiente para hibridar al extremo del cDNA objetivo (25 bases) pueden sintetizarse químicamente mediante métodos estándares. Estos iniciadores pueden usarse entonces para amplificar los fragmentos de genes deseados mediante PCR. Los fragmentos resultantes pueden ser M digeridos con enzimas de restricción apropiadas bajo condiciones estándares y aislados mediante electroforesis en gel. De manera alternativa, los fragmentos de genes similares pueden producirse mediante digestión del cDNA con enzimas de restricción apropiadas y llenando la 5 secuencia de gene faltante con oligonucleótidos químicamente sintetizados. La secuencia de nucleótidos parcial de más de un homólogo de proteasa de cisteína pueden ligarse juntas y clonarse en vectores apropiados para optimizar la expresión. Wfc Los huéspedes de expresión adecuados para tales moléculas lo quiméricas incluyen, pero no están limitados a, células mamíferas tal como células 293 humanas y de Ovario de Hámster Chino (CHO), células de insecto tal como células Sf9, células de levadura tal como Saccharomvces cerevisiae, y bacterias tal como E. coli. Para cada uno de estos sistemas de células, un vector de expresión útil también puede incluir un origen de
replicación para permitir la propagación en bacterias y un marcador seleccionable tal como el gene de resistencia antibiótica de ß-lactamasa para permitir la selección en las bacterias. Además, los vectores pueden incluir un segundo marcador seleccionable tal como el gene de fosfotransferasa de neomicina para permitir la selección en células
huésped eucarióticas transfectadas. Los vectores para usarse en huéspedes de expresión eucariótica pueden requerir elementos de procesamiento de RNA tal como secuencias de poliadenilación 3' si tales no son parte del cDNA de interés. Si los promotores nativos no son parte del cDNA, otros promotores
específicos de huésped pueden ser combinados específicamente con la Mk región de codificación de pcn. Incluyen promotores de metalotionina,
MMTV y SV40 para células CHO; promotores trp, lac, tac y T7 para huéspedes bacterianos; y promotores de factor alfa, oxidasa de alcohol y PGH para levadura. Además, los intensificadores de transcripción, tal 5 como el intensificador de virus de sarcoma estimulado (RSV), puede usarse en células de huésped de mamífero. Una vez que los cultivos homogéneos de células recombinantes son obtenidos a través de métodos de cultivos estándares, grandes cantidades de péptido producido de w manera recombinante pueden ser recuperadas del medio acondicionado y
analizadas usando métodos conocidos en la técnica.
IX Aislamiento de PCN recombinante La PCN puede expresarse como una proteína recombinante con uno o más dominios de polipéptidos adicionales añadidos para facilitar la
purificación de proteína. Tales dominios que facilitan la purificación incluyen, pero no están limitados a, péptidos quelantes de metal, tal como módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación en metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación en inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de
purificación por extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp, Seattie WA). La inclusión de una secuencia enlazadora que se puede cortar tal como Factor XA o enterocinasa (Invitrogen) entre el dominio de purificación y la secuencia de pcn puede ser útil para facilitar la expresión de PCN .
X Actividad de PCN * La actividad de PCN purificada o expresada puede probarse al mezclar una cantidad conocida de la enzima con un material de matriz proteinácea (tal como colágeno) en un medio biológicamente aceptable y 5 permitiendo que PCN realice una digestión durante un periodo apropiado de tiempo. Un cimogramo, el cual consiste de un gel de poliacrilamida no desnaturalizante empapado en el material proteináceo sobre el cual varias concentraciones, de preferencia entre 10 a 1000 ng/µl, de PCN son salpicadas, puede usarse para demostrar la actividad de PCN. Después 10 de 30-60 min, el gel es manchado con azul de Coomassie. Una enzima activa creará manchas en las cuales la concentración de proteína ha sido reducida (mancha más ligera) o completamente aclarada (Paech et al (1993) Anal Biochem 208:249-54).
XI Identificación de o producción de anticuerpos específicos de PCN # La PCN purificada es usada para clasificar una genoteca de anticuerpo pre-existente o para criar anticuerpos usando ya sea metodología policlonal o monoclonal. En un acercamiento policlonal, la
proteína desnaturalizada de la separación de HPLC de fase inversa es obtenida en cantidades hasta 75 mg. Esta proteína desnaturalizada puede usarse para inmunizar ratones o conejos usando protocolos estándares; aproximadamente 100 microgramos son adecuados para la inmunización de un ratón, mientras que hasta 1 mg podría ser usado para inmunizar un
conejo. Para identificar hibridomas de ratón, la proteína desnaturalizada puede radioyodinarse y usarse para clasificar hibridomas de células B de murino potenciales para aquéllas que producen anticuerpos. Este procedimiento requiere solo pequeñas cantidades de proteína, de manera que 20 mg serían suficientes para marcar y clasificar varios miles de clones. En un acercamiento monoclonal, la secuencia de aminoácidos de PCN , como se deduce de la traslación del cDNA, es analizada para determinar las regiones de alta inmunogenicidad. Oligopéptidos comprendiendo regiones hidrofílicas apropiadas, como se muestra en la Fig. 3, se sintetizan y usan en protocolos de inmunización adecuados para criar anticuerpos. El análisis para seleccionar epitopes apropiados es descrito por Ausubel FM et al (supra). Las secuencias de aminoácidos óptimas para inmunización generalmente están en la terminal C, la terminal N y aquellas regiones hidrofílícas, interventoras del polipéptido, las cuales posiblemente son expuestas al ambiente externo cuando la proteína está en su conformación natural. Típicamente, los péptidos seleccionados, aproximadamente 15 residuos en longitud, se sintetizan usando el Sintetizador de Péptidos de Applied Biosystems Modelo 431A usando química fmoc y acoplados a hemocianina de lapa de bocallave (KLH, Sigma) mediante reacción con M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster (MBS; Ausubel FM et al, supra). Si es necesario, una cisteína puede ser introducida en la terminal N del péptido para permitir el acoplamiento a KLH. Los conejos son inmunizados con el complejo péptido-KLH en auxiliar de Freund completo. Los antisueros resultantes son probados por su actividad antipéptido al ligar el péptido a plástico, bloqueando con 1 % de BSA, reaccionando con antisuero, lavando y reaccionando con IgG anti-conejo de cabra específica, purificada por afinidad, marcada (radioactiva o fluorescente). Los hibridomas también pueden ser preparados y clasificados usando técnicas estándares. Los hibridomas de interés son detectados al clasificar con PCN marcada para identificar aquellas fusiones que producen el anticuerpo monoclonal con la especificidad deseada. En un protocolo típico, las cavidades de placas (FAST; Becton-Dickinson, Palo alto, CA) se recubren con anticuerpos anti-ratón de conejo específicos, purificados por afinidad (o Ig anti-especie adecuada) a 10 mg/ml. Las cavidades cubiertas son bloqueadas con 1 % de BSA, lavadas y expuestas a sobrenadantes de hibridomas. Después de la incubación, las cavidades son expuestas a PCN marcada, 1 mg/ml. Los clones que producen anticuerpos ligarán una cantidad de PCN marcada, la cual es detectable sobre el fondo. Tales clones son expandidos y sometidos a 2 ciclos de clonación en dilución limitante (1 célula/3 cavidades). Los hibridomas clonados son inyectados en ratones limpios para producir ascitis, y el anticuerpo monoclonal es purificado del fluido ascítico de ratón mediante cromatografía de afinidad en Proteína A. Los anticuerpos monoclonales con afinidades de por lo menos 108/M, de preferencia 109 a 1010 o mayores, típicamente serán hechos mediante procedimientos estándares como se describió en Harlow y Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, y en Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principies and Practice. Academic Press, Nueva York, ambas incorporadas en la presente por referencia.
XII Prueba de diagnóstico usando anticuerpos específicos de PCN Anticuerpos de PCN particulares son útiles para el diagnóstico de condiciones prepatológicas, y enfermedades crónicas o agudas, las cuales están caracterizadas por diferencia en la cantidad o distribución de PCN . A la fecha, se ha encontrado PCN en muchas genotecas donde está predominantemente asociada con la defensa, inflamación o función del órgano. Las pruebas diagnósticas para PCN incluyen métodos utilizando el anticuerpo y una marca para detectar PCN en fluidos corporales humanos, tejidos o extractos de tales tejidos. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención pueden usarse con o sin modificación . Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos serán marcados al unirlos, ya sea covalente o no covalentemente, con una molécula reportadora. Una amplia variedad de marcas y técnicas de conjugación son conocidas y han sido reportadas extensivamente tanto en la literatura científica como de patentes. Las moléculas reportadoras adecuadas o marcas incluyen aquellos radionuclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimiluminiscentes o cromogénicos previamente mencionados así como substratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares. Las patentes que muestran el uso de tales marcas incluyen las patentes estadounidenses Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275, 149; y 4,366,241 . También, las inmunoglobulinas recombinantes pueden ser producidas como se muestra en la patente estadounidense No. 4,816,567, incorporadas en la presente por referencia.
Una variedad de protocolos para mediar la PCN ligada a la membrana o soluble, usando ya sea anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para la respectiva proteína son conocidos en la técnica. Ejemplos incluyen ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RÍA), y distribución de células activadas fluorescentes (FACS). Un inmunoensayo basado en monocional, de dos sitios, utilizando anticuerpos monoclonales reactivos para dos epitopes que no interfieren en PCN es preferido, pero un ensayo de ligadura competitiva puede ser empleado. Estos ensayos son descritos, entre otros lugares, en Maddox, DE et al (1983, J Exp Med 158: 121 1 ).
XIII Purificación de PCN natural usando anticuerpos específicos La PCN natural o recombinante puede ser purificada mediante cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos específicos para esa PCN particular. En general, una columna de inmunoafinidad es construida al acoplar de manera covalente el anticuerpo anti-PCN a una resina cromatográfica activada. Las inmunoglobulinas policlonales son preparadas a partir de sueros inmunes ya sea mediante precipitación con sulfato de amonio o mediante purificación en Proteína A inmovilizada (Pharmacia Biotech). De igual manera, los anticuerpos monoclonales son reparados a partir de fluido de ascitis de ratón mediante precipitación de sulfato de amonio o cromatografía en Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina parcialmente purificada está unida de manera covalente a una resina cromatográfica tal como Sefarosa activada con CnBr (Pharmacia Biotech) .
El anticuerpo es acoplado a la resina, la resina es bloqueada, y la resina derivada es lavada de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Tales columnas de inmunoafinidad pueden ser utilizadas en la purificación de PCN al preparar una fracción de células conteniendo PCN
en una forma soluble. Esta preparación puede derivarse mediante solubilización de células completas o de una fracción subcelular obtenida vía centrifugación diferencial (con o sin adición de detergente) o mediante otros métodos bien conocidos en la técnica. De manera alternativa, la t p PCN soluble conteniendo una secuencia de señal puede secretarse en
cantidad útil en el medio en el cual se hacen crecer las células. Una preparación conteniendo PCN soluble se pasa sobre la columna de inmunoafinidad, y la columna se lava bajo condiciones que permiten la absorbancia preferencia! de PCN (por ejemplo amortiguadores de alta fuerza iónica en la presencia de detergente). Entonces, la columna es 15 levigada bajo condiciones que rompen la ligadura anticuerpo/PCN (por ejemplo, un amortiguador de pH 2-3 o una alta concentración de un
* caotropo tal como urea o ion tiocianato), y PCN es recolectada.
XIV Clasificación de medicamento 20 Esta invención es particularmente útil para clasificar los compuestos terapéuticos al usar fragmentos de ligadura de PCN en cualquiera de una variedad de técnicas de clasificación de medicamento. El fragmento de péptido empleado en tal prueba puede estar libre en solución, fijo a un soporte sólido, soportado en una superficie celular o ubicado
intracelularmente. Uno puede medir, por ejemplo, la formación de complejos entre PCN y el agente que se está probando. De manera alternativa, uno puede examinar la disminución en la formación de complejos entre PCN y un receptor causado por el agente que se está probando. Métodos para clasificar medicamentos o cualquier otro agente el cual puede afectar la activación de macrófagos, comprenden poner en contacto tal agente con un fragmento de PCN y ensayar para la presencia de un complejo entre el agente y el fragmento de PCN. En tales ensayos, el fragmento de PCN está típicamente marcado. Después de la incubación adecuada, el fragmento de PCN libre es separado de aquél presente en forma ligada, y la cantidad de libre o marca sin complejo es una medida de la capacidad del agente particular para ligarse a PCN. Otra técnica para clasificación de medicamento proporciona clasificación de alto rendimiento para compuestos que tienen afinidad de ligadura adecuada para los polipéptidos de PCN y se describe en detalle en la Solicitud de Patente Europea 84/03564, publicada el 13 de septiembre de 1984, incorporada en la presente por referencia. Declarado brevemente, grandes números de diferentes compuestos de prueba de péptidos pequeños se sintetizan en un substrato sólido, tal como ganchos de plástico u algunas otras superficies. Los compuestos de prueba de péptidos se hacen reaccionar con fragmento de PCN y se lavan. El fragmento de PCN ligado es detectado entonces mediante métodos bien conocidos en la técnica. La PCN purificada, también puede cubrirse directamente en placas para usarse en las técnicas de clasificación de medicamento antes mencionadas. Además, los anticuerpos no neutralizantes pueden usarse para capturar el péptido e inmovilizarlo en el soporte sólido. Esta invención también contempla el uso de ensayos de clasificación de medicamento competitivos en los cuales los anticuerpos neutralizantes capaces de ligar PCN compiten específicamente con un compuesto de prueba para ligar a los fragmentos de PCN. En esta manera, los anticuerpos pueden ser usados para detectar la presencia de cualquier péptido el cual comparte uno o más determinantes antigénicos con PCN.
XV Identificación de moléculas las cuales interactúan con PCN La PCN purificada inventiva es una herramienta de investigación para identificación, caracterización y purificación de moléculas que interactúan. Las marcas apropiadas son incorporadas en PCN mediante varios métodos conocidos en la técnica y la PCN es usada para capturar moléculas solubles o que ¡nteractúan con moléculas ligadas a la membrana. Un método preferido involucra marcar los grupos amino primarios en PCN con reactivo de Bolton-Hunter 1 5l (Bolton, AE y Hunter, WM (1973) Biochem J 133:529). Este reactivo ha sido usado para marcar varias moléculas sin pérdida concomitante de actividad biológica (Hebert CA et al (191) J Biol Chem 266: 18989-94; McColl S et al (1993) J Immunol 150:4550-4555). Las moléculas ligada a la membrana se incuban con las moléculas de PCN marcadas, se lavan para remover moléculas sin ligar, y el complejo PCN es cuantificado. Los datos obtenidos usando diferentes concentraciones de PCN se usan para calcular valores para el número, afinidad y asociación de PCN.
Los fragmentos de PCN marcados también son útiles como un reactivo para la purificación de moléculas con las cuales interactúa PCN, incluyendo específicamente inhibidores. En una modalidad de purificación por afinidad, PCN es acoplada de manera covalente a una columna de cromatografía. Las células y sus membranas son extraídas, PCN es removida y varios subcomponentes libres de PCN se pasan sobre la columna. Las moléculas se ligan a la columna en virtud de su afinidad de PCN. El complejo de PCN es recuperado de la columna, disociado y la molécula recuperada es sometida a secuenciación de proteína N-terminal u otro procedimiento de identificación. Si la molécula capturada tiene una secuencia de aminoácidos, puede usarse para diseñar oligómeros degenerados para usarse en clonación del gene a partir de una genoteca de cDNA apropiada. En un método alternativo, los anticuerpos monoclonales criados contra fragmentos de PCN son clasificados para identificar aquellos que inhiben la ligadura de PCN marcada. Estos anticuerpos monoclonales son usados entonces en purificación por afinidad o clonación por expresión de moléculas asociadas. Otras moléculas de ligadura solubles son identificadas en una manera similar. La PCN marcada es incubada con extractos u otros materiales apropiados derivados de pulmón, riñon u otros tejidos con monocitos activados o macrófagos. Después de la incubación, los complejos de PCN (los cuales son mayores que el fragmento de PCN solo) son identificados mediante una técnica de dimensionamiento tal como una cromatografía de exclusión de tamaño o centrifugación de gradiente de densidad y son purificados mediante métodos conocidos en la técnica.
La(s) proteína(s) de ligadura soluble(s) son sometidas a secuenciación N-terminal para obtener información suficiente para la identificación de bases de datos, si la proteína soluble es conocida, o para clonación, si la proteína soluble es desconocida.
XVI Uso y administración de anticuerpos o inhibidores de PCN Los anticuerpos e inhibidores pueden proporcionar diferentes efectos cuando se administran terapéuticamente. Los anticuerpos e inhibidores son usados para disminuir o eliminar daños indebidos causados por desórdenes o enfermedades asociadas con expresión de PCN sobre-regulada. Cada una de estas moléculas o tratamientos (TSTs) serán formulados en un medio portador acuoso farmacéuticamente aceptable, inerte, no tóxico, de preferencia a un pH de aproximadamente 5 a 8, más preferiblemente 6 a 8, aunque el pH puede variar de acuerdo a las diferentes características del péptido, anticuerpo o inhibidor siendo formulado y la condición a ser tratada. Las características de TSTs incluyen solubilidad de la molécula, vida media, antigenicidad/inmunogenicidad y la capacidad del inhibidor para alcanzar su(s) objetivo(s). Estas y otras características puede ayudar a definir un portador efectivo. Las proteínas humanas naturales son preferidas como TSTs, pero péptidos recombinantes así como moléculas orgánicas o sintéticas resultantes de clasificaciones de medicamentos pueden ser igualmente efectivas en situaciones particulares. Las TSTs pueden entregarse mediante rutas conocidas de administración incluyendo pero no limitando a geles y cremas tópicas;
aerosol y atomizador transmucosal; venda o parche transdérmico; formulaciones inyectables, intravenosas y de lavado; y líquidos administrados oralmente y pildoras particularmente formuladas para resistir ácido estomacal y enzimas. La formulación particular, dosificación exacta y ruta de administración será determinada por el médico encargado y variará de acuerdo a cada situación específica. Tales determinaciones se hacen al considerar múltiples variables tal como la condición a ser tratada, la TST a ser administrada, y el perfil farmacocinético de la TST particular. Factores adicionales los cuales pueden ser tomados en cuenta incluyen estado de la enfermedad (por ejemplo, severidad) del paciente, edad, peso, género, dieta, tiempo y frecuencia de administración, combinación de medicamentos, sensibilidades a la reacción, y tolerancia/respuesta a la terapia. Las formulaciones de TST de larga duración pueden ser administradas cada 3 a 4 días, cada semana o una vez cada dos semanas dependiendo de la vida media y velocidad de evacuación de la TST particular. Las cantidades de dosificación normales pueden variar desde 0.1 hasta 100,000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente 1 g, dependiendo de la ruta de administración. La guía como dosificaciones particulares y métodos de entrega es proporcionada en la literatura. Ver las patentes estadounidenses Nos. 4,657,760; 5,206,344; o 5,225,212. Aquellos expertos en la técnica emplearán diferentes formulaciones para diferentes TSTs. La administración a células pulmonares puede necesitar la entrega en una manera diferente de aquella para riñon u otras células.
É Se contempla que las condiciones asociadas con expresión de PCN alterada son tratables con TSTs. Estas condiciones, las cuales incluyen específicamente, pero no están limitadas a, anemia, arterioesclerosis, asma, bronquitis, enfisema, gingivitis, enfermedad inflamatoria de
intestino, diabetes mellitus dependiente de insulina, leucemia, neoplasias endocrinas múltiples, osteoartritis, osteoporosis, fibrosis pulmonar, artritis reumatoide, síndromes de choque séptico, y lupus eritematoso sistemático pueden ser específicamente diagnosticadas mediante las pruebas discutidas antes. Además, tales pruebas pueden ser usadas para verificar
ei tratamiento. Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la especificación anterior se incorporan en la presente por referencia. Varias modificaciones y variaciones del método descrito y sistema de la invención serán aparentes para aquellos expertos en ia técnica sin apartarse del
alcance y espíritu de la invención. Aunque la invención ha sido descrita en conexión con modalidades preferidas específicas, se entenderá que la invención como es reclamada, no debe ser indebidamente limitada a tales modalidades específicas. En realidad, varias modificaciones de los modos antes descritos para realizar la invención, las cuales son obvias para
aquellos expertos en el campo de biología molecular o campos relacionados, pretenden estar dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.
LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: INCYTE PHARMACEUTICALS, INC. (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: PROTEASA DE CISTEINA HUMANA NOVEDOSA (¡ii) NUMERO DE SECUENCIAS: 24 (iv) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINARIO: INCYTE PHARMACEUTICALS, INC. (B) CALLE: 3174 Porter Drive (C) CIUDAD: Palo Alto (D) ESTADO: CA (D) PAÍS: EU (E) CÓDIGO POSTAL: 94304 (v) FORMA LEGIBLE DE COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PAQUETERÍA: Patente en liberación #1.0, versión #1 .3 (vi) DATOS DE SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: A ser asignado (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: Con la presente (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: US 60/005,799 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 23-?ct-1995 (viii) INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Billings, Lucy J. (B) NUMERO DE REGISTRO: 36,749 (C) NUMERO DE REFERENCIA/CASO: PF-0048 PCT (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMU NICACIONES: (A) TELEFONO: 415-855-0555 (B) TELEFAX: 415-845-4166
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1855 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: Adrenal (B) CLON: 100877 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1
AATTCGGCAC GAGGCCTGCC ACAGGTGTCT GCAATTGAAC TCCAAGGTGC AGAATGGTTT 60
GGAAAGTAGT TGTATTCCTC AGTGTGGCCC TGGGAATTGG TGCCGTTCCT ATAGATGATC 120
CTGAAGATGG AGGCAAGCAC TGGGTGGTGA TCGTGGCAGG TTCAAATGGC TGGTATAATT 180
ATAGGCACCA GGCAGACGCG TGCCATGCCT ACCAGTTCAT TCACCGCAAT GGGATTCCTG 240
CCGAACAGAT CGTTGTGATT ATGTACGATG ACATAGCTTA CTCTGAAGAC AATCCCACTC 300
CAGGAATTGT GATCAACAGG CCCAATGGCA CAGATGTCTA TCAGGGAGTC CCGAAGGACT 360
ACACTGGAGA GGATGTTACC CCACAAAATT TCCTTGTTGT GTTGAGAGGC GATGCAGAAG 420
CAGTGAAGGG TATAGGATCC CGCAAAGTCC TGAAGAGTGG TCCCCAGGAT CACGTGTTCA 480
TTTATTTCAC TGACCATGGA TCTTCTGGAA TACTGGTTTT CCCCAATGAA GATCTTCATG 540
TAAAGGACCT GATTAAGACC ACCCATTACA TTTTCAAAAA CAAAATGTAC CGAAAGATGG 600
TGTTCTACAT TGAGGCCTGT GAGTCTGGGT CCATGATGAA CCACCTGCCG GATAACATCA 660
ATGTTTATGC AACTACTGCT GCCAACCCCA GAGAGTCGTC CTACGCCTGT TACTATGATG 720
AGAAGAGGTC CACGTACCTG GGGGACTGGT ACAGCGTCAA CTGGATGGAA GACTCGGACG 780
TGGAAGATCT GACTAAAGAG ACCCTGCACA AGCAGTACCA CCTGGTAAAA TCGCACACCA 840
ACACCAGCCA CGTCATGCAG TATGGAAACA AAACAATCTC CACCATGAAA GTGATGCAGT 900
TTCAGGGTAT GAAACGCAAA GCCAGTTCTC CCGTCCCCCT ACCTCCAGTC ACACACCTTG 960
ACCTCACCCC CAGCCCTGAT GTGCCTCTCA CCATCATGAA AAGGAAACTG ATGAACACCA 1020
ATGATCTGGA GGAGTCCAGG CAGCTCACGG AGGAGATCCA GCGGTATCTG GATGCCAGGC 1080
ACCTCATCCG AGGTGAGGTG GAGCAGCTCC TGTCCGAGAG AGCCCCGCTC ACGGGGCACA 1140
GCTGCTACCC AGAGGTCCTG TTGTACTTCC GGACCCACTG CTTCAACTGG TACTCCCCCA 1200
CGTACGAGTT ATGTGTTGAG ACATTTTGTA CGTGTTGGTC AACCTTTGTG AGAAGGCGCT 1260
TCCACTTCAC AGGATATAAT TGTCCATGGC CCACGTGTGC CTTGGTCACT ACTGAAGAGC 1320
TGCCTCCTGG AAGCTTTTCC CAAGTGTGAG CGCCCCCACC GGCTGTGTTC TTGATCAAGA 1380
GACTGGAGAG GTGGAGTGAG AAGTCTCCGC TGCTCGGGCC CTCCTGGGGG ACCCCCCGCT 1440 CCAGGGCTCG CTCCAGGACC TTCTTCACAA GATGACTTGC TCGCTGTTAC CTGCTTCCCC 1500
AGTCTTTTCT GAAAAACTAC AAATTAGGGT GGGAAAAGCT CTGTATTGAG AAGGGTCATA 1560
TTTGCTTTCT AGGAGGTTTG TTGTTTTGCC TGTTAGTTTT GAGGAGCAGG AAGCTCATGG 1620
GGGCTTCTGT AGCCCCTCTC CAAAGGAGTC TTTATTCTGA GAATTTGAAG CTGAAACCTC 1680
TTTAAATCTT CAGAATGATT TTATTGAAGA GGGCCGCAAG CCCCAAATGG AAAACTGTTT 1740 TTAGAAAATA TGATGATTTT TGATTGCTTT TGTATTTAAT TCTGCAGGTG TTCAAGTCTT 1800
AAAAAATAAA GATTTATAAC AGAACCCCAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 1855
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 431 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:2 Met Val Trp Lys Val Val Val Phe Leu Ser Val Ala Leu Gly He Gly 1 5 10 15 Ala Val Pro He Asp Asp Pro Glu Asp Gly Gly Lys His Trp Val al 20 25 30 He Val Ala Gly Ser Asn Gly Trp Tyr Asn Tyr Arg His Gln Ala Asp 35 40 45 Ala Cys His Ala Tyr Gln Phe He His Arg Asn Gly He Pro Ala Glu 50 55 60 Gln He Val Val He Met Tyr Asp Asp- He Ala Tyr Ser Glu Asp Asn 65 70 75 80 Pro Thr Pro Gly He Val He Asn Arg Pro Asn Gly Thr Asp Val Tyr 85 90 95 Gln Gly Val Pro Lys Asp Tyr Thr Gly Glu Asp Val Thr Pro Gln Asn 100 105 110 Phe Leu Val Val Leu Arg Gly Asp Ala Glu Ala Val Lys Gly He Gly 115 120 125 Ser Arg Lys Val Leu Lys Ser Gly Pro Gln Asp His Val Phe He Tyr 130 135 140 Phe Thr Asp His Gly Ser Ser Gly He Leu Val Phe Pro Asn Glu Asp 145 150 155 160 Leu His Val Lys Asp Leu He Lys Thr Thr His Tyr He Phe Lys Asn 165 170 175 Lys Met Tyr Arg Lys Met Val Phe Tyr He Glu Ala Cys Glu Ser Gly 180 185 190 Ser Met Met Asn His Leu Pro Asp Asn He Asn Val Tyr Ala Thr Thr 195 200 205 Ala Ala Asn Pro Arg Glu Ser Ser Tyr Ala Cys Tyr Tyr Asp Glu Lvs 210 215 220 * Arg Ser Thr Tyr Leu Gly Asp Trp Tyr Ser Val Asn Trp Met Glu Asp 225 230 235 240 Ser Asp Val Glu Asp Leu Thr Lys Glu Thr Leu His Lys Gln Tyr His 245 250 255 Leu Val Lys Ser His Thr Asn Thr Ser His Val Met Gln Tyr Gly Asn 260 265 270 Lys Thr He Ser Thr Met Lys Val Met Gln Phe Gln Gly Met Lys Arg 275 280 285 Lys Ala Ser Ser Pro Val Pro Leu Pro Pro Val Thr His Leu Asp Leu 290 295 300 Thr Pro Ser Pro Asp Val Pro Leu Thr He Met Lys Arg Lys Leu Met 305 310 315 320 Asn Thr Asn Asp Leu Glu Glu Ser Arg Gln Leu Thr Glu Glu He Gln
# 325 330 335 10 Arg Tyr Leu Asp Ala Arg His Leu He Arg Gly Glu Val Glu Gln Leu 340 345 350 Leu Ser Glu Arg Ala Pro Leu Thr Gly His Ser Cys Tyr Pro Glu Val 355 360 365 Leu Leu Tyr Phe Arg Thr His Cys Phe Asn Trp Tyr Ser Pro Thr Tyr 370 375 380 Glu Leu Cys Val Glu Thr Phe Cys Thr Cys Trp Ser Thr Phe Val Arg 385 390 395 400
Arg Arg Phe His Phe Thr Gly Tyr Asn Cys Pro Trp Pro Thr Cys Ala 405 410 415 Leu Val Thr Thr Glu Glu Leu Pro Pro Gly Ser Phe Ser Gln Val ^ 420 425 430 f (2) IN FORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 267 pares de bases 20 (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Cdna (vi) FUENTE ORIGINAL: 25 (E) HAPLOTIPO: U937 (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: 001098 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:3 ATTTGCTTTC TAGGAGGTTT GTTGTTTTGC CTGTTAGTTT TGAGGAGCAG GAAGCTCATG 60
GGGGCTTCTG TAGCCCCTCT CAAAAGGAGT CTTTATTCTG AGAATTTGAA GCTGAAACCT 120
CTTTAATCTT CAGAATGATT TTATTGAAGA GGGCCGCAAG CCCCAAATGG AAAACTGTTT 180
TTAGAAAATA TGATGATTTT TGATTGCTTT TGTATTTAAT TCTGCAGGTG TTCAAGTCTT 240
AAAAAATAAA GATTTATAAC AGAACCC 267
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 195 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: Huvec (B) CLON: 066931 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:4
ACGGAGGAGA TCAGCGGCAT CTGGATGCAG GCACCTCATT GAGAAGTCAG TGCGTAAGAT 60
CGCTCATTCT GGCAGCGTCC GAGGCTGAGG TGGAGCAGCT CCTGTCCGAG AGAGCCCCGC 120 TCACGGGGAC AGCTCTACCC AGAGGCCCTG CTGCACTTCG GACCCACTCT TAACTGCACT 180
CCCCCACGTA CGAGT 195
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 155 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: THP-1 (B) CLON: 075848 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:5 GAGAAGAGGT CCACGTACCT GGGGGACTGG TACAGCNTCA ACTGGATGGA AGACTCGGAC 60
GTGGAAGATC TGACTAAAGA GACCCTGCAC AAGCAGTACC ACCTGGTAAA ATCGCACACC 120
AACACCAGCC ACGTCATGCA GTATGGAAAC AAAAC 155
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 245 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: Sinovio reumatoide (B) CLON: 077015 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:6 GAAACGCAAA GCCAGTTCTC CCGTCCCCCT ACCTCCAGTC ACACACCTTG ACCTCACCCC 60
CAGCCCTGAT GTGCCTCTCA CCATCATGAA AAGGAAACTG ATGAACACCA ATGATCTGGA 120
GGAGTCCAGG CAGCTCACGG NGGAGATCCA GCGGCATCTG GATGNCAGGC ACCTCATTGA 180
GAAGTCAGTG CGTAAGATCG TCTCCTTGCT GGNAGCGTCC GAGGCTGAGG TGGAGCAGCT 240
CCTTA 245
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 185 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: Sinovío reumatoide (B) CLON: 077424 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:7 GATGTGCTCT ACCATCATGA AAAGGAAACT ATGAACACCA ATATCTGGAG GAGTCCAGGC 60
AGCTCACGGA GGAGATCCAG CGGCATCTGG ATGCCAGGCA CCTCATTGAG AAGTCAGTGC 120
GTAAATCGTT CCTTGCTGGC AGCGTCCGAG GCTGAGGTGG AGCAGCTCCT TCCGAGAGAG 180
CCCCG 185
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 232 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: Sinovio reumatoide (B) CLON: 077645 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:8 AGAGACTGGA GAGGTGGAGT GAGAAGTCTC CGCTGCTCGG GCCTCCTGGG GAGCCCCCGC 60
TCCAGGGCTC GCTCCAGGAC CTTCTTCACA AGATGACTTN NTCGCTGTTA CCTGCTTCCC 120
CAGTCTTTTC TGNAAAACTA CAAATTAGGG TGGGAAAAGC TCTGTATTGA GAAGGGTCAT 180
ATTTGCTTTC TAGGAGGTTT GTTGTTTTGC CTGTAAGTTT TGAGGAGCAG GA 232
(2) IN FORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 235 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: Sinovio reumatoide (B) CLON: 077651 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:9 TGCACAAGCA GTACCACCTG GTAAAATCGC ACACCAACAC CAGCCACGTC ATGCAGTATG 60
GAAACAAAAC AATCTCCACC ATGAAAGTNA TGCAGTTTCA GGGTATGAAA CGCAAAGCCA 120
GTTCTCCCGT CCCCCTACCT TCAGTCACAC ACCTTGACCT CACCCCCAGC CCTGATGTGC 180
CTCTNACCAT CATGAAAAGG GTAACTGNTG AACACCAATN ATCTTGAGGA GTCCAGGNAG 240
CTTTACGGTG GTT 253
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 331 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: Sinovio reumatoide (B) CLON: 078547 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 10
ACTGGATGGA AGACTCGGAC GTGGAAGATC TGACTAAAGA GACCCTGCAC AAGCAGTACC 60
ACCTGGTAAA ATCGCACACC AACACCAGCC ACGTCATGCA GTATGGAAAC AAAACANTCT 120
CCACCATGAA AGTNATGCAG TTTCAGGGTA TGAAACGCAA AGCCAGTTCT CCCGTCCCCC 180
TACCTCCAGT CACACACCTT TGACCCTCAC CCCCAGNCCT GATGTGCCTC TAACCATCAT 240
GNAAAGGAAA CTGGATGGAC ACCAATGATC TGGGAGGAGT CCAGGGAAGG NTCACGGAGG 300
GNGATCCCAG CGGGNATCTG GGATTCCCAN N 331
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 219 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal ? (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: Hueso medular (B) CLON: 104286 5 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1 1 GTTTATGCAA CTNCTGCTGC CAACCCCAGA GAGTCGTCCT ACGCCTGTNA CTATGATGAG 60
AAGAGGTCCA CGTACCTGGG GGACTGGTAC AGCGTCAACT GGATGGAAGA CTCGGACGTG 120
GAAGATCTGA CTAAAGAGAC CCTGCACAAG CAGTACCACC TGGTAAAATC GCACACCAAC 180
ACCAGCCACG TCATGCAGTA TGGAAACAAA ACANTCTCC 219
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 271 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple 15 (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vii) FUENTE I NMEDIATA: (A) GENOTECA: Riñon (B) CLON: 1 15565 20 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 12 TCACTACTGA AGAGCTGCCT CCTGGAAGCT TTTCCAAGTN TGAGCGCCCC ACCGACTGTT 60
TGCTGATCAN AGACTGGAGA GGTGGAGTGA GAAGTCTCCG CTGCTCGGGC CCTCCTGGGG 120
AGCCCCCGCT CCAGGGCTCG CTCCAGGACC TTNTTCACAA GATGACTTGC TCGCTGTTAC 180
CNGCTTCCCC AGTCTTTTNT GAAAAACTAC AAATTAGGGT GGGAAAAGCT CTGTATTGAG 240
AAGGGTCATA TTTNCTTTCT AGGAGGTTTT T 271
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 229 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 30 (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: pulmón (B) CLON: 125569 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 13
GTTCTACATT GANGCCTGTG AGTCTGGGTC CATGATGAAC CACCTNCCGG ATAACATCAA 60
TGTTTATGCA ACTACTGCTG CCAACCCCAG AGAGTCGTCC TACGCCTGTT ACTATGATGA 120
GAAGAGGNCC ACGTACCTGG GGGACTNGTA CAAAGTNAAA NTNGATGGAA GAATTCAGAC . 180
GAGGAAGATC TNNCTAAAAN AGAACCTTAA CAAANCANTA ACNCCTAAG 229
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 207 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: pulmón (B) CLON: 125830 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 14
CCAGAGNCCT GCNGCACTTC CGGACCCACT GCTTCAACTG GCACTCCCCC ACGTACGAGT 60
ATGCNTTGAG ACATTTGTAC GTGCTGGTCA ACCTTTGTNA GAAGCCGTAT CCACTTCACA 120
GGATAAAATT GTCCATGGAC CACGTGTGCC TTGGTCACTA CTGANGAGCT GCCTCCTGGA 180
AGCTTTTCCA AGTNTGAGCG CCCCACC 207
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 220 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: riñon (B) CLON: 158868 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 15 ATGAACCACC TGCCGGATAA CATCAATGTT TATGCAACTA CTGCTGCCAA CCCCAGAGAG 60
TCGTCCTACG CCTGTAACTA TGATGAGAAG AGGTCCACGT ACCTGGGGGA CTGGTACAGC 120
GTCAACTGGA TGGAAGACTC GGACGTGGAA GATCTGACTA AAGAGACCCT GCACAAGCAG 180
TACCACCTGG TAAAATCGCA CACCAACACC AGCCACGTTG 220
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 254 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: adenoide (B) CLON: 162199 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 16 GTACCACCTG GTAAAATCGC ACACCAACAC CAGCCACGTC ATGCAGTATG GAAACAAAAC 60
AATCTCCACC ATGAAAGTGA TGCAGTTTCA GGGTATGAAA CGCAAAGCCA GTTCTCCCGT 120
CCCCCTACCT CCAGTCACAC ACCTTGACCT CACCCCCAGC CCTGATGTGC CTCTCACCAT 180
CATGAAAAGG AAACTGATGA ACACCAATGA TCTGGAGGAG TCCAGGCAGC TCACGGGAGG 240 AGATCCAGCG GCAT 254
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 218 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: hueso medular (B) CLON: 172499 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:17 AAATTGTCCA TGGACCACGT GTGCCTTGGT CACTACTGAA GAGCTGCCTC CTGGAAGCTT 60 TTCCAAGTGT GAGCGCCCCA CCGACTGTNT GCTGATCAGA GACTGGAGAG GTGGAGTGAG 120
AAGTCTCCGC TGCTCGGGCC CTCCTGGGGA GCCCCCGCTC CAGGNCTCGC TCCAGGACCT 180
__ __; TCTTCACAAG ATGACTTGCT CGCTGTTACC TGCTTCCG 218
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO58: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 199 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 15 (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: hueso medular 20 (B) CLON: 174690 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 18 GNGACTGGTA CAGCNTCAAC TGGNTGGAAG NCTNGGACGT GGAAGATCTG ACTAANGAGA 60
CCCTGCACAA GCAGTACCAC CTGGTAAAAT CGNACANCAA NACCAGCCAC GTCATGCAGT 120
ATGGGACAAN NCAATCTCCA CCATGAAAGT GATGCAGTTT CAGGGTATGA AACGCAGAGC 180
CATNTTCTCC CGTTCNACT 199
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 52 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 30 (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA * (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: placenta (B) CLON: 180594 5 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 19 GGCCCGGGCA GCGGAGACTT CTCACTCCAC CTCTCCAGTC TCTGATCAGC AC 52
(2) IN FORMACIÓN PARA SEQ ID NO:20: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 51 pares de bases 10 (B) TIPO: ácido nucleico ^ (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vii) FUENTE INMEDIATA: 15 (A) GENOTECA: placenta (B) CLON: 180935 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:20 GGCCGGGCAG CGGAGACTTC TCACTCCACC TCTCCAGTCT CTGATCAGCA C 51
(2) IN FORMACIÓN PARA SEQ ID NO:21 : 20 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECU ENCIA: (A) LONGITUD: 234 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal 25 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: sinovio reumatoide (B) CLON: 190299 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:21 30 AGCAGCTCCT GTCCGANAGA GCCCCGCTCA CGGGGCACAG CTGCTACCCA GAGGCCCTGC 60
TGCACTTCCG GACCCACTGC TTCAACTGGC ACTCCCCCAC GTACGAGTAT GCNTTGAGAC 120
ATTTGTACGT GCTGGTCAAC CTTTGTNAGA AGCCGTATCC GCTTCANAGG ATAAAATTGT 180
CCATGGACCA CGTGTGCCTT GGTCACTACT GAAGAGCTGC CTCCTGGAAG CTTT 234 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:22: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 206 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: riñon (B) CLON: 195541 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:22 CTGGTTTTNC CCAATGAAGA TCTTCATGTA AAGGACCTGA NTGAGACCAT CCATTACATG 60
TACAAACACA AAATGTACCG AAAGATGGTG TTCTACATTN AGGCCTGTNA GTCTGGGTCC 120
. ATGTTGANCC ACCTGCCGGN NANCATCAAN GTTNNTGCAA CTACTGNTNC CAACCCCTGA 180
GAGTNGTCCG ANGNCTGTNA CTATGT 206
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:23: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 181 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA . . (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: riñon (B) CLON: 197617 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:23 CTAAAGAGAC CCTGCACAAG CAGTACCACC TGGTAAAATC GCACACCAAC ACCAGCCACG 60 TCATGCAGTA TGGAAACAAA ACAATCTNCA CCATGAAAGT NATGCAGTTT CAGGGTATGA 120
AACGCAAAGC CAGTTCTCCC GTCCCCCTAC CTCCAGTCAC ACACCTTGAC CTCACCCCCN 180
T 181 w (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:24: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 212 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 5 (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: intestino delgado 10 (B) CLON: 238970 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:24 ACTACTGAAG AGCTGCCTCC TGGAAGCTTT TCCAAGTGTG AGCGCCCCAC CGACTGTTTG 60
CTGATCAGAG ACTGGAGAGG TNGAGTNAGA AGTCTCCGCT GCTCGNGCCC TCCTGGGGAG 120
CCCCCGCTCC AGGGCTCGCT CCAGGACCTT NTTCACAAGA TGACTTGCTC GCTGTTACCT 180
GCTTCCCCAG TCTTTTCTGA AAAACTACAA AA 212
Claims (20)
1. Una proteasa de cisteína novedosa substancialmente purificada (PCN) comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o fragmentos de la misma.
2. Una secuencia de polinucleótidos purificada y aislada que codifica la proteasa de cisteína novedosa de la reivindicación 1.
3. Una secuencia de polinucleótidos purificada y aislada que comprende SEQ ID NO: 1 o fragmentos de la misma.
4. Una secuencia de polinucleótidos la cual híbrida bajo condiciones severas a la secuencia de polinucléotidos de la reivindicación 3.
5. Un oligonucléotidos del polinucleótido de la reivindicación 3.
6. Una prueba diagnóstica para una condición asociada con expresión de pcn alterada comprendiendo los pasos de: a) proporcionar una muestra biológica; b) combinar la muestra biológica y el oligonucleótido de la reivindicación 5 en una solución; c) amplificar la secuencia de pcn; d) medir la expresión de pcn; y e) comparar la expresión medida con la expresión estándar, estableciendo con ello la presencia de la condición.
7. La prueba diagnóstica de la reivindicación 6, en donde la condición es seleccionada del grupo que consiste de anemia, arterioesclerosis, asma, bronquitis, enfisema, gingivitis, enfermedad inflamatoria de intestino, diabetes mellitus dependiente de insulina, leucemia, neoplasias endocrinas W múltiples, osteoartritis, osteoporosis, fibrosis pulmonar, artritis reumatoide, síndromes de choque séptico, y lupus eritematoso sistemático.
8. Un vector de expresión comprendiendo el polinucleótido de la reivindicación 3. 5
9. Una célula huésped transformada con el vector de expresión de la reivindicación 8.
10. Un método para producir y purificar un polipéptido inmunogénico o biológicamente activo, comprendiendo dicho método los pasos de: a) cultivar la célula huésped de la reivindicación 9 bajo condiciones lo adecuadas para la expresión del polipéptido; y b) recuperar el polipéptido del cultivo de la célula huésped.
11. Una composición farmacéutica comprendiendo el péptido de la reivindicación 1 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
12. Un método para tratar enfermedades asociadas con la expresión de 15 PCN alterada mediante administración apropiada de la composición farmacéutica de la reivindicación 11. #
13. Un anticuerpo específico para el polipéptido purificado de la reivindicación 1 .
14. Una prueba diagnóstica para una condición asociada con expresión 20 de PCN alterada comprendiendo los pasos: a) proporcionar una muestra biológica; b) combinar la muestra biológica y el anticuerpo de la reivindicación 13; c) medir la formación de complejo entre el anticuerpo y PCN; y d) comparar la expresión con la expresión estándar, estableciendo con ello 25 la presencia de la condición.
15. La prueba diagnóstica de la reivindicación 14, en donde la condición es seleccionada del grupo que consiste de anemia, arterioesclerosis, asma, bronquitis, enfisema, gingivitis, enfermedad inflamatoria de intestino, diabetes mellitus dependiente de insulina, leucemia, neoplasias endocrinas múltiples, osteoartritis, osteoporosis, fibrosis pulmonar, artritis reumatoide, síndromes de choque séptico, y lupus eritematoso sistemático.
16. Una composición farmacéutica comprendiendo el anticuerpo de la reivindicación 13 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
17. Un método para tratar una condición asociada con la expresión de PCN alterada comprendiendo administrar la composición farmacéutica de la reivindicación 16.
18. Un método para clasificar una pluralidad de compuestos para afinidad de ligadura específica con el polipéptido de la reivindicación 1 , comprendiendo los pasos de: a) proporcionar una pluralidad de compuestos; b) combinar los compuestos con el polipéptido en una manera y durante un tiempo suficiente para ligar PCN ; y c) detectar y recuperar PCN ligado; identificando con ello el compuesto.
19. Una composición farmacéutica comprendiendo el compuesto de la reivindicación 18 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
20. Un método para tratar una condición asociada con expresión de PCN alterada, comprendiendo administrar la composición farmacéutica de la reivindicación 17 a un sujeto en necesidad de tal tratamiento.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US005799 | 1987-01-16 |
Publications (1)
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