【発明の詳細な説明】
インシュリン非依存性糖尿病患者の膵臓由来のケモカイン技術分野
本発明は、インシュリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の患者の膵臓に由来す
る新規なケモカインの核酸配列及びアミノ酸配列に関する。本発明は、特に、疾
病の診断、研究、予防及び治療のためのその配列の利用に関する。
ケモカインは、一般に長さ約７０〜１００アミノ酸、分子量８〜１１ｋＤで、
１〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲で活性な小型のポリペプチドである。初めに、ケモ
カインは炎症組織から単離、精製され、その生物活性に対して特徴づけられた。
最近では、ケモカインは、分子クローニング技術を通して発見されてきており、
機能分析と構造分析の両面から特徴づけられている。現在ケモカインファミリー
に割り当てられている近縁なポリペプチドは、成熟細胞における初めの２つのシ
ステイン残基の間隔が一定であり、単球／マクロファージ、好塩基球、好酸球、
Ｔ細胞他を含む多様な標的細胞のグループに作用する。既知のケモカイン及びそ
の機能は、“Ｔｈｏｍｓｏｎ Ａ． （１９９４）Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ
Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｄ Ｅｄ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ．”
に記載されている。
現在、Ｃ−Ｃケモカインについて書かれたものは比較的少なく、また、そのＮ
末端プロセシングの数は、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインより少ないようである。既知の
Ｃ−Ｃケモカインには、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）、マクロファージ炎症
性タンパク質（ＭＩＰ）、Ｉ−３０９、ＴＣＡ３、及びＲＡＮＴＥＳが含まれる
。
単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１）は、７６アミノ酸のタンパク質
であって、様々な媒介物の刺激に応じてほとんど全ての細胞及び組織において発
現されるようである。Ｃｈａｒｏによれば、ＭＣＰ−１の標的は、単球及び好塩
基球に限定されており、そこでＭＣＰ−１は、ＭＣＰ−１レセプタ、Ｇタンパク
質結合レセプタを介してカルシウム流動（flux）を誘発する。Ｓｈｙｙ Ｙ−Ｊ
等（１９９０；Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １６
９：３４６−３５１）は、ホルボールエステル処理による内皮細胞培地における
ＭＣＰ−１の誘発、及びアテローム発生との関連の可能性について報告している
。他の２つの近縁関係にあるタンパク質（ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３）は、ヒト骨
肉腫細胞株から精製された。ＭＣＰ−２及びＭＣＰ−３はＭＣＰ−１とそれぞれ
６２％及び７３％のアミノ酸配列の同一性を有し、単球に対するその化学誘因物
質特異性をＭＣＰ−１と共通のものとしている。
ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βは、初めに剌激されたマウスのマクロファージ
株細胞から精製され、通常の組織に注入されると炎症反応を誘発した。そして、
少なくとも３つの異なる非対立遺伝子が、ヒトＭＩＰ−１αをコードし、異なる
７つの遺伝子がＭＩＰ−１βをコードする。ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βは６
８〜６９アミノ酸からなり、これらのアミノ酸の約７０％が、その酸性、成熟分
泌型について同一である。これらのタンパク質は双方共に、剌激されたＴ細胞、
Ｂ細胞、及び単球においてミトゲン、抗−ＣＤ３、及び内毒素に応じて発現され
、また両ポリペプチドはへバリンを結合する。両分子は単球を剌激し、ＭＩＰ−
１αはＴ細胞のＣＤ８サブセット及び好酸球を化学誘因し、ＭＩＰ−１βはＴ細
胞のＣＤ４サブセットを化学誘因する。マウスにおいては、これらのタンパク質
が骨髄造血を刺激することが知られている。
Ｉ−３０９はヒトγ−δＴ細胞株からクローニングされ、マウスからクローニ
ングされたＴ細胞活性化遺伝子３（ＴＣＡ３）と４２％のアミ
ノ酸同一性を示している。これらの２つのタンパク質の５′フランキング領域の
間には、かなりのレベルのヌクレオチド相同性が存在しており、他のケモカイン
においては見られない特別なシステイン残基の対を共通に持っている。このよう
な類似性は、Ｉ−３０９とＴＣＡ３とが、時間の経過のうちに配列及び機能が分
かれた種のホモログであることを示唆している。
ＲＡＮＴＥＳは、Ｃ−Ｃケモカインの一種であって、発現されるのはＴ細胞（
Ｂ細胞では発現されない）、血小板、ある種の腫瘍細胞株、及び刺激されたリウ
マチ滑膜線維芽細胞においてである。後者においては、ＩＬ（インターロイキン
）１及びＩＬ４、形質転換神経因子及びインターフェロンγにより調節される。
Ｔ細胞からクローニングされたｃＤＮＡは、Ｎ結合型グリコシル化を欠いた基本
的な８ｋＤのタンパク質をコードし、白血球、単球、好塩基球、及び好酸球に影
響を与え得る。ＲＡＮＴＥＳのｍＲＮＡの発現は、Ｔ細胞刺激により実質的に低
減する。
他の組織の炎症の場台と同様に、単球、マクロファージ、好中球、及び好酸球
を含む白血球が、膵臓の炎症を起こした領域に浸潤する。白血球の主たる役割は
炎症によって生ずる異物を除去することであるが、炎症部位に他の細胞を動員す
るサイトカイン類も分泌する。単球及びマクロファージは強力な酸化剤やプロテ
アーゼを作り出すが、これが組織損傷をもたらすこともある。
ケモカインファミリーは、異なる異常状態、炎症若しくは疾病状態における白
血球動員を説明するために必要不可欠の細胞特異性を有している。第１に、ケモ
カインは内皮細胞上の特定の接着分子の発現を媒介する。第２に、ケモカインは
、特定の細胞タイプを活性化する化学誘因物質因子の勾配を作り出す。更に、ケ
モカインは特定の細胞タイプの増殖を刺激し、特定のレセプタを保有する細胞の
活性化を調節する。これら
の何れもが、標的細胞に対する高い特異性を説明している。
ケモカイン分子について説明している文献には、“Ｓｃｈａ１１ ＴＪ （
１９９４） Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：
Ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｅｖｅ１ｏｐｍｅｎｔ．
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉ
ｏｎｓ， Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ ＭＡ ｐｐ １８０−２７０”及び“
Ｐａｕｌ ＷＥ（１９９３）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，
３ｒｄ Ｅｄ． Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ ｐｐ ８２２−８
２６”がある。
膵臓は、本発明のケモカインの由来する器官で、エキソクリン組織とエンドク
リン組織とからなる。下方向に順番に、エキソクリン部分は、葉、小葉、腺房と
して知られている機能的分泌単位に分かれている。全ての腺房は最終的に、十二
指腸に流れ込む前に、肝臓からの胆管と結合する主膵管の中に流れ込む、腺房細
胞は膵臓の８０％を占め、消化を助ける酵素の不活性型及び活性型の何れかを分
泌する。小導管の上皮細胞は、タンパク質、炭水化物及び脂肪の消化のための酵
素と共に、大量の重炭酸イオン及び水を分泌する。最も重要で、かつ量の多いタ
ンパク質分解酵素は、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、
エラスターゼ、アミラーゼ、膵臓リパーゼ、及びホスホリパーゼである。アセチ
ルコリン、ガストリン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、及びセクレチンは、腺房
の分泌を調節する。
エンドクリン膵臓はランゲルハンス島からなり、ランゲルハンス島の細胞は、
エキソクリン小胞から分離され、膵臓全体に分布している。島を構成する様々な
タイプのエンドクリン細胞の機能は、タンパク質、炭水化物、及び脂肪の代謝に
関与するホルモンを分泌する。主なエンドクリン細胞はα、β、及びδ細胞であ
り、その他の細胞として、Ｃ細胞、
ＥＣ細胞、及びＰＰ細胞がある。α細胞はグルカゴンを分泌する。β細胞はイン
スリンを分泌する。δ細胞はソマトスタチン及び血管作用性腸ペプチド（ＶＩＰ
）を分泌する。Ｃ細胞の機能は未知であり、ＥＣ細胞及びＰＰ細胞は各々、セロ
トニン及び膵ポリペプチドを分泌する。
膵臓の炎症及び膵臓炎は、臨床的な診断基準により急性と、慢性の何れかに分
類され得る。その治療については、急性膵臓炎は治癒可能なことが多く、その機
能も完全に回復させることが可能である。慢性膵臓炎の場合には、永久に障害が
残る事が多い。炎症が生ずる機構は正確にはわかっていない。しかし、その原因
となるものを挙げると、アルコール摂取、胆管の病気、手術による障害、及び遺
伝性膵臓炎がある。理論の一つによれば、自己消化、即ち十二指腸内でなく膵臓
内でのタンパク質解酵素の早発性の活性化により、膵臓炎が引き起こされる。
糖尿病は、最も重要な膵臓疾患である。インシュリン非依存性糖尿病（ＮＩＤ
ＤＭ）の臨床的症状は３つの異なる段階で進行する。第１段階では、血漿のグル
コースレベルは変化しないが、インスリンの増加時のインスリン抵抗性がはっき
りと現れる。第２段階では、インスリン抵抗性が悪化し、グルコース不耐性が、
食後の高血糖としてはっきり現れる。第３段階では、インスリン抵抗性が安定し
、インスリン分泌が低下し、高血糖状態が進み、顕性の糖尿病であることが明ら
かとなる。ＮＩＤＤＭの患者は、疾病状態が悪化し、自己免疫障害の潜伏性の発
症の後だいぶ時間が経過するまで、臨床的症状を示さないことが多い。
ＮＩＤＤＭや他の膵臓の異常の診断のための現在の技術は、主に臨床的な症状
の観察、若しくは人体組織または体液の、ホルモン、ポリペプチドまたは様々な
代謝物質についての血清学的な分析に大きく依存している。残念ながら、このよ
うな症状や分析は、病気の初期段階では行われず、血清学的な分析では、侵入性
の疾病の症状と、それと重複または
非常に類似した範囲を有する他の症状との区別が、必ずしもつくわけではない。
従って本発明のＮＩＤＤＭの膵臓に関係する新規なケモカインの核酸配列及びア
ミノ酸配列を、病理学的な初発性の診断や、この疾病を治療するための医薬品の
開発に利用することが可能である。
膵臓の解剖学、病理学、及び疾病について説明している文献には、“Ｇｕｙｔ
ｏｎ ＡＣ（１９９１） Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓ
ｉｏ１ｏｇｙ， ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ”
、“Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ，ＫＪ ｅｔ ａｌ． （１９９４）Ｈａｒｒｉｓ
ｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”
、“Ｊｏｈｎｓｏｎ ＫＥ（１９９１）Ｈｉｓｔｏ１ｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅ１１
Ｂｉｏ１ｏｇｙ”及び“Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａ１ ｏｆ Ｄｉａｇ
ｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｒａｈｗａｙ， ＮＪ”等がある。発明の開示
本発明は、インシュリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）膵臓ライブラリに由来
するｃＤＮＡから同定された新規なケモカイン、及びこの新規なケモカインの核
酸配列及びアミノ酸配列の、膵臓の疾病の研究、診断、予防、及び治療における
利用に関する。本発明のこの新規なケモカインは、コンピュータによるアミノ酸
配列アライメントの検索によりインサイト社クローン２７３０６１ではじめに同
定された。このケモカインは９９アミノ酸の長さを有し、Ｃ34及びＣ35において
一定のシステイン残基を有し、ヒトｍｃｐ−１の予測アミノ酸配列と約６６％の
アミノ酸配列の類似性を有する（GenBank GI 487124; Shyy Y-J et al.(1990) B
iochem Biophys Res Commun 169:346-351）。この新規なケモカインの核
酸配列は、本明細書においてｍｃｐ−４なる符号で示され、配列番号：１として
示されており、配列番号：２のＭＣＰ−４に対するアミノ酸配列をコードする。
本発明は、ＭＣＰ−４と単球走化性性タンパク質ＭＣＰ−１の間の相同性、及び
ＭＣＰ−４のケモカインを定義づける残基Ｃ34及びＣ35に部分的に基づいている
。
ｍｃｐ−４をコードする完全なポリヌクレオチドを用いて、臨床的な症状や組
織の破壊が顕在化する前に、ＮＩＤＤＭを含む膵臓関連の疾病の診断の基礎を築
くことができる。また、このポリヌクレオチドを用いて、過剰な自己免疫を患う
患者のゲノムのヌクレオチド配列の発現を抑制または抑止し、特に膵臓組織の破
壊を予防するのに役立つアンチセンス分子を設計することができる。本発明はま
た、宿主細胞または動物の形質転換に用いることができる発現べクターへのポリ
ヌクレオチドの挿入にも関係する。このような遺伝子組換え宿主を、コードされ
たＭＣＰ−４の産生と回収のために用いることもできる。
本発明は、免疫病の患者に対する白血球増殖の誘発のための精製ＭＣＰ−４の
投与もその範囲に含む。本発明では、ＭＣＰ−４に結合する他のアンタゴニスト
またはインヒビターの同定や抗体の産生のために同じＭＣＰ−４を利用する。抗
体、アンタゴニスト、またはインヒビターを過敏性の患者に用いて、ＭＣＰ−４
が白血球の増殖を誘発したり、特定の炎症部位にしたりしないようにし、免疫反
応をダウンレギュレートしたり、単球、マクロファージ、及びＴ細胞が、炎症を
引き起こすタンパク質分解性の酵素を分泌しないようにすることもできる。本発
明の範囲には、ＮＩＤＤＭが、それに類似した生化学的または免疫学的特徴を備
えた疾病状態の診断、予防または治療のためのポリペプチド、抗体、アンタゴニ
ストまたはインヒビターを含む医薬品組成物が含まれる。前述の疾病状態には、
ウィルス感染、細菌感染、真菌または寄生虫感染や、
アレルギー反応やまたは喘息反応や、外傷による機械的な組織の損傷や、動脈硬
化症、アテローム発生または膠原病や慢性関節リウマチ、白血病、リンパ腫、ま
たは癌腫のような遺伝病や、他の白血球、特に単球、マクロファージ及びＴ細胞
が関与する疾病状態が作られる。
このｍｃｐ−４ポリヌクレオチド配列、またはそのオリゴヌクレオチド、フラ
グメント、部分またはアンチセンスを、細胞及び組織におけるｍｃｐ−４ｍＲＮ
Ａの性質は定量のための診断的アッセイに用いることができる。例えば、このｍ
ｃｐ−４を遺伝子発現における異常を診断するための溶液ベース、膜ベース、ま
たは組織ベースの技術におけるハイブリダイゼーションや増幅のために用いるこ
とができる。本発明は更に、精製ポリペプチドをポジティブコントロールとして
使用し、抗−ＭＣＰ−４抗体を利用する天然ＭＣＰ−４の検出のための診断的ア
ッセイも提供する。このような抗体は、ＭＣＰ−４の異常発現に関係する疾病状
態の検出のための溶液ベース、膜ベース、または組織ベースの技術において使用
することができる。
ＭＣＰ−４、アンチセンス分子、抗体、アンタゴニスト、またはインヒビター
を、治療目的で使用することもできる。例えばこれらを通常組織の炎症のような
データに関係するＭＣＰ−４の異常活性を中和したり、白血球増殖を刺激する目
的で用いることができる。本発明はまた、ｍｃｐ−４の異常発現が関係する疾病
状態の治療のための医薬品組成物も提供する。このようなものには天然ＭＣＰ−
４に結合し得る抗体、アンタゴニスト、またはインヒビターと共に、ｍｃｐ−４
の転写や翻訳を抑制し得るアンチセンス分子が組換えＭＣＰ−４が含まれる。図面の簡単な説明
第１図はＮＩＤＤＭ膵臓からの人間の新しいケモカインの核酸配列及
びアミノ酸配列を示す。そのアラインメントはＭａｃＤＮＡｓｉｓ （商標）ソ
フトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｏ
．，Ｌｔｄ．Ｓａｎ Ｂｒｕｎｏ ＣＡ）を用いて生成された。
第２図はＭＣＰ−１（ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ ４８７１２４； Ｓｈｙｙ Ｙ
−Ｊ ｅｔ ａｌ． （１９９０）ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ
Ｃｏｍｍｕｎ １６９：３４６−３５１）とＭＣＰ−４との間のアミノ酸配列類
似性を示す。そのアラインメントはＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡ
Ｒ Ｉｎｃ． Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）のマルチ配列アラインメントプログラム
を用いて生成された。発明の詳細な説明
本発明は膵臓組織において発現される新規のケモカインに関する。ここで用い
られるように、小文字（ｍｃｐ−４）における新しいマクロファージ走化性タン
パク質に対する略語は核酸配列を示し、大文字（ＭＣＰ−４）はアミノ酸配列を
示す。
ここで用いられる核酸配列は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド或いはポリ
ヌクレオチド配列及びそのフラグメントであり、一本鎖或いは２本鎖であり、セ
ンス或いはアンチセンス鎖であるゲノミック或いは合成起点のＤＮＡ或いはＲＮ
Ａを示す。同様に、ここで用いられるアミノ酸配列は、オリゴペプチド、ぺプチ
ド、ポリペプチド或いはタンパク質配列を示す。
ここで用いられるＭＣＰ−４は自然発生或いは異型における牛、羊、豚、馬、
ねずみ及び好適には人間を含む任意の種からの、或いは自然、合成、半合成ある
いは組み換えの何れかの任意の発生原からのＭＣＰ−４を示す。好適なＭＣＰ−
４変異体は第１図に示されるＭＣＰ−４アミ
ノ酸配列に対して少なくとも８０%のアミノ酸配列類似性を有する変異体であり
、別の好適なＭＣＰ−４変異体は少なくとも９０%のアミノ酸配列類似性を有す
る変異体であり、別の好適なＭＣＰ−４変異体は少なくとも９５%のアミノ酸配
列類似性を有する変異体である。
ＭＣＰ−４は第２図においてＭＣＰ−１及びＭＣＰ−４により示される最終的
な２つのシステインモチーフＣ３４及びＣ３５を含むケモカインである。ケモカ
インは白血球の増殖及び遊送に伴い、免疫系の細胞ばかりでなく損傷した或いは
ストレスを受けた細胞によっても生成されることが知られている。
ここで用いられる用語「自然発生」は、自然中に見いだされるｍＲＮＡ配列を
有するＭＣＰ−４を示す。同様に用語「生物学的活性」は自然発生ＭＣＰ−４の
構造的、調節的或いは生化学的機能を有するＭＣＰ−４を示す。同様に「免疫学
的活性」は適切な動物或いは細胞における特定の免疫反応を誘発するための、さ
らには特定の抗体と結合するための自然、組み換え或いは合成ＭＣＰ−４、また
はその任意のオリゴペプチドの能力として定義される。
ここで用いられる用語「誘導体」はｍｃｐ−４、即ちコード化されたＭＣＰ−
４の化学修飾を示す。そのような修飾の例示は、アルキル基、アシル基或いはア
ミノ基による水素の置換である。ｍｃｐ−４誘導体は、例えば単球の化学誘引の
ような、Ｃ−Ｃケモカインの本質的な生物学的特性を保有するポリペプチドをコ
ード化する。
ここで用いられる用語「精製される」は自然環境から取り除かれ、自然に結合
される少なくとも１つの他の成分で分離された、核酸配列或いはアミノ酸配列の
分子を示す。ＭＣＰ−４コード化配列
ＭＣＰ−４の核酸配列及び予測アミノ酸配列が第１図に示される。本発明によ
り、ＭＣＰ−４のアミノ酸配列をコード化する任意のヌクレオチド配列は、ＭＣ
Ｐ−４を発現する組み換え分子を生成するために用いることができる。ここで記
載する特定の実施例では、ｍｃｐ−４はまず分離され、Ｉｎｃｙｔｅ Ｃ１ｏｎ
ｅ ２７３０６１内においてインシュリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）膵臓ラ
イブラリから同定される。
ＤＮＡ配列化に対するモデルは当技術分野ではよく知られており、ＤＮＡポリ
メラーゼＩのクレノウフラグメント、すなわちＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）
（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）、Ｔ
ａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ
ＣＡ）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ （Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｃｈｉｃａｇｏ
ＩＬ）或いは組み換えポリメラーゼとＧｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓ
ｂｕｒｇ ＭＤ）により販売されるＥＬＯＮＧＡＳＥ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ Ｓｙｓｔｅｍのようなプルーフリーディングエキソヌクレアーゼとの組み
合わせのような酵素を用いて、一本鎖及び二本鎖テンプレートの両方に対して発
現された、対象となるＤＮＡテンプレートにアニールしたオリゴヌクレオチドプ
ライマからＤＮＡを延長する。連鎖停止反応生成物は電気泳動を用いて分離され
、その組み込まれた、標識された先駆物質を介して検出される。機械化された反
応調整法、配列化及び解析における最近の改善により、一日あたりに画定できる
配列の数は拡大している。好適には、そのプロセスはＨａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃ
ｒｏ Ｌａｂ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ ＮＶ），Ｐｅｌｔｉ
ｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＰＴＣ２００；ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）及びＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔ
ｙ ＣＡ）Ｃａｔａｌｙｓｔ８００及び３７７、さらには３７３
ＤＮＡ配列器のような装置を用いて自動化される。
任意の特定ｃＤＮＡライブラリの品質は、ｃＤＮＡｓのパイロットスケール解
析を行い、べクタ、ラムダ或いはＥ．ｃｏｌｉＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ或
いは反復ＤＮＡを含むクローンのパーセンテージ及び公開データベースに厳密に
或いは相同的に一致するクローンのパーセンテージを検査することにより判定で
きる。
ｍｃｐ−４ポリヌクレオチド配列の延長
ｍｃｐ−４のポリヌクレオチド配列は、部分的なヌクレオチド配列と、プロモ
ータや調節エレメントのような上流の配列を検出するための周知の様々な方法を
利用して延長され得る。Gobinda et al（1993; PCR Methods Applic 2:318-22）
の論文には、既知の部位に隣接する未知の配列を検索するための一般的なプライ
マを利用する直接的な方法として、「制限部位」ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣ
Ｒ）が開示されている。この方法では、初めにゲノムのＤＮＡの増幅が、リンカ
ー配列に対するプライマ及びプライマに特異的な既知の領域の存在の下で行われ
る。増幅された配列は、同じリンカープライマ及び一回目より内部の部位に特異
的な別のプライマの存在の下で、２回目のＰＣＲ処理を受ける。各ＰＣＲ処理の
産物は、適当なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、逆転写酵素を用いて配列
決定される。
逆ＰＣＲ法は、既知の領域に基づいて多岐したプライマを用いて配列を増幅ま
たは延長するために利用される（Triglia T et al (1988)Nucleic Acids Res 16
:8186）。このプライマは、ＯＬＩＧＯ（登録商標）４．０(1992; National Bio
sciences Inc，Plymouth MN）、または他の適当なプログラムを用いて、２２〜
３０ヌクレオチドの長さを有し、ＧＣを５０％以上含み、約６８〜７２℃の温度
で標的配列にアニールするように設計され得る。この方法では、いくつかの制限
酵素を用いて、遺
伝子の既知の領域にある適当なフラグメントを生成する。フラグメントは、分子
内連鎖反応により環状にされ、ＰＣＲ用の鋳型として使用される。
キャプチャＰＣＲ法（Lagerstrom M et al (1991)PCR Methods Applic 1:111-
19）は、ヒト及びイースト菌の人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡにおける既知の配列
に隣接するＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅するための方法である。キャプチャ
ＰＣＲ法でも、多数の制限酵素による切断及びＰＣＲの前にＤＮＡ分子の未知の
部分に工学的処理をなされた二鎖の配列を入れるライゲーションが必要である。
Parker JD et al （1991; Nucleic Acids Res 19:3055-60）による歩行（walk
ing）ＰＣＲ法は、未知の配列の検索を可能にする標的とされた遺伝子の歩行の
ための方法である。ＰｒｏｍｏｔｅｒＦｉｎｄｅｒ（商標）というClontech社（
Palo Alto CA）製の新しいキットは、ＰＣＲ、入れ子状態のプライマ及びＰｒｏ
ｍｏｔｅｒＦｉｎｄｅｒライブラリを用いて、ゲノムのＤＮＡにおいて歩行を起
こさせる。この方法では、ライブラリのスクリーニングが不要であり、イントロ
ン−エキソンの接合部を見つけるのに役立つ。
別のＰＣＲ方法は、１９９６年６月７日出願のGuegler他による米国特許第０
８／４８７， １１２号の「Improvement Method for Obtaining Full Length c
DNA Sequence」があり、ここで参照して取入れている。このＰＣＲ方法はＸＬ−
ＰＣＲ（商標）（Perkin Elmer,Foster City CA）を用いて、ヌクレオチド配列
を増幅し、延長する。
完全長ｃＤＮＡのスクリーニングのための好適なライブラリは、より大きいｃ
ＤＮＡを含むようにサイズ選択されたものである。また、ランダムに初回刺激を
受けたライブラリは、それが遺伝子の５'及び上流の領域を含む配列をより多く
含んでいるという点で好適である。ランダムに
初回剌激を受けたライブラリは、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリでは完全長ｃＤＮＡ
が作れないような場合に特に役立つものであり得る。ゲノムのライブラリは、５
'の翻訳されない調節領域に向かって延長する場合に役立つ。
サイズの大小の分析、配列決定のヌクレオチド配列の確認、若しくはＰＣＲ生
成物のヌクレオチド配列の確認のための新しい方法は、キャピラリ電気泳動法で
ある。高速シークエンシング用のシステムは、PerkinElmer，Beckman Instrumen
ts （Fullerton CA）及び他の会社で発売されている。キャピラリシークエンシ
ングでは、電気泳動による分離のための流動性のポリマー、レーザーで活性化さ
れる４つの異なる蛍光性の染料（それぞれが各ヌクレオチドに対応している）、
及びＣＣＤカメラによる放出された光の波長の検出が利用される。アウトプット
／光強度は、適当なソフトウェア（例えばPerkin Elmer製のＧｅｎｏｔｙｐｅｒ
（商標）及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｎａｖｉｇａｔｏｒ（商標））を用いて電気信
号に変換され、サンプルを負荷するところからコンピュータ分析、電子的なデー
タの表示に至るまでのプロセス全体はコンピュータで制御される。キャピラリ電
気泳動法は、特定のサンプルにおいて僅かにしか存在し得ない小さなＤＮＡ断片
の配列決定を行うのに特に適している。再現可能な配列決定としてＭ１３ファー
ジＤＮＡの最大３５０塩基対を３０分で配列決定したことが報告されている（Ru
iz-Martinez MC et al（1993）Anal Chem 65:2851-8）。ｍｃｐ−４の発現
本発明によれば、ＭＣＰ−４、及びそのポリペプチドの断片、溶解タンパク質
あるいはその機能的な等価物をコードするｍｃｐ−４ポリヌクレオチド配列が、
適切な宿主細胞でＭＣＰ−４の発現をもたらす組換えＤＮＡ分子を作り出すため
に使用されうる。遺伝暗号固有の同義性のた
めに、同一の、及び機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列も
適切な宿主細胞におけるＭＣＰ−４のクローニングや発現のために用いられ得
る。当業者には理解されようが、自然発生のコドンには含まれていないＭＣＰ−
４をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有利であり得る。特定の原核
細胞あるいは真核細胞の宿主によって好まれるコドン（Ｍｕｒｒａｙ Ｅ等（１
９８９）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ１７：）、例えば、ＭＣＰ−４発現速度を
増加させるような、あるいは自然発生の配列からの転写物より長い半減期のよう
な望ましい特性を有する組換えＲＮＡ転写物が生成されるようなコドンを選択す
ることができる。
同様に、本発明の範囲には、中程度から最高度の厳格な条件のもとで、図１の
ヌクレオチド配列にハイブリッド形成可能なポリヌクレオチド配列が含まれる。
ハイブリッド形成条件は、ＷａｈｌとＢｅｒｇｅｒ（１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ １５２：３９９−４０７）やＫｉｍｍｅｌ（１９８７、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５２：５０７−１１）が教えるように、核酸複
合体の溶解温度（Ｔｍ）に基づく。そして「厳格性」の定義は以下のように与え
られる。
「最大の厳格性」は、Ｔｍが−５℃（プローブのＴｍが５℃未満）の場合に、
「高い厳格性」はＴｍが５〜１０℃の場合に、「中程度の厳格性」はＴｍが１０
〜２０℃の場合に、「低い厳格性」はＴｍが２０〜２５℃の場合に通常要求され
る。当業者には理解されようが、最大の厳格性でのハイブリダイゼーションは、
同一のポリヌクレオチド配列を識別するか、あるいは検出するために使われるが
、中程度（か、あるいは低い）厳格性でのハイブリダイゼーションは、類似か、
あるいは近縁なポリヌクレオチド配列を識別するか、あるいは検出するために使
われる。「ハイブリッド形成（ハイブリダイゼーション）」なる用語は、本明細
書においては、「核酸鎖が塩基対により相補的な鎖と結合するプロセス」（Ｃｏ
ｏｍｂｓ Ｊ （１９９４） Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）を
意味し、また増幅プロセスはＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ＣＷ ａｎｄ ＧＳ Ｄ
ｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５， ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，
Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ）に記載されているようにＰＣＲ法を用いて実行さ
れる。これらの文献を参照されたい。
本明細書において、「欠失」なる用語は、それぞれ、１または２以上のヌクレ
オチドあるいはアミノ酸残基が欠落しているヌクレオチドあるいはアミノ酸配列
の変化と定義される。
本明細書において、「挿入」あるいは「付加」なる用語は、自然発生ｍｃｐ−
４を比較したとき、１または２以上のヌクレオチドやアミノ酸残基が追加されて
いるようなヌクレオチドやアミノ酸配列の変化を意味する。
本明細書において、「置換」なる用語は、１または２以上のヌクレオチドまた
はアミノ酸残基が、それぞれ異なるヌクレオチドやアミノ酸残基と置き換わるよ
うな変化を意味する。
本発明に基づいて用いることのできる変形されたｍｃｐ−４ポリヌクレオチド
配列は、同一物若しくは機能的に等しいｍｃｐ−４をコードするポリヌクレオチ
ドを結果としてもたらす異なるヌクレオチド残基の削除、挿入、若しくは置換を
含む。タンパク質も、又、静的変化を産生しかつ機能的に等価なＭＣＰ−４を結
果としてもたらすアミノ酸残基の削除、挿入、若しくは置換を示すこともある。
意図的なアミノ酸の置換は、ＭＣＰ−４の生物学的な活性が保持される限り、残
基の、極性、変化、
可溶性、疎水性、親水性、及び／若しくは両親媒性の性質の共通性に基づいて行
うことができる。例えば、負に帯電したアミノ酸は、アスパラギン酸とグルタミ
ン酸を含み、正に帯電したアミノ酸は、ロイシンとアルギニンとを含み、同じ親
水性の値を有する帯電していない極性へッドグループを備えたアミノ酸は、ロイ
シン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラリン、アスパラギン、グルタミン
、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンを含む。
本発明の範囲内には、ｍｃｐ−４のアリルが含まれる。本明細書中の記載例用
いられているように、「アリル」若しくは「アリル配列」は、ｍｃｐ−４の変化
した形である。アリルは、突然変異、即ち、核酸配列の変化から生じ、一般に、
その構造若しくは機能が変化したり変化しなかったりする変形したｍＲＮＡ若し
くはポリペプチドを産生する。任意の与えられた遺伝子は、対位形式を、持たな
いか、１つ持つか、複数個持つ。アリルを引き起こす共通の突然変異は、通常、
アミノ酸の削除、挿入、若しくは置換に起因する。これらのタイプの変化の各々
は、単独で、若しくは、他のものと組み合わされて、１つの与えられた配列内で
１回若しくは複数回生ずる。
本発明のヌクレオチド配列は、限定を意図するものではないが、遺伝子生成物
のクローニング、プロセッシング、及び／又は発現を変化させる変更をを含む様
々な理由によって、ｍｃｐ−４コーディング配列を変化させるために開発される
。例えば、突然変異は、当業者に良く知られた、例えば、部位特異的な変異誘発
といった技術を用いて、導入されて、新たな制限部位を挿入し、グリコシル化パ
ターンを変更し、コドンの優先を変えるために用いられても良い。
本発明の他の実施例では、ｍｃｐ−４の自然発生の、変形された、若しくは遺
伝子組換えによる配列が、合成タンパク質をコードするために、
非同相の配列と結合されても良い。例えば、ＭＣＰ−４活性のインヒビターに対
するペプチドライブラリーをスクリーニングするために、商業的に利用できる抗
体によって認識される非同相のエピトープを発現するキメラＭＣＰ−４タンパク
質をコードするのに有益である。合成タンパク質は、ＭＣＰ−４配列と、非同相
タンパク配列との間に配置された切断部位を含むように製造され、ＭＣＰ−４が
、非同相の半分（片割れ）から切断されて精製されても良い。
本発明の更に他の実施例では、ｍｃｐ−４のコード配列が、当業者に良く知ら
れた化学的な方法を用いて、全体若しくは一部が合成される（Ｓｅｅ Ｃａｒｕ
ｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｓｙｍｐ
Ｓｅｒ ７：２１５−２３３；Ｃｒｅａ ａｎｄ Ｈｏｒｎ（１９８０）Ｎｕ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ９：２３３１；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ａｎｄ Ｃａｒ
ｕｔｈｅｒｓ（１９８０）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２１：７１９；
ａｎｄ Ｃｈｏｗ ａｎｄ Ｋｅｍｐｅ（１９８１）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ ９：２８０７−２８１７）。代わりに、タンパク質それ自身が、化学的な方
法を用いて、生み出されて、ＭＣＰ−４アミノ酸配列を全体若しくは部分的に合
成することもできる。例えばペプチドは、固相技術を用いて合成され、分離用高
性能液体クロマトグラフによって樹脂から切断され、精製される（ｅｇ，Ｃｒｅ
ｉｇｈｔｏｎ（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ａｎｄ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ
Ｃｏ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。合成ペプチドの組成物は、アミノ酸分析若
しくはシーケンシングによって確認される（ｅｇ， ｔｈｅ Ｅｄｍａｎ ｄｅ
ｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，ｓｕｐｒａ）
。
直接ペプチド合成が、様々な固相技術を用いて実行され、（Ｒｏｂｅ
ｒｇｅ ＪＹ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２−２
０４）、自動化された合成が、例えばアプライド・バイオシステム４３１Ａペプ
チドシンセサイザを用いて、製造業者によって提供された命令に基づいて、行わ
れても良い。加えて、ＭＣＰ−４若しくはその任意の部分のアミノ酸配列が、直
接合成、及び／若しくは、その他のケモカイン配列若しくはその任意の部分と化
学的な方法によって組み合わされる合成の間に、変形されて、変異体ポリペプチ
ドが生成される。発現組織
生物学的に活性なＭＰＣ−４を発現させるために、ＭＣＰ−４若しくは機能的
に等価なものに対するヌクレオチド配列コードが、適切な発現べクター、即ち挿
入されたコード配列の転写及び翻訳のために必要なエレメントを含むべクター内
に挿入される。
当業者に良く知られた方法が用いられて、ＭＣＰ−４コード配列及び適切な転
写若しくは翻訳コントロールを含む発現べクターが構築される。これらの方法は
、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え若
しくは遺伝子組換えを含む。そのような技術は、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ
．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａ
ｉｎｖｉｅｗ ＮＹ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．（１９８９
）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ１
ｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹに記載
されている。
様々な発現べクター／宿主組織が用いられて、ｍｃｐ−４コード配列を含み且
つ発現するために用いられる。これらには、限定を意図するも
のではないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド若しくはコスミドＤＮＡ
発現べクターと共に変換されたバクテリア、イースト菌発現べクターと共に変換
されたイースト菌、ウィルス発現べクター（例えばバキュロウィルス）によって
感染させられた昆虫細胞組織、ウィルス発現べクター（例えばカリフラワーモザ
イクウィルス：ＣａＭＶ、タバコモザイクウィルス：ＴＭＶ）が移入された植物
細胞組織若しくはバクテリア発現べクター（例えば、Ｄｉ若しくはｐＶＲ３２２
プラスミド）と共に変換された植物細胞組織、若しくは動物細胞組織などが含ま
れている。
これらの組織の「制御エレメント」若しくは「調節シーケンス」は、それらの
長さ及び特異性が変化し、べクター、エンハンサー、プロモーター、及び３'非
翻訳領域の、転写及び翻訳を実行するために宿主細胞のタンパク質と相互作用を
起こす翻訳されていない領域、である。用いられたべクター組織及び宿主に応じ
て、構成性及び誘導性のプロモータを含む、任意の個数の適切な転写及び翻訳エ
レメントが、用いられても良い。例えば、バクテリア組織をクローニングする時
、誘導性プロモーターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ファージミド（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ ＣＡ）のハイブリッドｌａｃＺプロモータ、ｐ
ｔｒｐ−ｌａｃハイブリッド及びそれらに類似するもの等の、誘導性プロモータ
が用いられる。バキュロウィルス・ポリヘドリン・プロモーターが、昆虫の細胞
で用いられる。植物の細胞のゲノム（例えば、熱衝撃、ＲＵＢＩＳＣＯ、及び、
貯蔵タンパク質遺伝子）から導かれた、若しくは、植物ウィルス（例えば、ウィ
ルスプロモータ若しくはリーダー配列）から導かれたプロモータ若しくはエンハ
ンサが、べクター内にクローニングされる。ほ乳類の細胞組織内では、ほ乳類遺
伝子からの、若しくは、ほ乳類ウィルスからのプロモータが、最も適している。
ｍｃｐ−４の複数のコピーを含む細胞ラインを生み出す必要がある場合には、Ｓ
Ｖ４０
若しくはＥＢＶに基づくべクターが適切な選択可能なマーカーと共に用いられて
も良い。
バクテリア組織内では、多くの発現べクターが、ＭＣＰ−４に対して意図され
た使用目的に応じて選択される。例えば、ＭＣＰ−４の大量な抗体の誘導に対し
て必要とされるとき、既に精製された融合タンパク質の高いレベルの発現に対し
て指向性の高いべクターが望ましい。その様なべクターには、限定を意図するも
のではないが、Ｅ−ｃｏｌｉクローニング及び発現べクターＰｂｌｕｅｓｃｒｐ
ｉｒｉｐｔ （商標）（薄相遺伝子）があり、その中では、ｍｃｐ−４コーディ
ング配列がフレーム内のベクターへ、アミノ終端Ｍｅｔと、β−ガラクトシダー
ゼの後続の７個の残基とに対するシーケンスを伴って結合され、ハイブリッドタ
ンパク質が産生され、ｐＩＮべクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔ
ｅｒ （１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：５５０３−５５０９）、
及び、それらに類似するものが含まれている。また、ｐＧＥＸべクター（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）が、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（
ＧＳＴ）を伴った融合タンパク質として、異なるポリペプチドを発現するために
用いられる。一般的に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、吸収によっ
て溶解された細胞から容易に精製されて、グルタチオン−アガローズビーズとな
り、次に、自由なグルタチオンの存在下で溶出される。その様な組織内で作られ
たタンパク質は、ぺパリン、トロンビン若しくはファクタ−ＸＡプロテアーゼ切
断部位を含むように設計されていて、注目されているクローニングされたポリペ
プチドが、ＧＳＴの半分から必要に応じて切断されるようになっている。
イースト菌の中では、（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）、多くの、アルファ因子、アルコールオキシターゼ、及びＰ
ＢＨ等の構成性若しくは誘導性プロモータを含むべクターが用いられる。参考の
ために、「Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｓｕｐｒａ）ａｎｄ Ｇｒａｎｔ
ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−
５４４」が参照される。
植物の発現べクターが用いられる場合、ＭＣＰ−４コーディングシーケンスの
発現が、多数のプロモータの任意のものによってドライブされる。例えば、Ｃａ
ＭＶの３５Ｓ及び１９Ｓプロモータ等のウィルスプロモータ（Ｂｒｉｓｓｏｎ
ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１−５１４）は、単独で
、若しくはＴＭＶからのオメガリーダーシーケンスと組み合わされて、用いられ
る（Ｔａｋａｍａｔｓｕｅｔ ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ ６：３０７−
３１１）。代わりに、ＲＵＢＩＳＣＯの小さいサブユニットの様な植物プロモー
タ（Ｃｏｒｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ ３：１６７１−
１６８０；Ｂｒｏｇｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４
：８３８−８４３）、若しくは熱衝撃プロモータ（Ｗｉｎｔｅｒ Ｊ ａｎｄ
Ｓｉｎｉｂａｌｄｉ ＲＭ（１９９１）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ Ｃｅｌｌ
Ｄｉｆｆｅｒ １７：８５−１０５）が用いられる。これらの構成は、ＤＮＡ
トランスフォーメーション若しくは病原体仲介移入によって植物細胞内へ導入さ
れる。これらの記述を復習するために、「Ｈｏｂｂｓ Ｓ ｏｒ Ｍｕｒｒｙ
ＬＥ ｉｎ ＭｃＧｒａｗ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ ＮＹ，ｐｐ１９１−１９６ ｏｒ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓ
ｓｂａｃｈ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ
Ｙ，ｐｐ４２１−４６３」が参照される。
ｍｃｐ−４を発現するために用いることのできる他の発現組織は、昆虫の組織
である。その様な組織のあるもののうちで、「Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉｃａ」核酸ポリヘドロシスウィルス（ＡｃＮＰＶ）が、べクターとし
て用いられて、「Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ」細胞若しくは
「Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ」の幼生内の異なる遺伝子を発現するために用いら
れる。ｍｃｐ−４コーディング配列は、ポリヘドリン遺伝子等のウィルスの本質
的でない領域内にクローニングされ、ポリヘドリンプロモーターのコントロール
のもとで配置される。ｍｃｐ−４を成功裏に挿入することにより、ポリヘドリン
遺伝子が不活性的となり、コートタンパク質コートを持たない組換えウィルスを
作り出すことができる。次にこの組換えウィルスが、ＭＣＰー４が発現された「
Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ」細胞若しくは「Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ」幼生を
感染させるのに用いられる（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ Ｖｉｒ
ｏｌ ４６：５８４；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ ＥＫ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐ
ｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１：３２２４−７）。
ほ乳類の宿主細胞内では、多くのウィルスベースの発現組織が用いられる。ア
デノウィルスが発現べクターとして用いられる場合では、ｍｃｐ−４コーディン
ク配列が、遅いプロモータ及び３分節系リーダー配列から成るアデノウィルス転
移／翻訳コンプレックス内に結合される。ウィルスゲノムの本質的でないＥ１若
しくはＥ３領域内への挿入によって、感染させられた宿主細胞内のＭＣＰ−４を
発現することのできる生存可能なウィルスが達成される（Ｌｏｇａｎ ａｎｄ
Ｓｈｅｎｋ（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１：３６５
５−３６５９）。加えて、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）エンハンサ等の転移エ
ンハンサが、ほ乳類の宿主細胞内での発現を増加させるために用いられて
も良い。
特異的開始信号も、挿入されたｍｃｐ−４コーディング配列の効率の良い翻訳
のために必要とされる。これらの信号には、ＡＴＧ開始コドンと隣接する配列と
が含まれている。その開始コドン及び上流の配列と、ｍｃｐ−４とが適切な発現
べクター内に挿入されている場合では、更に翻訳制御信号を必要とすることはな
い。しかしながら、コーディング配列のみ、若しくはそのタンパク質のみが挿入
されている場合には、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の転移制御信号が必要とさ
れる。更に、開始コドンは、全体の挿入の転移を確実にするため、正しい読み出
しフレーム内になければならない。外因性の転移エレメントと開始コドンとは、
様々な由来源からのものであって良く、自然発生したもの及び合成されたものの
何れであっても良い。発現の効率は、細胞組織に適したエンハンサを含むことに
よって強化されても良い（Ｓｃｈａｒｆ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｒｅｓｕｌ
ｔｓ Ｐｒｏｂｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ２０：１２５−６２；Ｂｉｔｔｎｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５３：５１
６−５４４）。
更に、宿主細胞の系統は、挿入された配列の発現を変更する能力に応じて、若
しくは、所望の形に発現されたタンパク質を処理する能力に応じて、選択されて
も良い。その様なポリペプチドの変更は、限定を意図するものではないが、アセ
チル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、アシル化が含まれ
る。タンパク質の「プレプロ」形状を切断するポスト・トランスレーションプロ
セスは、正しい挿入、折り曲げ、及び／若しくは、機能に対して、重要である。
ＣＨＯ，ＨｅＬａ，ＭＤＣＫ，２９３，ＷＩ３８等の異なる宿主細胞は、特定の
セル機構及びそのポスト・トランスレーション活性に対する特性機構を有し、導
入された異質のタンパク質を正しく変更及び処理するすることを確実にす
るように選択される。
組換えタンパク質の長い期間に渡る高い収率の産生のためには、安定した発現
が好ましい。例えば、安定してｍｃｐ−４を発現する細胞ラインは、複製若しく
は内因性発現エレメントと、選択可能なマーカー遺伝子のウィルスの源とを含む
発現べクターを用いて転換される。べクターの導入に続き、細胞は栄養価の高い
培地において１日から２日の間成長させられ、その後、選択的な培地に切り替え
られる。選択可能なマーカーは、選択に対する耐性をもたらし、導入された配列
をそのＤＮＡへ安定して結合させた細胞の特定を可能とする。細胞の耐性凝集塊
は、その細胞のタイプに適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。
任意の数の選択組織が、転換された細胞ラインを修復するために用いることが
できる。これらには、限定を意図するものではないが、へルペスシンプレックス
ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｃｅｌｌ
１１：２２３）と、アデニンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗ
ｙ ｅｔ ａｌ． （１９８０）Ｃｅｌｌ ２２：８１７）遺伝子が含まれ、こ
れらの遺伝子は、各々ｔｋ−若しくはａｐｒｔ−細胞内で用いられる。更に、代
謝拮抗物質、抗生物質、若しくは除草剤に対する耐性が、選択の基準として用い
ることができ、例えば、ｄｈｆｒは、メトトレキセートに対する耐性をもたらし
（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ７７
：３５６７）、ｎｐｔはアミノグリコシド・ネオマイシン及びＧ−４１８に対す
る耐性をもたらし（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８
１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １５０：１）、ａｌｓ及びｐａｔは、クロスルフロ
ン及びフォスフィノトリシン・アセチル・トランスフェラーゼに対する耐性をも
たらす（Ｍｕｒｒｙ ｓｕｐｒａ）。更に別の選択できる遺伝子が記載され、例
えば、ｔｒｐＰは、
トリプトファン又はｈｉｓＤの代わりにインドールを細胞が用いることを可能と
し、ヒスチジンの代わりにヒスチノールを細胞が用いることを可能にする（Ｈａ
ｒｔｍａｎ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃ
ａｄ Ｓｃｉ ８５：８０４７）。最近では、目に見えるマーカーを用いること
が一般的になりつつあり、その理由は、βグルクロニダーゼ、アントシアニン、
及びルシフェリンが、トランスフォーマントを特定するためのみに用いられるだ
けでなく、特定のべクター組織の特徴である過渡的なタンパク質の発現若しくは
安定なタンパク質の発現の量を測定するためにも用いられるからである（Ｒｈｏ
ｄｅｓ ＣＡ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ
５５：１２１−３１）。ｍｃｐ−４を含む形質転換体の同定
マーカー遺伝子の発現の有無が、注目されている遺伝子の存在をも表すのであ
るが、その存在及び発現が確認されなければならない。例えば、ｍｃｐ−４がマ
ーカー遺伝子配列内に挿入されている場合、組換え細胞（ｍｃｐ−４を含む）が
、マーカー遺伝子の機能が存在しないことによって同定される。代わりに、マー
カー遺伝子が、信号プロモータの制御のもとで、ＭＣＰ−４シーケンスとタンデ
ムに配置されても良い。マーカー遺伝子の導入若しくは選択に対応する発現は、
通常、十分にｍｃｐ−４の発現を表す。
代わりに、ｍｃｐ−４及び発現ＭＣＰ−４に対するコーディング配列を含む宿
主細胞が、当業者に良く知られた様々な手続きによって、同定されても良い。こ
れらの手順は、限定を意図するものではないが、核酸若しくはタンパク質の検出
及び／若しくは測定に対する技術に対するメンブレン、溶液、若しくはチップベ
ースの技術を含む、免疫検定技術、
ＤＮＡ−ＤＮＡ若しくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション及びタンパク質
バイオ検定を含む。
ｍｃｐ−４ポリヌクレオチド配列の存在は、ＤＮＡ−ＤＮＡ若しくはＤＮＡ−
ＲＮＡハイブリダイゼーション若しくはアンプリフィケーション（プローブ、タ
ンパク質、若しくはｍｃｐ−４のフラグメントを用いる）によって検出できる。
検定に基づく核酸増幅には、ｍｃｐ−４ＤＮＡ若しくはＲＮＡを含むトランスフ
ォーマントを検出するためのｍｃｐ−４配列に基づくオリゴヌクレオチド若しく
はオリゴマーを用いることが含まれている。本明細書中で用いられている「オリ
ゴヌクレオチド」若しくは「オリゴマー」は、少なくとも約１０個のヌクレオチ
ド、多くの場合約６０個のヌクレオチドの核酸配列を表し、より好ましくは約１
５から３０のヌクレオチド、更により好ましくは約２０から２５個のヌクレオチ
ドを、プローブ若しくはアンプリマとして用いることのできる核酸配列を表して
いる。
ＭＣＰ−４タンパク質生成物の発現は、走化性若しくはＣａ＋＋移動度検定に
よって生物学的に、若しくはウエスタンブロット、酵素結合免疫検定（ＥＬＩＳ
Ａ）等において免疫学的に、評価することができる。
「Ｆａｌｋ ＷＲ ｅｔ ａｌ．」（１９８０，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ３３：２３９）は、最初に４８−ウェルのマイクロ走化性チャンバを
用いて、走化性の活性の評価に関して説明した。この検定では、発現されたケモ
カインは、ポリカーボネートフィルタの一方のサイドの媒体内に配置され、特定
の集団の細胞が、このフィルターの反対のサイドの同じ媒体内に懸濁された。十
分なインキュベート時間によって、細胞は、ケモカインの濃度勾配に応じてフィ
ルタを移動した。このフィルタが、各ウエルから回収され、ケモカインに面する
フィルタのサイドに張り付いた細胞が、分類され、計数された。
その様な検定で用いられる細胞の集団は、静脈穿刺によって得られる血球細胞
、若しくは、望まれない集団の表面の分子に特異的な抗体を用いた濃度勾配遠心
分離及び／若しくは負の選択によって得られた好中球周辺血液の単核細胞、及び
、リンバ球の栄養価の高い集団、を含む。例えば、ＣＤ４＋を伴うＴ細胞の集団
のインキュベートと、ＣＤ４＋と結合したＴ細胞の分離とが、ＣＤ８＋の栄養価
の高いＴ細胞の集団を結果としてもたらす。
好中球及び単核細胞の非走化性の活性を検定するために、試験には、アクチン
重合化、呼吸バーストの活性の増加、アズロフィリック・グラニュールの脱顆粒
、若しくはＣａ−−の流動化の測定が含まれ、且つそれらの測定の結果を標準的
な値と比較することが含まれている。シグナル導入の経路の一部としてのＣａ−
−の流動化に対する検定は、その発光特性がＣａ−−結合によって変更された蛍
光プローブを伴った好中球をプレロードすることを必要とする。細胞が活性化刺
激にさらされたとき、Ｃａ−−のフラックスが、蛍光計内の細胞の観察によって
求められる。Ｃａ−−の流動化の測定は、「Ｇｒｙｎｋｉｅｖｉｃｚ Ｇ ｅｔ
ａｌ．（１９８５）Ｊ Ｂｏｉｌ Ｃｈｅｍ ２６０：３４００，ａｎｄ Ｍ
ｃＣｏｌｌ Ｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５０：４５
５０−４５５５」に記載されており、この文献はここで言及したことにより本質
の一部とされる。
脱顆粒及び呼吸バースト反応は、単核細胞内で同じように測定される（Ｚａｃ
ｈａｒｉａｅ ＣＯＣ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７１
：２１７７−８２）。更に、単核細胞の活性の測定は、リンパ球内の吸着分子の
発現の調節である（Ｊｉａｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ １４８：２４２３−８；Ｔａｕｂ Ｄ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２６０：３５５−
３５８）。
タンパク質に対して特異的な多クローンの若しくは単核細胞の抗体のいずれか
を用いた、ＭＣＰ−４の発現を検出し測定するためのプロトコル様々なプロトコ
ルが、当業者には良く知られている。具体例が、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩ
ＳＡ）、放射性免疫検定（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣ
Ｓ）を含んでいる。ＭＣＰ−４の２つの非干渉エピトープに対して反応するモノ
クローナルな抗体を用いた、２部位モノクローナルベースの免疫検定が、実行さ
れるが、それと匹敵する結合検定が用いられても良い。これらの及びその他の検
定は、「Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０，Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．ＡＰＳ Ｐ
ｒｅｓｓ ，Ｓｔ Ｐａｕｌ ＭＮ）と、「Ｍａｄｄｏｘ ＤＥｅｔ ａｌ．（
１９９３，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １５８：１２１１）に記載されている。
様々なラベリング及び接合技術が当業者に知られており、且つ、様々な核酸及
びアミノ酸検定で用いられる。ｍｃｐ−４に関連する配列を検出するための、ラ
ベリングされたハイブリダイゼーション若しくはＰＣＲプローブを生み出すため
の手段は、オリゴラベリング、ニックトランスレーション、エンドラベリング、
若しくは、ラベリングされたヌクレオチドを用いるＰＣＲアンプリフィケーショ
ンを含む。代わりに、ｍｃｐ−４配列、若しくはそのある部分が、ｍＲＮＡプロ
ーブを生み出すためのべクター内にクローニングされても良い。その様なべクタ
ーは、当業者に知られており、商業的にも入手でき、Ｔ７、Ｔ３、若しくはＳＰ
６の様な適切なＲＮＡポリメラーゼと、ラベリングされたヌクレオチドとを加え
ることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＲＮＡプローブを合成するのに用いるこ
とができる。「Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ
（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）」、「Ｐｒｏｍｅｇａ （Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗ
Ｉ）」及び、「ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ （Ｃｌｅｖｅｌａｎ
ｄ ＯＨ）」の様な多くの会社が、市販されているキット及びそれらを使うため
のプロトコルを供給している。適切なリポーター分子若しくはラベルは、それら
の放射性核種、酵素、蛍光体、化学的ルミネッセント、若しくは発色剤と、基質
、補助因子、インヒビター、磁気粒子等を含む。そのようなラベルの使用方法を
開示する特許として、米国特許第３，８１７，８３７；３，８５０，７５２；３
，９３９，３５０；３，９９６，３４５；４，２７７，４３７；４，２７５，１
４９；４，３６６，２４１。更に、組換え免疫グロブリンは、米国特許第４，８
１６，５６７号に開示されいるように作ることができ、この米国特許はここで言
及したことにより本出願の一部とされたい。ＭＰＣ−４の精製
ｍｃｐ−４ヌクレオチド配列と共に転換された宿主細胞は、細胞培地からコー
ドされたタンパク質を発現し回収するのに適した条件の元で培養される。組換え
細胞によって生み出されたタンパク質は、分泌されても良く、細胞内に含まれて
も良く、これは、用いられた配列及び／若しくはべクターに応じて変えられる。
当業者には良く分かることであるが、ｍｃｐ−４を含む発現べクターは、特定の
真核細胞若しくは原核細胞の細胞膜を通したＭＣＰ−４の分泌を司る信号配列に
よって設計される。他の組換え合成も、ｍｃｐ−４を、可溶性タンパク質の精製
を容易にするポリペプチドのドメインをエンコードするヌクレオチド配列に接合
する（Ｋｒｏｌｌ ＤＪ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ １２：４４１−５３）。
ＭＣＰ−４は、タンパク質の精製を容易にするために加えられた１つ
若しくは複数の追加のポリペプチドドメインを備えた組換えタンパク質として発
現されても良い。その様な精製はドメインを容易にし、限定を意図するものでは
ないが、固定化された金属に対する精製を可能とするヒスチジン−トリプトファ
ンのような金属キレート化べプチド、固定化された免疫グロブリンに対する精製
を可能とするタンパク質Ａドメイン、及び、ＦＬＡＧＳ拡張／親和性精製システ
ム（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ，Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）で用いられるドメイン
を含む。精製ドメインとＭＣＰ−４との間のファクターＸＡ若しくはエンテロキ
ナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）の様な切断可能な
リンカ配列を含むことは、精製を容易にするのに有効である。ＭＣＰ−４の使用
ＭＣＰ−４は、配列がＭＣＰ−１に類似し、ＮＩＤＤＭ膵臓に発現する点で、
全身性防御において或る役割を果たしているように見える。従って、ＭＣＰ−４
の迷走性発現に起因する疾患の治療に、ＭＣＰ−４の活性を調整（ｍｏｄｕｌａ
ｔｅ）する抗ＭＣＰ−４抗体、又はその他のポリペプチド、タンパク質或いは有
機分子を用いることができる。治療用分子は、ＮＩＤＤＭなどのＭＣＰ−４に関
連する疾患状態の治療に適用することができる。本発明の別の実施例によれば、
ＮＩＤＤＭに生物化学的に類似する症状又は疾患の予防又は治療に、ＭＣＰ−４
の活性を中性化し得る抗ＭＣＰ−４抗体を用いることができる。抗体、ポリペプ
チド、その他の分子が、ＭＣＰ−４の効果を調整する能力は、上記したマイクロ
ケモタキシス或いはＣａ＋＋フラックスアッセイを用いることにより測定するこ
とができる。実際、試験管中において、標準的な応答を調整量と比較することに
より、様様な治療用分子の有用性を評価することができる。
ＭＣＰ−４の抗体の製造のために本技術分野に於いてよく知られた手順を用い
ることができる。このような抗体は、限定的ではないが、ポリクロナル、モノク
ロナル、キメリック、単鎖、Ｆａｂフラグメント及びＦａｂ発現ライブラリによ
り生成したフラグメントを含む。中性化用抗体、すなわちＴＣＰ−４の生物学的
活性を抑制するものが、治療及び診断用に適している。
抗体の製造に際しては、山羊、ウサギ、ラット、マウスなどのさまざまなホス
トに、ＭＣＰ−４または免疫原性特性を保持するその一部、フラグメントまたは
オリゴペプチドを注入することによって免疫を与える。ホストの種に応じて、抗
体学的な反応を増大させるためにさまざまなアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）
を用いることができる。このようなアジュバントとしては、限定的ではないが、
Ｆｒｅｕｎｄ'ｓ、水酸化アルミニウムなどの鉱物性ゲル、リソレシチン、プル
オニック・ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホ
ール・リンピッド・へモシアニン及びジニトロフェノールなどの界面活性剤が含
まれる。白血球の増殖を刺激するために免疫不全の人に精製ＭＣＰ−４を投与す
る場合、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｉ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）及びＣｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍは、利用可能な潜在的に有用な人用
アジュバントである。
培養体内に於ける連続的なセルラインによる抗体分予の製造のためのあらゆる
技術を用いてＭＣＰ−４に対するモノクロナル抗体を生成することができる。こ
れらの方法としては、限定的ではないが、元々はＫｅｏｈｌｅｒら（１９７５
Ｎａｔｕｒｅ ２５６；４９５−４９７）によるヒブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏ
ｍａ）技術、ヒトＢ−セルヒブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら， １９８５ Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ８１；３１−４２； Ｃｏｔｅら， １９８
３ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａ
ｄ Ｓｃｉ ８０；２０２６−２０３０）及びＥＢＶヒブリドーマ技術（Ｃｏｌ
ｅら，１９８４Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ６２；１０９−１２０）が含まれ
る。さらに、「キメリック抗体」を製造するために開発された技術、マウス抗体
遺伝子を、人の抗体遺伝子にスプライスして、適切な抗体特異性及び生物学的活
性を備えた分子を得る方法などを用いることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，１
９８４ Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ ８１； ６８５１−６８５５；
Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，１９８４ Ｎａｔｕｒｅ ３１２； ６０４−６０８
； Ｔａｋａｄａら，１９８５ Ｎａｔｕｒｅ ３１４； ４５２−４５４）。
或いは、単鎖抗体を製造するために記述された技術（ＵＳＰ ４，９４６，７７
８）を適合させて、MCP−４特異性単鎖抗体を製造するために用いることができ
る。
リポサイト内に於いて生体内製造を引き起こしたり、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９
８９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８６；３８３３−３８３７）或
いはＷｉｎｔｅｒ Ｇ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ（１９９１； Ｎａｔｕｒｅ
３４９； ２９３−２９９）などによって開示されるような高度に特異性の結合
リエージェントの組換え型免疫グロブリンライブラリまたはパネルを選別するこ
とにより製造することができる。
ＭＣＰ−４のための変異性結合サイトを含む抗体フラグメントを製造すること
もできる。例えば、そのようなフラグメントとしては、限定的ではないが、抗体
分子のペプシン消化により生成されるＦ（ａｂ’）２フラグメントや、Ｆ（ａｂ
’）２フラグメントのジスルフィドブリッジを還元して製造されたＦａｂフラグ
メントがある。Ｆａｂ発現ライブラリは、所望の特異性を有するモノクロナルＦ
ａｂフラグメントを迅速かつ容易に同定させるために構成することができる（Ｈ
ｕｓｅら，１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６；１２７５−１２８１）。
ＭＣＰ−４特異性抗体は、ＭＣＰ−４の発現に関連する症状或いは疾
患の診断のために有用である。当該技術分野に於いては、すでに確立された特異
性をもってポリクロナルまたはモノクロナル抗体を用いて競合的結合或いは免疫
放射定量測定法を行うさまざまなプロトコルが知られている。このようなアッセ
イは、通常ＭＣＰ−４とその特異性抗体（又は同様なＭＣＰ−４結合分子）との
複合体の形成及び複合体の形成量の測定を伴う。特異性ＭＣＰ−４タンパク質上
に於ける２つの互いに干渉しないエピトープに対して反応する２−サイト・モノ
クロナル抗体に基づくアッセイを行うことが好ましいが、競合的結合アッセイを
用いることもできる。このようなアッセイがＭａｄｄｏｘ ＤＥら（１９８３，
Ｊ ＥｘｐＭｅｄ １５８；１２１１）に記載されている。
ＭＣＰ−４特異性抗体を用いた診断的アッセイ
ＭＣＰ−４の迷走性発現により特徴づけられる症状、障害或いは疾病の診断の
ために特定のＭＣＰ−４抗体が有用である。ＭＣＰ−４のための診断用エッセイ
は、人の体液、セル、組織またはそのような組織からの抽出物に於いて、ＭＣＰ
−４を検出するためにラベル及び抗体を用いる方法を含む。本発明のポリペプチ
ド及び抗体は、変更を加えずに用いることができる。多くの場合、ポリペプチド
及び抗体は、リポーター分子と共有結合的にまたは非共有結合的に結合すること
によりラベル付けされる。広い範囲のリポーター分子が知られており、そのいく
つかについて以下に記載する。
特定のタンパク質について特異的なポリクロナルまたはモノクロナル抗体を用
いたＭＣＰ−４を測定するためのさまざまなプロトコルが知られている。そのよ
うな例としては、酵素リンク・イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射
免疫検定法（ＲＩＡ）、蛍光活性化セル選別法（ＦＡＣＳ）がある。特異性ＭＣ
Ｐ−４タンパク質上に於ける２つの互いに干渉しないエピトープに対して反応す
る２−サイト・モノクロナ
ル抗体に基づくアッセイを行うことが好ましいが、競合的結合アッセイを用いる
こともできる。このようなアッセイがＭａｄｄｏｘ ＤＥら（１９８３， Ｊ
Ｅｘｐ Ｍｅｄ １５８；１２１１）に記載されている。
疾病の診断の基礎を提供するために、通常のまたは標準的なＭＣＰ−４発現値
を確立しなければならない。これは、動物または人であってよい、通常の対象か
ら得られた体液または細胞を、よく知られた複合体生成に適する条件下に於いて
ＭＣＰ−４に対する抗体と混合することにより達成される。標準的な複合体形成
量は、既知の濃度を有する精製ＭＣＰ−４と既知量の抗体を混合する際に於ける
、一連の希釈量の、コントロールされた濃度と比較することにより定量化される
。このようにして、通常のサンプルから得られた標準値を、ＭＣＰ−４の発現に
関連する疾病に冒されたかもしれない対象から得られたサンプルの値と比較する
。標準値と対象から得られた値との偏差から、疾病状態の有無を判定することが
できる。薬剤の選別
ＭＣＰ−４、その触媒的または抗体学的フラグメントまたはオリゴペプチドを
、さまざまな薬剤選別技術のいずれに於いても、治療用組成体を選別するために
用いることができる。このようなテストに用いられるフラグメントは、溶液内に
遊離していたり、固体支持体に固定されていたり、細胞面に支持されていたり、
或いは細胞間に位置するものであってよい。ＭＣＰ−４とテストされるエージェ
ントとの間の結合複合体の形成または触媒的活性の廃絶を測定することができる
。
別の薬剤選別技術によれば、ＭＣＰ−４ポリペプチドに対して適当な結合親和
を有する高スループット選別を可能にするもので、その詳細が１９８４年９月１
３日に公開されたＥＰ特許出願第８４／０３５６４号
に詳しく記載されており、それについて言及することをもって、その内容を本出
願の一部をなすものとする。要するに、多数の異なる小さなペプチドテスト組成
体を、プラスチックピンその他の表面などの固体基層上に合成することができる
。ペプチドテスト組成体はＭＣＰ−４フラグメントと反応し、洗浄される。結合
されたＭＣＰ−４は、当該技術分野で良く知られた方法により検出される。精製
ＭＣＰ−４は、上記した薬剤選別技術のために利用されるべく直接板上に塗布さ
れるものであってよい。或いは、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定
するために非中和性の抗体を用いることができる。
本発明は、ＭＣＰ−４に結合得る中和性抗体が、ＭＣＰ−４の結合をテスト組
成体と競うようにして競合的薬剤選別アッセイを利用することも考慮するもので
ある。このようにして、抗体を用いて、ＭＣＰ−４と、１つ又は複数の抗原性決
定子を共有するぺプチドの有無を検出することができる。ｍｃｐ−４ポリヌクレオチドの利用
ポリヌクレオチドｍｃｐ−４またはその任意の部分を、診断及び／または治療
の目的で使用することができる。診断のためには、本発明のｍｃｐ−４が、ＭＣ
Ｐ−４の活性が明らかとなるような疾病や状態における異常な遺伝子発現の検出
や定量のために、本発明のｍｃｐ−４を用いることができる。このような疾病状
態には、ウィルス感染、バクテリア感染、真菌感染または寄生虫様の感染や、ア
レルギーまたは喘息反応、外傷による機械的損傷、動脈硬化症、アテローム発生
や膠原病、慢性関節リウマチのような遺伝病や、リンパ腫や癌腫、または白血球
、特に単球、マクロファージ、及びＴ細胞が関与する疾病状態が含まれるがこれ
らに限定されるものではない。本発明の範囲には、オリゴヌクレオチド
配列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びリボザイムが含まれ、これらは
ＭＣＰ−４の翻訳を抑制する機能を有する。
本発明の別の形態では、ＭＣＰ−４をコードするゲノムの配列または近縁関係
を有する分子を含むポリヌクレオチド配列が検出できるＰＣＲプローブ及びハイ
ブリダイゼーションプローブが提供される。プローブの特異性は、そのプローブ
が高度に特異的な領域、例えば５′調節領域における１０個の独特なヌクレオチ
ドから作られたものであっても、特異性のあまり高くない領域、例えば３′領域
から作られたものであってもよく、ハイブリダイゼーションまたは増幅の厳密性
（最高レベル、高レベル、中レベル、または低レベル）により、このプローブが
自然発生ｍｃｐ−４のみを同定しているか、ｍｃｐに近縁の配列や他のケモカイ
ン分子をも同定しているかが決定される。ｍｃｐ−４ポリヌクレオチドの診断のための利用
ｍｃｐ−４ポリヌクレオチド配列を、ｍｃｐ−４の異常発現を伴う疾病状態の
診断に用いることができる。例えば、ＭＣＰ−４をコードするポリヌクレオチド
配列を、ｍｃｐ−４発現を検出するための生体組織検査または死亡組織検査で採
取された組織や体液のハイブリダイゼーションまたはＰＣＲアッセイにおいて使
用することができる。このような定量的または定性的方法の形態は、サザン法に
よる分析またはノーザン法による分析、ドットブロット、または他のメンブラン
を用いる技術、ＰＣＲ技術、浸漬スティック、ピン、チップ及びＥＬＩＳＡ技術
に含まれる。このような技術は全て周知のものであり、多くの市販の診断キット
の技術的基礎である。
このようなアッセイを、動物実験、臨床的治験、または個々の患者の治療のモ
ニタにおいて特定の治療的処置の効率を評価するのに用いてもよい。疾病診断の
ための基準を提供するために、ｍｃｐ−４発現の通常
のまたは標準のプロフィールが確立されていなければならない。これは、ヒトま
たは動物の何れかである通常の被験者から得られた体液または細胞の抽出物と、
ｍｃｐ−４またはその部分とを、ハイブリッド形成または増幅に適した条件の下
で結合するとによって達成される。標準ハイブリダイゼーションは、通常の治験
者から得られた値と、既知の量の精製ｍｃｐ−４が用いられる同じ実験で得られ
る一連の希釈ポジティブコントロールからえられる値のそれぞれとを比較するこ
とにより定量される。通常のサンプルから得られた標準値は、ｍｃｐ−４発現が
関与するような疾病を患う患者のサンプルから得られた値と比較される。標準値
と被験者の値の差が、疾病の存在を証明することになる。
ひとたび疾病の存在が確認されると、治療薬が投与され、治療プロフィールが
作成される。このようなアッセイは定期的に反復して行うことにより、プロフィ
ールの進行に際して値が通常のまたは標準のパターンに向かっている、若しくは
回復しているか否かを評価することができる。うまくいった治療のプロフィール
を用いて、数日または数ケ月の期間に亘る治療の効果を示すことができる。
米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，９６５，１８８号明細書に記載の
ＰＣＲ法を用いて、ｍｃｐ−４配列に基づくオリゴヌクレオチドの追加の利用法
が得られる。このようなオリゴマーは、一般的に化学的に合成されるが、このよ
うなオリゴマーを酵素を利用して作り出したり、組み換え体を起源として産生し
てもよい。オリゴマーは一般に一方はセンス方向（５′→３′）、もう一方はア
ンチセンス（３′←５′）である２つのヌクレオチド配列を含み、特定の遺伝子
の同定または特定の状態の同定のために最適化された条件の下で利用される。こ
の２つのオリゴマーは入れ子になったオリゴマーの組若しくは縮退したオリゴマ
ーのプールであって、厳密性の高くない条件の下で近縁関係にあるＤＮ
ＡまたはＲＮＡ配列の検出及び／または定量のために利用される。
更に、特定の分子の発現の定量のための方法としては、ヌクレオチドの放射標
識（Melby PC et al 1993 J Immunol Methods 159:235-44）またはビオチン標識
（Duplaa C et al 1993 Anal Biochem 229-36)、対照標準の核酸との同時増幅（
coamplification）、及び実験結果を補間した標準的な曲線を用いる方法がある
。多数のサンプルの定量では、興味の対象であるオリゴマーが様々な希釈液の中
に存在し、分光光度的若しくは比色定量的な反応によって高速の定量が行えるＥ
ＬＩＳＡ形式のアッセイを行うことによって定量のスピードを速くすることがで
きる。例えば、ｍｃｐ−４のアップレギュレートの結果、炎症反応が生じたり、
膨潤や不快感が生ずる。同様に、ｍｃｐ−４の過小発現により、免疫反応が不十
分になることがある。何れの場合においても、決定的な診断によって、医療従事
者が、患者を治療したり病状が悪化するのを防ぐことが可能となる。同様に、当
業者に周知のアッセイにより、ｍｃｐ−４関連疾病を患う患者の治療中の病状の
進行をモニタすることが可能である。ｍｃｐ−４ポリヌクレオチドの治療的利用
ｍｃｐ−４配列は、種々の異常状態の治療に役立つ。細胞にｍｃｐー４配列を
導入することによって、遺伝子治療により、ｍｃｐ−４の過小発現によって特徴
づけられる疾病状態を治療することができる。場合によっては、ＭＣＰ−４をコ
ードしている配列は、機能不全の内生遺伝子と置換されるか、代替物として機能
する。
レトロウィルス、アデノウイルス、へルペスあるいは バクシニアウイルスか
、あるいは種々のバクテリアのプラスミドに由来する発現ベクターを、目標の細
胞集団に組換えｍｃｐ−４や、センス分子またはアンチセンス分子を供給するた
めに用いることができる。当業者に周知の方法を用いて、ｍｃｐ−４を含む組換
えべクターを作ることができる。例
えば、上述のＭａｎｉａｔｉｓ等の論文やＡｕｓｕｂｅｌ等の論文に記載された
技術を参照されたい。別形態として、組換えｍｃｐ−４をリポソームで標的細胞
に供給することができる。
完全長ｃＤＮＡ配列及び／またはその調節エレメントを含むポリヌクレオチド
を、研究者が、遺伝子機能のセンス調節（Youssoufian H andHF Lodish 1993 Mo
l Cell Biol 13:98-104）またはアンチセンス調節（Eguchi et al （1991）Annu
Rev Biochem 60:631-652）の調査用の道具として利用することが可能である。
ゲノムＤＮＡから得られたｃＤＮＡや調節配列から設計されたオリゴヌクレオチ
ドをｉｎ ｖｉｔｒｏやｉｎ ｖｉｖｏで用いて、発現を抑制することができる
。このような技術は現在周知であり、センスまたはアンチセンスオリゴマー、ま
たはより大きい断片が、コード領域または調節領域に沿った様々な位置に配置さ
れるようにデザインすることができる。
ｍｃｐ−４は、所望のｍｃｐ−４フラグメントを高いレベルで発現する発現べ
クターを含む細胞または組織を形質移入することによって発現不可能な状態にさ
れ得る。このような構造物は、翻訳不能のセンス配列またはアンチセンス配列を
備えたフラッド（flood）細胞であり得る。このようなべクターは、ＤＮＡに組
み込まれなくても内在性のヌクレアーゼにより全てのコピーが機能を失うまでＲ
ＮＡ分子の転写を継続する。過渡的な発現は、非複製べクターと共に１ヶ月以上
継続し（Mettler I, personal communication）、適当な複製エレメントがべク
ター系の一部である場合には、更に継続し得る。
他方、適切な生殖系列の細胞、好ましくは接合体を、ｍｃｐ−４フラグメント
を含むべクターで安定的に形質転換することによって、遺伝子組換え生物体（米
国特許第４，７３６，８６６号）を作り出すことができる。この生物体は、内生
ｍｃｐ−４遺伝子の活性を、完全に排除する
か、著しく損なうに十分なセンスあるいはアンチセンス配列のコピーを作り出す
。多くの場合、このような遺伝子の分裂は、炎症反応の減少や白血球増殖の低下
のような挙動を観察することにより確認できる。
上述のように、ｍｃｐ−４の調節領域、即ちプロモータ、エンハンサ、及びイ
ントロンに対するアンチセンス配列をデザインすることによって遺伝子の発現を
変化させることができる。転写開始部位、例えばリーダー配列の−１０から＋１
０の間の領域に由来するオリゴヌクレオチドが好適である。アンチセンスＲＮＡ
及びＤＮＡ分子は、転写物のリボゾームへの結合を妨げることによりｍＲＮＡの
翻訳をブロックするようにも設計され得る。同様に、「トリプルヘリックス」塩
基対法としても知られている、Ｈｏｇｅｂｏｏｍ塩基対法を用いて抑制を達成す
ることもできる。トリプルヘリックス対合は、二重螺旋がポリメラーゼ、転写因
子、または調節分子が結びつくだけ十分にほどける能力を損なう。 リボザイム
は、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素性のＲＮＡ分子である。リボザイムの
作用の仕組みは、リボザイム分子と相補的な標的ＲＮＡとの配列特異的ハイブリ
ダイゼーションの後、ヌクレオチド鎖切断が行われる。本発明の範囲には、ｍｃ
ｐ−４ＲＮＡ配列のヌクレオチド鎖切断を特異的かつ効率的に触媒し得る工学的
処理をなされたハンマーへッドモチーフリボザイム分子が含まれている。
標的となり得る任意のＲＮＡ上にある特異的リボザイム切断部位は、以下の配
列、ＧＵＡ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位を標的の分子でスキ
ャンすることによって初めに同定された。ひとたび同定がなされると、その切断
部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮ
Ａ配列がオリゴヌクレオチドの作動不可能にし得る疑似構造の特徴が評価される
ことになる。標的として適切な候補がどの程度適切かは、リボヌクレアーゼ防護
アッセイを用いて
相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する接触性を試験することによ
っても評価され得る。
本発明のアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ、及びリボザイムは、周知のＲＮＡ分
子合成法を用いて調製され得る。このような方法には、固相ホスホラミダイト化
学合成のようなオリゴヌクレオチドの化学的な合成技術が含まれる。この他、Ｒ
ＮＡ分子は、ＵＢＣＰをコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖ
ｉｖｏの転写によって作ることができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７または
ＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモータを有する様々なべクターに
組み込まれ得る。この他、アンチセンスＲＮＡを構成的にまたは誘導的に合成す
るアンチセンスｃＤＮＡ構成物も細胞系、細胞または組織に導入することができ
る。
ＤＮＡ分子は、細胞内安定性及び半減期を長くするように変えることができる
。可能な変更としては、分子の５′末端及び／または３′末端にフランキング配
列を追加することや、分子のバックボーンの内部でホスホジエステラーゼ結合で
はなく２′Ｏ−メチルやホスホロチオネートを用いることが挙げられるが、これ
らに限定されない。
べクターを細胞または組織に導入する方法としては、後に論ずる方法があり、
この方法はｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの治療に対し
ても同様に適切なものである。ｅｘ ｖｉｖｏの治療法では、べクターは患者か
ら取られた幹細胞の中に導入され、同じ患者に戻す自家移植のためクローンとし
て増殖されるという方法は、米国特許第５，３９９，４９３号及び米国特許第５
，４３７，９９４号明細書に記載されており、ここではこれを参照されたい。
更に、ここに開示したｍｃｐ−４ポリヌクレオチド配列をまだ開発されていな
い分子生物学の技術に、その新しい技術はトリプレット遺伝暗
号や特異的塩基対相互作用のような特徴等を含む現在周知のヌクレオチド配列の
特性に基づいたものであるならば、その技術にこれを適用することができる。近縁なポリヌクレオチド配列の検出とマッピング
ｍｃｐ−４に対する核酸配列は、前述のように自然発生ゲノム配列のマッピン
グ用のハイブリダイゼーションプローブを作り出すためにも使用することができ
る。この配列を、特定の染色体または染色体の特定の領域へ、周知の技術を用い
てマッピングすることができる。このような技術には、染色体のスプレッド（sp
read）へのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、フローソートされた（flow
-sorted）染色体の調製、または酵母菌人工染色体、細菌性人工染色体、細菌性
Ｐ１構造体、またはＰｒｉｃｅ ＣＭ（1993;Blood Rev 7:127-34）やＴｒａｓ
ｋ ＢＪ（1991;Trends Genet 7:149-54）において研究されているような１個の
染色体ｃＤＮＡライブラリのような人工染色体構築物が含まれる。
染色体調整物のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び確立された染色体
マーカーを用いる連関分析のような物理的マッピング技術は、遺伝地図の延長に
おいて非常に重要である。ヒトゲノムのＳＴＳベースの地図の最近の例には、th
e Whitehead-MIT Center for Genomic Research（Hudson TJ et al（1995） Sci
ence 270:1945-1954）から最近出版されたものがある。マウスのような他のほ乳
類の染色体上の遺伝子の配置から、たとえ特定のヒト染色体の数またはアーム（
arm）が未知の場合でも、関連のあるマーカーがわかることが多い（Whitehead I
nstitute/MIT Center for Genome Reasearch，Genetic Map of the Mouse，Data
base Release 10，April 28，1995）。物理的マッピングにより新たな配列を染
色体アーム、またはその部分に割り当てることができる。これによって、位置的
なクローニングまたは他の遺伝子発見技術を用いる疾病遺伝子の
調査を研究者が行う際の有益な情報が得られる。血管拡張性失調症（ＡＴ）のよ
うな疾病または症候群が、例えばＡＴと１１ｑ２２−２３（Gatti et al（1988
）Nature 336:577-580）との連関のような特定のゲノム領域との遺伝子の連関に
より大体の位置が求められると、その領域に対する配列マッピングが、他の調査
用の関連する遺伝子または調節遺伝子を表すことになる。本発明のヌクレオチド
配列を、健常者、キャリア若しくは罹患者における転位や逆位によって生じた染
色体の位置の相違を検出するのにも用いることができる。医薬品組成物
本発明の活性な組成物には、ＭＣＰ−４の全体あるいはその部分や、抗体やア
ゴニストを含むＭＣＰ−４に結合するインヒビターが含まれる。このような組成
物は、単体で用いられるか、若しくはそれに安定化剤化合物のような他の薬剤を
少なくとも１種類組み合わせて用いられる医薬品組成物であって、滅菌された生
体適合性の医薬品用の担体に入れて投与されうる。このような担体には、生理食
塩水、緩衝剤で処理された生理食塩水、ブドウ糖及び水などが含まれる。
ＭＣＰ−４は、単体で、または他の薬剤、薬物またはホルモンと組み合わせて
、賦形剤または薬学的に許容される担体に混合された医薬品組成物の形態で患者
に投与され得る。本発明の一実施例では、この薬学的に許容される担体が、薬学
的に不活性なものである。
治療される病状や疾患や疾病によって、これらの医薬品組成物は配合され、局
所的に、あるいは全身に投与される。このような配合及び投与のための技術の詳
細は、”Remington's Pharmaceutical Sciences”（Maack Publishing Co，East
on PA）の最新版に記載されている。適当な投与経路には、例えば、経口投与、
経膣投与、経粘膜投与等があり、非経口的な投与方法には、筋肉内投与、皮下投
与、髄内投与、くも膜下腔内投
与、脳室内投与、静脈内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与が含まれる。ＭＣＰー４
やそのインヒビターの投与経路として好適なのは、静脈内投与である。
注射による投与のため、本発明の医薬品組成物は、水溶液、好ましくはハンク
溶液、リンガー溶液、または病理学的に緩衝剤で処理された生理食塩水のような
病理学的に適合性の緩衝液に配合される。組織や細胞への投与のため、浸透され
る特定のバリアに対する適切な浸透剤を配合しても良い。このような浸透剤は従
来より周知である。
経口投与用の医薬品組成物は、周知の薬学的に許容性の担体を用いて経口投与
に適した投与量で配合される。このような単体により、医薬品組成物が錠剤、丸
剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等の形態で患
者が経口摂取できるように配合される。
本発明における使用に適切な医薬品組成物は、意図した目的を達成するために
効果的な量だけ活性成分が含まれた組成物を含む。効果的な投与量の決定法は当
業者に周知である。
これらの医薬品組成物は、活性成分のほか適当な薬学的に許容性の担体を含み
得る。このような担体には、賦形剤及び活性化合物を薬学的に使用可能な調製物
に変える処理を促進する補助剤が含まれる。経口投与のために配合された医薬品
組成物が錠剤、糖衣錠、カプセル、液体の形態でありうる。
本発明の医薬品組成物は、従来より周知の方法、例えば従来の混合、溶解、粉
砕、糖衣形成（dragee-making）、湿式粉砕、乳化、カプセル化、包入または親
液化処理によって製造され得る。
非経口性投与のための医薬品製剤は、活性化合物の水溶液を含む。更に、活性
化合物の懸濁液は、適当な油性の注射懸濁液として調合される。適切な親油性溶
剤または溶媒は、ごま油のような脂肪油、オレイン酸エ
チルまたはトリグリセリド、またはリポゾームのような合成脂肪酸エステルを含
む。液体注射懸濁液は、懸濁液の粘性を高める物質、例えばナトリウムカルボキ
シメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストリンを含み得る。所望に応
じて、この懸濁液が化合物の可溶性を高め、高濃度の溶液の調合物ができるよう
にするための適切な安定化剤が加えられる。
経口的に使用するための薬学的製剤は、活性化合物と固体の賦形剤とを配合し
たり、所望に応じて得られた混合物を粉砕し、顆粒剤の混合物を処理することに
よって得られるが、この前に必要ならば錠剤や糖衣錠のコアを得るために適切な
補助剤が加えられる。適当な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトール
、またはソルビトールを含む糖、コーンスターチ、コムギ、コメ、ジャガイモ、
または他の植物、及びメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース
、またはナトリウムカルボキシメチルセルロース、及びアラビアゴム及びトラガ
カントゴムを含むゴム、及びゼラチンやコラーゲンのようなタンパク質のような
炭水化物またはタンパク質賦形剤である。必要ならば、架橋されたポリビニル−
ピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸
の塩のような崩壊剤または可溶化剤が添加される。
糖衣錠のコアは、濃縮された糖の溶液のような適切なコーティングで被覆され
るが、このようなコーティングにはアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリド
ン、カルボポルゲル（Carbopol gel）、ポリエチレングリコール、及び／または
二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機溶媒または溶媒混合物が含まれ得る
。色素またはピグメントが、生産物の識別のため、または活性化合物の量、即ち
投与量を明示するために錠剤または糖衣錠のコーティングに添加される。
経口的に使用され得る医薬品製剤には、ゼラチン製のプッシュフィッ
トカプセルや、ゼラチン製の密閉カプセル及びグリセロールまたはソルビトール
のようなコーティングが含まれる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースま
たはスターチのような賦形剤若しくは結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネ
シウムのような潤滑剤、及び所望に応じて安定化剤と共に混合された活性化成分
を含み得る。ソフトカプセルの場合は、活性化合物が適当な液体、例えば脂肪油
、液体パラピン、または液体ポリエチレングリコールに、安定化剤を所望に応じ
て加えたものに分解または懸濁される。
薬学的に許容される担体に配合された本発明の化合物を含む組成物は、調製さ
れて、適当なコンテナに入れられ、指定された状態の治療のためにラベル付けさ
れる。ＭＣＰ−４インヒビターの場合は、ラベルに表示された指定の状態には、
炎症の治療が含まれる。
この医薬品組成物は、塩として提供され、様々な酸と共に形成され得る。この
ような酸の例には、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等が
あるがこれらに限定されない。塩は、水または他の対応する遊離塩基形態である
プロトニック溶媒においてより可溶性を高める傾向がある。他の場合、好適な製
剤は、４．５〜５．５のｐＨ値の範囲で、１〜５０ｍＭヒスチジン、０．１〜２
％スクロース、２〜７％マニトールに未使用の緩衝液に結合された形態の親液性
粉末であり得る。
任意の化合物において、治療的に効果的な投与量は、初めに細胞培地のアッセ
イで推定され得る。次いで好ましくは動物モデルにおいて、ＭＣＰ−４レベルの
調節に望ましい循環濃度の範囲を達成するための投与量が配合されうる。このよ
うにして得られた情報を用いて、ヒトに対する効果的な投与量及び投与経路が決
定され得る。ＭＣＰ−４または、そのインヒビターの治療的投与の研究において
有用な動物モデルの例は、Ｈｕｔｚ （１９８９） Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎ ４０
：７０９−７１３： Ｈｕｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｊ Ｍｅｄ Ｐｒ
ｉｍａｔｏｌ １９：５５３−５７１ ’Ｋｉｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ． （
１９９２） Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ ２６８：１９１−Ｉ ９６；
ａｎｄ Ｑｕａｎｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ
４８：１０８８−１０９４に記載されている。
治療に効果的な投与量とは、症状または状態を寛解するようなＭＣＰ−４また
はそのインヒビターの量を指す。治療的な効果及びこのような化合物の毒性決定
は、細胞培地での標準的な薬学的手順または実験動物によって行われ、例えばＥ
Ｄ５０（集団の５０％に治療的な効果をもたらす投与量）及びＬＤ５０（集団の
５０％が死に至る投与量）が決定される。治療的効果をもたらす投与量と毒作用
を与える投与量との比は治療係数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０として表わ
される。医薬品組成物は大きな治療係数を示すものが好ましい。細胞培地アッセ
イ及び実験動物の研究から得られたデータは、ヒトに投与される投与量の範囲を
計算するのに用いられる。このような化合物の許容量は、毒性がごくわずか若し
くは全くないＥＤ５０の投与量だけを含む循環濃度の範囲内にあるのが好ましい
。投与量は、使用される薬用量、患者の感受性、及び投与経路に応じてこの範囲
内で様々に変えられる。
正確な投与量は、患者の治療に当たっている外科医個人によって選択される。
投与量及び投与方法は、十分なレベルの活性成分を与えるように、または望まし
い効果を維持するように調節される。追加の考慮されるべき要因には、疾病状態
の重症度（例えば腫瘍の大きさ及び位置）、患者の年齢、体重及び性別、食事、
投与の回数及び頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性、及び治療に対する耐性及
び反応などが含まれる。長時間作用する医薬品組成物は、その特定の配合の半減
期及びクリアラン
ス速度に応じて、３〜４日に１回、１週間に１回、または２週間に１回投与され
る。
通常の投与量は、投与経路に応じて、０．１〜１００，０００μｇの範囲であ
り、最大投与量は約１ｇである。特定の投与及び薬物の供給方法についてのガイ
ダンスは文献に記載されている。米国特許第４，６５７，７６０号明細書、米国
特許第５，２０６，３４４号明細書または米国特許第５，２２５，２１２号明細
書を参照されたい。当業者は、ＭＣＰ−４対してはＭＣＰ−４のインヒビターと
は異なる配合を採用できる。同様に、膵臓に対する投与方法は、肺や腎臓や、胃
に対する投与方法とは異なるものであることが必要である。
本発明においては、変化したＭＣＰ−４の発現に関連する疾病状態がＭＣＰ−
４かそのインヒビターの何れかで治療可能なことも含んでいる。この疾病状態に
は特にＮＩＤＤＭまたは類似した生化学的または免疫学的特徴を有する疾病状態
が含まれる。このような疾病状態には、ウィルス感染、バクテリア感染、真菌感
染または寄生虫様の感染や、アレルギーまたは喘息反応、外傷による機械的損傷
、動脈硬化症、アテローム発生や膠原病、慢性関節リウマチのような遺伝病や、
リンパ腫や癌腫、または他の上述したアッセイによって特に診断され得る白血球
が関与する疾病状態が含まれるがこれらに限定されるものではない。更にこのよ
うなアッセイを治療状態のモニタに使用することもできる。
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲をこれに
限定しようとするものではない。
実施例
１．ＮＩＤＤＭ膵臓ｃＤＮＡライブラリの構築
インサイト社クローンＮｏ．２７３０６１からのｍｃｐ−４完全長遺
伝子は、ＮＩＤＤＭ膵臓ライブラリから単離されたｃＤＮＡの中から同定された
。基底細胞節出血で死亡したＮＩＤＤＭと診断された５７歳の白人男性から得ら
れた膵臓組織のサンプル（Ｌｏｔ ＧＨＬ−６４５）が、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（
Ｅｘｔｏｎ ＰＡ）から得られた。この患者は高血圧と心血管性の疾病を患って
おり、Ｍｉｃｒｏｎａｓｅ（登録商標）錠剤による治療を受けていた。
この組織は液体窒素でフラッシュ冷凍され、乳棒と乳鉢ですりつぶされて、グ
アニジニウムイソチアシアネートを含む緩衝液に常に溶解された。次いで、この
溶液は５．７Ｍ ＣｓＣｌクッションに負荷され、ＳＷ２８ロータで２５０００
ｒｐｍで１８時間？温度の下で遠心分離された。このＲＮＡは、０．３Ｍ酢酸ナ
トリウム及び２．５ボリュームのエタノールを用いて沈殿され、水の中に再懸濁
されて、３７℃で１５分間ＤＮアーゼ処理をされた。このＲＮＡはＱｉａｇｅｎ
Ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて単離され、カスタムｃ
ＤＮＡライブラリの構築のためＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社に送られた。
初めの鎖ｃＤＮＡ合成は、ＸｈｏＩ制限部位をも含むオリゴｄ（Ｔ）プライマ
ー／リンカーを用いて行われた。第２の鎖合成は、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．
ｃｏｌｉリガーゼ、及びＲＮアーゼＨを用いて、行われ、次いでＥｃｏＲＩアダ
プタをブラント末端のｃＤＮＡに加えた。ＥｃｏＲＩアダプタを付けられた２鎖
のｃＤＮＡは、次いでＸｈｏＩ制限酵素で消化され、８００塩基対を越える大き
さの配列が分けられた。このｃＤＮＡはＬａｍｂｄａＺａｐ（登録商標）べクタ
ー系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に挿入され、次いでこのべクターがｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ（商標）ファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に入れられて、Ｅ
ｃｏｌｉ宿主細胞株ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ（商標）（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ社）を形質転換した。
ここのｃＤＮＡクローンのファージミド形態は、ｉｎ ｖｉｖｏ切除プロセス
によって得られた。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ及び同時に形質転換されたｆ１へル
パーファージの双方から得られた酵素はｄｎａに切り込みを入れ、新たなＤＮＡ
合成を開始し、より小さい、一鎖の環状ファージミド分子でこのｃＤＮＡインサ
ートが含められたものが生成された。このファージミドＤＮＡは放出され、精製
されて、新たな宿主細胞（ＳＯＬＲ）に再感染させるのに用いられたβラクタマ
ーゼの遺伝子を含むファージミドが存在することにより、形質転換されたバクテ
リアがアンピシリンを含む培地の上で成長できるようになる。
２．ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定
プラスミドＤＮＡは、細胞から放出され、次いでＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ｃ
ａｔａｌｏｇ ＃７７４６８；Advanced Genetic Technologies corporation，G
aithersburg MD）を用いて生成された。このキットは９６穴ブロックと９６０回
の精製用の試薬からなるものである。キットの推奨プロトコルを採用したが、以
下の点を変更した。９６個の穴は、それぞれ滅菌Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ
（ｃａｔａｌｏｇ ＃２２７１１，LIFE TECHN0L0GIES（商標）Gaithersburg MD
）を、カルベニシリン２５ｍｇ／Ｌ及びグリセロール０．４％と共に満たした。
細菌を穴に接種し、６０μｌの溶解バッファに溶解した後、２４時間培養した。
Ｂｅｃｋｍａｎ ＧＳ−６Ｒを用いて２９００ｒｐｍで５分間遠心分離するステ
ップの後、ブロックの内容物を一次フィルタプレートに添加した。ＴＲＩＳバッ
ファにイソプロパノールを添加すオプションステップは、定例的に実施しなかっ
た。このプロトコルの最終ステップが実施された後、サンプルを保存のためＢｅ
ｃｋｍａｎ９６穴ブロックに移した。
このｃＤＮＡの配列決定は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｌａｂ
２２００（Hamilton，Reno NV）を、４つのＰｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒｓ（ＰＴＣ２００ from MJ Research，Watertown MA）及びＡｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７または３７３ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Perkin Elmer）と共に用いてＳａｎｇｅｒ Ｆ及
びＡＲ Ｃｏｕｌｓｏｎ（1975;J Moｌ Biol 94:44lf）の方法によって行われ、
リーディングフレームが決定された。
３．ｃＤＮＡクローン及びその予測タンパク質配列の相同性検索
各ｃＤＮＡは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって開発された検
索アルゴリズムをＩＮＨＥＲＩＴ（商標） ６７０ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａ
ｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍに組み込んで用いてＧｅｎＢａｎｋ配列と比較された
。このアルゴリズムでは、ＰａｔｔｅｒｎＳｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｌａｎ
ｇｕａｇｅ（TRW Inc，Los Angeles CA）が相同領域の決定のために用いられた
。配列比較をどのように行うかを定める３つのパラメータは、ウィンドウサイズ
、ウィンドウオフセット、及び誤差許容度であった。これら３つのパラメータの
組み合わせを用いて、調査対象である配列に対して相同性を有する領域を含む配
列をＤＮＡデータベースから検索し、適当な配列に対して初期値と共にスコアが
付けられた。続けて、これらの相同な領域を、ドットマトリクス相同性プロット
法を用いて検定し、偶然の一致と真の相同領域とを区別した。相同性検索の結果
を表示するためにＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎのアライメントが用いられた。
ペプチド及びタンパク質配列の相同性はＩＮＨＥＲＩＴ（商標）６７０ Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを、ＤＮＡ配列の相同性の過程
に用いるのと同じ方法で用いて確認された。Ｐａｔｔｅｒｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ Ｌａｎｇｕａｇｅ及びパラメー
タウィンドウを用いて、相同性領域を含むタンパク質配列のデータベースを検索
し、相同性領域は初期値と共にスコアを付けられて表示された。ドットマトリク
ス相同性プロット法により検定を行い、有意な相同性領域を偶然の一致と区別し
た。
ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool（Altschul SF（1993）J Mo
l Evol 36:290-300; Altschul，SF et al（1990）J Mol Biol 215:403-10））を
用いて、局部的な配列の一致を検索した。ＢＬＡＳＴは、ヌクレオチド及びアミ
ノ酸配列双方のアライメントを検出して、配列の類似性を決定する。アライメン
トが局部的であることから、ＢＬＡＳＴは、正確な一致の決定、またはホモログ
の同定において特に有用である。ＢＬＡＳＴはギャップを含まない一致の検索に
有用である。ＢＬＡＳＴアルゴリズム出力の基本的な単位は、Ｈｉｇｈ−ｓｃｏ
ｒｉｎｇ Ｓｅｇｍｅｎｔ Ｐａｉｒ（ＨＳＰ）である。
ＨＳＰは、アライメントが局部的に最大となる部分の長さが等しく、アライメ
ントスコアがユーザが設定したカットオフスコアまたは閾値のスコア以上である
ような２つの任意の範囲の断片からなる。ＢＬＡＳＴ法では、調査対象のデータ
ベース配列との間のＨＳＰを探し、発見された一致の統計的有意性を評価し、ユ
ーザが選択した有意性の閾値を超える一致のみを報告する。パラメータＥはデー
タベース配列との一致を報告するための統計的有意性の閾値を設定するパラメー
タである。Ｅは、データベース検索全体の文脈の中で、ＨＳＰ（またはＨＳＰの
組）の偶然の一致の発生する予定頻度の上限と解釈される。Ｅを満たすデータべ
ース配列は、プログラムの出力で報告される。
４．ｍｃｐ−４の調節エレメントを回復するまでの延長
完全長ｍｃｐ−４の核酸配列（配列番号：１）を用いて、ゲノムライブラリー
から５′配列を得るためのヌクレオチドプライマーをデザイン
する。プライマーの一方はアンチセンス方向（ＸＬＲ）の延長を開始するために
合成され、他方はセンス方向（ＸＬＦ）に配列を延長するために合成される。こ
れらのプライマーにより、既知のｍｃｐ−４配列を「外向きに」延長し、新規な
、未知の興味の対象となる領域に対するヌクレオチド配列を含む単位複製配列を
生成することが可能となる。この初回剌激プライマーは、Ｏｌｉｇｏ４．０（Na
tional Biosciences）、または他の適当なプログラムを用いて、長さが２２〜３
０ヌクレオチド、ＧＣ群５０％以上、また約６８〜７２℃で目的の配列にアニー
ルするように設計された。へアピン構造を形成したり、プライマー−プライマー
二量体化するような任意のヌクレオチドストレッチは取り除かれる。
ヒトゲノムライブラリを用いて配列を延長し、５′上流領域を得る。より長い
延長が必要な場合には、既知の領域を更に延長するための第２のプライマーの組
がデザインされる。
ＸＬ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（Perkin Elmer）の指示に従い、酵素と反応混合物とを
徹底的に混合することによって、忠実度の高い増幅が達成される。各プライマー
の４０ｐｍｏｌ及び推奨された濃度のキットの他の全ての成分を用いて開始され
たＰＣＲは、Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＰＴＣ２００；
MJ Research，Watertown MA）を用いて以下のパラメータで実行される。
ステップ１ ９４℃で１分間（初期変性）
ステップ２ ６５℃で１分間
ステップ３ ６８℃で６分問
ステップ４ ９４℃で１５秒間
ステップ５ ６５℃で１分間
ステップ６ ６８℃で７分間
ステップ７ ステップ４〜６を更に１５回反復
ステップ８ ９４℃で１５秒間
ステップ９ ６５℃で１分間
ステップ１０ ６８℃で７分１５秒間
ステップ１１ ステッブ８〜１０を更に１２回反復
ステップ１２ ７２℃で８分間
ステップ１３ ４℃（この温度を維持）
５〜１０μｌの反応混合物のアリコットが低濃度（約０．６〜０．８％）アガ
ロースミニゲル上での電気泳動により分析され、配列の延長の反応がうまくいっ
たか否かが決定される。最も大きい生成物を含むと考えられるバンドが選択され
てゲルから切り取られる。更に精製を行うため、例えばＱＩＡＱｕｉｃｋ（商標
）（QIAGEN Inc）のような市販のゲル延長法が用いられる。ＤＮＡを回収した後
、クレノウ酵素を用いて一本鎖、ヌクレオチドの末端の突出をトリムし、再連結
及びクローニングが容易な平滑末端を形成した。
エタノール沈殿の後、生成物は１３μｌの連結バッファに再度溶解され、１μ
ｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼが添加され、この混合物は室温で２〜３時間、または１６℃で一晩インキュ
ベートされた。（１０μｌの適当な培養液に入った）コンピテントＥ．ｃｏｌｉ
細胞が３μｌのリゲーション混合物で形質転換され、８０μｌのＳＯＣ ｍｅｄ
ｉｕｍ（Sambrook J et al,supra）で培養される。３７℃で１時間のインキュベ
ーションの後、形質転換混合物全ては、２×Ｃａｒｂを含むＬｕｒｉａ Ｂｅｒ
ｔａｎｉ （ＬＢ）−ａｇａｒ（Sambrook J et al，supra）上にプレートされ
る。後日、各プレートからいくつかのコロニーをランダムに取り出し、適当な市
販の滅菌９６穴マイクロタイタープレートの個々の穴に入れられた１５０μｌの
液体ＬＢ／２×Ｃａｒｂ培養液内で培養される。翌日、５
μｌの各一晩培養した培養液は、非滅菌９６穴プレートに送られ、１：１０に水
で希釈された後、５μｌの各サンプルがＰＣＲアレイに移される。
ＰＣＲ増幅のために、４単位のｒＴｔｈ ＤＭＡポリメラーゼを含む１８μｌ
の濃縮ＰＣＲ反応混台物（３．３×）、べクタープライマー、及び延長反応に用
いられる遺伝子特異的プライマーの１または２以上が各穴に添加される。増幅は
以下の条件を用いて行われる。
ステップ１ ９４℃で６０秒間
ステップ２ ９４℃で２０秒間
ステップ３ ５５℃で３０秒間
ステップ４ ７２℃で９０秒間
ステップ５ ステップ２〜４を更に２９回反復
ステップ６ ７２℃で１８０秒間
ステップ７ ４℃（この温度を維持）
ＰＣＲ反応のアリコットは、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で泳動さ
せられる。ＰＣＲの生成物のサイズは、元の部分的ｃＤＮＡと比較され、適当な
クローンが選択されプラスミドにリゲートされて配列決定される。
５．ハイブリダイゼーションプローブの標識
配列番号：１の配列から作られたハイブリダイゼーションプローブは、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムのＤＮＡまたはｍＲＮＡをスクリーニングするのに利用される。約２
０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識化については前述したが、より大き
いｃＤＮＡ断片に対しても同じ手順が適用される。オリゴヌクレオチドは、５０
ｐｍｏｌの各オリゴマーと２５０ｍＣｉの［γ−32Ｐ］アデノシン三リン酸（Am
ersham，Chicago IL）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥ
Ｎ（登録商標），Bo
ston MA）を結合することによって標識される。この標識されたオリゴヌクレオ
チドは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ｓｕｐｅｒ ｆｉｎｅｒｅｓｉｎ ｃｏ
ｌｕｍｎ（Pharmacia）を用いて概ね精製される。１分あたり１０7カウントの各
センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む部分が、以下のエンドヌクレ
アーゼ（Ase I，Bgl II，Eco RI，PstI，Xba 1，or Pvu II; DuPont NEN（登録
商標））の１つで消化されるヒトゲノムＤＮＡの一般的なメンブランを用いるハ
イブリダイゼーションにおいて使用される。
消化されたＤＮＡのそれぞれは、０．７％アガロースゲル上で分画され、ナイ
ロンメンブラン（Ｎｙｔｒａｎ Ｐｌｕｓ， Schleicher & Schuell，Durham N
H）に移される。ハイブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行われる。
非特異的なシグナルを取り除くため、ブロットは、厳密性を高めた条件の下で、
最大０．１×塩類クエン酸ナトリウム（saline sodium citrate）及び０．５％
ドデシル硫酸ナトリウムにより、室温で続けて洗浄される。ＸＯＭＡＴ ＡＲ（
商標） ｆｉｌｍ（Kodak, Rochester NY）がPｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ ｃ
ａｓｓｅｔｔｅ（Molecular Dynamics，Sunnyvale CA）上のブロツトに数時間露
出された後、ハイブリダイゼーションパターンが視覚的に比較される。
６．アンチセンス分子
ｍｃｐ−４配列、またはその部分は、自然発生ｍｃｐ−４のｉｎ ｖｉｖｏま
たはｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現の抑制のために使用される。約２０塩基対を含む
アンチセンスオリゴヌクレオチドの利用については前述したが、より大きいｃＤ
ＮＡフラグメントに対しても同じ手順が利用される。第１Ａ図及び第１Ｂ図に示
すようなｍｃｐ−４をコードする配列に基づくオリゴヌクレオチドを用いて、自
然発生ｍｃｐ−４の発現が抑制される。相補的なオリゴヌクレオチドは、保存的
な５′配列からデ
ザインされ、上流の非翻訳配列に結合するプロモータを抑制することにより転写
を抑制したり、またはリーダー配列の−１０から＋１０の領域にリボゾームが結
合しないようにすることによってｍｃｐ−４の転写物の翻訳を抑制するために用
いられる。
８．ＭＣＰ−４の発現
ＭＣＰ−４の発現は、ｃＤＮＡを適当なべクターにサブクローニングし、その
べクターを宿主細胞に形質移入することによって達成される。この場合、以前に
ｃＤＮＡライブラリの形成のために用いたクローニングベクター（ｐＳｐｏｒｔ
）が、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＭＣＰ−４の発現のために利用される。クローニン
グ部位の上流に、このべクターは、β−ガラクトシダーゼのためのプロモータ、
それに続くアミノ末端Ｍｅｔ及びそれに続く７つのβ−ガラクトシダーゼの残基
を含む配列を有する。これらの８つの残基のすぐ後に、転写のために役立つバク
テリオファージプロモータ及び多数の独特な制限サイトを有するリンカーが存在
する。
標準的な方法を用いて単離されＩＰＴＧで形質転換された菌株の誘導により、
β−ガラクトシダーゼの初めの７つの残基、約５〜１５のリンカーの残基、及び
完全長ＭＣＰ−４からなる融合タンパク質が産生される。このシグナル配列によ
りＭＣＰ−４が細菌増殖培地に分泌され、これを次に説明する活性の検定におい
て直接用いることができる。
７．ＭＣＰ−４の活性
ケモカインの走化性の活性は、通常４８穴マイクロ走化性チャンバにおいて測
定される。各穴は、化学的な勾配に応じて一方のセルから他方のセルに通過させ
るフィルタによって２つのセルに分けられる。ＭＣＰ−４が分泌された細胞培地
が、ポリカーボネートフィルタの一方の側に入れられ、末梢血液細胞が、フィル
タの反対側のセルで同じ培養液に懸
濁される。ＭＣＰ−４の濃度勾配と拡散により、細胞がフィルタを通過するだけ
の十分な時間をかけてインキュベーションを行う。その後、各穴からフィルタが
取出され、フィルタのケモカイン側に付着した例えば単球のような特定の型の細
胞が、同定されカウントされる。
密度勾配遠心分離によって得られた、例えば好中球、単核細胞、単球、または
リンパ球の高濃度の集団のような分画された細胞集団に対する検定を行うことに
よって、化学誘因の特異性が決定される。特定のＴ細胞集団は、ＣＤ８＋及びＣ
Ｄ４＋特異的抗体を用いたネガティブ選択により精製される。
９．ＭＣＰ−４特異的抗体の生成
ＰＡＧＥ電気泳動法（上述のＭａｎｉａｔｉｓ参照）を用いて精製されたＭＣ
Ｐ−４は、標準的なプロトコルによるウサギの免疫化のために用いられるが、モ
ノクローナル法が通常は用いられる。ｍｃｐ−４から翻訳されたアミノ酸配列を
、ＤＮＡＳＴＡＲ ｓｏｆｔｗａｒｅ（DNAStar Inc）を用いて分析し、高度に
免疫原性の領域を決定し、対応するオリゴポリペプチドが合成され、それを用い
て当業者には周知の方法で抗体を産生する。Ｃ末端の近傍または親水性の領域の
ような適当なエピトープを選択するための分析についてはＡｕｓｂｅｌ ＦＭ
ｅｔ ａｌ（上述）に記載されている。
典型的には、約１５の残基を有する長さのこのオリゴポリペプチドは、ｆｍｏ
ｃ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを用いるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ４３１Ａを用いて合成され
、Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（M-male
imidobenzoyl-N-hydroxysuccinimideester）（MBS; Ausbel et al，supra）と反
応させることによってキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ，Ｓｉｇｍａ
）に結合される。
ウサギは、フロイント完全アジュバントのペプチド−ＫＬＨ複合体と共に免疫化
される。得られた抗血清は、ペプチドとプラスチックを結合し、１％のウシの血
清アルブミンでブロックし、抗血清と反応させ、洗浄し、かつ放射性ヨウ素標識
されたヤギの抗ウサギＩｇＧと反応させることによって抗ペプチド活性がテスト
される。
１０．特異的抗体を用いる自然発生ＭＣＰ−４の精製
自然発生または組換えＭＣＰ−４は、ＭＣＰ−４に対して特異的な抗体を用い
るイムノアフィニティークロマトグラフィーにより概ね精製される。イムノアフ
ィニティーカラムは、ＭＣＰ−４抗体をＣｎＢｒ活性化セルファロース（ＣｎＢ
ｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（Pharmacia Biotech）のよう
な活性化クロマトグラフィー樹脂と共有結合させることにより構築される。結合
の後、メーカーの指示に従って樹脂がブロックされ洗浄される。
ＭＣＰ−４を含む溶液はイムノアフィニティーカラムを通され、このカラムは
ＭＣＰ−４の優先的な吸収が可能な条件の下で洗浄される（例えば界面活性剤の
存在のもとイオン強度の高い緩衝液で洗浄される）。このカラムは、抗体−ＭＣ
Ｐ−４結合を分裂させるような条件（例えばｐＨ２〜３の緩衝液または尿素やチ
オシアン酸塩イオンのような高濃度のカオトロープ）のもとで処理され、ＭＣＰ
−４が捕集される。
１１．ＭＣＰ−４と相互作用する分子の同定
ＭＣＰ−４または生物学的に活性なその断片は、1251Ｉボルトンハンター試薬
（Bolton，AE and Hunter，WM（1973）Biochem Ｊ 133:529）で標識される。以
前に９６穴プレートの穴に配列された候補の分子は、標識されたＭＣＰ−４と共
にインキュベートされ、洗浄されて、標識されたＭＣＰ−４複合体を有する穴が
検定される。異なる濃度のＭＣＰ−４Ｐを用いて得られたデータは、ＭＣＰ−４
と候補の分子との結合、アフィ
ニティー、その数を表す数値の計算に用いられる。
上述の説明の中に記載された全ての文献及び特許明細書は、本明細書と一体に
組み込まれたものとして参照されたい。ここに開示した本発明の方法及びシステ
ムを本発明の範囲及び精神を逸脱することなく様々に変更を加えることは当業者
には明らかであろう。本発明は特定の好適実施例に関連して説明したが、本発明
の範囲がここに開示した特定の実施例のみに限定されるものではないということ
を理解されたい。実際、分子生物学またはその関連分野の専門家にとって明らか
な、ここに開示した本発明の実施例の様々な変更は、請求の範囲に記載の発明の
範囲内に含まれるものとして意図されている。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 43/00 Ａ６１Ｋ 31/00 ６４３Ｂ
Ａ６１Ｋ 31/70 31/70
38/00 45/00
45/00 48/00
48/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ
Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ
Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02
//(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ
Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ
，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ
，ＣＮ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＩＬ，ＪＰ，
ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＵ，ＳＥ，ＳＧ