JP3670665B2 - 単球走化性蛋白質−4 - Google Patents
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Description
単球走化性蛋白質には3つの型、すなわち、MCP−1、MCP−2およびMCP−3がある。これらの蛋白質のいずれもが、構造的および機械的に特徴づけられており、また、クローンされ、発現されている。MCP−1およびMCP−2は、白血球(単球および白血球)を引き付ける能力を有し、MCP−3は、好酸球およびTリンパ球も引き付ける(Dahinderi,E.et al.,J.Exp.Med.,179:751−756(1994))。
最初に、ヒト単球特異性の引き付け因子がグリオーム(glioma)セルラインおよび単球セルラインから精製された。Matsushima,K.et al,J.Exp.Med.,169:1485−1490(1989)。この因子は、当初、Matsushimaらにより、グリオール由来走化性因子(GDCF)および単球走化性、活性化因子(MCAF)と命名された。この因子が、現在、MCP−1と称されている。MCP−1に対するcDNAのその後のクローニングは、それがネズミ(murine)のJE遺伝子と非常に類似していることを示した。JE遺伝子は、血小板由来の成長因子によりネズミ線維芽細胞に大量に導入されうる。Cochran,B.H.,et al,Cell,33:939−947(1983)。ネズミJEはMCP−1と非常に類似している。MCP−1蛋白質は、68個のN−末端残基領域においてネズミJEと62%の同一性を有する。JEとMCP−1とが種相同性であることが広く認められている。本発明のポリペプチド、MCP−4は、構造的にも機械的にもMCP−1およびネズミJE蛋白質と関係している。図2参照。
JE/MCP−1の投与による脊椎動物における腫瘍形成の抑制方法が、JE/MCP−1の投与による悪性疾患の局所性合併症治療方法および寄生虫感染と闘う方法と共にPCT出願、WO92/20372号に開示されている。悪性細胞におけるJE/MCP−1蛋白質の発現が、in vivoにおける該細胞の腫瘍形成能力を抑制することが見いだされた。
ヒトMCP−1は、推定分子量8,700ダルトンを有する、76個のアミノ酸の塩基性ペプチドである。MCP−1は主に、単球、内皮細胞および線維芽細胞中で誘発的に発現される。Leonard,E.J.およびYoshimura,T.,Immunol.Today,11:97−101(1990)。この発現を誘発する因子は、IL−1,TNFまたはリポ多糖類処理である。
MCP−1の他の性質には、百日咳毒素−感受性法で成熟(mature)ヒト好塩基球を強く活性化する能力が含まれる。MCP−1は、好塩基球によるヒスタミン放出を直接誘発する能力を有するサイトカインである(Bischoff,S.C.et al.,J.Exp.Med.,175:1271−1275(1992))。さらに、MCP−1は、インターロイキン3、インターロイキン5または顆粒球/マクロファージコロニー−刺激因子で前処理された好塩基球によるロイコトリエンC4生成を促進する。MCP−1誘発好塩基球メジエター放出は、アレルギー性炎症およびMCP−1を発現する他の病状において重要な役割を演じうる。
ヒト単球走化性、活性化因子(MCAF)をコードする塩基配列を有するクローンは、23個のアミノ酸残基の推定シグナルペプチド配列と、76個のアミノ酸残基の成熟MCAF配列とからなるMCAFポリペプチドの一次構造を示す。Furutani,Y.H.,et al,Biochem.Biophys.Res.Commu.,159:249−55(1989)。ヒトグリオーム由来単球走化性因子(GDCF−2)の完全長アミノ酸配列も決定されている。このペプチドは、ヒト単球を引き付けるが、好中球は引き付けない。GDCF−2は76個のアミノ酸配列からなることが確立している。このペプチド鎖は、11、12、36および52の位置に、ジスルフィド架橋のところで房状になった一対のループを形成する4個のハーフ−システイン(half−cisteine)を含む。さらに、MCP−1遺伝子がヒト染色体17に指定されている。Mehrabian,M.R.,et al,Gemonics,9:200−3(1991)。ある種のデータは、MCP−1の潜在的役割が、動脈壁の単球浸透の媒介であることを示唆している。単球は、泡沫細胞の先祖および内膜肥厚を媒介する成長因子の潜在的な源として、アテローム発生の中枢であるらしい。Nelken,N.A.,et al,J.Clin.Invest.,88:1121−7(1991)。また、MCP−1の滑膜生成が、リウマチ様関節炎に伴う炎症の間の単核食細胞の漸増に重要な役割を果たしうるころ、および滑膜組織マクロファージが、このサイトカインの主な源であることも見いだされている。MCP−1レベルは、変形性関節症患者または他の関節炎の患者からの滑液と比べて、リウマチ様関節炎患者からの滑液に著しく高いことが見いだされた。Koch,A.E.,et al,J.Clin.Invest.,90:772−9(1992)。
MCP−2およびMCP−3は、プロ炎症性(proinflammatory)蛋白質の亜科に分類されており、それらは特異的に単球を引き付けるが、好中球を引き付けないので、機械的にMCP−1と関連づけられている。Van Damme,J.,et al,J.Exp.Med.,176:59−65(1992)。MCP−3は、MCP−1およびMCP−2と、各々、71%および58%のアミノ酸相同性を示す。MCP−3は、マクロファージ機能を調節する炎症性サイトカインの1種である。
本発明の1つの態様によれば、新規な成熟ポリペプチドであるMCP−4、ならびにそのフラグメント、アナログおよび誘導体が提供される。本発明のポリペプチドはヒト起源である。
本発明の他の態様によれば、該ポリペプチド類をコードするポリヌクレオチド類(DNAまたはRNA)が提供される。
本発明のさらにもう1つ別の態様によれば、組み換え技法による該ポリペプチドの製法が提供される。
本発明のさらにもう1つ別の態様によれば、該ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを治療目的、例えば、腫瘍の治療、創傷治癒の促進、寄生虫感染との闘い、および造血の調節のために利用する方法が提供される。
本発明のさらにもう1つ別の態様によれば、該ポリペプチド類に対する抗体が提供される。
本発明のさらにもう1つ別の態様によれば、該ポリペプチド類に対する拮抗剤/抑制剤が提供され、これは治療目的、例えば、リウマチ様関節炎、肺炎、アレルギー、感染症状の治療や、炎症およアテローム硬化の予防のために該ポリペプチドの作用の抑制に使用できる。
本発明のこれらの態様および他の態様は、本明細書の教示から当業者に明らかとなる。
以下の図面は、本発明の具体化の説明であって、特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を制限するものではない。
図1は、MCP−4のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。図示した119個のアミノ酸配列は、完全長蛋白質であり、概略、最初の22個のアミノ酸がリーダー配列を表し、蛋白質の成熟形は、長さ97個のアミノ酸である。アミノ酸についての標準的な1文字略号を使用している。
図2は、MCP−4とネズミJE蛋白質との間でのcDNA配列の相同性を示す。各3つのセグメントにおける上の配列がMCP−4であり、下の配列がネズミJE蛋白質である。
図3は、ヒト細胞におけるMCP−4についてのmRNA転写のノーザン・ブロット分析の結果を示す。
図4は、細菌発現および精製後のヒトMCP−4のバンド・パターンを示す。
図5は、pQE−9の模式図である。
本発明の1つの態様によれば、図1の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドまたは1994年3月10日にATCC受託番号75703として寄託されているクローンのcDNAによってコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸(ポリヌクレオチド)が提供される。
この発明のポリヌクレオチドは活性化された単球cDNAライブラリーから見いだされた。これは、約119アミノ酸長の、そのうち最初の22アミノ酸残基が推定リーダー配列を含む蛋白質をコードするオープンリーディングフレームを含む。その成熟蛋白質は97アミノ酸長であると予想される。これは構造的にマウス単球走化性蛋白質(MCP−1またはJE)と関連しており、全ヒトMCP−1蛋白質配列に対し、27%の同一性および56%の類似性を示す。該ポリペプチドは、全てのケモカイン(chemokine)類に存在する全4個のシステイン残基を特色として含む。これらのシステイン間の間隔が、ネズミMCP−1/JEと匹敵して保持されており、該新しい遺伝子がケモカインであることを強く示唆している。
本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形でも、DNAの形でもよく、DNAには、cDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAが包含されている。DNAは、二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖の場合は、コーディング鎖でも非コーディング(アンチセンス)鎖でもよい。成熟ポリペプチドをコードするコーディング鎖は図1に示すコーディング配列または寄託したクローンのコーディング配列と同じでも、また、遺伝子コードの重複または変性の結果、異なるコーディング配列であるが、図1のDNAまたは寄託したcDNAと同じ成熟ポリペプチドをコードするコーディング配列でもよい。
図1の成熟ポリペプチドまたは寄託cDNAによってコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、成熟ポリペプチドに対するコーディング配列のみ;成熟ポリヌクレオチドのコーディング配列と、リーダーもしくは分泌配列またはプロプロテイン配列のような付属の配列;成熟ポリペプチドに対するコーディング配列(および、所望により、付属の配列)と、イントロンもしくは成熟ポリペプチドに対するコーディング配列の非コーディング配列5’および/または3’のような非コーディング配列が包含されうる。
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる語は、該ポリペプチドに対するコーディング配列のみを含むポリヌクレオチドと、付属の配列および/または非コーディング配列を含むポリヌクレオチドとを包含する。
本発明はさらに、図1の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託したクローンのcDNAによってコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする上記したポリヌクレオチド類の変異体にも関する。該ポリヌクレオチドの変異体は、該ポリヌクレオチドの天然の対立遺伝子変位体でも、該ポリヌクレオチドの非天然の対立遺伝子変異体でもよい。
かくして、本発明は、図1に示したのと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託したクローンcDNAによってコードされると同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド類と、該ポリヌクレオチド類の変異体であって、図1に示したポリペプチドまたは寄託したクローンcDNAによってコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードするポリヌクレオチド類を包含する。このようなヌクレオチド変異体には、欠失変異体、置換変異体および付加または挿入変異体が含まれる。
上記したように、該ポリヌクレオチドは、図1に示したコーディング配列または寄託クローンのコーディング配列の天然の変異体であるコーディング配列を有してよい。当該分野で公知のごとく、対立遺伝子変異体は、1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有することのできる、コードされたポリペプチドの機能を実質的に変化させないポリヌクレオチド配列の1つの変形である。
本発明はまた、成熟ポリペプチドに対するコーディング配列が、宿主細胞からのポリペプチドの発現、分泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば、細胞からのポリペプチドの運搬を制御する分泌配列として機能するリーダー配列と、同じリーディングフレームで融合してもよいポリヌクレオチド類を含む。リーダー配列を有するポリペプチドがプロプロテインであり、リーダー配列は宿主細胞により切断され、ポリペプチドの成熟形を形成することができる。また、ポリヌクレオチド類は、成熟蛋白質プラス付属の5’アミノ酸残基であるプロプロテインをコードしてもよい。プロ配列を有する成熟蛋白質がプロプロテインであり、該蛋白質の不活性形である。一旦プロ配列が切断されると、活性成熟蛋白質が残る。
かくして、例えば、本発明のポリヌクレオチドは成熟蛋白質またはプロ配列を有する蛋白質またはプロ配列と、プレ配列(リーダー配列)を有する蛋白質をコードすることができる。
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列とフレーム内で融合するコーディング配列を有しても良い。マーカー配列は、pQE−9ベクターによって供給されるヘキサ−ヒスチジン標識でよく、細菌宿主の場合、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提供し、また、例えば、マーカー配列は、例えば、COS−7細胞のような哺乳動物宿主を使用する場合、ヘマググルチニン(HA)標識とすることができる。HA標識はインフルエンザ・ヘマググルチニン蛋白質から由来するエピトープに相当する(Wilson,I.,et al.,Cell,37:67(1984))。
本発明は、さらに、配列間に少なくとも50%、好ましくは70%の同一性がある場合に、上記した配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド類にも関する。本発明は、特に、ストリンジェントな条件の下、上記ポリヌクレオチド類とハイブリダイズするポリヌクレオチド類に関する。本明細書で使用する「ストリンジェントな条件」なる語は、配列間に、少なくとも95%、好ましくは、少なくとも97%の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こることを意味する。上記のポリヌクレオチド類にハイブリダイズするポリヌクレオチド類は、好ましい具体例において、図1のcDNAまたは寄託したcDNAによってコードされる成熟ポリペプチドの生物学的機能または活性を実質的に保持しているポリペプチド類をコードする。
本明細書でいう寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の条件の下で維持されている。これらの寄託は、単に、当業者に対する便宜としてであって、35U.S.C.112で要求される寄託を自認したものではない。寄託した材料に含まれるポリヌクレオチド類の配列、それによってコードされるポリペプチド類のアミノ酸配列を、参照としてここにに引用し、本明細書の配列の記載と何らかの不一致がある場合の照合とする。寄託した材料の製造、使用または販売にはライセンスが必要でありえるが、これにより、何ら、そのようなライセンスを与えるものではない。
本発明は、さらに、図1の推定アミノ酸配列または寄託したcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するMCP−4ポリペプチド、ならびに該ポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体にも関する。
図1のポリペプチドまたは寄託されたcDNAについて言及する場合の「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」なる語は、該ポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドを意味する。すなわち、アナログにはプロプロテイン部分を切断して活性化し、活性成熟ポリペプチドを生ずるプロプロテインが包含される。
本発明のポリペプチドは、組換ポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドでよく、好ましくは組換ポリペプチドである。
図1のポリペプチドまたは寄託cDNAによってコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、(i)そのアミノ酸残基の1つ以上が保存的または非保存的アミノ酸残基(好ましくは、保存的アミノ酸残基)で置換され、該置換アミノ酸残基はその遺伝子コードでコードされても、されなくてもよいもの、または(ii)1つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または(iii)成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような他の化合物と融合しているもの、または(iv)リーダーまたは分泌配列または成熟ポリペプチドの精製に使用する配列またはプロプロテイン配列のような、さらなるアミノ酸が成熟ポリペプチドと融合したものとすることができる。かかるフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書の教示から当業者に明らかである。
本発明のポリペプチド類およびポリヌクレオチド類は、好ましくは、単離した形態で提供され、また、好ましくは、均質に精製される。
「単離」なる語は、その物質が元の環境(例えば、天然のものであれば、天然の環境)から移されることを意味する。例えば、生きた動物中に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、天然系に共存する材料のいくらかまたは全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。そのようなポリヌクレオチド類はベクターの一部でよく、および/またはそのようなポリヌクレオチド類またはポリペプチド類は組成物の一部でよく、かつ、そのようなベクターまたは組成物が天然環境の一部でない点でやはり単離されている。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド類を含むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作された宿主および組換え技術による本発明のポリペプチド類の製造にも関する。
宿主細胞は、クローニング・ベクターでも、発現ベクターでもよい本発明のベクターで遺伝子操作(形質導入または形質転換またはトランスフェクション)される。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形態でよい。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、あるいはMCP−4遺伝子を増幅するために適宜改変した通常の栄養培地中で培養できる。温度、pH等の培養条件は、発現用に選択した宿主細胞について従来使用されているものでよく、当業者に明らかである。
本発明のポリヌクレオチド類は組換え技法によるポリペプチド類の製造に使用できる。すなわち、例えば、ポリヌクレオチドは種々の発現ベクターのいずれか1つに含ませることができる。そのようなベクターには、染色体、非染色体および合成DNA配列、例えば、SV40の誘導体、細菌性プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージDNAの組み合わせから由来するベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび仮性狂犬病のようなウイルス性DNAが包含される。しかし、宿主中で複製でき、生育できる限り、他のいずれのベクターも使用できる。
適当なDNA配列を種々の操作でベクターに挿入できる。一般に、DNA配列は、自体公知の方法で適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。このような操作およびその他の操作は、当業者に自明である。
発現ベクター中のDNA配列を操作可能に適当な発現制御配列(プロモーター)に結合し、mRNA合成を指令させる。そのようなプロモーターの代表的な例としては、LTRまたはSV40プロモーター、イー・コリ(E.coli)lacまたはtrp、ファージ・ラムダPLプロモーターおよび原核または真核細胞またはそれらのウイルスにおいて遺伝子の発現を制御することが公知の他のプロモーターを挙げることができる。該発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターも含む。該ベクターはまた、発現を増幅するための適当な配列を含んでもよい。
また、該発現ベクターは、好ましくは、真核細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性のような、また、イー・コリにおけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性のような、形質転換された宿主細胞選択用の表現型特徴を与える1つ以上の選択できるマーカー遺伝子を含む。
上記したような適当なDNA配列と、適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを適当な宿主の形質転換に用い、宿主に蛋白質を発現させることができる。
適当な宿主の代表例として、イー・コリ、ストレプトマイセス(Streptomyces)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)のような細菌細胞、酵母のような糸状菌細胞、ドロソフィラ(Drosophila)、Sf9のような昆虫細胞、CHO、COSまたはボウエス(Bowes)黒色腫のような動物細胞、植物細胞等を挙げることができる。適当な宿主の選択は、本明細書の教示から当業者に自明である。
さらに詳しくは、本発明は、上記に概説した1つ以上の配列からなる組換体構造も包含する。該構造は、その中に本発明の配列を、前進または逆配向で挿入したプラスミドまたはウイルス性ベクターのようなベクターを含む。この具体例の好ましい態様では、該構造はさらに、例えば、操作可能に結合したプロモーターを含む調節配列も含む。多くの適当なベクターおよびプロモーターが当業者に公知であり、商業的に利用できる。例として以下のベクターを挙げる。細菌性:pQE70、pQE60、pQE−9(Qiagen)、ファージスクリプト、psiX174、pbluescriptSK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223−3、pKK233−3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)、真核:pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、宿主中で複製でき、生育できる限り、他のイいずれのプラスミドまたはベクターを使用できる。
プロモーター領域は、CAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、いずれの所望の遺伝子からも選択できる。2つの適当なベクターはPKK232−8およびPCM7である。特に命名されたプロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダPR、PLおよびtrpが包含される。真核プロモーターには、CMV即時初期、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルスからのLTRおよびマウスメタロチオネイン−Iが包含される。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者の技術範囲のものである。
さらなる具体例において、本発明は、上記の構造を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような下等真核細胞とすることができ、また、宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞とすることができる。宿主細胞への該構造の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン介在トランスフェクションまたはエレクトロポレーションで行うことができる。(Davis,L.,Dibner,M.,Battey,I.,Basic Methods in Molecular Bioloby,(1986))。
宿主細胞における構造を、常法にしたがって使用して組換体配列によりコードされる遺伝子生成物を製造する。別法として、本発明のポリペプチドは通常のペプチド合成法により、合成的に製造できる。
成熟蛋白質は、適当なプロモーターの制御の下、哺乳動物細胞、酵母、細菌または他の細胞中で発現させることができる。無細胞翻訳系も、本発明のDNA構造から誘導したRNAを用いるこれらの蛋白質の製造に使用できる。原核および真核宿主と共に使用するための適当なクローニングおよび発現ベクターは、Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manuarl,Second Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989)に記載されており、当該記載をここに参照として引用する。
高等真核細胞による本発明のポリペプチドをコードするDNAの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増加される。エンハンサーは、通常、プロモーターに作用してその転写を増加させる約10〜300bpの、DNAのシス活性エレメントである。例としては、複製開始点の後期側bp100〜270のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側ポリオーマエンサハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
一般に、組換体発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製開始点および選択マーカー、例えば、イー・コリのアンピシリン耐性遺伝子およびエス・セレヴィシアエ(S.cereviseiae)TRP1遺伝子、ならびに下流構造配列の転写を指令する高度発現遺伝子からのプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、とりわけ、解糖酵素3−ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、α−因子、酸ホスファターゼまたは熱ショック蛋白質をコードするオペロンから誘導できる。該異種構造配列を、翻訳開始および終止配列および、好ましくは、翻訳された蛋白質のペリプラズム空間または細胞外培地への分泌を指令する能力を有するリーダー配列を有する適当な相に組み入れる。所望により、該異種配列は、例えば、発現された組換体生成物の安定化または精製簡略化のような、望ましい特性を付与するN−末端同定(identification)ペプチドを含む融合蛋白質をコードすることができる。
細菌用の有用な発現ベクターは、所望の蛋白質をコードする構造DNA配列を、適当な翻訳開始および終止シグナルと共に、機能性プロモーターを有する操作可能なリーディング相に挿入することにより構築される。該ベクターは、1つ以上の表現型選択マーカーおよび複製開始点を含む、ベクターの維持を保証し、要すれば、宿主中での増幅を与える。形質転換用の適当な原核宿主には、イー・コリ、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)、サルモネラ・チフィムリルムならびにシウドモナス(Pseudomonas)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属およびスタフィロコッカス(Staphylococcus)属に属する種々の種が包含されるが、他のものも選択できる。
特に限定するものではないが、代表例として、細菌に使用する有用な発現ベクターは、よく知られたクローニングベクターpBR322(ATCC37017)の遺伝子エレメントからなる商業的に入手できるプラアスミドから由来する選択マーカーおよび複製開始点を含むことができる。そのような商業的ベクターには、例えばpKK223−3(Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden)およびGEM−1(Promega Biotec,Madison,WI,USA)が含まれる。これらのpBR322「骨格」セクションを適当なプロモーターおよび発現させるべき構造配列と組み合わせる。
適当な宿主株の形質転換および該宿主株の適当な細胞濃度までの増殖についで、選択したプロモーターを適当な手段(例えば、温度シフトまたは化学的誘発)により誘発し、細胞をさらなる期間培養する。
細胞を、典型的には、遠心分離して収穫し、物理的または化学的手段により破壊し、得られた粗抽出物をさらなる精製用の保持する。
蛋白質の発現に用いた微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、超音波処理、機械的崩壊または細胞溶解剤の使用を含む常法により破壊でき、これらの方法は当業者によく知られている。
種々の哺乳動物細胞培養系も組換蛋白質の発現に使用できる。哺乳動物発現系の例には、Gluzman,Cell,23:175(1981)によって記載されているサル腎臓線維芽細胞のCOS−7ラインおよび適合ベクターの発現能を有する他のセルライン、例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、BHKセルラインが含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適したプロモーターおよびエンハンサー、いずれかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニレーション部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終止配列および5’フランキング非転写配列を含む。SV40スプライスから誘導されたDNA配列およびポリアデニレーション部位を、必要な非転写遺伝子エレメントの提供に使用できる。
該ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを包含する方法により、組換体細胞培養から回収、精製される。精製の間、低濃度(約0.15〜5mM)のカルシウムイオンが存在することが好ましい。(Priceら,J.Biol.Chem.,244:917(1968))。要すれば、成熟蛋白質の配置完了に蛋白質の再生(refolding)工程を使用できる。最後に、最終精製工程に高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用できる。
本発明のポリペプチドは、天然の精製生成物でも、化学的合成法による生成物でも、真核または原核宿主から組換技術により生成されたもの(例えば、培養中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞による)でもよい。組換製造操作において使用した宿主により、本発明のポリペプチドはグリコシル化されていても、非グリコシル化のものでもよい。本発明のポリペプチドには、最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでもよい。
本発明のポリペプチド、特にMCP−4は、創傷治癒の促進に使用することができる。MCP−4はケモカインであるので、白血球(単球、Tリンパ球、好塩球等のような)に対するケモアトラクタント(chemoattractant)であり、したがって、標的免疫細胞の創傷領域への浸潤を起こさせる。
MCP−4ポリペプチドは、抗腫瘍治療薬として、また、胸膜滲出または腹水のような悪性疾患の局所合併症の治療用にも使用できる。MCP−4の解剖空隙への滴下は局所単球蓄積および活性化を導くことができる。
in vivoにおけるMCPの存在は、住血吸虫症、施毛虫症および回虫症のような組織に侵入する寄生虫の幼虫を殺す別の機能を有する好酸球の存在を局所的に増加させる。したがって、MCP−4は寄生虫感染との闘いにも使用できる。
MCP−4ポリペプチドはまた、種々の造血先祖細胞の活性および分化の調節により、造血調節にも役割を果たすことができる。
また、本発明によれば、該ポリペプチドは、しばしば「遺伝子治療」と称される、in vivoにおけるそのようなポリペプチドの発現にも使用できる。
例えば、患者からの細胞を、ex vivoで、MCP−4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(DNAまたはRNA)で操作し、操作した細胞をついで、該ポリペプチドで治療すべき患者に供給する、このような方法は当該分野でよく知られている。例えば、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウイルス粒子を用いて細胞を公知の方法で操作することができる。
同様に、細胞は、例えば、公知の方法により、MCP−4ポリペプチドのin vivoにおける発現のため、in vivoで操作することができる。公知のように、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウイルス粒子を生産する生産細胞を患者にin vivoにて操作してポリペプチドとして投与し、in vivoで発現させることができる。本発明のポリペプチドを投与するこれらの方法および他の方法は本発明の教示から当業者に明らかである。例えば、操作細胞の発現ビヒクルは、レトロウイルス以外、例えば、適当なデリバリビヒクルと組み合わせた後、in vivo細胞操作に使用できるアデノウイルスでもよい。
本発明のポリペプチドは適当な医薬担体と組み合わせて用いてもよい。かかる組成物は医薬上有効量のポリペプチドと、医薬上許容される担体または賦形剤とからなる。かかる担体は、セイライン、セイライン緩衝液、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびその組み合わせを包含するが、これらに限定されるものではない。処方を投与の形式に適用させる。
本発明はまた、該発明の医薬組成物の1またはそれ以上の成分を充填した1またはそれ以上の容器からなる医薬用パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を取り締まる政府機関により規定された形式の注意書であって、ヒトに投与する製品の製造、使用または販売についての機関による認証を反映している注意書をかかる容器に添付することができる。加えて、本発明のポリペプチドを他の治療用化合物と組み合わせて使用してもよい。
医薬組成物は、常法、例えば局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経鼻内または皮内経路により投与してもよい。MCP−4は特定の適用症の治療および/または予防に有効な量にて投与される。対象に投与するMCP−4の量および投与計画は、投与方法、治療される症状の性質または療法を指示する顧問医の判断などの多くの因子に依存するであろう。一般に、MCP−4は少なくとも約10μg/kg体重の量で投与され、大抵の場合、約8mg/kg体重/日を越えない量にて投与される。大抵の場合、投与量は、投与経路、徴候などを考慮して約10μg/kg体重/日から約1mg/kg体重/日である。
本発明の配列はまた染色体を同定するのに有用である。配列を特に標識化し、個々のヒト染色体上の特定の位置でハイブリダイズさせることができる。その上、染色体上の特定の部位を同定することについての要求がある。実際の配列データに基づく染色体マーキング試薬(繰り返し多形体)は、現在、染色体の位置をマークするのにほとんど利用されない。本発明にしたがってDNAの染色体へのマッピングは、それらの配列を疾患に関連する遺伝子と相関させる重要な第1工程である。
簡単には、配列は、PCRプライマー(好ましくは15〜25bp)をcDNAから製造することにより染色体にマップさせることができる。cDNAのコンピューター分析は、ゲノムDNA中の1より多くのエキソンにまたがらない、すなわち増幅工程を複雑にしないプライマーを速やかに選択する。ついで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに用いる。該プライマーに相当するヒト遺伝子含有のバイブリッドだけが増幅フラグメントを生成するであろう。
体細胞バイブリッドのPCRマッピングは特定のDNAを特定の染色体に割り当てるための迅速な手段である。本発明を同一のオリゴヌクレオチドプライマーで用いると、サブローカリゼーションが、同様の方法にて特定の染色体または大きなゲノムクローンのプールに由来のフラグメントのパネルを用いて達成され得る。同様に、その染色体にマップするのに用いることができる他のマッピング法は、系内でのハイブリダイゼーション、標識されたフロー選別染色体を用いる予備スクリーニング、およびハイブリダイゼーションに付し、染色体特異的cDNAライブラリーを構築する予備セレクションを包含する。
cDNAクローンの中期染色体スプレッドへの蛍光・イン・シトゥ・ハイブリダイゼーション(FISH)を用い、一工程において正確な染色体位置を得ることができる。この技法は500または600塩基のような短いcDNAで行うことができる;しかしながら、2,000bpより長いクローンが、単一検出に十分なシグナル強度で独特な染色体位置に結合する可能性が高い、FISHはESTを誘導する、長いほど良好であるクローンの使用を必要とする。例えば、2,000bpがよく、4,000がさらによく、適度の百分率の時間の良好な結果を得るのに、おそらく4,000以上は必要ではない。この方法を検討するには、Vermaら、Human Chromosome:a Manual of Basic Techniques、Pergamon Press、New York(1988)を参照のこと。
配列が正確な染色体位置にマップされると、その染色体上の該配列の物理的位置をゲノムマップデータと相関させることができる。そのようなデータは、例えば、V.McKusick、Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University Welch Medical Libraryよりオン・ラインにて利用可能)に見られる。ついで、同じ染色体領域にマップされた、遺伝子と疾患の間の関係を係合分析(物理的に隣接する遺伝子の共同遺伝)を介して同定する。
次に、影響を受けたおよび受けていない個体の間のcDNAまたはゲノム配列の違いを決定することが必要である。正常な個体では観察されないが、いくつかのまたはすべての影響を受けた個体で変異が観察されるならば、その場合、変異がその疾患の原因であるかもしれない。
物理的マッピング技法および遺伝マッピング技法の分解で、疾患に付随する染色体領域に正確に局在化されたcDNAが、50と500の間の潜在的病因性遺伝子の一であるとすることができる。(これは1メガ塩基マッピング分解および20kb当たり1遺伝子を仮定する)。
影響を受けた個体と影響を受けていない個体の比較は、一般に、最初に染色体における構造的変化、例えば、染色体スプレッドから可視可能であるか、またはcDNA配列に基づくPCRを用いて検出可能な欠失または転座を調査することを包含する。最終的に、いくつかの個体由来の遺伝子の配列を完全に決定し、変異の存在を確認し、多形体からの変異を区別することが要求される。
ポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導体、またはそのアナログ、またはそれらを発現する細胞を、抗体を産生するための免疫原として用いることができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体とすることができる。本発明はまた、キメラ抗体、一本鎖抗体およびヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産物を包含する。かかる抗体およびフラグメントの産生に当該分野にて知られている種々の操作を用いることができる。
本発明の配列に対応するポリペプチドに対して産生される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注射することにより、またはポリペプチドを好ましくはヒト以外の動物に投与することにより得ることができる。ついで、こうして得られた抗体はポリペプチドそのものと結合する。このように、ポリペプチドのフラグメントだけをコードする配列であっても完全な天然ポリペプチドに結合する抗体を生成するのに用いることができる。ついで、かかる抗体を用いてそのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離することができる。
モノクローナル抗体の製造では、連続的細胞系培養により得られる抗体を供給するいずれの方法も用いることができる。例えば、ハイブリドーマ法(KohlerおよびMilstein、1975、Nature、256:495−497)、トリオーマ法、ヒトB−細胞ハイブリドーマ法(Kozborら、1983、Immunology Today 4:72)およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBV−ハイブリドーマ法(Coleら、1985、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R.Liss,Inc.、pp.77−96)。
一本鎖抗体の産生について記載されている技法(米国特許第4,946,778号)は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する一本鎖抗体を産生するのに用いることができる。
本発明はまた、定性的かつ定量的に、MCP−4のレベルを検出するための診断アッセイに関する。このようなアッセイは当該分野において周知であり、ELISAアッセイおよびラジオイムノアッセイを包含する。該アッセイにて検出されるMCP−4のレベルは、種々の疾患におけるMCP−4の有意性を解明するのに、およびMCP−4が作用しているかもしれない疾患の診断に用いることができる。
本発明はMCP−4レセプターの同定方法を提供する。MCP−4レセプターをコードする遺伝子は発現クローニングにより同定できる。簡単には、ポリアデニル化RNAをMCP−4に応答する細胞より調製し、このRNAから形成されたcDNAライブラリーをプールに分け、COS細胞またはMCP−4に応答しない他の細胞をトランスフェクションするのに用いる。ガラススライド上で増殖させたトランスフェクション細胞を標識されたMCP−4に暴露する。MCP−4は、部位特異的蛋白質キナーゼについての認識部位のヨウ素化または封入を包含する種々の手段により標識させることができる。固定し、かつインキュベートした後、スライドをオートラジオグラフ分析に付す。陽性のプールを同定し、サブプールを調製し、繰り返しサブプーリング法および再スクリーニング法を用いて再トランスフェクションし、最終的に推定レセプターをコードする単クローンを生成する。レセプターを同定する別法として、標識されたMCP−4を、MCP−4レセプター分子を発現する細胞膜または抽出調製物と光親和性結合させることができる。架橋物質をPAGEで分解し、x−線フィルムに暴露する。MCP−4レセプター含有の標識された複合体を切除し、ペプチドフラグメントに分解し、蛋白質ミクロ配列決定に付すことができる。ミクロ配列決定より得られるアミノ酸配列を用いて一対のジェネレート・オリゴヌクレオチド・プローブを設計し、cDNAライブラリーをスクリーンし、推定レセプターをコードする遺伝子を同定する。
本発明はまた、MCP−4のそのレセプターに対する相互作用を亢進する(アゴニスト)または遮断する(アンタゴニスト)薬を同定するための薬スクリーニング法を提供する。アゴニストはMCP−4の生物学的機能を向上させ、一方、アンタゴニストはそのような機能を減少または排除する。例えば、MCP−4レセプターを発現する哺乳動物の細胞または膜調製物を、薬の存在下で標識されたMCP−4と一緒にインキュベートする。そして、薬のこの相互作用の亢進能または遮断能を測定することができる。また、MCP−4とそのレセプターの相互作用の後の公知の第2メッセンジャー系の応答を、薬の存在下または不在下で比較して測定する。かかる第2メッセンジャー系は、cAMPグアニレート・シクラーゼ、イオンチャネルまたはホスホイノシチド加水分解を包含するが、これに限定されない。
また、本発明は、本発明ポリペプチドに対するアンタゴニスト/阻害剤分子に指向される。アンタゴニストはMPC−4の陰性優勢変異体を包含する。MCP−4は四量体ポリペプチドであり、その中で1個の変異単位がポリペプチド全体を無機能なものにしている。MCP−4の陰性優勢変異体はMCP−4受容体に結合するが、それが結合する細胞(白血球および単球)を活性化しない。MCP−4の陰性優勢変異体を検出するためのアッセイは、インビトロでの化学走性アッセイであり、該アッセイにおいてポリビニルピロリドン不含ポリカーボネート膜を装備した多ウェル化学走性チャンバーを用いて、潜在的なアンタゴニスト/阻害剤またはアゴニスト分子の存在下および不存在下において白血球に対するMCP−4の化学誘引能を測定する。
阻害剤の例はアンチセンスDNAまたはRNA構築物である。アンチセンス法を用いて、3重らせん形成またはアンチセンスDNAもしくはRNAにより遺伝子発現を調節することができ、その方法のいずれもがポリヌクレオチドのDNAもしくはRNAへの結合に基づいている。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の5'コーディング部分を用いて長さ約10ないし40塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計する。転写に関与する遺伝子領域に相補的であるようにDNAオリゴヌクレオチドを設計し(3重らせん−リー(Lee)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)、第6巻:3073頁(1979年);クーニー(Cooney)ら、サイエンス(Science)、第241巻:456頁(1988年);およびダーバン(Dervan)ら、サイエンス、第251巻:1360頁(1990年)参照)、それにより転写およびMCP−4の産生を防止する。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドはインビボでmRNAにハイブリダイゼーションし、mRNA分子のMCP−4への翻訳をブロックする(アンチセンス−オカノ(Okano)、ジャーナル・オブ・ニューロケミストリー(J.Neurochem.)、第56巻:560頁(1991年);オリゴヌクレオタイズ・アズ・アンチセンス・インヒビターズ・オブ・ジーン・イクスプレッション(Oligonucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression)、CRC Press,Boca Raton,FL(1988))。別法として、アンチセンスRNAおよびDNAを細胞に送り込んで、それらがインビボで発現されてMCP−4の産生を阻害するようにしてもよい。
アンタゴニストの別の例は、生物学的機能を失っているが、やはり受容体を認識して結合し、そのことにより受容体を効果的にブロッキングする天然または合成により修飾されたMCP−4アナログであるMCP−4のペプチド誘導体である。
アンタゴニスト/阻害剤を用いて、創傷または外傷部位への単球の誘引を防止することにより炎症を治療してもよく、また、急性および慢性の炎症性の肺疾患は肺の単球食細胞の没収に関連しているので、正常な肺のマクロファージ数を調節することもできる。MCPレベルはリューマチ性関節炎の患者由来の滑液中で上昇することが見いだされており、それによりMCPの滑液産生は単球を誘引し、その流入および活性が変質性および炎症性双方の関節障害の病理において重要であることが示唆されているため、それらを用いてリューマチ性関節炎を治療してもよい。
MCPは動脈壁における単球の浸潤を媒介し、浸潤はアテローム性動脈硬化症を引き起こすので、アンタゴニスト/阻害剤をアテローム性動脈硬化症を治療に用いてもよく、さらに、MCPは好塩基球によるヒスタミン放出を直接誘導することが示されているので、アンタゴニスト/阻害剤をアレルギーの防止に用いてもよい。
結核は、細胞を、通常には単球を標的とし、単球にMCPを放出させ、そのことによりより多くの単球が肺に誘引されて重篤な感染を引き起こすので、アンタゴニスト/阻害剤を用いて結核のごとき感染症を治療してもよい。例えば、上記の医薬上許容される担体を伴った医薬組成物中にアンタゴニスト/阻害剤を用いてもよい。
さらに本発明は、MCP−4に特異的な潜在的アンタゴニスト/阻害剤を同定するためのアッセイにも関する。かかるアッセイの例は、競争的阻害アッセイに適する条件下で、MCP−4ならびに潜在的なアンタゴニスト/阻害剤を膜結合MCP−4受容体または組み換えMCP−4受容体と結合させる。例えば、放射活性によってMCP−4を標識することができ、その結果、受容体に結合したMCP−4分子数により潜在的なアンタゴニスト/阻害剤の有効性を決定することができる。
さらに本発明を下記実施例を参照して説明する。しかしながら、本発明はかかる実施例に限定されないことが理解されるべきである。特記しない限り、すべての部または量は重量により表される。
下記実施例の理解を容易にするために、頻出する特定の方法および/または用語を説明する。
「プラスミド」は、大文字および/または数が前および/または後についた小文字pにより命名される。本発明の出発プラスミドは市販され、制約なしに公に得られるものであるか、あるいは公表された手順によって使用可能なプラスミドから構築されうる。さらに、記載されたのと均等なプラスミドが当該分野において知られており、当業者に明らかであろう。
DNAの「消化」とは、DNAの特定配列にのみ作用する制限酵素でのDNAの触媒的開裂をいう。本発明に用いる種々の制限酵素は市販されており、当業者に知られたそれらの反応条件、コファクターおよび他の必要因子が用いられる。分析を目的とする場合には、典型的には、約20μlの緩衝液中、1μgのプラスミドまたはDNAフラグメントを約2ユニットの酵素とともに使用する。プラスミド構築のためのDNAフラグメントの単離を目的とする場合には、典型的には、より大きな体積中で、5ないし50μgのDNAを20ないし250ユニットの酵素で消化する。個々の制限酵素に適するバッファーおよび基質量が製造者により詳述されている。37℃で1時間のインキュベーション時間が通常用いられるが、供給者の説明に従って変更してもよい。消化後、反応物を直接ポリアクリルアミドゲルに乗せて所望フラグメントを単離する。
ゲデル,ディー(Goeddel,D.)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第8巻:4057頁(1980年)により記載されている8パーセントのポリアクリルアミドゲルを用いて開裂フラグメントのサイズ分離を行う。
「オリゴヌクレオチド」とは、化学合成してもよい1本鎖ポリヌクレオチドまたは2本の相補的ポリヌクレオチドをいう。かかる合成オリゴヌクレオチドは5'リン酸を有しておらず、かくして、キナーゼ存在下でATPを用いてリン酸を付加しない場合は別のオリゴヌクレオチドに連結しないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに連結するであろう。
「連結」とは、2本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する工程をいう(マニアティス,ティー(Maniatis,T.)ら、上記文献、146頁)。特記しない限り、ほぼ等モル量の連結すべきDNAフラグメント0.5μgにつき10ユニットのT4 DNAリガーゼ(「リガーゼ」)を用い、既知のバッファーおよび条件を用いて連結を行ってよい。
特記しない限り、グラハム,エフ(Graham,F.)およびファン・デル・エブ,エイ(Van der Eb,A.)、ウイロロジー(Virology)、第52巻:456〜457頁(1973年)に記載のごとく形質転換を行った。
実施例1
MCP−4の細菌での発現および精製
まず、MCP−4をコードしているDNA配列ATCC75703を、プロセッシングされたMCP−4蛋白の5'ならびに3'配列(シグナルペプチド配列を欠くもの)およびMCP−4遺伝子に対するベクター配列3'に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。MCP−4に対応するさらなるヌクレオチドをそれぞれ5'および3'配列に付加した。5'オリゴヌクレオチドヌクレオチドプライマーは配列5'−TCAGGATCCCCTACGGGCTCGTGGTC−3'を有し、プロセッシングされた蛋白のコドンの推定末端アミノ酸から始まるMCP−4コーディング配列のうちの18個のヌクレオチドが後に続くBamHI制限酵素部位を含んでいる。3'配列3'−CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT−5'は、XbaI部位およびMCP−4 DNAインサートの3'側に存在するpBluescript SKベクター配列に相補的な配列を含んでいる。制限酵素部位は細菌発現ベクターpQE−9(キアゲン・インコーポレイテッド(Quiagen、Inc.)9529 Eton Avenue,Chestworth,CA,91311)上の制限酵素部位に対応している。pQE−9は抗生物質耐(Ampr)、細菌の複製開始点(ori)、IPTG−調節可能プロモーターオペレーター(P/O)、リボゾーム結合部位(RBS)、6−Hisタグおよび制限酵素部位をコードしている。次いで、pQE−9をBamHIおよびXbaIで消化した。増幅された配列をpQE−9中に連結し、ヒスチジンタグおよびRBSをコードしている配列とフレームを合わせて挿入した。図5は、この配置をスキーム的に表したものである。次いで、サムブルック,ジェイ(Sambrook,J.)ら、モレキュラー・クローニング:ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、Cold Spring Laboratory Press、1989年に記載の手順により、連結混合物を用いて、商標名M15/rep4としてキアジェンから市販されているイー・コリ(E.coli)m15/rep4株を形質質転換した。M15/rep4は多コピーのプラスミドpERP4を含んでおり、該プラスミドはlacIリプレッサーを発現し、カナマイシン耐性(Kanr)を付与する。LBプレート上での増殖能により形質転換体を同定し、アンピシリン/カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを単離し、制限分析により確認した。所望構築物を含むコロニーを、Amp(100μg/ml)およびKan(25μg)双方を補足したLB培地中の液体培養で一晩(O/N)増殖させた。O/N培養物を用いて、1:100ないし1:250の割合で大型培養に接種する。光学密度が0.4と0.6の間になるまで細胞を増殖させた。次いで、IPTG([イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド])を添加して最終濃度1mMとした。IPTGは、P/Oを解除してlacIリプレッサーを不活性化し、遺伝子発現の増大を引き起こすことにより誘導を行う。細胞をさらに3ないし4時間増殖させた。次いで、細胞を遠心分離により集めた。細胞ペレットをカオトロピック剤である6モラーのグアニジン塩酸中に可溶化した。清澄化後、6−Hisタグを含む蛋白による強い結合を可能にする条件下でのニッケル−キレートカラムでのクロマトグラフィーにより、可溶化したMCP−4をこの溶液から精製した。ホチュリ,イー(Hochuli,E.)ら、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー(J.Chromatography)、第411巻:177〜184頁(1984年)。MCP−4(純度95%)は、6モラーのグアニジン塩酸(pH5.0)中のカラムから溶離され、再生を目的として3モラーのグアニジンHCl、100mMのリン酸ナトリウム、10ミリモラーのグルタチオン(還元型)および2ミリモラーのグルタチオン(酸化型)に調節した。この溶液中で12時間インキュベーション後、蛋白を10ミリモラーのリン酸ナトリウムに対して透析した。図4。
実施例2
ヒト・細胞におけるMCP−4の発現パターン
ノーザンブロット分析を行ってヒト・細胞におけるMCP−4の発現レベルを試験した。RNAzolTMBシステム(バイオテックス・ラボラトリーズ・インコーポレイテッド(Biotex Laboratories,Inc.)、6023 South Loop East,Houston,TX 77033)を用いて全細胞RNA試料を単離した。特定されたそれぞれのヒト組織から単離した全RNA約1.0μgを1%アガロースゲルで分離し、ナイロンフィルター上にブロットした(サムブルック、フリッチュ、およびマニアティス(Sambrook,Fritsch,and Maniatis)、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)、Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989))。50ngのDNAフラグメントを用いて、ストラタジーン(Stratagene)のPrime-Itキットによって標識反応を行った。標識DNAをSelect-G-50カラムで精製した(5プライム−3プライム・インコーポレイテッド(5Prime-3Prime,Inc.)、5603 Arapathoe Road,Boulder,CO 80303)。次いで、0.5M NaPO4,pH7.4および7%SDS中、65℃において、フィルターを、1000000cpm/mlの標識全長MCP−4遺伝子とハイブリダイゼーションさせた。フィルターを0.5xSSC、0.1% SDSで、室温で2回、次いで、60℃で2回洗浄した後、−70℃で一晩フィルターを増強スクリーンに一晩曝露した。MCP−4に対するメッセンジャーRNAは、活性化ならびに未活性化T細胞、単球およびT細胞系において豊富であった。図3。
上記教示によれば本発明の多くの修飾および変更が可能であり、それゆえ、添付した請求の範囲の範囲内において、特記しない限り本発明を実施することができる。
配列表
(1)一般的情報:
(i)出願人:リーら
(ii)発明の名称:単球化学走性蛋白質−4
(iii)配列の数:2
(iv)連絡先:
(A)宛て名:カレラ、バイアン、ベイン、ジルフィルマン、チェッキ、スチュワート、およびオルステン
(B)通り名:ベッカー・ファーム・ロード6
(C)都市名:ローズランド
(D)州名:ニュージャージー
(E)国名:アメリカ合衆国
(F)ZIP:07068
(v)コンピューター・リーダブル・フォーム:
(A)メディウムタイプ:3.5インチ・ディスケット
(B)コンピューター:IBM PS/2
(C)オペレイティングシステム:MS−DOS
(D)ソフトウェア:ワードパーフェクト5.1
(vi)現在の出願データ:
(A)出願番号:
(B)出願日:本明細書とともに提出
(C)分類:
(vii)先の出願データ:
(A)出願番号:
(B)出願日:
(viii)代理人等の情報:
(A)氏名:フェラーロ,グレゴリー・ディー
(B)登録番号:36134
(C)代理人等における処理番号:325800−160
(ix)テレコミュニケーションの情報:
(A)電話番号:201−994−1700
(B)ファックス番号:201−994−1744
(2)配列番号:1に関する情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:360塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列の記載:配列番号:1:
(2)配列番号:2に関する情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:119アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:蛋白
(xi)配列の記載:配列番号:2:
Claims (18)
- (a)配列番号:2のアミノ酸−22ないし97を含むポリペプチドをコードする核酸;
(b)配列番号:2のアミノ酸1ないし97を含むポリペプチドをコードする核酸;
(c)配列番号:1の核酸;
(d)1個ないし数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されている配列番号:2のアミノ酸−22ないし97を含み、白血球に対するケモアトラクタントであるMCP−4の活性を有する、ポリペプチドをコードする核酸;
(e)1個ないし数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されている配列番号:2のアミノ酸1ないし97を含み、白血球に対するケモアトラクタントであるMCP−4の活性を有する、ポリペプチドをコードする核酸;
および
(f)1個ないし数個の核酸が欠失、置換および/または付加されている配列番号:1の核酸;
からなる群より選択される核酸を含むポリヌクレオチド。 - DNAである請求項1のポリヌクレオチド。
- ゲノムDNAである請求項2のDNA。
- RNAである請求項1のポリヌクレオチド。
- 請求項1ないし4のいずれか1項のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 原核宿主細胞または真核宿主細胞における発現を可能にする発現制御配列に該ポリヌクレオチドが作動可能に連結されている請求項5のベクター。
- 請求項5または6のベクターで遺伝子操作された宿主細胞。
- 請求項7の宿主細胞を培養し、該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを培養物から回収することを特徴とする、白血球に対するケモアトラクタントであるポリペプチドの製造方法。
- 請求項5または6のベクターを用いて細胞を遺伝子操作することを特徴とする、白血球に対するケモアトラクタントであるポリペプチドを発現しうる細胞の製造方法。
- 請求項1ないし4のいずれか1項のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含むか、あるいは請求項8の方法により得ることのできるポリペプチド。
- N−末端メチオニン残基を含む請求項10のポリペプチド。
- 請求項10または11のポリペプチドに対する抗体。
- 異種ポリヌクレオチドに融合する請求項1ないし4のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
- 宿主細胞が原核細胞、真核細胞、脊椎動物細胞、Cos細胞、CHO細胞またはイー・コリ細胞である、請求項7記載の宿主細胞。
- ポリペプチドが標識されているか、修飾されているか、あるいはポリエチレングリコールに融合されている、請求項10または11記載のポリペプチド。
- ポリペプチドが異種ポリペプチドに融合されている、請求項10または11記載のポリペプチド。
- 請求項10または11に記載のポリペプチドに特異的に結合する、請求項12記載の抗体。
- ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項12または17記載の抗体。
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