JP2002320492A - ヒトケモカインβ−１１およびヒトケモカインα−１ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトケモカインポリペプチド、およびそのよ
うなケモカインポリペプチドをコードするＤＮＡ(ＲＮ
Ａ)、およびそのようなポリペプチドを組換え技術によ
り製造する方法を開示する。 【解決手段】 そのようなケモカインポリペプチドを、
白血病、腫瘍、慢性感染、自己免疫疾患、線維症障害、
創傷治癒および乾癬の処置に利用する方法もまた開示す
る。そのようなケモカインポリペプチドに対するアンタ
ゴニスト、および慢性関節リウマチ、自己免疫疾患、お
よび慢性並びに急性の炎症性並びに感染症、アレルギー
反応、プロスタグランジンとは無関係の発熱、骨髄不全
を処置するための治療法としての、それらの使用もまた
開示する。核酸配列における変異、およびポリペプチド
の濃度変化に関係がある疾患を検出するための診断アッ
セイもまた開示する。ケモカインポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドにおける変異を検出するための、
および宿主におけるポリペプチドのレベル変化を検出す
るための診断アッセイもまた開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの使用、さらにはまた、そのよう
なポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に関す
る。とりわけ、本発明のポリペプチドは、時として以下
でヒトケモカインβ−１１(Ｃkβ−１１)およびヒトケ
モカインα−１(Ｃkα−１)と呼ぶ、ヒトケモカインポ
リペプチドである。本発明はまた、そのようなポリペプ
チドの作用を阻害することにも関する。

【０００２】インタークリン(intercrine)サイトカイン
とも呼ばれるケモカインは、構造上および機能上関係の
あるサイトカインのサブファミリーである。これらの分
子は、大きさが８−１０kdである。一般に、ケモカイン
は、アミノ酸レベルで２０〜７５％の相同性を示し、ま
た２つのジスルフィド結合を形成する、４つの保存され
たシステイン残基により特徴付けられる。最初の２つの
システイン残基の配置に基づいて、ケモカインは、２つ
のサブファミリー、αおよびβに分類されている。αサ
ブファミリーでは、最初の２つのシステインが１つのア
ミノ酸により分けられていることから、「Ｃ−Ｘ−Ｃ」
サブファミリーと呼ばれる。βサブファミリーでは、２
つのシステインが隣接した位置にあることから、「Ｃ−
Ｃ」サブファミリーと呼ばれる。これまで、このファミ
リーの少なくとも８つの異なったメンバーがヒトにおい
て同定されている。

【０００３】インタークリンサイトカインは、広範囲に
わたる様々な機能を示す。特質的な(hallmark)特徴は、
単球、好中球、Ｔリンパ球、好塩基球、および線維芽細
胞を含め、別の細胞種の走化性移動を誘引する、それら
の能力である。多くのサイトカインは、前炎症活性を有
しており、また炎症性反応の間の多数の過程に関与す
る。これらの活性には、ヒスタミン放出、リソソーム酵
素並びにロイコトリエン放出の刺激、標的免疫細胞の内
皮細胞への付着の増加、補体タンパク質の結合の向上、
顆粒球付着分子並びに補体受容体の発現の誘発、および
レスピラトリーバーストが含まれる。炎症におけるそれ
らの関与に加えて、あるケモカインは他の活性を示すこ
とが示されている。例えば、マクロファージ炎症性タン
パク質１(ＭＩＰ−１)は造血幹細胞の増殖を抑制するこ
とができ、血小板因子(ＰＦ−４)は内皮細胞増殖の有効
な阻害剤であり、インターロイキン−３(ＩＬ−８)はケ
ラチノサイトの増殖を促進し、またＧＲＯはメラノーマ
細胞に対するオートクリン増殖因子である。

【０００４】様々な生物学的活性から考えて、ケモカイ
ンが、リンパ球のトラフィッキング(trafficking)、創
傷治癒、造血調節、およびアレルギー、喘息、並びに関
節炎といったような免疫学的障害を含め、多くの生理学
的状態および疾患状態に関係していることは驚くべきこ
とではない。

【０００５】「Ｃ−Ｃ」分枝のメンバーは、それらの効
果を次の細胞に対して発揮する：寄生生物を死滅させ
て、寄生生物感染を減少させ、また呼吸器系の気道にお
ける慢性炎症を引き起こす好酸球；脊椎動物における腫
瘍形成を抑制するマクロファージ；およびアレルギー性
炎症における役割を担うヒスタミンを放出する好塩基
球。しかし、１つの分枝のメンバーは、普通、他の分岐
のケモカインに応答する細胞に対して効果を発揮し得る
ことから、その分岐のメンバーに正確な役割を結び付け
ることはできない。

【０００６】Ｃ−Ｃ分枝のメンバーは主に単核細胞に対
して作用し、またＣ−Ｘ−Ｃ分枝のメンバーは主に好中
球に対して作用するが、別の化学誘引物質の特性は、こ
のガイドラインに基づいてケモカインに属し得ない。あ
るファミリーに由来する幾つかのケモカインは、他の特
色を示す。

【０００７】本発明のポリペプチドは、保存されたシス
テイン残基を有する、つまり、Ｃkβ−１１は「Ｃ−
Ｃ」を有し、Ｃkα−１は「Ｃ−Ｘ−Ｃ」領域を有し、
またそれらは、既知のケモカインに対して高いアミノ酸
配列の相同性を有することから、ヒトケモカインとして
推定的に特徴付けられている。

【０００８】本発明の一態様により、ヒトＣkβ−１１
およびＣkα−１である新規ポリペプチド、さらにはま
た、生物学的に活性であって、診断上または治療上有用
な、そのフラグメント、アナログおよび誘導体を提供す
る。

【０００９】本発明の別の態様により、mＲＮＡ、ＤＮ
Ａ、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含め、そのようなポリペ
プチドをコードする、単離された核酸分子、さらにはま
た、生物学的に活性であって、診断上または治療上有用
な、そのフラグメント、アナログおよび誘導体を提供す
る。

【００１０】本発明の別の態様により、Ｃkβ−１１お
よびＣkα−１配列へ特異的にハイブリダイズするのに
十分な長さの核酸分子を含んでなる核酸プローブを提供
する。本発明のまたさらなる態様により、そのようなポ
リペプチドを組換え技術により製造する方法であって、
当該タンパク質の発現、およびその後の当該タンパク質
の回収を促進する条件下、Ｃkβ−１１またはＣkα−１
核酸配列を含む組換え原核および／または真核宿主細胞
を培養することを含んでなる方法を提供する。

【００１１】本発明のまたさらなる態様により、そのよ
うなポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを、治療目的に、例えば、固
体(solid)腫瘍、慢性感染、白血病、Ｔ細胞により媒介
される自己免疫疾患、寄生生物感染、乾癬、喘息、アレ
ルギーを処置するために、造血を調節するために、増殖
因子活性を刺激するために、脈管形成を阻害するため
に、また創傷治癒を促進するために利用する方法を提供
する。

【００１２】本発明のまたさらなる態様により、そのよ
うなポリペプチドに対する抗体を提供する。

【００１３】本発明のまた別の態様により、例えば、あ
る自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症、慢性炎症並
びに感染症、ヒスタミン並びにＩgＥにより媒介される
アレルギー反応、プロスタグランジンとは無関係の発
熱、骨髄不全、癌、珪肺症、サルコイドーシス、慢性関
節リウマチ、ショック、過エオシン好性症候群、および
喘息の肺における線維症の処置において、そのようなポ
リペプチドの作用を阻害するために使用することができ
る、そのようなポリペプチドに対するアンタゴニストを
提供する。

【００１４】本発明の別の態様により、Ｃkβ−１１ま
たはＣkα−１核酸配列、およびそのような核酸配列に
よりコードされるタンパク質における変異に関係がある
疾患、または疾患に対する感受性を診断する方法を提供
する。

【００１５】本発明のまたさらなる態様により、そのよ
うなポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを、科学的研究、ＤＮＡの合
成、およびＤＮＡベクターの製造に関係があるインビト
ロにおける目的に利用する方法を提供する。

【００１６】本発明のこれらの態様および他の態様は、
本明細書中の教示から当業者に明らかであろう。

【００１７】次の図面は、本発明の態様を説明するもの
であって、請求の範囲により包含される本発明の範囲を
限定しようとするものではない。第１図は、Ｃkβ−１
１のcＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示
す。最初の１７個のアミノ酸はリーダー配列を示すこと
から、推定される成熟ポリペプチドは８１個のアミノ酸
を含んでなる。アミノ酸に関する標準的な１文字略号を
使用する。配列決定は、３７３ 自動化ＤＮＡシークエ
ンサー(Ａpplied Ｂiosystems,Ｉnc.)を使用して行っ
た。配列決定の正確さは、９７％以上正確であると予想
される。第２図は、Ｃkα−１のcＤＮＡ配列および対応
する推定アミノ酸配列を示す。最初の２２個のアミノ酸
はリーダー配列を示すことから、推定される成熟ポリペ
プチドは８７個のアミノ酸を含んでなる。アミノ酸に関
する標準的な１文字略号を使用する。第３図は、Ｃkβ
−１１(上段)とラットＲＡＮＴＥＳポリペプチド(下段)
との間のアミノ酸配列の相同性を示す。第４図は、Ｃk
α−１とＯvis Ａriesインターロイキン−８(下段)との
間のアミノ酸配列の相同性を示す。

【００１８】本発明の一態様により、第１図(配列番号
２)および第２図(配列番号４)の推定アミノ酸配列を有
する成熟ポリペプチド、または１９９４年１１月１１日
にＡＴＣＣ寄託番号第７５９４８号(Ｃkβ−１１)およ
び同第７５９４７号(Ｃkα−１)として寄託されたクロ
ーンのcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドを
コードする、単離された核酸(ポリヌクレオチド)を提供
する。

【００１９】Ｃkβ−１１をコードするポリヌクレオチ
ドは、多数のヒト成人および胎児cＤＮＡライブラリ
ー、例えば、ヒト胎児脾臓cＤＮＡライブラリーから単
離することができる。Ｃkβ−１１は、Ｃ−Ｃ分枝のケ
モカインのメンバーである。それは、９８個のアミノ酸
残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフ
レームを含み、このうち、最初の約１７個のアミノ酸残
基は推定されるリーダー配列であることから、成熟タン
パク質は８１個のアミノ酸を含んでなる。そのタンパク
質は、ラットＲＡＮＴＥＳポリペプチドに対し、８９個
のアミノ酸範囲にわたり、３１％の同一性および４７％
の類似性をもって、最も高い程度の相同性を示す。ケモ
カインにおける４つの空間的に保存されたシステイン残
基が、そのポリペプチドにおいて見い出されることもま
た重要である。

【００２０】Ｃkα−１をコードするポリヌクレオチド
は、多数のヒト成人および胎児cＤＮＡライブラリー、
例えば、ヒト扁桃腺cＤＮＡライブラリーから単離する
ことができる。Ｃkα−１は、Ｃ−Ｘ−Ｃ分枝のケモカ
インのメンバーである。それは、１０９個のアミノ酸残
基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレ
ームを含み、このうち、最初の約２２個のアミノ酸残基
は推定されるリーダー配列であることから、成熟タンパ
ク質は８７個のアミノ酸を含んでなる。そのタンパク質
は、ヒツジ(Ｏvis Ａries)由来のインターロイキン−８
に対し、９７個のアミノ酸範囲にわたり、３１％の同一
性および８０％の類似性をもって、最も高い程度の相同
性を示す。ケモカインにおける４つの空間的に保存され
たシステイン残基が、そのポリペプチドにおいて見い出
されることもまた重要である。

【００２１】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該
ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖で
あるなら、コード鎖または非コード(アンチ−センス)鎖
であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列
は、第１図(配列番号１)および第２図(配列番号３)に示
すコード配列もしくは寄託されたクローンのコード配列
と同じであってよく、または遺伝コードの重複または縮
重の結果として、第１図(配列番号１)および第２図(配
列番号３)のＤＮＡもしくは寄託されたcＤＮＡと同じ成
熟ポリペプチドをコードする異なったコード配列であっ
てもよい。

【００２２】第１図(配列番号２)および第２図(配列番
号４)の成熟ポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによ
りコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドには、以下のものが含まれ得る：成熟ポリペプ
チドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配
列、およびリーダーもしくは分泌配列またはプロタンパ
ク質配列といったような付加的コード配列；成熟ポリペ
プチドのコード配列(また場合により、付加的コード配
列)、および成熟ポリペプチドのコード配列のイントロ
ンまたは非コード配列５'および／または３'といったよ
うな非コード配列。

【００２３】従って、「ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコード配
列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた、付
加的コードおよび／または非コード配列が含まれるポリ
ヌクレオチドを包含する。

【００２４】本発明はさらに、第１図(配列番号２)およ
び第２図(配列番号４)の推定アミノ酸配列を有するポリ
ペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコ
ードされるポリペプチドのフラグメント、アナログおよ
び誘導体をコードする、上記のポリヌクレオチドの変異
体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレ
オチドの天然に存在するアレル変異体またはポリヌクレ
オチドの天然には存在しない変異体であり得る。

【００２５】従って、本発明には、第１図(配列番号２)
および第２図(配列番号４)に示すのと同じ成熟ポリペプ
チドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコード
される同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドの変
異体が含まれ、これらの変異体は、第１図(配列番号２)
および第２図(配列番号４)のポリペプチドまたは寄託さ
れたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチ
ドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードす
る。そのようなヌクレオチド変異体には、欠失変異体、
置換変異体、および付加または挿入変異体が含まれる。

【００２６】先に示したように、該ポリヌクレオチド
は、第１図(配列番号１)および第２図(配列番号３)に示
すコード配列の天然に存在するアレル変異体または寄託
されたクローンのコード配列の天然に存在するアレル変
異体であるコード配列を有し得る。当業界で知られてい
るように、アレル変異体は、１つまたはそれ以上のヌク
レオチドの置換、欠失または付加を有し得る別の形のポ
リヌクレオチド配列であり、これは、コードされるポリ
ペプチドの機能を実質的には変えない。

【００２７】本発明にはまた、成熟ポリペプチドのコー
ド配列が、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分
泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば、細胞からの
ポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機
能するリーダー配列に、同じ読み枠内で融合し得るポリ
ヌクレオチドも含まれる。リーダー配列を有するポリペ
プチドがプレタンパク質であり、また宿主細胞により切
断されて、成熟型のポリペプチドを形成したリーダー配
列を有することがある。該ポリヌクレオチドはまた、付
加的５'アミノ酸残基を加えた成熟タンパク質であるプ
ロタンパク質もコードし得る。プロ配列を有する成熟タ
ンパク質がプロタンパク質であり、また不活性型のタン
パク質である。プロ配列が一度切断されると、活性成熟
タンパク質が残る。

【００２８】従って、例えば、本発明のポリヌクレオチ
ドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を有するタンパ
ク質、またはプロ配列およびプレ配列(リーダー配列)の
両方を有するタンパク質をコードし得る。

【００２９】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能とするマーカー配列に枠内
で融合したコード配列も有し得る。細菌宿主の場合に
は、そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリ
ペプチドの精製を提供するための、pＱＥ−９ベクター
により与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ(tag)であっ
てよく、または、例えば、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯ
Ｓ−７細胞を使用する場合には、そのマーカー配列は、
赤血球凝集素(ＨＡ)タグであってよい。ＨＡタグは、イ
ンフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピ
トープに対応する(Ｗilson,Ｉ.ら、Ｃell、３７：７６
７（１９８４）)。

【００３０】本発明はさらに、配列間に少なくとも５０
％、また好ましくは７０％の同一性がある場合に、上記
の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポ
リヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド
に関する。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェ
ント条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、
また好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合に
のみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを
意味する。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチド
にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、第１図(配
列番号１)および第２図(配列番号３)のcＤＮＡまたは寄
託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチド
と同じ生物学的機能または活性を実質的には保有するポ
リペプチドをコードする。

【００３１】本明細書中で言う寄託は、特許手続上の微
生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件の
下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者
への便宜として与えられるものであって、寄託が３５
Ｕ.Ｓ.Ｃ. §１１２下に要求されることを承認するもの
ではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチ
ドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリ
ペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成し
て、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際は
いつでも照合している。寄託された物質を製造し、使用
し、または販売するには、実施許諾が要求され得、また
そのような実施許諾は、ここでは付与されない。

【００３２】本発明はさらに、第１図(配列番号２)およ
び第２図(配列番号４)の推定アミノ酸配列を有する、ま
たは寄託されたcＤＮＡによりコードされるアミノ酸配
列を有するポリペプチド、さらにはまた、そのようなポ
リペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関
する。

【００３３】第１図(配列番号２)および第２図(配列番
号４)のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコ
ードされるポリペプチドを示す場合、「フラグメン
ト」、「誘導体」および「アナログ」という用語は、そ
のようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能また
は活性を保有するポリペプチドを意味する。従って、ア
ナログには、プロプロテイン部分を切断することにより
活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造することが
できるプロプロテインが含まれる。

【００３４】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ま
しくは組換ポリペプチドであってよい。

【００３５】第１図(配列番号２)および第２図(配列番
号４)のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコ
ードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体または
アナログは、（ｉ）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基
が同型または非同型アミノ酸残基(好ましくは、同型ア
ミノ酸残基)で置換されており、またそのような置換ア
ミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるものであっ
てもよく、またはコードされたものでなくてもよいも
の、（ii）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に置換基
が含まれるもの、または（iii）成熟ポリペプチドが、
該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例えば、
ポリエチレングリコール)のような、他の化合物と融合
しているもの、または（iv）リーダーもしくは分泌配
列、または成熟ポリペプチドの精製に使用される配列、
またはプロプロテイン配列といったような、付加的アミ
ノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているものであり得
る。そのようなフラグメント、誘導体およびアナログ
は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思わ
れる。

【００３６】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ま
しくは、均一となるまで精製される。

【００３７】「単離された」という用語は、物質がその
元の環境(例えば、それが天然に存在するなら、天然の
環境)から除去されていることを意味する。例えば、生
きている動物にある天然に存在するポリヌクレオチドま
たはポリペプチドは単離されていないが、天然の系にお
ける共存物質のいくつかまたは全てから分離された同じ
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されてい
る。そのようなポリヌクレオチドはベクターの部分とな
り得、および／またはそのようなポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは組成物の部分となり得、またそのよう
なベクターまたは組成物はその天然の環境の部分ではな
いという点で、なお単離されている。

【００３８】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
が含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作
された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え
技術による製造にも関する。

【００３９】宿主細胞は、例えば、クローニングベクタ
ーまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺
伝的に操作される(トランスデュースされ、またはトラ
ンスフォームされ、またはトランスフェクトされる)。
該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、フ
ァージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プロ
モーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、
またはＣkβ−１１またはＣkα−１遺伝子を増幅するの
に適するよう改変された従来の栄養培地で培養すること
ができる。温度、pＨ等といったような培養条件は、発
現用に選択された宿主細胞で先に使用した培養条件であ
って、当業者に明らかであろう。

【００４０】本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを
組換え技術により製造するのに使用することができる。
従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチド
を発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに
含ませることができる。そのようなベクターには、染色
体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０
の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロ
ウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮ
Ａとの組合せから得られるベクター；ワクシニア、アデ
ノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったような
ウイルスＤＮＡが含まれる。しかし、他のいずれのベク
ターも、それが宿主中で複製可能であって、生存可能で
ある限り、使用することができる。

【００４１】適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベク
ターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を
当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアー
ゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、
当業者の範囲内であると思われる。

【００４２】発現ベクターのＤＮＡ配列を、適当な発現
制御配列(プロモーター)に作動可能に結合し、mＲＮＡ
合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例とし
て、以下のものが挙げられる：ＬＴＲまたはＳＶ４０プ
ロモーター、Ｅ.coli. lacまたはtrp、ファージラムダ
Ｐ_Ｌプロモーター、および原核もしくは真核細胞または
それらのウイルスでの遺伝子の発現を制御することが知
られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻
訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結区も
含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配
列も含み得る。

【００４３】さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の
場合にはジヒドロフォレートレダクターゼまたはネオマ
イシン耐性といったような、またはＥ.coliではテトラ
サイクリンまたはアンピシリン耐性といったような、ト
ランスフォームされた宿主細胞の選択のための表現型特
性を与えるために、１つまたはそれ以上の選択可能なマ
ーカー遺伝子を含むのが好ましい。

【００４４】上記のような適当なＤＮＡ配列、さらには
また、適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクタ
ーを、適当な宿主をトランスフォームするために使用し
て、その宿主がタンパク質を発現するのを可能にするこ
とができる。

【００４５】適当な宿主の代表例として、以下のものが
挙げられる：Ｅ.coli、Ｓtreptomyces、Ｓalmonella ty
phimuriumといったような細菌細胞；酵母のような真菌
細胞；Ｄrosophila Ｓ２およびＳpodoptera Ｓf９とい
ったような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢowesメラ
ノーマといったような動物細胞；アデノウイルス；植物
細胞等。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当
業者の範囲内であると思われる。

【００４６】とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載
した配列を１つまたはそれ以上含んでなる組換え構築物
も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆
方向で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベク
ターといったようなベクターを含んでなる。この実施態
様の好ましい態様では、該構築物はさらに、例えば、該
配列に作動可能に結合したプロモーターを含め、制御配
列を含んでなる。適当なベクターおよびプロモーターが
多数、当業者に知られていて、市販されている。次のベ
クターを例として挙げる。細菌用： pＱＥ７０、pＱＥ
６０、pＱＥ−９(Ｑiagen)、pＢＳ、pＤ１０、ファージ
スクリプト(phagescript)、psiＸ１７４、pＢluescript
ＳＫ、pＢＳＫＳ、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ１８
Ａ、pＮＨ４６Ａ(Ｓtratagene)；pＴＲＣ９９a、pＫＫ
２２３−３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ
５(Ｐharmacia)。真核生物用： pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２
ＣＡＴ、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ(Ｓtratagene)、p
ＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ(Ｐharmacia)。
しかし、他のいずれのプラスミドまたはベクターも、そ
れらが宿主中で複製可能であって、生存可能である限
り、使用することができる。

【００４７】プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望
の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベク
ターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。個々
に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、
Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰ_Ｒ、Ｐ_Ｌおよびtrpが含まれ
る。真核プロモーターには、ＣＭＶ即時初期(immediate
early)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期Ｓ
Ｖ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスの
メタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当なベクターおよ
びプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲
内である。

【００４８】さらなる態様では、本発明は、上記の構築
物を含む宿主細胞に関する。その宿主細胞は、哺乳動物
細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核
細胞であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような
原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リ
ン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキ
ストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポ
レーションにより行うことができる。(Ｄavis,Ｌ.、Ｄi
bner,Ｍ.、Ｂattey,Ｌ.、Ｂasic Ｍethods inＭolecula
r Ｂiology（１９８６）)。

【００４９】宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用し
て、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造す
ることができる。あるいはまた、本発明のポリペプチド
は、従来のペプチド合成装置により合成的に製造するこ
とができる。

【００５０】成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中
で発現させることができる。そのようなタンパク質を、
本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造
するために、無細胞翻訳系もまた使用することができ
る。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニ
ングおよび発現ベクターは、Ｓambrookら、Ｍolecular
Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual, 第２版、Ｃold Ｓ
pring Ｈarbor、ニューヨーク、（１９８９)により記載
されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。

【００５１】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベク
ターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、
プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、
約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。
例には、bp １００〜２７０の、複製開始点の後期側に
あるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期
プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にある
ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハ
ンサーが含まれる。

【００５２】通例、組換え発現ベクターには、複製開始
点、および宿主細胞のトランスフォーメーションを可能
にする選択可能なマーカー、例えば、Ｅ.coliのアンピ
シリン耐性遺伝子並びにＳ.cerevisiae ＴＲＰ１遺伝
子、および下流の構造配列の転写を行わせるために高度
に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれ
るであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３
−ホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系
酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショック
タンパク質をコードするオペロンから得ることができ
る。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開始および終結配
列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺
腔または細胞外媒体への分泌を行わせることができるリ
ーダー配列と共に、適当な相(phase)で構築される。場
合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特性、例え
ば、発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易
化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパ
ク質をコードすることができる。

【００５３】細菌で使用するのに有用な発現ベクター
は、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、
適当な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能的なプ
ロモーターを有する作動可能なリーディング相に挿入す
ることにより構築される。そのベクターは、ベクターの
維持を確実なものとするために、また所望により、宿主
内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現
型の選択可能なマーカーおよび複製開始点を含んでなる
であろう。トランスフォーメーションに適当な原核宿主
には、Ｅ.coli、Ｂacillus subtilis、Ｓalmonella typ
himurium、およびＰseudomonas属、Ｓtreptomyces属、
並びにＳtaphylococcus属の範囲内の様々な種が含まれ
るが、他のものもまた、選択物質として使用することが
できる。

【００５４】代表的であるが、非限定的な例として、細
菌で使用するのに有用なベクターは、周知のクローニン
グベクター pＢＲ３２２(ＡＴＣＣ ３７０１７)の遺伝
要素を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択
可能なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んでなり得
る。そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ２
２３−３(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals、Ｕppsala、ス
ウェーデン)およびpＧＥＭ１(Ｐromega Ｂiotec、Ｍadi
son、ＷＩ、米国)が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨
核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構
造配列と組み合わせる。

【００５５】適当な宿主株をトランスフォーメーション
して、その宿主株を適当な細胞密度まで増殖させた後、
選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温度シ
フトまたは化学誘導)により誘導して、細胞をさらなる
期間培養する。

【００５６】細胞を、一般的には、遠心分離により収集
し、物理的または化学的方法により破壊して、その結果
得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保有する。

【００５７】タンパク質の発現に使用される微生物細胞
は、凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的破壊、また
は細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても
破壊でき、そのような方法は、当業者に周知である。

【００５８】組換えタンパク質を発現させるために、様
々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。
哺乳動物発現系の例には、Ｇluzman、Ｃell、２３：１
７５（１９８１）により記載されている、サルの腎臓線
維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合可能なベクターを
発現させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２
７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨＫ細胞系が含ま
れる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプ
ロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの必要な
リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス
ドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および
５'に隣接する非転写配列もまた含んでなるであろう。
ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列、お
よびポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転
写遺伝要素を与えることができる。

【００５９】該ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまた
はエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交
換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラ
フィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトク
ロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー
が含まれる方法により、組換え細胞培養物から回収し
て、精製することができる。必要に応じて、タンパク質
の再生工程を、成熟タンパク質の立体配置を完成するの
に使用することができる。最後に、高性能液体クロマト
グラフィー(ＨＰＬＣ)を最終精製工程に使用することが
できる。

【００６０】本発明のポリペプチドは、天然に精製され
た産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、また
は原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細
菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によっ
て)組換え技術により製造することができる。組換え製
造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され
得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオ
ニンアミノ酸残基が含まれ得る。

【００６１】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、ヒト疾患に対する処置および診断の発見のため
の研究試薬および物質として使用することができる。

【００６２】ヒトケモカインポリペプチドは、癌の化学
療法の間の、また白血病に対する補助的保護処置とし
て、骨髄幹細胞のコロニー形成を阻害するために使用す
ることができる。

【００６３】該ヒトケモカインポリペプチドはまた、ケ
ラチノサイトの過増殖により特徴付けられる乾癬の処置
として、表皮ケラチノサイト増殖を阻害するために使用
することもできる。

【００６４】該ヒトケモカインポリペプチドはまた、宿
主防御細胞、例えば、細胞障害性Ｔ細胞およびマクロフ
ァージの侵入および活性化を刺激することにより、また
腫瘍の脈管形成を阻害することにより、固形腫瘍を処置
するために使用することもできる。それらはまた、耐性
の慢性および急性感染、例えば、殺菌性白血球の誘引お
よび活性化によるミコバクテリア感染に対する宿主防御
を高めるために使用することもできる。

【００６５】該ヒトケモカインポリペプチドはまた、Ｔ
細胞により媒介される自己免疫疾患およびリンパ性白血
病の処置のためのＩＬ−２生合成の阻害により、Ｔ細胞
増殖を阻害するために使用することもできる。

【００６６】Ｃkβ−１１およびＣkα−１はまた、デブ
リ(debris)をクリアリングする、また結合組織を促進す
る炎症性細胞の漸増によって、また過剰のＴＧＦβによ
り媒介される線維症の制御によっても、創傷治癒を刺激
するために使用することもできる。これと同じ方法で、
Ｃkβ−１１およびＣkα−１をまた、肝硬変、変形性関
節症および肺線維症が含まれる、他の線維症障害を処置
するために使用することもできる。

【００６７】該ヒトケモカインポリペプチドはまた、住
血吸虫症、旋毛虫症および回虫症でのように、組織に侵
入する寄生生物の幼虫を殺すという、特徴のある機能を
有する好酸球の存在も増加させる。

【００６８】それらはまた、様々な造血始原細胞の活性
化および分化を調節することにより、造血を調節するた
めに、例えば、化学療法後に成熟白血球を骨髄から放出
させるために使用することもできる。

【００６９】該ポリヌクレオチド、およびそのようなポ
リヌクレオチドによりコードされるポリペプチドはま
た、科学的研究、ＤＮＡの合成、およびＤＮＡベクター
の製造に関係があるインビトロにおける目的に、またヒ
ト疾患の処置に対する治療および診断を設計するために
利用することもできる。

【００７０】完全な長さのＣkβ−１１またはＣkα−１
遺伝子のフラグメントは、完全な長さの遺伝子を単離す
るために、また該遺伝子に対する高い配列類似性、また
は類似の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離するた
めに、cＤＮＡライブラリーに対するハイブリダイゼー
ションプローブとして使用することができる。この種類
のプローブは、通例、少なくとも２０塩基を有する。好
ましくは、しかし、該プローブは、少なくとも塩基を有
しており、また通例、５０塩基を越えないが、それら
は、より多数の塩基を有していてもよい。該プローブは
また、完全な長さの転写物、およびゲノムクローン、ま
たは調節並びにプロモーター領域、エキソン、およびイ
ントロンが含まれる、完全な遺伝子を含むクローンに対
応するcＤＮＡクローンを同定するのに使用することも
できる。スクリーニングの例は、既知のＤＮＡ配列を使
用してオリゴヌクレオチドプローブを合成することによ
り、遺伝子のコード領域を単離することを含んでなる。
本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識化オ
リゴヌクレオチドを、ヒトのcＤＮＡ、ゲノムＤＮＡま
たはmＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするため
に使用して、ライブラリーのどのメンバーにプローブが
ハイブリダイズするかを決定する。

【００７１】本発明はまた、Ｃkβ−１１またはＣkα−
１核酸配列における変異の存在に関係がある疾患、また
は疾患に対する感受性を検出するための診断アッセイの
一部としての、Ｃkβ−１１またはＣkα−１遺伝子の使
用にも関する。そのような疾患、例えば、腫瘍および癌
は、ヒトケモカインポリペプチドの発現不足に関係があ
る。

【００７２】Ｃkβ−１１またはＣkα−１遺伝子におい
て変異が起こっている個体は、様々な技術により、ＤＮ
Ａレベルで検出することができる。診断用の核酸は、患
者の細胞から、例えば、血液、尿、唾液、組織生検およ
び剖検材料から得ることができる。ゲノムＤＮＡは、検
出のために直接使用することができ、または分析前にＰ
ＣＲ(Ｓaikiら、Ｎature、３２４：１６３−１６６（１
９８６）)を利用することにより、酵素的に増幅するこ
とができる。ＲＮＡまたはcＤＮＡもまた、同じ目的に
使用することができる。例としては、Ｃkβ−１１また
はＣkα−１をコードする核酸に相補的なＰＣＲプライ
マーを使用して、Ｃkβ−１１またはＣkα−１変異を同
定して分析することができる。例えば、欠失および挿入
は、正常な遺伝子型と比較しての増幅産物のサイズにお
ける変化により検出することができる。点変異は、増幅
されたＤＮＡが、放射能標識化Ｃkβ−１１またはＣkα
−１のＲＮＡ、あるいはまた、放射能標識化Ｃkβ−１
１またはＣkα−１のアンチセンスＤＮＡ配列にハイブ
リダイズすることにより同定することができる。完全に
対合している配列は、ＲＮアーゼ Ａ 消化により、また
は融解温度の相違により、対合していない複式物(duple
xes)と区別することができる。

【００７３】ＤＮＡ配列の相違に基づいた遺伝試験は、
変性剤を含む、または含まないゲルでのＤＮＡフラグメ
ントの電気泳動移動度における変化の検出により成し遂
げることができる。小さな配列の欠失および挿入は、高
分解能ゲル電気泳動により視覚化することができる。Ｄ
ＮＡフラグメントの様々な配列は、ホルムアミジングラ
ジエントゲルを変性することで区別することができ、こ
こでは、様々なＤＮＡフラグメントの移動度が、それら
の特異的な融解または部分的な融解温度により、ゲルに
おける様々な位置で遅延される(例えば、Ｍyersら、Ｓc
ience、２３０：１２４２（１９８５）を参照)。

【００７４】特定の位置での配列変化もまた、ＲＮアー
ゼおよびＳ１保護といったようなヌクレアーゼ保護アッ
セイ、または化学切断法により示すことができる(例え
ば、Ｃottonら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−
４４０１（１９８５）)。従って、特異的なＤＮＡ配列
の検出は、ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーション、Ｒ
Ｎアーゼ保護、化学切断、直接ＤＮＡ配列決定、または
制限酵素の使用(例えば、制限酵素断片長多型（ＲＦＬ
Ｐ）)、およびサザンブロッティングといったような方
法により成し遂げることができる。

【００７５】さらに従来的なゲル電気泳動およびＤＮＡ
配列決定に加えて、変異はまた、insitu 分析により検
出することもできる。

【００７６】本発明はまた、正常な対照の組織試料と比
較しての該タンパク質の過剰発現により、疾患、または
疾患に対する感受性、例えば、腫瘍の存在を検出するこ
とができることから、様々な組織におけるＣkβ−１１
またはＣkα−１タンパク質レベルの変化を検出するた
めの診断アッセイにも関する。宿主から得られた試料中
のＣkβ−１１またはＣkα−１タンパク質レベルを検出
するために利用されるアッセイは当業者に周知であっ
て、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェス
タンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、および「サン
ドイッチ」アッセイが含まれる。ＥＬＩＳＡアッセイ
(Ｃoliganら、Ｃurrent Ｐrotocols in Ｉmmunology、
１（２）、第６章、（１９９１）)は、まず最初に、Ｃk
β−１１またはＣkα−１抗原に特異的な抗体、好まし
くはモノクローナル抗体を調製することを含んでなる。
さらに、リポーター抗体を、そのモノクローナル抗体に
対して調製する。そのリポーター抗体に、放射能、蛍
光、または本実施例では、ワサビペルオキシダーゼ酵素
といったような、検出可能な試薬を結合させる。試料を
宿主から取り除いて、試料中のタンパク質を結合する固
形保持体、例えば、ポリスチレン皿の上でインキュベー
トする。次いで、ＢＳＡのような、非特異的なタンパク
質と共にインキュベートすることにより、その皿の上の
空いているタンパク質結合部位を全て覆う。次に、モノ
クローナル抗体を皿においてインキュベートするが、そ
の間に、そのモノクローナル抗体は、ポリスチレン皿に
結合した全てのＣkβ−１１またはＣkα−１タンパク質
に結合する。結合しなかったモノクローナル抗体を全
て、緩衝液で洗い流す。ワサビペルオキシダーゼに結合
したリポーター抗体を直ちに皿に置くと、リポーター抗
体の、Ｃkβ−１１またはＣkα−１に結合した全てのモ
ノクローナル抗体への結合が起こる。次いで、結合しな
かったリポーター抗体を洗い流す。次いで、ペルオキシ
ダーゼ基質を皿に加えて、一定時間に発生した色の量
は、標準曲線に対して比較する場合、患者の試料の一定
体積中に存在するＣkβ−１１またはＣkα−１タンパク
質の量の測定値である。

【００７７】競合アッセイを利用することができ、ここ
では、Ｃkβ−１１またはＣkα−１に特異的な抗体を固
形保持体に結合させて、標識化Ｃkβ−１１またはＣkα
−１および宿主から得られた試料を固形保持体上に通過
させて、例えば、液体シンチレーションクロマトグラフ
ィーにより検出される標識の量を、試料中のＣkβ−１
１またはＣkα−１の量に関連づけることができる。

【００７８】「サンドイッチ」アッセイは、ＥＬＩＳＡ
アッセイに似ている。「サンドイッチ」アッセイでは、
Ｃkβ−１１またはＣkα−１を固形保持体上に通過させ
て、固形保持体に結合した抗体に結合させる。次いで、
第二抗体をＣkβ−１１またはＣkα−１に結合させる。
標識化され、また第二抗体に特異的な第三抗体を固形保
持体上に通過させて、第二抗体に結合させた後、量を定
量することができる。

【００７９】本発明は、ヒトケモカインポリペプチドに
対する受容体の同定方法を提供する。該受容体をコード
する遺伝子は、当業者に知られている多数の方法、例え
ば、リガンドパンニングおよびＦＡＣＳ選別により同定
することができる(Ｃoliganら、Ｃurrent Ｐrotocols i
n Ｉmmun.、１（２)、第５章、（１９９１）)。好まし
くは、発現クローニングを使用し、ここでは、ポリアデ
ニル化ＲＮＡを該ポリペプチドに応答する細胞から調製
して、このＲＮＡから作られるcＤＮＡライブラリーを
プールに分けて、ＣＯＳ細胞または該ポリペプチドに応
答しない他の細胞をトランスフェクトするために使用す
る。ガラススライド上で増殖させた、トランスフェクト
された細胞を、標識化ポリペプチドにさらす。該ポリペ
プチドは、ヨウ素化または部位特異的プロテインキナー
ゼに対する認識部位の包含を含め、様々な方法により標
識化することができる。固定およびインキュベーション
に続いて、そのスライドをオートラジオグラフ分析にか
ける。陽性のプールを同定して、サブプールを調製し、
反復サブプーリングおよび再スクリーニング方法を利用
して、再びトランスフェクトし、最終的には、推定され
る受容体をコードする単一クローンを得る。

【００８０】受容体を同定するための他の方法として、
標識化ポリペプチドを細胞膜と光親和性により結合させ
るか、または受容体分子を発現する調製物を抽出するこ
とができる。橋かけ(cross-linked)物質をＰＡＧＥ分析
により分けて、Ｘ線フィルムにさらす。該ポリペプチド
の受容体を含む標識化複合体を切除し、ペプチドフラグ
メントに分けて、タンパク質ミクロ配列決定にかけるこ
とができる。ミクロ配列決定から得られるアミノ酸配列
を使用して、一組の縮重オリゴヌクレオチドプローブを
設計し、cＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、
推定される受容体をコードする遺伝子が同定されるであ
ろう。

【００８１】本発明は、本発明のヒトケモカインポリペ
プチドに対するアゴニストおよびアンタゴニストを同定
するために、化合物をスクリーニングする方法を提供す
る。アゴニストは、該ポリペプチドと同様の生物学的機
能を有する化合物であるが、アンタゴニストは、そのよ
うな機能をブロックする。本発明のポリペプチドのいず
れかにより化学誘引される細胞を、細胞を通すのに十分
な直径(約５μm)の細孔を有するフィルターの上部に置
くことにより、走化性をアッセイすることができる。可
能性のあるアゴニストの溶液を、上方のコンパートメン
ト(compartment)に適当な対照媒体の入ったチャンバー
の底部に置くことから、アゴニストの濃度グラジエント
を、時間中に多孔膜の中へ、または多孔膜を通って移動
する細胞を計数することにより測定する。

【００８２】アンタゴニストに関してアッセイする場
合、本発明のヒトケモカインポリペプチドをチャンバー
の底部に置いて、可能性のあるアンタゴニストを加え
て、その細胞の走化性が妨げられるかどうかを測定す
る。

【００８３】あるいはまた、化合物の存在下、該ポリペ
プチドの受容体を発現する哺乳動物細胞または膜調製物
を標識化ヒトケモカインポリペプチド、例えば、放射能
と共にインキュベートする。次いで、この相互反応をブ
ロックする化合物の能力を測定することができる。この
方法でアゴニストに関してアッセイする場合、ヒトケモ
カインポリペプチドは存在せず、また受容体と相互作用
するアゴニスト自体の能力を測定することができる。

【００８４】可能性のあるＣkβ−１１およびＣkα−１
アンタゴニストの例には、抗体、また幾つかの場合に
は、ポリペプチドに結合するオリゴヌクレオチドが含ま
れる。可能性のあるアンタゴニストの別の例は、ポリペ
プチドの負の(negative)優性突然変異体である。負の優
性突然変異体は、野生型のポリペプチドの受容体に結合
するが、生物学的活性を保有していないポリペプチドで
ある。

【００８５】アンチセンス技術を利用して製造されたア
ンチセンス構築物もまた、可能性のあるアンタゴニスト
である。アンチセンス技術を利用して、三重らせん形成
またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝
子発現を制御することができ、この方法は両方とも、ポ
リヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づ
く。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする、
ポリヌクレオチド配列の５'コード部分を使用して、長
さ約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌク
レオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転
写に関与する遺伝子領域に対して相補的であるよう設計
し(三重らせん−Ｌeeら、Ｎucl.Ａcids Ｒes.、６：３
０７３（１９７９）；Ｃooneyら、Ｓcience、２４１：
４５６（１９８８）；およびＤervanら、Ｓcience、２
５１：１３６０（１９９１）を参照)、そのことによっ
て、転写およびヒトケモカインポリペプチドの産生を妨
げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、イン
ビボにおいてmＲＮＡにハイブリダイズして、mＲＮＡ分
子のポリペプチドへの翻訳をブロックする(アンチセン
ス−Ｏkano、Ｊ.Ｎeurochem.、５６：５６０（１９９
１）；Ｏligodeoxynucleotides as Ａntisense Ｉnhibi
tors of Ｇene Ｅxpression、ＣＲＣ Ｐress、ＢocaＲa
ton、ＦＬ（１９８８）)。上記のオリゴヌクレオチドを
また、細胞に送り込むことから、アンチセンスＲＮＡま
たはＤＮＡをインビボにおいて発現させて、ヒトケモカ
インポリペプチドの産生を阻害することができる。

【００８６】別の可能性のあるヒトケモカインアンタゴ
ニストは、生物学的機能を失ってしまってはいるが、そ
れにもかかわらず、ポリペプチドの受容体を認識して結
合し、それによって、その受容体を有効にブロックする
ポリペプチドの、自然に、または合成的に修飾されたア
ナログである、ポリペプチドのペプチド誘導体である。
ペプチド誘導体の例には、これらに限定されるものでは
ないが、小さなペプチドまたはペプチド様分子が含まれ
る。

【００８７】該アンタゴニストは、ある自己免疫疾患お
よび慢性の炎症性疾患および感染症において、マクロフ
ァージ並びにそれらの前駆体の、および好中球、好塩基
球、Ｂリンパ球並びに幾つかのＴ細胞サブセット、例え
ば、活性化並びにＣＤ８細胞障害性Ｔ細胞、および天然
のキラー細胞の走化性並びに活性化を阻害するために使
用することができる。自己免疫疾患の例には、多発性硬
化症、およびインスリン依存性糖尿病が含まれる。

【００８８】該アンタゴニストはまた、単核食細胞の漸
増および活性化を妨げることにより、珪肺症、サルコイ
ドーシス、特発性肺線維症が含まれる感染症を処置する
ために使用することもできる。それらはまた、好酸球産
生および移動を妨げることにより、特発性過エオシン好
性症候群を処置するために使用することもできる。内毒
素性ショックもまた、マクロファージの移動および本発
明のヒトケモカインポリペプチドの産生を妨げることに
より、該アンタゴニストによって処置することができ
る。

【００８９】該アンタゴニストはまた、動脈壁における
単球浸潤を妨げることにより、アテローム性動脈硬化症
を処置するために使用することもできる。

【００９０】該アンタゴニストはまた、ケモカインによ
り誘発されるマスト細胞並びに好塩基球の脱顆粒、およ
びヒスタミンの放出を阻害することにより、ヒスタミン
により媒介されるアレルギー反応、および後期(late ph
ase)アレルギー反応、慢性じんま疹、並びにアトピー性
皮膚炎が含まれる免疫学的障害を処置するために使用す
ることもできる。アレルギー性喘息、鼻炎、および湿疹
といったような、ＩgＥにより媒介されるアレルギー反
応もまた処置することができる。

【００９１】該アンタゴニストはまた、単球の創傷領域
への誘引を妨げることにより、慢性および急性の炎症を
処置するために使用することもできる。それらはまた、
慢性および急性の炎症性肺疾患が、肺における単核食細
胞の腐骨形成と関連があることから、正常な肺のマクロ
ファージ数を調節するために使用することもできる。

【００９２】アンタゴニストはまた、患者の関節におい
て単球の滑液中への誘引を妨げることにより、慢性関節
リウマチを処置するために使用することもできる。単球
の流入および活性化は、変性および炎症性関節炎の両方
の病因において重要な役割を担う。

【００９３】該アンタゴニストはまた、他の炎症性サイ
トカインの生合成を妨げる、主としてＩＬ−１およびＴ
ＮＦが原因となる有害なカスケードを妨げるために使用
することもできる。この方法では、該アンタゴニストは
また、炎症を妨げるために使用することもできる。該ア
ンタゴニストはまた、ケモカインにより誘発される、プ
ロスタグランジンとは無関係の発熱を阻止するために使
用することもできる。

【００９４】該アンタゴニストはまた、骨髄不全の病
症、例えば、再生不良性貧血および脊髄形成異常症候群
を処置するために使用することもできる。

【００９５】該アンタゴニストはまた、肺における好酸
球蓄積を妨げることにより、喘息およびアレルギーを処
置するために使用することもできる。該アンタゴニスト
はまた、喘息肺の顕著な特徴である上皮下基底膜線維症
を処置するために使用することもできる。

【００９６】該アンタゴニストはまた、薬学上許容され
得る担体、例えば、以下に記載するような担体と共に、
組成物中で使用することもできる。

【００９７】該ヒトケモカインポリペプチドおよびアゴ
ニストおよびアンタゴニストは、適当な薬学的担体と組
み合わせて使用することができる。そのような組成物
は、治療上有効な量のポリペプチド、および薬学上許容
され得る担体または賦形剤を含んでなる。そのような担
体には、これに限定されるものではないが、生理食塩
水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロ
ール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれ
る。その製剤は、投与方法に適合すべきである。

【００９８】本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分
を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の
容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供す
る。そのような容器に関連して、薬学的または生物学的
製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により
規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒト
への投与のための製造、使用または販売の、該当局によ
る承認を表わす。さらに、該ポリペプチドおよびアゴニ
ストおよびアンタゴニストは、他の治療化合物と共に使
用することができる。

【００９９】該医薬組成物は、局所、静脈内、腹腔内、
筋肉内、腫瘍内、皮下、鼻腔内または皮内経路といった
ような、便利な方法で投与することができる。該医薬組
成物は、具体的な徴候を処置および／または予防するの
に有効な量で投与される。一般に、該ポリペプチドは、
少なくとも約１０μg／kg(体重)の量で投与され、最も
多くの場合、それらは、１日当り約８mg／kg(体重)を超
えない量で投与されるであろう。最も多くの場合、投与
経路および症状等を考慮に入れて、投薬量は、毎日約１
０μg／kg〜約１mg／kg(体重)である。

【０１００】該ヒトケモカインポリペプチド、およびポ
リペプチドであるアゴニストまたはアンタゴニストは、
「遺伝子治療」と呼ばれることが多い、そのようなポリ
ペプチドのインビボにおける発現により、本発明に従っ
て使用することができる。

【０１０１】従って、例えば、患者由来の細胞を、エク
スビボにおいてポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作した細胞
を該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような方
法は、当業界で周知である。例えば、本発明のポリペプ
チドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の使
用によって、細胞を当業界で既知の方法により操作する
ことができる。

【０１０２】同様に、例えば、当業界で既知の方法によ
り、ポリペプチドのインビボにおける発現のために、細
胞をインビボにおいて操作することができる。当業界で
知られているように、細胞をインビボにおいて処理し
て、ポリペプチドをインビボにおいて発現させるため
に、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレ
トロウイルス粒子を製造するための産生細胞を患者に投
与することができる。そのような方法により本発明のポ
リペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方
法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。例え
ば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイ
ルス以外のもの、例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合
わせた後、細胞をインビボにおいて操作するために使用
することができるアデノウイルスであってもよい。

【０１０３】本発明の配列はまた、染色体同定にも有益
である。その配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に
対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせること
ができる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同
定する必要がある。実際の配列データ(反復多型性)に基
づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマ
ークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤ
ＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を病気と
関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階である。

【０１０４】簡単に言えば、cＤＮＡ由来のＰＣＲプラ
イマー(好ましくは、１５−２５bp)を調製することによ
り、配列を染色体にマップすることができる。３'非翻
訳領域のコンピューター分析を使用して、ゲノムＤＮＡ
中の１つ以上のエクソンをスパン(span)しないプライマ
ーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑なものと
する。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色
体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに
使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含む、そ
れらのハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを
与えるであろう。

【０１０５】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅
速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いての本発明を利用して、サブローカリゼーション
は、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプー
ル由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達
成することができる。その染色体へマップするのに同様
に利用することができる他のマッピング方法には、in s
itu ハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティ
ッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニン
グ、および染色体特異的cＤＮＡライブラリーを構築す
るためのハイブリダイゼーションによるプレセレクショ
ンが含まれる。

【０１０６】cＤＮＡクローンの、中期染色体スプレッ
ドへの蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(ＦＩＳ
Ｈ)を利用して、正確な染色体位置を一工程で与えるこ
とができる。この技術は、５００または６００塩基とい
う短いcＤＮＡで利用することができる；しかし、それ
より大きいクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強
度を有する独自の染色体位置へ結合する可能性が高い。
ＦＩＳＨは、ＥＳＴが得られるクローンの使用を必要と
し、また長ければ長いほどよい。例えば、２,０００bp
が良好であり、４,０００はより良好であって、４,００
０以上は、恐らく、良好な結果を妥当な時間割合で得る
のに必要ない。この技術の復習には、Ｖermaら、Ｈuman
Ｃhromosomes：a Ｍanual of Ｂasic Ｔechniques、Ｐ
ergamon Ｐress、ニューヨーク（１９８８）を参照。

【０１０７】ある配列が正確な染色体位置に一度マップ
されると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデ
ータと関連付けることができる。そのようなデータは、
例えば、Ｖ.ＭcＫusick、Ｍendelian Ｉnheritance in
Ｍan(Ｊohns Ｈopkins Ｕniversity Ｗelch Ｍedical
Ｌibraryを介してオンラインで利用できる)に見い出さ
れる。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝
子と疾患との間の関係を結合分析(物理的に隣接した遺
伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認する。

【０１０８】次に、病気に冒された個体と冒されていな
い個体との間のcＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定
する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまた
は全てにおいて認められるが、いずれの正常な個体にお
いても認められないなら、その変異は疾患の原因となる
ものであるらしい。

【０１０９】現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッ
ピングの分析から、疾患と関連する染色体領域に正確に
局在化したcＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因とな
る遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガ
ベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝子
を仮定する)。

【０１１０】ポリペプチド、それらのフラグメントもし
くは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそ
れらを発現する細胞を免疫原として使用して、それらに
対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、
例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であ
り得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化
抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発
現ライブラリーの生成物も含まれる。当業界で既知の様
々な方法を、そのような抗体およびフラグメントの製造
に使用することができる。

【０１１１】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入
することにより、またはポリペプチドを動物、好ましく
はヒトでない動物に投与することにより得ることができ
る。次いで、そのようにして得られた抗体は、そのポリ
ペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリ
ペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、
完全な天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するの
に使用することができる。次いで、そのような抗体を使
用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプ
チドを単離することができる。

【０１１２】モノクローナル抗体を調製するには、連続
的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全
て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術
(ＫohlerおよびＭilstein、１９７５、Ｎature、２５
６：４９５−４９７)、トリオーマ(trioma)技術、ヒト
Ｂ細胞ハイブリドーマ技術(Ｋozborら、１９８３、Ｉmm
unology Ｔoday ４：７２)、およびヒトモノクローナル
抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Ｃo
leら、１９８５、Ｍonoclonal Ａntibodies andＣancer
Ｔherapy、Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.、７７−９６頁にお
いて)が含まれる。

【０１１３】単鎖抗体の産生に関して記載されている技
術(米国特許第４,９４６,７７８号)は、本発明の免疫原
性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を製造するのに適
合し得る。それにまた、トランスジェニックマウスを使
用して、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒ
ト化抗体を発現させることができる。

【０１１４】本発明をさらに、次の実施例に関して記載
する；しかし、本発明は、そのような実施例に限定され
ないことを理解すべきである。部または量は全て、特に
ことわらない限り、重量単位である。次の実施例の理解
を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法およ
び／または用語を記載する。

【０１１５】「プラスミド」は、前置きする小文字のp
および／または続けて大文字および／または数字により
示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されてい
て、限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、ま
たは公開された方法により入手可能なプラスミドから構
築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラス
ミドは、当業界で既知であって、当業者に明らかであろ
う。

【０１１６】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列に
のみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒切断することを示
す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されて
おり、それらの反応条件、補因子および他の必要条件
は、当業者に知られているように使用した。分析目的に
は、一般的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使
用する。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを
単離する目的には、一般的に、より多量の体積中、ＤＮ
Ａ５〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。
特定の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者
により指定されている。３７℃で約１時間のインキュベ
ーション時間が通常利用されるが、供給者の指示に従っ
て変えることができる。消化後、その反応物をポリアク
リルアミドゲルで直接電気泳動して、所望のフラグメン
トを単離する。切断したフラグメントのサイズ分離は、
Ｇoeddel,Ｄら、Ｎucleic Ａcids Ｒes.、８：４０５７
（１９８０）により記載されている８％ ポリアクリル
アミドゲルを用いて行う。

【０１１７】「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成
することができる、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、
または２つの相補的ポリヌクレオチド鎖を示す。そのよ
うな合成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを有さ
ないことから、キナーゼの存在下、ＡＴＰでホスフェー
トを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチドにラ
イゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、
脱リン酸化されていないフラグメントにライゲートする
であろう。

【０１１８】「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸
フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過
程をいう(Ｍaniatis,Ｔ.ら、同上、１４６頁)。特にこ
とわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせる
べきＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量の０.５μg当り
１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、
既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができ
る。

【０１１９】特にことわらない限り、トランスフォーメ
ーションは、Ｇraham,Ｆ.およびＶan der Ｅb,Ａ.、Ｖi
rology、５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記
載されているようにして行った。

【０１２０】

【実施例】

【０１２１】実施例 １ Ｃkβ−１１の細菌発現および精製 最初に、Ｃkβ−１１をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣ
Ｃ第７５９４８号を、プロセシングされたＣkβ−１１
核酸配列の５'および３'末端配列(推定されるシグナル
ペプチド配列なし)に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチ
ドプライマーを利用して増幅する。Ｃkβ−１１遺伝子
に対応する付加的ヌクレオチドを各々、５'および３'末
端配列に付加する。５'オリゴヌクレオチドプライマー
は、配列：5' CCCGCATGCC AACTCTGAGT GGCACCA 3'を有
し、ＳphＩ制限酵素部位(肉太の活字)、続いて、成熟タ
ンパク質をコードする配列の第２ヌクレオチドから始ま
る１８ヌクレオチドのＣkβ−１１コード配列(下線を引
いた活字)を含む。ＡＴＧコドンは、ＳphＩ部位に含ま
れる。ＡＴＧに続く次のコドンでは、１つ目の塩基がＳ
phＩ部位に由来し、また残りの２つの塩基は、推定され
る成熟タンパク質の最初のコドン(残基１８)の２つ目お
よび３つ目の塩基に対応する。３'配列：5' CCCGGATCCC
AATGCTTGAC TCGGACT 3'は、ＢamＨ１部位に対する相補
的配列(肉太の活字)、続いて、終止コドンより前に、１
８ヌクレオチドの遺伝子特異的配列を含む。その制限酵
素部位は、細菌発現ベクター pＱＥ−９(Ｑiagen,Ｉnc.
Ｃhatsworth、ＣＡ)上の制限酵素部位に対応する。pＱ
Ｅ−９は、抗生物質耐性(Ａmp^ｒ)、細菌の複製開始点(o
ri)、ＩＰＴＧ−調節可能なプロモーターオペレーター
(Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)、６−Ｈisタグ
および制限酵素部位をコードする。次いで、pＱＥ−９
をＳphＩおよびＢamＨ１で消化する。増幅された配列を
pＱＥ−９にライゲートして、ヒスチジンタグおよびＲ
ＢＳをコードする配列と共に枠内に挿入する。次いで、
そのライゲーション混合物を使用して、Ｓambrook,Ｊ.
ら、Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual、
Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress（１９８９）に記載
されている手順により、Ｅ.coli.株 Ｍ１５／rep４(Ｑi
agen,Ｉnc.)をトランスフォームする。Ｍ１５／rep４は
プラスミドpＲＥＰ４の多重コピーを含み、これは、lac
Ｉリプレッサーを発現して、またカナマイシン耐性(Ｋa
n^ｒ)も与える。トランスフォーマントを、それらがＬＢ
プレートで増殖する能力により同定して、アンピシリン
／カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドＤ
ＮＡを単離して、制限分析により確認する。所望の構築
物を含むコロニーを、Ａmp(１００ug／ml)とＫan(２５u
g／ml)の両方を補ったＬＢ培地中での液体培養で一晩増
殖させる(Ｏ／Ｎ)。そのＯ／Ｎ培養物を使用して、大き
な培養系に１：１００〜１：２５０の割合で播種する。
細胞が、０.４〜０.６の光学密度６００(Ｏ.Ｄ.^６００)
まで増殖する。次いで、ＩＰＴＧ(「イソプロピル−Ｂ
−Ｄ−チオガラクトピラノシド」)を、最終濃度が１mＭ
となるまで加える。ＩＰＴＧは、lacＩリプレッサーを
不活性化することにより、Ｐ／Ｏのクリアリングを誘導
し、遺伝子発現を増加させる。細胞をさらに３〜４時間
増殖させる。次いで、細胞を遠心分離により収集する。
細胞ペレットをカオトロピック剤である６モルのグアニ
ジンＨＣl pＨ ５.０中で可溶化する。清澄後、この溶
液から、６−ヒスチジンタグを含むタンパク質による強
固な結合を可能にする条件下、ニッケル−キレートカラ
ムでのクロマトグラフィーにより、可溶化したＣkβ−
１１を精製する(Ｈochuli,Ｅ.ら、Ｊ.Ｃhromatography
４１１：１７７−１８４（１９８４）)。６Ｍのグアニ
ジンＨＣl中、Ｃkβ−１１(純度 ＞９８％)をカラムか
ら溶出する。ＧnＨＣlからのタンパク質の再生は、幾つ
かのプロトコルにより成し遂げることができる(Ｊaenic
ke,Ｒ.およびＲudolph,Ｒ.、Ｐrotein Ｓtructure−Ａ
Ｐractical Ａpproach、ＩＲＬ Ｐress、ニューヨーク
（１９９０）)。まず最初に、段階透析を利用して、Ｇn
ＨＣＬを除去する。あるいはまた、Ｎi−キレートカラ
ムから単離される精製タンパク質を、減少型リニアＧn
ＨＣＬグラジエントを通す第２カラムに結合させること
ができる。そのタンパク質をカラムに結合している間に
再生させた後、２５０mＭのイミダゾール、１５０mＭの
ＮaＣl、２５mＭのトリス−ＨＣl(pＨ ７.５)および１
０％のグリセロールを含む緩衝液で溶出する。最後に、
可溶性タンパク質を、５mＭの重炭酸アンモニウムを含
む貯蔵緩衝液に対して透析する。

【０１２２】実施例 ２ Ｃkα−１の細菌発現および精製 最初に、Ｃkα−１をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ
第７５９４７号を、プロセシングされたＣkα−１核酸
配列(推定されるシグナルペプチド配列なし)の５'およ
び３'末端配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプ
ライマーを利用して増幅する。Ｃkα−１に対応する付
加的ヌクレオチドを各々、５'および３'末端配列に付加
する。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列：5'C
CCGCATGCC TTCTGGAGGT CTATTACACA 3'を有し、ＳphＩ制
限酵素部位(肉太の活字)、続いて、成熟タンパク質をコ
ードする配列の第２ヌクレオチドから始まる２１ヌクレ
オチドのＣkα−１コード配列を含む。ＡＴＧコドン
は、ＳphＩ部位に含まれる。ＡＴＧに続く次のコドンで
は、１つ目の塩基がＳphＩ部位に由来し、また残りの２
つの塩基は、推定される成熟タンパク質の最初のコドン
(残基２３)の２つ目および３つ目の塩基に対応する。結
果として、このコドンにおける１つ目の塩基は、もとの
配列と比較して、ＶalからＬeuに変わり、結果的には、
組換えタンパク質においてＥがＱに置き換わる。３'配
列：5' CCCGGATCCG GGAATCTTTC TCTTAAAC 3'は、ＢamＨ
１部位に対する相補的配列(肉太の活字)、続いて、終止
コドンより前に、１９ヌクレオチドの遺伝子特異的配列
を含む。その制限酵素部位は、細菌発現ベクター pＱＥ
−９(Ｑiagen,Ｉnc. Ｃhatsworth、ＣＡ)上の制限酵素
部位に対応する。pＱＥ−９は、抗生物質耐性(Ａm
p^ｒ)、細菌の複製開始点(ori)、ＩＰＴＧ−調節可能な
プロモーターオペレーター(Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部
位(ＲＢＳ)、６−Ｈisタグおよび制限酵素部位をコード
する。次いで、pＱＥ−９をＳphＩおよびＢamＨ１で消
化する。増幅された配列をpＱＥ−９にライゲートし
て、ヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードする配列と共
に枠内に挿入する。次いで、そのライゲーション混合物
を使用して、Ｓambrook,Ｊ.ら、Ｍolecular Ｃloning：
Ａ Ｌaboratory Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory
Ｐress（１９８９）に記載されている手順により、Ｅ.c
oli. Ｍ１５／rep４(Ｑiagen,Ｉnc.)をトランスフォー
ムする。Ｍ１５／rep４はプラスミドpＲＥＰ４の多重コ
ピーを含み、これは、lacＩリプレッサーを発現して、
またカナマイシン耐性(Ｋan^ｒ)も与える。トランスフォ
ーマントを、それらがＬＢプレートで増殖する能力によ
り同定して、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニー
を選択する。プラスミドＤＮＡを単離して、制限分析に
より確認する。所望の構築物を含むコロニーを、Ａmp
(１００ug／ml)とＫan(２５ug／ml)の両方を補ったＬＢ
培地中での液体培養で一晩増殖させる(Ｏ／Ｎ)。そのＯ
／Ｎ培養物を使用して、大きな培養系に１：１００〜
１：２５０の割合で播種する。細胞が、０.４〜０.６の
光学密度６００(Ｏ.Ｄ.^６００)まで増殖する。次いで、
ＩＰＴＧ(「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド」)を、最終濃度が１mＭとなるまで加える。ＩＰ
ＴＧは、lacＩリプレッサーを不活性化することによ
り、Ｐ／Ｏのクリアリングを誘導し、遺伝子発現を増加
させる。細胞をさらに３〜４時間増殖させる。次いで、
細胞を遠心分離により収集する。細胞ペレットをカオト
ロピック剤である６モルのグアニジンＨＣl pＨ ５.０
中で可溶化する。清澄後、この溶液から、６−ヒスチジ
ンタグを含むタンパク質による強固な結合を可能にする
条件下、ニッケル−キレートカラムでのクロマトグラフ
ィーにより、可溶化したＣkα−１を精製する(Ｈochul
i,Ｅ.ら、Ｊ.Ｃhromatography ４１１：１７７−１８４
（１９８４）)。６ＭのグアニジンＨＣl中、Ｃkα−１
(純度 ＞９８％)をカラムから溶出する。ＧnＨＣlから
のタンパク質の再生は、幾つかのプロトコルにより成し
遂げることができる(Ｊaenicke,Ｒ.およびＲudolph,
Ｒ.、Ｐrotein Ｓtructure−Ａ ＰracticalＡpproach、
ＩＲＬ Ｐress、ニューヨーク（１９９０）)。まず最初
に、段階透析を利用して、ＧnＨＣＬを除去する。ある
いはまた、Ｎi−キレートカラムから単離される精製タ
ンパク質を、減少型リニアＧnＨＣＬグラジエントを通
す第２カラムに結合させることができる。そのタンパク
質をカラムに結合している間に再生させた後、２５０m
Ｍのイミダゾール、１５０mＭのＮaＣl、２５mＭのトリ
ス−ＨＣl(pＨ ７.５)および１０％のグリセロールを含
む緩衝液で溶出する。最後に、可溶性タンパク質を、５
mＭの重炭酸アンモニウムを含む貯蔵緩衝液に対して透
析する。

【０１２３】実施例 ３ ＣＯＳ細胞における組換えＣkβ−１１の発現 プラスミド、Ｃkβ−１１ ＨＡの発現は、１）ＳＶ４０
複製開始点、２）アンピリシン耐性遺伝子、３）Ｅ.co
li 複製開始点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ４０ イン
トロンおよびポリアデニル化部位が続くＣＭＶプロモー
ターを含む、ベクター pcＤＮＡＩ／Ａmp(Ｉnvitrogen)
から得られる。完全なＣkβ−１１前駆体およびその３'
末端に枠内で融合したＨＡタグ(tag)をコードするＤＮ
Ａフラグメントを、そのベクターのポリリンカー領域に
クローン化することから、組換えタンパク質発現は、Ｃ
ＭＶプロモーターの下に指示される。ＨＡタグは、前記
のようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得
られるエピトープに対応する(Ｉ.Ｗilson、Ｈ.Ｎiman、
Ｒ.Ｈeighten、Ａ.Ｃherenson、Ｍ.Ｃonnolly、および
Ｒ.Ｌerner、１９８４、Ｃell ３７、７６７)。ＨＡタ
グを標的タンパク質へ融合させることにより、組換えタ
ンパク質を、ＨＡエピトープを認識する抗体で容易に検
出することが可能となる。 プラスミド構築方法を次のように記載する：Ｃkβ−１
１をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ第７５９４８号
を、２つのプライマーを用いてのＰＣＲにより構築す
る：５'プライマー5' AAAAAGCTTG CCATGGCCCT GCTACTG
3'は、ＨindIII部位、続いて、開始コドンに比べて３つ
の位置がないものから始まる１８ヌクレオチドのＣkβ
−１１コード配列を含む；３'配列5' CGCTCTAGAT TAAGC
GTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAT AGGTTAACTG CTGCGAC 3'
は、ＸbaＩ部位に対する相補的配列、翻訳終止コドン、
ＨＡタグ、およびＣkβ−１１コード配列の最後の１８
ヌクレオチド(終止コドンは含まれていない)を含む。従
って、ＰＣＲ産物は、ＨindIII部位、Ｃkβ−１１コー
ド配列、続いて、枠内で融合したＨＡタグ、そのＨＡタ
グの隣の翻訳終了終止コドン、およびＸbaＩ部位を含
む。ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡフラグメントおよび
ベクター、pcＤＮＡＩ／Ａmpを、ＨindIIIおよびＸbaＩ
制限酵素で消化して、ライゲートさせる。そのライゲー
ション混合物をＥ.coli株 ＳＵＲＥ(Ｓtratagene Ｃlon
ing Ｓystems、Ｌa Ｊolla、ＣＡ)にトランスフォーム
し、そのトランスフォームされた培養物をアンピシリン
培地プレート上に置いて、耐性コロニーを選択する。プ
ラスミド ＤＮＡをトランスフォーマントから単離し
て、正しいフラグメントの存在に関して制限分析により
試験する。組換えＣkβ−１１の発現には、ＤＥＡＥ−
ＤＥＸＴＲＡＮ方法により、ＣＯＳ細胞を発現ベクター
でトランスフェクトする(Ｊ.Ｓambrook、Ｅ.Ｆritsch、
Ｔ.Ｍaniatis、Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory
Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress、（１９
８９）)。Ｃkβ−１１ ＨＡタンパク質の発現を、放射
能標識および免疫沈降法により検出する(Ｅ.Ｈarlow、
Ｄ.Ｌane、Ａntibodies：Ａ Ｌaboratory Ｍanual、Ｃo
ld Ｓpring Ｌaboratory Ｐress、（１９８８）)。トラ
ンスフェクションから２日後、細胞を^３５Ｓ−システイ
ンで８時間標識化する。次いで、細胞培地を集めて、細
胞を界面活性剤(ＲＩＰＡ緩衝液(１５０mＭ ＮaＣl、１
％ ＮＰ−４０、０.１％ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０.
５％ ＤＯＣ、５０mＭ トリス、pＨ ７.５))で溶菌す
る。(Ｗilson,Ｉ.ら、同上 ３７：７６７（１９８
４）)。細胞溶菌液および培養培地は両方とも、ＨＡに
特異的なモノクローナル抗体で沈降する。沈降したタン
パク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。

【０１２４】実施例 ４ ＣＯＳ細胞における組換えＣkα−１の発現 プラスミド、Ｃkα−１ ＨＡの発現は、１）ＳＶ４０
複製開始点、２）アンピリシン耐性遺伝子、３）Ｅ.col
i 複製開始点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ４０ イン
トロンおよびポリアデニル化部位が続くＣＭＶプロモー
ターを含む、ベクター pcＤＮＡＩ／Ａmp(Ｉnvitrogen)
から得られる。完全なＣkα−１前駆体およびその３'末
端に枠内で融合したＨＡタグ(tag)をコードするＤＮＡ
フラグメントを、そのベクターのポリリンカー領域にク
ローン化することから、組換えタンパク質発現は、ＣＭ
Ｖプロモーターの下に指示される。ＨＡタグは、前記の
ようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得ら
れるエピトープに対応する(Ｉ.Ｗilson、Ｈ.Ｎiman、
Ｒ.Ｈeighten、Ａ.Ｃherenson、Ｍ.Ｃonnolly、および
Ｒ.Ｌerner、１９８４、Ｃell ３７、７６７)。ＨＡタ
グを標的タンパク質へ融合させることにより、組換えタ
ンパク質を、ＨＡエピトープを認識する抗体で容易に検
出することが可能となる。

【０１２５】プラスミド構築方法を次のように記載す
る：Ｃkα−１をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ第７
５９４７号を、２つのプライマーを用いてのＰＣＲによ
り構築する：５'プライマー5' AAAAAGCTTA GAATGAAGTT
CATCTCG 3'は、ＨindIII部位、続いて、開始コドンに比
べて３つの位置がないものから始まる１８ヌクレオチド
のＣkα−１コード配列を含む；３'配列5' CGCTCTAGAT
TAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAG GGAATCTTTC TCTT
3'は、ＸbaＩ部位に対する相補的配列、翻訳終止コド
ン、ＨＡタグ、およびＣkα−１コード配列の最後の１
８ヌクレオチド(終止コドンは含まれていない)を含む。
従って、ＰＣＲ産物は、ＨindIII部位、Ｃkα−１コー
ド配列、続いて、枠内で融合したＨＡタグ、そのＨＡタ
グの隣の翻訳終了終止コドン、およびＸbaＩ部位を含
む。ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡフラグメントおよび
ベクター、pcＤＮＡＩ／Ａmpを、ＨindIIIおよびＸbaＩ
制限酵素で消化して、ライゲートさせる。そのライゲー
ション混合物をＥ.coli株 ＳＵＲＥ(Ｓtratagene Ｃlon
ing Ｓystems、Ｌa Ｊolla、ＣＡ)にトランスフォーム
し、そのトランスフォームされた培養物をアンピシリン
培地プレート上に置いて、耐性コロニーを選択する。プ
ラスミド ＤＮＡをトランスフォーマントから単離し
て、正しいフラグメントの存在に関して制限分析により
試験する。組換えＣkα−１の発現には、ＤＥＡＥ−Ｄ
ＥＸＴＲＡＮ方法により、ＣＯＳ細胞を発現ベクターで
トランスフェクトする(Ｊ.Ｓambrook、Ｅ.Ｆritsch、
Ｔ.Ｍaniatis、Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory
Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress、（１９
８９）)。Ｃkα−１ＨＡタンパク質の発現を、放射能標
識および免疫沈降法により検出する(Ｅ.Ｈarlow、Ｄ.Ｌ
ane、Ａntibodies：Ａ Ｌaboratory Ｍanual、Ｃold Ｓ
pring Ｌaboratory Ｐress、（１９８８）)。トランス
フェクションから２日後、細胞を^３５Ｓ−システインで
８時間標識化する。次いで、細胞培地を集めて、細胞を
界面活性剤(ＲＩＰＡ緩衝液(１５０mＭ ＮaＣl、１％
ＮＰ−４０、０.１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０.５
％ ＤＯＣ、５０mＭ トリス、pＨ ７.５))で溶菌する。
(Ｗilson,Ｉ.ら、同上 ３７：７６７（１９８４）)。細
胞溶菌液および培養培地は両方とも、ＨＡに特異的なモ
ノクローナル抗体で沈降する。沈降したタンパク質をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。

【０１２６】実施例 ５ バキュロウイルス発現システムを用いてのＣkβ−１１
のクローニングおよび発現 完全な長さのＣkβ−１１タンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列、ＡＴＣＣ第７５９４８号を、遺伝子の５'およ
び３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライ
マーを利用して増幅する。

【０１２７】その５'プライマーは、配列：5' CGCGGGAT
CC GCCATCATGG CCCTGCTACT GGCCCT 3'を有し、またＢam
ＨＩ制限酵素部位(肉太の活字)、続いて、真核細胞にお
ける翻訳の開始に有効なシグナルに似ている６ヌクレオ
チドを含み(Ｋozak,Ｍ.、Ｊ.Ｍol.Ｂiol.、１９６：９
４７−９５０（１９８７）)、このすぐ後ろは、Ｃkβ−
１１遺伝子の最初の２０ヌクレオチドである(翻訳開始
コドン「ＡＴＧ」に下線を引く)。

【０１２８】その３'プライマーは、配列：5' CGGCGGTA
CC TGGCTGCACG GTCCATAGG 3'を有し、また制限エンドヌ
クレアーゼ Ａsp７８１の切断部位、およびＣkβ−１１
遺伝子の３'非翻訳配列に対して相補的な１９ヌクレオ
チドを含む。増幅された配列を、市販のキット(「Ｇene
clean」、ＢＩＯ １０１ Ｉnc.、Ｌa Ｊolla、Ｃa.)を
使用して、１％ アガロースゲルから単離する。次い
で、そのフラグメントをエンドヌクレアーゼ ＢamＨＩ
およびＡsp７８１で消化した後、１％ アガロースゲル
上で次に精製する。このフラグメントをＦ２と名付け
る。

【０１２９】ベクター pＲＧ１(pＶＬ９４１ベクターの
修飾、以下に論ずる)を、バキュロウイルス発現システ
ムを用いてのＣkβ−１１タンパク質の発現に使用した
(レビューには、Ｓummers,Ｍ.Ｄ.およびＳmith,Ｇ.Ｅ.
１９８７、Ａ manual of methods for baculovirus vec
tors and insect cell culture procedures、ＴexasＡg
ricultural Ｅxperimental Ｓtation Ｂulletin Ｎo.１
５５５を参照)。この発現ベクターは、オートグラファ
(Ａutographa)カリフォルニア核多角体病ウイルス群(Ａ
cＭＮＰＶ)の強多角体(strong polyhedrin)プロモータ
ー、続いて、制限エンドヌクレアーゼ ＢamＨＩおよび
Ａsp７８１の認識部位を含む。シミアンウイルス(ＳＶ)
４０のポリアデニル化部位を、有効なポリアデニル化
に使用する。組換えウイルスを容易に選択するには、
Ｅ.coli由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、多角体
(polyhedrin)遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く多
角体プロモーターと同じ向きに挿入する。同時トランス
フェクトした(cotransfected)野生型ウイルスＤＮＡ
の、細胞により媒介される相同組換えのためのウイルス
配列を多角体配列の両側に隣接させる。多くの他のバキ
ュロウイルスベクターを、pＡc３７３、pＶＬ９４１、
およびpＡcＩＭ１といったようなpＲＧ１の代わりに使
用することができるであろう(Ｌuckow,Ｖ.Ａ.およびＳu
mmers,Ｍ.Ｄ.、Ｖirology、１７０：３１−３９)。

【０１３０】プラスミドを制限酵素ＢamＨＩおよびＡsp
７８１で消化した後、当業界で既知の方法により、仔ウ
シ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次いで、
ＤＮＡを、市販のキット(「Ｇeneclean」、ＢＩＯ １０
１ Ｉnc.、Ｌa Ｊolla、Ｃa.)を使用して、１％ アガロ
ースゲルから単離する。このベクター ＤＮＡをＶ２と
名付ける。

【０１３１】フラグメント Ｆ２および脱リン酸化プラ
スミド Ｖ２をＴ４ ＤＮＡリガーゼでライゲートさせ
る。次いで、Ｅ.coli ＨＢ１０１細胞をトランスフォー
ムして、Ｃkβ−１１遺伝子を有するプラスミド(pＢac
−Ｃkβ−１１)を含む細菌を、酵素 ＢamＨＩおよびＡs
p７８１を用いて同定する。クローン化されたフラグメ
ントの配列を、ＤＮＡ配列決定により確認する。

【０１３２】リポフェクション法を利用して、プラスミ
ド pＢac−Ｃkβ−１１ ５μgを市販の線形化バキュロ
ウイルス(「ＢaculoＧold^ＴＭバキュロウイルス ＤＮ
Ａ」、Ｐharmingen、Ｓan Ｄiego、ＣＡ)１.０μgと共
に同時トランスフェクトする(Ｆelgnerら、Ｐroc.Ｎat
l.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１７（１
９８７）)。

【０１３３】ＢaculoＧold^ＴＭ ウイルス ＤＮＡ １μg
およびプラスミド pＢac−Ｃkβ−１１ ５μgを、無血
清グレイス(Ｇrace's)培地(Ｌife Ｔechnologies Ｉn
c.、Ｇaithersburg、ＭＤ)５０μlを含むマイクロタイ
タープレートの無菌ウェル中で混合する。その後、リポ
フェクチン(Ｌipofectin)１０μlとグレイス培地９０μ
lを加え、混合して、室温で１５分間インキュベートす
る。次いで、トランスフェクション混合物を、無血清グ
レイス培地１mlを含む、３５mmの組織培養プレートに播
種したＳf９昆虫細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１)に滴
加する。そのプレートを前後に揺り動かして、新たに加
えた溶液を混合する。次いで、そのプレートを２７℃で
５時間インキュベートする。５時間後、そのトランスフ
ェクション溶液をプレートから除去して、１０％ ウシ
胎児血清を補ったグレイス昆虫培地１mlを加える。その
プレートをインキュベーターに戻して、２７℃で４日間
培養し続ける。

【０１３４】４日後、上清を集めて、ＳummersおよびＳ
mith(上記)により記載されたようにして、プラークアッ
セイを行う。変更として、「Ｂlue Ｇal」(Ｌife Ｔech
nologies Ｉnc.、Ｇaithersburg)を含むアガロースゲル
を使用するが、このことにより、青色に染色されたプラ
ークを容易に単離することが可能となる。(「プラーク
アッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞培養に関する
利用者のガイド、およびＬife Ｔechnologies Ｉnc.、
Ｇaithersburgにより配布されたバキュロウイルス学、
９−１０頁にも見い出すことができる)。

【０１３５】連続希釈してから４日後に、ウイルスを細
胞に加えて、青色に染色されたプラークをエッペンドル
フピペットの先端で採取する。次いで、組換えウイルス
を含む寒天を、グレイス培地２００μlを含むエッペン
ドルフ管内で再び懸濁させる。その寒天を短時間の遠心
分離により除去して、組換えバキュロウイルスを含む上
清を、３５mmの皿に播種した昆虫Ｓf９細胞を感染させ
るのに使用する。４日後、これらの培養皿の上清を収集
した後、４℃で保存する。

【０１３６】Ｓf９細胞を、１０％ 熱不活性化ＦＢＳを
補ったグレイス培地で増殖させる。その細胞に、感染多
重度(ＭＯＩ) ２で組換えバキュロウイルス Ｖ−Ｃkβ
−１１を感染させる。６時間後、その培地を除去して、
メチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ II
培地(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithersburg)に替
える。４２時間後、５μＣiの^３５Ｓ−メチオニンおよ
び５μＣiの^３５Ｓ システイン５μＣi(Ａmersham)を加
える。その細胞をさらに１６時間インキュベートした
後、それらを遠心分離により収集して、標識化タンパク
質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィー
により視覚化する。

【０１３７】実施例 ６ バキュロウイルス発現システムを用いてのＣkα−１の
クローニングおよび発現 完全な長さのＣkα−１タンパク質をコードするＤＮＡ
配列、ＡＴＣＣ第７５９４７号を、遺伝子の５'および
３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマ
ーを利用して増幅する。

【０１３８】その５'プライマーは、配列：5' GCCGGATC
CG CCATCATGAA GTTCATCTCG ACATC 3'を有し、またＢam
ＨＩ制限酵素部位(肉太の活字)、続いて、真核細胞にお
ける翻訳の開始に有効なシグナルに似ている６ヌクレオ
チドを含み(Ｋozak,Ｍ.、Ｊ.Ｍol.Ｂiol.、１９６：９
４７−９５０（１９８７）)、このすぐ後ろは、Ｃkα−
１遺伝子の最初の２０ヌクレオチドである(翻訳開始コ
ドン「ＡＴＧ」に下線を引く)。

【０１３９】その３'プライマーは、配列：5' CGCGGGTA
CC GGTGTTCTTA GTGGAAA 3'を有し、また制限エンドヌク
レアーゼ Ａsp７８１の切断部位(肉太の活字)、および
Ｃkα−１遺伝子の３'非翻訳配列に対して相補的な１７
ヌクレオチドを含む。増幅された配列を、市販のキット
(「Ｇeneclean」、ＢＩＯ １０１ Ｉnc.、Ｌa Ｊolla、
Ｃa.)を使用して、１％ アガロースゲルから単離する。
次いで、そのフラグメントをエンドヌクレアーゼ Ｂam
ＨＩおよびＡsp７８１で消化した後、１％ アガロース
ゲル上で次に精製する。このフラグメントをＦ２と名付
ける。

【０１４０】ベクター pＲＧ１(pＶＬ９４１ベクターの
修飾、以下に論ずる)を、バキュロウイルス発現システ
ムを用いてのＣkα−１タンパク質の発現に使用した(レ
ビューには、Ｓummers,Ｍ.Ｄ.およびＳmith,Ｇ.Ｅ. １
９８７、Ａ manual of methods for baculovirus vecto
rs and insect cell culture procedures、Ｔexas Ａgr
icultural Ｅxperimental Ｓtation Ｂulletin Ｎo.１
５５５を参照)。この発現ベクターは、オートグラファ
(Ａutographa)カリフォルニア核多角体病ウイルス群(Ａ
cＭＮＰＶ)の強多角体(strong polyhedrin)プロモータ
ー、続いて、制限エンドヌクレアーゼ ＢamＨＩおよび
Ａsp７８１の認識部位を含む。シミアンウイルス(ＳＶ)
４０のポリアデニル化部位を、有効なポリアデニル化
に使用する。組換えウイルスを容易に選択するには、
Ｅ.coli由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、多角体
(polyhedrin)遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く多
角体プロモーターと同じ向きに挿入する。同時トランス
フェクトした(cotransfected)野生型ウイルスＤＮＡ
の、細胞により媒介される相同組換えのためのウイルス
配列を多角体配列の両側に隣接させる。多くの他のバキ
ュロウイルスベクターを、pＡc３７３、pＶＬ９４１、
およびpＡcＩＭ１といったようなpＲＧ１の代わりに使
用することができるであろう(Ｌuckow,Ｖ.Ａ.およびＳu
mmers,Ｍ.Ｄ.、Ｖirology、１７０：３１−３９)。

【０１４１】プラスミドを制限酵素ＢamＨＩおよびＡsp
７８１で消化した後、当業界で既知の方法により、仔ウ
シ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次いで、
ＤＮＡを、市販のキット(「Ｇeneclean」、ＢＩＯ １０
１ Ｉnc.、Ｌa Ｊolla、Ｃa.)を使用して、１％ アガロ
ースゲルから単離する。このベクター ＤＮＡをＶ２と
名付ける。

【０１４２】フラグメント Ｆ２および脱リン酸化プラ
スミド Ｖ２をＴ４ ＤＮＡリガーゼでライゲートさせ
る。次いで、Ｅ.coli ＨＢ１０１細胞をトランスフォー
ムして、Ｃkα−１遺伝子を有するプラスミド(pＢac−
Ｃkα−１)を含む細菌を、酵素ＢamＨＩおよびＡsp７８
１を用いて同定する。クローン化されたフラグメントの
配列を、ＤＮＡ配列決定により確認する。

【０１４３】リポフェクション法を利用して、プラスミ
ド pＢac−Ｃkα−１ ５μgを市販の線形化バキュロウ
イルス(「ＢaculoＧold^ＴＭ バキュロウイルス ＤＮ
Ａ」、Ｐharmingen、Ｓan Ｄiego、ＣＡ)１.０μgと共
に同時トランスフェクトする(Ｆelgnerら、Ｐroc.Ｎat
l.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１７（１
９８７）)。

【０１４４】ＢaculoＧold^ＴＭ ウイルス ＤＮＡ １μg
およびプラスミド pＢac−Ｃkα−１ ５μgを、無血清
グレイス(Ｇrace's)培地(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、
Ｇaithersburg、ＭＤ)５０μlを含むマイクロタイター
プレートの無菌ウェル中で混合する。その後、リポフェ
クチン(Ｌipofectin)１０μlとグレイス培地９０μlを
加え、混合して、室温で１５分間インキュベートする。
次いで、トランスフェクション混合物を、無血清グレイ
ス培地１mlを含む、３５mmの組織培養プレートに播種し
たＳf９昆虫細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１)に滴加す
る。そのプレートを前後に揺り動かして、新たに加えた
溶液を混合する。次いで、そのプレートを２７℃で５時
間インキュベートする。５時間後、そのトランスフェク
ション溶液をプレートから除去して、１０％ ウシ胎児
血清を補ったグレイス昆虫培地１mlを加える。そのプレ
ートをインキュベーターに戻して、２７℃で４日間培養
し続ける。

【０１４５】４日後、上清を集めて、ＳummersおよびＳ
mith(上記)により記載されたようにして、プラークアッ
セイを行う。変更として、「Ｂlue Ｇal」(Ｌife Ｔech
nologies Ｉnc.、Ｇaithersburg)を含むアガロースゲル
を使用するが、このことにより、青色に染色されたプラ
ークを容易に単離することが可能となる。(「プラーク
アッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞培養に関する
利用者のガイド、およびＬife Ｔechnologies Ｉnc.、
Ｇaithersburgにより配布されたバキュロウイルス学、
９−１０頁にも見い出すことができる)。

【０１４６】連続希釈してから４日後に、ウイルスを細
胞に加えて、青色に染色されたプラークをエッペンドル
フピペットの先端で採取する。次いで、組換えウイルス
を含む寒天を、グレイス培地２００μlを含むエッペン
ドルフ管内で再び懸濁させる。その寒天を短時間の遠心
分離により除去して、組換えバキュロウイルスを含む上
清を、３５mmの皿に播種した昆虫Ｓf９細胞を感染させ
るのに使用する。４日後、これらの培養皿の上清を収集
した後、４℃で保存する。

【０１４７】Ｓf９細胞を、１０％ 熱不活性化ＦＢＳを
補ったグレイス培地で増殖させる。その細胞に、感染多
重度(ＭＯＩ) ２で組換えバキュロウイルス Ｖ−Ｃkα
−１を感染させる。６時間後、その培地を除去して、メ
チオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ II 培
地(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithersburg、ＭＤ)
に替える。４２時間後、５μＣiの^３５Ｓ−メチオニン
および５μＣiの^３５Ｓ システイン５μＣi(Ａmersham)
を加える。その細胞をさらに１６時間インキュベートし
た後、それらを遠心分離により収集して、標識化タンパ
ク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィ
ーにより視覚化する。

【０１４８】上記の教示から見て、本発明の多数の変更
および変化が可能であることから、後記する請求の範囲
内で、特に記載した以外の方法で、本発明を行うことが
できる。

【０１４９】

【配列表】 （１） 一般的情報 ： （i） 特許出願人 ： リー等 （ii） 発明の名称 ： ヒトケモカインβ−１１およびヒトケモカインα−１ （iii） 配列の数 ： １６ （iv） 連絡先 ： （Ａ） 住所 ： カレラ，バーン，ベーン，ギルフィラン， セッチ，ステュアート・アンド・オルステイン （Ｂ） 通り ： ベッカー・ファーム・ロード６番 （Ｃ） 市 ： ローズランド （Ｄ） 州 ： ニュージャージー （Ｅ） 国 ： アメリカ合衆国 （Ｆ） ＺＩＰ ： ０７０６８ （v） コンピューター解読書式 ： （Ａ） 媒体型 ： ３.５インチ ディスケット （Ｂ） コンピューター ： ＩＢＭ ＰＳ／２ （Ｃ） オペレーティング・システム ： ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ） ソフトウエア ： ワードパーフェクト ５.１ （vi） 本出願のデータ ： （Ａ） 出願番号 ： （Ｂ） 出願日 ： 同日 （Ｃ） 分類 ： （vii） 先行技術データ ： （Ａ） 出願番号 ： （Ｂ） 出願日 ： （viii） 弁理士／代理人情報 ： （Ａ） 氏名 ： フェルラロ，グレゴリー・ディ （Ｂ） 登録番号 ： ３６,１３４ （Ｃ） 参照／整理番号 ： ３２５８００−２７２ （ix） 電話連絡先情報 ： （Ａ） 電話番号 ： ２０１−９９４−１７００ （Ｂ） ファックス番号 ： ２０１−９９４−１７４４ （２） 配列番号１の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ２９７塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： cＤＮＡ （xi） 配列の記述 ： 配列番号１ ： ATGGCCCTGC TACTGGCCCT CAGCCTGCTG GTTCTCTGGA CTTCCCCAGC CCCAACTCTG 60 AGTGGCACCA ATGAAGCTGA AGACTGCTGC CTGTCTGTGA CCCAGAAACC CATCCCTGGG 120 TACATCGTGA GGAACTTCCA CTACCTTCTC ATCAAGGATG GTTGCAGGGT GCCTGCTGTA 180 GTGTTCACCA CACTGAGGGG CCGCCAGCTC TGTGCACCCC CAGACCAGCC CTGGGTAGAA 240 CGCATCATCC AGAGACTGCA GAGGACCTCA GCCAAGATGA AGCGCCGCAG CAGTTAA 297 （２） 配列番号２の情報 ： （i） 配列の特徴 ： （Ａ） 長さ ： ９８アミノ酸 （Ｂ） 型 ： アミノ酸 （Ｃ） 鎖の数 ： （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 配列の種類 ： タンパク質 （xi） 配列の記述 ： 配列番号２ ： Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro -15 -10 -5 Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Glu Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser 1 5 10 15 Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr 20 25 30 Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr 35 40 45 Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu 50 55 60 Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg 65 70 75 Ser Ser 80 （２） 配列番号３の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ３３３塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： cＤＮＡ （xi） 配列の記述 ： 配列番号３ ： ATGAAGTTCA TCTCGACATC TCTGCTTCTA ATGCTGCTGG TCAGCACCTC TCTCCAGTCC 60 AAGGTGTTCT GGAGGTCTAT TAACACAAGC TTGAGGTGTA GATGTGTCCA AGAAGAAGCT 120 CAGTCTTTAT CCCTAGACGC TTCATTGATC GAATTCAAAT CTTGGCCCCG TGGGAATGGT 180 TGTCCAAGAA AAGAAATCAT AGTCTGGAAG AAGAACAAGT CAATTGTGTG TGTGGACCCT 240 CAAGCTGAAT GGGTACAAAG AATGATGGAA GTATTGAGAA AAAGAAGTTC TTCAACTCTA 300 CCAGTTCCAG TGTTTAAGAG AAAGATTCCC TGA 333 （２） 配列番号４の情報 ： （i） 配列の特徴 ： （Ａ） 長さ ： １０９アミノ酸 （Ｂ） 型 ： アミノ酸 （Ｃ） 鎖の数 ： （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 配列の種類 ： タンパク質 （xi） 配列の記述 ： 配列番号４ ： Met Lys Phe Ile Ser Thr Ser Leu Leu Leu Met Leu Leu Val Ser Ser -20 -15 -10 Leu Ser Pro Val Gln Gly Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr Ser Leu Arg -5 1 5 10 Cys Arg Cys Val Gln Glu Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile 15 20 25 Asp Arg Ile Gln Ile Leu Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu 30 35 40 Ile Ile Val Trp Lys Lys Asn Lys Ser Ile Val Cys Val Asp Pro Gln 45 50 55 Ala Glu Trp Ile Gln Arg Met Met Glu Val Leu Arg Lys Arg Ser Ser 60 65 70 Ser Thr Leu Pro Val Pro Val Phe Lys Arg Lys Ile Pro 75 80 85 （２） 配列番号５の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ２７塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号５ ： CCCGCATGCC AACTCTGAGT GGCACCA 27 （２） 配列番号６の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ２７塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号６ ： CCCGGATCCC AATGCTTGAC TCGGACT 27 （２） 配列番号７の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ３０塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号７ ： CCCGCATGCC TTCTGGAGGT CTATTACACA 30 （２） 配列番号８の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ２８塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号８ ： CCCGGATCCG GGAATCTTTC TCTTAAAC 28 （２） 配列番号９の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ２７塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号９ ： AAAAAGCTTG CCATGGCCCT GCTACTG 27 （２） 配列番号１０の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ５７塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号１０ ： CGCTCTAGAT TAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAT AGGTTAACTG CTGCGAC 57 （２） 配列番号１１の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ２７塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号１１ ： AAAAAGCTTA GAATGAAGTT CATCTCG 27 （２） 配列番号１２の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ５４塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号１２ ： CGCTCTAGAT TAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAG GGAATCTTTC TCTT 54 （２） 配列番号１３の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ３６塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号１３ ： CGCGGGATCC GCCATCATGG CCCTGCTACT GGCCCT 36 （２） 配列番号１４の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ２９塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号１４ ： CGGCGGTACC TGGCTGCACG GTCCATAGG 29 （２） 配列番号１５の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ３５塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号１５ ： GCCGGATCCG CCATCATGAA GTTCATCTCG ACATC 35 （２） 配列番号１６の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ２７塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号１６ ： CGCGGGTACC GGTGTTCTTA GTGGAAA 27

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｃkβ−１１のcＤＮＡ配列および対応する推
定アミノ酸配列を示す。最初の１７個のアミノ酸はリー
ダー配列を示すことから、推定される成熟ポリペプチド
は８１個のアミノ酸を含んでなる。アミノ酸に関する標
準的な１文字略号を使用する。配列決定は、３７３ 自
動化ＤＮＡシークエンサー(ＡppliedＢiosystems,Ｉn
c.)を使用して行った。配列決定の正確さは、９７％以
上正確であると予想される。

【図２】 Ｃkα−１のcＤＮＡ配列および対応する推定
アミノ酸配列を示す。最初の２２個のアミノ酸はリーダ
ー配列を示すことから、推定される成熟ポリペプチドは
８７個のアミノ酸を含んでなる。アミノ酸に関する標準
的な１文字略号を使用する。

【図３】 Ｃkβ−１１(上段)とラットＲＡＮＴＥＳポ
リペプチド(下段)との間のアミノ酸配列の相同性を示
す。

【図４】 Ｃkα−１とＯvis Ａriesインターロイキン
−８(下段)との間のアミノ酸配列の相同性を示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１４年３月７日（２００２．３．７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１４９

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１４９】

【配列表】 （１） 一般的情報 ： （i） 特許出願人 ： ヒューマン・ジェノム・サイエンシズ・ インコーポレイテッド アメリカ合衆国２０８５０メリーランド州、 ロックビル、キー・ウエスト・アベニュー９４１０番 特許出願人／発明者 ： リー，ハオドン （ii） 発明の名称 ： ヒトケモカインβ−１１およびヒトケモカインα−１ （iii） 配列の数 ： １８ （iv） 連絡先 ： （Ａ） 宛名 ： スターン，ケスラー，ゴールドスタイン・アンド・ フォックス，ピー・エル・エル・シー （Ｂ） 通り ： スウィート６００，ニューヨーク・アベニュー１１００番 （Ｃ） 市 ： ワシントン （Ｄ） 州 ： コロンビア区 （Ｅ） 国 ： アメリカ合衆国 （Ｆ） ＺＩＰ ： ２０００５−３９３４ （v） コンピューター解読書式 ： （Ａ） 媒体型 ： フロッピーディスク （Ｂ） コンピューター ： ＩＢＭ ＰＣ コンパティブル （Ｃ） オペレーティング・システム ： ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ） ソフトウエア ： パテント・イン・リリース・ナンバー１.０、 バージョン・ナンバー１.３０ （vi） 本出願のデータ ： （Ａ） 出願番号 ： ＰＣＴ／ＵＳ９５／０１７８０ （Ｂ） 出願日 ： １９９５年２月８日 （Ｃ） 分類 ： （viii） 弁理士／代理人情報 ： （Ａ） 氏名 ： ゴールドスタイン，ジョージ・エイ （Ｂ） 登録番号 ： ２９,０２１ （Ｃ） 参照／整理番号 ： １４８８.０３８ＰＣ００ （ix） 電話連絡先情報 ： （Ａ） 電話番号 ： （２０２）３７１−２６００ （Ｂ） ファックス番号 ： （２０２）３７１−２５４０ （２） 配列番号１の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ２９７塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 二本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： cＤＮＡ （ix） 配列の特徴 （Ａ） 名称／キー ： ＣＤＳ （Ｂ） 存在位置 ： １..２９４ （ix） 配列の特徴 （Ａ） 名称／キー ： シグ・ペプチド （Ｂ） 存在位置 ： １..５１ （ix） 配列の特徴 （Ａ） 名称／キー ： マット・ペプチド （Ｂ） 存在位置 ： ５２..２９４ （xi） 配列の記述 ： 配列番号１ ： ATG GCC CTG CTA CTG GCC CTC AGC CTG CTG GTT CTC TGG ACT TCC CCA 48 Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro -17 -15 -10 -5 GCC CCA ACT CTG AGT GGC ACC AAT GAT GCT GAA GAC TGC TGC CTG TCT 96 Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser 1 5 10 15 GTG ACC CAG AAA CCC ATC CCT GGG TAC ATC GTG AGG AAC TTC CAC TAC 144 Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr 20 25 30 CTT CTC ATC AAG GAT GGT TGC AGG GTG CCT GCT GTA GTG TTC ACC ACA 192 Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr 35 40 45 CTG AGG GGC CGC CAG CTC TGT GCA CCC CCA GAC CAG CCC TGG GTA GAA 240 Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu 50 55 60 CGC ATC ATC CAG AGA CTG CAG AGG ACC TCA GCC AAG ATG AAG CGC CGC 288 Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg 65 70 75 AGC AGT TAA 297 Ser Ser 80 （２） 配列番号２の情報 ： （i） 配列の特徴 ： （Ａ） 長さ ： ９８アミノ酸 （Ｂ） 型 ： アミノ酸 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 配列の種類 ： タンパク質 （xi） 配列の記述 ： 配列番号２ ： Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro -17 -15 -10 -5 Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser 1 5 10 15 Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr 20 25 30 Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr 35 40 45 Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu 50 55 60 Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg 65 70 75 Ser Ser 80 （２） 配列番号３の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ３３０塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 二本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： cＤＮＡ （ix） 配列の特徴 （Ａ） 名称／キー ： ＣＤＳ （Ｂ） 存在位置 ： １..３２７ （ix） 配列の特徴 （Ａ） 名称／キー ： シグ・ペプチド （Ｂ） 存在位置 ： １..６６ （ix） 配列の特徴 （Ａ） 名称／キー ： マット・ペプチド （Ｂ） 存在位置 ： ６７..３２７ （xi） 配列の記述 ： 配列番号３ ： ATG AAG TTC ATC TCG ACA TCT CTG CTT CTC ATG CTG CTG GTC AGC AGC 48 Met Lys Phe Ile Ser Thr Ser Leu Leu Leu Met Leu Leu Val Ser Ser -22 -20 -15 -10 CTC TCT CCA GTC CAA GGT GTT CTG GAG GTC TAT TAC ACA AGC TTG AGG 96 Leu Ser Pro Val Gln Gly Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr Ser Leu Arg -5 1 5 10 TGT AGA TGT GTC CAA GAG AGC TCA GTC TTT ATC CCT AGA CGC TTC ATT 144 Cys Arg Cys Val Gln Glu Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile 15 20 25 GAT CGA ATT CAA ATC TTG CCC CGT GGG AAT GGT TGT CCA AGA AAA GAA 192 Asp Arg Ile Gln Ile Leu Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu 30 35 40 ATC ATA GTC TGG AAG AAG AAC AAG TCA ATT GTG TGT GTG GAC CCT CAA 240 Ile Ile Val Trp Lys Lys Asn Lys Ser Ile Val Cys Val Asp Pro Gln 45 50 55 GCT GAA TGG ATA CAA AGA ATG ATG GAA GTA TTG AGA AAA AGA AGT TCT 288 Ala Glu Trp Ile Gln Arg Met Met Glu Val Leu Arg Lys Arg Ser Ser 60 65 70 TCA ACT CTA CCA GTT CCA GTG TTT AAG AGA AAG ATT CCC TGA 330 Ser Thr Leu Pro Val Pro Val Phe Lys Arg Lys Ile Pro 75 80 85 （２） 配列番号４の情報 ： （i） 配列の特徴 ： （Ａ） 長さ ： １０９アミノ酸 （Ｂ） 型 ： アミノ酸 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 配列の種類 ： タンパク質 （xi） 配列の記述 ： 配列番号４ ： Met Lys Phe Ile Ser Thr Ser Leu Leu Leu Met Leu Leu Val Ser Ser -22 -20 -15 -10 Leu Ser Pro Val Gln Gly Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr Ser Leu Arg -5 1 5 10 Cys Arg Cys Val Gln Glu Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile 15 20 25 Asp Arg Ile Gln Ile Leu Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu 30 35 40 Ile Ile Val Trp Lys Lys Asn Lys Ser Ile Val Cys Val Asp Pro Gln 45 50 55 Ala Glu Trp Ile Gln Arg Met Met Glu Val Leu Arg Lys Arg Ser Ser 60 65 70 Ser Thr Leu Pro Val Pro Val Phe Lys Arg Lys Ile Pro 75 80 85 （２） 配列番号５の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ２７塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： cＤＮＡ （xi） 配列の記述 ： 配列番号５ ： CCCGCATGCC AACTCTGAGT GGCACCA 27 （２） 配列番号６の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ２７塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： cＤＮＡ （xi） 配列の記述 ： 配列番号６ ： CCCGGATCCC AATGCTTGAC TCGGACT 27 （２） 配列番号７の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ３０塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： cＤＮＡ （xi） 配列の記述 ： 配列番号７ ： CCCGCATGCC TTCTGGAGGT CTATTACACA 30 （２） 配列番号８の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ２８塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： cＤＮＡ （xi） 配列の記述 ： 配列番号８ ： CCCGGATCCG GGAATCTTTC TCTTAAAC 28 （２） 配列番号９の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ２７塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： cＤＮＡ （xi） 配列の記述 ： 配列番号９ ： AAAAAGCTTG CCATGGCCCT GCTACTG 27 （２） 配列番号１０の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ５７塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： cＤＮＡ （xi） 配列の記述 ： 配列番号１０ ： CGCTCTAGAT TAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAT AGGTTAACTG CTGCGAC 57 （２） 配列番号１１の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ２７塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： cＤＮＡ （xi） 配列の記述 ： 配列番号１１ ： AAAAAGCTTA GAATGAAGTT CATCTCG 27 （２） 配列番号１２の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ５４塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： cＤＮＡ （xi） 配列の記述 ： 配列番号１２ ： CGCTCTAGAT TAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAG GGAATCTTTC TCTT 54 （２） 配列番号１３の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ３６塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： cＤＮＡ （xi） 配列の記述 ： 配列番号１３ ： CGCGGGATCC GCCATCATGG CCCTGCTACT GGCCCT 36 （２） 配列番号１４の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ２９塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： cＤＮＡ （xi） 配列の記述 ： 配列番号１４ ： CGGCGGTACC TGGCTGCACG GTCCATAGG 29 （２） 配列番号１５の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ３５塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： cＤＮＡ （xi） 配列の記述 ： 配列番号１５ ： GCCGGATCCG CCATCATGAA GTTCATCTCG ACATC 35 （２） 配列番号１６の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ２７塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： cＤＮＡ （xi） 配列の記述 ： 配列番号１６ ： CGCGGGTACC GGTGTTCTTA GTGGAAA 27 （２） 配列番号１７の情報 ： （i） 配列の特徴 ： （Ａ） 長さ ： ９７アミノ酸 （Ｂ） 型 ： アミノ酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 不明 （ii） 配列の種類 ： タンパク質 （xi） 配列の記述 ： 配列番号１７ ： Leu Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Phe Leu Leu Ser Ala Ala Leu Cys 1 5 10 15 Glu Ala Ala Val Leu Ser Arg Met Ser Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys 20 25 30 Ile Lys Thr His Ser Thr Pro Phe His Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu 35 40 45 Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Glu Asn Ser Glu Ile Ile Val 50 55 60 Lys Leu Thr Asn Gly Lys Glu Val Cys Leu Asp Pro Lys Glu Lys Trp 65 70 75 80 Val Gln Lys Val Val Gln Ala Phe Leu Lys Arg Ala Glu Lys Gln Asp 85 90 95 Pro （２） 配列番号１８の情報 ： （i） 配列の特徴 ： （Ａ） 長さ ： ８９アミノ酸 （Ｂ） 型 ： アミノ酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 不明 （ii） 配列の種類 ： タンパク質 （xi） 配列の記述 ： 配列番号１８ ： Ile Ser Ala Ala Ala Leu Thr Ile Ile Leu Thr Ala Ala Ala Leu Cys 1 5 10 15 Thr Pro Ala Pro Ala Ser Pro Tyr Gly Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys 20 25 30 Phe Ala Tyr Leu Ser Leu Glu Leu Pro Arg Ala His Val Lys Glu Tyr 35 40 45 Phe Tyr Thr Ser Ser Lys Cys Ser Asn Leu Ala Val Val Phe Val Thr 50 55 60 Arg Arg Asn Arg Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Gln 65 70 75 80 Glu Tyr Ile Asn Tyr Leu Glu Met Ser 85

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２】

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 11/06 ４Ｃ０８６ Ａ６１Ｐ 7/00 17/02 ４Ｈ０４５ 11/06 17/06 17/02 19/02 17/06 31/00 19/02 33/00 31/00 35/00 33/00 35/02 35/00 37/00 35/02 37/08 37/00 43/00 １０１ 37/08 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １０１ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｍ 33/53 33/566 Ｃ１２Ｒ 1:19 33/566 1:91 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ハオドン・リー アメリカ合衆国20878メリーランド州ゲイ ザーズバーグ、ラトリッジ・ドライブ 11033番 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 BB20 CA25 CB01 CB03 CB07 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 FB03 FB04 FB07 4B024 AA01 AA11 BA21 CA04 DA02 DA06 EA04 GA11 HA12 4B064 AG02 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 4C084 AA01 AA02 AA06 AA13 AA16 BA01 BA08 BA19 BA20 BA21 CA53 DA01 NA14 ZA592 ZA892 ZA962 ZB132 ZB262 ZB272 ZB312 ZB372 ZC012 4C085 AA13 BB31 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA59 ZA89 ZA96 ZB13 ZB26 ZB27 ZB31 ZB37 ZC01 4H045 AA10 AA20 BA10 CA40 DA01 EA22 EA28 FA72 FA73 FA74

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 本明細書に記載されたいずれかの発明。