KR19990087164A - 사람 케모킨 폴리펩티드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사람 케모킨 폴리펩티드, 이러한 케모킨 폴리펩티드를 암호화하는 DNA(RNA) 및 이러한 폴리펩티드를 재조합 기술에 의해 제조하는 방법을 기술하고 있다. 또한, 백혈병, 종양, 만성 감염, 자가 면역 질환, 섬유증 장애, 상처 치유 및 건선을 치료하는데 상기 케모킨 폴리펩티드를 이용하는 방법을 기술한다. 또한, 본 발명은 상기 케모킨 폴리펩티드에 대한 길항제, 및 류마티스성 관절염, 자가 면역 및 만성 염증성 및 감염성 질환, 알레르기 반응, 프로스타글란딘-독립적인 열병 및 골수 부전증을 치료하기 위한 치료제로서의 이들의 용도를 기술한다.

Description

사람 케모킨 폴리펩티드

본 발명은 새롭게 동정된 폴리뉴클레오티드, 이러한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드, 상기 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 용도, 및 상기 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명의 폴리펩티드는 사람 케모킨 베타-4("Ckβ-4"로서 지칭되기도 함) 및 사람 케모킨 단구 화학주성 단백질("MCP-4"로서 지칭되고 또한 사람 케모킨 베타-10 및 "Ckβ-10"으로서 지칭 공지되기도 함)이며, 이들은 "케모킨 폴리펩티드"로서 총칭된다. 또한, 본 발명은 이러한 폴리펩티드의 작용 억제에 관한 것이다.

케모킨은 구조적이고도 작용적으로 관련이 있는, 최근 만들어진 슈퍼-계열의 분비된 작은 사이토킨이다. 모든 케모킨은 아미노산 수준에서 25 내지 75% 상동성을 나타내고 본 발명의 폴리펩티드와 같이 공간적으로 보존된 시스테인 잔기를 함유한다. (보존된 영역에서 첫 번째 2개의 시스테인의 위치에 따라서) "C-X-C 브랜치"의 구성원은 또한, 주로 친핵구(예: IL-2 및 NAP-2)에 대한 작용을 통하여 프로-염증 활성을 나타내는 친핵구-활성화 펩티드(NAP)/IL-8 계열로서 공지되는 반면, "C-C 브랜치" 계열의 구성원은 특정의 단핵 세포를 유인하는 것으로 여겨진다. "C-C 브랜치"의 구성원으로는 PF4, MIP, MCP, 및 본 발명의 케모킨 폴리펩티드가 있다.

이러한 케모킨 계열에 수 많은 생물학적 활성이 설정되었다. 대식구 염증성 단백질 1α 및 1β는 별개의 임파구 집단 및 단구에 대해서 화학주성인 반면[참조: Shall, T.J., Cytokine, 3:165(1991)], MCP-1은 특이적 단구 화학유인제로서 기술되었다[참조: Matsushima et al., J. Exp. Med., 169:1485(1989)]. 이러한 케모킨 계열이 지니는 공통의 기능은 이들이 별개의 세포 셋트, 예를 들면, 면역 세포(백혈구)와 섬유아세포의 화학주성 이동을 자극시키는 능력이 있다는 것이다. 이들 케모킨은 이러한 계열의 특정 세포를 활성화시킬 수도 있다.

케모킨에 반응성인 면역 세포는 상당 수의 생체내 기능을 지니므로, 이들 면역 세포가 상기 케모킨에 의해 조절된다는 것은 질병 치료에 있어서 중요한 분야이다.

예를 들면, 호산구는 기생충을 파괴시켜 기생충 감염을 감소시킨다. 호산구는 또한, 호흡기 시스템의 기도에서 만성적인 염증을 일으킨다. 대식구는 척추동물에서 종양 형성을 억제시키는 것과 관련이 있다. 추가로, 호염기구는 알레르기성 염증에 중요한 역할을 할 수 있는 히스타민을 방출시킨다. 따라서, 이러한 세포를 증진 및 억제시키는 것이 치료학적으로 광범위하게 적용된다.

본 발명의 한 국면에 따르면, Ckβ-4 및 MCP-4(Ckβ-10으로서 지칭되기도 함)인 신규의 폴리펩티드, 및 이의 단편, 동족체 및 유도체가 제공된다. 본 발명의 폴리펩티드는 사람 기원의 것이다.

본 발명의 또 다른 국면에 따르면, 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)가 제공된다.

본 발명의 또 다른 국면에 따르면, 재조합 기술에 의해 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 국면에 따르면, 상기 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 치료 목적, 예를 들어, 충실성 종양, 만성적 감염, 자가 면역 질환, 건선, 천식, 알레르기를 치료하고, 조혈을 조절하며 상처 치유를 촉진시키는 방법이 제공된다.

본 발명의 추가 국면에 따르면, 상기 폴리펩티드에 대한 항체가 제공된다.

본 발명의 또다른 국면에 따르면, 예를 들면, 자가 면역 질환, 만성 염증성 및 감염성 질환, 히스타민-매개된 알레르기 반응, 프로스타글란딘-독립적인 열병, 골수 부전증, 규분증, 유육종증, 과호산구증 및 폐 염증의 치료에 있어서, 상기 폴리펩티드의 작용을 억제하는데 사용될 수 있는, 상기 폴리펩티드에 대한 길항제/억제제가 제공된다.

본 발명의 모든 국면은 본원의 교시로부터 당해 기술 분야의 숙련인에게 명백해야만 한다.

도면은 본 발명의 특정 양태를 예시하지만 어떠한 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다.

도 1은 Ckβ-4의 cDNA 서열 및 상응하는 추론된 아미노산 서열을 예시한다. 초기 24개 아미노산은 추정상의 성숙한 폴리펩티드가 70개의 아미노산을 포함하도록 추론된 Ckβ-4의 리더 서열이다. 아미노산에 대한 표준 단일문자 약어를 사용한다.

도 2는 MCP-4(Ckβ-10으로서 지칭되기도 함)의 cDNA 서열 및 상응하는 추론된 아미노산 서열을 예시한다. 초기 23개 아미노산은 추정상의 성숙한 폴리펩티드가 75개의 아미노산을 포함하도록 추론된 MCP-4(Ckβ-10)의 리더 서열이다. 그러나 도 5에서 인지된 바와 같이, 도 1에서 화살표로 나타낸, 세포에서 생성된 MCP-4의 수 개의 아미노 말단이 있는데, 이는 도 5에 도시되고 본원에서 논의된 바와 같다. 또한, 수 개의 카복실 말단이 세포에서 생성된 특정 형태의 MCP-4에서 관찰되었으며; 이는 도 5에 도시되었고 본원에서 논의되었다. 아미노산에 대한 표준 단일문자 약어를 사용한다.

도 3은 Ckβ-4와 에오탁신의 성숙한 펩티드(하단) 간의 아미노산 서열 상동성을 도시한 것이다. 아미노산에 대한 표준 단일문자 약어를 사용한다.

도 4는 MCP-4(Ckβ-10)(상단)와 사람 MCP-3(하단) 간의 아미노산 서열 상동성을 도시한 것이다. 아미노산에 대한 표준 단일문자 약어를 사용한다.

도 5는 시험관내 발현에 의해 분리된 여러 가지 상이한 형태의 MCP-4(Ckβ-10)의 아미노산 서열을 도시한 것이다. Bac 1, 2 및 3은 바쿨로바이러스를 사용하여 발현된 MCP-4의 3가지 NH₂-말단 변이체의 서열을 나타낸다. Dro 1, 2 및 3+는 시험관내 드로소필라(Drosophila) 세포에서의 MCP-4 cDNA의 발현에 의해 분리된 MCP-4의 서열을 나타낸다. 상기 도면은 또한, 완전한 길이의 MCP-4 서열과 MCP-3 및 에오탁신의 서열과의 상동성 비교를 나타내고 있다. 동일한 잔기는 수직선으로 지시된다.

도 6은 (A) MCP-4(Ckβ-10), 에오탁신, MCP-1, MCP-2, MCP-3 및 RANTES에 반응하여 일어난 사이토칼라신 B-처리된 사람 혈액 단구로부터의 N-아세틸-β-D-글루코사미니다제의 방출 및 (B) MCP-4(Ckβ-10), MCP-1, MCP-3 및 음성 대조군에 반응하여 일어난 사이토칼라신 B-처리된 단구의 이동 지수를 나타내는 한 쌍의 그래프이다.

효소 활성은 (A)에서 세로 축을 따라 임의의 형광성 단위를 선형 등급으로 제시된다. 상대적 이동 지수는 (B)에서 세로 축 위에 선형 등급으로 제시된다. 케모킨 농도(nM)는 양 그래프에서 가로 축을 따라 로그 등급으로 제시된다.

다음 실시예에서 논의된 바와 같이, 세포 이동은 48웰 화학주성 챔버에서 측정한다. 이동하는 세포는 5개의 고전력장에서 계수한다. 이러한 이동은 이동 지수(이동된 세포의 평균/케모킨의 첨가 없이 이동된 세포의 평균)로서 나타낸다. 각 지점은 3회 배양의 평균치이다. 바(bar)는 3회 배양의 평균치에 대한 표준 편차이다.

도 7은 각종 농도의 MCP-4(Ckβ-10), 에오탁신, MCP-1, MCP-1α 및 음성 대조군에 반응하여 일어난 CD4⁺및 CD8⁺T-임파구의 이동을 도시하는 한 셋트의 그래프이다. 상부 그래프는 CD4⁺T-임파구의 이동을 도시한 것이다. 하부 그래프는 DC8⁺T-임파구의 이동을 도시한 것이다. 상부와 하부 쌍 모두에 있어서, 좌측 그래프는 MCP-1, MCP-1α 및 음성 대조군에 반응하여 일어난 이동을 도시한 것이며 우측 그래프는 MCP-4(Ckβ-10) 및 에오탁신에 반응하여 일어난 이동을 도시한 것이다. 이동하는 세포의 수는 세로 축을 따라 선형 등급으로 지시된다. 유인제 배지에서의 케모킨 농도는 가로 축을 따라 로그 등급으로 nM로써 제시된다.

다음 실시예에서 논의된 바와 같이, 세포 이동은 48웰 화학주성 챔버에서 측정한다. 이동하는 세포는 5개의 고전력장에서 계수한다. 이러한 이동은 이동 지수(이동된 세포의 평균/케모킨의 첨가 없이 이동된 세포의 평균)로서 나타낸다. 각 지점은 3회 배양의 평균치이다. 바는 3회 배양의 평균치에 대한 표준 편차이다.

도 8은 음성 대조군, 100nM MCP-1, 100nM MCP-3 및 여러 가지 농도의 MCP-4(Ckβ-10) 및 에오탁신에 반응하여 일어난 사람 호산구의 이동을 도시한 한 쌍의 그래프이다. 이동 지수는 세로 축을 따라 선형 등급으로 지시된다. 유인물 배지에서의 케모킨 농도는 가로 축을 따라 로그 등급으로 nM로써 제시된다.

다음 실시예에서 논의된 바와 같이, 세포 이동은 48웰 화학주성 챔버에서 측정한다. 이동하는 세포는 5개의 고전력장에서 계수한다. 이러한 이동은 이동 지수(이동된 세포의 평균/케모킨의 첨가 없이 이동된 세포의 평균)로서 나타낸다. 각 지점은 3회 배양의 평균치이다. 바는 3회 배양의 평균치에 대한 표준 편차이다.

도 9는 각종 농도의 Ckβ-4, 염기성 FGF 및 HG0100의 존재하에서 배양된 피질성 신경단위 세포의 생존을 도시한 그래프이다. 계수된 생존 가능한 세포수는 세로 축을 따라 선형 등급으로 칼세인 방출 측면에서 지시된다. 성장 배지에서의 상기 인자의 농도는 가로 축을 따라 로그 등급으로 ng/ml로써 제시된다. 각 지점은 6회 배양의 평균치이다. 바는 이러한 6회 배양의 평균치에 관한 평균의 표준 오차이다.

도 10은 각종 농도의 Ckβ-4, 염기성 FGF 및 HG0100의 존재하에서 배양된 피질성 신경단위의 신경돌기 성장을 도시한 그래프이다. 신경돌기 성장은 세로 축을 따라 선형 등급으로, 490nm에서의 측정된 뉴로필라멘트 단백질 광밀도(OD⁴⁹⁰) 측면에서 지시된다. 성장 배지에서의 상기 인자의 농도는 가로 축을 따라 로그 등급으로 ng/ml로써 제시된다. 각 지점은 6회 배양의 평균치이다. 바는 이러한 6회 배양의 평균치에 관한 평균의 표준 오차이다.

도 11은 각종 농도의 Ckβ-4 및 MCP-1의 존재하에서 배양된 것에 반응하여 일어난 말초혈 임파구의 화학주성을 도시한 그래프이다. 각 그래프에서, 화학주성은 세로 축을 따라 선형 등급으로, 485nm 여기에 의해 자극된 530nm에서의 형광성 방출의 비율 측면에서 지시된다. 성장 배지에서의 상기 인자의 농도는 가로 축을 따라 로그 등급으로 ng/ml로써 제시된다. 각 지점은 수회 배양의 평균치이다. 바는 이러한 배양의 평균치에 관한 평균의 표준 오차이다.

본 발명의 한 국면에 따르면, 도 1의 추론된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 Ckβ-4 폴리펩티드 또는 1994년 7월 29일에 ATCC 기탁번호 제75848호로서 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드와 도 2 및 5의 추론된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 MCP-4(Ckβ-10으로서 공지되기도 함) 폴리펩티드 또는 1994년 7월 29일에 ATCC 기탁번호 제75849호로서 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산(폴리뉴클레오티드)이 제공된다. 또한, 이러한 본 발명의 국면에 따르면, 도 2 및 5에 제시된 28번에서 93번 까지의 아미노산 잔기를 포함하는 MCP-4 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 특히 도 2 및 5에 제시된 1번에서 98번, 17번에서 98번, 20번에서 98번, 22번에서 98번, 24번에서 98번, 28번에서 98번, 28번에서 95번 및 28번에서 93번 까지의 아미노산 잔기로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 및 이의 단편, 동족체 및 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

Ckβ-4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 사람 담낭으로부터 유도된 cDNA 라이브러리에서 발견되었다. Ckβ-4는 케모킨 계열과 구조적으로 관련이 있다. 이는 96개 아미노산 잔기의 단백질(이중 처음 26개 아미노산 잔기는 성숙한 단백질이 70개 아미노산을 포함하도록 추정상의 리더 서열이다)을 암호화하는 개방 판독 프레임을 함유한다. 이러한 단백질은 에오탁신과 가장 높은 상동성을 나타내는데, 전체 암호화 서열에 걸쳐 20%의 동질성과 37%의 유사성을 지니고 있다. 케모킨에서 공간적으로 보존된 4개의 시스테인 잔기가 본 발명의 폴리펩티드에서 발견된다는 사실이 또한 중요하다.

MCP-4(Ckβ-10으로서 공지되기도 함)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 9주된 초기 단계의 사람 조직으로부터 유도된 cDNA 라이브러리에서 발견되었다. MCP-4는 케모킨 계열과 구조적으로 관련이 있다. 이는 98개 아미노산 잔기의 단백질(이중 대략 처음 20개 아미노산 잔기는 도 5에 나타낸 바와 같고 본원에서 논의된 바와 같이 추정상 또는 실제의 리더 서열이고 성숙한 단백질은 또한 도 5에 도시된 바와 같이 절단 부위(들)에 따라 약 75개 아미노산을 포함한다)을 암호화하는 개방 판독 프레임을 함유한다. 이러한 단백질은 MCP-1, MCP-2, MCP-3 및 에오탁신과 유사성을 지닌 마크된 서열을 가지며 MCP-3과 가장 높은 상동성을 나타내는데, 전체 암호화 서열에 걸쳐 65%의 동질성과 77%의 유사성을 지니고 있다.

다음에 보다 상세히 기술될 본 발명의 특히 바람직한 MCP-4 폴리펩티드(본원에서 Ckβ-10으로서 지칭되기도 함)로는 도 2 또는 도 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 있다. 이러한 바람직한 폴리펩티드로는 유리 아미노 및 차단기 아미노 말단을 갖는 것, 특히 도 5에 제시된 것이 있으며, 여기서 말단 글루타민은 차단된 피로글루타민 잔기이다. 본 발명의 한 국면에 따르면, 도 2 또는 도 5에 제시된 28번에서 93번 까지의 서열 잔기를 포함하는 MCP-4 폴리펩티드, 특히 도 2 또는 도 5에 제시된 1번에서 98번, 17번에서 98번, 20번에서 98번, 22번에서 98번, 24번에서 98번, 28번에서 98번, 28번에서 95번 및 28번에서 93번 까지의 서열 잔기로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 및 이의 단편, 동족체 및 유도체가 바람직하다.

이러한 폴리펩티드는 예를 들어 곤충 숙주 세포에서 바쿨로바이러스 벡터를 사용하여, 본 발명의 cDNA, 특히 도 1, 2 또는 5에 제시된 서열을 가지거나 기탁된 클론의 사람 cDNA의 서열을 갖는 cDNA를 발현시킴으로써 제조할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA 형태이거나, 또는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함하는 DNA 형태일 수 있다. 이러한 DNA는 이본쇄 또는 일본쇄일 수 있고 일본쇄인 경우에는 암호화 쇄 또는 비-암호화(안티-센스) 쇄일 수 있다. 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 암호화 서열은 도 1 및 2에 나타낸 암호화 서열 또는 기탁된 클론의 암호화 서열과 동일하거나, 또는 유전자 암호의 중복성 또는 축퇴성의 결과로서 암호화 서열이 도 1, 2 또는 5의 DNA 또는 기탁된 cDNA와 동일한 성숙한 폴리펩티드, 또는 예를 들어 본원에서 앞서 논의된 바와 같은 기타 폴리펩티드를 암호화하는 상이한 암호화 서열일 수 있다.

도 1, 2 또는 5의 폴리펩티드 및 본원에 언급된 바와 같은 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 단지 성숙한 폴리펩티드에 대한 암호화 서열; 성숙한 폴리펩티드에 대한 암호화 서열 및 리더 또는 분비성 서열 또는 프로단백질 서열과 같은 부가의 암호화 서열; 성숙한 폴리펩티드에 대한 암호화 서열(및 임의의 부가적 암호화 서열) 및 인트론 또는 성숙한 폴리펩티드에 대한 암호화 서열의 비-암호화 서열 5' 및/또는 3'과 같은 비-암호화 서열을 포함할 수 있다.

따라서, 용어 "폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드"는 단지 폴리펩티드에 대한 암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라 부가의 암호화 및/또는 비-암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다.

또한 본 발명은 도 1 및 2의 추론된 아미노산 서열 및 도 5에 제시된 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드의 단편, 동족체 및 유도체를 암호화하는 상기 언급된 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 변이체는 폴리뉴클레오티드의 천연 대립 유전자성 변이체 또는 폴리뉴클레오티드의 비-천연 변이체일 수 있다.

따라서, 본 발명은 도 1 및 2에 나타낸 바와 동일한 성숙한 폴리펩티드, 도 5에 제시된 폴리펩티드 또는 기탁된 클론(들)의 cDNA에 의해 암호화된 동일한 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 도 1 및 2의 폴리펩티드, 도 5에 제시된 폴리펩티드 또는 기탁된 클론(들)의 cDNA에 의해 암호화된 동일한 성숙한 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 동족체를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함한다. 이러한 뉴클레오티드 변이체로는 결실 변이체, 치환 변이체 및 첨가 또는 삽입 변이체가 있다.

앞서 지적한 바와 같이, 당해 폴리뉴클레오티드는 도 1 및 2에 나타낸 암호화 서열, 도 5에 제시된 폴리펩티드 또는 기탁된 클론(들)의 암호화 서열의 천연 대립 유전자성 변이체인 암호화 서열을 가질 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 대립 유전자성 변이체는 암호화된 폴리펩티드의 기능을 실질적으로 변형시키지 않으면서, 하나 이상의 뉴클레오티드가 치환, 결실 또는 첨가될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열의 대체 형태이다.

또한 본 발명은 성숙한 폴리펩티드에 대한 암호화 서열이 숙주 세포로부터의 폴리펩티드의 발현 및 분비를 보조하는 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 상기 숙주 세포로부터의 폴리펩티드의 수송을 조절하는 분비성 서열로서 작용하는 리더 서열에 동일한 판독 프레임으로 융합될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 리더 서열을 갖는 폴리펩티드는 프리(pre) 단백질이고 숙주 세포에 의해 절단되어 성숙한 형태의 폴리펩티드를 형성시키는 리더 서열을 가질 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 성숙한 단백질 + 부가의 5' 아미노산 잔기인 프로(pro) 단백질을 암호화할 수도 있다. 프로서열을 갖는 성숙한 단백질은 프로단백질이고 불활성 형태의 단백질이다. 프로서열이 절단되면, 활성을 지닌 성숙한 단백질이 남게 된다.

따라서, 예를 들어 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 성숙한 단백질, 프로서열을 갖는 단백질, 또는 프로서열과 프리서열(리더 서열) 모두를 갖는 단백질을 암호화할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드의 정제를 가능케하는 마커 서열에 동일한 프레임으로 융합된 암호화 서열을 가질 수도 있다. 이러한 마커 서열은 세균성 숙주의 경우에는 상기 마커와 융합된 성숙한 폴리펩티드를 정제하기 위해 제공된, pQE-9 벡터에 의해 공급된 헥사히스티딘 태그(tag)일 수 있거나, 또는 예를 들어 COS-7 세포와 같은 포유류 숙주가 사용된 경우에는 혈구응집소(HA) 태그일 수 있다. HA 태그는 인플루엔자 혈구응집소 단백질로부터 유도된 에피토프(epitope)에 상응한다[참조: Wilson, I., et al., Cell, 37:767(1984)].

또한, 본 발명은 서열간에 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상의 동질성이 존재하는 경우, 상기 언급된 서열과 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 상기 언급된 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "엄격한 조건"이란 서열간에 95% 이상, 바람직하게는 97% 이상의 동질성이 존재하는 경우에만 하이브리드화가 발생하는 것을 의미한다. 바람직한 양태에서 상기 언급된 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드는 도 1 및 2의 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드, 도 5에 제시된 폴리펩티드 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드와 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 실질적으로 보유하는 폴리펩티드를 암호화한다.

본 발명에서 언급된 기탁은 특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 협약하에 주장된다. 이들 기탁은 단지 당해 기술분야의 숙련인에게 편의를 제공하는 것이지 기탁이 35 U.S.C. §112 규정을 충족시켜야 하는 승인 요건은 아니다. 기탁된 물질에 함유된 폴리뉴클레오티드의 서열, 및 이에 의해 암호화된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 본 명세서에서 참조로 인용되고 본 명세서내에 기술된 서열과 분쟁이 일어날 경우에 조정한다. 실시권은 기탁된 물질을 제조, 사용 또는 판매하는데 필요할 수 있는데, 어떠한 실시권도 본원에 의해 허여되지 않는다.

또한 본 발명은 도 1 및 2의 추론된 아미노산 서열 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 케모킨 폴리펩티드 뿐만 아니라 이러한 폴리펩티드의 단편, 동족체 및 유도체에 관한 것이다.

도 1 및 2의 폴리펩티드 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드에 관해 언급할 경우, 용어 "단편", "유도체" 및 "동족체"는 상기 폴리펩티드와 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 실질적으로 보유하는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, 동족체는 프로단백질 부분의 절단에 의해 활성화되어 활성을 지닌 성숙한 폴리펩티드를 생성시킬 수 있는 프로단백질을 포함한다.

본 발명의 케모킨 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드, 바람직하게는 재조합 폴리펩티드일 수 있다.

도 1 및 2의 폴리펩티드, 도 5의 폴리펩티드 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 동족체는 (ⅰ) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존되거나 보존되지 않는 아미노산 잔기(바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환되고 이와 같이 치환된 아미노산 잔기가 유전자 암호에 의해 암호화된 것이거나 아닐 수 있는 것, (ⅱ) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환체 그룹을 포함하는 것, (ⅲ) 성숙한 폴리펩티드가 또다른 화합물, 예를 들어 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)과 융합되는 것, 또는 (ⅳ) 리더 또는 분비성 서열; 성숙한 폴리펩티드의 정제를 위해 사용되는 서열; 또는 프로단백질 서열과 같은 부가의 아미노산이 성숙한 폴리펩티드와 융합되는 것일 수 있다. 본 명세서의 교시로부터 당해 기술 분야의 숙련인은 상기 단편, 유도체 및 동족체가 본 발명의 범주 내에 있다고 간주할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 분리된 형태로 제공되고, 바람직하게는 동질할 정도로 정제된다.

용어 "분리된"이란 물질을 이의 본래 환경(예를 들면, 천연 물질인 경우에는 천연 환경)으로부터 제거함을 의미한다. 예를 들어, 살아 있는 동물 내에 존재하는 천연의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 분리되지 않으나, 천연 시스템 내에 공존하는 몇몇 또는 모든 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 분리된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있으므로, 상기 벡터 또는 조성물이 이의 천연 환경의 일부가 아닌 경우에 분리될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 본 발명의 벡터를 사용하여 유전공학적으로 조작된 숙주 세포, 및 재조합 기술에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다.

숙주 세포를, 예를 들어 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명의 벡터를 사용하여 유전공학적으로 조작(형질도입, 형질전환 또는 형질감염)한다. 이러한 벡터는, 예를 들어 플라스미드, 바이러스 입자, 파아지 등의 형태일 수 있다. 상기와 같이 유전공학적으로 조작된 숙주 세포를 프로모터의 활성화, 형질전환체의 선별 또는 당해 Ckβ-4 및 MCP-4 유전자(Ckβ-10 유전자로서 공지되기도 함)의 증폭에 적합하도록 변형시킨 통상의 영양 배지에서 배양할 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 미리 사용된 것이고, 당해 분야의 숙련인에게는 명백할 것이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 재조합 기술에 의해 폴리펩티드를 제조하는데 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어 당해 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 각종 발현 벡터 중의 어느 하나에 포함될 수 있다. 이러한 벡터로는 염색체성, 비염색체성 및 합성 DNA 서열, 예를 들어 SV40의 유도체; 세균성 플라스미드; 파아지 DNA; 바쿨로바이러스; 효모 플라스미드; 플라스미드와 파아지 DNA의 조합으로부터 유도된 벡터, 백시니아, 아데노바이러스, 가금류 폭스 바이러스 및 슈도라비스와 같은 바이스성 DNA를 포함한다. 그러나, 그 외의 어떠한 벡터라도 숙주 내에서 복제가능하고 생존가능한 경우에는 사용될 수 있다.

적당한 DNA 서열을 각종 방법에 의해 벡터내로 삽입할 수 있다. 일반적으로, 이러한 DNA 서열은 당해 기술 분야에 널리 공지된 방법에 의해 적당한 제한 엔도뉴클레아제 부위 내로 삽입된다. 이러한 방법 및 기타 방법은 당해 기술 분야의 숙련인의 범주 내에 있는 것으로 간주된다.

발현 벡터 내의 DNA 서열은 적당한 발현 조절(control) 서열(프로모터)에 작동적으로 연결되어 mRNA 합성을 지시한다. 상기 프로모터의 대표적인 예로서, LTR 또는 SV40 프로모터, 이. 콜라이(E. coli)lac또는trp, 파아지 람다 P_L프로모터, 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스 내에서 유전자 발현을 조절하는 것으로 공지된 기타 프로모터를 언급할 수 있다. 또한 발현 벡터는 해독 개시를 위한 리보솜 결합 부위 및 전사 종결인자를 함유한다. 상기 벡터는 발현을 증폭시키기에 적합한 서열을 포함할 수도 있다.

또한, 발현 벡터는 바람직하게는, 진핵 세포 배양의 경우에는 디하이드로폴레이트 리덕타제 또는 네오마이신 내성, 또는 이. 콜라이 내에서의 테트라사이클린 또는 앰피실린 내성과 같은, 형질전환된 숙주 세포의 선별을 위한 표현형 특성을 제공하는 하나 이상의 선별 가능한 마커 유전자를 함유한다.

상기 언급된 바와 같은 적당한 DNA 서열 뿐만 아니라 적당한 프로모터 또는 조절 서열을 함유하는 벡터를 사용하여 적당한 숙주를 형질전환시킴으로써 상기 숙주가 단백질을 발현할 수 있도록 한다.

적합한 숙주의 대표적인 예로서는, 이. 콜라이, 스트렙토마이세스(Streptomyces),살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium)과 같은 세균성 세포; 효모와 같은 진균성 세포; 드로소필라 (Drosophila)및Sf9와 같은 곤충류 세포; CHO, COS 또는 보웨스 흑색종과 같은 동물 세포; 식물 세포 등을 언급할 수 있다. 적합한 숙주의 선별은 본 명세서의 교시로부터 당해 기술 분야의 숙련인의 범주 내에 있다고 간주된다.

보다 특히, 본 발명은 앞서 광범위하게 기술된 바와 같은 서열 중 하나 이상을 포함하는 재조합 작제물도 포함한다. 이러한 작제물은 본 발명의 서열을 정방향 또는 역방향으로 삽입시킨 플라스미드 또는 바이러스성 벡터와 같은 벡터를 포함한다. 상기 양태의 바람직한 국면에서, 작제물은, 예를 들어 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 조절성 서열을 추가로 포함한다. 다수의 적합한 벡터 및 프로모터가 당해 기술 분야의 숙련인에게 공지되어 있고, 시판되고 있다. 하기 벡터가 예로써 제공된다. 세균성: pQE70, pQE60, pQE-9(공급원: Qiagen), pBS, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsKS, pNH8a, pNH16a, pNH18A, pNH46A(공급원: Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(공급원: Pharmacia). 진핵성: pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1, pSG(공급원: Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL(공급원: Pharmacia). 그러나, 그 외의 어떠한 플라스미드 또는 벡터라도 숙주 내에서 복제가능하고 생존가능하다면 사용될 수 있다.

프로모터 영역은 CAT(클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제) 벡터 또는 선별 가능한 마커를 갖는 기타 벡터를 사용하여 바람직한 어떠한 유전자로부터도 선별할 수 있다. 두가지 적합한 벡터는 pKK232-8 및 pCM7이다. 특정하게 명명된 세균성 프로모터로는 lacⅠ, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 P_R, P_L및 trp가 있다. 진핵성 프로모터로는 CMS 전 초기(immediate early) 프로모터, HSV 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터의 LTR, 및 마우스 메탈로티오네인-Ⅰ이 있다. 적당한 벡터 및 프로모터의 선별은 충분히 당해 분야에서 통상적인 기술의 범주 내이다.

추가 양태에서, 본 발명은 상기 언급된 작제물을 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 포유류 세포와 같은 고등 진핵 세포, 또는 효모 세포와 같은 하등 진핵 세포일 수 있거나, 숙주 세포는 세균성 세포와 같은 원핵 세포일 수 있다. 작제물의 숙주 세포로의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 또는 전기천공(electroporation)에 의해 수행될 수 있다[참조: Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Method in Molecular Biology, (1986)].

숙주 세포 내의 작제물을 통상적인 방법으로 사용하여 재조합 서열에 의해 암호화된 유전자 생성물을 제조할 수 있다. 또다른 방법으로는, 본 발명의 폴리펩티드를 통상적인 펩티드 합성기에 의해 합성적으로 제조할 수 있다.

성숙한 단백질은 적합한 프로모터의 조절하에 포유류 세포, 효모, 세균, 또는 기타 세포 내에서 발현될 수 있다. 본 발명의 DNA 작제물로부터 유도된 RNA를 사용하여 상기 단백질을 제조하기 위해 무세포 해독 시스템을 사용할 수도 있다. 원핵성 및 진핵성 숙주와 함께 사용하기에 적합한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌[참조: Sambrook. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)]에 기술되어 있고, 이는 본 발명의 명세서에 참조로 인용된다.

고등 진핵 세포에 의한 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 전사는 인핸서(enhancer) 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 인핸서는 통상적으로 약 10 내지 300bp이고 프로모터에 작용하여 전사를 증가시키는, DNA의 cis-작용성 요소이다. 복제 기점 bp 100 내지 270의 말단측 상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 말단측 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 예로서 포함한다.

일반적으로, 재조합 발현 벡터는 복제 기점; 숙주 세포의 형질전환을 가능하게 하는 선별 가능한 마커, 예를 들어 이. 콜라이 및 에스. 세레비지애(S. cerevisiae)TRP1 유전자의 앰피실린 내성 유전자; 및 하부 구조 서열의 전사를 지시하는 고도로 발현된 유전자로부터 유도된 프로모터를 포함한다. 상기 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제(PGK), α-인자, 산 포스파타제, 또는 열 쇼크 단백질 등과 같은 당분해 효소를 암호화하는 오페론으로부터 유도될 수 있다. 이종 구조 서열은 해독 개시 및 종결 서열, 및 바람직하게는 해독된 단백질이 페리플라즘 공간 또는 세포외 매질 내로 분비되도록 지시할 수 있는 리더 서열과 함께 적당한 상에서 어셈블리된다. 임의로, 이러한 이종 구조 서열은 목적하는 특성, 예를 들어 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 간소화된 정제를 제공하는 N-말단 동정 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호화할 수 있다.

세균에 사용하기에 유용한 발현 벡터는 목적하는 단백질을 암호화하는 구조적 DNA 서열을 적합한 해독 개시 및 종결 시그날과 함께, 작용성 프로모터를 가진 작동성 판독 상 내로 삽입함으로써 작제된다. 상기 벡터는 하나 이상의 표현형 선별 가능한 마커 및 복제 기점을 포함하여 벡터를 유지할 수 있고, 필요한 경우 숙주 내에서 증폭을 제공한다. 형질전환에 적합한 원핵 숙주 세포로는 이. 콜라이, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무륨, 및 슈도모나스(Pseudomanas) 속, 스트렙토마이세스 속 및 스타필로코커스(Staphylococcus) 속 내의 각종 종들이 있지만, 다른 것들을 선택하여 사용할 수도 있다.

대표적이나 이에 제한되지 않는 예로서, 세균에 사용하기에 유용한 발현 벡터는 익히 공지된 클로닝 벡터 pBR322(ATCC 37017)의 유전적 요소를 포함하는 시판용 플라스미드로부터 유도된 선별 가능한 마커 및 세균성 복제 기점을 포함할 수 있다. 이러한 시판용 벡터로는, 예를 들어 pKK223-3(제조원: Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) 및 pGEM1(제조원: Promega Biotec, Madison, WI, USA)이 있다. 상기 pBR322 "중축(backbone)" 절편을 적당한 프로모터 및 발현될 구조 서열과 결합한다.

적합한 숙주 균주를 형질전환시키고 적당한 세포 밀도로 숙주 균주를 성장시킨 다음, 선별된 프로모터를 적합한 방법(예: 온도 변화 또는 화학적 유도)으로 유도시키고 세포들을 추가 기간 동안 배양한다.

세포를 전형적으로 원심분리에 의해 수거하고, 물리적 또는 화학적 수단으로 파쇄한 다음, 생성된 조 추출물을 추가 정제를 위해 보유한다.

단백질의 발현에 사용되는 미생물 세포는 냉동-해동 순환, 초음파 분해처리, 기계적 파쇄, 또는 세포 용해제의 사용을 포함하는 통상적인 방법에 의해 파쇄시킬 수 있으며, 이러한 방법은 당해 분야의 숙련인에게 널리 공지되어 있다.

또한, 각종 포유류 세포 배양 시스템을 사용하여 재조합 단백질을 발현시킬 수 있다. 포유류 발현 시스템의 예로는 문헌[참조: Gluzman, Cell, 23:175(1981)]에 기술된 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 주, 및 적합한 벡터를 발현시킬 수 있는 기타 세포주, 예를 들어 C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주가 있다. 포유류 발현 벡터는 복제 기점, 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 필수 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플리스 공여체 및 수용체 부위, 전사 종결 서열 및 5' 인접 비-전사 서열을 포함한다. SV40 스플리스 및 폴리아데닐화 부위로부터 유도된 DNA 서열을 사용하여 필요로 하는 비-전사된 유전적 요소를 제공할 수 있다.

본 발명의 케모킨 폴리펩티드를 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화 크로마토그패피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수하고 정제할 수 있다. 단백질 리폴딩(refolding) 단계를, 필요한 경우 성숙한 단백질의 배열을 완성하는데 사용할 수 있다. 최종적으로, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 최종 정제 단계에 사용할 수 있다.

본 발명의 케모킨 폴리펩티드는 천연적으로 정제된 생성물이거나, 또는 화학적 합성 과정 또는 원핵 또는 진핵 세포 숙주(예를 들어, 배양물 중의 세균성, 효모, 고등 식물, 곤충류 및 포유류 세포에 의해)로부터 재조합 기술에 의해 제조된 생성물일 수 있다. 재조합 제조 과정에 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 글리코실화되거나 글리코실화 되지 않을 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수도 있다.

당해 케모킨 폴리펩티드는 암 화학치료요법 동안 및 백혈병에 대한 보조의 보호성 치료제로서 골수 간 세포 콜로니 형성을 억제하는데 사용할 수 있다.

이들은 또한, 각종 조혈성 원종 세포의 활성 및 분화를 조절함으로써 조혈을 조절하는데 사용할 수 있다.

당해 케모킨 폴리펩티드는 각질세포 과증식의 특징을 나타내는 건선을 치료하기 위해 표피성 각질세포 증식을 억제하는데 사용할 수도 있다.

당해 케모킨 폴리펩티드는 숙주 방어 세포, 예를 들어, CD8⁺, 세포독성 T 세포 및 대식구의 침입과 활성화를 자극함으로써 충실성 종양을 치료하는데 사용할 수도 있다. 특히, Ckβ-4는 말초혈 임파구에 대해 사용하고 MCP-4(Ckβ-10으로서 지칭되기도 함)는 CD8⁺T-세포, 호산구 및 단구에 대해 사용한다. 이들을 사용하여 Ckβ-4에 의한 말초혈 백혈구("PBLs") 및 MCP-4에 의한 CD4⁺T-세포, 단구 및 호산구 등과 같이 살미생물성 백혈구의 유인을 통하여, 내성 만성적 감염, 예를 들면, 미코박테리아, 리스테리아 또는 레이슈마니아 감염, 또는 크립토코커스 감염과 같은 기회주의적 감염에 대한 숙주 방어를 증진시킬 수도 있다.

당해 케모킨 폴리펩티드는 주혈흡충증, 선모충증 및 회충병에서와 같이, 조직을 칩입하는 기생충의 유충을 사멸시키는 독특한 기능을 갖는 호산구의 존재를 증가시킨다.

당해 케모킨 폴리펩티드는 IL-2 생합성 억제에 의해 T-세포 증식을 억제시킴으로써 자가 면역 질환과 임파성 백혈병을 치료하는데 사용할 수도 있다.

Ckβ-4 및 MCP-4(Ckβ-10으로서 지칭되기도 함)은 또한, 부스러기를 정화시키고 연결 조직을 증진시키는 염증성 세포의 보충을 통하여, 또한 과도한 TGFβ 매개된 섬유증의 억제를 통하여 상처를 치유하는데 사용할 수도 있다. 이와 동일한 방식으로, Ckβ-4 및 MCP-4를 사용하여 간 경변, 골관절염 및 폐동맥 섬유증을 포함한 기타 섬유증 질환을 치료할 수 있다.

케모킨은 또한, 맥관형성의 억제제로서 사용할 수 있기 때문에, 항-종양 효과를 지니고 있다.

본 발명의 케모킨을 사용하여 신경단위 생존과 분화를 증진시킬 수도 있으며 이와 관련하여 이들이 유효한 경우에는 이들 케모킨을 신경변성 질환에 사용할 수도 있다. 따라서, 예를 들면, Ckβ-4를 유효한 경우, 신경단위 생존과 신경돌기 성장을 증진시키는데 사용할 수 있다.

본 발명의 케모킨 폴리펩티드는 유사한 생물학적 활성을 갖는 기타 분자를 동정하는데 유용할 수도 있다. 이를 위한 스크린의 한 예는 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하기 위해 공지된 DNA 서열을 사용함으로써 유전자의 암호화 영역을 분리하는 것이다. 본 발명의 유전자의 서열에 상보적인 서열을 갖는 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 사람 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크린함으로써 상기 프로브와 하이브리드화하는 라이브러리의 구성원을 결정한다.

본 발명은 변형된 수준의 폴리펩티드 또는 이러한 폴리펩티드에 대한 메시지를 제공해주는 mRNA를 정량적 및 정성적으로 탐지하기 위한 진단 검정법에 관한 것이다. 이러한 검정법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고 이의 예로는 ELISA 검정, 방사선면역 검정 및 RT-PCR이 있다. 이러한 검정에서 탐지되는 폴리펩티드 또는 이들의 mRNA의 수준은 각종 질병에서의 당해 폴리펩티드의 중요성을 밝히는데 이용되고 또한 변형된 수준의 폴리펩티드가 상당할 수 있는 질병을 진단하는데 사용할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 대한 수용체의 동정 방법을 제공한다. 이러한 수용체를 암호화하는 유전자는 발현 클로닝에 의해 동정할 수 있다. 폴리아데닐화 RNA를 당해 폴리펩티드에 대해 반응성인 세포로부터 제조하고, 이러한 RNA로부터 창출된 cDNA 라이브러리를 풀(pool)로 분할하고 이를 당해 폴리펩티드에 대해 반응성이 없는 COS 세포 또는 기타 세포를 형질감염시키는데 사용한다. 슬라이드 상에서 배양될 수 있는 형질감염된 세포를 표지된 본 발명의 폴리펩티드에 노출시킨다. 당해 폴리펩티드를 부위 특이적 단백질 키나제에 대한 인식 부위의 요오드화 또는 혼입을 포함하는 각종 방법으로 표지시킬 수 있다. 고정 및 배양한 다음, 슬라이드를 대상으로 자동방사성사진술을 이용하여 분석한다. 양성 풀을 동정하고 서브-풀을 제조하고 반복되는 서브-풀링 및 재스크리닝 방법을 사용하여 재형질감염시켜, 최종적으로 추정상의 수용체를 암호화하는 단일 클론을 수득한다.

수용체 동정에 대한 또 다른 접근법으로서, 표지된 폴리펩티드를 세포막 또는 수용체 분자를 발현시키는 추출물 제제와 광친화적으로 연결시킬 수 있다. 가교결합된 물질을 PAGE 분석에 의해 분할하고 X-레이 필름에 노출시킨다. 당해 폴리펩티드의 수용체를 함유하는 표지된 복합체를 절단하고, 펩티드 단편으로 분할하고, 단백질 미소서열분석(microsequencing)시킬 수 있다. 미소서열분석으로부터 수득된 아미노산 서열을 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프로브의 세트를 디자인하는데 사용하여 추정상의 수용체를 암호화하는 유전자를 동정할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드와 이들의 동정된 수용체와의 상호작용을 증진시키는 것(효능제) 또는 차단시키는 것(길항제)들을 동정하기 위한 약물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 효능제는 당해 폴리펩티드의 천연 생물학적 작용을 증가시키는 화합물인 반면, 길항제는 이러한 작용을 제거시킨다. 한 예로서, 당해 폴리펩티드의 수용체를 발현하는 포유류 세포 또는 막 제제를 상기 약물의 존재하에서 표지된 케모킨 폴리펩티드(예: 방사능)와 함께 배양한다. 이어서, 이러한 상호작용을 증진 또는 차단시키는 약물의 능력을 측정할 수 있다.

효능있는 길항제의 예로는 당해 폴리펩티드에 결합하는 항체, 또는 몇몇 경우에 있어서는 올리고뉴클레오티드가 있다. 효능있는 길항제의 또 다른 예는 당해 폴리펩티드의 음성 우성적 돌연변이체이다. 음성 우성적 돌연변이체는 야생형 폴리펩티드의 수용체와는 결합되지만, 생물학적 활성을 보유하지는 않는 폴리펩티드이다.

당해 폴리펩티드의 음성 우성적 돌연변이체를 탐지하는 검정법으로는 폴리비닐피롤리돈이 없는 폴리카보네이트 막이 장착된 다중웰 화학주성 챔버를 사용하여 효능있는 길항제/억제제 또는 효능제 분자의 존재 및 부재하에서 백혈구에 대한 당해 폴리펩티드의 화학유인제 활성을 측정하는 시험관내 화학주성 검정법이 있다.

안티센스(antisense) 기술을 사용하여 제조된 안티센스 작제물 역시 효능있는 길항제이다. 안티센스 기술을 사용하여 삼중-나선 구조 형성을 통하여 유전자 발현을 조절하거나 안티센스 DNA 또는 RNA를 통하여 유전자 발현을 조절하는데, 이들 방법 모두는 폴리뉴클레오티드를 DNA 또는 RNA에 결합시키는 것을 기초로 한다. 예를 들어, 본 발명의 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 암호화 부분을 사용하여 약 10 내지 40 염기쌍 길이의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 디자인한다. DNA 올리고뉴클레오티드를 전사에 관계된 유전자 영역에 상보적이도록 디자인함으로써[삼중 나선 - 참조: Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073(1979); Cooney et al, Science, 241:456(1988); 및 Dervan et al., Science, 251: 1360(1991)], 본 발명에 따른 폴리펩티드의 전사 및 생성을 억제한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드가 생체 내에서 mRNA와 하이브리드화하고 mRNA 분자가 당해 폴리펩티드로 해독되는 것을 차단한다[안티센스-참조: Okano, J. Neurochem., 56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL(1988)]. 또한 상기 언급된 올리고뉴클레오티드를 세포로 전달하여, 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체 내에서 발현되어 당해 폴리펩티드의 생성을 억제할 수 있도록 한다.

또 다른 효능있는 길항제는 생물학적 작용은 상실하였지만 당해 폴리펩티드의 수용체를 인식하여 이와 결합됨으로써 상기 수용체를 효과적으로 차단시키는 폴리펩티드의 천연적으로 또는 합성적으로 변형된 동족체인, 당해 폴리펩티드의 펩티드 유도체이다. 이러한 펩티드 유도체의 예로는 작은 펩티드 또는 펩티드-유사 분자가 있지만 이에 제한되지는 않는다.

상기 길항제를 사용하여 자가 면역 질환 및 만성적 염증성 및 감염성 질병에 있어서, 대식구 및 이들의 전구체의 화학주성 및 활성화를 억제하고 친핵구, 호염기구, B 임파구 및 몇몇 T 세포 아셋트, 예를 들면, 활성화된 및 CD8+ 세포독성 T-세포 및 천연 킬러 세포의 화학주성 및 활성화를 억제할 수 있다. 자가 면역 질환의 예로는 류마티스성 관절염, 다발성 경화증 및 인슐린 의존성 당뇨병이 있다. 몇몇 감염성 질환으로는 단핵성 식세포의 보충 및 활성화를 억제시킨 것에 의한 규분증, 유육종증, 특발성 폐동맥 섬유증; 호산구 생성 및 이동을 억제시킨 것에 의한 특발성 과호산구증; 대식구의 이동 및 이들의 본 발명의 케모킨 폴리펩티드의 생성을 억제시킨 것에 의한 내독성 쇽이 있다. 이러한 길항체는 또한, 동맥벽에서의 단구 침윤을 억제함으로써, 아테롬성 동맥경화증을 치료하는데 사용할 수도 있다.

당해 길항제를 사용하여, 케모킨 유도된 비만 세포 및 호염기구 과립감소 및 히스타민 방출을 억제함으로써 히스타민-매개된 알레르기성 반응을 치료할 수 있다.

당해 길항제를 사용하여, 상처 부위에 대한 단구의 유인을 억제함으로써 염증을 치료할 수도 있다. 이들을 또한 사용하여 정상의 폐동맥 대식구 집단을 조절할 수 있는데, 이는 급성 및 만성적 염증성 폐동맥 질환이 폐에서 단핵성 식세포의 격리와 연관이 있기 때문이다.

당해 길항제를 사용하여, 환자의 관절에서의 활액 내로 단구가 유인되는 것을 방지함으로써 류마티스성 관절염을 치료할 수도 있다. 단구 유입 및 활성화는 퇴행성 및 염증성 관절증 모두의 발병학에 있어서 중요한 역할을 한다.

당해 길항제를 사용하여 기타 염증성 사이토킨의 생합성을 억제시키는, 주로 IL-1 및 TNF에 기인된 유해한 케스케이드를 방해할 수 있다. 이와 같은 방식으로, 당해 길항제를 사용하여 염증을 예방할 수 있다. 당해 길항제를 또한 사용하여 케모킨에 의해 유도된, 프로스타글란딘-독립적인 열병을 억제할 수 있다.

당해 길항제를 사용하여 골수 부전증, 예를 들면, 재생불량성 빈혈 및 척수 이형성증을 치료할 수 있다.

당해 길항제를 사용하여 폐에 호산구가 축적되는 것을 방지함으로써 천식과 알레르기를 치료할 수도 있다. 당해 길항제는 다음에 후술되는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 조성물에 이용될 수 있다.

본 발명의 케모킨 폴리펩티드 및 효능제 또는 길항제를 적합한 약제학적 담체와 배합하여 사용할 수 있다. 이러한 조성물은 치료학적 유효량의 당해 폴리펩티드와 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 상기 담체로는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로즈, 물, 글리세롤, 에탄올, 및 이의 배합물이 있으나 이에 제한되지는 않는다. 상기 제형물은 투여 형태에 적합해야 한다.

또한 본 발명은 본 발명의 약제학적 조성물의 하나 이상의 성분으로 충전된 하나 이상의 컨테이너를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 상기 컨테이너와 관련된 사항은 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 통지일 수 있고, 이러한 통지는 상기 정부 기관에 의한, 사람 투여용 제품에 대한 제조, 사용 또는 판매의 승인을 반영한다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드를 다른 치료학적 화합물과 함께 사용할 수 있다.

당해 약제학적 조성물은 통상적인 방법, 예를 들어 국부, 정맥내, 복강내, 근육내, 종양내, 피하, 비강내 또는 피내 경로로 투여할 수 있다. 당해 폴리펩티드는 특이적인 증상의 치료 및/또는 예방에 효과적인 양으로 투여한다. 일반적으로, 이를 1일 약 10μg/체중 kg 이상의 양으로 투여하고 대부분의 경우에는 1일 약 8mg/체중 kg을 초과하지 않는 양으로 투여해야 한다. 대부분의 경우에, 투여량은 투여 경로, 증상 등을 고려하여, 1일 약 10μg/체중 kg 내지 약 1mg/체중 kg이다.

본 발명의 케모킨 폴리펩티드 및 효능제 또는 길항제는 본 발명에 따라서, 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현시킴으로써 사용할 수도 있는데, 이는 종종 "유전자 치료법(gene therapy)"으로서 지칭된다.

따라서, 예를 들어 특정 환자로부터의 세포를 생체 외에서 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)로 유전 공학적으로 조작한 다음, 이와 같이 유전 공학적으로 조작된 세포를 상기 폴리펩티드로 치료하고자 하는 환자에게 제공할 수 있다. 상기 방법은 당해 기술 분야에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 세포를 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 RNA를 함유하는 레트로바이러스성 입자를 사용함으로써 당해 분야에 공지된 방법으로 유전공학적으로 조작할 수 있다.

유사하게, 예를 들어 당해 기술 분야에서 공지된 방법에 의해 폴리펩티드를 생체 내에서 발현시키기 위해 생체 내에서 유전 공학적으로 조작할 수 있다. 당해 기술 분야에서 공지된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 RNA를 함유하는 레트로바이러스성 입자를 제조하기 위한 생산자 세포를 생체 내에서 세포를 조작하고 생체 내에서 폴리펩티드를 발현시키기 위해 환자에게 투여할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 상기 과정에 의해 투여하는 방법 및 기타 방법은 본 발명의 교시로부터 당해 기술 분야의 숙련인에게 명백하여야 한다. 예를 들어, 세포를 조작하기 위한 발현 비히클(vehicle)은 레트로바이러스 이외의 것일 수 있는데, 예를 들어 아데노바이러스를 적합한 운반용 비히클과 결합시킨 후에 생체 내에서 세포를 조작하는데 사용할 수 있다.

본 발명의 서열은 또한, 염색체 동정에도 유용하다. 상기 서열은 개개의 사람 염색체 상의 특정한 위치에 대해 특이적으로 표적되고 이와 하이브리화할 수 있다. 더욱이, 현재에는 염색체 상의 특정 부위를 동정해야 할 필요가 있다. 염색체 위치를 표식하기 위한, 실제 서열 데이터(반복 다형성)를 기준으로 하는 염색체 표식화 시약을 현재 거의 입수할 수 없다. 본 발명에 따라 염색체에 대한 DNA의 유전자 위치를 나타내는 것(지도화)은 이들 서열을 질환과 관련된 유전자와 상호연관시키는데 있어서 중요한 제1 단계이다.

간략히 언급하면, cDNA로부터 PCR 프라이머(바람직하게는 15 내지 25bp)를 제조함으로써 서열을 염색체에 대해 지도화할 수 있다. cDNA의 컴퓨터 분석을 사용하여 게놈 DNA 내에 하나 이상의 엑손을 걸치지 않는 프라이머를 신속하게 선별하여, 증폭 과정을 복잡하게 만든다. 다음, 상기 프라이머를 개개의 사람 염색체를 함유하는 체강 세포 하이브리드의 PCR 스크리닝에 사용한다. 상기 프라이머에 상응하는 사람 유전자를 함유하는 하이브리드만이 증폭된 단편을 생성시킬 수 있다.

체강 세포 하이브리드의 PCR 지도화는 특정한 DNA를 특정한 염색체로 분배하기 위한 신속한 방법이다. 본 발명에 있어서 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, 서브-국재(sublocalization)를 특이적 염색체 또는 대형 게놈 클론의 풀로부터의 단편의 패널을 사용하여 유사한 방법으로 성취할 수 있다. 이의 염색체로 지도화하는데 유사하게 사용될 수 있는 다른 지도화 방법으로는 염색체 특이적-cDNA 라이브러리를 작제하기 위한, 원 위치(in situ) 하이브리드화, 표지된 플로우(flow)-분류 염색체를 사용한 예비스크리닝 및 하이브리드화에 의한 예비선별 방법이 있다.

cDNA 클론을 중기 염색체 확산배양물에 원 위치 형광성 하이브리드화(FISH)시켜 한 단계로 정확한 염색체의 위치를 제공할 수 있다. 이러한 기술은 500 또는 600개 염기 정도로 짧은 cDNA를 사용할 수 있다. 그러나, 2,000bp 보다 큰 클론은 샘플 탐지를 위해 충분한 시그날 강도를 이용하여 독특한 염색체 위치에 결합할 가능성이 더 높다. FISH는 EST가 유도되는 클론의 사용을 필요로 하고 더 길수록 더 좋다. 예를 들면, 2,000bp가 좋으며, 4,000bp는 더 좋으며 4,000bp 초과는 아마도, 합리적인 시간 비율상 우수한 결과를 획득하는데 필요치 않다. 상기 기술의 재고를 위해, 문헌[참조: Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York(1988)]을 참조할 수 있다.

서열이 정확한 염색체 위치로 지도화되면, 염색체 상의 서열의 물리적 위치를 유전자 지도 데이터와 상호연관시킬 수 있다. 이러한 데이터는, 예를 들어 V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University Welch Medical Library를 통해 온 라인으로 구입할 수 있다)에서 발견된다. 이어서, 동일한 염색체 영역에 지도화시킨 유전자와 질환 간의 관계를 결합 분석(물리적으로 인접한 유전자의 공동유전형질)을 통해 동정한다.

다음, 감염자 및 비감염자간의 cDNA 또는 게놈 서열 차이를 결정하는 것이 필요하다. 돌연변이가 몇몇 감염자 또는 모든 감염자에서 관찰되나 정상인에게서는 관찰되지 않을 경우, 이러한 돌연변이가 아마도 상기 질환의 유발 원인제일 것이다.

통상적인 물리적 지도화의 분해 및 유전학적 지도화 기술을 이용하면, 상기 질환과 연관된 염색체 영역으로 정확하게 국재된 cDNA가 50 내지 500가지의 잠재적인 유발 원인성 유전자 중의 하나일 수 있다(이는 1 메가염기 지도화 분해능 및 20kb당 하나의 유전자를 취한다).

당해 폴리펩티드, 이의 단편 또는 기타 유도체, 이의 동족체, 또는 이들을 발현시키는 세포를 면역원으로서 사용하여 이에 대한 항체를 생성시킬 수 있다. 이들 항체는, 예를 들어 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 또한 본 발명은 키메라성, 일본쇄, 및 사람적응화 항체 뿐만 아니라 Fab 단편, 또는 Fab 발현 라이브러리의 생성물을 포함한다. 당해 기술 분야에 공지된 각종 방법을 상기 항체 및 단편을 제조하는데 사용할 수 있다.

본 발명의 서열에 상응하는 폴리펩티드에 대해 생성된 항체는, 상기 폴리펩티드를 동물에게 직접 주사하거나 상기 폴리펩티드를 동물, 바람직하게는 사람이 아닌 동물에게 투여함으로써 수득할 수 있다. 이때, 상기와 같이 수득된 항체는 상기 폴리펩티드 자체에 결합될 것이다. 이러한 방법으로, 당해 폴리펩티드의 단편만을 암호화하는 서열이라도 완전한 천연 폴리펩티드에 결합하는 항체를 생성시키는데 사용할 수 있다. 이어서, 상기 항체를 사용하여 상기 폴리펩티드를 발현시키는 조직으로부터 상기 폴리펩티드를 분리시킬 수 있다.

모노클로날 항체의 제조를 위해, 연속적인 세포주 배양에 의해 생성된 항체를 제공하는 어떠한 기술도 사용할 수 있다. 이의 예로는 하이브리도마(hybridoma) 기술[참조: Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495-497], 트리오마(trioma) 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술[참조: Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72], 및 사람 모노클로날 항체를 제조하기 위한 EBV-하이브리도마 기술[참조: Cole, et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Caner Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96]이 있다.

일본쇄 항체의 제조를 위해 기술된 기술[미국 특허 제4,946,778호]을 본 발명의 면역원성 폴리펩티드 생성물에 대한 일본쇄 항체를 제조하는데 적용할 수 있다.

본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 추가로 기술될 것이나; 본 발명이 이들 실시예로 제한되지는 않는다는 것을 인지해야 한다. 달리 명시하지 않는 한, 모든 부 또는 양은 중량 기준이다.

하기 실시예의 이해를 용이하게 하기 위해, 종종 나타나는 특정 방법 및/또는 용어에 관해 기술한다.

"플라스미드"는 처음에는 소문자 p로 표기하고/하거나 그 다음에는 대문자 및/또는 숫자로 표기한다. 본 발명에서 출발 플라스미드는 제한되지 않은 조건으로 공개적으로 구입할 수 있도록 시판중이거나, 또는 시판용 플라스미드로부터 공개된 방법에 따라 작제할 수 있다. 또한, 본원에 기술된 것과 동등한 플라스미드는 당해 기술에 공지되어 있고 통상의 숙련인에게 명백할 것이다.

DNA의 "분해(digestion)"란 DNA의 특정 서열에서만 작용하는 제한 효소로 DNA를 촉매적 절단하는 것을 지칭한다. 본 발명에 사용된 각종 제한 효소는 시판용이고 이의 반응조건, 보조인자 및 기타 필요조건은 통상의 숙련인에게 공지된 바와 같이 사용된다. 분석 목적을 위해서는, 전형적으로 플라스미드 또는 DNA 단편 1μg을 약 20μl의 완충액에서 효소 약 2 유니트와 함께 사용한다. 플라스미드 작제를 위해 DNA 단편을 분리하고자 하는 경우에는, 전형적으로 DNA 5 내지 50μg을 효소 20 내지 250 유니트를 사용하여 보다 큰 용적으로 분해한다. 특정한 제한 효소에 적합한 완충액 및 기질의 양은 제조업자에 의해 명시된다. 37℃에서 약 1시간의 배양 시간이 통상적으로 사용되나, 공급자의 지시에 따라 변화될 수 있다. 분해 후에, 반응물을 폴리아크릴아미드 겔 상에서 직접 전기영동시켜 목적하는 단편을 분리시킨다.

절단된 단편의 크기 분리는 문헌[참조: Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8:4057(1980)]에 기술된 8% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 수행한다.

"올리고뉴클레오티드"란 화학적으로 합성할 수 있는 일본쇄 폴리데옥시뉴클레오티드 또는 두 개의 상보적 폴리데옥시뉴클레오티드 쇄를 지칭한다. 이러한 합성 올리고뉴클레오티드는 5' 포스페이트를 가지지 않으므로 키나제의 존재하에 ATP와 함께 포스페이트를 첨가하지 않을 경우 또 다른 올리고뉴클레오티드에 연결되지 않는다. 합성 올리고뉴클레오티드는 탈포스포릴화되지 않은 단편에 연결될 것이다.

"연결(ligation)"이란 두 개의 이본쇄 핵산 단편 간의 포스포디에스테르 결합을 형성하는 방법을 지칭한다[참조: Maniatis, T., et al., Id., p. 146]. 다른 방법으로 제공하지 않는 한, 공지된 완충액 및 조건을 이용하여, 거의 등몰량의 연결시키고자 하는 DNA 단편 0.5μg당 T4 DNA 리가제("리가제") 10 유니트를 사용하여 연결을 수행한다.

달리 언급되지 않는 한, 형질전환은 문헌[참조: Graham, F. and Van der Eb, A., Virology, 52:456-457(1973)]에 기술된 방법과 같이 수행한다.

실시예 1

Ckβ-4의 세균성 발현 및 정제

Ckβ-4를 암호화하는 DNA 서열(ATCC # 75848)을, 프로세싱된 Ckβ-4 단백질의 5' 및 3' 서열(추정상의 시그날 펩티드 서열 부재)에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 초기에 증폭시킨다. Ckβ-4에 상응하는 부가의 뉴클레오티드를 5' 및 3' 서열에 각각 가한다. 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열(서열 5)을 갖는다. 5' CCCGCATGCAAGCAGCAAGCAACTTT3'은 SphⅠ 제한 효소 부위(고딕체) 다음에 성숙한 단백질을 암호화하는 서열의 제2 뉴클레오티드로부터 출발하는 Ckβ-4 암호화 서열(밑줄쳐져 있음)의 17개 뉴클레오티드를 함유하고 있다. ATG 코돈은 SphⅠ 부위에 포함되어 있다. 다음 코돈에서, ATG 다음의 첫 번째 염기는 SphI로부터의 것이며 나머지 2개의 염기는 추정상의 성숙한 단백질의 제1 코돈의 두 번째 및 세 번째 염기에 상응한다. 결과로서, 이의 작제물 내에 아미노산 MQA를 성숙한 단백질 서열의 아미노 말단에 가한다. 3' 서열(서열 6), 즉 5' AAAGGATCCCATGTTCTTGACTTTTTTACT 3'는 BamH1 부위에 상보적인 서열(고딕체)을 함유하고 그 다음에 종결 코돈에 앞서 유전자 특이적 서열의 21개 뉴클레오티드를 함유한다. 제한 효소 부위는 세균성 발현 벡터 pQE-70(공급원: Qiagen, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311) 상의 제한 효소 부위에 상응한다. pQE-70은 항생제 내성(Amp^r), 세균성 복제 기점(ori), IPTG-조절성 프로모터 작동인자(P/O), 리보솜 결합 부위(RBS), 6-His 태그 및 제한 효소 부위를 암호화한다. 그 다음, pQE-70를 SphⅠ 및 BamHⅠ을 사용하여 분해한다. 증폭된 서열을 pQE-70에 연결하고 히스티딘 태그 및 RBS를 암호화하는 서열과 동일한 프레임으로 삽입한다. 그 다음, 연결 혼합물을 사용하여 문헌[참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)]에 기술된 방법에 의해 이. 콜라이 균주 M15/rep 4(공급원: Qiagen, Inc.)를 형질전환시킨다. M15/rep 4는 lacⅠ 억제인자를 발현시키고 또한 카나마이신 내성(Kan^r)을 부여하는 플라스미드 pREP4의 다중 복사물을 함유한다. LB 판 상에서 성장하는 이의 능력에 의해 형질전환체를 동정하고 앰피실린/카나마이신 내성 콜로니를 선별한다. 플라스미드 DNA를 분리시키고 제한 분석에 의해 확인한다. 목적하는 작제물을 함유하는 클론을 Amp(100ug/ml)와 Kan(25ug/ml) 모두가 보충된 LB 배지 중의 액체 배양물에서 밤새(O/N) 성장시킨다. O/N 배양물을 사용하여 1:100 내지 1:250의 비로 대형 배양물에 접종시킨다. 세포를 0.4 내지 0.6의 광밀도 600(O.D⁶⁰⁰)으로 성장시킨다. 그 다음, IPTG("이소프로필-B-D-티오갈락토 피라노사이드")를 가하여 최종 농도가 1mM이 되도록 한다. lacⅠ 억제인자를 불활성화시킴으로써 IPTG가 유도되는데, 이로써 P/O가 유전자 발현 증가를 유발시킨다는 것이 명백해졌다. 세포를 3 내지 4시간 더 성장시킨다. 그 다음, 세포를 원심분리시켜 수거한다. 세포 펠릿을 카오트로픽제 6몰 구아니딘 HCl 중에서 가용화시킨다. 정화 후, 가용화된 Ckβ-4을, 6-His 태그를 함유하는 단백질에 의해 단단히 결합시켜 주는 조건하에서 닉켈-킬레이트 칼럼 상에서 크로마토그래피하여 상기 용액으로부터 정제한다[참조: Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411:177-184(1984)]. Ckβ-4(>98% 순도)을 6몰 구아니딘 HCl(pH 5.0) 중에서 상기 칼럼으로부터 용출시킨다. GnHCl로부터의 단백질 재생은 여러 가지 프로토콜에 의해 달성할 수 있다[참조: Jaenicke, R. and Rudolph, R., Protein Structure - A Practical Approach, IRL Press, New York (1990)]. 초기에, 단계 투석을 이용하여 GnHCl를 제거한다. 또 다른 방법으로는, Ni-킬레이트 칼럼으로부터 분리된 정제된 단백질을, 감소하는 선형 GnHCl 구배가 수행되는 제2 칼럼에 결합시킬 수 있다. 상기 단백질이 상기 칼럼에 결합되는 동안에는 재생될 수 있고 250mM 이미다졸, 150mM NaCl, 25mM 트리스-HCl(pH 5.0) 및 10% 글리세롤을 함유하는 완충액으로 연속적으로 용출시킨다. 최종적으로, 가용성 단백질을 5mM 암모늄 비카보네이트를 함유하는 저장 완충액에 대하여 투석시킨다.

실시예 2

MCP-4의 세균성 발현 및 정제

ATCC 제75849호의 기탁물에 사람 cDNA에 존재하는, MCP-4(Ckβ-10으로서 지칭되기도 함)를 암호화하는 DNA 서열을, 프로세싱된 MCP-4 단백질의 5' 및 3' 서열(시그날 펩티드 서열 부재) 및 MCP-4에 대한 3' 벡터 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 초기에 증폭시킨다. MCP-4에 상응하는 부가의 뉴클레오티드를 5' 및 3' 서열에 각각 가한다. 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열(서열 7)을 갖는다. 5' CCCGCATGCAGCCAGATGCACTCAACG3'은 SphⅠ 제한 효소 부위(고딕체) 다음에 성숙한 단백질을 암호화하는 서열로부터 출발하는 MCP-4 암호화 서열(밑줄쳐져 있음)의 19 뉴클레오티드를 함유하고 있다. ATG 코돈은 SphⅠ 부위에 포함되어 있다. 3' 서열(서열 8), 즉 5' AAAGGATCCAGTCTTCAGGGTGTGAGCT 3'는 BamH1 부위에 상보적인 서열(고딕체)을 함유하고 그 다음에 종결 코돈에 앞서 유전자 특이적 서열의 19개 뉴클레오티드를 함유한다. 제한 효소 부위는 세균성 발현 벡터 pQE-70(공급원: Qiagen, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311) 상의 제한 효소 부위에 상응한다. pQE-70는 항생제 내성(Amp^r), 세균성 복제 기점(ori), IPTG-조절성 프로모터 작동인자(P/O), 리보솜 결합 부위(RBS), 6-His 태그 및 제한 효소 부위를 암호화한다. 그 다음, pQE-70를 SphⅠ 및 BamHⅠ을 사용하여 분해한다. 증폭된 서열을 pQE-70에 연결하고 히스티딘 태그 및 RBS를 암호화하는 서열을 이용하여 동일한 프레임 내에 삽입한다. 그 다음, 연결 혼합물을 사용하여 문헌[참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)]에 기술된 방법에 의해 이. 콜라이 균주 M15/rep 4(공급원: Qiagen, Inc.)를 형질전환시킨다. M15/rep 4는 lacⅠ 억제인자를 발현시키고 또한 카나마이신 내성(Kan^r)을 부여하는 플라스미드 pREP4의 다중 복사물을 함유한다. LB 평판 상에서 성장하는 이의 능력에 의해 형질전환체를 동정하고 앰피실린/카나마이신 내성 콜로니를 선별한다. 플라스미드 DNA를 분리시키고 제한 분석에 의해 확인한다. 목적하는 작제물을 함유하는 클론을 Amp(100ug/ml)와 Kan(25ug/ml) 모두가 보충된 LB 배지 중의 액체 배양물에서 밤새(O/N) 성장시킨다. O/N 배양물을 사용하여 1:100 내지 1:250의 비로 대형 배양물에 접종시킨다. 세포를 0.4 내지 0.6의 광밀도 600(O.D⁶⁰⁰)으로 성장시킨다. 그 다음, IPTG("이소프로필-B-D-티오갈락토 피라노사이드")를 가하여 최종 농도가 1mM이 되도록 한다. lacⅠ 억제인자를 불활성화시킴으로써 IPTG가 유도되는데, 이로써 P/O가 유전자 발현 증가를 유발시킨다는 것이 명백해졌다. 세포를 3 내지 4시간 더 성장시킨다. 그 다음, 세포를 원심분리시켜 수거한다. 세포 펠릿을 카오트로픽제 6몰 구아니딘 HCl 중에서 가용화시킨다. 정화 후, 가용화된 MCP-4(Ckβ-10으로서 지칭되기도 함)를, 6-His 태그를 함유하는 단백질에 의해 단단히 결합시켜 주는 조건하에서 닉켈-킬레이트 칼럼 상에서 크로마토그래피하여 상기 용액으로부터 정제한다[참조: Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411:177-184(1984)]. MCP-4(>98% 순도)를 6몰 구아니딘 HCl(pH 5.0) 중에서 상기 칼럼으로부터 용출시킨다. GnHCl로부터의 단백질 재생은 여러 가지 프로토콜에 의해 달성할 수 있다[참조: Jaenicke, R. and Rudolph, R., Protein Structure - A Practical Approach, IRL Press, New York (1990)]. 초기에, 단계 투석을 이용하여 GnHCl를 제거한다. 또 다른 방법으로는, Ni-킬레이트 칼럼으로부터 분리된 정제된 단백질을, 감소하는 선형 GnHCl 구배가 수행되는 제2 칼럼에 결합시킬 수 있다. 상기 단백질이 상기 칼럼에 결합되는 동안에는 재생될 수 있고 250mM 이미다졸, 150mM NaCL, 25mM 트리스-HCl(pH 5.0) 및 10% 글리세롤을 함유하는 완충액으로 연속적으로 용출시킨다. 최종적으로, 가용성 단백질을 5mM 암모늄 비카보네이트를 함유하는 저장 완충액에 대하여 투석시킨다. 이어서, 상기 단백질을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한다.

실시예 3

COS 세포 내에서의 재조합 Ckβ-4의 발현

플라스미드 Ckβ-4 HA의 발현을 (1) SV40 복제 기점, (2) 앰피실린 내성 유전자, (3) 이. 콜라이 복제 기점, (4) CMV 프로모터에 이어 폴리링커 영역, SV40 인트론 및 폴리아데닐화 부위를 함유하는 벡터 pcDNAⅠ/Amp(Invitrogen)으로부터 유도한다. 완전한 Ckβ-4 전구체를 암호화하는 DNA 단편 및 이의 3' 말단에 동일 프레임으로 융합된 HA 태그를 당해 벡터의 폴리링커 영역 내로 클론화하여, 재조합 단백질 발현을 CMV 프로모터 하에 지시한다. HA 태그는 앞서 기술된 바와 같이 인플루엔자 혈구응집소 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응한다[참조: I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A Cherenson, M. Connolly, and R. Lerner, 1984, Cell 37. 767]. 표적 단백질로의 HA 태그의 융합은 HA 에피토프를 인식하는 항체를 사용하여 상기 재조합 단백질을 용이하게 검출하도록 한다.

플라스미드 작제 방법은 하기에 기술한다:

Ckβ-4를 암호화하는 DNA 서열(ATCC 제75848호)을 두 개의 프라이머: 즉, HindⅢ 부위에 이어 개시 코돈으로부터 출발하는 Ckβ-4 암호화 서열의 20개 뉴클레오티드를 함유하는 5' 프라이머, 5' GGAAAGCTTATGTGCTGTACCAAGAGTTT 3'(서열 9); XbaⅠ부위에 상보적인 서열, 해독 정지 코돈, HA 태그 및 Ckβ-4 암호화 서열의 마지막 20개의 뉴클레오티드(정지 코돈을 함유하지 않음)를 함유하는 3' 프라이머, 5' CGCTCTAGATTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAACATGGTTCCTTGACTTTTT 3'(서열 10)를 사용하여 클론된 본래의 EST 상에서 PCR에 의해 작제한다. 따라서, 이러한 PCR 생성물은 HindⅢ 부위, Ckβ-4 암호화 서열에 이어 동일 프레임으로 융합된 HA 태그, 이러한 HA 태그 다음의 해독 종결 코돈, 및 XbaⅠ 부위를 함유한다.

PCR 증폭된 DNA 단편 및 벡터 pcDNAⅠ/Amp를 HindⅢ 및 XbaⅠ 제한 효소로 분해하고 연결시킨다. 연결 혼합물을 이. 콜라이 균주 SURE(공급원: Stratagene Cloning System, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) 내로 형질전환시키고, 형질전환된 배양물을 앰피실린 배지 평판 위에 도말하고 내성 콜로니를 선별한다. 플라스미드 DNA를 상기 형질전환체로부터 분리시키고 정확한 단편의 존재 여부를 알아보기 위해 제한 분석으로 조사한다. 재조합 Ckβ-4를 발현시키기 위해, COS 세포를 DEAE-DEXTRAN 방법에 의해 발현 벡터로 형질감염시킨다[참조: J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)]. Ckβ-4 HA 단백질의 발현을 방사성표지 및 면역침전법으로 탐지한다[참조: E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1988)]. 형질감염시킨지 2일 후에 세포를³⁵S-시스테인으로 8시간 동안 표지시킨다. 이어서, 배양 배지를 수집하고 세포를 세정제[RIPA 완충액(150mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 50mM 트리스, pH 7.5)(참조: Wilson, I. et al., Id. 37:767(1984))]로 용융시킨다. 세포 용융물과 배양 배지 모두를 HA 특이적 모노클로날 항체로 침전시킨다. 침전된 단백질을 15% SDS-PAGE 겔 상에서 분석한다.

실시예 4

COS 세포 내에서의 재조합 MCP-4의 발현

플라스미드 MCP-4-HA(Ckβ-10-HA로서 지칭되기도 함)의 발현을 (1) SV40 복제 기점, (2) 앰피실린 내성 유전자, (3) 이. 콜라이 복제 기점, (4) CMV 프로모터에 이어 폴리링커 영역, SV40 인트론 및 폴리아데닐화 부위를 함유하는 벡터 pcDNAⅠ/Amp(Invitrogen)으로부터 유도한다. 완전한 MCP-4 전구체를 암호화하는 DNA 단편 및 이의 3' 말단에 동일 프레임으로 융합된 HA 태그를 벡터의 폴리링커 영역 내로 클로닝하여, 재조합 단백질 발현을 CMV 프로모터 하에 지시한다. HA 태그는 앞서 기술된 바와 같이 인플루엔자 혈구응집소 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응한다[참조: I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A Cherenson, M. Connolly, and R. Lerner, 1984, Cell 37. 767]. 표적 단백질로의 HA 태그의 융합은 HA 에피토프를 인식하는 항체를 사용하여 상기 재조합 단백질을 용이하게 탐지하도록 한다.

플라스미드 작제 방법은 하기에 기술한다:

ATCC 기탁번호 제75849호의 DNA중의 cDNA 삽입물 내에 존재하는, MCP-4(Ckβ-10으로서 지칭되기도 함)를 암호화하는 DNA 서열을 두 개의 프라이머: 즉, HindⅢ 부위에 이어 개시 코돈으로부터 출발하는 MCP-4 암호화 서열의 19개 뉴클레오티드를 함유하는 5' 프라이머, 5' GGAAAGCTTATGAAAGTTTCTGCAGTGC 3'(서열 11); XbaⅠ부위에 상보적인 서열, 해독 정지 코돈, HA 태그 및 MCP-4 암호화 서열의 마지막 19개의 뉴클레오티드(정지 코돈을 함유하지 않음)를 함유하는 3' 프라이머, 5' CGCTCTAGAT CAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAA GTCTTCAGGG TGTGAGCT 3'(서열 12)를 사용하여 클론된 본래의 EST 상에서 PCR에 의해 작제한다. 따라서, 이러한 PCR 생성물은 HindⅢ 부위, MCP-4 암호화 서열에 이어 동일 프레임으로 융합된 HA 태그, 이러한 HA 태그 다음의 해독 종결 코돈, 및 XbaⅠ 부위를 함유한다. PCR 증폭된 DNA 단편 및 벡터 pcDNAⅠ/Amp를 HindⅢ 및 BamH1 제한 효소로 분해하고 연결시킨다. 연결 혼합물을 이. 콜라이 균주 SURE(공급원: Stratagene Cloning System, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) 내로 형질전환시키고, 형질전환된 배양물을 앰피실린 배지 평판 위에 도말하고 내성 콜로니를 선별한다. 플라스미드 DNA를 상기 형질전환체로부터 분리시키고 정확한 단편의 존재 여부를 알아보기 위해 제한 분석으로 조사한다. 재조합 MCP-4(Ckβ-10으로서 공지되기도 함)를 발현시키기 위해, COS 세포를 DEAE-DEXTRAN 방법에 의해 발현 벡터로 형질감염시킨다[참조: J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)]. MCP-4 HA 단백질의 발현을 방사성표지 및 면역침전법으로 탐지한다[참조: E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1988)]. 형질감염시킨지 2일 후에 세포를³⁵S-시스테인으로 8시간 동안 표지시킨다. 이어서, 배양 배지를 수집하고 세포를 세정제[RIPA 완충액(150mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 50mM 트리스, pH 7.5)(참조: Wilson, I. et al., Id. 37:767(1984))]로 용융시킨다. 세포 용융물과 배양 배지 모두를 HA 특이적 모노클로날 항체로 침전시킨다. 침전된 단백질을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한다.

실시예 5

바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용한 MCP-4의 추가의 클로닝 및 발현

ATCC 기탁번호 제75849호로 DNA 중의, 완전한 길이의 MCP-4 단백질(Ckβ-10 단백질로서 공지되기도 함)을 암호화하는 cDNA 서열을 다음과 같이, 상기 유전자의 5' 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시킨다:

5' 프라이머는 서열 5' CGCGGGATCC TTAACCTTCA ACATGAAA 3'(서열 13)을 가지고 BamHⅠ 제한 효소 부위(고딕체로 표시됨)에 이어서 진핵성 세포에서 해독을 개시하는데 효과적인 시그날과 유사한 12개 뉴클레오티드[참조: J. Mol. Biol. 1987, 196, 947-950, Kozak, M.]를 함유하고 그 다음 MCP-4 암호화 서열의 처음 6개 뉴클레오티드(해독을 위한 개시 코돈 "ATG"는 밑줄쳐져 있다)를 함유한다.

3' 프라이머는 서열 5' CGCGGGTACC TTAACACATA GTACATTTT 3'(서열 14)을 가지고 제한 엔도뉴클레아제 Asp718에 대한 절단 부위 및 당해 MCP-4 유전자의 3' 비-해독된 서열에 상보적인 19개 뉴클레오티드를 함유한다. 증폭된 서열을 시판용 키트(상표: "Geneclean", 공급원: BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.)을 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리시킨다. 이어서, 상기 단편을 엔도뉴클레아제 BamHⅠ 및 Asp781로 분해시킨 다음 1% 아가로스 겔상에서 다시 정제한다. 이 단편을 F2로 명명한다.

벡터 pA2(다음에 논의된, pVL941의 변형물)를 바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하는 MCP-4 단백질의 발현에 사용한다[참조: Summers, M.D. and Smith, G.E. 1987, A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555]. 이러한 발현 벡터는 오토그라파 칼리포니카 핵 폴리헤드로시스 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus; AcMNPV)의 강력한 폴리헤드린 프로모터에 이어 제한 엔도뉴클레아제 BamHⅠ 및 Asp781에 대한 인식 부위를 함유한다. 원숭이 바이러스(SV) 40의 폴리아데닐화 부위를 효율적인 폴리아데닐화를 위해 사용한다. 재조합 바이러스의 용이한 선별을 위해, 이. 콜라이로부터의 베타-갈락토시다제를 폴리헤드린 프로모터에 이어 폴리헤드린 유전자의 폴리아데닐화 시그날과 동일한 방향으로 삽입한다. 폴리헤드린 서열의 양측에 공동형질감염된 야생형 바이러스성 DNA의 세포-매개된 상동 재조합을 위한 바이러스성 서열을 플랭킹한다. pRG1 대신 pAc373, pVL941 및 pAcIM1과 같은 수 많은 기타 바쿨로바이러스 벡터를 사용할 수 있다[참조: Luckow, V.A. and Summers, M.D., Virology, 170:31-39].

상기 플라스미드를 상기 제한 효소 BamHⅠ 및 Asp718를 사용하여 분해한 다음, 송아지 장의 포스파타제를 사용하여 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 탈포스포릴화한다. 그 다음, DNA를 1% 아가로스 겔로부터 분리시킨다. 이러한 벡터 DNA를 V2로 명명한다.

단편 F2와 탈포스포릴화 플라스미드 V2를 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결시킨다. 그 다음, 이. 콜라이 HB101 세포를 형질전환시키고 효소 BamHⅠ 및 Asp781를 사용하여 MCP-4 유전자를 갖는 플라스미드 pBacMCP-4(pBacCkβ-10으로서 공지되기도 함)에 함유된 세균을 동정하였다. 이와 같이 클론된 단편의 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인한다.

플라스미드 pBacMCP-4 5μg을 리포펙션(lipofection) 방법[참조: Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417(1987)]을 사용하여 시판용의 선형화된 바쿨로바이러스[상표: "바쿨로골드(BaculoGold^TM)바쿨로바이러스 DNA", 공급원: Pharmingen, San Diego, CA.] 1.0μg으로 공동형질감염시킨다.

바쿨로골드^TM바이러스 DNA 1μg 및 상기 플라스미드 pBacMCP-4 5μg을 무혈청 그레이스 배지(공급원: Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) 50μl를 함유하는 미세역가 평판의 멸균 웰에서 혼합한다. 리포펙틴 10μl와 그레이스 배지 90μl를 가한 후에, 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양한다. 그 다음, 형질감염 혼합물을 무혈청 그레이스 배지 1ml와 함께 35mm 조직 배양 평판에 접종된 Sf9 곤충 세포(ATCC CRL 1711)에 적가한다. 상기 평판을 전후로 진탕하여 새로이 추가된 용액을 혼합한다. 그 다음, 상기 평판을 27℃에서 5시간 동안 배양한다. 5시간 후에 형질감염 용액을 상기 평판으로부터 제거하고 10% 태아 송아지 혈청이 보충된 그레이스 곤충 배지 1ml을 가한다. 상기 평판을 배양기 내에 넣고 4일 동안 27℃에서 계속 배양한다.

4일 후에 상등액을 수집하고 플라크 분석을 상기 섬머즈(Summers)와 스미스(Smith)에 의해 기술된 바와 유사하게 수행한다. 한 변형으로서, 블루 염색된 플라크를 용이하게 분리시킬 수 있는 "블루 갈(Blue Gal)"[Life Technologies Inc., Gaithersburg]이 수반된 아가로스 겔을 사용한다. ("플라크 분석"의 상세한 설명은 공급자(Life Technologies Inc., Gaithersburg)에 의해 배포된 곤충 세포 배양 및 바쿨로바이러스학에 관한 사용자 지침서 제9면 내지 제10면에서 참조할 수 있다).

일련의 희석을 수행한지 4일 후에, 바이러스를 세포에 가하고, 블루 염색된 플라크를 에펜도르프 피펫 팁으로 골라낸다. 그 다음, 재조합 바이러스를 함유하는 한천을 그레이스 배지 200μl를 함유하는 에펜도르프 튜브 내에서 재현탁시킨다. 상기 한천을 단시간의 원심분리에 의해 제거하고 재조합 바쿨로바이러스를 함유하는 상등액을 사용하여 35mm 디쉬에 접종된 Sf9 세포를 감염시킨다. 4일 후에 상기 배양 디쉬의 상등액을 수거한 다음 4℃에서 저장한다.

Sf9 세포를 10% 열-불활성화된 FBS가 보충된 그레이스 배지 내에서 성장시킨다. 상기 세포를 감염 다중도(multiplicity of infection(MOI)) 2에서 재조합 바쿨로바이러스 V-MCP-4(V-Ckβ-10으로서 지칭되기도 함)로 감염시킨다. 6시간 후에 배지를 제거하고 메티오닌 및 시스테인 부재의 SF900 Ⅱ 배지[Life Technologies Inc., Gaithersburg]로 대체한다. 42시간 후에³⁵S-메티오닌 5μCi 및³⁵S 시스테인 5μCi(공급원: Amersham)를 가한다. 세포를 원심분리에 의해 수거하기 전에 16시간 동안 추가로 배양하고 표지된 단백질을 SDS-PAGE 및 자가방사성사진에 의해 가시화시킨다.

실시예 6 내지 12

바쿨로바이러스 발현 시스템 및 드로소필라 세포 발현 시스템을 사용한 MCP-4(Ckβ-10으로서 지칭되기도 함)의 발현 및 이와 같이 발현된 MCP-4의 성상 확인

다음 실시예 6 내지 12를 상기 언급된 바와 같이 수행하며, 변형 및 부가의 기술은 일반적으로 바로 다음에 기재되고 또한 특정 실시예에 기재되어 있다. (본원에서 나타낸 바와 같이 MCP-4는 Ckβ-10으로서 지칭 공지되기도 한다).

클로닝 및 발현

MCP-4를 암호화하는 완전한 길이의 cDNA를 바쿨로바이러스 발현 벡터(PharMingen) 내로 클로닝하고, Sf9 세포를 제조업자의 지시에 따라서 재조합 바쿨로바이러스로 감염시키며, 세포 상등액을 저속 원심분리시켜 수집한다. 이러한 상등액을 프로테아제 억제제의 칵테일(20㎍/ml 페파블록 SC, 1㎍/ml 로이펩틴, 1㎍/ml E64 및 1mM EDTA)로 처리하고, 재조합 단백질을 헤파린 친화, 양이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제한다. 95% 초과 순도의 단백질은 전자 분무 질량 분광법으로 분석하고 서열분석한다.

케모킨

비교용으로 사용된 케모킨인 MCP-1, MCP-2, MCP-3, RANTES, MIP-1α 및 에오탁신을 문헌[참조: Clark-Lewis et al., Biochemistry 30:3128-3135 (1991)]에 정립된 프로토콜에 따라서 화학적으로 합성한다.

세포

단구[참조: Uguccioni et al., Eur. J. Immunol. 25:64-68 (1995)] 및 호중구[참조: Peveri et al., J. Exp. Med. 167:1547-1559 (1988)]를 센트랄 라보라토리(Central Laboratory, Swiss Red Cross)에 의해 공급된 공여자 혈액 연막으로부터 90% 이상의 순도로 분리한다. 동일한 공급원을 혈액 임파구[참조:Loetscher et al., FASEB J. 8:1055-1060 (1994)] 분리에 사용한다. 사람 CD4+ 및 CD8+ T-세포 클론을 배양물 내에 유지시키고 문헌[참조: Loetscher et al., FASEB J. 8:1055-1060 (1994)]에 따라서 사용한다. 건강한 개개인의 신선한 혈액을 사용하여 덱스트란 침강에 이어서 퍼콜 밀도 구배 원심분리하고 항-CD16 mAB-피복된 자기 비이드로 음성 선별함으로써 호산구를 정제한다[참조: Rot et al., Exp. Med. 179:8960-8964 (1995)].

실시예 6

바쿨로바이러스 발현 시스템에서의 MCP-4(Ckβ-10으로서 지칭되기도 함)의 발현

MCP-4의 암호화 서열을 함유하는 바쿨로바이러스 전달 벡터의 작제

본 실시예에 대한 발현 벡터는 상기 언급된 바와 같이 만든다. 플라스미드 벡터 pA2를 사용하여 MCP-4를 발현시킨다. 이러한 플라스미드는 문헌[참조: Gentz et al., Eur. J. Biochem. 210:545-554 (1992)]에 기술된 pNR704의 유도체이다. 이. 콜라이 β-갈락토시다제 유전자를 상기 벡터 내로 도입하여 재조합체의 선별을 촉진시킨다.

다음 PCR 올리고뉴클레오티드를 사용하여 MCP-4의 암호화 서열을 분리 및 증폭시킨다:

정방향 프라이머(서열 15):

5' GCGGGATCCTTAACCTTCAACATGAAA

역방향 프라이머(서열 16):

5' CGCGGGTACCTTAACACATAGTACATTTT

증폭 후, 상기 단편을 제한 효소 BamHⅠ 및 Asp718로 분해한 다음, 폴리헤드론 프로모터의 제한 부위 하부를 함유하는 발현 벡터 내로 삽입한다.

적절한 삽입 및 벡터와 삽입체의 배향은 제한 분석 및 DNA 서열 분석에 의해 확인한다.

재조합 바쿨로바이러스의 분리

MCP-4 cDNA를 함유하는 발현 벡터 5㎍ 및 선형화된 바쿨로바이러스 DNA("바쿨로골드 TM", Pharmingen, San Diego, CA) 1㎍을 리포펙틴 방법을 이용하여 Sf9 세포 내로 공동형질감염시킨다. 3 내지 4일 후, 상등액을 수집한다. 이어서, 일련의 제한된 희석을 수행하고 단일의 블루 염색된 플라크를 분리한다.

본 실시예에서 사용된 곤충 세포주 Sf9는 널리 공지되어 있고 용이하게 입수 가능하다. 이는 예를 들면, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션: ATCC CRL 1711로부터 수득될 수 있다.

MCP-4의 정제

Sf9 세포를 2% FBS를 함유하는 EX-CELL 400 배지에서 27℃하에 성장시킨다. 감염시키기 전에, 세포를 저속 원심분리하여 수집하고 배지를 무혈청 EX-CELL 400 배지로 대체한다. 6시간 후, 세포를 MOI=2로 감염시킨다. 감염시킨지 약 72시간 후에 세포를 저속 원심분리하여 제거한다. 이러한 상등액을 프로테아제 억제제의 칵테일(20㎍/ml 페파블록 SC, 1㎍/ml 로이펩틴, 1㎍/ml E64 및 1mM EDTA)로 처리한다. 상등액을 초기 포획을 위해 강력한 양이온 교환 칼럼 Ⅰ 포로스 50 HS(Perseptive Biosystem) 내로 통과시킨다. 재조합 MCP-4 단백질을 25mM 나트륨 아세테이트(pH 6) 중의 1M NaCl로 용출시키고 헤파린 친화 크로마토그래피(포로스 20 HEI1, Perseptive Biosystem)에 의해 추가로 정제한다. 이로써 생성된 MCP-4 단백질을 크기 배제 크로마토그래피(Sephacryl S200 HR, Pharmacia)로 연마한다. 크기 배제 후에 수득된 정제된 MCP-4는 순도가 약 95% 이상이다. 이러한 물질은 질량 분광계 및 미소서열분석에 의해 추가로 분석한다.

정제된 물질을 표준 질량 스펙트럼 분석에 의해 분석한다.

정제된 MCP-4를 또한, 널리 공지된 통상의 기술을 이용하여 미소서열분석하여 분석한다. 이를 위하여, 정제된 물질을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Novex 4-20% 겔)에 적용하고 프로블롯 막(Applied Biosystem, Inc.(ABI)) 상으로 트랜스블롯팅한다. Ponceau S(4% 아세트산 중의 0.2%)로 염색한 후, 단백질 밴드를 절단하고, "블롯 카트릿지"에 놓아둔 다음, 기상 블롯 사이클러가 있는 모델 ABI-494 서열분석기(Perking-Elmer-Applied Biosystem, Inc.)를 사용하여 N-말단 아미노산을 서열분석시킨다.

분석 결과

바쿨로바이러스 발현 시스템을 이용하여 클론된 유전자로부터 MCP-4를 발현시키면, 여러 형태의 MCP-4가 생성되었다.

바쿨로바이러스 발현 시스템에서 도 1의 cDNA를 발현시킴으로써 MCP-4를 만들고 이를 분리시킨 다음, 상기 언급된 바와 같이 18% 우레아를 함유하는 SDS PAGE 상에서 전기영동하여 성상확인한 결과, 가시적 M_r이 대략 8,000달톤인 다소 넓은 단일 밴드가 발생된다. 오염물 단백질에 대한 지시가 전혀 없다.

이와 같이 정제된 제제를 질량 분광 측정하면, 질량이 각각 8,576 및 8,754 달톤인 2개의 주 성분이 산출되었다.

미소서열분석은 NH₂말단에서 몇 개의 잔기에 의해 길이가 상이한 3가지 성숙한 형태의 MCP-4를 나타내었다.

이들 MCP-4 폴리펩티드의 서열은 완전한 길이의 cDNA에 암호화된 아미노산 서열(이는 또한 MCP-3 및 에오탁신의 서열과 함께 정렬되어 있다)과 함께, 도 5에 도시되어 있다. 주요 형태의 MCP-4는 이들 단백질과 60%의 아미노산 동일성을 공유하며 RANTES, MIP-1α 및 MIP-1β와는 각각 29%, 39% 및 41% 동일성을 공유한다.

2가지 밀접하게 관련된 변이체의 혼합물을 다음에 기술된 활성 검정에 사용한다.

실시예 7

MCP-4는 각종 혈액 세포의 화학주성을 자극한다

단구 및 호산구의 경우에는 5㎛ 구경을 지니고 임파구의 경우에는 3㎛ 구경을 지닌, 폴리비닐피롤리돈이 없는 폴리카보네이트 막(Nucleopore)을 사용하여 화학주성을 48웰 챔버(Neuro Probe, Cabin John, MD, USA)에서 평가하고, 20mM 헤페스(pH 7.4) 및 1% 저온살균된 플라스마 단백질 용액(5% PPL SRK; Swiss Red Cross Laboratory, Bern, Switzerland)이 보충된 RPMI 1640을 사용하여 하부 웰에 놓여져 있는 케모킨을 용해시키고 상기 세포들(상부 웰당 50,000 단구 또는 호산구 및 100,000 백혈구)을 현탁시킨다. 37℃에서 60분 후, 막을 꺼내고, 상부측면을 PBS로 세척하고 고착시킨 다음 염색한다. 모든 검정을 3회 수행하고, 이동된 세포를 1,000배 배율로 5가지의 랜덤하게 선별된 필드에서 계수한다. 화학유인제의 부재하에서 자발적인 이동을 결정한다.

MCP-4는 전형적인 2-모드 농도 의존성을 나타내면서(도 6, 7 및 8에 도시된 바와 같음) 단구, 호산구 및 임파구의 이동을 유도하였다.

단구에 대한 활성은 도 6에서 그래프 (B)에 예시된 바와 같이, 최대 효과가 관찰되는 농도(100nM)와 이동하는 세포의 수에 의해 지시된 바와 같이 효율과 효능 양 측면에서 MCP-3의 활성에 필적한다. 전자의 연구[참조: Uguccioni et al., Eur. J. Immunol. 25:64-68 (1995)]에 동의하여, MCP-1은 이들 세포에 대해서 다소 더욱 더 효율적이고 상당히 보다 효능이 있으며, 1nM에서 최대 효과에 도달된다.

MCP-4는 도 7에 예시된 바와 같이, CD4+ 및 CD8+ T 임파구의 강력한 이동을 유도하였다. 이의 효능은 MCP-1의 효능과 유사하지만, 1nM MCP-1과 비교해서 10 내지 100nM MCP-4가 최대 효과에 요구된다. 10nM 내지 1μM 농도에서 에오탁신을 사용하여 양 유형의 T 세포의 몇몇 이동을 관찰하였다. 신선하게 제조된 혈액 임파구는 클론된 세포에 대해 유효한 케모킨 중의 어떠한 것에 반응하여서도 이동되지 않았다.

도 8에 도시된 바와 같이 호산구 상에서, MCP-4는 에오탁신과 유사한 이동을 발생시켰으며, 10 내지 30nM에서 최대가 된다. MCP-3은 필적하는 효능을 지니고 있지만, 이의 최대 유효 농도는 100nM이다. 에오탁신과 MCP-3 모두는 이들 세포에 대한 강력한 유인제이다. MCP-1은 호산구에 대한 화학유인제가 아니며 음성 대조군으로서 작용한다.

실시예 8

MCP-4(Ckβ-10으로서 지칭되기도 함)는 세포를 자극하여 N-아세틸-β-D-글루코사미니다제를 방출시킨다

문헌[참조: Uguccioni et al., Eur. J. Immunol. 25:64-68 (1995)]에는 화학자극에 반응하여 일어난 N-아세틸-β-D-글루코사미니다제의 방출을 측정하는 것이 단구의 반응을 정량적으로 결정하기 위한 특히 신뢰성 있고 편리한 방법이라는 것이 나타나 있다. 케모킨에 대한 단구 반응성을 본원에 기술된 바와 같이 정확하게 결정한다.

간략하게 언급하면, 0.3ml 예비가온된 배지(136mM NaCl, 4.8mM KCl, 1.2mM KH₂PO₄, 1mM CaCl₂, 20mM Hepes, pH 7.4, 5mM D-글루코즈 및 1mg/ml 지방산-무함유 BSA) 중의 1.2 x 10⁶단구 샘플을 2분 동안 사이토칼라신 B(2.7㎍/ml)로 예비처리하고 케모킨으로 자극하였다. 3분 후에 얼음 상에서 냉각시키고 원심분리(6,000, 3분)시킴으로써 반응을 중지시키고 효소 활성을 상등액에서 측정한다.

도 6, 그래프(A)에 나타낸 바와 같이, MCP-4에 노출된 세포를 자극하여 잉여 량의 라이소좀 효소(예: N-아세틸-β-D-글루코사미니다제)를 방출시킨다. 이에 관하여, MCP-4는 MCP-2와 같이 효능있고 다른 단구 화학주성 단백질의 효과와 유사하다. 이와는 대조적으로, RANTES는 상당히 덜 효소 방출을 자극하였고 에오탁신에 의한 방출의 자극은 전혀 없었다.

유사하게, 호중구에 의한 엘라스타제 방출을 측정하여 문헌[참조: Peveri et al., J. Exp. Med. 167:1547-1559 (1988)]에 기술된 방법에 따라서 케모킨에 대한 반응성을 결정한다. MCP-4는 이들 실험에서 호중구에 의한 엘라스타제 방출을 자극하지 못하였다.

실시예 9

MCP-4(Ckβ-10으로서 지칭되기도 함)는 사이토졸성 유리 Ca ²⁺ 를 조절한다

사이토졸 유리 Ca²⁺농도([Ca²⁺]) 변화를 문헌[참조: von Tscharner et al., Nature 324:369-372 (1986)]에 의해 필수적으로 기술된 바와 같은 표준 기술을 이용하여 단구, 호산구 및 임파구에서 측정한다.

세포에, 136mM NaCl, 4.8mM KCl, 1mM CaCl₂, 5mM 글루코즈 및 20mM HEPES(pH 7.4)를 함유하는 완충액 중에서 10⁶세포당 0.2nmol fura-2 아세톡시메틸에스테르와 함께 37℃에서 30분 동안 배양함으로써 fura-2를 충전시킨다. 원심분리시킨 후, fura-충전된 세포를 동일한 완충액 중에서 재현탁시키고(10⁶세포/ml) 37℃에서 케모킨으로 자극한다. 이어서, [CaCl₂]-관련된 형광성 변화를 기록한다.

단구, 임파구 및 호산구를 MCP-4 자극한 후에 신속하고도 일시적인 [Ca²⁺] 상승이 관찰되었다. 상승 속도와 크기는 MCP-4 농도에 따라 증가하였다. [Ca²⁺] 최대 상승은 10 내지 100nM 농도에서 수득되었다. MCP-4 및 MCP-1은 CD4+ 및 CD8+ T 임파구 모두에 대하여 유사한 농도-의존적 [Ca²⁺] 일시적인 유도를 나타내었다. MIP-1α 및 에오탁신은 양 유형의 세포에서 훨씬 더 작긴하지만 중요한 [Ca²⁺] 변화를 유도하였다. 이에 관해서 이들 사이토킨의 보다 낮은 효능은 선행 문헌[참조: Loetscher et al., FASEB J. 8:1055-1060 (1994)]의 보고 내용 및 이들이 약한 임파구 유인제라는 기타 보고 내용과 일치한다.

실시예 10

수용체 용법/탈감작화 실험

짧은 간격으로 반복된 케모킨 자극에 의해 발생된 [Ca²⁺] 변화를 모니터함으로써 수용체 용법을 시험한다. 노출 섭생의 결과로서 일어나는 탈감작화는 수용체 활용의 측정치를 제공해준다. 문헌[참조: Uguccioni et al., Eur. J. Immunol. 25:64-68 (1995)]중 단구에 대해 기술된 바와 같이 정확하게 90초 간격을 이용하여 결정한다. 단구 및 호산구에서 결정한다.

MCP-1 또는 MCP-3로 단구를 자극하면, MCP-4에 대한 반응성이 없어지는데, 이는 신규의 케모킨이 이들 단구 화학주성 단백질과 수용체를 공유한다는 것을 지시해준다. 이와는 반대로, RANTES 또는 MIP-1α로의 자극은 본 검정에서 MCP-4 반응성에 영향을 미치지 않는다.

반대 극성의 시험에 있어서, MCP-4로 먼저 자극시킨 단구는 MCP-1, RANTES 및 MIP-1α에 대해서 현저하게 덜 반응성이고 MCP-3에 대해서는 약간 덜 반응성이다. 탈감작화는 MCP-4의 농도에 따라 증가하였다.

결과는 MCP-4가 기타 단구 화학주성 단백질과 수용체를 공유하고 있고 MCP-4가 RANTES 및 MIP-1α를 결합시키는 수용체를 인식한다는 것을 보여주고 있다.

호산구에서, MCP-4는 MCP-3, RANTES 및 에오탁신과 현저한 교차-탈감작화를 나타내었다. 사실상, 이는 에오탁신 및 MCP-3에 의한 후속 자극에 대한 반응을 철폐시켰으며, RANTES에 대한 반응성을 현저하게 감소시켰다. 따라서, MCP-4는 이들 세포에 대한 주요 효능제인 것으로 여겨진다. 결과는 MCP-4가 MCP-3, RANTES 및 에오탁신과 수용체를 공유한다는 것을 지시하고 있다.

이와는 달리, MCP-4에 의한 자극은 MIP-1α에 대한 호산구의 반응에 영향을 미치지 못하였다. 따라서, MIP-1α 수용체는 명백하게 MCP-4를 인식하거나 결합하지 못한다. 동일한 수용체는 아마도, MCP-4로 자극시킨 세포에 대하여 몇몇 활성을 보유한, RANTES와 결합된다.

실시예 11

드로소필라 발현 시스템에서 MCP-4(Ckβ-10으로서 지칭되기도 함)의 발현

MCP-4를 암호화하는 완전한 길이의 cDNA를 널리 공지되고 용이하게 입수 가능한 드로소필라 세포 발현 시스템에서 클론된 유전자를 발현하는데 통상적인 기술을 이용하여 상기 발현 시스템에서 발현시킨다.

폴리펩티드 및 단백질의 성상을 확인하는데 널리 공지되고 통상적인 기술을 이용하여, cDNA가 발현된 다음 이의 성상확인되는 세포로부터 발현된 MCP-4를 제조한다.

단축된 아미노 및 카복실 말단을 갖는 MCP-4 및 해독 후 변형을 포함하는 MCP-4을 포함한, 여러 가지 형태의 MCP-4가 발현 세포내에서 발견된다.

특히, 드로소필라 세포는 다음의 차이점를 제외하고 도 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 MCP-4를 발현시켰다:

N-말단 서열이 다음과 같이 변하였다:

Dro 1: QGLKAQPD

Dro 2: pyroQGLKAQPD

Dro 3++: LNVPST, 이들은 C-말단 서열의 상이한 결실에 의해 차이가 나는 3가지 형태로 존재한다. 특히, DRO 3은 도 5에 지시된 바와 같이 T, T(des 3) 및 A(des 5) 카복실 말단을 갖는 것으로 밝혀졌다.

완전한 서열이 도 5에 제시되어 있다.

실시예 12

드로소필라 발현 시스템에서 생성된 MCP-4(Ckβ-10으로서 지칭되기도 함)의 검정

드로소필라 세포에서 발현된 상이한 형태의 MCP-4를 대상으로 하여, 앞서 본원에 언급된 기술을 이용하여 활성에 대해 검정한다.

Dro 1 및 Dro 2 고정화 단구, 화학주성 검정에서의 PBL 및 EOL-3 세포, 및 이들 둘다는 Ca2⁺고정화 검정에서 활성이다.

Dro 3은 상당히 감소된 생활성을 나타내었으며, 실제로, 길항제로서 사용될 수 있다.

실시예 13

Ckβ-4는 피질성 신경단위의 생존을 증진시킨다

임신 17일 째인 랫트 태아로부터 피질성 세포를 유도한다. 단일 세포 현탁액을 제조한 후, 상기 세포를 혈청 함유 배지에서 15,000세포/웰로 도말한다. 24시간 후, 상기 배지를 무혈청 배지로 변화시키고 시험 인자들을 가한다. 배지를 매일 변화시키고 시험 인자를 다시 가한다.

6 내지 7일 후, 살아있는 세포와 죽은 세포를 자발적으로 결정해주는 2색 형광을 이용하여 세포 생존 여부를 결정한다. 이러한 검정에서 살아있는 세포를 세포내 에스테라제 활성에 의해 결정하고, 거의 비-형광성인 세포 투과성 칼세인 AM을 강렬히 형광성인 칼세인으로 전환시킴으로써 정량화한다. 살아 있는 세포는 거의 보편적으로 에스테라제 활성을 나타내고 폴리양이온성 형광성 칼세인을 잘 나타낸다. 따라서, 살아 있는 세포는 상기 검정에서 균일하고 강렬한 그린 형광을 야기시킨다. 520nm에서의 방출이 배양물 중의 총 생존 세포수를 결정하는데 사용될 수 있도록 상기 검정을 조정할 수 있다. 상기 검정은 몰레큘라 프로브로부터 입수 가능한 키트(Live/Dead Cell Assay Kit)를 사용하여 본 실시예에 대해서와 같이 이행될 수 있다.

도 9에 도시된 바와 같이, Ckβ-4(채워진 사각형)는 HG0100(비어있는 사각형)과 유사하게 배양물에서 피질성 신경단위 세포 생존을 자극한다.

각 지점은 6회 배양의 평균치를 나타낸다.

실시예 14

Ckβ-4는 피질성 신경단위의 성장을 증진시킨다

표준 기술에 따라서 피질성 신경단위의 배양물을 제조하고 유지시킨다. 시험 인자의 존재하에서 6 내지 7일 후에, 배양물 내에 존재하는 뉴로필라멘트 단백질의 양을 ELISA에 의해 결정한다.

도 10에 도시된 바와 같이, 10 내지 100ng/ml 농도의 Ckβ-4는 bFGF-10와 유사하게 신경돌기 성장을 증진시킨다. 결과는 6회 배양에 대해서이다.

실시예 15

Ckβ-4는 말초혈 임파구의 화학주성을 유도한다

Ckβ-4 및 MCP-1에 반응하여 일어난 말초혈 임파구의 화학주성을 상기 언급된 방법에 의해 결정한다.

도 11에 도시된 바와 같이, Ckβ-4는 포화에서의 MCP-1의 활성에 필적하게, 1 내지 10ng/ml에서 활성 피크를 나타낸다.

본 발명의 수 많은 변형 및 변이가 상기 교시에 비추어 볼 때 가능하므로, 첨부된 청구의 범위내에서 본 발명은 구체적으로 기술된 것 이외의 양태로 실시할 수 있다.

서열 목록

(1) 일반적 정보:

(ⅰ) 출원인: 리 하오동

(ⅱ) 발명의 명칭: 사람 케모킨 폴리펩티드

(ⅲ) 서열수: 20

(ⅳ) 서신 주소:

(A) 수신인: 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드

(B) 거리: 키 웨스트 애비뉴 9410

(C) 시: 록크빌

(D) 주: 메릴랜드

(E) 국가: 미국

(F) 우편번호: 20850

(ⅴ) 컴퓨터 판독형:

(A) 매체 유형: 플로피 디스켓

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환성

(C) 운영 시스템: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: 페이턴트인 릴리즈 #1.0, 버전 #1.30

(ⅵ) 현 출원 데이터:

(A) 출원 번호: US

(B) 출원일: 1996. 2. 23

(C) 분류:

(ⅷ) 변호사/대리인 정보:

(A) 성명: 밀스타인 래리 에스

(B) 등록 번호: 34,679

(ⅸ) 전자통신 정보:

(A) 전화: 301-309-8504

(B) 팩시밀리: 301-309-8512

(2) 서열 1에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 291개 염기 쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(ⅸ) 양상

(A) 명칭/특징: CDS

(B) 위치: 1..288

(2) 서열 2에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 96개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(2) 서열 3에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 297개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA (게놈성)

(ⅸ) 양상

(A) 명칭/특징: CDS

(B) 위치: 1..294

(2) 서열 4에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 98개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(2) 서열 5에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 26개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

CCCGCATGCA AGCAGCAAGC AACTTT 26

(2) 서열 6에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 30개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

AAAGGATCCC ATGTTCTTGA CTTTTTTACT 30

(2) 서열 7에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 27개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

CCCGCATGCA GCCAGATGCA CTCAACG 27

(2) 서열 8에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 28개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

AAAGGATCCA GTCTTCAGGG TGTGAGCT 28

(2) 서열 9에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 29개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

GGAAAGCTTA TGTGCTGTAC CAAGAGTTT 29

(2) 서열 10에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 59개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

CGCTCTAGAT TAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAA CATGGTTCCT TGACTTTTT 59

(2) 서열 11에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 28개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

GGAAAGCTTA TGAAAGTTTC TGCAGTGC 28

(2) 서열 12에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 58개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

CGCTCTAGAT CAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAA GTCTTCAGGG TGTGAGCT 58

(2) 서열 13에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 28개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

CGCGGGATCC TTAACCTTCA ACATGAAA 28

(2) 서열 14에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 29개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

CGCGGGTACC TTAACACATA GTACATTTT 29

(2) 서열 15에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 27개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

GCGGGATCCT TAACCTTCAA CATGAAA 27

(2) 서열 16에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 29개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

CGCGGGTACC TTAACACATA GTACATTTT 29

(2) 서열 17에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 70개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(2) 서열 18에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 99개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

(2) 서열 19에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 76개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: DNA(게놈성)

(2) 서열 20에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 74개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

Claims (30)

1. (a) 도 1의 추론된 아미노산 서열을 갖는 Ckβ-4 폴리펩티드, 또는 이러한 폴리펩티드의 단편, 동족체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;

   (b) ATCC 기탁번호 제75848호에 함유된 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 Ckβ-4 폴리펩티드, 또는 이러한 폴리펩티드의 단편, 동족체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;

   (c) 도 2의 추론된 아미노산 서열을 갖는 도 2의 MCP-4 폴리펩티드의 28번에서 93번 까지의 아미노산 잔기 서열을 포함하는 MCP-4 폴리펩티드, 또는 이러한 폴리펩티드의 단편, 동족체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및

   (d) ATCC 기탁번호 제75849호에 함유된 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 MCP-4 폴리펩티드, 또는 이러한 폴리펩티드의 단편, 동족체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 분리된 폴리뉴클레오티드.
2. 제1항에 있어서, DNA인 폴리뉴클레오티드.
3. 제1항에 있어서, RNA인 폴리뉴클레오티드.
4. 제1항에 있어서, 게놈 DNA인 폴리뉴클레오티드.
5. 제2항에 있어서, 도 1의 추론된 아미노산 서열을 갖는 Ckβ-4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
6. 제2항에 있어서, 도 2 및 5에 제시된 1번에서 98번, 17번에서 98번, 20번에서 98번, 22번에서 98번, 24번에서 98번, 28번에서 98번, 28번에서 95번 및 28번에서 93번 까지의 잔기로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 MCP-4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
7. 제2항에 있어서, ATCC 기탁번호 제75848호의 cDNA에 의해 암호화된 Ckβ-4 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
8. 제2항에 있어서, ATCC 기탁번호 제75849호의 cDNA에 의해 암호화된 MCP-4 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
9. 제1항에 있어서, 도 1에 도시된 바와 같은 Ckβ-4의 암호화 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
10. 제1항에 있어서, 도 2에 도시된 바와 같은 MCP-4의 암호화 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
11. 제2항에 있어서, ATCC 기탁번호 제75848호로서 기탁된 Ckβ-4의 암호화 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
12. 제2항에 있어서, ATCC 기탁번호 제75849호로서 기탁된 MCP-4의 암호화 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
13. 제2항에 따른 DNA를 함유하는 벡터.
14. 제13항에 따른 벡터를 사용하여 유전 공학적으로 조작시킨 숙주 세포.
15. 제14항에 따른 숙주 세포로부터 제2항의 DNA에 의해 암호화된 폴리펩티드를 발현시킴을 포함하여, 폴리펩티드를 제조하는 방법.
16. 제13항에 따른 벡터를 사용하여 세포를 유전 공학적으로 조작함을 포함하여, 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 세포를 생산하는 방법.
17. 제2항에 따른 DNA와 하이브리드화할 수 있고 Ckβ-4 활성을 지닌 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 DNA.
18. 제2항에 따른 DNA와 하이브리드화할 수 있고 MCP-4 활성을 지닌 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 DNA.
19. (ⅰ) 도 1의 추론된 아미노산 서열을 갖는 Ckβ-4 폴리펩티드, 및 이의 단편, 동족체 및 유도체; (ⅱ) ATCC 기탁번호 제75848호의 cDNA에 의해 암호화된 Ckβ-4 폴리펩티드, 및 이의 단편, 동족체 및 유도체; (ⅲ) 도 2 및 5에 제시된 1번에서 98번, 17번에서 98번, 20번에서 98번, 22번에서 98번, 24번에서 98번, 28번에서 98번, 28번에서 95번 및 28번에서 93번 까지의 잔기로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 MCP-4 폴리펩티드, 및 이의 단편, 동족체 및 유도체; 및 (ⅳ) ATCC 기탁번호 제75849호의 cDNA에 의해 암호화된 MCP-4 폴리펩티드, 및 이의 단편, 동족체 및 유도체로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리펩티드.
20. 제19항에 있어서, 도 1의 추론된 아미노산 서열을 갖는 Ckβ-4인 폴리펩티드.
21. 제19항에 있어서, (ⅲ)에 제시된 그룹 중에서 선택된 MCP-4 폴리펩티드.
22. 제19항의 폴리펩티드에 대한 항체.
23. 제19항의 폴리펩티드에 대한 길항제.
24. Ckβ-4를 필요로 하는 환자에게 치료학적 유효량의 제19항의 Ckβ-4 폴리펩티드를 투여함을 포함하여, 상기 환자를 치료하는 방법.
25. Ckβ-4를 억제시킬 필요가 있는 환자에게 치료학적 유효량의 제23항의 Ckβ-4 길항제를 투여함을 포함하여, 상기 환자를 치료하는 방법.
26. MCP-4를 필요로 하는 환자에게 치료학적 유효량의 제19항의 MCP-4 폴리펩티드를 투여함을 포함하여, 상기 환자를 치료하는 방법.
27. MCP-4를 억제시킬 필요가 있는 환자에게 치료학적 유효량의 제23항의 길항제를 투여함을 포함하여, 상기 환자를 치료하는 방법.
28. 제19항의 폴리펩티드와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
29. 제24항에 있어서, 치료학적 유효량의 폴리펩티드가, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 환자에게 제공하여 이러한 폴리펩티드가 생체내에서 발현됨으로써 투여되는 방법.
30. 제26항에 있어서, 치료학적 유효량의 폴리펩티드가, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 환자에게 제공하여 이러한 폴리펩티드가 생체내에서 발현됨으로써 투여되는 방법.