【発明の詳細な説明】
マクロファージ遊走阻止因子−３
本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチド
によりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドの使用、およびそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関
する。より詳細には、本発明のポリペプチドは、マクロファージ遊走阻止因子-3
（Macrophage Migration Inhibitory Factor-3）（MIF-3）である。本発明はま
た、そのようなポリペプチドの作用を阻害することに関する。
抗原刺激または細胞分裂促進因子刺激に応答して、リンパ球は、リンホカイン
と呼ばれるタンパク質調節因子を分泌する。リンホカインは免疫調節、炎症およ
び細胞性免疫のエフェクター機構において重要な役割を果たす（Miyajima，A.ら
、FASEB J.，38:2462-2473(1988)）。初めに報告されたリンホカイン活性は、抗
原感作され、そして活性化されたモルモットリンパ球の培養上清において観察さ
れた。この活性は、インビトロでモルモットマクロファージが毛細管の外に遊走
することを妨げるその能力のために、遊走阻止因子（MIF）と名付けられた(Bloo
m，B.R.ら、Science，153:80-82(1966))。
MIF活性の検出は、種々の炎症性応答と相関し、これには、遅延された過敏感
性および細胞性免疫（Rocklin，R.E.ら、New Engl．J．Med.，282:1340-1343(19
70)）；同種移植片拒絶(Al-Askari，S.ら、Nature，205:916-917(1965))；およ
びリュウマチ多発関節炎滑液症（synovialis）（Odinkら、Nature，330:80-82(1
987)が包含される。
MIFは、活性化されたＴ細胞により産生されることが知られている。MIFは下垂
体前葉細胞により放出される主要な分泌タンパク質である。極めて多数の刊行物
が、MIFと推定される分子の単離および同定を報告してきた。例えば、MIF-1は、
F5と呼ばれるヒトＴ細胞ハイブリドーマクローンの無血清培養上清から均質に精
製された。Oki，S.，Lymphokine Cytokine Res.，10:273-80(1991)。また、MIF-
2（MIF-1よりも疎水性である）が、同じクローンから均質に精製された（Hirose
，S.ら、M,Microbiol．Immunol.，35:235-45（1991））。本発明のポリペプチ
ドMIF-3は、構造上、MIFファミリーに関連している。
本発明の１つの局面に従って、新規な成熟ポリペプチド（これはMIF-3である
）ならびにそのフラグメント、アナログおよび誘導体が提供される。本発明のポ
リペプチドは、ヒト起源である。
本発明の別の局面に従って、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド（DNAまたはRNA）が提供される。
本発明のまたさらなる局面に従って、そのようなポリペプチドを組換え技術に
より産生するためのプロセスが提供される。
本発明の別の局面に従って、このようなポリペプチドに対する抗体が提供され
る。
本発明のまたさらなる局面に従って、そのようなポリペプチド、またはそのよ
うなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、治療目的（例えば、ガン、
感染を処置する、創傷治癒を促進する、および免疫系を刺激する）のために利用
するためのプロセスが提供される。
本発明のまた別の局面に従って、このようなポリペプチドに対するアンタゴニ
スト/インヒビターが提供される。これは、そのようなポリペプチドの作用を阻
害するために、例えば、敗血症性ショック、致死性内毒血症、および眼の炎症の
処置において、使用され得る。
本発明のこれらおよび他の局面は、本明細書中の教示から当業者に明らかであ
るはずである。
以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして請求の範囲により包含
される本発明の範囲を限定することを意味しない。
図１は、MIF-3のポリヌクレオチド配列、および対応する推定のアミノ酸配列
を示す。示されるアミノ酸配列によりコードされるポリペプチドは、ポリペプチ
ドのプレタンパク質の形態であり、そしてアミノ酸について、標準的な１文字略
語を使用する。
本発明の１つの局面によれば、図１の推定のアミノ酸配列を有する成熟ポリペ
プチド、または1994年３月18日にATCC寄託番号75712として寄託されたクローン
のcDNAにコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリヌク
レオチド）が提供される。
本発明のポリヌクレオチドは、ヒトＴ細胞に由来するcDNAライブラリーから発
見された。このポリヌクレオチドは、構造上ヒトMIFファミリーに関連する。こ
のポリヌクレオチドは、約118アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープン
リーディングフレームを含む。このタンパク質は、アミノ酸配列全体にわたって
、34%の同一性、および78%の類似性でヒトMIFに最も高い程度の相同性を示す。
本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNA（このDNAはcDNA、ゲノムD
NA、および合成DNAを包含する）の形態であり得る。DNAは二本鎖または一本鎖で
あり得、そして一本鎖はコード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る
。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１に示すコード配列または寄
託したクローンのコード配列と同一であり得、あるいはそのコード配列が、遺伝
コードの重複性または縮重の結果として、図１のDNAまたは寄託したcDNAと同じ
成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列であり得る。
図１の成熟ポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドは以下を包含し得る：成熟ポリペプチドのコ
ード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列およびリーダーまたは分泌配列ま
たはプロタンパク質配列のようなさらなるコード配列；成熟ポリペプチドのコー
ド配列（および随意のさらなるコード配列）および非コード配列（例えば、イン
トロンまたは成熟ポリペプチドのコード配列の5'および/または3'側にある非コ
ード配列）。
従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチ
ドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、およびさらなるコード配列および
/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
本発明はさらに、図１の推定のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託
したクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログ
、および誘導体をコードする、本明細書中上記のポリヌクレオチドの改変体に関
する。ポリヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオチドの天然の対立遺伝子改変
体またはポリヌクレオチドの非天然の改変体であり得る。
従って、本発明は、図１に示す同じ成熟ポリペプチドまたは寄託したクローン
のcDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
、およびそのようなポリヌクレオチドの改変体を包含する。この改変体は、図１
のポリペプチドまたは寄託したクローンのcDNAによりコードされるポリペプチド
のフラグメント、誘導体、またはアナログをコードする。このようなヌクレオチ
ド改変体は、欠失改変体、置換改変体および付加または挿入改変体を包含する。
本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図１に示すコード配列
または寄託したクローンのコード配列の天然の対立遺伝子改変体であるコード配
列を有し得る。当該分野で公知なように、対立遺伝子改変体は、１以上のヌクレ
オチドの置換、欠失、または付加を有するポリヌクレオチド配列の別の形態であ
り、これはコードされるポリペプチドの機能を実質的に変化させない。
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にする
マーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列
は、細菌宿主の場合にマーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供する
、pQE-9ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。または、
例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、COS-7細胞）が使用される場合
は、血球凝集素（HA）タグであり得る。HAタグはインフルエンザ血球凝集素タン
パク質に由来するエピトープに対応する（Wilson，I.ら、Cell，37:767(1984)）
。
本発明はさらに、配列間に少なくとも50%および好ましくは70%の同一性が存在
する場合、本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる
用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが、配列間に少な
くとも95%および好ましくは少なくとも97%の同一性が存在する場合のみに生じる
ことを意味する。好ましい実施態様において本明細書中上記のポリヌクレオチド
にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１のcDNAまたは寄託したcDNAによ
りコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持
するポリペプチドをコードする。
本明細書中でいう寄託物は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関す
るブダペスト条約の条件下に維持される。これらの寄託物は、当業者に単に便宜
上提供されるのみであり、そして米国特許法第112条の下で寄託が必要とされる
ことを認めたわけではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならび
にそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考と
して援用されており、そして本明細書中の配列の記載とのいかなる矛盾も抑えて
いる。寄託物を製造し、使用し、または販売するためには実施許諾が必要とされ
得、そしてそのような実施許諾はこれによって与えられるわけではない。
本発明はさらに、図１の推定のアミノ酸配列を有するまたは寄託したcDNAによ
りコードされるアミノ酸配列を有するMIF-3ポリペプチド、およびそのようなポ
リペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体に関する。
用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」は、図１のポリペプ
チドまたは寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドをいう場合は、そのよ
うなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチ
ドを意味する。従ってアナログは、プロタンパク質部分の切断により活性化され
て活性な成熟ポリペプチドを生じ得るプロタンパク質を包含する。
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチドまたは合
成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。
図１のポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドのフ
ラグメント、誘導体、またはアナログは、(i)そこで１以上のアミノ酸残基が保
存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、そし
てこのような置換されるアミノ酸残基がこの遺伝コードによりコードされるアミ
ノ酸残基であり得るかあり得ないもの、または(ii)そこで１以上のアミノ酸残基
が置換基を含有するもの、または(iii)そこで成熟ポリペプチドがポリペプチド
の半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の
化合物に融合されているもの、または(iv)そこでリーダー配列または分泌配列あ
るいは成熟ポリペプチドまたはプロタンパク質の精製に用いられる配列のような
さらなるアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合されるものであり得る。このような
フラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範
囲内にあると考えられる。
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態
で提供され、そして好ましくは均質に精製される。
用語「単離された」は、物質がその本来の環境（例えば、天然に存在する場合
は、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動
物の中に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されてい
るわけではなく、しかし天然の系において共存する物質の幾らかまたは全部から
分離されている同一のポリヌクレオチドあるいはポリペプチドは、単離されてい
る。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、および／またはこ
のようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得るが、
それにもかかわらずそのようなベクターまたは組成物がその天然の環境の一部で
はないため単離されている。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクター
を用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプ
チドの産生に関する。
宿主細胞は、本発明のベクター（これは例えば、クローニングベクターまたは
発現ベクターであり得る）を用いて遺伝子操作される（形質導入されるまたは形
質転換されるまたはトランスフェクトされる）。ベクターは例えば、プラスミド
、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロ
モーターを活性化し、形質転換体を選択し、またはMIF遺伝子を増幅するために
適切に改変した従来の栄養培地中において培養され得る。培養条件（例えば、温
度、pHなど）は、発現のために選択される宿主細胞に以前使用された条件であり
、そして当業者には明らかである。
本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを産生するため
に用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現す
るための種々の発現ベクターのいずれか１つに含まれ得る。このようなベクター
は、染色体DNA配列、非染色体DNA配列、および合成DNA配列を包含する。このよ
うなベクターは、例えば、SV40の誘導体；細菌性プラスミド；ファージDNA；バ
キュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージDNAの組み合わせ
に由来するベクター、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、お
よび仮性狂犬病のようなウイルスDNAである。しかし、宿主において複製可能で
、
そして存続可能である限り、他の任意のベクターが使用され得る。
適切なDNA配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、DNA配
列は当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入され
る。このような手順および他の手順は、当業者に公知の範囲内であると考えられ
る。
発現ベクター中のDNA配列は、適切な発現制御配列（プロモーター）に作動可
能に連結され、mRNAの合成を指示する。このようなプロモーターの代表的な例と
しては、以下が挙げられ得る：LTRまたはSV40プロモーター、E.coli lacまたはt rp
、λファージPLプロモーター、および原核細胞または真核細胞あるいはそのウ
イルス内で遺伝子の発現を制御すると公知である他のプロモーター。発現ベクタ
ーはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含
有する。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含有し得る。
さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のため
の表現型特性（例えば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼま
たはネオマイシン耐性、またはE.coliにおけるテトラサイクリン耐性またはアン
ピシリン耐性）を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。
本明細書中上記のような適切なDNA配列ならびに適切なプロモーター配列また
は制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質
を発現させるために用いられ得る。
適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞（例えば、E.coli
、Streptomyces、Salmonella typhimurium）；真菌細胞（例えば酵母）；
昆虫細胞（例えば、DrosophilaおよびSf9）；動物細胞（例えば、CHO、COSまた
はBowes黒色腫）；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書の教示により
当業者に公知の範囲内であると考えられる。
さらに詳細には、本発明はまた、上で広範に記載した１以上の配列を含む組換
え構築物を包含する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクターまたは
ウイルスベクター）を包含し、このベクターの中には本発明の配列が正方向また
は逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面によれば、構築物はさ
らに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを包含す
る）を含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であり
、そして購入可能である。以下のベクターが例として提供される。細菌性：pQE7
0、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK
、pbsKs、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、p
KK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核性：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1
、pSG(Stratagene)；pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、それらが
宿主において複製可能で、そして存続可能である限り、他の任意のプラスミドま
たはベクターも使用され得る。
プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベク
ターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子
から選択され得る。２つの適切なベクターは、pKK232-8およびpCM7である。特に
よく知られた細菌プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PLおよびt
rpを包含する。真核プロモーターは、CMV即時型、HSVチミジンキナーゼ、初期SV
40および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスＩ型メタロチオネ
インを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者の
レベル範囲内である。
さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。
宿主細胞は、高等真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核細胞（例え
ば、酵母細胞）であり得るか、または宿主細胞は原核細胞（例えば、細菌細胞）
であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクシ
ョン、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレー
ションにより達成され得る(Davis,L.,Dibner,M.,Battey,I.,Basic Methods in M
olecular Biology，(1986))。
宿主細胞中の構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生する
ために、従来の方法において使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは
、従来のペプチド合成機により合成的に産生され得る。
成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプ
ロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、このようなタンパク
質を産生するために、本発明のDNA構築物に由来するRNAを使用して用いられ得る
。
原核宿主および真核宿主で使用される適切なクローニングベクターおよび発現ベ
クターは、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第２版,Col
d Spring Harbor,N.Y.，(1989)（この開示は、本明細書中に参考として援用され
ている）に記載されている。
本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクタ
ーにエンハンサー配列を挿入することにより増大され得る。エンハンサーはDNA
のシス作用因子であり、通常は約10〜約300bpであり、これはプロモーターに作
用してその転写を増大させる。例は、複製起点bp100〜270の後期側のSV40エンハ
ンサー、サイトメガロウイルスの早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後
期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを包含する
。
一般に、組換え発現ベクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能と
する選択マーカー（例えば、E.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS.cerevisi ae
のTRP1遺伝子）および下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来プロ
モーターを含有する。このようなプロモーターは、特に解糖酵素（例えば、3-ホ
スホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショ
ックタンパク質）をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開
始配列および翻訳終止配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質の細胞周辺
腔または細胞外培地への分泌を指示し得るリーダー配列と適切な相内で組立てら
れる。随意に異種配列は、所望の特徴を与えるＮ末端同定ペプチド（例えば、発
現された組換え産物の安定化または簡略化された精製）を含む融合タンパク質を
コードし得る。
細菌での使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能な読
みとり相で、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を適切な翻訳開始シグ
ナルおよび翻訳終止シグナルと共に挿入することにより構築される。ベクターは
、１以上の表現型選択マーカー、およびベクターの維持を保証するため、そして
所望により宿主内での増幅を提供するために複製起点を含有する。形質転換のた
めに適切な原核宿主は、E.coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium
、およびPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属内の種々の
種を包含するが、他の種もまた選択対象に用いられ得る。
代表的な、しかし限定しない例として、細菌での使用に有用な発現ベクターは
、周知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37017)の遺伝エレメントを含む市販
のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。こ
のような市販のベクターは、例えば、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Upp
sala，Sweden)およびGEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)を包含する。こ
れらのpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配
列と組み合わされる。
適切な宿主系統の形質転換および適切な細胞密度への宿主系統の増殖に続いて
、選択されたプロモーターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導
）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。
細胞は、代表的には遠心分離により収集され、物理的手段または化学的手段に
より破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。
タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音
波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法によ
り破砕され得、このような方法は当業者に周知である。
種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用い
られ得る。哺乳動物発現系の例は、Gluzman，Cell，23: 175(1981)に記載された
サル腎臓線維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の細胞
株（例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株）を包含する。哺乳動物
発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサーを含有し、
そして任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナ
ー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、および５'フランキ
ング非転写配列をも含有する。SV40スプライスに由来するDNA配列、およびポリ
アデニル化部位は、必要な非転写遺伝エレメントを提供するために使用され得る
。
MIF-3ポリペプチドは、以下で使用される方法により組換え細胞培養物から回
収され、そして精製され得る。これらの方法には、硫安沈殿またはエタノール沈
殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロー
スクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチン
クロマトグラフィーが包含される。精製の間に低濃度（約0.15〜約５mM）のカル
シウムイオンが存在することが好ましい(Priceら、J.Biol.Chem.，244: 917(196
9))。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ（refolding）工程が、成熟タン
パク質を完全な配置とするために使用され得る。最終的に、高性能液体クロマト
グラフィー(HPLC)が、最終的な精製工程に用いられ得る。
本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物または化学合成手順の産物で
あり得るか、または原核宿主または真核宿主（例えば、培養中の細菌、酵母、高
等植物、昆虫、および哺乳動物細胞）から組換え技術により産生され得る。組換
え産生手順に用いられる宿主により、本発明のポリペプチドは、グリコシル化さ
れ得るか、またはグリコシル化され得ない。本発明のポリペプチドはまた、最初
のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。
本発明のMIF-3タンパク質は、一般的なアクチベーターまたはいくつかの異な
るマクロファージ機能としてのその役割を示す、ディスプレーされた生物学的活
性を有する。さらにMIF-3は、ヒトマクロファージの遊走を阻止し、かつマクロ
ファージの活性を刺激する。
本発明のMIF-3ポリペプチドは、抗腫瘍剤として用いられ得る。活性化された
マクロファージは、単独でまたは特異的な抗腫瘍モノクローナル抗体と組み合わ
せて、かなりの殺腫瘍性活性を有する。同様に、特定の病原体のマクロファージ
仲介性殺傷を促進するMIF-3の能力は、種々の感染（結核、ハンセン病、および
カンジダを含む）を処置する際のこの分子の使用を示す。
さらに、マクロファージの遊走を阻止するMIF-3の能力は、創傷を処置するた
めの治療剤において開発され得る。損傷部位でのMIF-3の局所適用の結果、創傷
内で濃縮される活性化されたマクロファージの数を増加させ、それゆえ創傷の治
癒速度が増加する。
さらに、MIF-3は、一般的な免疫刺激因子として使用され得、特定のワクチン
に対して生じる免疫性を増加する。MIFタンパク質は、Ｔ細胞に対して抗原を提
示するマクロファージを増強させる能力を有する。それゆえ、MIF-3は、異なる
抗原に対する免疫応答を強化するために用いられ得る。MIFは、AIDSまたはAIDS
関連性複合体のような症例において極めて重要である。
MIF-3はまた、肝臓の解毒機能を増強するために用いられ得る。ラットの肝臓
においてMIF活性を有するタンパク質が、化学的解毒システムおよび免疫学的解
毒システムを関連づける証拠がある。このタンパク質はグルタチオンS-転移酵素
（GST）活性およびMIF活性の両方を作動させる。一次構造比較により、GSTとMIF
との間に有意な類似性が示される。
MIFポリペプチドはまた、インビボでのこのようなポリペプチドの発現により
本発明に従って用いられ得、これはしばしば、「遺伝子治療」といわれる。
従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド(DNAまたはRNA)を用いてエクソビボで操作され得、次いで、操作された細胞
はポリペプチドで処置される患者に提供される。このような方法は当該分野で周
知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有する
レトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって操作され得る
。
同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分
野で公知の手順によりインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発
明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を産生するた
めの産生細胞は、インビボで細胞を操作するためおよびインビボでのポリペプチ
ドの発現のために患者に投与され得る。このような方法により本発明のポリペプ
チドを投与するこれらの方法または他の方法は、本発明の教示により当業者には
明らかである。例えば、細胞を操作するための発現媒介物は、レトロウイルス以
外のもの（例えば、アデノウイルス）であり得る。これは、適切な送達媒介物と
組み合わせた後インビボで細胞を操作するために使用され得る。
本発明のポリペプチドは、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ得る
。このような組成物は、治療有効量のポリペプチド、および薬学的に受容可能な
キャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアは、生理食塩水、緩衝化生理
食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み
合わせを包含するが、これに限定されない。処方は、投与方法に合わせるべきで
ある。
本発明はまた、１以上の本発明の薬学的組成物の成分が満たされた１以上の容
器を含有する薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器は、薬剤ま
たは生物製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関により規定された形
式の通知を伴い得、この通知はヒトへの投与についての製造、使用、または販売
における機関による認可を反映する。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治
療的化合物と併用して用いられ得る。
薬学的組成物は、局所経路、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、皮下経路
、鼻腔内経路または皮内経路のような便利な方法で投与され得る。被験体に投与
されるMIFの量および投与法は、多数の因子（投与方法、処置される症状の性質
、および処方する医師の判断）に依存する。一般的にいえば、これらは、例えば
少なくとも約10μg/kg体重の治療有効用量で与えられ、そしてほとんどの場合、
１日あたり約８mg/kg体重を超えない量で投与され、そして好ましくは、投与量
は、投与経路、症状などを考慮して、１日あたり約10μg/kg体重〜約１mg/kg体
重である。
本発明の配列はまた、染色体の同定に有益であり得る。配列は、個々のヒト染
色体の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置でハイブリダイズし得る
。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染色体位
置の標識に利用可能な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識試薬
はほとんどない。本発明によるDNAの染色体へのマッピングは、これらの配列と
疾患に関する遺伝子とを相関させることにおける重要な第１段階である。
簡略に述べれば、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは15〜25bp）を
調製することにより染色体にマップされ得る。cDNAのコンピューター解析が、ゲ
ノムDNA内で１より多いエキソンにまたがらない、従って増幅プロセスを複雑化
しないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライ
マーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニング
に使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが
増幅フラグメントを生じる。
体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当て
るための迅速な手順である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプライマーと共に
使用して、類似の方法で特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは大きな
ゲノムクローンのプールを用いて下位位置決め(sublocalization)が達成され得
る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピング戦略は、イン
サイチュハイブリダイゼーション、標識したフローサイトメトリーで選別した染
色体でのプレスクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリーを構築する
ためのハイブリダイゼーションによる前選択を包含する。
cDNAクローンの中期染色体展開物への蛍光インサイチュハイブリダイゼーショ
ン(FISH)は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技
術は、500または600塩基程度の短さのcDNAで使用され得る；しかし、2,000bpよ
りも長いクローンの方が、簡便な検出のために充分なシグナル強度でユニークな
染色体位置に結合しやすい。FISHは、ESTが由来するクローンの使用を必要とし
、そしてこのクローンはより長いことが好ましい。例えば、2,000bpが良好であ
り、4,000bpはより良好であり、そして4,000bpを超える長さは、良好な結果に時
間の合理的な割合を得るためにはおそらく必要でない。この技術の総説としては
、Vermaら，Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques，Pergamon Pre
ss，New York(1988)を参照のこと。
一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、配列の染色体上での物理的な
位置を遺伝的地図のデータと相関させ得る。このようなデータは、例えば、V．M
cKusick，Mendelian Inheritance in Man に見出される(Johns Hopkins Univers
ity Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能である)。次いで、同一の
染色体領域にマップされる遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理的に隣接し
た遺伝子の同時遺伝）により同定される。
次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNAまたはゲノム配列の差異を決定する
必要がある。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正常な個体
には観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であると思われる。
物理的マッピング技術および遺伝的マッピング技術の現在の解像度では、疾患
に関する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の潜在的原
因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガ塩基のマッピング解像度で、そし
て20kbあたり１遺伝子と仮定する。）
罹患個体と非罹患個体との比較は、一般に、まず染色体の構造変化（例えば、
染色体展開物で目視できるか、あるいはそのcDNA配列に基づくPCRを使用して検
出可能な欠失または転座）を探す工程を包含する。最終的には、変異の存在を確
認し、そして変異を多型から区別するために、数個体由来の遺伝子の完全な配列
決定が必要とされる。
このポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらのアナ
ログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生させるため
の免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およ
びヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産物を
包含する。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメント
の産生のために使用され得る。
本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポ
リペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られ
得る。この動物は、好ましくは非ヒトである。次いで、このようにして得られた
抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグ
メントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体
を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチド
を発現する組織からポリペプチドを単離するために使用され得る。
モノクローナル抗体の調製のために、細胞株の連続培養により産生される抗体
を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術(Kohle
rおよびMilstein，1975，Nature，256: 495-497)、トリオーマ(trioma)技術、ヒ
トＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら，1983，Immunology Today 4: 72)、およ
びヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら，19
85，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss,Inc.,77-96頁)
が挙げられる。
単鎖抗体を産生するために記載された技術(米国特許第4,946,778号)を、本発
明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合させ得る
。
本発明はさらに、MIF-3レセプターを同定するための方法に関する。レセプタ
ーをコードする遺伝子は、発現クローニングにより同定され得、発現クローニン
グには、MIF-3に応答性の細胞からポリアデニル化されたRNAを調製することを包
含し、そしてこのRNAから調製されたcDNAライブラリーをプールに分割し、そし
てCOS細胞またはMIS-3に非応答性である他の細胞をトランスフェクトするために
使用される。ガラススライド上で増殖したトランスフェクトされた細胞は、標識
MIF-3に曝露される。MIF-3は、種々の方法（部位特異的プロテインキナーゼにつ
いての認識部位のヨウ素化、または封入を包含する）により標識され得る。固定
化およびインキュベーションに続いて、スライドをオートラジオグラフィー分析
に供する。陽性プールを同定し、サブプールを調製し、そしてサブプール化およ
び再スクリーニングプロセスの反復を用いて再トランスフェクトし、最終的に推
定レセプターをコードする単一のクローンを得る。レセプターを同定するための
代わりのアプローチとして、標識MIF-3を、レセプター分子を発現する細胞膜ま
たは抽出調節物とともに光親和的に連結し得る。架橋物質は、PAGEにより分析さ
れ、そしてＸ線フィルムに感光される。リガンド-レセプターを含む標識複合体
が切り出され得、ペプチドフラグメントに分解され得、そしてタンパク質ミクロ
シークエンシングに供され得る。ミクロシークエンシングから得られたアミノ酸
配列は、cDNAライブラリーをスクリーニングして推定のレセプターをコードする
遺伝子を同定するための一般的な（generate）オリゴヌクレオチドプローブの組
合せを設計するために使用される。
本発明はまた、MIF-3のそのレセプターに対する相互作用を増強する（アゴニ
スト）か、またはブロックする（アンタゴニスト）薬物を同定するために薬物を
スクリーニングする方法を提供する。アゴニストは、MIF-3の天然の生物学的機
能を増加させる化合物であり、アンタゴニストは、このような機能を除去する。
例として、MIF-3レセプターを発現する哺乳動物細胞または膜調製物が、薬物の
存在下で標識MIF-3とともにインキュベートされる。次いで、薬物がこの相互作
用を増強またはブロックする能力が測定され得る。あるいは、リガンドとレセプ
ターとの相互作用に続く公知の第２のメッセンジャーシステムの応答が、薬物の
存在下または非存在下で測定され比較される。このような第２のメッセンジャー
システムとしては、cAMPグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネル、またはホス
ホイノシチド加水分解酵素が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明はまた、本発明のポリペプチドのアンタゴニスト/インヒビター分子、
およびポリペプチドの機能を阻害または除去するためのそれらの使用に関する。
アンタゴニストの例は、MIF-3ポリペプチドに対する抗体、または、ある場合
では、ポリペプチドに結合するオリゴヌクレオチドである。アンタゴニストはま
た、MIF-3のペプチド誘導体であり得る。MIF-3のペプチド誘導体は、MIF-3レセ
プター部位を認識し、結合するが、それにより効果的にレセプターをブロックす
る生物学的機能を有さないMIF-3ペプチド誘導体であり得る。
インヒビターの例は、アンチセンス技術を用いて調製されるアンチセンス構築
物である。アンチセンス技術は、３重ヘリックスの形成あるいはアンチセンスDN
AまたはアンチセンスRNAにより遺伝子発現を制御するために使用され得る。これ
らの方法は両方とも、ポリヌクレオチドのDNAまたはRNAへの結合に基づく。例え
ば、ポリヌクレオチド配列の５'コード部分（これは、本発明の成熟ポリペプチ
ドをコードする）が、長さ約10〜40塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチ
ドを設計するために使用される。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関わる遺伝
子の領域に相補的であるように設計され（３重ヘリックス−Leeら，Nucl．Acids
Res.,6: 3073(1979); Cooneyら，Science，241: 456(1988); およびDervanら，
Science，251: 1360(1991)を参照のこと）、その結果、MIF-3の転写および産生
を防ぐ。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、インビボでmRNAにハイブリダ
イズし、そしてmRNA分子のMIF-3への翻訳をブロックする（アンチセンス−Okano
，J．Neurochem.,56: 560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibi
tors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988)を参照のこと）。
上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスRNAまたはアンチセンスDNAがイ
ンビボで発現されて、MIF-3の産生を阻害し得るように、細胞に送達され得る。
アンタゴニスト/インヒビターは、致死性内毒血症および敗血症性ショックに
対して保護するために用いられ得る。サイトカイン（マクロファージ遊走阻止タ
ンパク質を含む）は、敗血症性ショックを引き起こす事象のほとんどの致死的な
カスケードにおいて決定的である。内毒素は、グラム陰性細菌の細胞壁のリポ多
糖(LPS)部分である。この内毒素は、小動脈または小静脈の血管狭窄を引き起こ
し、末梢血管抵抗性の増加、および心拍量の減少を導く。これらは敗血症性ショ
ックを導く致死的な内毒血症の症状である。下垂体前葉細胞は、LPSの存在に応
答してMIFタンパク質を特異的に放出する。これらの下垂体由来のMIFタンパク質
は、内毒血症の急性期後に既に存在するMIFタンパク質を循環させることに寄与
する。
アンタゴニスト/インヒビターはまた、小レンズタンパク質の部分的な配列決
定が、ウシレンズにおけるMIFタンパク質を同定したことから、眼の炎症を処置
するために用いられ得る。したがって、MIFタンパク質は細胞間メッセンジャー
としてか、または細胞分化の機構の一部として作用し得、その結果、MIFタンパ
ク質の過剰発現が眼の炎症を導き得る。
MIF-3に対する抗体は、疾患の進行および治療的介入の効力を診断するために
用いられ得る。なぜなら、循環系におけるMIF-3のレベルが疾患の状態と相関し
得るからである。アンタゴニスト/インヒビターは、例えば本明細書中上記のよ
うな薬学的に受容可能なキャリアを有する組成物中で用いられ得る。
本発明はまた、MIF-3に特異的な、潜在性アンタゴニスト/インヒビターを同定
するためのアッセイに関する。このようなアッセイの例は、MIF-3および潜在性
アンタゴニスト/インヒビターを、競合阻害アッセイのための適切な条件下、膜
結合MIF-3レセプターまたは組換えMIF-3レセプターと組み合わせる。MIF-3は、
例えば放射活性により標識され得、その結果、レセプターに結合したMIF-3分子
の数が、潜在性アンタゴニスト/インヒビターの有効性を決定し得る。
本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する；しかし、本発明はこのよ
うな実施例に限定されないことを理解されたい。すべての部または量は、他に明
記しない限り重量基準である。
以下の実施例の理解を容易にするために、現れる頻度の高い所定の方法および
／または用語を記載する。
「プラスミド」は、小文字のｐの前および／または後に大文字および／または
数字を示すことにより命名される。本明細書中の出発プラスミドは、市販であり
、制限無く公的に入手可能であり、または公開された手順に従って入手可能なプ
ラスミドから構築され得る。さらに、記載されるプラスミドと等価のプラスミド
が
当該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。
DNAの「消化」は、DNA中の所定の配列でのみ作用する制限酵素でそのDNAを触
媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市
販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者
に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には１μgのプラスミドまた
はDNAフラグメントが約２単位の酵素とともに約20μlの緩衝溶液中で使用される
。プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的には、代表的には５
〜50μgのDNAが20〜250単位の酵素で、より大きな容量中で消化される。特定の
制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。37℃
にての約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、しかしこれは供
給者の説明書に従って変動させ得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲル
で直接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。
切断フラグメントのサイズ分離は、Goeddel,D.ら，Nucleic Acids Res.,８: 4
057(1980)により記載された８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。
「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相
補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成さ
れ得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、５'リン酸を有さず、従ってキ
ナーゼの存在下でリン酸塩とATPとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドと
連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメント
に連結する。
「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形
成するプロセスをいう(Maniatis,Tら、前出、146頁)。他に提供されていなけれ
ば、連結は公知の緩衝液および条件で、大体等モル量の連結されるべきDNAフラ
グメントの0.5μgあたり10単位のT4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて達成
され得る。
記載しない限り、形質転換はGraham,F.およびVan der Eb，A.，Virology，52:
456-457(1973)の方法に記載のように実施した。
実施例１ MIF-3 の細菌発現および精製
最初に、MIF-3をコードするDNA配列（ATCC番号75712）を、５'末端、およびプ
ロセスされたMIF-3タンパク質の配列、およびMIF-3遺伝子に対して３'のベクタ
ー配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。MIF-3に
対応する別のヌクレオチドを５'配列および３'配列のそれぞれに添加した。５'
オリゴヌクレオチドプライマーは、配列CCCGCATGCCGTTCCTGGAGCTGGを有し、SphI
制限酵素部位、および開始コドンから始まるMIF-3コード配列の19ヌクレオチド
を含む。３'配列CCCAGATCTTAAAAAAGTCATGACCGTは、BglII部位に対する相補的配
列を含み、そして、その後にMIF-3の終止コドンの前の18ヌクレオチドが続く。S
phIおよびBamHI制限酵素部位は、細菌発現ベクターpQE-70（Qiagen，Inc．9259
Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311）上のSphIおよびBamHI制限酵素部位に対
応する。pQE-70は、抗生物質耐性（Ampr）、細菌の複製起点（ori）、IPTG調節
可能なプロモーターオペレーター（P/O）、リボゾーム結合部位（RBS）をコード
し、遺伝子の３'末端に対しHisタグをおく。pQE-70を、次いで、SphIおよびBamH
Iで消化した。増幅配列を、pQE-70に連結し、ヒスチジンタグをコードする配列
とインフレームで挿入した。図２に、この配置の模式図を示す。次いで連結混合
物を用いて、M15/rep4の商標でQiagenから入手可能なE.coli株M15/rep4を、Samb
rook,J.ら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Laborator
y Press，（1989）に記載される手順により形質転換した。M15/rep4は多コピー
のプラスミドpREP4を含む。pREP4は、lacIリプレッサーを発現し、そしてさらに
カナマイシン耐性（Kanr）を付与する。形質転換体を、LBプレート上で増殖する
それらの能力により同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを
選択した。プラスミドDNAを単離し、そして制限分析により確認した。所望の構
築物を含有するクローンを、Amp（100μg/ml）およびKan（25μg/ml）の両方を
補充したLB培地での液体培養で一晩（O/N）増殖させた。O/N培養を用いて、1:10
0〜1:250の比で大規模培養に播種する。細胞を、0.4と0.6との間の光学密度600
（O.D.600）まで増殖させた。次いでIPTG（「イソプロピル-β-D-チオガラクト
ピラノシド」）を、１mMの最終濃度で添加した。IPTGは、lacIリプレッサーを不
活
性化することにより、P/Oの解放（clearing）を誘導して遺伝子発現の増大を導
く。細胞をさらに３〜４時間増殖させた。次いで、遠心分離により細胞を回収し
た。細胞ペレットを、カオトロピック剤（６M グアニジンHCl）中で可溶化した
。澄明化後、6-Hisタグを含むタンパク質による強固な結合を可能にする条件下
で、ニッケル-キレートカラム上でのクロマトグラフィーにより、この溶液から
可溶化MIF-3を精製した。Hochuli，E.ら、J．Chromatography 411:177-184(1984
)。MIF-3（純度95%）を、６MグアニジンHCl（pH5.0）中、カラムから溶出した。
GnHClからのタンパク質の再生を、いくつかのプロトコルで実施し得る。（Jae
nicke，R.およびRudolph，R.、Protein Structure‐A Practical Approach IRL
Press、New York(1990)）。最初に、透析工程を用いて、GnHClを除いた。あるい
は、Niキレートカラムから単離された精製タンパク質を、第２のカラムに結合さ
せ得る。このカラムに、減少する直線勾配のGnHClを流す。タンパク質を、カラ
ムに結合させながら再生させ、続いて250mM イミダゾール、150mM NaCl、25mM T
ris-Hcl（pH7.5）、および10% グリセロールを含有する緩衝液で溶出する。最後
に、可溶性タンパク質を、5mM 重炭酸アンモニウムを含有する保存緩衝液に対し
て透析する。精製タンパク質を、SDS-PAGEにより分析した。図３を参照のこと。
実施例２ COS 細胞における組換えMIF-3の発現
発現プラスミド（MIF-3 HA）は、以下を含むベクターpcDNAI/Amp(Invitrogen)
に由来する：１)SV40複製起点、２)アンピシリン耐性遺伝子、３)E.coli複製起
点、４)CMVプロモーター、それに続くポリリンカー領域、SV40イントロンおよび
ポリアデニル化部位。完全なMIF-3前駆体およびその３'末端にインフレームで融
合したHAタグをコードするDNAフラグメントを、ベクターのポリリンカー領域に
クローン化する。従って、組換えタンパク質発現は、CMVプロモーター下の支配
を受ける。HAタグは、以前に記載した（I．Wilson、H．Niman、R．Heighten、A
．Cherenson、M．Connolly、およびR．Lerner、1984，Cell 37：767）インフル
エンザ血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する。標的タンパク質に対
するHAタグの融合は、HAエピトープを認識する抗体を用いる組換えタンパク質
の容易な検出を可能にする。
プラスミド構築ストラテジーを以下に記す：
MIF-3をコードするDNA配列（ATCC番号75712）を、２つのプライマーを用いて
、元のクローン化されたEST上でPCRにより構築する：５'プライマー（CCCAAGCTT
ATGCCGTTCCTGGAACTG）は、HindIII部位およびその後に開始コドンから始まるMIF
-3コード配列の18ヌクレオチドを含有する；３'配列（CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTG
GGACGTCGTATGGGTATAAAAAAGTCATGACCGTC）は、XbaI部位、翻訳停止コドン、HAタ
グ、およびMIF-3コード配列の最後の19ヌクレオチド（停止コドンを含まない）
に対して相補的な配列を含有する。従って、PCR産物は、HindIII部位、MIF-3コ
ード配列、それに続くインフレームに融合したHAタグ、HAタグに隣接する翻訳停
止停止コドン、およびXbaI部位を含有する。PCR増幅DNAフラグメントおよびベク
ター（pcDNAI/Amp）を、HindIIIおよびXbaI制限酵素で消化し、そして連結した
。連結混合物を、E.coli株 SURE（Stratagene Cloning Systems，11099 North T
orrey Pines Road，La Jolla，CA 92037から入手可能）に形質転換した。形質転
換培養物をアンピシリン培地プレート上に塗布して、そして耐性コロニーを選択
する。プラスミドDNAを、形質転換体から単離して、正しいフラグメントの存在
に対する制限分析により試験する。組換えMIF-3の発現のために、COS細胞を、DE
AEデキストラン法により発現ベクターでトランスフェクトする。（J．Sambrook
、E．Fritsch、T．Maniatis、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold
Spring Laboratory Press、(1989)）。MIF-3 HAタンパク質の発現を、放射性標
識法および免疫沈降法により検出する。（E．Harlow、D．Lane、Antibodies：A
Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、(1988)）。細胞を
、トランスフェクションの２日後に35S-システインで８時間標識する。次いで培
養培地を採集し、そして細胞を界面活性剤で溶解する（RIPA緩衝液（150mM NaCl
、１％NP-40、0.1％SDS、１％NP-40、0.5％DOC、50mM Tris、pH 7.5））。（Wil
son I．ら、前出37：767(1984)）。細胞溶解物および培養培地の両方を、HA特異
的モノクローナル抗体で沈澱させる。沈澱したタンパク質を、15％SDS-PAGEゲル
で分析する。
本発明の多数の改変および変型が上記の技術を考慮すれば可能であり、それゆ
え添付の請求の範囲内で、本発明は他に、特定に記載されている以外にも実施さ
れ得る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ｃ０７Ｈ 21/04 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 16/18
Ｃ０７Ｋ 14/47 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/21
16/18 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｋ
Ｃ１２Ｎ 1/21 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ
Ｃ１２Ｐ 21/02 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ
Ｇ０１Ｎ 33/53 9358−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08
// Ａ６１Ｋ 39/395 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ
Ｃ１２Ｐ 21/08 ＡＢＤ
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）