JP2008188011A - ヒトケモカイン様レセプターの調節 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定アミノ酸配列と少なくとも約26%同一なアミノ酸配列;該特定アミノ酸配列;別に示す特定アミノ酸配列と少なくとも約26%同一なアミノ酸配列;該特定アミノ酸配列;さらに別の特定アミノ酸配列と少なくとも約26%同一なアミノ酸配列;該特定アミノ酸配列より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むケモカイン様レセプターポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド。
【選択図】なし
Description
多くの医学的に重要な生体プロセスは、Gタンパク質を含むシグナル伝達経路により仲介されている(Lefkowitz, Nature 351, 353-354, 1991)。Gタンパク質共役レセプター(GPCR)のファミリーは、ホルモン、神経伝達物質、成長因子、およびウイルスに対するレセプターを包含している。GPCRの具体的例には、ドーパミン、カルシトニン、アドレナリン作動性ホルモン、エンドセリン、cAMP、アデノシン、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子1、ロドプシン、臭気物質、サイトメガロウイルス、Gタンパク質自身、エフェクタータンパク質、例えばホスホリパーゼC、アデニルシクラーゼ、およびホスホジエステラーゼ、ならびにアクチュエータータンパク質、例えばプロテインキナーゼAおよびプロテインキナーゼCといったような多彩な物質のレセプターが包含される。
ケモカインは、様々な種類の細胞によって産生される、低分子量で、誘導性の、分泌される、炎症性サイトカインの大ファミリーである。米国特許第5,955,303号。それらは、それらの保存されたシステインの位置に基づいて、いくつかのサブファミリーに分けらる。CXCファミリーには、インターロイキン8(IL−8)、成長調節遺伝子、好中球活性化ペプチド−2、および血小板第4因子(PF−4)が含まれる。IL−8およびPF−4はいずれも多形核の化学誘引物質であり、血管形成はIL−8により刺激され、PF−4により阻害される。CCファミリーには、単球走化性タンパク質1(MCP−1)、RANTES(活性化により調節される、正常T細胞で発現し分泌される)、マクロファージ炎症性タンパク質(MIP−1.α、MIP−1.β)、およびエオタキシンが含まれる。MCP−1は、内皮細胞、上皮細胞、および造血細胞を含む、多く種類の細胞によって分泌され、単球およびCD45RO+リンパ球に対する化学誘引物質である(Proost, P. (1996) Int J. Clin. Lab. Res. 26: 211-223; Raport, C. J. (1996) J. Biol. Chem. 271: 17161-17166)。
本発明の目的は、ヒトケモカイン様レセプターを調節する試薬および方法を提供することである。本発明のこのおよびその他の目的は、下に記載する1またはそれ以上の態様によって提供する。
配列番号2に示すアミノ酸配列と少なくとも約26%同一なアミノ酸配列;
配列番号2に示すアミノ酸配列;
配列番号7に示すアミノ酸配列と少なくとも約26%同一なアミノ酸配列;
配列番号7に示すアミノ酸配列;
配列番号8に示すアミノ酸配列と少なくとも約26%同一なアミノ酸配列;
配列番号8に示すアミノ酸配列
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むケモカイン様レセプターポリペプチドである。
配列番号2に示すアミノ酸配列と少なくとも約26%同一なアミノ酸配列;
配列番号2に示すアミノ酸配列;
配列番号7に示すアミノ酸配列と少なくとも約26%同一なアミノ酸配列;
配列番号7に示すアミノ酸配列;
配列番号8に示すアミノ酸配列と少なくとも約26%同一なアミノ酸配列;
配列番号8に示すアミノ酸配列
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むケモカイン様レセプターポリペプチドと接触させる。
配列番号1に示すヌクレオチド配列と少なくとも約50%同一なヌクレオチド配列;
配列番号1に示すヌクレオチド配列;
配列番号4に示すヌクレオチド配列と少なくとも約50%同一なヌクレオチド配列;
配列番号4に示すヌクレオチド配列;
配列番号5に示すヌクレオチド配列と少なくとも約50%同一なヌクレオチド配列;
配列番号5に示すヌクレオチド配列;
配列番号9に示すヌクレオチド配列と少なくとも約50%同一なヌクレオチド配列;
配列番号9に示すヌクレオチド配列;
からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む、ケモカイン様レセプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと接触させる。
配列番号2に示すアミノ酸配列と少なくとも約26%同一なアミノ酸配列;
配列番号2に示すアミノ酸配列;
配列番号7に示すアミノ酸配列と少なくとも約26%同一なアミノ酸配列;
配列番号7に示すアミノ酸配列;
配列番号8に示すアミノ酸配列と少なくとも約26%同一なアミノ酸配列;
配列番号8に示すアミノ酸配列
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むケモカイン様レセプターポリペプチドと接触させる。
配列番号1に示すヌクレオチド配列と少なくとも約50%同一なヌクレオチド配列;
配列番号1に示すヌクレオチド配列;
配列番号4に示すヌクレオチド配列と少なくとも約50%同一なヌクレオチド配列;
配列番号4に示すヌクレオチド配列;
配列番号5に示すヌクレオチド配列と少なくとも約50%同一なヌクレオチド配列;
配列番号5に示すヌクレオチド配列;
配列番号9に示すヌクレオチド配列と少なくとも約50%同一なヌクレオチド配列;
配列番号9に示すヌクレオチド配列;
からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドのケモカイン様レセプター産物と接触させる。
配列番号1に示すヌクレオチド配列と少なくとも約50%同一なヌクレオチド配列;
配列番号1に示すヌクレオチド配列;
配列番号4に示すヌクレオチド配列と少なくとも約50%同一なヌクレオチド配列;
配列番号4に示すヌクレオチド配列;
配列番号5に示すヌクレオチド配列と少なくとも約50%同一なヌクレオチド配列;
配列番号5に示すヌクレオチド配列;
配列番号9に示すヌクレオチド配列と少なくとも約50%同一なヌクレオチド配列;
配列番号9に示すヌクレオチド配列;
からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む、ケモカイン様レセプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合する物質または、そのポリヌクレオチドによってコードされる産物と接触させる。
本発明は、以下からなる群から選択される、ケモカイン様レセプターポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する:
a)配列番号2に示すアミノ酸配列と少なくとも約26%同一なアミノ酸配列;
配列番号2に示すアミノ酸配列;
配列番号7に示すアミノ酸配列と少なくとも約26%同一なアミノ酸配列;
配列番号7に示すアミノ酸配列;
配列番号8に示すアミノ酸配列と少なくとも約26%同一なアミノ酸配列; および
配列番号8に示すアミノ酸配列;
b)配列番号1、4、5または9に示す配列を含むポリヌクレオチド;
c)(a)および(b)に示すポリヌクレオチドとストリンゲントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
d)その配列が、遺伝コードの縮重のために(a)〜(c)に示したポリヌクレオチド配列とは異なるポリヌクレオチド;および
e)(a)〜(d)に示すポリヌクレオチド配列の断片、誘導体またはアレル変異を示すポリヌクレオチド。
生物学的に活性な、即ちケモカイン活性を保持する、ヒトケモカイン様レセプターポリペプチド変異体もまた、ケモカイン様レセプターポリペプチドである。好ましくは、天然または非天然に存在するケモカイン様レセプターポリペプチド変異体は、配列番号2、7または8に示すアミノ酸配列またはその断片と少なくとも約26、30、35、40、45、50、55、65または70、好ましくは約75、80、85、90、96、96または98%一致するアミノ酸配列を有する。推定されるケモカイン様レセプターポリペプチド変異体と配列番号2、7または8のアミノ酸配列との一致パーセントは、管用の方法によって決定する。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986)、およびHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)を参照。簡潔には、2つのアミノ酸配列を、ギャップオープニングペナルティ10、ギャップ伸長ペナルティ1、およびHenikoff and Henikoff (ibid.)の「BLOSUM62」スコアリングマトリクスを用いてアライメントスコアが最適になるよう整列させる。当業者は、2つのアミノ酸配列を整列させるために用いることができる確立されたアルゴリズムが多く存在することを理解している。Pearson and Lipmanの「FASTA」類似性検索アルゴリズムは、本明細書に開示されたアミノ酸配列と推定の変異体のアミノ酸配列が共有する同一性のレベルを調べるための適当なタンパク質アライメント法である。FASTAアルゴリズムは、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444(1988)、およびPearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)に記載されている。簡潔には、FASTAは、最初に、保存的なアミノ酸置換、挿入または欠失を考慮することなく、照会する配列(即ち、配列番号2、7または8)および最も高い同一性の密度(ktup変数が1である場合)または同一の対(ktup=2の場合)のいずれかを有する試験配列が共有する領域を同定することによって配列の類似性を特徴付ける。次いで、最も高い同一性の密度を有する10の領域を、アミノ酸置換マトリクスを用いてすべての対のアミノ酸の類似性を比較することによって再スコア化し、その領域の末端を、最も高いスコア貢献する残基のみを含むように切り取る。「切り捨て(cutoff)」値(配列の長さとktup値に基づいて所定の式によって計算された)よりも大きいスコアを有する領域がいくつか存在する場合は、切取った最初の領域を調べ、その領域が連結してgapを有する近似アライメントを形成することができるかどうかを決定する。最後に、2つのアミノ酸配列の最も高いスコアの領域を、アミノ酸挿入および欠失を許容する、Needleman-Wunsch- Sellers algorithm (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol.48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974))を用いて整列させる。FASTA分析に好ましいパラメーターは、以下のとおりである:ktup=1, ギャップオープニングペナルティ=10, ギャップ伸長ペナルティ=1、および置換マトリクス=BLOSUM62。これらのパラメータは、Appendix 2 of Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)において説明されているように、スコアリングマトリクスファイル(「SMATRIX」)に修飾を施してFASTAプログラムに導入することができる。FASTAは、上記の比率を用いて核酸分子の配列同一性を決定するために用いることもできる。ヌクレオチド配列の比較に関して、ktup値は、1〜6の範囲内であり得、好ましくは3〜6の範囲、最も好ましくは3であり、その他のパラメータは既定値である。
融合タンパク質は、ケモカイン様レセプターポリペプチドアミノ酸配列に対する抗体の作製に、そして様々な検定系での使用に有用である。例えば、融合タンパク質は、ケモカイン様レセプターポリペプチドの一部と相互作用するタンパク質の同定に使用できる。タンパク質親和クロマトグラフィーまたはタンパク質−タンパク質相互作用のためのライブラリーに基づく検定、例えば酵母2−ハイブリッドまたはファージディスプレイ系をこの目的のために使用できる。このような方法は当分野で周知であり、薬物スクリーニングとしても使用できる。
ケモカイン様レセプターポリペプチドのポリヌクレオチド(下記)を使用して他の種、例えばマウス、サル、または酵母由来のcDNA発現ライブラリーをスクリーニングするために好適なプローブまたはプライマーを作製し、ケモカイン様レセプターポリペプチドの相同体をコードしているcDNAを同定し、そして当分野で周知のようにこのcDNAを発現させて、ヒトケモカイン様レセプターポリペプチドの種相同体を得ることができる。
ケモカイン様レセプターポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であってよく、ケモカイン様レセプターポリペプチドのコード配列またはこのコード配列の相補体を含んでいる。ケモカイン様レセプターのコード配列は配列番号1、4および5に示す。
上記のケモカイン様レセプターポリヌクレオチドの変異体および相同体もまたケモカイン様レセプターポリヌクレオチドである。典型的には、ケモカイン様レセプターポリヌクレオチド配列は、当分野で周知のように、ストリンジェントな条件下で候補ポリヌクレオチドを既知のケモカイン様レセプターポリヌクレオチドにハイブリダイズすることにより同定できる。例えば、以下の洗浄条件 -- 2X SSC(0.3M NaCl、0.03Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)、0.1%SDS、室温 2回、各々30分間;次いで2X SSC、0.1%SDS、50℃ 1回、30分間;次いで2X SSC、室温 2回、各々10分間 -- を使用して、最大約25−30%の塩基対ミスマッチを含むホモローガス配列を同定できる。より好ましくは、ホモローガス核酸鎖は15−25%の塩基対ミスマッチを、さらに好ましくは5−15%の塩基対ミスマッチを含む。
Tm=81.5℃−16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)−0.63(%ホルムアミド)−600/l)、
[式中、l=塩基対で表したハイブリッドの長さ]
を用いて算出できる。
ケモカイン様レセプターポリヌクレオチドは、膜構成成分、タンパク質および脂質といった他の細胞成分を含まないよう単離できる。ポリヌクレオチドは細胞から調製でき、標準的核酸精製技術を用いて単離、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のような増幅技術を用いて合成、もしくは自動合成機を用いることによって調製できる。ポリヌクレオチドを単離する方法は常套的であり、当分野で知られている。ポリヌクレオチドを取得するためこのような任意の技術を用いて、単離されたケモカイン様レセプターポリヌクレオチドを得ることができる。例えば、制限レセプターおよびプローブを用いてケモカイン様レセプターヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド断片を単離できる。単離したポリヌクレオチドは、他の分子を少なくとも70、80、または90%含まない調製物である。
PCRに基づく様々な方法を用いて本明細書に開示の核酸配列を伸長させ、プロモーターおよび調節エレメントといった上流配列を検出することができる。例えば制限部位PCRは、既知の座に隣接する未知配列を回収するため、普遍的プライマーを使用する(Sarkar, PCR Methods Applic. 2,318-322,1993)。まず、ゲノムDNAを、リンカー配列に対するプライマーおよび既知領域に対し特異的なプライマーの存在下で増幅する。次に、増幅させた配列を、同じリンカープライマーおよび最初のものの内部にある別の特異的プライマーを用いる第二回目のPCRに付す。各回のPCRの産物を適当なRNAポリメラーゼで転写し、逆転写酵素を用いて配列決定する。
ヒトケモカイン様レセプターポリペプチドは、例えばヒト細胞からの精製によって、ケモカイン様レセプターポリヌクレオチドの発現によって、または直接的化学合成によって取得できる。
ヒトケモカイン様レセプターポリペプチドは、ケモカイン様レセプター発現構築物でトランスフェクトした宿主細胞を包含する、該レセプターを発現する任意のヒト細胞から精製できる。精製されたケモカイン様レセプターポリペプチドは、細胞内のケモカイン様レセプターポリペプチドに通常付随するその他の化合物、例えば或る種のタンパク質、炭水化物、または脂質から、当分野で周知の方法を用いて分離する。このような方法は、サイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム分画、イオン交換クロマトグラフィー、親和クロマトグラフィー、および調製用ゲル電気泳動を包含するが、これらに限定されない。精製ケモカイン様レセプターポリペプチドの調製物は少なくとも80%純粋であり、好ましくは該調製物は90%、95%、または99%純粋である。調製物の純度はSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような当分野で既知の任意の手段によって評価できる。
ケモカイン様レセプターポリヌクレオチドを発現させるため、挿入されたコード配列の転写と発現に必要な要素を含む発現ベクター中にそのポリヌクレオチドを挿入することができる。ケモカイン様レセプターポリペプチドをコードしている配列および適当な転写および翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを組み立てるため、当業者に周知の方法が利用できる。これらの方法には、インビトロ組換えDNA技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えがある。このような技術は、例えばSambrook et al.(1989)およびAusubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York., 1989に記載されている。
細菌系では、ケモカイン様レセプターポリペプチドに対して意図する用途に応じて数多くの発現ベクターを選択できる。例えば、抗体の誘導のため大量のケモカイン様レセプターポリペプチドが必要である場合は、容易に精製できる融合タンパク質の高レベル発現を指令するベクターが使用できる。このようなベクターは、BLUESCRIPT(Stratagene)のような多機能E.coliクローニングおよび発現ベクターを包含するが、これに限定される訳ではない。BLUESCRIPTベクターにおいては、ケモカイン様レセプターポリペプチドをコードしている配列を、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Metとこれに続く7残基の配列と共にフレーム内で該ベクター中にライゲーションすることができ、その結果ハイブリッドタンパク質が産生される。pINベクター(Van Heeke & Schuster, J.Biol.Chem. 264,5503-5509,1989)またはpGEXベクター(Promega, Madison, Wis.)もまた、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)を伴う融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるのに使用できる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、その後遊離グルタチオンの存在下で溶離することにより、溶菌させた細胞から容易に精製できる。このような系で調製したタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または第Xa因子プロテアーゼ開裂部位を含むよう設計でき、その結果、目的とするクローンポリペプチドをGST部分から随意に解放することができる。
植物発現ベクターを使用する場合、ケモカイン様レセプターポリペプチドをコードしている配列の発現は、幾つかのプロモーターのうち任意のものにより駆動できる。例えば、CaMVの35Sおよび19Sプロモーターのようなウイルスプロモーターを、単独で、またはTMV由来のオメガリーダー配列と組み合わせて使用できる(Takamatsu, EMBO J. 6,307-311,1987)。別法として、RUBISCOの小サブユニットのような植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを使用することもできる(Coruzzi et al., EMBO J. 3,1671-1680,1984;Broglie et al., Science 224,838-843,1984;Winter et al., Results Probl.Cell Differ. 17,85-105,1991)。これらの組み立て物は、直接DNA形質転換または病原体仲介トランスフェクションにより植物細胞中に導入できる。このような技術は幾つかの一般に入手可能な総説に記載されている(例えば、HobbsまたはMurray、MCGRAW HILL YEARBOOK OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, McGraw Hill, New York, N.Y., pp191-196,1992)。
ウイルスに基づく多くの発現系を用いて哺乳動物宿主細胞でケモカイン様レセプターポリペプチドを発現させることができる。例えば、発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、ケモカイン様レセプターポリペプチドをコードしている配列は、後期プロモーターおよび3部に分かれたリーダー配列を含むアデノウイルス転写/翻訳複合体中にライゲーションできる。該ウイルスゲノムの非必須E1またはE3領域における挿入を用いて、感染宿主細胞においてケモカイン様レセプターポリペプチドを発現できる生存ウイルスを取得できる(Logan & Shenk, Proc.Natl.Acad.Sci. 81,3655-3659,1984)。所望により、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーのような転写エンハンサーを用いて哺乳動物宿主細胞での発現を増大させることができる。
宿主細胞菌株は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現されたケモカイン様レセプターポリペプチドを所望の方法で処理できる能力を目的として選択できる。該ポリペプチドのこのような修飾には、アセチル化、カルボキシ化、グリコシル化、燐酸化、脂質化、およびアシル化が包含されるがこれらに限定されない。該ポリペプチドの「プレプロ」型を開裂する翻訳後プロセシングもまた、正しい挿入、折り畳み、および/または機能を促進するために使用できる。翻訳後活性のための特異的な細胞機構および特徴的メカニズムを持つ異なる宿主細胞(例えばCHO、HeLa、MDCK、HEK293、1321N1およびWI38)が、American Type Culture Collection(ATCC;10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209)から入手でき、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実とするために選択できる。
マーカー遺伝子発現の存在はケモカイン様レセプターポリヌクレオチドもまた存在することを示唆しているが、その存在と発現は確認する必要がある。例えば、もしケモカイン様レセプターポリペプチドをコードしている配列がマーカー遺伝子配列内部に挿入されるならば、ケモカイン様レセプターポリペプチドをコードしている配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の不在によって同定できる。これに代わり、マーカー遺伝子は、単一のプロモーターの調節下にケモカイン様レセプターポリペプチドをコードしている配列とタンデムに並べて位置させることもできる。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、通常、ケモカイン様レセプターポリヌクレオチドの発現を示す。
ケモカイン様レセプターポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列で形質転換させた宿主細胞は、発現と、細胞培養からのタンパク質の回収に適した条件下で培養できる。形質転換細胞により産生されたポリペプチドは、その配列および/または使用したベクターに応じて分泌されまたは細胞内に貯留され得る。当業者には理解できるであろうが、ケモカイン様レセプターポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核または真核細胞膜を通った可溶性ケモカイン様レセプターポリペプチドの分泌を指令する、または膜結合ケモカイン様レセプターポリペプチドの、膜挿入を指令する、シグナル配列を含むよう設計できる。
ケモカイン様レセプターポリペプチドをコードしている配列は、その全体または一部を、当分野で周知の化学的方法を用いて合成できる(Caruthers et al., Nucl.Acids Res.Symp.Ser. 215-223,1980;Horn et al., Nucl.Acids Res.Symp.Ser. 225-232,1980)。これとは別に、ケモカイン様レセプターポリペプチド自身を、そのアミノ酸配列を合成するための化学的方法、例えば固相技術を用いる直接ペプチド合成を用いて調製できる(Merrifield, J.Am.Chem.Soc. 85,2149-2154,1963;Roberge et al., Science 269,202-204,1995)。タンパク質合成は手動技術またはオートメーションを用いて実施できる。自動化合成は、例えばApplied Biosystems 431Aペプチド合成機(Perkin Elmer)を用いて達成できる。所望により、ケモカイン様レセプターポリペプチドの断片を別々に合成し、化学的方法を用いて合して完全長の分子を調製することもできる。
当業者には理解できるであろうが、天然に存在しないコドンを有するケモカイン様レセプターポリペプチドコード化ヌクレオチドを調製することは有利であり得る。例えば、特定の原核または真核宿主が好むコドンを選択して、タンパク質発現の速度を増大させ、または所望の性質、例えば天然に存在する配列から産み出される転写物の半減期より長い半減期を持つRNA転写物を調製することができる。
当分野で知られているいかなる型の抗体も、ケモカイン様レセプターポリペプチドのエピトープに特異的に結合するよう作製できる。本明細書で使用する「抗体」とは、無傷の免疫グロブリン分子、およびその断片、例えばFab、F(ab')2、およびFvを包含し、これらはケモカイン様レセプターポリペプチドのエピトープに結合できる。典型的には、エピトープを形成するためには少なくとも6、8、10、または12の連続するアミノ酸が必要である。しかしながら、非連続アミノ酸を含むエピトープはより多くの、例えば少なくとも15、25、または50のアミノ酸を必要とするかも知れない。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のDNAまたはRNA配列に対し相補的なヌクレオチド配列である。いったん細胞中に導入されるとこの相補的ヌクレオチドは、該細胞が産生した天然配列と結合して複合体を形成し、転写または翻訳のいずれかを遮断する。好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも11ヌクレオチド長であるが、少なくとも12、15、20、25、30、35、40、45、もしくは50またはそれ以上のヌクレオチド長であってもよい。より長い配列もまた使用できる。アンチセンスオリゴヌクレオチド分子をDNA組み立て物に提供し、上記のように細胞中に導入して、その細胞におけるケモカイン様レセプター遺伝子産物のレベルを低下させることができる。
リボザイムは触媒活性を有するRNA分子である。例えば、Cech, Science 236,1532-1539; 1987; Cech, Ann.Rev.Biochem. 59,543-568; 1990, Cech, Curr.Opin.Struct.Biol. 2,605-609; 1992, Couture & Stinchcomb, Trends Genet. 12,510-515, 1996を参照されたい。当分野で知られるように、リボザイムは、RNA配列を開裂することにより遺伝子機能を阻害するのに使用できる(例えば、Haseloff et al., 米国特許5641673)。リボザイムの作用機構は、相補的標的RNAに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後のendonucleolyticな開裂を含む。例には、特異的ヌクレオチド配列のendonucleolyticな開裂を特異的且つ効果的に触媒できる、設計されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子がある。
遺伝子産物がヒトケモカイン様レセプターポリペプチドと相互作用する遺伝子の同定方法をここに記載する。このような遺伝子は、HIV感染、心臓血管障害、喘息およびCOPDを包含する(但しこれらに限定されない)疾患において区別して(区別的に)発現される遺伝子を表し得る。さらに、係る遺伝子は、このような疾患の進行または治療に関連する操作に応答して区別的に調節される遺伝子を表し得る。加えて、このような遺伝子は、組織または生物の発生の異なる段階で増大または低下する、一時的に調節される発現を示すことができる。区別的に発現される遺伝子はまた、その発現を、対照対実験条件の下で調節させることができる。さらに、ヒトケモカイン様レセプターポリペプチド遺伝子または遺伝子産物は、これ自体区別的発現について試験できる。
区別的に発現される遺伝子を同定するためには、目的とする組織から全RNA、または好ましくはmRNAを単離する。例えば、RNA試料は、実験対象の組織から、そして対照となる対象の対応組織から取得する。mRNAの単離に対して不利に選択しない任意のRNA単離技術を、係るRNA試料の精製に利用できる。例えば、Ausubel et al., ed., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc. New York, 1987-1993を参照されたい。当業者に周知の技術、例えばChomczynski、米国特許4843155の一段階RNA単離プロセスを用いて多数の組織試料を容易に処理することができる。
本発明は、ケモカイン様レセプターポリペプチドまたはケモカイン様レセプターポリヌクレオチドに結合する、またはその活性を調節する、被験化合物をスクリーニングするための検定を提供する。被験化合物は好ましくはケモカイン様レセプターポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する。より好ましくは、被験化合物は、ヒトケモカイン様を、被験化合物の不在時と比較して少なくとも約10、好ましくは約50、より好ましくは約75、90、または100%低下または増大させる。
被験化合物は当分野で既知の薬理学的物質であってよく、または薬理活性を持っていることが前もって分かっていない化合物であってよい。この化合物は天然に存在する、または実験室で設計されたものであってよい。これらは、微生物、動物、または植物から単離されたものであってよく、そして組換え的に調製され、または当分野で既知の化学的方法により合成されたものであってよい。所望により被験化合物は、生物学的ライブラリー、空間的アドレス特定可能な並行固相または液相ライブラリー、デコンボルーションを要する合成ライブラリー法、「一ビーズ一化合物」ライブラリー法、および親和クロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を包含する(但しこれらに限定される訳ではない)当分野で既知の数多くの組み合わせライブラリー法のいずれかを用いて取得できる。生物学的ライブラリーアプローチはポリペプチドライブラリーに限定されているが、他の4種のアプローチはポリペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用できる。Lam, Anticancer Drug Des. 12,145,1997を参照されたい。
被験化合物は、高(ハイ)スループットスクリーニングを用いて、ケモカイン様レセプターポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する能力、またはケモカイン様レセプタータンパク質活性もしくはケモカイン様レセプター遺伝子発現に影響を及ぼす能力についてスクリーニングできる。ハイスループットスクリーニングを使用して、多くの個別的化合物を並行して試験でき、その結果多数の被験化合物を迅速にスクリーニングできる。最も広範に確立されている技術は96ウェル微量定量プレートを利用するものである。この微量定量プレートのウェルは、典型的には50ないし500μlの範囲の検定容量を必要とする。このプレートに加えて、96ウェルフォーマットに適合させた多くの機器、材料、ピペット、ロボット、プレート洗浄機、およびプレート読み取り機が市販されている。
結合検定については、被験化合物は好ましくは、例えばケモカイン様レセプターポリペプチドの活性部位に結合してこれを占有し、それにより基質がリガンド結合部位に接近できなくさせ、その結果正常な生物活性が妨げられるような小分子またはペプチド様分子である。このような小分子の例は小ペプチドまたはペプチド様分子を包含するが、これらに限定される訳ではない。
ケモカインポリペプチドの生物学的効果を増大または低下させる能力について被験化合物を試験できる。そのような生物学的効果は、下記の具体的実施例に記載の機能検定を用いて測定できる。機能検定は、精製したケモカイン様レセプターポリペプチド、細胞膜調製物、または無傷の細胞を被験化合物と接触させた後に実施できる。ケモカインの機能的活性を少なくとも約10、好ましくは約50、より好ましくは約75、90、または100%低下させる被験化合物を、ケモカインを減少させる可能性ある物質として同定する。ケモカイン活性を少なくとも約10、好ましくは約50、より好ましくは約75、90、または100%増大させる被験化合物を、ケモカインを増大させる可能性ある物質として同定する。
別の態様では、ケモカイン様レセプタータンパク質遺伝子の発現を増大または減少させる被験化合物を同定する。ケモカイン様レセプターポリヌクレオチドを被験化合物と接触させ、RNAまたはケモカイン様レセプターポリヌクレオチドのポリペプチド産物の発現を測定する。被験化合物存在下での適当なmRNAまたはポリペプチドの発現レベルを、該被験化合物不在下でのmRNAまたはポリペプチドの発現レベルと比較する。すると被験化合物が、この比較に基づく発現のモジュレーターとして同定できる。例えば、mRNAまたはポリペプチドの発現が、被験化合物の不在時よりも存在時により大きい場合は、この被験化合物を、該mRNAまたはポリペプチド発現の刺激物質または増強物質と同定する。そうではなく、mRNAまたはポリペプチドの発現が、被験化合物の不在時よりも存在時により小さい場合は、この被験化合物を、該mRNAまたはポリペプチド発現のインヒビターと同定する。
本発明はさらに、治療効果を達成するために患者に投与できる医薬組成物を提供する。本発明に係る医薬組成物は、例えばケモカイン様レセプターポリペプチド、ケモカイン様レセプターポリヌクレオチド、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ケモカイン様レセプターポリペプチドに特異的に結合する抗体、または類似体、アゴニスト、アンタゴニスト、またはケモカイン様レセプターポリペプチド活性のインヒビターを含み得る。この組成物は単独で、または少なくとも1種類の他の物質、例えば安定化化合物と組み合わせて投与でき、これは、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、および水を包含する(但しこれらに限定されない)任意の無菌で生物学的適合性のある製薬的担体中で投与できる。この組成物は単独で、または他の物質、薬物またはホルモンと組み合わせて患者に投与できる。
ヒトケモカイン様レセプターを調節して、HIV感染、心臓血管疾患、喘息およびCOPDを処置することができる。
治療的有効量の決定は、充分当業者の能力の範囲内にある。治療的有効量とは、治療的有効量の不在下で起こるケモカイン様レセプター活性に比較してケモカイン様レセプター活性を増大させ、または低下させる活性成分の量を指す。
ヒトケモカイン様レセプターはさらに、このレセプターをコードしている核酸配列における突然変異の存在に関連する疾病および異常、または疾病および異常に対する感受性を検出する診断検定に使用できる。例えば、疾病に罹患している個体と正常な個体とにおけるケモカイン様レセプターをコードしているcDNAまたはゲノム配列の間の相違を決定できる。もし罹患している個体の幾つかまたは全てに突然変異が観察され、正常な個体には観察されないならば、この突然変異がその疾病の原因であると思われる。
ケモカイン様レセプター活性の検出
配列番号1に記載のポリヌクレオチドを発現ベクターpCEV4に挿入し、得られた発現ベクターpCEV4−ケモカイン様レセプターポリペプチドをヒト胚の腎臓293細胞にトランスフェクトする。これらの細胞から溶解物を得、1000rpm、5分間の遠心を4℃にて行う。その上清を30,000×g、4℃で20分間遠心分離する。そのペレットを、50mM トリスHCl、5mM MgSO4、1mM EDTA、100mM NaClを含み、0.1% BSA、2μg/mlアプロチニン、0.5mg/mLロイペプチンおよび10μg/mLホスホラミドンを添加した結合バッファー(pH7.5)中に懸濁する。添加する放射性リガンド、即ちケモカインの10%未満と結合するのに必要とされるタンパク質濃度で規定される最適な膜懸濁希釈液を、リガンド、非標識化ペプチド、および結合バッファーを含む96ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレートに添加し、最終量を250μLとする。
組換えヒトケモカイン様レセプターの発現
ピキア パストリス(Pichia pastoris)発現ベクターpPICZB(Invitrogen, San Diego, CA) を用いて、大量の組換えヒトケモカイン様ポリペプチドを酵母中に生産させる。ヒトP2Y1様GPCRコード化DNA配列は配列番号1、4または5に示されるヌクレオチド配列から誘導する。ベクターpPICZB中に挿入する前に、DNA配列を、その5'端に開始コドン、及び3'端にエンテロキナーゼ開列部位、His6レポータータグや終止コドンを含ませるといった周知の方法によって修飾する。さらに、その両末端に制限エンドヌクレアーゼの認識配列を加え、対応する制限酵素を用いてpPICZBのマルチクローニングサイトを消化した後に、修飾ポリペプチドをコードするDNA配列をpPICZB中にライゲートする。この発現ベクターを、ピキア パストリスにて発現が酵母プロモーターにより誘導される誘導性発現用に設計する。得られたpPICZ/md−His6ベクターを用いて、酵母を形質転換する。
ケモカイン様レセプターポリペプチドと結合する被験化合物の同定
グルタチオン−S−トランスフェラーゼタンパク質を含み96ウェル マイクロタイタープレートのグルタチオン誘導化ウェルに吸着した精製ケモカイン様レセプターポリペプチドを、生理緩衝溶液pH7.0の小分子ライブラリー由来の被験化合物と接触させる。ケモカイン様レセプターポリペプチドは、配列番号2、7または8に示すアミノ酸配列を含む。被験化合物は蛍光標識を含む。この試料を5分間〜1時間インキュベートする。コントロール試料は、被験化合物の非存在下にてインキュベートする。
ケモカイン様レセプター遺伝子発現を低下させる被験化合物の同定
被験化合物を、ケモカイン様レセプター発現構築物でトランスフェクトしたヒト培養細胞に投与し、37℃で10〜45分間インキュベートする。トランスフェクトしなかった同じタイプの細胞培養を、被験化合物なして同じ時間インキュベートし、ネガティブコントロールとする。
ケモカイン様レセプター活性を低下させる被験化合物の同定
被験化合物を、ケモカイン様レセプター発現構築物でトランスフェクトしたヒト培養細胞に投与し、37℃で10〜45分間インキュベートする。トランスフェクトしなかった同じタイプの細胞培養を、被験化合物なして同じ時間インキュベートし、ネガティブコントロールとする。ケモカインレセプター活性は、米国特許第5,955,303号の方法を用いて測定する。ケモカイン様レセプターのケモカイン活性を試験化合物非存在下でのケモカイン活性と比べて減少させる試験化合物を、ケモカイン様レセプター活性のインヒビターとして同定する。
ケモカインレセプター様タンパク質の組織特異的発現
ケモカインレセプター様タンパク質がCOPDの疾患過程に関与することを実証するために、初期発現パネルはCOPDに関連する呼吸器組織及び炎症細胞由来のRNA試料からなる:肺(成人及び胎児)、気管、新たに単離された肺胞型II細胞、培養されたヒト気管支上皮細胞、培養された小気道上皮細胞、培養された気管支平滑筋細胞、培養されたH441細胞(Clara様)、新たに単離された好中球及び単球、並びに培養された単球(マクロファージ様)。また、Clontechから購入した全RNAパネルを用いてボディマッププロファイリングも行う。組織は、副腎腺、骨髄、脳、大腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、乳腺、膵臓、唾液腺、骨格筋、小腸、脾臓、胃、精巣、胸腺、気管、甲状腺及び子宮である。
RNA抽出およびcDNA調製。上記の組織から得た全RNAを発現の定量化に使用する。「剖検から得た」標識RNAを、TRIzol試薬(Life Technologies, MD)を用い、製造元のプロトコルにしたがって、剖検組織から抽出した。
新規ヒトケモカインレセプター様mRNAの定量的発現プロファイル
発現プロファイリングは定量ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)分析、または動的(キネティクス)分析とも称される分析(最初にHiguchiら,1992、およびHiguchiら,1993によって記載された)に基づく。重要なことは、PCR対数期の任意のサイクルにおいて、産生物量が最初の鋳型のコピー数に比例していることである。この技術を用いることで、染色体からメッセンジャーRNA(mRNA)として転写される特定の遺伝子の発現レベルを、最初にDNAコピー(cDNA)をmRNAから作製した後に、そのcDNAについて定量PCRを行なう、定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(定量RT−PCR)と称される方法で測定する。
Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S. and Griffith, R. (1992) Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. BioTechnology 10:413-417.
Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G. and Watson, R. (1993) Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. BioTechnology 11:1026-1030.
T.B. Morrison, J.J. Weis & C.T. Wittwer .(1998) Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification. Biotechniques 24:954962.
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Liew, C. C., Hwang, D. M., Fung, Y. W., Laurenson, C., Cukerman, E., Tsui, S. & Lee, C. Y. (1994) A catalog of genes in the cardiovascular system as identified by expressed sequence tags. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1014510649.
ヒトケモカインレセプター様mRNAに特異的に結合する試薬による患者の処置
配列番号1の相補物より選択される少なくとも11個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの合成は、ホスホラミダイト手順を用いるPharmacia Gene Assembler series synthesizerにて実施する(Uhlmannら、Chem. Rev. 90, 534-83, 1990を参照のこと)。アセンブリーおよび脱保護に続き、オリゴヌクレオチドを2度エタノール沈殿させ、乾燥させ、そしてリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に所望の濃度に懸濁する。これらのオリゴヌクレオチドの純度は、キャピラリーゲル電気泳動及びイオン交換HPLCにより試験する。オリゴヌクレオチド調製のエンドトキシンレベルは、リムルスアメーバ様検定(Limulus Amebocyte Assay)(Bang, Biol. Bull. (Woods Hole, Mass.) 105, 361-362, 1953) を用いて決定する。
喘息処置のための化合物/標的確認の in vivo 試験
1.T細胞の活性に関する試験
共刺激分子−サイトカイン、サイトカインレセプター、シグナル伝達分子、T細胞活性化に関与する任意の分子
マウス抗CD3誘導サイトカイン産生モデル
BALB/c マウスに10μgの145-2C11 (精製したハムスター抗マウスCD3εモノクローナル抗体、PHARMINGEN)を1回静脈注射した。抗CD3 mAb注射の60分前に化合物を腹腔内注射した。血液を抗体注射の90分後に採取した。血清を3000 r.p.m、10分の遠心により得た。血清中のIL-2およびIL-4のレベルをELISAにより測定した。
B細胞レセプター−シグナル伝達分子、B細胞活性化/Igクラススィッチングに関与する任意の分子
マウス抗IgD誘導IgE産生モデル
BALB/cマウスに0.8mgの精製したヤギ抗マウスIgD抗体またはPBSを静脈注射した(0日目と定義)。化合物を0〜6日目までの間腹腔内投与した。7日目に血液を集め、血清を3000 r.p.m、10分の遠心により得た。IgE血清総レベルをヤマサELISAキットにより測定し、そのIgサブタイプをIgELISAキットにより測定した(Rougier Bio-tech's, Montreal, Canada)。
マウスLPS−誘導TNF−α産生モデル
BALB/cマウスにLPS (200μg/マウス)を腹腔内投与した。化合物をLPS注射の1時間前に投与した。LPS注射から90分後に血液を集め、血漿を得た。サンプル中のTNF−α濃度をELISAキットを用いて測定した。
エオタキシン−エオタキシンレセプター(GPCR)
シグナル伝達分子、細胞骨格分子、接着分子
マウスエオタキシン誘導好酸球モデル
BALB/c マウスに2.5mLの空気を−6および−3に日目に皮内注射し、airpouchを作製した。0日目に、エオタキシン注射(3μg/マウス、i.d.)の60分間前に化合物を投与した。IL-5 (300 ng/マウス)をエオタキシン注射の30分間前に静脈内注射した。エオタキシン注射の4時間後、滲出液中の白血球を集め、細胞の総数を計測した。滲出液における識別的細胞計数をMay-Grunwald Gimsa溶液で染色することにより行った。
抗原提示に関与する分子、共刺激分子、シグナル伝達分子、転写因子に関与する分子
マウスD10細胞移動モデル
生理食塩水中に2mgの粗アルブミンを含むD10.G4.1細胞 (1×107 細胞/マウス)をAKRマウスに静脈内投与した。6時間後に血液を集め、3000 r.p.m.10分の遠心により血清を得た。血清中のIL-4およびL-5レベルをELISAキットにより測定した。これら細胞の注射の、4時間目および+1時間目に化合物を腹腔内投与した。
6週齢の雄性 Wistarラットの剃毛した背中に対し、弱い麻酔下で、0.1μg/mLマウス抗DNP IgEモノクローナル抗体(SPE-7)50μLで皮内(i.d.)感作した。24時間後、このラットに対し、0.6 mgのDNP-BSA (30) (LSL CO., LTD) および0.005gのEvansブルーを含有する生理食塩水1mLを静脈内投与により抗原投与した。抗原注射の0.5時間前に化合物を腹腔内 (i.p.)投与した。ブランク(対照)として、感作、抗原投与および化合物処置を行わないラットを用いて、阻害なしの値を測定する。抗原投与の30分後に、ラットを殺し、背中の皮膚を剥がした。皮膚のEvansブルー染料をホルムアルデヒド中63℃にて一晩抽出する。次いで、620nmでの吸光度を測定し、漏れ出た染料の光学密度を求める。
化合物によるPCAの阻害の百分率を以下のようにして計算する:
%阻害={(平均のビークル値−サンプル値)/(平均ビークル値−平均対照値)}×100
6週齢の雄性 Wistarラットに対し、10μgマウス抗DNP IgE、SPE-7で静脈内(i.v.)感作し、1日後に、ラットに対し、1.5mgDNP−BSA(30)を含有する0.3mLの生理食塩水を、ウレタン(1000mg/kg、i.p.)およびガラミン(50mg/kg、i.v.)による軽い麻酔下で静脈内投与により抗原投与した。
圧力変換器につないだカニューレのサイドアームを介して最大吸気圧(PIP)を記録する。PIPの変化は、肺の抵抗とコンプライアンスの両方の変化を反映する。薬物を評価するために、各薬物を抗原投与の5分前にi.v.投与する。
Claims (71)
- ケモカイン様レセプターポリペプチドをコードしている単離されたポリヌクレオチドであって、
a) 配列番号2に示すアミノ酸配列と少なくとも約26%同一なアミノ酸配列;
配列番号2に示すアミノ酸配列;
配列番号7に示すアミノ酸配列と少なくとも約26%同一なアミノ酸配列;
配列番号7に示すアミノ酸配列;
配列番号8に示すアミノ酸配列と少なくとも約26%同一なアミノ酸配列;
配列番号8に示すアミノ酸配列
より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むケモカイン様レセプターポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド;
b)配列番号1、4、5または9で示される配列を含むポリヌクレオチド;
c)(a)および(b)に明記したポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
d)遺伝コードの縮重のため、その配列が(a)から(c)に明記するポリヌクレオチド配列から逸脱している配列のポリヌクレオチド;および、
e)(a)から(d)に明記したポリヌクレオチド配列の断片、誘導体またはアレル変異を表すポリヌクレオチド、
より成る群から選ばれるポリヌクレオチド。 - 請求項1に記載の任意のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項2に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドによりコードされている、実質上精製されたケモカイン様レセプターポリペプチド。
- 以下の工程:
a)請求項3に記載の宿主細胞を、ケモカイン様レセプターポリペプチドの発現に好適な条件下で培養し;そして、
b)ケモカイン様レセプターポリペプチドを宿主細胞培養から回収する、
を含む、ケモカイン様レセプターポリペプチドを調製する方法。 - 以下の工程:
a)請求項1に記載の任意のポリヌクレオチドを生体試料の核酸材料とハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成し;そして、
b)該ハイブリダイゼーション複合体を検出する、
を含む、生体試料中の、ケモカイン様レセプターポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを検出するための方法。 - ハイブリダイゼーションの前に、生体試料の核酸材料を増幅させる、請求項6に記載の方法。
- 生体試料を、請求項1に記載のポリヌクレオチドまたは請求項4に記載のケモカイン様レセプターポリペプチドと特異的に相互作用する試薬と接触させる工程、
を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチドまたは請求項4に記載のケモカイン様レセプターポリペプチドを検出するための方法。 - 請求項6から8までのいずれかに記載の方法を実施するための診断キット。
- 被験化合物を、請求項1に記載の任意のポリヌクレオチドによりコードされる任意のケモカイン様レセプターポリペプチドと接触させ;
ケモカイン様レセプターポリペプチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含む、ケモカイン様レセプターの活性を低下させる物質をスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドに結合する被験化合物を、ケモカイン様レセプターの活性を低下させる可能性ある治療物質として同定する方法。 - 被験化合物を、請求項1に記載の任意のポリヌクレオチドによりコードされるケモカイン様レセプターポリペプチドと接触させ;そして、
該ポリペプチドのケモカイン様レセプター活性を検出する工程、
を含む、ケモカイン様レセプターの活性を調節する物質をスクリーニングする方法であって、ケモカイン様レセプター活性を増大させる被験化合物を、ケモカイン様レセプターの活性を増大させる可能性ある治療物質として同定し、そして該ポリペプチドのケモカイン様レセプター活性を低下させる被験化合物を、ケモカイン様レセプターの活性を低下させる可能性ある治療物質として同定する方法。 - 被験化合物を、請求項1に記載の任意のポリヌクレオチドと接触させ;そして、
該ポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含む、ケモカイン様レセプターの活性を低下させる物質をスクリーニングする方法であって、該ポリヌクレオチドに結合する被験化合物を、ケモカイン様レセプターの活性を低下させる可能性ある治療物質として同定する方法。 - 細胞を、請求項1に記載の任意のポリヌクレオチドまたは請求項4に記載の任意のケモカイン様レセプターポリペプチドに特異的に結合する試薬と接触させ、それによりケモカイン様レセプターの活性を減少させる工程、
を含む、ケモカイン様レセプターの活性を減少させる方法。 - 請求項10から12のいずれかに記載の方法によって同定される、ケモカイン様レセプターポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を調節する試薬。
- 請求項2に記載の発現ベクターまたは請求項14に記載の試薬および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
- 疾患におけるケモカイン様レセプターの活性を調節するための医薬の製造における、請求項2に記載の発現ベクターまたは請求項14に記載の試薬の使用。
- 疾患がHIV感染、心臓血管疾患、喘息またはCOPDである、請求項16に記載の使用。
- 配列番号2、7または8に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているcDNA。
- 配列番号1、4、5または9を含む請求項18に記載のcDNA。
- 配列番号1、4、5または9より成る請求項18に記載のcDNA。
- 配列番号2、7または8に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 該ポリヌクレオチドが配列番号1、4、5または9より成る、請求項21に記載の発現ベクター。
- 配列番号2、7または8に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている発現ベクターを含む宿主細胞。
- 該ポリヌクレオチドが配列番号1、4、5または9より成る、請求項23に記載の宿主細胞。
- 配列番号2、7または8に示すアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド。
- 配列番号2、7または8に示すアミノ酸配列より成る請求項25に記載の精製されたポリペプチド。
- 配列番号2、7または8に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む融合タンパク質。
- 配列番号2、7または8に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを調製する方法であって、該ポリペプチドをコードしている発現ベクターを含む宿主細胞を、該ポリペプチドが発現される条件下で培養し;そして該ポリペプチドを単離する工程を含む方法。
- 発現ベクターが配列番号1、4、5または9を含む、請求項28に記載の方法。
- 配列番号1、4、5または9に記載の11個の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを生体試料の核酸材料とハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成し;そして、
該ハイブリダイゼーション複合体を検出する、
工程を含む、配列番号2、7または8に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドのコード配列を検出する方法。 - ハイブリダイズする工程の前に核酸材料を増幅する工程をさらに含む、請求項30に記載の方法。
- 配列番号1、4、5または9に記載の11個の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド;および、請求項30に記載の方法のための使用説明書、
を含む、配列番号2、7または8に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドのコード配列を検出するためのキット。 - 配列番号2、7または8に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出する方法であって、生体試料を該ポリペプチドに特異的に結合する試薬と接触させて試薬−ポリペプチド複合体を形成し;そして、この試薬−ポリペプチド複合体を検出する工程を含む方法。
- 該試薬が抗体である、請求項33に記載の方法。
- 配列番号2、7または8に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出するためのキットであって、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体;および、
請求項33に記載の方法のための使用説明書、を含むキット。 - 被験化合物を、(1)配列番号2、7または8に示すアミノ酸配列と少なくとも約26%一致するアミノ酸配列、および(2)配列番号2、7または8に示すアミノ酸配列、より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させ;そして、
該ポリペプチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含む、ケモカイン様レセプタータンパク質の活性を調節できる物質をスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドに結合する被験化合物をケモカイン様レセプタータンパク質の活性を調節する可能性ある物質と同定する方法。 - 接触させる工程が細胞内においてである、請求項36に記載の方法。
- 細胞がインビトロである、請求項36に記載の方法。
- 接触させる工程が無細胞系においてである、請求項36に記載の方法。
- 該ポリペプチドが検出可能な標識を含む、請求項36に記載の方法。
- 被験化合物が検出可能な標識を含む、請求項36に記載の方法。
- 被験化合物が該ポリペプチドに結合している標識リガンドに取って代わる、請求項36に記載の方法。
- 該ポリペプチドが固体支持体に結合している、請求項36に記載の方法。
- 被験化合物が固体支持体に結合している、請求項36に記載の方法。
- 被験化合物を、(1)配列番号2、7または8に示すアミノ酸配列と少なくとも約26%一致するアミノ酸配列、および(2)配列番号2、7または8に示すアミノ酸配列、より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させ;そして、
該ポリペプチドの活性を検出する工程、
を含む、ヒトケモカイン様レセプタータンパク質の活性を調節する物質をスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドの活性を増大させる被験化合物を、ヒトケモカイン様レセプタータンパク質の活性を増大させる可能性ある物質として同定し、そして該ポリペプチドの活性を低下させる被験化合物を、ヒトケモカイン様レセプタータンパク質の活性を低下させる可能性ある物質として同定する方法。 - 接触させる工程が細胞においてである、請求項45に記載の方法。
- 細胞がインビトロである、請求項45に記載の方法。
- 接触させる工程が無細胞系においてである、請求項45に記載の方法。
- 被験化合物を、配列番号1、4、5または9に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされている産物と接触させ;そして、
該産物に対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含む、ヒトケモカイン様レセプタータンパク質の活性を調節する物質をスクリーニングする方法であって、該産物に結合する被験化合物をヒトケモカイン様レセプタータンパク質の活性を調節する可能性ある物質として同定する方法。 - 該産物がポリペプチドである、請求項49に記載の方法。
- 該産物がRNAである、請求項49に記載の方法。
- 細胞を、配列番号1、4、5または9に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされている産物に特異的に結合する試薬と接触させ、それによりヒトケモカイン様レセプタータンパク質の活性を減少させる工程、
を含む、ヒトケモカイン様レセプタータンパク質の活性を減少させる方法。 - 該産物がポリペプチドである、請求項52に記載の方法。
- 該試薬が抗体である、請求項53に記載の方法。
- 該産物がRNAである、請求項52に記載の方法。
- 該試薬がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項55に記載の方法。
- 該試薬がリボザイムである、請求項56に記載の方法。
- 細胞がインビトロである、請求項52に記載の方法。
- 細胞がインビボである、請求項52に記載の方法。
- 配列番号2、7または8に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する試薬;および、製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
- 該試薬が抗体である、請求項60に記載の医薬組成物。
- 配列番号1、4、5または9に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの産物に特異的に結合する試薬;および、製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
- 該試薬がリボザイムである、請求項62に記載の医薬組成物。
- 該試薬がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項62に記載の医薬組成物。
- 該試薬が抗体である、請求項62に記載の医薬組成物。
- 配列番号2、7または8に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている発現ベクター;および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
- 発現ベクターが配列番号1、4、5または9を含む、請求項66に記載の医薬組成物。
- ヒトケモカイン様レセプタータンパク質の機能を調節する試薬の治療的有効量をそれを必要とする患者に投与し、それによりケモカイン様レセプター機能不全に関連する疾患の症状を改善する工程を含む、ケモカイン様レセプター機能不全に関連する疾患を処置する方法。
- 該試薬が請求項36に記載の方法によって同定される、請求項68に記載の方法。
- 該試薬が請求項45に記載の方法によって同定される、請求項68に記載の方法。
- 該試薬が請求項49に記載の方法によって同定される、請求項68に記載の方法。
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