JP2001506843A

JP2001506843A - ヒト蛋白質キナーゼ

Info

Publication number: JP2001506843A
Application number: JP51377698A
Authority: JP
Inventors: オウ―ヤング、ジャニス; ゲグラー、カール・ジェイ; ホーキンス、フィリップ・アール
Original assignee: Incyte Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Incyte Corp
Priority date: 1996-09-12
Filing date: 1997-09-10
Publication date: 2001-05-29
Also published as: US20020042114A1; US6232077B1; CA2264541A1; US5863780A; EP0927257A2; US6045792A; AU4261197A; WO1998011234A3; WO1998011234A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、新規なヒト蛋白質キナーゼ（ＨＰＫ）及びＨＰＫを同定し、かつコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明は、ＨＰＫをコードする核酸配列からなる遺伝子組換え発現ベクタ及び宿主細胞のために提供する。また本発明は、ＨＰＫ或いはＨＰＫの拮抗体からなる医薬品組成物及び特にＨＰＫを結合する抗体を提供する。さらに本発明は、ＨＰＫの異常な発現に関連する疾患の治療及び予防のためにＨＰＫに対するアンチセンス分子を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト蛋白質キナーゼ技術分野本発明は新規のヒト蛋白質キナーゼの核酸配列及びアミノ酸配列に関するものであり、かつ疾患の診断、研究、予防並びに治療における本発明の使用方法に関するものである。背景技術キナーゼは、リン酸塩基を蛋白質に加えることにより種々の細胞増殖、細胞分化並びに情報伝達処理を調節する。非管理状態の情報伝達は、炎症、癌、動脈硬化症並びに乾癬を含む種々の疾患条件に影響を受けている。真核細胞の活性化を調節するための主な方策として、可逆的蛋白質リン酸化がある。典型的な咄乳動物細胞において活性状態にある１００００個の蛋白質の１０００個を超える数がリン酸化される。活性化状態に至らせる高エネルギーリン酸塩は一般に、蛋白質キナーゼによりアデノシン三リン酸分子（ＡＴＰ）からある特定の蛋白質に伝達され、蛋白質フォスファターゼによりその蛋白質から除去される。リン酸化は、細胞外シグナル（ホルモン、神経伝達物質、成長並びに分化因子等）、細胞周期チェックポイント並びに環境性或いは栄養性ストレスに応じて生じ、概ね分子スイッチをオンすることに類似する。スイッチをオンするとき、適当な蛋白質キナーゼが、代謝酵素、調節蛋白質、受容体、細胞骨格蛋白質、イオンチャネル或いはポンプ、或いは転写因子を活性化する。キナーゼは、最大の既知の蛋白質グループ、すなわち幅広く変化する機能及び特異性を有するスーパーファミリーの酵素である。それらは通常、基質、調節分子或いはいくつかの態様の突然変異体表現型から命名される。大部分のキナーゼは類似の２５０−３００アミノ基と触媒作用領域とを備える。Ｎ末端領域は、サブドメインＩ−ＩＶを備え、一般にＡＴＰ（或いはＧＴＰ）供与体分子を結合し、かつ適応させる二葉状構造体に折り重なる。より大きさＣ末端葉部は、サブドメインＶＩＡ−ＸＩを備え、蛋白質基質を結合し、ＡＴＰからセリン、スレオニン或いはチロシン残基までγリン酸塩を伝達する。サブドメインＶは２つの葉状部に及ぶ。キナーゼは、キナーゼ領域の側部に位置するか、或いはその領域のループ内に挿入される種々のアミノ酸配列（概ね５〜１００残基）によりフアミリーに類別される。キナーゼが標的蛋白質を認知し、かつ相互作用するとき、これらの付加されたアミノ酸配列により各キナーゼを調節することができる。キナーゼ領域の主な構造は保存され、さらに１１のサブドメインに分割されるようになる。１１のサブドメインの各々は、そのサブドメインの特徴をなす特定の残基及びアミノ基のモチーフ或いはパターンを有し、大部分保存される（Hardie G and Hanks S （1995）The Protein Kinase Facts Books,I and II,Academic Press,San Diego CA）。第２のメッセンジャ依存蛋白質キナーゼは主に、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、サイクリックＧＭＰ、イノシトール三リン酸、ホスファチジルイノシトール、３，４，５−三リン酸、サイクリックＡＤＰリボース、アラキドン酸並びにジアシルグリセロールのような第２のメッセンジャの効果を伝達する。サイクリックＡＭＰは、研究されている全ての原核及び動物細胞においてホルモン活性の細胞内メディエータである。そのようなホルモン誘発型の細胞反応は、甲状腺ホルモン分泌、コルチゾール分泌、プロゲストロン分泌、グリコーゲン破壊、骨再吸収、並びに心拍数の調節及び心筋収縮の力を含む。サイクリックＡＭＰ依存蛋白質キナーゼ（ＰＫＡ）は、全ての動物細胞において見出され、これらの細胞の大部分においてサイクリックＡＭＰの全ての効果の原因となる。非活性状態では、Ａ−キナーゼは、２つの触媒作用サブユニット及び２つの調節サブユニットの複合体からなる。各調節サブユニットがｃＡＭＰの２つ分子と結合しているとき、触媒作用サブユニットは活性化され、高エネルギーリン酸塩をＡＴＰから基質蛋白質のセリン或いはスレオニンまで伝達する。修正ＰＫＡ発現は、甲状腺障害、糖尿病、動脈硬化症並びに心臓血管性疾患を含む種々の障害及び疾患に影響される（Isse lbacher KJ et al（1994）Harrison's Principles of Internal Medicine,McGra w-Hill,New York City）。蛋白質キナーゼＣ（ＰＫＣ）は、水溶性のＣａ^--依存キナーゼであり、通常脳組織において見出され、Ｃａ^--イオンの存在時に原形質膜に移動する。ＰＫＣのアイソフォームの概ね半分がジアシルグリセロール及びホスファチジルセリンにより最初に活性化される。ＰＫＣの持続性活性化は、ホスホリパーゼがホスファチジルコリンを切断する際に形成されるジアシルグリセロール分子の持続的な生成に依存する。神経細胞では、ＰＫＣがイオンチャネルをリン酸化し、細胞膜の興奮性を修正する。他の細胞では、ＰＫＣの活性化は、調節エレメントを活性化する蛋白質キナーゼカスケードを誘発するか、調節蛋白質の阻害剤をリン酸化し、かつ非活性化するかのいずれかにより、遺伝子転写を増加する。ＰＫＣ活性化は、癌（O'Brian CA et al(1995)Prog Clin Biol Res 391:117-120）、腫瘍プロモーション（O'Brian CA and Ward NE(1989)Cancer Metast Rev 8:199-214）、記憶障害（Saito N．et al（1994）Brain Res 656:245-256）、並びに自己免疫疾患(Ohkusu K et al(1995)Eur J Immunol 25:3180-3186)における多剤耐性に特に関連している。キナーゼ経路及びシグナル伝達の詳細に理解することは、炎症性疾患及び非管理状態下の細胞増殖の進行に介在するいくつかのメカニズムを明らかにすることから始まる。それらをコードする新規のキナーゼポリヌクレオチド及びそれらに対する抗体は、種々の細胞及び組織内の情報伝達カスケードを研究したり、疾患を診断したり、或いは修正キナーゼ発現が影響を受ける種々の障害或いは疾患に介在する潜在性を有する阻害剤或いは薬剤を選択するための複数の手段を実現することにより当技術分野における必要性を満足する。発明の開示本発明は、他の蛋白質キナーゼと相同性を有することを特徴とする３つの新規のヒト蛋白質キナーゼ（ここでは個別にＨＰＫ１、ＨＰＫ２並びにＨＰＫ３と呼び、集合的にはＨＰＫと呼ぶ）に向けられる。従って、本発明は、配列番号：１、３並びに５のアミノ酸配列或いはそのフラグメントからなり、蛋白質キナーゼファミリーメンバーの機能的な特徴を有する実質的に精製されたＨＰＫを特徴とする。本発明の１つの態様は、ＨＰＫの全部或いは一部をコードする分離したポリヌクレオチドを特徴とする。ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは配列番号：２、４並びに６において知られるヌクレオチド配列である。またそのようなポリヌクレオチドを含むベクタ及びそのようなベクタを用いて形質転換及び形質移入される宿主細胞が提供される。さらに本発明は、ＨＰＫ或いはその変異体、ＨＰＫに対する抗体或いは拮抗体をコードするポリヌクレオチドと相補性のポリヌクレオチド配列及びＨＰＫ或いはＨＰＫに対する拮抗体からなる医薬品組成物に関連する。図面の簡単な説明第１Ａ、１Ｂ、１Ｃ並び１Ｄ図は、ヒト蛋白質キナーゼＨＰＫ−１の核酸配列（配列番号：２）及びアミノ酸配列（配列番号：１）を示す。その配列は、Mac DNAsis software（Hitachi Software Engineering Co.Ltd.SanBruno，CA）を用いて生成された。第２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ並びに２Ｆ図は、ヒト蛋白質キナーゼＨＰＫ −２の核酸配列（配列番号：４）及びアミノ酸配列（配列番号：３）を示す。第３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ並びに３Ｆ図は、ヒト蛋白質キナーゼＨＰＫ −３の核酸配列（配列番号：６）及びアミノ酸配列（配列番号：５）を示す。第４Ａ、４Ｂ、４Ｃ並び４Ｄ図は、ＨＰＫ−１、ＨＰＫ−２、ＨＰＫ−３と線虫（ＧＩ１０８２１１５；配列番号：７）からの蛋白質キナーゼ、ヒト蛋白質キナーゼ（ＧＩ１１１７７９１；配列番号：８）、ラット（ＧＩ２９４６３７；配列番号：９）からの蛋白質キナーゼの間のアミノ酸配列を示す。これらの配列は、DNAStar software(DNAStar Inc.MadisonWI)のマルチシーケンスアライメントプログラムを用いて生成された。発明を実施するための形態本ヌクレオチド及びポリペプチド配列を記載する前に、本発明は記載される特定の方法、プロトコル、細胞株、ベクタ並びに試薬に制限されず、変形される場合もあることを理解されたい。また本明細書で用いられる専門用語は、特定の実施例を記載することのみを目的としており、本発明の範囲を制限することを意図するわけではなく、本発明は添付の請求の範囲によってのみ制限されることを理解されたい。本明細書で用いられるように、添付の請求の範囲では、単数形の冠詞、「及び」並びに「前記」は、文脈において違うように明確に規定されない限り、複数の指示物を含むことに注意されたい。従って例えば、「１つの宿主細胞」が示すものは、複数のそのような宿主細胞を含んでおり、「その抗体」は当業者には既知の１つ或いはそれ以上の抗体及びその等価物を示しており、他も同様である。異なるように規定されなければ、本明細書で用いられる科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者に通常理解されているのと同じ意味である。本明細書で記載される内容と類似或いは等価な任意の方法、装置並びに材料が本発明の検証に際して用いられてもよいが、好適な方法、装置並びに材料は本明細書中に記載される。ここで言及する全ての刊行物は、記載される本発明に関連して用いられることも考えられる刊行物に記載される細胞株、ベクタ並びに方法論を記載、かつ開示するために参照して本明細書の一部としている。ここで議論される刊行物は、本出願の出願日に先行して、全く別にそれらを開示するために提供されている。本明細書に記載される内容は、本発明者が、先行発明によりそのような開示に先行して権利を有さないことを容認するものと解釈されるべきではない。定義本明細書で用いる「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド或いはポリヌクレオチド並びにそのフラグメント、さらには一本鎖或いは二本鎖である場合があるゲノム或いは合成起源のＤＮＡ或いはＲＮＡのことであり、センス鎖或いはアンチセンス鎖を表す。同様にここで用いるアミノ酸は蛋白質或いはペプチド配列ことである。本明細書で用いる「コンセンサス」は、核酸配列のうち、１）無関係な（unca lled）塩基を分解するために再配列されているもの、２）５’ 或いは３’方向にXL-PCR(Perkin Elmer)を用いて伸展され、再配列されているもの、３）Incyte clone GCG Fragment Assembly System.(GCG,Madison WI)より大きい重複配列から構築されているもの、或いは４）伸展及び構築のいずれもが施されているもののことである。本明細書で用いる「ペプチド核酸」は、リジンのようなアミノ酸残基及びアミノ基が加えられているオリゴマーからなる分子のことである。これらの小さな分子は、抗遺伝因子（anti-geneagent）とも呼ばれ、核酸の相補（鋳型）鎖（Niel sen PE et al（1993）Anticancer Drug Des 8:53-63）に結合することにより転写伸展を停止する。ここで用いられるように、ＨＰＫは、自然、合成、半合成或いは組換え体のいずれかを任意のソースとする実質的に精製されたＨＰＫのアミノ酸配列のことである。ＨＰＫの「変異体」は、１つ或いはそれ以上のアミノ酸を置換することにより異なるアミノ酸配列と定義される。変異体は「保存的に」変化する場合があり、置換されたアミノ酸は、例えばロイシンをイソロイシンと置換する場合のように、類似の構造的及び化学的特性を有する。さらにまれにではあるが、変異体は、グリシンをトリプトファンと置換する場合のように「非保存的に」変化する場合がある。また類似の少数変異体は、アミノ酸欠失或いは挿入、またはその両方を含む場合もある。生物学的及び免疫学的活性を無くすことなくアミノ酸残基が、どのように何個置換、挿入或いは欠失されればよいかを確定する際の指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばDNAStar softwareを用いて見出すことができる。「欠失」は、１つ或いはそれ以上のヌクレオチド残基或いはアミノ酸残基がそれぞれ欠失するヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列における変化のことである。「挿入」或いは「付加」は、結果的に、自然発生ＨＰＫに比べて、１つ或いはそれ以上のヌクレオチド残基或いはアミノ酸残基がそれぞれ加わるヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列における変化のことである。「置換」は、１つ或いはそれ以上のヌクレオチド或いはアミノ酸が、それぞれ異なるヌクレオチド或いはアミノ酸により置換されることに起因する。用語「生物学的活性」は、自然発生ＨＰＫの構造的、調節的或いは生化学的機能を有するＨＰＫのことである。同様に「免疫学的活性」は、自然、組換え体或いは合成ＨＰＫ，またはそのオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞において特定の免疫反応を誘発し、かつ特定の抗体と結合する能力と定義する。本明細書で用いる用語「誘導体」は、核酸配列をコードするＨＰＫ或いはコードされたＨＰＫの化学的修飾体のことである。そのような修飾の例示は、水素をアルキル基、アシル基或いはアミノ基で置き換えることである。核酸誘導体は、自然ＨＰＫの本質的な生物学的特性を保持するポリペプチドをコードする。本明細書で用いられる用語「実質的に精製された」は、分子、すなわち自然環境から除去されるか、隔離されるか或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列のいずれかのことであり、自然に結合する他の組成物から少なくとも６０％遊離し、好適には７５％遊離し、さらに好適には９０％遊離している。「厳密性」は典型的に、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い温度）から約Ｔｍより２０〜２５℃低い温度において生じる。当業者には理解されるように、厳密性ハイブリダイゼーションを用いて、同一のポリヌクレオチド配列を同定或いは検出するか、或いは類似の、または関連するポリヌクレオチド配列を同定或いは検出することができる。本明細書で用いる用語「ハイブリダイゼーション」は、「核酸の鎖が塩基対を介して相補鎖と結合する任意のプロセス」（Coombs J（1994）Dictionary of Bi otechnology ,Stockton Press,New York NY）を含むものとする。ポリメラーゼ連鎖反応技術において実行されるような増幅は、Dieffenbach CW and GS Dveksler (1995,PCR Primer,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Plainview NY)に記載される。説明本発明は、最初は、脳海馬ライブラリ（HIPONOTO1;HPK-1）、末梢血単核細胞ライブラリ（TMLR3DT01;HPK-2）並びにマクロファージ細胞ライブラリ（MPHGN0T 03;HPK-3）からの部分ｃＤＮＡの中で同定される新規なヒト蛋白質キナーゼに関連し、疾患の研究、診断、予防並びに治療における本明細書で開示される核酸配列或いはアミノ酸配列の使用法に関連する。上記ソースに加えて、ノーザン解析は、ＨＰＫ−１の一部をコードする核酸が神経組織（多発性硬化症）及び脳腫瘍からのｃＤＮＡライブラリにおいても見出されたということを示す。ＨＰＫ−２の一部をコードする核酸は、乳児脳、てんかん（脳）並びに種々の腫瘍組織（陰茎癌種、膀胱癌種並びに甲状腺腺種）において見出された。ＨＰＫ−３の一部をコードする核酸は、多発性硬化症、アルツハイマ（脳）、変形性関節症膝組織並びに乳房及び肺の腫瘍において見出された。また本発明はＨＰＫ変異体も含む。好適なＨＰＫ変異体は、ＨＰＫアミノ酸配列（配列番号：１、３或いは５）に少なくとも８０％アミノ酸配列類似性を有するものであり、さらに好適なＨＰＫ変異体は、配列番号：１、３或いは５に少なくとも９０％アミノ酸配列類似性を有するものであり、最も好適な好適なＨＰＫ変異体は、配列番号：１、３或いは５に少なくとも９５％アミノ酸配列類似性を有するものである。ＨＰＫコード配列ＨＰＫ−１の一部をコードする核酸は、アミノ酸配列アライメントのためのコンピュータ生成検索を介してIncyte Clones 240142において最初に同定された。同様に、ＨＰＫ−２及びＨＰＫ−３の一部をコードする核酸は、それぞれIncyte Clones 391602及び477245において最初に同定された。ここで開示される核酸配列、配列番号：２、４並びに６は、以降ＨＰＫとして開示されるアミノ酸配列、配列番号：１、３並びに５をそれぞれコードする。本発明は一部、ＨＰＫ−１、ＨＰＫ−２並びにＨＰＫ−３中の化学的及び構造的相同性、種々の既知の蛋白質キナーゼ、並びに蛋白質キナーゼの触媒作用領域の特徴をなすこれらの蛋白質(Hardie G and Hanks S(1995)上記)内の種々のアミノ酸配列モチーフに基づく。第４Ａ、４Ｂ並びに４Ｃ図を参照すると、蛋白質キナーゼにおけるサブドメインＩの特徴を示す配列GXGXXGXVは、Ｇ₂₇で始まるＨＰＫ−２及びＨＰＫ−３、GI 1117791及びGI 294637の場合に対応する残基において見出される。ＨＰＫ−２の場合にＫ₄₉に位置するサブドメインＩＩにおける保存されたリジン残基は、ＨＰＫ−３、GI 1117791及びGI 294637に対して繰り返される。多くの蛋白質キナーゼのサブドメインＶＩＢにおいて見出された配列 HRDIKXXNはHPK-1(H₉₀)，HPK-2，HPK-3，GI 1082115及びGI 1117791において見出される。最終的にサブドメインＶＩＩにおけるトリプレット配列ＤＦＧは、HPK- 3(G₂₄₂)，GI 1117791及びGI 294637において見出され、トリプレット配列ＡＰＥ（サブドメインＶＩＩＩ）は、HPK-2(A₂₈₃),HPK-3,GI 1117791及びGI 294637に見出される。こうして蛋白質キナーゼＨＰＫ−１、ＨＰＫ−２並びＨＰＫ−３のいずれもが蛋白質キナーゼの特徴を示す配列パターンを帯びるが、全配列においては互いに異なる。ＨＰＫ−１は線虫:GI 1082115(Wilson,R et al(1994)Nature 368:32-38 )からの蛋白質キナーゼに70％配列同一性を示す。GI 1082115はサイクリック− ＡＭＰ依存ＰＫＡファミリーのメンバーとして特徴付けられている。ＨＰＫ−２はヒト蛋白質キナーゼGI 1117791(Creasy，CL and Chernoff，J(1995)J．Biol C hem 270:21695-21700)に最も近い（４２％）同一性を示す。GI 1117791は、マイトジェン活性化蛋白質キナーゼ（ＭＡＰＫ）ファミリーの他のメンバーと類似するものと特徴付けられるが、おそらく今のところ確認されていない伝達経路において含まれる。ＨＰＫ−３は、ラットからの蛋白質キナーゼGI 294637(Webster ，M．K．etal（1993）Mol．Cell Biol．13:2031-2040)におよそ９６％同一性を有する。GI 294637は、糖質コルチコイドホルモンにより転写調節され、ＰＫＡ及びＰＫＣファミリー両方の蛋白質キナーゼに配列相同性を示す。ＨＰＫ−１は配列番号：２によりコードされ、、以下の部分ｃＤＮＡ（ライブラリ）、Incyte Clones 67192(HUVESTB01),240142,243638,298165(HIPONOT01)， 449634(TLYMNOT02)，461400(KERANOT01),739131(PANCNOT04)並びに(12143028?) の伸展及び構築から導出される。ＨＰＫ−２は配列番号：４によりコードされ、以下の部分ｃＤＮＡ（ライブラリ）、Incyte Clones 1394374，1395924，1392440，1394764,1393587，及び1439 946(THYRNOT03:487890(HNT2AGT01);737620(TONSNOT01);391602(TMLR3DT01);3733 01(LUNGNOT02);1291632(PGANNOT03);550890(BEPINOT011);1314539(BLADTUT02);6 47351(BRSTTUT02);917302(BRSTNOT04);541117(LNODN0T02); 235796(SINTNOT02);827973(PROSNOT06);36252(HUVENOB01);1339623(COLNTUT03); 719820及び365833(SYNORAT01);32632(THP1NOB01);888061(PANCNOT05);1262882(S YN0RAT05);975808(MUSCNOT02);275375(TESTNOT03);1433039及び1425069(BEPINON 01);and 94156(PITUNOT01)の伸展及び構築から導出される。ＨＰＫ−３は配列番号：６によりコードされ、以下の部分ｃＤＮＡ（ライブラリ）、Incyte Clones 477245及び445652(MPHGNOT03):386314(THYMNOT02);121940 4(NEUTGMT01),478857(MMLR2DT01);1239468(LUNGTUT02);603976(BRSTTUT01;56561 3(NEUTLPT01)の伸展及び構築から導出される。遺伝子コードの厳密性の結果として、多くのＨＰＫコード用ヌクレオチド配列が生成され、その中には任意の既知の自然発生遺伝子のヌクレオチド配列に最低限の相同性を示すものもあるということは当業者には明らかであろう。本発明は、可能なコドン選択に基いて組み合わせを選択することにより形成されるようになるヌクレオチド配列のあらゆる可能な変異体を考える。これらの組み合わせは、自然発生ＨＰＫのヌクレオチド配列に加えられるような標準的なトリプレット遺伝子コードに従って形成され、全てのそのような変異体が特に開示されているもの考慮されたい。ＨＰＫをコードするヌクレオチド配列及びその変異体は、適当に選択された厳密な条件下で、自然発生ＨＰＫのヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションできることが好ましいが、ＨＰＫをコードするヌクレオチド配列或いは実質的に異なるコドン使用法を処理するその誘導体を生成するという利点を有する場合もある。コドンを選択して、特定のコドンが宿主によって利用される頻度に従って、ペプチドの発現が特定の原核或いは真核発現宿主において生じる割合を多くしてもよい。コードされたアミノ酸配列を修正することなくＨＰＫをコードするヌクレオチド配列及びその誘導体を実質的に修正する他の理由には、より長い半減期のような、自然発生配列から生成された転写より望ましい特性を有するＲＮＡ転写の生成を含む。現在、合成化学により完全に、請求の範囲に記載の全てのＨＰＫをコードするＤＮＡ配列或いはその一部、並びに誘導体を生成し、その後本特許出願の出願時点で当分野において周知の試薬を用いて、合成遺伝子が、任意の多くの入手可能なＤＮＡベクタ及び細胞系に挿入されることが可能である。さらに、合成化学を用いて、ＨＰＫ或いは任意のその一部に突然変異を導入することもできる。また本発明には、種々の厳密な条件下で第１Ａ、１Ｂ、１Ｃ並びに１Ｄのヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションすることができるポリヌクレオチド配列が含まれる。ハイブリダイゼーション条件は、参照して本明細書の一部としているBerger and Kimmel(1987，Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology，Vol 152，Academic Press，San Diego CA)に教示されるような、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいており、定義された厳密性において用いられてもよい。本発明に従って用いることができるＨＰＫをコードする修正核酸配列は、同一或いは機能的に等価なＨＰＫをコードするポリヌクレオチドをもたらす異なるヌクレオチドの欠失、挿入或いは置換を含む。また蛋白質は、サイレントな変化（ silentchange）を生成し、機能的に等価なＨＰＫをもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入或いは置換を示す場合もある。故意のアミノ酸置換は、ＨＰＫの生物活性が保持される限り、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びにまた両親媒性に基づいて行ってよい。例えば、負に帯電したアミノ酸はアスパラギン酸及びグルタミン酸を含み、正に帯電したアミノ酸はリジン及びアルギニンを含み、同様の親水値を有する帯電していない極性頭基（polar head group）有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンフェニルアラニン、並びにチロシンを含む。ＨＰＫコード化配列のアレルも本発明の範囲内に含まれる。本明細書で用いる「アレル」或いは「アレル配列」は、ＨＰＫコード化配列の代替形である。アレルは突然変異、例えば核酸配列の変化に起因し、一般に修正ｍＲＮＡ或いはポリペプチドを生成するが、その構造或いは機能は、修正される場合もあれば、修正されない場合もある。任意の所与の遺伝子は、１つ或いは多くのアレル形を有する場合もあれば、全く有さない場合もある。アレルを引き起こす通常の突然変異は一般に、アミノ酸の自然の欠失、付加或いは置換に起因する。これらの種類の変化のいずれも単独で、或いは他との組み合わせにおいて、所与の配列において１回或いはそれ以上生じる場合がある。当業者には周知のＤＮＡ配列化のための方法が用いられるが、これらの方法は DNA polymerase I，Sequenase（登録商標）(US BiochemicalCorp，Cleveland OH ))のKlenow fragment、Taq polymerase(Perkin Elmer，Norwalk CT)、thermosta ble T7 polymerase(Amersham，Chicago IL)或いはGibco BRL(Gaithersburg MD) により市販されているELONGASE Amplification Systemのような組換えポリメラーゼとプルーフリーディングエキソヌクレアーゼの組み合わせのような酵素を利用してもよい。このプロセスはHamilton Micro Lab2200(Hamilton,Reno NV),Pel tier Thermal Cycler(PTC200;MJ Research,Watertown ＭＡ）並びにthe ABI 377 ＤＮＡ sequencers(Perkin Elmer)のような機器を用いて自動化することが好ましい。ポリヌクレオチド配列の伸展ＨＰＫをコードするポリヌクレオチド配列は、部分ヌクレオチド配列並びにプロモータ及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当分野において既知の種々の方法を用いて伸展されることができる。例えば、ある方法では、汎用プライマを用いて既知の位置に隣接する未知の配列を回復する直接的な方法として「制限部位」ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる場合がある（Gobind aetal(1993)PCR Methods Applic 2:318.22）。特に、ゲノムＤＮＡは、リンカー配列に対するプライマの存在時に、かつ既知の領域に特定のプライマの存在時に増幅される。増幅された配列は、同じリンカープライマ及び第１のプライマに内在する別の特定のプライマを用いて第２巡目のＰＣＲにかけられる。各回のＰＣＲの生成物は、適当なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、逆転写酵素を用いて配列される。逆ＰＣＲを利用して、既知領域に基づく多岐プライマを用いて配列を増幅或いは伸展することができる（Triglia T et al(1988)Nucleic Acids Res 16:8186）。プライマはOLIGO（登録商標）4.06 Primer Analysis Software(1992;National Biosciences Inc，Plymouth MN)或いは別の適当なプログラムを用いて設計され、長さが２２−３０ヌクレオチドになり、５０％以上のＧＣ含量を有するか、或いは約６８−７２℃の温度で標的配列にアニールする場合もある。その方法は、いくつかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知の領域内に適当なフラグメントを生成する。その後そのフラグメントは、分子間連結反応により環状にされ、ＰＣＲ鋳型として用いられる。用いられる可能性のある別の方法は、ヒトの既知の配列に隣接するＤＮＡフラグメントと酵母菌人工クロモソームＤＮＡとをＰＣＲ増幅することを伴う捕獲ＰＣＲ(Lagerstrom M et al（1991）PCR Methods Applicl:111-1 9）である。捕獲ＰＣＲは、多数の制限酵素消化及び連鎖反応を伴い、操作された二本鎖配列を、ＰＣＲに先行してＤＮＡ分子の未知の部分に配置する。未知の配列を回復するために用いられる可能性のある別の方法は、Parker JD et al(1991;Nucleic Acids Res 19:3055-60による方法である。さらに、ある方法はＰＣＲ，入れ子状プライマ並びにPromoterFinder libraryを用いて、ゲノムＤＮＡに歩行することができる（PromoterFinder（登録商標）Clontech,Palo Al to CA）。このプロセスは、ライブラリをスクリーニングする必要性を回避し、イントロン／エクソン接合部を見つける際に有用である。完全長ｃＤＮＡに対してスクリーニングするための好適なライブラリは、より長いｃＤＮＡを含むように大きさを選択されたライブラリである。またランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリも、それらが遺伝予の５’及び上流領域を含むより大きな配列を含むという点で好ましい。ランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリは、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全長ｃＤＮＡをもたらさない場合には特に有効な場合がある。ゲノムライブラリは、５’非翻訳調節領域に伸展するために有用である。毛細管電気泳動法を用いて、配列化或いはＰＣＲ生成物の大きさを解析したり、或いはヌクレオチド配列を確認したりする場合もある。迅速に配列化するためのシステムは、Perkin Elmer,Beckman Instruments(Fullerton CA)或いは他の企業から購入することができる。毛細管シーケンス法は、電気泳動分離のための流動性ポリマ、レーザにより活性化される（各ヌクレオチドに対して１種類の）４つの異なる蛍光性染料、並びにＣＣＤカメラによる放射波長の検出を用いる場合もある。出力／光輝度が適当なソフトウエア（例えばGenotyper^TM及びSequence Navigator^TM(Perkin Elmer)）を用いて電気信号に変換され、サンプルをコンピュータ解析にかけ、電子データを表示することから全プロセスがコンピュータ制御される。毛細管電気泳動法は、特定のサンプルの限定された量内に存在する場合があるＤＮＡの小片の配列化に特に適している。３０分にＭ１３ファージＤＮＡの３５０ｂｐまでの再現配列化が報告されている（Ruiz-Martinez MC et al(1 993)Anal Chem 65:2851-8）。本発明に従って、ポリペプチド、融合蛋白質、或いはその作用的等価物のフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列が、適当な宿主細胞においてＨＰＫの発現をもたらす組換え体ＤＮＡ分子に用いられる場合がある。ゲノムコードの固有の縮重により、概ね同一か、或いは機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を用いて、ＨＰＫをクローニングし、発現する場合もある。当業者には理解されようが、これは非自然発生コドンを処理するＨＰＫ−コードヌクレオチド配列を生成するために有利な場合もある。特定の原核或いは真核宿主により選択されたコドンを選択して、例えば、ＨＰＫコード配列発現の割合の増大したり、或いは自然発生配列から生成される転写物ではなく、より長い半減期のような所望の特性を有する組換え体ＲＮＡ転写物を生成することができる（Mu rray E et al(1989)Nuc Acids Res 17:477-508）。本発明によるヌクレオチド配列は、限定はしないが、遺伝子生成物のクローニング、処理並びにまた発現を修飾する修正を含む種々の理由によりＨＰＫを修正するために処理されることができる。例えば、突然変異が、当分野で周知の技術を用いて導入される場合がある。例えば、位置指定突然変異誘発を用いて、新しい制限部位の挿入、グリコシレーションパターンの修正、コドン基準の変更、スプライシング変異体の生成等を行うこともできる。本発明の別の実施例に従って、自然、修飾或いは組換え配列コードＨＰＫは、融合蛋白質をコードするために異種配列に結合されることもできる。例えば、ＨＰＫ活性の阻害剤のためのペプチドライブラリをスクリーニングする場合に、それは、市販されている抗体により認識されるキメラＨＰＫ蛋白質をコードするために有用な場合もある。また融合蛋白質は、ＨＰＫ配列と異種蛋白質配列との間に位置する分割部位を含むように処理されることもでき、それによりＨＰＫは分割され、概ね異種部分から離隔して精製されるようになる。本発明の別の実施例では、当分野で周知の化学的方法を用いて、配列コードＨＰＫは、全体が或いはその一部分が合成される(Caruthers MH et al(1980)Nuc A cids Res Symp Ser 215-23,Horn T et al（1980）Nuc Acids Res Symp Ser 225- 32，etc参照）。別法では、蛋白質が、アミノ酸配列の全体或いは一部を合成するために化学的方法を用いて生成される場合がある。例えば、ペプチド合成は種々の固相技術（Roberge JY et al（1995）Science 269:202-204）を用いて実行されることができ、自動化合成は、例えばABI 431A Peptide Synthesizer(Perki n Elmer)を製造業者により提供される取扱説明書に従って用いて達成することができる。新しく合成されたペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィにより概ね精製されることができる（例えばCreighton（1983）Proteins,Structures and Mol ecular Principles,WH Freeman and Co,New York NY）。合成ペプチドの組成物は、アミノ酸解析及びシーケンス法により確認することができる（例えばEdman degradation procedure;Creighton，上記）。さらにＨＰＫのアミノ酸配列或いはその任意の一部は、直接合成中に修正されるか、並びにまた他の蛋白質或いはその任意の一部からの配列に化学的方法を適用して結合され、変異体ポリペプチドを生成する場合もある。発現系生物学的活性ＨＰＫを発現するために、ヌクレオチド配列コードＨＰＫ或いはその作用的等価物が、適当な発現ベクタ、すなわち挿入されたコード化配列の転写及び翻訳のために必要な要素を含むベクタ内に挿入される。当業者に周知の方法を用いて、ＨＰＫコード化配列及び転写或いは翻訳制御を含む発現ベクタを構成することができる。これらの方法は、ｉｎｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術並びにｉｎｖｉｖｏ組換え或いはゲノム組換えを含む。そのような技術はSambrooketal(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Man ual ，Cold Spring Harbor Press,Plainview NY and Ausubel FM et al（1989）C urrent Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons，New York NYに記載されている。種々の発現ベクタ／宿主系を利用して、ＨＰＫコード化配列を包含し、発現する場合もある。これらは、限定するわけではないが、組換え体バクテリオファージ、プラスミド、或いはコスミドＤＮＡ発現ベクタと形質転換されたバクテリア、酵母菌発現ベクタと形質転換された酵母菌、ウイルス発現ベクタに感染した昆虫細胞系（例えばバキュロウイルス）、ウイルス発現ベクタに形質移入した植物細胞系（例えば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ、タバコモザイクウイルスＴＭＶ）或いはバクテリア発現ベクタに形質移入した植物細胞系（例えば、Ｔｉ或いはｐＢＲ３２２プラスミド）、或いは動物細胞系のような微生物を含む。これらの系の「制御素子」或いは「調節配列」は、長さ及び特異性において変化し、ベクタ、エンハンサ、プロモータ並びに３’非翻訳領域の非翻訳領域であり、転写及び翻訳を実行するために宿主細胞蛋白質と相互作用する場合がある。用いられるベクタ系及び宿主により、構成的及び誘導性プロモータを含む、任意の数の転写及び翻訳素子を用いてよい。例えば、バクテリア系においてクローニングする際、Bluescript（登録商標）phagemid(Stratagene，L aJolla CA)或いはpSport 1（GibcoBRL)のハイブリッドｌａｃＺプロモータ並びにｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッド等のような誘導性プロモータを用いることもできる。バキュロウイルスポリヘドリン（polyhedrin）プロモータが昆虫細胞に用いられる。植物細胞のゲノム（例えば、熱ショックＲＵＢＩＳＣＯ及び貯蔵蛋白質遺伝子）から、或いは植物ウイルス（例えば、ウイルス性プロモータ或いはリーダ配列）から導出されるプロモータ或いはエンハンサが、ベクタにクローニングされる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子或いは哺乳動物ウイルスからのプロモータが最も適切である。もしＨＰＫコード化配列の多数の複製を含む細胞株を発生させる必要があるなら、ＳＶ４０或いはＥＢＶに基づくベクタを適当な選択可能マーカと共に用いてもよい。バクテリア系では、いくつかの発現ベクタが、ＨＰＫに対する使用に応じて選択されてもよい。例えば、大量のＨＰＫが抗体を誘導するために必要とされるとき、容易に精製される融合蛋白質を高レベルで発現させるベクタが望まれる場合もある。そのようなベクタは、限定するわけではないが、ＨＰＫコード化配列が、アミノ末端Ｍｅｔ及び後続のβ−ガラクトシダーゼの７残基に対する配列の枠内のベクタに結合されることができ、ハイブリッド蛋白質が生成されるBluescri pt（登録商標）(Stratagene)のような多機能Ｅ．ｃｏｌｉクローニング及び発現ベクタ、ｐＩＮベクタ（Van Heeke & Schuster（1989）J Biol Chem 264:5503-5 509）等を含む。ｐＧＥＸベクタ（Promega,Madison WI）を用いて、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を有する融合蛋白質として異種のポリペプチドを発現してもよい。一般に、そのような融合蛋白質は可溶性であり、遊離グルタチオンの存在時に溶出により後続されるグルタチオンーアガロースビードへの吸収により分離した細胞から容易に精製することができる。その系内で形成される蛋白質は、ヘパリン、トロンビン或いは第ＸＡ因子プロテアーゼ分割部位を含むように設計され、対象のクローニングされたポリペプチドが自由にＧＳＴ成分から放出されることができる。酵母菌、サッカロミセス‐セレビジエでは、α因子、アルコールオキシダーゼ並びにＰＧＨのような構成的及び誘導性プロモータを含むいくつかのベクタを用いてもよい。一般的な方法は、Ausubel et al(supra)and Grant et al(1987)Met hods in Enzymology 153:516-544に見出される。植物発現ベクタが用いられる場合には、ＨＰＫをコードする配列の発現は、いくつかのプロモータの任意のものにより行われる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ及び１９Ｓプロモータ（Brisson et al（1984）Nature 310:511-514）のようなウイルス性プロモータは単独で、或いはＴＭＶからのω−リーダ配列（Takamatsu et al(1987)EMBO J 6:307-311）と共に用いることができる。別法では、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのような植物プロモータ（Coruzzi et al(1984)EMBO J 3:1671-1680;Broglie et al(1984)Science 224:838-843）或いは熱ショックプロモータ（Winter J and Sinibaldi RM（1991）Results Probl Cell Differ 17: 85-105）を用いてもよい。これらの構成体は、直接ＤＮＡ形質転換或いは病原体媒介形質移入により植物細胞内に導入されることができる。これらの技術を再確認する場合には、Hobbs S or Murry LE in McGraw Hill Yearbook of Science a nd Technology（1992）Mc Graw Hill New York NY，pp 191-196或いはWeissbach and Weissbach（1988）Methods for Plan t Molecuar Biology，Academic Press,New York NY,pp 421-463を参照されたい。ＨＰＫコード化配列を発現するために用いることができる別の発現系は昆虫系である。あるそのような系では、autographa californica核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクタとして用いて、ヨトウガ細胞或いはイクラサキンウワバ幼虫（Trichoplusia larvae）において外来遺伝子を発現する。ＨＰＫコード化配列は、ポリヘドリン（polyhedrin）遺伝子のようなウイルスの非必須領域にクローニングし、ポリヘドリンプロモータの制御下に置かれる。ＨＰＫコード化配列を有効に挿入することにより、ポリヘドリン遺伝子は非活性になり、コート蛋白質の外皮を欠如する組換え体ウイルスが生成される。その後組換え体ウイルスを用いて、ＨＰＫが発現されるヨトウガ細胞或いはイクラサキンウワバの幼虫を感染させる(Smithetal(1983)J Virol 46:584;Engelhard EK et al(1994),Proc Nat Acad Sci91:3224-7）。哺乳類宿主細胞では、いくつかのウイルス性発現系が利用される場合がある。アデノウイルスが発現ベクタとして用いられる場合には、ＨＰＫコード化配列は、後期プロモータ及び３深裂のリーダ配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に結合される場合がある。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１或いはＥ３領域内の挿入の結果、感染した宿主細胞内にＨＰＫを発現することができる生存可能ウイルスが生成される（Logan and Shenk(1984)Proc Natl Acad Sci 81:3655-59）。さらにラウス肉腫エンハンサのような転写エンハンサを用いて、哺乳動物宿主細胞内の発現を増加させるてもよい。また特定の開始シグナルもＨＰＫコード化配列の有効な転写のために必要とされる。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含む。ＨＰＫコード化配列、その開始コドン並びに上流配列が適当な発現ベクタに挿入される場合には、追加の翻訳制御シグナルが不要である。しかしながら、コード化配列或いはその一部のみが挿入される場合には、ＡＴＧ開始コドンを含む外性の転写制御シグナルが与えられるべきである。さらに、開始コドンは、全挿入物を確実に転写するために、正確な読み枠内に置かれなければならない。外性転写素子及び開始コドンは、自然及び合成両方の種々の起源からなることができる。発現の効率は、使用中の細胞系に適当なエンハンサを含めることにより高められる場合がある（Scharf D et al（1994）Results Probl Cell Differ 20:1 25-62:Bittner et al(1987)Methods in Enzymol 153:516-544）。さらに宿主細胞列は、挿入した配列の発現を修飾することができるように、或いは所望のように発現した蛋白質を処理することができるように選択されてもよい。そのようなポリペプチドの修飾は、限定するわけではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸エステル化、脂質化或いはアシル化を含む。「プレ蛋白質（prepro）」形態の蛋白質を切断する事後翻訳処理も、正確な挿入、折りたたみ並びにまた機能のために重要である。CHO，HeLa，MDCK，293， WI38等のような種々の宿主細胞は、そのような事後翻訳活性のために特異の細胞機構及び特性機構を有し、導入された外来蛋白質の正確な修飾及び処理を確実にするように選択されることができる。長期に渡って歩留まりの高い蛋白質の生産を行う場合、安定した発現が望ましい。例えば、ＨＰＫコード化配列を安定に発現する細胞株は、複製或いは内性発現素子のウイルス起源及び選択可能マーカ遺伝子を含む発現ベクタを用いて形質転換されことができる。ベクタの導入に後続して、細胞を強化培地内で１〜２日間成長させる場合もあり、その後選択培地に切り替えられる。選択可能マー力の目的は、選択への耐性を与えることであり、その存在により、導入された配列を有効に発現する細胞が成長し、回収されるようになる。安定して形質転換された細胞の抵抗性凝集塊は、細胞タイプに適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。任意の数の選択系を用いて、形質転換される細胞株を回収することができる。これらは、限定するわけではないが、それぞれｔｋ−細胞或いはａｐｒｔ−細胞に用いることができる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ及び及びアデニンフォスフォリボシール転換酵素遺伝子を含む（Wigler M et al（1977）Cell 11: 223-32;Lowy I et al（1980）Cell 22:817-23）。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤耐性を選択のための基剤として用いることができる。例えば、ｄｈｆｒはメトトレキセートへの耐性を与え、ｎｐｔはアミノグリコシッドネオマイシン及びＧ−４１８への耐性を与え、ａｌｓ及びｐａｔはそれぞれ、クロルスルフロン及びホスフィノトリシン（phosphinotricin）アセチル基転移酵素への耐性を与える（Wigler M et al（1980）Proc Natl Acad Sci 77:3567-70;Colbere- Garapin F et al(1981)J Mol Biol 150:1-14:Murry，上記）。さらに選択可能遺伝子を用いる場合もあり、例えば、ｔｒｐＢにより細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようになり、ｈｉｓＤにより細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histinol）を利用できるようになる（Hartman SC and RC Mulligan（1988）Proc Natl Acad Sci 85:8047-51）。アントシアニン、β−グルクロニダーゼ及びその基質ＧＵＳ，並びにルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリンを用いて、転換体を同定するのみならず、特異のベクタ系に帰する一過性或いは安定した蛋白質発現の量を定量することもできる（Rhodes CA et al（199 5）Methods Mol Biol 55:121-131）。ポリヌクレオチド配列を含む転換体の同定マー力遺伝子発現の存在／不在は、対象の遺伝子が存在することを示唆するが、その存在及び発現が確認されるべきである。例えば、もしＨＰＫコード化配列がマー力遺伝子配列内に挿入されるなら、ＨＰＫコード化配列を含む組換え細胞は、マー力遺伝子機能の不在により同定されることができる。別法では、マー力遺伝子は、単一のプロモータの制御下でＨＰＫ配列と直列に配置される。誘導及び選択に応じたマー力遺伝子の発現は通常、直列のＨＰＫコード化配列の発現も同様に示す。別法では、ＨＰＫコード化配列を含み、ＨＰＫを発現する宿主細胞は、当業者に知られる種々の手順により同定されてもよい。この手順は、限定はしないが、核酸或いは蛋白質の検出並びにまた定量化のための技術に基づく膜、溶液或いはチップを含むＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション及び蛋白質バイオアッセイ或いはイムノアッセイ技術を含む。ＨＰＫをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、ＨＰＫコード化配列のプローブ、一部或いはそのフラグメントを用いて、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ− ＲＮＡハイブリダイゼーション或いは増幅することにより検出されることができる。アッセイに基づく核酸増幅は、ＤＮＡ或いはＲＮＡ内のＨＰＫコード化配列を含む転換体を検出するために、ＨＰＫをコードする配列に基づくオリゴヌクレオチド或いはオリゴマを使用することを伴う。本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」或いは「オリゴマ」は、少なくとも約１０ヌクレオチドから６０ヌクレオチドの核酸配列、好ましくは約１５−３０ヌクレオチドの核酸配列、より好ましくは２０−２５ヌクレオチドの核酸配列を含み、ヌクレオチドをプローブ或いはアンプライマとして用いることができる。ＨＰＫの発現を検出し、測定するための種々のプロトコルは、蛋白質に対して特異なポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用いており、当業者には周知である。例えば、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光性活性化細胞選別（ＦＡＣＥ）である。ＨＰＫの２つの非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる２部位のモノクローナルに基づくイムノアッセイ（monoclonal-based immun oassay）が好ましいが、結合蛋白競合測定法が用いられてもよい。ここで記載した測定法及び他の測定法は、Hampton R et al(1990,Serological Methods,a Lab oratory Manual,APSP ress，St．Paul MN)及びMaddox DE et al（1983，J Exp'M ed 158:1211に記載される。幅広い標識及び接合技術は当業者には知られており、種々の核酸及びアミノ酸測定法において用いることができる。ＨＰＫコード化配列に関連する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーション或いはＰＣＲプローブを生成するための手段は、標識されたヌクレオチドを用いる、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化或いはＰＣＲ増幅を含む。別法では、ＨＰＫコード化配列或いはその任意の一部が、ｍＲＮＡプローブの生成のためにベクタ内にクローニングされる場合もある。そのようなベクタは当分野において知られており、市販されており、Ｔ７、Ｔ３、或いはＳＰ６及び標識されたヌクレオチドのような適当なＲＮＡポリメラーゼを加えることによりｉｎｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いる場合もある。これらの手順を実行するためのいくつかの市販のキット或いはプロトコルは、Pharmacia Biotech(Piscataway NJ)，Pr omega（Madison WI）並びにUS Biochemical Corp(Cleveland OH)のような企業から入手することができる。適当なリポータ分子或いは標識は、その放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤或いは色素生産剤並びに基質、コファクタ、阻害剤、磁気粒子等を含む。これらの標識を用いるためのプロトコルは、当分野で幅広く入手することができる。その１つは、当分野において与えられた方法により組換え体免疫グロブリンを生成することもできる。ＨＰＫの精製ＨＰＫをコードするヌクレオチド配列を用いて形質転換された宿主細胞は、細胞培養からのコードされた蛋白質の発現及び回収のために適した条件下で培養されることができる。組換え細胞により生成される蛋白質は、用いられる配列並びにまたベクタにより分泌されるか或いは細胞内に包含される。当業者には理解されようが、ＨＰＫをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクタは、原核細胞膜或いは真核細胞膜を介してＨＰＫを分泌するシグナル配列を用いて設計することができる。他の組換え構造を用いて、Kroll DJ et al（1993）DNA Cell Biol 12:441-53に記載されるような可溶性蛋白質の精製を容易にするポリペプチド領域をコードするヌクレオチド配列にＨＰＫコード化配列を結合してもよい。またＨＰＫは、蛋白質精製を容易にするために加えられる１つ或いはそれ以上の追加ポリペプチド領域を用いて組換え蛋白質として発現することもできる。そのような精製を容易にする領域は、限定するわけではないが、固定化金属において精製できるようにするヒスチジン−トリプトファンモジュールのような金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリンにおいて精製できるようにするプロテインＡ領域、並びにＦＬＡＧＳ伸展／親和精製系（Immunex Corp，Seattle WA）において利用される領域を含む。精製領域とＨＰＫとの間にあるＸＡ因子或いはエンテロキナーゼ（Invitrogen，San Diego CA）のような分割可能リンカー配列の含有物は、精製を容易にするために有用である。ＨＰＫを含む融合蛋白質の発現のために与える１つのそのような発現ベクタは、核酸コード用６ヒスチジン残基を含み、それにチオレドキシン及びエンテロキナーゼ分割部位が後続する。ヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ（Porath et al(1992)Pr otein Expression and Purification 3:263-281に記載されるような固定化金属イオン親和性クロマトグラフィ）における精製を容易にし、一方エンテロキナーゼ分割部位はneuronatinを精製するための手段を与える。組換え生成物に加えて、ＨＰＫのフラグメントが、固相技術（Stewart et al （1969）Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co，San Francisco;Merr ifield J（1963）J Am Chem Soc 85:2149-2154）を用いてペプチド合成することにより生成される場合もある。ｉｎｖｉｔｒｏ蛋白質合成は手動技術或いは自動化を用いて実行されることができる。例えば、Applied Biosystems 431A Pept ide Synthesizer(Perkin Elmer，Foster City CA)を製造者により提供される取扱説明書に従って用いて、自動化合成を実現してもよい。ＨＰＫの種々のフラグメントは化学的に個別に合成されるか、或いは完全長分子を生成するために化学的方法を用いて結合されてもよい。ＨＰＫ蛋白質の治療及び診断への利用ここで開示されるヌクレオチド及びポリペプチドの使用に対する合理性は、新規のＨＰＫと線虫（ＧＩ１０８２１１５）、ラット（ＧＩ２９４６３７）並びにヒト（ＧＩ１１１７７９１）（Wilson et al，上記;Webster et al，上記 ;Creasy et al，上記）からの既知の蛋白質キナーゼとの間の化学的及び構造的相同性に一部基づいている。種々の細胞及び組織内の細胞情報伝達プロセスにおける蛋白質キナーゼに対する広範囲の役割のために、修正ＨＰＫ発現は種々の障害及び疾患において影響を受ける場合がある。ＨＰＫ−１は、海馬内にそれが出現することによって、記憶及び学習に影響し、アルツハイマ疾患のような障害に関連する場合がある。それゆえ、ＨＰＫをコードする配列を用いる、或いはＨＰＫ−１の作動薬を投与することによる遺伝子治療を介してＨＰＫ−１活性を高めるこは、アルツハイマによる記憶損失を一変させるために有用である場合がある。ＨＰＫ−２はリンパ球内において同定され、種々の腫瘍組織及びリウマチ様関節炎に関連した。ＨＰＫ−２は腫瘍プロモーションにおいて機能し、それにより癌治療の方策としてＨＰＫ−２をコードする配列のアンチセンス分子或いはＨＰＫ−２活性の拮抗体による抑圧のための標的を与えることもできる。同様に、ＨＰＫ−２活性は関節炎条件内で炎症性反応を促進し、再度ＨＰＫ−２をコードする配列のアンチセンス分子或いはＨＰＫ−２活性の拮抗体による抑圧のための標的を与えることができる。ＨＰＫ−３は、免疫反応或いは炎症内に含まれる可能性を示唆するマクロファージから導出される。ＨＰＫ−３と糖質コルチコイド調節ラット蛋白質キナーゼＧＩ２９４６３７との著しい相同性は、ＨＰＫ−３が同じように調整される場合があるということを示唆する。それゆえＨＰＫ−３発現は、喘息、多発性硬化症、リウマチ様関節炎のような状態に対して、並びにリンパ性白血病及びリンパ腫のようなある種の癌に対して糖質コルチコイド治療の抗炎症性及び免疫抑制効果に関連する場合がある。こうして遺伝子治療を介して、或いはＨＰＫ−３の作動薬の投与を介してＨＰＫ−３発現を増加することは、これらの状態に対する糖質コルチコイド治療の代わりになるものを実現する場合がある。ＨＰＫを発現するＨＰＫ並びにまた細胞株を用いて、化合物、合成薬、抗体、ペプチド或いはＨＰＫの活性を調節する他の分子を、評価、スクリーニング、並びに同定することができ、それゆえＨＰＫの発現に関連する疾患の治療において有用である。ＨＰＫ抗体ＨＰＫ特異抗体は、ＨＰＫの発現に関連する状態及び疾患の治療に対して有用である場合がある。そのような抗体は、限定するわけではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント並びにＦａｂ発現ライブラリにより生成されるフラグメントを含む場合がある。ダイマー形成物を抑制するもののような抗体を中和することは、診断及び治療に対して特に好ましい。抗体を生成する場合、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等を含む種々の宿主は、ＨＰＫ或いは任意の一部、フラグメント、或いは免疫原特性を保持するオリゴペプチドを注入することにより免疫される。抗体誘導のために用いられる蛋白質フラグメント或いはオリゴペプチドが機能的な生物活性を有するということは必要ないが、しかしながら抗原性でなければならない。特異な抗体を誘導するために用いられるペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸からなり、好ましくは１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。好ましくは、そのペプチドは自然の蛋白質のアミノ酸配列の一部を模倣し、小さな自然発生した分子の全アミノ酸配列を含む場合がある。ＨＰＫアミノ酸の短い伸展は、キーホールリンペットヘモシアニン及びキメラ分子に抗して生成される抗体のような別の蛋白質のアミノ酸と融合される場合もある。当分野で周知の手順がＨＰＫに対する抗体を生成するために用いることができる。宿主種に応じて、種々のアジュバントを用いて、免疫学的反応を高めることができる。そのようなアジュバントは、限定するわけではないが、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質を含む。ＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム ‐パルヴムが、潜在的に有用なヒトアジュバントである。ＨＰＫに対するモノクローナル抗体は、培養中の持続細胞株による抗体分子の生成を実現する任意の技術を用いて調製されることができる。これらの技術は、限定するわけではないが、最初にKoehler and Milstein(1975 Nature 256:495-4 97)により記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kos boretal(1983)Immunol Today4:72;Cote et al(1983)Proc Natl Acad Sci80:2026 -2030）、並びにＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al（1985）Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R Liss Inc,New York NY,pp77-96）を含む。さらに「キメラ抗体」の生成のために開発された技術、適当な抗原特異性及び生物活性を有する分予を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシングが用いられる（Morrison et al(1984)Proc Natl Acad Sci 81:6851-6 855:Neuberger et al(1984)Nature 312:604-608;Takeda et al(1985)Nature 314 :452-454）。別法では、一本鎖抗体の生成のために開示された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）が、ＨＰＫ特異性一本鎖抗体を生成するために適用されることができる。また抗体は、リンパ球集団においてｉｎｖｉｖｏ生成を誘導することにより、或いは組換え免疫グロブリンまたはOrlandi et al(1989,Proc Natl Acad Sci 86:3833-3837及びWinter G and Milstein C（1991;Nature 349:293-299)に開示されるような特異性の高い結合剤のパネルをスクリーニングすることにより生成することもできる。またＨＰＫのための特異な結合部位を含む抗体フラグメントを発生させることもできる。例えば、そのようなフラグメントは、限定するわけではないが、抗体分子のペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ’）２フラグメント及びＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルファイド架橋を還元することにより発生することができるＦａｂフラグメントを含む。別法では、Ｆａｂ発現ライブラリを構成して、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速にしかも容易に同定することができる（Huse WD et al.(1 989)Science 256:1275-1281）。確立された特異性を有するポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用いる結合蛋白競合測定法或いは免疫放射測定法のための種々のプロトコルは、当分野では周知である。そのようなイムノアッセイは典型的には、ＨＰＫとその特異抗体との間に複合体を形成すること、並びに複合形成体を測定することを伴う。特異性ＨＰＫ蛋白質において２つの非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する２部位のモノクローナル抗体に基づくイムノアッセイが好ましいが、結合蛋白質競合測定法を用いてもよい。これらの測定法は、 Maddox DE et al(1983,J Exp Med 158：1211)に記載される。ＨＰＫ特異性抗体を用いる診断測定法特定のＨＰＫ抗体を、ＨＰＫの発現により特徴をなす状態或いは疾患の診断のために、或いはＨＰＫ作動剤或いは拮抗剤を用いて治療される患者を監視するための測定法において用いてもよい。ＨＰＫのための診断測定法は、抗体及び細胞或いは組織のヒト体液或いは抽出物においてＨＰＫを検出するための標識を利用する方法を含む。本発明のポリペプチド及び抗体を、修飾ありなしいずれかで用いてもよい。多くの場合に、ポリペプチド及び抗体は、リポータ分子と共有結合、或いは非共有結合でそれらを結合することにより標識されるであろう。数多くのリポータ分子が知られており、そのうちのいくつかが上述されている。それぞれの蛋白質に対して特異なポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用いてＨＰＫを測定するための種々のプロトコルが当分野で知られている。例えば、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光性活性化細胞選別（ＦＡＣＥ）である。ＨＰＫの２つの非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる２部位のモノクローナルに基づくイムノアッセイ（monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、結合蛋白競合測定法が用いられてもよい。ここで記載した測定法及び他の測定法は、Maddox DE et al(1983,J Exp Med 158：1211)に記載される。診断のための基準を与えるために、ＨＰＫ発現に対する通常或いは標準値が確立されなければならない。これは、動物或いはヒトいずれかの被検者から取り出された体液或いは細胞抽出物を、当分野で周知の複合形成体に適した条件下でＨＰＫに対する抗体と結合することにより実現される。標準的な複合形成体の量は、既知の量のＨＰＫを含む種々の人工膜をバイオプシーを実施した組織からの調節サンプル及び疾患サンプルと比較することにより定量することができる。その後通常サンプルから得られた標準値が、疾患の症状がある被検者のサンプルから得られた値と比較される。標準値と被検者値との間の偏差が疾患状態の存在を立証する。薬物スクリーニングＨＰＫ、その触媒作用或いは免疫原性フラグメント或いはそのオリゴペプチドは、種々の薬物スクリーニング技術の任意のものにおいて治療化合物をスクリーニングするために用いることができる。そのような試験に用いられるフラグメントは、溶液中に遊離するか、固体支持体に付着するか、細胞表面上に結合するか、或いは細胞内に配置されてもよい。ＨＰＫと試験されている薬剤との間に複合体を結合する形成体が測定される。薬物スクリーニングに用いてもよい他の技術は、ＨＰＫへの適当な結合親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングを実現する（ＰＣＴ出願ＷＯ８４／０３５６４に記載されており、参照して本明細書の一部としている）。要約すると、多数の異なる小さなペプチド試験化合物がプラスチックピン或いはある他の表面のような固体基質上で合成される。ペプチド試験化合物はＨＰＫのフラグメントと反応し、洗浄される。その後結合されたＨＰＫは当分野で周知の方法により検出される。また実質的に精製されたＨＰＫは、上記の薬物スクリーニング技術において用いるためのプレート上に直接塗着される。別法では、非中和性抗体を用いて、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化することができる。また本発明は、ＨＰＫを結合することができる中和性抗体が、ＨＰＫを結合するための試験化合物と特に競合する、競合薬物スクリーニングアッセイを使用することを考慮する。この方法では、抗体を用いて、ＨＰＫと１つ或いはそれ以上の抗原性デターミナントを共有するあらゆるペプチドの存在を検出することができる。ＨＰＫをコードするポリヌクレオチドの診断及び治療への使用ここでＨＰＫコード化配列と呼ばれるポリヌクレオチド、或いはその一部は、診断並びにまた治療のために用いてもよい。診断に用いる場合には、本発明のＨＰＫコード化配列を用いて、ＨＰＫコード化配列の発現が影響を受けるバイオプシーを実施した組織において遺伝子発現を検出し、かつ定量することができる。診断測定法は、ＨＰＫコード化配列の欠如、存在及び過剰な発現を識別し、治療介入中のＨＰＫコード化配列の調節を監視するのに有用である。特定の組織におけるＨＰＫと障害及び疾患状態との関連は、これらの状態内でのＨＰＫ機能を決定することを狙った研究及びそれらを治療するための治療法の開発をかなり容易にするであろう。オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子、並びにＰＮＡが本発明の範囲に含まれる。本発明の別の実施例では、ゲノム配列、コード用ＨＰＫ或いは密接に関連した分子を含むポリヌクレオチド配列を検出することができるハイブリダイゼーション或いはＰＣＲプローブが実現される。プローブの特異性は、著しく特異な領域、例えば５’調節領域内の１０個の非反復ヌクレオチド、或いは特異性が低い領域、例えば特に３’領域のいずれから構成されても、ハイブリダイゼーション及び増幅の厳密性（最大、高い、中間、低い）と共に、プローブが自然発生ＨＰＫコード化配列のみ、アレル或いは関連配列のいずれを同定するかを確定する。またプローブは、関連配列の検出にも用いられ、好ましくは、これらのＨＰＫコード化配列の任意のものからのヌクレオチドを少なくとも５０％を含むべきである。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、配列番号：２、４並びに６のヌクレオチド配列から、或いはプロモータ、エンハンサ素子並びに自然発生ＨＰＫコード化配列のイントロンを含むゲノム配列から導出される場合がある。ハイブリダイゼーションプローブは、３２Ｐ或いは３５Ｓ、またはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに連結したアルカリ性ホスファターゼのような酵素性標識のような放射性核種等を含む種々のリポータ群により標識されることができる。ＨＰＫコード化配列ＤＮＡに対する特異性ハイブリダイゼーションプローブを生成するための他の手段は、ＨＰＫをコードする核酸配列のクローニング、或いはｍＲＮＡを生成するためのベクタ内へのＨＰＫ誘導体のクローニングを含む。そのようなベクタは当分野では知られており、市販されており、Ｔ７或いはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのような適当なＲＮＡポリメラーゼ及び適当な放射活性標識されたヌクレオチドを付加することによりｉｎｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いることができる。ＨＰＫをコードするポリヌクレオチド配列は、ＨＰＫの発現に関連する状態或いは疾患を診断するために用いることもできる。例えばＨＰＫをコードするポリヌクレオチド配列は、生検からの体液或いは組織のハイブリダイゼーション或いはＰＣＲアッセイにおいて用いられ、ＨＰＫコード化配列発現を検出することができる。そのような定性的或いは定量的方法の形成は、サザン或いはノーザン法、ドットブロット或いは他の膜用技術、ＰＣＲ技術、ディップスティック、ピン、チップ及びＥＬＩＳＡ技術を含む。これらの全ての方法は当分野では周知であり、多くの市販の診断キットの基礎となっている。ここで開示されるＨＰＫコード用ヌクレオチド配列は、特定の疾患と関連するＨＰＫコード化配列の活性化及び誘導を検出する測定法にための基準を与える。ＨＰＫコード用ヌクレオチド配列は、当分野で知られた方法により標識され、ハイブリダイゼーション複合体を形成するのに適した条件下で患者からの体液或いは組織に加えられることができる。インキュベーション期間の後、もしヌクレオチドが酵素で標識されているなら、サンプルは染料（或いは現像液を必要とする他の標識）を付加的に含む適合性液体を用いて洗浄される。適合性液体を洗い流した後、染料は定量化され、基準と比較される。生検された、或いは抽出されたサンプル内の染料の量が、適合性調節サンプルより著しく高くなるなら、そのヌクレオチド配列はサンプル内のヌクレオチド配列を用いてハイブリダイゼーションしており、サンプル内のＨＰＫコード用ヌクレオチド配列のレベルが高められたということは、関連した疾患が存在することを示す。またそのような測定法を用いて、動物研究、臨床試験、或いは個々の患者の治療を監視する際に、特定の治療法の有効度を高めることができる。疾患を診断するための基礎を与えるために、ＨＰＫコード化配列発現に対する通常の或いは標準のプロファイルが確立されなければならない。これは、動物或いはヒトのいずれかの正常な被検者から取り出された体液或いは細胞抽出物を、ハイブリダイゼーション或いは増幅に適した条件下でＨＰＫコード化配列或いはその一部と結合することにより達成される。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被検者の場合に得られた値を、同一の実験において行われた一連のＨＰＫコード化配列を希釈したものと比較することにより定量化されることができ、その実験では、既知の量の実質的に精製されたＨＰＫコード化配列が用いられる。正常なサンプルから得られた標準値は、ＨＰＫに関連した疾患に苦しむ患者のサンプルから得られた値と比較される。標準値と生検値との間の偏差を用いて、疾患の存在が立証される。一度疾患が立証されれば、治療薬が投与され、治療プロファイルが作成される。そのような測定法は、プロファイルの値が正常の或いは標準のパターンに向かって、或いは回復して進行するか否かを評価するために、規則的に繰り返されてもよい。有効な治療プロファイルを用いて、数日或いは数ヶ月に渡る治療の有効度を示すことができる。ＰＣＲを用いて、ＨＰＫ配列の基礎となるオリゴヌクレオチドに対する付加的な使用法を提供することもできる。そのようなオリゴマーは一般に化学的に合成されるが、酵素を用いて発生させても、或いは組換え体源から生成されてもよい。オリゴマーは一般に２つのヌクレオチド配列からなり、１つはセンス方向（５ ’→３’）を有し、他方はアンチセンス方向（３’←５’）を有しており、特異遺伝子或いは状態を同定するために最適化された条件下で用いられる。同一の２つのオリゴマー、入れ子状態のオリゴマーの組、或いはオリゴマーの縮重プールでさえ、密接に関連するＤＮＡ或いはＲＮＡ配列を検出し、定量化するために厳密性を欠いた条件下で用いてもよい。さらに、特定の分子の発現を定量化するために用いられることもできる方法は、放射性標識化（radiolabeling）或いはビオチン標識化（biotinylating）ヌクレオチド、調節核酸の相互増幅（coamplification）実験結果が書き込まれた標準曲線を含む（Melby PC et al（1993）J Immunol Methods 159:235-44;Duplaa C et al（1993）Anal Biochem 229-36）。多数のサンプルの定量化は、ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて測定法を実行することによる加速することができ、その実験フォーマットには、対象のオリゴマーが種々の希釈法において与えられ、スペクトル光測定或いは色測定反応が迅速な定量化を実現する。この種の最終的な診断により、医療専門家は、積極的な治療を開始し、状態がさらに悪化するのを防ぐことができるようになる。同様にさらに測定法を用いて、治療中の患者の進行状態を監視することができる。さらに、ここで開示されるヌクレオチド配列は、未だ開発されていない分子生物学技術において用いることもでき、提供された新規の技術は、トリプレットゲノムコード、特定の塩基対相互作用等の現在既に知られているヌクレオチド配列の特性によるものである。治療のために、ＨＰＫコード化配列のアンチセンス分子が基礎を与え、その治療では遺伝子の下方制御及びその結果生じる活性の抑制が望まれる。別法では、ＨＰＫをコードする配列は、ＨＰＫの発現が増加し、それによりその活性が増加することが望まれる状態において遺伝子治療のための基礎を与えることができる。発現ベクタは、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス或いはワクシニアウイルスから、また種々の細菌性プラスミドから導出され、標的となる器官、組織或いは細胞集団にヌクレオチド配列を運ぶために用いられる場合がある。当業者には周知の方法を用いて、アンチセンスＨＰＫを発現する組換えベクタを構成することができる。例えば、Sambrook等(上記)及びAu subel等(上記)に記載される技術を参照されたい。ＨＰＫをコードする完全長ｃＤＮＡ配列並びにまたその調節素子からなるポリヌクレオチドは、遺伝子機能のセンス或いはアンチセンス調整における研究ツールとして調査に用いてもよい(Youssoufian H and HF Lodish 1993 Mol Cell Bio l 13:98-104;Eguchi et al(1991)Annu Rev Biochem 60:631-652)。そのような技術は現在当分野では周知されており、センスオリゴマー或いはアンチセンスオリゴマー、またはより大きなフラグメントが、コード用或いは調節領域に沿った種々の位置から設計されることができる。ＨＰＫをコードする遺伝子は、所望のＨＰＫコード化配列フラグメントを高レベルで発現する発現ベクタを細胞或いは組織に形質移入することにより遮断されるようになる。そのような構成物は、細胞を非翻訳センス或いはアンチセンス配列で満たす。ＤＮＡ内に統合されない場合であっても、そのようなベクタは、全ての複製が内因性ヌクレアーゼにより無能にされるまで、ＲＮＡ分子を転写し続けることができる。一過性の発現は、非複製ベクタを用いて一ヶ月或いはそれ以上の間持続し、適当な複製素子がベクタ系の一部であるならさらに長く持続するようになる（Mettler I,personal communication）。上述のように、遺伝子発現の修飾は、ＨＰＫコード化配列の調節領域、すなわちプロモータ、エンハンサ並びにイントロンに対してアンチセンス分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ或いはＰＮＡを設計することにより得られるようになる。転写開始部位、すなわちリーダ配列の−１０と＋１０領域の間から導出されたオリゴヌクレオチドが好ましい。またアンチセンス分子は、転写物がリボソームに結合するのを防ぐことによりｍＲＮＡの翻訳を阻止するように設計される。同様に、三重らせん塩基対技術を用いて抑制を実現することができる。三重らせん対は二重らせんの能力に近くなり、ポリメラーゼ、転写因子或いは調節分子の結合のために十分に開く。三重ＤＮＡを用いる最近の治療の進歩は、Gee JE et al(In:Huber BE and BI Carr（1994）Molecular and Immunologi c Approaches,Futura Publishing Co.Mt Kisco NY)に記載された。リボザイムは、ＲＮＡの特異性分割に触媒作用することができる酵素ＲＮＡ分子である。リボザイム活性機構は、相補的標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特定ハイブリダイゼーションを伴い、それにヌクレオチド鎖切断分割が伴う。別の実施例は、特異にしかも有効にＨＰＫコード化配列のヌクレオチド鎖切断分割に触媒作用することができるハンマヘッド状リボザイムの工業化を含む。任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異なリボザイム分割部位は、配列、ＧＵＡ、ＧＵＵ並びにＧＵＣを含むリボザイム分割部位に対して標的分子を走査することにより最初に同定される。一度同定されれば、分割部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオチドを無能にする二次構造機構に対して評価されることができるまた候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的なオリゴヌクレオチドについてハイブリダイゼーションへの実施容易性を試験することにより評価することができる。本発明のアンチセンス分子及びリボザイムは、ＲＮＡ分子の合成に関する当分野で知られた任意の方法により調製されることができる。これらは、固相ホスホラミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成するための方法を含む。別法では、ＲＮＡ分子は、ＨＰＫをコードするＤＮＡ配列のｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏ転写により発生させることができる。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７或いはＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメラーゼプロモータと共に広範なベクタ内に組み込まれる場合がある。別法では、アンチセンスｃＤＮＡ構成物は、構造的に或いは誘導的にアンチセンスＲＮＡを合成し、細胞株、細胞或いは組織内に導入されることができる。ＲＮＡ分子を修飾して、細胞内安定性及び半減期を改善することもできる。可能な修飾は、限定するわけではないが、分子の５’並びにまた３’末端でのフランキング配列の付加、或いは分子のバックボーン内のホスホジエステラーゼではなくホスホロチオネート或いは２’Ｏ−メチルの使用を含む。この概念はＰＮＡの生成に固有のものであり、イノシン、キュェオシン及びワイブトシン並びにアセチル−、メチル−、チオ−、及び内因性エンドヌクレアーゼにより容易に識別されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンの同様に修飾された形成体のような従来にはない塩基の含有物によるこれらの全分子に拡張されることができる。細胞或いは組織内のベクタを導入するための方法は、以下に議論する方法及びｉｎｖｉｖｏ、ｉｎｖｉｔｒｏ並びにｅｘｖｉｖｏ治療のために同じく適した方法を含む。ｅｘｖｉｖｏ治療の場合、ベクタは、患者から取り出された基幹細胞内に導入され、同じ患者に戻される自家移植物に対してクローンを繁殖することができる。形質移入及びリポソームによる配達は、当業者に周知されている。さらにここで開示されるＨＰＫコード化配列のためのヌクレオチド配列は、未だ開発されていない分子生物学技術において用いることができ、提供される新規の技術は、限定はしないが、トリプレットゲノムコード及び特異塩基対相互作用のような特性を含む、現在既知のヌクレオチド配列の特性による。関連するポリヌクレオチド配列の検出及びマッピングまたＨＰＫのための核酸配列を用いて、自然発生ゲノム配列をマッピングするためのハイブリダイゼーションプローブを生成することもできる。その配列は、周知の技術を用いて特定のクロモソームに、或いはクロモソームの特異領域にマップ化される。これらは、クロモソームスプレツド（chromosome spread）とのｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション、フローソートされたクロモソーム標本（flow-sorted chromosomal preparation）、或いはPrice CM(1993;Blood Rev 7 :127-34)及びTrask BJ(1991;Trends Genet 7:149-54)に記載されるような、酵母菌人工クロモソーム、細菌性人工クロモソーム、細菌性Ｐ１構造或いは単一クロモソームｃＤＮＡライブラリのような人工クロモソーム構造体を含む。クロモソームスプレッドの蛍光性ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションの技術は、Verma et al(1988)Human Chromosomes:A Manual of Basic Techniques,Pe rgamon Press,New York NYに記載されている。クロモソーム標本の蛍光性ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び他の物理的なクロモソームマッピング技術は、付加的な遺伝マップデータと相関性が示される。遺伝子マップデータの例は 1994 Genome Issue of Science(265:1981f)に見出すことができる。物理的クロモソームマップ上のＨＰＫコード化配列の位置と特定の疾患（或いは特定の疾患に対する素因）との間の相関は、その遺伝的疾患に関連するＤＮＡの領域の境界を定めることを可能にする。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者と担体或いは感染した個体との間の遺伝子配列における差を検出することができる。クロモソーム標本のｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び確立されたクロモソームマー力を用いるリンケージ解析のような物理的マッピング技術は、遺伝子マップを拡張するために用いることができる。例えば、ヒト遺伝子の配列標識部位用マップ（sequence tagged site based map）が最近Wh itehead-MIT Center for Genomic Research(Hudson TJ et al(1995)Science 270 :1945-1954)により確立された。しばしばマウスのような別の哺乳動物種のクロモソーム（Whitehead Institute/MIT Center for Genomic Research，Genetic M ap of the Mouse,Database Release 10,April 28,1995）上の遺伝子の配列は、特定のヒトクロモソームの数或いは腕が未知であっても関連したマー力を明らかにすることができる。新規の配列は、物理的なマッピングによりクロモソーム腕或いはその一部に割り当てることができる。これは、位置クローニング或いは他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を検索する研究者に貴重な情報を与える。一度、毛細管拡張性運動失調（ＡＴ）のような疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域、例えばAT to 11q22-23(Gatti et al(1998)Nature 336:577-580)への遺伝的リンケージにより初期状態で局部に制限されれば、その領域に対する任意の配列マッピングが、さらに研究するための関連した或いは調節遺伝子を表すことができる。また本発明のヌクレオチド配列を用いて、転座、すなわち正常個体と担体或いは感染個体との間の逆位等によりクロモソーム位置内の差を検出することができる。医薬品組成物本発明は医薬品組成物に関連し、その医薬品組成物は、単独のヌクレオチド、蛋白質、抗体、作動剤、拮抗剤或いは阻害剤、または、限定はしないが、緩衝食塩水、デキストロース並びに水を含む任意の無菌の生体活性医薬品担体において投与されることがある、安定化化合物のような少なくとも１つの他の医薬品との組み合わせからなる。これらの任意の分子は、単独で、或いは医薬品添加物或いは製薬的に許容可能な担体と混合される医薬品組成物において、他の医薬品、薬物或いはホルモンと組み合わせて患者に投与されることができる。本発明の一実施例では、製薬的許容担体は製薬的に不活性である。医薬品組成物の投与医薬品組成物は、限定はしないが、ヒト及び家畜を含む治療を要する任意の被検者に投与されることができる。医薬品組成物の投与は、経口的に或いは非経口的に行われる。非経口配達の方法は、局所的な、動脈内（直接腫瘍への）投与、筋肉内投与、皮下投与、骨髄内投与、クモ膜下投与、心室内投与、静脈内投与、腹膜内投与、鼻腔内投与を含む。活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物は、製薬的に用いることができるプレパレート内への活性化合物の処理を容易にする医薬品添加物及び補助剤からなる適当な製薬的に許容可能な担体を含む場合もある。さらに製剤及び投与に関する技術の詳細は、「Remington's Pharmaceut ical Sciences」(Maack Publishing Co.Easton PA)の最新版に見出される。経口投与の場合の医薬品組成物は、経口投与に適した投与量において当分野で周知の製薬的に許容可能な担体を用いて調剤することができるそのような担体により、医薬品組成物は、患者が経口摂取するために、錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤等として調剤されることができる。経口投与するための医薬品調剤は、活性化合物と固形の医薬品添加物とを混合して、選択によってはその混合物を細かく砕いて、さらに所望に応じて、錠剤或いは糖衣剤コアを得るために適当な補助剤を加えた後、顆粒剤の混合物を処理することにより得ることができる。適当な医薬品添加物は、ラクトース、スクロース、マンニトール或いはソルビトールを含む糖、トウモロコシ、小麦、米、じゃがいも、或いは他の植物からのデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのようなセルロース、並びにアラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、及びゼラチン及びコラーゲンのような蛋白質のような炭水化物或いは蛋白質フィルタである。必要なら、架橋結合されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸或いはアルギン酸ナトリウムのようなその塩のような、崩壊剤或いは可溶化剤が加えられてもよい。糖衣剤コアは濃縮糖液のような適当なコーティングを被着され、その濃縮糖液は、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル（carbop ol gel）、ポリエチレングリコール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液並びに適当な有機溶剤あるいは溶剤混合物を含む場合もある。染料或いは色素が、製品識別、すなわち活性化合物の量、すなわち投与量を特徴付けるために、錠剤或いは糖衣錠コーティングに加えられる場合もある。経口投与される医薬品製剤は、ゼラチンからなる押込嵌め式のプッシュフィットカプセル剤、並びにゼラチン、及びグリコール或いはソルビトールのようなコーティングからなる緩く封止されたソフトシールカプセル剤を含む。プッシュフィットカプセル剤は、ラクトース或いはデンプンのようなフィルタ或いは結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、さらに必要なら安定化剤と混合された活性処方成分を含むことができる。ソフトシールカプセル剤では、活性化合物は、脂肪油、パラフィン油、或いは安定化剤を用いて用いなくてもよいが液体ポリエチレングリコールのような適当な溶液内の溶解或いは懸濁されている場合がある。非経口投与のための医薬品製剤は、活性化合物の水溶液を含む。注入するために、本発明の医薬品組成物は、水溶液内で、好ましくはハンクス溶液、リンガー溶液或いは生理緩衝食塩水のような生体適合性緩衝液内で調製される。水性の注入懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール或いはデキストランのように、懸濁液を増粘する物質を含む場合がある。さらに、活性化合物の懸濁液は、適当な油性の注入懸濁液として調製される場合もある。適当な親油性溶剤或いは賦形剤は、ゴマ油のような脂肪油、或いはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、或いはリポソームを含む。さらに、懸濁液は、高濃縮の溶液の調製を可能とするために化合物の可溶性を増加させる適当な安定化剤或いは薬剤を含むこともできる。局所或いは鼻腔投与の場合、特定の障壁を浸透させるのに適した浸透剤が調製において用いられる。そのような浸透剤は当分野で一般に知られている。製造及び保管本発明の医薬品組成物は、当分野において知られた、例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣形成、微粒子化、乳状化、カプセル化、封入（entrapping）或いは凍結乾燥処理による方法で製造される。医薬品組成物は塩類として提供され、限定はしないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸等の多くの酸を用いて形成することができる。塩類は、対応する遊離塩基形である水性或いはプロトン性溶剤における可溶性を高める傾向がある。他の場合に好ましい製剤は、使用に先だって緩衝剤と結合されたｐＨ範囲４．５−５．５の１ｍＭ−５０ｍＭヒスチジン、０．１％−２％スクロース、２％−７％マンニトールの状態の凍結乾燥粉末である。許容可能な担体内に調剤された本発明の化合物からなる医薬品組成物が調製された後、それらは適当な容器に入れられ、指示された条件の治療のためにラベルを貼るようにする。ＨＰＫの投与の場合、そのようなラベル貼付は、投与の量、頻度並びに方法を含むであろう。製薬的に有効な投与量本発明に用いるために適した医薬品組成物は、活性処方成分が目的を果たすための有効な量において含まれる組成物を含む。有効な量を投与することは、当業者の能力内で果たし得るものである。任意の化合物の場合、製薬的に有効な量は、例えば腫瘍細胞の細胞培養アッセイ、或いは通常マウス、ウサギ、イヌ或いはブタの動物標本のいずれかにおいて最初に見積もられる。また動物標本を用いて、所望の濃縮範囲及び投与の経路が達成される。その後そのような情報を用いて、ヒトに投与するための有効な量及び経路を確定することができる。製薬的に有効な量は、症状或いは状態を改善する蛋白質或いはその抗体、拮抗体、或いは阻害剤の量のことである。そのような化合物の治療への有効度及び毒性は、細胞培養或いは実験動物における標準的な製薬的手順、例えばＥＤ５０（集団の５０％において製薬的に有効な量）及びＬＤ５０（集団の５０％が致死する量）により確定することができる。治療効果と毒性効果の投与量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表される。大きな治療誘導性を表す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータは、ヒトに投与するために量の範囲を処方する際に用いられる。そのような化合物の投与量は、毒性が非常に少ないか或いは全くないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、用いられる投与形態、患者の感度、並びに投与経路によりこの範囲内で変化する。厳密な投与量は、治療される患者を診察する個々の医師により選択される。量及び投与を調整して、十分なレベルの活性成分を与えたり、或いは所望の効果を維持したりする。考慮されてもよいさらに別の要因は、疾患の過酷さ、例えば腫瘍の大きさ及び場所、患者の年齢、体重、性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組み合わせ、反応への敏感度、並びに治療に対する抵抗性／反応を含む。特定の製薬の半減期及びクリアランス率により、３〜４日毎、毎週、或いは４週間毎に一度、活性が持続する医薬品組成物が投与されてもよい。通常の投与量は、投与の経路にもよるが、０．１μｇ〜１００，０００μｇまで変化し、全投与量は約１ｇまでである。詳細な投与量及び配達の方法に関する手引きは、一般に科学文献で入手できる。当業者は、蛋白質或いはその阻害剤ではなく、ヌクレオチドのための異なる剤形を用いるであろう。同様に、ポリヌクレオチド或いはポリペプチドに配達は特定の細胞、状態、位置等に対して特異であろう。例えば、ＨＰＫの抗体或いはＨＰＫ誘導体のようなＨＰＫ活性を修飾する分子或いは化合物が、治療剤として適当な製剤中に配達されることができることが考慮される。同様に、作動剤の投与も、この蛋白質の活性或いは寿命を改善し、老化の発症及び進行を低減すべきである。以下の例は、本発明を例示するために与えられ、本発明を制限するためのものではない。産業上の利用可能性ＩＨＰＫ−１ＨＩＰＯＮＯＴＯ１ｃＤＮＡライブラリ構成このライブラリのために用いられる海馬は、Keystone Skin Bank,Internation al Institute for the Advancement of Medicine(Exton,PA)から得られた。７２歳白人女性（ＲＦ９４−０９０８３）からの海馬組織は、瞬間凍結され、乳鉢及び乳棒を用いて砕かれ、グアニジニウムイソチオシアネートを含む緩衝液内に溶解された。溶解の後、数回のフェノールクロロホルム抽出及びエタノール沈殿を行った。常磁性体粒子に結合したビオチン標識化オリゴｄ（Ｔ）プライマ及びストレプトアビジン（Promega Corp,Madison WI）を用いて分離され、Stratageneに送った。Stratageneはオリゴｄ（Ｔ）プライミングを用いてｃＤＮＡライブラリを調製した。合成アダプタオリゴヌクレオチドは、それらをUni-Zap^TM vector system(Stratagene)に挿入することができるようにするｃＤＮＡ分子に結合させた。ｃＤＮＡライブラリの品質は、ＤＮＡプローブを用いてスクリーニングされ、その後pBluescript phagemid(Stratagene)が切除された。次に、特別に形成されたライブラリファージ粒子が、E.coli host st rain XL 1 Blue(Stratagene)に感染した。代替の一方向性ベクタは、限定はしないが、pcDNAI(Invitrogen)及びpSHlox-1(Novagen)を含む場合もある。個別のｃＤＮＡクローンからなるファージミド形成体は、ｉｎｖｉｖｏ切除プロセスにより得られ、そこでは宿主菌株がライブラリファイ時及びｆ１ヘルパーファージの両方と共通に感染した。ライブラリ含有ファージとヘルパーファージの両方から導出されたポリペプチド或いは酵素がＤＮＡに切れ目を入れ、標的ＤＮＡ上の画定された配列から新規のＤＮＡ合成を開始し、さらにpBluescript phagemid及びｃＤＮＡ挿入物の全ＤＮＡ配列を含む小さな、一本鎖環状ファージミドＤＮＡ分子を生成した。ファージミドＤＮＡは細胞から遊離され、精製され、さらに二本鎖ファージミドＤＮＡが生成された新鮮な宿主細胞（SOLR，Strata gene）を再感染するために用いられた。ファージミドはβ−ラクタマーゼのための遺伝子を運ぶため、新規に形質転換されたバクテリアがアンピシリンを含む培地上で選択された。ファージミドＤＮＡは、QIAGEN DNA Purification System(QIAGEN Inc．Ch atsworth，CA)が提供するQIAWELL-8 Plasmid Purification Systemを用いて精製された。ＤＮＡは精製樹脂から溶離され、ＤＮＡ配列化及び他の解析的操作のために準備された。ＩＩＨＰＫ−２ＴＭＬＲ３０Ｔ０１ｃＤＮＡライブラリ構成このライブラリのために用いられる正常の末梢血流Ｔ−リンパ球は２人の２４歳白人男性から得られた。このライブラリは、フィコールーハイパック法で精製されたバッフィコートから得られる同種間で刺激されたヒトＴ細胞集合体の混合物を表す。２人の異なるドナー（ＨＬＡアレルに対して分類されていない）からの細胞が、１×１０６／ｍｌの密度でインキュベートされ、１０％ヒト血清を含むＤＭＥ内で９６時間培養され、ＰＢＳ内で洗浄され、切屑され、グアニジニウムイソチオシアネートを含む緩衝液内に即座に溶解した。溶解物はフェノール及びクロロホルムｐＨ８．０の混合物を用いて２回抽出され、L8-70M Ultracentri fuge(Beckman Instruments)のBeckman SW28ロータを用いてＣｓＣｌ緩衝体上に遠心分離された。ＲＮＡは３７℃で１５分間処理された水及びデオキシリボヌクレアーゼ内に再懸濁された、０．３Ｍ酢酸ナトリウム及び２．５体積のエタノールを用いて沈殿析出された。全ＲＮＡが、Qiagen Oligotex kit(QIAGEN Inc．Ch atsworth CA)を用いて分離された。Ｂリンパ球は除去されず、またある汚染したマクロファージも存在する場合もあったということに注目されたい。Stratagene (La Jolla CA)は全ＲＮＡを用いて、全ＲＮＡが概ね上述のようなカスタムｃＤＮＡライブラリを構成した。ｃＤＮＡはLambdaZap^TM vector system(Stratagene )内に挿入され，そのベクタはＥ．ｃｏｌｉストレーンXL1-BlueMRF(Stratagene) の細胞内に形質転換された。個々のｃＤＮＡクローンのファージミド形は、前述のｉｎｖｉｖｏ切除プロセスにより得られた。プラスミドＤＮＡは、前述したMiniprep Kit(Catalogue #77468;Advanced Gen etic Technologies Corporation，Gaithersburg MD)を用いて、細胞から分離され、精製された。プラスミドＤＮＡを精製する別の方法は、MAGIC MINIPREPS-DN A Purification System(Catalogue #A7100，Promega，Madison WI)或いはQIAwel l-8 Plasmid，QIAwell PLUS DNA及びQIAwell ULTRA DNA Purification Systems( QIAGEN Chatsworth CA)を使用することを伴う。ＩＩＩＨＰＫ−３ＭＰＨＧＮＯＴＯ３ｃＤＮＡライブラリ構成末梢血が、２４歳白人男性から得られた。単核細胞は、Sigma Diagnostics(St Louis MO)から市販されているHISTOPAQUE(登録商標)-1119及びHISTOPAQUE(登録商標)-1077を用いてFicoll/Hypaqueを介して遠心分離した後、ヘパリン添加静脈血から分離された。末梢血単核細胞を含むFicoll/Hypaqueバッフィコートは無菌のシャーレ内に置かれ、１０％ヒト血清を追加したダルベッコの最小必須培養液（ＤＭＥ）内で３〜５日間培養された。インキュベーションの後、マクロファージは大部分プラスチック表面に付着したが、ほとんどの他の細胞種、Ｂ及びＴリンパ球は、培養液中に残されたままであった。ＤＭＥはウエル（well）からデカントされ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄された。マクロファージは、 PBS/1mM EDTA内でシャーレを静かに切屑することにより、プラスチック表面から分離された。マクロファージは、グアニジニウムイソチオシアネートを含む緩衝液内に即座に溶解した。溶解物はフェノール及びクロロホルムｐＨ８．０の混合物を用いて２回抽出され、L8-70M Ultracentrifuge(Beckman Instruments)のBeckman SW28ロータを用いてＣｓＣｌ緩衝体上に遠心分離された。ＲＮＡは３７℃で１５分間処理された水及びデオキシリボヌクレアーゼ内に再懸濁された、０．３Ｍ酢酸ナトリウム及び２．５体積のエタノールを用いて沈殿析出された。全ＲＮＡが、Qiag en Oligotex kit(QIAGEN Inc，Chatsworth CA)を用いて分離された。ある汚染したＴ及びＢリンパ球も存在する場合があったということに注目されたい。ポリＡ＋ＲＮＡはを用いて、ＭＰＨＧＮＯＴＯ３ｃＤＮＡライブラリを構成し、個々のｃＤＮＡクローンのファージミド形がｉｎｖｉｖｏ切除プロセスにより得られ、プラスミドＤＮＡが、上記のようなMiniprepKit(Catalogue #77468 ．Advanced Genetic Technologies Corporation,Gaithersburg MD)を用いて細胞から分離及び再生された。ＩＶｃＤＮＡクローンの配列決定ｃＤＮＡは、４つのPeltier Thermal Cyclers（PTC200 from MJ Research，Wa tertown MA)とApplied Biosystems 377 or 373 DNA Sequencing Systems(Perkin Elmer)とを組み合わせてCatalyst 800Hamilton Micro Lab 2200(Hamilton，Ren o NV)を用いて、Sanger F and AR Coulson(1975;J Mol Biol 94:441f)の方法により配列化され、読み枠が確定された。ＶｃＤＮＡクローン及びその推定蛋白質の相同性検索各ｃＤＮＡはApplied Biosystemsにより開発された検索アルゴリズムを用いて GenBank内の配列と比較され、INHERIT^TM 670 Sequence Analysis System内に組み込まれた。このアルゴリズムでは、Pattern Specification Language(TRW Inc ．Los Angeles CA)を用いて、相同性の領域を確定した。配列比較が如何に実行されるかを確定する３つのパラメータはウインドウサイズ、ウインドウオフセット並びに誤差許容量である。これらの３つのパラメータの組み合わせを用いて、ＤＮＡデータベースは問合わせ配列に相同性を有する領域を含む配列を検索され、適当な配列が初期値で与えられる。その後、これらの相同性領域はドットマトリクス相同性プロットを用いて試験され、相同性の領域と偶然の一致とを区別した。Smith-Waterman配列を用いて、相同性検索の結果を表示した。ペプチド及び蛋白質配列相同性は、ＤＮＡ配列相同性に用いられる方法と同様の方法を用いるINHERIT^TM 670 Sequence Analysis Systemを用いて確認された。Pa ttern Specification Language及びパラメータウインドウを用いて、初期値で与えられた相同性の領域を含む配列に対する蛋白質データベースを検索した。ドットマトリクス相同性プロットが試験され、著しい相同性を有する領域と偶然の一致とを区別した。 Basic Local Alignment Search Tool(Altschul SF（1993）J Mol Evol 36:290 -300;Altschul，SF et al（1990）J Mol Biol 215:403-10)を表すＢＬＡＳＴを用いて、局部配列を検索した。ＢＬＡＳＴは、ヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方の配列を生成し、配列類似性を確定する。配列の局部的な性質のため、ＢＬＡＳＴは特に厳密な一致の判定或いは相同性の同定時に有効である。ＢＬＡＳＴは間隙を含まない一致に対して有効である。ＢＬＡＳＴアルゴリズム出力の基本的な単位はHigh-scoring Segment Pair(HSP)である。ＨＳＰは、任意であるが、等しい長さを有する２つの配列フラグメントからなり、その長さの配列は局部的に最大であり、しかも配列スコアは使用者により設定される閾値或いはカットオフスコアを満足するか或いはそれを超えるものである。ＢＬＡＳＴアプローチは、問合せ配列とデータベース配列との間のＨＳＰを検索し、見出されたあらゆる一致の統計的有意性を評価し、かつ使用者により選択された有意性の閾値を満足する一致のみを報告するものである。パラメータＥはデータベース配列との一致を報告するために統計的に有意な閾値を確立する。Ｅは、全データベース検索の環境内でＨＳＰ（或いはＨＳＰの組）の機会が生じる予想頻度の上限として解釈される。データベース配列との一致がＥを満足するものが、プログラム出力で報告される。ＶＩノーザン解析遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技術であり、特定の細胞種或いは組織からのＲＮＡが結合されている膜に対する標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う（Sambrook等、上記）。ＢＬＡＳＴ（Altschul SF 1993 and 1990上記）を用いる類推コンピュータ技術（analogous computer technique）を用いて、GenBank或いはLIFESEQ^TM datab ase(Incyte，Palo Alto CA)のようなヌクレオチドデータベース内の同一の或いは関連する分子を検索する。多数の膜を用いるハイブリダイゼーションより非常に速度が速い。さらに、コンピュータ検索の感度を変更して、任意の特定の一致が、厳密な一致、或いは相同と分類されるか否かを確定することができる。検索の基準は、％配列密度×％最大ＢＬＡＳＴスコア／１００として定義される積スコアであり、２つの配列間の類似度及び配列一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア４０の場合、その一致は１−２％の範囲内で正確であり、７０ではその一致は正確であろう。相同性を有する分子は通常、１５−４０間の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが、それより低いスコアでも関連した分子が同定される場合もある。ＶＩＩ完全長或いは回復調節素子に対するＨＰＫの伸展完全長ＨＰＫコード化配列（配列番号：２、４或いは６）の核酸配列を用いて、部分ヌクレオチド配列を完全長まで伸展するための、或いはゲノムライブラリから５’配列を得るためのオリゴヌクレオチドプライマを設計する。１つのプライマを合成して、アンチセンス方向（ＸＬＲ）に伸展を開始し、他のプライマを合成して、センス方向（ＸＬＦ）に配列を伸展する。プライマにより、既知のＨＰＫコード化配列の伸展が、対象の領域に対する新規で未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを「外側に」発生させるようになる（米国特許出願第０８／４８７，１１２号）。初期プライマは、OLIGO(登録商標)4.06 Primer Analysis Software(National Biosciences)或いは他の適当なプログラムを用いてｃＤＮＡから設計され、長さ２２−３０のヌクレオチドになり、５０％以上のＧＣ含有物を有し、約６８−７２℃の温度で標的配列にアニーリングする。ヘアピン構造及びプライマープライマ２量体化をもたらすことになるヌクレオチドのあらゆる伸長は避けられる。起源の選択されたｃＤＮＡライブラリ或いはヒトゲノムライブラリを用いて配列を伸展する。後者は５’上流領域を得るのに最も有効である。さらに伸展が必要或いは要求される場合には、追加のプライマの組が既知領域をさらに伸展させるために設計される。 XL-PCR kit(Perkin Elmer)用の取扱説明書に従って、完全に酵素及び反応混合物を混合することにより、高い忠実度を有する増幅が得られる。各プライマを４０ｐｍｏｌで、かつキット全ての他の成分を推奨された濃度で開始するとき、ＰＣＲはPeltier Thermal Cycler(PTC200;MJ Researc h，Watertown MA)及び以下のパラメータを用いて実行される。ステップ１１分間９４℃（初期変性）ステップ２１分間６５℃ ステップ３６分間６８℃ ステップ４１５秒間９４℃ ステップ５１分間６５℃ ステップ６７分間６８℃ ステップ７さらに１５サイクル間ステップ４−６の繰返しステップ８１５秒間９４℃ ステップ９１分間６５℃ ステップ１０７分１５秒間６８℃ ステップ１１１２サイクル間ステップ８−１０の繰返しステップ１２８分間７２℃ ステップ１３４℃（保持）反応混合物の５−１０μｌ部分標本が低濃度（約０．６−０．８％）アガロースミニゲルにおける電気泳動により解析され、反応物が配列の伸展に成功したかを判定する。最も大きな生成物が含むと考えられる帯が選択され、そのゲルが切除された。さらに精製は、QIA Quick^TM(QIAGEN Inc.)のような市販のゲル抽出方法を使用することを伴う。ＤＮＡの回復の後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素を用いて、再連結及びクローニングを容易にするブラントエンドを生成する一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを切り取る。エタノール沈殿の後、その生成物は１３μｌの結合緩衝剤中に再溶解される。１μｌＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５ユニット）及び１μｌＴ４ポリヌクレオチドキナーゼが加えられ、その混合物は、１６℃で２〜３時間或いは一晩の間室温でインキュベートされる。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（４０＆ｌの適当な媒質）が３μｌの結合混合物と形質転換され、８０＆ｌのＳＯＣ媒質内で培養される（Sambrook J et等、上記）。３７℃で１時間インキュベートした後、全形質転換混合物が、２ｘＣａｒｂを含むLuria Bertani(LB)-agar(Sambrook J等、上記) 上で培養される。翌日、いくつかのコロニーが各プレートから無作為に選び取られ、適当な市販の無菌の９６ウエル微量定量プレートの個々のウエル内に配置される１５０μｌの液体ＬＢ／２ｘＣａｒｂ媒質内で培養される。翌日、５μｌの各一晩おいた培養株が非無菌の９６ウエルプレートに移入され、水で１：１０に希釈された後、５μｌの各サンプルがＰＣＲアレイ内に移入される。ＰＣＲ増幅の場合、伸展反応のために用いられる、４ユニットのｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ベクタプライマ並びに１つ或いは両方の遺伝子特異性プライマを含む１８μｌの濃縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）が各ウエルに加えられる。増幅は以下の条件を用いて実行される。ステップ１６０秒間９４℃ ステップ２２０秒間９４℃ ステップ３３０秒間５５℃ ステップ４９０秒間７２℃ ステップ５さらに２９サイクルの間ステップ２−４の繰返しステップ６１８０秒間７２℃ ステップ７４℃（保持）ＰＣＲ反応物の部分標本が、分子重量マー力と共にアガロースゲル上で処理される。ＰＣＲ生成物の大きさは、起源の部分ｃＤＮＡと比較され、適当なクローンが選択され、プラスミドに結合され、配列される。ＶＩＩＩ標識化及びハイブリダイゼーションプローブの使用配列番号：２から導出されるハイブリダイゼーションプローブは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ或いはｍＲＮＡをスクリーニングするために用いられる。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識化が特に記載されるが、より大きなｃＤＮＡフラグメントにも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4. 06(National Biosciences)のような業界で用いられるソフトウエアにより設計され、５０ｐｍｏｌの各オリゴマと２５０ｍＣｉの[-³²Ｐ]アデノシントリホスターゼ(Amersham，Chicago IL)及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPont NEN(登録商標),Boston MA)とを組み合わせることにより標識される。標識されたオリゴヌクレオチドは、Sephadex G-25 super fine resin column(Pharmacia)を用いて実質的に精製される。センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドをそれぞれ１０⁷カウント／分含む部分は、以下のエンドヌクレアーゼの１つ(Ase I，Bgl Il Eco RI，Pst I．Xba 1．or Pvu II;DuPont NEN(登録商標))で消化されるヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜に基づくハイブリダイゼーション解析において用いられる。各消化物からのＤＮＡは、０．７％アガロースゲルに分割され、ナイロン膜(N ytran Plus,Schleicher & Schuell,Durham NH)に転写される。ハイブリダイゼーションは、4０℃で１６時間実行される。非特異性シグナルを除去するために、ブロットは、０．１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムまでの徐々に厳密性を増す条件下で室温にで順次洗浄される。XOMAT AR^TM film(Kodak,Rochester NY)が数時間Phosphoimager cassette(Molecular Dynamics，Synnyvale CA)内でブロットに暴露された後、ハイブリダイゼーションパターンが視覚的に比較される。ＩＸアンチセンス分子ＨＰＫコード化配列或いはその任意の一部を用いて、自然発生ＨＰＫコード化配列のｉｎｖｉｖｏ及びｉｎｖｉｔｒｏ発現を抑制する。約２０塩基対からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用が特に記載されるが、より大きなｃＤＮＡフラグメントにも概ね同じ方法を用いる。例えば、第ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ並びにＩＤ図に示されるＨＰＫ−１のコード化配列に基づくオリゴヌクレオチドを用いて、自然発生ＨＰＫの発現を抑制する。相補性オリゴヌクレオチドは、第１Ａ、１Ｂ、１Ｃ並びに１Ｄ図に示される最も独特な５’配列から設計され、リボソームが結合するのを防ぐことによりＨＰＫコード化配列転写物の翻訳を抑制するために用いられる。配列番号：２のリーダ配列及び５’配列の適当な一部を用いるとき、有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、第１Ａ、１Ｂ、１Ｃ並びに１Ｄ図に示されるようなポリペプチドのシグナル或いは初期コード化配列に翻訳する領域に及ぶ任意の１５−２０ヌクレオチドを含む。ＸＨＰＫの発現ＨＰＫの発現は、適当なベクタ内にｃＤＮＡをサブクローニングし、ベクタを宿主細胞に形質移入することにより実現される。この場合に、ｃＤＮＡライブラリの発生のために以前に用いられたクローニングベクタｐＳｐｏｒｔを用いて、クローニング部位のＥ．ｃｏｌｉ上流内にＨＰＫを発現し、このベクタはβ−ガラクトシダーゼのためのプロモータを含み、アミノ末端Ｍｅｔ及び後続のβ−ガラクトシダーゼの７残基を含む配列が後続する。直後に続くこれらの８残基は、転写のために有用なバクテリオファージプロモータ及びいくつかの独特の制限部位を含むリンカーである。標準的な方法を用いてＩＰＴＧを有する分離され、形質移入されたバクテリアストレーンの誘導は、β−ガラクトシダーゼの最初の７残基、リンカーの約５〜１５残基並びに完全長ＨＰＫからなる融合蛋白質を生成する。シグナル配列は、活性化のために以下の測定法において直接用いることができるバクテリア成長媒質内に、ＨＰＫの分泌を促す。ＸＩＨＰＫ活性化ＨＰＫ活性化は、γ一標識化³²Ｐ−ＡＴＰを用いる蛋白質基質のリン酸化により、さらにγ放射線同位元素カウンタを用いる組み込まれた放射能の定量化により測定されることができる。ＨＰＫは、蛋白質基質、³²Ｐ−ＡＴＰ並びにキナーゼ緩衝剤を用いてインキュベートされる。基質内に組み込まれた³²Ｐは、その後電気泳動により遊離した³²Ｐ−ＡＴＰから分離され、組み込まれた³²Ｐがカウントされる。リン酸化された特異なアミノ酸残基の判定は、Boyle WJ et al（1991 ）Methods in Enzymol 201:110-148により記載されるようなホスホアミノ酸（ph osphoamino acid）解析により行われる。ＸＩＩＨＰＫ特異性抗体の生成ＰＡＧＥ電気泳動(Sambrook)を用いて実質的に精製されたＨＰＫを用いて、ウサギを免疫し、標準的なプロトコルを用いて抗体を生成する。ＨＰＫから翻訳されたアミノ酸配列は、DNAStar software(DNAStar Inc)を用いて解析され、免疫原性の高い領域と対応するオリゴポリペプチドの領域が判別され、当業者に知られた手段により抗体を取り出すために用いられる。Ｃ−末端付近にある、或いは塩酸領域内にある（第４Ａ、４Ｂ、４Ｃ並びに４Ｄ図に示される）ような適当なエピトープを選択するための解析は、Ausubel FMに記載される。典型的にはオリゴペプチドは長さ１５残基で、ｆｍｏｃ（フルオレニルメトキシカルボニル）化学を用いるApplied Biosystems Peptide Synthesizer Model 4 31Aを用いて合成され、M-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester（MBS: Ausubel FM等）と反応することによりキーホールリンペットヘモシアニン(KLH， Sigma)に結合される。ウサギは、完全なフロイントアジュバント内でオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いて免疫される。その結果生じる抗血清は、例えば、プラスチックにペプチドを結合し、１％ＢＳＡを用いて遮断し、ウサギ抗血清と反応させ、洗浄し、さらに放射線ヨウ化されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させることにより、アンチペプチド活性のために試験される。ＸＩＩＩ特異性抗体を用いる自然発生ＨＰＫの精製自然発生或いは組換えＨＰＫは、ＨＰＫに対して特異な抗体を用いる免疫親和性クロマトグラフィにより実質的に精製される。免疫親和性カラムが、ＨＰＫ抗体を、CnBr-activated Sepharose(Pharmacia Biotech)のような活性化されたクロマトグラフ樹脂に共有結合することにより構成される。結合の後、樹脂は遮断され、製造者の取扱説明書に従って洗浄される。ＨＰＫを含む媒質を免疫親和性カラム上を通過させ、カラムは、ＨＰＫを選択吸収させる条件下（例えば界面活性剤中に高イオン強度緩衝剤を入れたもの）で洗浄される。カラムは、抗体／ＨＰＫ結合状態を分裂する条件下（ｐＨ２−３の緩衝剤或いは尿素或いはチオシアネートイオンのような高濃度のカオトロープ）で分離され、ＨＰＬが収集される。ＸＩＶＨＰＫと相互作用する分子の同定ＨＰＫ或いはその生物学的活性フラグメントは、¹²⁵I Bolton-Hunter reagent (Bolton AE and Hunter WM(1973)Biochem J 133:529を用いて標識される。９６ウエルプレートのウエル内に以前に配列された候補分子は、標識されたＨＰＫを用いてインキュベートされ、洗浄され、標識されたＨＰＫ複合体を有する任意のウエルが測定される。異なるＨＰＫ濃度を用いて得られたデータを用いて、その数、親和性、並びにＨＰＫと候補分子の関係に対する値が計算される。以上の明細書中に記載された全ての特許出願及び特許は参照して本明細書の一部としている。本発明の記載された方法及びシステムの種々の変更例及び変形例は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明らかであろう。本発明は特定の好適な実施例に関連して記載されてきたが、本発明はそのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、本発明を実施するために記載された形態の種々の変更例は、分子生物学或いは関連する分野の当業者には明らかであり、以下の請求の範囲内に入ることを意図するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 11/06 Ａ６１Ｐ 11/06 19/02 19/02 25/28 25/28 29/00 29/00 35/00 35/00 43/00 43/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 9/12 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/48 9/12 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＡＣ１２Ｑ 1/48 Ａ６１Ｋ 37/52 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＵ，ＳＥ，ＵＳ (72)発明者ホーキンス、フィリップ・アールアメリカ合衆国カリフォルニア州94034・マウンテンビュー・＃96・ノースショアラインブールバード 750

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号：１のアミノ酸配列或いはそのフラグメントからなる実質的に精製されたヒト蛋白質キナーゼポリペプチド。２．請求項１のポリペプチドをコードする、単離され、精製されたポリヌクレオチド配列。３．配列番号：２の配列或いはその変異体からなる単離され、精製された請求項２のポリヌクレオチド配列。４．配列番号：２の配列或いはその変異体に相補的なポリヌクレオチド配列。５．請求項２のポリヌクレオチド配列からなる組換え体発現ベクタ。６．請求項５の発現ベクタからなる組換え体宿主細胞。７．配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを生成するための方法であって、ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項６の宿主細胞を培養する過程と、ｂ）前記宿主細胞培養から前記ポリペプチドを回収する過程とを有することを特徴とする方法。８．適当な医薬品担体と共に配列番号：１のアミノ酸配列或いはそのフラグメントを有する実質的に精製されたヒト蛋白質キナーゼポリペプチドからなる医薬品組成物。９．請求項１のポリペプチドに特に結合する精製された抗体。１０．請求項１のポリペプチドの活性を特に調節或いは変調する精製された拮抗体。１１．適当な医薬品担体と共に請求項１のポリペプチドの実質的に精製された拮抗体からなる医薬品組成物。１２．配列番号：３のアミノ酸配列或いはそのフラグメントからなる実質的に精製されたヒト蛋白質キナーゼポリペプチド。１３．請求項１２のポリペプチドをコードする、単離され、精製されたポリヌクレオチド配列。１４．配列番号：４の配列或いはその変異体からなる単離され、精製された請求項１３のポリヌクレオチド配列。１５．配列番号：４の配列或いはその変異体に相補的なポリヌクレオチド配列。１６．請求項１３のポリヌクレオチド配列からなる組換え体発現ベクタ。１７．請求項１６の発現ベクタからなる組換え体宿主細胞。１８．配列番号：３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを生成するための方法であって、ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項１７の宿主細胞を培養する過程と、ｂ）前記宿主細胞培養から前記ポリペプチドを回収する過程とを有することを特徴とする方法。１９．適当な医薬品担体と共に配列番号：３のアミノ酸配列或いはそのフラグメントを有する実質的に精製されたヒト蛋白質キナーゼポリペプチドからなる医薬品組成物。２０．請求項１２のポリペプチドに特に結合する精製された抗体。２１．請求項１２のポリペプチドの活性を特に調節或いは変調する精製された拮抗体。２２．適当な医薬品担体と共に請求項１２のポリペプチドの実質的に精製された拮抗体からなる医薬品組成物。２３．配列番号：５のアミノ酸配列或いはそのフラグメントからなる実質的に精製されたヒト蛋白質キナーゼポリペプチド。２４．請求項２３のポリペプチドをコードする、単離され、精製されたポリヌクレオチド配列。２５．配列番号：６の配列或いはその変異体からなる、単離され、精製された請求項２４のポリヌクレオチド配列。２６．配列番号：６の配列或いはその変異体に相補的なポリヌクレオチド配列。２７．請求項２４のポリヌクレオチド配列からなる組換え体発現ベクタ。２８．請求項２７の発現ベクタからなる組換え体宿主細胞。２９．配列番号：５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを生成するための方法であって、ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項２８の宿主細胞を培養する過程と、ｂ）前記宿主細胞培養から前記ポリペプチドを回収する過程とを有することを特徴とする方法。３０．適当な医薬品担体と共に配列番号：５のアミノ酸配列或いはそのフラグメントを有する実質的に精製されたヒト蛋白質キナーゼポリペプチドからなる医薬品組成物。３１．請求項２３のポリペプチドに特に結合する精製された抗体。３２．請求項２３のポリペプチドの活性を特に調節或いは変調する精製された拮抗体。３３．適当な医薬品担体と共に請求項２３のポリペプチドの実質的に精製された拮抗体からなる医薬品組成物。