JP2002510710A - ヒト酸化ｌｄｌレセプター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト酸化ＬＤＬレセプター（ＨＯＬＲ）とそれを同定及びコードするポリヌクレオチドとを提供する。また、本発明は、発現ベクター及び宿主細胞、抗体、アゴニスト、アンタゴニストを提供する。更に、本発明は、ＨＯＬＲの発現に関連する疾患の診断または治療方法、予防方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の技術分野 本発明は、ヒト酸化ＬＤＬレセプターの核酸配列及びアミノ酸配列、並びにこ
れらの配列を用いた癌及び自己免疫異常、心血管疾患の診断及び治療、予防に関
連する。

【０００２】 発明の背景 多種のタンパク質のファミリーが、カルシウム依存性糖認識ドメインとして知
られる保存された領域を共有する。このドメインは、植物に存在するレクチンと
呼ばれるタンパク質と結合している糖において初めに同定されたため、Ｃ型レク
チンドメインとしても知られている。Ｃ型レクチンドメインは、１１０から１３
０個のアミノ酸の伸展であり、２つのジスルフィルド結合における４つの保存さ
れたシステイン残基や、多数の別の保存された残基を含む。このドメインは、あ
る種の糖残基の糖タンパク質へのカルシウム依存性の結合を仲介する。幾つかの
カテゴリーのタンパク質は、Ｃ型レクチンドメインを含み、その中には、アシア
ロ糖タンパク質レセプターなどのII型膜タンパク質、肺胞界面活性物質関連タン
パク質などのコレクチン（collectin）、内皮白血球接着分子−１（ＥＬＡＭ− １）などのセレクチン、マクロファージマンノースレセプターなどのI型膜タン パク質、及びその他様々なものも含まれる。(Drickamer, K.J. (1988) J. Biol.
Chem. 263:9557-9560: PROSITE document PDOC00537)。

【０００３】 細胞表面レセプタータンパク質のあるグループは、ある別の構造的特徴だけで
なくＣ型レクチンドメインを共有する。これらのレセプターは、短いＮ末端サイ
トゾル領域、１つの膜貫通領域、及びＣ型レクチンドメインを含む大きな細胞外
のＣ末端領域を有する。これらのタンパク質の例には、マクロファージＣ型レク
チンレセプター、ラット星細胞レセプター、Ｂ細胞低親和性ＩｇＥレセプター、
ナチュラルキラー細胞レセプターＰ１（ＮＫＲ−Ｐ１）及びＣＤ９４、及び酸化
低密度リポタンパク質レセプターが含まれる。(Sawamura, T. 他 (1997) Nature
386:73-77)。

【０００４】 ＮＫＲ−Ｐ１及びＣＤ９４は、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞の表面に発現
するタンパク質である。これらは、クラスI ＭＨＣ（主要組織適合複合体）を認
識してそれと結合する。この標的認識過程の後に、ＮＫ細胞が活性化され、そし
て最終的に標的細胞が破壊される。酸化ＬＤＬ（ＯＸＬＤＬ）のレセプターは、
ＮＫＲ−Ｐ１と配列類似性が高い。ＯＸＬＤＬは、コレステロールを輸送する分
子である酸化低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）と結合して内部移行する。(Sawamura. s
upra; Nagase. M et al. (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 237:496-498) 。

【０００５】 コレステロールは、膜の生合成における必須の要素である。また、コレステロ
ールは、様々なステロイドホルモン、胆汁酸塩、及び他の重要な生物学的に活性
な化合物の合成経路を阻害する。更に、アテローム硬化及び高血圧、冠状動脈疾
患におけるコレステロールのレベルを上昇させることはよく知られている。

【０００６】 コレステロールは、コレステロ−ル及びコレステロールエステル、リン脂質、
特定のタンパク質の複合体として血液の中に運ばれる。タンパク質及び他の要素
の関連成分の違いにより、高密度リポ蛋白、低密度リポ蛋白、中間型リポ蛋白に
分類される。ＬＤＬの高血漿中濃度及びＨＤＬの低血漿中濃度は、明らかに動脈
硬化及び高血圧の多発と関係がある。ＬＤＬの有害な影響の中には、酸化された
ＬＤＬの誘導体と関係があるものもある。ＬＤＬを銅や鉄などの酸化剤に曝すと
、ＬＤＬ内の脂質成分の過酸化やＬＤＬ内のタンパク質成分の共有結合による修
飾が起こる。血管内皮細胞へのＯＸＬＤＬの取りこみ及びそれに続く分解は、ア
テローム性動脈硬化斑（atherosclerotic plaques）の発生に関係している。従 って、ＯＸＬＤＬはアテローム性動脈硬化症の発生に関与している可能性がある
。(Hajjar. D.P.. 及び Haberland. M.E. (11997) J. Biol. Chem.272:22975-22
978)。

【０００７】 新規のヒト酸化ＬＤＬレセプター及びそれをコードするポリヌクレオチドの発
見により、癌及び自己免疫異常、心血管疾患の診断及び治療、予防に有用な新規
の組成物を提供することで当分野のニーズに答えることができる。

【０００８】 発明の要約 本発明は、新規のヒト酸化ＬＤＬレセプター(ＨＯＬＲ)及びＨＯＬＲをコード
するポリヌクレオチドの発見、並びに癌及び自己免疫異常、心血管疾患の診断及
び治療、予防のためのこれらの組成物の使用に関連する。

【０００９】 本発明は、SEQ ID NO:1またはその断片のアミノ酸配列を含む実質的に精製さ れたポリペプチドを提供する。

【００１０】 更に本発明は、SEQ ID NO:1またはその断片と少なくとも９０％のアミノ酸配 列同一性を有する実質的に精製された変異体を提供する。本発明はまた、SEQ ID
NO:1またはその断片の配列を含むポリペプチドをコードする単離され実質的に 精製されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、SEQ ID NO:1またはそ の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少な
くとも９０％のポリヌクレオチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌ
クレオチド変異配列を提供する。

【００１１】 更に、本発明は、SEQ ID NO:1またはその断片のアミノ酸配列を含むポリペプ チドをコードするポリヌクレオチドと厳密な条件の下でハイブリダイズする単離
され精製されたポリヌクレオチドと、SEQ ID NO:1またはその断片のアミノ酸配 列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な単離され精製さ
れたポリヌクレオチドとを提供する。

【００１２】 本発明はまた、SEQ ID NO:2またはその断片のポリヌクレオチド配列を含む単 離され精製されたポリヌクレオチドと、SEQ ID NO:2またはその断片のポリヌク レオチド配列を含むポリヌクレオチドと９０％以上のポリヌクレオチド配列同一
性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列とを提供する。更に本
発明は、SEQ ID NO:2またはその断片のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレ オチドと相補的な配列を有する単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する
。

【００１３】 本発明は更に、SEQ ID NO:1またはその断片の配列を含むポリペプチドをコー ドするポリヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む発現ベクターを提供する
。別の実施態様では、発現ベクターは宿主細胞内に含まれる。

【００１４】 本発明はまた、SEQ ID NO:1またはその断片のアミノ酸配列を含むポリペプチ ドを製造する方法であって、（ａ）そのポリペプチドの発現に好適な条件の下、
SEQ ID NO:1またはその断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポ リヌクレオチドの少なくとも１つの断片を有する発現ベクターを含む宿主細胞を
培養する過程と、（ｂ）その宿主細胞の培地からそのポリペプチドを回収する過
程とを含む製造方法を提供する。

【００１５】 本発明はまた、SEQ ID NO:1またはその断片の配列を有する実質的に精製され たポリペプチドを含む医薬品組成物を好適な医薬用担体と共に提供する。

【００１６】 更に本発明は、SEQ ID NO:1またはその断片の配列を含むポリペプチドと結合 する精製された抗体と、そのポリペプチドの精製されたアゴニスト及びアンタゴ
ニストとを提供する。

【００１７】 本発明はまた、癌の治療または予防が必要な患者にSEQ ID NO:1またはその断 片のアミノ酸配列を有するポリペプチドのアンタゴニストを効果的な量投与する
ことを含む、癌の治療または予防方法を提供する。

【００１８】 本発明はまた、自己免疫異常の治療または予防が必要な患者にSEQ ID NO:1ま たはその断片のアミノ酸配列を有するポリペプチドのアンタゴニストを効果的な
量投与することを含む、自己免疫異常の治療または予防方法を提供する。

【００１９】 本発明はまた、心血管疾患の治療または予防が必要な患者にSEQ ID NO:1また はその断片のアミノ酸配列を有するポリペプチドのアンタゴニストを効果的な量
投与することを含む、心血管疾患の治療または予防方法を提供する。

【００２０】 本発明はまた、核酸を含む生物学的サンプルにおいて、SEQ ID NO:1またはそ の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出
する方法であって、（ａ）SEQ ID NO:1またはその断片のアミノ酸配列を含むポ リペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補配列と、少なくとも１つの生物
学的サンプルの核酸とをハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション複合体を
形成する過程と、（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを含み
、そのハイブリダイゼーション複合体の存在と生物学的サンプルにおけるSEQ ID
NO:1またはその断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌク レオチドの存在とが相関性を有する、検出方法を提供する。本発明の一実施態様
では、ハイブリダイゼーションの前に生物学的サンプルの核酸がポリメラーゼ連
鎖反応によって増幅される。

【００２１】 本発明の記載について 本発明のタンパク質及び核酸配列、方法について説明する前に、本発明は、こ
こに開示した特定の方法論及びプロトコル、細胞系、ベクター、試薬に限定され
ず、その実施形態を変更できることに理解されたい。また、ここで用いられる用
語は、特定の実施例のみを説明する目的で用いられたものであり、後述の請求の
範囲によってのみ限定され、本発明の範囲を限定することを意図したものではな
いということも理解されたい。

【００２２】 本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その（この等）」
は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って
、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体
は含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。

【００２３】 本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、
本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。
本明細書で記述したものと類似、或いは同等の全ての方法及び材料は、本発明の
実施及びテストに使用できるが、好適な方法、装置、及び材料をここに記す。本
明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に記
載された細胞系、ベクター、及び方法論を記述し開示するために引用した。従来
の発明を引用したからと言って、本発明の新規性が損なわれると解釈されるもの
ではない。

【００２４】 定義 本明細書においての「ＨＯＬＲ」とは、天然、合成、半合成或いは組換え体な
ど全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及び好ましくは人類を含む
哺乳動物）から得られる実質的に精製されたＨＯＬＲのアミノ酸配列のことであ
る。

【００２５】 本明細書において、「アゴニスト」とは、ＨＯＬＲと結合したとき、ＨＯＬＲ
の効果を増大する、或いはその持続時間を延長する分子のことである。このアゴ
ニストには、ＨＯＬＲに結合してその効果を変調するタンパク質、核酸、糖質、
任意の他の分子を含み得る。

【００２６】 本明細書において、「アレル変異配列」とは、ＨＯＬＲをコードする遺伝子の
別の形である。アレル変異配列は、核酸配列における少なくとも１つの変異によ
って生じ、変異ｍＲＮＡ若しくは変異ポリペプチドになり、これらの構造や機能
は変わる場合もあれば変わらない場合もある。天然或いは組換え体のすべての遺
伝子には、アレル形が存在しないもの、１つ或いは多数存在するものがある。一
般にアレル変異配列を生じる変異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付加、或いは
置換による。これらの各変異は、単独或いは他の変異と同時に起こり、所定の配
列内で一回或いはそれ以上生じる。

【００２７】 本明細書において、ＨＯＬＲをコードする「変異」核酸配列とは、様々なヌク
レオチドの欠失、挿入、或いは置換が起こっても、ＨＯＬＲと同じポヌクレオチ
ド或いはＨＯＬＲの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドのことであ
る。この定義には、ＨＯＬＲをコードするポリヌクレオチド配列の正常の染色体
の遺伝子座ではない位置でアレル変異配列と不適当或いは予期せずハイブリダイ
ゼーション、及びＨＯＬＲをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレ
オチドプローブを用いて、容易に検出可能な或いは検出困難な多形性を含む。コ
ードされたタンパク質も変異され得り、サイレント変化を生じＨＯＬＲと機能的
に等価となるアミノ酸残基の欠失、挿入、或いは置換を含み得る。意図的なアミ
ノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にＨＯＬＲの活性が保持される範囲で、残
基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性についての類
似性に基づいて成され得る。たとえば、負の電荷をもつアミノ酸は、アスパラギ
ン酸及びグルタミン酸を含み得り、正の電荷をもつアミノ酸は、リジン及びアル
ギニンを含み得り、そして近い親水性値をもち非電荷極性頭基を有するアミノ酸
は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グ
ルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン及びチロシンを含みうる。

【００２８】 本明細書において、「アミノ酸」或いは「アミノ酸配列」とは、オリゴペプチ
ド、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列及びその断片であり、天然の
分子または合成された分子である。ＨＯＬＲの断片である「断片」及び「免疫原
性断片」、「抗原性断片」は、好ましくはアミノ酸約５〜約１５個の長さであり
、最も好ましくはアミノ酸１４個の長さであり、ＨＯＬＲのある生物学的活性ま
たは免疫学的活性を保持する。ここでは、「アミノ酸配列は自然発生タンパク質
分子のアミノ酸配列であるが、アミノ酸配列及び類似の用語は、列記したタンパ
ク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定されるわけではない。

【００２９】 本明細書において、用語「増幅」とは、核酸配列の付加的な複製を生成するこ
とに関連する。一般にはこの技術分野では公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ
）技術を用いて行われる(例えば、Dieffenbach, C.W.及びG.S. Dveksler (1995)
PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press,Plainview, NY
, pp. 1-5.を参照)。

【００３０】 本明細書において、「アンタゴニスト」とは、ＨＯＬＲと結合したとき、ＨＯ
ＬＲの生物学的または免疫学的活性の効果の程度を低下させたり、その持続時間
を短縮する分子である。アンタゴニストは、タンパク質、核酸、糖質、抗体また
はＨＯＬＲの効果を減少させるの他の分子である。

【００３１】 本明細書において、「抗体」とは、Ｆab及びＦ(ab')₂、及びそれらの断片、Ｆ
ｖ断片などの無傷の分子であり、抗原決定基と結合可能である。ＨＯＬＲポリペ
プチドと結合する抗体は、抗体を免疫する目的の小さなペプチドを含む無傷の分
子またはその断片を用いて調整可能である。動物（例えば、マウス、ラット、若
しくはウサギ）を免疫化するのに使用されるポリペプチド或いはオリゴペプチド
は、ＲＮＡの翻訳から引き出されたり化学的に合成され得り、必要に応じて担体
プロテインと結合することも可能である。ペプチドと化学的に結合した一般に用
いられる担体は、ウシ血清アルブミン、チログロビン、及びキーホールリンペッ
トヘモニアン（ＫＬＨ）を含む。次ぎに、この結合したペプチドを用いて動物を
免疫化する。

【００３２】 本明細書において、「抗原決定基」とは、特定の抗体と接触する分子のフラグ
メント（即ちエピトープ）である。タンパク質或いはタンパク質の断片が、宿主
動物を免疫化するのに用いられるとき、このタンパク質の種々の領域は、抗原決
定基（タンパク質上の所定の領域或いは三次元構造体）に特異的に結合する抗体
の産生を誘発し得る。抗原決定基は、抗体と結合するために無傷の抗原（即ち、
免疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得る。

【００３３】 本明細書において、「アンチセンス」とは、特定の核酸配列のセンス鎖と相補
的な核酸配列を含む全ての組成物である。アンチセンス分子は、合成や転写を含
む任意の方法で作り出すことができる。相補的ヌクレオチドは、一度細胞に導入
されると、細胞によって作られた天然の配列と結合して二重鎖を形成し、転写や
翻訳を阻害する。「マイナス（−）」という表現はアンチセンス鎖と言え、「プ
ラス（＋）」という表現はセンス鎖と言える。

【００３４】 本明細書において、「生物学的活性」とは、自然発生分子の構造的、調節的、
或いは生化学的機能を有するタンパク質のことである。同様に、「免疫学的に活
性」とは、天然或いは組換え体のＨＯＬＲ、合成のＨＯＬＲまたはそれらの任意
のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の
抗体と結合する能力のことである。

【００３５】 本明細書において、「相補的」若しくは「相補性の」とは、許容の塩と許容の
温度条件の下で、塩基対の形成によってポリヌクレオチドが自然に結合すること
である。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」と相補的な配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」と結合する
。２つの一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核酸が結合するのみの部分的な場合
、或いは一本鎖間に完全な相補性が存在して完全な相補性となる場合があり得る
。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強
度に大きな影響を与える。このことは、核酸鎖間の結合に左右される増幅反応、
並びにペプチド核酸（ＰＮＡ）分子の設計若しくは使用において特に重要である
。

【００３６】 本明細書において、「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所
定のアミノ酸配列を含む組成物」とは広い意味で、所定のヌクレオチド配列或い
はアミノ酸配列を含む任意の組成物のことである。この組成物は、乾燥した製剤
或いは水溶液、無菌組成物を含み得る。ＨＯＬＲ若しくはＨＯＬＲの断片をコー
ドするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブ
として使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質な
どの安定化剤と結合可能である。ハイブリダイゼーションにおいて、プローブは
、塩（例えば、ＮａＣｌ）及び界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）、その他の物質（
例えば、デンハート液、乾燥ミルク、サケ精子ＤＮＡ等）を含む水溶液に展開さ
れ得る。

【００３７】 本明細書において、「コンセンサス配列」とは、不要な塩基を分離するために
再配列された核酸配列であって、ＸＬ−ＰＣＲ^TM（Perkinn Elmer, Norwalk, CT
）を用いて５'及び／または３'の方向に延長されて再配列された核酸配列、或い
はGELVIEW^TM Fragment Assembly system（GCG, Madison, WI）などのフラグメン
トの構築のためのコンピュータプログラムを用いて２つ以上のインサイトクロー
ン社の重複配列から構築された核酸配列のことである。延長及び構築の両方によ
ってコンセンサス配列に構築されるものもある。

【００３８】 本明細書において、「ポリヌクレオチドの発現と相関性を有する」とは、ノー
ザン分析によるＨＯＬＲをコードする核酸配列と同じ或いは関連する核酸の検出
が、サンプル内のＨＯＬＲをコードする核酸の存在を示すことから、ＨＯＬＲを
コードするポリヌクレオチドからの転写物の発現と相関性を有することを意味す
る。

【００３９】 本明細書において、「欠失」とは、１個以上のアミノ酸残基若しくは核酸残基
が欠如するアミノ酸配列若しくは核酸配列の変化である。

【００４０】 本明細書において、「誘導体」とは、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチ
ド配列の化学修飾のことである。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば
、アルキル基、アシル基、或いはアミノ基による水素の置換がある。誘導体ポリ
ヌクレオチドは、自然分子（未修飾の分子）の生物学的或いは免疫学的機能を少
なくとも１つ保持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドとは、も
とのポリペプチドの生物学的機能、或いは免疫学的機能を少なくとも１つ保持す
る、グリコシル化、ポリエチレングリコール化、或いは任意の同様のプロセスに
よって修飾されたものである。

【００４１】 本明細書において、「類似性」とは、相補性の程度を表すものである。これに
は、部分的類似性と完全な類似性とがあり得る。この「同一性」は「類似性」と
も言える。同一の配列が標的の核酸とハイブリダイゼーションするのを少なくと
も部分的に阻止する部分的に相補的な配列は、「実質的に同様」と呼ばれる。完
全に相補的な配列と標的の配列とのハイブリダイゼーションの抑制は、厳密性を
低下させた条件の下ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロッティング或
いはノーザンブロッティング法、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて検査
される。実質的に同様の配列或いはハイブリダイゼーションプローブは、厳密性
を低下させた条件の下、完全に相補的な配列と標的の配列との結合に対して競合
して抑制する。これは、厳密性を低下させた条件では、２つの配列の互いへの結
合が特異的（即ち、選択的）に相互作用しなけらばならず、厳密性を低下させた
条件の下では非特異的な結合が許容されるということではない。部分的な相補性
ともいえない（例えば、３０％未満の類似性或いは同一性）第２の標的配列を用
いて、非特異的結合が存在しないことの検査が可能である。非特異的結合が存在
しない場合は、実質的に類似配列或いはプローブが第２の非相補的標的配列とハ
イブリダイゼーションしない。

【００４２】 本明細書において、「百分率同一性」又は「％同一性」とは、２つ以上のアミ
ノ酸配列或いは核酸配列の比較で見つかった配列類似性の百分率のことである。
この百分率同一性は、例えば、MegAlignプログラム(DNASTAR, Inc., Madison Wl
)など電子装置を用いて決定可能である。このMegAlignプログラムは、様々な方 法、例えば、クラスター方法 (Higgins, D.G.及びP.M. Sharp (1988) Gene73:23
7-244.)に従って、２つ以上の配列間のアライメントを作り出すことが可能であ る。クラスターアルゴリズムが、全ての組の間の距離を測って、配列を各クラス
ターに分類する。これらのクラスターは、組によって整列され、次ぎにグループ
に分けられる。２つのアミノ酸の配列間の百分率類似性、例えば配列Ａと配列Ｂ
の百分率類似性は、配列Ａと配列Ｂの一致する残基の合計数を、配列Ａの長さか
ら配列Ａのギャップ残基数と配列Ｂのギャップ残基数とを差し引いたもので除し
、それに１００を掛けることによって得られる。２つのアミノ酸配列間の低い類
似性或いは非類似性のギャップは、百分率類似性の決定には含まれない。核酸配
列間の百分率同一性はまた、クラスター法或いはJotun Hein法などの当分野で公
知の別の方法によってカウント或いは計算することも可能である(例えば、Hein.
J. (1990) Methods Enzymol. 183:626-645.を参照)。配列間の同一性はまた、 例えば、ハイブリダイゼーションの条件を変えるなどの当分野で公知の別の方法
によって決定することも可能である。

【００４３】 ヒト人工染色体（ＨＡＣ）は、６Ｋｂ〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を含み
得り、安定した分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の微
小染色体である（Harrington, J.J.等 (1997) Nat Genet. 15:345-355を参照） 。

【００４４】 本明細書において、「ヒト化抗体」とは、もとの結合能力を保持しつつよりヒ
トの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変異された抗体分子
である。

【００４５】 本明細書において、「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の一本鎖が相補的
な一本鎖と塩基対を形成して結合する全てのプロセスである。

【００４６】 本明細書において、「ハイブリダイゼーション複合体」とは、相補的な塩基対
間の水素結合の形成によって、２つの核酸配列間に形成された複合体のことであ
る。ハイブリダイゼーション複合体は溶液中（例えば、Ｃ₀ｔまたはＲ₀ｔ分析）
で形成されるか、或いは溶液中の１つの核酸配列と固体の支持物（例えば、紙、
膜、フィルター、チップ、ピン、或いはスライドガラス、または細胞及びその核
酸を固定する任意の適当な基板）に固定されたもう一つの核酸配列との間で形成
され得る。

【００４７】 本明細書において、「挿入」或いは「付加」とは、自然発生の分子の配列に対
して、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ
酸配列或いは核酸配列の変化のことである。

【００４８】 本明細書において、「免疫応答」とは、炎症性疾患及び外傷、免疫異常、感染
症、遺伝病などと関係する症状である。これらの症状は、細胞系及び全身防衛系
に影響を及ぼすサイトカイン及びケモカイン、別の情報伝達分子などの様々な因
子の発現によって特徴づけられ得る。

【００４９】 本明細書において、「マイクロアレイ」とは、紙、ナイロンまたは別のタイプ
の膜、フィルター、チップ、スライドガラス、或いはその他の好適な固体の支持
物などの基板上に配列された様々なポリヌクレオチドのアレイのことである。

【００５０】 本明細書のマイクロアレイの記述における「要素」或いは「アレイ要素」とは
、基板の表面に配列されたハイブリダイゼーション可能なポリヌクレオチドのこ
とである。

【００５１】 本明細書において、「変調」とは、ＨＯＬＲの活性の変化のことである。変調
の例として、ＨＯＬＲのタンパク質活性の特性、或いは結合特性、またはその他
の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化がある。

【００５２】 本明細書において、「核酸」或いは「核酸配列」とは、ヌクレオチド、オリゴ
ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、或いはそれらの断片を指す。また、一本鎖若
しくは二本鎖のセンス鎖或いはアンチセンス鎖であるゲノム若しくは合成起源の
ＤＮＡ或いはＲＮＡと、またペプチド核酸（PNA）や任意のＤＮＡ様物質、ＲＮ Ａ様物質も指す。「断片（またはフラグメント）」とは、翻訳された場合に完全
長のポリペプチドの抗原性などの機能的特徴或いはＡＴＰ結合部位などの構造的
特徴を維持したポリペプチドを形成する核酸配列のことである。

【００５３】 本明細書において、「機能的に関係した」或いは「機能的に結合した」とは、
機能的に関係する核酸配列のことである。コードされたポリペプチドの転写をプ
ロモータが制御する場合、そのプロモーターはコードする配列と機能的に関係す
る或いは機能的に結合する。機能的に関係した或いは機能的に結合した核酸配列
は近接して同じ読み枠内に存在し得るが、リプレッサー遺伝子などのある種の遺
伝子要素は、ポリペプチドをコードする配列とは近接して結合していないが、ポ
リペプチドの発現を調節するオペレーター配列とは結合したままである。

【００５４】 本明細書において、「オリゴヌクレオチド」とは、ＰＣＲ増幅、ハイブリダイ
ゼーション、或いはマイクロアレイに使用可能な核酸配列のことであり、その長
さは少なくとも６ヌクレオチドから６０ヌクレオチドである。好ましくは約１５
から３０ヌクレオチドであり、さらに好ましいくは約２０から２５のヌクレオチ
ドである。本明細書において、オリゴヌクレオチドは、当技術分野では同一と定
義される「アンプリマー」及び「プライマー」、「オリゴマー」と実質的に同じ
である。

【００５５】 本明細書において、「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）とは、末端がリジンで終わる
アミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合した、約５ヌクレオチド以上の長さ
のオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス分子又は抗遺伝子剤のことである。こ
の末端のリジンにより、この組成物が溶解性を有する。ＰＮＡは、相補的な一本
鎖ＤＮＡやＲＮＡに優先的に結合して転写物の伸長を止め、ポリエチレングリコ
ール化して細胞において寿命を延ばし得る。（例えば、Nielsen, P.E.他(1993)
Anticancer Drug Des. 8:53-63を参照）。

【００５６】 本明細書において、「サンプル」とは、その最も広い意味で用いられている。
ＨＯＬＲをコードする核酸若しくはその断片、ＨＯＬＲ自体を含むと推測される
生物学的サンプルには、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体
や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶液中又は固体の支持物に固定されたゲノムＤ
ＮＡ，ＲＮＡ，ｃＤＮＡと、組織又は組織プリント等も含まれ得る。

【００５７】 本明細書において、「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、タンパ
ク質或いはペプチドとアゴニスト或いは抗体、アンタゴニストとの間の相互作用
のことである。この相互作用は、結合する分子によって認識される、例えば、抗
原決定基つまりエピトープなどのタンパク質の特定の構造の存在によって左右さ
れる。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合してい
ない標識した「Ａ」及びその抗体を含む反応において、エピトープＡを含むポリ
ペプチドが存在するか或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体
と結合する標識Ａの量が減少する。

【００５８】 本明細書において、「厳密な条件」とは、ポリヌクレオチドと請求項に記載さ
れたポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能な条件である。厳密な
条件は、塩濃度及び有機溶剤（例えば、ホルムアミド）の濃度、温度、及び当分
野で公知の別の条件によって決められる。詳細には、塩の濃度を下げたり、ホル
ムアミドの濃度を上げたり、またハイブリダイゼーションの温度を上げることで
厳密性を高めることができる。

【００５９】 例えば、厳密な塩濃度は、通常は約７５０ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約７５
ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、好ましくは約５００ｍＭ未満の塩化ナ
トリウムと約５０ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、最も好ましくは約２
５０ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約２５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである
。例えば、ホルムアミドなどの有機溶剤を使用しないと、厳密性の低いハイブリ
ダイゼーションになり、約３５％以上のホルムアミド、更に好ましくは５０％以
上のホルムアミドを使用すると、厳密性の高いハイブリダイゼーションになる。
温度の厳密条件は、通常は約３０℃以上であり、より好ましくは約３７℃以上で
あり、最も好ましくは約４２℃以上である。その他の変更できるパラメーターに
は、ハイブリダイゼーション時間、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの薬
品の濃度、キャリアＤＮＡの含有の有無があり、当分野の技術者には公知である
。必要な様々な条件を組み合わせることで、厳密性の程度を変えることができる
。好適な実施例では、ハイブリダイゼーションは、温度が３０℃で、７５０ｍＭ
の塩化ナトリウムと７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳで行う。よ
り好適な実施例では、温度が３７℃で、５００ｍＭの塩化ナトリウムと５０ｍＭ
のクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％のホルムアミド、１００μｇ／
ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）で行う。最も好適な実施例では、温度
が４２℃で、２５０ｍＭの塩化ナトリウムと２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、
１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド、２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡで行う。
これらの条件の有用な変更は、当分野の技術者には明らかである。

【００６０】 ハイブリダイゼーションの後の洗浄にも、様々な厳密性の程度がある。洗浄の
厳密な条件は、塩濃度と温度によって決められる。上記したように、塩濃度を下
げること或いは温度を上げることで洗浄の厳密性を高めることができる。例えば
、洗浄過程での塩濃度の厳密な条件は、好ましくは約３０ｍＭ未満の塩化ナトリ
ウムと約３ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、更に好ましくは約１５ｍＭ
未満の塩化ナトリウムと約１０５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである。洗浄
過程の温度の厳密な条件は、通常は約２５℃以上であり、好ましくは約４２℃以
上であり、更に好ましくは約６８℃以上である。好適な実施例では、洗浄過程は
、温度が２５℃で、３０ｍＭの塩化ナトリウムと３ｍＭのクエン酸三ナトリウム
、０．１％ＳＤＳで行われる。より好適な実施例では、洗浄過程は、温度が４２
℃で、１５ｍＭの塩化ナトリウムと１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０．１
％ＳＤＳで行われる。最も好適な実施例では、洗浄過程は、温度が６８℃で、１
５ｍＭの塩化ナトリウムと１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０．１％ＳＤＳ
で行われる。更なるこれらの条件の変更は、当分野の技術者には明らかである。

【００６１】 本明細書において、「実質的に精製された」とは、自然の環境から取り除かれ
てから、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結
合している構成要素が少なくとも約６０％以上除去されたものであり、好ましく
は約７５％以上の除去、最も好ましいのは約９０％以上除去されたものである。

【００６２】 本明細書において、「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドを
それぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。

【００６３】 本明細書において、「形質転換」とは、外来ＤＮＡが入り込みレセプター細胞
を変化させるプロセスのことである。形質転換は、当分野で公知の種々の方法に
より、自然或いは人工の条件の下で起こり得り、原核宿主細胞若しくは真核宿主
細胞の中に外来核酸配列を挿入する任意の公知の方法によって行うことができる
。この形質転換の方法は、形質転換される宿主細胞のタイプによって選択される
。この方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リポ
フェクション、及び微粒子照射が含まれるが、限定されるものではない。「形質
転換された」細胞には、導入されたＤＮＡが自律的に複製するプラスミドとして
或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含
まれる。さらに、限られた時間に一時的に導入ＤＮＡ若しくは導入ＲＮＡを発現
する細胞も含まれる。

【００６４】 本命鎖書において、「変異体」とは、一つ以上のアミノ酸が変異したアミノ酸
配列である。この変異体には、例えばロイシンとイソロシンとの置換のような、
置換されたアミノ酸が類似の構造或いは類似の化学特性を有する「保存的」変異
が含まれる。稀ではあるが、変異体には、グリシンをトリプトファンで置換する
「非保存的」変異も含まれる。また、類似の小さな変異には、アミノ酸の欠失、
挿入、或いはその両方が含まれる。当分野で公知の例えばＬＡＳＥＲＧＥＮＥ^TM ソフトウエアを用いて、生物学的或いは免疫学的活性を損なうことなく、どのア
ミノ酸残基を置換、挿入、或いは欠失させるかを決めることができるであろう。

【００６５】 発明 本発明は、新規のヒト酸化ＬＤＬレセプター(ＨＯＬＲ)、及びＨＯＬＲをコー
ドするポリヌクレオチドの発見に基づき、癌及び自己免疫異常、心血管疾患の診
断、治療、または予防におけるこれらの組成物の使用法に関する。

【００６６】 本発明のＨＯＬＲをコードする核酸が、アミノ酸配列アライメント用のコンピ
ュータ検索によって、胎児肺のｃＤＮＡライブラリ(LUNGNOT09)を起源とするイ ンサイト社クローン番号1355922において初めに同定された。コンセンサス配列 、SEQ ID NO:2は以下の核酸配列を重複及び／又は伸長して得られた。インサイ ト社クローン番号744983 (BRAITUT01)及び1355922 (LUNGNOT09)、ショットガン 配列SAOA02497及びSAOA02958、SAOA02959。

【００６７】 一実施例において、本発明は、図１Ａ及び図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅに
示されているように、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む 。ＨＯＬＲはアミノ酸２８４個の長さを有し、Ｎ９９及びＮ１７３残基における
２つのグリコシル化可能部位と、Ｔ８５及びＳ９１、Ｔ１００、Ｓ１６１、Ｓ１
９２、Ｔ２７９残基におけるの６つのカゼインキナーゼIIリン酸化可能部位と、
Ｔ１９及びＴ３６、Ｓ２０９、Ｓ２３４残基における４つのプロテインキナーゼ
Ｃリン酸化可能部位と、Ｙ１５３及びＹ１６７残基における２つのチロシンキナ
ーゼリン酸可能部位と、Ｃ４１からＣ２６１残基までの１つのＣ型レクチンドメ
インを有する。またＨＯＬＲは、概ねＶ４０残基からＣ６２残基に潜在的な膜貫
通領域を有する。図２Ａ及び図２Ｂに示されているように、ＨＯＬＲは、ヒトレ
クチン様酸化ＬＤＬレセプター(GI 1902984: SEQ ID NO:3)及びウシレクチン様 酸化ＬＤＬレセプター(GI 1902982: SEQ ID NO:4)と化学的及び構造的相同性を 有する。詳しくは、ＨＯＬＲとヒトレクチン様酸化ＬＤＬレセプター（ＨＬＬＯ
ＬＲ）とは２２％の同一性を有し、一方ＨＯＬＲとウシレクチン様酸化ＬＤＬレ
セプター（ＢＬＬＯＬＲ）とは２３％の同一性を有する。ＨＯＬＲは、概ねＭ１
からＰ３９残基の短いサイトゾルドメイン、及び概ねＶ４０からＣ６２残基の膜
貫通領域、並びに概ねＫ６３からＤ２８４残基の細胞外ドメインとを有すると予
想されている。また、ＨＯＬＲは、ＨＬＬＯＬＲ及びＢＬＬＯＬＲと同じ位置に
潜在的な膜貫通領域を有し、全てが保存された６つのシステインをもつＣ型レク
チンドメインを有する。図３に示されているように、ＨＯＬＲはＨＬＬＯＬＲ及
びＢＬＬＯＬＲとかなり類似した疎水性プロットと、殆ど同一の疎水性領域とを
有する。ノーザン分析によって、神経組織から生殖組織までの様々なライブラリ
においてこの配列の発現が確認された。これらのライブラリの少なくとも５０％
が不死化或いは癌性であり、少なくとも２７％が免疫応答に関連する。また、脳
及び乳房の腫瘍におけるＨＯＬＲの発現に注目されたい。

【００６８】 本発明はまた、ＨＯＬＲの変異体を含む。ＨＯＬＲの変異体は、好ましくはＨ
ＯＬＲのアミノ酸配列と約８０％以上の配列同一性、更に好ましくは約９０％以
上の配列同一性、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を有し、ＨＯＬＲの
機能的特性或いは構造的特性のうちの少なくとも１つが保存されている。

【００６９】 本発明はまた、ＨＯＬＲをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施例
において、本発明は、ＨＯＬＲをコードするSEQ ID NO:2の配列を有するポリヌ クレオチド配列を含む。

【００７０】 本発明はまた、ＨＯＬＲをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む
。詳細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、好ましくはＨＯＬ
Ｒをコードするポリヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性、更に好ましく
は９０％以上の配列同一性、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有する
。また本発明の特定の実施態様では、SEQ ID NO:2と少なくとも約８０％の配列 同一性、好ましくは約９０％以上の配列同一性、最も好ましくは約９５％以上の
配列同一性を有するSEQ ID NO:2の変異配列を含む。上記の各ポリヌクレオチド 変異配列のすべてが、ＨＯＬＲの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有
するアミノ酸配列をコードする。

【００７１】 遺伝暗号の縮重により作り出され得るＨＯＬＲをコードする種々のポリヌクレ
オチド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最
小の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。し
たがって本発明には、可能なコドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作
り出され得る可能なポリヌクレオチド配列の変異の全てが含まれ得る。これらの
組み合わせは、自然発生のＨＯＬＲのポリヌクレオチド配列に適用される標準的
なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考
慮する。

【００７２】 ＨＯＬＲをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、好適に選択され
た厳密な条件の下で、自然発生のＨＯＬＲのヌクレオチドとハイブリダイズ可能
なことが望ましいが、非自然発生のコドンを含めるなどの実質的に異なったコド
ンの使用を有するＨＯＬＲ又はその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り
出すことは有益となり得る。特定のコドンが宿主によって利用される頻度に基づ
いてコドンを選択して、ペプチドの発現が特定の真核細胞又は原核宿主に発生す
る割合を高めることが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、Ｈ
ＯＬＲ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理
由は、自然発生の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特
性を備えるＲＮＡ転写物を作ることにある。

【００７３】 本発明はまた、ＨＯＬＲ及びその誘導体をコードするＤＮＡ配列又はそれらの
断片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、
当分野で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系
の何れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、ＨＯＬＲまたはその
任意の断片をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。

【００７４】 更に本発明には、種々の厳密性条件の下で、請求項に記載されたポリヌクレオ
チド配列とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる。詳しくは、
記載のSEQ ID NO:2またはその断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配 列が含まれる。(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (1987) Methods Enzymol.
152:399-407; and Kimmel. A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507-511.を参 照)。

【００７５】 当分野で良く知られ一般的に入手可能なＤＮＡのシークエンシング方法を用い
て、本発明の何れの実施例も実行可能である。この方法には、例えばＤＮＡポリ
メラーゼIのクレノウ断片であるSequenase（US Biochemical社, Cleveland OH）
、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Chi
cago IL）、或いはELONGASE増幅システム(GIBCO/BRL,Gaithersburg, MD)にみら れるような校正エキソヌクレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせなどの酵素が
用いられる。このプロセスは、Hamilton Micro Lab2200（Hamilton, Reno, NV）
、Peltier Thermal Cycler（PTC200；MJ Reserch, Watertown MA）並びにABI Ca
talyst及び373及び377 DNAシーケンサ（Perkin Elmer）等の装置を用いて自動化
するのが好ましい。

【００７６】 部分的なヌクレオチド配列を利用し、当分野で既知のＰＣＲ法をベースにした
種々の方法を用いてＨＯＬＲをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調
節エレメントなどの上流にある配列を検出する。例えば制限部位ＰＣＲ法を利用
する１つの方法では、一般的なプライマー及びネスト化プライマーを用いてクロ
ーニングベクター内のゲノムＤＮＡから未知の配列を増幅する。（例えば、Sark
ar, G. (1993) PCR Methods Applic 2:318-322を参照）。逆ＰＣＲ法を用いる別
法では、広範な方向に伸長して環状化した鋳型から未知の配列を増幅するプライ
マーを用いる。この鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制
限断片に由来する。（Triglia, T.等（1988）Nucleic Acids Res 16:8186）。キ
ャプチャＰＣＲ法を用いる第３の方法は、ヒト及び酵母菌人工染色体ＤＮＡの既
知の配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む。（例えば、Lagerstrom, M.
他（1991）PCR Methods Applic 1:111-119を参照）。この方法では、多数の制限
酵素による消化及びライゲ−ションを用いて、ＰＣＲを行う前に未知の配列の領
域の中に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、当分野で公知の
別の方法を用いて未知の配列を得ることも可能である。(例えば、Parker, J.D.
他 (1991)Nucleic Acids Res. 19:3055-3060を参照)。更に、ＰＣＲ、ネスト化 プライマー、PromoterFinder^TMライブラリを用いれば、ゲノムＤＮＡ内の歩行が
可能である（Clontech, Palo Alto CA）。この方法ではライブラリをスクリーニ
ングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部を探すのに有用である。全て
のＰＣＲ法をベースにした方法では、プライマーは、市販のOLIGO 4.06 Primer
Analysis software（National Biosciences社, Plymouth MN）或いは別の好適な
プログラムなどを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が５０％
以上、約６８℃〜７２℃の温度で鋳型に対してアニールするよう設計される。

【００７７】 完全な長さのｃＤＮＡのスクリーニングの際は、大きなｃＤＮＡを含むように
サイズが選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、オリゴｄ（Ｔ）ラ
イブラリが完全な長さのｃＤＮＡを産生できない場合は、遺伝子の５'領域を有 する配列を含むものが多いランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリが有用で
ある。ゲノムライブラリは、５'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう 。

【００７８】 市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはＰＣ
Ｒ産物のヌクレオチド配列のサイズの分析、または確認が可能である。詳しくは
、キャピラリーシークエンシングには、電気泳動による分離のための流動性ポリ
マー、及び４つの異なったヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光
色素、放出された波長の検出に利用するＣＣＤカメラを使用することが可能であ
る。出力／光強度は、適切なソフトウエア（例えばPerkin Elmer社のGenotyper^{T M} 及びSequence Navigator^TM）を用いて電気信号に変換され、サンプルのローデ ィングからコンピュータ分析までのプロセス及び電子データ表示がコンピュータ
制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在し
ない場合もあるＤＮＡの小片のシークエンシングに特に適している。

【００７９】 本発明の別の実施例では、ＨＯＬＲをコードするポリヌクレオチド配列または
その断片を組換えＤＮＡ分子に用いて、適切な宿主細胞内にＨＯＬＲ、その断片
または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の宿重により
、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列
が作られ得り、これらの配列をＨＯＬＲのクローン化及び発現に利用可能である
。

【００８０】 種々の目的でＨＯＬＲをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知
られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。
この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現の調
節が含まれるが、これらに限定されるものではない。ランダムな断片によるＤＮ
Ａの混合や遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再組み立てを用いて、
ヌクレオチド配列の組換えが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドの仲介に
よる定方向突然変異誘発を利用して、新しい制限部位を生成する突然変異の導入
、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライスバリアントの生
成等が可能である。

【００８１】 別の実施例によれば、ＨＯＬＲをコードする配列は、当分野で周知の化学的方
法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Caruthers. M.H.等（1
980）Nuc Acids Res Symp Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他（1980）Nucl. Acids
Res Symp. Ser.225-232を参照）。別法として、化学的方法を用いてＨＯＬＲ自
体またはその断片を合成することが可能である。例えば、ペプチド合成は種々の
固相技術を用いて実行可能である（例えば、Roberge, J.Y.等(1995) Science 26
9:202-204を参照）。また、合成の自動化は例えばABI 431Aペプチドシンセサイ ザ（Perkin Elmer）を用いて達成し得る。更にＨＯＬＲのアミノ酸配列または任
意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または化学的方法を用いた他
のタンパク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、変異体ポ
リペプチドを作ることが可能である。

【００８２】 このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー(例えば、Chiez, R.M. 及び F.Z. Regnier (1990)Methods Enzymol. 182:392-421を参照)を用いて実質 的に精製可能である。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸分析或いはシーク
エンシングにより確認することができる(例えば、Creighton. T. (1983) Protei n.s, Structures and Molecular Properties , WH Freeman and Co., New York,
NYを参照)。

【００８３】 生物学的に活性のＨＯＬＲを発現させるために、ＨＯＬＲをコードするヌクレ
オチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクタ
ーは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な
エレメントを含む。これらのエレメントには、ベクター及びＨＯＬＲをコードす
るポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモ
ーター、５'及び３'の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。このようなエレメ
ントは、その長さ及び特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、ＨＯ
ＬＲをコードする配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。このよ
うなシグナルには、ＡＴＧ開始コドン及びコザック配列などの近傍の配列が含ま
れる。ＨＯＬＲをコードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な
発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナル
は必要なくなるであろう。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみ
が挿入された場合は、インフレームのＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳調節
シグナルが発現ベクターに含まれなければならない。外来性の翻訳エレメント及
び開始コドンは、自然及び合成の様々なものから得ることが可能である。用いら
れる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高める
ことが可能である。(例えば、Scharf, D. 他 (1994) Results Probl. Cell Diff
er. 20:125-162.を参照)。

【００８４】 当業者に周知の方法を用いて、ＨＯＬＲをコードする配列、好適な転写及び翻
訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方
法には、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術 が含まれる。(例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Labor atom Manual , Cold Spring Harbor Press,Plainview, NY, 4章及び8章, 及び１6
-17章; 及び Ausubel, F.M. 他. (1995, and periodicsupplements) Current Pr otocols irt Molecular Biology , John Wiley & Sons, New York,NY. ch. 9章及
び13章、16章を参照)。

【００８５】 種々の発現ベクター／宿主系を利用して、ＨＯＬＲをコードする配列の保持及
び発現が可能である。これらには、限定するものではないが、組換えバクテリオ
ファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細
菌などの微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母菌や、ウイルス発
現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発
現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイ
クウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２
２プラスミド）で形質転換された植物細胞系や、動物細胞系などが含まれる。本
発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。

【００８６】 細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、ＨＯＬＲをコ
ードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、Ｈ
ＯＬＲをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクロー
ニング、増殖には、Bluescript? (Stratagene)またはpSportlTM plasmid (GIBCO
BRL)などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多数の クローニング部位にＨＬＯＲをコードする配列をライゲーションするとlacＺ遺 伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スク
リーニング法が可能となる。更に、これらのベクターを用いて、クローニングさ
れた配列のin vitroでの転写、ジデオキシンスクリーニング、ヘルパーファージ
による一本鎖の救出、入れ子状態の欠失を作り出すことが可能である。(例えば 、Van Heeke. G.及びS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509.を 参照)。例えば、抗体の産生のためなどに多量のＨＯＬＲが必要な場合は、ＨＯ ＬＲの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力に発現
を誘発するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターを使
用できる。

【００８７】 ＨＯＬＲの発現に酵母の発現系の使用が可能である。酵母菌サッカロミセス−
セレビジエでは、α因子やアルコールオキシダーゼやＰＧＨなどの構成型或いは
誘導型のプロモーターを含む多種のベクターが使用可能である。更に、このよう
なベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持のどちらかを誘導し
、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込む。(例えば、上記 のAusubel.; 及び Grant 他 (1987) Methods Enzymol.153:516-54: Scorer. C.
A. 他 (1994) Bio/Technology 12:181-184.を参照) 植物系もＨＯＬＲの発現に使用可能である。ＨＯＬＲをコードする配列の転写
は、例えば、ＣａＭＶ由来の３５Ｓ及び１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロ
モーターが単独で、或いはＴＭＶ（Takamatsu, N.等（1987）EMBO J 6:307-311 ）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて促進される。これらの作製物は、直
接のＤＮＡ形質転換或いは病原体を介したトランスフェクションによって、植物
細胞の中に導入可能である。（例えば、Hobbs, S.又はMurry, L.E. in McGraw H ill Yearbook of Science and Technology（1992）McGraw Hill NY, pp.191-196
を参照）。

【００８８】 哺乳動物細胞では、多種のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウ
イルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダ
ー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にＨＯＬＲをコードする配列
を結合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入により
、感染した宿主細胞にＨＯＬＲを発現する生ウイルスを得ることが可能である（
Logan, J.及びShenk, T.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659を参照 ）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサー を用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることが可能である。タン
パク質を高レベルで発現させるために、ＳＶ４０またはＥＢＶを基にしたベクタ
ーを用いることが可能である。

【００８９】 ヒト人工染色体（HACs）を用いて、プラスミドで発現しそれに含まれているも
のより大きなＤＮＡの断片を供給可能である。治療のために約６ｋｂ〜１０Ｍｂ
のＨＡＣｓを作製し、従来の方法（リボソーム、ポリカチオンアミノポリマー、
またはベシクル）で供給する。

【００９０】 哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞にお
けるＨＯＬＲの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、ＨＯ
ＬＲをコードする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。このような
発現ベクターは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現エレメントや、
同じ或いは別のベクターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入の後
、細胞を選択培地に移す前に、強化培地で約１〜２日の間増殖させる。選択マー
カーの目的は選択的な媒介物に対する抵抗性を与えるとともに、その存在により
導入された配列をうまく発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。安定的に形
質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に好適な組織培養技術を用いて
増殖可能である。

【００９１】 任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することが可能であ
る。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジン
キナーゼ遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ
、それぞれtk^-又はaprt^-細胞において使用される。(例えば、Wigler, M. 他 (19
77) Cell 11:223-232; and Lowy. I. 他(1980) Cell 22:817-823を参照)。また 代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択のベースとして用いること
ができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグ リコシッドネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え、als或いはpatはクロル スルフロン（chlorsulfuron）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラー ゼ（phosphinotricin acetyltransferase）に対する耐性を与える(例えば、Wigl
er, M. 他. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-3570; Colbere-Garapin,
F. 他(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14; 及び上記のMurryを参照)。さらに選択に
利用できる遺伝子、例えば、代謝のために細胞が必要なものを変えるtrpB及びhi
sDが文献に記載されている（Hartman, S.C.及びR.C. Mulligan（1988）Proc. Na
tl. Acad. Sci. 85:8047-51を参照）。アニトシアニン、緑色蛍光タンパク質（ ＧＦＰ）(Clontech. Palo Alto. CA)、βグルクロニダーゼ及びその基質ＧＵＳ ，ルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリンなどの可視マーカーが用いられる。
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）(Clontech, Palo Alto, CA)も使用できる。これ らのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベ
クター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能
である（例えば、Rhodes, C.A.他（1995）Methods Mol. Biol. 55:121-131を参 照）。

【００９２】 マーカー遺伝子の発現の存在／不在によって目的の遺伝子の存在が示されても
、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、ＨＯＬＲをコ
ードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、ＨＯＬＲをコードす
る配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能
である。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がＨＯＬＲをコ
ードする配列と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマ
ーカー遺伝子の発現は、通常タンデム遺伝子の発現も示す。

【００９３】 一般に、ＨＯＬＲをコードする核酸配列を含み、ＨＯＬＲを発現する宿主細胞
は、当業者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。これらの方
法には、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションや、ＰＣ
Ｒ法、核酸或いはタンパク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベー
ス、或いはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的
アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。

【００９４】 特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるＨ
ＯＬＲの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。
このような技法には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラ ジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光標示式細胞分取器（FACS）などがある。ＨＯ ＬＲ上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部
位のモノクローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immun
oassay）が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのア
ッセイ及びその他のアッセイは、当分野では十分に知られている。(例えば、 Ha
mpton. R. 他.(1990) Serological Methods, a Laboratony Manual. APS Press.
St Paul. MN, Section IV; Coligan. J. E. 他 (1997 and periodic supplemen
ts) Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley-In
terscience, New York. NY: 及び Maddox. D.E. 他 (1983) J. Exp. Med. 158:1
211-1216)。

【００９５】 種々の標識方法及び結合方法が当業者には周知であり、様々な核酸アッセイお
よびアミノ酸アッセイに用いられ得る。ＨＯＬＲをコードするポリヌクレオチド
に関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ
或いはＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレー
ション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含ま
れる。別法として、ＨＯＬＲをコードする配列、またはその任意の断片をｍＲＮ
Ａプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。当
分野では周知であり市販されているこのようなベクターを、Ｔ７，Ｔ３，または
ＳＰ６などの好適なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドの追加によ
って、in vitroでのＲＮＡプローブの合成に用いることができる。これらの方法
は、例えば、Pharmacia＆Upjohn（Kalamazoo, MI）及びPromega（Madison WI） 、U.S. Biochemical Corp（Cleveland OH）が市販する種々のキットを用いて行 うことができる。容易な検出のために用い得る好適なレポーター分子或いは標識
には、基質、コファクター、インヒビター、磁気粒子、及び放射性核種、酵素、
蛍光剤、化学発光剤、色素産生剤などが含まれる。

【００９６】 ＨＯＬＲをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培
地でのこのタンパク質の出現及び回収に好適な条件の下で培養される。形質転換
された細胞で作製されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用さ
れるその配列及び／またはそのベクターによる。ＨＯＬＲをコードするポリヌク
レオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を通ってＨＯＬＲの
分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解さ
れよう。別の作製物を用いて、ＨＯＬＲをコードする配列を、可溶性タンパク質
の精製を促すポリペプチド領域をコードするヌクレオチド配列と結合させること
も可能である。このような精製を促す領域には、固定された金属上での精製を可
能とするヒスチジントリプトファンモジュールなどの金属キレートペプチド、固
定された免疫グロブリンでの精製を可能とするタンパク質Ａ領域、ＦＬＡＧＳ伸
長／アフィニティー精製システム（Immunex Corp., Seattle WA）に用いられる 領域が含まれるが、これらに限定されるものではない。精製領域と配列をコード
するＨＯＬＲとの間のXA因子或いはエンテロキナーゼ(Invitrogen, San Diego,
CA)に特異的なものなどの切断可能なリンカー配列を含むものを用いて、精製が 促進され得る。このような発現ベクターの１つは、ＨＯＬＲと、チオレドキシン
或いはエンテロキナーゼ切断部位に先行する６ヒスチジン残基をコードする核酸
とを含む融合タンパク質を発現させる。ヒスチジン残基は、固定された金属イオ
ンアフィニティクロマトグラフィー上で精製を促進する(IMAC)（例えば、Porath
, J他（1992）; Protein Exp. Purif. 3:263-281を参照）。エンテロキナーゼ切
断部位が、融合タンパク質からＨＯＬＲを精製する手段を提供する(例えば、Kro
ll, D.J.他(1993); DNA Cell Biol. 12:441-453を参照)。

【００９７】 更に、挿入した配列の発現調節能力またはタンパク質の発現を所望の形にプロ
セシングする能力によって宿主細胞株が選択される。このようなポリペプチドの
修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（li
pidation）、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。タ
ンパク質の「prepro」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、標的タン
パク質、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活
性のための特定の細胞装置及び特徴のある機構をもつ異なった宿主細胞（例えば
、CHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38）がAmerican Type Culture Collection（ATC
C; Bethesda, MD）より入手可能であり、外来のタンパク質の正しい修飾及びプ ロセシングを確実にするために選択される。

【００９８】 本発明の別の実施例では、ＨＯＬＲをコードする自然或いは変更された、また
は組換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種
配列に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメ
ラＨＯＬＲタンパク質が、ＨＯＬＲの活性のインヒビターに対するペプチドライ
ブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプ
チド部分が、市販の親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。こ
のような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース
結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペ
プチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）が
含まれるが、これらに限定されるものではない。ＧＳＴ及びＭＢＰ、Ｔｒｘ、Ｃ
ＢＰ、６−Ｈｉｓによって、固定されたグルタチオン、マルトース、フェニルア
ルシン酸化物（phenylarsine oxide）、カルモジュリン、金属キレート樹脂のそ
れぞれで同族の融合タンパク質の精製が可能となる。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、及び
赤血球凝集素（ＨＡ）によって、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市
販のモノクロナール抗体及びポリクロナール抗体を用いた融合タンパク質の免疫
親和性の精製ができる。また、ＨＯＬＲをコードする配列と異種タンパク質配列
との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作
すると、ＨＯＬＲが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発
現と精製の方法は、Ausubel. F. M. 他による (1995 and periodic supplements
) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons. Ne,,v York.
NY. ch 10.に記載されている。本発明の別の実施例では、ＴＮＴ^TMウサギ網状 赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系(Promega. Madison. WI)を用いてin vit ro で放射能標識したＨＯＬＲの合成が可能である。これらの系は、Ｔ７またはＴ
３、ＳＰ６プロモーターと機能的に結合したタンパク質をコードする配列の転写
と翻訳をつなげる。転写は、好ましくは３５Ｓメチオニンである放射能標識され
たアミノ酸前駆体の存在の下で起こる。

【００９９】 ＨＯＬＲの断片は、組換え生成物だけでなく固相技術を用いて直接的なペプチ
ド合成によって作製され得る(例えば、前出のCreighton, pp. 55-60.を参照)。 タンパク質の合成は、手動或いは自動で行われ得る。自動合成は、例えばApplie
d Biosystem 431Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて行うことが可
能である。ＨＯＬＲの種々の断片は別々に合成して、次ぎに結合させて完全長分
子を生成する。

【０１００】 治療 ＨＯＬＲと、ヒトからのレクチン様酸化ＬＤＬレセプター(GI 1902984)と、ウ
シ（Bos taurus）からのレクチン様酸化ＬＤＬレセプター(GI 1902982)との間に
、化学的及び構造的相同性が存在する。更にＨＯＬＲは癌組織に発現する。従っ
てＨＯＬＲは、癌及び自己免疫異常、心血管疾患において一定の役割を果たすと
考えられる。

【０１０１】 従って、一実施例において、癌の治療や予防のために、ＨＯＬＲのアンタゴニ
ストを患者に投与することが可能である。このような癌には、腺癌及び白血病、
リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌などがあり、詳しくは副腎、膀胱、骨
、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉
、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲
状腺、子宮の癌が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。一実施態様
では、ＨＯＬＲと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはＨ
ＯＬＲを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶ標的或いは運搬機構として間接的
に用いられ得る。

【０１０２】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した癌の治療または予防の
ために、ＨＯＬＲをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクター
を患者に投与することも可能である。

【０１０３】 更に別の実施例では、自己免疫異常の予防及び治療のためにＨＯＬＲのアンタ
ゴニストを患者に投与し得る。このような疾患には、後天性免疫不全症候群（Ａ
ＩＤＳ）、副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、ア
ミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自
己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮
膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、偶発性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅
斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、
橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力
症、心筋又は心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ラ
イター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフ
ィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大
腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環と、ウィルス感染症及
び細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症、外傷が
含まれ得るが、これらに限定されるものではない。一実施態様では、ＨＯＬＲと
特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはＨＯＬＲを発現する
細胞または組織に薬剤を運ぶ標的或いは運搬機構として間接的に用いられ得る。

【０１０４】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した自己免疫異常の治療ま
たは予防のために、ＨＯＬＲをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現す
るベクターを患者に投与することも可能である。

【０１０５】 また、別の実施例では、ＨＯＬＲのアンタゴニストを、心血管疾患の予防及び
治療のために患者に投与し得る。このような心血管疾患には、アテローム性動脈
硬化症及び非アテローム動脈硬化症を含む動脈硬化症、高血圧、脳卒中、冠状動
脈疾患、虚血、心筋梗塞、狭心症、心不整脈、洞結節ブロック、房室結節ブロッ
ク、慢性血行過負荷、動脈瘤が含まれ得るが、これらに限定されるものではない
。一実施態様では、ＨＯＬＲと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとし
て、或いはＨＯＬＲを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶ標的或いは運搬機構
として間接的に用いられ得る。

【０１０６】 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した心血管疾患の治療
または予防のために、ＨＯＬＲをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現
するベクターを患者に投与することもできる。

【０１０７】 別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ
スト、相補的な配列、ベクターを別の好適な治療薬と組み合わせて投与すること
もできる。当業者は、従来の医薬原理にしたがって併用療法で用いる好適な治療
薬を選択可能である。治療薬との組み合わせにより、上に列記した種々の疾患の
治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いて少ない量の各薬剤
で医薬効果をあげることが可能であり、広範囲な副作用の可能性を低減し得る。

【０１０８】 ＨＯＬＲのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが
可能である。詳しくは、精製されたＨＯＬＲを用いて抗体を作ったり、治療薬の
ライブラリをスクリーニングしてＨＯＬＲと特異的に結合するものを同定が可能
である。ＨＯＬＲの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能
である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメ
ラ抗体、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリによって作ら
れたフラグメントが含まれる。但し、これらに限定されるものではない。治療用
には、中和抗体（即ち、二量体の形成を阻害するもの）が特に好ましい。

【０１０９】 抗体の作製のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のも
のを含む種々の宿主が、ＨＯＬＲまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備
えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種
々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。このようなアジュバ
ントにはフロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジ
ュバント、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油
性乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、及びジニトロフェノールなどの界
面活性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトに用いられるア
ジュバントの中では、ＢＣＧ（bacilli Calmette-Guerin）及びCorynebacterium parvum が特に好ましい。

【０１１０】 ＨＯＬＲに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド
、または断片は、約５以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列が望ましく、更に望
ましいのは約１０以上のアミノ酸からなるものである。これらのオリゴペプチド
或いはペプチド、またはそれらの断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一
部と同一であることが望ましく、小さな自然発生の分子のアミノ酸配列全体も含
む。ＨＯＬＲアミノ酸の短い伸展部は、ＫＬＨ(キーホールリンペットヘモシニ アン)などの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生さ れ得る。

【０１１１】 ＨＯＬＲに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、
抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらの技
術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びＥＢＶ−ハ
イブリドーマ技術が含まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、Ko
hler, G. 等. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D. 等. (1985) .J. Immuno
l. Methods 81.:31-42; Cote, R.J. 等. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:20
26-2030; Cole, S.P. 等. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120を参照）。

【０１１２】 更に、「キメラ抗体」の作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺
伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を
備える分子を得るために用いられる（例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc.
Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:604
-608; Takeda, S.等. (1985) Nature 314:452,454を参照）。別法では、当分野 で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、
ＨＯＬＲ特異性一本鎖抗体を生成する。関連する特異性を備えるが別のイディオ
タイプの組成の抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリから
鎖混合によって生成することもできる（例えば、Burton D.R. (1991) Proc. Nat
l. Acad. Sci. 88:11120-3を参照）。

【０１１３】 抗体は、in vivoでのリンパ球集団の中の生成を誘発することによって、また は免疫グロブリンライブラリのスクリーニング又は文献に示されているような、
高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって、作製する
こともできる（例えば、Orlandi, R. 他. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:
3833-3837; Winter, G. 他. (1991) Nature 349:293-299を参照）。

【０１１４】 ＨＯＬＲに対する特異的な結合部位を含む抗体も作製することができる。例え
ば、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ
’）２断片と、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を減じることによって生
成されるＦａｂ断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。別法では
、Ｆａｂ発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性とモノクローナ
ルＦａｂ断片の迅速且つ容易な同定が可能となる（例えば、Huse, W.D. 等. (19
89) Science 254:1275-1281を参照）。

【０１１５】 種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体
を同定する。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のための数々のプ
ロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、ＨＯ
ＬＲとその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。二つの非干渉性Ｈ
ＯＬＲエピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノク
ローナルベースのイムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイも利用する
ことができる（Maddox, 前出）。

【０１１６】 本発明の別の実施例では、ＨＯＬＲをコードするポリヌクレオチド、または任
意の断片またはその相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施形
態では、ＨＯＬＲをコードするポリヌクレオチドの相補配列がｍＲＮＡの転写を
阻止するのに好適である場合、これを使用することができる。特に細胞は、ＨＯ
ＬＲをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列で形質転換することもできる
。したがって、相補的分子または断片は、ＨＯＬＲの活性の調節、または遺伝子
機能の調節のために使用することができる。このような技術は当分野では周知で
あり、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、ＨＯ
ＬＲをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位
置から設計可能である。

【０１１７】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス又はワクシニア、又は様々な細菌
性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的の器官、組
織又は細胞集団に運ぶこともできる。当業者に周知の方法を用いてＨＯＬＲをコ
ードポリヌクレオチドと相補的な核酸配列を発現するベクターを作製することが
できる(例えば、前出のSambrook 他、及び前出のAusubel 他によるものを参照) 。

【０１１８】 ＨＯＬＲをコードする遺伝子は、ＨＯＬＲをコードするポリヌクレオチド又は
その断片を高いレベルで発現する発現ベクターで、細胞又は組織を形質転換する
ことによって止めることができる。このような作製物を用いて翻訳できないセン
ス又はアンチセンス配列を細胞の中に導入することができる。ＤＮＡの中に組み
入れられない場合でも、このようなベクターは内在性のヌクレアーゼによって機
能が損なわれるまでｍＲＮＡ分子を転写し続ける。非複製ベクターでも一過性の
発現を一ヶ月以上に亘って続け、好適な複製エレメントがベクター系の一部であ
る場合はさらに長く持続し得る。

【０１１９】 上記した通り、遺伝子の発現は、ＨＯＬＲをコードする遺伝子の制御５’また
は調節領域に対する相補的な配列またはアンチセンス分子（ＤＮＡ或いはＲＮＡ
、ＰＮＡ）を設計することによって調節することができる。転写開始部位、即ち
開始部位から−１０と＋１０との間の領域に由来するオリゴヌクレオチドが好適
である場合と同様に、「三重らせん」と塩基対合法を用いて阻止することができ
る。三重らせん構造は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、または調節分子
の結合のために十分に広がるのを阻止するため有益である。三重式ＤＮＡを用い
る最近の治療の進歩は文献に記載されている（例えば、Gee, J.E. 等. (1994) I
n: Huber, B.E. 及び B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Fut
ura Publishing Co., Mt. Kisco, NYを参照）。相補的な配列またはアンチセン ス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってｍＲＮ
Ａの翻訳を阻止するように設計できる。

【０１２０】 酵素性ＲＮＡ分子であるリボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒するために
用いることができる。リボザイム作用の機構には、相補的な標的ＲＮＡへのリボ
ザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれ、ヌクレオチド鎖切断
が続く。例えば、ＨＯＬＲをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、特異的且
つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。

【０１２１】 任意の潜在的ＲＮＡ標的の中の特異的なリボザイム切断部位が、後続の配列Ｇ
ＵＡ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位に対して、標的分子をスキ
ャニングすることによって初めに同定される。一度同定されると、切断部位を含
む標的遺伝子の領域に対応する１５個から２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮ
Ａ配列を、オリゴヌクレオチドの機能を不全にする二次的な構造の特徴について
評価することが可能である。候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセ
イを用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易性
をテストすることによって評価することが可能である。

【０１２２】 本発明の相補的なリボ核酸分子及びリボザイムは、当分野で周知の方法を用い
て、核酸分子の合成のために作製することができる。これらの方法には、固相ホ
スホラミダイト化合物などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法が含ま
れる。別法では、ＲＮＡ分子がin vitro及びin vivoでＨＯＬＲをコードするＤ ＮＡ配列の転写によって生成され得る、このようなＤＮＡ配列はＴ７またはＳＰ
６等の好適なＲＮＡポリメラーゼプロモータを用いて、種々のベクターの中に組
み入れることが可能である。別法では、相補的なＲＮＡを構成的または誘導的に
合成するこれらのｃＤＮＡ作製物は、細胞株、細胞、または組織の中に導入する
ことができる。

【０１２３】 ＲＮＡ分子を修飾することによって、細胞内の安定性を高め、半減期を長くす
ることができる。可能な修飾には、分子の５’及び／または３’端部でのフラン
キング配列の追加、または分子のバックボーン内でのホスホジエステラーゼ結合
よりむしろホスホロチオネート又は２’Ｏメチルの使用が含まれる、がこれらに
限定されるものではない。ＰＮＡの生成に固有のこの概念は、内在性のエンドヌ
クレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミ
ン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び同様の修飾形態だけで
なく、イノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブトシン（wybutosine）
などの従来のものでない塩基を含めるこによって、これらの分子の全体に拡大す
ることができる。

【０１２４】 ベクターを細胞又は組織に導入する多数の方法が利用でき、in vivo、in vitr o 、及びex vivoでの使用に等しく適している。ex vivoでの治療の場合、患者か ら採取された肝細胞の中にベクターを導入して、自家移植で同じ患者に戻すため
にクローニング増殖される。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリ
カチオンアミノポリマーによる運搬は、当分野で周知の方法を用いて実行するこ
とができる（例えば、Goldman, C.K. 他. (1997) Nature Biotechnology 15:462
-66:を参照）。

【０１２５】 上記したいかなる治療方法も、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル
、及び最も好ましいヒトなどの哺乳動物を含む、治療が必要な全ての被験者に適
用できる。

【０１２６】 本発明の別の実施例は、上記した全ての治療効果のために、医学上認められる
担体と共に医薬品或いは無菌組成物の投与に関連する。このような医薬品組成物
は、ＨＯＬＲ、ＨＯＬＲに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、又
はＨＯＬＲのインヒビターなどからなる。この組成物は、単体で、或いは安定剤
などの１種類以上の別の薬剤と共に、無菌の生体適合性医薬品担体に投与するこ
とができる。このような医薬品担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、
及び水などが含まれるがこれらに限定されるものではない。この組成物は、単独
或いは薬物又はホルモンなどの別の薬剤と共に投与することができる。

【０１２７】 本発明に用いられる医薬品組成物は、任意の数の経路を用いて投与することも
できる。この経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、もく膜下腔内
、心室内、経皮性、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、異所性、舌下、または直腸が
含まれるがこれらに限定されるものではない。

【０１２８】 活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物には、活性化合物を医薬的に使
用可能な薬剤にするのを容易にする、医薬品添加物及び補助剤を含む好適な薬学
的に認められる担体が含まれ得る。製剤及び投与についての詳しい技術について
は、最新版のRemington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., E
aston, PA)に記載されている。

【０１２９】 経口投与用の医薬品組成物が、経口投与に好適な投与量において当分野で周知
の薬学的に許容される担体を用いて、製剤することができる。このような担体に
より、医薬品組成物が患者が摂取するために、錠剤、丸薬、糖衣剤、カプセル、
液体、ゲル状、シロップ剤、泥状物、懸濁液として製剤される。

【０１３０】 経口用に用いられる医薬品は、活性化合物と固体の薬品添加物とを混合し、得
られた顆粒の混合物を処理して、（所望に応じてすりつぶした後）タブレット或
いは糖衣錠コア（dragee cores）にする。好適な医薬品添加物とは、ラクトース
、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖類、トウモロコシ、小
麦、米、ジャガイモ、又はその他の植物からのでんぷん、メチルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウ
ムなどのセルロース、アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、ゼラチン
及びコラーゲンなどのタンパク質などの炭水化物又はタンパク質賦形剤である。
必要に応じて、例えば、架橋結合したポリビニルピロリドン、かんてん、アルギ
ン酸、またはその塩であるアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤が
加えられる。

【０１３１】 糖衣錠コアは、濃縮糖溶剤などの好適なコーティングと共に用いられる。この
ような濃縮糖溶剤には、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボ
ポルゲル（carbopol gel）、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタ
ン、ラッカー溶剤、及び好適な有機溶媒または混合溶剤などが含まれ得る。染料
または色素が、製品の識別又は活性化合物の量、即ち薬用量を示すため、錠剤ま
たは糖衣錠に加えられる。

【０１３２】 経口用に用いられる医薬品製剤には、ゼラチンから作られたプッシュ−フィッ
ト型のカプセル、グリセロールまたはソルビトールなどのコーティングとゼラチ
ンからなる封入されたカプセルが含まれる。プッシュ−フィット型のカプセルに
は、ラクトース又はスターチなどの賦形剤や結合材、タルク又はステアリン酸マ
グネシウムなどの潤滑剤、所望に応じて安定剤と混合された活性処方成分が含ま
れる。ソフトカプセルでは、活性化合物が、安定剤と共に或いは安定剤なしで、
脂肪油、溶液、またはポリエチレングリコール溶液などの好適な溶液に溶解或い
は懸濁され得る。

【０１３３】 非経口投与用に好適な医薬品剤が、水溶液で製剤されるが、ハンクス液、リン
ガー液、生理緩衝食塩水などの生理学的に適合性のある緩衝剤が好ましい。水性
懸濁注射液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデ
キストランなどの懸濁液の粘性を高める物質を含み得る。更に、活性化合物の懸
濁液は、好適な油性注入懸濁液として製剤され得る。好適な親水性溶液または媒
体には、ごま油などの脂肪油、オレイン酸エチル、トリグリセリド又はリボソー
ムなどの合成脂肪酸が含まれる。非脂質ポリカチオンアミノポリマーが、運搬目
的で使用される。随意選択により、懸濁液は高濃度の溶液が可能となるよう化合
物の溶解性を高める好適な安定剤または薬剤を含み得る。

【０１３４】 局部または鼻腔投与のため、特定の障壁に浸透する好適な浸透剤が製剤に用い
られる。このような浸透剤は当業者には周知である。

【０１３５】 本発明の医薬品組成物は、当分野で周知の方法、例えば従来の混合、溶解、顆
粒化、糖衣化、溶離（levigating）、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥
処理を用いて製造され得る。

【０１３６】 医薬品組成物は塩類として製剤され、限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳
酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等の多くの酸と共に形成可能である。塩分は対
応する遊離塩基系よりも、水溶剤または他のプロトン溶剤に溶けやすい。別の場
合の好ましい薬剤の形態には、１から５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スク
ロース、及び２〜７％マンニトールの幾つか或いは全てを含み、ｐＨの範囲が４
．５〜５．５であり、使用前に緩衝剤と結合する凍結乾燥粉末を用いることがで
きる。

【０１３７】 医薬品組成物が調合された後、それらは適当な箱に詰められ、指定した症状の
薬としてラベルが貼られる。ＨＯＬＲの投与のため、このようなラベルには、量
、頻度、及び投与の方法が含まれるであろう。

【０１３８】 本発明に用いる好適な医薬品組成物には、目的を達成するため、効果的な量の
活性処方成分を含む組成物が含まれる。当業者は、自分の能力で十分に効果的な
服用量を決めることができる。

【０１３９】 どのような組成物であっても、治療に効果的な薬用量は、初めは、例えば腫瘍
細胞の腫瘍細胞アッセイで、或いは動物モデルのどちらかで推定することができ
る。通常、動物モデルには、マウス、ウサギ、イヌ、又はブタなどが用いられる
。動物モデルはまた、好適な濃縮範囲及び投与の経路を決めるのに用いることが
できる。このような治療をもとに、ヒトへの有益な薬用量及び投与経路を決定す
ることができる。

【０１４０】 医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばＨＯＬＲ又は
その断片、ＨＯＬＲの抗体、ＨＯＬＲのアゴニストまたはアンタゴニスト、イン
ヒビターなどの活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、たとえば
、ＥＤ₅₀（服用に対して集団の５０％に医薬的効果がある。）またはＬＤ₅₀（服
用に対して集団の５０％に致命的である）統計を計算するなど、細胞培養または
動物実験における標準的な薬剤手法によって決定することができる。治療効果と
毒性効果との薬用量比は治療指数であり、ＬＤ₅₀／ＥＤ₅₀の比率で示すことがで
きる。高い治療指数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物
実験から得られたデータが、ヒトへの適用のために、薬用量の範囲を調剤するの
に用いられる。このような組成物が含まれる薬用量は、毒性を殆ど或いは全く含
まず、ＥＤ₅₀を含む血中濃度の範囲であることが望ましい。薬用量は、用いられ
る投与形態及び患者の感受性、投与の経路にによって、この範囲内で様々である
。

【０１４１】 正確な薬用量は、治療が必要な患者に関する要素を考慮して、実務者によって
決められるであろう。薬用量及び投与は、効果的なレベルの活性成分を与えるた
め或いは所望の効果を維持するために調節される。薬用量の要素として考慮され
るものには、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、年齢、体重、及び患者の
性別、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、及び治療に対する応答
が含まれる。作用器官が長い医薬品組成物は、三日か四日に一度、一週間に一度
、二週間に一度、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって左右され、投
与され得る。

【０１４２】 通常の薬用量は投与の経路によって異なるが、約０．１〜１００，０００μｇ
までの最大約１グラムまでである。特定の薬用量及び運搬の方法に関するガイダ
ンスは文献に記載されており、一般に当分野の実務者はそれを利用することがで
きる。当業者は、タンパク質またはインヒビターとは異なったヌクレオチドの製
剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの運搬は、
特定の細胞、状態、位置などに対して特異的であろう。

【０１４３】 診断 別の実施例では、特異的にＨＯＬＲと結合する抗体が、ＨＯＬＲの発現によっ
て特徴づけられる疾患の診断、或いはＨＯＬＲやＨＯＬＲのアゴニストまたはア
ンタゴニスト、インヒビターで治療を受ける患者を監視するためのアッセイに用
いられる。診断に有益な抗体は、治療のところで記載した方法と同じ方法で製剤
される。ＨＯＬＲの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは
細胞や組織から採取されたものにおけるＨＯＬＲを検出する方法が含まれる。こ
れらの抗体は、修飾をして或いはしないで使用され、レポーター分子の共有結合
か非共有結合によって標識化され得る。当分野で周知の幅広いレポーター分子が
用いられるが、その内の幾つかは既に記述した。

【０１４４】 ＨＯＬＲを測定するためのＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，及びＦＡＣＳを含む種々のプ
ロトコルは、当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのＨＯＬＲの
発現を診断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なＨＯＬＲの発現の
値は、複合体の形成に適した条件の下、正常な哺乳動物、好ましくはヒトである
被験者から採取した体液または細胞とＨＯＬＲに対する抗体とを結合させること
によって決定する。標準的な複合体形成の量は種々の方法で定量され得るが、測
光法（photometric）が好ましい。被験者のＨＯＬＲの発現の量、制御及び疾患 、生検組織からのサンプルが標準値と比較される。標準値と被験者との間の偏差
が、疾患を診断するパラメーターとなる。

【０１４５】 別の実施例によれば、ＨＯＬＲをコードするポリヌクレオチドを診断のために
用いることもできる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配
列、相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡが含まれる。ポリヌクレオチド
を用いて、疾患と相関し得るＨＯＬＲを発現する生検組織における遺伝子の発現
を検出及び定量する。この診断アッセイを用いて、ＨＯＬＲの不在、存在、及び
過度の発現を調べ、治療中のＨＯＬＲレベルの制御を監視する。

【０１４６】 ある実施形態では、ＨＯＬＲまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含む
ポリヌクレオチド配列を検出可能なＰＣＲプローブを用いたハイブリダイゼーシ
ョンによって、ＨＯＬＲをコードする核酸配列を同定することが可能である。例
えば５'調節領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであ るやや特異性の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダ
イゼーション或いは増幅の厳密性（最大、高い、中間、または低い）は、プロー
ブがＨＯＬＲをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いはアレル
や関連配列コードする自然界の配列のみを同定するかどうかによって決まるであ
ろう。

【０１４７】 プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、ＨＯＬＲをコードする任意
の配列からのヌクレオチドを５０％以上含むのが望ましい。目的の本発明のハイ
ブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡあるいはＲＮＡが可能であり、SEQ ID N
O:2の配列、或いはＨＯＬＲ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロン を含むゲノム配列に由来し得る。

【０１４８】 ＨＯＬＲをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプロー
ブの作製方法には、ＨＯＬＲ及びＨＯＬＲ誘導体をコードするポリヌクレオチド
配列をｍＲＮＡプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある
。このようなベクターは市販されており、当業者には周知であり、好適なＲＮＡ
ポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vit ro でＲＮＡプローブを合成するために用いられる。ハイブリダイゼーションプロ
ーブは、例えば３２Ｐ或いは３５Ｓなどの放射性核種、或いはアビジン／ビオチ
ン（biotin）結合系によってプローブに結合されたアルカリホスファターゼなど
の酵素標識等の種々のレポーターの集団によって標識され得る。

【０１４９】 ＨＯＬＲをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、ＨＯＬＲの発現と関連
のある疾患の診断が可能である。以下に限定するものではないがこのような疾患
の例には、例えば癌が含まれ、その中には、腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫
、骨髄腫、肉腫、奇形癌などがあり、詳しくは副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房
、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副
甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が
含まれ、また自己免疫異常も含まれ、その中には、後天性免疫不全症候群（ＡＩ
ＤＳ）、副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミ
ロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己
免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚
炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、偶発性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑
、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋
本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症
、心筋又は心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライ
ター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィ
ラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸
炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環と、ウィルス感染症及び
細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症、外傷が含
まれ、更に心血管疾患も含まれ、その中には、アテローム性動脈硬化症及び非ア
テローム動脈硬化症を含む動脈硬化症、高血圧、脳卒中、冠状動脈疾患、虚血、
心筋梗塞、狭心症、心不整脈、洞結節ブロック、房室結節ブロック、慢性血行過
負荷、動脈瘤が含まれる。ＨＯＬＲをコードするポリヌクレオチド配列は、サザ
ーンブロット法やノーザンブロット法、或いはその他の膜系の技術、ＰＣＲ法、
ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）、ＥＬＩＳＡアッセイ、及び患 者から採取した体液或いは組織を利用して変異ＨＯＬＲの発現の検出に用いられ
るマイクロアレイに使用することが可能である。このような質的或いは量的方法
は、当分野では周知である。

【０１５０】 特定の形態において、ＨＯＬＲをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾
患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。ＨＯＬＲをコ
ードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーシ
ョン複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプ
ルに加えることができるであろう。好適な培養期間の後、サンプルを洗浄し、シ
グナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、制御サ
ンプルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のＨＯＬＲをコードする
ヌクレオチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。こ
のようなアッセイを用いて、動物実験、臨床試験、或いは個人の患者の治療を監
視における、特定の治療効果を推定することが可能である。

【０１５１】 ＨＯＬＲの発現に関連する疾患の診断の元となるものを提供するために、正常
あるいは標準的な発現の概要が確立される。この確立は、ハイブリダイゼーショ
ン或いは増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽
出された体液或いは細胞と、ＨＯＬＲをコードする配列或いはその断片とを結合
させることにより達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被
験者から得た値と周知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる
実験からの値とを比較することによって定量可能である。正常なサンプルから得
た標準的な値を、疾患の症状を示す被験者から得た値と比較可能である。標準値
と被験者の値との偏差を用いて疾患の存在を確定する。

【０１５２】 疾患の存在が確定され治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーショ
ンアッセイを通常ベースで繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な患
者に示される値に近づき始めたかどうかを推定することが可能である。繰り返し
行ったアッセイの結果を、数日から数ヶ月の期間の治療の効果を見るのに用いる
ことができる。

【０１５３】 癌において、個体からの生体組織における比較的多量の転写物は、疾患の発生
の素因を示し、また実際に臨床的症状が出る前に疾患を検出する方法を提供する
ことが可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法或
いは積極的な治療法を早くから利用して、癌の発生または進行を防ぐことが可能
となる。

【０１５４】 ＨＯＬＲをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断
への利用には、ＰＣＲの利用が含まれ得る。このようなオリゴマーは、化学的な
合成、酵素を用いた生成、或いはin vitroで生成され得る。オリゴマーは、好ま
しくはＨＯＬＲをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはＨＯＬＲをコード
するポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件の
下、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、や
や緩い厳密性条件の下、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出及び／または定量
のため用いることが可能である。

【０１５５】 ＨＯＬＲの発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射
標識或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）、及び標準 的な曲線に結果が加えられたものが含まれる（例えば、Melby, P.C.等(1993) J.
Immunol. Methods, 159:235-44；Duplaa, C.等(1993) Anal. Biochem. 229-236
を参照）。多数のサンプルの定量の速度が、目的のオリゴマーが種々の希釈液に
含まれ、分光光度法或いは非色応答により迅速に定量するＥＬＩＳＡ型のアッセ
イを用いることによって加速された。

【０１５６】 別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリ
ゴヌクレオチドまたはそれより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いる。マイクロアレイを用いて、同時に極めて多くの遺伝子の発現レベルを監
視し、遺伝子の変異、突然変異及び多形性を識別する。この情報は、遺伝子機能
の決定、疾患の遺伝的根拠の解釈、疾患の診断、及び治療薬剤の活性の監視及び
開発に有用である。

【０１５７】 当分野で公知の方法でマイクロアレイを準備して使用し、分析する。(例えば 、Brennan, T.M. 他 (1995) 米国特許第5,474,796号;Schena, M. 他 (1996) Pro
c. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619; Baldeschweiler 他(1995) PCT出願番号W
O95/251116; Shalon, D.他 (1995) PCT出願番号WO95/35505; Heller, R.A. 他(1
997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155; 及び Heller, M.J. 他 (1997) 米
国特許第5,605,662号を参照) 本発明の別の実施例ではまた、ＨＯＬＲをコードする核酸配列を用いて、自然
発生のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブ
を生成することが可能である。この配列は、以下のものに対してマッピングされ
る。特定の染色体、染色体の特定領域または人工生成の染色体、例えば、ヒト人
工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、
細菌Ｐ１生成物或いは単一染色体ｃＤＮＡライブラリである。（例えば、Price,
C.M. (1993) Blood Rev. 7:127-134, 及びTrask, B.J. (1991) Trends Genet.
7:149-154を参照） In sit蛍光ハイブリダイゼーション（FISH）は、他の物理的染色体マッピング
技術及び遺伝マップデータと相関するであろう（例えば、Heinz-Ulrich, 他によ
る(1995) in Meyers, R.A. (ed.) Moecular Biology and Biotechnology, VCH P
ublishers New York, NY, pp. 965-968.を参照）。遺伝子マップデータの例は、
種々の科学誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のサイト で見付けることができる。物理的な染色体マップ上のＨＯＬＲをコードする遺伝
子の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に対する素因が、このよう
な疾患と関係するＤＮＡの領域を決定するのに役立つ。本発明のヌクレオチド配
列を用いて、正常者と、保有者、及び感染した者との遺伝子配列における違いを
検出することもある。

【０１５８】 染色体標本のIn sitハイブリダイゼーション、及び確定した染色体マーカーを
用いた結合分析などの物理的マッピング技術を用いて、遺伝子マップを拡張する
こともできる。マウスなどの別の哺乳動物の染色体上での遺伝子の配置により、
たとえ特定のヒト染色体の数或いはアームが分かっていなくても、関連するマー
カーが明らかになることが多い。新規の配列を、物理的なマッピングによって、
染色体アームに割り付けることもできる。このことは、位置クローニング或いは
別の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患の研究をしている研究者にとって、価値
ある情報である。疾患或いは症候群の位置が、例えば血管拡張性失調症の11q22-
23などの特定の遺伝子領域に遺伝子結合によって大まかに決定されると、その領
域に対するどの配列マッピングも、さらなる調査のための関連する遺伝子或いは
調節遺伝子を表す（例えば、Gatti, R.A.他による（1988）Nature 336:577-580 を参照）。また、目的の本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、保有者、
即ち感染者の間の、転位置、反転などによる染色体位置の違いを検出することも
ある。

【０１５９】 本発明の別の実施例では、ＨＯＬＲ、その触媒作用断片或いは免疫原断片また
はそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物
のライブラリのスクリーニングに用いることができる。このようなスクリーニン
グに用いる断片は、溶液に遊離、固体支持物に固定、細胞の表面上に保持、或い
は細胞内に存在する。ＨＯＬＲとテストされる薬剤との複合体を結合することに
よる形成は計測されることもある。

【０１６０】 薬剤スクリーニングに用いる別の方法は、目的のタンパク質に対して、好適な
結合親和性を有する化合物のスクリーニング処理能力を高めるために用いられる
（例えば、Geysen,他による(1984) PCT出願番号 WO84/03564を参照）。この方法
では、相当な数の異なる小さな試験用化合物が、プラスチックピン或いは他の基
板の上に合成される。試験用化合物は、ＨＯＬＲ、或いはその断片と反応してか
ら洗浄される。次ぎに、結合されたＨＯＬＲが、当分野で周知の方法で検出され
る。精製されたＨＯＬＲはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用い
られるプレート上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いて
、ペプチドを捕らえ、固体支持物に固定することもできる。

【０１６１】 別の実施例では、ＨＯＬＲと結合可能な中和抗体がＨＯＬＲと結合するため試
験用化合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることが
できる。この方法では、抗体が、ＨＯＬＲと１つ以上の抗原決定因子を共有する
どのペプチドの存在も検出する。

【０１６２】 別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にＨＯＬＲをコードするヌクレオ
チド配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び
特異的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を
提供することができる。

【０１６３】 以下の実施例は、目的の発明を例示し、発明を限定する目的のものではない。

【０１６４】

【実施例】

１ ＬＵＮＧＮＯＴ０９ ｃＤＮＡライブラリ作製 LUNGNOT09肺組織ライブラリは、２３週目の白人の男の胎児の肺組織から単離 した１μｇのポリＡ ＲＮＡから作製された。超音波によって乳児型嚢胞腎と診 断されたため、中絶処置が行われた。この凍結組織をBrinkman Homogenizer Pol
ytron-PT 3000 (Brinkman Instruments社, Westbury, NY)を用いてホモジナイズ
して溶解した。この溶解物を、Beckman L8-70M Ultracentrifuge (Beckman Inst
ruments)のBeckman SW28ローターを用いて５．７Ｍの塩化セシウムにおいて、室
温で１８時間、毎分２５,０００の回転数で遠心分離した。このＲＮＡを、０． ３Ｍの酢酸ナトリウム及び２．５倍量のエタノールを用いてｐＨ８．０の酸性フ
ェノールクロロホルム（acid phenol chloroform）で沈殿させ、ＤＥＰＣ処理水
で再懸濁して、３７℃でＤＮＡ分解酵素で処理した。上記したようにＲＮＡの抽
出及び際沈殿を繰り返した。その後、ｍＲＮＡをQIAGEN Oligotex.kit(QIAGEN,
Inc.. Chatsworth, CA)を用いて単離し、ｃＤＮＡライブラリの作製に用いた。

【０１６５】 このＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成及びプラスミドクローニング用のスーパースクリ
プトプラスミドシステム(Catalog #18248-013: GIBRO/BRL)の推奨プロトコルに 従って処理した。ｃＤＮＡの合成は、NotI-oligo(dT)プライマーを用いて開始し
た。二本鎖ｃＤＮＡを平滑末端化し、EcoR1アダプタに結合させ、NotIで消化し て、サイズを選択し、plNCYベクター(Incyte)のNotI及びEcoRI部位にクローン化
した。最後に、このplNCYプラスミドをDH5α^TMコンピテント細胞(Gibco/BRL)に 形質転換した。

【０１６６】 ２ ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定 プラスミドＤＮＡは、REAL Prep 96プラスミドキット(QIAGEN, Inc.)を用いて
細胞から遊離させ、精製した。このキットにより、マルチチャンネル試薬ディス
ペンサーを用いて９６のウェルブロックで９６個のサンプルを同時に精製できた
。以下の変更点を除いて推奨プロトコルに従った。１）細菌は２５ｍｇ／ｌのカ
ルベニシリン及び０．４％のグリセロールを含む１ｍｌの滅菌のTerrific Broth
（GIBCO/BRL）内で培養する。２）接種後、その培養株を１９時間インキュベー トし、インキュベーション終了時にその細胞を０．３ｍｌの溶解緩衝液で溶解す
る。３）イソプロパノール沈殿後、プラスミドＤＮＡペレットを０．１ｍｌの蒸
留水に再懸濁する。プロトコルの最終ステップを終了した後、サンプルを４℃で
保管するために９６−ウエルブロックに移す。

【０１６７】 これらのｃＤＮＡは、Peltier Thermal Cyclers (PTC200 from MJ Research,
Watertown MA)及びApplied Biosystems 377 DNA Sequencing Systemsと共にHami
lton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno NV)を用いて、Sanger他(1975; J Mol Bi ol 94:441f)の方法により配列決定して、読み枠を決定した。

【０１６８】 ３ ｃＤＮＡクローン及びその推定されるタンパク質の類似性検索 配列表のヌクレオチド配列及び／またはアミノ酸配列を、GenBank、SwissProt
, BLOCKS及びPima IIのデータベースにある配列と照合する。以前に同定されて 注釈が付けられた配列を含むそれらのデータベースを、ＢＬＡＳＴ（Basic Loca
l Alignment Search Tool）で類似性領域の検索を行う。(例えば、Altschul, S.
F. (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; 及び Altschul 他(1990) J. MOl. Biol.
215:403-410を参照)。

【０１６９】 ＢＬＡＳＴは、配列類似性を決定するためにヌクレオチド配列及びアミノ酸配
列の両方のアライメントを生成する。このアライメントが局部的な性質を有する
ため、ＢＬＡＳＴは厳密な一致を判定する際、或いは原核（細菌）又は真核（動
物、真菌或いは植物）起源からなる相同体を同定する際に特に有用である。他の
アルゴリズムを、主要配列パターン及び副次的な構造の間隙の問題を取り扱う際
に用いることが可能である(例えば、 Smith, T. 他. (1992) Protein Engineeri
ng 5:35-51.を参照)。本明細書に開示している配列は、長さが少なくとも４９ヌ
クレオチドであり、ＡまたはＣ、Ｇ、ＴではなくＮが記録される不要な塩基の上
限は１２％である。

【０１７０】 このＢＬＡＳＴ法は、問合せ配列とデータベース配列との間の一致を検索し、
すべての見つかった一致配列の統計的有意性を評価し、ユーザが選択した有意性
の閾値を満足する一致のみを報告する。本明細書では、ヌクレオチドの閾値を１
０^-25、ペプチドの閾値を１０^-8に設定した。

【０１７１】 インサイト社ヌクレオチド配列が霊長類（ｐｒｉ）、齧歯類（ｒｏｄ）及び他
の哺乳動物（ｍａｍ）配列の場合には、GenBankデータベースに対して検索した 。次ぎに、同じクローンに由来する推定されたアミノ酸配列の類似性が、GenBan
k機能タンパク質データベース及び哺乳動物（ｍａｍｐ）、脊椎動物（ｖｒｔｐ ）、真核生物（ｅｕｋｐ）に対して検索した。

【０１７２】 更に、BLOCKS（Block 2 Bioanalysis Program (Incyte, Palo Alto, CA)）な どの好適な分析プログラムを用いて、ｃＤＮＡライブラリ由来の同定された配列
を分析して、保存されたタンパク質モチーフをコードするそれらの遺伝子配列を
同定する。BLOCKSは、短いアミノ酸セグメントまたはブロックを用いた重量マト
リクス分析アルゴリズムであり、PROSITEデータベースで編集する。(Bairoch. A
. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25:217-221.)。このBLOCKSアルゴリズムは、 未知の機能をもつ遺伝子を分類する際に有用である。(Henikoff S.及びHenikoff
G.J..Nucleic Acids Research (1991) 19:6565-6572.)。アミノ酸３０から６０
個分の長さのBLOKSは、タンパク質の最も高度に保存された領域に対応する。こ のBLOKSアルゴリズムは、問合わせの配列をBLOKSデータベースの重量評点したブ
ロックのマトリクスと比較する。このBLOKSデータベースのブロックは、SWISS-P
ROTデータベースからの未知の機能をもつタンパク質配列に対して較正して、一 致の確率分布を決定する。タンパク質フィンガープリントであるPRINTSなどの類
似のデータベースもまた、BLOKSアルゴリズムを用いて検索できる。(Attwood. T
. K.他 (1997) J. Chem. Inf. Comput. Sci. 37:417-424.)。PRINTSは、非重複 性の配列に基づいてSWISS-PROTまたはGenBank、PIR、NRL-3Dなどから得た。

【０１７３】 このBLOKSアルゴリズムは、問合わせの配列とBLOKSやPRINTSのデータベースと
の一致を検索し、見つかった一致の全ての統計的有用性を評価する。BLOKSやPRI
NTS検索での一致は、局部的類似性と全体的類似性の２つに分類される。局部的 類似性の程度はスコアによって決められ、全体的類似性の程度はスコアと確率値
とで決められる。BLOKSの最も高い一致レベルは１０００点以上であり、一致し たブロックをSWISS-PROTに対して較正すると、正の不一致率は０．５％以内であ
る。同様に、１／１０００の確率値は、１０００回の検索で１回より多くは一致
しないと言うことである。１０００点以上のカットオフスコア及び１／１０００
以下のカットオフ確率値をもつ一致のみが、Sequence Listingにおけるタンパク
質配列の機能分析とみなされる。

【０１７４】 別法では、共通の生物学的機能をもつタンパク質のデータセットによってそれ
ぞれが定義されるタンパク質領域を見つけ出すために、Hidden Markovモデル(HM
M)を用いることが可能である(例えば、Pearson, W.R. 及び D.J. Lipman (1988)
Proc. Natl. Acad. Sci.85:2444-2448; 及び Smith, T.F. and M.S. Waterman
(1981) J. Mol. Biol. I47:195-197を参照)。HMMは当初、言語認識パターンとし
て開発されたが、現在は生物学的文脈に用いて、モデルタンパク質構造だけでな
くタンパク質及び核酸配列を分析する(例えば、Krogh, A. 他(1994) J. Mol. Bi
ol. 235:1501-1531;及びCollin, M. 他. (1993) Protein Sci. 2:305-314)。ま た、ＨＭＭは正式な確率的根拠をもち、アミノ酸或いはヌクレオチドに位置−特
有スコアを用いる。このアルゴリズムは新しく同定された配列の情報を組み入れ
続け、モチーフ分析能力を高める。

【０１７５】 ４ ノーザン分析 ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技
術であり、特定の細胞種或いは組織からのＲＮＡが結合されている膜への標識さ
れたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う(例えば、Sambrook,上記
, 7章; 及び Ausubel. F.M. 他、上記, 4章及び 16章を参照)。

【０１７６】 ＢＬＡＳＴに用いる類似のコンピュータ技術を用いて、GenBank或いはLIFESEQ ^TM データベース（インサイト社）のようなヌクレオチドデータベース内の同一或
いは関連する分子を検索する。この分析は多くの膜系ハイブリダイゼーションよ
り非常に速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を変更して、任意の特定の
一致が、厳密な一致或いは相同的一致の何れとして分類されるかを確定すること
ができる。検索の基準は、 （％配列同一性×％最大ＢＬＡＳＴスコア）／１００ として定義される積スコアである。積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列
一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア４０の場合、その一致は１〜２
％誤差の範囲内で正確であり、７０ではその一致は正確であろう。類似分子は通
常、１５〜４０の間の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが、
それより低いスコアでも関連した分子が同定される場合もある。

【０１７７】 ノーザン分析の結果は、ＨＯＬＲをコードする転写物が発生するライブラリの
リストとして報告される。また存在量及び存在比も報告される。存在量は、特定
の転写物がｃＤＮＡライブラリ内に現れる回数を直接表し、存在率は、存在量を
ｃＤＮＡライブラリ内で試験された配列の全数で割った値である。

【０１７８】 ５ ＨＯＬＲをコードするポリヌクレオチドの延長 インサイト社クローン番号2061917及び2287407、2379155の核酸配列を用いて 、部分的ヌクレオチド配列を完全長まで伸長させるためのオリゴヌクレオチドプ
ライマーを設計する。各核酸配列において、一方のプライマーはアンチセンスポ
リヌクレオチドの延長を開始するために合成し、他方のプライマーはセンスヌク
レオチドの延長を開始するために合成する。これらのプライマーを用いて既知の
配列の「外側への」延長を促進し、目的の領域の新しい未知のヌクレオチド配列
を含むアンプリコンを作り出す。開始プライマーは、ＯＬＩＧＯ ４．０６（Nat
ional Biosciences, Plymouth, MN）或いは他の適切なプログラムを用いて、約 ２２個から約３０個のヌクレオチドからなる長さで、約５０％以上のＧＣ含量を
有し、かつ約６８〜約７２℃の温度で標的配列にアニールするようにｃＤＮＡか
ら設計する。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体化を生ずるような
ヌクレオチドのストレッチは避ける。

【０１７９】 この配列の延長のために選択されたヒトｃＤＮＡライブラリー（Gibco/BRL） を用いる。２段階以上の延長が必要な場合、若しくは望ましい場合は、既知領域
をさらに延長するための別のプライマーの組を設計する。

【０１８０】 ＸＬ−ＰＣＲキット（Perkin Elmer）の説明書の指示に従って処理を行い、ま
た酵素と反応混合物とを徹底的に混合することにより、高い忠実度の増幅を行う
。それぞれ４０ｐｍｏｌの各プライマーと、推奨された濃度のキットの他の全て
の成分とから増幅を開始する場合、Peltier Thermal Cycler（PTC200；M.J. Res
erch, Watertown MA）を用いて、以下のパラメータ、即ち、 ステップ１ ９４℃で１分間（初期変性） ステップ２ ６５℃で１分間 ステップ３ ６８℃で６分間 ステップ４ ９４℃で１５秒間 ステップ５ ６５℃で１分間 ステップ６ ６８℃で７分間 ステップ７ ステップ４〜６をさらに１５サイクル反復 ステップ８ ９４℃で１５秒間 ステップ９ ６５℃で１分間 ステップ１０ ６８℃で７分１５秒間 ステップ１１ ステップ８〜１０を１２サイクル反復 ステップ１２ ７２℃で８分間 ステップ１３ ４℃（その温度を保持） でＰＣＲを行う。

【０１８１】 反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを、低濃度の（約０．６〜０．８％）
アガロースミニゲル上での電気泳動で解析して、何れの反応物が配列を延長する
ことに成功したかを決定する。最も大きな生成物を含むと考えられるバンドを選
択して、ゲルから切り出し、QIAQuick^TM（QIAGEN Inc.）を用いて精製し、クレ ノウ酵素を用いて末端の延び出しを切り取って、再連結及びクローニングが容易
になる平滑末端を作る。

【０１８２】 エタノール沈殿の後、生成物を１３μｌの連結バッファーに再溶解し、１μｌ
のＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを加えて、その混合物を室温で２〜３時間、或いは１６℃で終夜インキュベー
トする。（４０μｌの適切な培養液の中の）コンピテントな大腸菌細胞を、３μ
ｌの連結混合物を用いて形質転換し、８０μｌのＳＯＣ培養液で（例えば、Semb
roo、前出、Appendix A, p. 2を参照）で培養する。３７℃で１時間インキュベ ートした後、全ての形質転換した混合物を、カルベニシリン（２ｘ ｃａｒｂ） を含むLuria Bertani（ＬＢ）アガー（例えば、Sembrook、前出、Appendix A, p
. 1を参照）上にプレートする。後日、いくつかのコロニーを各プレートから無 作為に選択し、適切な市販の滅菌９６穴マイクロタイタープレートの各ウェル内
に入れられた１５０μｌの液状のＬＢ／２ｘＣａｒｂ培地で培養する。さらに後
日、それぞれ５μｌの終夜培養した各培養物を非滅菌９６穴プレート内に移し、
水で１：１０に希釈した後、各サンプルの内の５μｌをＰＣＲアレイに移す。

【０１８３】 ＰＣＲ増幅のため、４単位のｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを含む１８μｌの濃
縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）、ベクタープライマー、並びに延長反応に用い
られる遺伝子特異的プライマーの一方或いは両方を各ウェルに加える。増幅は以
下の条件、即ち ステップ１ ９４℃で６０秒間 ステップ２ ９４℃で２０秒間 ステップ３ ５５℃で３０秒間 ステップ４ ７２℃で９０秒間 ステップ５ ステップ２〜４をさらに２９サイクル反復 ステップ６ ７２℃で１８０秒間 ステップ７ ４℃（そのまま保持） で行う。

【０１８４】 ＰＣＲ反応物のアリコットを、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で移動
させる。ＰＣＲ産物のサイズを元の部分的なｃＤＮＡと比較して、適切なクロー
ンを選択し、プラスミドに連結して、配列決定を行う。

【０１８５】 同様に上述の手順で、５′末端側の延長のために設計されたオリゴヌクレオチ
ドと、適切なゲノムライブラリーとを用いて５′調節配列を得るために、SEQ ID
NO:2のヌクレオチド配列を利用する。

【０１８６】 ６ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 SEQ ID NO:2から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃ ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩基対か
らなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、より大きなｃＤＮＡフラ
グメントの場合でも基本的に同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、OLIGO4
.06ソフトウェア（National Bioscience）のような最新式のソフトウェアを用い
てデザインし、５０ｐｍｏｌの各オリゴマーと、２５０μＣｉの[γ‐³²Ｐ]アデ
ノシン三リン酸（Amersham, Chicago, IL）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ （DuPont NEN、Boston MA）とを組み合わせて用いることにより標識する。標識 されたオリゴヌクレオチドを、Sephadex^TM G-25超精細排除デキストランビード カラム（Pharmacia & Upjohn, Kalamazoo, MI）を用いて実質的に精製する。毎 分１０⁷カウントの標識されたプローブを含むアリコットを、次のエンドヌクレ アーゼ、AseI，Bgl II，EcoRI，Pst I，Xba1或いはPvuII（DuPont NEN）の１つ を用いて切断したヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーショ
ン解析において用いる。

【０１８７】 各切断物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画して、ナイロン製
メンブラン（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に転写する。ハ
イブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り
除くため、ブロットを、段階的に厳密性が増す条件で最大０．１ｘクエン酸ナト
リウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムまで順次室温にて洗浄する。
XOMAT AR^TMフィルム（Kodak, Rochester, NY）を、フィルムに写すためにブロッ
トに数時間露光した後、ハイブリダイゼーションパターンを視覚的に比較する。

【０１８８】 ７ マイクロアレイ 化学結合方法及びインクジェット装置を用いて、基板の表面上でアレイ要素を
合成することが可能である（例えば、上記Baldeschweilerを参照）。ドットブロ
ット法またはスロットブロット法に類似したアレイを利用し、要素を熱、ＵＶ、
機械的または化学的結合方法を用いて基板の表面に配置し結合させる。典型的な
アレイは、手作業または利用可能な方法や機械を用いて作製することができ、任
意の適正な数の要素を含み得る。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズ
していないプローブを取り除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターン
を決定する。スキャンした画像を分析して、マイクロアレイ上で要素にハイブリ
ダイズする各プローブの相補性の程度及び相対的な量／発現レベルを調べること
が可能である。

【０１８９】 完全長のｃＤＮＡ、発現配列タグ（ＥＳＴ：Expressed Sequence Tags）、或 いはそれらの断片が、マイクロアレイの要素を含み得る。ハイブリダイゼーショ
ンに好適な断片を、LASERGENE^TMなどの当分野で公知のソフトウェアを用いて選 択することが可能である。本発明の核酸配列の１つに対応する完全長のｃＤＮＡ
、ＥＳＴ、或いはそれらの断片、或いは本発明に関連するｃＤＮＡライブラリか
ら任意に選択されたｃＤＮＡを、ガラススライドなどの好適な基質に整列する。
ｃＤＮＡは、例えばＵＶ交差結合（UV cross-linking）を利用してスライドに固
定してから、熱処理及び化学処理を施し、最後に乾燥させる(例えば、 Schena,
M. 他. (1995) Science 270:467-470; 及び Shalon,D. 他. (1996) Genome Res.
6:639-645を参照)。蛍光プローブを準備して、基質上の要素にハイブリダイゼ ーションするために用いる。上記した方法によってこの基質を分析する。

【０１９０】 ８ 相補的ポリヌクレオチド ＨＯＬＲをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、自
然発生のＨＯＬＲの発現の低下即ち阻害するために用いられる。約１５〜約３０
個の塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、より小さな或いは
より大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Olig
o4.06ソフトウェア及びＨＯＬＲのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌ クレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５′配列から相補
的なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコーディング配
列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオ
チドを設計して、リボソームがＨＯＬＲをコードする転写物に結合するのを阻害
する。

【０１９１】 ９ ＨＯＬＲの発現 ＨＯＬＲの発現及び精製は、細菌またはウイルスを基にした発現系を用いて行
うことができる。細菌でＨＯＬＲが発現するために、抗生物質耐性及びｃＤＮＡ
の転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにｃＤＮＡを
サブクローニングする。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節エ レメントに関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター及びtrp-la
c(tac)ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではな
い。組換えベクターを、BL21(DE3)などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生 物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘
発されるとＨＬＯＲを発現する。真核細胞でのＨＯＬＲの発現は、昆虫細胞株ま
たは哺乳動物細胞株に一般にバキュロウイスルスとして知られているAutographi ca californica 核多面性ウイルス(AcMNPV)を感染させて行う。バキュロウイルス
の非必須ポリヘドリン遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う
細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、ＨＯＬＲをコードするｃＤＮ
Ａと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強いポリヘドリンプロモータによ
って高いレベルのｃＤＮＡの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多く
の場合はSpodoptera frugiperda (Sf9)昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝 細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルス
の更なる遺伝的変更が必要になる。(例えば、Engelhard. E. K.他 (1994) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227; Sandig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther.
7:1937-1945.を参照)。

【０１９２】 殆どの発現系では、ＨＯＬＲが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(G
ST)、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパ
ク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベー
スの精製が素早く１回で行うことができる。Schistosoma japonicumからの２６ キロダルトンの酵素であるＧＳＴによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持
した状態で固定されたグルタチオンで融合タンパク質の精製が可能となる。(Pha
rmacia, Piscataway, N J)。精製の後、ＧＳＴ部分を特定の操作部位でＨＬＯＲ
からタンパク分解的に切断できる。アミノ酸８個のペプチドであるＦＬＡＧで、
市販のモノクロナール及びポリクロナール抗FLAG抗体を用いた免疫親和性の精製
が可能となる。６個のヒスチジン残基が連続して伸展した6-Hisによって、金属 キレート樹脂(QIAGEN Inc, Chatsworth, CA)で精製が可能となる。タンパク質の
発現及び精製の方法は、Ausubel. F. M. 他による(1995年、及び定期的に補足さ
れた) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New Yor
k, NY, ch 10, 16)に記載されている。これらの方法で精製したＨＬＯＲを直接 用いて以下のアッセイを行うことができる。

【０１９３】 １０ ＨＯＬＲ活性の実証 ＨＯＬＲの活性は、ＨＯＬＲの精製されたヒト酸化ＬＤＬへの結合を計測する
ことで実証できる。ヒトＬＤＬを一連の超遠心によって単離してから、in vitro でＣｕ^2-で酸化的に修飾する。酸化は、チオバルビツール酸反応性物質の量を計
測することでモニターする。(例えば、Kume, N. 他 (1991) Blochim. Biophys.
Acta 1090:63-67.を参照)。酸化ＬＤＬを[¹²⁵I]で標識する。(例えば、上記のSa
wamura. T. 他による文献を参照)。ＨＯＬＲを含むサンプルを、５０ｍＭのトリ
ス／塩化水素、ｐＨ８．０の０．２ｍＭの塩化カルシウム、９０ｍＭの塩化ナト
リウムの[¹²⁵I]ＯＸＬＤＬで２時間インキュベートする。結合した放射能を、緩
衝液で３回洗浄したワットマン社の濾紙で素早くろ過して採集する。濾紙に採集
した放射能の量は、シンチレーション計数法によって決定する。この放射能の量
は、サンプル内のＨＯＬＲの結合活性に比例する。

【０１９４】 １１ 機能的アッセイ ＨＯＬＲの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベル
でのＨＯＬＲをコードする配列の発現によって評価する。ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡ
を高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブク
ローニングする。このようなベクターには、pCMV SPORT^TM (Life Technologies.
Gaithersburg. MD)及びpCR^TM 3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)が含まれ、どち
らもサイトメガロウイルスプロモーターを含んでいる。５〜１０μｇの組換えベ
クターを、好ましくは内皮由来か造血由来のヒト細胞株にリポソーム製剤或いは
電気穿孔法によって一過性に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする
配列を含む１〜２μｇのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発
現により、形質移入された細胞と形質移入されていない細胞とを区別できる。ま
た、標識タンパク質の発現によって、ｃＤＮＡの組換えベクターからの発現を正
確に予想できる。このような標識タンパク質には、緑色蛍光タンパク質(GFP) (C
lontech, Palo Alto, CA)、及びCD64またはCD64-GFP融合タンパク質が含まれる 。レーザー光学に基づいた技術を利用した自動流動細胞計測法(FCM)を用いて、G
FPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、アポトーシスの状態
などの特性を評価する。また、ＦＣＭで、先行した或いは同時の細胞死の現象を
診断する蛍光分子の取り込みを検出して計量する。これらの現象には、プロピジ
ウムヨウ化物でのＤＮＡの染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化と、ブ
ロモデオキシウリジンの取り込み量の低下によって計測されるＤＮＡ合成の下方
調節と、特異的な抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内のタン
パンク質の発現の変化と、蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合
によって計測される原形質膜組成の変化とが含まれる。流動細胞計測法は、Orme
rod, M. G.による (1994) Flow Cytometry ( Oxford, New York, NY.)に記載さ れている。

【０１９５】 遺伝子発現におけるＨＯＬＲの影響は、ＨＯＬＲをコードする配列とCD64また
はCD64-GFPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価
することができる。CD64またはCD64-GFPは形質転換された細胞表面で発現し、ヒ
ト免疫グロブリンG(IgG)の保存された領域と結合する。形質転換された細胞と形
質転換されない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された 磁気ビードを用いて分離することができる。(DYNAL. Lake Success. NYを参照) 。ｍＲＮＡは、当分野で公知の方法で細胞から精製することができる。ＨＯＬＲ
及び目的の他の遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析やマイクロ
アレイ技術で分析することができる。

【０１９６】 １２ ＨＯＬＲに特異的な抗体の産生 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE) (例えば、Harrington,M.G. (1990)
Methods Enzymol. 182:488-495を参照)または他の精製技術を用いて実質的に精
製されたＨＯＬＲを、標準的なプロトコルによりウサギを免疫化し、抗体を作り
出すために用いる。

【０１９７】 別法では、ＨＯＬＲアミノ酸配列をＬＡＳＥＲＧＥＮＥ^TMソフトウエア（DNAS
TAR社）を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチ ドを合成してこれを用いて当業者に周知の方法で抗体を産生させる。Ｃ末端付近
の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択に
ついては、当分野で周知である(例えば、前出のAusubel他による11章を参照)。

【０１９８】 通常、約１５残基の長さのオリゴペプチドを、Applied Biosystemsのペプチド
シンセサイザModel 431Aを用いてｆｍｏｃ法のケミストリにより合成し、Ｎ−マ
レイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用い
た反応によりＫＬＨ（Sigma, St. Louis, MO）に結合させて、免疫原生を高める
(例えば、前出のAusubel 他による文献を参照)。フロイントの完全アジュバント
においてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた
抗血清の抗ペプチド活性を検査するには、例えばペプチドをプラスチックに結合
し、１％ＢＳＡを用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに
放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。

【０１９９】 １３ 特異的抗体を用いる自然発生ＨＯＬＲの精製 自然発生ＨＯＬＲ或いは組換えＨＯＬＲを、ＨＯＬＲに特異的な抗体を用いる
イムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィ
ニティーカラムは、CNBr-活性化Sepharose（Pharmacia & Upjohn）のような活性
化クロマトグラフィー用レジンとＨＯＬＲ抗体とを共有結合させることにより構
築する。結合の後、そのレジンを製造者の使用説明書に従って、ブロックし洗浄
する。

【０２００】 ＨＯＬＲを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラムをＨ
ＯＬＲを優先的に吸着できる条件下で（例えば、界面活性剤の存在下において高
イオン強度のバッファーで）洗浄する。このカラムを、抗体とＨＯＬＲとの結合
を切るような条件下で（例えば、ｐＨ２−３のバッファー、或いは高濃度の尿素
またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、ＨＯ
ＬＲを回収する。

【０２０１】 １４ ＨＯＬＲと相互作用する分子の同定 ＨＯＬＲ又は生物学的に活性なその断片を、¹²⁵Ｉボルトンハンター試薬（例 えば、Bolton他 (1973) Biochem. J. 133:529を参照）で標識する。マルチウェ ルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したＨＯＬＲと共にインキ
ュベートし、洗浄して、標識したＨＯＬＲ複合体を有する全てのウェルをアッセ
イする。様々なＨＯＬＲ濃度で得られたデータを用いて、候補の分子とＨＯＬＲ
との結合、親和性、数について数値を計算する。

【０２０２】 当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法
及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。特定の好適実施例に基
づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に
制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連す
る分野の専門家には明らかな本明細書に記載の本発明の実施のための方法の様々
な改変は、特許請求の範囲に含まれることが意図されている。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 ＨＯＬＲのアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び核酸配列（SEQ ID NO:2）の一部を
示す。この配列アライメントは、MacDNASIS PRO^TM（Hitachi Software Engineer
ing Co., Ltd., San Bruno, CA）のソフトウエアを用いて作成された。

【図１Ｂ】 ＨＯＬＲのアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び核酸配列（SEQ ID NO:2）の一部を
示す。この配列アライメントは、MacDNASIS PRO^TM（Hitachi Software Engineer
ing Co., Ltd., San Bruno, CA）のソフトウエアを用いて作成された。

【図１Ｃ】 ＨＯＬＲのアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び核酸配列（SEQ ID NO:2）の一部を
示す。この配列アライメントは、MacDNASIS PRO^TM（Hitachi Software Engineer
ing Co., Ltd., San Bruno, CA）のソフトウエアを用いて作成された。

【図１Ｄ】 ＨＯＬＲのアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び核酸配列（SEQ ID NO:2）の一部を
示す。この配列アライメントは、MacDNASIS PRO^TM（Hitachi Software Engineer
ing Co., Ltd., San Bruno, CA）のソフトウエアを用いて作成された。

【図１Ｅ】 ＨＯＬＲのアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び核酸配列（SEQ ID NO:2）の一部を
示す。この配列アライメントは、MacDNASIS PRO^TM（Hitachi Software Engineer
ing Co., Ltd., San Bruno, CA）のソフトウエアを用いて作成された。

【図２Ａ】 LASERGENE^TMソフトウエア（DNASTAR Inc, Madison WI）のマルチシークエンスア
ライメントプログラムを用いて作成した、ＨＯＬＲ(インサイト社クローン番号1
355922: SEQ ID NO: 1)と、ヒトレクチン様酸化ＬＤＬレセプター(GI 1902984;
SEQ ID NO:3)と、ウシレクチン様酸化ＬＤＬレセプター(GI 1902982; SEQ ID NO
:4)との間のアミノ酸配列アライメントの一部を示す。

【図２Ｂ】 LASERGENE^TMソフトウエア（DNASTAR Inc, Madison WI）のマルチシークエンスア
ライメントプログラムを用いて作成した、ＨＯＬＲ(インサイト社クローン番号1
355922: SEQ ID NO: 1)と、ヒトレクチン様酸化ＬＤＬレセプター(GI 1902984;
SEQ ID NO:3)と、ウシレクチン様酸化ＬＤＬレセプター(GI 1902982; SEQ ID NO
:4)との間のアミノ酸配列アライメントの一部を示す。

【図３】 LASERGENE^TMソフトウエア（DNASTAR Inc, Madison WI）のタンパク質分析プログ
ラムを用いて作成した、ＨＯＬＲ(インサイト社クローン番号1355922: SEQ ID N
O: 1)と、ヒトレクチン様酸化ＬＤＬレセプター(GI 1902984; SEQ ID NO:3)と、
ウシレクチン様酸化ＬＤＬレセプター(GI 1902982; SEQ ID NO:4)との疎水性プ ロットと疎水性領域の比較を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/00 Ｃ０７Ｋ 16/28 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 パターソン、チャンドラ アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・レランドアベニュー 2189 (72)発明者 コーレイ、ニール・シー アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃30・デールアベニュ ー 1240 (72)発明者 サザー、スーザン アメリカ合衆国カリフォルニア州94303・ パロアルト・＃203・ミッドタウンコート 2721 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA12 BA63 CA04 DA02 DA06 EA02 EA04 GA11 HA14 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ08 QQ43 QR08 QR33 QR42 QR56 QS25 QS34 QX02 4B064 AG20 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 DA05 DA13 DA14 4B065 AA26X AA90X AA93Y AA95X AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA17 BA22 CA18 DC23 NA14 ZB072 ZB262 ZC332 ZC412 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA50 EA22 EA28 EA51 EA54 FA74

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 SEQ ID NO:1またはその断片のアミノ酸配列を含む実質的 に精製されたポリペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１の配列と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有す
   る実質的に精製された変異体。
3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドをコードする単離され精製された
   ポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 請求項３のポリヌクレオチドと９０％以上のポリヌクレオ
   チド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。
5. 【請求項５】 厳密な条件の下で請求項３のポリヌクレオチドとハイブリ
   ダイズする単離され精製されたポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項３のポリヌクレオチドと相補的な単離され精製され
   たポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 SEQ ID NO:2またはその断片のポリヌクレオチド配列を含 む単離され精製されたポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】 請求項７のポリヌクレオチドと９０％以上のポリヌクレオ
   チド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。
9. 【請求項９】 請求項７のポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単離
   され精製されたポリヌクレオチド。
10. 【請求項１０】 請求項３のポリヌクレオチドの少なくとも１つの断片を
    含む発現ベクター。
11. 【請求項１１】 請求項１０の発現ベクターを含む宿主細胞。
12. 【請求項１２】 SEQ ID NO:1またはその断片の配列を含むポリペプチド の製造方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件の下で、請求項１１の宿主細胞を
    培養する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むこと
    を特徴とする製造方法。
13. 【請求項１３】 好適な医薬用担体と共に請求項１のポリペプチドを含む
    医薬品組成物。
14. 【請求項１４】 請求項１のポリペプチドと特異的に結合する精製された
    抗体。
15. 【請求項１５】 請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。
16. 【請求項１６】 請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。
17. 【請求項１７】 癌の治療または予防が必要な患者に、請求項１６の精製
    されたアンタゴニストを効果的な量投与する過程を含む、癌を治療または予防す
    る方法。
18. 【請求項１８】 自己免疫異常の治療または予防が必要な患者に、請求項
    １６の精製されたアンタゴニストを効果的な量投与する過程を含む、自己免疫異
    常を治療または予防する方法。
19. 【請求項１９】 心血管疾患の治療または予防が必要な患者に、請求項１
    ６の精製されたアンタゴニストを効果的な量投与する過程を含む、心血管疾患を
    治療または予防する方法。
20. 【請求項２０】 核酸を含む生物学的サンプルにおいてSEQ ID NO:1のア ミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出する方法で
    あって、 （ａ）請求項６のポリヌクレオチドを前記生物学的サンプルの少なくとも１つ
    の核酸とハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程
    と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記ハイ
    ブリダイゼーション複合体の存在が、前記生物学的サンプルに前記ポリペプチド
    をコードするポリヌクレオチドが存在することと相関性を有する、該過程とを含
    むことを特徴とする検出方法。
21. 【請求項２１】 前記生物学的サンプルの核酸が、前記ハイブリダイゼー
    ションの前にＰＣＲ法により増幅されることを特徴とする請求項２０に記載の方
    法。