FR2816060A1

FR2816060A1 - Procede d'identification de nouvelles molecules se liant au recepteur lox et utilisation de ces molecules

Info

Publication number: FR2816060A1
Application number: FR0013884A
Authority: FR
Inventors: Yves Delneste; Pascale Jeannin; Giovanni Magistrelli
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 2000-10-27
Filing date: 2000-10-27
Publication date: 2002-05-03
Also published as: AU2002214114A1; WO2002035242A1

Abstract

L'invention concerne un procédé d'identification de nouvelles molécules se liant au récepteur LOX et, le cas échéant, qui sont capables en outre d'être internalisées par une cellule présentatrice d'antigène. L'invention concerne l'utilisation desdits molécules se liant au récepteur LOX pour la préparation d'une composition pharmaceutique, notamment destinée au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires et fongiques ou au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers.

Description

L'invention concerne un procédé d'identification de nouvelles molécules se liant au récepteur LOX et, le cas échéant, qui sont capables en outre d'être intemalisées par une cellule présentatrice d'antigène. L'invention concerne l'utilisation desdites molécules se liant au récepteur LOX pour la préparation d'une composition pharmaceutique, notamment destinée au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires et fongiques ou au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers.

La vaccination est un moyen efficace de prévenir ou de réduire les infections virales ou bactériennes. Le succès des campagnes de vaccination dans ces domaines a permis d'étendre le concept de vaccin jusqu'alors utilisé dans le domaine de l'infectiologie aux domaines du cancer et des maladies auto-immunes. Les antigènes vaccinaux administrés seuls chez l'hôte ne sont souvent pas assez immunogéniques pour induire une réponse immunitaire, et doivent donc être associés à un adjuvant ou couplés à une protéine porteuse pour induire (ou augmenter) leur immunogénicité. Dans ces conditions, seule une réponse immune de type humorale peut être induite, réponse au cours de laquelle les antigènes exogènes sont présentés dans le contexte des molécules du CMH de classe II aux lymphocytes T CD4.

Ainsi, de nouveaux porteurs ou adjuvants permettant d'augmenter ou d'induire l'immunogénicité sont constamment recherchés.

De plus, dans le cadre d'une thérapie antivirale, la génération de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) capables de reconnaître et de détruire le virus est de toute importance (Bachmann et al., 1994, Eur. J. Immunol., 24,2228-2236 ; Borrow P., 1997, J. Virol. Hepat., 4,16-24), comme l'attestent de nombreuses études montrant, in vivo, le rôle protecteur des réponses dirigées contre les épitopes viraux (Arvin AM, 1992, J. Inf.

Dis., 166, S35-S41 ; Koszinowski et al., 1987, Immunol. Lett., 16,185-192). L'importance des réponses CTL a aussi été fortement documentée dans les réponses antitumorales notamment celles dirigées contre les cellules de mélanome (revue dans Rivoltini et al., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18,55-63). Le ou les épitopes CTL (séquences peptidiques interagissant avec les molécules du CMH de classe I et présentées aux lymphocytes T CD8+) ont été définis pour plusieurs antigènes.

Cependant, la difficulté réside dans la génération de CTL in vivo, due à la faible

immunogénicité de ces peptides (Melief, 1992, Adv. Cancer Res., 58, 143-175 ; Nandaz et Sercaz, 1995, Cell, 82, 13-17).

Des recherches s'orientent par conséquent vers l'identification de nouveaux adjuvants, ou de système de délivrance d'antigènes ( delivery system ), permettant d'induire des CTL. Grâce à leur efficacité à présenter les antigènes et à stimuler le système immunitaire, les cellules dendritiques, par exemple, ont été utilisées pour générer des réponses CTL antivirales (Ludewig B et al., 1998, J. Virol., 72,3812-3818 ; Brossard P. et al., 1997, J. Immunol., 158,3270-3276) ou anticancéreuses (Nestle F. O. et al., 1998, Nat. Med., 4,328-332).

Les cellules dendritiques (DC) sont les cellules présentatrices d'antigène les plus efficaces et en particulier les seules capables d'initier une réponse CTL (Banchereau, J. et al., Dendritic cells and the control of immunity, Nature, 392,245-252, 1998 ; Watts, C., Dendritic cells spill the beans, Nature Cell Biol., 1,152-154, 1999). Les DC sont la cible de nombreuses stratégies vaccinales (Timmerman J. M. et al., Dendritic cell vaccines for cancer immunotherapy, Annu. Rev. Med., 50,507-529, 1999). En effet, de nombreux arguments expérimentaux montrent que ce sont les DC immatures qui seraient capables dans certaines conditions de présenter les antigènes exogènes dans le CMH de classe 1 aux CTL. Les DC existent dans deux états de différentiation. Les DC présentes dans les tissus périphériques sont immatures et agissent comme des sentinelles qui capturent les antigènes exogènes. Après un contact avec les antigènes ou des signaux de stress, elles subissent un processus de maturation, acquièrent l'expression de nombreuses molécules de costimulation et migrent dans les ganglions ou elles présentent l'antigène aux lymphocytes T naïfs. Le phénomène de cross-présentation (encore connu sous le nom de cross-priming) qui permet à un antigène exogène d'accéder à une présentation dans les molécules des CMH de classe 1 est actuellement très étudié (Yewdell J. W., et al., Mechanisms of exogenous antigen presentation by MHC class 1 molecules in vitro and in vivo : implications for generating CD8+ T cell responses to infectious agents, tumors, transplants, and vaccines, Adv. Immunol., 73,1-77, 1999). Il est actuellement admis que la façon dont l'antigène est capturé joue un rôle. Bien qu'il ait été observé que des antigènes internalisés par des moyens non spécifiques de type phagocytose ou macropinocytose étaient dans certains cas présentés par des DC ou des macrophages

dans le contexte des molécules du CMH de classe I, il est maintenant admis que la capture des antigènes via un récepteur favorise l'accès des antigènes au cytosol des cellules présentatrices d'antigène et donc à la présentation dans le CMH de classe I. Des exemples sont fournis par les immunocomplexes et les HSP qui sont capturés par les DC via des récepteurs spécifiques et qui sont présentés dans les molécules du CMH de classe I (Rodriguez A., et al., Selective transport of intemalized antigens to the cytosol for

MHC class I presentation in dendritic cells, Nat. Cell Biol., 1, 362-368, 1999).

Des approches vaccinales ont ainsi consisté à charger les cellules dendritiques ex vivo avec l'antigène d'intérêt (peptides ou lysat cellulaire) et à les réimplanter chez le patient. D'autres approches consistent à transfecter ex vivo les cellules dendritiques avec le gène codant pour l'antigène d'intérêt et à réinjecter ces cellules transfectées (Gilboa E., et al., 1998, Cancer Immunol. Immunother., 46,82-87). Ces approches ont été utilisées avec succès chez la souris et chez l'homme (Hsu F. J., et al., 1996, Nat. Med., 2,52-58) mais restent néanmoins complexes dans la mesure où ces cellules doivent être traitées ex vivo (transformation des cellules ou intemalisation des antigènes) et transplantées dans l'organisme hôte. De même, l'utilisation de particules de type viral (Layton G. T., et al., 1993, J. Immunol., 151,1097-1107) ou de l'adjuvant incomplet de Freund (IFA) (Valmori et al., Eur. J. Immunol., 1994,24, 1458-1462) permet de générer des réponses CTL. Toutefois, une vaccination antivirale ou antitumorale réalisée avec des peptides correspondant à des épitopes CTL et en présence d'un tel adjuvant peuvent conduire à un état de tolérance spécifique qui peut conduire dans certains cas à l'effet contraire recherché, c'est-à-dire à une diminution de la réponse immune (Toes et al., Proc. Nat.

Acad. Sci. USA, 1996,93, 7855-7860).

Ainsi, il existe aujourd'hui un grand besoin de disposer d'un composé qui, associé à une molécule, notamment un antigène ou haptène, soit capable de générer une réponse immunitaire, et notamment une réponse de type T cytotoxique (CTL), dirigée contre ladite molécule. Un tel composé pourrait en particulier être utilisé pour la préparation d'une composition vaccinale destinée à induire une protection immunitaire, notamment de type CTL, antivirale, antibactérienne, antifongique, antiparasitaire ou antitumorale.

On recherche également de nouvelles molécules pour le ciblage spécifique d'une substance biologiquement active vers les cellules présentatrices d'antigènes, telles que les cellules dendritiques, les macrophages, les lymphocytes B ou les monocytes.

En effet, on recherche des nouvelles molécules qui, associées avec une substance biologiquement active telle que des antigènes ou des facteurs de croissance cellulaire, peuvent se fixer spécifiquement sur les cellules présentatrices d'antigènes et/ou être intemalisées dans lesdites cellules et ainsi être capables d'exercer une activité thérapeutique modulée par l'intermédiaire des cellules présentatrices d'antigène.

Les scavengers récepteurs sont des protéines exprimées à la surface de nombreuses cellules et en particulier des cellules présentatrices d'antigènes professionnelles que sont les DC et les macrophages (Medzhitov R., et al., Innate immunity : impact on the adaptative immune response, Curr. Opin. Immunol., 9,4-9, 1997 ; Lebecque S., Antigen receptors and dendritic cells, Vaccine, 25,1603-1605, 2000). Ils lient notamment les lipoprotéines modifiées chimiquement. Plusieurs familles de scavengers récepteurs ont été identifiées, chaque famille pouvant contenir plusieurs membres. Ils lient un large panel de ligands différents. En particulier, certains scavengers récepteurs sont impliqués dans la réponse antibactérienne et lient des molécules bactériennes telles que le LPS ou l'acide lipotéchoique. La liaison est suivie par une endocytose de la molécule. La demande EP 0 783 892 décrit une méthode pour augmenter l'immunogénicité dans laquelle un antigène et un ligand d'un récepteur scavenger sont conjugués à un adjuvant.

Le récepteur scavenger LOX-1 a été initialement identifié comme un récepteur aux LDL ( Low Density Lipoprotein ) oxydés. Comme tout scavenger récepteur, LOX-1 fixe de nombreux ligands et est également impliqué dans la phagocytose des cellules apoptotiques par liaison à la phosphatidyl sérine exprimée à la surface de ces cellules. LOX-1 est exprimé sur les cellules endothéliales, les monocytes/macrophages ainsi que les fibroblastes. Son expression est très augmentée au niveau des plaques d'athérome.

La demande WO 99/32520 décrit une méthode pour quantifier les LDL dénaturés utilisant un polypeptide fusionné composé d'une région extracellulaire d'un récepteur des LDL oxydés et d'une partie d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline.

Des ADNc de récepteurs humains et bovins des LDL modifiés sont décrits dans la demande WO 96/17058. La demande US 5, 510, 466 décrit des récepteurs scavenger constitués de trois sous-unités capables de lier les LDL acétylés. Des anticorps contre ces récepteurs sont aussi décrits. Des analogues des récepteurs aux LDL et leurs séquences nucléiques sont décrits dans la demande US 5,665, 872. Quant à la demande US 5,521, 071, elle décrit des récepteurs aux LDL solubles et leurs séquences nucléiques.

Les HSP (Heat Shock Protein) sont des molécules chaperonnes qui contrôlent le repliement des protéines et évitent leur agrégation ; elles sont fortement conservées lors de l'évolution (Feldman, D. E., et al., Protein folding in vivo : the importance of molecular chaperones, Curr. Opin. Struct. Biol., 10,26-33, 2000). De nombreuses études ont démontré que les HSP peuvent être utilisées comme protéines porteuses et favorisent une réponse immune contre des peptides ou des oligosaccharides (Lussow, A. R, et al., Mycobacterial heat-shock proteins as carrier molecules, Eur. J. Immunol., 21, 2297-2302,1991). Les HSP n'induisent pas de suppression épitopique (Barrios, C., et al., Mycobacterial heat-shock proteins as carrier molecules. II : The use of the 70-kDa mycobacterial heat-shock protein as carrier for conjugated vaccines can circumvent the need for adjuvants and Bacillus Calmette Guerin priming, Eur. J. Immunol., 22,1365- 1372,1992) et sont efficaces en absence d'adjuvant (Barrios C. et al., 1992), suggérant que les HSP peuvent être considérées comme des adjuvants en tant que tels (Blachere, N. E., et al., Heat shock protein-peptide complexes, reconstituted in vitro, elicit peptidespecific cytotoxic T lymphocyte response and tumor immunity, J. Exp. Med., 186,1315- 1322,1997).

L'utilisation potentielle des HSP en immunothérapie antitumorale est actuellement très étudiée (Srivastava, P. K., et al., Heat shock proteins corne of age : primitive functions acquire new rotes in an adaptive world, Immunity, 8,657-665, 1998). Les HSP isolées des cellules tumorales engendrent une puissante réponse CTL CD8+ protectrice et spécifique de la tumeur (Srivastana, P. K., et al., Heat shock proteins transfer peptides during antigen processing and CTL priming, Immunogenetics, 39,93- 98,1994, Tamura, Y. et al., Immunotherapy of tumors with autologous tumor-derived heat shock protein preparations, Science, 278,117-120, 1997). Cette propriété provient de la capacité des HSP à se lier de façon non covalente à des peptides antigéniques

spécifiques des tumeurs (Udono, H., et al., Heat shock protein 70-associated peptides elicit specifc cancer immunity, J. Exp. Med., 178, 1391-1396, 1993 ; Tamura, Y., et al., 1997 ; Nieland, T. J., et al., Isolation of an immunodominant viral peptide that is endogenously bound to the stress protein GP96/GRP94, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93,6135-6139, 1996). Parmi les différentes HSP testées, gp96 (un homologue endoplasmique de la HSP90) et la HSP70 sont les plus utilisés dans des vaccins antitumoraux prophylactiques ou thérapeutiques contre différents types de tumeurs (Udono, H., et al., Comparison of tumor-specific immunogenicities of stress-induced proteins gp96, hsp90, and hsp70 ; J. Immunol., 152,5398-5403, 1994).

Des études récentes ont analysé les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels les complexes HSP-peptides dérivés de tumeurs induisent une réponse antitumorale. Les HSP se lient aux cellules présentatrices d'antigènes (monocytes/macrophages, lymphocytes B et cellules dendritiques immatures) mais pas aux cellules T (Udono, H., et al., 1993). La liaison est suivie de leur intemalisation (endocytose médiée par un récepteur) (Arnold-Schild, D., et al., Cutting edge : receptormediated endocytosis of heat shock proteins by professional antigen-presenting cells, J.

Immunol., 162,3757-3760, 1999) qui est nécessaire pour la représentation dans les molécules du CMH de classe 1 des peptides associés aux HSP et pour une activation subséquente des cellules T. L'intemalisation des HSP est similaire à celle des complexes FcyR-Ac qui conduit à une présentation des antigènes dans les molécules du CMH de

classe 1 (Rodriguez, A., et al., Selective transport of internalized antigens to the cytosol for MHC class 1 presentation in dendritic cells, Nat. Cell Biol., 1,362-368, 1999).

L'identification des structures qui lient les HSP est d'une grande importance afin de pouvoir les cibler de façon sélective dans le but de générer des réponses immunes de type CTL. Binder et al ont montré que CD91 est un ligand pour gp96 (Binder, R. J., et al., CD91 : a receptor for heat shock protein gp96, Nat. Immunol., 1,151-155, 2000). Il est intéressant de noter que la liaison de gp96 au CD91 est nécessaire pour la représentation du complexe gp96-peptide associé. Toutefois, plusieurs données suggèrent que d'autres structures liant les HSP existent : (i) il n'y a pas de compétition entre gp96 et HSP70 pour la liaison aux cellules présentatrices d'antigène (Binder, R. J., et al., Saturation, competition, and

specificity in interaction of heat shock proteins (hsp) gp96, hsp90, and hsp70 with CD11b+ cells, J. Immunol., 165, 2582-2587, 2000), et (ii) la liaison de HSP70 aux cellules mononucléées de souris est hétérogène (Castellino, F., et al., Receptor-mediated uptake of antigen/heat shock protein complexes results in major histocompatibility complex class 1 antigen presentation via two distinct processing pathways, J. Exp. Med., 191,1957-1964, 2000).

De manière surprenante, il a maintenant été mis en évidence que les HSP se liaient à certains types de récepteurs scavenger. De manière encore plus surprenante, il a aussi été déterminé que les HSP ne se liaient pas sur tous les types de récepteurs scavenger, mais se liaient spécifiquement sur le récepteur scavenger LOX.

La présente invention a ainsi pour objet un procédé d'identification de nouvelles molécules d'intérêt thérapeutique, caractérisé en ce qu'on sélectionne les molécules qui se lient à un récepteur LOX, de préférence un récepteur LOX d'origine humaine.

Ce procédé, et les nouvelles molécules sélectionnées identifiées comme se liant à un récepteur LOX, pourront ainsi répondre aux problèmes mentionnés ci-dessus, à savoir trouver de nouveaux porteurs ou adjuvants permettant d'augmenter ou induire l'immunogénicité notamment de type cellulaire, de nouveaux composés qui, associés à une molécule, notamment un antigène ou haptène, soient capables de générer une réponse CTL, tout comme de nouveaux composés capables de cibler les cellules présentatrices d'antigènes, de préférence celles exprimant ledit récepteur LOX, et notamment les cellules dendritiques de préférence immatures.

Par cellules présentatrices d'antigènes (CPA ou APC), on entendra désigner dans la présente invention, les cellules CPA professionnelles formant partie intégrante du système immunitaire telles que les cellules dendritiques, les macrophages, les lymphocytes B ou les monocytes, notamment les cellules dendritiques immatures.

Dans la présente invention, on entendra désigner également par le terme peptide les protéines ou les polypeptides, termes qui seront ici employés indifféremment.

Selon l'invention, il est possible d'utiliser tout type de récepteur LOX et notamment le récepteur LOX-1 de préférence d'origine humaine dont la séquence de l'ADNc codant pour ce récepteur LOX-1 humain est décrite dans la banque de données

GenBank sous le numéro d'accession A. N. AB 010710, ou un peptide dérivé dudit récepteur LOX-1, peptide dérivé dont sa séquence nucléique codante présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 90 %, 95 % et 99 % avec la séquence décrite dans ledit document GenBank A. N. AB 010710.

Selon l'invention, on pourra également utiliser tout fragment du récepteur LOX et notamment du récepteur LOX-1, de préférence d'origine humaine codée par la séquence GenBank A. N. AB 010710, capable de se lier avec au moins l'un des ligands connus de ce récepteur LOX, en particulier les ligands tels que cités ci-après.

Dans la présente description, par pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Le meilleur alignement ou alignement optimal est l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer, comme calculé ci-après, est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par fenêtre de comparaison pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2 : 482], au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48 : 443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou encore BLASTN ou BLASTX, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215,403, 1990).

Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenêtre de comparaison dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou

d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.

Les récepteurs décrits dans les demandes WO 99/32520, WO 96/17058 (et particulièrement les séquences nucléiques SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, et les séquences protéiques SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6), US 5,510, 466, US 5,665, 872 (et particulièrement la séquence nucléique SEQ ID No. 1 et la séquence protéique SEQ ID No. 3) et US 5,521, 071 (et particulièrement la séquence protéique SEQ ID No. 2) pourront être utilisés. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le récepteur LOX utilisé correspond au récepteur LOX-1.

Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé d'identification selon l'invention, caractérisé en ce qu'on sélectionne les molécules qui se lient à un récepteur LOX et qui sont en outre capables d'être intemalisées par une cellule présentatrice d'antigène exprimant ledit récepteur LOX.

Les molécules à sélectionner et, le cas échéant, à identifier si elles sont de structure inconnue ou si lesdites molécules sont sélectionnées à partir d'un mélange de composés connus ou inconnus, peuvent être choisies parmi toutes catégories de molécules naturelles ou synthétiques. L'invention n'est nullement limitée à un type de molécules à sélectionner mais au contraire permet d'identifier de nouveaux composés à partir de molécules très diverses, comme par exemple des molécules chimiques ou biologiques, des extraits cellulaires, notamment de bactéries, des extraits de plantes, etc..

On pourra, de façon préférée, tester des extraits membranaires, et plus préférentiellement solubles, de pathogènes (bactéries, parasites, etc. ) et de cellules eucaryotes, notamment humaines.

De préférence, le procédé d'identification selon l'invention pour l'identification de nouvelles molécules d'intérêt thérapeutique se liant à un récepteur LOX est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :

a) la mise en contact d'une molécule, ou d'un mélange de molécules, connue ou inconnue à tester avec un récepteur LOX, dans un milieu permettant la fixation éventuelle d'une molécule testée avec ledit récepteur LOX ; b) la mise en évidence de la fixation ou non de ladite molécule testée avec ledit récepteur LOX ; et c) la sélection de cette molécule si sa fixation avec ledit récepteur LOX a été mise en évidence à l'étape b).

Ledit récepteur LOX, ou un de ses fragments comprenant son site de fixation spécifique, utilisé à l'étape a) pourra être isolé ou purifié à partir de culture de cellules exprimant naturellement ce récepteur. De préférence, ledit récepteur LOX utilisé à l'étape a), ou l'un de ses fragments comprenant son site de fixation spécifique, notamment sa fraction soluble dépourvue de son domaine transmembranaire, sera de nature recombinante, soit isolé et/ou purifié à partir de cultures de cellules hôtes transformées avec un ADN codant pour cedit récepteur, ou soit sous forme de cesdites cellules hôtes exprimant à leur surface ledit récepteur LOX.

Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé d'identification selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape d) suivante : d) l'identification de la molécule sélectionnée à l'étape c) si celle-ci n'est pas connue.

En effet, il sera possible d'utiliser dans les procédés selon la présente invention, une molécule à tester, prise de manière isolée et dont la structure n'est pas connue, ou un mélange de molécules à tester connues ou inconnues, dont les étapes a), b) et c) du procédé ci-avant décrites permettront seulement d'identifier leur capacité à se lier audit récepteur. Ladite étape d) aura pour objectif d'identifier la structure de la molécule inconnue ayant cette capacité, ou d'identifier parmi l'ensemble des molécules connues testées simultanément celle (s) présentant cette capacité.

Par exemple, de telles molécules à tester, seules ou en mélange, pourront être issues de synthèse chimique par chimie combinatoire, de banques de clones d'expression de peptides ou d'extraits naturels contenant des mélanges complexes.

Les molécules ayant la capacité de se fixer aux formes recombinantes des récepteurs LOX pourront ensuite être analysées, si nécessaire, par toute méthode d'analyse permettant de définir la structure d'un composé chimique ou biochimique connue de l'homme de l'art telle que, sans s'y limiter, par spectrométrie de masse, HPLC, infrarouges et/ou par RMN (Résonance Magnétique Nucléaire).

Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé d'identification selon l'invention, caractérisé en ce que la mise en évidence et/ou l'identification des molécules capables de se lier au récepteur LOX est réalisée par une méthode choisie parmi les méthodes suivantes : - une chromatographie d'affinité, - une identification par FACS des molécules se liant à des cellules transfectées par un récepteur LOX, - une technique de type BIACOR, ou - un clonage par expression à partir d'une sonde portant un récepteur LOX, tel qu'un screening en utilisant comme sonde une forme soluble d'un récepteur LOX, le domaine extracellulaire du récepteur LOX pouvant être fusionné à une chaîne lourde d'immunoglobuline.

La technique dite de chromatographie d'affinité connue de l'homme du métier pourra être réalisée en utilisant des formes recombinantes des récepteurs LOX immobilisées sur une résine. Idéalement, les formes recombinantes des récepteurs LOX seront composées uniquement des domaines extracellulaires des formes recombinantes des récepteurs LOX fusionnées ou non à une séquence Tag (c-myc, His6, chaîne lourde de l'immunoglobuline yl murine, GST (Glutathion S-Transférase),...). Les molécules recombinantes pourront être produites en système procaryote ou eucaryote (cellules COS, CHO ou cellules d'insecte). Les molécules recombinantes seront fixées sur une résine adaptée en utilisant des techniques conventionnelles incluant le couplage chimique à une matrice de colonne appropriée telle que l'agarose, Affi Gel, ou d'autres matrices connues de l'homme de l'art. Les molécules à tester décrites ci-dessus telles que des extraits protéiques totaux issus de bactéries, parasites, virus, cellules eucaryotes pourront être incubés avec ces résines sont ensuite déposées sur la colonne. Les molécules

interagissant avec ledit récepteur LOX sont retenues par la colonne et peuvent être isolées par élution.

L'identification par FACS ( Fluorescence Activated Cells Sorting ) est une technique connue de cytométrie en flux, et permet d'analyser la fixation de la molécule testée sur des transfectants stables exprimant un récepteur LOX. Les transfectants stables peuvent être générés dans des cellules hôtes qui n'expriment peu ou pas de récepteur scavenger comme les cellules CHO. Pour identifier les molécules ayant la capacité de se fixer aux récepteurs LOX, il sera possible de créer une banque d'expression. Brièvement, les ADNc ou l'ADN génomique issu de bactéries, parasites, cellules eucaryotes, etc., seront insérés dans un vecteur d'expression procaryote permettant la production de molécules recombinantes solubles et taggées (marquées) (idéalement, nous choisirons un Tag (ou marqueur) détectable par un anticorps compatible avec un screening par cytofluorométrie). Les molécules recombinantes produites par les clones bactériens seront sélectionnées sur la capacité à se fixer aux transfectants stables exprimant un récepteur LOX. L'ADN plasmidique pourra ensuite être identifié par séquençage.

Dans d'autres méthodes, les molécules susceptibles d'interagir avec ledit récepteur LOX peuvent être liés à des marqueurs détectables telles que des marqueurs radioactifs, fluorescents ou enzymatiques. Ces molécules marquées sont mises en contact avec ledit récepteur LOX immobilisé, dans des conditions permettant une interaction spécifique. Après élimination des molécules non-fixées spécifiquement, les molécules liées sont détectées par des moyens appropriés.

La technologie du BIACORE peut également être utilisée pour effectuer le criblage de composés capables d'interagir avec ledit récepteur LOX. Cette technologie permet de détecter des interactions entre molécules en temps réel sans utilisation de marquage. Elle est basée sur le phénomène de SPR (surface plasmon resonance). Un des principaux avantages de cette méthode est qu'elle permet la détermination des constantes d'association entre le récepteur et les molécules interagissant. Ainsi, il est possible de sélectionner spécifiquement les molécules interagissant avec de fortes ou de faibles constantes d'association.

Le clonage par expression peut aussi être effectué à partir d'une sonde constituée du domaine extracellulaire du récepteur LOX fusionné à un Tag, idéalement une chaîne lourde d'immunoglobuline murine. La détection de cette molécule pourra se faire à l'aide d'un anticorps anti-immunoglobuline murine marquée à un fluor, un fluorochrome (Alexa ou FITC) ou de billes magnétiques coatées avec un anticorps antiIg de souris. Les banques d'expression (procaryotique ou eucaryotique) construites avec de l'ADNc ou de l'ADN génomique provenant de bactéries, virus, parasites, cellules eucaryotes, etc. seront screenées à l'aide des formes recombinantes solubles des récepteurs LOX. Les clones ainsi isolés pourront être identifiés par séquençage.

Par exemple, mais sans s'y limiter, on pourra également mettre en oeuvre dans les procédés d'identification selon l'invention une autre méthode d'identification de molécules capables d'interagir avec ledit récepteur LOX utilisant un système de double hybrides bactériens ou levures tel que le Matchmaker Two Hybrid System 2. Selon les instructions du manuel accompagnant le Matchmaker Two Hybrid System 2 (Catalogue ? Kl 604-1, Clontech), lorsque par exemple les molécules à tester sont des peptides non connus dont les ADNc sont clonés dans des banques de plasmides.

On peut également citer une autre méthode d'identification pour mettre en évidence l'interaction dudit récepteur LOX avec des petites molécules telles que celles générées par chimie combinatoire, mettant en oeuvre une microdialyse couplée à une HPLC ou une électrophorèse capillaire d'affinité, techniques connues de l'homme de l'art.

Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé d'identification selon l'invention, caractérisé en ce que la capacité des molécules se liant à un récepteur LOX à être intemalisées par une cellule présentatrice d'antigène est mise en évidence par une méthode comprenant les étapes suivantes : A) le marquage de ladite molécule sélectionnée se liant à un récepteur LOX par un marqueur susceptible de permettre la détection directe ou indirecte de la présence de ladite molécule ainsi marquée à la surface et/ou à l'intérieur d'une cellule, de préférence d'une cellule présentatrice d'antigène exprimant ledit récepteur LOX ; B) la mise en contact de ladite molécule marquée avec une cellule présentatrice d'antigène exprimant un récepteur LOX, dans un milieu permettant la fixation (et/ou

le cas échéant l'intemalisation dans la cellule) de ladite molécule marquée avec ledit récepteur LOX ; C) la mise en évidence de l'internalisation ou non de ladite molécule marquée dans ladite cellule présentatrice d'antigène ; et D) la sélection de cette molécule si l'intemalisation de ladite molécule marquée a été mise en évidence à l'étape C).

Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé d'identification selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de détermination de la capacité de ladite molécule ainsi identifiée d'être immunogène.

Dans ce mode préféré de réalisation de l'invention, après avoir réalisé le procédé selon l'invention, on effectue une étape supplémentaire consistant à analyser ou évaluer l'immunogénicité de la molécule sélectionnée.

Pour ce faire, on peut coupler un haptène (par exemple le TNP (Trinitrophényl)) ou antigène tel qu'un oligosaccharide, un lipide ou un peptide à la molécule identifiée.

Des souris sont ensuite injectées par voie intra péritonéale ou sous-cutanée selon des protocoles connus de l'homme de métier. La production d'Ac anti-haptène,-oligo- saccharide, -lipide ou-peptide est analysée par ELISA.

On pourra également évaluer la capacité de ladite molécule sélectionnée à générer et/ou à augmenter la réponse immune de type CTL par mesure de l'activité cytotoxique de cellules effectrices de type lymphocyte générées après immunisation avec ladite molécule sélectionnée, la mesure du pourcentage de lyse de cellules co-incubées avec lesdites cellules effectrices étant par exemple évaluée par le taux de relargage de "Cr comme décrit par exemple, mais sans s'y limiter, dans la demande de brevet WO 00/48628 ou WO 00/48629 aux exemples 4 et 5.

Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé d'identification selon l'invention, caractérisé pour l'identification de nouvelles HSP ou des analogues d'HSP.

Par analogue d'HSP, on entend désigner ici des composés capables d'exercer au moins l'une des fonctions d'adjuvant de l'immunité, et/ou de protéine porteuse favorisant une réponse immune efficace contre des peptides ou des oligosaccharides, notamment en

absence d'adjuvant, notamment une réponse de type CTL, telle que décrite ci-avant dans le paragraphe concernant les HSP.

Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé d'identification selon l'invention, pour : - l'identification en particulier de nouveaux adjuvants de l'immunité ; et/ou - l'identification de molécule capable de cibler un composé tel qu'une substance à activité biologique, notamment un antigène ou haptène, qui lui est associé, de préférence par couplage covalent ou par affinité, vers une cellule exprimant ledit récepteur LOX, ledit composé associé à la molécule étant de préférence intemalisé dans la cellule exprimant ledit récepteur LOX ; et/ou - pour l'identification de molécule destinée à moduler l'activité biologique de composé (ou substance) qui lui est associé par l'intermédiaire des cellules exprimant ledit récepteur LOX, notamment les cellules présentatrices d'antigène comme les cellules dendritiques immatures ; et/ou - pour l'identification de molécule destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre un antigène ou haptène qui lui est associé ; et/ou - pour l'identification de molécule destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire de type T cytotoxique ; et/ou - pour l'identification de molécule destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre un agent infectieux ou une cellule tumorale.

Un objet de l'invention concerne également de nouvelles molécules susceptibles d'être identifiées par le procédé selon l'invention, tel que décrit ci-dessus.

Ces nouvelles molécules susceptibles d'être obtenues par la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention n'englobent pas les ligands connus à ce jour susceptibles de se lier à LOX-1, tels que les HSP, les LDL modifiés, oxydés ou acétylés, les apolipoprotéines, telles que les Apo B, les dérivés d'acide désoxyribonucléotidiques tétramériques tels que les polyinosines, et les acides nucéliques non naturels tels que l'inositine.

Par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, il sera possible d'identifier de nouveaux anticorps anti-LOX. Ces derniers, tout comme les anticorps anti-LOX déjà connus, pourront être utilisés de la même façon que les HSP.

Ainsi, l'invention concerne plus particulièrement un complexe anticorps (dénommé également anticorps de fusion), caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments capable de se fixer spécifiquement sur un épitope d'un récepteur LOX ledit anticorps ou fragment étant associé à une substance biologiquement active.

Par substance biologiquement active , on entend désigner tout composé capable d'exercer une activité thérapeutique, notamment les composés dont l'activité peut être modulée par l'intermédiaire des cellules CPA.

Comme exemple de telles substances biologiquement actives, on peut citer sans s'y limiter les composés immunogènes tels que des antigènes ou haptènes de nature protéique, lipidique, poly ou oligosaccharidique, glycoprotéique, lipoprotéique ou des acides nucléiques.

Au sens de la présente invention, par immunogène, antigène ou haptène , on entend notamment désigner tout composé exprimé par un agent infectieux, tel un virus, une bactérie, une levure, un champignon ou un parasite, par une cellule tumorale, ou un de leurs analogues structuraux, qui seul ou en association avec un adjuvant ou porteur est capable d'induire une réponse immunitaire spécifique dudit agent infectieux ou de ladite cellule tumorale.

On entend également désigner par"immunogène, antigène ou haptène"dans la présente description un composé présentant une analogie structurale avec ledit antigène ou haptène capable d'induire une réponse immunologique dirigée contre ledit antigène ou haptène dans un organisme préalablement immunisé avec ledit composé analogue. Les composés immunogènes, antigènes ou haptènes, pouvant être portés par ou dérivés des structures complexes telles que des bactéries, des levures, des particules virales, des parasites ou des champignons ou être associés à ou issus de cellules tumorales, telles que ci-après décrites.

Par substance biologiquement active , on entend également désigner tout composé capable de modifier l'activité fonctionnelle des cellules CPA, en particulier leur croissance, leur différentiation ou leur système d'expression. On peut citer comme exemple de telles substances biologiquement actives, mais sans s'y limiter, les facteurs de croissance cellulaire dont les cytokines (IL-4, IL-3, GM-CSF, TNF-alpha), les acides

nucléiques codant pour des protéines d'intérêt homologues ou hétérologues et capables d'être exprimées par les cellules CPA.

Au sens de la présente invention, le terme anticorps comprend les anticorps monoclonaux, polyclonaux, ou un de leurs fragments, dirigés spécifiquement contre le récepteur LOX. On utilisera préférentiellement des anticorps monoclonaux, polyclonaux, ou un de leurs fragments qui sont utilisables chez l'homme, et notamment ceux humanisés.

Ainsi, l'anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments, est capable de se fixer spécifiquement sur un épitope ou déterminant du récepteur LOX. Les déterminants épitopiques consistent habituellement en des groupes de molécules présentant des surfaces chimiquement actives telles que des acides aminés ou des chaînes latérales de sucres et ayant une structure tridimensionnelle spécifique et/ou une charge spécifique caractéristique.

Les fragments d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux selon l'invention comprennent tout fragment dudit anticorps monoclonal capable de se fixer sur un épitope du récepteur LOX sur lequel se fixe l'anticorps monoclonal ou polyclonal dont ledit fragment est issu. Des exemples de tels fragments incluent en particulier des anticorps monoclonaux simple chaîne ou des fragments monovalents Fab ou Fab'et des fragments divalents tels que F (ab') 2, qui possèdent la même spécificité de fixation que l'anticorps monoclonal ou polyclonal dont ils sont issus. Un fragment pourra également être un fragment Fv simple chaîne produit par des méthodes connues de l'homme de l'art et telles que décrites par exemple par Skerra et al. (Science, 240 : 1038-1041,1988) et King et al.

(Biochemical J., 290 : 723-729, 1991).

Des fragments d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux peuvent être obtenus à partir des anticorps monoclonaux ou polyclonaux tels que décrits précédemment par des méthodes telles que la digestion par des enzymes, comme la pepsine ou la papaïne et/ou par clivage des ponts disulfures par réduction chimique. Les fragments d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux, compris dans la présente invention, peuvent également être synthétisés par des synthétiseurs automatiques de peptides tels que ceux fournis par la société Applied Biosystems, etc., ou peuvent être préparés manuellement en utilisant

des techniques connues de l'homme de l'art et telles que décrites par exemple par Geysen et al. (J. Immunol. Methods, 102 : 259-274, 1978).

En général, pour la préparation d'anticorps monoclonaux, polyclonaux ou de leurs fragments, on pourra se référer aux techniques qui sont en particulier décrites dans le manuel"antibodies" (Harlow et al., antibodies : a laboratory manual, Cold Spring Harbor publications pp. 726,1988) ou à la technique de préparation à partir d'hybridomes décrite par Kohler et Milstein en 1975.

L'invention comprend de préférence un complexe anticorps selon l'invention, caractérisé en ce que ledit anticorps, ou l'un de ses fragments, et ladite substance biologiquement active sont associés par liaison covalente ou par affinité.

Les substances biologiquement actives, de préférence les immunogènes, seront couplés à l'anticorps par liaison covalente (comme par exemple l'emploi des réactifs de couplage (tels que les bis (succinimidyl subérate) ou BS3, glutaraldéhyde, les réactifs en général homo-ou hétérobifonctionnels utilisés par l'homme de l'art pour le couplage de deux composés destinés à un usage thérapeutique,...) ou encore par interaction non covalente de l'anticorps couplé à la biotine avec l'antigène couplé à la streptavidine. On pourra également envisager un complexe anticorps obtenu par fusion génétique si l'immunogène est de nature peptidique, telle qu'une protéine de fusion du domaine Fab de l'anticorps avec un antigène protéique recombinant. Dans tous les cas, il sera préféré une technique d'association qui n'affecte pas le site de fixation de l'anticorps.

Dans un mode de réalisation de l'invention, ledit complexe anticorps comprend en outre un élément de liaison qui lie ledit anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments capable de se fixer spécifiquement sur un épitope d'un récepteur LOX et ladite substance biologiquement active, de préférence un immunogène, antigène ou haptène.

Dans le cadre de la présente invention, l'élément de liaison est défini comme tout élément permettant de relier ledit anticorps et ladite substance biologiquement active, de préférence un immunogène, antigène ou haptène.

L'élément de liaison est choisi préférentiellement parmi ceux permettant d'obtenir des complexes anticorps présentant une activité biologique supérieure à celle du complexe anticorps sans élément de liaison.

Ce dernier est notamment choisi parmi : - un peptide de liaison, - un pont disulfure, et - un élément de liaison résultant de l'utilisation d'un agent chimique.

Les agents chimiques sont notamment choisis parmi : - les agents dits"zero-length", c'est-à-dire sans bras de couplage, tels que les carbodiimides, - les agents homobifonctionnels, tels que les aldéhydes (formaldéhyde, glutaraldéhyde), les hydrazides (carbohydrazide), les NHS esters (DSP, DSS, BS3) et les imidoesters (DMA, DMP, DMS), - les agents hétérobifonctionnels tels que les Amino-et thiol-réactifs (SPDP, SMPT, SMCC, MBS), les carbonyl-et thiol-réactifs (MPBH, M2C2H), et les photoactivables (NHS-ASA, SASD, HSAB, ABH).

Pour l'utilisation de ces réactifs chimiques ou pour d'autres éléments de liaison chimiques, on pourra se reporter à l'ouvrage"Bioconjugate Techniques", Greg T.

Hermanson Ed., 1996, Academic press, pages 169 à 286.

Les réactifs chimiques permettant ce couplage seront déterminés en fonction de l'extrémité dudit anticorps et de ladite substance biologiquement active, de préférence un immunogène antigène ou haptène, choisi à coupler.

Parmi les complexes anticorps, on préfère ceux obtenus par voie recombinante.

Ainsi, un mode de réalisation préféré de l'invention concerne ledit complexe anticorps selon l'invention, caractérisé en ce que l'élément de liaison est un peptide de liaison.

Les procédés de synthèse de telles protéines de fusion englobent les méthodes utilisées en génie génétique pour construire des polynucléotides hybrides codant pour les séquences polypeptidiques recherchées. On pourra, par exemple, se référer avantageusement à la technique d'obtention de gènes codant pour des protéines de fusion décrite par D. V. Goeddel (Gene expression technology, Methods in Enzymology, vol. 185,3-187, 1990).

Le peptide de liaison est notamment un peptide de 1 à 50 acides aminés et préférentiellement de 10 à 30 et plus préférentiellement de 15 à 25 acides aminés.

Il est préférentiellement choisi parmi un peptide de séquence (Gly-Gly-Gly-GlySer) n, (Gly-Gly-Ser-Gly-Gly) n, (Gly-Ser-Gly-Gly-Gly) n ou (Gly-Gly-Gly-Ser-Gly) n dans laquelle n désigne un nombre entier, préférentiellement de 1 à 10 et plus préférentiellement de 2 à 4.

Il est plus préférentiellement choisi parmi un peptide de séquence (Gly-Gly-GlyGly-Ser) n, dans laquelle n désigne un nombre entier, préférentiellement de 1 à 10 et plus préférentiellement de 2 à 4.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le peptide de liaison correspond à toute ou à une partie d'une région charnière d'une immunoglobuline. Cette région charnière, aussi appelée région hinge, est la région d'une immunoglobuline qui lie les unités Fab (constituée de la chaîne L entière et de la moitié N-terminale de la chaîne H) au fragment Fc (constitué des moitiés C-terminales des chaînes H). Une séquence hinge préférée est la séquence Ala-Glu.

Le peptide de liaison correspond dans un autre mode de réalisation de l'invention à un leucine zipper. Les leucines zipper correspondent à des domaines responsables de la dimérisation de protéines et notamment de protéines se liant à l'ADN.

Ils sont constitués de deux séquences de 7 acides aminés comprenant 4 ou 5 leucines. Ces deux séquences permettent ensuite un appariement des deux protéines sur lesquelles elles sont présentes. On pourra se reporter au brevet US 5,837, 816 et plus particulièrement aux leucines zipper artificiels décrits dans ce document, utilisables dans la présente invention.

Lesdits complexes anticorps comprenant un élément de liaison peptidique peuvent être obtenus sous forme de protéines recombinantes, glycosylées ou non, par les techniques standards de recombinaison génétique en utilisant des cellules procaryotes ou eucaryotes transformées par des vecteurs plasmidiques ou viraux contenant des acides nucléiques codant pour lesdites protéines et peptide de liaison.

L'invention a encore pour objet une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins une molécule se liant à un récepteur LOX, et préférentiellement au moins une nouvelle molécule susceptible d'être identifiée par le procédé d'identification selon l'invention.

De préférence, ces molécules utilisées dans une composition pharmaceutique sont différentes des HSP et des dérivés d'acides désoxyribonucléotidiques tétramériques tels que les polyinosines, et les acides nucléiques non naturels tels que l'inositine.

L'invention a ainsi aussi pour objet une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins des LDL modifiés, oxydés ou acétylés, des apolipoprotéines, telles que les Apo B, et/ou du fucoidan.

L'invention a également pour objet cette composition selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique comprend en outre un immunogène, un antigène ou haptène.

L'invention concerne encore une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins un complexe anticorps tel que défini ci-dessus.

De préférence, dans les compositions selon l'invention, ledit immunogène, antigène ou haptène, est choisi parmi toute substance chimique en général, notamment parmi les peptides, les glycopeptides, les lipopeptides, les poly-ou oligosaccharides, les acides nucléiques et les lipides, de manière préférée ledit antigène ou haptène dérive d'un virus, d'une bactérie, d'une levure, d'un parasite ou d'un champignon.

De manière encore plus préférée, ledit immunogène comprend au moins un peptide dérivé de micro-organisme responsable de pathologies des voies aériennes choisi parmi le VRS, le para influenza virus (PIV), l'influenza virus, les hantavirus, les streptocoques, les pneumocoques, haemophilus influenza type b, les rhinovirus, les coronovirus et les méningocoques.

De manière également encore plus préférée, ledit immunogène, antigène ou haptène, peut être associé à ou spécifique d'une cellule tumorale.

Parmi les cancers dont les tumeurs expriment un antigène tumoral associé pouvant être prévenus ou traités par les utilisations selon la présente invention, on peut citer en particulier, mais sans s'y limiter : e le cancer du sein, du poumon, du colon, et le carcinome gastrique (Kawashima et al.,
1999, Cancer Res., 59 : 431-5) ;

'le mésothéliome, l'ostéosarcome, les cancers du cerveau (Xie et al., 1999, J. Natl.

Cancer. Inst., 91 : 169-75) ; Ie mélanome (Zheuten et al., 1998, Bratilsl. Lek. Listy, 99 : 426-34) ; * l'adénome cystique du pancréas (Hammel et al., 1998, Eur. J. gastroenterol. Hepatol.,
10 : 345-8) ; le cancer colorectal (Ogura et al., 1998, Anticancer Res., 18 : 3669-75) ;

Ie carcinome des cellules rénales (Jantzer et al., 1998, Cancer Res., 58 : 3078-86) ; et Ie cancer de l'ovaire et du cervix (Sonoda et al., 1996, Cancer., 77 : 1501-9).

Ainsi, l'antigène pourra notamment être choisi parmi les épitopes CTL tumoraux.

Les compositions selon l'invention peuvent contenir en outre un adjuvant. Ce dernier peut notamment être choisi parmi le MPL-A, le Quil-A, l'ISCOM, le Diméthyl Dioctadécyl Ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC), les CpG, la Leif, la CT (toxoïde du choléra), la LT (Heat labile enterotoxine) et les versions détoxifiées de la CT ou la LT.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la composition pharmaceutique selon l'invention ne contient pas d'adjuvant autre que la molécule se liant au récepteur LOX, et notamment aucun autre adjuvant permettant d'induire ou d'augmenter l'immunogénicité ou une réponse CTL.

Au sens de la présente invention, le milieu pharmaceutiquement acceptable est le milieu dans lequel les composés de l'invention sont administrés, préférentiellement un milieu injectable chez l'homme. Il peut être constitué d'eau, d'une solution aqueuse saline ou d'une solution aqueuse à base de dextrose et/ou de glycérol.

L'invention comprend également une composition selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité ; ainsi, elle peut être véhiculée sous forme de liposomes, virosomes, nanosphères, microsphères ou microcapsules.

L'utilisation d'une molécule se liant à un récepteur LOX, et préférentiellement d'une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en oeuvre du procédé d'identification selon l'invention ou d'un anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de

leurs fragments capable de se fixer spécifiquement sur un épitope d'un récepteur LOX comme porteur et/ou adjuvant dans un vaccin constitue un autre objet de l'invention.

L'invention comprend également l'utilisation d'un complexe anticorps selon l'invention, pour la préparation d'un vaccin, de préférence, ledit antigène ou haptène dudit complexe anticorps se lie à un récepteur LOX de cellules présentatrices d'antigènes et est intemalisé dans lesdites cellules présentatrices d'antigènes.

De préférence, ces molécules utilisées comme porteur et/ou adjuvant dans un vaccin sont différentes des HSP, des dérivés d'acides désoxyribonucléotidiques tétramériques tels que les polyinosines, et des acides nucléiques non naturels tels que l'inositine.

L'invention concerne encore l'utilisation d'une molécule se liant à un récepteur LOX, et préférentiellement d'une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention, ou d'un complexe anticorps selon l'invention pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers. De préférence, ces molécules utilisées pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers sont différentes des HSP et des dérivés d'acide désoxyribonucléotidiques tétramériques tels que les polyinosines, et les acides nucéliques non naturels tels que l'inositine.

L'invention a aussi pour objet l'utilisation des LDL modifiés, oxydés ou acétylés, des apolipoprotéines, telles que les Apo B, et/ou du fucoidan pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers.

L'invention a encore pour objet l'utilisation d'une molécule se liant à un récepteur LOX, et préférentiellement d'une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention, ou d'un complexe anticorps selon l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou

accroître une réponse immunitaire contre un agent infectieux ou une cellule tumorale. De préférence, ces molécules utilisées pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre un agent infectieux ou une cellule tumorale sont différentes des HSP et des dérivés d'acide désoxyribonucléotidiques tétramériques tels que les polyinosines, et les acides nucéliques non naturels tels que l'inositine.

L'invention a aussi pour objet l'utilisation des LDL modifiés, oxydés ou acétylés, des apolipoprotéines, telles que les Apo B, et/ou du fucoidan pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre un agent infectieux ou une cellule tumorale.

La présente invention est aussi relative à l'utilisation d'une molécule se liant à un récepteur LOX, et préférentiellement d'une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en oeuvre d'un procédé d'identification selon l'invention, ou d'un complexe anticorps selon l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou à accroître une réponse T cytotoxique contre un agent infectieux ou une cellule tumorale. On pourra utiliser de telles compositions en thérapie ex vivo ou in vivo. De préférence, ces molécules utilisées pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou à accroître une réponse T cytotoxique contre un agent infectieux ou une cellule tumorale sont différentes des HSP, des dérivés d'acide désoxyribonucléotidiques tétramériques tels que les polyinosines, et des acides nucéliques non naturels tels que l'inositine.

L'invention a aussi pour objet l'utilisation des LDL modifiés, oxydés ou acétylés, des apolipoprotéines, telles que les Apo B, et/ou du fucoidan pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou à accroître une réponse T cytotoxique contre un agent infectieux ou une cellule tumorale.

L'invention concerne encore l'utilisation d'un complexe anticorps selon l'invention pour le ciblage spécifique des cellules présentatrices d'antigènes, de préférence vers une cellule présentatrice d'antigène exprimant le récepteur LOX.

L'invention concerne encore l'utilisation d'une molécule se liant à un récepteur LOX, et préférentiellement d'une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en oeuvre du procédé d'identification selon l'invention, ou d'un complexe anticorps

selon l'invention pour le ciblage spécifique d'une substance biologiquement active qui lui est associée vers les cellules présentatrices d'antigènes, de préférence vers une cellule présentatrice d'antigène.

De préférence, lesdites cellules présentatrices d'antigènes sont choisies parmi les cellules dendritiques, les macrophages, les lymphocytes B ou les monocytes, et préférentiellement parmi les cellules dendritiques immatures.

De préférence, ladite substance biologiquement active est un antigène ou haptène ou un facteur de croissance tel que ci-avant décrit.

L'invention concerne encore l'utilisation d'une molécule ou d'un anticorps, ou l'un de ses fragments, ou un complexe anticorps selon l'invention, caractérisé en ce que ladite molécule, ledit anticorps ou fragment, ou ledit complexe anticorps se lie à un récepteur LOX de cellules présentatrices d'antigènes et est intemalisé dans lesdites cellules présentatrices d'antigènes, de préférence dans les cellules dendritiques immatures.

De préférence, ces molécules utilisées pour le ciblage spécifique d'une substance biologiquement active qui lui est associé vers les cellules présentatrices d'antigènes sont différentes des HSP, des dérivés d'acides désoxyribonucléotidiques tétramériques tels que les polyinosines, et des acides nucléiques non naturels tels que l'inositine.

L'invention a aussi pour objet l'utilisation des LDL modifiés, oxydés ou acétylés, des apolipoprotéines, telles que les Apo B, et/ou du fucoidan pour le ciblage spécifique d'une substance biologiquement active qui lui est associé vers les cellules présentatrices d'antigènes.

Il a également été constaté que l'expression de LOX-1 était augmentée dans les plaques d'athérome humaines (Kataoka et al., 1999), suggérant ainsi que le dysfonctionnement de l'expression de LOX-1 pourrait être associé avec le développement de l'athérogénèse (Kita et al., 2000). De plus, une augmentation de l'expression/localisation des HSP et particulièrement des HSP70 (Berberian et al., 1990), a été signalée dans les plaques d'athérome humaines. On peut citer à ce sujet les références suivantes : Kita, T., et al., Oxidized-LDL and atherosclerosis. Role of LOX-1- 1, Ann. N. Y. Acad. Sci., 902,95-100, 2000 ; Kataoka, H., et al., Expression oflectinlike oxidized low-density lipoprotein receptor-1 in human atherosclerotic lesions,

Circulation, 99, 3110-3117, 1999 et Berberian, P. A., et al., Immunohistochemical localization of heat shock protein-70 in normal-appearing and atherosclerotic specimens ofhumanarteries. /M. Po/., 136,71-80, 1990.

La demande WO 00/20019 décrit une composition pour la prévention et/ou le traitement de l'athérosclérose, comprenant un composé actif choisi parmi les LDL oxydés ou modifiés, les lipoprotéines, les HSP 60/65 et la béta2-glycoprotéine-1. La demande WO 99/32520 quant à elle décrit un polypeptide fusionné composé d'une région extracellulaire d'un récepteur des LDL oxydés et d'une partie d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline, polypeptide pouvant être utilisé pour le traitement de l'artériosclérose.

L'invention a ainsi encore pour objet l'utilisation d'un complexe anticorps selon l'invention ou d'une molécule se liant à un récepteur LOX, et préférentiellement d'une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention, à l'exception des HSP 60/65, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement prophylactique ou thérapeutique de l'artériosclérose.

L'invention a encore pour objet l'utilisation d'une molécule se liant à un récepteur LOX, et préférentiellement d'une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention ou d'un complexe anticorps selon l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement prophylactique ou thérapeutique de maladies liées au dysfonctionnement des récepteurs LOX ou au dysfonctionnement des ligands de ces récepteurs et plus particulièrement des HSP.

Enfin, la présente invention a pour objet l'ensemble des utilisations si avant décrites selon l'invention, caractérisées en ce que ladite molécule capable de se fixer ou

de se lier spécifiquement sur ledit récepteur LOX de préférence le récepteur LOX-1, notamment d'origine humaine, et, le cas échéant, capable d'être intemalisée après ladite fixation dans une cellule présentatrice d'antigène exprimant ledit récepteur LOX, est sélectionnée, et, le cas échéant, identifiée par un procédé d'identification selon l'invention.

Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.

Figures 1A et 1B. HSP70 se lie à un récepteur scavenger
Figure 1A. HSP70 se lie aux cellules dendritiques humaines immatures. Les

cellules dendritiques humaines immatures sont incubées pendant 20 minutes à 4 C avec 20 gg/ml de HSP70 marquée à la biotine. Après lavage, les cellules sont incubées avec de la streptavidine marquée par du FITC (Isothiocyanate de fluorrescéine).

Figure 1B. La liaison des HSP70 aux cellules dendritiques immatures est inhibée par la BSA maléylée. Les cellules dendritiques immatures sont incubées pendant 20

minutes à 4 C avec 20 lig/rnl de BSA maléylée ou de BSA (sérum albumine bovine). Après lavage, les cellules sont incubées avec 2 gg/ml de HSP70 marquée à la biotine et révélée avec de la streptavidine marquée par du FITC.

La fluorescence a été analysée par un cytofluoromètre FACScan.

Figures 2A à 2E. Les HSP70 se lient au scavenger récepteur LOX-1
Les cellules CHO ont été transfectées avec le vecteur pEBS contenant l'ADNc codant pour les scavenger récepteurs LOX-1 (figure 2A), SR-A1 (figure 2B), CD36 (figure 2C), SR-C1 (figure 2D) et MARCO (figure 2E). Les cellules CHO ont été incubées pendant 20 minutes à 4 C avec 20 ug/ml de HSP70 marquée à la biotine avant incubation avec de la streptavidine marquée par du FITC. La fluorescence a été analysée par un cytofluoromètre FACScan.

Figures 3A et 3B. LOX-1 est un récepteur des HSP70 sur les cellules dendritiques
Figure 3A. L'ARNm de LOX-1 est exprimé par les APCs humaines.

L'expression de LOX-1 a été analysée par RT-PCR dans des lymphocytes humains B (1), des monocytes (2), des macrophages (3), des cellules dendritiques immatures (4), des lymphocytes T (5) et des cellules endothéliales (6). Les segments amplifiés ont été séparés en fonction de leur taille sur un gel d'agarose à 1 % et visualisés par coloratin au bromure d'éthidium. L'intégrité des ARN et des ADNc synthétisés a été vérifiée en amplifiant l'ADNc GAPDH.

Figure 3B. Les structures liant les HSP70 sont diminuées quand les DC (cellules dendritiques) sont activées. La liaison des HSP70 a été évaluée par FACS sur les cellules

dendritiques immatures non stimulées ou activées avec 1 ng/ml LPS ou 20 ng/ml TNFa.

La fluorescence a été analysée par un cytofluoromètre FACScan.

Figure 4. LOX-1-Fc inhibe la présentation dans le CMH de classe 1 de l'ovalbumine associée à HSP70.

L'ovalbumine (Ova) a été traitée ou non avec BS3 (Ova-BS3) ou couplée à HSP70 (HSP70-Ova). Les cellules dendritiques immatures ont été pulsées pendant 8 h avec Ova, Ova-BS3, ou HSP70-Ova avant leur mise en culture avec 5x105 cellules T d'hybridome B3Z. Dans certaines expériences, les cellules dendritiques ont été incubées avec de l'Ova-HSP70 en présence de 10 mg/ml de LOX-1-Fc ou de CD86-Fc. La production d'IL-2 a été mesurée par ELISA. Les résultats sont exprimés en pg/ml (moyenne sd, n=3).

Exemple 1 : Matériel et méthodes
Purification des cellules
Des cellules dendritiques humaines immatures et des macrophages ont été générés in vitro, de façon connue de l'homme du métier. Des monocytes humains ont été isolés à partir de PBMC (peripheral blood mononuclear cells) en utilisant un anticorps monoclonal anti-CD14 mAb marqué avec des billes magnétiques (Miltenyi Biotech, Bergish Gladbach, Germany). La pureté déterminée par analyse FACS a été supérieure à 98 %. Les monocytes humains ainsi purifiés ont été mis en culture pendant 5 jours avec 20 ng/ml d'IL-4 plus 20 ng/ml de GM-CSF (R & D Systems, Abingdon, UK) de manière à générer des cellules dendritiques immatures DC ou avec 20 ng/ml de GM-CSF pour générer des macrophages. Les cellules dendritiques humaines ont été caractérisées par l'expression de CD la et l'absence de CD83. Les cellules dendritiques matures ont été générées par une nouvelle culture des cellules dendritiques immatures avec de l'IL-4 et du GM-CSF et 10 ng/ml de LPS (de Escherichia coli isotype 0111 : B4) (Sigma, St Louis, MO). Seules les populations de cellules caractérisées par une expression homogène de CD83 ont été utilisées comme cellules dendritiques matures. Les cellules T ont été isolées par rosetting avec des érythrocytes de mouton. Après la lyse des erythrocytes, la pureté déterminée a été supérieure à 95 %.

Production et purification de LOX-1-Fc
L'ADNc de la séquence codante pour LOX-1 humain (accession number #AB010710 dans la banque GenBank ; Sawamura et al., 1997) correspondant au domaine 71-273 de la protéine a été inséré dans le vecteur d'expression Signal pIg-Tail (R & D Systems, Abingdon, UK) avec la séquence Fcyl humaine. La protéine chimère a été produite dans les cellules CHO en culture dans le milieu Optimem medium (Life technologies, Cergy Pontoise, France) et purifié en utilisant la protéine A immobilisée sur de l'agarose (Pierce, Rockford, IL).

Expériences de fixation
La HSP 70 recombinante (StressGen Biotechnologies Corp, Victoria BC, Canada) a été biotinylée en utilisant un kit commercial (Pierce). La HSP70 marquée à la biotine a été incubée à 4 C pendant 30 minutes dans un tampon pour FACS (PBS contenant 0,1 % BSA et 0,05 % NaN3). Après lavage dans le tampon FACS, les cellules ont été incubées avec de la streptavidine marquée au FITC (Molecular Probes, Eugene, OR) pendant 20 min à 4 C avant le lavage avec le tampon FACS. La fluorescence a été analysée par FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Dans certaines expériences, les cellules ont été préincubées avec de la HSP70 non marquée, de la BSA, de la BSA maléylée (mBSA), de l'acide polyinosinique (poly [I]), de l'acide polyadénosique (poly [A]) (Sigma), des Ac-LDL (Biogenesis, Poole, UK), du LOX-1-Fc ou CD86-Fc pendant 20 min à 4 C avant incubation avec de la HSP70 marquée à la biotine.

Analyse de l'expression de l'ARNm de LOX-1 par RT-PCR

L'expression de l'ARNm codant pour LOX-1 dans les APCs professionnelles comparée avec les cellules endothéliales a été évaluée par RT-PCR. Les cellules ont été resuspendues dans 1 ml de réactif Trizol (Life technologies). Après extraction au chloroforme, l'ARN total a été précipité avec l'alcool d'isopropyl. L'ADNc simple brin a été synthétisé en utilisant 2 ug de l'ARN total par transcription inverse en utilisant des amorces oligo-dT et la reverse transcriptase (Promega, Madison, WI). L'amplification par PCR a été effectuée avec une quantité d'ADNc correspondant à 25 ng de l'ARN total (2 minutes à 94 C suivi par 30 cycles (30 secondes à 94 C, 1 minute à 60 C et 1 minute à 72 C) suivi d'une extension finale de 4 minutes à 72 C) en utilisant des oligonucléotides spécifiques. L'intégrité de l'ARN a été estimée en amplifiant l'ADNc

GAPDH. Les produits de la PCR ont été analysés sur un gel à 1 % d'agarose par électrophorèse en présence de bromure d'éthidium.

Les transfectants
L'ADNc codant pour les récepteurs scavenger SR-A1, CD36, SR-CI, MARCO et LOX-1 a été cloné dans le vecteur d'expression pEBS/PL. Les cellules CHO (ATCC, Manassas, VA) ont été transfectées en utilisant le réactif Effecten (Qiagen, Courtaboeuf, France) et mis en culture dans un milieu DMEM supplémenté de 10 % de FCS et sélectionnées à l'aide d'hygromycine (Life technologies).

Activation de l'hybridome T B3Z spécifique de l'ovalbumine (Ova)
Les cellules T hybridome B3Z sont spécifiquement activées par le peptide dérivé d'Ova SIINFEKL presenté par H-2Kb. Les cellules dendritiques de souris ont été générées par culture de cellules de moelle de souris C57BL/6 (H-2b) dans le milieu RPMI contenant 10 % de FCS et des antibiotiques (Life technologies) et 3 ng/ml de GM-CSF (R & D Systems). L'Ovalbumin (Ova) (Sigma) a été couplée à l'HSP70 (Ova-HSP70) en utilisant du bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) à 0.25 mM tel que décrit par le fabricant (Pierce). Comme contrôle, l'Ova a été traitée par BS3 (Ova-BS3). Les protéines et les conjugués ont été mesurés avec le kit BCA (Pierce). Les cellules dendritiques immatures (caractérisées par des niveaux intermédiaires d'I-Ab) ont été pulsées pendant 8 h avec de l'HSP70, Ova, Ova-BS3 ou Ova-HSP70. Après plusieurs lavages, 5x105 cellules dendritiques pulsées sont mis en culture avec 5xl05 cellules T hybridome B3Z T. Dans

certaines expériences, les cellules dendritiques ont été incubées avec Ova-HSP70 en présence de 10 ug/ml de LOX-1-Fc, 100 ug/ml d'Ac-LDL ou 10 ug/ml de CD86-Fc. La production d'IL-2 a été mesurée par ELISA (Endogen, Wobum, MA) dans les sumageants de 16 h.

Exemple II : La liaison de l'HSP70 sur des cellules présentatrices d'antigène humaine est inhibée par la BSA maléylée
La liaison de l'HSP70 marquée à la biotine a été évaluée par FACS HSP70 se lie aux cellules dendritiques humaines immatures (figure 1A) de façon dose-dépendante, détectable à 100 ng/ml (MFI = 6 3 ; moyenne sd, n = 5) et maximale à la concentration la plus élevée testée (MFI = 92 12 using 20 mg/ml HSP70). La liaison de l'HSP70 marquée à la biotine aux cellules dendritiques immatures est empêchée par une

préincubation avec de l'HSP70 non marquée (55 9 % inhibition ; moyenne SD, n = 5) et également avec 100 ug/ml de BSA maléylée (92 5 % inhibition) mais pas avec de la BSA (figure 1B).

La BSA maléylée se lie aux récepteurs scavenger (SR) (Rhaindts, D., et al., Uptake and fate of class B scavenger receptor ligands in HepG2 cells, Eur. J. Biochem., 261,227-235, 1999), ces derniers pourraient donc être impliqués dans la liaison avec les HSP70. Ces tests d'inhibition ont également été réalisés avec d'autres molécules se liant aux SR. Les résultats obtenus ont montré que la liaison de l'HSP70 marquée à la biotine aux cellules dendritiques immatures est empêchée par Ox-LDL (75 8 % inhibition), Ac-LDL (85 10 %) poly [I] (94 6 % inhibition) mais pas par la poly [A].

Ainsi, la liaison de l'HSP70 aux CFA (Cellules Présentatrices d'Antigènes) est empêchée par des molécules se liant aux SR, suggérant ainsi que les HSP70 se lient à un SR.

Exemple m : HSP70 se lie à LOX-1
De façon à déterminer la nature du récepteur des HSP70, des cellules CHO ont été transfectées avec de l'ADNc codant pour des SR. Les cellules CHO ont été choisies car elles ne lient pas le DiI-Ac-LDL fluorescent, suggérant qu'elles expriment les SR à un taux très faible. Une analyse par FACS a montré que les HSP70 se lient à des cellules transfectées par LOX-1 mais pas à des cellules exprimant d'autres récepteurs scavenger testés : SR-A1, CD36, SR-C1 et MARCO (figures 2B à 2E). La liaison de HSP70 à des cellules transfectées par LOX-1 (MFI = 75 9) a été inhibée par HSP70 en tant que tel et également par d'autres molécules connues pour se lier à LOX-1 telles que Ox-LDL, Ac-LDL, poly [I] mais pas par la poly [A]. De plus, la liaison des HSP70 à LOX-1 a été

inhibée par LOX-1-Fc (MFI = 26 8 à comparer avec 75 9 respectivement en présence ou en absence de LOX-1-Fc ; expériences réalisées en utilisant 20 ug/ml de HSP70) mais pas par CD86-Fc.

Ainsi, LOX-1 est un récepteur liant HSP70.

Exemple IV : Expression de LOX-1 par des cellules dendritiques humaines

LOX-1 est exprimé dans les cellules endothéliales, les monocytes/macrophages, les cellules musculaires lisses et les fibroblastes. Nous avons analysé son expression dans les CPA humaines. De l'ARNm de LOX-1 a été détecté par RT-PCR dans les cellules

dendritiques immatures, les lymphocytes B, les monocytes et les macrophages (figure 3A). Comme contrôle, des transcripts de LOX-1 ont aussi été détectés dans des cellules endothéliales humaines (figure 3A). La liaison des HSP70 aux cellules dendritiques immatures est inhibée par LOX-1-Fc mais pas par CD86-Fc (556 et 5i4 % inhibition, respectivement ; moyenne + sd, n = 5), démontrant que le récepteur LOX-1 exprimé par les cellules dendritiques est un récepteur de HSP 70. Nous avons ensuite évalué par une analyse FACS si l'activation des cellules dendritiques avec TNFa ou du LPS pouvait moduler la liaison de HSP70. Le LPS et TNFalpha induisent la maturation des cellules dendritiques. Les résultats ont montré que l'activation des cellules dendritiques immatures avec le TNFalpha et le LPS induit une diminution de la liaison de HSP70 (figure 3B). Ces résultats montrent que le récepteur des HSP70 est sélectivement exprimé par les cellules dendritiques immatures et non par les cellules dendritiques matures.

Exemple V : LOX-1-Fc inhibe la présentation dans le CMH de classe 1 des antigènes associés à HSP70 Il a été montré que les HSP70 permettaient d'initier une réponse CTL dans le CMH de classe I-CD8+ (Udono et al., 1993 ; Udono et al., 1994). De plus, les HSP70 requièrent une endocytose médiée par un récepteur avant de parvenir dans le circuit du CMH de classe I. Nous avons analysé le rôle de LOX-1 dans la réponse MHC classe 1 induite par HSP70 en utilisant l'activation spécifique par l'ovalbumine du modèle CTL de cellules hybridomes H-2b-restreints B3Z. Les cellules dendritiques immatures murines ont été pulsées avec de l'ovalbumine (Ova) couplée à HSP70 en utilisant du bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) (HSP70-Ova) et exposé aux cellules T hybridomes B3Z. Les résultats ont montré qu'une concentration 1000 fois moindre d'Ova est requise lorsqu'elle est couplée à la HSP70 comparativement à l'Ova soluble pour induire des concentrations équivalentes d'IL-2. Aucune IL-2 n'a été produite en utilisant de l'Ova couplée à BS3 à la même concentration qu'HSP70-Ova (figure 4). La production d'IL-2 induite par HSP70-Ova a été inhibée en utilisant 10 mg/ml de LOX-1-Fc (52 8 % d'inhibition) mais pas par CD86-Fc (figure 4). Ainsi, LOX-1 est impliqué dans le processing des antigènes couplés à HSP70 dans la présentation au CMH de classe 1.

Exemple V : Méthode de screening de nouveaux ligands du récepteur LOX-1
La méthodologie décrite ci-dessous permet l'identification de molécules se liant à un récepteur LOX-1.

Dans l'exemple, nous présenterons une méthode d'identification de molécules d'origine bactérienne à l'aide d'une banque d'expression. Cette méthodologie est applicable à l'identification de molécules exprimées par n'importe quel organisme multicellulaire en utilisant des banques d'expression procaryotiques ou eucaryotiques et contenant soit des ADNc, soit de l'ADN génomique. a. Génération de clones stables exprimant des récepteurs LOX-1
Les ADNc codant pour les récepteurs LOX-1 identifiés jusqu'à maintenant sont intégrés dans un vecteur d'expression eucaryotique en aval d'une séquence codant pour un peptide signal (permettant de produire des molécules recombinantes solubles). Les cellules CHO sont transfectées par lipofection puis mises en culture avec un agent de sélection, comme par exemple l'hygromycine. La sélection de clones exprimant le transgène pourra se faire de différentes manières en fonction des sondes disponibles : - utilisation d'un anticorps monoclonal, couplé ou non à une molécule fluorescente, - utilisation de DiI-Ac-LDL fluorescent [une molécule est définie comme un SR lorsqu'elle fixe les LDL modifiés comme les LDL oxydés (Ox-LDL) ou les LDL acétylés (Ac-LDL), (Dil pour 1, 1'-dioctadécyl-3, 3, 3,'3'-tétraméthylindo-carbocyanine- perchlorate), - sélection de transfectants exprimant de manière contemporaine le récepteur et une molécule comme l'EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein). Dans ce cas, l'expression des deux molécules recombinantes (EGFP et récepteur LOX-1) est sous le contrôle d'un même promoteur, les ADNc sont séparés par une séquence IRES qui permet la synthèse de deux protéines à partir d'un seul ARNm. Dans ce cas, toute cellule

exprimant la EGFP exprime de manière contemporaine le récepteur LOX-1.

Les clones exprimant le plus fortement le récepteur LOX-1 recombinant seront sélectionnés par cytofluorométrie (utilisation d'un trieur de cellules), par exemple. Les transfectants seront maintenus en culture en présence de l'agent de sélection.

b. Création de la banque d'expression
L'ADN génomique bactérien est cassé mécaniquement afin d'obtenir des fragments d'une taille d'environ 1 kb. Les fragments d'ADN sont ensuite intégrés dans un vecteur d'expression présentant un double promoteur procaryote/eucaryote. Ce plasmide présente au moins les caractéristiques suivantes : une séquence codant pour un peptide signal en amont de l'ADN exogène et une séquence codant pour un Tag en aval de l'ADN exogène. Le Tag sera choisi sur la base de l'existence d'anticorps monoclonaux dirigés contre cette séquence Tag.

Après transformation avec les plasmides contenant les fragments d'ADN génomique, les bactéries contenant un ADN plasmidique sont sélectionnées (utilisation d'une résistance à un antibiotique exprimée par le plasmide) puis clonées. Les cellules eucaryotes (comme par exemple les cellules CHO ou HEK-293) seront transfectées par électroporation ou lipofection avec 10 plasmides (n=10). 24 heures après la transfection, le milieu de culture est changé et les cellules sont maintenues en culture dans un milieu sans FCS ni acides gras. Les surnageants sont ensuite collectés après 48 h de culture et concentrés. La production de protéines recombinantes solubles pourra être évaluée aisément par Dot-blotting. c. Identification des clones produisant une molécule se fixant à un récepteur LOX-1
Les surnageants de culture contenant les molécules recombinantes solubles sont incubés avec les différents clones stables exprimant les récepteurs LOX-1. Après lavage, les cellules sont incubées avec un anticorps fluorescent dirigé contre la séquence Tag choisie. La fluorescence sera ensuite analysée par cytofluorométrie. Après identification des groupes produisant une molécule soluble dirigée contre un récepteur LOX-1, chacun des plasmides contenu dans le groupe de 10 clones sera analysé individuellement afin d'identifier celui produisant la molécule d'intérêt. La nature de la protéine sera ensuite déterminée par séquençage du fragment d'ADN génomique. d. Production de la molécule recombinante
Dans le cas où la séquence présente dans le plasmide code pour la protéine entière, nous analyserons directement quelle molécule Tlr est impliquée dans la signalisation. Si la séquence présente dans le plasmide ne code pas pour la protéine

entière, le gène sera cloné en entier (détermination du cadre de lecture complet). Ceci pourra se faire de différentes manières : - si la séquence issue de la souche choisie est connue dans la littérature, la séquence complète sera amplifiée par PCR à l'aide de sondes oligonucléotidiques spécifiques, - si la séquence issue de la souche choisie n'est pas connue mais homologue à un gène déjà identifié dans une autre souche, la séquence complète sera amplifiée par PCR à l'aide de sondes oligonucléotidiques dégénérées, - si la séquence n'est pas connue dans les banques de données publiques, la séquence complète sera identifiée par séquençage de l'ADN génomique.

La séquence complète sera insérée dans un vecteur d'expression procaryotique en aval d'une séquence codant un Tag contre lequel des anticorps monoclonaux sont disponibles. Après sélection d'un clone produisant de manière élevée la protéine, la protéine sera produite selon des techniques connues d'homme de métier et purifiée par immunoprécipitation à l'aide d'un anticorps anti-Tag immobilisé sur une résine. La capacité de la molécule recombinante purifiée à se fixer au récepteur LOX-1 sera réévaluée par cytofluorométrie comme décrit ci-dessus.

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé d'identification de nouvelles molécules d'intérêt thérapeutique, caractérisé en ce qu'on sélectionne les molécules qui se lient à un récepteur LOX.

2. Procédé d'identification selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on sélectionne les molécules qui se lient à un récepteur LOX et qui en outre sont capables d'être intemalisées par une cellule présentatrice d'antigène, de préférence par une cellule dendritique immature.

3. Procédé d'identification selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact d'une molécule, ou d'un mélange de molécules, connue ou inconnue à tester avec un récepteur LOX, dans un milieu permettant la fixation éventuelle d'une molécule testée avec ledit récepteur LOX ; b) la mise en évidence de la fixation ou non de ladite molécule testée avec ledit récepteur

LOX ; et c) la sélection de cette molécule si sa fixation avec ledit récepteur LOX a été mise en évidence à l'étape b).

4. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape d) suivante : d) l'identification de la structure de la molécule sélectionnée à l'étape c) si celle-ci n'est pas connue.

5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la sélection des molécules capables de se lier au récepteur LOX est réalisée par une méthode choisie parmi les méthodes suivantes : - une chromatographie d'affinité, - une identification par FACS des molécules se liant à des cellules transfectées par un récepteur LOX, - une technique de type BIACOR, ou - un clonage par expression à partir d'une sonde portant un récepteur LOX.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit récepteur LOX est le récepteur LOX-1.

7. Procédé d'identification selon l'une des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que la capacité des molécules se liant à un récepteur LOX à être intemalisées par une cellule présentatrice d'antigène est mise en évidence par une méthode comprenant les étapes suivantes :

A) le marquage de ladite molécule sélectionnée se liant à un récepteur LOX par un marqueur susceptible de permettre la détection directe ou indirecte de la présence de ladite molécule ainsi marquée à la surface ou à l'intérieur d'une cellule ;

B) la mise en contact de ladite molécule marquée avec une cellule présentatrice d'antigène exprimant un récepteur LOX, dans un milieu permettant la fixation de ladite molécule marquée avec ledit récepteur LOX ;

C) la mise en évidence de l'intemalisation ou non de ladite molécule marquée par ladite cellule présentatrice d'antigène ; et

D) la sélection de cette molécule si l'intemalisation de ladite molécule marquée a été mise en évidence à l'étape C).

8. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de détermination de la capacité de ladite molécule ainsi identifiée d'être immunogène.

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour l'identification de nouvelles HSP ou des analogues d'HSP.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour l'identification de nouveaux adjuvants de l'immunité.

11. Complexe anticorps caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments capable de se fixer spécifiquement sur un épitope d'un récepteur LOX, ledit anticorps ou fragment étant associé à une substance biologiquement active.

12. Complexe selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit anticorps, ou l'un de ses fragments, et ladite substance biologiquement active sont associés par liaison covalente ou par affinité.

13. Complexe anticorps selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un élément de liaison qui lie ledit anticorps, ou l'un de ses fragments, et ladite substance biologiquement active.

14. Complexe anticorps selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que ladite substance biologiquement active est un immunogène, antigène ou haptène.

15. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable une molécule se liant à un récepteur LOX.

16. Composition selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle contient en outre un immunogène, antigène ou haptène.

17. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins un complexe anticorps selon l'une des revendications 11 à 14.

18. Composition selon la revendication 16, caractérisée en ce que ledit immunogène, antigène ou haptène, est choisi parmi les peptides, les glycopeptides, les lipopeptides, les poly-ou oligosaccharides, les acides nucléiques et les lipides.

19. Composition selon la revendication 18, caractérisée en ce que ledit immunogène, antigène ou haptène, dérive d'un virus, d'une bactérie, d'un parasite ou d'un champignon.

20. Composition selon la revendication 19, caractérisée en ce que ledit immunogène, antigène ou haptène, comprend au moins un peptide dérivé de microorganisme responsable de pathologies des voies aériennes choisi parmi le VRS, le para influenza virus (PIV), l'influenza virus, les hantavirus, les streptocoques, les pneumocoques, haemophilus influenza type b, les rhinovirus, les coronovirus et les méningocoques.

21. Composition selon la revendication 16, caractérisée en ce que l'immunogène, antigène ou haptène, associé est spécifique d'une cellule tumorale.

22. Composition selon l'une des revendications 15 à 21, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique ne contient pas d'adjuvant autre que la molécule se liant à un récepteur LOX.

23. Composition selon l'une des revendications 15 à 22, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité.

24. Utilisation d'une molécule se liant à un récepteur LOX, ou d'un anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments capable de se fixer spécifiquement

sur un épitope d'un récepteur LOX, comme porteur et/ou adjuvant pour la préparation d'un vaccin.

25. Utilisation d'une molécule ou d'un anticorps, ou l'un de ses fragments, selon la revendication 24, caractérisée en ce que ladite molécule ou ledit anticorps ou fragment, se lie à un récepteur LOX de cellules présentatrices d'antigènes et est internalisé dans lesdites cellules présentatrices d'antigènes.

26. Utilisation d'un complexe selon la revendication 14, pour la préparation d'un vaccin.

27. Utilisation d'un complexe selon la revendication 26, caractérisée en ce que ledit immunogène, antigène ou haptène, dudit complexe se lie à un récepteur LOX de cellules présentatrices d'antigènes et est intemalisé dans lesdites cellules présentatrices d'antigènes.

28. Utilisation selon l'une des revendications 24 à 27, pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers.

29. Utilisation d'une molécule se liant à un récepteur LOX ou d'un complexe selon la revendication 14, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre un agent infectieux ou une cellule tumorale.

30. Utilisation d'une molécule se liant à un récepteur LOX ou d'un complexe selon la revendication 14, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse T cytotoxique (CTL) contre un agent infectieux ou une cellule tumorale.

31. Utilisation d'au moins une molécule se liant à un récepteur LOX ou d'un complexe selon la revendication 14, pour la préparation d'une composition destinée au ciblage spécifique d'une substance biologiquement active qui lui est associée vers les cellules présentatrices d'antigènes.

32. Utilisation d'un complexe selon l'une des revendications 11 à 14, pour la préparation d'une composition destinée au ciblage spécifique des cellules présentatrices d'antigènes.

33. Utilisation selon la revendication 31 ou 32, caractérisée en ce que lesdites cellules présentatrices d'antigènes sont choisies parmi les cellules dendritiques, les macrophages, les lymphocytes B ou les monocytes, et préférentiellement parmi les cellules dendritiques immatures.

34. Utilisation selon la revendication 31, caractérisée en ce que ladite substance biologiquement active est un antigène ou haptène ou un facteur de croissance.

35. Utilisation d'une molécule se liant à un récepteur LOX à l'exception des HSP 60/65, ou d'un complexe selon l'une des revendications 11 à 14, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement prophylactique ou thérapeutique de l'artériosclérose.

36. Utilisation d'une molécule se liant à un récepteur LOX ou d'un complexe selon l'une des revendications 11 à 14, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement prophylactique ou thérapeutique de maladies liées au dysfonctionnement des récepteurs LOX ou au dysfonctionnement des ligands de ces récepteurs et plus particulièrement des HSP.

37. Utilisation selon l'une des revendications 24 à 36, caractérisée en ce que ladite molécule capable de se lier spécifiquement sur ledit récepteur LOX, de préférence le récepteur LOX-1, et, le cas échéant, capable d'être intemalisée après ladite fixation dans une cellule présentatrice d'antigène exprimant ledit récepteur LOX, est identifiée par un procédé selon l'une des revendications 1 à 10.