FR2816059A1

FR2816059A1 - Procede d'identification de nouvelles molecules se liant aux recepteurs scavenger et signalees via un recepteur toll

Info

Publication number: FR2816059A1
Application number: FR0013883A
Authority: FR
Inventors: Pascale Jeannin; Giovanni Magistrelli; Nathalie Herbault; Jean Yves Bonnefoy
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 2000-10-27
Filing date: 2000-10-27
Publication date: 2002-05-03
Anticipated expiration: 2020-10-27
Also published as: AU2002215079A1; FR2816059B1; WO2002035236A1

Abstract

L'invention concerne un procédé d'identification de nouvelles molécules se liant aux récepteurs scavenger et signalées via un récepteur Toll, tout comme l'utilisation de ces nouvelles molécules identifiées pour la préparation d'une composition pharmaceutique, notamment destinée au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires et fongiques ou au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers.

Description

La vaccination est un moyen efficace de prévenir ou de réduire les infections virales ou bactériennes. Le succès des campagnes de vaccination dans ces domaines a permis d'étendre le concept de vaccin jusqu'alors utilisé dans le domaine de l'infectiologie aux domaines du cancer et des maladies auto-immunes. Les antigènes vaccinaux administrés seuls chez l'hôte ne sont souvent pas assez immunogéniques pour induire une réponse immunitaire, et doivent donc être associés à un adjuvant ou couplés à une protéine porteuse pour induire (ou augmenter) leur immunogénicité.

Dans ces conditions, seule une réponse immune de type humorale peut être induite, réponse au cours de laquelle les antigènes exogènes sont présentés dans le contexte des molécules du MHC classe II aux lymphocytes T CD4.

Ainsi, de nouveaux porteurs ou adjuvants permettant d'augmenter ou d'induire l'immunogénicité sont constamment recherchés.

De plus, dans le cadre d'une thérapie antivirale, la génération de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) capables de reconnaître et de détruire le virus est de toute importance (Bachmann et al., 1994, Eur. J. Immunol., 24,2228-2236 ; Borrow P., 1997, J. Virol. Hepat., 4,16-24), comme l'attestent de nombreuses études montrant, in vivo, le rôle protecteur des réponses dirigées contre les épitopes viraux (Arvin AM, 1992, J. Inf. Dis., 166, S35-S41 ; Koszinowski et al., 1987 Immunol. Lett., 16,185- 192). L'importance des réponses CTL a aussi été fortement documentée dans les réponses antitumorales notamment celles dirigées contre les cellules de mélanome (revue dans Rivoltini et al., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18,55-63). Le ou les épitopes CTL (séquences peptidiques interagissant avec les molécules de classe 1 et présentées aux lymphocytes T CD8+) ont été définis pour plusieurs antigènes. Cependant, la difficulté réside dans la génération de CTL in vivo, due à la faible immunogénicité de

ces peptides (Melief, 1992, Adv. Cancer Res., 58, 143-175 ; Nandaz et Sercaz, 1995, Cell, 82, 13-17).

Des recherches s'orientent par conséquent vers l'identification de nouveaux adjuvants, ou de système de délivrance d'antigènes ( delivery system ), permettant d'induire des CTL. Grâce à leur efficacité à présenter les antigènes et à stimuler le système immunitaire, les cellules dendritiques, par exemple, ont été utilisées pour générer des réponses CTL antivirales (Ludewig B et al., 1998, J. Virol., 72,3812- 3818 ; Brossard P. et al., 1997, J. Immunol., 158,3270-3276) ou anticancéreuses (Nestle F. O. et al., 1998, Nat. Med., 4,328-332).

Les cellules dendritiques (DC) sont les cellules présentatrices d'antigène les plus efficaces et en particulier les seules capables d'initier une réponse CTL (Banchereau, J. et al., Dendritic cells and the control of immunity, Nature, 392,245- 252,1998, et Watts, C., Dendritic cells spill the beans, Nature Cell Biol., 1,152-154, 1999). Les DC sont la cible de nombreuses stratégies vaccinales (Timmerman J. M., et al., Dendritic cell vaccines for cancer immunotherapy, Annu. Rev. Med., 50,507- 529,1999). En effet, de nombreux arguments expérimentaux montrent que ce sont les DC immatures qui seraient capables dans certaines conditions de présenter les antigènes exogènes dans le CMH de classe 1 aux CTL. Les DC existent dans deux états de différentiation. Les DC présentes dans les tissus périphériques sont immatures et agissent comme des sentinelles qui capturent les antigènes exogènes. Après un contact avec les antigènes ou des signaux de stress, elles subissent un processus de maturation, acquièrent l'expression de nombreuses molécules de costimulation et migrent dans les ganglions ou elles présentent l'antigène aux lymphocytes T naïfs. Le phénomène de cross-présentation (encore connu sous le nom de cross-priming) qui permet à un antigène exogène d'accéder à une présentation dans les molécules des MHC classe 1 est actuellement très étudié (Yewdell J. W., et al., Mechanisms of exogenous antigen presentation by MHC class 1 molecules in vitro and in vivo : implications for generating CD8+ T cell responses to infectious agents, tumors, transplants, and vaccines, Adv. Immunol., 73,1-77, 1999). Il est actuellement admis que la façon dont l'antigène est capturé joue un rôle. Bien qu'il ait été observé que des antigènes internalisés par des moyens non spécifiques de type phagocytose ou

macropinocytose étaient dans certains cas présentés par des DC ou des macrophages dans le contexte des CMH classe I, il est maintenant admis que la capture des antigènes par le biais d'un récepteur favorise F accès des antigènes au cytosol des APC et donc à la présentation dans le CMH classe 1. Des exemples sont fournis par les immuncomplexes et les HSP qui sont capturés par les DC via des récepteurs spécifiques et qui sont présentés dans les molécules du CMH de classe 1 (Rodriguez

A., et al., Selective transport of internalized antigens to the cytosol for MHC class 1 presentation in dendritic cells, Nat. Cell Biol., 1,362-368, 1999).

Des approches vaccinales ont ainsi consisté à charger les cellules dendritiques ex vivo avec l'antigène d'intérêt (peptides ou lysat cellulaire) et réimplanter ces cellules chez le patient. D'autres approches consistent à transfecter ex vivo les cellules dendritiques avec le gène codant pour l'antigène d'intérêt et à réinjecter ces cellules transfectées (Gilboa E. et al., 1998, Cancer Immunol. Immunother., 46,82-87). Ces approches ont été utilisées avec succès chez la souris et chez l'homme (Hsu F. J. et al., 1996, Nat. Med., 2,52-58) mais restent néanmoins complexes dans la mesure où ces cellules doivent être traitées ex vivo (transformation des cellules ou internalisation des antigènes) et transplantées dans l'organisme hôte. De même, l'utilisation de particules de type viral (Layton G. T. et al., 1993, J. Immunol., 151,1097-1107) ou de l'adjuvant incomplet de Freund (IFA) (Valmori et al., Eur. J. Immunol., 1994,24, 1458-1462) permet de générer des réponses CTL. Toutefois, une vaccination antivirale ou antitumorale réalisée avec des peptides correspondant à des épitopes CTL et en présence d'un tel adjuvant peuvent conduire à un état de tolérance spécifique qui peut conduire dans certains cas à l'effet contraire recherché, c'est-à-dire à une diminution de la réponse immune (Toes et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1996,93, 7855-7860).

Ainsi, il existe aujourd'hui un grand besoin de disposer d'un composé qui, associé à une molécule, notamment un antigène ou haptène, soit capable de générer une réponse immunitaire, et notamment une réponse CTL, dirigée contre ladite molécule. Un tel composé pourrait en particulier être utilisé pour la préparation d'une composition vaccinale destinée à induire une protection immunitaire, notamment de type CTL, antiviral, antibactérienne, antifongique, antiparasitaire ou antitumorale.

On recherche également de nouvelle molécule pour le ciblage spécifique d'une substance biologiquement active vers les cellules présentatrices d'antigènes, telles que les cellules dendritiques, les macrophages, les lymphocytes B ou les monocytes.

En effet, on recherche des nouvelles molécules qui, associées avec une substance biologiquement active telle que des antigènes ou des facteurs de croissance cellulaire, peuvent se fixer spécifiquement sur les cellules présentatrices d'antigènes et/ou être intemalisées dans lesdites cellules et ainsi être capable d'exercer une activité thérapeutique modulée par l'intermédiaire des cellules présentatrices d'antigène.

Les scavengers récepteurs sont des protéines exprimées à la surface de nombreuses cellules et en particulier des cellules présentatrices d'antigènes professionnelles que sont les DC et les macrophages (Medzhitov R. et al., Innate immunity : impact on the adaptative immune response, Curr. Opin. Immunol., 9,4-9, 1997, et Lebecque S., Antigen receptors and dendritic cells, Vaccine 25,1603-1605, 2000). Ils lient notamment les lipoprotéines modifiées chimiquement. Plusieurs familles de scavengers récepteurs ont été identifiées, chaque famille pouvant contenir plusieurs membres. Ils lient un large panel de ligands différents. En particulier, certains scavengers récepteurs sont impliqués dans la réponse antibactérienne et lient des molécules bactériennes telles que le LPS ou l'acide lipotéchoique. La liaison est suivie par une endocytose de la molécule.

La demande EP 0 783 892 décrit une méthode pour augmenter l'immunogénicité dans laquelle un antigène et un ligand d'un récepteur scavenger sont conjugués à un adjuvant. La demande EP 0 808 899 a pour objet le récepteur scavenger humain Marco et décrit une méthode d'identification de composés qui se lient et qui activent ou inhibent ce récepteur. La demande WO 99/14329 divulgue quant à elle un nouveau récepteur Marco, nommé MCCOL.

La molécule Toll a été initialement décrite comme un récepteur transmembranaire chez la drosophile impliqué dans l'embryogénèse et la réponse antifongique. Une activation via Toll induit une interaction et la stimulation de molécules de signalisation intracellulaire homologue aux facteurs de transcription de NFkB, en aval du récepteur à l'interleukine-1 chez les mammifères. Une famille de récepteurs

humains structurellement identiques à la molécule Toll de la drosophile a été identifiée (Bowie A., et al., The interleukin-1 receptor/Toll-like receptor superfamily : signal generators for pro-inflammatory interleukins and microbial products, J. Leuk. Biol. 67,508-514, 2000 ; Muzion M., et al., Toll-like receptors, Microbes & infec., 2,251- 255,2000). Cette famille de molécules contient actuellement 6 membres. A l'exception de Tlr2 et Tlr4, les ligands ne sont pas connus. L'activation de Tlr2 et 4 est associée à une activation de NFkB ; la production de cytokines proinflammatoires. Les molécules Tlr2 et 4 jouent un rôle crucial dans la réponse à un signal de danger, en particulier en réponse à des agents étrangers comme les bactéries. De nombreux constituants bactériens, tels que des séquences d'ADN de type CPG ou des constituants de la paroi de type LPS, lipoprotéines ou LTA activent les APC et les cellules de l'innate immunity via les TIR. (Rescigno M. et al. Coordinated events during bacteria-induced DC maturation, Immunol. today, 20,200-203, 1999). En particulier les cellules dendritiques (Muzio M. et al., Differential expression and regulation of Toll-like receptors in human leukocytes : selective expression of TLR3 in dendritic cells, J. Immunol. 164,5998-6004, 2000) et les macrophages expriment de nombreux Tlr qui leur permettent de répondre aux agressions microbiennes.

Des récepteurs humains type TOLL sont décrits dans la demande WO 98/50547 qui a encore pour objet des ligands de ces récepteurs. Les demandes WO 99/20756 et WO 00/24776 décrivent également des homologues Humain Toll.

L'OmpA de Klebsiella pneumoniae, protéine majeure de la membrane externe (baptisée P40) présente une activité de protéine porteuse, par voie systémique, pour des antigènes sous-unitaires peptidiques (demandes de brevet WO 95/27787 et WO 96/14415 ; Haeuw et al., Eur. J. Biochem, 255, 1998,446-454 ; PlotnickyGilquin et al., J. Virol. 73, 1999,5637-5645) et polysaccharidiques (demande de brevet WO 97/41888 ; Rauly et al., Infect. Immun. 67,1999, 5547-5551).

Les HSP (Heat Shock Protein) sont des molécules chaperonnes qui contrôlent le repliement des protéines et évitent leur agrégation ; elles sont fortement conservées lors de l'évolution (Feldman, D. E., et al., Protein folding in vivo : the importance of molecular chaperones, Curr. Opin. Struct. Biol., 10,26-33, 2000). De nombreuses études ont démontré que les HSP peuvent être utilisées comme protéines porteuses et

favorisent une réponse immune contre des peptides ou des oligosaccharides (Lussow, A. R, et al., Mycobacterial heat-shock proteins as carrier molecules, Eur. J. Immunol., 21,2297-2302, 1991). Les HSP n'induisent pas de suppression épitopique (Barrios, C., et al., Mycobacterial heat-shock proteins as carrier molecules. II : The use of the 70-kDa mycobacterial heat-shock protein as carrier for conjugated vaccines can circumvent the need for adjuvants and Bacillus Calmette Guerin priming, Eur. J. Immunol., 22,1365-1372, 1992) et sont efficaces en absence d'adjuvant (Barrios et al., 1992) suggérant que les HSP peuvent être considérées comme des adjuvants en tant que tels (Blachere, N. E., et al., Heat shock protein-peptide complexes, reconstituted in vitro, elicit peptide-specific cytotoxic T lymphocyte response and tumor immunity, J. Exp. Med., 186,1315-1322, 1997).

L'utilisation potentielle des HSP en immunothérapie antitumorale est actuellement très étudiée (Srivastava, P. K., et al., Heat shock proteins corne of age : primitive functions acquire new roles in an adaptive world, Immunity, 8,657-665, 1998). Les HSP isolées des cellules tumorales engendrent une puissante réponse CTL CD8+ protectrice et spécifique de la tumeur (Srivastana, P. K., et al., Heat shock proteins transfer peptides during antigen processing and CTL priming, Immunogenetics, 39,93-98, 1994 ; Tamura, Y. et al., Immunotherapy of tumors with autologous tumor-derived heat shock protein preparations, Science, 278,117-120, 1997). Cette propriété provient de la capacité des HSP à se lier de façon non covalente à des peptides antigéniques spécifiques des tumeurs (Udono, H., et al., Heat shock protein 70-associated peptides elicit specifc cancer immunity, J. Exp. Med., 178, 1391-1396,1993 ; Tamura, Y., et al., 1997 ; Nieland, T. J., et al., Isolation of an immunodominant viral peptide that is endogenously bound to the stress protein GP96/GRP94, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93,6135-6139, 1996). Parmi les différentes HSP testées, gp96 (un homologue endoplasmique de la HSP90) et la HSP70 sont les plus utilisés dans des vaccins anti-tumoraux prophylactiques ou thérapeutiques contre différents types de tumeurs (Udono, H., et al., Comparison of tumor-specific immunogenicities of stress-induced proteins gp96, hsp90, and hsp70 ; J.

Immunol., 152,5398-5403, 1994 ; Tamura et al., 1997).

Il semblerait que la HSP 60 se liait au Tlr4 (T ! r pour ToU-Like Receptor , récepteur Toll apparenté ou récepteur de type Toll) (Ohashi K., et al., Cutting edge : heat shock protein 60 is a putative endogenous ligand of the toll-like receptor-4 complex, J. Immunol., 164 : 558-561,2000).

De manière surprenante, il a maintenant été mis en évidence que les OmpA et les HSP se liaient aux récepteurs scavenger. De manière encore plus surprenante, il a aussi été déterminé que ces mêmes molécules étaient en outre signalées via un récepteur Toll.

La présente invention a ainsi pour objet un procédé d'identification de nouvelles molécules d'intérêt thérapeutique, caractérisé en ce qu'on sélectionne les molécules qui se lient aux récepteurs scavengers et qui sont signalées via un récepteur Toll.

Ce procédé, et les nouvelles molécules sélectionnées, pourront ainsi répondre aux problèmes mentionnés ci-dessus, à savoir trouver de nouveaux porteurs ou adjuvants permettant d'augmenter ou induire l'immunogénicité notamment de type humorale, de nouveaux composés qui, associés à une molécule, notamment un antigène ou haptène, soient capables de générer une réponse CTL, tout comme de nouveaux composés capables de cibler les cellules présentatrices d'antigènes, de préférence celles exprimant un récepteur scavenger, et notamment les cellules dendritiques de préférence immatures.

Par cellules présentatrices d'antigènes (CPA ou APC), on entendra désigner dans la présente invention, les cellules CPA professionnelles formant partie intégrante du système immunitaire telles que les cellules dendritiques, les macrophages, les lymphocytes B ou les monocytes, notamment les cellules dendritiques immatures.

Dans la présente invention, on entendra désigner également par le terme peptides les protéines ou les polypeptides, termes qui seront ici employés indifféremment.

Selon l'invention, il est possible d'utiliser tout type de récepteur scavanger, de préférence d'origine humaine, et notamment les récepteurs SR-Al, SR-B1, SR-CI, Marco, LOX, notamment LOX-1, CD36. Les récepteurs décrits dans les demandes EP 0 783 892 et EP 0808 899 (séquences nucléotidiques SEQ ID Nol et SEQ ID No5,

et les séquences protéiques SEQ ID No2 et SEQ ID No6) et WO 99/14329 (séquence nucléotidique SEQ ID No2 et séquence protéique SEQ ID Nol) pourront être utilisés.

Pour les récepteurs LOX, on pourra également se référer aux récepteurs décrits dans les demandes WO 99/32520, WO 96/17058 (et particulièrement les séquences nucléiques SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, et les séquences protéiques SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6), US 5,510, 466, US 5,665, 872 (et particulièrement la séquence nucléique SEQ ID No. 1 et la séquence protéique SEQ ID No. 3) et US 5,521, 071 (et particulièrement la séquence protéique SEQ ID No. 2) pourront être utilisés.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le récepteur scavenger utilisé correspond au récepteur Marco, en particulier le récepteur Marco humain dont la séquence de l'ADNc codant pour ce récepteur est décrite dans la banque de données GenBank sous le numéro d'accession A. N. NM 006770 ou au récepteur LOX-1, en

particulier le récepteur LOX-1 humain dont la séquence de l'ADNc codant pour ce récepteur LOX-1 humain est décrite dans la banque de données GenBank sous le numéro d'accession A. N. AB 010710.

De même, tout type de récepteur Toll peut être utilisé. Ainsi, dans le cadre de la présente invention, le terme"récepteur Toll"désignera la molécule Toll de la drosophile tout comme les récepteurs humains structurellement identiques et notamment les récepteurs Tlr 1,2, 3,4, 5 ou 6. Les récepteurs humains type Toll décrits dans les demandes WO 98/50547 (séquences protéiques SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 22 et SEQ ID No. 34 et leurs séquences nucléiques codantes correspondantes), WO 99/20756 (SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 13) et WO 00/24776 pourront être utilisés.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le récepteur Toll utilisé correspond au récepteur Tlr 2 ou Tlr 4, en particulier le récepteur Tir 2 humain dont la séquence de l'ADNc codant pour ce récepteur est décrite dans la banque de données

GenBank sous le numéro d'accession A. N. U88878 ou Tlr 4 humain dont la séquence de l'ADNc codant pour ce récepteur est décrite dans la banque de données GenBank sous le numéro d'accession A. N. U88880.

Selon l'invention, on pourra également utiliser : - tout récepteur scavanger, de préférence d'origine humaine, notamment les récepteurs SR-Al, SR-BI, SR-C1, Marco, LOX, de préférence LOX-1, CD36 dont les séquences, nucléiques codantes ou d'acides aminés, présentent un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 90 %, 95 % et 99 % avec leur séquence sauvage, notamment les séquences dont il fait référence ci-avant ; - ou tout fragment de cesdits récepteurs scavenger comprenant le site de fixation à son ou à ses ligands naturels.

Selon l'invention, on pourra également utiliser :

- tout récepteur Toll, notamment les récepteurs humains structurellement identiques et de préférence les récepteurs Tir 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, dont les séquences, nucléiques codantes ou d'acides aminés, présentent un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 90 %, 95 % et 99 % avec leur séquence sauvage, notamment les séquences dont il fait référence ci-avant pour ces récepteurs ; - ou tout fragment de cesdits récepteurs Toll comprenant le domaine responsable de la médiation du signal d'activation des cellules.

Dans la présente description, par pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Le meilleur alignement ou alignement optimal est l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer, comme calculé ci-après, est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par fenêtre de comparaison pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Watennan (1981) [Ad. App. Math. 2 : 482], au moyen de l'algorithme d'homologie

locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48 : 443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou encore BLASTN ou BLASTX, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215,403, 1990).

Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenêtre de comparaison dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.

Les molécules à sélectionner (et, le cas échéant, à identifier si elles sont de structure inconnue ou si lesdites molécules sont sélectionnées à partir d'un mélange de composés connus ou inconnus) peuvent être choisies parmi toutes catégories de molécules naturelles ou synthétiques. Ainsi, l'invention n'est nullement limitée à un type de molécules à sélectionner mais également, et de préférence, permet d'identifier de nouveaux composés à partir de molécules très diverses, comme par exemple des molécules chimiques ou biologiques, des extraits cellulaires, notamment de bactéries, des extraits de plantes, etc..

On pourra, de façon préférée, tester des extraits membranaires, et plus préférentiellement solubles, de pathogènes (bactéries, parasites, etc. ) et de cellules eucaryotes, notamment humaines.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend les deux étapes distinctes suivantes (étapes réalisées séparément) : a) la sélection des molécules qui se lient aux récepteurs scavengers ; et

b) la sélection, parmi les molécules sélectionnées à l'étape a), des molécules qui fournissent un signal d'activation via un récepteur Toll.

De préférence, le procédé d'identification selon l'invention pour l'identification de nouvelles molécules d'intérêt thérapeutique se liant à un récepteur scavenger est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
1) la mise en contact d'une molécule, ou d'un mélange de molécules, connue ou inconnue à tester avec un récepteur scavenger, dans un milieu permettant la fixation éventuelle d'une molécule testée avec ledit récepteur scavenger ;
2) la mise en évidence de la fixation ou non de ladite molécule testée avec ledit récepteur scavenger ; et
3) la sélection de cette molécule si sa fixation avec ledit récepteur scavenger a été mise en évidence à l'étape 2).

Ledit récepteur scavenger, ou un de ses fragments comprenant son site de fixation spécifique, utilisé à l'étape 1) pourra être isolé ou purifié à partir de culture de cellules exprimant naturellement ce récepteur. De préférence, ledit récepteur scavenger utilisé à l'étape a), ou l'un de ses fragments comprenant son site de fixation spécifique, notamment sa fraction soluble dépourvue de son domaine transmembranaire, sera de nature recombinante, soit isolé et/ou purifié à partir de cultures de cellules hôtes transformées avec un ADN codant pour cedit récepteur, ou soit sous forme de cesdites cellules hôtes exprimant à leur surface ledit récepteur scavenger.

Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé d'identification selon l'invention, caractérisé en ce que la sélection des molécules capables de se lier au récepteur scavenger est réalisée par une méthode choisie parmi les méthodes suivantes : - une chromatographie d'affinité, - une identification par FACS des molécules se liant à des cellules transfectées par un récepteur scavenger ; - une technique de type BIACORE ; ou - un clonage par expression à partir d'une sonde portant un récepteur scavenger, tel qu'un screening en utilisant comme sonde une forme soluble d'un

récepteur scavenger, le domaine extracellulaire du récepteur scavenger pouvant être fusionné à une chaîne lourde d'immunoglobuline.

La technique dite de chromatographie d'affinité connue de l'homme du métier pourra être réalisée en utilisant des formes recombinantes des récepteurs scavenger, immobilisées sur une résine. Idéalement, les formes recombinantes des récepteurs scavenger, seront composées uniquement des domaines extracellulaires des formes recombinantes des récepteurs scavenger, fusionnées ou non à une séquence Tag (cmyc, His6, chaîne lourde de l'immunoglobuline yl murine, GST (Glutathion STransférase),...). Les molécules recombinantes pourront être produites en système procaryote ou eucaryote (cellules COS, CHO ou cellules d'insecte). Les molécules recombinantes seront fixées sur une résine adaptée en utilisant des techniques conventionnelles incluant le couplage chimique à une matrice de colonne appropriée telle que l'agarose, Affi Gel, ou d'autres matrices connues de l'homme de l'art. Les molécules à tester décrites ci-dessus telles que des extraits protéiques totaux issus de bactéries, parasites, virus, cellules eucaryotes pourront être incubés avec ces résines sont ensuite déposées sur la colonne. Les molécules interagissant avec ledit récepteur scavenger, sont retenues par la colonne et peuvent être isolées par élution.

L'identification par FACS ( Fluorescence Activated Cells Sorting ) est une technique connue de cytométrie en flux, et permet d'analyser la fixation de la molécule testée sur des transfectants stables exprimant un récepteur scavenger. Les transfectants stables peuvent être générés dans des cellules hôtes qui n'expriment peu ou pas de récepteur scavenger comme les cellules CHO. Pour identifier les molécules ayant la capacité de se fixer aux récepteurs scavenger, il sera possible de créer une banque d'expression. Brièvement, les ADNc ou l'ADN génomique issu de bactéries, parasites, cellules eucaryotes, etc., seront insérés dans un vecteur d'expression procaryote permettant la production de molécules recombinantes solubles et taggées (marquées) (idéalement, nous choisirons un Tag (ou marqueur) détectable par un anticorps compatible avec un screening par cytofluorométrie). Les molécules recombinantes produites par les clones bactériens seront sélectionnées sur la capacité à se fixer aux transfectants stables exprimant un récepteur scavenger. L'ADN plasmidique pourra ensuite être identifié par séquençage.

Dans d'autres méthodes, les molécules susceptibles d'interagir avec ledit récepteur scavenger, peuvent être liées à des marqueurs détectables tels que des marqueurs radioactifs, fluorescents ou enzymatiques. Ces molécules marquées sont mises en contact avec ledit récepteur scavenger immobilisé, dans des conditions permettant une interaction spécifique. Après élimination des molécules non fixées spécifiquement, les molécules liées sont détectées par des moyens appropriés.

La technologie du BIACORE peut également être utilisée pour effectuer le criblage de composés capables d'interagir avec ledit récepteur scavenger. Cette technologie permet de détecter des interactions entre molécules en temps réel sans utilisation de marquage. Elle est basée sur le phénomène de SPR (surface plasmon resonance). Un des principaux avantages de cette méthode est qu'elle permet la détermination des constantes d'association entre le récepteur et les molécules interagissant. Ainsi, il est possible de sélectionner spécifiquement les molécules interagissant avec de fortes ou de faibles constantes d'association.

Le clonage par expression peut aussi être effectué à partir d'une sonde constituée du domaine extracellulaire du récepteur scavenger, fusionné à un Tag, idéalement une chaîne lourde d'immunoglobuline murine. La détection de cette molécule pourra se faire à l'aide d'un anticorps anti-immunoglobuline murine marquée à un fluor, un fluorochrome (Alexa ou FITC) ou de billes magnétiques coatées avec un anticorps anti-Ig de souris. Les banques d'expression (procaryotique ou eucaryotique) construites avec de l'ADNc ou de l'ADN génomique provenant de bactéries, virus, parasites, cellules eucaryotes, etc., seront screenées à l'aide des formes recombinantes solubles des récepteurs scavenger. Les clones ainsi isolés pourront être identifiés par séquençage.

Par exemple, mais sans s'y limiter, on pourra également mettre en oeuvre dans les procédés d'identification selon l'invention une autre méthode d'identification de molécules capables d'interagir avec ledit récepteur scavenger, utilisant un système de double hybrides bactériens ou levures tel que le Matchmaker Two Hybrid System 2. Selon les instructions du manuel accompagnant le Matchmaker Two Hybrid System 2 (Catalogue ? Kl 604-1, Clontech), lorsque par exemple les molécules à tester sont des peptides non connus dont les ADNc sont clonés dans des banques de plasmides.

On peut également citer une autre méthode d'identification pour mettre en évidence l'interaction dudit récepteur scavenger, avec des petites molécules telles que celles générées par chimie combinatoire, mettant en oeuvre une microdialyse couplée à une HPLC ou une électrophorèse capillaire d'affinité, techniques connues de l'homme de l'art.

Dans un mode de réalisation préféré, le procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce que ledit récepteur scavenger est choisi parmi les récepteurs les récepteurs SR-Al, SR-B1, SR-C1, Marco, LOX, notamment LOX-1, CD36, de préférence d'origine humaine, et notamment les récepteurs dont les références aux documents et/ou ont été décrits ci-avant, de manière tout à fait préférée, le récepteur scavenger Marco, en particulier celui dont la séquence de l'ADNc codant pour ce récepteur est décrite dans la banque de données GenBank sous le numéro d'accession A. N. NM 006770 ou le récepteur LOX-1, en particulier celui dont la séquence de l'ADNc codant pour ce récepteur LOX-1 humain est décrite dans la banque de données GenBank sous le numéro d'accession A. N. AB 010710, ou les récepteurs dont la séquence peptidique ou nucléique présente au moins un des pourcentages d'identité préférés cités ci-avant, ou leur fragment comprenant le site de fixation de ces récepteurs.

Dans un mode de réalisation préféré, la deuxième étape b) du procédé d'identification selon l'invention comprend une étape d'identification de la molécule Toll associée à la signalisation cellulaire consécutivement à la fixation de la molécule identifiée sur le récepteur scavenger.

De préférence ladite deuxième étape b) comprend les étapes suivantes :
A) la mise en contact de ladite molécule sélectionnée à ladite première étape a) du procédé général en deux étapes avec une cellule exprimant ledit récepteur Toll, de préférence transfectée avec un acide nucléique codant pour ledit récepteur Toll et de préférence en outre avec un acide nucléique codant pour ledit récepteur scavenger ce dernier étant de préférence aussi identique au récepteur scavenger utilisé à l'étape a) ;

B) la mesure d'un marqueur significatif d'une activation cellulaire, de préférence médiée par ledit récepteur Toll, de manière plus préférée la mesure de la production d'une ou de plusieurs cytokines ;
C) la sélection de ladite molécule, si la mesure met en évidence la génération ou l'augmentation d'une activité cellulaire, de préférence par rapport à un contrôle témoin, de préférence le contrôle témoin est une cellule n'exprimant pas ledit récepteur Toll, mais pouvant, de préférence, exprimer ledit récepteur scavenger, motamment le récepteur scavenger utilisé à l'étape a).

L'activation cellulaire peut être mesurée en évaluant la production de cytokines, l'expression de molécules de surface ou par toute technique connue de l'homme du métier à cet effet. On pourra ainsi notamment utiliser des transfectants stables exprimant conjointement le scavenger récepteur et un des Tlr, qui seront incubés avec la molécule identifiée.

Pour ce faire, il est possible d'incuber la molécule testée avec les transfectants et de suivre la production de cytokines (par exemple par ELISA), l'activation du facteur de transcription NF-kB (activation associée à la production de cytokines pro-inflammatoires) ou la modulation d'expression de molécules de surface (par exemple la molécule ICAM-1).

Il est aussi possible de mesurer un flux calcique (associé à la signalisation cellulaire) par une technique fluorométrique.

Les cellules transfectées sont obtenues à partir de cellules couramment utilisées à cet effet, telles que les cellules CHO, Cos ou HEK 293. Elles peuvent être transfectées de façon stable ou transitoire.

Dans un mode de réalisation préféré, le procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce que ledit récepteur Toll est choisi parmi les récepteurs Toll apparentés Tlr 1,2, 3,4, 5 et 6, de préférence d'origine humaine, et notamment les récepteurs dont les références aux documents et/ou ont été décrits ci-avant, de manière tout à fait préférée le récepteur Tlr 2, en particulier celui dont la séquence de l'ADNc codant pour ce récepteur est décrite dans la banque de données GenBank sous

le numéro d'accession A. N. U88878 ou le récepteur Tlr 4, en particulier celui dont la séquence de l'ADNc codant pour ce récepteur humain est décrite dans la banque de

données GenBank sous le numéro d'accession A. N. U8888, ou les récepteurs dont la séquence peptidique ou nucléique présente au moins un des pourcentages d'identité préférés cités ci-avant, ou leur fragment Toll comprenant le domaine responsable de la médiation du signal d'activation des cellules.

Sous un autre aspect de l'invention, le procédé d'identification selon l'invention est, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre en une seule étape a).

Dans un mode de réalisation préféré, le procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce que l'unique étape a) met en oeuvre une cellule cotransfectée par un récepteur scavenger et un récepteur Toll.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, cette seule étape met en oeuvre une cellule cotransfectée par un récepteur scavenger et un récepteur Toll à l'aide d'un vecteur d'expression eucaryotique permettant l'expression concomitante et à des niveaux équivalents des deux molécules recombinantes.

Dans un mode de réalisation préféré, le procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce que l'étape a) comprend les étapes suivantes :
X) la mise en contact d'une molécule, ou d'un mélange de molécules, connue ou inconnue, à tester avec une cellule hôte cotransfectée avec un acide nucléique codant pour un récepteur scavenger et un acide nucléique codant pour un récepteur Toll., dans un milieu permettant la fixation éventuelle de la ou desdites molécules testées avec ledit récepteur scavenger et/ou l'activation cellulaire éventuelle de ladite cellule médiée par ledit récepteur Toll ;
Y) la mise en évidence de l'activation cellulaire de ladite cellule médiée par ledit récepteur Toll par la mesure d'au moins un marqueur significatif d'une activation cellulaire, de préférence médiée par ledit récepteur Toll ; et
Z) la sélection de cette molécule si ladite mesure à l'étape Y) met en évidence la génération ou l'augmentation de ladite activité cellulaire mesurée, de préférence par rapport à un contrôle témoin.

Dans un mode de réalisation préféré, le procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce que lesdits récepteurs Toll et scavenger, lesdits marqueurs de mesure d'activité cellulaire utilisés sont de préférence ceux indiquées pour le procédé en deux étapes tels que décrits ci-avant.

Dans un mode de réalisation préféré, le procédé d'identification en une étape ou en deux étapes selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape d'identification de la structure de la molécule sélectionnée si celle-ci n'est pas connue.

En effet, il sera possible d'utiliser dans les procédés selon la présente invention, une molécule à tester, prise de manière isolée et dont la structure n'est pas connue, ou un mélange de molécules à tester connues ou inconnues, dont les étapes du procédé ci-avant décrit permettront seulement d'identifier leur capacité fonctionnelle.

Ladite étape d'identification de la structure aura pour objectif d'identifier la structure de la molécule inconnue ayant cette capacité, ou d'identifier parmi l'ensemble des molécules connues testées simultanément celle (s) présentant cette capacité.

Par exemple, de telles molécules à tester, seules ou en mélange, pourront être issues de synthèse chimique par chimie combinatoire, de banques de clones d'expression de peptides ou d'extraits naturels contenant des mélanges complexes.

Les molécules sélectionnées pourront ensuite être analysées, si nécessaire, par toute méthode d'analyse permettant de définir la structure d'un composé chimique ou biochimique connue de l'homme de l'art telle que, sans s'y limiter, par spectrométrie de masse, HPLC, infrarouges et/ou par RMN (Résonance Magnétique Nucléaire).

Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé d'identification en une ou deux étapes selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de détermination de la capacité de ladite molécule ainsi identifiée d'être immunogène.

Dans ce mode préféré de réalisation de l'invention, après avoir réalisé le procédé selon l'invention, on effectue une étape supplémentaire consistant à analyser ou évaluer l'immunogénicité de la molécule sélectionnée.

Pour ce faire, on peut coupler un haptène (par exemple le TNP (Trinitrophényl)) ou antigène tel qu'un oligosaccharide, un lipide ou un peptide à la

molécule identifiée. Des souris sont ensuite injectées par voie intra péritonéale ou sous-cutanée selon des protocoles connus de l'homme de métier. La production d'Ac anti-haptène, -oligosaccharide, -lipide ou-peptide est analysée par ELISA.

On pourra également évaluer la capacité de ladite molécule sélectionnée à générer et/ou à augmenter la réponse immune de type CTL par mesure de l'activité cytotoxique de cellules effectrices de type lymphocyte générées après immunisation avec ladite molécule sélectionnée, la mesure du pourcentage de lyse de cellules coincubées avec lesdites cellules effectrices étant par exemple évaluée par le taux de relargage de 51Cr comme décrit par exemple, mais sans s'y limiter, dans la demande de brevet WO 00/48628 ou WO 00/48629 aux exemples 4 et 5.

Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé d'identification selon l'invention, caractérisé pour l'identification de nouvelles HSP, de nouvelles Omp ou leurs analogues.

Par analogue d'HSP ou d'OmpA ( Outer Membrane Protéine de type A ), on entend désigner ici des composés capables d'exercer au moins l'une des fonctions d'adjuvant de l'immunité, et/ou de protéine porteuse favorisant une réponse immune efficace contre des peptides ou des oligosaccharides, notamment en absence d'adjuvant, notamment une réponse de type CTL, telle que décrite ci-avant dans le paragraphe concernant les HSP ou les OmpA.

Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé d'identification selon l'invention, pour : - l'identification en particulier de nouveaux adjuvants de l'immunité ; et/ou - l'identification de molécule capable de cibler un composé tel qu'une substance à activité biologique, notamment un antigène ou haptène, qui lui est associé, de préférence par couplage covalent ou par affinité, vers une cellule exprimant ledit récepteur scavenger et dont l'activité cellulaire est médiée pat un récepteur Toll apparentée, ledit composé associé à la molécule étant de préférence intemalisée dans la cellule ciblée ; et/ou

- l'identification de molécule destinée à moduler l'activité biologique de composé (ou substance) qui lui est associé par l'intermédiaire des cellules exprimant ledit récepteur scavenger et dont l'activité cellulaire est médiée pat un récepteur Toll

apparentée, notamment les cellules présentatrices d'antigène comme les cellules dendritiques immatures ; et/ou - l'identification de molécule destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre un antigène ou haptène qui lui est associé ; et/ou - l'identification de molécule destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire de type T cytotoxique ; et/ou - l'identification de molécule destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre un agent infectieux ou une cellule tumorale.

Un objet de l'invention concerne également de nouvelles molécules susceptibles d'être obtenues par la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention, telle que décrite ci-dessus. Ces nouvelles molécules susceptibles d'être obtenues par la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention n'englobent pas les ligands connus à ce jour qui seraient susceptibles de se lier aux récepteurs scavenger et signalées via un récepteur Toll tels que les HSP, les lipoprotéines telles que les OspA, l'OmpA de Klebsiella pneumoniae et le pEA (pseudomonas Exotoxin A).

Ainsi, la méthode selon l'invention pourra notamment être utilisée pour identifier de nouvelles HSP ou de nouvelles Omp.

Ces nouvelles molécules ainsi identifiées pourront être utilisées de la même façon que les HSP ou les Omp, notamment l'OmpA de Klebsiella pneumoniae dénommé P40 dont l'utilisation comme protéine adjuvante et/ou porteuse pour induire ou augmenter la réponse immune de type humoral ou CTL a été décrite en particulier dans de nombreux brevets et ainsi bien connue de l'homme de l'art, et de façon tout à fait particulière lorsque ladite P40 est associée à un antigène tumoral ou issu d'un agent infectieux.

L'invention a encore pour objet une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins une molécule se liant aux récepteurs scavenger et signalée via un récepteur Toll, et préférentiellement au moins une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention.

De préférence, ces molécules utilisées dans une composition pharmaceutique sont différentes des HSP, des lipoprotéines telles que les OspA, de l'OmpA de Klebsiella pneumoniae et du pEA.

L'invention a également pour objet la composition selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique comprend en outre, un antigène, immunogène ou haptène.

Par immunogène, antigène ou haptène , on entend notamment désigner tout composé exprimé par un agent infectieux, tel un virus, une bactérie, une levure, un champignon ou un parasite, par une cellule tumorale, ou un de leurs analogues structuraux, qui seul ou en association avec un adjuvant ou porteur est capable d'induire une réponse immunitaire spécifique dudit agent infectieux ou de ladite cellule tumorale.

On entend également désigner par"immunogène, antigène ou haptène"dans la présente description un composé présentant une analogie structurale avec ledit antigène ou haptène capable d'induire une réponse immunologique dirigée contre ledit antigène ou haptène dans un organisme préalablement immunisé avec ledit composé analogue.

Ledit antigène ou haptène peut notamment être choisi parmi les protéines, les glycopeptides, les lipopeptides, les polysaccharides, les oligosaccharides, les acides nucléiques et les lipides.

Dans une forme de réalisation de l'invention, ledit antigène, immunogène ou haptène dérive d'un virus, d'une bactérie, d'un parasite ou d'un champignon.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un peptide dérivé de micro-organisme responsable de pathologies des voies aériennes choisi parmi le VRS, le para influenza virus (PIV), l'influenza virus, les hantavirus, les streptocoques, les pneumocoques, haemophilus influenza type b, les rhinovirus, les coronovirus et les méningocoques.

L'antigène, immunogène ou haptène peut être associé ou spécifique d'une cellule tumorale.

Parmi les cancers dont les tumeurs expriment un antigène tumoral associé pouvant être prévenus ou traités par les utilisations selon la présente invention, on peut citer en particulier, mais sans s'y limiter : * le cancer du sein, du poumon, du colon, et le carcinome gastrique (Kawashima et al., 1999, Cancer Res. 59 : 431-5) ;

* le mésothéliome, l'ostéosarcome, les cancers du cerveau (Xie et al., 1999, J. Natl. Cancer. Inst. 91 : 169-75) ; * le mélanome (Zheuten et al., 1998, Bratilsl. Lek. Listy 99 : 426-34) ; * l'adénome cystique du pancréas (Hammel et al., 1998, Eur. J. gastroenterol. Hepatol. 10 : 345-8) ;

* le cancer colorectal (Ogura et al., 1998, Anticancer Res. 18 : 3669-75) ; * le carcinome des cellules rénales (Jantzer et al., 1998, Cancer Res.

58 : 3078-86) ; et * le cancer de l'ovaire et du cervix (Sonoda et al., 1996, Cancer.

77 : 1501-9).

Les compositions selon l'invention peuvent contenir en outre un adjuvant. Ce dernier peut notamment être choisi parmi le MPL-A, le Quil-A, l'ISCOM, le Dimethyl Dioctadécyl Ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC), les CpG, la Leif, la CT (Toxoïde tétanique), la LT (Heat Labil Toxine) et les versions détoxifiées de la CT ou la LT.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la composition pharmaceutique selon l'invention ne contient pas d'adjuvant autre que la molécule se liant aux récepteurs scavengers et signalée via un récepteur Toll, et notamment aucun autre adjuvant permettant d'induire ou d'augmenter l'immunogénicité ou une réponse CTL.

Au sens de la présente invention, le milieu pharmaceutiquement acceptable est le milieu dans lequel les composés de l'invention sont administrés, préférentiellement un milieu injectable chez l'homme. Il peut être constitué d'eau, d'une solution aqueuse saline ou d'une solution aqueuse à base de dextrose et/ou de glycérol.

L'invention comprend également une composition selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité ; ainsi, elle peut être véhiculée sous forme de liposomes, virosomes, nanosphères, microsphères ou microcapsules.

L'utilisation d'une molécule se liant aux récepteurs scavengers et signalée via un récepteur Toll, et préférentiellement d'une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention comme porteur et/ou adjuvant dans un vaccin constitue un autre objet de l'invention.

De préférence, ces molécules utilisées comme porteur et/ou adjuvant dans un vaccin sont différentes des HSP, des lipoprotéines telles que les OspA, de l'OmpA de Klebsiella pneumoniae et du pEA.

L'invention concerne encore l'utilisation d'une molécule se liant aux récepteurs scavenger et signalée via un récepteur Toll, et préférentiellement d'une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention, pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers.

De préférence, ces molécules utilisées pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers sont différentes des HSP, des lipoprotéines telles que les OspA, de l'OmpA de Klebsiella pneumoniae et du pEA.

L'invention a encore pour objet l'utilisation d'une molécule se liant aux récepteurs scavenger et signalée via un récepteur Toll, et préférentiellement d'une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre un agent infectieux ou une cellule tumorale.

De préférence, ces molécules utilisées pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre un agent infectieux ou une cellule tumorale sont différentes des HSP, des lipoprotéines telles que les OspA, de l'OmpA de Klebsiella pneumoniae et du pEA.

La présente invention est aussi relative à l'utilisation d'une molécule se liant aux récepteurs scavenger et signalée via un récepteur Toll, et préférentiellement d'une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou à accroître une réponse T cytotoxique contre un agent infectieux ou une cellule tumorale. On pourra utiliser de telles compositions en thérapies ex vivo ou in vivo.

De préférence, ces molécules utilisées pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou à accroître une réponse T cytotoxique contre un agent infectieux ou une cellule tumorale sont différentes des HSP, des lipoprotéines telles que les OspA, de l'OmpA de Klebsiella pneumoniae et du pEA.

L'invention concerne encore l'utilisation d'une molécule se liant aux récepteurs scavenger et signalée via un récepteur Toll, et préférentiellement d'une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention, pour le ciblage spécifique d'une substance biologiquement active qui lui est associé vers les cellules présentatrices d'antigènes.

De préférence, ces molécules utilisées pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou à accroître une réponse T cytotoxique contre un agent infectieux ou une cellule tumorale sont différentes des HSP, des lipoprotéines telles que les OspA ( Outer Surface Protein ), de l'OmpA de Klebsiella pneumoniae et du pEA.

Dans l'utilisation selon l'invention, la nouvelle molécule peut se fixer spécifiquement sur les cellules présentatrices d'antigènes et/ou être intemalisée dans lesdites cellules.

Par cellules présentatrices d'antigènes ou APC, on entendra désigner dans la présente invention, les APC professionnelles formant partie intégrante du système immunitaire telles que les cellules dendritiques, les macrophages, les lymphocytes B

ou les monocytes. De préférence, l'invention concerne l'utilisation pour le ciblage vers les cellules dendritiques.

Par substance biologiquement active, on entend désigner tout composé capable d'exercer une activité thérapeutique et dont l'activité peut être modulée par l'intermédiaire des cellules APC. Comme exemple de telles substances biologiquement actives, on peut citer sans s'y limiter les composés immunogènes tels que des antigènes ou haptènes de nature protéique, poly ou oligosaccharidique, glycoprotéique ou lipoprotéique.

Par substance biologiquement active, on entend encore désigner tout composé capable de modifier l'activité fonctionnelle des cellules APC, en particulier leur croissance, leur différentiation ou leur système d'expression. On peut citer comme exemple de tels composés, sans s'y limiter, les facteurs de croissance cellulaire dont les cytokines (IL-4, IL-3, GM-CSF, TNF-alpha).

Ainsi, la substance biologiquement active peut être choisie parmi les protéines ou les peptides, les lipopeptides, les poly-ou oligosaccharides, les acides nucléiques, les lipides et, de manière générale, parmi l'ensemble des substances chimiques.

Enfin, la présente invention à pour objet l'ensemble des utilisations selon la présente invention caractérisées en ce que ladite molécule capable de se lier aux récepteurs scavenger et/ou signalée via un récepteur Toll, et, le cas échéant, capable d'être intemalisée après ladite fixation dans une cellule présentatrice d'antigène, est identifiée par un procédé en une ou deux étapes selon la présente invention.

Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.

Légende des figures :
La figure 1 correspond au profil obtenu par analyse au FACSavantage cytofluoromètre et démontre que des cellules CHO transfectées avec MARCO lient P40 de façon plus importante que des cellules transfectées avec CD83 utilisées comme contrôle négatif ou des cellules CHO non transfectées.

La figure 2 correspond à la quantification en IL-8 de cellules 293 et démontre la capacité des cellules 293 lorsqu'elles sont transfectées par Tlr2 ou Tlr4 à répondre aux OmpA.

Exemple 1 : Les Omp se lient à un récepteur scavanger
A. Génération des transfectants MARCO :
L'ADNc codant pour le récepteur scavenger MARCO (séquence identifiée dans la banque de données GenBank sous le Numéro d'accession A. N. NM006770) a été cloné dans un vecteur d'expression pEBS/PL contenant une séquence codant pour une protéine C accolée à la séquence insérée. Des cellules CHO (ATCC, Manassas, VA) ont été transfectées en utilisant la technique Effecten (Qiagen, Courtaboeuf, France) et cultivées dans un milieu DMEM supplémenté avec 10 % de FCS et sélectionnées à l'aide de l'hygromycine (commercialisés par Life Technologies).

Après cette étape de clonage, les cellules exprimant MARCO ont été sélectionnées en se basant sur l'expression de la protéine C utilisée comme marqueur, déterminée par Western blotting. Les cellules ont été lysées dans 10 mM de tampon phosphate pH 7.4 contenant 0,5 % de Nonidet P40 (Sigma) et des inhibiteurs de protéases (Boehringer Mannheim). Les protéines de 5x106 cellules ont été séparées par électrophorèse sur un gel à 10 % de polyacrylamide gel dans des conditions non réductrices, puis transférées sur une membrane de nitrocellulose (commercialisée par Biorad, Ivry sur Seine, France). Après saturation, les membranes ont été incubées en présence d'anticorps monoclonaux anti-protéine C (Roche Diagnostics, Meylan, France). Après lavage, les membranes ont été incubées avec des anticorps anti-immunoglobuline de souris marqués à la péroxydase (Dako, Glostrup, Denmark) ; les anticorps fixés ont été détectés en utilisant le système ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden).

B. Etude de la fixation de P40 au FACS :
Les macrophages ainsi générés sont incubés dans du tampon FACS (RPMI contenant 0,1 % de sérum albumine bovine) à 2 x 105 cellules par puits de 96 fonds pointus pendant 20 minutes en présence de différentes concentrations de P40 marqué avec de l'Alexa488 ou avec de la glycophorine A marquée par de l'Alexa488. Le

marquage à l'Alexa est réalisé comme décrit par le commerçant (Molecular Probes). Les cellules sont alors lavées en tampon FACS et analysées en utilisant un FACSvantage cytofluoromètre.

C. Résultats :
Les résultats décrits dans la figure 1 montrent que des cellules CHO transfectées avec MARCO lient P40 de façon plus importante que des cellules transfectées avec CD83 utilisées comme contrôle négatif ou des cellules CHO non transfectées.

Exemple 2 : Les Omp sont intemalisés par un récepteur scavanger L'intemalisation de P40 a été étudiée par microscopie confocale. Les macrophages humains sont incubés dans du tampon FACS (RPMI contenant 0,1 % de sérum albumine bovine) à 2 x 105 cellules par puits de 96 fonds pointus pendant 20

488 minutes en présence de 0. 5 mM P40 marqué avec de l'Alexa488, lavés puis incubés ou non à 37 C. Les macrophages sont finalement cytospinés et observés avec un microscope confocal en utilisant un microscope inversé LSM510 commercialisé par Zeiss muni d'un objectif apochromat plan 63 X. Dans certaines expériences, 150 mM de diméthyl amiloride (DMA) ont été ajoutés 10 minutes avant ajout de P40 ainsi que dans le tampon FACS utilisé. La fluorescence de l'alexa488 a été mesurée avec un filtre 530-30 nm après excitation avec un laser à ion argon a 488nm.

Exemple 3 : Les Omp stimulent les cellules via un récepteur Toll
A. Generation des transfectants Tlr
L'ADNc de Tir 2, Tlr 4 et CD14 (séquences respectivement identifiées dans la banque de données GenBank sous les Numéro d'accession A. N. U88878, U88880 et X06682) a été cloné dans le vecteur pCDNA3.1 (Invitrogen, Groningen, Hollande), par la suite utilisé pour transfecter des cellules 293 (ATCC) par lipofection tel que décrit ci-dessus.

B. Stimulation of Tlr-transfected cells
48 h après la transfection, les cellules ont été lavées et cultivées dans du milieu sans FCS, RPMI 1640 pendant 12 h. Après remplacement du milieu, les cellules ont été soit non stimulées, soit stimulées pendant 6 h avec 0.5 mM d'OmpA,

0. 5 mM de BB ou 100 pg ml-1 de LPS. L'IL-8 a ensuite été quantifiée par ELISA (R & D Systems) dans le surnageant obtenu après les 6 h.

C. Résultats
Comme décrit dans la figure 2, les cellules 293 lorsqu'elles sont transfectées par Tlr2 acquièrent la capacité de répondre aux OmpA. L'effet des OmpA ne requiert pas la présence de CD 14 comme c'est parfois le cas pour des lipoprotéines ou le LPS qui activent également les cellules via Tlr4.

Exemple 4 : Les HSP se lient à un récepteur scavanger
A. Génération des CD
Génération in vitro de cellules dendritiques humaines immatures.

Les cellules dendritiques humaines sont générées à partir de monocytes isolés du sang périphérique. Le sang est prélevé par leucophérèse en présence d'anticoagulant comme par exemple l'héparinate de lithium. Les cellules mononucléées (CMN) sont isolées de sujets sains par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque (densité=1, 077) (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suède).

Les cellules du sang sont centrifugées à 1500 rpm pendant 30 minutes à température ambiante. Les CMN, localisées à l'interface Ficoll-plasma, sont récupérées et lavées deux fois en présence de milieu RPMI 1640 (Life technologies, Cergy Pontoise, France). Les monocytes sont purifiés par sélection positive en utilisant un séparateur magnétique de cellules (MAss ; Miltenyi Biotex, Bergisch Gladbach, Allemagne) en accord avec les instructions du fabriquant. Les CMN sont incubées pendant 20

minutes à 4 C avec des billes magnétiques sur lesquelles sont fixées un anticorps monoclonal anti-CD14 humain. Après lavage, la suspension cellulaire plus billes est déposée sur une colonne et soumise à un champ magnétique. Après trois lavages, la colonne n'est plus soumise au champ magnétique et les monocytes sont collectés par gravitation. La pureté des monocytes est évaluée par cytofluorométrie (cytofluoromètre FACScan ; Becton Dickinson, Erembodegem, Belgique) sur la base des paramètres taille-granulosité des cellules. La pureté est supérieure à 98 %. Les monocytes sont ensuite mis en culture à la concentration de 5x1O6 cellules/ml dans le milieu suivant (dénommé par la suite milieu de culture complet) : milieu RPMI 1640 supplémenté de 10 % de sérum de veau foetal (chauffage à 56 C pendant 30 minutes),

2 mM de L-glutamine, 50 U/ml de pénicilline et 50 ug/ml de streptomycine (Life technologies) dans des plaques de culture 6 puits (Nunc, Roskilde, Danemark) à raison de 5 ml de milieu par puits. Les cellules sont activées avec 20 ng/ml d'IL-4 humaine recombinante et 20 ng/ml de GM-CSF humaine recombinante (R & D Systems, Abingdon, Royaume Uni). Après 6 jours de culture (37 C, 5 % C02 en atmosphère humide), le phénotype des cellules est défini par cytofluorométrie.

B. Analyse par FACS
Les cellules sont lavées dans du tampon FACS puis réparties dans des puits d'une plaque de culture 96 puits à fond conique à raison de 2x105 cellules dans un volume de 50 ml de tampon FACS. Puis les cellules sont incubées 10 min dans du tampon FACS en absence ou en présence de 100 mg/ml de sérum albumine bovine (SAB) ou de SAB maleylé. Après 10 min 10 mg/ml de HSP70 marqué à la biotine sont ajoutés. Après 20 min à 4 cm, les cellules sont lavées et incubées avec de l'avidine marquée FITC.

C. Résultats
La SAB maleylé inhibe la fixation des HSP70 aux DC alors que la SAB non maléylé n'a aucun effet. Cela indique que les HSP se lient à un récepteur scavanger.

Exemple 5 : Méthode d'identification de nouvelles molécules en deux étapes
La méthodologie décrite ci-dessous permet l'identification en deux étapes de molécules se liant à un SR et signalant via une molécule Tlr : - la première étape est une sélection des molécules ciblant un SR, - la deuxième étape sélectionne parmi ces molécules celles signalant via une molécule Tlr.

Dans l'exemple, nous présenterons une méthode d'identification de molécules d'origine bactérienne à l'aide d'une banque d'expression. Cette méthodologie est applicable à l'identification de molécules exprimées par n'importe quel organisme multicellulaire en utilisant des banques d'expression procaryotiques ou eucaryotiques et contenant soit des ADNc, soit de l'ADN génomique.

Génération de clones stables exprimant des SR.

Les ADNc codant pour les SR identifiés jusqu'à maintenant sont intégrés dans un vecteur d'expression eucaryotique en aval d'une séquence codant pour un peptide

signal (permettant de produire des molécules recombinantes solubles). Les cellules CHO sont transfectées par lipofection puis mises en culture avec un agent de sélection, comme par exemple l'hygromycine. La sélection de clones exprimant le transgène pourra se faire de différentes manières en fonction des sondes disponibles : - utilisation d'un anticorps monoclonal, couplé ou non à une molécule fluorescente, - utilisation de Dil-Ac-LDL fluorescent [une molécule étant définie comme un SR lorsqu'elle fixe les LDL modifés comme les LDL oxydés ou les LDL acétylés, respectivement Ox-LDL et Ac-LDL], - sélection de transfectants exprimant de manière contemporaine le SR et une molécule comme l'EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein). Dans ce cas, l'expression des deux molécules recombinantes (EGFP et SR) est sous le contrôle d'un même promoteur ; les ADNc sont séparés par une séquence IRES qui permet la synthèse de deux protéines à partir d'un seul ARNm. Dans ce cas, toute cellule exprimant la EGFP exprime de manière contemporaine le SR.

Les clones exprimant le plus fortement le SR recombinant seront sélectionnés par cytofluorométrie (utilisation d'un trieur de cellules), par exemple. Les transfectants seront maintenus en culture en présence de l'agent de sélection.

Création de la banque d'expression.

L'ADN génomique bactérien est cassé mécaniquement afin d'obtenir des fragments d'une taille d'environ 1 kb. Les fragments d'ADN sont ensuite intégrés dans un vecteur d'expression présentant un double promoteur procaryote/eucaryote.

Ce plasmide présente au moins les caractéristiques suivantes : une séquence codant pour un peptide signal en amont de l'ADN exogène et une séquence codant pour un Tag en aval de l'ADN exogène. Le Tag sera choisi sur la base de l'existence d'anticorps monoclonaux dirigés contre cette séquence Tag.

Après transformation avec les plasmides contenant les fragments d'ADN génomique, les bactéries contenant un ADN plasmidique sont sélectionnées (utilisation d'une résistance à un antibiotique exprimée par le plasmide) puis clonées. Les cellules eucaryotes (comme par exemple les cellules CHO ou HEK-293) seront transfectées par électroporation ou lipofection avec 10 plasmides (n=10). 24 heures après la

transfection, le milieu de culture est changé et les cellules sont maintenues en culture dans un milieu sans FCS ni acides gras. Les surnageants sont ensuite collectés après 48 h de culture et concentrés. La production de protéines recombinantes solubles pourra être évaluée aisément par Dot-blotting.

Identification des clones produisant une molécule se fixant à un SR.

Les sumageants de culture contenant les molécules recombinantes solubles sont incubés avec les différents clones stables exprimant les SR. Après lavage, les cellules sont incubées avec un anticorps fluorescent dirigé contre la séquence Tag choisie. La fluorescence sera ensuite analysée par cytofluorométrie. Après identification des groupes produisant une molécule soluble dirigée contre un SR, chacun des plasmides contenus dans le groupe de 10 clones sera analysé individuellement afin d'identifier celui produisant la molécule d'intérêt. La spécificité de fixation au SR sera évaluée contre tous les autres SR. La nature de la protéine sera ensuite déterminée par séquençage du fragment d'ADN génomique.

Production de la molécule recombinante.

Dans le cas où la séquence présente dans le plasmide code pour la protéine entière, nous analyserons directement quelle molécule Tlr est impliquée dans la signalisation. Si ce n'est pas le cas, le gène sera cloné en entier (détermination du cadre de lecture complet). Ceci pourra se faire de différentes manières : - si la séquence issue de la souche choisie est connue dans la littérature, la séquence complète sera amplifiée par PCR à l'aide de sondes oligonucléotidiques spécifiques, - si la séquence issue de la souche choisie n'est pas connue mais homologue à un gène déjà identifié dans une autre souche, la séquence complète sera amplifiée par PCR à l'aide de sondes oligonucléotidiques dégénérées, - si la séquence n'est pas connue dans les banques de données publiques, la séquence complète sera identifiée par séquençage de l'ADN génomique.

La séquence complète sera insérée dans un vecteur d'expression procaryotique en aval d'une séquence codant un Tag contre lequel des anticorps monoclonaux sont disponibles. Après sélection d'un clone produisant de manière élevée la protéine, la protéine sera produite selon des techniques connues d'homme de

métier et purifiée par immunoprécipitation à l'aide d'un anticorps anti-Tag immobilisé sur une résine. La capacité de la molécule recombinante purifiée à se fixer au SR sera réévaluée par cytofluorométrie comme décrit ci-dessus.

Identification de la molécule Tlr associée à la signalisation via le SR.

Les ADNc codant pour les molécules Tlrl à Tlr6 humaines seront clonés par PCR et insérés dans un vecteur d'expression contenant une séquence codant pour une séquence Tag, en l'occurrence la séquence FLAGTM (Sigma, St Louis, MO) de telle manière que la séquence FLAG soit exprimée à l'extrémité du domaine extracellulaire. Les transfectants stables exprimant le SR d'intérêt seront transfectés avec chacun des plasmides codant pour les Tlr. L'expression du Tlr sera évaluée par cytofluorométrie en utilisant en anticorps anti-FLAG. Les transfectants seront ensuite mis en culture en présence de la molécule recombinante d'intérêt. L'activation des cellules transfectées sera évaluée par la néosynthèse de médiateurs solubles aisément quantifiables par ELISA, comme par exemple l'interleukine-8 ou le TNFalpha.

Exemple 6 : Méthode en une étape
Dans ce cas, la sélection des molécules d'intérêt se fait sur des transfectants exprimant conjointement un SR et une molécule Tlr. Les banques d'ADNc ou d'ADN génomique ainsi que la production des protéines recombinantes solubles ont été décrites ci-dessus.

Deux approches sont possibles pour générer les transfectants exprimant de manière contemporaine un SR et une molécule Tlr : - les cellules sont transfectées par électroporation ou lipofection avec deux vecteurs, l'un codant pour le SR et l'autre pour la molécule SR ; dans ce cas, on choisira deux plasmides chacun codant pour une protéine de résistance à une drogue différente, - les cellules sont transfectées par électroporation ou lipofection avec un vecteur contenant les deux séquences d'intérêt séparées par une séquence IRES (voir

ci-dessus les propriétés de cette séquence). Dans ce cas, il faut cloner les SR en association avec chacune des séquences Tlr connues.

Dans les deux cas, la molécule Tlr exprime une séquence Tag FLAG à l'extrémité de son domaine extracellulaire. La sélection des clones exprimant

conjointement le SR et la molécule Tlr se fera par cytofluorométrie comme décrit cidessus en utilisant un anticorps monoclonal anti-FLAG (couplé à une molécule fluorescente) pour l'expression du SR et de la molécule fluorescente Dil-Ac-LDL pour l'expression de la molécule Tlr. Après transfection, les cellules sont cultivées en présence du ou des agents de sélection.

Les clones cellulaires sont ensuite utilisés dans les tests de screening comme décrit précédemment. Dans ce cas, le paramètre unique mesuré sera l'activation des cellules par les protéines recombinantes solubles (en mesurant par exemple la production d'IL-8 ou de TNFalpha par les transfectants).

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé d'identification de nouvelles molécules d'intérêt thérapeutique, caractérisé en ce qu'on sélectionne les molécules qui se lient aux récepteurs scavengers et qui sont signalées via un récepteur Toll.

2. Procédé d'identification selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les deux étapes distinctes suivantes : a) la sélection des molécules qui se lient aux récepteurs scavenger ; et b) la sélection, parmi les molécules sélectionnées à l'étape a), des molécules qui fournissent un signal d'activation via un récepteur Toll.

3. Procédé d'identification selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'étape a) comprend les étapes suivantes :

1) la mise en contact d'une molécule, ou d'un mélange de molécules, connue ou inconnue à tester avec un récepteur scavenger, dans un milieu permettant la fixation éventuelle d'une molécule testée avec ledit récepteur scavenger ;

2) la mise en évidence de la fixation ou non de ladite molécule testée avec ledit récepteur scavenger ; et

3) la sélection de cette molécule si sa fixation avec ledit récepteur scavenger a été mise en évidence à l'étape 2).

4. Procédé selon l'une des revendications 2 à 3, caractérisé en ce que la sélection des molécules capables de se lier au récepteur scavenger est réalisée par une méthode choisie parmi les méthodes suivantes : - une chromatographie d'affinité ; - une identification par FACS des molécules se liant à des cellules transfectées par un récepteur scavenger ; - une technique de type BIACORE ; ou - un clonage par expression à partir d'une sonde portant un récepteur scavenger.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit récepteur scavenger est choisi parmi les SR-Al, SR-B1, SR-C1, Marco, LOX, notamment LOX-1, CD36, de préférence d'origine humaine.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit récepteur scavenger est choisi parmi : - les récepteurs scavenger Marco ; - le récepteur Marco dont la séquence de l'ADNc codant pour ce récepteur est décrite dans la banque de données GenBank sous le numéro d'accession A. N. NM 006770 ; - leur fragment comprenant le site de fixation de ces récepteurs ; ou - les récepteurs dont la séquence peptidique ou nucléique présente au moins un pourcentage d'identité d'au moins 80 % avec ces récepteurs Marco ou leurs séquences d'ADNc.

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que la deuxième étape b) du procédé d'identification selon l'invention comprend une étape d'identification du récepteur Tol-associé à la signalisation cellulaire consécutivement à l'étape a).

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que la deuxième étape b) du procédé d'identification comprend les étapes suivantes :

A) la mise en contact de ladite molécule sélectionnée à ladite première étape a) avec une cellule exprimant ledit récepteur Toll ;

B) la mesure d'un marqueur significatif d'une activation cellulaire, de préférence médiée par ledit récepteur Toll ;

C) la sélection de ladite molécule, si ladite mesure à l'étape B) met en évidence la génération ou l'augmentation de ladite activité cellulaire mesurée, de préférence par rapport à un contrôle témoin.

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, caractérisé en ce que ladite cellule exprimant ledit récepteur Toll à l'étape A) est une cellule hôte transfectée avec un acide nucléique codant pour ledit récepteur Toll.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite cellule exprimant ledit récepteur Toll à l'étape A) est une cellule hôte transfectée en outre avec un acide nucléique codant pour un récepteur scavenger, de préférence ledit récepteur scavenger utilisé à l'étape a).

11. Procédé selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que ledit marqueur utilisé à l'étape B) est choisi parmi : - la mesure de la production d'une ou de plusieurs cytokines par ladite cellule utilisée à l'étape A) ; - la mesure de la modulation de l'expression de molécules de surface par ladite cellule utilisée à l'étape A) ; - la mesure de l'activation du facteur de transcription NF-kB par ladite cellule utilisée à l'étape A) ; - la mesure du flux calcique, de préférence par une technique fluorométrique.

12. Procédé selon l'une des revendications 8 à 11, caractérisé en ce que ledit marqueur utilisé à l'étape B) est la mesure de la production d'une ou plusieurs cytokines par ladite cellule utilisée à l'étape A).

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que ledit récepteur Toll est choisi parmi les récepteurs Toll Tlr 1,2, 3,4, 5 et 6, de préférence d'origine humaine.

14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que ledit récepteur Toll est choisi parmi :

- les récepteurs Toll Tlr 1 et Tlr 4 ; - le récepteur Toll Tlr 1 dont la séquence de l'ADNc codant pour ce récepteur est décrite dans la banque de données GenBank sous le numéro d'accession A. N. A. N. U88878 ; - le récepteur Toll Tlr 4 dont la séquence de l'ADNc codant pour ce récepteur est décrite dans la banque de données GenBank sous le numéro d'accession A. N. A. N. U88880 ; - leurs fragments comprenant le domaine responsable de la médiation du signal d'activation des cellules ; ou - les récepteurs dont la séquence peptidique ou nucléique présente au moins un pourcentage d'identité d'au moins 80 % avec ces récepteurs Toll Tlr 1 et Tlr 4 ou leurs séquences d'ADNc.

15. Procédé d'identification selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre en une étape a).

16. Procédé d'identification selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'unique étape a) met en oeuvre une cellule cotransfectée par un récepteur scavenger et un récepteur Toll.

17. Procédé d'identification selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'étape a) comprend les étapes suivantes :

X) la mise en contact d'une molécule, ou d'un mélange de molécules, connue ou inconnue, à tester avec une cellule hôte cotransfectée avec un acide nucléique codant pour un récepteur scavenger et un acide nucléique codant pour un récepteur Toll, dans un milieu permettant la fixation éventuelle de la ou desdites molécules testées avec ledit récepteur scavenger et/ou l'activation cellulaire éventuelle de ladite cellule médiée par ledit récepteur Toll ;

Y) la mise en évidence de l'activation cellulaire de ladite cellule médiée par ledit récepteur Toll par la mesure d'au moins un marqueur significatif d'une activation cellulaire, de préférence médiée par ledit récepteur Toll ; et

Z) la sélection de cette molécule si ladite mesure à l'étape Y) met en évidence la génération ou l'augmentation de ladite activité cellulaire mesurée, de préférence par rapport à un contrôle témoin.

18. Procédé d'identification selon l'une des revendications 16 et 17, caractérisé en ce que lesdits récepteurs Toll et scavengers, lesdits marqueurs de mesure d'activité cellulaire utilisés sont de préférence ceux indiqués pour le procédé en deux étapes selon l'une des revendications 2 à 14.

19. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape d'identification de la structure de la molécule sélectionnée si celle-ci n'est pas connue.

20. Procédé d'identification selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, utilisé pour identifier de nouvelles HSP, de nouvelles Omp ou leurs analogues.

21. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins une molécule se liant aux récepteurs scavengers et signalée via un récepteur Toll, ladite molécule étant identifiée par un procédé selon l'une des revendications 1 à 20.

22. Composition selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'elle contient en outre un antigène, immunogène ou haptène.

23. Composition selon la revendication 22, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène est choisi parmi les protéines, les peptides, les glycopeptides, les lipopeptides, les polysaccharides, les oligosaccharides, les acides nucléiques et les lipides.

24. Composition selon la revendication 22 ou 23, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène dérive d'un virus, d'une bactérie, d'une levure, d'un parasite ou d'un champignon.

25. Composition selon la revendication 24, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un peptide dérivé de microorganisme responsable de pathologies des voies aériennes choisi parmi le VRS, le para influenza virus (PIV), l'influenza virus, les hantavirus, les streptocoques, les pneumocoques, haemophilus influenza type b, les rhinovirus, les coronovirus et les méningocoques.

26. Composition selon la revendication 22, caractérisée en ce que l'antigène, immunogène ou haptène est associé ou spécifique d'une cellule tumorale.

27. Composition selon l'une des revendications 21 à 26, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique ne contient pas d'adjuvant autre que la molécule se liant aux récepteurs scavengers et signalée via un récepteur Toll.

28. Composition selon l'une des revendications 21 à 27, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité.

29. Utilisation d'une molécule se liant aux récepteurs scavengers et signalée via un récepteur Toll, ladite molécule étant identifiée par un procédé selon l'une des revendications 1 à 20 comme porteur et/ou adjuvant dans un vaccin.

30. Utilisation d'une molécule se liant aux récepteurs scavengers et signalée via un récepteur Toll pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou

thérapeutique des cancers, ladite molécule étant identifiée par un procédé selon l'une des revendications 1 à 20.

31. Utilisation d'une molécule se liant aux récepteurs scavengers et signalée via un récepteur Toll pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre un agent infectieux ou une cellule tumorale, ladite molécule étant identifiée par un procédé selon l'une des revendications 1 à 20.

32. Utilisation d'une molécule se liant aux récepteurs scavengers et signalée via un récepteur Toll pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse T cytotoxique contre un agent infectieux ou une cellule tumorale, ladite molécule étant identifiée par un procédé selon l'une des revendications 1 à 20.

33. Utilisation d'une molécule se liant aux récepteurs scavengers et signalée via un récepteur Toll pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au ciblage spécifique d'une substance biologiquement active qui lui est associée vers les cellules présentatrices d'antigènes, ladite molécule étant identifiée par un procédé selon l'une des revendications 1 à 20.

34. Utilisation selon la revendication 33, caractérisée en ce que lesdites cellules présentatrices d'antigènes sont choisies parmi les cellules dendritiques, les macrophages, les lymphocytes B ou les monocytes et préférentiellement parmi les cellules dendritiques.

35. Utilisation selon la revendication 33 ou 34, caractérisée en ce que ladite substance biologiquement active est un antigène ou haptène ou un facteur de croissance.

36. Utilisation selon l'une des revendications 33 à 35, caractérisée en ce que ladite substance biologiquement active est choisie parmi les protéines ou les peptides, les lipopeptides, les poly-ou oligosaccharides, les acides nucléiques, les lipides et les substances chimiques.

37. Utilisation selon l'une des revendications 33 à 36, caractérisée en ce que ladite molécule est capable d'être intemalisée après sa fixation dans une cellule présentatrice d'antigène.