WO2002035236A1 - Procede d'identification de nouvelles molecules se liant aux recepteurs scavengers et signalees via un recepteur toll - Google Patents

Procede d'identification de nouvelles molecules se liant aux recepteurs scavengers et signalees via un recepteur toll Download PDF

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WO2002035236A1
WO2002035236A1 PCT/FR2001/003352 FR0103352W WO0235236A1 WO 2002035236 A1 WO2002035236 A1 WO 2002035236A1 FR 0103352 W FR0103352 W FR 0103352W WO 0235236 A1 WO0235236 A1 WO 0235236A1
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molecule
toll
scavenger
molecules
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PCT/FR2001/003352
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Pascale Jeannin
Giovanni Magistrelli
Nathalie Herbault
Jean-Yves Bonnefoy
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Pierre Fabre Medicament
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the invention relates to a method for identifying new molecules which bind to scavenger receptors and which are signaled via a Toll receptor, as well as the use of these new identified molecules for the preparation of a pharmaceutical composition, in particular intended for prophylactic or therapeutic treatment.
  • Vaccination is an effective way to prevent or reduce viral or bacterial infections. The success of vaccination campaigns in these areas has made it possible to extend the concept of vaccine previously used in the field of infectious diseases to the fields of cancer and autoimmune diseases.
  • Vaccine antigens administered alone in the host are often not immunogenic enough to induce an immune response, and must therefore be combined with an adjuvant or coupled to a carrier protein to induce (or increase) their immunogenicity. Under these conditions, only a humoral type immune response can be induced, during which exogenous antigens are presented in the context of MHC class II molecules to CD4 T lymphocytes. Thus, new carriers or adjuvants making it possible to increase or induce immunogenicity are constantly sought.
  • cytotoxic T lymphocytes capable of recognizing and destroying the virus is of great importance (Bachmann et al., Eur. J. Immunol., 24, 2228- 2236, 1994; Borrow P., J. Virol. Hepat., 4, 16-24, 1997), as attested by numerous studies showing, in vivo, the protective role of responses directed against viral epitopes (Arvin AM, J. Inf. Dis., 166, S35-S41, 1992; Koszinowski et al., Immunol. Lett., 16, 185-192, 1987).
  • CTL cytotoxic T lymphocytes
  • CTL epitope peptide sequences interacting with class I molecules and presented to CD8 + T lymphocytes
  • the difficulty resides in the generation of CTL in vivo, due to the low immunogenicity of these peptides (Melief, Adv. Cancer Res., 58, 143-175, 1992; Nandaz and Sercaz, Cell, 82, 13-17, 1995).
  • DC Dendritic cells
  • CD Dendritic cells
  • CD are the most efficient antigen presenting cells and in particular the only ones capable of initiating a CTL response (Banchereau, J. et al., Nature, 392, 245-252, 1998, and Watts, C, Nature Cell Biol., 1, 152-154, 1999).
  • CD are the target of many vaccine strategies (Timmerman JM, et al., Annu. Rev. Med., 50, 507-529, 1999). Indeed, numerous experimental arguments show that it is the immature DCs which would be capable, under certain conditions, of presenting the exogenous antigens in the MHC class I to the CTLs.
  • DCs exist in two states of differentiation.
  • the DCs present in the peripheral tissues are immature and act as sentinels which capture exogenous antigens. After contact with antigens or stress signals, they undergo a maturation process, acquire the expression of numerous costimulation molecules and migrate into the ganglia where they present the antigen to naive T lymphocytes.
  • the cross-presentation phenomenon also known as cross-priming
  • MHC class I molecules The cross-presentation phenomenon which allows an exogenous antigen to access a presentation in MHC class I molecules is currently very much studied (Yewdell JW, et al., Adv. Immunol., 73, 1-77, 1999). It is currently recognized that the way the antigen is captured plays a role.
  • Vaccine approaches have thus consisted of loading the dendritic cells ex vivo with the antigen of interest (peptides or cell lysate) and re-implanting these cells in the patient.
  • Other approaches consist in transfecting the dendritic cells ex vivo with the gene coding for the antigen of interest and in reinjecting these transfected cells (Gilboa E. et al., Cancer Immunol. Immunother., 46, 82-87, 1998 ). These approaches have been successfully used in mice and in humans (Hsu FJ et al., Nat.
  • an antiviral or antitumor vaccination carried out with peptides corresponding to CTL epitopes and in the presence of such an adjuvant can lead to a specific state of tolerance which can lead in certain cases to the desired opposite effect, that is to say - say a decrease in the immune response (Toes et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 93, 7855-7860, 1996).
  • a compound could in particular be used for the preparation of a vaccine composition intended to induce immune protection, in particular of the CTL, antiviral, antibacterial, antifungal, antiparasitic or antitumour type.
  • New molecules are also being sought for the specific targeting of a biologically active substance towards antigen-presenting cells, such as dendritic cells, macrophages, B lymphocytes or monocytes.
  • the receptor scavengers are proteins expressed on the surface of numerous cells and in particular cells presenting professional antigens, namely DCs and macrophages (Medzhitov R. et al., Curr. Opin. Immunol., 9, 4-9 , 1997, and Lebecque S., Vaccine, 25, 1603-1605, 2000). In particular, they bind chemically modified lipoproteins.
  • EP 0 783 892 describes a method for increasing immunogenicity in which an antigen and a ligand of a scavenger receptor are conjugated to an adjuvant.
  • Application EP 0 808 899 relates to the human scavenger receptor Marco and describes a method of identifying compounds which bind and which activate or inhibit this receptor.
  • WO 99/14329 discloses a new Marco receiver, named MCCOL.
  • the Toll molecule was originally described as a transmembrane receptor in Drosophila involved in embryogenesis and the antifungal response. Activation via Toll induces interaction and stimulation of intracellular signaling molecules homologous to NFkB transcription factors, downstream of the interleukin-1 receptor in mammals.
  • a family of human receptors structurally identical to the Toll molecule of Drosophila has been identified (Bowie A., et al., J. Leuk. Biol. 67, 508-514, 2000; Muzion M., et al, Microbes & infec , 2, 251-255, 2000). This family of molecules currently contains 6 members. With the exception of Tir 2 and Tir 4, the ligands are not known.
  • Tir 2 and 4 The activation of Tir 2 and 4 is associated with an activation of NFkB; production of proinflammatory cytokines.
  • the Tir 2 and 4 molecules play a crucial role in the response to a danger signal, in particular in response to foreign agents such as bacteria.
  • Many bacterial constituents, such as CPG type DNA sequences or LPS type wall components, lipoproteins or LTA activate APCs and innate immunity cells via TIRs (Rescigno M. et al., Immunol. Today, 20, 200-203, 1999).
  • the dendritic cells Muzio M. et al., J. Immunol., 164, 5998-6004, 2000
  • macrophages express numerous Tir which allow them to respond to microbial aggressions.
  • TOLL type human receptors are described in application WO 98/50547 which also relates to ligands for these receptors.
  • Applications WO 99/20756 and WO 00/24776 also describe Human Toll counterparts.
  • the OmpA of Klebsiella pneumoniae a major protein of the outer membrane (called P40) exhibits carrier protein activity, systemically, for peptide subunit antigens (patent applications WO 95/27787 and WO 96/14415; Haeuw et al., Eur. J. Biochem., 255, 446-454, 1998; Plotnicky-Gilquin et al., J. Virol., 73, 5637-5645, 1999) and polysaccharides (patent application WO 97/41888; Rauly et al., Infect. Immun., 67, 5547-5551, 1999).
  • HSP Heat Shock Protein
  • HSPs are chaperone molecules that control the folding of proteins and prevent their aggregation; they are strongly conserved during evolution (Feldman, DE 3 et al., Curr. Opin. Struct. Biol., 10, 26-33, 2000). Numerous studies have demonstrated that HSPs can be used as carrier proteins and promote an immune response against peptides or oligosaccharides (Lussow, AR, et al, Eur. J. Immunol., 21, 2297-2302, 1991). HSPs do not induce epitopic suppression (Barrios, C, et al, Eur. J.
  • HSPs human immunotherapy
  • PK et al.
  • Immunogenetics 39, 93-98, 1994
  • Tamura Y. et al., Science, 278, 1 17-120, 1997
  • This property stems from the ability of HSPs to bind non-covalently to tumor-specific antigenic peptides (Udono, H., et al., J. Exp.
  • gp96 an endoplasmic homolog of HSP90
  • HSP70 the most used in anti-tumor vaccines prophylactic or therapeutic against different types of tumors (Udono, H., et al., J. Immunol., 152, 5398-5403, 1994; Tamura et al, 1997).
  • HSP 60 appears to bind to Tlr4 (Toll-Like Receptor, Toll-like Receiver or Toll-like Receiver) (Ohashi K., et al., J. Immunol., 164: 558-561, 2000 ).
  • the subject of the present invention is therefore a method of identifying new molecules of therapeutic interest, characterized in that the molecules which bind to the scavenger receptors and which are signaled via a Toll receptor are selected.
  • CPA protein presenting cells
  • APC professional CPA cells forming an integral part of the immune system such as dendritic cells, macrophages, B lymphocytes or monocytes, in particular dendritic cells. immature.
  • dendritic cells a part of the immune system
  • macrophages a part of the immune system
  • B lymphocytes a part of the immune system
  • monocytes a part of the immune system
  • dendritic cells forming an integral part of the immune system
  • dendritic cells such as dendritic cells, macrophages, B lymphocytes or monocytes, in particular dendritic cells. immature.
  • dendritic cells forming an integral part of the immune system
  • macrophages a part of the immune system
  • B lymphocytes a part of the immune system
  • monocytes a part of the immune system
  • dendritic cells a part of the immune system
  • dendritic cells a part of the immune system
  • macrophages
  • Protein means proteins or polypeptides, terms which will be used here interchangeably.
  • scavanger receptor preferably of human origin, and in particular the receptors SR-Al, SR-B 1, SR-C1, Marco, LOX, in particular LOX-1, CD36.
  • nucleotide sequences SEQ ID No. I and SEQ ID No. 5, and the protein sequences SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 6 and WO 99/14329 may be used.
  • LOX receptors reference may also be made to the receptors described in applications WO 99/32520 (human and bovine LOX-1 receptor respectively of peptide sequence SEQ ID No. 1 and No. 2, and their respective nucleic sequence SEQ ID No 5 and No.
  • WO 96/17058 and in particular the nucleic and protein sequences of the LOX receptors of bovine and human origin identified by the sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 3 in this document
  • US 5,510,466 whose nucleic and protein sequences are represented in FIGS. 3A to 4D of this document
  • US 5,665,872 and in particular the nucleic sequence SEQ ID No. 1 and the protein sequence SEQ ID No. 3
  • US 5,521,071 and in particular the nucleic sequence SEQ ID No. 1 and protein SEQ ID No.
  • the scavenger receptor used corresponds to the Marco receptor, in particular the human Marco receptor whose cDNA sequence coding for this receptor is described in the GenBank database under the number accession AN NM 006770 (whose nucleic and protein sequences are respectively represented by the sequences SEQ ID No. 1 and No.
  • Toll receptor will designate the Toll molecule of Drosophila just like structurally identical human receptors and in particular the Tir 1, 2, 3, 4, 5 or 6 receptors.
  • Human receptors Toll type described in applications WO 98/50547 protein sequences SEQ ID No. 4, SEQ ID No.
  • the Toll receptor used corresponds to the Tir 2 or Tir 4 receptor, in particular the human Tir 2 receptor whose cDNA sequence coding for this receptor is described in the GenBank database under accession number AN U88878 (whose nucleic and protein sequences are respectively represented by the sequences SEQ ID No. 5 and No. 6 in the list of sequences below) or Human Tir 4 whose cDNA sequence coding for this receptor is described in the GenBank database under the accession number AN U88880 (the nucleic and protein sequences of which are represented by the sequences SEQ ID No. 7 and No. 8 respectively in the sequence list below ).
  • any scavanger receptor preferably of human origin, in particular the receptors SR-A1, SR-B1, SR-Cl, Marco, LOX, preferably LOX-1, CD36 whose sequences, nucleic coding or amino acids, have a percentage identity of at least 80%, preferably at least 90%, 95% and 99% with their wild-type sequence, in particular the sequences to which it refers above;
  • any fragment of these said scavenger receptors comprising the site of attachment to its natural ligand (s).
  • any Toll receptor in particular structurally identical human receptors and preferably Tir 1, 2, 3, 4, 5 or 6 receptors, whose sequences, nucleic coding or amino acids, have a percentage identity of at least at least 80%, preferably at least 90%, 95% and 99% with their wild-type sequence, in particular the sequences of which it refers above for these receptors;
  • Toll receptors comprising the domain responsible for mediating the cell activation signal.
  • the term "percentage of identity" between two nucleic acid or amino acid sequences within the meaning of the present invention is intended to denote a percentage of identical nucleotides or amino acid residues between the two sequences. to compare, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed randomly and over their entire length.
  • the best alignment or optimal alignment is the alignment for which the percentage of identity between the two sequences to be compared, as calculated below, is the highest.
  • Sequence comparisons between two nucleic acid or amino acid sequences are traditionally carried out by comparing these sequences after having optimally aligned them, said comparison being carried out by segment or by "comparison window" to identify and compare the regions. sequence similarity locale.
  • the optimal alignment of the sequences for comparison can be achieved, besides manually, by means of the local homology algorithm of Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2: 482], using the local homology algorithm of Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443], using the similarity search method of Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444], using computer software using these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, or BLASTN or BLASTX, Altschul and al., J. Mol. Biol. 215,403,1990).
  • the percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences is determined by comparing these two optimally aligned sequences per comparison window in which the region of the nucleic acid or amino acid sequence to be compared. may include additions or deletions with respect to the reference sequence for optimal alignment between these two sequences.
  • the percentage of identity is calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide or the amino acid residue is identical between the two sequences, by dividing this number of identical positions by the total number of positions in the comparison window and multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage of identity between these two sequences.
  • the molecules to be selected can be chosen from all categories of natural or synthetic molecules.
  • the invention is in no way limited to a type of molecules to be selected but also, and preferably, makes it possible to identify new compounds from very diverse molecules, such as, for example, chemical or biological molecules, cell extracts, in particular bacteria, plant extracts, etc.
  • test membrane extracts and more preferably soluble, of pathogens (bacteria, parasites, etc.) and of eukaryotic cells, in particular human.
  • the identification method according to the invention is characterized in that it comprises the following two distinct stages (stages carried out separately): a) the selection of the molecules which bind to the scavengers receptors ; and b) the selection, among the molecules selected in step a), of the molecules which provide an activation signal via a Toll receptor.
  • the identification method according to the invention for the identification of new molecules of therapeutic interest which bind to a scavenger receptor is characterized in that it comprises the following steps:
  • Said scavenger receptor, or one of its fragments comprising its specific binding site, used in step 1) can be isolated or purified from a culture of cells expressing this receptor naturally.
  • said scavenger receptor used in step a), or one of its fragments comprising its specific binding site, in particular its soluble fraction devoid of its transmembrane domain will be of a recombinant nature, either isolated and / or purified to starting from cultures of host cells transformed with a DNA coding for said receptor, or either in the form of said host cells expressing on their surface said scavenger receptor.
  • the invention relates to an identification method according to the invention, characterized in that the selection of the molecules capable of binding to the scavenger receptor is carried out by a method chosen from the following methods:
  • a probe carrying a scavenger receptor such as a screening using as probe a soluble form of a scavenger receptor, the extracellular domain of the scavenger receptor being able to be fused to a heavy chain of immunoglobulin .
  • the technique known as affinity chromatography known to a person skilled in the art can be carried out using recombinant forms of the scavenger receptors, immobilized on a resin.
  • the recombinant forms of the scavenger receptors will be composed only of the extracellular domains of the recombinant forms of the scavenger receptors, fused or not with a Tag sequence (c- myc, His 6 , heavy chain of the murine ⁇ l immunoglobulin, GST (Glutathione S - Transferase), ).
  • the recombinant molecules can be produced in a prokaryotic or eukaryotic system (COS, CHO cells or insect cells).
  • the recombinant molecules will be fixed on a suitable resin using conventional techniques including chemical coupling to an appropriate column matrix such as agarose, Affi Gel, or other matrices known to those skilled in the art.
  • an appropriate column matrix such as agarose, Affi Gel, or other matrices known to those skilled in the art.
  • the test molecules described above such as total protein extracts from bacteria, parasites, viruses, eukaryotic cells can be incubated with these resins are then deposited on the column.
  • the molecules interacting with said scavenger receptor are retained by the column and can be isolated by elution.
  • FACS Fluorescence Activated Cells Sorting
  • cDNA or genomic DNA from bacteria, parasites, eukaryotic cells, etc. will be inserted into a prokaryotic expression vector allowing the production of soluble and tagged (tagged) recombinant molecules (ideally, we will choose a Tag (or tag) detectable by an antibody compatible with screening by cytofluorometry).
  • the recombinant molecules produced by the bacterial clones will be selected on the ability to bind to stable transfectants expressing a scavenger receptor.
  • the plasmid DNA can then be identified by sequencing.
  • the molecules capable of interacting with said scavenger receptor can be linked to detectable markers such as radioactive, fluorescent or enzymatic markers. These labeled molecules are brought into contact with said immobilized scavenger receptor, under conditions allowing a specific interaction. After elimination of the molecules which are not specifically fixed, the linked molecules are detected by appropriate means.
  • BIACORE technology can also be used to screen for compounds capable of interacting with said scavenger receptor.
  • This technology makes it possible to detect interactions between molecules in real time without the use of labeling. It is based on the phenomenon of SPR (surface plasmon resonance).
  • SPR surface plasmon resonance
  • Cloning by expression can also be carried out using a probe consisting of the extracellular domain of the scavenger receptor, fused to a Tag, ideally a heavy chain of murine immunoglobulin.
  • the detection of this molecule can be done using a murine anti-immunoglobulin antibody labeled with a fluorine, a fluorochrome (Alexa or FITC) or magnetic beads coated with an anti-mouse Ig antibody.
  • the expression libraries (prokaryotic or eukaryotic) constructed with cDNA or genomic DNA originating from bacteria, viruses, parasites, eukaryotic cells, etc., will be screened using the recombinant soluble forms of the scavenger receptors. The clones thus isolated can be identified by sequencing.
  • the identification methods according to the invention another method of identifying molecules capable of interacting with said scavenger receptor, using a system of double bacterial or yeast hybrids such as the Matchmaker Two Hybrid System 2.
  • a system of double bacterial or yeast hybrids such as the Matchmaker Two Hybrid System 2.
  • the molecules to be tested are unknown peptides whose cDNAs are cloned in plasmid banks.
  • Another method of identification can also be cited to demonstrate the interaction of said scavenger receptor with small molecules such as those generated by combinatorial chemistry, implementing a microdialysis coupled to an HPLC or a capillary affinity electrophoresis, techniques known to those skilled in the art.
  • the identification method according to the invention is characterized in that said scavenger receiver is chosen from the receivers SR-A l, SR-B l, SR-Cl, Marco, LOX, in particular LOX- 1, CD36, preferably of human origin, and in particular the receptors whose references to documents and / or have been described above, very preferably, the scavenger Marco receptor, in particular the receptor whose sequence of l CDNA coding for this receptor is described in the GenBank database under the accession number AN NM 006770 or the LOX-1 receptor, in particular the one whose cDNA sequence coding for this human LOX-1 receptor is described in the GenBank database under accession number AN AB 010710, or the receptors whose peptide or nucleic sequence has at least one of the preferred percentages of identity cited above, or their fragment comprising the site of fixation n of these receptors.
  • the second step b) of the identification method according to the invention comprises a step of identifying the Toll molecule associated with cell signaling following the binding of the identified molecule to the scavenger receptor.
  • said second step b) comprises the following steps:
  • control control is a cell not expressing said Toll receptor , but which can preferably express said scavenger receiver, in particular the scavenger receiver used in step a).
  • Cell activation can be measured by evaluating the production of cytokines, the expression of surface molecules or by any technique known to those skilled in the art for this purpose. It will thus be possible in particular to use stable transfectants jointly expressing the receptor scavenger and one of the Tir, which will be incubated with the identified molecule.
  • cytokines for example by ELISA
  • activation of the transcription factor NF-kB activation associated with the production of cytokines inflammatory
  • modulation of expression of surface molecules eg the ICAM-1 molecule
  • the transfected cells are obtained from cells commonly used for this purpose, such as CHO, Cos or HEK.293 cells. They can be transfected stably or transiently.
  • the identification method according to the invention is characterized in that said Toll receptor is chosen from the related Toll receptors Tir 1, 2, 3, 4, 5 and 6, preferably of human origin , and in particular the receptors whose references to documents and / or have been described above, very preferably the Tir 2 receptor, in particular the one whose cDNA sequence coding for this receptor is described in the library GenBank data under accession number AN U88878 or the Tir 4 receptor, in particular that whose cDNA sequence coding for this human receptor is described in the GenBank database under accession number AN U8888, or receptors whose sequence peptide or nucleic acid exhibits at least one of the preferred percentages of identity cited above, or their Toll fragment comprising the domain responsible for mediating the activation signal of the cells.
  • the identification method according to the invention is, characterized in that it is implemented in a single step ⁇ ).
  • the identification method according to the invention is characterized in that the single step ⁇ ) implements a cell cotransfected with a scavenger receptor and a Toll receptor.
  • this single step implements a cell cotransfected with a scavenger receptor and a Toll receptor using a eukaryotic expression vector allowing concomitant expression and at equivalent levels of the two recombinant molecules.
  • the identification method according to the invention is characterized in that the single step ⁇ ) implements a cell cotransfected with a scavenger receptor and a Toll receptor.
  • step ⁇ ) comprises the following steps:
  • the identification method according to the invention is characterized in that said Toll and scavengers receivers, said Cell activity measurement markers used are preferably those indicated for the two-step process as described above.
  • the one-step or two-step identification method according to the invention is characterized in that it further comprises a step of identifying the structure of the selected molecule if the latter n is not known.
  • test molecule taken in isolation and whose structure is not known, or a mixture of known or unknown test molecules, the steps of which of the process described above will only allow their functional capacity to be identified.
  • the objective of said structure identification step will be to identify the structure of the unknown molecule having this capacity, or to identify among the set of known molecules tested simultaneously that (s) exhibiting this capacity.
  • such molecules to be tested may be derived from chemical synthesis by combinatorial chemistry, from banks of peptide expression clones or from natural extracts containing complex mixtures.
  • the selected molecules can then be analyzed, if necessary, by any method of analysis which makes it possible to define the structure of a chemical or biochemical compound known to those skilled in the art such as, without being limited to, by spectrometry. mass, HPLC, infrared and / or by NMR (Nuclear Magnetic Resonance).
  • the invention relates to a one or two step identification method according to the invention, characterized in that it further comprises a step of determining the capacity of said molecule thus identified to be immunogenic.
  • an additional step is carried out consisting in analyzing or evaluating the immunogenicity of the selected molecule.
  • hapten for example TNP (Trinitrophenyl)
  • antigen such as an oligosaccharide, a lipid or a peptide
  • mice are then injected intraperitoneally or subcutaneously according to protocols known to those skilled in the art.
  • the production of anti-hapten Ac, - oligosaccharide, -lipid or -peptide is analyzed by ELISA.
  • We can also assess the capacity of said selected molecule to generate and / or increase the CTL type immune response by measuring the cytotoxic activity of lymphocyte type effector cells generated after immunization with said selected molecule, measuring the percentage of lysis of cells co-incubated with said effector cells being for example evaluated by the rate of release of Cr as described for example, but not limited thereto, in patent application WO 00/48628 or WO 00/48629 in Examples 4 and 5.
  • the invention relates to an identification method according to the invention, characterized for the identification of new HSPs, new Omps or their analogs.
  • HSP or OmpA Outer Membrane Protein type A
  • compounds capable of exerting at least one of the functions of adjuvant of immunity, and / or protein carrier promoting an effective immune response against peptides or oligosaccharides, in particular in the absence of adjuvant, in particular a CTL type response, as described above in the paragraph concerning HSPs or OmpA.
  • the invention relates to an identification method according to the invention, for:
  • An object of the invention also relates to new molecules capable of being obtained by the implementation of the method according to the invention, as described above. These new molecules capable of being obtained by implementing the method according to the invention do not include the ligands known to date which would be capable of binding to scavenger receptors and signaled via a Toll receptor such as HSP, lipoproteins such as OspA, Klebsiella pneumoniae OmpA and pEA (pseudomonas Exotoxin A).
  • the method according to the invention can in particular be used to identify new HSPs or new Omps.
  • the subject of the invention is also a pharmaceutical composition characterized in that it comprises, in a pharmaceutically acceptable medium, at least one molecule binding to scavenger receptors and signaled via a Toll receptor, and preferably at least one new molecule capable of being obtained by implementing the method according to the invention.
  • these molecules used in a pharmaceutical composition are different from HSPs, lipoproteins such as OspA, OmpA from Klebsiella pneumoniae and pEA.
  • a subject of the invention is also the composition according to the invention, characterized in that said pharmaceutical composition further comprises an antigen, immunogen or hapten.
  • immunogen, antigen or hapten is understood to mean in particular any compound expressed by an infectious agent, such as a virus, a bacterium, a yeast, a fungus or a parasite, by a tumor cell, or one of their structural analogues, which alone or in combination with an adjuvant or carrier is capable of inducing a specific immune response of said infectious agent or of said tumor cell.
  • immunogen, antigen or hapten is also intended to denote in the present description a compound having a structural analogy with said antigen or hapten capable of inducing an immunological response directed against said antigen or hapten in an organism previously immunized with said analogous compound.
  • Said antigen or hapten can in particular be chosen from proteins, glycopeptides, lipopeptides, polysaccharides, oligosaccharides, nucleic acids and lipids.
  • said antigen, immunogen or hapten is derived from a virus, a bacterium, a parasite or a fungus.
  • said antigen, immunogen or hapten comprises at least one peptide derived from a microorganism responsible for airway pathologies chosen from RSV, para influenza virus (PIV), influenza virus , hantaviruses, streptococci, pneumococci, haemophilus influenzae type b, rhinoviruses, coronoviruses and meningococci.
  • the antigen, immunogen or hapten can be associated or specific for a tumor cell.
  • compositions according to the invention may also contain an adjuvant.
  • the latter can in particular be chosen from MPL-A, Quil-A, ISCOM, Dimethyl Dioctadecyl Ammonium in the form of bromide (DDAB) or chloride (DDAC), CpG, Leif, CT (Toxoid of cholera), LT (Heat Labil Toxin) and detoxified versions of CT or LT.
  • the pharmaceutical composition according to the invention does not contain an adjuvant other than the molecule binding to scavenger receptors and signaled via a Toll receptor, and in particular no other adjuvant making it possible to induce or to increase immunogenicity or response
  • the pharmaceutically acceptable medium is the medium in which the compounds of the invention are administered, preferably a medium injectable into humans. It can consist of water, an aqueous saline solution or an aqueous solution based on dextrose and / or glycerol.
  • the invention also comprises a composition according to the invention, characterized in that said pharmaceutical composition is conveyed in a form making it possible to improve its stability and / or its immunogenicity; thus, it can be conveyed in the form of liposomes, virosomes, nanospheres, microspheres or microcapsules.
  • a molecule binding to scavenger receptors and signaled via a Toll receptor and preferably of a new molecule capable of being obtained by the implementation of the method according to the invention as carrier and / or adjuvant in another object of the invention is a vaccine.
  • these molecules used as a carrier and / or adjuvant in a vaccine are different from HSP, lipoproteins such as OspA, OmpA from Klebsiella pneumoniae and pEA.
  • the invention also relates to the use of a molecule binding to scavenger receptors and signaled via a Toll receptor, and preferably of a new molecule capable of being obtained by the implementation of the method according to the invention, for the preparation of a vaccine for prophylactic treatment or therapeutic of viral, bacterial, parasitic or fungal infections or for the preparation of a vaccine intended for the prophylactic or therapeutic treatment of cancers.
  • these molecules used for the preparation of a vaccine intended for the prophylactic or therapeutic treatment of viral, bacterial, parasitic or fungal infections or for the preparation of a vaccine intended for the prophylactic or therapeutic treatment of cancers are different from HSPs, lipoproteins such as OspA, Klebsiella pneumoniae OmpA and pEA.
  • the subject of the invention is also the use of a molecule binding to scavenger receptors and signaled via a Toll receptor, and preferably of a new molecule capable of being obtained by the implementation of the method according to the invention , for the preparation of a pharmaceutical composition intended to generate or increase an immune response against an infectious agent or a tumor cell.
  • these molecules used for the preparation of a pharmaceutical composition intended to generate or increase an immune response against an infectious agent or a tumor cell are different from HSPs, lipoproteins such as OspA, OmpA from Klebsiella pneumoniae and from the pEA.
  • the present invention also relates to the use of a molecule binding to scavenger receptors and signaled via a Toll receptor, and preferably of a new molecule capable of being obtained by the implementation of the method according to the invention , for the preparation of a pharmaceutical composition intended to generate or increase a cytotoxic T response against an infectious agent or a tumor cell.
  • a pharmaceutical composition intended to generate or increase a cytotoxic T response against an infectious agent or a tumor cell.
  • Such compositions may be used in ex vivo or in vivo therapies.
  • these molecules used for the preparation of a pharmaceutical composition intended to generate or increase a cytotoxic T response against an infectious agent or a tumor cell are different from HSPs, lipoproteins such as OspA, OmpA from Klebsiella pneumoniae and pEA.
  • the invention also relates to the use of a molecule binding to scavenger receptors and signaled via a Toll receptor, and preferably of a new molecule capable of being obtained by the implementation of the method according to the invention, for the specific targeting of a biologically active substance associated with it towards the antigen presenting cells.
  • these molecules used for the preparation of a pharmaceutical composition intended to generate or increase a cytotoxic T response against an infectious agent or a tumor cell are different from HSPs, lipoproteins such as OspA ("Outer Surface Protein”) , Klebsiella pneumoniae OmpA and pEA.
  • the new molecule can specifically bind to the antigen presenting cells and / or be internalized in said cells.
  • APCs antigen presenting cells or APCs
  • professional APCs forming an integral part of the immune system such as dendritic cells, macrophages, B lymphocytes or monocytes.
  • the invention relates to the use for targeting to dendritic cells.
  • biologically active substance is intended to denote any compound capable of exercising therapeutic activity and the activity of which can be modulated by means of APC cells.
  • biologically active substances mention may be made without being limited to immunogenic compounds such as antigens or haptens of protein, poly or oligosaccharide, glycoprotein or lipoprotein nature.
  • biologically active substance is also intended to denote any compound capable of modifying the functional activity of APC cells, in particular their growth, their differentiation or their expression system. Examples of such compounds that may be mentioned, but are not limited to, are cell growth factors including cytokines (IL-4, IL-3, GM-CSF, TNF-alpha).
  • the biologically active substance can be chosen from proteins or peptides, lipopeptides, poly- or oligosaccharides, nucleic acids, lipids and, in general, from all the chemical substances.
  • the present invention relates to all the uses according to the present invention characterized in that said molecule capable of binding to scavenger receptors and / or signaled via a Toll receptor, and, if necessary, capable of being internalized after said fixation in an antigen presenting cell, is identified by a one or two step process according to the present invention.
  • said legends of the figures and examples which follow are intended to illustrate the invention without in any way limiting its scope.
  • FIG. 1 corresponds to the profile obtained by analysis with the FACS disadvantage cytofluorometer and demonstrates that CHO cells transfected with MARCO bind P40 to a greater extent than cells transfected with CD83 used as negative control or non-transfected CHO cells.
  • FIG. 2 corresponds to the quantification in IL-8 of 293 cells and demonstrates the capacity of 293 cells when they are transfected with Tlr2 or Tlr4 to respond to Omp A.
  • Example 1 The Omp bind to a scavanger receptor A.
  • Generation of MARCO transfectants The cDNA coding for the scavenger MARCO receptor (sequence identified in the GenBank database under the accession number AN NM006770, SEQ ID No. 1 from the list of sequences below) was cloned into a pEBS / PL expression vector containing a sequence coding for a protein C attached to the inserted sequence.
  • CHO cells ATCC, Manassas, VA
  • the cells expressing MARCO were selected based on the expression of protein C used as a marker, determined by Western blotting.
  • the cells were lysed in 10 mM phosphate buffer pH 7.4 containing 0.5% Nonidet P40 (Sigma) and protease inhibitors (Boehringer Mannheim).
  • the proteins of 5 ⁇ 10 6 cells were separated by electrophoresis on a 10% polyacrylamide gel gel under non-reducing conditions, then transferred to a nitrocellulose membrane (marketed by Biorad, Ivry sur Seine, France). After saturation, the membranes were incubated in the presence of anti-protein C monoclonal antibodies (Roche Diagnostics, Meylan, France).
  • the membranes were incubated with anti-mouse immunoglobulin antibodies labeled with peroxidase (Dako, Glostrup, Denmark); bound antibodies were detected using the ECL system (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden).
  • the macrophages thus generated are incubated in FACS buffer (RPMI containing 0.1% bovine serum albumin) at 2 ⁇ 10 5 cells per well of 96 sharp bottoms for 20 minutes in the presence of different concentrations of labeled P40.
  • FACS buffer RPMI containing 0.1% bovine serum albumin
  • 488 marking with Alexa is carried out as described by the merchant (Molecular Probes). The cells are then washed in FACS buffer and analyzed using a FACSvantage cytofluorometer.
  • Example 2 Omps are internalized by a scavanger receiver
  • the fluorescence of the alexa was measured with a 530-30 nm filter after excitation with an argon ion laser at 488 nm.
  • Example 3 The Omp Stimulate Cells Via a Toll A Receptor. Generation of Tir Transfectants
  • Tir 2 Tir 4 and CD 14 cDNA (sequences respectively identified in the GenBank database under the accession numbers AN U88878, U88880 and M8651 1, and whose nucleic sequence is respectively represented by the sequences SEQ ID No 5, No. 7 and No. 9 in the sequence list below) has been cloned in the vector pCDNA3.1 (Invitrogen, Groningen, Holland), subsequently used to transfect 293 cells (ATCC) by lipofection as described above.
  • pCDNA3.1 Invitrogen, Groningen, Holland
  • the cells were washed and cultured in medium without FCS, RPMI 1640 for 12 h. After replacing the medium, the cells were either unstimulated or stimulated for 6 h with 0.5 mM of OmpA, 0.5 mM of BB or
  • IL-8 was then quantified by ELISA (R&D Systems) in the supernatant obtained after 6 h.
  • Tir 2 acquire the ability to respond to OmpA.
  • the effect of OmpA does not require the presence of CD 14 as is sometimes the case for lipoproteins or LPS which also activate cells via Tir 4.
  • Example 4 HSPs bind to a scavanger receptor A. Generation of CD
  • Human dendritic cells are generated from monocytes isolated from peripheral blood. The blood is taken by leukopheresis in the presence of an anticoagulant such as for example lithium heparinate.
  • Mononuclear cells are isolated from healthy subjects by centrifugation on a Ficoll-Hypaque gradient (density ⁇ 1.077) (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). The blood cells are centrifuged at 1500 rpm for 30 minutes at room temperature. The CMNs, located at the Ficoll-plasma interface, are recovered and washed twice in the presence of RPMI 1640 medium (Life technologies, Cergy Pontoise, France).
  • the monocytes are purified by positive selection using a magnetic cell separator (MACS TM; Miltenyi Biotex, Bergisch Gladbach, Germany) in accordance with the manufacturer's instructions. CMNs are incubated for 20 minutes at 4 ° C with magnetic beads on which are fixed an anti-human CD14 monoclonal antibody. After washing, the cell suspension plus beads is placed on a column and subjected to a magnetic field. After three washes, the column is no longer subjected to the magnetic field and the monocytes are collected by gravitation. The purity of the monocytes is evaluated by cytofluorometry (FACScan cytofluorometer; Becton Dickinson, Erembodegem, Belgium) based on the size-grain size parameters of the cells.
  • cytofluorometry FACScan cytofluorometer; Becton Dickinson, Erembodegem, Belgium
  • the purity is greater than 98%.
  • the monocytes are then cultured at a concentration of 5 ⁇ 10 6 cells / ml in the following medium (hereinafter referred to as complete culture medium): RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum (heating at 56 ° C. for 30 minutes), 2 mM L-glutamine, 50 U / ml of penicillin and 50 ug / ml of streptomycin (Life technologies) in 6-well culture plates (Nunc, Roskilde, Denmark) at a rate of 5 ml of medium per well.
  • complete culture medium hereinafter referred to as complete culture medium: RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum (heating at 56 ° C. for 30 minutes), 2 mM L-glutamine, 50 U / ml of penicillin and 50 ug / ml of streptomycin (Life technologies) in 6-well culture plates (Nunc, Roskilde, Denmark
  • the cells are activated with 20 ng / ml of recombinant human IL-4 and 20 ng / ml of recombinant human GM-CSF (R&D Systems, Abingdon, United Kingdom). After 6 days of culture (37 ° C., 5% CO 2 in a humid atmosphere), the phenotype of the cells is defined by cytofluorometry.
  • the cells are washed in FACS buffer and then distributed in wells of a 96-well conical bottom culture plate at the rate of 2 ⁇ 10 5 cells in a volume of 50 ml of FACS buffer.
  • the cells are then incubated for 10 min in FACS buffer in the absence or in the presence of 100 mg / ml of bovine serum albumin (BSA) or of maleylated BSA. After 10 min, 10 mg / ml of HSP70 labeled with biotin are added. After 20 min at 4 ° C, the cells are washed and incubated with FITC-labeled avidin. C. Results
  • the first step is a selection of molecules targeting an SR
  • the second step selects among these molecules those signaling via a Tir molecule.
  • cDNAs coding for the SRs identified so far are integrated into a eukaryotic expression vector downstream of a sequence coding for a signal peptide (making it possible to produce recombinant soluble molecules).
  • CHO cells are transfected by lipofection and then cultured with a selection agent, such as, for example, hygromycin.
  • the selection of clones expressing the transgene can be done in different ways depending on the available probes: - use of a monoclonal antibody, whether or not coupled to a fluorescent molecule,
  • fluorescent Dil-Ac-LDL [a molecule being defined as an SR when it fixes the modified LDL such as oxidized LDL or acetylated LDL, respectively Ox-LDL and Ac-LDL], - selection of transfectants expressing in a contemporary SR and a molecule like EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein).
  • EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein
  • the expression of the two recombinant molecules (EGFP and SR) is under the control of the same promoter; the cDNAs are separated by an IRES sequence which allows the synthesis of two proteins from a single mRNA.
  • any cell expressing the EGFP expresses the SR in a contemporary manner.
  • the clones expressing most strongly the recombinant SR will be selected by cytofluorometry (use of a cell sorter), for example.
  • the transfectants will be maintained in culture in the presence of the selection agent.
  • the bacterial genomic DNA is broken mechanically to obtain fragments of about 1 kb in size.
  • the DNA fragments are then integrated into an expression vector exhibiting a double prokaryotic / eukaryotic promoter.
  • This plasmid has at least the following characteristics: a sequence coding for a signal peptide upstream of the exogenous DNA and a sequence coding for a Tag downstream of the exogenous DNA.
  • the Tag will be chosen on the basis of the existence of monoclonal antibodies directed against this Tag sequence.
  • the bacteria containing a plasmid DNA are selected (use of an antibiotic resistance expressed by the plasmid) and then cloned.
  • Eukaryotic cells such as, for example, CHO or HEK-293 cells
  • the culture supernatants containing the soluble recombinant molecules are incubated with the different stable clones expressing the SRs. After washing, the cells are incubated with a fluorescent antibody directed against the chosen Tag sequence. The fluorescence will then be analyzed by cytofluorometry. After identification of the groups producing a soluble molecule directed against an SR, each of the plasmids contained in the group of 10 clones will be analyzed individually in order to identify the one producing the molecule of interest. The specificity of fixation to the SR will be evaluated against all the other SRs. The nature of the protein will then be determined by sequencing the genomic DNA fragment. Production of the recombinant molecule.
  • the sequence present in the plasmid codes for the entire protein
  • the complete sequence will be identified by sequencing genomic DNA.
  • the complete sequence will be inserted into a prokaryotic expression vector downstream of a sequence encoding a Tag against which monoclonal antibodies are available.
  • the protein will be produced according to techniques known to a person skilled in the art and purified by immunoprecipitation using an anti-Tag antibody immobilized on a resin.
  • the capacity of the purified recombinant molecule to bind to the SR will be reassessed by cytofluorometry as described above.
  • the cDNAs coding for the human Tir 1 to Tir 6 molecules will be cloned by PCR and inserted into an expression vector containing a sequence coding for a Tag sequence, in this case the FLAG TM sequence (Sigma, St Louis, MO) of such that the FLAG sequence is expressed at the end of the extracellular domain.
  • the stable transfectants expressing the SR of interest will be transfected with each of the plasmids coding for the Tir.
  • the expression of the Tir will be evaluated by cytofluorometry using anti-FLAG antibodies.
  • the transfectants will then be cultured in the presence of the recombinant molecule of interest.
  • Example 6 One-step method In this case, the selection of the molecules of interest is done on transfectants jointly expressing an SR and a Tir molecule.
  • the cDNA or genomic DNA libraries as well as the production of the recombinant soluble proteins have been described above.
  • the cells are transfected by electroporation or lipofection with two vectors, one coding for SR and the other for the SR molecule; in this case, two plasmids will be chosen each coding for a protein for resistance to a different drug,
  • the cells are transfected by electroporation or lipofection with a vector containing the two sequences of interest separated by an IRES sequence (see the properties of this sequence above).
  • the SRs must be cloned in association with each of the known Tir sequences.
  • the Tir molecule expresses a Tag FLAG sequence at the end of its extracellular domain.
  • the selection of the clones expressing jointly the SR and the Tir molecule will be made by cytofluorometry as described above using an anti-FLAG TM monoclonal antibody (coupled to a fluorescent molecule) for the expression of the SR and of the fluorescent molecule Dil- Ac-LDL for the expression of the Tir molecule.
  • the cells are cultured in the presence of the selection agent (s).
  • the unique parameter measured will be the activation of the cells by the recombinant soluble proteins (by measuring for example the production of IL-8 or TNFalpha by the transfectants).

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Abstract

L'invention concerne un procédé d'identification de nouvelles molécules se liant aux récepteurs scavengers et signalées via un récepteur Toll, tout comme l'utilisation de ces nouvelles molécules identifiées pour la préparation d'une composition pharmaceutique, notamment destinée au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires et fongiques ou au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers.

Description

PROCEDE D'IDENTIFICATION DE NOUVELLES MOLECULES SE LIANT AUX RECEPTEURS SCAVENGERS ET SIGNALEES VIA UN RECEPTEUR TOLL.
L'invention concerne un procédé d'identification de nouvelles molécules se liant aux récepteurs scavengers et signalées via un récepteur Toll, tout comme l'utilisation de ces nouvelles molécules identifiées pour la préparation d'une composition pharmaceutique, notamment destinée au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires et fongiques ou au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers. La vaccination est un moyen efficace de prévenir ou de réduire les infections virales ou bactériennes. Le succès des campagnes de vaccination dans ces domaines a permis d'étendre le concept de vaccin jusqu'alors utilisé dans le domaine de l'infectiologie aux domaines du cancer et des maladies auto-immunes. Les antigènes vaccinaux administrés seuls chez l'hôte ne sont souvent pas assez immunogéniques pour induire une réponse immunitaire, et doivent donc être associés à un adjuvant ou couplés à une protéine porteuse pour induire (ou augmenter) leur immunogénicité. Dans ces conditions, seule une réponse immune de type humorale peut être induite, réponse au cours de laquelle les antigènes exogènes sont présentés dans le contexte des molécules du MHC classe II aux lymphocytes T CD4. Ainsi, de nouveaux porteurs ou adjuvants permettant d'augmenter ou d'induire l'immunogénicité sont constamment recherchés.
De plus, dans le cadre d'une thérapie antivirale, la génération de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) capables de reconnaître et de détruire le virus est de toute importance (Bachmann et al., Eur. J. Immunol., 24, 2228-2236, 1994 ; Borrow P., J. Virol. Hepat., 4, 16-24, 1997), comme l'attestent de nombreuses études montrant, in vivo, le rôle protecteur des réponses dirigées contre les épitopes viraux (Arvin AM, J. Inf. Dis., 166, S35-S41, 1992 ; Koszinowski ét al., Immunol. Lett., 16, 185-192, 1987). L'importance des réponses CTL a aussi été fortement documentée dans les réponses antitumorales notamment celles dirigées contre les cellules de mélanome (revue dans Rivoltini et al, Crit. Rev. Immunol., 18, 55-63, 1998). Le ou les épitopes CTL (séquences peptidiques înteragissant avec les molécules de classe I et présentées aux lymphocytes T CD8+) ont été définis pour plusieurs antigènes. Cependant, la difficulté réside dans la génération de CTL in vivo, due à la faible immunogénicité de ces peptides (Melief, Adv. Cancer Res., 58, 143-175, 1992 ; Nandaz et Sercaz, Cell, 82, 13-17, 1995).
Des recherches s'orientent par conséquent vers l'identification de nouveaux adjuvants, ou de système de délivrance d'antigènes («delivery System»), permettant d'induire des CTL. Grâce à leur efficacité à présenter les antigènes et à stimuler le système immunitaire, les cellules dendritiques, par exemple, ont été utilisées pour générer des réponses CTL antivirales (Ludewig B et al., J. Virol., 72, 3812-3818, 1998 ; Brossard P. et al., J. Immunol., 158, 3270-3276, 1997) ou anticancéreuses (Nestlé F.O. et al., Nat. Med., 4, 328-332, 1998).
Les cellules dendritiques (DC) sont les cellules présentatrices d'antigène les plus efficaces et en particulier les seules capables d'initier une réponse CTL (Banchereau, J. et al., Nature, 392, 245-252, 1998, et Watts, C, Nature Cell Biol., 1, 152-154, 1999). Les DC sont la cible de nombreuses stratégies vaccinales (Timmerman J. M., et al., Annu. Rev. Med., 50, 507-529, 1999). En effet, de nombreux arguments expérimentaux montrent que ce sont les DC immatures qui seraient capables dans certaines conditions de présenter les antigènes exogènes dans le CMH de classe I aux CTL. Les DC existent dans deux états de différentiation. Les DC présentes dans les tissus périphériques sont immatures et agissent comme des sentinelles qui capturent les antigènes exogènes. Après un contact avec les antigènes ou des signaux de stress, elles subissent un processus de maturation, acquièrent l'expression de nombreuses molécules de costimulation et migrent dans les ganglions ou elles présentent l'antigène aux lymphocytes T naïfs. Le phénomène de cross-présentation (encore connu sous le nom de cross-priming) qui permet à un antigène exogène d'accéder à une présentation dans les molécules des MHC classe I est actuellement très étudié (Yewdell J. W., et al., Adv. Immunol., 73, 1-77, 1999). Il est actuellement admis que la façon dont l'antigène est capturé joue un rôle. Bien qu'il ait été observé que des antigènes internalisés par des moyens non spécifiques de type phagocytose ou macropinocytose étaient dans certains cas présentés par des DC ou des macrophages dans le contexte des CMH classe I, il est maintenant admis que la capture des antigènes par le biais d'un récepteur favorise l'accès des antigènes au cytosol des APC et donc à la présentation dans le CMH classe I. Des exemples sont fournis par les immuncomplexes et les HSP qui sont capturés par les DC via des récepteurs spécifiques et qui sont présentés dans les molécules du CMH de classe I (Rodriguez A., et al., Nat. Cell Biol., 1 , 362-368, 1999).
Des approches vaccinales ont ainsi consisté à charger les cellules dendritiques ex vivo avec l'antigène d'intérêt (peptides ou lysat cellulaire) et réimplanter ces cellules chez le patient. D'autres approches consistent à transfecter ex vivo les cellules dendritiques avec le gène codant pour l'antigène d'intérêt et à réinjecter ces cellules transfectées (Gilboa E. et al., Cancer Immunol. Immunother., 46, 82-87, 1998). Ces approches ont été utilisées avec succès chez la souris et chez l'homme (Hsu F.J. et al., Nat. Med., 2, 52-58, 1996) mais restent néanmoins complexes dans la mesure où ces cellules doivent être traitées ex vivo (transformation des cellules ou internalisation des antigènes) et transplantées dans l'organisme hôte. De même, l'utilisation de particules de type viral (Layton G.T. et al., J. Immunol., 151, 1097-1 107, 1993) ou de l'adjuvant incomplet de Freund (IFA) (Valmori et al., Eur. J. Immunol., 24, 1458-1462, 1994) permet de générer des réponses CTL. Toutefois, une vaccination antivirale ou antitumorale réalisée avec des peptides correspondant à des épitopes CTL et en présence d'un tel adjuvant peuvent conduire à un état de tolérance spécifique qui peut conduire dans certains cas à l'effet contraire recherché, c'est-à-dire à une diminution de la réponse immune (Toes et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 93, 7855-7860, 1996).
Ainsi, il existe aujourd'hui un grand besoin de disposer d'un composé qui, associé à une molécule, notamment un antigène ou haptène, soit capable de générer une réponse immunitaire, et notamment une réponse CTL, dirigée contre ladite molécule. Un tel composé pourrait en particulier être utilisé pour la préparation d'une composition vaccinale destinée à induire une protection immunitaire, notamment de type CTL, antiviral, antibactérienne, antifongique, antiparasitaire ou antitumorale. On recherche également de nouvelles molécules pour le ciblage spécifique d'une substance biologiquement active vers les cellules présentatrices d'antigènes, telles que les cellules dendritiques, les macrophages, les lymphocytes B ou les monocytes.
En effet, on recherche des nouvelles molécules qui, associées avec une substance biologiquement active telle que des antigènes ou des facteurs de croissance cellulaire, peuvent se fixer spécifiquement sur les cellules présentatrices d'antigènes et/ou être intemalisées dans lesdites cellules et ainsi être capable d'exercer une activité thérapeutique modulée par l'intermédiaire des cellules présentatrices d'antigène. Les scavengers récepteurs sont des protéines exprimées à la surface de nombreuses cellules et en particulier des cellules présentatrices d'antigènes professionnelles que sont les DC et les macrophages (Medzhitov R. et al., Curr. Opin. Immunol., 9, 4-9, 1997, et Lebecque S., Vaccine, 25, 1603-1605, 2000). Ils lient notamment les lipoprotéines modifiées chimiquement. Plusieurs familles de scavengers récepteurs ont été identifiées, chaque famille pouvant contenir plusieurs membres. Ils lient un large panel de ligands différents. En particulier, certains scavengers récepteurs sont impliqués dans la réponse antibactérienne et lient des molécules bactériennes telles que le LPS ou l'acide lipotéchoique. La liaison est suivie par une endocytose de la molécule.
La demande EP 0 783 892 décrit une méthode pour augmenter l'immunogénicité dans laquelle un antigène et un ligand d'un récepteur scavenger sont conjugués à un adjuvant. La demande EP 0 808 899 a pour objet le récepteur scavenger humain Marco et décrit une méthode d'identification de composés qui se lient et qui activent ou inhibent ce récepteur. La demande WO 99/14329 divulgue quant à elle un nouveau récepteur Marco, nommé MCCOL.
La molécule Toll a été initialement décrite comme un récepteur transmembranaire chez la drosophile impliqué dans l'embryogenèse et la réponse antifongique. Une activation via Toll induit une interaction et la stimulation de molécules de signalisation intracellulaire homologue aux facteurs de transcription de NFkB, en aval du récepteur à l'interleukine-1 chez les mammifères. Une famille de récepteurs humains structurellement identiques à la molécule Toll de la drosophile a été identifiée (Bowie A., et al., J. Leuk. Biol. 67, 508-514, 2000; Muzion M., et al, Microbes & infec, 2, 251-255, 2000). Cette famille de molécules contient actuellement 6 membres. A l'exception de Tir 2 et Tir 4, les ligands ne sont pas connus. L'activation de Tir 2 et 4 est associée à une activation de NFkB; la production de cytokines proinflammatoires. Les molécules Tir 2 et 4 jouent un rôle crucial dans la réponse à un signal de danger, en particulier en réponse à des agents étrangers comme les bactéries. De nombreux constituants bactériens, tels que des séquences d'ADN de type CPG ou des constituants de la paroi de type LPS, lipoprotéines ou LTA activent les APC et les cellules de l'innate immunity via les TIR (Rescigno M. et al., Immunol. today, 20, 200-203, 1999). En particulier les cellules dendritiques (Muzio M. et al., J. Immunol., 164, 5998-6004, 2000) et les macrophages expriment de nombreux Tir qui leur permettent de répondre aux agressions microbiennes.
Des récepteurs humains type TOLL sont décrits dans la demande WO 98/50547 qui a encore pour objet des ligands de ces récepteurs. Les demandes WO 99/20756 et WO 00/24776 décrivent également des homologues Humain Toll.
L'OmpA de Klebsiella pneumoniae, protéine majeure de la membrane externe (baptisée P40) présente une activité de protéine porteuse, par voie systémique, pour des antigènes sous-unitaires peptidiques (demandes de brevet WO 95/27787 et WO 96/14415 ; Haeuw et al., Eur. J. Biochem., 255, 446-454, 1998 ; Plotnicky-Gilquin et al., J. Virol., 73, 5637-5645, 1999) et polysaccharidiques (demande de brevet WO 97/41888 ; Rauly et al., Infect. Immun., 67, 5547-5551, 1999).
Les HSP (Heat Shock Protein) sont des molécules chaperonnes qui contrôlent le repliement des protéines et évitent leur agrégation; elles sont fortement conservées lors de l'évolution (Feldman, D. E.3 et al., Curr. Opin. Struct. Biol., 10, 26-33, 2000). De nombreuses études ont démontré que les HSP peuvent être utilisées comme protéines porteuses et favorisent une réponse immune contre des peptides ou des oligosaccharides (Lussow, A.R, et al, Eur. J. Immunol., 21 , 2297-2302, 1991). Les HSP n'induisent pas de suppression épitopique (Barrios, C, et al, Eur. J. Immunol., 22, 1365-1372, 1992) et sont efficaces en absence d'adjuvant (Barrios et al., 1992) suggérant que les HSP peuvent être considérées comme des adjuvants en tant que tels (Blachere, N.E., et al., J. Exp. Med., 186, 1315-1322, 1997).
L'utilisation potentielle des HSP en immunothérapie antitumorale est actuellement très étudiée (Srivastava, P. ., et al, Immunity, 8, 657-665, 1998). Les HSP isolées des cellules tumorales engendrent une puissante réponse CTL CD8+ protectrice et spécifique de la tumeur (Srivastana, P.K., et al., Immunogenetics, 39, 93- 98, 1994 ; Tamura, Y. et al., Science, 278, 1 17- 120, 1997). Cette propriété provient de la capacité des HSP à se lier de façon non covalente à des peptides antigéniques spécifiques des tumeurs (Udono, H., et al., J. Exp. Med., 178, 1391 -1396, 1993 ; Tamura, Y., et al., 1997 ; Nieland, T.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93, 6135- 6139, 1996). Parmi les différentes HSP testées, gp96 (un homologue endoplasmique de la HSP90) et la HSP70 sont les plus utilisés dans des vaccins anti-tumoraux prophylactiques ou thérapeutiques contre différents types de tumeurs (Udono, H., et al., J. Immunol., 152, 5398-5403, 1994 ; Tamura et al, 1997).
Il semblerait que la HSP 60 se liait au Tlr4 (Tir pour « Toll-Like Receptor », récepteur Toll apparenté ou récepteur de type Toll) (Ohashi K., et al., J. Immunol., 164:558-561, 2000).
De manière surprenante, il a maintenant été mis en évidence que les OmpA et les HSP se liaient aux récepteurs scavengers. De manière encore plus surprenante, il a aussi été déterminé que ces mêmes molécules étaient en outre signalées via un récepteur Toll. La présente invention a ainsi pour objet un procédé d'identification de nouvelles molécules d'intérêt thérapeutique, caractérisé en ce qu'on sélectionne les molécules qui se lient aux récepteurs scavengers et qui sont signalées via un récepteur Toll.
Ce procédé, et les nouvelles molécules sélectionnées, pourront ainsi répondre aux problèmes mentionnés ci-dessus, à savoir trouver de nouveaux porteurs ou adjuvants permettant d'augmenter ou induire l'immunogénicité notamment de type humorale, de nouveaux composés qui, associés à une molécule, notamment un antigène ou haptène, soient capables de générer une réponse CTL, tout comme de nouveaux composés capables de cibler les cellules présentatrices d'antigènes, de préférence celles exprimant un récepteur scavenger, et notamment les cellules dendritiques de préférence immatures.
Par cellules présentatrices d'antigènes (CPA ou APC), on entendra désigner dans la présente invention, les cellules CPA professionnelles formant partie intégrante du système immunitaire telles que les cellules dendritiques, les macrophages, les lymphocytes B ou les monocytes, notamment les cellules dendritiques immatures. Dans la présente invention, on entendra désigner également par le terme
«peptide» les protéines ou les polypeptides, termes qui seront ici employés indifféremment.
Selon l'invention, il est possible d'utiliser tout type de récepteur scavanger, de préférence d'origine humaine, et notamment les récepteurs SR-Al, SR-B 1 , SR-C1 , Marco, LOX, notamment LOX-1 , CD36. Les récepteurs décrits dans les demandes EP
0 783 892 et EP 0 808 899 (séquences nucléotidiques SEQ ID No. I et SEQ ID No. 5, et les séquences protéiques SEQ ID No. 2 et SEQ ID No. 6) et WO 99/14329 (séquence nucléotidique SEQ ID No. 2 et séquence protéique SEQ ID No. 1) pourront être utilisés. Pour les récepteurs LOX, on pourra également se référer aux récepteurs décrits dans les demandes WO 99/32520 (récepteur LOX- 1 humain et bovin respectivement de séquence peptidique SEQ ID No. 1 et No. 2, et leur séquence nucléique respective SEQ ID No. 5 et No. 6 dans ce document), WO 96/17058 (et particulièrement les séquences nucléiques et protéiques des récepteurs LOX d'origine bovine et humaine identifiées par les séquences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 et SEQ ID No. 3 dans ce document), US 5,510,466 (dont les séquences nucléiques et protéiques sont représentées aux figures 3A à 4D de ce document), US 5,665,872 (et particulièrement la séquence nucléique SEQ ID No. 1 et la séquence protéique SEQ ID No. 3) et US 5,521,071 (et particulièrement la séquence nucléique SEQ ID No. 1 et protéique SEQ ID No. 2) pourront être utilisés, de même que le récepteur LOX, dénommé HORL, dont les séquences nucléique et peptidique sont décrites dans le brevet US 5,945,308. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le récepteur scavenger utilisé correspond au récepteur Marco, en particulier le récepteur Marco humain dont la séquence de l'ADNc codant pour ce récepteur est décrite dans la banque de données GenBank sous le numéro d'accession A.N. NM 006770 (dont les séquences nucléique et protéique sont respectivement représentées par les séquences SEQ ID No. 1 et No. 2 dans la liste des séquences ci-après) ou au récepteur LOX-1, en particulier le récepteur LOX- 1 humain dont la séquence de l'ADNc codant pour ce récepteur LOX-1 humain est décrite dans la banque de données GenBank sous le numéro d'accession A.N. AB 010710 (dont les séquences nucléique et protéique sont respectivement représentées par les séquences SEQ ID No. 3 et No. 4 dans la liste des séquences ci-après). De même, tout type de récepteur Toll peut être utilisé. Ainsi, dans le cadre de la présente invention, le terme "récepteur Toll" désignera la molécule Toll de la drosophile tout comme les récepteurs humains structurellement identiques et notamment les récepteurs Tir 1 , 2, 3, 4, 5 ou 6. Les récepteurs humains type Toll décrits dans les demandes WO 98/50547 (séquences protéiques SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 22 et SEQ ID No. 34 et leurs séquences nucléiques codantes correspondantes), WO 99/20756 (SEQ ID No. 1 , SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 13) et WO 00/24776 pourront être utilisés.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le récepteur Toll utilisé correspond au récepteur Tir 2 ou Tir 4, en particulier le récepteur Tir 2 humain dont la séquence de l'ADNc codant pour ce récepteur est décrite dans la banque de données GenBank sous le numéro d'accession A.N. U88878 (dont les séquences nucléique et protéique sont respectivement représentées par les séquences SEQ ID No. 5 et No. 6 dans la liste des séquences ci-après) ou Tir 4 humain dont la séquence de l'ADNc codant pour ce récepteur est décrite dans la banque de données GenBank sous le numéro d'accession A.N. U88880 (dont les séquences nucléique et protéique sont respectivement représentées par les séquences SEQ ID No. 7 et No. 8 dans la liste des séquences ci-après).
Selon l'invention, on pourra également utiliser :
- tout récepteur scavanger, de préférence d'origine humaine, notamment les récepteurs SR-Al, SR-Bl, SR-Cl, Marco, LOX, de préférence LOX-1, CD36 dont les séquences, nucléiques codantes ou d'acides aminés, présentent un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 90 %, 95 % et 99 % avec leur séquence sauvage, notamment les séquences dont il fait référence ci-avant ;
- ou tout fragment de cesdits récepteurs scavengers comprenant le site de fixation à son ou à ses ligands naturels.
Selon l'invention, on pourra également utiliser :
- tout récepteur Toll, notamment les récepteurs humains structurellement identiques et de préférence les récepteurs Tir 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, dont les séquences, nucléiques codantes ou d'acides aminés, présentent un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 90 %, 95 % et 99 % avec leur séquence sauvage, notamment les séquences dont il fait référence ci-avant pour ces récepteurs ;
- ou tout fragment de cesdits récepteurs Toll comprenant le domaine responsable de la médiation du signal d'activation des cellules.
Dans la présente description, par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotîdes ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Le meilleur alignement ou alignement optimal est l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer, comme calculé ci-après, est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou encore BLASTN ou BLASTX, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215,403,1990).
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenêtre de comparaison dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotîde ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.
Les molécules à sélectionner (et, le cas échéant, à identifier si elles sont de structure inconnue ou si lesdites molécules sont sélectionnées à partir d'un mélange de composés connus ou inconnus) peuvent être choisies parmi toutes catégories de molécules naturelles ou synthétiques. Ainsi, l'invention n'est nullement limitée à un type de molécules à sélectionner mais également, et de préférence, permet d'identifier de nouveaux composés à partir de molécules très diverses, comme par exemple des molécules chimiques ou biologiques, des extraits cellulaires, notamment de bactéries, des extraits de plantes, etc..
On pourra, de façon préférée, tester des extraits membranaires, et plus préférentiellement solubles, de pathogènes (bactéries, parasites, etc.) et de cellules eucaryotes, notamment humaines.
Dans un mode de réalisation de l'invention, le procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend les deux étapes distinctes suivantes (étapes réalisées séparément) : a) la sélection des molécules qui se lient aux récepteurs scavengers ; et b) la sélection, parmi les molécules sélectionnées à l'étape a), des molécules qui fournissent un signal d'activation via un récepteur Toll.
De préférence, le procédé d'identification selon l'invention pour l'identification de nouvelles molécules d'intérêt thérapeutique se liant à un récepteur scavenger est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
1) la mise en contact d'une molécule, ou d'un mélange de molécules, connue ou inconnue à tester avec un récepteur scavenger, dans un milieu permettant la fixation éventuelle d'une molécule testée avec ledit récepteur scavenger ;
2) la mise en évidence de la fixation ou non de ladite molécule testée avec ledit récepteur scavenger ; et
3) la sélection de cette molécule si sa fixation avec ledit récepteur scavenger a été mise en évidence à l'étape 2).
Ledit récepteur scavenger, ou un de ses fragments comprenant son site de fixation spécifique, utilisé à l'étape 1) pourra être isolé ou purifié à partir de culture de cellules exprimant naturellement ce récepteur. De préférence, ledit récepteur scavenger utilisé à l'étape a), ou l'un de ses fragments comprenant son site de fixation spécifique, notamment sa fraction soluble dépourvue de son domaine transmembranaire, sera de nature recombînante, soit isolé et/ou purifié à partir de cultures de cellules hôtes transformées avec un ADN codant pour cedit récepteur, ou soit sous forme de cesdites cellules hôtes exprimant à leur surface ledit récepteur scavenger.
Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé d'identification selon l'invention, caractérisé en ce que la sélection des molécules capables de se lier au récepteur scavenger est réalisée par une méthode choisie parmi les méthodes suivantes :
- une chromatographie d'affinité,
- une identification par FACS des molécules se liant à des cellules transfectées par un récepteur scavenger ;
- une technique de type BIACORE ; ou
- un clonage par expression à partir d'une sonde portant un récepteur scavenger, tel qu'un screening en utilisant comme sonde une forme soluble d'un récepteur scavenger, le domaine extracellulaire du récepteur scavenger pouvant être fusionné à une chaîne lourde d ' immunoglobuline.
La technique dite de chromatographie d'affinité connue de l'homme du métier pourra être réalisée en utilisant des formes recombinantes des récepteurs scavengers, immobilisées sur une résine. Idéalement, les formes recombinantes des récepteurs scavengers, seront composées uniquement des domaines extracellulaires des formes recombinantes des récepteurs scavengers, fusionnées ou non à une séquence Tag (c- myc, His6, chaîne lourde de l' immunoglobuline γl murine, GST (Glutathion S- Transférase), ...). Les molécules recombinantes pourront être produites en système procaryote ou eucaryote (cellules COS, CHO ou cellules d'insecte). Les molécules recombinantes seront fixées sur une résine adaptée en utilisant des techniques conventionnelles incluant le couplage chimique à une matrice de colonne appropriée telle que l'agarose, Affi Gel, ou d'autres matrices connues de l'homme de l'art. Les molécules à tester décrites ci-dessus telles que des extraits protéiques totaux issus de bactéries, parasites, virus, cellules eucaryotes pourront être incubés avec ces résines sont ensuite déposées sur la colonne. Les molécules interagissant avec ledit récepteur scavenger, sont retenues par la colonne et peuvent être isolées par élution.
L'identification par FACS (« Fluorescence Activated Cells Sorting ») est une technique connue de cytométrie en flux, et permet d'analyser la fixation de la molécule testée sur des transfectants stables exprimant un récepteur scavenger. Les transfectants stables peuvent être générés dans des cellules hôtes qui n'expriment peu ou pas de récepteur scavenger comme les cellules CHO. Pour identifier les molécules ayant la capacité de se fixer aux récepteurs scavengers, il sera possible de créer une banque d'expression. Brièvement, les ADNc ou l'ADN génomîque issu de bactéries, parasites, cellules eucaryotes, etc., seront insérés dans un vecteur d'expression procaryote permettant la production de molécules recombinantes solubles et taggées (marquées) (idéalement, nous choisirons un Tag (ou marqueur) détectable par un anticorps compatible avec un screening par cytofluorométrie). Les molécules recombinantes produites par les clones bactériens seront sélectionnées sur la capacité à se fixer aux transfectants stables exprimant un récepteur scavenger. L'ADN plasmidique pourra ensuite être identifié par séquençage.
Dans d'autres méthodes, les molécules susceptibles d'interagir avec ledit récepteur scavenger, peuvent être liées à des marqueurs détectables tels que des marqueurs radioactifs, fluorescents ou enzymatiques. Ces molécules marquées sont mises en contact avec ledit récepteur scavenger immobilisé, dans des conditions permettant une interaction spécifique. Après élimination des molécules non fixées spécifiquement, les molécules liées sont détectées par des moyens appropriés.
La technologie du BIACORE peut également être utilisée pour effectuer le criblage de composés capables d'interagir avec ledit récepteur scavenger. Cette technologie permet de détecter des interactions entre molécules en temps réel sans utilisation de marquage. Elle est basée sur le phénomène de SPR (surface plasmon résonance). Un des principaux avantages de cette méthode est qu'elle permet la détermination des constantes d'association entre le récepteur et les molécules interagissant. Ainsi, il est possible de sélectionner spécifiquement les molécules interagissant avec de fortes ou de faibles constantes d'association.
Le clonage par expression peut aussi être effectué à partir d'une sonde constituée du domaine extracellulaire du récepteur scavenger, fusionné à un Tag, idéalement une chaîne lourde d'immunoglobuline murine. La détection de cette molécule pourra se faire à l'aide d'un anticorps anti-immunoglobuline murine marquée à un fluor, un fluorochrome (Alexa ou FITC) ou de billes magnétiques coatées avec un anticorps anti- Ig de souris. Les banques d'expression (procaryotique ou eucaryotique) construites avec de l'ADNc ou de l'ADN génomique provenant de bactéries, virus, parasites, cellules eucaryotes, etc., seront screenées à l'aide des formes recombinantes solubles des récepteurs scavengers. Les clones ainsi isolés pourront être identifiés par séquençage.
Par exemple, mais sans s'y limiter, on pourra également mettre en œuvre dans les procédés d'identification selon l'invention une autre méthode d'identification de molécules capables d'interagir avec ledit récepteur scavenger, utilisant un système de double hybrides bactériens ou levures tel que le Matchmaker Two Hybrid System 2. Selon les instructions du manuel accompagnant le Matchmaker Two Hybrid System 2 (Catalogue N° Kl 604-1 , Clontech), lorsque par exemple les molécules à tester sont des peptides non connus dont les ADNc sont clones dans des banques de plasmides.
On peut également citer une autre méthode d'identification pour mettre en évidence l'interaction dudit récepteur scavenger, avec des petites molécules telles que celles générées par chimie combinatoire, mettant en œuvre une microdialyse couplée à une HPLC ou une électrophorèse capillaire d'affinité, techniques connues de l'homme de l'art.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce que ledit récepteur scavenger est choisi parmi les récepteurs SR-A l , SR-B l, SR-Cl, Marco, LOX, notamment LOX-1, CD36, de préférence d'origine humaine, et notamment les récepteurs dont les références aux documents et/ou ont été décrits ci-avant, de manière tout à fait préférée, le récepteur scavenger Marco , en particulier celui dont la séquence de l'ADNc codant pour ce récepteur est décrite dans la banque de données GenBank sous le numéro d'accession A.N. NM 006770 ou le récepteur LOX-1 , en particulier celui dont la séquence de l'ADNc codant pour ce récepteur LOX-1 humain est décrite dans la banque de données GenBank sous le numéro d'accession A.N. AB 010710, ou les récepteurs dont la séquence peptidique ou nucléique présente au moins un des pourcentages d'identité préférés cités ci-avant, ou leur fragment comprenant le site de fixation de ces récepteurs.
Dans un mode de réalisation préféré, la deuxième étape b) du procédé d'identification selon l'invention comprend une étape d'identification de la molécule Toll associée à la signalisation cellulaire consécutivement à la fixation de la molécule identifiée sur le récepteur scavenger.
De préférence ladite deuxième étape b) comprend les étapes suivantes :
A) la mise en contact de ladite molécule sélectionnée à ladite première étape a) du procédé général en deux étapes avec une cellule exprimant ledit récepteur Toll, de préférence transfectée avec un acide nucléique codant pour ledit récepteur Toll et de préférence en outre avec un acide nucléique codant pour ledit récepteur scavenger ce dernier étant de préférence aussi identique au récepteur scavenger utilisé à l'étape a) ; B) la mesure d'un marqueur significatif d'une activation cellulaire, de préférence médiée par ledit récepteur Toll, de manière plus préférée la mesure de la production d'une ou de plusieurs cytokines ;
C) la sélection de ladite molécule, si la mesure met en évidence la génération ou l'augmentation d'une activité cellulaire, de préférence par rapport à un contrôle témoin, de préférence le contrôle témoin est une cellule n'exprimant pas ledit récepteur Toll, mais pouvant, de préférence, exprimer ledit récepteur scavenger, notamment le récepteur scavenger utilisé à l'étape a).
L'activation cellulaire peut être mesurée en évaluant la production de cytokines, l'expression de molécules de surface ou par toute technique connue de l'homme du métier à cet effet. On pourra ainsi notamment utiliser des transfectants stables exprimant conjointement le scavenger récepteur et un des Tir, qui seront incubés avec la molécule identifiée.
Pour ce faire, il est possible d'incuber la molécule testée avec les transfectants et de suivre la production de cytokines (par exemple par ELISA), l'activation du facteur de transcription NF-kB (activation associée à la production de cytokines pro- inflammatoires) ou la modulation d'expression de molécules de surface (par exemple la molécule ICAM-1).
Il est aussi possible de mesurer un flux calcique (associé à la signalisation cellulaire) par une technique fluorométrique.
Les cellules transfectées sont obtenues à partir de cellules couramment utilisées à cet effet, telles que les cellules CHO, Cos ou HEK.293. Elles peuvent être transfectées de façon stable ou transitoire.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce que ledit récepteur Toll est choisi parmi les récepteurs Toll apparentés Tir 1 , 2, 3, 4, 5 et 6, de préférence d'origine humaine, et notamment les récepteurs dont les références aux documents et/ou ont été décrits ci-avant, de manière tout à fait préférée le récepteur Tir 2, en particulier celui dont la séquence de l'ADNc codant pour ce récepteur est décrite dans la banque de données GenBank sous le numéro d'accession A.N. U88878 ou le récepteur Tir 4, en particulier celui dont la séquence de l'ADNc codant pour ce récepteur humain est décrite dans la banque de données GenBank sous le numéro d'accession A.N. U8888, ou les récepteurs dont la séquence peptidique ou nucléique présente au moins un des pourcentages d'identité préférés cités ci-avant, ou leur fragment Toll comprenant le domaine responsable de la médiation du signal d'activation des cellules.
Sous un autre aspect de l'invention, le procédé d'identification selon l'invention est, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre en une seule étape α).
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce que l'unique étape α) met en œuvre une cellule cotransfectée par un récepteur scavenger et un récepteur Toll.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, cette seule étape met en œuvre une cellule cotransfectée par un récepteur scavenger et un récepteur Toll à l'aide d'un vecteur d'expression eucaryotique permettant l'expression concomitante et à des niveaux équivalents des deux molécules recombinantes.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce que l'unique étape α) met en œuvre une cellule cotransfectée par un récepteur scavenger et un récepteur Toll.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce que l'étape α) comprend les étapes suivantes :
X) la mise en contact d'une molécule, ou d'un mélange de molécules, connue ou inconnue, à tester avec une cellule hôte cotransfectée avec un acide nucléique codant pour un récepteur scavenger et un acide nucléique codant pour un récepteur Toll, dans un milieu permettant la fixation éventuelle de la ou desdites molécules testées avec ledit récepteur scavenger et/ou l'activation cellulaire éventuelle de ladite cellule médiée par ledit récepteur Toll ;
Y) la mise en évidence de l'activation cellulaire de ladite cellule médiée par ledit récepteur Toll par la mesure d'au moins un marqueur significatif d'une activation cellulaire, de préférence médiée par ledit récepteur Toll ; et
Z) la sélection de cette molécule si ladite mesure à l'étape Y) met en évidence la génération ou l'augmentation de ladite activité cellulaire mesurée, de préférence par rapport à un contrôle témoin. Dans un mode de réalisation préféré, le procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce que lesdits récepteurs Toll et scavengers, lesdits marqueurs de mesure d'activité cellulaire utilisés sont de préférence ceux indiquées pour le procédé en deux étapes tels que décrits ci-avant.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé d'identification en une étape ou en deux étapes selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape d'identification de la structure de la molécule sélectionnée si celle-ci n'est pas connue.
En effet, il sera possible d'utiliser dans les procédés selon la présente invention, une molécule à tester, prise de manière isolée et dont la structure n'est pas connue, ou un mélange de molécules à tester connues ou inconnues, dont les étapes du procédé ci- avant décrit permettront seulement d'identifier leur capacité fonctionnelle. Ladite étape d'identification de la structure aura pour objectif d'identifier la structure de la molécule inconnue ayant cette capacité, ou d'identifier parmi l'ensemble des molécules connues testées simultanément celle(s) présentant cette capacité.
Par exemple, de telles molécules à tester, seules ou en mélange, pourront être issues de synthèse chimique par chimie combinatoire, de banques de clones d'expression de peptides ou d'extraits naturels contenant des mélanges complexes.
Les molécules sélectionnées pourront ensuite être analysées, si nécessaire, par toute méthode d'analyse permettant de définir la structure d'un composé chimique ou biochimique connue de l'homme de l'art telle que, sans s'y limiter, par spectrométrie de masse, HPLC, infrarouges et/ou par RMN (Résonance Magnétique Nucléaire). Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé d'identification en une ou deux étapes selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de détermination de la capacité de ladite molécule ainsi identifiée d'être immunogène.
Dans ce mode préféré de réalisation de l'invention, après avoir réalisé le procédé selon l'invention, on effectue une étape supplémentaire consistant à analyser ou évaluer l'immunogénicité de la molécule sélectionnée.
Pour ce faire, on peut coupler un haptène (par exemple le TNP (Trinîtrophényl)) ou antigène tel qu'un oligosaccharide, un lipide ou un peptide à la molécule identifiée.
Des souris sont ensuite injectées par voie intra péritonéale ou sous-cutanée selon des protocoles connus de l'homme de métier. La production d'Ac anti-haptène, - oligosaccharide, -lipide ou -peptide est analysée par ELISA. On pourra également évaluer la capacité de ladite molécule sélectionnée à générer et/ou à augmenter la réponse immune de type CTL par mesure de l'activité cytotoxique de cellules effectrices de type lymphocyte générées après immunisation avec ladite molécule sélectionnée, la mesure du pourcentage de lyse de cellules co- incubées avec lesdites cellules effectrices étant par exemple évaluée par le taux de relargage de Cr comme décrit par exemple, mais sans s'y limiter, dans la demande de brevet WO 00/48628 ou WO 00/48629 aux exemples 4 et 5.
Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé d'identification selon l'invention, caractérisé pour l'identification de nouvelles HSP, de nouvelles Omp ou leurs analogues.
Par analogue d'HSP ou d'OmpA (« Outer Membrane Protéine de type A »), on entend désigner ici des composés capables d'exercer au moins l'une des fonctions d'adjuvant de l'immunité, et/ou de protéine porteuse favorisant une réponse immune efficace contre des peptides ou des oligosaccharides, notamment en absence d'adjuvant, notamment une réponse de type CTL, telle que décrite ci-avant dans le paragraphe concernant les HSP ou les OmpA.
Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé d'identification selon l'invention, pour :
- l'identification en particulier de nouveaux adjuvants de l'immunité ; et/ou - l'identification de molécule capable de cibler un composé tel qu'une substance à activité biologique, notamment un antigène ou haptène, qui lui est associé, de préférence par couplage covalent ou par affinité, vers une cellule exprimant ledit récepteur scavenger et dont l'activité cellulaire est médiée pat un récepteur Toll apparentée, ledit composé associé à la molécule étant de préférence internalisée dans la cellule ciblée ; et/ou
- l'identification de molécule destinée à moduler l'activité biologique de composé (ou substance) qui lui est associé par l'intermédiaire des cellules exprimant ledit récepteur scavenger et dont l'activité cellulaire est médiée pat un récepteur Toll apparentée, notamment les cellules présentatrices d'antigène comme les cellules dendritiques immatures ; et/ou
- l'identification de molécule destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre un antigène ou haptène qui lui est associé ; et/ou - l'identification de molécule destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire de type T cytotoxîque ; et/ou
- l'identification de molécule destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre un agent infectieux ou une cellule tumorale. Un objet de l'invention concerne également de nouvelles molécules susceptibles d'être obtenues par la mise en œuvre de la méthode selon l'invention, telle que décrite ci-dessus. Ces nouvelles molécules susceptibles d'être obtenues par la mise en œuvre de la méthode selon l'invention n'englobent pas les ligands connus à ce jour qui seraient susceptibles de se lier aux récepteurs scavenger et signalées via un récepteur Toll tels que les HSP, les lipoprotéines telles que les OspA, l'OmpA de Klebsiella pneumoniae et le pEA (pseudomonas Exotoxin A).
Ainsi, la méthode selon l'invention pourra notamment être utilisée pour identifier de nouvelles HSP ou de nouvelles Omp.
Ces nouvelles molécules ainsi identifiées pourront être utilisées de la même façon que les HSP ou les Omp, notamment l'OmpA de Klebsiella pneumoniae dénommé P40 dont l'utilisation comme protéine adjuvante et/ou porteuse pour induire ou augmenter la réponse immune de type humoral ou CTL a été décrite en particulier dans de nombreux brevets et ainsi bien connue de l'homme de l'art, et de façon tout à fait particulière lorsque ladite P40 est associée à un antigène tumoral ou issu d'un agent infectieux.
L'invention a encore pour objet une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins une molécule se liant aux récepteurs scavenger et signalée via un récepteur Toll, et préférentiellement au moins une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en œuvre de la méthode selon l'invention.
De préférence, ces molécules utilisées dans une composition pharmaceutique sont différentes des HSP, des lipoprotéines telles que les OspA, de l'OmpA de Klebsiella pneumoniae et du pEA.
L'invention a également pour objet la composition selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique comprend en outre, un antigène, immunogène ou haptène. Par « immunogène, antigène ou haptène», on entend notamment désigner tout composé exprimé par un agent infectieux, tel un virus, une bactérie, une levure, un champignon ou un parasite, par une cellule tumorale, ou un de leurs analogues structuraux, qui seul ou en association avec un adjuvant ou porteur est capable d'induire une réponse immunitaire spécifique dudit agent infectieux ou de ladite cellule tumorale.
On entend également désigner par "immunogène, antigène ou haptène" dans la présente description un composé présentant une analogie structurale avec ledit antigène ou haptène capable d'induire une réponse immunologique dirigée contre ledit antigène ou haptène dans un organisme préalablement immunisé avec ledit composé analogue. Ledit antigène ou haptène peut notamment être choisi parmi les protéines, les glycopeptides, les lipopeptides, les polysaccharides, les oligosaccharides, les acides nucléiques et les lipides.
Dans une forme de réalisation de l'invention, ledit antigène, immunogène ou haptène dérive d'un virus, d'une bactérie, d'un parasite ou d'un champignon. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un peptide dérivé de micro-organisme responsable de pathologies des voies aériennes choisi parmi le VRS, le para influenza virus (PIV), l'influenza virus, les hantavirus, les streptocoques, les pneumocoques, haemophilus influenza type b, les rhinovirus, les coronovirus et les méningocoques. L'antigène, immunogène ou haptène peut être associé ou spécifique d'une cellule tumorale.
Parmi les cancers dont les tumeurs expriment un antigène tumoral associé pouvant être prévenus ou traités par les utilisations selon la présente invention, on peut citer en particulier, mais sans s'y limiter : * le cancer du sein, du poumon, du colon, et le carcinome gastrique
(Kawashima et al., Cancer Res., 59:431-5, 1999) ;
* le mésothéliome, l'ostéosarcome, les cancers du cerveau (Xie et al., J. Natl. Cancer. Inst, 91 : 169-75, 1999) ;
* le mélanome (Zheuten et al., Bratilsl. Lek. Listy, 99:426-34, 1998) ; * l'adénome cystique du pancréas (Hammel et al., Eur. J. gastroenterol.
Hepatol., 10:345-8, 1998) ;
* le cancer colorcctal (Ogura et al., Anticancer Res., 18:3669-75, 1998) ; * le carcinome des cellules rénales (Jantzer et al., Cancer Res., 58:3078-86, 1998); et
* le cancer de l'ovaire et du cervix (Sonoda et al., Cancer., 77: 1501-9, 1996). Les compositions selon l'invention peuvent contenir en outre un adjuvant. Ce dernier peut notamment être choisi parmi le MPL-A, le Quil-A, l'ISCOM, le Diméthyl Dioctadécyl Ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC), les CpG, la Leif, la CT (Toxoïde du choléra), la LT (Heat Labil Toxine) et les versions détoxifiées de la CT ou la LT.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la composition pharmaceutique selon l'invention ne contient pas d'adjuvant autre que la molécule se liant aux récepteurs scavengers et signalée via un récepteur Toll, et notamment aucun autre adjuvant permettant d'induire ou d'augmenter l'immunogénicité ou une réponse
CTL.
Au sens de la présente invention, le milieu pharmaceutiquement acceptable est le milieu dans lequel les composés de l'invention sont administrés, préférentiellement un milieu injectable chez l'homme. Il peut être constitué d'eau, d'une solution aqueuse saline ou d'une solution aqueuse à base de dextrose et/ou de glycérol.
L'invention comprend également une composition selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité ; ainsi, elle peut être véhiculée sous forme de liposomes, virosomes, nanosphères, microsphères ou microcapsules.
L'utilisation d'une molécule se liant aux récepteurs scavengers et signalée via un récepteur Toll, et préférentiellement d'une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en œuvre de la méthode selon l'invention comme porteur et/ou adjuvant dans un vaccin constitue un autre objet de l'invention.
De préférence, ces molécules utilisées comme porteur et/ou adjuvant dans un vaccin sont différentes des HSP, des lipoprotéines telles que les OspA, de l'OmpA de Klebsiella pneumoniae et du pEA.
L'invention concerne encore l'utilisation d'une molécule se liant aux récepteurs scavengers et signalée via un récepteur Toll, et préférentiellement d'une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en œuvre de la méthode selon l'invention, pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers.
De préférence, ces molécules utilisées pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers sont différentes des HSP, des lipoprotéines telles que les OspA, de l'OmpA de Klebsiella pneumoniae et du pEA.
L'invention a encore pour objet l'utilisation d'une molécule se liant aux récepteurs scavengers et signalée via un récepteur Toll, et préférentiellement d'une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en œuvre de la méthode selon l'invention, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre un agent infectieux ou une cellule tumorale.
De préférence, ces molécules utilisées pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre un agent infectieux ou une cellule tumorale sont différentes des HSP, des lipoprotéines telles que les OspA, de l'OmpA de Klebsiella pneumoniae et du pEA.
La présente invention est aussi relative à l'utilisation d'une molécule se liant aux récepteurs scavengers et signalée via un récepteur Toll, et préférentiellement d'une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en œuvre de la méthode selon l'invention, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou à accroître une réponse T cytotoxique contre un agent infectieux ou une cellule tumorale. On pourra utiliser de telles compositions en thérapies ex vivo ou in vivo.
De préférence, ces molécules utilisées pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou à accroître une réponse T cytotoxique contre un agent infectieux ou une cellule tumorale sont différentes des HSP, des lipoprotéines telles que les OspA, de l'OmpA de Klebsiella pneumoniae et du pEA.
L'invention concerne encore l'utilisation d'une molécule se liant aux récepteurs scavengers et signalée via un récepteur Toll, et préférentiellement d'une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en œuvre de la méthode selon l'invention, pour le ciblage spécifique d'une substance biologiquement active qui lui est associée vers les cellules présentatrices d'antigènes. De préférence, ces molécules utilisées pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou à accroître une réponse T cytotoxique contre un agent infectieux ou une cellule tumorale sont différentes des HSP, des lipoprotéines telles que les OspA (« Outer Surface Protein »), de l'OmpA de Klebsiella pneumoniae et du pEA.
Dans l'utilisation selon l'invention, la nouvelle molécule peut se fixer spécifiquement sur les cellules présentatrices d'antigènes et/ou être internalisée dans lesdites cellules.
Par cellules présentatrices d'antigènes ou APC, on entendra désigner dans la présente invention, les APC professionnelles formant partie intégrante du système immunitaire telles que les cellules dendritiques, les macrophages, les lymphocytes B ou les monocytes. De préférence, l'invention concerne l'utilisation pour le ciblage vers les cellules dendritiques.
Par substance biologiquement active, on entend désigner tout composé capable d'exercer une activité thérapeutique et dont l'activité peut être modulée par l'intermédiaire des cellules APC. Comme exemple de telles substances biologiquement actives, on peut citer sans s'y limiter les composés immunogènes tels que des antigènes ou haptènes de nature protéique, poly ou oligosaccharidique, glycoprotéique ou lipoprotéique. Par substance biologiquement active, on entend encore désigner tout composé capable de modifier l'activité fonctionnelle des cellules APC, en particulier leur croissance, leur différentiation ou leur système d'expression. On peut citer comme exemple de tels composés, sans s'y limiter, les facteurs de croissance cellulaire dont les cytokines (IL-4, IL-3, GM-CSF,TNF-alpha). Ainsi, la substance biologiquement active peut être choisie parmi les protéines ou les peptides, les lipopeptides, les poly- ou oligosaccharides, les acides nucléiques, les lipides et, de manière générale, parmi l'ensemble des substances chimiques.
Enfin, la présente invention a pour objet l'ensemble des utilisations selon la présente invention caractérisées en ce que ladite molécule capable de se lier aux récepteurs scavengers et/ou signalée via un récepteur Toll, et, le cas échéant, capable d'être internalisée après ladite fixation dans une cellule présentatrice d'antigène, est identifiée par un procédé en une ou deux étapes selon la présente invention. Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.
Légende des figures : La figure 1 correspond au profil obtenu par analyse au FACSavantage cytofluoromètre et démontre que des cellules CHO transfectées avec MARCO lient P40 de façon plus importante que des cellules transfectées avec CD83 utilisées comme contrôle négatif ou des cellules CHO non transfectées.
La figure 2 correspond à la quantification en IL-8 de cellules 293 et démontre la capacité des cellules 293 lorsqu'elles sont transfectées par Tlr2 ou Tlr4 à répondre aux Omp A.
Exemple 1 : Les Omp se lient à un récepteur scavanger A. Génération des transfectants MARCO : L'ADNc codant pour le récepteur scavenger MARCO (séquence identifiée dans la banque de données GenBank sous le Numéro d'accession A.N. NM006770, SEQ ID No. 1 de la liste des séquences ci-après) a été clone dans un vecteur d'expression pEBS/PL contenant une séquence codant pour une protéine C accolée à la séquence insérée. Des cellules CHO (ATCC, Manassas, VA) ont été transfectées en utilisant la technique Effecten (Qiagen, Courtaboeuf, France) et cultivées dans un milieu DMEM supplémenté avec 10 % de FCS et sélectionnées à l'aide de l'hygromycine (commercialisés par Life Technologies). Après cette étape de clonage, les cellules exprimant MARCO ont été sélectionnées en se basant sur l'expression de la protéine C utilisée comme marqueur, déterminée par Western blotting. Les cellules ont été lysées dans 10 mM de tampon phosphate pH 7.4 contenant 0,5 % de Nonidet P40 (Sigma) et des inhibiteurs de protéases (Boehringer Mannheim). Les protéines de 5xl06 cellules ont été séparées par électrophorèse sur un gel à 10 % de polyacrylamide gel dans des conditions non réductrices, puis transférées sur une membrane de nitrocellulose (commercialisée par Biorad, Ivry sur Seine, France). Après saturation, les membranes ont été incubées en présence d'anticorps monoclonaux anti-protéine C (Roche Diagnostics, Meylan, France). Après lavage, les membranes ont été incubées avec des anticorps antî-immunoglobuline de souris marqués à la péroxydase (Dako, Glostrup, Denmark) ; les anticorps fixés ont été détectés en utilisant le système ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden).
B. Etude de la fixation de P40 au FACS :
Les macrophages ainsi générés sont incubés dans du tampon FACS (RPMI contenant 0,1 % de sérum albumine bovine) à 2 x 105 cellules par puits de 96 fonds pointus pendant 20 minutes en présence de différentes concentrations de P40 marqué
4-88 488 avec de l'Alexa ou avec de la glycophorine A marquée par de l'Alexa . Le
488 marquage à l'Alexa est réalisé comme décrit par le commerçant (Molecular Probes). Les cellules sont alors lavées en tampon FACS et analysées en utilisant un FACSvantage cytofluoromètre.
C. Résultats :
Les résultats décrits dans la figure 1 montrent que des cellules CHO transfectées avec MARCO lient P40 de façon plus importante que des cellules transfectées avec CD83 utilisées comme contrôle négatif ou des cellules CHO non transfectées. Exemple 2 : Les Omp sont internalisés par un récepteur scavanger
L'internalisation de P40 a été étudiée par microscopie confocale. Les macrophages humains sont incubés dans du tampon FACS (RPMI contenant 0, 1 % de sérum albumine bovine) à 2 x 105 cellules par puits de 96 fonds pointus pendant 20
488 minutes en présence de 0.5 mM P40 marqué avec de l'Alexa , lavés puis incubés ou non à 37°C. Les macrophages sont finalement cytospinés et observés avec un microscope confocal en utilisant un microscope inversé LSM510 commercialisé par Zeiss muni d'un objectif apochromat plan 63 X. Dans certaines expériences, 150 mM de diméthyl amiloride (DMA) ont été ajoutés 10 minutes avant ajout de P40 ainsi que dans
488 le tampon FACS utilisé. La fluorescence de l'alexa a été mesurée avec un filtre 530- 30 nm après excitation avec un laser à ion argon à 488 nm.
Exemple 3 : Les Omp stimulent les cellules via un récepteur Toll A. Génération des transfectants Tir
L'ADNc de Tir 2, Tir 4 et CD 14 (séquences respectivement identifiées dans la banque de données GenBank sous les numéros d'accession A.N. U88878, U88880 et M8651 1 , et dont leur séquence nucléique est respectivement représentée par les séquences SEQ ID No. 5, No. 7 et No. 9 dans la liste des séquences ci-après) a été clone dans le vecteur pCDNA3.1 (Invitrogen, Groningen, Hollande), par la suite utilisé pour transfecter des cellules 293 (ATCC) par lipofection tel que décrit ci-dessus.
B. Stimulation of Tlr-transfected cells
48 h après la transfection, les cellules ont été lavées et cultivées dans du milieu sans FCS, RPMI 1640 pendant 12 h. Après remplacement du milieu, les cellules ont été soit non stimulées, soit stimulées pendant 6 h avec 0.5 mM d'OmpA, 0.5 mM de BB ou
100 pg ml-1 de LPS. L'IL-8 a ensuite été quantifiée par ELISA (R&D Systems) dans le surnageant obtenu après les 6 h.
C. Résultats Comme décrit dans la figure 2, les cellules 293 lorsqu'elles sont transfectées par
Tir 2 acquièrent la capacité de répondre aux OmpA. L'effet des OmpA ne requiert pas la présence de CD 14 comme c'est parfois le cas pour des lipoprotéines ou le LPS qui activent également les cellules via Tir 4. Exemple 4 : Les HSP se lient à un récepteur scavanger A. Génération des CD
Génération in vitro de cellules dendritiques humaines immatures. Les cellules dendritiques humaines sont générées à partir de monocytes isolés du sang périphérique. Le sang est prélevé par leucophérèse en présence d'anticoagulant comme par exemple l'héparinate de lithium. Les cellules mononucléées (CMN) sont isolées de sujets sains par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque (densité≈ 1,077) (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suède). Les cellules du sang sont centrifugées à 1500 rpm pendant 30 minutes à température ambiante. Les CMN, localisées à l'interface Ficoll-plasma, sont récupérées et lavées deux fois en présence de milieu RPMI 1640 (Life technologies, Cergy Pontoise, France). Les monocytes sont purifiés par sélection positive en utilisant un séparateur magnétique de cellules (MACS™ ; Miltenyi Biotex, Bergisch Gladbach, Allemagne) en accord avec les instructions du fabriquant. Les CMN sont incubées pendant 20 minutes à 4°C avec des billes magnétiques sur lesquelles sont fixées un anticorps monoclonal anti-CD14 humain. Après lavage, la suspension cellulaire plus billes est déposée sur une colonne et soumise à un champ magnétique. Après trois lavages, la colonne n'est plus soumise au champ magnétique et les monocytes sont collectés par gravitation. La pureté des monocytes est évaluée par cytofluorométrie (cytofluoromètre FACScan ; Becton Dickinson, Erembodegem, Belgique) sur la base des paramètres taille-granulosité des cellules. La pureté est supérieure à 98 %. Les monocytes sont ensuite mis en culture à la concentration de 5xl06 cellules/ml dans le milieu suivant (dénommé par la suite milieu de culture complet) : milieu RPMI 1640 supplémenté de 10 % de sérum de veau foetal (chauffage à 56°C pendant 30 minutes), 2 mM de L-glutamine, 50 U/ml de pénicilline et 50 ug/ml de streptomycine (Life technologies) dans des plaques de culture 6 puits (Nunc, Roskilde, Danemark) à raison de 5 ml de milieu par puits. Les cellules sont activées avec 20 ng/ml d'IL-4 humaine recombinante et 20 ng/ml de GM-CSF humaine recombinante (R&D Systems, Abingdon, Royaume Uni). Après 6 jours de culture (37°C, 5 % C02 en atmosphère humide), le phénotype des cellules est défini par cytofluorométrie.
B. Analyse par FACS
Les cellules sont lavées dans du tampon FACS puis réparties dans des puits d'une plaque de culture 96 puits à fond conique à raison de 2xl05 cellules dans un volume de 50 ml de tampon FACS. Puis les cellules sont incubées 10 min dans du tampon FACS en absence ou en présence de 100 mg/ml de sérum albumine bovine (SAB) ou de SAB maleylé. Après 10 min 10 mg/ml de HSP70 marqué à la biotine sont ajoutés. Après 20 min à 4°C, les cellules sont lavées et incubées avec de l'avidine marquée FITC. C. Résultats
La SAB maleylé inhibe la fixation des HSP70 aux DC alors que la SAB non maléylé n'a aucun effet. Cela indique que les HSP se lient à un récepteur scavanger. Exemple 5 : Méthode d'identification de nouvelles molécules en deux étapes
La méthodologie décrite ci-dessous permet l'identification en deux étapes de molécules se liant à un SR et signalant via une molécule Tir :
- la première étape est une sélection des molécules ciblant un SR,
- la deuxième étape sélectionne parmi ces molécules celles signalant via une molécule Tir.
Dans l'exemple, nous présenterons une méthode d'identification de molécules d'origine bactérienne à l'aide d'une banque d'expression. Cette méthodologie est applicable à l'identification de molécules exprimées par n'importe quel organisme multicellulaire en utilisant des banques d'expression procaryotîques ou eucaryotiques et contenant soit des ADNc, soit de l'ADN génomique.
Génération de clones stables exprimant des SR.
Les ADNc codant pour les SR identifiés jusqu'à maintenant sont intégrés dans un vecteur d'expression eucaryotique en aval d'une séquence codant pour un peptide signal (permettant de produire des molécules recombinantes solubles). Les cellules CHO sont transfectées par lipofection puis mises en culture avec un agent de sélection, comme par exemple l'hygromycine. La sélection de clones exprimant le transgène pourra se faire de différentes manières en fonction des sondes disponibles : - utilisation d'un anticorps monoclonal, couplé ou non à une molécule fluorescente,
- utilisation de Dil-Ac-LDL fluorescent [une molécule étant définie comme un SR lorsqu'elle fixe les LDL modifiés comme les LDL oxydés ou les LDL acétylés, respectivement Ox-LDL et Ac-LDL], - sélection de transfectants exprimant de manière contemporaine le SR et une molécule comme l'EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein). Dans ce cas, l'expression des deux molécules recombinantes (EGFP et SR) est sous le contrôle d'un même promoteur ; les ADNc sont séparés par une séquence IRES qui permet la synthèse de deux protéines à partir d'un seul ARNm. Dans ce cas, toute cellule exprimant la EGFP exprime de manière contemporaine le SR.
Les clones exprimant le plus fortement le SR recombinant seront sélectionnés par cytofluorométrie (utilisation d'un trieur de cellules), par exemple. Les transfectants seront maintenus en culture en présence de l'agent de sélection.
Création de la banque d'expression. L'ADN génomique bactérien est cassé mécaniquement afin d'obtenir des fragments d'une taille d'environ 1 kb. Les fragments d'ADN sont ensuite intégrés dans un vecteur d'expression présentant un double promoteur procaryote/eucaryote. Ce plasmide présente au moins les caractéristiques suivantes : une séquence codant pour un peptide signal en amont de l'ADN exogène et une séquence codant pour un Tag en aval de l'ADN exogène. Le Tag sera choisi sur la base de l'existence d'anticorps monoclonaux dirigés contre cette séquence Tag. Après transformation avec les plasmides contenant les fragments d'ADN génomique, les bactéries contenant un ADN plasmidique sont sélectionnées (utilisation d'une résistance à un antibiotique exprimée par le plasmide) puis clonées. Les cellules eucaryotes (comme par exemple les cellules CHO ou HEK-293) seront transfectées par électroporation ou lipofection avec 10 plasmides (n=10). 24 heures après la transfection, le milieu de culture est changé et les cellules sont maintenues en culture dans un milieu sans FCS ni acides gras. Les surnageants sont ensuite collectés après 48 h de culture et concentrés. La production de protéines recombinantes solubles pourra être évaluée aisément par Dot-blotting. Identification des clones produisant une molécule se fixant à un SR.
Les surnageants de culture contenant les molécules recombinantes solubles sont incubés avec les différents clones stables exprimant les SR. Après lavage, les cellules sont incubées avec un anticorps fluorescent dirigé contre la séquence Tag choisie. La fluorescence sera ensuite analysée par cytofluorométrie. Après identification des groupes produisant une molécule soluble dirigée contre un SR, chacun des plasmides contenus dans le groupe de 10 clones sera analysé individuellement afin d'identifier celui produisant la molécule d'intérêt. La spécificité de fixation au SR sera évaluée contre tous les autres SR. La nature de la protéine sera ensuite déterminée par séquençage du fragment d'ADN génomique. Production de la molécule recombinante.
Dans le cas où la séquence présente dans le plasmide code pour la protéine entière, nous analyserons directement quelle molécule Tir est impliquée dans la signalisation. Si ce n'est pas le cas, le gène sera clone en entier (détermination du cadre de lecture complet). Ceci pourra se faire de différentes manières : - si la séquence issue de la souche choisie est connue dans la littérature, la séquence complète sera amplifiée par PCR à l'aide de sondes oligonucléotidiques spécifiques,
- si la séquence issue de la souche choisie n'est pas connue mais homologue à un gène déjà identifié dans une autre souche, la séquence complète sera amplifiée par PCR à l'aide de sondes oligonucléotidiques dégénérées,
- si la séquence n'est pas connue dans les banques de données publiques, la séquence complète sera identifiée par séquençage de l'ADN génomique. La séquence complète sera insérée dans un vecteur d'expression procaryotique en aval d'une séquence codant un Tag contre lequel des anticorps monoclonaux sont disponibles. Après sélection d'un clone produisant de manière élevée la protéine, la protéine sera produite selon des techniques connues d'homme de métier et purifiée par immunoprécipitation à l'aide d'un anticorps anti-Tag immobilisé sur une résine. La capacité de la molécule recombinante purifiée à se fixer au SR sera réévaluée par cytofluorométrie comme décrit ci-dessus.
Identification de la molécule Tir associée à la signalisation via le SR.
Les ADNc codant pour les molécules Tir 1 à Tir 6 humaines seront clones par PCR et insérés dans un vecteur d'expression contenant une séquence codant pour une séquence Tag, en l'occurrence la séquence FLAG™ (Sigma, St Louis, MO) de telle manière que la séquence FLAG soit exprimée à l'extrémité du domaine extracellulaire. Les transfectants stables exprimant le SR d'intérêt seront transfectés avec chacun des plasmides codant pour les Tir. L'expression du Tir sera évaluée par cytofluorométrie en utilisant en anticorps anti-FLAG. Les transfectants seront ensuite mis en culture en présence de la molécule recombinante d'intérêt. L'activation des cellules transfectées sera évaluée par la néosynthèse de médiateurs solubles aisément quantifiables par ELISA, comme par exemple l'interleukine-8 ou le TNFalpha. Exemple 6 : Méthode en une étape Dans ce cas, la sélection des molécules d'intérêt se fait sur des transfectants exprimant conjointement un SR et une molécule Tir. Les banques d'ADNc ou d'ADN génomique ainsi que la production des protéines recombinantes solubles ont été décrites ci-dessus.
Deux approches sont possibles pour générer les transfectants exprimant de manière contemporaine un SR et une molécule Tir :
- les cellules sont transfectées par électroporation ou lipofection avec deux vecteurs, l'un codant pour le SR et l'autre pour la molécule SR ; dans ce cas, on choisira deux plasmides chacun codant pour une protéine de résistance à une drogue différente,
- les cellules sont transfectées par électroporation ou lipofection avec un vecteur contenant les deux séquences d'intérêt séparées par une séquence IRES (voir ci-dessus les propriétés de cette séquence). Dans ce cas, il faut cloner les SR en association avec chacune des séquences Tir connues. Dans les deux cas, la molécule Tir exprime une séquence Tag FLAG à l'extrémité de son domaine extracellulaire. La sélection des clones exprimant conjointement le SR et la molécule Tir se fera par cytofluorométrie comme décrit ci- dessus en utilisant un anticorps monoclonal anti-FLAG™ (couplé à une molécule fluorescente) pour l'expression du SR et de la molécule fluorescente Dil-Ac-LDL pour l'expression de la molécule Tir. Après transfection, les cellules sont cultivées en présence du ou des agents de sélection.
Les clones cellulaires sont ensuite utilisés dans les tests de screening comme décrit précédemment. Dans ce cas, le paramètre unique mesuré sera l'activation des cellules par les protéines recombinantes solubles (en mesurant par exemple la production d'IL-8 ou de TNFalpha par les transfectants).

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'identification de nouvelles molécules d'intérêt thérapeutique, caractérisé en ce qu'on sélectionne les molécules qui se lient aux récepteurs scavengers et qui sont signalées via un récepteur Toll.
2. Procédé d'identification selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il comprend les deux étapes distinctes suivantes : a) la sélection des molécules qui se lient aux récepteurs scavengers ; et b) la sélection, parmi les molécules sélectionnées à l'étape a), des molécules qui fournissent un signal d'activation via un récepteur Toll.
3. Procédé d'identification selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'étape a) comprend les étapes suivantes :
1) la mise en contact d'une molécule, ou d'un mélange de molécules, connue ou inconnue à tester avec un récepteur scavenger, dans un milieu permettant la fixation éventuelle d'une molécule testée avec ledit récepteur scavenger ;
2) la mise en évidence de la fixation ou non de ladite molécule testée avec ledit récepteur scavenger ; et
3) la sélection de cette molécule si sa fixation avec ledit récepteur scavenger a été mise en évidence à l'étape 2).
4. Procédé selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que la sélection des molécules capables de se lier au récepteur scavenger est réalisée par une méthode choisie parmi les méthodes suivantes :
- une chromatographie d'affinité ;
- une identification par FACS des molécules se liant à des cellules transfectées par un récepteur scavenger ;
- une technique de type BIACORE ; ou
- un clonage par expression à partir d'une sonde portant un récepteur scavenger.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit récepteur scavenger est choisi parmi les SR-Al , SR-B l , SR-Cl , Marco, LOX, notamment LOX- 1 , CD36, de préférence d'origine humaine.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit récepteur scavenger est choisi parmi : - les récepteurs scavengers Marco ;
- le récepteur Marco dont la séquence de l'ADNc codant pour ce récepteur est la séquence SEQ ID No. 1 ;
- leur fragment comprenant le site de fixation de ces récepteurs ; ou - les récepteurs dont la séquence peptidique ou nucléique présente au moins un pourcentage d'identité d'au moins 80 % avec ces récepteurs Marco ou leurs séquences d'ADNc.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que la deuxième étape b) du procédé d'identification selon l'invention comprend une étape d'identification du récepteur Toll -associé à la signalisation cellulaire consécutivement à l'étape a).
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que la deuxième étape b) du procédé d'identification comprend les étapes suivantes :
A) la mise en contact de ladite molécule sélectionnée à ladite première étape a) avec une cellule exprimant ledit récepteur Toll ;
B) la mesure d'un marqueur significatif d'une activation cellulaire, de préférence médiée par ledit récepteur Toll ;
C) la sélection de ladite molécule, si ladite mesure à l'étape B) met en évidence la génération ou l'augmentation de ladite activité cellulaire mesurée, de préférence par rapport à un contrôle témoin.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, caractérisé en ce que ladite cellule exprimant ledit récepteur Toll à l'étape A) est une cellule hôte transfectée avec un acide nucléique codant pour ledit récepteur Toll.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite cellule exprimant ledit récepteur Toll à l'étape A) est une cellule hôte transfectée en outre avec un acide nucléique codant pour un récepteur scavenger, de préférence ledit récepteur scavenger utilisé à l'étape a).
1 1. Procédé selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que ledit marqueur utilisé à l'étape B) est choisi parmi : - la mesure de la production d'une ou de plusieurs cytokines par ladite cellule utilisée à l'étape A) ; - la mesure de la modulation de l'expression de molécules de surface par ladite cellule utilisée à l'étape A) ;
- la mesure de l'activation du facteur de transcription NF-kB par ladite cellule utilisée à l'étape A) ; - la mesure du flux calcique, de préférence par une technique fluorométrique.
12. Procédé selon l'une des revendications 8 à 1 1 , caractérisé en ce que ledit marqueur utilisé à l'étape B) est la mesure de la production d'une ou plusieurs cytokines par ladite cellule utilisée à l'étape A).
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que ledit récepteur Toll est choisi parmi les récepteurs Toll Tir 1, 2, 3, 4, 5 et 6, de préférence d'origine humaine.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que ledit récepteur Toll est choisi parmi :
- les récepteurs Toll Tir 1 et Tir 4 ; - le récepteur Toll Tir 1 dont la séquence de l'ADNc codant pour ce récepteur est la séquence SEQ ID No. 5 ;
- le récepteur Toll Tir 4 dont la séquence de l'ADNc codant pour ce récepteur est la séquence SEQ ID No. 7 ;
- leurs fragments comprenant le domaine responsable de la médiation du signal d'activation des cellules ; ou
- les récepteurs dont la séquence peptidique ou nucléique présente au moins un pourcentage d'identité d'au moins 80 % avec ces récepteurs Toll Tir 1 et Tir 4 ou leurs séquences d'ADNc.
15. Procédé d'identification selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre en une étape α).
16. Procédé d'identification selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'unique étape α) met en œuvre une cellule cotransfectée par un récepteur scavenger et un récepteur Toll.
17. Procédé d'identification selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'étape α) comprend les étapes suivantes :
X) la mise en contact d'une molécule, ou d'un mélange de molécules, connue ou inconnue, à tester avec une cellule hôte cotransfectée avec un acide nucléique codant pour un récepteur scavenger et un acide nucléique codant pour un récepteur Toll, dans un milieu permettant la fixation éventuelle de la ou desdites molécules testées avec ledit récepteur scavenger et/ou l'activation cellulaire éventuelle de ladite cellule médiée par ledit récepteur Toll ; Y) la mise en évidence de l'activation cellulaire de ladite cellule médiée par ledit récepteur Toll par la mesure d'au moins un marqueur significatif d'une activation cellulaire, de préférence médiée par ledit récepteur Toll ; et
Z) la sélection de cette molécule si ladite mesure à l'étape Y) met en évidence la génération ou l'augmentation de ladite activité cellulaire mesurée, de préférence par rapport à un contrôle témoin.
18. Procédé d'identification selon l'une des revendications 16 et 17, caractérisé en ce que lesdits récepteurs Toll et scavengers, lesdits marqueurs de mesure d'activité cellulaire utilisés sont de préférence ceux indiqués pour le procédé en deux étapes selon l'une des revendications 2 à 14.
19. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape d'identification de la structure de la molécule sélectionnée si celle-ci n'est pas connue.
20. Procédé d'identification selon l'une quelconque des revendications 1 à
19, utilisé pour identifier de nouvelles HSP, de nouvelles Omp ou leurs analogues.
21. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins une molécule se liant aux récepteurs scavengers et signalée via un récepteur Toll, ladite molécule étant identifiée par un procédé selon l'une des revendications 1 à 20.
22. Composition selon la revendication 21 , caractérisée en ce qu'elle contient en outre un antigène, immunogène ou haptène.
23. Composition selon la revendication 22, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène est choisi parmi les protéines, les peptides, les glycopeptides, les lipopeptides, les polysaccharides, les oligosaccharides, les acides nucléiques et les lipides.
24. Composition selon la revendication 22 ou 23, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène dérive d'un virus, d'une bactérie, d'une levure, d'un parasite ou d'un champignon.
25. Composition selon la revendication 24, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un peptide dérivé de microorganisme responsable de pathologies des voies aériennes choisi parmi le VRS, le para influenza virus (PIV), l'influenza virus, les hantavirus, les streptocoques, les pneumocoques, haemophilus influenza type b, les rhinovirus, les coronovirus et les méningocoques.
26. Composition selon la revendication 22, caractérisée en ce que l'antigène, immunogène ou haptène est associé ou spécifique d'une cellule tumorale.
27. Composition selon l'une des revendications 21 à 26, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique ne contient pas d'adjuvant autre que la molécule se liant aux récepteurs scavengers et signalée via un récepteur Toll.
28. Composition selon l'une des revendications 21 à 27, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité.
29. Utilisation d'une molécule se liant aux récepteurs scavengers et signalée via un récepteur Toll, ladite molécule étant identifiée par un procédé selon l'une des revendications 1 à 20 comme porteur et/ou adjuvant dans un vaccin.
30. Utilisation d'une molécule se liant aux récepteurs scavengers et signalée via un récepteur Toll pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers, ladite molécule étant identifiée par un procédé selon l'une des revendications 1 à 20.
31. Utilisation d'une molécule se liant aux récepteurs scavengers et signalée via un récepteur Toll pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre un agent infectieux ou une cellule tumorale, ladite molécule étant identifiée par un procédé selon l'une des revendications 1 à 20.
32. Utilisation d'une molécule se liant aux récepteurs scavengers et signalée via un récepteur Toll pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse T cytotoxique contre un agent infectieux ou une cellule tumorale, ladite molécule étant identifiée par un procédé selon l'une des revendications 1 à 20.
33. Utilisation d'une molécule se liant aux récepteurs scavengers et signalée via un récepteur Toll pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au ciblage spécifique d'une substance biologiquement active qui lui est associée vers les cellules présentatrices d'antigènes, ladite molécule étant identifiée par un procédé selon l'une des revendications 1 à 20.
34. Utilisation selon la revendication 33, caractérisée en ce que lesdites cellules présentatrices d'antigènes sont choisies parmi les cellules dendritiques, les macrophages, les lymphocytes B ou les monocytes et préférentiellement parmi les cellules dendritiques.
35. Utilisation selon la revendication 33 ou 34, caractérisée en ce que ladite substance biologiquement active est un antigène ou haptène ou un facteur de croissance.
36. Utilisation selon l'une des revendications 33 à 35, caractérisée en ce que ladite substance biologiquement active est choisie parmi les protéines ou les peptides, les lipopeptides, les poly- ou oligosaccharides, les acides nucléiques, les lipides et les substances chimiques.
37. Utilisation selon l'une des revendications 33 à 36, caractérisée en ce que ladite molécule est capable d'être internalisée après sa fixation dans une cellule présentatrice d'antigène.
1/1
Figure imgf000039_0001
log fluorescence
FIGURE 1
Figure imgf000039_0002
Mock Tlrl Tlr2 TIr3 Tlr4 CD14 χir2 +
CD14
FIGURE 2
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