WO2004011486A2 - Procede de solubilisation de peptides hydrophobes et leur utilisation pour generer une response de type ctl antitumorale ou anti-infectieuse - Google Patents

Procede de solubilisation de peptides hydrophobes et leur utilisation pour generer une response de type ctl antitumorale ou anti-infectieuse Download PDF

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    • C12N2760/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the subject of the present invention is a general method for solubilization in aqueous medium of a hydrophobic peptide, in particular of a peptide compound of pharmaceutical interest such as a ligand of the hydrophobic major histocompatibility complex (MHC) soluble in solvents such as DMSO.
  • MHC major histocompatibility complex
  • the subject of the invention is also such MHC ligands thus modified in particular as an anti-infectious or anti-tumor medicament and their use for the preparation of a pharmaceutical composition intended to generate an immune response mediated by cytotoxic T lymphocytes.
  • the invention also relates to the use of such ligands mixed or coupled to a carrier protein for the preparation of a vaccine composition intended for the prevention of infectious diseases or the treatment of cancers.
  • Vaccination is an effective way to prevent or reduce viral or bacterial infections.
  • the success of vaccination campaigns in this area has made it possible to extend the concept of vaccine in the field of autoimmune diseases and cancer.
  • Cytotoxic T cells recognize peptides from the breakdown of intracellular proteins that are presented by class I major histocompatibility complex (MHC) molecules on the surface of cells. After processing the proteins, the CTL peptides are selected from the pool of cytosolic peptides on the basis of their length and their amino acid sequence and transported to the endoplasmic reticulum and then associated with MHC class I molecules.
  • MHC major histocompatibility complex
  • Several studies have shown that these naturally occurring MHC class I peptides are generally 9 ⁇ 1 amino acids in length and contain specific anchor residues which have specific properties in terms of hydrophobicity and charge (Falk K. et al., Nature, 1991, 351: 290-296; Hunt DF et al., Science, 1992, 255: 1261 -1263).
  • HLA-A2 molecules EJ Collins et al., Nature 1994, 371: 626-629; Y. Chen et al., J. Immunol., 1994, 152 : 2874-2881) or other HLA class I molecules (RG Urban et al., PNAS, USA, 1994, 91: 1534-1538).
  • MHC ligands classes I and II
  • CTL epitope peptides have been identified (HG Rammensee et al., Immunogenetics, 1999, 50 (3-4): 213-219; Sette et al., Immunogenetics, 1999 , 50: 201-212).
  • the interest of these MHC ligands is confirmed by the increasing number of clinical studies in humans of these compounds as vaccine candidates against various pathologies, in particular against melanoma (Jager E. et al., Int. J.
  • the peptide FluMI 56-68 of sequence TKGILGFVFTLTV (SEQ ID No. 1) has been described as a CTL-restricted HLA-A2 epitope by Gotch et al. (Nature, 1987, 326: 881-882). This sequence was first optimized by Gotch et al. (J. Exp. Med., 1988, 168: 2045-2057), which clearly showed that the FluMI peptides 57-68, 58-68, 59-68 had the same CTL activity as the FluMI 56-68 peptide. Bednarek et al. (J.
  • ELA peptide of sequence ELAGIGILTV (SEQ ID No. 47) corresponding to the peptide Melan26-35 analogous to the “parent” decamer EAAGIGIL (SEQ ID No. 46), has been described by Valmori D. et al. (International Immunology, Vol. 11, N ° 12, pp1971- 1979) as being an excellent HLA-A2 ligant and being capable of inducing a CTL response in the A2-Kb mouse greater than that obtained with the “parent” peptide.
  • the peptides ELA and FluMI have already been injected into humans solubilized in DMSO 20% (Jager E. et al., Int. J. Cancer, 2000, 86: 538-547) or in pure DMSO for ELA (Wang F. et al., Clinical Cancer Research, 1999, 5: 2756-2765) in clinical studies carried out on patients with melanoma.
  • a hydrophobic peptide ligand of MHC class I or II in particular a peptide ligand whose CTL epitope fragment is hydrophobic in nature, while retaining its ability to bind to MHC molecules and / or its ability to induce a CTL response.
  • peptide compounds having a desired activity such as those having a pharmaceutical interest such as MHC ligands comprising a CTL epitope of hydrophobic nature, this by adding to them at least a total of 3 residues, preferably consecutive, selected from arginine and / or lysine distributed at the N-terminal and / or C-terminal end of these hydrophobic ligands while retaining at least in part this biological activity sought when these peptide compounds are used in an aqueous medium.
  • arginine and / or lysine residues to the N-terminal and / or C-terminal of peptide, such as the ligand of the MHC FluMI of sequence SEQ ID No. 2 or the ligand of the MHC ELA of sequence SEQ ID No. 47 or alternatively the ligands of MHC derived from the hTERT 572 Y1 telomerase of sequence SEQ ID No. 66, hTERT 988 of sequence SEQ ID No. 67 and hTERT 988 Y1 of sequence SEQ ID No. 68, made it possible to obtain an increased solubility of these peptides thus modified in an aqueous medium while retaining for those tested their capacity to induce a CTL response in aqueous medium.
  • the inventors have demonstrated, for example, that the addition of 3 aspartic acid residues to the N-terminal or C-terminal end of the FluMI MHC ligand of sequence SEQ ID No. 2 if it does not disturb the binding capacity of this HLA-A2 peptide nevertheless causes a total loss of its capacity to induce a CTL response when tested under the same conditions as the FluMI peptide supplemented with N- or C-terminal arginine and / or lysine residues, thus showing the additional difficulty of obtaining both better solubility for a peptide, while retaining the biological activity sought for this peptide.
  • the present invention relates to a method for rendering soluble or improving the solubility in aqueous medium of a peptide, characterized in that it comprises a step in which said peptide is modified by l addition by covalent bond of at least a total of 3 residues, preferably consecutive, selected from arginine and / or lysine, said at least 3 residues being distributed at the N-terminal and / or C-terminal of said peptide, and which can constitute a linear or branched chain.
  • said modification made to the peptide not yet modified is constituted by the sole addition of consecutive arginine and / or lysine residues at the N-terminal and / or C-terminal.
  • peptide or by “MHC ligand”, the MHC peptide or ligand not yet modified by the process of the invention, this as opposed to the term “modified peptide” (or “peptide thus modified”) or “ligand of the modified MHC” (or “ligand of the MHC thus modified”), respectively.
  • the method of the invention is characterized in that the solubility in aqueous medium obtained for the peptide thus modified is sufficient for at least a part of the biological activity of said unmodified peptide which it is sought to exercise , is preserved by said peptide thus modified by the method of the invention when the latter is used in an aqueous medium.
  • biological activity for a peptide or for a peptide compound is intended to denote any biological activity such as for example, and without being limited to, an antigenic activity, in particular capable of inducing an immune response, of humoral or cellular type, such that the capacity to bind to the MHC (MHC ligand), in particular of class I or II and, where appropriate, to generate helper T cells and / or CTL type lymphocytes, or alternatively an antibody activity, of ligand of receptor, receptor, inhibitor, enzymatic, hormonal, signal mediator, inducer, substrate for a biochemical reaction, etc.
  • MHC MHC ligand
  • a modified peptide or for a peptide compound modified according to the method of the invention is meant to denote any biological activity exerted by the unmodified peptide and which is at least partially exerted in aqueous medium with the modified peptide or peptide compound.
  • a process according to the invention also forms part of the invention in which a residue other than an arginine or lysine residue is also added to the N-terminal or C-terminal end of said peptide compound, this by in addition to said at least 3 residues, preferably consecutive, arginine and / or lysine, if this other added residue does not significantly reduce the increase in solubility and, where appropriate, the biological activity observed in aqueous medium for the peptide modified by the addition of the only arginine and / or lysine residues.
  • the expression “peptide compound” is intended to denote
  • the term “peptide” will also be understood to denote proteins or polypeptides, terms which will be used here interchangeably.
  • aqueous medium is intended to denote very particularly an aqueous solution such as a buffer solution, in particular physiological solution, such as a saline buffer such as a saline phosphate buffer (PBS) or any aqueous solution injectable into humans.
  • a buffer solution in particular physiological solution, such as a saline buffer such as a saline phosphate buffer (PBS) or any aqueous solution injectable into humans.
  • physiological solution such as a saline buffer such as a saline phosphate buffer (PBS) or any aqueous solution injectable into humans.
  • PBS saline phosphate buffer
  • the present invention also relates to , according to a second aspect, a method of solubilization or improvement of the solubility of a peptide by adding at least a total of 3 residues, preferably consecutive, consisting of a mixture of arginine and lysine residues.
  • a method of solubilization or improvement of the solubility of a peptide by adding at least a total of 3 residues, preferably consecutive, consisting of a mixture of arginine and lysine residues.
  • KKK-peptide-R R-peptide-KKK, RKRK-peptide, peptide-RKRK, KKKR-peptide or even peptide-RKKK.
  • the process which is the subject of the invention is characterized in that it comprises a step in which said peptide is modified by the addition by covalent bond of at least a total of 3 lysine residues, preferably consecutive, distributed at the N-terminal and / or C-terminal end of said peptide, these at least 3 lysine residues being able to constitute a linear or branched chain.
  • the process which is the subject of the invention is characterized in that it comprises a step in which said peptide is modified by the addition by covalent bond of at least a total of 3 arginine residues, preferably consecutive, distributed at the N-terminal and / or C-terminal end of said peptide, these at least 3 arginine residues being able to constitute a linear or branched chain.
  • the present invention relates to a method according to the invention, characterized in that the total number of residues, preferably consecutive, arginine and / or lysine distributed at the N-terminal end and / or C-terminal of said peptide is between 3 and 6, limits included, preferably between 3 and 5, limits included and, even better, is 4.
  • said at least a total of 3 residues, preferably consecutive, arginine and / or lysine constitute a linear chain of amino acid.
  • said at least a total of 3 residues, preferably consecutive, arginine and / or lysine are added either to the free N-terminal end or to the free C-terminal end of said peptide.
  • said at least a total of 3 residues, preferably consecutive, arginine and / or lysine added are of L form.
  • said peptide (not yet modified by the method according to the invention) comprises at least 6 amino acids, preferably at least 7 or 8 amino acids. In an equally preferred embodiment, said peptide (not yet modified) comprises at most 50 amino acids, preferably at most 45, 40 or 35 amino acids, more preferably at most 30, 25, 20 or 15 amino acids. In an also preferred embodiment, the addition by covalent bond of said at least a total of 3 residues, preferably consecutive, arginine and / or lysine to the free N-terminal and / or C-terminal end of said peptide is carried out by chemical synthesis, or even by genetic fusion when the structure of said peptide thus modified allows it.
  • the modified peptide obtained by the process according to the invention is soluble in an aqueous medium, in particular in a PBS buffer, at least 5 mg / ml, preferably at least 6 or 7 mg / ml, at least 7 mg / ml being the most preferred minimum solubility.
  • said peptide is a peptide useful for the preparation of a pharmaceutical or cosmetic composition.
  • said peptide is an active principle capable of exerting a therapeutic action (preventive or curative).
  • said peptide is a peptide whose sequence comprises one or more antigenic epitopes of hydrophobic nature.
  • antigenic epitope is intended to denote here a peptide which, when administered to an animal or to humans, alone or in the presence of an adjuvant of immunity or else in combination with a carrier molecule, is capable of induce an immune response of humoral or cellular type directed specifically against this epitope, preferably capable of generating CTL lymphocytes directed specifically against this epitope.
  • said peptide is a ligand, natural or synthetic, of the MHC, in particular of class I or II.
  • said peptide is chosen from antigenic epitopes derived from an antigenic protein of a microorganism, preferably pathogenic for a mammal such as man, these microorganisms possibly being viruses, bacteria, yeasts, fungi or parasites, or else derivatives of an antigenic protein associated with a tumor.
  • said peptide is a ligand, natural or synthetic, of the MHC, characterized in that it can also be chosen from multi-epitopic polypeptide constructs, pseudopeptides, retro-inverso peptide peptides, peptoids, peptido -mimetics, or chosen from among peptides included in peptide compounds such as acid nucleic peptides, ⁇ popeptides or glycopeptides.
  • multi-epitopic polypeptide is intended to denote a peptide construct comprising, on the same sequence, a set of several epitopes of peptide nature.
  • the term “pseudopeptide” is intended to denote any peptide or analogous molecule containing one or more non-peptide bonds between the amino acids.
  • the term “retro-inverso peptide” is intended to denote, for a given peptide of n amino acids and of general sequence H2N- rX 2 - -X n-1 -X n -COOH, a peptide of n amino acids of sequence H 2 NX n -X n -1- where the L-series amino acids are replaced by D-series amino acids, where H 2 NX ! (or H 2 NX n t) and X n -COOH (or Xi-COOH) respectively represent the amino acid residue in the N-terminal position and the amino acid residue in the C-terminal position of said peptide.
  • eptoid is intended to denote oligomers obtained from N-substituted glycine derivatives.
  • the term “peptidomimetic” is intended to denote any molecule exhibiting at least one functional property specific to peptides and, more particularly, any molecule in which the amide bonds are completely or partially replaced by non-peptide bonds. while retaining the amino acid chains essential for activity in a defined spatial position and / or any molecule in which the ⁇ CHs are replaced by a nitrogen atom and / or any molecule in which the side chains of amino acids are changed.
  • said unmodified peptide is a ligand, natural or synthetic, of the MHC allowing the generation of cytotoxic T lymphocytes, characterized in that it is chosen from CTL epitopes.
  • said unmodified peptide is a ligand, natural or synthetic, of the MHC allowing the generation of cytotoxic T lymphocytes, characterized in that it is chosen from CTL epitopes in the form of octapeptide, nonapeptide, decapeptide hydrophobic, preferably in the form of a peptide of at most 15 amino acids, or alternatively in the form of a group of hydrophobic epitopes.
  • said peptide is a MHC ligand allowing the generation of cytotoxic T lymphocytes, characterized in that said MHC ligand comprises a peptide chosen from the peptides of sequence SEQ ID No. 2, SEQ ID No.
  • said peptide is a MHC ligand, characterized in that said MHC ligand comprises a peptide chosen from the following peptides: a) a peptide whose amino acid sequence is sequence of the retro-reverse form of a peptide of sequence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 or SEQ ID No. 47; and b) a peptide whose sequence has a degree of identity after optimal alignment of at least 70%, preferably at least 80%, 85%, 90% or 95% with the sequence of a peptide of sequence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 or SEQ ID No.
  • said MHC ligand is capable of generating T lymphocytes of cytotoxic type and / or T helper, in specific specific for said MHC ligand, and / or capable of generating a significant increase in the level of CD8 + and / or CD4 + T lymphocytes producing INF- ⁇ and, where appropriate, TNF- ⁇ , when said ligand of MHC is put in the presence of T lymphocytes of subjects having presented the antigens from which said ligand is derived.
  • the subject of the present invention is a MHC ligand, in particular of class I or II, of peptide nature, modified by the addition of at least 3 residues, preferably consecutive, arginine and / or lysine , distributed at its N-terminal and / or C-terminal end, these 3 arginine and / or lysine residues can constitute a linear or branched chain, preferably the MHC ligand before modification being hydrophobic in nature.
  • hydrophobic in the present description, is meant to denote, for a peptide or a MHC ligand of peptide nature, a peptide or a ligand of MHC not soluble in an aqueous medium, or insufficiently soluble to be able to exploit in this aqueous medium the together or at least one of the biological activities which can be exercised by this same peptide or ligand of the MHC in another medium (in particular in a medium containing DMSO).
  • the modification made to the MHC ligand which has not yet been modified or in general to a peptide consists of the only addition of consecutive arginine and / or lysine residues at the N-terminal and / or C-terminal end, this in particular to exclude from the invention any peptide or ligand of the MHC modified by the addition to a first peptide of a second peptide having an activity other than that of increasing the solubility of said first peptide, this second peptide can naturally comprise at least three arginine and / or lysine residues consecutive or dispersed in its sequence, or still at one of its ends for fusion with the first peptide ("linker").
  • said MHC ligand according to the invention is characterized in that the total number of residues, preferably consecutive, arginine and / or lysine distributed at the N-terminal and / or C-terminal of said ligand is between 3 and 6, limits included, preferably between 3 and 5, limits included. More preferably, said at least a total of 3 residues, preferably consecutive, arginine and / or lysine constitute a linear chain of amino acid.
  • said at least a total of 3 residues, preferably consecutive, arginine and / or lysine are added either to the free N-terminal end or to the free C-terminal end of said MHC ligand. More preferably, all of the residues, preferably consecutive, arginine and / or lysine added are of L form.
  • said MHC ligand (unmodified) comprises at most 50 amino acids, preferably at most 45, 40 or 35 amino acids, more preferably at most 30, 25, 20 or 15 amino acids.
  • MHC ligands (unmodified) consisting of at most 15 amino acids are preferred.
  • said MHC ligand of unmodified peptide nature is capable of generating cytotoxic T lymphocytes and / or T helper, in particular specific of said MHC ligand and / or capable of generating a significant increase in the level of CD8 + T lymphocytes and / or CD4 + producing INF-D and, where appropriate, TNF- ⁇ , when said MHC ligand is brought into contact with T lymphocytes from subjects having presented the antigens from which said ligand is derived; and, is characterized in that the solubility in aqueous medium of said MHC ligand of peptide nature before modification is significantly lower than that under the same conditions of said MHC ligand thus modified according to the invention.
  • said unmodified MHC ligand is not soluble in an aqueous medium, in particular in phosphate buffered saline (PBS), at a concentration greater than 1 mg / ml.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the difference in solubility evaluated in PBS buffer between said unmodified MHC ligand and said modified MHC ligand is greater than or equal to 2, preferably 3 and 4 mg / ml.
  • said modified MHC ligand is characterized in that it is soluble in an aqueous medium, in particular in phosphate buffered saline (PBS), at least 5 mg / ml, preferably at least 6 or 7 mg / ml, 7 mg / ml being the most preferred minimum solubility.
  • PBS phosphate buffered saline
  • said MHC ligand thus modified in particular when the consecutive arginine and / or lysine residues added to said MHC ligand (unmodified) are of form L, is capable in aqueous solution of generating cytotoxic T lymphocytes and / or T helper , in particular specific for said MHC ligand, and / or capable of generating a significant increase in the level of CD8 + and / or CD4 + T lymphocytes producing INF- ⁇ and, where appropriate, TNF- ⁇ , when said MHC ligand is placed in the presence of T lymphocytes of subjects having presented the antigens from which said MHC ligand is derived.
  • said MHC ligand according to the invention is characterized in that it is chosen from CTL epitopes. More preferably, said MHC ligand according to the invention is characterized in that it is chosen from CTL epitopes in the form of octapeptide, nonapeptide or decapeptide or a group of hydrophobic epitopes.
  • said MHC ligand of peptide nature before modification comprises one or consists of a peptide chosen from the peptides of the following sequences: a) SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 or SEQ ID No. 47; b) a peptide whose amino acid sequence is the sequence of the retro-reverse form of a peptide of sequence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 or SEQ ID No. 47; and c) a peptide whose sequence has a degree of identity after optimal alignment of at least 70%, preferably at least 80%, 85%, 90% or 95% with the sequence of a peptide of sequence SEQ ID No. 2, SEQ ID No.
  • MHC ligands of peptide nature chosen from peptides of sequence SEQ ID Nos are preferred. 75, 76 and 77 and the peptides of sequence SEQ ID Nos. 78 and 79, these peptides possibly, if necessary, comprising a point mutation in the sequence of the unmodified MHC ligand from which it is derived, in particular a substitution of an amino acid by another natural or non-natural amino acid.
  • the subject of the present invention is a peptide whose sequence comprises one or more antigenic epitopes of hydrophobic nature, said peptide having been modified by a method according to the invention, or a MHC ligand according to the invention as a medicament .
  • the subject of the present invention is a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a compound chosen from:
  • peptide modified by a method according to the invention or a MHC ligand modified according to the invention, optionally mixed or coupled to a carrier protein or one of its fragments; or
  • nucleic construct containing a DNA coding for a peptide modified by a method according to the invention, or for a MHC ligand modified according to the invention, where appropriate also containing a DNA coding for a carrier protein or one of its fragments.
  • the subject of the present invention is the use of a peptide whose sequence comprises one or more antigenic epitopes of hydrophobic nature derived from an antigenic protein of pathogenic microorganism, said peptide having been modified by a method according to the invention.
  • a modified MHC ligand according to the invention comprising such antigenic epitopes, for the preparation of a vaccine intended for the prophylactic or therapeutic treatment of infections by this microorganism, in particular viral, bacterial, parasitic or fungal infections .
  • the subject of the present invention is the use of a peptide whose sequence comprises one or more antigenic epitopes of hydrophobic nature derived from an antigenic protein associated with a tumor, said peptide having been modified by a method according to the invention, or of a modified MHC ligand according to the invention comprising such antigenic epitopes, for the preparation of a vaccine intended for the prophylactic or therapeutic treatment of cancers associated with this antigen, preferably to inhibit the growth of associated tumors to this antigen.
  • the present invention relates to a vaccine, characterized in that it comprises at least one peptide whose sequence comprises one or more antigenic epitopes of hydrophobic nature derived from an antigenic protein of pathogenic microorganism or derived from an antigenic protein associated with a tumor, said peptide having been modified by a method according to the invention, or in that it comprises a MHC ligand modified according to the invention comprising at least one such antigenic epitope.
  • the present invention also relates to a vaccine according to the invention, characterized in that it further comprises an adjuvant, preferably chosen from the following adjuvants: proteins of the external membrane of type A, called OmpA of enterobacterium, TT, PLGA, ISCOM, IFA, Montanide, ISA 720, ISA 51, lipid quaternary ammonium, MPL-A, Quil-A and other saponins (QS21) CpG.
  • an adjuvant preferably chosen from the following adjuvants: proteins of the external membrane of type A, called OmpA of enterobacterium, TT, PLGA, ISCOM, IFA, Montanide, ISA 720, ISA 51, lipid quaternary ammonium, MPL-A, Quil-A and other saponins (QS21) CpG.
  • the present invention also relates to a vaccine according to the invention characterized in that it further comprises, a carrier compound mixed or coupled to said modified peptide comprising one or more antigenic epitopes or to said modified MHC ligand.
  • the present invention also relates to a vaccine according to the invention characterized in that said modified peptide comprising one or more antigenic epitopes or said modified MHC ligand, optionally associated with a carrier compound, is incorporated into vectors chosen from liposomes, virosomes, nanospheres, microspheres or microcapsules.
  • the invention also relates to a vaccine according to the invention characterized in that said modified peptide comprising one or more antigenic epitopes or said modified MHC ligand, optionally associated with a carrier compound, is conveyed in a form which makes it possible to improve its stability and or its immunogenicity.
  • liposomes PLGAs or other polymers
  • viral or bacterial vectors containing a nucleic construct coding for said peptide and optionally also said protein carrier, or one of its fragments.
  • said carrier compound is a carrier protein chosen from the TT protein (Tetanus Toxoid) or its derivatives, the DT protein (Diphtheria Toxoid) or its derivatives, KLH (Key Limpet Haemocyanin), heat shock proteins or HSP, bacterial membrane proteins of the Omp type, in particular enterobacteria, or their fragments.
  • TT protein Tetanus Toxoid
  • DT protein Diphtheria Toxoid
  • KLH Key Limpet Haemocyanin
  • heat shock proteins or HSP bacterial membrane proteins of the Omp type, in particular enterobacteria, or their fragments.
  • fragment or compounds derived from a carrier protein is intended to denote in particular any fragment of the amino acid sequence included in the amino acid sequence of the carrier protein which, when associated with an immunogen, is capable of generate or increase an immune response, in particular humoral and / or CTL type, directed against said immunogen and comprising at least 8 consecutive amino acids, preferably at least 10 amino acids or more preferably at least 15, 20, 30 or 50 consecutive amino acids of the amino acid sequence of said carrier protein, their derivative compounds comprising at least one of its fragments.
  • the invention comprises a vaccine according to the invention in which the carrier protein Omp of enterobacterium or one of its fragments, is obtained by an extraction process from a culture of said culture. enterobacterium or recombinantly.
  • said carrier protein is an OmpA protein from Klebsiella pneumoniae, in particular the P40 protein of sequence SEQ ID No. 72, one of its fragments of at least 8 amino acids, preferably at least 10 , 15, 20, 30 or 50 amino acids, or a peptide whose sequence has a degree of identity after optimal alignment of at least 80%, preferably 85%, 90% or 95% with the sequence of P40 or one of its said fragments .
  • the carrier protein named P40 derived from the outer membrane of type A of Klebsiella pneumoniae has been described in particular in patent applications WO
  • the invention relates to a vaccine according to the invention, characterized in that said vaccine contains a vector comprising a nucleic construct coding for the hybrid peptide resulting from the coupling between the modified peptide comprising one or more antigenic epitopes or for said MHC ligand and said carrier protein, or a fragment thereof, or contains a host cell transformed by said vector capable of expressing said hybrid peptide.
  • the subject of the present invention is a pharmaceutical composition or a vaccine according to the invention, which can be administered systemically, in particular by injectable, mucosal or transdermal route.
  • Figures 1A to 1D Secretion of IFN ⁇ , induced by the peptides FluMI (1A), 4K-FluM1
  • FIGS 2A to 2D Secretion of IFN ⁇ , induced by the peptides FluMI (2A), 4K-FluM1 (2C), FluM1-4K (2D), and 4k-FluM1 (2B), solubillized in DMSO, in an HLA subject -
  • Figures 3A to 3C Study of the CTL response induced by the peptides 4K-FluM1 (3A),
  • Figures 4A to 4C Study of the CTL response induced by the peptides 4K-ELA (4A), ELA-
  • Figures 5A and 5B Study of the CTL response induced by the 4R-ELA peptides solubilized at 2 mg / ml in PBS in the presence of P40 after immunization of the HLA-A2 / Kb mouse.
  • Figure 6 Study of the CTL response induced by the 5K-ELA peptide solubilized at 2 mg / ml in PBS in the presence of P40 after immunization of the HLA-A2 / Kb mouse.
  • Figure 7 Study of the CTL response induced by the 3D-FluM1 peptide solubilized at 2 mg / ml in PBS in the presence of P40 after immunization of the HLA-A2 / Kb mouse.
  • Figures 8A to 8E Secretion of IFN ⁇ , induced by the peptides FluMI, 4K-FluM1, FluM1- 4K and 4k-FluM1 solubilized in DMSO, in a human CD8 + T clone, specific for the peptide FluMI.
  • Figures 9A to 9D Secretion of IFN ⁇ , induced by the peptides 4K-FluM1, FluM1-4K and 4k- FluM1 solubilized in PBS, in a human CD8 + T clone, specific for the FluMI peptide.
  • Figure 10 SDS-PAGE electrophoresis analysis of the rP40-C4KELA conjugate.
  • Figures 11A and 11B Analysis by exclusion chromatography at -6 months of the rP40-C4KELA conjugates in solution (sol) (figure 11 A) or lyophilized (lyo) (figure 11B) stored at + 4 ° C or at + 37 ° C “Sample Name” for “Sample name”.
  • Figures 12A and 12B Study of the CTL response induced by the rP40-C4KELA conjugates in solution or lyophilized at tO after immunization of the HLA A2 Kb mouse ( Figure 12A) and at t6 months after immunization of the HLA A2 Kb mouse ( Figure 12B ) "Lysis" for "lysis”.
  • the preloaded Wang- or 2-chlorotrityl- type resins carrying the COOH-terminal residue of the peptides to be synthesized were introduced into the wells of a reactor comprising 96 wells.
  • the ⁇ -NH2 function of the amino acids used for the synthesis was protected by a group (Fmoc) and the functions of the side chains of the amino acids were protected by groups compatible with the chemistry Fmoc [Cys (Trt); Arg (Pmc); His (Trt); Trp (Boc); Asn (Trt); Gln (Trt); Lys (Boc); Ser (tBu); Thr (tBu); Tyr (tBu); Asp (OtBu); Glu (OtBu)].
  • Fmoc [Cys (Trt); Arg (Pmc); His (Trt); Trp (Boc); Asn (Trt); Gln (Trt); Lys (Boc); Ser (tBu); Thr (tBu); Tyr (tBu); Asp (OtBu); Glu (OtBu)].
  • L Synthesis protocol Preliminary washing: DCM 1500 ⁇ l / well 3 times 5 min DMF 1500 ⁇ l
  • DMF washes 1500 ⁇ l / well 2 times 2 min b.
  • Aa / HOBt 0.5M 500? ⁇ l / well HATU 0.5M 500 ⁇ l / well DIEA 2M 250 ⁇ l / well 1 time 20 min
  • the peptides are then cleaved from the resin and the functions of the side chains of the amino acids are deprotected by reaction for 3 h at room temperature of the peptidylresin with a cleavage mixture the composition of which is as follows for 100 mg of peptidylresin, 1.5 ml of the mixture: TFA 82.5%; 5% H2O; 2.5% EDT; Thioanisol 5% and phenol 5%.
  • the resin is separated from the peptide by simple filtration.
  • the peptide is then precipitated by adding diethyl ether at 4 ° C.
  • the crude peptide is recovered by centrifugation at 3000 rpm for 3 min. After three washes with ether, the peptide is taken up with an aqueous solution of acetic acid and then lyophilized.
  • the peptides are taken up in a mixture of acetic acid and water and purified by RP-HPLC (high performance liquid chromatography in reverse phase) semi-preparation on a column C4 or C18.
  • the elution system being an H 2 O and acetonitrile gradient in the presence of 0.1% TFA.
  • the purity of the peptide is verified by RP-HPLC in reverse phase.
  • the identity of the peptide is confirmed by mass spectrometry of the ES-MS type.
  • Aa Fmoc amino acid; Boc: Tertiobutyloxycarbonyl; DCM: Dichloromethane; DIEA: Diisopropylethylamine; DMF: Dimethylformamide; EDT: Ethanedithiol; ES- MS: Electrospray Mass Spectrometry; Fmoc: 9-Fluorenylmethoxycarbonyl; top: O- (7-azabenzotriazol-1-yl) -1,1,3,3, -tetramethyluronium hexafluorophosphate; HBTU: 2- (1H-Benzotriazo!
  • Example 2 Identification of peptides soluble in PBS, in particular at 7 mg / ml
  • Each peptide (6 different weighings) is taken up at 1 mg / ml in DMSO (3 samples) as well as in PBS at 10 mg / ml (3 samples).
  • the concentration obtained is the result of the calculation of the average of the ratio: area of the HPLC peak obtained with the peptide solubilized in PBS (at 10 mg / ml) / area of the HPLC peak obtained with the peptide solubilized in DMSO (at 1 mg / ml ) on 3 different samples.
  • Table IV Sequences of FLUM1 / ELA peptides and derivatives soluble in PBS at a concentration of at least 7 mg / ml
  • Insoluble peptides modified by 3, 4 or 5 consecutive L- or D- arginine and / or lysine residues in N- and / or C-terminal, variegated or not, are soluble in PBS at at least 7 mg / ml (Table IV) and therefore, a fortiori, have a solubility greater than the limit usable in the intended applications, namely 2 mg / ml.
  • the T2 line is a human lymphocyte line corresponding to a hybrid T cells / B cells, constitutively expressing HLA-A2.
  • HLA-A2 molecules express few HLA-A2 molecules on their surface.
  • the HLA-A2- ⁇ 2 microglobulin complex is constantly recycled in the cell and a basal level of complex is observed on the surface of the cell.
  • the presence of an exogenous peptide which binds to the HLA-A2 molecules stabilizes the complex more or less long, depending on its affinity, preventing the re-internalization of the HLA-A2 molecules and thus inducing an increase in the number of HLA-A2 molecules to the surface of cell T2.
  • the 96 peptides derived from ELA and FluMI were tested for their capacity to induce a more or less significant stabilization according to the peptide of the HLA- molecules.
  • T2 cells were incubated overnight at 37 ° C. with 100 ⁇ g / ml of each of the peptides in an OptiMEM medium devoid of SVF and supplemented with 100 ng / ml of ⁇ 2 microglobulin. After 4 washes with the aim of eliminating the excess of unfixed peptide, the cells were resuspended with 1 ml of RPM1 1640 medium, 10% FCS containing 10 ⁇ g / ml of Brefeldin A capable of blocking the surface expression of newly synthesized HLA-A2 molecules.
  • the cells were again incubated at 37 ° C. for 0, 2, 4 or 6 hours before being labeled with the monoclonal antibody MA2.1 to evaluate the surface expression of HLA-A2 molecules at FACS (Fluorescens Activated Cells Sorter).
  • FACS Fluorescens Activated Cells Sorter
  • na not determined (because not soluble or not sufficiently soluble in PBS to be able to be tested)
  • Table VII Fixation of peptides derived from ELA solubilized in DMSO or in PBS on the HLA-A2 molecules of T2 cells.
  • na not determined (because not soluble or not sufficiently soluble in PBS to be able to be tested)
  • EXAMPLE 4 Measurement of the Secretion of IFND by Human T Lymphocytes Induced by the Peptides 4K-FluM1, FluM1-4K and 4k-FluM1
  • the peptides derived from FluMI 4K-FluM1 and FluM1-4K, positive in the T2 cell binding test as well as the negative 4k-FluM1 derivative in this same test were solubilized in the PBS tested on CD8 + cytotoxic T cells of a positive HLA-A2 subject sensitized by the influenza virus, for their capacity to induce secretion of interferon ⁇ by these cells.
  • peripheral blood cells obtained after Ficoll are taken up in RPMI-10% FCS in 15 ml polypropylene tubes and placed in the presence of 100 ⁇ l of peptide to be tested, at a concentration of 10 ⁇ g / ml (solution mother at 4 mg / ml) for 2 h at 37 ° C in an incubator.
  • the cells After transfer to a 96-well plate with conical bottoms, the cells are incubated for 20 minutes at 4 ° C. and then fixed for 10 minutes, in the dark, at room temperature with 100 ⁇ l of 2% paraformaldehyde (PFA) in PBS. After two washes in PBS, 50 ⁇ l of PBS-Hepes 1 mM-Saponin 0.1%, containing 0.4 ⁇ l of anti-IFN ⁇ antibody coupled to FITC (stock solution at 0.5 mg / ml) are added to the cell pellets, in each well. After 30 minutes of incubation at 4 ° C, the cells are washed twice and then transferred to Micronic tubes, for analysis by flow cytometry.
  • PFA paraformaldehyde
  • FIGS. 1A to 1D Flow cytometry analysis of IFN secretion? by CD8 + T lymphocytes, presented in FIGS. 1A to 1D, shows that in the presence of the peptides 4K-FluMI and FluM1-4K 0.16% and 0.14%, respectively of CD8 + T lymphocytes secrete IFN ⁇ whereas in the presence of the peptide 4k-FluM1, 0.03% of the CD8 + T cells are positive in secretion of IFN ⁇ .
  • FluMI peptide is not soluble and does not induce secretion of IFN ⁇ by CD8 + T cells (0.06% of positive cells).
  • Figures 2A to 2D show that whatever peptide derived from FluMI tested in an individual HLA-A2 negative, there is no secretion of IFN? by CD8 + T cells.
  • the peptides derived from FluMI, 4K-FluM1 and FluM1-4K, positive in the T2 cell binding test as well as the derivative 4k-FluM1, negative in this same test were solubilized in DMSO or PBS and tested on cells derived from a human CD8 + cytotoxic T clone, specific to FluMI, for their capacity to induce secretion of IFN ⁇ by these cells.
  • FIGS. 8A to 8E and 9A to 9D respectively show that among the 4K-FIuM1, 4k-FluM1 and FluM1-4K modified FluMI peptides, solubilized in DMSO or in PBS, only the 4K-FluM1 and FluM1-4K peptides are capable , when presented via MHC class I dimers, to induce a secretion of interferon ⁇ in the entire clonal population tested, secretion comparable to that induced by the native peptide FluMI (cf. figure 8B). As expected, when the experiment is carried out in the presence of uncharged dimers, no production of ⁇ interferon is observed (cf. FIGS. 8A and 9A).
  • each of the peptides soluble in PBS described above in Table IV as well as the 3D-FluM1 peptide not soluble at 10 mg / ml in PBS but soluble at 2 mg / ml in PBS sufficient concentration to allow carrying out a CTL test, were tested for induction of a cytotoxic type response (CTL) in HLA A2 / kb mice. To do this, these peptides were administered individually, subcutaneously.
  • CTL cytotoxic type response
  • One injection consisting of 50 ⁇ g of peptide derived from ELA, or two injections one week apart consisting of 100 ⁇ g of peptide derived from FluMI, + 300 ⁇ g of P40 were carried out.
  • the spleen cells are cultured in the presence of IL2 and of presenting cells fixed and loaded with the peptide ELA or FluMI.
  • Seven days after this first stimulation a second stimulation of the effector cells is carried out, followed after 5 days by an evaluation of the cytotoxic activity by a release test of 51 Cr.
  • This test consists in incubating EL4 A2 / kb cells loaded with the peptide with different ratio of effector cells resulting from the culture and evaluating the cytotoxic activity of these effector cells by calculating the amount of 51 Cr released by the target cells during their lysis by the effector cells according to the formula:
  • the lysis of the target cells corresponds for each ratio to the contacting of the target cells and the effector cells; spontaneous lysis corresponds to the spontaneous release of 51 Cr from the target cells in the absence of any other cell and the total lysis corresponds to the maximum release of 51 Cr during lysis of all the target cells by addition of triton X100.
  • a control is carried out by replacing the target cells loaded with the peptide with uncharged target cells which therefore must not be recognized by the effector cells and therefore must not be lysed by the latter. .
  • FIGS. 3A to 3C, 4A to 4C and 5A and 5B below show that among the peptides tested, the derivatives having 4 arginine and / or lysine residues on the N-terminal side or 4 arginine and / or lysine residues on the C side terminal of the FluMI peptide (FIGS. 3A to 3C) and of the ELA peptide (FIGS. 4A to 4C and 5B) are capable of generating a significant CTL response in HLA A2 Kb mice.
  • the modified cells are capable of lysing target cells loaded with the parent peptides FluMI or ELA respectively (FIGS. 3A and 3B, 4A and 4B, 5B and 6).
  • the peptide C4KELA comprising the sequence ELAGIGILTV derived from the protein Melan-A / MART-1 (amino acids 26-35), is a synthetic peptide of 15 amino acids whose sequence is as follows: ⁇ CKKKKELAGIGILT ⁇ s 0 (SEQ ID No. 107).
  • a cysteine residue was introduced at the N-terminal position of the peptide for the purposes of coupling the peptide to the rP40 protein (rP40 for recombinant P40).
  • the coupling is carried out using the bromoacetic acid N-hydroxysuccinimide ester or BAH reagent (Haeu et al., 1998, Eur. J. Biochem. 255: 446-454). This heterobifunctional reagent allows activation of the Lys residues of the protein by bromoacetylation, then coupling of the peptide by the free thiol group carried by the Cys residue.
  • the rP40 protein is activated by BAH.
  • the rP40 is dialyzed against a 50 mM carbonate buffer pH 9.2 containing 0.1% Zwittergent 3-14 for 24 hours at + 4 ° C. After dialysis, the concentration is adjusted to 5 mg / ml using the same buffer before addition of BAH at a rate of 2 mg / mg of rP40 from a solution of BAH at 120 mg / ml in DMF. The whole is placed in the dark for one hour with stirring and at room temperature. The activated protein is then purified by gel-filtration chromatography (elution with the aforementioned buffer). The fractions containing the bromoacetylated protein are combined.
  • the peptide (5 mg / ml in 50 mM carbonate buffer pH 9.2 containing 0.1% Zwittergent 3-14) is added to the activated protein at a rate of 0.33 mg / mg of protein, i.e. 7 , 7 moles of peptide / mole of rP40. After saturation under a stream of nitrogen, the tube is again placed in the dark for 1 night with stirring and at room temperature. The activated sites of the protein which has not reacted with the peptide are then saturated using an amino-ethanethiol solution (“capping” step by incubation with shaking for 2 hours).
  • the conjugate is purified by molecular sieving chromatography after elimination of the detergent by ethanolic precipitation and resolubilization of the conjugate with a solution of Guanidine-HCl 7M.
  • the conjugate is eluted with a 20 mM disodium phosphate solution containing 275 mM trehalose. After purification, the conjugate is concentrated by ultrafiltration and filtered through 0.22 ⁇ m.
  • the conjugate obtained is characterized by SDS-PAGE electrophoresis ( Figure 10).
  • the coupling rate determined for the rP40-C4KELA conjugate synthesized is 5 to 6 C4KELA peptides / mole of rP40.
  • a solution of PEG 4000 (10 mg / ml) is added to the conjugate in solution in order to obtain 1% of PEG in the end.
  • the mixture is then frozen in liquid nitrogen and lyophilized on a tray. After lyophilization, the bottles are sealed under nitrogen.
  • the conjugate in solution is distributed in vials sealed under nitrogen.
  • the stability study was carried out with the two conjugates in solution or lyophilized, at + 4 ° C and at + 37 ° C.
  • the samples were analyzed at tO and t6 months in exclusion chromatography (FIG. 11) to detect a possible physicochemical degradation of the conjugate but also in CTL activity to determine if these remain biologically active (FIGS. 12A and 12B).
  • FIG. 12A shows that the rP40-C4KELA conjugates in solution or lyophilized (lyoph.) Are capable of generating a significant CTL response in HLA A2 Kb mice. The response is greater than that obtained with the simple P40 + 4KELA peptide mixture.
  • Figure 12B shows that the rP40-C4KELA conjugates in solution or lyophilized (lyoph.) Stored at + 4 ° C at t6 months, are capable of generating a significant CTL response in HLA A2 Kb mice. The response is greater than that obtained with the simple mixtures P40 + peptide 4KELA or P40 + the reference peptide ELA. It should be noted that despite the difference in profile between the conjugate stored at + 4 ° C in lyophilized form or in solution, revealed by exclusion chromatography, the two conjugates retain their biological activity at t6 months.

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Abstract

La présente invention a pour objet une molécule d'intérêt pharmaceutique, de préférence un ligand du Complexe Majeur d'Histocompatibité (CMH) hydrophobe soluble dans des solvants tels que le DMSO, rendu soluble dans un milieu aqueux injectable à l'Homme pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer une réponse immunitaire médiée par des lymphocytes T cytotoxiques. L'invention concerne également l'utilisation de tels peptides mélangés ou couplés à une protéine porteuse pour la préparation d'une composition vaccinale destinée à la prévention de maladie infectieuses ou le traitement des cancers. L'invention a également pour objet de tels peptides, notamment à titre de médicament anti-infectieux ou antitumoral.

Description

PROCEDE DE SOLUBILISATION DE PEPTIDES HYDROPHOBES ET LEUR UTILISATION POUR GENERER UNE REPONSE DE TYPE CTL ANTITUMORALE OU ANTI-INFECTIEUSE
La présente invention a pour objet un procédé général de solubilisation en milieu aqueux d'un peptide hydrophobe, en particulier d'un composé peptidique d'intérêt pharmaceutique comme un ligand du Complexe Majeur d'Histocompatibité (CMH) hydrophobe soluble dans des solvants tels que le DMSO. L'invention a également pour objet de tels ligands du CMH ainsi modifiés notamment à titre de médicament anti-infectieux ou antitumoral et leur utilisation pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer une réponse immunitaire médiée par des lymphocytes T cytotoxiques. L'invention concerne également l'utilisation de tels ligands mélangés ou couplés à une protéine porteuse pour la préparation d'une composition vaccinale destinée à la prévention de maladies infectieuses ou le traitement des cancers.
La vaccination est un moyen efficace de prévenir ou de réduire les infections virales ou bactériennes. Le succès des campagnes de vaccination dans ce domaine a permis d'étendre le concept de vaccin dans le domaine des maladies auto-immunes et du cancer.
Dans le cadre d'une thérapie anti-virale ou anticancéreuse, la génération de réponses CTL et T auxiliaires est de toute importance (Bachmann et al., Eur. J. Immunol., 1994, 24:2128-2136 ; Borrow P., J. Viral Hepat., 1997, 4:16-24 ; revue de Rivoltini et al., Crit. Rev. Immunol., 1998, 18:55-63), comme l'attestent de nombreuses études montrant in vivo le rôle protecteur des réponses dirigées contre des épitopes viraux (Arvin AM., J. Inf. Dis., 1992, 166:S35-S41 ; Koszinowski et al., Immunol. Lett, 1987, 16:185-192).
Les lymphocytes T cytotoxiques reconnaissent des peptides provenant de la dégradation de protéines intracellulaires qui sont présentées par les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I à la surface des cellules. Après processing des protéines, les peptides CTL sont sélectionnés à partir du pool de peptides cytosoliques sur la base de leur longueur et de leur séquence en acide aminé et transportés vers le réticulum endoplasmique puis associés aux molécules du CMH de classe I. Plusieurs études ont montré que ces peptides naturellement présentés par le CMH de classe I ont en général une longueur de 9±1 acides aminés et contiennent des résidus d'ancrage spécifiques qui possèdent des propriétés particulières en terme d'hydrophobicité et de charge (Falk K. et al., Nature, 1991, 351:290-296 ; Hunt DF et al., Science, 1992, 255:1261-1263). La qualité et la position de ces résidus d'ancrage sont dictées par « les poches du sillon de présentation d'antigène » spécifiques de chaque allèle du CMH classe I (Matsumara M. et al., Science, 1992, 257:927-934) suggérant que les résidus d'ancrage sont essentiellement impliqués dans la fixation au CMH de classe I. Cette hypothèse semble confirmée par le fait que toute altération (remplacement, délétion) des résidus d'ancrage de ces peptides CTL abroge la fixation de ceux-ci au CMH classe I, et que toute mutation des molécules de CMH de classe I au niveau des poches de fixation modifie le répertoire des peptides liés (Ruppert J. et al., Cell., 1993, 74:929-937 ; Rohren EM et al., J. Exp. Med., 1993, 177:1713-1721).
Cependant, plusieurs études montrent que des peptides plus longs peuvent accommoder une association aux molécules HLA-A2 (E.J. Collins et al., Nature 1994, 371:626-629 ; Y. Chen et al., J. Immunol., 1994, 152:2874-2881) ou à d'autres molécules HLA de classe I (R.G. Urban et al., PNAS, USA, 1994, 91:1534-1538).
Il a été également montré dans la littérature que des modifications apportées à des épitopes CTL en N-ou C-terminal du peptide, pouvaient soit permettre de conserver l'activité CTL du peptide tout en augmentant sa stabilité (Brinckerhoff L.H. et al., 1999, Int. J. Cancer, 83:326-334 ; Loing E. et al., 2000, J. Immunol., 164:900-907), soit conduire à une perte totale de l'activité du peptide (Beck et al., 2001, J. Pep. Res., 57:528-538 ; C. Widmann et al., 1991 , J. Immunol., 147:3745-3751).
De nombreux ligands du CMH (classes I et II) et notamment des peptides épitopes CTL ont été identifiés (HG Rammensee et al., Immunogenetics, 1999, 50(3- 4):213-219 ; Sette et al., Immunogenetics, 1999, 50:201-212). L'intérêt de ces ligands du CMH est confirmé par le nombre croissant d'études cliniques chez l'Homme de ces composés en tant que candidats vaccins contre différentes pathologies, notamment contre le mélanome (Jager E. et al., Int. J. Cancer, 2000, 86:538-547 ; M.L. Salgaller et al., Cancer Research, 1996, 56:4749-4757 ; S.A. Rosenberg et al., 1998, Nature Médecine, 4, n° 3, 321-327 ; S.R. Reynolds et al., 1998, J. Immunol., 161:6970-6976), contre HBV (Livingston et al., J. Immunol., 1999, 162:3088-3095) et autres antigènes (revue par C.J.M. Melief and W.M. Kast Immunological Reviews, 1995, 146:167-177). Toutefois, la difficulté de ces études réside à la fois dans le fait que ces peptides sont très souvent peu immunogènes (Melief et al., 1992, Adv. Cancer Res., 58:143-175 ; Nanda et Sercarz, 1995, Cell, 82, 13-17) donc nécessitent la présence d'un porteur et d'un adjuvant, mais également dans le fait qu'ils sont très souvent hydrophobes et nécessitent donc l'utilisation de solvants tels que le DMSO pour leur solubilisation avant leur administration aux patients. La présence de DMSO est très souvent préjudiciable pour la protéine porteuse qui peut précipiter, posant des problèmes de reproductibilité des préparations injectables, ce qui n'est pas tolérable pour un usage pharmaceutique.
De plus, l'utilisation de DMSO reste problématique surtout lors d'injections répétées au cours des thérapies anticancéreuses. En effet, le DMSO est rarement associé à une forme injectable en raison de ses activités pharmacologiques et toxicologiques non négligeables. Il n'entre dans la composition que de deux spécialités à base d'idoxuridine (C. Heintz et C. Boymond STP PHARMA 5, 1989, 548-560).
Notre étude visant à solubiliser des peptides hydrophobes a été menée sur deux peptides CTL modèles décrits dans la littérature comme étant très hydrophobes : le peptide FluMI 58-66 de la protéine de la matrice M1 du virus de la grippe et le peptide ELA 26-35 de la protéine Melan/Mart-1, antigène décrit comme étant associé aux cellules tumorales du mélanome. Ces deux peptides sont décrits ci-dessous.
Le peptide FluMI 56-68 de séquence TKGILGFVFTLTV (SEQ ID No. 1) a été décrit comme épitope CTL restreint HLA-A2 par Gotch et al. (Nature, 1987, 326:881- 882). Cette séquence a été optimisée dans un premier temps par Gotch et al. (J. Exp. Med., 1988, 168:2045-2057), qui ont clairement montré que les peptides FluMI 57-68, 58-68, 59-68 avaient la même activité CTL que le peptide FluMI 56-68. Bednarek et al. (J. Immunol., 1991, 147:4047-4053) ont également optimisé ce peptide et ont démontré que le peptide FluMI 58-66 GILGFVFTL (SEQ ID No. 2) donnait une réponse CTL 100 à 1000 fois plus importante que le peptide 57-68.
Ce peptide étant très hydrophobe, une étude visant à rendre ce peptide hydrosoluble avait déjà été menée (Bednarek et al., J. Immunol. Meth., 1991, 139:41- 47). Les auteurs de cet article ont réalisé cette étude sur le peptide FluMI 57-68 moins actif que le peptide FluMI 58-66, en substituant les résidus 58, 59, 60 ainsi que les résidus 65, 67 et 68 par des acides aminés moins hydrophobes, rendant ce peptide plus hydrosoluble. Les épitopes CTL dominants issus de l'antigène associé au mélanome Mart-1, restreints HLA-A2 de séquences AAGIGILTV (SEQ ID No. 45) et EAAGIGJL (SEQ ID No. 46) ont été identifiés par Y. Kawakami et al. (J. Exp. Med. 1994, 180:347-352).
Le peptide ELA de séquence ELAGIGILTV (SEQ ID No. 47) correspondant au peptide Melan26-35 analogue au décamère « parent » EAAGIGIL (SEQ ID No. 46), a été décrit par Valmori D. et al. (International Immunology, Vol. 11, N° 12, pp1971- 1979) comme étant un excellent ligant du HLA-A2 et étant capable d'induire une réponse CTL chez la souris A2-Kb supérieure à celle obtenue avec le peptide « parent ».
Ce peptide, très hydrophobe est solubilisé et conservé dans le DMSO pour les essais biologiques. Il semble qu'aucune étude visant à améliorer sa solubilité dans les milieux aqueux n'ait été menée.
Les peptides ELA et FluMI ont déjà été injectés à l'Homme solubilisés dans le DMSO 20 % (Jager E. et al., Int. J. Cancer, 2000, 86:538-547) ou dans le DMSO pur pour ELA (Wang F. et al., Clinical Cancer Research, 1999, 5:2756-2765) lors d'études cliniques réalisées sur des patients atteints de mélanome.
Des études de solubilité ont également été menées avec l'antigène associé aux tumeurs hTERT dérivé de la télomérase.
Ainsi, il reste souhaitable de pouvoir disposer d'un procédé général permettant de rendre soluble ou d'améliorer la solubilité en milieu aqueux, notamment en milieu injectable à l'Homme, d'un composé peptidique de nature hydrophobe. De préférence, ledit procédé doit permettre, le cas échéant, de conserver au moins une part suffisante d'une activité biologique d'intérêt dudit composé hydrophobe.
Plus particulièrement, il reste souhaitable de pouvoir disposer d'un procédé permettant d'une part de rendre soluble ou d'améliorer la solubilité en milieu aqueux injectable à l'Homme, d'un ligand peptidique hydrophobe du CMH de classe I ou II, notamment d'un ligand peptidique dont le fragment épitope CTL est de nature hydrophobe, ceci tout en conservant sa capacité à se lier aux molécules du CMH et/ou sa capacité à induire une réponse CTL.
Ceci est justement l'objet de la présente invention. Les inventeurs ont en effet constaté qu'il est possible d'améliorer de manière très significative la solubilité en milieu aqueux, notamment en milieu aqueux injectable à l'Homme, des composés peptidiques possédant une activité recherchée comme ceux ayant un intérêt pharmaceutique tels que les ligands du CMH comportant un épitope CTL de nature hydrophobe, ceci en leur ajoutant au moins au total 3 résidus, de préférence consécutifs, sélectionnés parmi l'arginine et/ou la lysine répartis à l'extrémité N-terminale et/ou C-terminale de ces ligands hydrophobes tout en conservant au moins en partie cette activité biologique recherchée lorsque ces composés peptidiques sont utilisés en milieu aqueux.
Les inventeurs ont mis en évidence de façon tout à fait surprenante, que l'addition de résidus arginine et/ou lysine à l'extrémité N-terminale et/ou C-terminale de peptide, tel que le ligand du CMH FluMI de séquence SEQ ID No. 2 ou le ligand du CMH ELA de séquence SEQ ID No. 47 ou encore les ligands du CMH dérivés de la télomérase hTERT 572 Y1 de séquence SEQ ID No. 66, hTERT 988 de séquence SEQ ID No. 67 et hTERT 988 Y1 de séquence SEQ ID No. 68, permettait d'obtenir une solubilité accrue de ces peptides ainsi modifiés en milieu aqueux tout en conservant pour ceux testés leur capacité à induire une réponse CTL en milieu aqueux.
Les inventeurs ont mis par exemple en évidence que l'addition de 3 résidus acide aspartique à l'extrémité N-terminale ou C-terminale du ligand du CMH FluMI de séquence SEQ ID No. 2 si elle ne perturbe pas la capacité de fixation de ce peptide au HLA-A2 provoque néanmoins une perte totale de sa capacité à induire une réponse CTL lorsqu'il est testé dans les mêmes conditions que le peptide FluMI additionné de résidus arginine et/ou lysine en N-ou C-terminal, montrant ainsi la difficulté supplémentaire d'obtenir à la fois une meilleure solubilité pour un peptide, tout en conservant l'activité biologique recherché pour ce peptide. Ainsi, sous un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé permettant de rendre soluble ou d'améliorer la solubilité en milieu aqueux d'un peptide, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle ledit peptide est modifié par l'adjonction par liaison covalente d'au moins au total 3 résidus, de préférence consécutifs, sélectionnés parmi l'arginine et/ou la lysine, lesdits au moins 3 résidus étant répartis à l'extrémité N-terminale et/ou C-terminale dudit peptide, et pouvant constituer une chaîne linéaire ou branchée.
De préférence, ladite modification apportée au peptide non encore modifié est constituée par la seule adjonction de résidus d'arginine et/ou de lysine consécutifs à l'extrémité N-terminale et/ou C-terminale. ' Pour plus de clarté, on entendra désigner dans la présente description, notamment dans le jeu de revendications, et en absence de précision complémentaire par « peptide » ou par « ligand du CMH », le peptide ou le ligand du CMH non encore modifié par le procédé de l'invention, ceci par opposition respectivement au terme « peptide modifié » (ou « peptide ainsi modifié ») ou « ligand du CMH modifié » (ou « ligand du CMH ainsi modifié »).
De préférence, le procédé de l'invention est caractérisé en ce que la solubilité en milieu aqueux obtenue pour le peptide ainsi modifié est suffisante pour qu'au moins une part de l'activité biologique dudit peptide non modifié que l'on recherche à exercer, soit conservée par ledit peptide ainsi modifié par le procédé de l'invention lorsque ce dernier est utilisé en milieu aqueux. Par activité biologique pour un peptide ou pour un composé peptidique, on entend désigner toute activité biologique telle que par exemple, et sans s'y limiter, une activité antigénique, notamment capable d'induire une réponse immune, de type humorale ou cellulaire, telle que la capacité à se fixer au CMH (ligand de CMH), notamment de classe I ou II et, le cas échéant, de générer des cellules T helper et/ou des lymphocytes de type CTL, ou encore une activité anticorps, de ligand de récepteur, de récepteur, d'inhibiteur, enzymatique, hormonale, de médiateur de signal, d'inducteur, de substrat pour une réaction biochimique, etc..
Par au moins une part de l'activité biologique pour un peptide modifié ou pour un composé peptidique modifié selon le procédé de l'invention, on entend désigner toute activité biologique exercée par le peptide non modifié et qui est au moins exercée de manière partielle en milieu aqueux par le peptide ou le composé peptidique modifié.
Il est également entendu que fait aussi partie de l'invention un procédé selon l'invention dans lequel un résidu autre qu'un résidu arginine ou lysine est également ajouté à l'extrémité N-terminale ou C-terminale dudit composé peptidique, ceci en outre desdits au moins 3 résidus, de préférence consécutifs, arginine et/ou lysine, si cet autre résidu ajouté ne réduit pas significativement l'accroissement de solubilité et, le cas échéant, l'activité biologique observé(s) en milieu aqueux pour le peptide modifié par l'ajout des seuls résidus arginine et/ou lysine. Dans la présente description, on entendra désigner par « composé peptidique
», tout composé comprenant un peptide constitué d'une séquence d'acides aminés naturels ou non, de forme L ou D, ledit composé peptidique pouvant être choisi notamment parmi les peptides, les peptides-nucléiques acides, les lipopeptides ou les glycopeptides. Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme « peptide » également les protéines ou les polypeptides, termes qui seront ici employés indifféremment.
Par milieu aqueux, on entend désigner tout particulièrement une solution aqueuse telle qu'une solution tampon, notamment physiologique, comme un tampon salin tel qu'un tampon phosphate salin (PBS) ou toute solution aqueuse injectable à l'Homme.
En outre, les inventeurs ayant mis en évidence, comme il ressortira des exemples suivants, une amélioration de la solubilité en milieu aqueux d'un peptide comprenant au moins 3 résidus, de préférence consécutifs, arginine et/ou lysine, la présente invention concerne également, selon un deuxième aspect, un procédé de solubilisation ou d'amélioration de la solubilité d'un peptide par adjonction d'au moins au total 3 résidus, de préférence consécutifs, consistant en un panachage de résidus arginine et lysine. Par panachage, il faut comprendre que les résidus consécutifs arginine et lysine peuvent être alternés, de manière aléatoire, les uns avec les autres, et ce sans se soucier de leur répartition entre les extrémités N- et C-terminal. Plusieurs combinaisons sont envisageables comme par exemple, sans aucune limitation, KKK- peptide-R, R-peptide-KKK, RKRK-peptide, peptide-RKRK, KKKR-peptide ou encore peptide-RKKK.
Selon un troisième aspect préféré, le procédé objet de l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle ledit peptide est modifié par l'adjonction par liaison covalente d'au moins au total 3 résidus lysine, de préférence consécutifs, répartis à l'extrémité N-terminale et/ou C-terminale dudit peptide, ces au moins 3 résidus lysine pouvant constituer une chaîne linéaire ou branchée.
Selon un quatrième aspect préféré, le procédé objet de l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle ledit peptide est modifié par l'adjonction par liaison covalente d'au moins au total 3 résidus arginine, de préférence consécutifs, répartis à l'extrémité N-terminale et/ou C-terminale dudit peptide, ces au moins 3 résidus arginine pouvant constituer une chaîne linéaire ou branchée.
Dans un mode de réalisation également préféré, la présente invention a pour objet un procédé selon l'invention, caractérisé en ce que le nombre total de résidus, de préférence consécutifs, arginine et/ou lysine répartis à l'extrémité N-terminale et/ou C- terminale dudit peptide est compris entre 3 et 6, bornes incluses, de préférence entre 3 et 5, bornes incluses et, encore mieux, est de 4.
Dans un mode de réalisation également préféré, lesdits au moins au total 3 résidus, de préférence consécutifs, arginine et/ou lysine constituent une chaîne linéaire d'acide aminé.
Dans un mode de réalisation également préféré, lesdits au moins au total 3 résidus, de préférence consécutifs, arginine et/ou lysine sont ajoutés soit à l'extrémité libre N-terminale ou soit à l'extrémité libre C-terminale dudit peptide. Dans un mode de réalisation également préféré, lesdits au moins au total 3 résidus, de préférence consécutifs, arginine et/ou lysine ajoutés sont de forme L.
Dans un mode de réalisation également préféré, ledit peptide (non encore modifié par le procédé selon l'invention) comprend au moins 6 acides aminés, de préférence au moins 7 ou 8 acides aminés. Dans un mode de réalisation également préféré, ledit peptide (non encore modifié) comprend au plus 50 acides aminés, de préférence au plus 45, 40 ou 35 acides aminés, de manière plus préférée au plus 30, 25, 20 ou 15 acides aminés. Dans un mode de réalisation également préféré, l'ajout par liaison covalente desdits au moins au total 3 résidus, de préférence consécutifs, arginine et/ou lysine à l'extrémité libre N-terminale et/ou C-terminale dudit peptide est réalisée par synthèse chimique, ou encore par fusion génétique lorsque la structure dudit peptide ainsi modifié le permet.
Dans un mode de réalisation également préféré, le peptide modifié obtenu par le procédé selon l'invention, est soluble en milieu aqueux, notamment dans un tampon PBS, à au moins 5 mg/ml, de préférence à au moins 6 ou 7 mg/ml, au moins 7 mg/ml étant le minimum de solubilité le plus préféré.
Sous un autre aspect préféré, ledit peptide est un peptide utile pour la préparation d'une composition pharmaceutique ou cosmétique.
De préférence, ledit peptide est un principe actif capable d'exercer une action thérapeutique (préventive ou curative).
De préférence encore ledit peptide est un peptide dont la séquence comprend un ou plusieurs épitopes antigéniques de nature hydrophobe.
Par « épitope antigénique », on entend désigner ici un peptide qui lorsqu'il est administré chez un animal ou l'Homme, seul ou en présence d'adjuvant de l'immunité ou encore en association avec une molécule porteuse, est capable d'induire une réponse immune de type humoral ou cellulaire dirigée spécifiquement contre cette épitope, de préférence capable de générer des lymphocytes CTL dirigés spécifiquement contre cette épitope.
Sous un autre aspect particulièrement préféré, ledit peptide est un ligand, naturel ou synthétique, du CMH, notamment de classe I ou II.
De préférence, ledit peptide est choisi parmi les épitopes antigéniques dérivés d'une protéine antigénique de microorganisme, de préférence pathogène pour un mammifère tel que l'Homme, ces microorganismes pouvant être des virus, bactéries, levures, champignons ou parasites, ou encore dérivés d'une protéine antigénique associée à une tumeur.
De préférence, ledit peptide est un ligand, naturel ou synthétique, du CMH, caractérisé en ce qu'il peut être également choisi parmi des constructions polypeptidiques multi-épitopiques, des pseudopeptides, des peptides rétro-inverso de peptides, des peptoïdes, des peptido-mimétiques, ou encore choisi parmi des peptides inclus dans des composés peptidiques tels que des peptides-nucléiques acides, des ϋpopeptides ou des glycopeptides.
Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme « polypeptide multi-épitopiques », une construction peptidique comprenant sur une même séquence un ensemble de plusieurs épitopes de nature peptidique.
Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme « pseudopeptide », tout peptide, ou molécule analogue, contenant une ou plusieurs liaisons non peptidiques entre les acides α aminés.
Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme « peptide rétro- inverso », pour un peptide donné de n acides aminés et de séquence générale H2N- rX2- -Xn-1-Xn-COOH, un peptide de n acides aminés de séquence H2N-Xn-Xn-1-
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où les acides aminés de la série L sont remplacés par des acides aminés de la série D, où H2N-X! (ou H2N-Xn t) et Xn-COOH (ou Xi-COOH) représentent respectivement le résidu d'acide aminé en position N-terminale et le résidu d'acide aminé en position C-terminale dudit peptide.
Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme « peptoïde », des oligomères obtenus à partir de dérivés glycine N-substitués.
Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme « peptido- mimétique », toute molécule présentant au moins une propriété fonctionnelle propre aux peptides et, plus particulièrement, toute molécule dans lesquelles les liaisons amides sont complètement ou partiellement remplacées par des liaisons non peptidiques tout en conservant les chaînes d'acides aminés essentiels à l'activité dans une position spatiale définie et/ou toute molécule dans lesquelles les α CH sont remplacés par un atome d'azote et/ou toute molécule dans lesquelles les chaînes latérales des acides aminés sont modifiées.
De préférence, ledit peptide non modifié est un ligand, naturel ou synthétique, du CMH permettant la génération de lymphocytes T cytotoxiques, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les épitopes CTL.
De préférence, ledit peptide non modifié est un ligand, naturel ou synthétique, du CMH permettant la génération de lymphocytes T cytotoxiques, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les épitopes CTL se présentant sous forme d'octapeptide, de nonapeptide, de décapeptide hydrophobes, de préférence se présentant sous la forme d'un peptide d'au plus 15 acides aminés, ou encore sous la forme d'un regroupement d'épitopes hydrophobes. De préférence, ledit peptide est un ligand du CMH permettant la génération de lymphocytes T cytotoxiques, caractérisé en ce que ledit ligand du CMH comprend un peptide choisi parmi les peptides de séquence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID Mo. 46 ou SEQ ID No. 47. De préférence, ledit peptide est un ligand du CMH, caractérisé en ce que ledit ligand du CMH comprend un peptide choisi parmi les peptides suivants : a) un peptide dont la séquence d'acides aminés est la séquence de la forme rétroinverso d'un peptide de séquence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 ou SEQ ID No. 47 ; et b) un peptide dont la séquence présente un degré d'identité après alignement optimal d'au moins 70 %, de préférence d'au moins 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % avec la séquence d'un peptide de séquence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 ou SEQ ID No. 47, et caractérisé en ce que ledit ligand du CMH est capable de générer des lymphocytes T de type cytotoxique et/ou T helper, en particulier spécifique dudit ligand du CMH, et/ou capable de générer une augmentation significative du taux de lymphocytes T CD8+ et/ou CD4+ produisant de l'INF-γ et, le cas échéant, du TNF-α, lorsque cedit ligand du CMH est mis en présence de lymphocytes T de sujets ayant présenté les antigènes dont ledit ligand est issu. Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un ligand du CMH, notamment de classe I ou II, de nature peptidique, modifié par l'adjonction d'au moins au total 3 résidus, de préférence consécutifs, arginine et/ou lysine, répartis à son extrémité N-terminale et/ou C-terminale, ces 3 résidus arginine et/ou lysine pouvant constituer une chaîne linéaire ou branchée, de préférence le ligand du CMH avant modification étant de nature hydrophobe.
Par le terme hydrophobe dans la présente description, on entend désigner pour un peptide ou un ligand du CMH de nature peptidique, un peptide ou un ligand du CMH non soluble dans un milieu aqueux, ou insuffisamment soluble pour pouvoir exploiter dans ce milieu aqueux l'ensemble ou l'une au moins des activités biologiques pouvant être exercées par ce même peptide ou ligand du CMH dans un autre milieu (notamment dans un milieu contenant du DMSO).
De préférence, la modification apportée au ligand du CMH non encore modifié ou de manière générale à un peptide est constituée par la seule adjonction de résidus d'arginine et/ou lysine consécutifs à l'extrémité N-terminale et/ou C-terminale, ceci notamment pour exclure de l'invention tout peptide ou ligand du CMH modifié par l'adjonction à un premier peptide d'un second peptide présentant une activité autre que celle d'augmenter la solubilité dudit premier peptide, ce second peptide pouvant comporter naturellement au moins trois résidus arginine et/ou lysine consécutifs ou dispersés dans sa séquence, ou encore à une de ses extrémités pour la fusion avec le premier peptide (« linker »).
De préférence, ledit ligand du CMH selon l'invention, est caractérisé en ce le nombre total de résidus, de préférence consécutifs, arginine et/ou lysine répartis à l'extrémité N-terminale et/ou C-terminale dudit ligand est compris entre 3 et 6, bornes incluses, de préférence entre 3 et 5, bornes incluses. De préférence encore, lesdits au moins au total 3 résidus, de préférence consécutifs, arginine et/ou lysine constituent une chaîne linéaire d'acide aminé.
De préférence encore, lesdits au moins au total 3 résidus, de préférence consécutifs, arginine et/ou lysine sont ajoutés soit à l'extrémité libre N-terminale ou soit à l'extrémité libre C-terminale dudit ligand du CMH. De préférence encore, l'ensemble des résidus, de préférence consécutifs, arginine et/ou lysine ajoutés est de forme L.
De préférence encore, ledit ligand du CMH (non modifié) comprend au plus 50 acides aminés, de préférence au plus 45, 40 ou 35 acides aminés, de manière plus préférée au plus 30, 25, 20 ou 15 acides aminés. Parmi cesdits ligands du CMH (non modifié), on préfère les ligands du CMH constitués d'au plus 15 acides aminés.
De préférence, ledit ligand du CMH de nature peptidique non modifié est capable de générer des lymphocytes T cytotoxiques et/ou T helper, en particulier spécifiques dudit ligand du CMH et/ou capable de générer une augmentation significative du taux de lymphocytes T CD8+ et/ou CD4+ produisant de l'INF-D et, le cas échéant, du TNF-α, lorsque cedit ligand du CMH est mis en présence de lymphocytes T de sujets ayant présenté les antigènes dont ledit ligand est issu ; et, est caractérisé en ce que la solubilité en milieu aqueux dudit ligand du CMH de nature peptidique avant modification est significativement inférieure à celle dans les mêmes conditions dudit ligand du CMH ainsi modifié selon l'invention.
De préférence, ledit ligand du CMH non modifié n'est pas soluble en milieu aqueux, notamment en tampon phosphate salin (PBS), à une concentration supérieure à 1 mg/ml. De préférence, la différence de solubilité évaluée en tampon PBS entre ledit ligand du CMH non modifié et ledit ligand du CMH modifié est supérieure ou égale à 2, de préférence à 3 et 4 mg/ml.
Comme méthode de calcul de solubilité, on pourra se référer notamment à la méthode comme décrite à l'exemple 2.
De préférence ledit ligand du CMH modifié est caractérisé en ce qu'il est soluble en milieu aqueux, notamment en tampon phosphate salin (PBS), à au moins 5 mg/ml, de préférence à au moins 6 ou 7 mg/ml, 7 mg/ml étant la solubilité minimale la plus préférée. De préférence, ledit ligand du CMH ainsi modifié, notamment lorsque les résidus consécutifs arginine et/ou lysine ajoutés audit ligand du CMH (non modifié) sont de forme L, est capable en solution aqueuse de générer des lymphocytes T cytotoxiques et/ou T helper, en particulier spécifique dudit ligand du CMH, et/ou capable de générer une augmentation significative du taux de lymphocytes T CD8+ et/ou CD4+ produisant de l'INF-γ et, le cas échéant, du TNF-α, lorsque cedit ligand du CMH est mis en présence de lymphocytes T de sujets ayant présenté les antigènes dont ledit ligand du CMH est issu.
De préférence encore, ledit ligand du CMH selon l'invention est caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les épitopes CTL. De préférence encore, ledit ligand du CMH selon l'invention est caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les épitopes CTL se présentant sous forme d'octapeptide, de nonapeptide ou de décapeptide ou un regroupement d'épitopes hydrophobes.
De préférence encore ledit ligand du CMH de nature peptidique avant modification comprend un ou est constitué d'un peptide choisi parmi les peptides de séquences suivantes : a) SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 ou SEQ ID No. 47; b) un peptide dont la séquence d'acides aminés est la séquence de la forme rétroinverso d'un peptide de séquence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 ou SEQ ID No. 47 ; et c) un peptide dont la séquence présente un degré d'identité après alignement optimal d'au moins 70 %, de préférence d'au moins 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % avec la séquence d'un peptide de séquence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 ou SEQ ID No. 47. Parmi cesdits ligands du CMH ainsi modifiés selon l'invention, on préfère les ligands du CMH de nature peptidique choisis parmi les peptides de séquence SEQ ID Nos. 75, 76 et 77 et les peptides de séquence SEQ ID Nos. 78 et 79, ces peptides pouvant, le cas échéant, comprendre une mutation ponctuelle dans la séquence du ligand du CMH non modifié dont il est issu, notamment une substitution d'un acide aminé par un autre acide aminé naturel ou non naturel.
Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un peptide dont la séquence comprend un ou plusieurs épitopes antigéniques de nature hydrophobe, ledit peptide ayant été modifié par un procédé selon l'invention, ou un ligand du CMH selon l'invention comme médicament.
Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant un composé choisi parmi :
- un peptide modifié par un procédé selon l'invention, ou un ligand du CMH modifié selon l'invention, le cas échéant mélangé ou couplé à une protéine porteuse ou l'un de ses fragments ; ou
- une construction nucléique contenant un ADN codant pour un peptide modifié par un procédé selon l'invention, ou pour un ligand du CMH modifié selon l'invention, le cas échéant contenant en outre un ADN codant pour une protéine porteuse ou l'un de ses fragments. Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un peptide dont la séquence comprend un ou plusieurs épitopes antigéniques de nature hydrophobe dérivé d'une protéine antigénique de microorganisme pathogène, ledit peptide ayant été modifié par un procédé selon l'invention, ou d'un ligand du CMH modifié selon l'invention comprenant de tels épitopes antigéniques, pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections par ce microorganisme, notamment des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques.
Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un peptide dont la séquence comprend un ou plusieurs épitopes antigéniques de nature hydrophobe dérivés d'une protéine antigénique associée à une tumeur, ledit peptide ayant été modifié par un procédé selon l'invention, ou d'un ligand du CMH modifié selon l'invention comprenant de tels épitopes antigéniques, pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers associés à cette antigène, préférentiellement à inhiber la croissance de tumeurs associées à cette antigène. Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un vaccin, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un peptide dont la séquence comprend un ou plusieurs épitopes antigéniques de nature hydrophobe dérivé d'une protéine antigénique de microorganisme pathogène ou dérivé d'une protéine antigénique associée à une tumeur, ledit peptide ayant été modifié par un procédé selon l'invention, ou en ce qu'il comprend un ligand du CMH modifié selon l'invention comprenant au moins un tel épitope antigénique.
La présente invention a également pour objet un vaccin selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un adjuvant, de préférence choisi parmi les adjuvants suivants : les protéines de la membrane externe de type A, dénommées OmpA d'entérobactérie, TT, PLGA, ISCOM, IFA, Montanide, ISA 720, ISA 51 , les ammonium quaternaires lipidiques, MPL-A, le Quil-A et autres saponines (QS21) les CpG.
La présente invention porte également sur un vaccin selon l'invention caractérisé en ce qu'il comprend en outre, un composé porteur mélangé ou couplé audit peptide modifié comprenant un ou plusieurs épitopes antigéniques ou audit ligand du CMH modifié.
La présente invention porte également sur un vaccin selon l'invention caractérisé en ce que ledit peptide modifié comprenant un ou plusieurs épitopes antigéniques ou ledit ligand du CMH modifié, associé éventuellement à un composé porteur, est incorporé dans des vecteurs choisis parmi les liposomes, les virosomes, les nanosphères, les microsphères ou les microcapsules.
L'invention a également pour objet un vaccin selon l'invention caractérisé en ce que ledit peptide modifié comprenant un ou plusieurs épitopes antigéniques ou ledit ligand du CMH modifié, associé éventuellement à un composé porteur, est véhiculé sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et ou son immunogénicité.
Parmi les véhicules permettant d'améliorer la stabilité et/ou l'immunogénicité desdits peptides, on préfère notamment les liposomes, les PLGA ou autres polymères ainsi que les vecteurs viraux ou bactériens contenant une construction nucléique codant pour ledit peptide et éventuellement en outre ladite protéine porteuse, ou l'un de ses fragments.
De préférence, ledit composé porteur est une protéine porteuse choisie parmi la protéine TT (Toxoïde Tétanique) ou ses dérivés, la protéine DT (Toxoïde Diphtérique) ou ses dérivés, la KLH (Key Limpet Haemocyanin), les protéines de choc thermique ou HSP, les protéines de membranes bactériennes de type Omp, notamment d'entérobactéries, ou leurs fragments.
Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme « Omp » (pour « Outer Membrane Protéin »), les protéines de la membrane externe, et par « OmpA » celles de type A.
Par fragment ou composés dérivés d'une protéine porteuse, on entend désigner en particulier tout fragment de séquence d'acides aminés compris dans la séquence d'acides aminés de la protéine porteuse qui, lorsqu'il est associé à un immunogène, est capable de générer ou accroître une réponse immune, notamment humorale et/ou de type CTL, dirigée contre ledit immunogène et comprenant au moins 8 acides aminés consécutifs, de préférence au moins 10 acides aminés ou de manière plus préférée au moins 15, 20, 30 ou 50 acides aminés consécutifs de la séquence d'acides aminés de ladite protéine porteuse, leurs composés dérivés comprenant au moins l'un de ses fragments. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention comprend un vaccin selon l'invention dans laquelle la protéine porteuse Omp d'entérobactérie ou l'un de ses fragments, est obtenue par un procédé d'extraction à partir d'une culture de ladite entérobactérie ou par voie recombinante.
Les procédés d'extraction de protéines de membranes bactériennes sont connus de l'homme de l'art et ne seront pas développés dans la présente description. On peut citer par exemple, mais sans s'y limiter le procédé d'extraction décrit par Haeuw J.F. et al. (Eur. J. Biochem, 255:446-454, 1998).
Les méthodes de préparation de protéines recombinantes sont aujourd'hui également bien connues de l'homme de l'art. Parmi les cellules utilisables pour la production de ces protéines recombinantes, on peut citer par exemple les cellules bactériennes (Olins P.O. et Lee S.C., 1993, Curr. Op. Biotechnology, 4:520-525), mais également les cellules de levure (Buckholz R.G., 1993, Curr. Op. Biotechnology, 4:538- 542), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifères (Edwards OP. et Aruffo A., 1993, Curr. Op. Biotechnology, 4:558-563) mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre par exemple des baculovirus (Luckow V.A., 1993, Curr. Op. Biotechnology, 4:564-572).
De manière tout à fait préférée, ladite protéine porteuse est une protéine OmpA de Klebsiella pneumoniae, en particulier la protéine P40 de séquence SEQ ID No. 72, l'un de ses fragments d'au moins 8 acides aminés, de préférence au moins 10, 15, 20, 30 ou 50 acides aminés, ou un peptide dont la séquence présente un degré d'identité après alignement optimal d'au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 % ou 95 % avec la séquence de P40 ou l'un de sesdits fragments.
La protéine porteuse nommée P40, dérivée de la membrane externe de type A de Klebsiella pneumoniae a été décrite en particulier dans les demandes de brevet WO
95/27787 et WO 96/14415 comme permettant d'augmenter la réponse immune, notamment de type humorale et cellulaire, lorsque celle-ci était associée à un immunogène.
Sous un autre aspect, l'invention concerne un vaccin selon l'invention, caractérisée en ce que ledit vaccin contient un vecteur comprenant une construction nucléique codant pour le peptide hybride résultant du couplage entre le peptide modifié comprenant un ou plusieurs épitopes antigéniques ou pour ledit ligand du CMH et ladite protéine porteuse, ou l'un de ses fragments, ou contient une cellule hôte transformée par ledit vecteur capable d'exprimer ledit peptide hybride. Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet une composition pharmaceutique ou un vaccin selon l'invention, administrable par voie systémique, notamment par voie injectable, mucosale ou transdermique.
Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. Légendes des figures :
Figures 1A à 1D : Sécrétion d'IFNγ, induite par les peptides FluMI (1A), 4K-FluM1
(1C), FluM1-4K (1D), et 4k-FluM1 (1B), solubillisés dans le PBS, chez un sujet HLA-A2 positif et sensibilisé par le virus de la grippe.
Figures 2A à 2D : Sécrétion d'IFNγ, induite par les peptides FluMI (2A), 4K-FluM1 (2C), FluM1-4K (2D), et 4k-FluM1 (2B), solubillisés dans le DMSO, chez un sujet HLA-
A2 négatif.
Figures 3A à 3C : Etude de la réponse CTL induite par les peptides 4K-FluM1 (3A),
FluM1-4K (3B) et 4k-FluM1 (3C) solubillisés à 2 mg/ml dans le PBS en présence de
P40 après immunisation de la souris HLA-A2/Kb. Figures 4A à 4C : Etude de la réponse CTL induite par les peptides 4K-ELA (4A), ELA-
4K (4B) et 4k-ELA (4C) solubillisés à 2 mg/ml dans le PBS en présence de P40 après immunisation de la souris HLA-A2/Kb.
Figures 5A et 5B : Etude de la réponse CTL induite par les peptides 4R-ELA solubilisés à 2 mg/ml dans le PBS en présence de P40 après immunisation de la souris HLA- A2/Kb. Figure 6 : Etude de la réponse CTL induite par le peptide 5K-ELA solubilisé à 2 mg/ml dans le PBS en présence de P40 après immunisation de la souris HLA-A2/Kb. Figure 7 : Etude de la réponse CTL induite par le peptide 3D-FluM1 solubilisé à 2 mg/ml dans le PBS en présence de P40 après immunisation de la souris HLA-A2/Kb. Figures 8A à 8E : Sécrétion d'IFNγ, induite par les peptides FluMI, 4K-FluM1, FluM1- 4K et 4k-FluM1 solubilisés dans le DMSO, chez un clone T CD8+ humain, spécifique du peptide FluMI.
Figures 9A à 9D : Sécrétion d'IFNγ, induite par les peptides 4K-FluM1, FluM1-4K et 4k- FluM1 solubilisés dans le PBS, chez un clone T CD8+ humain, spécifique du peptide FluMI.
Figure 10 : Analyse par électrophorèse SDS-PAGE du conjugué rP40-C4KELA. Figures 11A et 11B : Analyse par chromatographie d'exclusion à -6 mois des conjugués rP40-C4KELA en solution (sol) (figure 11 A) ou lyophilisé (lyo) (figure 11B) conservés à + 4°C ou à + 37°C « Sample Name » pour « Nom de l'échantillon ». Figures 12A et 12B : Etude de la réponse CTL induite par les conjugués rP40-C4KELA en solution ou lyophilisé à tO après immunisation de la souris HLA A2 Kb (figure 12A) et à t6 mois après immunisation de la souris HLA A2 Kb (figure 12B) « Lysis » pour « lyse ».
EXEMPLES
Exemple 1 : Synthèse, purification et caractérisation de peptides
Les 96 peptides FluMI et ELA et dérivés ainsi que les 6 peptides épitopes CTL HLA-A2 et dérivés appartenant à la télomérase, ont été synthétisés à l'aide d'un synthétiseur multiple de peptides (Advanced ChemTech, modèle 348 oméga) en phase solide en utilisant la chimie Fmoc à l'échelle de 50 μmoles. Les résines de types Wang- ou 2-chlorotrityl- préchargées portant le résidu COOH-terminal des peptides à synthétiser ont été introduites dans les puits d'un réacteur comportant 96 puits. La fonction α-NH2 des acides aminés utilisés pour la synthèse était protégée par un groupement (Fmoc) et les fonctions des chaînes latérales des acides aminés étaient protégées par des groupes compatibles avec la chimie Fmoc [Cys(Trt) ; Arg(Pmc) ; His(Trt) ; Trp(Boc) ; Asn(Trt) ; Gln(Trt) ; Lys(Boc) ; Ser(tBu) ; Thr(tBu) ; Tyr(tBu) ; Asp(OtBu) ; Glu(OtBu)]. L Protocole de synthèse Lavages préliminaires : DCM 1500 μl/puits 3 fois 5 min DMF 1500 μl/puits 3 fois 10 min
1. Déprotections : a. DMF 1125 μl/puits pipéridine 375 μl/puits 1 fois 2 min rinçage : DMF 1500 μl/puits vidange b. DMF 1125 μl/puits pipéridine 375 μl/puits 1 fois 10 min
2. Lavages : DMF 1500 μl/puits 6 fois 2 min
3. Couplages a. aa/HOBt 0.5M 500 μl/puits HBTU 0.5M 500 μl/puits DIEA 2M 250 μl/puits 1 fois 20 min
Lavages DMF 1500 μl/puits 2 fois 2 min b. Aa/HOBt 0.5M 500?ιl/puits HATU 0.5M 500 μl/puits DIEA 2M 250 μl/puits 1 fois 20 min
4. Lavages DMF 1500 μl/puits 4 fois 2 min DCM 1500 μl/puits 3 fois 1 min
5. Acétylation mélange § 1500 μl/puits 1 fois 10 min
6. Lavages DCM 1500 μl/puits 3 fois 1 min DMF 1500 μl/puits 4 fois 2 min
§ Mélange utilisé : Anhydride acétique 10 %, DIEA 5 %, dans le DCM.
Le cycle comprenant les étapes 1 à 6 est répété n fois jusqu'à l'obtention des séquences désirées. Après le dernier cycle de couplage, la fonction α-NH2 du peptidylrésine est déprotégée à l'aide de pipéridine comme décrit dans l'étape 1.
En fin de synthèse, les peptidylrésines sont lavés comme ci-après : Lavages DMF 1500 μl/puits 4 fois 2 min
DCM 1500 μl/puits 4 fois 3 min avant d'être séchés pendant 3 heures sous azote.
SS. Clivage des peptidylrésines et récupération des peptides
Les peptides sont ensuite clivés de la résine et les fonctions des chaînes latérales des acides aminés sont déprotégées par réaction pendant 3 h à température ambiante du peptidylrésine avec un mélange de clivage dont la composition est la suivante pour 100 mg de peptidylrésine, 1 ,5 ml du mélange : TFA 82,5 % ; H2O 5 % ; EDT 2,5 % ; Thioanisol 5 % et phénol 5 %.
La résine est séparée du peptide par simple filtration. Le peptide est ensuite précipité par addition de diéthyléther à 4°C. Le peptide brut est récupéré par centrifugation à 3000 tr/min pendant 3 min. Après trois lavages à l'éther, le peptide est repris à l'aide d'une solution aqueuse d'acide acétique puis lyophilisé.
III. Purification des peptides
Les peptides sont repris dans un mélange d'acide acétique et d'eau et purifiés par RP-HPLC (Chromatographie liquide haute performance en phase reverse) semi- préparative sur une colonne C4 ou C18. Le système d'élution étant un gradient H2O et acétonitrile en présence de 0,1 % de TFA.
IV. Analyses des peptides
La pureté du peptide est vérifiée par RP-HPLC en phase inverse. L'identité du peptide est confirmée par spectrométrie de masse de type ES-MS.
Caractéristiques des nonapeptides synthétisés : pureté des peptides: > 85 % (RP-HPLC) identité des peptides: en accord avec la masse attendue (ES-MS)
Abréviations :
Aa : Fmoc acide aminé ; Boc : Tertiobutyloxycarbonyl ; DCM : Dichlorométhane ; DIEA : Diisopropyléthylamine ; DMF : Diméthylformamide ; EDT : Ethanedithiol ; ES- MS : Electrospray Mass Spectrometry ; Fmoc : 9-Fluorenylméthoxycarbonyl ; haut : O- (7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tétraméthyluronium hexafluorophosphate; HBTU : 2- (1H-Benzotriazo!e-1-yl)-1,1,3,3-tétraméthyluronium hexafluorophosphate ; HOBt : Hydroxybenzotriazole ; NMP : N-méthyl-2-pyrrolidone ; Pmc : 2,2,5,7,8-Pentamethyl- chroman-6-sulfonyl ; RP-HPLC : Reverse Phase - High Performance Liquide Chromatography ; TBu (OtBu) : Tertiobutyl ; TFA : Trifluoroacetic acid ; Trt : Trityl.
Tableau I : Séquence des 60 peptides FLUM1 et dérivés synthétisés
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
* k = D-Lysine Tableau II : Séquence des 21 peptides ELA et dérivés synthétisés
Figure imgf000023_0001
k = D-
Figure imgf000024_0001
Tableau III : Séquence des 6 peptides CTL HLA-A2 dérivés de la télomérase synthétisés
Figure imgf000024_0002
Exemple 2 : Identification des peptides solubles dans le PBS, notamment à 7 mg/ml
I. Résultats généraux obtenus pour l'ensemble des peptides synthétisés II ressort des résultats obtenus que, quelle que soit la nature du peptide de base auquel est appliqué le procédé, le couplage avec des acides aminés autres que l'arginine et/ou la lysine, et notamment avec 4 desdits acides aminés autres que l'arginine et/ou la lysine, ne donne que des niveaux de solubilité inférieurs à environ 2 mg/ml, ce qui n'est pas exploitable pour les applications souhaitées.
II. Identification des peptides solubles dans le PBS à 7 mg/ml
Chaque peptide (6 pesées différentes) est repris à 1 mg/ml dans le DMSO (3 échantillons) ainsi que dans le PBS à 10 mg/ml (3 échantillons).
Les solutions de chaque peptide solubilisé dans le DMSO ou le PBS sont agitées au moyen d'un vortex et placées sur un agitateur vibrant pendant 1 heure à température ambiante. Les solutions sont ensuite placées 5 min dans un bain à ultrasons, puis centrifugées à 10 000 rpm pendant 5 minutes. Les surnageants sont analysés par RP-HPLC (purs ou dilués au 1/5e ou au 1/10e) sur une colonne C18 (250 mm x 2,1mm x 5 μm). Les éluants sont les suivants : A = H2O + 0,05 % TFA et B = CH3CN/H2O 80/20 + 0,05 % TFA. Le gradient utilisé est de 20 % à 100 % d'éluant B avec une pente de 2 % d'éluant B / min, le débit est de 0,25 ml/min.
La concentration obtenue est le résultat du calcul de la moyenne du rapport : aire du pic HPLC obtenu avec le peptide solubilisé en PBS (à 10 mg/ml) / aire du pic HPLC obtenu avec le peptide solubilisé en DMSO (à 1 mg/ml) sur 3 échantillons différents.
Tableau IV : Séquences des peptides FLUM1 / ELA et dérivés solubles dans le PBS à la concentration d'au moins 7 mg/ml
Figure imgf000025_0001
Les peptides insolubles, modifiés par 3, 4 ou 5 résidus L- ou D- arginine et/ou lysine consécutifs en N- et/ou C-terminal, panachés ou non, sont solubles dans PBS à au moins 7 mg/ml (Tableau IV) et donc, a fortiori, ont une solubilité supérieure à la limite exploitable dans les applications visées, à savoir 2 mg/ml.
Tableau V : Séquences des peptides CTL HLA-A2 et dérivés hTERT solubles dans le PBS à la concentration d'au moins 7 mg/ml
Figure imgf000026_0001
Sur les 6 peptides synthétisés, seuls ceux qui ont été modifiés par addition de 4 résidus lysine (représentés sur ce tableau) mettent en évidence un gain de solubilité en milieu aqueux suffisant pour les applications envisagées, à savoir une solubilité supérieure à environ 2 mg/ml.
Exemple 3 : Identification de peptides se fixant sur les molécules HLA-A2
Afin de faire un criblage rapide des 96 peptides dérivés de ELA et FluMI synthétisés, ces derniers ont été évalués, dans un premier temps, par I' étude de leur capacité à se fixer au complexe HLA-A2, propriété nécessaire à toute initiation d'une réponse immunitaire de type cytotoxique. Pour ce faire la lignée cellulaire T2 a été utilisée.
La lignée T2 est une lignée lymphocytaire humaine correspondant à un hybride cellules T/cellules B, exprimant constitutivement HLA-A2.
Ces cellules, déficientes en transporteur TAP, expriment peu de molécules HLA-A2 à leur surface. En absence de peptide, le complexe HLA-A2-β2 microglobuline est en permanence recyclé dans la cellule et un niveau basai de complexe est observé à la surface de la cellule. La présence d'un peptide exogène se fixant sur les molécules HLA-A2 stabilise le complexe plus ou moins longtemps, en fonction de son affinité, empêchant la réintemalisation des molécules HLA-A2 et induisant ainsi une augmentation du nombre de molécules HLA-A2 à la surface de la cellule T2. Les 96 peptides dérivés de ELA et FluMI ont été testés pour leur capacité à induire une stabilisation plus ou moins importante selon le peptide des molécules HLA- A2 à la surface des cellules T2 solubilisées dans le DMSO, alors que seuls les peptides solubles à au moins 7 mg/ml ont été testés dans le PBS (tableau IV). Pour ce faire, des cellules T2 ont été incubées une nuit à 37°C avec 100 μg/ml de chacun des peptides en milieu OptiMEM dépourvu de SVF et supplémenté avec 100 ng/ml de β2 microglobuline. Après 4 lavages ayant pour but d'éliminer l'excès de peptide non fixé, les cellules ont été resuspendues avec 1 ml de milieu RPM1 1640, 10 % SVF contenant 10 μg/ml de Brefeldine A capable de bloquer l'expression de surface des molécules HLA-A2 nouvellement synthétisées. Après une heure d'incubation à 37°C et 3 lavages les cellules ont été à nouveau incubées à 37°C durant 0, 2, 4 ou 6 heures avant d'être marquées avec l'anticorps monoclonal MA2.1 pour évaluer l'expression de surface des molécules HLA-A2 au FACS (Fluorescens Activated Cells Sorter).
Les résultats (tableau VI) montrent que 45 peptides dérivés de FluMI solubilisés en DMSO comme le peptide parent FluMI, sont capables parmi les 47 synthétisés d'induire une augmentation de l'expression de HLA-A2 à la surface des cellules T2. Les peptides incapables d'induire une augmentation de l'expression de HLA-A2 à la surface des cellules T2 sont: 5Q-FluM1 et 4k-FluM1.
Les résultats (tableau VII) montrent également que 7 peptides dérivés de ELA solubilisés en DMSO, parmi les 20 synthétisés sont capables d'induire une augmentation de l'expression de HLA-A2 à la surface des cellules T2. Les peptides incapables d'induire une augmentation de l'expression de HLA-A2 à la surface des cellules T2 sont : 4k-ELA ; 1D-, 2D-, 3D-, 4D- et 5D-ELA ; 4H-, 4T-, 4N-, 4Q-, 4E-, 4S- ELA et 3R-ELA.
Les résultats (tableaux VI et VII) montrent que tous les peptides dérivés de ELA et FluMI solubles dans le PBS à au moins 7 mg/ml sont capables d'induire une augmentation de l'expression de HLA-A2 à la surface des cellules T2 à l'exception des peptides 4k-FluM1 , 4k-ELA et 3R-ELA.
Tableau VI : Fixation des peptides dérivés de FluMI solubilisés en DMSO ou en PBS sur les molécules HLA-A2 des cellules T2
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
nd : non déterminé (car non soluble ou peu suffisamment soluble en PBS pour pouvoir être testé)
Tableau Vil : Fixation des peptides dérivés de ELA solubilisés en DMSO ou en PBS sur les molécules HLA-A2 des cellules T2.
Figure imgf000029_0002
Figure imgf000030_0001
nd : non déterminé (car non soluble ou peu suffisamment soluble en PBS pour pouvoir être testé)
Exemple 4 : Mesure de la sécrétion de IFND par les lymphocytes T humains, induite par les peptides 4K-FluM1, FluM1-4K et 4k-FluM1
Les peptides dérivés de FluMI 4K-FluM1 et FluM1-4K, positifs dans le test de liaison aux cellules T2 ainsi que le dérivé 4k-FluM1 négatif dans ce même test ont été solubilisés dans le PBS testés sur des cellules T cytotoxiques CD8+ d'un sujet HLA-A2 positif et sensibilisé par le virus de la grippe, pour leur capacité à induire une sécrétion d'interféron γ par ces cellules.
Brièvement, 106 cellules de sang périphérique, obtenues après Ficoll sont reprises en RPMI-10 % SVF dans des tubes de 15 ml en polypropylène et mises en présence de 100 μl de peptide à tester, à une concentration de 10 μg/ml (solution mère à 4 mg/ml) pendant 2 h à 37°C dans un incubateur. 800 μl de RPMI-10 % SVF contenant 12,5 μg/ml de Brefeldine A, bloquant la sécrétion de cytokines, sont ajoutés puis les tubes sont replacés pendant 4 heures dans l'incubateur, à 37°C.
A la fin de la période d'incubation, 100 μl de PBS-EDTA 20 mM froid sont ajoutés puis après 5 minutes, les cellules sont centrifugées et remises en suspension dans 100 μl de PBS-1 % BSA-0,01 % NaN3 (BSA pour sérum albumine bovine), contenant 0,7 μl d'anticorps anti-CD8 couplé à l'allophycocyanine (APC).
Après transfert en plaque 96 puits à fonds coniques, les cellules sont incubées 20 minutes à 4°C puis fixées 10 minutes, à l'obscurité, à température ambiante avec 100 μl de paraformaldéhyde (PFA) 2 % dans du PBS. Après deux lavages en PBS, 50 μl de PBS-Hepes 1 mM-Saponine 0,1 %, contenant 0,4 μl d'anticorps anti-IFNγ couplé au FITC (solution mère à 0,5 mg/ml) sont ajoutés sur les culots cellulaires, dans chaque puits. Après 30 minutes d'incubation à 4°C, les cellules sont lavées deux fois puis transférées dans des tubes Micronic, pour une analyse par cytométrie en flux.
L'analyse par cytométrie en flux de la sécrétion d'IFN? par les lymphocytes T CD8+, présentée dans les figures 1A à 1D, montre qu'en présence des peptides 4K- FluMI et FluM1-4K 0,16 % et 0,14 %, respectivement des lymphocytes T CD8+ sécrètent de l'IFNγ alors qu'en présence du peptide 4k-FluM1, 0,03 % des T CD8+ sont positifs en sécrétion de l'IFNγ.
Dans ces conditions, le peptide FluMI n'est pas soluble et n'induit pas de sécrétion d'IFNγ par les cellules T CD8+ (0,06 % de cellules positives). Les figures 2A à 2D montrent que quel que soit le peptide dérivé de FluMI testé chez un individu HLA-A2 négatif, il n'y a pas de sécrétion d'IFN? par les cellules T CD8+.
Exemple 5 : Mesure de la sécrétion de IFNγ induite par les peptides 4K-FluM1, FluMI -4K et 4k-FluM1, chez un clone T CD8+ humain, spécifique du peptide FluMI
Les peptides dérivés de FluMI , 4K-FluM1 et FluM1-4K, positifs dans le test de liaison aux cellules T2 ainsi que le dérivé 4k-FluM1, négatif dans ce même test ont été solubilisés dans le DMSO ou le PBS et testés sur des cellules issues d'un clone T cytotoxique CD8+ humain, spécifique de FluMI, pour leur capacité à induire une sécrétion d'IFNγ par ces cellules.
Brièvement, 5.105 cellules du clone FluMI sont incubées, en tube, 1h à température ambiante, sous agitation lente, en présence de dimères vides ou de dimères chargés la veille à 37°C en présence d'un excès du peptide à tester. Les cellules sont alors lavées deux fois en PBS BSA 0,2 % et marquées avant passage au FACS.
Les figures 8A à 8E et 9A à 9D montrent respectivement que parmi les peptides FluMI modifiés 4K-FIuM1, 4k-FluM1 et FluM1-4K, solubilisés dans le DMSO ou dans le PBS, seuls les peptides 4K-FluM1 et FluM1-4K sont capables, lorsqu'ils sont présentés par l'intermédiaire de dimères du CMH classe I, d'induire une sécrétion d'interféron γ chez l'ensemble de la population clonale testée, sécrétion comparable à celle induite par le peptide natif FluMI (cf. figure 8B). Comme attendu, lorsque l'expérience est effectuée en présence de dimères non chargés, aucune production d'interféron γ n'est observée (cf. figures 8A et 9A).
Exemple 6 : Vérification de l'activité CTL des peptides dérivés de FluMI et de ELA solubles dans le PBS (tableau IV) dans un modèle de souris transgéniques HLA A2 Kb
Parallèlement aux mesures d'interféron γ chez le sujet HLA-A2 positif sensibilisé par le virus de la grippe, chacun des peptides solubles dans le PBS, décrits ci-dessus dans le tableau IV ainsi que le peptide 3D-FluM1 non soluble à 10 mg/ml dans le PBS mais soluble à 2 mg/ml dans le PBS concentration suffisante pour permettre de réaliser un test CTL, ont été testés pour l'induction d'une réponse de type cytotoxique (CTL) chez la souris HLA A2/kb. Pour ce faire ces peptides ont été administrés individuellement, par voie sous cutanée. Une injection constituée de 50 μg de peptide dérivé de ELA, ou deux injections à une semaine d'intervalle constituées de 100 μg de peptide dérivé de FluMI, + 300 μg de P40 ont été effectuées. Dix jours après la dernière injection les cellules de la rate sont mises en culture en présence d'IL2 et de cellules présentatrices fixées et chargées avec le peptide ELA ou FluMI. Sept jours après cette première stimulation, une seconde stimulation des cellules effectrices est effectuée suivie, après 5 jours d'une évaluation de l'activité cytotoxique par un test de relarguage de 51Cr. Ce test consiste à incuber des cellules EL4 A2/kb chargées avec le peptide avec différents ratio de cellules effectrices issues de la mise en culture et d'évaluer l'activité cytotoxique de ces cellules effectrices par calcul de la quantité de 51Cr relarguée par les cellules cibles lors de leur lyse par les cellules effectrices selon la formule :
(Lyse des cellules cibles chargées - lyse spontanée) / (Lyse totale des cellules cibles chargées - lyse spontanée) x 00.
Dans cette formule, la lyse des cellules cibles correspond pour chaque ratio à la mise en contact des cellules cibles et des cellules effectrices ; la lyse spontanée correspond au relarguage spontané de 51Cr des cellules cible en absence de toute autre cellule et la lyse totale correspond au relarguage maximum de 51Cr lors d'une lyse de la totalité des cellules cibles par addition de triton X100.
Afin de déterminer la spécificité de la réaction, un témoin est effectué en remplaçant les cellules cibles chargées avec le peptide par des cellules cibles non chargées qui ne doivent donc pas être reconnues par les cellules effectrices et par conséquent ne doivent pas être lysées par ces dernières.
Les figures 3A à 3C, 4A à 4C et 5A et 5B ci-après montrent que parmi les peptides testés, les dérivés ayant 4 résidus arginine et/ou lysine du côté N-terminal ou 4 résidus arginine et/ou lysine du côté C-terminal du peptide FluMI (figures 3A à 3C) et du peptide ELA (figures 4A à 4C et 5B) sont capables de générer une réponse CTL significative chez les souris HLA A2 Kb. L'importance particulière des peptides 4K- FluM1 , 5K-FluM1, 4K-ELA, FluM1-4K, ELA-4K et 4R-ELA, réside en fait dans l'observation que des cellules effectrices issues de souris immunisées par ces peptides modifiés sont capables de lyser des cellules cibles chargées par les peptides parents FluMI ou ELA respectivement (figures 3A et 3B, 4A et 4B, 5B et 6).
En revanche, la substitution des résidus L-arginine et/ou L-lysine par des résidus D-arginine et ou D-lysine semble avoir un effet négatif sur l'induction de la réponse cytotoxique malgré une solubilité aqueuse équivalente. En effet, les résultats obtenus avec les peptides 4k-FluM1 et 4k-ELA montrent l'absence de toute induction de réponse CTL lorsque ces peptides sont utilisés pour immuniser les souris HLA- A2/Kb. Les résultats obtenus dans les tests CTL sont en parfait accord avec ceux observés chez le sujet testé dans l'exemple 4 de sécrétion d'IFNγ. II est également important de noter que le peptide 3D-FluM1, qui stabilise les molécules HLA-A2 à la surface des cellules T2 de façon similaire au peptide 4K-FluM1, n'est pas capable de générer une réponse cytotoxique (figure 7) lorsqu'il est testé dans des conditions identiques à celles de 4K-FluM1.
Exemple 7 : couplage du peptide C4KELA sur rP40
Le peptide C4KELA, comportant la séquence ELAGIGILTV issue de la protéine Melan-A/MART-1 (acides aminés 26-35), est un peptide synthétique de 15 acides aminés dont la séquence est la suivante : ^CKKKKELAGIGILTΛs0 (SEQ ID No. 107). Un résidu cystéine a été introduit en position N-terminale du peptide pour les besoins du couplage du peptide sur la protéine rP40 (rP40 pour P40 recombinante). Le couplage est réalisé à l'aide du réactif bromoacetic acid N-hydroxysuccinimide ester ou BAH (Haeu et al., 1998, Eur. J. Biochem. 255:446-454). Ce réactif hétérobifonctionnel permet une activation des résidus Lys de la protéine par bromoacétylation, puis un couplage du peptide par le groupement thiol libre porté par le résidu Cys.
Dans un premier temps, la protéine rP40 est activée par le BAH. La rP40 est dialysée contre un tampon carbonate 50 mM pH 9,2 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14 pendant 24 heures à +4°C. Après dialyse, la concentration est ajustée à 5 mg/ml à l'aide du même tampon avant addition du BAH à raison de 2 mg/mg de rP40 à partir d'une solution de BAH à 120 mg/ml dans du DMF. L'ensemble est placé à l'obscurité pendant une heure sous agitation et à température ambiante. La protéine activée est ensuite purifiée par chromatographie de gel-filtration (élution par le tampon précédemment cité). Les fractions contenant la protéine bromoacétylée sont rassemblées. Pour le couplage, le peptide (5 mg/ml en tampon carbonate 50 mM pH 9,2 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14) est additionné à la protéine activée à raison de 0,33 mg/mg de protéine, soit 7,7 moles de peptide / mole de rP40. Après saturation sous courant d'azote, le tube est placé à nouveau à l'obscurité pendant 1 nuit sous agitation et à température ambiante. Les sites activés de la protéine n'ayant pas réagi avec le peptide sont ensuite saturés à l'aide d'une solution d'amino-éthanethiol (étape de « capping » par incubation sous agitation pendant 2 heures).
Le conjugué est purifié par chromatographie de tamisage moléculaire après élimination du détergent par précipitation éthanolique et resolubilisation du conjugué par une solution de Guanidine-HCI 7M. L'élution du conjugué est réalisée par une solution de phosphate disodique 20 mM contenant du tréhalose 275 mM. Après purification, le conjugué est concentré par ultrafiltration et filtré sur 0,22 μm.
Le conjugué obtenu est caractérisé par électrophorèse SDS-PAGE (figure 10).
Sur cette figure, le contenu de chaque piste est le suivant : - Piste 1 : témoin de masses moléculaires
- Piste 2 : rP40
- Piste 3 : rP40 activée
- Piste 4 : conjugué rP40-C4KELA
- Piste 5 : conjugué rP40-C4KELA « cappé » par Pamino-éthanethiol. Le taux de couplage du peptide sur la protéine est estimé par SDS-PAGE, spectrométrie de masse de type MALDI-TOF et dosage du résidu carboxyméthylcystéine. Dans ce dernier cas, le dosage des acides aminés libérés par hydrolyse (HCI 6N) est réalisé par HPLC après dérivatisation à l'aide du PITC.
Le taux de couplage déterminé pour le conjugué rP40-C4KELA synthétisé est de 5 à 6 peptides C4KELA / mole de rP40.
Exemple 8 : Stabilité des conjugués rP40-C4KELA en solution ou lyophilisé
Préparation du conjugué rP40-C4KELA lyophilisé.
Une solution de PEG 4000 (10 mg/ml) est ajoutée au conjugué en solution afin d'obtenir 1 % de PEG en final. Le mélange est ensuite congelé dans l'azote liquide et lyophilisé sur plateau. Après lyophilisation, les flacons sont scellés sous azote.
Pour l'étude de stabilité, le conjugué en solution est réparti dans des flacons scellés sous azote.
L'étude de stabilité a été menée avec les deux conjugués en solution ou lyophilisé, à +4°C et à +37°C. Les échantillons ont été analysés à tO et t6 mois en chromatographie d'exclusion (figure 11) pour détecter une éventuelle dégradation physico-chimique du conjugué mais également en activité CTL pour déterminer si ceux-ci restent biologiquement actifs (figures 12A et 12B).
Les profils obtenus à tO sont similaires à celui obtenu après 6 mois à +4°C sous forme de lyophilisât.
On note une dégradation des caractéristiques physico-chimiques du conjugué rP40-C4KELA en solution à +4°C (sol4). Cette dégradation s'est accélérée à +37°C (sol37). On ne note pas de dégradation du conjugué rP40-C4KELA lyophilisé après reprise de l'échantillon par de l'eau ppi ni à +4°C (lyo4) ni à +37°C (lyo37). Le conjugué rP40-C4KELA lyophilisé d'une part est limpide après reprise par de l'eau ppi et d'autre part il est stable.
La figure 12A montre que les conjugués rP40-C4KELA en solution ou lyophilisé (lyoph.) sont capables de générer une réponse CTL significative chez les souris HLA A2 Kb. La réponse est supérieure à celle obtenue avec le simple mélange P40 + peptide 4KELA.
La figure 12B montre que les conjugués rP40-C4KELA en solution ou lyophilisé (lyoph.) conservés à +4°C à t6 mois, sont capables de générer une réponse CTL significative chez les souris HLA A2 Kb. La réponse est supérieure à celle obtenue avec les simples mélanges P40 + peptide 4KELA ou P40 + le peptide de référence ELA. Il faut noter que malgré la différence de profil entre le conjugué conservé à +4°C sous forme lyophilisée ou en solution, révélée par la chromatographie d'exclusion, les deux conjugués conservent leur activité biologique à t6 mois.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de solubilisation ou d'amélioration de la solubilité en milieu aqueux d'un peptide, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle ledit peptide est modifié par l'adjonction par liaison covalente d'au moins au total 3 résidus consécutifs sélectionnés parmi l'arginine et/ou la lysine, répartis à l'extrémité N- terminale et/ou C-terminale dudit peptide, et pouvant constituer une chaîne linéaire ou branchée.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que lesdits au moins au total 3 résidus consécutifs consistent en un panachage de résidus arginine et lysine.
3. Procédé de solubilisation ou d'amélioration de la solubilité en milieu aqueux d'un peptide, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle ledit peptide est modifié par l'adjonction par liaison covalente d'au moins au total 3 résidus lysine consécutifs, répartis à l'extrémité N-terminale et/ou C-terminale dudit peptide, ces au moins au total 3 résidus lysine pouvant constituer une chaîne linéaire ou branchée.
4. Procédé de solubilisation ou d'amélioration de la solubilité en milieu aqueux d'un peptide, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle ledit peptide est modifié par l'adjonction par liaison covalente d'au moins au total 3 résidus arginine consécutifs, de forme L ou D, répartis à l'extrémité N-terminale et/ou C- terminale dudit peptide, ces au moins au total 3 résidus arginine pouvant constituer une chaîne linéaire ou branchée.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le nombre total de résidus consécutifs arginine et/ou lysine répartis à l'extrémité N- terminale et/ou C-terminale dudit peptide modifié est compris entre 3 et 6, bornes incluses, de préférence entre 3 et 5, bornes incluses, et encore mieux est de 4.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que lesdits au moins au total 3 résidus consécutifs arginine et/ou lysine sont ajoutés soit à l'extrémité libre N-terminale ou soit à l'extrémité libre C-terminale dudit peptide.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'ensemble des résidus consécutifs arginine et/ou lysine ajoutés est de forme L.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'ajout par liaison covalente desdits au moins au total 3 résidus consécutifs arginine et/ou lysine à l'extrémité libre N-terminale et/ou C-terminale dudit peptide est réalisé par synthèse chimique, ou encore par fusion génétique lorsque la structure dudit peptide ainsi modifié le permet.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le peptide modifié est soluble en milieu aqueux à au moins 5 mg/ml.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que ledit peptide modifié est soluble en milieu aqueux à au moins 7 mg/ml.
11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que ledit peptide est un peptide utile pour la préparation d'une composition pharmaceutique ou cosmétique.
12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que ledit peptide est un peptide dont la séquence comprend un ou plusieurs épitopes antigéniques de nature hydrophobe.
13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que ledit peptide est capable d'induire une réponse immune de type humoral ou cellulaire dirigée spécifiquement contre cet épitope.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit peptide est choisi parmi les épitopes antigéniques dérivés d'une protéine antigénique de microorganisme pathogène pour un mammifère, ou encore dérivés d'une protéine antigénique associée à une tumeur.
15. Procédé selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce que ledit peptide est capable de générer des lymphocytes CTL dirigés spécifiquement contre cet épitope.
16. Procédé selon l'une des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que ledit peptide est un ligand, naturel ou synthétique, du CMH, notamment de classe I ou II.
17. Procédé selon l'une des revendications 13 à 16, caractérisé en ce que ledit peptide est un ligand, naturel ou synthétique, du CMH permettant la génération de lymphocytes T cytotoxiques choisi parmi les épitopes CTL.
18. Procédé selon l'une des revendications 13 à 17, caractérisé en ce que ledit peptide est choisi parmi les épitopes CTL se présentant sous la forme d'octapeptide, de nonapeptide, de decapeptide hydrophobes, d'un peptide hydrophobe d'au plus 15 acides aminés, ou encore sous la forme d'un regroupement d'épitopes hydrophobes.
19. Procédé selon l'une des revendications 13 à 18, caractérisé en ce que : a) ledit peptide est un ligand du CMH capable de générer des lymphocytes T cytotoxiques et/ou T helper, en particulier spécifique dudit ligand du CMH, et/ou capable de générer une augmentation significative du taux de lymphocytes T CD8+ et/ou CD4+ produisant de l'INF-γ et, le cas échéant, du TNF-α, lorsque cedit ligand du CMH est mis en présence de lymphocytes T de sujets ayant présenté les antigènes dont ledit ligand du CMH est issu ; et, caractérisé en ce que : b) ledit ligand du CMH modifié est capable en solution aqueuse d'exercer une au moins des activités citées en a).
20. Procédé selon l'une des revendications 15 à 19, caractérisé en ce que ledit peptide est un ligand du CMH permettant la génération de lymphocytes T cytotoxiques, comprenant ou constitué d'un peptide choisi parmi les peptides de séquences SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 ou SEQ ID No. 47.
21. Procédé selon l'une des revendications 15 à 19, caractérisé en ce que ledit peptide est un ligand du CMH permettant la génération de lymphocytes T cytotoxiques, comprenant ou constitué d'un peptide choisi parmi les peptides de séquences suivantes : a) la séquence de la forme rétroinverso d'un peptide de séquence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 ou SEQ ID No. 47 ; et b) un peptide dont la séquence présente un degré d'identité après alignement optimal d'au moins 70 %, de préférence d'au moins 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % avec la séquence d'un peptide de séquence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 ou SEQ ID No. 47 ; et, caractérisé en ce que : le ligand du CMH modifié est capable de générer des lymphocytes T cytotoxiques et/ou T helper, en particulier spécifique dudit ligand du CMH, et/ou capable de générer une augmentation significative du taux de lymphocytes T CD8+ et/ou CD4+ produisant de l'INF-γ et, le cas échéant, du TNF-α, lorsque cedit ligand modifié du CMH est mis en présence de lymphocytes T de sujets ayant présenté les antigènes dont ledit ligand du CMH est issu.
22. Ligand du CMH de nature peptidique modifié par l'adjonction d'au moins au total 3 résidus lysine consécutifs, répartis à son extrémité N-terminale et/ou C- terminale, ces 3 résidus lysine pouvant constituer une chaîne linéaire ou branchée.
23. Ligand du CMH de nature peptidique modifié par l'adjonction d'au moins au total 3 résidus arginine consécutifs, répartis à son extrémité N-terminale et/ou C- terminale, ces 3 résidus arginine pouvant constituer une chaîne linéaire ou branchée.
24. Ligand du CMH modifié selon la revendication 22 ou 23, caractérisé en ce que le nombre total de résidus consécutifs arginine et/ou lysine répartis à l'extrémité N-terminale et/ou C-terminale dudit ligand modifié est compris entre 3 et 6, bornes incluses, de préférence entre 3 et 5, bornes incluses.
25. Ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 22 à 24, caractérisé en ce qu'au moins 3 résidus consécutifs lysine ou arginine ont été ajoutés soit à l'extrémité libre N-terminale ou soit à l'extrémité libre C-terminale dudit ligand du CMH.
26. Ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 22 à 25, caractérisé en ce que l'ensemble des résidus consécutifs lysine ou arginine ajoutés est de forme L.
27. Ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 22 à 26, caractérisé en ce que ledit ligand du CMH avant modification est constitué d'au plus 15 acides aminés.
28. Ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 22 à 27, caractérisé en ce que ledit ligand du CMH non modifié est un peptide choisi parmi les épitopes antigéniques dérivés d'une protéine antigénique de microorganisme pathogène pour un mammifère, ou encore dérivés d'une protéine antigénique associée à une tumeur.
29. Ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 22 à 28, caractérisé en ce que ledit ligand du CMH non modifié est un peptide choisi parmi les épitopes CTL.
30. Ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 22 à 29, caractérisé en ce que ledit ligand du CMH non modifié est un peptide choisi parmi les épitopes CTL se présentant sous forme d'octapeptide, de nonapeptide ou de decapeptide ou un regroupement d'épitopes hydrophobes.
31. Ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 22 à 30, caractérisé en ce que ledit ligand du CMH avant modification est capable de générer des lymphocytes T cytotoxiques et/ou T helper, en particulier spécifiques dudit ligand du CMH et/ou capable de générer une augmentation significative du taux de lymphocytes T CD8+ et/ou CD4+ produisant de l'INF-γ et, le cas échéant, du TNF-α, lorsque cedit ligand du CMH est mis en présence de lymphocytes T de sujets ayant présenté les antigènes dont ledit ligand est issu ; et, caractérisé en ce que la solubilité en milieu aqueux dudit ligand du CMH avant modification est inférieure à 1 mg/ml.
32. Ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 22 à 31 , caractérisé en ce que ledit ligand du CMH modifié est soluble en milieu aqueux à au moins 5 mg/ml, de préférence à au moins 7 mg/ml.
33. Ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 22 à 32, caractérisé en ce que ledit ligand du CMH modifié est capable en solution aqueuse de générer des lymphocytes T cytotoxiques et ou T helper, en particulier spécifique dudit ligand du CMH, et/ou capable de générer une augmentation significative du taux de lymphocytes T CD8+ et/ou CD4+ produisant de l'INF-γ et, le cas échéant, du TNF-α, lorsque cedit ligand du CMH est mis en présence de lymphocytes T de sujets ayant présenté les antigènes dont ledit ligand du CMH est issu.
34. Ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 22 à 33, caractérisé en ce que ledit ligand du CMH avant modification comprend un ou est constitué d'un peptide choisi parmi les peptides de séquences suivantes : a) SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 ou SEQ ID No. 47; b) un peptide dont la séquence d'acides aminés est la séquence de la forme rétroinverso d'un peptide de séquence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 ou SEQ ID No. 47 ; et c) un peptide dont la séquence présente un degré d'identité après alignement optimal d'au moins 70 %, de préférence d'au moins 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % avec la séquence d'un peptide de séquence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46 ou SEQ ID No. 47.
35. Ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 22 à 34, caractérisé en ce que ledit ligand du CMH modifié est choisi parmi les peptides de séquence SEQ ID Nos. 75, 76 et 77 et les peptides de séquence SEQ ID Nos. 78 et 79, ces peptides pouvant, le cas échéant, comprendre une mutation ponctuelle dans la séquence du ligand du CMH non modifié dont il est issu, notamment une substitution d'un acide aminé par un autre acide aminé naturel ou non naturel.
36. Peptide modifié par un procédé selon l'une des revendications 12 à 21 , ou un ligand du CMH selon l'une des revendications 22 à 35, comme médicament.
37. Composition pharmaceutique comprenant un composé choisi parmi :
- un peptide modifié par un procédé selon l'une des revendications 12 à 21, ou un ligand du CMH selon l'une des revendications 22 à 35, le cas échéant mélangé ou couplé à une protéine porteuse ou l'un de ses fragments ; ou
- une construction nucléique contenant un ADN codant pour un peptide modifié par un procédé selon l'une des revendications 12 à 21, ou un ligand du CMH selon l'une des revendications 22 à 35, le cas échéant contenant en outre un ADN codant pour une protéine porteuse ou l'un de ses fragments.
38. Utilisation d'un peptide dont la séquence comprend un ou plusieurs épitopes antigéniques de nature hydrophobe dérivé d'une protéine antigénique de microorganisme pathogène, ledit peptide ayant été modifié par un procédé selon l'une des revendications 14 à 19, ou d'un ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 22 à 34 comprenant un ou plusieurs de ces épitopes antigéniques, pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections par ce microorganisme, notamment des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques.
39. Utilisation d'un peptide dont la séquence comprend un ou plusieurs épitopes antigéniques de nature hydrophobe dérivés d'une protéine antigénique associée à une tumeur, ledit peptide ayant été modifié par un procédé selon l'une des revendications 14 à 21, ou d'un ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 22 à 36 comprenant un ou plusieurs de ces épitopes antigéniques, pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers associés à cette antigène, préférentiellement à inhiber la croissance de tumeurs associées à cette antigène.
40. Vaccin, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un peptide dont la séquence comprend un ou plusieurs épitopes antigéniques de nature hydrophobe dérivés d'une protéine antigénique de microorganisme pathogène ou associée à une tumeur, ledit peptide ayant été modifié par un procédé selon l'une des revendications 14 à 21, ou d'un ligand du CMH modifié selon l'une des revendications 22 à 36 comprenant un ou plusieurs de ces épitopes antigéniques.
41. Composition pharmaceutique selon la revendication 37 ou vaccin selon la revendication 40, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un adjuvant.
42. Composition pharmaceutique selon la revendication 37 ou 41 ou vaccin selon la revendication 40 ou 41, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un composé porteur mélangé ou couplé audit peptide modifié ou audit ligand du CMH modifié.
43. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 37, 41 et
42 ou vaccin selon l'une des revendications 40, 41 et 42, caractérisé en ce qu'il est incorporé dans des vecteurs choisis parmi les liposomes, les virosomes, les nanosphères, les microsphères ou les microcapsules.
44. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 37, 41 à 43 ou vaccin selon l'une des revendications 40, 41 à 42, caractérisé en ce qu'il est administrable par voie systemique, notamment par voie injectable, mucosale ou transdermique.
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