CN102066410B - Hla‑dr结合肽和它们的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供源自卵巢癌/乳腺癌相关抗原、人表皮生长因子2(HER‑2/neu)、癌胚抗原(CEA)、胰岛素生长因子结合蛋白2(IGFBP‑2)和细胞周期蛋白D1的HLA‑DR(II类MHC)结合肽。该免疫原性肽可用于癌症疫苗。

Description

HLA-DR结合肽和它们的应用

相关申请的交叉引用

本申请要求2007年11月1日提交的美国临时申请序列号60/984,646的优先权。

发明背景

发明领域

本发明涉及预防、治疗或诊断许多病理学状态，例如癌症的组合物和方法。具体地说，本发明提供能结合所选的主要组织相容性复合体(MHC)分子并诱导免疫应答的新型肽。

MHC分子分为I类或II类分子。II类MHC分子主要表达在参与启动和维持免疫应答的细胞上，例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突细胞、巨噬细胞等。II类MHC分子由辅助T淋巴细胞识别，诱导辅助T淋巴细胞增殖并放大针对所展示特定免疫原性肽的免疫应答。特定疾病-相关抗原性肽和II类HLA分子之间的复合体由辅助T淋巴细胞识别，诱导辅助T淋巴细胞增殖并放大特异性CTL及抗体免疫应答。

HLA分子和肽抗原的复合体用作HLA-限制性T细胞(HLA-restricted Tcell)识别的配体(Buus，S.等，Cell 47：1071，1986；Babbitt，B.P.等，Nature317：359，1985；Townsend，A.和Bodmer，H.，Annu.Rev.Immunol.7：601，1989；Germain，R.N.，Annu.Rev.Immunol.11：403，1993)。

本发明的肽包含结合HLA II类DR分子的表位。对于II类肽配体，与该肽的N-和C-末端相比，该基序的大小和结合框位置的异质性程度更高。II类HLA肽配体的这种异质性增加是因为II类HLA分子的结合沟槽结构与I类分子不同，其在两端开放。II类HLA DRB*0101-肽复合物的晶体学分析显示肽残基与DRB*0101分子上的互补袋形成复合体贡献主要的结合能量。重要的锚定残基与疏水性袋最深处结合(参见，例如Madden，D.R.Ann.Rev.Immunol.13：587，1995)，该残基称为1位(P1)。P1可表示II类结合肽表位的N-末端残基，但其更常见是通过一个或多个残基侧接N-末端。其它研究也指出相对于P1，对着C-末端的第六位的肽残基对于结合各种DR分子的重要作用。

在过去几年，累积的证据证明大部分的I类和II类HLA分子可分类成较少几种超型(supertype)，各自的特征在于肽结合库的大量重叠和主要肽结合袋的共同结构。因此，通过几种HLA-特异性氨基酸基序中的任一种鉴定本发明肽，或者如果基序的存在与结合几种等位基因-特异性HLA分子的能力相对应，则是超基序(supermotif)。结合具有特定氨基酸超基序的肽的HLA分子统称为HLA“超型”。

由于人群(包括人种和种族集团)中HLA等位基因分布模式不同，鉴定能结合多种HLA等位基因的肽的基序是有价值的，从而能充分覆盖所有人群。本发明解决了这些和其它需要。

T淋巴细胞识别能结合I类或II类MHC分子的肽片段形式的抗原，而不是完整的外来抗原本身。II类MHC分子呈递的抗原通常是通过吞噬作用、胞饮作用或受体介导的内吞作用进入抗原呈递细胞的可溶性抗原。一旦处于细胞中，抗原被内体中的酸-依赖性蛋白酶部分降解。CLIP片段释放后，得到的片段或肽与II类MHC分子结合，从而形成稳定的复合体，然后该复合体运输至表面由特异性HTL进行可能的识别。参见Blum等，Crit.Rev.Immunol.，17：411-17(1997)；Arndt等，Immunol.Res.，16：261-72(1997)。

结合特定MHC等位基因的肽常匹配基序内部，该肽内特定位置处的氨基酸残基具有特定生物化学特性。这种残基通常由MHC等位基因的生物化学特性决定。肽序列基序已用于筛选能结合MHC分子的肽(Sette等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：3296(1989))，早已有报道说，I类结合基序在动物模型中鉴定到可能的免疫原性肽(De Bruijn等，Eur.J.Immunol.21：2963-70(1991)；Pamer等，Nature 353：852-955(1991))。特定肽与MHC分子的结合还与该肽的免疫原性有关(Schaeffer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：4649(1989))。

因此，虽然鉴定了一些MHC结合肽，本领域需要从肿瘤相关抗原鉴定新型MHC结合肽，其可用于疫苗中产生针对这些靶标的免疫应答。此外，本领域需要鉴定能结合各种不同类型MHC分子的肽，它们在大部分人远亲后代种群中具有免疫原性。

开发广泛有效的肽免疫疗剂的最难克服障碍之一是HLA分子的极端多态性。因此，如果使用对应于各等位基因的HLA分子的特异性表位，有效覆盖人群而没有偏差是极其复杂的任务，因为不得不使用大量表位以覆盖种族各异的群体。因此，需要开发以高亲和力结合多种HLA抗原分子的肽表位以便用于基于表位的疫苗。所结合的HLA抗原分子数越多，该疫苗所覆盖的种群宽度越大。可根据本文公开的信息工程改造类似肽，从而用其增加种群覆盖的宽度。

附图简述

图1显示对混杂HER-2/neu HLA-DR表位的在先免疫力的鉴定。各图显示的点状图是健康志愿供体和患者中鉴定的HER-2/neu(见各图的标题)肽之一的特异性T细胞的平均数量。各图表示独特的肽，各数据点得自一位个体。灰框(即，截断值)划出了从正常健康个体计算的构成平均值和两个标准偏差的区域。百分数表示T细胞平均值在截断值之上的患者部分。画有圆圈的肽是与正常的健康对照相比，有更高部分的患者起反应的那些肽。这些肽认为是最佳候选疫苗。然而，该方案的严格性可能产生许多假阴性。例如，有25％的患者显示识别p885，但发现只有4％的患者识别极类似的肽，p886。然而，如果观察p886的图的话，有健康个体显示稳定的反应。排除该数据点得到的患者应答率为15％，这将与p885应答一致。尽管这样，我们鉴定了5个候选对象以便进一步研究。从早已证明包含p885的结合基序的HER-2/neu肽，p884-899是HLA-DR4表位的在先研究可以看出该方案的保真度。

图2显示显示对混杂CEA HLA-DR表位的在先免疫力的鉴定。图2与图1相同，唯一例外是CEA是抗原。鉴定了7种候选肽。

图3显示对混杂IGFBP2HLA-DR表位的在先免疫力的鉴定。图3与图1相同，唯一例外是IGFBP2是抗原。鉴定了4种候选肽。注意，只评估了10种肽，文本中作出了解释。

图4显示对混杂IGFBP2HLA-DR表位的在先免疫力的鉴定。图4与图1相同，唯一例外是细胞周期蛋白D1是抗原。采用更自由的统计学方法鉴定了7种可能的表位。

图5显示HER-2/neu肽，p59、p83、p88和p885是天然加工和呈递的抗原。用HER-2/neu肽，p53(图A)、p83(图B)、p88(图C)和p885(图D)产生的短期T细胞谱系的IFN-γELISpot分析。检验这些谱系对各培养肽的应答：无关的15-聚体肽、HER-2/neu蛋白片段(氨基酸22-122，图A-C；氨基酸676-1255，图D)或无关的重量相似蛋白，卵白蛋白。各图显示了从两位不同乳腺癌或卵巢癌患者建立的两个谱系的结果，这些患者对该肽的ELIspot分析反应呈阳性。各柱是三次重复的平均值(s.e.m.)。

图6显示IGFBP2肽p17、p22、p249和p293是天然加工的肽。图6与图5相同，除了利用IGFBP-2衍生的辅助表位获得结果。

发明概述

本发明涉及预防、治疗或诊断许多病理学状态，例如病毒性疾病和癌症的组合物和方法。因此，本文提供能结合所选的主要组织相容性复合体(MHC)分子并诱导或调节免疫应答的新型肽。披露的肽中有一些能结合人II类MHC(HLA)分子，包括HLA-DR和HLA-DQ等位基因。还提供了包含免疫原性肽的组合物，所述肽具有MHC分子的特异性结合基序。披露的肽和组合物可用于给予某体系以诱导免疫应答、辅助T淋巴细胞(HTL)应答或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的方法。

现已鉴定了许多免疫原性肿瘤相关抗原的表位。因此，这些表位可用于体内和离体治疗和诊断应用的药物组合物中(例如，四聚体试剂；B&C公司(Beckman Coulter))。

这些肽还可用作基于表位的疫苗。基于表位的疫苗优选具有增强的，通常是更宽的种群覆盖度。构成疫苗组合物的携带HLA-DR超基序的表位优选结合多种HLA DR超型分子，其中K_D小于1000nM或500nM，并在携带该肽所结合的HLA DR超型等位基因的患者中刺激HTL应答。

携带基序的肽还可用作诊断试剂，而非免疫原性试剂以评估免疫应答。例如，可预后性使用携带HLA-DR超基序的肽表位来分析具有该肽表位所结合HLA DR超型等位基因的患者的特异性HTL群体存在时的免疫应答。

优选测定本发明肽表位与至少一种HLA DR超型分子的结合亲和力。肽表位对至少一种HLA DR超型分子的结合亲和力的结合亲和力优选低于1000nM，或更优选低于500nM，最优选低于50nM。

可在体外或体内合成携带HLA DR超基序的表位。在优选的实施方式中，该肽由重组核酸编码，在细胞中表达。核酸可编码一种或多种肽，其中至少一种是本发明的表位。

就其结合的HLA DR超型分子而言，本发明肽表位可在体外或体内接触细胞毒性T淋巴细胞，从而用于在HLA-多样化种群中引发T细胞应答。

HTL表位可由一种肽构成。此外，HTL表位可以脂化，优选用棕榈酸，还可通过间隔分子连接于另一HTL表位或CTL表位。核苷酸序列可表达该表位；在优选的实施方式中，该核苷酸序列包含在减毒病毒宿主中。

从以下讨论可明白，方法和组合物的其它实施方式也属于本发明的范围。此外，本文所述任何方法产生的新型合成肽也是本发明的一部分。

本发明提供肽和编码这些肽的核酸以便用于疫苗和治疗剂中。本发明提供诱导患者中针对预先选择的抗原的辅助T细胞应答的方法，该方法包括将辅助T细胞与本发明的免疫原性肽接触。本发明肽的可衍生自许多肿瘤相关抗原。本发明方法可在体外或体内实施。在优选的实施方式中，通过将包含编码该免疫原性肽的序列的核酸分子给予患者而使这些肽与辅助T细胞接触。

本发明涉及调节肽表位与II类HLA分子结合的方法。本发明包括改进原始肽表位的结合的方法，所述原始肽表位携带与HLA分子结合相关的基序，所述基序包含至少一个一级锚定位置(primary anchor position)，因此，所述至少一个一级锚定位置具有特定的一级锚定氨基酸残基(基本上有两个或更多个残基组成)，所述方法包括将该原始肽表位的一级锚定残基与另一个一级锚定残基作交换，前提是该原始一级锚定残基与交换的一级锚定残基不同。本发明的优选实施方式包括其中该原始一级锚定残基的不大优选的残基，而交换的残基是更优选残基的方法。

本发明的备选实施方式包括改进原始肽表位的结合的方法，所述原始肽表位携带与HLA分子结合相关的基序，所述基序包含至少一个一级锚定位置，因此，具有特定的至少一个一级锚定残基，所述基序还含至少一个二级锚定位置(secondary anchor position)，因此，具有特定的至少一个二级残基，所述方法包括将该原始肽表位的二级锚定残基与另一二级锚定残基作交换，前提是该原始二级锚定残基与交换的氨基酸残基不同。在各情况中，该原始二级残基是有害残基，而交换的残基是不同于有害残基的残基和/或该原始二级锚定残基是不大优选的残基，而交换的残基的更优选的残基。

从以下讨论可以明白，还考虑了其它方法和实施方式。此外，本文所述任何方法产生的新型合成肽也是本发明的一部分。

定义

提供以下定义使得本领域普通技术人员理解本文公开的一些本发明优选实施方式。然而，应该理解，这些定义只是示范性的，不应用于限制权利要求所示的本发明范围。本领域普通技术人员能对以下定义作出略微改进并利用这些改进的定义理解和实施本文公开的发明。这种改进对于本领域普通技术人员是显而易见的，因为它们可适用于以下所示的权利要求，这些改进应视作落在本发明的范围内。如果本部分所列定义与专利、公布的专利申请和其它出版物的定义及通过引用纳入本文的GenBank和其它数据库的序列相反或不一致，该部分所列定义优于通过引用纳入本文的定义。

本文所用的“HLA超型或家族”描述了依据共有的肽结合特异性分组的多组HLA分子，而不是依据共有抗原决定簇的血清学超型。将对携带某些氨基酸基序的肽的结合亲和力些许相似的II类HLA分子分成HLA超型。术语“HLA超家族”、“HLA超型家族”、“HLA家族”和“HLA xx-样分子”(其中xx表示特定的HLA类型)是同义词。

本文所用的术语“IC₅₀”指结合试验中观察到50％的参比肽结合受抑制的肽浓度。根据进行试验的条件(即，限制MHC蛋白和标记肽浓度)，这些数值可以近似为K_D值。应该注意，如果试验条件变化，则IC₅₀值可变，通常是剧烈变化，并且取决于所用的特定试剂(例如，HLA制品等)。例如，浓度过量的HLA分子会增加给定配体检测到的表观IC₅₀。

或者，可相对于参比肽表示结合情况。随着特定试验的灵敏度变高或低，所测试肽的IC₅₀可有些许变化。然而，相对于参比肽的结合不会变。例如，在参比肽的IC₅₀增加10-倍的条件下进行试验，测试肽的IC₅₀值也改变约10-倍。因此，为更明确起见，评估某肽是良好的、中等的、弱的还是负结合剂通常依据其与标准肽的IC₅₀相比的IC₅₀。

对于结合II类HLA分子的肽，本文所用的“高亲和力”定义为结合的K_D(或IC₅₀)小于50nM。“中等亲和力”是结合的K_D(或IC₅₀)在约50-约500nM之间。对于结合II类HLA分子，本文所用的“高亲和力”定义为结合的K_D(或IC₅₀)小于100nM。“中等亲和力”是结合的K_D(或IC₅₀)在约100-约1000nM之间。测定结合的试验详细描述于，例如PCT公布WO94/20127和WO 94/03205。

还可利用其它试验系统测定结合，包括采用以下的那些试验：活细胞(例如，Ceppellini等，Nature 339：392(1989)；Christnick等，Nature 352：67(1991)；Busch等，Int.Immunol.2：443(1990)；Hill等，J Immunol.147：189(1991)；delGuercio等，JImmunol.154：685(1995))；利用洗涤剂裂解物的无细胞系统(例如，Cerundolo等，JImmunol.21：2069(1991))；固定的纯化MHC(例如，Hill等，J Immunol.152，2890(1994)；Marshall等，J Immunol.152：4946(1994))；ELISA系统(例如，Reay等，EMBO J 11：2829(1992))；表面等离振子共振(例如，Khilko等，J Biol.Chem.268：15425(1993))；高通量可溶相试验(high flux soluble phase assay)(Hammer等，J.Exp.Med.180：2353(1994))。

在本说明书中，术语“肽”与“寡肽”可互换使用，表示通常经由α-氨基和毗邻氨基酸的羰基之间的肽键逐一连接的一系列残基，通常是L-氨基酸。在某些实施方式中，本发明寡肽的长度小于约50个残基，通常由约6-约25个残基，优选14或15个残基构成。此外，本发明寡肽可以是包含天然抗原中不超过50个毗连氨基酸的寡肽。本发明的优选HTL-诱导肽长30个残基或不到，有时是20个残基或不到，通常由约6-约25个残基，优选14或15个残基构成。

“合成肽”指非天然产生，而是采用诸如化学合成或重组DNA技术等方法人工制备的肽。

用于描述肽化合物的术语遵循惯例，其中氨基在各氨基酸残基的左侧(N-末端)，羧基在各氨基酸残基的右侧(C-末端)。除非另有规定，在代表所选的本发明特定实施方式的结构式中，氨基和羧基末端基团的形式是它们在生理pH值下呈现的形式，虽然未专门显示。在氨基酸结构式中，通常由标准的三字母或单字母名称表示各残基。大写单字母或三字母标记的大写首字母表示L-型氨基酸残基，小写单字母或小写的三字母标记表示D-型氨基酸。甘氨酸不具有不对称碳原子，简写为“Gly”或G。各氨基酸的标记如下所示：

表1

氨基酸及其缩写

氨基酸	三字母密码	单字母密码子
			丙氨酸	Ala	A
精氨酸	Arg	R
			天冬酰胺	Asn	N
天冬氨酸	Asp	D
			半胱氨酸	Cys	C
谷氨酰胺	Gln	Q
			谷氨酸	Glu	E
甘氨酸	Gly	G
			组氨酸	His	H
异亮氨酸	Ile	I
			亮氨酸	Leu	L
赖氨酸	Lys	K
			甲硫氨酸	Met	M
苯丙氨酸	Phe	F
			脯氨酸	Pro	P
丝氨酸	Ser	S
			苏氨酸	Thr	T

色氨酸	Trp	W
			酪氨酸	Tyr	Y
缬氨酸	Val	V

对于特定氨基酸序列，“表位”是参与由特定免疫球蛋白识别的一组氨基酸残基，或者就T细胞而言，指由T细胞受体蛋白和/或主要组织相容性复合体(MHC)受体识别所必需的那些残基。在体内或体外的免疫系统配置中，表位是分子的集合特征，例如一级、二级和三级肽结构及电荷，这些特征一起形成由免疫球蛋白、T细胞受体或HLA分子识别的位点。在该说明书中，表位和肽常互换使用。

应该知道，包含本发明表位以及其它氨基酸的蛋白质或肽分子依旧属于本发明。在某些实施方式中，本发明肽的长度有限制。当包含本发明表位的蛋白质/肽含有与天然序列有100％相同性的区域(即，毗邻的一系列氨基酸)时，该实施方式的长度有所限制。为避免从阅读，例如整个天然分子来限定表位，对与天然肽序列有100％相同性的任何区域的长度作出限制。因此，对于包含本发明表位和与天然肽序列有100％相同性的区域的肽，与天然肽序列有100％相同性的该区域的长度为：小于或等于600个氨基酸、常是小于或等于500个氨基酸、常是小于或等于400个氨基酸、常是小于或等于250个氨基酸、常是小于或等于100个氨基酸、常是小于或等于85个氨基酸、常是小于或等于75个氨基酸、常是小于或等于65个氨基酸和常是小于或等于50个氨基酸。在某些实施方式中，本发明的“表位”由某肽构成，该肽具有少于51个氨基酸并与天然肽序列有100％相同性的区域，最少5个氨基酸。

因此，长于600个氨基酸的蛋白质或肽序列属于本发明的范围，只要它们不包含与天然肽序列有100％相同性的多于600个氨基酸的任何毗连序列。为落在本发明的范围内，具有对应于天然序列的5个或更少的毗连残基的任何肽，该肽的最大长度没有限制。目前优选的CTL表位长度短于600个残基，最少8个氨基酸残基。

在用包含“显性表位(dominant epitope)”的完整天然抗原免疫后，该表位诱导免疫应答。(参见，例如Sercarz等，Annu.Rev.Immunol.11：729-766(1993))。这种应答在体外与分离的肽表位交叉反应。

当包含“隐性表位(cryptic epitope)”的完整全蛋白用作抗原时，用分离的肽免疫后，该表位引发应答，但该应答在体外无交叉反应性。

“亚显性表位(subdominant epitope)”是用包含该表位的完整抗原免疫后，引发低应答或无应答的表位，但用分离的表位在体内或体外免疫可获得针对该表位的应答，并且当用完整蛋白进行体外回忆应答时检测到该应答(与隐性表位的情形不同)。

“药物赋形剂”包括诸如佐剂、运载体、pH-调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、防腐剂等材料。

本文所用的术语“药学上可接受的”指通常是无毒的、惰性的和/或生理学上相容的组合物。

本文所用的术语“保护性免疫应答”或“治疗性免疫应答”指针对肿瘤相关抗原的HTL和/或CTL应答，其在某些方面防止或至少阻止疾病症状、副作用或进展。免疫应答可包括通过刺激辅助T细胞促进的抗体应答。

在某些实施方式中，“免疫原性肽”是包含等位基因特异性基序的肽，从而该肽将结合MHC(HLA)分子并诱导HTL应答。本发明的免疫原性肽能结合合适的II类MHC分子(例如，HLA-DR)并诱导针对产生该免疫原性肽的抗原的辅助T细胞应答。

“免疫原性应答”包括在体外和/或体内刺激HTL和/或CTL应答以及通过定向诱导特异性T细胞群体中的细胞死亡(或凋亡)来调节现有免疫应答的应答。

本发明的免疫原性肽能结合合适的HLA-DR分子并诱导针对产生该免疫原性肽的抗原的辅助T细胞应答。本发明的免疫原性肽的长度小于约50个残基，常是30个残基或更短，或20个残基或更短，通常由约6-约25个残基，优选14或15个残基构成。

当术语“衍生”用于讨论表位时，其是“制备”的同义词。衍生的肽可从天然来源分离，或者其可以按照本领域的标准方法合成。合成表位可包含人工氨基酸、“氨基酸模拟物”，例如天然L氨基酸的D同种型或非天然氨基酸，例如环己基丙氨酸。衍生的/制备的表位可以是天然表位的类似物。

采用为特定HLA亚型(例如，HLA-DR)描述的结合基序算法不难鉴定免疫原性肽。这些算法是产生某种评分的数学方法，而这种评分能用于选择免疫原性肽。通常采用具有“结合阈值”的算法评分来选择很有可能以某种亲和力结合，进而具有免疫原性的肽。该算法是依据肽中特定位置处的特定氨基酸对MHC结合的影响或含基序的肽中特定取代对结合的影响。

术语“残基”指通过酰胺键或酰胺键模拟物掺入寡肽的氨基酸或氨基酸模拟物。

“保守性残基”是这样一种氨基酸，其在肽中特定位置出现的频率显著高于随机分布所预计的。保守性残基通常是MHC结构可提供与免疫原性肽的接触点的残基。限定长度的肽中至少1-3个或更多个，优选2个保守性残基限定了免疫原性肽的基序。这些残基通常与肽结合沟槽紧密接触，它们的侧链埋在该沟槽本身的特异性袋中。免疫原性肽通常包含最多3个保守性残基，更常见是2个保守性残基。

术语“基序”指由特定MHC等位基因(一种或多种HLA分子)识别的限定长度肽中的残基模式，通常约6-约25个氨基酸。对于各人MHC等位基因，肽基序通常在高度保守性残基和阴性残基(negative residue)的模式方面不同。对于各人HLA等位基因编码的蛋白质，肽基序常是独特的，它们的一级和二级锚定残基模式不同。本文所用的“基序”通常指特定等位基因编码的HLA分子识别的残基的模式。可增加精确性程度来限定等位基因的结合基序。

表位中称作“羧基末端”或“羧基末端位置”的残基位置指最接近肽的羧基末端的表位末端残基位置，其采用以下定义的常规术语命名。表位的“羧基末端位置”可以对应于或实际不对应于肽或多肽的末端。

表位中称作“氨基末端”或“氨基末端位置”的残基位置指最接近肽的氨基末端的表位末端残基位置，其采用以下定义的常规术语命名。表位的“氨基末端位置”可以对应于或实际不对应于肽或多肽的末端。

“携带基序的肽”或“包含基序的肽”指包含给定基序或超基序的特异性一级锚定(氨基酸)的肽。

在某些实施方式中，“超基序”肽具有两种或更多种HLA等位基因编码的HLA分子共有的结合特异性。携带超基序的肽优选由两种或更多种HLA分子或抗原以高或中等亲和力(如本文定义的)识别。

或者，术语“超基序”指当存在于免疫原性肽中时，使得该肽结合多于一种HLA抗原的基序。超基序优选由至少一种在人群中广泛分布的HLA等位基因以高或中等亲和力(如本文定义的)识别，优选由至少两种等位基因识别，更优选由至少三种等位基因识别，最优选由多于三种等位基因识别。

“人白细胞抗原”或“HLA”是I类或II类人主要组织相容性复合体(MHC)蛋白(参见，Stites等，IMMUNOLOGY(免疫学)，第8版，朗阁出版公司(LangePublishing)，洛斯阿尔托斯，加利福尼亚州(1994))。

“主要组织相容性复合体”或“MHC”是在控制负责生理免疫应答的细胞相互作用中起作用的基因簇。在人中，MHC复合体也称为HLA复合体。MHC和HLA复合体的详述参见Paul，FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(基础免疫学)，第3版，雷文出版社(Raven Press)，纽约，1993。

短语“分离的”或“生物学纯的”指某物质基本上或实质上不含在其天然状态中发现的与其正常相伴的组分。因此，本发明肽不含有与其原位环境正常相关的物质，例如抗原呈递细胞上的II类MHC分子。即使蛋白质已分离至均一或优势条带，还是有天然蛋白质的5-10％的痕量污染物与所需蛋白质共同纯化。本发明的分离的肽不含这种内源性的共同纯化蛋白质。

“外周血单核的细胞”(PBMC)是在患者的外周血中发现的细胞。PBMC包括，例如CTL和HTL及抗原呈递细胞。这些细胞可在体内接触抗原，或者可从哺乳动物来源获得并在体外接触抗原。

“交叉反应性结合”表示某肽被多于一种HLA分子结合；其同义词是“简并结合”。

“混杂识别”是同一T细胞克隆识别不同HLA分子结合的同一肽的情况。就多种HLA等位基因而言，其还指肽被一种T细胞受体识别的能力。

“连接”或“接入”指功能性连接肽的本领域已知的任何方法，包括但不限于重组融合、共价结合、二硫键结合、离子键结合、氢键结合和静电结合。

“非天然”序列或“构建物”指自然界中未发现的，即“非天然产生”的序列。这种序列包括，例如脂化或作其它修饰的肽和含有天然蛋白质序列中不毗连的表位的多肽组合物。

本文所用的“疫苗”是含有一种或多种本发明肽的组合物，参见，例如表I。本发明疫苗有多种实施方式，例如一种或多种肽的混合物；多表位肽构成的一种或多种本发明肽；或编码这种肽或多肽的核酸，例如编码多表位肽的小基因。“一种或多种肽”可包括1-150的任何全单位整数，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150或更多种本发明肽。可任选修饰肽或多肽，例如通过脂化、加入靶向或其它序列。本发明的II类HLA-结合肽可连接于I类HLA-结合肽以促进细胞毒性T淋巴细胞和辅助T淋巴细胞的活化。疫苗可包含肽脉冲的抗原呈递细胞，例如树突细胞。

发明详述

本发明的某些实施方式部分涉及用于疫苗设计的表位方法。该方法依据已有的发现，即，诱导HTL免疫应答的机制，包括呈递HTL表位作为结合展示在抗原呈递细胞上的HLA分子的约6-25氨基酸的肽的步骤。

本发明的某些实施方式涉及包含结合II类HLA分子的等位基因特异性肽基序和超基序的肽。

如上所述，HLA结合亲和力高与免疫原性较高相关。免疫原性较高可体现在几个不同的方面。例如，结合更高的肽常更具免疫原性。接近90％的高结合肽是免疫原性的，相比之下，结合亲和力中等的肽只有约50％具免疫原性。结合更高的肽还导致更强的应答。因此，引发类似的生物学效应需要较少的肽。因此，在本发明的一些实施方式中，高结合表位尤其理想。

现已注意到，显著数量的衍生自已知非病毒肿瘤相关抗原(TAA)的表位以中等亲和力(IC₅₀为50-500mM)结合II类HLA。现已发现，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或CTL识别的15种已知TAA肽中有8种以50-500mM(亲和力)结合。这些数据与以下相反，估计肽识别的90％已知病毒抗原以50mM或较小的IC₅₀结合HLA，而只有约10％以50-500mM的范围结合(Sette等，J.Immunol.，153：5586-5592(1994))。该现像可能是因为癌症消退，或识别几种最高结合肽的CTL的功能受抑制，估计是因为T细胞耐受事件。

可通过合成，或重组DNA技术，或从天然来源，例如完整的病毒或肿瘤制备本发明的携带表位的肽。虽然肽最好基本上不含其它天然产生的宿主细胞蛋白及其片段，但在一些实施方式中，通过合成将肽偶联于天然分子或颗粒；该肽还可偶联于非天然分子或颗粒。

本发明肽的长度可以各异，可以是其天然(不带电荷)形式或盐形式。本发明肽可以不含修饰，例如糖基化、侧链氧化或磷酸化；或者它们含有这些修饰。

携带表位的肽最好尽可能小，但仍保留大肽的相关免疫学活性；当然，来自病原性生物的肽是尤其理想的，该肽应小从而能避免致病功能。对于II类分子，如果可能，将本发明的表位优化至长度为约6-约25，优选14-15个氨基酸残基是理想的。所述肽优选在大小上与结合细胞表面上的I类或II类HLA分子的内源性加工病毒肽或肿瘤细胞肽相当。然而，可采用本文所述的技术鉴定和制备其它长度的肽，例如一级锚定位置所述。应该知道，本发明的肽表位可存在于长于表位本身的肽或蛋白质中。此外，多表位肽可包含至少一种本发明表位以及一种或多种其它表位。

具体地说，本发明提供与多于一种的HLA等位基因结合的肽的共有基序。通过组合基序鉴定和MHC-肽相互作用研究，现已鉴定了可用于肽疫苗的肽。

合成包含这些抗原的表位的肽，然后在利用，例如免疫荧光染色和流式显微荧光法的试验、肽-依赖性II类装配试验中检验它们结合适当MHC分子的能力。进一步评估结合II类分子的那些肽用作衍生自感染或经免疫个体的HTL的靶标的能力以及它们作为潜在的治疗剂诱导体内或体外原代HTL应答的能力，所述应答可产生能与肿瘤细胞反应的HTL群体。

因此，设计有效疫苗的起点是确保该疫苗会产生可成功呈递的大量表位。可能给予代表表位本身的肽。这种给药取决于呈递展示在对象细胞上的“空”HLA分子。在利用免疫原性肽本身的方法中，这些肽可与待治疗对象的抗原呈递细胞离体温育，然后将这些细胞输回该对象。

或者，可通过给予含有编码肽的核苷酸序列的核酸在原位产生该肽。提供这种核酸分子的手段描述于WO99/58658，其内容通过引用纳入本文。此外，可将免疫原性肽作为较大肽分子的一部分给予，经切割释放所需肽。所述较大肽分子可含有外来氨基酸，通常是越少越好。因此，含有这种氨基酸的肽通常是50个氨基酸或略少，更常见是30个氨基酸或略少，还要常见是20个氨基酸或略少。前体还可以是含有多个不同或相同HTL表位的异质聚合物或均质聚合物。当然，还可利用肽和产生各种免疫原性肽的核酸的混合物。肽疫苗、核酸分子或异质或均质聚合物的设计取决于包含所需表位。

在某些实施方式中，肽优选包含结合HLA-DR超型等位基因的表位。这些基序可用于限定任何所需抗原的T-细胞表位，特别是潜在抗原靶标的氨基酸序列已知的人癌症相关的那些。

因此，这些肽可用于体内和离体治疗和诊断应用的药物组合物中。

如上所述，可通过筛选潜在的抗原性来源鉴定包含超基序序列的肽。还可通过合成超基序中含有可变残基的系统性或随机取代的肽，并根据提供的试验检验它们来鉴定有用的肽。如下所示，述及靶HLA分子的序列也是有用的。

对于表位疫苗，本发明的肽优选包含在人群中广泛分布的II类HLA分子识别的超基序和/或基序。HLA多态性程度高是表位方法到疫苗开发有待考虑的重要因素。为解决该因素，优选采用表位选择，包括鉴定能以高或中等亲和力结合多种HLA分子的肽，更优选的是，这些表位以高或中等亲和力结合两种或更多种等位基因-特异性HLA分子。

疫苗组合物的感兴趣HTL-诱导肽优选包括与II类HLA分子的IC₅₀或结合亲和力值为1000nM或更好的那些(即，该数值大于或等于1000nM)。例如，通过检验候选肽体外结合纯化HLA分子的能力来评估肽结合情况。然后将显示高或中等亲和力的肽考虑作进一步分析。通常利用该超型家族的其它成员检验所选肽。在优选的实施方式中，然后将显示交叉反应性结合的肽用于细胞筛选分析或疫苗中。

测定预计能结合特定II类等位基因的基序能鉴定氨基酸序列已知的抗原性蛋白质的潜在肽表位。通常利用计算机扫描所需抗原的氨基酸序列中是否存在基序和/或超基序来初步鉴定潜在肽表位。

早先测定不同II类等位基因的特异性基序使得能从氨基酸序列已知的抗原性蛋白质鉴定潜在肽表位。通常利用计算机扫描所需抗原的氨基酸序列中是否存在基序来初步鉴定潜在肽表位。然后合成表位序列。采用各种不同的方法检测结合II类MHC分子的能力。

用于鉴定本发明肽的方法通常遵循通过引用纳入本文的Falk等(Nature351：290(1991))所述的方法。简言之，这些方法一般通过免疫沉淀或亲和层析从适当的细胞或细胞系大规模分离II类MHC分子。分离所需MHC分子的其它方法的例子同样是技术人员熟知的，包括离子交换层析、凝集素层析、尺寸排阻、高效液相层析和所有上述技术的组合。

通常采用酸处理洗脱与分离的MHC分子的肽结合沟槽结合的肽。还可通过各种标准变性方法，例如加热、pH、洗涤剂、盐、离液剂或它们的组合使得肽与II类分子解离。

通过反相高效液相层析(HPLC)进一步分离肽组分与MHC分子，并测序。可通过技术人员熟知的各种其它标准方法分离肽，包括过滤、超滤、电泳、尺寸层析、用特异性抗体沉淀、离子交换层析、等电聚焦等。

可按照标准技术测序分离的肽，例如Edman降解(Hunkapiller，M.W.等，Methods Enzymol.91，399[1983])。适合测序的其它方法包括如前所述各肽的质谱测序(通过引用全纳入本文的Hunt等，Science 225：1261(1992))。不同I类分子的大量异质肽(例如，合并的HPLC组分)的氨基酸序列通常显示各I类等位基因的特征性序列基序。

随后，检验在II类MHC结合试验中检验呈阳性的肽在体外诱导特异性HTL应答的能力。例如，可检验与肽温育的抗原呈递细胞在应答细胞群中诱导HTL应答的能力。抗原呈递细胞可以是正常细胞，例如外周血单核的细胞或树突细胞(Inaba等，J.Exp.Med.166：182(1987)；Boog，Eur.J.Immunol.18：219(1988))。

如本文所述，HLA结合亲和力较高与免疫原性较高相关。免疫原性较高可以体现在几个不同方面。免疫原性可对应于免疫应答是否引发、任何特定应答的强度以及引发应答的人群的多样性程度。例如，某肽可在不同人群中引发免疫应答，但无一例产生强烈应答。按照本文所述的原理，发现接近90％的高结合肽是免疫原性的，相比之下，结合亲和力中等的肽只有约50％具免疫原性。此外，结合亲和力更高的肽导致更强的免疫应答。因此，如果利用高亲和力结合肽，引发类似的生物学效应需要较少的肽。因此，在本发明的优选实施方式中，高亲和力结合表位尤其有用。然而，利用中等或高结合肽产生胜过现有技术的改进。

测定它们的结合亲和力后，可进行其它验证工作以在这些候选疫苗中选择就人群覆盖度、抗原性和免疫原性而言，具有较好特征的表位。

因此，可采用各种方案评估免疫原性，包括：

1)评估正常个体的原代T细胞培养物(参见，例如Wentworth，P.A.等，Mol.Immunol.32：603，1995；Celis，E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2105，1994；Tsai，V.等，J.Immunol.158：1796，1997；Kawashima，I.等，HumanImmunol.59：1，1998)。该方法包括有抗原呈递细胞存在下用测试肽体外刺激正常对象的外周血淋巴细胞(PBL)数周。在该期间，该肽的特异性T细胞得到激活，并作检测。

2)免疫HLA转基因小鼠(参见，例如Wentworth，P.A.等，J.Immunol.26：97，1996；Wentworth，P.A.等，Int.Immunol.8：651，1996；Alexander，J.等，J.Immunol.159：4753，1997)。在该方法中，将不完全弗氏佐剂配制的肽皮下给予HLA转基因小鼠。免疫几周后，取出脾细胞，在有测试肽存在下体外培养约1周。检测肽-特异性T细胞。

3)证明已经有效疫苗接种或具有肿瘤的患者的回忆T细胞应答；(参见，例如Rehermann，B.等，J.Exp.Med.181：1047，1995；Doolan，D.L.等，Immunity 7：97，1997；Bertoni，R.等，J.Clin.Invest.100：503，1997；Threlkeld，S.C.等，J.Immunol.159：1648，1997；Diepolder，H.M.等，J.Virol.71：6011，1997；Tsang等，J.Natl.Cancer Inst.87：982-990，1995；Disis等，J.Immunol.156：3151-3158，1996)。应用该方案，通过培养已“自然”产生免疫应答的癌症患者的或用肿瘤抗原疫苗接种的患者的PBL检测回忆应答。与“天然”T细胞相比，在有测试肽和抗原呈递细胞(APC)存在下体外培养对象的PBL1-2周，从而激活记忆T细胞。培养期结束时，检测T细胞活性。

本发明的免疫原性肽表位可包含在含有同一抗原、相同来源的抗原和/或不同来源的抗原的其它肽表位的多表位疫苗组合物中。此外，可包含II类表位和I类表位。同一抗原的肽表位可以是在序列中毗连的毗邻表位，或者可从该蛋白质的不同区域获得。

本发明肽中存在的表位与MHC等位基因和等位基因亚型的相互作用可以是交叉反应性或非交叉反应性的。表位(或肽)的交叉反应性结合使得多于一种的HLA分子结合表位。这种交叉反应性还称为简并结合。非交叉反应性表位局限于结合特定MHC等位基因或等位基因亚型。

指示II类HTL诱导肽表位的基序

II类HLA超基序和基序的一级锚定残基限定于下文。

HLA DR-1-4-7超基序

还鉴定了结合三种共有II类HLA等位基因-特异性HLA分子的肽的基序：HLA DRB1*0401、DRB1*0101和DRB1*0701(参见，例如Southwood等J.Immunology 160：3363-3373，1998的综述)。这些基序的共有残基共同限定了HLA DR-1-4-7超基序。结合这些DR分子的肽携带超基序，该基序的特征在于9-聚体核心区域1位的一级锚定残基是大的芳族或疏水性残基(Y、F、W、L、I、V或M)，和9-聚体核心区域6位的一级锚定残基是小的不带电荷残基(S、T、C、A、P、V、I、L或M)。还鉴定了这些HLA类型中各自的等位基因-特异性二级效应和二级锚定(残基)(Southwood等，同上)。通过在一级和/或二级锚定位置作取代来调节结合HLA-DRB1*0401、DRB1*0101和/或DRB1*0701的肽，最好选择超基序的各特异性残基。

两种备选基序(即，亚基序)表征了结合HLA-DR3分子的肽表位(参见，例如Geluk等，J.Immunol.152：5742，1994)。在第一基序中(亚基序DR3A)，对着表位的羧基末端，9-聚体核心的锚定1位是大的芳族或疏水性残基(L、I、V、M、F或Y)，4位的D作为锚定(残基)。与其它II类基序中一样，核心1位可占据或不占据该肽N-末端位置。

对着表位的羧基末端，备选的DR3亚基序在锚定1位缺乏大的疏水性残基，和/或在4位缺乏带负电荷的或酰胺样锚定残基，在6位存在正电荷(残基)。因此，对于备选的等位基因-特异性DR3基序(亚基序DR3B)：L、I、V、M、F、Y、A或Y存在于锚定1位；D、N、Q、E、S或T存在于锚定4位；K、R或H存在于锚定6位。可通过在一级和/或二级锚定位置作取代，最好选择基序的各特异性残基来调节结合HLA-DR3的肽。

与I类HLA结合肽一样，还测定了II类HLA-结合肽的基序。几项研究鉴定了9-聚体核心区域1位的芳族或疏水性残基(I、L、M、V、F、W或Y)在肽配体结合几种II类HLA等位基因中的重要作用，所述残基通常嵌套在较长的肽序列内(Hammer等，Cell 74：197，(1993)；Sette等，J.Immunol.151：3163-70(1993)；O’Sullivan等，J.Immunol.147：2663(1991)；和Southwood等，J.Immunol.160：3363-73(1998))。还证明了9-聚体核心的6位残基优选短和/或疏水性残基(S、T、C、A、P、V、I、L或M)并具有强烈作用。有人将该1位-6位基序描述为DR-超基序(Southwood等，J.Immunol.160：3363-3373(1998))，并证明其能有效鉴定能结合共有II类HLA等位基因的大量肽。

对于鉴定次优选的或有害的残基，还可分析结合II类分子的肽。例如，为获得更详细的DRB1*0401基序来确定影响肽结合的二级残基，我们采用与I类肽所进行的类似方案。对于分析的各肽，根据一级II类锚定位置P1和P6比对9-残基长的核心区域。然后计算相比于该组中其余的肽，在各位置携带特定残基的肽的平均结合亲和力。按照该方法，编辑显示平均相对结合(亲和力)的数值。这些数值还提供了相比于P1-P6II类基序位置，20种天然氨基酸各自占据特定位置时，其在DRB1*0401结合能力中的正面或负面作用。

平均相对结合中大于或等于4倍或小于或等于0.25的差异任意视作显著的，并表示给定残基对HLA-肽相互作用有次级作用。大多数次级作用与P4、P7和P9相关。这些位置对应于结合DR分子上浅袋(shallow pocket)的次级锚定(位置)。还对DRB1*0101和DRB1*0701进行了测定二级残基的类似研究。DR1、DR4和DR7的基序的二级残基的测定见表139。

测定了等位基因-特异性二级作用和二级锚定(残基)后，获得等位基因-特异性算法，利用其鉴定结合DRB1*0101、DRB1*0401和DRB*0701的肽。其它实验鉴定了大量II类HLA分子，至少包括识别DR超基序的DRB1*0101、DRB1*0401和DRB*0701、DRB1*1501、DRB1*0901和DRB1*1302等位基因产物，其特征在于极大重叠的肽结合库。

上述数据证实几种常见的II类HLA类型的特征在于极大重叠的肽结合库。基于此，与I类HLA分子类似，II类HLA分子可分组成II类HLA超型，根据相似性或极大重叠(虽然不同)的肽结合特异性测定并表征。

可通过任何合适的方法鉴定本发明的肽。例如，采用共同待批美国专利申请序列号09/894,018所述的本发明算法不难鉴定肽。这些算法是产生某种评分的数学方法，而这种评分能用于选择免疫原性肽。通常采用具有“结合阈值”的算法评分来选择很有可能以某种亲和力结合，进而具有免疫原性的肽。该算法是依据肽中特定位置处的特定氨基酸对MHC结合的影响或含基序的肽中特定取代对结合的影响。

已采用各种技术鉴定在分子结合试验和捕捉试验中表征的肽序列。采用埃匹免疫公司(Epimmune)开发的定制应用程序鉴定基序-阳性序列。序列还用基于矩阵的算法鉴定，并与产生50％预计抑制浓度(PIC)值的“功率”模块联用。后几种方法在埃匹免疫公司的HTML-表位信息系统(EIS)数据库上操作。在肽序列选择中可选择所有描述的方法以便采用结合试验测定IC₅₀。

采用各种方法检测结合MHC分子的能力。一种方法是上述相关申请描述的MHC结合试验。参考文献中描述的其它备选方案包括抑制抗原呈递(Sette等，J.Immunol.141：3893(1991))，体外装配试验(Townsend等，Cell 62：285(1990))和利用突变细胞的FACS试验，例如RMA.S(Melief等，Eur.J.Immunol.21：2963(1991))。

捕捉试验：与上述基于HPLC的分子结合试验不同，高通量筛选(“HTS”)捕捉试验不利用尺寸排阻二氧化硅柱来分离结合的与未结合的放射性标记。该方法用3μg(100μl，30μg/ml)HLA-特异性抗体(Ab)包被半透明的白色96-孔Opti平板(帕卡德公司(Packard))，所述抗体“捕捉”从分子结合试验平板转移的100μl 0.05％NP40/PBS中的放射性标记MHC和未标记肽的复合体。温育3-小时后，倾析出上清液，加入闪烁液(Microscint 20)。然后利用微板闪烁和发光计数器(TopCount NXTTM；帕卡德公司)检测捕捉的复合体。

测定结合的其它试验细节描述于PCT公布WO 94/20127和WO94/03205。结合数据结果常表示为IC₅₀值。IC₅₀是指结合试验中观察到50％的参比肽结合受抑制的肽浓度。给定进行试验的条件(即，限制MHC蛋白和标记肽浓度)，这些数值可以近似为K_D值。应该注意，如果试验条件变化，则IC₅₀值可变，通常是剧烈变化，并且取决于所用的特定试剂(即，MHC制品等)。例如，浓度过量的MHC分子会增加给定配体检测到的表观IC₅₀。或者，可相对于参比肽表示结合情况。虽然随着特定试验的灵敏度变高或低，所测试肽的IC₅₀可有些许变化，但相对于参比肽的结合情况不会显著改变。例如，在参比肽的IC₅₀增加10-倍的条件下进行试验，测试肽的IC₅₀值也增加约10-倍。因此，为更明确起见，评估某肽是良好的、中等的、弱的还是负结合剂通常依据其与标准肽的IC₅₀相比的IC₅₀。

本发明肽还可包含MHC-结合肽中两个或更多个残基的等构物。本文限定的等构物是可取代第二序列的两个或更多个残基的序列，因为第一序列的空间构象匹配该第二序列的特异性结合位点。该术语专门包括本领域技术人员熟知的肽骨架修饰。这种修饰包括酰胺氮、α-碳、酰胺羰基、酰胺键的完全替代、延长、缺失或骨架交联。通常参见Spatola，Chemistry andBiochemistry of Amino Acids，Peptides and Proteins(氨基酸、肽和蛋白质的化学和生物化学)，第VII卷(Weinstein编，1983)。

用各种氨基酸模拟物或非天然氨基酸修饰肽对于增加肽的体内稳定性特别有用。可采用许多方法检验稳定性。例如，肽酶和各种生物学介质，例如人血浆和血清已用于检验稳定性。参见，例如Verhoef等，Eur.J.DrugMetab.Pharmacokin.11：291-302(1986)。采用25％人血清(v/v)试验不难测定本发明肽的半衰期。该方案通常如下所示。先通过离心合并的人血清(AB型，非热灭活)使之脱脂，再使用。然后用RPMI组织培养基将该血清稀释至25％，用其检验肽稳定性。在预定的时间间隔取出少量反应液，加入6％水性三氯乙酸或乙醇。将混浊的反应样品冷却(4℃)15分钟，然后离心以沉淀血清蛋白。然后采用稳定性-特异性层析条件，通过反相HPLC测定是否存在肽。

这种类似物还可具有改善的储存期或制造特性。更具体地说，蛋白质中的非关键氨基酸无需局限于天然产生的氨基酸，例如L-α-氨基酸或它们的D-同种型，而可包含非天然氨基酸，例如氨基酸模拟物，如D-或L-萘基丙氨酸(naphylalanine)；D-或L-苯基甘氨酸；D-或L-2-噻吩基丙氨酸(thieneylalanine)；D-或L-1、-2、3-或4-芘基丙氨酸；D-或L-3噻吩基丙氨酸；D-或L-(2-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(2-吡嗪基)-丙氨酸；D-或L-(4-异丙基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基丙氨酸；D-ρ-氟苯基丙氨酸；D-或L-ρ-联苯基苯基丙氨酸；D-或L-ρ-甲氧基联苯基苯基丙氨酸；D-或L-2-吲哚(烷基)丙氨酸；和D-或L-烷基丙氨酸，其中所述烷基可以是取代或未取代的的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、仲丁基(sec-isotyl)、异戊基或非酸性氨基酸。非天然氨基酸的芳环包括，例如噻唑基、苯硫基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳环。

产生有效肽类似物的另一实施方式包括取代对肽在，例如液体环境中的稳定性或溶解性有不利影响的残基。该取代可位于肽表位的任何位置。本发明的类似物可包括含有取代的肽从而修饰所得肽的物理特性(例如，稳定性或溶解性)。例如，半胱氨酸(C)可取代为α-氨基丁酸。半胱氨酸因其化学性质而倾向于形成二硫键桥并充分改变肽的结构，从而降低结合能力。用α-氨基丁酸取代C不仅减轻该问题，在某些情况中实际上还提高了结合和交联能力(参见，例如以下综述：Sette等，刊于Persistent Viral Infections(持久的病毒感染)，R.Ahmed和I.Chen编，约翰威利父子公司(John Wiley & Sons)，英格兰，1999)。用α-氨基丁酸取代半胱氨酸可发生在肽表位的任何残基处，即，在锚定或非锚定位置。

还可采用类似方法改变本发明肽的结合活性，特别是改进HLA超型家族成员的结合亲和力或交叉反应性，其描述于1/6/99提交的共同待批美国申请号09/226,775。简言之，类似的方案利用与某些HLA分子结合有关的基序或超基序。可通过在一级锚定、二级锚定或在一级和二级锚定位置作取代来制备类似的肽。通常制备早已携带基序或超基序的肽的类似物。对于本发明的许多基序或超基序，测定对结合等位基因-特异性HLA分子或结合各基序或超基序的HLA超型成员有害的残基(参见，例如Rupert等，Cell74：929，1993；Sidney，J.等，Hu.Immunol.45：79，1996；和Sidney等，Sidney等，J.Immunol.154：247，1995)。因此，可按照本发明除去对结合有害的这种残基。例如，在A3超型的情况中，当从分析所用肽群体中除去具有这种有害残基的所有肽时，交叉反应的发生率从22％提高到37％(参见，例如Sidney，J.等，Hu.Immunol.45：79，1996)。

因此，提高给定超基序中肽的交叉反应性的一种方法是简单地删除肽内存在的一个或多个有害残基并取代为小的“中性”残基，例如Ala(可能不影响该肽的T细胞识别)。如果与消除肽中的有害残基相组合插入与高亲和力结合等位基因-特异性HLA分子或超家族内的多种HLA分子有关的“优选”残基，则预计会提高交叉反应的可能性。

在一些实施方式中，除了本发明肽之一外，可利用T辅助肽。一类T辅助肽是在大多数人群中由T辅助细胞识别的肽。可通过选择结合许多、大多数或全部II类MHC分子的氨基酸序列来实现。这些称为″宽松的MHC-限制性″T辅助序列。宽松的MHC-限制性氨基酸序列的例子包括，例如破伤风毒素830-843位(QYIKANSKFIGITE(SEQ ID NO：1))、镰状疟原虫(Plasmodium falciparum)环子孢子蛋白(circumsporozoite)(CS)蛋白378-398位(DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS(SEQ ID NO：2))和链球菌18kD蛋白1-16位(YGAVDSILGGVATYGAA(SEQ ID NO：3))的抗原序列。

或者，可能利用自然界中未见的氨基酸序列制备能以宽松的MHC-限制性方式刺激T辅助淋巴细胞的合成肽(参见，例如PCT公布WO 95/07707)。依据它们对大多数HLA-DR(人II类MHC)分子的结合活性设计这些合成化合物，称为泛(Pan)-DR-结合表位或分子(加利福尼亚州圣迭戈的埃匹免疫公司)(参见，例如USSN 08/121,101(现放弃)和相关的USSN 08/305,871(现为美国专利号5,736,142))。例如，发现下式：aKXVWANTLKAAa(SEQIDNO：4)所示泛-DR-结合肽表位能结合大多数HLA-DR等位基因并刺激大多数个体的T辅助淋巴细胞应答，而无论他们的HLA类型，其中X是环己基丙氨酸、苯基丙氨酸或酪氨酸，“a”是D-丙氨酸或L-丙氨酸。

特别优选的免疫原性肽和/或T辅助偶联物由间隔分子相连。间隔分子通常由较小的、中性分子构成，例如氨基酸或氨基酸模拟物，它们在生理条件下基本上不带电荷。间隔分子通常从，例如Ala、Gly或非极性氨基酸或中性极性氨基酸的其它中性间隔分子选择。应该知道，任选存在的间隔分子无需由相同残基构成，因此可以是异质或均质寡聚物。存在时，间隔分子通常是至少1个或2个残基，更常见是3-6个残基。或者，HTL肽可连接于T辅助肽而无需间隔分子。

免疫原性肽可以直接或在HTL肽的氨基或羧基末端经间隔分子连接于T辅助肽。免疫原性肽或T辅助肽的氨基末端可作酰化。可采用与HTL肽相同的方式修饰本发明所用的T辅助肽。例如，它们可经修饰包含D-氨基酸或偶联于其它分子，例如脂质、蛋白质、糖等。示范性T辅助肽包括破伤风类毒素830-843、流感307-319、疟疾环子孢子蛋白382-398和378-389。

在一些实施方式中，本发明药物组合物中最好包含至少一种引发HTL和CTL的组分。脂质已鉴定为能在体内引发针对病毒抗原的HTL和CTL的物质。例如，可将棕榈酸残基连接于Lys残基的α和ε氨基，然后通过，例如Gly、Gly-Gly-、Ser、Ser-Ser等一个或多个连接残基连接于免疫原性肽。然后可将脂化肽以胶束形式直接注射，掺入脂质体或用佐剂，例如不完全弗氏佐剂乳化。在优选的实施方式中，特别有效的免疫原包含连接于Lys的α和ε氨基的棕榈酸，其通过连接部分，例如Ser-Ser连接于免疫原性肽的氨基末端。在优选的实施方式中，特别有效的免疫原还包含连接于Lys的α和ε氨基的棕榈酸，其通过连接部分，例如Ser-Ser连接于具有T细胞决定簇的I类限制性肽，例如本文所述那些肽以及鉴定为具有这种决定簇的其它肽的氨基末端。

大肠杆菌脂蛋白，例如三棕榈酰-S-甘油基半胱氨酰基丝氨酰基-丝氨酸(P3CSS)是引发HTL和CTL应答的脂质的另一例子，当共价连接于适当肽时，其可用于引发病毒特异性HTL CTL。参见，通过引用纳入本文的Deres等，Nature 342：561-564(1989)。例如，本发明肽可偶联于P₃CSS，给予个体这种脂肽特异性引发针对靶抗原的HTL应答。此外，由于用偶联于展示适当表位的肽的P₃CSS也可引发诱导中和抗体，可组合两种组合物以更有效地引发针对感染的体液和细胞-介导应答。

此外，可将其它氨基酸加入肽的末端，从而便于将肽彼此连接，偶联于运载体支持物或较大的肽，改进肽或寡肽的物理或化学特性，等等。可将氨基酸，例如酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸引入肽或寡肽的C-或N-末端。在一些情况中，在C末端作修饰可改变肽的结合特征。此外，肽或寡肽序列可通过末端-NH₂酰化，例如通过烷酰基(C₁-C₂₀)或硫代乙醇酰基酰化、末端-羧基酰胺化，例如氨、甲胺等作修饰而不同于天然序列。在一些情况中，这些修饰可提供连接支持物或其它分子的位点。

可采用各种方法制备本发明的肽。由于它们的尺寸较短，可按照常规技术在溶液中或固体支持物上合成这些肽。可商品化购得各种自动合成仪，并用于已知方案中。参见，例如Stewart和Young，Solid Phase Peptide Synthesis(固相肽合成)，第2版，皮尔斯化学品公司(Pierce Chemical Co).(1984)，同上。

本发明另一方面涉及包含免疫学有效量的一种或多种本文所述肽的疫苗。可利用本领域技术人员已知的各种递送载体将肽引入宿主，包括包埋有肽的PLG微球和病毒样颗粒。此外，可将表位作为本领域已知的多种抗原肽(MAP)(参见，例如Mora和Tam，J.Immunol.161：3616-23(1998))或作为免疫刺激复合体(ISCOMS)(参见，例如Hu等，Clin.Exp.Immunol.113：235-43(1998))引入。

含有免疫学有效量的一种或多种本文所述肽的疫苗是本发明进一步的实施方式。本发明的疫苗可用作预防剂或治疗剂。一旦测定了免疫原性适当的表位，可通过各种方式递送它们，本文称为“疫苗”组合物。这种疫苗组合物可包含，例如脂肽(例如，Vitiello，A.等，J：Clin.Invest.95：341，1995)、包封在多聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(″PLG″)微球中的肽组合物(参见，例如Eldridge等，Molec.Immunol.28：287-294，1991：Alonso等，Vaccine12：299-306，1994；Jones等，Vaccine 13：675-681，1995)、包含在免疫刺激复合体(ISCOMS)中的肽组合物(参见，例如Takahashi等，Nature 344：873-875，1990；Hu等，ClinExp Immunol.113：235-24：1998)、多种抗原肽系统(MAP)(参见，例如，Tam，J.P.，Proc.Nati.Acaa Sci.U.S.A.85：5409-5413，1988；Tam，J.P.，J Immunol.Methods 196：17-32，1996)、病毒(vir)递送载体(Perkus，M.E.等，刊于：Concepts in vaccine development(疫苗开发的概念)，Kaufmann H.E.编，第379页，1996；Chakrabarti，S.等，Nature 320：535，1986；Hu，S.L.等，Nature 320：537，1986；Kieny，M.-P.等，AIDS Bio/Technology 4：790，1986；Top，F.等，J Infect.Dis.124：148，1971；Chanda，P.K.等，Virology 175：535，1990)、病毒或合成来源的颗粒(例如，Kofler，N.等，J Immunol.Methods.192：2～1996；Eldridge，J.H.等，Sem.Bematol.30：16，1993；Fa10，L.D.，Jr.等，NatureMed.7：649，1995)、佐剂(Warren，H.S.，Vogel，F.R.和Chedid，L.A.Annu.Re lmmunol.4：369，1986；Gupta，R.K.等，Vaccine 11：293，1993)、脂质体(Reddy，R等，J.Immunol.148：1585，1992；Rock，K.L.，Immunol.Today17：131，1996)、或裸cDNA或颗粒吸附的cDNA(Ulmer，J.B.等，Science259：1745，1993；Robinsol H.L.，Hunt，L.A.和Webster，R.G.，Vaccine 11：957，1993；Shiver，J.W.等，刊于：Concepts in vaccine development(疫苗开发的概念)，Kaufmann，S.H.E.编，第423页，1996；Cease，K.B.和Berzofsky，J.A.，Annu.Rev.Immunol.12：923，1994和Eldridge，J.H.等，Sem.Hematol.30：16，1993)。还可采用毒素靶向递送技术，也称为受体介导靶向，例如马萨诸塞州尼德姆市阿凡特免疫治疗公司(Avant Immunotherapeutics，Inc.，Needham，Massachusetts)的那些技术。

本发明疫苗组合物包括核酸介导的形式。还可将编码一种或多种本发明肽的DNA或RNA给予患者。该方法描述于，例如Wolff等，Science 247：1465(1990)以及美国专利号5,580,859；5,589,466；5,804,566；5,739,118；5,736,524；5,679,647；WO 98/04720；下文更详细描述。DNA递送技术的例子包括“裸DNA”、促进(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽介导)的递送，阳离子脂质复合体、和颗粒介导(“基因枪”)或压力介导递送(参见，例如美国专利号5,922,687)。

对于治疗或预防免疫目的，本发明肽可以是表达载体，包括减毒的病毒宿主，例如牛痘病毒或禽痘病毒。该方法包括利用牛痘病毒，例如作为载体表达编码本发明肽的核苷酸序列。引入急性或慢性感染的宿主或未感染宿主后，重组牛痘病毒表达免疫原性肽，从而引发宿主CTL和/或HTL应答。可用于免疫方案中的牛痘病毒载体和方法如美国专利号4,722,848所述。另一载体是BCG(卡介苗)。BCG载体描述于Stover等，Nature 351：456-460(1991)。本领域技术人员从本文描述中可以明白可用于本发明肽的治疗性给药或免疫的各种其它载体，例如腺病毒和腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门菌(Salmonellatyphi)载体、脱毒炭疽毒素载体等。

此外，本发明的疫苗可包含一种或多种本发明肽。因此，肽可以在疫苗中单独存在。或者，可将肽单独连接于其本身的运载体；或者，肽可作为包含多拷贝同一肽的均质聚合物，或作为各种肽的异质聚合物存在。聚合物的优点在于增强免疫反应以及在用不同肽表位构成聚合物的情况下，诱导与病原性生物的不同抗原决定簇反应的抗体或使免疫应答靶向肿瘤相关肽的抗体和/或CTL应答的额外能力。该组合物可以是抗原的天然区域，或可通过，例如重组或化学合成方法制备。

可用于本发明疫苗的运载体是本领域熟知的，包括，例如甲状腺球蛋白，白蛋白，例如人血清白蛋白，破伤风类毒素、多聚氨基酸，例如多聚L-赖氨酸、多聚L-谷氨酸，流感、乙肝病毒核心蛋白，等等。这些疫苗可包含生理上可耐受的(即，可接受的)稀释剂，例如水或盐水，优选磷酸缓冲盐水。疫苗还通常包含佐剂。诸如弗氏佐剂、磷酸铝、氢氧化铝或明矾等佐剂是本领域熟知材料的例子。此外，可以通过将本发明肽偶联于脂质，例如三棕榈酰-S-甘油基半胱氨酰基丝氨酰基-丝氨酸(P3CSS)来引发CTL应答。

利用本发明肽组合物，通过注射、气溶胶、口服、经皮、经粘膜、胸膜内、鞘内或其它合适途径免疫后，宿主的免疫系统通过产生大量所需抗原的特异性HTL和/或CTL而对疫苗起反应。因此，宿主对随后的感染至少部分免疫，或对现有慢性感染的进展至少部分耐受，或者当抗原是肿瘤相关抗原时，至少产生一些治疗益处。

对于治疗或免疫目的，还可通过载体表达本发明肽。表达载体的例子包括减毒的病毒宿主，例如牛痘病毒或禽痘病毒。该方法包括利用牛痘病毒作为载体表达编码本发明肽的核苷酸序列。可用于免疫方案中的牛痘病毒载体和方法如美国专利号4,722,848所述。另一载体是BCG(卡介苗)。BCG载体描述于Stover等，Nature 351：456-460(1991)。本领域技术人员从本文描述中可以明白可用于本发明肽的治疗性给药或免疫的各种其它载体，例如伤寒沙门菌载体、逆转录病毒载体、腺病毒和腺相关病毒载体等。

或者，可采用重组DNA技术，其中编码感兴趣免疫原性肽的核苷酸序列插入表达载体，转化或转染入适当宿主细胞并在适于表达的条件下进行培养。这些方法通常是本领域已知的，如通过引用纳入本文的Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆，实验室手册)，冷泉港出版社，冷泉港，纽约(1982)(还有1989)所述。因此，包含一种或多种本发明肽序列的融合蛋白可用于呈递适当的T细胞表位。例如，编码本发明肽的编码序列可用适当接头连接入本领域可普遍获得的表达载体，该载体用于转化合适的宿主以便产生所需的融合蛋白。目前有许多这种载体和合适的宿主系统可用。以下部分详细描述了表达构建物，即小基因。这些方法也用于呈递至少一种本发明肽以及并非本发明肽的物质。

由于可通过化学技术，例如采用Matteucci等(J.Am.Chem.Soc.103：3185(1981))的磷酸三酯方法合成本文所考虑长度的肽的编码序列，用适当的碱基取代编码天然肽序列的那些碱基不难作出修饰。然后给编码序列提供适当接头并连接入本领域可普遍获得的表达载体，该载体用于转化合适的宿主以便产生所需融合蛋白。目前有许多这种载体和合适的宿主系统可用。为表达融合蛋白，可为编码序列提供操作性连接的起始和终止密码子、启动子和终止子区域，通常是复制系统以提供表达载体，从而能在所需细胞宿主中表达。例如，在含有便利的限制性位点的质粒中提供细菌宿主相容的启动子序列以便插入所需的编码序列。得到的表达载体转化入合适的细菌宿主。当然，还可利用酵母菌或哺乳动物细胞宿主，利用合适的载体和控制序列。

本发明肽及其药物组合物和疫苗组合物可用于向哺乳动物，特别是人给药来治疗和/或预防癌症。

在治疗性应用中，将有效量的组合物给予患者以引发针对肿瘤抗原的有效HTL应答和治愈症状和/或并发症或至少使之部分停止。足以实现该目的的用量定义为“治疗有效剂量”或“单位剂量”。该应用有效的用量取决于，例如肽组合物、给药方式、所治疗疾病的阶段和严重性、患者的体重和总体健康状况以及开处方医师的判断，但对于70kg的患者，初始免疫(即治疗性或预防性给药)的范围通常是约1.0μg-约5000μg肽，然后根据患者的反应和检测患者血液中特异性CTL活性的条件，按照加强方案在数周到数月给予约1.0μg-约1000μg肽的加强剂量。在备选实施方式中，对于人，70kg患者的初始免疫(即治疗性或预防性给药)的剂量范围通常是约1.0μg-约20,000μg肽，优选100μg-、150μg-、200μg-、250μg-、300μg-、400μg-或500μg-20,000μg，然后根据患者的反应和检测患者血液中特异性HTL活性的条件，按照加强方案在数周到数月给予加强剂量。在采用重组核酸给药的实施方式中，给予的物质经滴定获得适当的治疗反应。

必须记住，本发明的肽和组合物通常用于严重的疾病状态，即危及生命或可能危及生命的情况。在这些情况中，考虑到尽可能减少外来物质和肽的相对无毒性本质，由治疗医师给予实质过量的这些肽组合物可能是理想的。

对于治疗应用，给药应在首次肿瘤征兆之时或诊断后不久开始。然后给予加强剂量直至至少症状实质性减轻并随后持续一段时期。

用本发明组合物治疗患病个体可能加快解决急性感染个体中的感染。对于易于(或倾向于)产生癌症的那些个体，所述组合物尤其可用于预防癌症发生的方法。

用于治疗性治疗的药物组合物打算用于胃肠外、外用、口服或局部给药。优选胃肠外给予药物组合物，例如静脉内、皮下、真皮内或肌肉内。因此，本发明提供胃肠外给予的组合物，其包含溶解或悬浮于可接受的运载体，优选水性运载体中的免疫原性肽溶液。可利用各种水性运载体，例如水、缓冲水、0.8％盐水、0.3％甘油、透明质酸等。这些组合物可通过常规的熟知灭菌技术灭菌，或可经除菌过滤。得到的水性溶液可原样包装以供使用，或冻干，冻干的制品在给药前与无菌溶液混合。组合物可视需要含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、单月桂酸钠、油酸三乙醇胺等。

本发明药物组合物可包含一种或多种本发明的T细胞刺激性肽。例如，药物组合物可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30种或更多种本发明的T细胞刺激性肽。此外，本发明的药物组合物可包含一种或多种本发明的T细胞刺激性肽与一种或多种其它T细胞刺激性肽的组合。按照所选的特定给药方式，药物制剂中本发明的独特T细胞刺激性肽各自的浓度可以极为不同，例如以重量计小于约0.001％、约0.002％、约0.003％、约0.004％、约0.005％、约0.006％、0.007％、0.008％、0.009％、约0.01％、约0.02％、约0.025％、约0.03％、约0.04％、约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约20％到约50％或更高，并且主要根据液体体积、粘度等选择。在优选的实施方式中，药物制剂中本发明的独特T细胞刺激性肽各自的浓度是，以重量计约0.001％、约0.002％、约0.003％、约0.004％、约0.005％、约0.006％、0.007％、0.008％、0.009％、约0.01％、约0.02％、约0.025％、约0.03％、约0.04％、约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％。在更优选的实施方式中，药物制剂中本发明的独特T细胞刺激性肽各自的浓度是，以重量计约0.01％、约0.02％、约0.025％、约0.03％、约0.04％、约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％、约0.1％。

按照所选的特定给药方式，药物制剂中本发明的HTL刺激性肽的浓度可以极为不同，即，以重量计从小于约0.1％，通常是或至少约2％到最多20％到50％或更高，并且主要根据液体体积、粘度等选择。肽组合物的人单位剂型通常包括在含有人单位剂量的可接受运载体，优选水性运载体的药物组合物中，给予该单位剂型的液体的体积是本领域技术人员已知将这种组合物给予人所用的。

还可利用脂质体给予本发明肽，所述脂质体用于将该肽靶向特定组织，例如淋巴组织或选择性靶向感染的细胞以及增加肽组合物的半衰期。脂质体包括乳剂、泡沫、胶束、不可溶单层、液晶、磷脂分散体、薄层等。在这些制品中，待递送的肽单独作为脂质体的一部分掺入，或与结合，例如淋巴细胞中的普遍受体的分子，例如结合CD45抗原的单克隆抗体组合，或与其它治疗组合物或免疫原性组合物组合而作为脂质体的一部分掺入。因此，可将用所需的本发明肽填充或修饰的脂质体引向淋巴细胞的位点，然后脂质体在该处递送所选的治疗性/免疫原性肽组合物。本发明所用的脂质体从标准的囊泡形成性脂质形成，其通常包含中性和带负电荷的磷脂及固醇，例如胆固醇。通常考虑以下因素选择脂质，例如脂质体大小、脂质体在血流中的酸不稳定性和稳定性。可用各种方法制备脂质体，例如通过引用纳入本文的Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467(1980)，美国专利号4,235,871；4,501,728；4,837,028和5,019,369。

为靶向免疫细胞，待掺入脂质体的配体可包括，例如所需免疫系统细胞的细胞表面决定簇的特异性抗体或其片段。可通过静脉内、局部、外用等途径给予含肽的脂质体悬浮液，其剂量根据给药方式、所递送的肽和所治疗疾病的阶段等而有所不同。

对于固体组合物，可利用常规无毒固体运载体，包括，例如药物级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服给药，通过掺入任何正常使用的赋形剂，例如以前所列的那些运载体来形成药学上可接受的无毒组合物，通常是活性成分，即，一种或多种本发明肽的10-95％，更优选浓度为25％-75％。

对于气溶胶给药，免疫原性肽优选以精细分级的形式与表面活性剂和推进剂一起提供。以重量计，肽的百分比是0.01％-20％，优选1％-10％。当然，表面活性剂必须是无毒的，优选可溶于推进剂。这种试剂的代表是含6-22个碳原子的脂肪酸酯或偏酯，例如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、奥斯地酸(olesteric acid)和油酸以及脂族多羟基醇或其环状酐。可利用混合酯，例如混合或天然的甘油酯。以组合物的重量计，表面活性剂占0.1％-20％，优选0.25-5％。组合物的余量通常是推进剂。还可视需要包含运载体，例如用于鼻内递送的卵磷脂。

在另一方面，本发明涉及含有免疫学有效量的本文所述免疫原性肽作为活性成分的疫苗。可将一种或多种肽与其本身的运载体相连或作为活性肽单位的均质聚合物或异质聚合物而引入宿主，包括人。这种聚合物的优点在于免疫反应增强以及在用不同肽构成聚合物的情况下，诱导与肿瘤细胞的不同抗原决定簇反应的抗体和/或CTL的额外能力。可用的运载体是本领域熟知的，包括，例如甲状腺球蛋白，白蛋白，例如人血清白蛋白，破伤风类毒素、多聚氨基酸，例如多聚(赖氨酸:谷氨酸)，流感、乙肝病毒核心蛋白，乙肝病毒重组疫苗等。这些疫苗还可包含生理上可耐受的(可接受的)稀释剂，例如水、磷酸缓冲盐水或盐水，还通常包含佐剂。诸如不完全弗氏佐剂、磷酸铝、氢氧化铝或明矾等佐剂是本领域熟知的材料。利用本文所述肽组合物，通过注射、气溶胶、口服、经皮或其它途径免疫后，宿主的免疫系统通过产生大量所需抗原的特异性HTL而对疫苗起反应，宿主对随后的感染至少部分免疫，或对慢性感染的进展至少部分耐受。

本发明肽和本发明的药物组合物及疫苗组合物可用于向哺乳动物，特别是人给药来治疗和/或预防癌症。含有本发明肽的疫苗组合物给予易患或具有癌症风险的患者以引发针对该抗原的免疫应答，从而增强患者本身的免疫应答能力。这种用量定义为“免疫原性有效剂量”。在该应用中，精确的用量再次取决于患者的总体健康状况和体重、给药方式、制剂的性质等，但范围通常是每70kg体重约1.0μg-约5000μg，更常见是每70kg体重约10μg-约500μg。

如本文所述，本发明肽在接触该肽所含表位的特异性HTL时诱导HTL免疫应答。对于本发明，肽与HTL接触的方式无关紧要。例如，肽可在体内或体外接触HTL。如果接触发生在体内，可将该肽本身给予患者，或可利用其它载体，例如编码一种或多种肽的DNA载体、编码一种或多种肽的病毒载体、脂质体等，如本文所述。

为治疗或免疫目的，还可将编码一种或多种本发明肽的核酸给予患者。不难采用许多方法将核酸递送给患者。例如，可将核酸作为“裸DNA”直接递送。该方法描述于，例如Wolff等，Science 247：1465-68(1990)以及美国专利号5,580,859和5,589,466。还可采用弹道递送给予核酸，例如美国专利号5,204,253所述。可给予仅由DNA构成的颗粒。或者，可将DNA粘附于颗粒，例如金颗粒。

还可递送与阳离子化合物，例如阳离子脂质形成复合体的核酸。脂质-介导的基因递送方法描述于，例如WO 96/18372；WO 93/24640；Mannino和Gould-Fogerite(1988)BioTechniques 6(7)：682-691；Rose的美国专利号5,279,833；WO 91/06309；和Felgner等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-14。

还可给予患者编码一种或多种本发明肽的核酸。该方法描述于，例如Wolff等，Science，247：1465-68(1990)以及美国专利号5,580,859和5,589,466。

给予编码本发明肽的核酸的优选方式利用编码多种本发明表位的小基因构建物。为产生编码所选HTL表位的DNA序列(小基因)以便在人细胞中表达，反向翻译该表位的氨基酸序列。利用人密码子使用表指导各氨基酸的密码子选择。这些编码表位的DNA序列直接相连，从而产生连续的多肽序列。为优化表达和/或免疫原性，可将额外的元件掺入该小基因设计。可以反向翻译并包括在小基因序列中的氨基酸序列的例子包括：前导(信号)序列和内质网停留信号。此外，可通过在HTL表位附近包含合成的(例如，多聚丙氨酸)或天然产生的侧接序列来改善HTL表位的MHC呈递。

通过装配编码小基因正链和负链的寡核苷酸将该小基因序列转化成DNA。采用熟知的技术，在合适条件下合成重叠的寡核苷酸(长30-100碱基)、磷酸化、纯化并退火。利用T4DNA连接酶连接诸寡核苷酸的末端。然后可将编码HTL表位多肽的该合成小基因克隆入所需表达载体。

载体中包含本领域技术人员熟知的标准调控序列以确保在靶细胞中表达。需要几种载体元件：具有下游克隆位点以供小基因插入的启动子；多核苷酸信号以便有效的转录终止；大肠杆菌复制起点；和大肠杆菌可选择标记(例如，氨苄青霉素或卡那霉素耐受性)。许多启动子可用于该目的，例如人巨细胞病毒(hCMV)启动子。合适的启动子序列可参见美国专利号5,580,859和5,589,466。

可能需要其它载体修饰以优化小基因表达和免疫原性。在一些情况中，有效基因表达需要内含子，可将一种或多种合成或天然产生的内含子掺入小基因的转录区。为增加小基因表达也可考虑纳入mRNA稳定序列。最近有人提出免疫刺激性序列(ISS或CpG)在DNA疫苗的免疫原性中起作用。如果发现能增强免疫原性，这些序列可包含在载体中、小基因编码序列外。

在一些实施方式中，可利用双顺反子表达载体，从而能产生小基因编码的表位和纳入以增强或降低免疫原性的第二蛋白。共表达时有利于增强免疫应答的蛋白质或多肽的例子包括细胞因子(例如，IL2、IL12、GM-CSF)、细胞因子-诱导分子(例如，LeIF)或共刺激分子。可将辅助(HTL)表位连接于胞内靶向信号并与CTL表位分别表达。这能将HTL表位定向于不同于CTL表位的细胞区室。如果需要，这可促进HTL表位更有效地进入II类MHC途径，从而增强CTL诱导。与CTL诱导相反，通过共表达免疫抑制分子(例如，TGF-β)特异性降低免疫应答可能有利于某些疾病。

一旦选择了表达载体，可将小基因克隆入启动子下游的多接头区域。该质粒转化入合适的大肠杆菌菌株，采用标准技术制备DNA。采用限制性作图和DNA序列分析证实小基因DNA序列的取向和以及载体中所包含的所有其它元件。保存包含正确质粒的细菌细胞作为主细胞库和工作细胞库。

通过发酵大肠杆菌产生治疗量的质粒DNA，然后纯化。利用工作细胞库的等份试样接种发酵培养基(例如奇幻肉汤(Terrific Broth))，按照熟知技术在摇瓶或生物反应器中培养至饱和。可采用标准生物分离技术，例如奎精公司(Quiagen)供应的固相阴离子-交换树脂纯化质粒DNA。如果需要，可采用凝胶电泳或其它方法将超螺旋DNA与开环和线形形式相分离。

可制备纯化的质粒DNA以便利用各种制剂注射。这些制剂中最简单的是在无菌磷酸缓冲盐水(PBS)中重建冻干的DNA。各种方法已见描述，新技术亦可用。如上所述，不难用阳离子性脂质配制核酸。此外，糖脂、促融合(fusogenic)脂质体、肽和统称为保护性、相互作用、非缩合(PINC)的化合物还可与纯化的质粒DNA形成复合体，从而影响诸如稳定性、肌肉内分散度或到特定器官或细胞类型的输送等变量。

还可采用弹道递送给予核酸，例如美国专利号5,204,253所述。可给予仅含DNA的颗粒。或者，可将DNA粘附于颗粒，例如金颗粒。

体内免疫原性是功能测试小基因DNA制剂的第二种方法。用该DNA产物免疫表达合适人MHC分子的转基因小鼠。剂量和给药途径依赖于配制方法(例如，PBS配制的DNA用肌肉内，与脂质形成复合体的DNA用腹膜内)。免疫后21-天收获脾细胞，在编码所测试各表位的肽存在下再刺激1周。

本发明疫苗组合物的实施方式包括将携带表位的肽的混合物离体给予患者血液的PBMC，或从中分离的DC。用肽脉冲DC之后和再输注入患者之前，洗涤DC以除去未结合的肽。在该实施方式中，疫苗包含肽-脉冲的DC，该DC将HLA分子中脉冲的肽表位呈递至其表面。

还可用，例如包含编码本发明表位的核酸序列的小基因转染树突细胞以引发免疫应答。树突细胞动员(mobilization)和收获后，可在体外产生疫苗组合物，从而在体外进行树突细胞的加载。

适当单倍型的转基因动物提供了优化小基因DNA的体内免疫原性的有用工具。此外，可利用动物，例如具有与人MHC分子识别的CTL表位交叉反应性的保守性HLA分子的猴测定CTL表位的人免疫原性(Bertoni等，J.Immunol.16l：4447-4455(1998))。

这种体内研究是解决疫苗开发的关键变数所必需的，这些变数通过体外使用难以评估，例如给药途径、疫苗制剂、组织生物分布以及一级和二级淋巴器官的参与。与利用高等动物，例如非人灵长类的更加繁重和昂贵的研究相比，HLA转基因小鼠因其简单且灵活而至少是初步疫苗开发研究的有吸引力的备选方案。

还利用抗原性肽离体引发HTL反应。得到的HTL细胞可用于治疗对其它常规形式治疗没反应或对本发明治疗性疫苗肽或核酸没反应的患者的肿瘤。在组织培养中将患者的(HTLp)或遗传相容的HTL前体细胞与抗原呈递细胞(APC)来源，例如树突细胞一起与合适的免疫原性肽温育以诱导针对特定抗原的离体HTL应答。适当温育时间后(通常约7-28天(1-4周))，在此期间前体细胞活化、成熟并扩增成效应细胞，将这些细胞输注回患者，它们会破坏它们的特异性靶细胞(感染的细胞或肿瘤细胞)。转染的树突细胞还可用作抗原呈递细胞。为优化产生特异性辅助T细胞的体外条件，在合适的无血清培养基中培养刺激细胞。

这些肽还可用作诊断剂。例如，可利用本发明肽测定特定个体对利用所述肽或相关肽的治疗方案的易感性，因此可用于改进现有的治疗方法或测定患病个体的预后。此外，还可利用这些肽预测哪位个体具有产生慢性感染的实质性风险。

例如，可将本发明肽用于四聚体染色试验以评估接触病原体或免疫原后，外周血单核的细胞是否存在抗原特异性CTL。HLA-四聚体复合体用于直接目测观察抗原-特异性CTL(参见，例如Ogg等，Science 279：2103-2106，1998；和Altman等，Science 174：94-96，1996)并测定外周血单核的细胞的样品中抗原-特异性CTL群体的频率。利用本发明肽的四聚体试剂可如下所示制备：在有相应HLA重链和β₂-微球蛋白存在下使得结合等位基因-特异性HLA分子或超型分子的肽重折叠，从而产生三分子复合体。生物素化该复合体的重链羧基末端，以前经工程改造加入蛋白质的位点。然后通过加入链霉亲和素诱导四聚体形成。借助荧光标记的链霉亲和素，可将该四聚体用于染色抗原-特异性细胞。然后可通过，例如流式细胞术鉴定细胞。可为诊断或预后目的采用这种分析。此外，还可利用这些肽预测具有产生慢性感染风险的个体。

如同各出版物、专利或专利申请专门且单独表明通过引用纳入本文一样，本说明书述及的所有出版物、专利和专利申请通过引用纳入本文。虽然出于清晰和理解的目的，通过说明和实例描述的本发明的一些细节，本领域普通技术人员鉴于本发明的教导会明白可作出某些改变和改进而不脱离随附权利要求的构思或范围。

实施例

材料与方法

以下材料和方法普遍适用于本文所述所有实施例。特定的材料和方法视需要披露于各实施例。

试剂：抗-IFN-γ和生物素化的抗-IFN-γ购自瑞典的马伯泰克公司(Mabtech，Sweden)。豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(PMA)、人血清白蛋白(HSA)、多克隆人IgG、破伤风毒素(TT)和伊屋诺霉素购自美国密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma，St.Louis，MO，USA)。山羊抗-人辣根过氧化物酶(HRP)-偶联抗体购自加利福尼亚州圣克鲁斯市圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)。汉克平衡盐溶液(HBSS)、RPMI-1640和磷酸缓冲盐水购自美国弗吉尼亚州赫尔登市赛尔格罗公司(Cellgro，Hernden，VA，USA)。Ficoll-Paque购自瑞典乌普萨拉市安玛西亚生物科学公司(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)。所有肽由梅约临床蛋白质化学和蛋白质组中心(Mayo Clinic ProteinChemistry and ProteomicsCore)或埃匹免疫公司(圣迭戈，加利福尼亚州)合成并如前所述(Dzuris JL，Sidney J，Appella E，Chesnut RW，Watkins DI，Sette A.Conserved MHCclassI peptide binding motif between humans and rhesus macaques(人和恒河猴之间的保守性I类MHC肽结合基序).J Immunol 2000；164：283-91)通过反相HPLC纯化至＞95％均质。采用反相HPLC和氨基酸分析、测序和/或质谱法测定肽的纯度。冻干的肽以20mg/ml悬浮在100％DMSO中，然后用PBS稀释至所需浓度。

表位预测：所用的预测程序，PIC(预测IC50)是改进的线性系数或基于矩阵的方法以便预测具有HLA-DR结合能力的肽。PIC依据肽分子上各残基独立影响结合亲和力这一假设作出预测(Sette A等，Proc Natl Acad Sci US A 1989；86：3296-300；Sette A等，JImmunol 1989；142：35-40)。该算法获得相应输入序列的预测IC50值(命名为PIC)。PIC值较低表示与HLA结合的可能性较高。该程序通过3个残基支距分析长15个氨基酸的序列进而包括整个蛋白质。

制备外周血单核的细胞(PBMC)：如所述(Disis ML等，Clin Cancer Res1999；5：1289-97)从血液分离PBMC，利用冷冻介质(RPMI，含12.5％HAS、青霉素、链霉素和2mM谷氨酰胺)冷冻保存于液氮中(20x10⁶个细胞/ml)(Disis ML等，J Immunol Methods 2005)。

HLA-DR纯化：定量试验中利用15种不同的HLA-DR分子来检测肽与可溶性HLA-DR分子的结合。选择这些HLA-DR分子以获得均衡的人群覆盖程度：DRB1*0101、DRB1*1501、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0404、DRB1*1101、DRB5*0101、DRB4*0101、DRB3*0101、DRB1*0701、DRB1*0405、DRB1*0802、DRB1*0901、DRB1*1201和DRB1*1302(24)。所用的MHC分子从EBV转化的纯合细胞系或单MHC等位基因转染的721.221、C1R或成纤维细胞系纯化。这些细胞系在补加了2mM L-谷氨酰胺、100U(100μg/ml)青霉素-链霉素溶液和10％热灭活FCS的RPMI-1640培养基中培养。采用抗体亲和层析从利用50mM Tris-HCL(pH 8.5，含1％(v/v)NP-40、150mMNaC1、5mM EDTA和2mM PMSF)制备的细胞裂解液中纯化HLA-DR分子。简言之，利用灭活琼脂糖CL4B和A蛋白琼脂糖的柱作为预柱。将裂解液流过LB3.1单克隆抗体(抗-HLA-DRA)柱来捕捉HLA-DR分子。依次用10mM Tris-HCL(pH8.0，含1％(v/v)NP-40)和含0.4％(w/v)正-辛基葡糖苷的PBS洗涤抗体柱。然后用含0.4％(w/v)正-辛基葡糖苷的0.15M NaC1配制的50mM二乙胺(pH 11.5)洗脱MHC分子。将pH降低至8.0，利用马萨诸塞州贝弗利市阿米康公司的离心30浓缩器(Centriprep 30 concentrators，Amicon，Beverly，MA)，以2000rpm浓缩洗脱液。

HLA-DR结合试验：根据以前所述放射性标记标准肽结合的抑制(Sidney J，Southwood S，Oseroff C，del Guercio MF，Grey HM，Sette A.Measurement of MHC/peptide interactions by gel filtration(通过凝胶过滤检测MHC/肽相互作用).CurrProtocols Immunol 1998；18：18.3.2-.3.9)，采用放射性配体结合抑制试验检测肽与可溶性HLA-DR分子的结合。简言之，室温下或37℃，将1-10nM放射性标记的肽与1μM-1nM纯化的HLA-DR分子在有蛋白酶抑制剂混合物存在下共同温育两天。在pH 4-pH 7的各种pH条件下进行试验。如它处所述(Sidney J，Curr Protocols Immunol 1998)，利用柠檬酸缓冲液调节试验混合物的最终pH。温育后，利用康涅狄格州梅里登市帕卡德仪器公司(PackardInstruments，Meriden，CT)的包被有LB3.1抗体的Opti平板捕捉HLA-DR/肽复合体并用帕卡德仪器公司的TopCount微量闪烁计数器测定每分钟的结合计数来测定HLA-DR-结合放射性的百分比。产生10-20％结合放射性用量的HLA-DR用于抑制试验，计算产生放射性标记肽结合的50％抑制的肽浓度。在所用条件下，检测的IC50值是真实Kd值的合理近似值。采用2-4个完全独立实验检验竞争性肽，浓度范围是30μg/mL-300pg/mL。与以前的研究一样，对特定HLA-DR分子的亲和力为1000nM或更好的肽测定为各抗原的结合剂。

酶联免疫吸附斑点测定.如(Knutson KL等.J Clin Onc 2006；24：4254-61)所述，采用检测低-频率T细胞的10-天ELIspot来测定对肿瘤抗原肽的反应活性(表1)。对肽的阳性反应测定为频率显著(p＜0.05，双尾t检验)高于无抗原对照孔的平均值并是可检测的(即，＞1∶100,000)。如以前所述(Knutson，2006)，PMA/伊屋诺霉素和CEF合并物用作肿瘤无关正对照。

ELISA.如前所述(Knutson，2006)进行ELISA。简言之，用1μg/mlIGFBP-2蛋白、200ng/ml破伤风毒素或1μg/ml BSA包被96-孔板。将200-0.2ng/ml浓度范围的人IgG加入一些孔中以便产生标准曲线。洗涤和封闭后，将1∶40稀释的人血清一式三份加入平板，室温下温育平板2小时。洗涤后，将100微升/孔的HRP(圣克鲁斯生物技术公司)作1∶2000稀释，室温下温育1小时。最终洗涤后，各孔与100μL(四甲基联苯胺)TMB底物(BD生物科学公司(BDBioscience))温育。用稀HCL终止显色，用平板读数计在450nm读数。

提供以下实施例仅是为了说明而非限制。本领域技术人员不难知道可改变或改进各种非关键参数但仍得到相似结果。

实施例1

采用已建立的基序检索算法鉴定肿瘤相关抗原衍生的保守性II类HLA-限制性肽

为鉴定可用于疫苗设计的表位，首先依据肿瘤相关抗原序列的氨基酸基序检索，采用多学科方法鉴定潜在的II类HLA基序(参见表I)。然后利用纯化的HLA分子进行高通量合成肽结合试验以测定表位肽结合的亲和力和广度。

算法基序检索：对于大多数共有II类HLA等位基因，验证了基序检索算法，集中在HLA DRB1*0101、DRB1*1501、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0404、DRB1*1101、DRB5*0101、DRB4*0101、DRB3*0101、DRB1*0701、DRB1*0405、DRB1*0802、DRB1*0901、DRB1*1201和DRB1*1302超型以获得实际上的100％人群覆盖程度。利用该基序定义扫描所选的肿瘤相关抗原序列中的基序阳性氨基酸序列。

鉴定了总共约150条各种DR超型特异性的II类-限制性肽序列(见表I)。对于各鉴定的DR抗原肽，表I列出各纯化HLA的IC₅₀(nM)。

实施例2

鉴定肿瘤疫苗包含的HTL表位

在表I所列肽中，鉴定了以小于1000nM的IC₅₀结合至少4种不同HLA的那些肽，示于表II。进一步评估表II所示肽序列结合纯化MHC分子的能力。图1-4显示表II中具有免疫原性的那些肽(以圆圈表示)。这些HTL肽是包含入肿瘤疫苗的候选对象。

采用上述预测算法鉴定候选的HLA-DR1-结合表位。靶向15种不同HLA-DR分子的结合试验显示这些表位中的10种是无选择的，结合(IC₅₀＜1000nM)至少4种不同的HLA-DR变体。采用干扰素-γELIspot试验，在48位乳腺癌或卵巢癌患者和18位健康对照中评估针对无选择结合肽的免疫力。结果显示检测到患者中针对几种肽的T细胞免疫力提高(图1-4)。

获得健康供者和患者的样品。采血时(200ml)，患者未经积极治疗至少30天。对于T细胞研究，健康供者和患者的平均年龄(±s.e.m)分别是42±11和55±2岁(p＜0.0001)。由于无血清可用，未检测T细胞研究中所用全部对照的血清中肿瘤相关抗原抗体。然而，其它对照和患者血清可用于抗体评估。其它健康供者血清购自纽约州希克斯维勒市的生物回收公司(Bioreclamation，Hicksville，NY)。

采用ELIspot试验筛选衍生自患者的PBMC对所有HLA-DR结合肽的反应活性，该试验的检测界限是约1∶100,000抗原特异性T细胞/百万个PBMC。几种肽的免疫原性数据示于图1-4。

实施例3

多表位疫苗的设计和开发

选择如上所述结合至少4种不同HLA亚型并显示免疫原性(如图1-4所示)的肽包含入多表位疫苗。表III显示表现出阳性反应的患者百分比和8种候选疫苗对特定HLA亚型的结合模式。

本领域技术人员鉴于本文内容和随附的权利要求会更加明白这些实施例及其等价方式。然而，应该知道这些实施例仅是为说明的目的，而非以任何方式限制本发明的范围。

(为显示，SEQ ID NO分别是5-27、20、28-33、19、34-57、57、58-64、64和65-192)

表I：乳腺/卵巢-衍生的肽的HLA-DR结合亲和力

Claims (39)

1.一种疫苗组合物，包含分离的HER-2/neu p885HLA-DR结合肽，还包含选自HER-2/neup83和HER-2/neu p88的分离的HER-2/neu HLA-DR结合肽。

2.如权利要求1所述的疫苗组合物，还含有选自HER-2/neu p59和HER-2/neu p422的至少一种其它HLA-DR结合肽。

3.如权利要求1所述的疫苗组合物，包含至少4种HER-2/neu HLA-DR结合肽。

4.如权利要求1所述的疫苗组合物，包含HLA-DR结合肽HER-2/neu p885、HER-2/neup88、HER-2/neu p59和HER-2/neu p422。

5.如权利要求1-4中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述组合物还包含CTL肽。

6.如权利要求1-4中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述组合物还包含脂质。

7.如权利要求1-4中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述组合物还包含脂质体。

8.如权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，至少一种所述HLA-DR结合肽连接于间隔分子。

9.如权利要求1-4或8中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述组合物还包含运载体。

10.如权利要求1-4或8中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述组合物还包含抗原呈递细胞。

11.一种分离的核酸，所述核酸分子编码HER-2/neu p885HLA-DR结合肽，并且还编码选自HER-2/neu p83和HER-2/neu p88的HLA-DR结合肽。

12.如权利要求11所述分离的核酸，还编码选自HER-2/neu p59和HER-2/neu p422的至少一种其它HLA-DR结合肽。

13.如权利要求12所述分离的核酸，其编码HLA-DR结合肽HER-2/neu p885、HER-2/neup88、HER-2/neu p59和HER-2/neu p422。

14.如权利要求11所述的分离的核酸，其特征在于，所述核酸分子还编码CTL肽。

15.如权利要求11所述分离的核酸，所述核酸分子还编码至少一种纳入以增强或降低免疫原性的蛋白质或多肽。

16.如权利要求11所述分离的核酸，所述核酸分子还编码信号序列。

17.一种包含权利要求11-16中任一项所述核酸的组合物。

18.如权利要求17所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含脂质。

19.如权利要求17所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含脂质体。

20.如权利要求17所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含运载体。

21.HER-2/neu p885HLA-DR结合肽与选自HER-2/neu p83和HER-2/neu p88的HLA-DR结合肽用于制造预防或治疗癌症的药物的用途。

22.如权利要求21所述的用途，还采用了选自HER-2/neu p59和HER-2/neu p422的至少一种其它HLA-DR结合肽。

23.如权利要求22所述的用途，其为HLA-DR结合肽HER-2/neu p885、HER-2/neu p88、HER-2/neu p59和HER-2/neu p422用于制造所述药物的用途。

24.编码HER-2/neu p885HLA-DR结合肽并编码选自HER-2/neu p83和HER-2/neu p88的HLA-DR结合肽的核酸用于制造预防或治疗癌症的药物的用途。

25.如权利要求24所述的用途，所述核酸还编码选自HER-2/neu p59和HER-2/neu p422的至少一种其它HLA-DR结合肽的核酸。

26.如权利要求25所述的用途，其为编码HLA-DR结合肽HER-2/neu p885、HER-2/neup88、HER-2/neu p59和HER-2/neu p422的核酸用于制造所述药物的用途。

27.HER-2/neu p885HLA-DR结合肽与选自HER-2/neu p83和HER-2/neu p88的HLA-DR结合肽用于制造诊断试剂的用途，所述诊断试剂用于确定患者癌症的治疗、预后或风险。

28.如权利要求27所述的用途，还采用了选自HER-2/neu p59和HER-2/neu p422的至少一种其它HLA-DR结合肽。

29.如权利要求27所述的用途，其为HLA-DR结合肽HER-2/neu p885、HER-2/neu p88、HER-2/neu p59和HER-2/neu p422用于制造所述诊断试剂的用途。

30.一种分离的多表位多核苷酸，其编码HER-2/neu p885和至少一个其它HLA-DR结合肽并包含一个或多个其它多核苷酸，所述其它HLA-DR结合肽选自HER-2/neu p83和HER-2/neu p88，所述其它多核苷酸包含各自编码又一HLA-DR结合肽的5-25种核酸，其中所述又一HLA-DR结合肽选自：SEQ ID NO:86所示HER-2/neu p59、SEQ ID NO:89所示HER-2/neu p83、SEQ ID NO:90所示HER-2/neu p88、SEQ ID NO:109所示HER-2/neu p422、SEQ ID NO:6所示CEA p24、SEQ ID NO:10所示CEA p76、SEQ ID NO:20所示CEA p176、SEQ ID NO:29所示CEAp423、SEQ ID NO:32所示CEA p488、SEQ ID NO:40所示CEA p650、SEQ ID NO:41所示CEAp653、SEQ ID NO:167所示IGFBP-2p17、SEQ ID NO:168所示IGFBP-2p22、SEQ ID NO:188所示IGFBP-2p249、SEQ ID NO:190所示IGFBP-2p293、SEQ ID NO:46所示细胞周期蛋白D1p3、SEQ ID NO:51所示细胞周期蛋白D1p49、SEQ ID NO:52所示细胞周期蛋白D1p53、SEQ IDNO:59所示细胞周期蛋白D1p98、SEQ ID NO:67所示细胞周期蛋白D1p137、SEQ ID NO:69所示细胞周期蛋白D1p145、SEQ ID NO:73所示细胞周期蛋白D1p174和SEQ ID NO:76所示细胞周期蛋白D1p199，其中所述核酸在同一读框中彼此直接或间接相连。

31.一种分离的多核苷酸，其为多表位多核苷酸，其编码HER-2/neu p885和至少一个其它HLA-DR结合肽并包含一个或多个其它多核苷酸，所述其它HLA-DR结合肽选自HER-2/neup83和HER-2/neu p88，所述其它多核苷酸包含各自编码又一HLA-DR结合肽的5-25种核酸，其中所述又一HLA-DR结合肽是表II所列表位中的任一种，其中所述核酸在同一读框中彼此直接或间接相连。

32.如权利要求31所述的分离的多核苷酸，所述的多表位多核苷酸中有一个或多个间隔核酸位于所述又一HLA-DR结合肽核酸之间。

33.如权利要求32所述的分离的多核苷酸，所述一个或多个间隔核酸各自编码1-8个氨基酸。

34.如权利要求32所述的分离的多核苷酸，所述一个或多个间隔核酸编码选自下组的氨基酸序列：包含SEQ ID NO:193所示GPGPG或由其组成的氨基酸序列，包含SEQ ID NO:194所示PGPGP或由其组成的氨基酸序列，包含SEQ ID NO:195所示(GP)n或由其组成的氨基酸序列，包含SEQ ID NO:196所示(PG)n或由其组成的氨基酸序列，包含SEQ ID NO:197所示(GP)nG或由其组成的氨基酸序列，和包含SEQ ID NO:198所示(PG)nP，其中n是0-11的整数。

35.如权利要求31-34中任一项所述的分离的多核苷酸，所述的多表位多核苷酸还包含一种或多种胞内靶向信号。

36.如权利要求35所述的分离的多核苷酸，所述一种或多种胞内靶向信号编码选自下组的一种或多种靶向序列：Igκ信号序列、组织纤维蛋白溶酶原激活剂信号序列、胰岛素信号序列、内质网信号序列、LAMP-1溶酶体靶向序列、LAMP-2溶酶体靶向序列、HLA-DM溶酶体靶向序列、HLA-DO的HLA-DM-相关序列、Ig-a胞浆区、Ii蛋白、流感基质蛋白、HCV抗原和酵母菌Ty蛋白。

37.如权利要求31所述的分离的多核苷酸，所述的多表位多核苷酸为了HTL表位加工而被优化。

38.如权利要求31所述的分离的多核苷酸，其中所述多表位多核苷酸包含至少两种癌胚抗原(CEA)HLA-DR结合肽、至少两种细胞周期蛋白D1HLA-DR结合肽、至少两种人表皮生长因子受体2(HER-2/neu)HLA-DR结合肽和至少两种胰岛素生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)HLA-DR结合肽。

39.如权利要求38所述的分离的多核苷酸，所述至少两种癌胚抗原(CEA)HLA-DR结合肽、至少两种细胞周期蛋白D1HLA-DR结合肽、至少两种人表皮生长因子受体2(HER-2/neu)HLA-DR结合肽和至少两种胰岛素生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)HLA-DR结合肽选自表II所列表位。