ES2602629T3 - Compuestos y métodos para tratar trastornos de los huesos y controlar el peso - Google Patents

Abstract

Un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos KHHLGLEEPKKLR (SEQ ID NO: 1).

Description

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DESCRIPCION

Compuestos y metodos para tratar trastornos de los huesos y controlar el peso Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un peptido, a formulaciones farmaceuticas que lo contienen, y a la utilizacion de los mismos en el control de peso, el tratamiento de trastornos de los huesos y la mejora de la reconstitucion de la medula osea.

Antecedentes de la invencion

La protema de union al factor de crecimiento de tipo insulmico 2 (IGFBP-2) es una protema de 36.000 dalton que es miembro de la familia de IGFBP. Existen seis formas de protemas de union a IGF de alta afinidad. Ademas de unirse a los factores de crecimiento de tipo insulmico I y II y de actuar como protemas de transporte, se ha demostrado que estas protemas tienen algunas acciones que son independientes de su capacidad para unirse a los IGF.

La IGFBP-2 es la segunda protema de union mas abundante en suero. Circula en los seres humanos a concentraciones que vanan entre 100 y 600 ng/ml. Las concentraciones de protema son elevadas durante la vida fetal y en el nacimiento y caen progresivamente durante la infancia y la adolescencia. Hay un ligero aumento, un incremento de aproximadamente 25%, que se produce entre los 60 y 80 anos. Las concentraciones en suero de IGFBP-2 estan reguladas por las hormonas y los nutrientes. El ayuno provoca un aumento significativo de IGFBP-2 y la alimentacion (en particular la alimentacion de protema) restaura las concentraciones a la normalidad. Las concentraciones tambien se suprimen mediante la administracion de insulina u hormona de crecimiento, y se incrementan mediante factor de crecimiento de tipo insulmico 1. Esto es probablemente debido en parte a la supresion de la hormona del crecimiento y la insulina, ambos las cuales son suprimidas por la administracion de IGF- 1.

El documento WO 2009/059011 describe el uso de peptidos para el diagnostico del cancer y entre ellos dos peptidos de 15 aminoacidos, los fragmentos de IGFBP-2. Silke et al. (Biochemistry 2005) describen largos fragmentos de IGFBP-2 por su capacidad para unirse a IGF. El documento WO 2005/014635 describe una firma biologica para las enfermedades cardiovasculares que consiste en un grupo de mas de 300 peptidos pequenos que se encuentran en el suero de pacientes que tienen una enfermedad coronaria. Se identifican dos peptidos de 9 y 10 aminoacidos con una secuencia correspondiente a un fragmento de IGFBP-2.

La escision proteolttica de IGFBP-2 da como resultado fragmentos pequenos que incluyen el dominio de union a heparina (hBd). Se ha sintetizado una molecula pequena que contiene el HBD presente en la region conectora de IGFBP-2. De los dos HBD de esta molecula, el sintetizado es unico para IGFBP-2 y no esta representado en otras IGFBP.

La presente invencion supera las deficiencias anteriores de la tecnica proporcionando peptidos de IFGBP-2 y metodos para su uso en el tratamiento de trastornos de los huesos, el control del peso y la mejora de la reconstitucion de la medula osea.

Compendio de la invencion

Un primer aspecto de la invencion es un compuesto que comprende, o consiste en el fragmento KHHLGLEEPKKLR de IGFBP-2 (en lo sucesivo referido a veces como "compuesto activo").

Un segundo aspecto de la invencion es una composicion que comprende el compuesto activo como se describe en la presente memoria, que puede estar combinado con un portador farmaceuticamente aceptable, y opcionalmente incluye al menos un agente activo adicional (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) tal como un inhibidor de la resorcion osea o un agente de control del peso.

Un aspecto adicional de la invencion es el compuesto para su uso en una terapia para inducir el deposito y la maduracion de hueso en un sujeto que tiene una afeccion osea comprometida, en una cantidad eficaz para inducir el deposito y la maduracion de hueso en el sujeto. Adicionalmente comprende la administracion simultanea de un inhibidor de la resorcion osea al sujeto en una cantidad eficaz.

Un aspecto adicional de la invencion es el compuesto para su uso en una terapia para controlar el peso corporal en un sujeto que lo necesita, en una cantidad eficaz para controlar el peso corporal. El metodo puede comprender adicionalmente la administracion concurrente al sujeto de un agente de control del peso adicional.

Otro aspecto de la invencion es el compuesto para su uso en una terapia para la mejora de la reconstitucion de la medula osea en un sujeto que lo necesite, en una cantidad eficaz para mejorar la reconstitucion de medula osea.

La presente invencion se explica con mayor detalle a continuacion.

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Breve descripcion de los dibujos

Figura 1. El dominio de union a heparina de IGFBP2 mejora la osteoblastogenesis in vitro. a. Se llevo a cabo la tincion de Von Kossa utilizando tibia de raton macho Igfbp2+I+ y Igfbp2-' de 8 semanas de edad. b. Se cosecharon osteoblastos de boveda craneal (COB) de raton macho Igfbp2+I+ y Igfbp2-I~ de 7 dfas edad, y se trataron con medios osteogenicos en presencia de FCS al 2,5%. El dfa 7, se llevo a cabo una tincion con fosfatasa alcalina (ALP). c y d. Los COB y celulas estromales de medula osea (BMSC) de raton Igfbp2-I~ fueron tratados con medios osteogenicos con peptido de dominio de union a heparina pegilado (PEG-HBD) en presencia de FCS a 10%. Se realizaron la tincion con ALP (dfa 7) y la tincion con Rojo Alizarina (dfa 14) (c). Se aislo el ARN el dfa 14 de las BMSC y se analizo la expresion de ALP, osteocalcina (OC) y Runx2 por medio de PCR en tiempo real. Las figuras representan al menos 3 experimentos independientes (n = 3). La diferencia estadfstica se analizo mediante el test de la t de Student; p <0,05.

Figura 2. El dominio de union a heparina de IGFBP2 mejora la expansion del periostio de los metacarpianos ex vivo. Se recogieron los metacarpianos de un raton macho de 1 dfa, y se trataron con medios osteogenicos con IGFBP2 (200 ng/ml) o el peptido del dominio de union a heparina (HBD-peptido) (2 pg/ml) en presencia o ausencia de IGF-1 (20 ng/ml) durante 10 dfas. Los huesos fueron marcados con calcema (500 ng/ml) y el area que incorporaba la calcema se visualizo (a) y se cuantifico la dimension longitudinal del area que habfa incorporado la calcema (b). Se realizo una doble tincion con azul Alcian y de Von Kossa (c) y se cuantificaron la longitud y la anchura de los metacarpianos (d). La diferencia estadfstica se analizo mediante ANOVA seguido de un test post-hoc de Bonferroni. Las figuras mostradas representan al menos 3 experimentos independientes. Los valores se expresan como la media ± ETM (n = 3-4). a; <0,05 vs PBS, b; <0,01 vs PBS, c; <0,001 vs PBS, d; <0,01 vs HBD.e; <0,05 vs IGF-1 ,f; <0,05 vs HBD.

Figura 3. El dominio de union a heparina de IGFBP5 no muestra ningun efecto sobre la osteoblastogenesis in vitro o la expansion del periostio de metacarpianos ex vivo. a. Se recogieron osteoblastos primarios de boveda craneal de raton macho Igfbp2-I~ y se trataron con medios osteogenicos con o sin el dominio de union a heparina de IGFBP-5 (HBD-BP5) (2 pg/ml). La osteoblastogenesis se evaluo por medio de tincion con Rojo Alizarina. b y c. Se recogieron los metacarpianos de un raton macho de 1 dfa, y se trataron con medios osteogenicos con o sin HBD- BP5 (2 pg/ml) durante 10 dfas. Los huesos fueron marcados con calcema (500 ng/ml) y el area que habfa incorporado la calcema se visualizo (a). Se cuantifico la dimension longitudinal del area que habfa incorporado la calcema (b). Se realizo una doble tincion con azul Alcian y de Von Kossa (c) y se cuantificaron la longitud y la anchura de los metacarpianos (d). Las Figuras mostradas representan al menos 3 experimentos independientes. Los valores se expresan como la media ± ETM. La diferencia estadfstica se analizo por medio del test de la t de Student (n = 3-4).

Figura 4. El dominio de union a heparina de IGFBP2 rescata parcialmente el fenotipo de osteopenia de ratones Igfbp2-I~. Se trataron ratones Igfbp2-I~ con PBS o dominio de union a heparina pegilado (PEG-HBD) de 6 a 9 semanas de edad. a. Imagen de MicroCT del femur distal. b. Se muestran los parametros de un estudio de flexion de tres puntos. c. Se determinaron el numero de osteoblastos/penmetro del hueso (NobBPm), la superficie de osteoblastos/superficie del hueso (ObSBS), el numero de osteoclastos/parametro oseo (NocBPm) y la superficie de erosion/superficie del hueso (ES/BS) por histomorfometna (n = 5). d. Se conto el numero de adipocitos (N.Ad) inmediatamente proximos a la placa de crecimiento distal del femur y se normalizo para el area total (T.Ar) (n = 6). e. Se trataron osteoblastos de boveda craneal Igfbp2-' con PBS o PEG-HBD durante 24 horas en medio libre de suero. Se analizo la expresion de Pparg por medio de PCR en tiempo real (n = 3). f. Se analizaron los niveles en suero de Trap5b por medio de ELISA (immunodiagnostics Inc.) (n = 6-9). g y h. Se trataron COB Igfbp2-I~ con o sin PEG-HBD durante 2 horas (h). Se cultivaron BMSC Igfbp2-I~ con medio osteogenico con PBS o PEG-HBD durante 2 semanas (i). Se analizo la expresion de Opg y Rankl por medio de PCR en tiempo real (n = 3). Las figuras mostradas representan al menos 3 experimentos independientes. Los valores se expresan como la media ± ETM. La diferencia estadfstica se analizo por el test de la t de Student*; <0,001, **; <0,01, f; <0,05,ft; <0,06.

Figura 5. El dominio de union a heparina de IGFBP2 suprime la expresion de PTEN. a y b. Se aislaron osteoblastos de boveda craneal Igfbp2-' (COB), y se trataron con PBS, IGFBP-2 o peptido de dominio de union a heparina pegilado (PEG-HBD) en MEMa que contema BSA al 0,1% durante la noche. Se recogio el producto lisado de celulas enteras y se analizo la expresion de PTEN y a-actina por medio de analisis de transferencia Western. Los niveles de expresion de PTEN se cuantificaron mediante la normalizacion a los niveles de expresion de a-actina. c y d. Los COB preincubados con PBS, IGFBP-2 o PEG-HBD durante la noche se trataron con IGF-1 (100 ng/ml) durante 15 minutos. Se recogio el producto lisado de celulas enteras y se analizo la expresion de pSer473-Akt y Akt por medio de analisis de transferencia Western. Los niveles de expresion de pSer473-Akt se cuantificaron mediante la normalizacion a los niveles de expresion de Akt. Las figuras mostradas representan al menos 3 experimentos independientes. Los valores se expresan como la media ± ETM (n = 3-4). La diferencia estadfstica se analizo mediante el test de la t de Student. *; <0,001, **; <0,01,t; <0,05.

Figura 6. El dominio de union a heparina de IGFBP-2 estimula la acumulacion citosolica y la fosforilacion de Ser552 de p-catenina por IGF-1. a. Se privaron de suero celulas MC3T3-E1 durante la noche y se trataron con IGF-1

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a la concentracion indicada durante 6 horas. Se analizo la expresion de p-catenina y a-actina mediante analisis de transferencia Western con la fraccion de membrana y la citosolica. b. Se privaron de suero osteoblastos de boveda craneal Igfbp2--- (COB) durante la noche con PBS o peptido de dominio de union a heparina pegilado (PEG-HBD) y despues se trataron con IGF-1 (100 ng/ml) durante 6 horas. Se analizo la expresion de la p-catenina por medio de analisis de transferencia Western con la fraccion citosolica y se cuantifico mediante la normalizacion a a-actina (n = 3). c. Se privaron de suero las celulas MC3T3-E1 durante la noche y se trataron con IGF-1 (100 ng/ml) durante 15 min. Se analizo la expresion de pSer552-p-catenina, p-catenina, pSer473-Akt, Akt y a-actina mediante analisis de transferencia de Western con productos lisados de celulas enteras. d. Se privaron de suero COB Igfbp2--- durante la noche con PBS o PEG-HBD y luego se trataron con IGF-1 (100 ng/ml) durante 15 min. Se analizo la expresion de pSer552-p-catenina por medio de analisis de transferencia de Western con productos lisados de celulas enteras y se cuantifico mediante la normalizacion a 13-catenina (n = 3). Las figuras mostradas representan al menos 3 experimentos independientes. Los valores se expresan como la media ± ETM. La diferencia estadfstica se analizo mediante el test de la t de Student. *; <0,001, **; <0,01,f; <0,05.

Figura 7. El peptido de control para el peptido de dominio de union a heparina no tiene ningun efecto anabolico sobre la osteoblastogenesis in vitro. Se cultivaron osteoblastos de boveda craneal (COB) Igfbp2--- con medio osteogenico con PBS, peptido de control (2 jg/ml) o peptido de dominio de union a heparina (HBD-peptido) (2 |jg/ml). Se evaluo la osteoblastogenesis portincion con Rojo Alizarina.

Figura 8. El peptido de control para el peptido de dominio de union a heparina no tiene ningun efecto anabolico sobre los metacarpianos ex vivo. Se recogieron los metacarpianos de raton macho de 1 dfa Igfbp2+I+, y se cultivaron en DMEM (1 g/L de glucosa) que contema p-glicerofosfato 1 mM y 50 jg/mL de acido ascorbico. Se anadieron PBS o peptido de control (2 jg/ml) al medio. El dfa 10, los huesos se trataron con 500 ng/ml de calcema durante dos horas. Se visualizo el area que habfa incorporado la calcema (b) y se cuantifico la dimension longitudinal de la zona incorporada (c). Se fijaron los metacarpianos con PFA al 4% y se sometieron a doble tincion con Azul Alcian y de von Kossa (d). Se cuantificaron la longitud y anchura de los metacarpianos (e). Los valores se expresaron como la media ± ETM (n = 3). La significacion estadfstica se analizo mediante el test de la t de Student. ns; no significativo.

Figura 9. El peptido de control para el peptido de dominio de union a heparina no suprime la expresion de PTEN en osteoblastos Igfbp2+I+ de la boveda craneal. Se trataron osteoblastos Igfbp2+I+ de boveda craneal con PBS, peptido de control, o peptido de dominio de union a heparina (peptido HBD) durante la noche, y se recogio el producto lisado de celulas enteras. Se analizo la expresion de PTEN mediante analisis de transferencia Western (a), y se realizo un analisis cuantitativo (b). Los valores se expresaron como la media ± ETM (n = 3). La significacion estadfstica se analizo por ANOVA seguido del test post-hoc de Bonferroni. a; p <0,01 vs. PBS, b; p <0,01 vs. peptido de control.

Figura 10. El HBD de IGFBP-2 aumento la proliferacion celular de los osteoblastos y las celulas estromales de la medula osea en comparacion con IGFBP-2 (BP2) de longitud completa (FL) y peptido de control y como se observa por el aumento de la fosfatasa alcalina y la tincion con rojo de alizarina, respectivamente.

Figura 11. El HBD de IGBP-2 rescato el fenotipo de baja masa osea de ratones Igfbp2-' in vivo, como se muestra por medio del analisis de pCT.

Figura 12. HBD revirtio el aumento el fenotipo hematopoyetico linfoide y mieloide de ratones Igfbp2---.

Figura 13. En trasplantes de medula osea por re-poblacion competitiva, las celulas del donante de medula osea Igfbp2--- repoblaron la medula osea de los receptores de la misma cepa con una eficacia 30% menor que las celulas de donante Igfbp2+I+.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se explica con mayor detalle a continuacion.

La presente invencion se basa en el descubrimiento de que los peptidos de IGFBP-2, (p. ej., el dominio de union a heparina (HBD)) se pueden emplear en metodos de tratamiento de trastornos de los huesos, metodos de control del peso y metodos para mejorar la reconstitucion de medula osea.

Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la presente invencion proporciona el compuesto para su uso en la terapia para la mejora de la formacion de hueso (es decir, aumentando la cantidad de hueso nuevo que se deposita) y la inhibicion de la resorcion osea (es decir, reduciendo la cantidad de hueso que se disuelve) simultaneamente en un sujeto que lo necesite, que comprende la administracion al sujeto de un compuesto activo de esta invencion en una cantidad eficaz para mejorar la formacion de hueso e inhibir la resorcion osea simultaneamente en dicho sujeto. Los ejemplos no limitantes de los sujetos para los cuales estana indicado dicho tratamiento y/o sena beneficioso, incluyen mujeres (p. ej., despues de la menopausia; premenopausicas) con osteoporosis o baja masa osea, hombres con osteoporosis o baja masa osea, sujetos con una fractura en curacion, sujetos sometidos a inmovilizacion prolongada, sujetos que han sido o estan inmovilizados durante un penodo prolongado, sujetos propensos a sufrir o experimentar una inmovilizacion prolongada, sujetos con deficiencia de estrogenos, etc., como

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se conoce en la tecnica.

Tambien se proporciona en la presente memoria el compuesto para su uso en terapia para inducir el deposito y la maduracion de hueso en un sujeto que lo necesite (p. ej., un sujeto que tiene una afeccion osea comprometida), que comprende la administracion al sujeto de un compuesto activo de esta invencion en una cantidad eficaz para inducir el deposito y la maduracion de hueso en el sujeto. Los metodos de esta invencion pueden comprender ademas al mismo tiempo la administracion de un inhibidor de la resorcion osea al sujeto en una cantidad eficaz.

En algunas realizaciones, una afeccion osea comprometida se encuentra en un sitio diana del sujeto. El sitio puede ser un espacio intervertebral, una articulacion facetaria, un sitio de una fractura osea, huesos de la boca, la barbilla y la mandfbula, o un lugar de implantacion.

Tambien se proporciona en la presente memoria el compuesto para su uso en la terapia para la mejora de la reconstitucion de la medula osea en un sujeto que lo necesite, que comprende la administracion a dicho sujeto de un compuesto activo de esta invencion en una cantidad eficaz para mejorar la reconstitucion de la medula osea (es decir, la restauracion (p. ej., parcialmente o totalmente) de las celulas de la medula osea en un sujeto, que puede ser, por ejemplo, un sujeto que ha recibido quimioterapia, radiacion u otros tratamientos que agotan las celulas de la medula osea. Por ejemplo, un sujeto sometido a quimioterapia con o sin radiacion se beneficiana de un restablecimiento mas rapido de las celulas de la medula osea con el fin de prevenir las infecciones oportunistas. Un objeto de estos metodos tambien puede ser un sujeto que tiene o se sospecha que tiene un trastorno hematologico (p. ej., anemia aplasica; mielodisplasia) que agota las celulas de la medula osea. Tal mejora o potenciacion o aumento de la reconstitucion de medula osea es en comparacion con un sujeto al que no se ha administrado el compuesto activo.

La administracion del compuesto o la composicion de esta invencion se puede realizar por cualquier via adecuada, incluyendo la inyeccion intratecal, subcutanea, cutanea, oral, intravenosa, intraperitoneal, inyeccion intramuscular, en un implante, en una matriz, en un gel, o cualquier combinacion de los mismos.

Una afeccion osea que puede sertratada con el compuesto de esta invencion puede ser uno o mas de huesos rotos, defectos oseos, trasplante de hueso, injertos de hueso, cancer de hueso, protesis articulares, reparacion de las articulaciones, fusion, reparacion de las facetas, degeneracion osea, implantes y reparaciones dentales, deficits de medula osea y otras afecciones asociadas con el hueso y el tejido oseo. Los defectos oseos pueden ser un hueco, una deformacion y/o una fractura sin union en un hueso.

La degeneracion osea puede ser debida a la osteopenia u osteoporosis (p. ej., el paciente esta afectado por osteoporosis geriatrica o senil, por osteoporosis postmenopausica, etc.), o ser debida a enanismo.

Las protesis articulares que se pueden tratar incluyen vertebra, rodilla, cadera, tarso, falange, codo, tobillo y/u otras articulaciones o protesis de las mismas. Las reparaciones de articulaciones incluyen, pero no se limitan a, vertebra, rodilla, cadera, tarso, falange, codo, tobillo, y las reparaciones de la articulacion sacroilfaca.

Un aspecto adicional de la invencion es el compuesto para su uso en la terapia para el control del peso corporal en un sujeto que lo necesite, que comprende la administracion al sujeto de un compuesto activo como se describe en la presente memoria en una cantidad eficaz para controlar el peso corporal. El metodo puede comprender adicionalmente al mismo tiempo la administracion al sujeto de un agente de control del peso adicional.

En algunas realizaciones, el sujeto es obeso.

En algunas realizaciones, el compuesto para su uso en terapia se administra en una cantidad eficaz para reducir el aumento de peso o inducir la perdida de peso (o concretamente la perdida de grasa) en el sujeto.

En algunas realizaciones, el compuesto para su uso en terapia se administra en una cantidad eficaz para reducir el mdice de masa corporal del sujeto.

En algunas realizaciones, el sujeto tiene un mdice de masa corporal de 25 o 30 kg/m2 o superior.

En algunas realizaciones, el compuesto para su uso en terapia se administra durante un penodo de al menos 16 o 24 semanas, y/o hasta que el individuo ha alcanzado al menos una perdida de peso de 5% o el mdice de masa corporal del individuo se reduce a menos de 25 kg/m2.

En algunas realizaciones, el compuesto activo se utiliza en la terapia para ser administro en una cantidad eficaz para inhibir la diferenciacion de las celulas de grasa (p. ej., la inhibicion de la diferenciacion de celulas precursoras de grasa en adipocitos maduros) en el sujeto.

En algunas realizaciones el compuesto para su uso en terapia comprende adicionalmente la administracion concurrente al sujeto de una agente de control del peso adicional.

La dosificacion terapeuticamente eficaz de cualquier compuesto activo espedfico de esta invencion variara de compuesto a compuesto, y de paciente a paciente, y dependera, entre otras cosas, del efecto o resultado que se

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deba conseguir, del estado del paciente y de la ruta de suministro. En algunas realizaciones, se puede utilizar una dosis de aproximadamente 0,001 (es dedr, 1 pg/kg), 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1,0 mg/kg, hasta aproximadamente 30, 40 o 50 mg/kg (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 mg/kg), o mas.

A. Definiciones.

"Sujetos" segun se utiliza en la presente memoria son generalmente sujetos humanos e incluyen, pero no se limitan a, sujetos post-menopausicos. Los sujetos pueden ser machos o hembras, y pueden ser de cualquier raza o grupo etnico, incluyendo, pero no limitados a, Europeos, Afro-Americanos, Africanos, Asiaticos, Hispanos, Indios, etc. Los sujetos pueden ser de cualquier edad, incluyendo recien nacidos, neonatos, lactantes, ninos, adolescentes, adultos y geriatricos. En algunas realizaciones, los sujetos son sujetos de sexo femenino postmenopausicos, o sujetos que sufren osteoporosis senil. Los sujetos tambien pueden incluir sujetos animales, en particular sujetos mairnferos, tales como caninos, felinos, bovinos, caprinos, equinos, ovinos, porcinos, roedores (p. ej. ratas y ratones), lagomorfos, primates (incluyendo primates no humanos), etc., para la medicina veterinaria o para propositos de desarrollo de farmacos farmaceuticos.

"Tratar", "tratando" o "tratamiento" segun se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier tipo de tratamiento que confiere un beneficio a un paciente aquejado de una enfermedad, incluyendo la mejora en la condicion del paciente (p. ej., en uno o mas smtomas), el retraso en la progresion de la enfermedad, etc.

"Farmaceuticamente aceptable" segun se utiliza en la presente memoria significa que el compuesto o composicion son adecuados para la administracion a un sujeto para lograr los tratamientos descritos en la presente memoria, sin efectos secundarios indebidamente perjudiciales teniendo en cuenta la gravedad de la enfermedad y la necesidad de tratamiento.

"Administrando concurrentemente" o "administrar concurrentemente" segun se utiliza en la presente memoria significa que los dos o mas compuestos o composiciones se administran lo suficientemente proximos en el tiempo como para producir un efecto combinado (es decir, concurrentemente puede ser simultaneamente, o puede haber dos o mas eventos que ocurren dentro de un corto penodo de tiempo antes o despues del otro, p.ej., sucesivamente). La administracion concurrente simultanea se puede llevar a cabo mezclando los compuestos antes de la administracion, o administrando los compuestos en el mismo punto temporal pero en diferentes sitios anatomicos y/o mediante el uso de diferentes vfas de administracion.

"Inhibidor de la resorcion osea", segun se utiliza en la presente memoria puede ser cualquier inhibidor de la resorcion osea adecuado, incluyendo pero no limitado a un bisfosfonato, un modulador selectivo del receptor de estrogeno, calcitonina, un analogo de la vitamina D, y una sal de calcio. Vease, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Num. 7.507.715. Se conocen varios de estos compuestos. Veanse, p. ej., las Patentes de los Estados Unidos Nums. 7.018.982; 6.723.696; 6.284.730; y 5.039.669.

"Agente de control del peso", segun se utiliza en la presente memoria incluye cualquier agente activo de control del peso adicional, incluyendo pero no limitado a los supresores del apetito tales como sibutramina, fentermina, dietilpropion, fendimetrazina, etc.; inhibidores de lipasa tales como orilstat; antidepresivos tales como bupropion; agentes anticonvulsivos como topiramato, zonisamida, y metformina, etc.

Los "poli(oxidos de alquileno)" segun se utilizan en la presente memoria son conocidos (vease, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Num. 7.462.687) e incluyen poli(etilenglicol) o "PEG". Otros ejemplos pueden contener heteroatomos tales como S o N, y son tfpicamente poli(oxidos de alquileno) lineales, tales como: 0- (CH2CH2O)x-, - 0-C(0)CH2-0-(CH2CH20)x-CH2C(0)-0-, -NRCH2CH22-0-(CH2CH2o)x-CH2CH2NR-, y SHCH2CH2-O- (CH2CH20)x- CH2CH2SH-, en donde R es H o alquilo inferior (preferiblemente metilo), y x es un numero entero que proporciona o produce un peso molecular promedio en numero total para la molecula de aproximadamente 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 15.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000,

90.000 o 100.000 dalton o mas.

B. Compuestos activos.

El compuesto activo de esta invencion es el peptido KHHLGLEEPKKLR (SEQ ID NO: 1)

Otros ejemplos de compuestos de la presente invencion incluyen el peptido, con un peso molecular de 10.000 a

30.000 de radical de poli(etilenglicol) (o "PEG") acoplado a cualquiera de los extremos N o C del mismo.

"Polialquilenglicol" se refiere a polfmeros de polialquilenglicol lineales o ramificados, incluyendo, pero no limitados a, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol (PPG), y el polibutilenglicol (PBG), asf como co-polfmeros de PEG, PPG y PBG en cualquier combinacion, e incluye monoalquileter de polialquilenglicol. Por lo tanto, en diversas realizaciones de esta invencion, el polialquilenglicol de las composiciones de esta invencion puede ser, pero no se limita a, polietilenglicol, polipropilenglicol, polibutilenglicol, y cualquier combinacion de los mismos.

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En ciertas realizaciones, el polialquilenglicol de la composicion es polietilenglicol o "PEG". El termino "subunidad de PEG" se refiere a una unidad de polietilenglicol solo, es dedr, --(CH2CH2O)--.

En algunas realizaciones, el polialquilenglicol (p. ej., PEG) puede ser no polidisperso, monodisperso, sustancialmente monodisperso, puramente monodisperso, o sustancialmente puramente monodisperso.

"Monodisperso" se usa para describir una mezcla de compuestos en donde aproximadamente 100 por ciento de los compuestos en la mezcla tienen el mismo peso molecular.

"Sustancialmente monodisperso" se usa para describir una mezcla de compuestos en donde al menos aproximadamente 95 por ciento de los compuestos de la mezcla tienen el mismo peso molecular.

"Puramente monodisperso" se usa para describir una mezcla de compuestos en los que aproximadamente 100 por cien de los compuestos de la mezcla tienen el mismo peso molecular y tienen la misma estructura molecular. De este modo, una mezcla puramente monodispersa es una mezcla monodispersa, pero una mezcla monodispersa no es necesariamente una mezcla puramente monodispersa.

"Sustancialmente puramente monodisperso" se utiliza para describir una mezcla de compuestos en donde al menos aproximadamente 95 por ciento de los compuestos de la mezcla tienen el mismo peso molecular y tienen la misma estructura molecular. Por lo tanto, una mezcla sustancialmente puramente monodispersa es una mezcla sustancialmente monodispersa, pero una mezcla sustancialmente monodispersa no es necesariamente una mezcla sustancialmente puramente monodispersa.

C. Formulaciones farmaceuticas.

Los compuestos activos descritos anteriormente se pueden formular para la administracion en un portador farmaceutico de acuerdo con tecnicas conocidas. Vease, p. ej., Remington, The Science And Practice of Pharmacy (9a Ed. 1995). En la fabricacion de una formulacion farmaceutica de acuerdo con la invencion, el compuesto activo (incluyendo las sales fisiologicamente aceptables del mismo) se mezcla tipicamente, entre otras cosas, con un portador aceptable. El portador debe, por supuesto, ser aceptable en el sentido de ser compatible con cualquier otro ingrediente de la formulacion y no debe ser perjudicial para el paciente. El portador puede ser un solido o un lfquido, o ambos, y se formula preferiblemente con el compuesto en forma de una formulacion de dosis unitaria, por ejemplo, un comprimido, que puede contener de 0,01 o 0,5% a 95% o 99% en peso del compuesto activo. Se pueden incorporar uno o mas compuestos activos a las formulaciones de la invencion, que se pueden preparar por cualquiera de las tecnicas farmaceuticas bien conocidas que comprenden mezclar los componentes, incluyendo opcionalmente uno o mas ingredientes accesorios.

Las formulaciones de la invencion incluyen aquellas adecuadas para la administracion oral, rectal, topica, bucal (p. ej., sublingual), vaginal, parenteral (p. ej., subcutanea, intramuscular, intradermica o intravenosa), topica (es decir., tanto la piel como las superficies mucosas, incluyendo superficies de las vfas respiratorias) y la administracion transdermica, aunque la via mas adecuada en cualquier caso dado dependera de la naturaleza y gravedad de la afeccion que se este tratando y de la naturaleza del compuesto activo particular que se este utilizando.

Las formulaciones adecuadas para la administracion oral se pueden presentar en unidades discretas, tales como capsulas, sellos, grageas o comprimidos, conteniendo cada uno una cantidad predeterminada del compuesto activo; en forma de polvo o granulos; en forma de una solucion o una suspension en un lfquido acuoso o no acuoso; o en forma de una emulsion de aceite-en-agua o de agua-en-aceite. Tales formulaciones se pueden preparar por cualquier metodo farmaceutico adecuado que incluye la etapa de asociar el compuesto activo y un portador adecuado (que puede contener uno o mas ingredientes accesorios como se ha senalado mas arriba). En general, las formulaciones de la invencion se preparan mezclando uniforme e mtimamente el compuesto activo con un portador lfquido o solido finamente dividido, o ambos, y luego, si es necesario, conformando la mezcla resultante. Por ejemplo, se puede preparar un comprimido comprimiendo o moldeando un polvo o granulos que contienen el compuesto activo, opcionalmente con uno o mas ingredientes accesorios. Los comprimidos se pueden preparar comprimiendo, en una maquina adecuada, el compuesto en una forma de flujo libre, tal como un polvo o granulos opcionalmente mezclados con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, y/o uno o varios agentes activos/dispersantes. Los comprimidos moldeados se pueden elaborar por moldeo, en una maquina adecuada, el compuesto en polvo humedecido con un aglutinante lfquido inerte.

Las formulaciones adecuadas para la administracion bucal (sublingual) incluyen grageas que comprenden el compuesto activo en una base aromatizada, normalmente sacarosa y goma arabiga o tragacanto; y pastillas que comprenden el compuesto en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y acacia.

Las formulaciones de la presente invencion adecuadas para administracion parenteral comprenden soluciones inyectables acuosas y no acuosas esteriles del compuesto o los compuestos activos, cuyas preparaciones son preferiblemente isotonicas con la sangre del receptor previsto. Estas preparaciones pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostaticos y solutos que hacen la formulacion isotonica con la sangre del receptor previsto. Las suspensiones acuosas y no acuosas esteriles pueden incluir agentes de suspension y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitarias o de multiples dosis, por ejemplo ampollas

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selladas y viales, y se pueden almacenar en un estado secado por congelacion (liofilizado) que requiere solo la adicion del portador Kquido esteril, por ejemplo, solucion salina o agua para inyectables inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones para inyeccion extemporanea se pueden preparar a partir de polvos esteriles, granulos y comprimidos del tipo descrito previamente. Por ejemplo, en un aspecto de la presente invencion, se proporciona una composicion inyectable, estable, esteril que comprende uno o varios compuestos activos, o una sal de los mismos, en una forma de dosificacion unitaria en un recipiente sellado. El compuesto o la sal se proporcionan en forma de un producto liofilizado que es susceptible de ser reconstituido con un portador adecuado farmaceuticamente aceptable para formar una composicion lfquida adecuada para su inyeccion en un sujeto. La forma de dosificacion unitaria tipicamente comprende de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 10 gramos del compuesto o la sal. Cuando el compuesto o la sal son sustancialmente insolubles en agua, se puede emplear una cantidad suficiente de agente emulsionante que sea fisiologicamente aceptable en cantidad suficiente para emulsionar el compuesto o sal en un portador acuoso. Uno de tales agentes emulsionantes utiles es la fosfatidilcolina.

Las formulaciones adecuadas para la administracion rectal se presentan preferiblemente en forma de supositorios de dosis unitaria. Estos se pueden preparar mezclando el compuesto activo con uno o mas portadores solidos convencionales, por ejemplo, manteca de cacao, y luego conformando la mezcla resultante.

Las formulaciones adecuadas para la aplicacion topica a la piel adoptan preferiblemente la forma de un unguento, crema, locion, pasta, gel, pulverizacion, aerosol, o aceite. Los portadores que se pueden utilizar incluyen vaselina, lanolina, polietilenglicoles, alcoholes, potenciadores transdermicos, y combinaciones de dos o mas de los mismos.

Las formulaciones adecuadas para la administracion transdermica se pueden presentar en forma de parches discretos adaptados para permanecer en contacto mtimo con la epidermis del receptor durante un penodo prolongado de tiempo. Las formulaciones adecuadas para la administracion transdermica tambien se pueden suministrar por medio de iontoforesis (vease, por ejemplo, Pharmaceutical Research 3 (6):318 (1986)) y tfpicamente adoptan la forma de una solucion acuosa opcionalmente tamponada del compuesto activo. Las formulaciones adecuadas comprenden tampon citrato o bis\tris (pH 6) o etanol/agua y contienen ingrediente activo de 0,1 a 0,2 M.

Adicionalmente, la presente invencion proporciona formulaciones liposomales de los compuestos descritos en la presente memoria y sus sales. La tecnologfa para formar suspensiones liposomales es bien conocida en la tecnica. Cuando el compuesto o sal del mismo con una sal soluble en agua, utilizando la tecnologfa de liposomas convencional, los mismos se pueden incorporar en vesfculas lipfdicas. En tal caso, debido a la solubilidad en agua del compuesto o la sal, el compuesto o la sal seran arrastrados sustancialmente dentro del centro hidrofilo o el nucleo de los liposomas. La capa lipfdica empleada puede ser de cualquier composicion convencional y puede contener colesterol o puede estar libre de colesterol. Cuando el compuesto o la sal de interes son insolubles en agua, de nuevo empleando la tecnologfa de formacion de liposomas convencional, la sal puede ser arrastrada sustancialmente dentro de la bicapa lipfdica hidrofoba que forma la estructura del liposoma. En cualquier caso, los liposomas que se producen pueden tener un tamano reducido, a traves de la utilizacion de tecnicas de sonicacion y homogeneizacion convencionales.

Por supuesto, las formulaciones liposomales que contienen los compuestos descritos en la presente memoria o las sales de los mismos, se pueden liofilizar para producir un producto liofilizado que puede reconstituirse con un portador farmaceuticamente aceptable, tal como agua, para regenerar una suspension liposomal.

Se pueden preparar otras composiciones farmaceuticas a partir de los compuestos insolubles en agua descritos en la presente memoria, o de las sales de los mismos, tales como emulsiones de base acuosa. En tal caso, la composicion contendra una cantidad suficiente de agente emulsionante farmaceuticamente aceptable para emulsionar la cantidad deseada del compuesto o la sal del mismo. Los agentes emulsionantes particularmente utiles incluyen fosfatidilcolinas y lecitina.

Ademas del compuesto o los compuestos activos, las composiciones farmaceuticas pueden contener otros aditivos, tales como aditivos de ajuste del pH. En particular, los agentes de ajuste del pH utiles incluyen acidos, tales como acido clortudrico, bases o tampones, tales como lactato de sodio, acetato de sodio, fosfato de sodio, citrato de sodio, borato de sodio, o gluconato de sodio. Ademas, las composiciones pueden contener conservantes microbianos. Los conservantes microbianos utiles incluyen metilparabeno, propilparabeno, y alcohol bendlico. El conservante microbiano se emplea tfpicamente cuando la formulacion se coloca en un vial disenado para su uso de multiples dosis. Por supuesto, como se indica, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion se pueden liofilizar utilizando mecanismos bien conocidos en la tecnica.

La presente invencion se ilustra en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Los estudios iniciales demostraron que cuando algunos tipos de celulas eran expuestas a IGFBP-2, se podfa mejorar la capacidad de IGF-1 para estimular la smtesis de ADN y el crecimiento. En contraste otros laboratorios demostraron que las altas concentraciones de la protema nativa a menudo inhiben la capacidad de IGF-1 para estimular el crecimiento.

Los estudios descritos en el presente documento se han centrado en las acciones independientes de IGF de IGFBP- 2 que son independientes de su capacidad para inhibir la union de IGF-1 a su receptor e inhibir el crecimiento. Espedficamente se ha demostrado en ratones en los que se ha suprimido el gen de la IGFBP-2 que presentaban una reduccion del recambio oseo como se refleja por el examen histologico de los huesos siguiente a un marcaje 5 con tetraciclina y que el espesor cortical y el grosor trabecular tambien se redujeron como se evidencia por el barrido DEXA, el barrido PIXI y el analisis microCT. Una explicacion molecular de este fenomeno fue proporcionada por la observacion de que tanto las celulas musculares de la musclatura lisa aortica como de hueso retiradas de estos animales mostraban altas concentraciones del inhibidor del crecimiento PTEN y que la adicion exogena de IGFBP-2 o del peptido de 13 aminoacidos descrito en la presente memoria podna suprimir las concentraciones de 10 PTEN, lo que conduce a la activacion mejorada de la via de la quinasa PI-3/AKT que es necesaria para la estimulacion del crecimiento. Otros trabajadores han sugerido tambien que IGFBP-2 puede estimular las celulas madre. Lodish y Zhang demostraron que IGFBP-2 era un potente factor de crecimiento de celulas madre y que podna estimular la reconstitucion de celulas madre hematopoyeticas despues de la ablacion de la medula osea con la terapia de radiacion. Estos investigadores no investigaron si los fragmentos de IGFBP-2 o cualquier porcion de la 15 protema teman esta propiedad.

Ejemplo 1

Secuencias peptfdicas

La secuencia de aminoacidos de un peptido de 13 aminoacidos de la invencion es la siguiente:

KHHLGLEEPKKLR (SEQ ID NO: 1).

20 La razon fundamental para escoger esta region particular de la protema IGFBP-2 se baso principalmente en ciertos factores. El primero es su densidad de carga; es decir, el peptido contiene 6 residuos alcalinos en 13 posiciones y 2 residuos acidos. Esto le confiere una densidad de carga extremadamente alta. En segundo lugar, esta flanqueado por una secuencia de poliprolina, lo que indica que se mantiene en posicion ngida por la protema parental. En tercer lugar, esta secuencia es unica para IGFBP-2. La familia de IGFBP contiene 6 miembros que tienen un alto grado de 25 conservacion de la secuencia en los extremos N terminal y C terminal de las protemas. Sin embargo, la region media de cada protema muestra la divergencia de secuencias. Esta secuencia de 13 aminoacidos es completamente unica para IGFBP-2 y no esta contenida en ninguna de las otras 6 protemas de union a IGF. La importancia de esto es que la desactivacion del gen IGFBP-2 en ratones proporciona un fenotipo unico: bajo recambio oseo y elevado contenido de masa grasa. La desactivacion de cualquiera de las otras 5 protemas de union a IGF no proporciona este fenotipo. 30 Por lo tanto, se planteo la hipotesis de que habfa una region dentro de IGBP-2 que justificaba estos efectos.

Ejemplo 2

Preparacion de peptido pegilado

El peptido de 13 aminoacidos del SEQ ID NO: 1 descrito en la presente memoria se preparo por medio de smtesis en fase solida, se purifico mediante HPLC y, a continuacion se evaluo la pureza mediante espectrometna de masas. 35 El poli(etilenglicol) ("PEG") se adquirio de JenKem Technology USA (2033 W. McDermott Dr., Suite 320 num. 188, Allen, Tx 75013-4675). Se disolvieron 10,3 mg del peptido en 1,0 ml de fosfato sodico 50 mM pH 6,5. Se disolvieron 406 mg de metoxiPEG propinaldetndo de peso molecular 20 kDa en 4 ml de fosfato de sodio 50 mM. Se anadieron 120 |jl de una solucion 1 M de cianoborohidruro de sodio, y tetrahidrofurano (Aldridge) a la solucion de PEG. A continuacion, se anadio 1 ml de peptido a la solucion de pEg, seguido de 1 ml adicional de fosfato de sodio. La 40 mezcla de reaccion se hizo girar despues en un tubo conico de 15 ml durante 24 horas a 4°C. Despues de la incubacion, se anadio base Tris a una concentracion final de 6,8 mM para bloquear los sitios que no habfan reaccionado. La pegilacion N-terminal se verifico por medio de SDS-PAGE seguido de tincion de Coumassie, que proporciono un peso molecular que era compatible con 1 molecula de PEG anadida por molecula de peptido. El compuesto tambien se analizo por inmunotransferencia utilizando un anticuerpo que se habfa preparado 45 espedficamente contra la secuencia de 13 aminoacidos. Las movilidades electroforeticas de la protema sometida a

tincion de Coumassie y la protema inmunotransferida eran identicas, lo que indica que el peptido inmunorreactivo se habfa pegilado.

Ejemplo 3

Analisis de celulas grasas

50 En algunos analisis, se obtuvieron los datos de celulas grasas mediante el uso de la lmea de celulas 3T3L1, que se utiliza para estudiar la diferenciacion de celulas grasas. Estas celulas se cultivan como precursores de celulas grasas. Estas celulas se mantienen en Hams F12 con suero de ternera fetal y glutamina 15 mM. Para estimularlas a entrar en la ruta de diferenciacion de las celulas grasas, se anadieron isometilbutilxantina, dexametasona e insulina usando concentraciones de IBMX 0,5 mM, insulina 16,7nM y dexametasona 0,1jM. En algunos casos se anadieron 55 100 ng/ml de IGF-1 en lugar de insulina. Tres dfas despues de la adicion, la diferenciacion en adipocitos es evidente

y se detecta mediante tincion con Rojo Oleoso O.

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Para determinar los efectos del peptido del SEQ ID NO: 1, este se anadio a concentraciones de 20 ng/ml, 200 ng/ml y 2 |jg/ml. Se detecto una inhibicion detectable de la diferenciacion de adipocitos, tal como se determina por una disminucion en el numero de celulas positivas para Rojo Oleoso O, utilizando 20 ng/ml de peptido. La respuesta fue maxima a 200 ng/ml y no aumento mas mediante la adicion de 2 mcg/ml. Se sometio a ensayo IGFBP-2 de tipo salvaje en paralelo y se encontro que tambien inhibfa la diferenciacion de adipocitos utilizando concentraciones entre 50-500 ng/ml.

Para la tincion con Rojo Oleoso O, se prepara una solucion de partida de 0,5 ml/100 ml de isopropanol. Se mezclan 60 ml de solucion con 40 ml de agua y se dejan reposar a temperatura ambiente durante una hora y despues se filtran. El medio se aspira de los cultivos de adipocitos y las celulas se fijan en formaldel'ndo al 1%. El formaldel'ndo se aspira y se anade la solucion de Rojo Oleoso O en una cantidad necesaria para cubrir las celulas, que luego se dejan a temperatura ambiente durante una hora. A continuacion se elimina el colorante y se lavan las placas con agua destilada y se secan. Por lo general 60-70% de las celulas se tinen de manera positiva despues de 3 dfas.

El efecto maximo del peptido fue la inhibicion de la diferenciacion a un nivel en donde <20% de las celulas fueron positivas. Estos hallazgos fueron reconfirmados utilizando preadipocitos primarios de raton. Se sacrificaron ratones de 35-50 dfas de edad y se eliminaron de forma aseptica las almohadillas de grasa inguinales. El tejido graso se lavo y se disolvio en solucion salina alcalina de Hanks que contema glucosa al 0,1% y 2 mg/ml de colagenasa, (tipo 3 Worthington) y BSA al 4%. Despues de 15 min de digestion a 37°, el tejido se separo por medio de dispersion y pipeteado y despues se filtro a traves de un filtro de nailon esteril de 80 micras. Despues las celulas se cultivaron en placa en DMEM F12 que contema suero de ternera fetal al 10% y luego se centrifugaron a 700 x g para separar las celulas vasculares estromales de los adipocitos, que flotan. Se desecho el sobrenadante y el sedimento celular, que contema las celulas vasculares del estroma ,se resuspendio en DMEM F12 con FCS al 10% y se cultivo en placa a una densidad de 15.000 celulas/cm2. Se aspiro el medio 24 horas mas tarde y el medio de nuevo aportacion se reemplazo cada 3 dfas hasta que las celulas alcanzaron una confluencia de 80-90%. Se indujo la diferenciacion mediante la adicion de medio libre de suero que contema glucosa 25 mM, 10 jg/ml de transferrina, T3 10 nM, dexametasona 10-7, 5 jg/ml de HDL e insulina 16,7nM. Esto se anadio a los cultivos que estaban entre 30-50% de confluencia. El medio se sustituyo cada 3 dfas hasta que se observaron gotitas de grasa, por lo general 6-8 dfas. Despues se confirmaron por medio de tincion con Rojo Oleoso O como se ha descrito anteriormente. El peptido se sometio a ensayo a concentraciones entre 2 ng y 2 jg/ml de protema IGFBP-2 nativa entre 50-500 ng/ml. La IGFBP- 2 se habfa purificado a partir de medio celular acondicionado y se determino que era homogenea por medio de analisis de la secuencia de aminoacidos.

Ejemplo 4

Medicion de la diferenciacion de los osteoclastos

El metodo para la diferenciacion de los osteoclastos es el siguiente: se anestesiaron ratones BALB/c en los que se habfa suprimido el gen de IGFBP-2 (vease V. DeMambro et al., Endocrinology, 149(5): 2051-2061 (2007)) y se sacrificaron por dislocacion cervical. Los femures de cada raton se diseccionaron libres de tejido blando y la medula osea se aspiro por medio de puncion con aguja. Las celulas se eliminaron en condiciones esteriles y se resuspendieron en DMEM con suero de ternera fetal al 10%. Las celulas se centrifugaron a 700 x g y el sedimento de celulas se resuspendio en medio y se sembro en placas de 24 pocillos a una concentracion de 5000 celulas/cm2. Las placas que se utilizan son placas de baja adherencia que no tienen aditivos para facilitar la adherencia de las celulas. En estas condiciones, los macrofagos se adheriran mientras que otras celulas no lo haran. El medio se complemento con mCSF de 20 ng/ml. Despues de 3 dfas las celulas se retiraron de la placa y los macrofagos adherentes se expusieron a medio de nueva aportacion que contema FBS al 10% y mCSF. Esto se repitio de nuevo despues de 3 dfas y luego despues de otros 3 dfas las celulas se trataron con tripsina y se volvieron a sembrar en placas nuevas a 6 x 104 celulas/cm. En este momento se anadio el ligando RaNk, 50 ng/ml, aunque en algunos experimentos se utilizaron concentraciones tan bajas como 10 ng/ml. El medio se cambio a los 3 y 6 dfas y el dfa 7 las celulas se tineron para determinar la fosfatasa acida resistente a tartrato, un marcador de diferenciacion de los osteoclastos. Se anadio IGFBP-2 a concentraciones entre 50 ng/ml y 500 mcg/ml. El peptido se anadio a 20 o 200 ng/ml.

Los resultados mostraron que las celulas no se diferenciaban en osteoclastos sin la adicion del peptido o de la IGFBP-2 nativa. Ademas, en presencia del peptido, la concentracion en suero podra reducirse hasta un mmimo de 0,5% y todavfa se detectaba diferenciacion de los osteoclastos. Ademas, si se utilizaba suero al 2%, se podfa suprimir mCSF del medio y el ligando RANK disminrna tanto como 30 ng/ml. Sin embargo, no fue posible eliminar la IGFBP-2. Es decir, los cultivos mantenidos sin IGFBP-2 o peptido no se diferenciaban en osteoclastos.

Para la tincion para determinar la fosfatasa acida resistente al tartrato, se preparo una solucion al 1% y se incubo con las celulas durante 30 min a temperatura ambiente. Los cultivos se lavaron a continuacion y el numero de celulas se determino por recuento manual. En algunos experimentos, el peptido de 13 aminoacidos pegilado se comparo con el peptido no pegilado y se encontro queteman una actividad biologica equivalente.

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Ejemplo 5

Medicion de la diferenciacion de osteoblastos

Para la medicion de la diferenciacion de osteoblastos, las celulas tambien se obtienen de los mismos aspirados de medula osea. Sin embargo, en algunos experimented se obtuvieron de boveda craneal obtenida a partir de animales recien nacidos. Las celulas se cultivaron en placas de 6 pocillos a 20 x 106 celulas/pocillo en medio alfa MEM con suero bovino fetal al 10%. El medio se cambio los dfas 1 y 3. El dfa 3 las celulas recibieron medio de diferenciacion, que es alfaMEM que contiene suero de ternera fetal al 10%, fosfato de glicerol 8 mM y 50 pg/ml de acido ascorbico. El medio se cambio con posterioridad cada 2 dfas hasta la terminacion del experimento, en general, a los 18 dfas. En algunos experimentos la concentracion de suero de ternera fetal se redujo un 5% o un 2%. Se anadieron 200 ng/ml de IGFBP-2 a algunos cultivos o el peptido IGFBP-2 a concentraciones entre 2 ng/ml y 2 mcg/ml. Para determinar la diferenciacion de osteoblastos, las celulas se fijaron con paraformaldetndo al 4% y luego se tineron para determinar la fosfatasa alcalina. Despues las celulas se contratineron con tincion de von Kossa para detectar la mineralizacion. En algunos experimentos, el peptido de 13 aminoacidos pegilado se comparo con el peptido no pegilado y se encontro que teman actividad biologica equivalente.

Ejemplo 6

Estudios de crecimiento oseo y mineralizacion

Este sistema utiliza un sistema de explante ex vivo, por lo tanto es una transicion entre las celulas cultivadas y los experimentos in vivo. El tejido de formacion de hueso se elimina directamente de un raton y luego se cultiva en cultivo de organos durante varios dfas. Los aditivos de ensayo se pueden anadir directamente al medio a cualquier concentracion con el fin de someter a ensayo la actividad biologica. El metodo es el siguiente: se aislaron huesos metatarsianos de ratones recien nacidos entre los dfas 0 y 3 despues del nacimiento utilizando el microscopio de diseccion. Se utilizaron los tres metatarsianos medios para todos los experimentos. Se incubaron tres metatarsianos por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos en medio DMEM que contema suero bovino al 0,5%, acido ascorbico 0,5 M, beta glicerol fosfato 1 mM a 37°C. El medio fue reemplazado un dfa despues y los metatarsianos se cultivaron hasta durante 10 dfas. El crecimiento se midio por aumento cuantitativo del tamano, longitud y anchura de los huesos utilizando un microscopio de fase invertida con una escala micrometrica incorporada para las mediciones. La mineralizacion fue evaluada por la adicion de calcema (500 ng/ml) al medio durante 2 horas antes de la fijacion del tejido. Las imagenes fluorescentes se capturaron con una camara digital conectada a un microscopio invertido y cuantificando la fluorescencia de la calcema bajo un estfmulo de longitud de onda adecuada. La histologfa del hueso y el cartflago se midio mediante la fijacion de los huesos en PFA al 4% durante la noche y almacenamiento en etanol del 70%, seguido de la inclusion en Parafilm seccionamiento y tincion. Las secciones fueron tenidas con H y E, Rojo Alizarina o fosfatasa alcalina. Para el analisis de protemas, el tejido se homogeneizo en tampon de muestra de Laemmli y los geles se hicieron circular utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida SDS convencional y transferencia Western.

Los resultados demostraron que la adicion de IGFBP-2 intacta o del peptido de IGFBP-2 a una concentracion de 20200 ng/ml estimulaba el crecimiento oseo y la calcificacion en metatarsianos derivados de ratones IGFBP-2 -/-. El peptido tambien tema un efecto estimulante adicional modesto sobre metatarsianos con respecto a animales normales, pero el porcentaje de incremento fue mucho mayor en los metatarsianos derivados de animales con el gen de IGFBP-2 desactivado.

Ejemplo 7

Rescate in vivo del fenotipo de hueso en ratones IGFBP-2 -/Los ratones IGFBP-2 -/- tienen una densidad mineral osea reducida, un espesor cortical y trabecular reducido y un recambio oseo reducido, tanto en la formacion como en la resorcion. Para determinar si el peptido de 13 aminoacidos era activo sistemicamente, se preparo una preparacion pegilada con el fin de prolongar la semivida. A continuacion, se inyecto esta preparacion en los ratones. Se utilizaron ratones con edades entre 16 y 20 semanas. Se sabe que estos ratones tienen un fenotipo de hueso importante. El peptido se inyecto a una dosis de 50 mcg de peptido mas producto conjugado, que es el peso molecular total del PEG mas el peptido, que es un peso molecular de aproximadamente 23.000, que se inyecto por via intraperitoneal cinco dfas por semana durante tres semanas. Se inyecto a seis ratones en cada grupo. La medida principal de la densidad osea es el volumen de hueso sobre el volumen total calculado por analisis microCT. Este mide la cantidad de hueso total dentro de un espacio determinado. Los animales de control reciben inyecciones de PBS.

Los valores de BV/TV fueron los siguientes: Para los ratones normales, el valor del volumen ocupado por el hueso fue de 0,22 (22%); para los ratones con la delecion del gen IGFBP-2, el valor fue de 0,12; y para los ratones que recibieron el peptido, fue de 0,18. Por lo tanto, la inyeccion del peptido rescato el fenotipo de hueso dentro del 70% del normal incluso aunque estos ratones hubieran pasado las primeras 6 semanas de vida sin exposicion a esta protema. La medicion del espesor cortical tambien demostro que este aumento sustancialmente mediante la administracion del peptido. El analisis de los huesos bioqmmicamente mostro que PTEN estaba regulado a la baja. Por lo tanto, parece que el peptido es totalmente capaz de rescatar un fenotipo de hueso en un modelo de animal

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Ejemplo 8

El dominio de union a heparina de IGFBP2 es anabolico para el esqueleto y funciona a traves de un mecanismo que es independiente de la union a IGF-1

Ratones. La generacion de la cepa original de origen mixto, B6; 129-Igfbp2<tm1Jep>, que se refiere a ratones Igfbp2-I~ ratones, se ha descrito previamente10,52 Los ratones originales se retrocruzaron sobre un origen C57BL/6J durante al menos 10 generaciones. Todos los estudios experimentales in vivo y ex vivo se realizaron con ratones macho. Todos los estudios con animales fueron revisados y aprobados por el AnimalCare and Use Committee of Maine Medical Center Research Institute. Los ratones teman libre acceso a agua y dieta durante la duracion del estudio. Las condiciones medioambientales de las colonias inclrnan ciclos de luz:oscuridad de 14:10 horas.

Cultivo de celulas. Se recogieron osteoblastos de boveda craneal neonatal de ratones de 7-10 dfas como se ha descrito anteriormente53 Brevemente, las bovedas craneales fueron digeridas 5 veces con colagenasa P y tripsina. Las celulas liberadas de los productos digeridos 2 a 5 se recogieron como osteoblastos primarios de boveda craneal, y se mantuvieron en DMEM con un suplemento de FCS al 10% y aminoacidos no esenciales. La osteoblastogenesis de los osteoblastos primarios de boveda craneal se llevo a cabo por tratamiento de las celulas con p-glicerofosfato 4 mM y 50 pg/ml de acido ascorbico en aMEM. Las celulas estromales de la medula osea (BMSC) se recogieron de los femures y las tibias de ratones de 8 semanas de edad como se describio previamente10. La osteoblastogenesis de BMSC fue inducida por el tratamiento con medio osteogenico que consistfa en aMEM que contema FCS al 10%, p-glicerofosfato 8 mM, y 50 pg/ml de acido ascorbico.

Cultivo de metacarpianos. Se aislaron los metacarpianos de ratones Igfbp2-I~ de 1 dfa de edad y se incubaron en DMEM que contema BSA al 0,5%, 50 pg/ml de acido ascorbico y p-glicerofosfato 1 mM durante 10 dfas54 Los estimulantes se anadieron al medio de cultivo a partir del dfa 1. El dfa 10, se incubaron los metacarpianos en medio que contema calcema (500 ng/ml) durante 2 horas para la tincion del deposito de calcio, y se obtuvieron imagenes. Despues, los huesos se fijaron con PFA al 4%, se incluyeron en parafina, y se procesaron para la doble tincion con azul Alcian y von Kossa.

PCR en tiempo real. El ARN total se preparo utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen) y se trato con ADNasa (Qiagen). El ADNc se genero utilizando un hexamero al azar y transcriptasa inversa (SuperScript III, Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La cuantificacion de la expresion del ARNm se llevo a cabo utilizando un iQ SYBR Green Supermix en un ciclador termico iQ5 y un sistema de deteccion (Bio-Rad). Se utilizo ARNr de 18S Gapdh como un gen de control convencional interno para toda la cuantificacion.

Analisis de transferencia Western. Para preparar productos lisados de celulas enteras, las celulas se solubilizaron en tampon RIPA55. Por fraccion citosolica, las celulas se solubilizaron con tampon hipotonico que contema inhibidores de proteasa y de fosfatasa (Tris 10 mM, MgCh 0,2 mM, pH 7,4) y se mantuvieron en hielo durante 10 min. Los productos lisados celulares se mezclaron con tampon de sacarosa (concentracion final; sacarosa 25 mM, EDTA 0,1 mM) y se centrifugaron a 20.000 x g durante 1 hora. El sobrenadante se utilizo como fraccion citosolica. Para preparar la fraccion de membrana, las celulas se solubilizaron con PBS que contema inhibidores de proteasa y fosfatasa. Los productos lisados se congelaron a -80°C durante 1 h y se descongelaron a temperatura ambiente. Despues de tres ciclos, se centrifugaron a 13.000 x g durante 25 min. El sedimento se suspendio con tampon de aislamiento de protema de membrana (Tris-HCl 20 mM; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM; EGTA 1 mM; y Triton X-100 al 1%, pH 7,5) que contema inhibidores de proteasa y fosfatasa. La concentracion de protema se evaluo mediante el kit de analisis de protema BCA (Thermo Scientific) y se separaron cantidades iguales de la muestra mediante SDS- PAGE y se transfirieron electroforeticamente a membranas de nitrocelulosa. Las membranas fueron bloqueadas en BSA al 5% en solucion salina tamponada con Tris. A continuacion, las membranas se sometieron a inmunotransferencia con anti-PTEN (Senalizacion celular, Num. 9559), anti-Akt (Senalizacion celular, Num. 9272), anti-pSer473-Akt (Senalizacion celular, Num. 9271), anti-p-catenina (BD Transduction Laboratories, 610153), anti- pSer552-p-catenina (Senalizacion celular, Num. 9566P), o anti-a-actina (Santa Cruz, sc-47778), y se revelaron con anticuerpos anti-IgG de conejo o raton acoplados con peroxidasa de rabano picante, seguido de intensificacion con SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate Antibodies (Pierce Chemical Co.).

Generacion del peptido de dominio de union a heparina. El peptido sintetico que contiene el homologo de raton del dominio de union a heparina (AA246-249) y 9 aminoacidos adicionales de IGFBP2 de raton, 237KHLSLEEPKKLRP250 (en adelante referido como peptido HBD), y el peptido de control para el peptido HBD (AALSLEEPAALAP) fueron sintetizados por Protein Chemistry Core Facility at the University of North Carolina en Chapel Hill. El peptido sintetico para el dominio de union a heparina de IGFBP5 (201RKGFyYkRKQCKPSRGKRK218) fue generado de la misma manera. La pureza y la confirmacion de la secuencia se determinaron por espectrometna de masas. El peptido HBP de IGFBP-2 se pegilo como sigue: se mezclaron 10 mg de peptido con 380 pg de metoxi PEG maleimida (20.000 kDa) (razon molar de peptido con respecto a PEG 1:3) (Jenkem Biotechnology) en 4,0 ml de NaH2P04 0,05 M, pH 7,0. Despues de una incubacion durante la noche a 4°C, se anadio cistema a una concentracion final de 17 mM para bloquear los sitios que no habfan reaccionado. Para eliminar el peptido no pegilado y la cistema, la mezcla fue desalinizada usando una columna de centrifugacion Zebra Desalt (Thermo Scientific) siguiendo las instrucciones del

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fabricante. La pegilacion se verifico mediante analisis SDS-PAGE con tincion de Coomassie.

Tratamiento in vivo de ratones Igfbp2--- con peptido de union a heparina pegilado (PEG-HBD-peptido). Se administraron a ratones Igfbp2+I+ y Igfbp2--- PBS o PEG-HBD-peptido (50 pg/dfa) por via intraperitoneal 5 veces por semana desde las 6 hasta las 9 semanas de edad. La absorciometna con rayos X de doble energfa se realizo antes del inicio del tratamiento. A los ratones se les inyectaron 20 mg de calcema/kg por via intraperitoneal 7 dfas y 2 dfas antes de la recogida de muestras.

Absorciometna con rayos X de doble energfa (DXA). La absorciometna con rayos X de doble energfa (DXA) para la densidad mineral osea de todo el cuerpo y de la zona femoral (aBMD) y la composicion corporal exclmda de la cabeza se realizaron con el PIXImus (GE-Lunar)10. El PIXImus se calibro diariamente con un fantasma de raton proporcionado por el fabricante.

MicroTC. La microarquitectura del hueso trabecular distal y del hueso cortical de la diafisis se analizo con femures y vertebras (L5) por medio de MicroTC (MicroCT40)10 Se midieron aproximadamente 100 secciones inmediatamente proximales a la placa de crecimiento distal, con un tamano de pixel isotropico de 12 pm y un grosor de la seccion de 12 pm. El espesor del hueso cortical de la diafisis fue analizado de una manera similar utilizando aproximadamente 18 secciones obtenidas en el punto medio exacto del femur.

Histomorfometna osea. Se analizaron las diferencias histomorfometricas in vivo entre los ratones Igfbp2--- tratados con PBS o PEG-HBD-peptido a las 9 semanas de edad. A los ratones se les inyectaron 20 mg/kg de calcema por via intraperitoneal 7 dfas y 2 dfas antes de la recogida de muestras. Los femures se analizaron como se ha descrito previamente10.

Biomecanica femoral. Se compararon las propiedades biomecanicas femorales mediante la flexion en tres puntos entre los ratones Igfbp2--- tratados con PBS o PEG-HBD-peptido a las 9 semanas de edad. La carga se aplico a una velocidad constante (0,05 mm/seg) hasta la rotura. Se midieron la carga de rotura (newton), la rigidez a la flexion (newton por milfmetro) y el trabajo de rotura (newton-milfmetros) de la curva de carga-desplazamiento y se midieron el modulo elastico aparente (megapascal) y la resistencia ultima (gigapascal) utilizando la geometna de la seccion transversal de la parte media femoral correspondiente medida desde pCT.

Analisis estadfstico. Todos los datos se expresan como la media ± Error Tfpico de la Media (ETM). Los resultados se analizaron para las diferencias estadfsticamente significativas utilizando el test de la t de Student o ANOVA seguido del test de comparacion multiple post hoc de Bonferroni. Se analizo el ensayo de tolerancia a la glucosa usando medidas repetidas ANOVA. La significacion estadfstica se fijo en p<0,05.

El dominio de union a heparina de IGFBP-2 estimula la osteoblastogenesis in vitro. Se ha informado anteriormente de que los ratones Igfbp2--- mostraban un fenotipo osteopenico con baja formacion osea y deterioro de la osteoblastogenesis en las celulas estromales de la medula osea (BMSC) de ratones Igfbp2--- en comparacion con celulas de tipo salvaje (Fig. 1a)10. Consecuentemente con ello, los osteoblastos de boveda craneal carentes de Igfbp2 (COB) mostraron un deterioro de la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) durante la osteoblastogenesis en comparacion con las celulas de tipo salvaje (Fig. 1b). Para investigar si el dominio de union a heparina (HBD) de IGFBP-2 tiene un efecto anabolico sobre el esqueleto, se genero una molecula pequena (el HBD-peptido), que contiene el HBD de IGFBP-2, y se sometio a ensayo para determinar su efecto sobre la osteoblastogenesis in vitro. Para confirmar que el efecto del HBD-peptido era espedfico, tambien se elaboro un peptido de control y se analizo para determinar su efecto sobre la osteogenesis. El peptido de control no aumento la mineralizacion de los COB Igfbp2---, en comparacion con las celulas tratadas con pBs, mientras que el HBD-peptido era completamente activo (Fig. 7). Para prolongar la vida media de la molecula pequena de manera que fuera viable emprender estudios in vivo, se realizo la pegilacion del HBD-peptido (PEG-HBD). Los COB Igfbp2--- y las BMSC se cultivaron en medio osteogenico (es decir, acido ascorbico y p-glicerolfosfato) en presencia de PEG-HBD. El PEG-HBD mejoro fuertemente la osteogenesis de COB y BMSC, medida por medio de fosfatasa alcalina y tincion con Rojo Alizarina (Fig. 1c). Consecuentemente con esto, las expresiones de ALP, Runx2 y osteocalcina (OC) mejoraron en las BMSC tratadas con PEG-HBD en comparacion con las celulas tratadas de control (Fig. 1d).

El dominio de union a heparina de IGFBP-2 estimula la expansion del periostio de los metacarpianos ex vivo. Para entender aun mejor el efecto anabolico de HBD sobre el esqueleto, se recogieron metacarpianos de raton de 1 dfa de edad y se incubaron con medio osteogenico en ausencia de suero de ternera fetal y se analizaron para determinar los efectos del HBD-peptido sobre el crecimiento esqueletico. Se evaluo la acumulacion de hueso por la dimension longitudinal del area que incorporaba calcema, asf como la anchura y la longitud de los metacarpianos. El peptido de control no tuvo efecto sobre el area que incorporaba calcema, y la longitud y la anchura de los metacarpianos fueron comparables con las de los metacarpianos tratados con pBs. Por lo tanto se utilizo PBS como control posterior para estudios adicionales (Fig. 8). Como se muestra en la Fig. 2a, la IGFBP-2 y el HBD-peptido mejoraron de forma significativa el area que incorporaba calcema de los metacarpianos (Fig. 2a y b). El iGF-1 tambien estimulo la expansion del area que incorporaba calcema en una medida similar a IGFBP-2 y HBD-peptido (Fig. 2a y b). Cuando los huesos metacarpianos fueron tratados con IGF-1 junto con HBD-peptido los metacarpianos mostraron una mejora adicional del area que incorporaba calcema. Ademas, la IGFBP-2 y el HBD-peptido tambien aumentaron la anchura de los metacarpianos, lo que implica que la IGFBP-2 tiene un papel importante en la

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expansion del periostio (Fig. 2c y d).

El dominio de union a heparina de IGFBP-5 no tiene un efecto anabolico sobre el esqueleto in vitro y ex vivo. Debido a que otras IGFBP poseen regiones HBD como IGFBP-2, se llevaron a cabo analisis para determinar si el efecto osteogenico del peptido de HBD era espedfico para esta region en IGFBP-2 o si el dominio HBD en otras formas de IGFBP tambien tema este efecto. Para este proposito se preparo un peptido que contema la region HBD en IGFBP-5 (HBD-BP5) y se determino su efecto sobre la osteoblastogenesis. Los COB carentes de Igfbp2 se cultivaron en presencia de HBD-BP5, y se determino que HBD-BP5 no mostraba ninguna mejora de la mineralizacion en comparacion con las celulas tratadas con PBS (Fig. 3a). En segundo lugar, se recogieron los metacarpianos y se trataron con medios osteogenicos con o sin HBD-BP5. El HBD-BP5 no tuvo ningun efecto sobre el area que incorporaba calcema o sobre la longitud y la anchura de los metacarpianos. Estos datos indican que el efecto del HBD sobre la adquisicion esqueletica es probablemente espedfico para IGFBP-2.

El dominio de union a heparina de IGFBP-2 rescata el fenotipo osteopenico de ratones Igfp2--- in vivo mediante la mejora de la micro-arquitectura del esqueleto. Basandose en estas observaciones in vitro y ex vivo se realizaron estudios para determinar si el HBD-peptido podna rescatar el fenotipo osteopenico de ratones Igfbp2---. Para este proposito, se trataron ratones Igfbp2--- con pBs o PEG-HBD. Basandose en el analisis de la semivida de PEG-HBD (datos no mostrados), se administraron 50 |jg de PEG-HBD s 5 veces por semana durante 3 semanas en ratones de 6 a 9 semanas de edad. La densidad mineral osea por area corporal (aBMD) y el contenido mineral oseo (aBMC)/peso corporal (PC) analizados por DXA no fueron diferentes antes del inicio del tratamiento entre ratones Igfbp2-'- tratados con PBS o PEG-HBD (Tabla 3). Como era de esperar debido al crecimiento y la consolidacion normales, los ratones Igfbp2+I+ tratados con PBS mostraron un incremento en el volumen de hueso trabecular por microCT en comparacion con los ratones Igfbp2--- tratados con PBS. El tratamiento con PEG-HBD mejoro la aBMD de todo el organismo y aBMD/PC en ratones Igfbp2--- (Tabla 4), aunque no alcanzo significacion estadfstica. Por otra parte, el analisis microCT revelo un aumento en el volumen de hueso trabecular tanto en el femur distal como en las vertebras L5 de los ratones Igfbp2--- tratados con PEG-HBD vs los ratones Igfbp2--- tratados con PBS. Esto estuvo acompanado por un aumento del grosor trabecular (Fig. 4a, Tabla 1, Tabla 5). El espesor cortical en la diafisis media del femur no se vio afectada por la administracion de PEG-HBD, pero el area total analizada a nivel de la diafisis media del femur se incremento en los ratones Igfbp2--- tratados con PEG-HBD en comparacion con los ratones Igfbp2--- tratados con PBS. Esto es compatible con un efecto de PEG-HBD sobre la expansion del periostio de una manera similar a lo que se demostro en el analisis con metacarpianos ex vivo (Tabla 1 y Fig. 2). Los cambios en la arquitectura esqueletica se asociaron con una tendencia similar en la resistencia osea. En los estudios de tres puntos de flexion del femur, los ratones Igfbp2-' tratados con PEG-HBD tuvieron una rigidez osea y un modulo de Young estimado ligeramente mayores en comparacion con los ratones con el gen desactivado tratados con PBS (Fig. 4b). Por otra parte, la fuerza en el lfmite elastico y el desplazamiento en el lfmite elastico fueron menores en los animales tratados con PEG-HBD en comparacion con los controles (Fig. 4b).

El analisis histomorfometrico revelo que el numero de osteoblastos por penmetro de hueso se incremento significativamente, mientras que el numero de osteoclastos por penmetro del hueso mostro una disminucion en ratones Igfbp2--- tratados con PEG-HBD vs ratones Igfbp2--- tratados con PBS (Fig. 4c, Tabla 6). Curiosamente, el numero de adipocitos de medula osea se redujo en los ratones Igfbp2--- tratados con PEG-HBD, aunque PEG-HBD no tuvo efecto directo sobre la adiposidad corporal total (Fig. 4d, Tablas 3 y 4). El aumento en el numero de osteoblastos de los ratones Igfbp2--- tratados con PEG-HBD coincidente con la reduccion en los adipocitos de medula implica que la asignacion de las celulas madre mesenquimales se puede alterar hacia el linaje osteogenico en los ratones tratados con PEG-HBD. Consecuente con esto, la expresion de Pparg en COB tratados con PEG- HBD se redujo (Fig. 4e).

En lo que respecta a la reduccion en el numero de osteoclastos observada en la histomorfometna de los ratones tratados con PEG-HBD, los niveles de TRAP5b en suero tambien se redujeron significativamente en los ratones Igfbp2--- tratados con PEG-HBD (Fig. 4f). Para investigar el mecanismo por el cual PEG-HBD afecta a los osteoclastos, se cultivaron celulas del estroma de medula osea de ratones Igfbp2--- y se indujo la osteoclastogenesis en presencia o ausencia de HBD. El PEG-HBD no tuvo un efecto directo sobre la osteoclastogenesis (datos no mostrados). En segundo lugar, se recogieron COB y BMSC Igfbp2---, y se trataron con PEG-HBD. El PEG-HBD no afecto a la expresion de opg, pero suprimio marcadamente la expresion de RANKL (Fig. 4 g y h). Estos datos implican que PEG-HBD reduce la osteoclastogenesis indirectamente a traves de la regulacion a la baja de la expresion de RANKL en osteoblastos.

El dominio de union a heparina de IGFBP-2 suprime la expresion de PTEN y estimula la senalizacion de IGF-1/Akt. Existe evidencia de una asociacion negativa entre IGFBP-2 y la expresion de PTEN en las celulas cancerosas humanas tales como glioblastoma y cancer de prostata18-21. Ademas, se ha demostrado que la expresion de PTEN se encuentra reforzada en osteoblastos deficientes en Igfbp2 10. Estos hallazgos llevaron a la especulacion de que IGFBP-2 regula negativamente la expresion de PTEN y mejora de senalizacion de IGF-1 en osteoblastos. Los primeros analisis se llevaron a cabo para determinar si IGFBP-2 supriirna la expresion de PTEN utilizando COB Igfbp2--- primarios. Se encontro que la IGFBP-2 completa supriirna considerablemente la expresion PTEN en estas celulas (Fig. 5a). El peptido de control no tuvo ningun efecto sobre la expresion de PTEN (Fig. 9), pero al igual que IGFBP-2, PEG-HBD tambien indujo una reduccion en la expresion de PTEN (Fig. 5b). En segundo lugar, se llevaron a cabo analisis para determinar si la reduccion de la expresion de PTEN daba como resultado la senalizacion

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mejorada de IGF-1/Akt. El analisis de transferencia Western para determinar la fosforilacion de Akt en la serina 473 (pSer473-Akt) revelo que la activacion de Akt estimulada por IGF-1 estaba deteriorada en COB Igfbp2-/" en comparacion con COB Igfbp2+I+ (Fig. 5c). Ademas, pSer473-Akt se intensified en COB lgIbp2-', tratados con PEG- HBD vs los controles tratados con PBS (Fig. 5d). Estos datos indican que IGFBP-2 mejora la activacion de Akt estimulada por IGF-1 mediante la supresion de la expresion de PTEN en parte a traves de HBD.

El dominio de union a heparina de IGFBP-2 estimula la acumulacion de p-catenina citosolica inducida por IGF-1 y la fosforilacion de Ser552 de p-catenina. Varias lmeas de evidencia demuestran la diafoma entre la senalizacion de IGF-1 y la senalizacion de p-catenina en lmeas de celulas tumorales24-27. Por lo tanto, se planteo la hipotesis de que la senalizacion de IGF-1 estimulaba la senalizacion de p-catenina y de que el HBD-peptido podna mejorar la senalizacion de p-catenina mediante la supresion de la expresion de PTEn en las celulas osteoblasticas. Los analisis se llevaron a cabo primero para determinar si IGF-1 afecta a la acumulacion de p-catenina en el citosol de las celulas osteoblasticas. El analisis de transferencia Western revelo que el IGF-1 reduce la expresion de p- catenina unida a la membrana y aumenta la acumulacion citosolica de p-catenina en las celulas MC3T3-E1 (Fig. 6a). Ademas, la acumulacion citosolica de p-catenina en respuesta a IGF-1 estaba intensificada en COB Igfbp2-' tratados con PEG-HBD en comparacion con las celulas de control tratadas con PBS (Fig. 6B). Esto sugiere que el HBD- peptido esta implicado en la senalizacion de IGF-1Ip-catenina, posiblemente, por la supresion de la expresion de PTEN. Se ha demostrado que la fosforilacion de la serina 552 (Ser552) de la p-catenina, que puede ser inducida por Akt es importante para la disociacion de la p-catenina de la membrana y la re-localizacion en el citoplasma y el nucleo 28- 0 Basandose en esta observacion, se realizaron estudios para determinar si IGF-1 estimulaba la fosforilacion de Ser552 en la p -catenina y si el HBD-peptido facilitaba esta respuesta en las celulas osteoblasticas. Como se muestra en la Fig. 5c y d, el IGF-1 estimulaba la fosforilacion de p-catenina en Ser552, y esta respuesta se potenciaba en las celulas tratadas con PEG-HBD. Debido a que la activacion de la p-catenina es importante para la formacion de hueso, el efecto osteogenico del HBD-peptido podna estar mediado por la senalizacion de IGF-1Ip- catenina en los osteoblastos.

Este estudio proporciona evidencia de que el dominio de union a heparina de IGFBP-2 puede ser cntico para las acciones anabolicas de IGFBP-2 sobre el hueso. La determinacion de que el HBD suprime la expresion de PTEN en los osteoblastos proporciona un mecanismo por medio del cual la IGFBP-2 podna regular el destino de la celula. Sin embargo, la clasificacion de las actividades dependientes e independientes de de IGF-1 de la IGFBP-2 intacta es un reto. La senalizacion de IGF-1 es un requisito previo para la adquisicion de esqueleto y la modulacion de esta via de senalizacion da como resultado alteraciones en la homeostasis esqueletica17, 4-40 Por lo tanto, un efecto anabolico de HBD sobre el esqueleto podna, en parte, estar mediado por la mejora de la activacion inducida por IGF-1 de la via PI3KIAkt como resultado de la supresion de PTEN. Ademas, el aumento en el numero de osteoblastos en ratones Igfbp2-' tratados con HBD tambien podna ser debido a este cambio mecanicista puesto que la senalizacion PI3KIAkt mejorada en osteoblastos esta implicada en la proliferacion celular. De hecho, Liu et al. demostraron que la perdida de PTEN en los osteoblastos in vivo daba como resultado una masa osea muy elevada y un aumento del numero de osteoblastos17.

Aunque el HBD rescato el bajo numero de osteoblastos en ratones Igfbp2-', el numero de osteoclastos se vio disminuido aun mas mediante la administracion de HBD. Esta observacion es compatible con el aumento observado en la masa osea, pero sugiere que el recambio oseo no es acelerado portratamiento con HBD. De hecho, latasa de aposicion mineral y la tasa de formacion osea mostraron cambios mmimos en los ratones IgfbpZ1' tratados con HBD. En contraste con el HBD, se ha demostrado que la senalizacion de IGF-1 estimula directamente la osteoclastogenesis, y los datos anteriores sugieren que se requieren niveles fisiologicos de IGFBP-2 en el microambiente oseo para la osteoclastogenesis41. Es posible que la IGFBP-2 actue manteniendo las concentraciones de IGF-1 dentro del nicho pericelular pero que el HBD, que carece del dominio de union de IGF-1, pueda jugar un papel distinto mediante la inhibicion de la resorcion osea cuando se administran concentraciones suprafisiologicas. Dado que el HBD no suprime directamente la diferenciacion de osteoclastos in vitro, el mecanismo subyacente mediante el cual el HBD disminuye la resorcion osea es probablemente indirecto y debido a la disminucion de la expresion de RANKL en los osteoblastos. La expresion de RANKL esta regulada por numerosos factores, incluyendo la via de senalizacion WntIp-catenina42. Glass et al. informaron de que los ratones que expresan la forma estabilizada de la p-catenina mostraban un aumento del volumen de hueso trabecular con una reduccion en el numero de osteoclastos causada principalmente por un aumento de la proporcion de OpglRankf3. En consonancia con esto, la supresion selectiva de p-catenina en osteoblastos dio como resultado una baja masa osea con un aumento de la resorcion osea43. Por lo tanto, la estabilizacion de la p-catenina en osteoblastos aumenta la masa osea no solo mediante el aumento de la activacion mediada por Wnt, sino tambien a traves de la supresion de la resorcion osea.

Se ha demostrado que una reduccion en la expresion de PTEN esta asociada con un aumento de la p -catenina en la senalizacion. Se ha propuesto que la inactivacion de GSK3 (glucogeno sintasa quinasa 3) por Akt es la via clave por el cual la activacion de Akt mejora la estabilizacion de p-catenina, mientras que varias lmeas de evidencia demuestran el importante papel de la fosforilacion de Ser 552 en la activacion de p-catenina28-30. La p-catenina es fosforilada directamente por Akt y la fosforilacion de Ser552 es importante para la acumulacion citosolica y nuclear de p-catenina, dando como resultado el aumento de la actividad transcripcional de la p-catenina28. He et al informaron de que la perdida de PTEN produda un exceso de celulas madre intestinales mediante la estimulacion de la actividad de la p-catenina, en parte a traves de la fosforilacion de Ser 55229. El estudio actual demostro que el

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IGF-1 aumentaba la acumulacion de p-catenina en el citoplasma y fosforilaba la ser552 de la p-catenina en las celulas osteoblasticas, y esta respuesta se vefa reforzada por el HBD. En conjunto, estas lmeas de evidencia sugieren que la activacion mejorada de la senalizacion de p-catenina puede contribuir tanto al aumento de la formacion de hueso como a la disminucion de la resorcion osea en ratones Igfbp2--- tratados con PEG-HBD.

En ratones Igfbp2--- tratados con PEG-HBD, el numero de osteoblastos se incremento y esto estuvo acompanado de la reduccion del numero de adipocitos en la medula. La asignacion de celulas mesenquimales es una etapa importante en la regulacion de la masa osea y la adiposidad de la medula. Numerosos factores estan involucrados en este proceso, incluyendo la senalizacion de Wnt/p-catenina y el factor de transcripcion, PPAR-gamma44 La activacion de la senalizacion de Wnt/p-catenina favorece osteoblastogenesis sobre la adipogenesis en parte por el secuestro de PPAR-gamma o por la supresion de la actividad transcripcional de PPAR-gamma45-47. Debido a que HBD mejora la estabilidad de la p-catenina que es inducida por IGF-1, el cambio de las celulas mesenquimales hacia el linaje osteogenico podna explicar el aumento de osteoblastos y la reduccion de adipocitos en la medula osea de ratones Igfbp2--- tratados con PEG-HBD.

Sin embargo, el mecanismo por el cual el HBD suprime la expresion de PTEN no se ha definido. Una posibilidad reside en la union de HBD con el receptor de la integrina. Maile et al. informaron de que el dominio de union a heparina de la vitronectina se urna a una region del bucle de cistema de la integrina p3 y modulaba la senalizacion de la integrina aVp3 en las celulas de musculo liso48. Ademas, Perks et al. informaron de que la regulacion a la baja de PTEN por IGFBP-2 podna estar mediada por un receptor de integrina, a pesar de que no demostraron una interaccion entre la IGFBP-2 y un receptor de integrina espedfico ni que el HBD estuviera implicado en esta interaccion20

La presencia de un motivo de secuencia RGD en el extremo C de IGFBP-2 ha llevado a la especulacion de que IGFBP-2 podna unirse a una integrina, independientemente de su union a IGF3. Schutt et al. informaron de que la union de IGFBP-2 a la superficie celular estaba mediada por la integrina a5p1, y bloqueada por un peptido que contema RGD en lmeas celulares de sarcoma de Ewing y cancer de mama49. Wang et al. tambien demostraron que IGFBP-2 interactuaba con la integrina a5 a traves de un motivo RGD en una lmea celular de glioblastoma humano50. En contraste con estos informes, Russo et al. y Pereira et al. informaron independientemente de que la union de IGFBP-2 a la matriz extracelular fuera independiente de las secuencias de RGD en celulas de neuroblastoma y celulas de cancer de mama. Ademas, Hoeflich et al. demostraron que el motivo RGD no esta involucrado en la union

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de IGFBP-2 a la membrana plasmatica en multiples organos . Por lo tanto, el papel funcional del motivo RGD en ratones Igfbp2--- sigue siendo controvertido y se necesitan mas estudios.

No se pueden utilizar los resultados que emplean una concentracion suprafisiologica de HBD para llegar a una conclusion definitiva con respecto a la funcion de las concentraciones fisiologicas de IGFBP-2 en la adquisicion de hueso. Sin embargo, sf sugieren que esta protema de union tiene propiedades unicas que podnan explicar los altos niveles circulantes de IGFBP-2 durante penodos de crecimiento rapido tales como el primer ano de vida y durante la pubertad. En resumen, estos estudios muestran que el HBD en IGFBP-2 tiene un efecto anabolico sobre el esqueleto y este efecto esta mediado en parte por la supresion de la expresion de PTEN e implica la activacion de la senalizacion de p-catenina. Estas lmeas de evidencia proporcionan nuevos conocimientos sobre el papel fisiologico de la IGFBP-2 en el hueso y sugieren que una pequena molecula tal como el HBD-peptido podna tener potencial como intervencion farmacologica para el tratamiento de la osteoporosis.

Referencias para el Ejemplo 8

1. Hwa, V., Oh, Y. & Rosenfeld, R.G. The insulin-like growth factor-binding protein (IGFBP) superfamily.

Endocr Rev 20, 761-87 (1999).

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Ejemplo 9

Eficacia del peptido en la inhibicion de la acumulacion de grasa.

Una variedad de datos de la bibliograffa respaldan que la IGFBP-2 inhibe la acumulacion de grasa. Estos datos incluyen estudios en los que se sobreexpresa IGFBP-2 en ratones; es decir se crearon ratones transgenicos que produdan excesiva IGFBP-2. Estos animales presentaban una disminucion de la masa grasa. De manera importante, cuando fueron alimentados con una dieta con alto contenido de grasa que normalmente induce intolerancia a la glucosa, manteman la tolerancia normal a la glucosa en comparacion con los ratones control que fueron alimentados con la misma dieta con alto contenido de grasa y desarrollaron hiperglucemia. Esto sugiere que IGFBP-2 protege contra la resistencia a la insulina. Por el contrario los ratones en los que se ha eliminado el gen de IGFBP-2 teman el fenotipo opuesto; es decir eran significativamente mas gordos que los ratones de control. Despues de 24 semanas, los ratones con el gen IGFBP-2 inactivado pesaban 37 ± 1,5 g mientras que los animales de control pesaban 32 ± 1,3 g. Despues de 52 semanas se mantuvo esta diferencia. Esta es una diferencia altamente significativa en el peso corporal total. De manera mas importante aun, cuando se analizo la masa de grasa mediante escaneo DEXA casi toda la diferencia en el peso corporal era debida a una diferencia en la masa de grasa. A las 26 semanas, el porcentaje de grasa corporal en los ratones de control fue de 16,1 ± 1,4% de grasa, mientras que en los ratones con el gen desactivado era de 24,2 ± 1,1%. De nuevo, esta es una diferencia muy significativa e indica que gran parte de la diferencia de peso era debida a una diferencia en la grasa. Los ensayos de tolerancia a la glucosa mostraron que los ratones con supresion del gen IGFBP-2 teman intolerancia a la glucosa y eran menos sensibles a la administracion de insulina. Esto indica que el aumento de la masa grasa causaba una mayor resistencia a la hormona insulina. Los niveles de insulina en sangre fueron mayores en los ratones con el gen IGFBP-2 inactivado demostrando que teman resistencia a la insulina que daba lugar a concentraciones de insulina en suero elevadas. Otros han demostrado que es un factor de riesgo importante para la enfermedad cardiovascular.

Se han llevado a cabo otros experimentos en los que se ha administrado a ratones con el gen desactivado y a los animales de control el homologo de raton del peptido de union a heparina. El peptido se administro a 8 animales en cada grupo. Los datos de tratamiento de 6 semanas se proporcionan en la Tabla 2. Los animales con el gen desactivado pesaban 30,4 ± 1,5 g mientras que los animales de control pesaban 25,2 ± 1,1 g. Los animales con el gen desactivado que recibieron el peptido activo pesaban 24,9 ± 1,3 g. Esto indicaba claramente que la administracion del peptido que se habfa suministrado a una dosis de 50 mcg administro por via intraperitoneal tres veces por semana era eficaz en la prevencion de la ganancia de peso. De manera mas importante aun, cuando la masa grasa absoluta fue analizada por resonancia magnetica, tambien se encontraron diferencias altamente significativas. Los ratones con el gen desactivado teman 6,21 ± 0,76 gramos de grasa. Los ratones de control teman 3,82 ± 0,67 gramos y los ratones con el gen desactivado a los que se habfa administrado el peptido de union a heparina teman 3,67 ± 0,36 gramos. Una vez mas se trata de diferencias altamente significativas. Los ensayos de tolerancia a la glucosa tambien se llevaron a cabo en estos animales y demostraron que los animales con el gen desactivado presentaban una tolerancia a la glucosa deteriorada y esto mejoraba significativamente con la administracion del peptido y sin una diferencia significativa con los ratones de control.

Ejemplo 10

La delecion global de IGFBP-2 interrumpe la hematopoyesis y compromete el injerto de medula osea en ratones irradiados letalmente.

Se llevaron a cabo estudios para determinar si la delecion global de IGFBP2 (BP2) podna alterar la hematopoyesis en estado estacionario e interferir en el injerto de celulas de donante de medula osea. Primero se analizaron celulas de sangre periferica y de bazo de ratones macho (M) y hembra (F) WT y By2 -/- por medio de citometna de flujo para determinar las principales poblaciones de globulos blancos (WBC). En la sangre periferica, los ratones BP2 -/-F teman significativamente menos celulas T CD3+ en comparacion con WT-F y BP2 -/-M (p = 0,02), mientras que BP2 -/-M teman significativamente mas celulas T CD3+ (p = 0,03 ), celulas B CD19+ (p = 0,00), macrofagos F480+ (p = 0,00), monocitos CD11b+ (p = 0,00) y neutrofilos LY6G+ (p = 0,02) en comparacion con WT-M y BP2-/- F. La inyeccion intraperitoneal de peptido de union de dominio de union a heparina (HBD) de IGFBP-2 redujo el porcentaje de macrofagos (p = 0,01) y neutrofilos (p = 0,02) en la sangre periferica de BP2-/-M en comparacion con los controles a los que se habfa inyectado PBS. Las celulas T CD3+ esplenicas de BP2-/-F aumentaron (p = 0,0) y las

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celulas B CD19+ se redujeron (p = 0,05) en comparacion con WT-F, WT-M y BP2-M. Hubo un aumento significativo en las celulas progenitoras de celulas B B220+ en el bazo de BP2-/-M en comparacion con WT-M pero no hubo diferencia en los porcentajes de todas las demas poblaciones de WBC maduros. Se llevaron a cabo trasplantes de medula osea en receptores macho WT y BP2-/- macho letalmente irradiados. En los trasplantes no competitivos, la eficacia del injerto de donante fue la misma para ambas cepas ya que >75% de las celulas de repoblacion tanto en WT como en BP2-/- teman su origen en el donante (Ly5.1 +). En los trasplantes de repoblacion competitivos, se mezclaron celulas de donante de apoyo de ratones Ly5.1+ con celulas de donante competidor, ya sea de WT o de BP2-/- en proporciones de 2:3 y 1:3 y se trasplantaron a receptores espedficos de las cepas. A las 8 semanas del trasplante, los receptores WT en los que 2/3 de las celulas del donante eran WT (Ly5.2+), 75% de las celulas de medula osea eran de origen WT (Ly5.2+), mientras que en los receptores BP2 -/- en los que 2/3 de las celulas del donante eran de BP2-/- (Ly5.2 +) solamente 56% de las celulas de medula osea eran Ly5.2+ a las 8 semanas del trasplante representando un 20% menos (p = 0,01) de injerto de celulas de donante BP2-/- en comparacion con WT. Estos datos confirman que IGFBP2 puede ser un importante regulador del nicho de celulas madre hematopoyeticas.

Ejemplo 11

La IGFBP-2 de celulas estromales mesenquimales (MSC) en el nicho de medula osea regula la proliferacion de celulas madre hematopoyeticas y el injerto de medula osea.

La IGFBP2 (BP2) es una de las 6 protemas de union a IGF que transportan los IGF a sus respectivos receptores. Se ha demostrado que PTH induce la smtesis de IGFBP-2 en osteoblastos de boveda craneal y la delecion global de BP2 produce bazos pequenos, una formacion de hueso muy baja, un deterioro de la resorcion osea y un aumento de la adiposidad osea. In vitro, la medula osea de ratones BP2-/- muestra un deterioro del reclutamiento tanto de osteoblastos como de osteoclastos. Los machos con el gen BP2 inactivado tambien tienen un fenotipo hematopoyetico en el que se encuentran mayores porcentajes de subpoblaciones linfoides y mieloides tanto en la sangre periferica como en bazo. Se realizaron estudios para determinar si BP2 ejerce un papel fundamental como factor de proliferacion en el nicho de medula osea. Utilizando ARN de celulas madre mesenquimales de raton purificadas (Stem Cell Technologies), se determino primero que los niveles de expresion genica de BP2 eran 6-8 veces mayores que en celulas Bo T purificadas. Los trasplantes de medula osea no competitivos (BMT) se llevaron a cabo mediante el trasplante de celulas de donante LY 5.1+ a receptores WT y bp2-/- letalmente irradiados. El injerto de donante no fue diferente entre las cepas como se muestra por mas de 70% de celulas del donante presentes en la sangre periferica de los ratones receptores de ambas cepas. Sin embargo, en el trasplante de repoblacion competitivo utilizando los mismos pares de cepa de donante-receptor, las celulas de donantes bp2-/- injertaron la medula osea del receptor bp2-/- de una manera 30% menos eficaz (P = 0,01) que los trasplantes de WT. Ademas, hubo significativamente menos celulas linfoides (CD3, CD19) y mieloides (CD11b, LY6G y F480) maduras en la sangre periferica de los receptores bp2 -/- (p < 0,05). En respuesta a la administracion de un solo componente de la molecula de IGFBP2, el dominio de union a heparina (HBD), a ratones bp2 -/-, la masa osea trabecular fue rescatada y numero de osteoblastos aumento. En gran medida, la administracion in vivo del HBD suprimio los porcentajes de monocitos, macrofagos y neutrofilos maduros en la circulacion periferica, en comparacion con los encontrados en los ratones WT. Tomados en conjunto estos datos demuestran que BP2, que es sintetizado por las MSC e inducible por la PTH, es un potente regulador de la hematopoyesis y puede controlar espedficamente el destino de las celulas madre de una manera independiente de la union a IGF dentro del nicho de medula. La regulacion del nicho por IGFBP2 puede ser terapeuticamente importante para el trasplante clmico de medula osea que es actualmente la unica opcion de tratamiento para muchas enfermedades malignas hematologicas y de tejidos solidos.

Ejemplo 12

Regulacion de celulas madre hematopoyeticas por el dominio de union a heparina de IGFBP-2

Se describen los siguientes estudios para determinar el papel de IGFBP-2, a traves de su dominio de union a heparina, en la mejora del exito del trasplante de medula osea mediante estimulacion de la repoblacion de medula osea hematopoyetica.

Razon fundamental. El trasplante de celulas madre hematopoyeticas se utiliza principalmente en el tratamiento de canceres hematopoyeticos (leucemias y linfomas), despues de la quimioterapia de alta dosis para tumores malignos no hematopoyeticos. Tambien se utiliza para enfermedades que implican disfuncion de medula osea genetica o adquirida, tal como anemia aplasica y enfermedades autoinmunitarias. Los resultados positivos del trasplante dependen de (1) la recuperacion de un numero suficiente de celulas madre hematopoyeticas (HSC) a partir de medula osea del donante, sangre del cordon umbilical o sangre periferica y (2) el anidamiento celular exitoso de las HSC a la medula osea del receptor1. Se ha demostrado que IGFBP-2 es un factor necesario para la proliferacion in vitro de celulas madre hematopoyeticas tanto humanas como murinas23. De acuerdo con este resultado, se ha encontrado que la delecion global de IGFBP-2 en ratones da como resultado una repoblacion comprometida de la medula osea despues de la irradiacion letal. Se ha sintetizado un peptido unico para el dominio de union a heparina (HBD) de IGFBP-2 y se ha demostrado que este peptido tiene la capacidad de aumentar el numero de osteoblastos y de celulas del estroma de medula osea in vitro y de mejorar la formacion de hueso in vivo independientemente de la senalizacion de IGF. Estos estudios investigan el papel del HBD de IGFBP-2 en el trasplante de celulas madre

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hematopoyeticas, un componente cntico de los reg^enes terapeuticos contra el cancer.

Trascendencia. El transplante de medula osea satisfactorio es una opcion terapeutica importante para neoplasmas tanto hematologicos como de tejidos solidos. Por ejemplo, un avance importante en el tratamiento del mieloma multiple ha sido el trasplante de celulas madre hematopoyeticas de la medula osea (HSC). La propagacion de las HSC antes del trasplante aumenta la probabilidad de exito del injerto y el restablecimiento de la hematopoyesis en estado estacionario4 Se ha demostrado que IGFBP-2 es un potente estimulo para la proliferacion in vitro de celulas madre hematopoyeticas de raton y humanas2,3 Sin embargo, se desconoce el mecanismo responsable de este efecto. Estudios recientes han establecido la importancia de IGFBP-2 para el exito del trasplante de medula osea in vivo, asf como su capacidad para estimular la diferenciacion de celulas estromales mesenquimales (MSC). Los estudios descritos en la presente memoria tienen por objeto senalar las vfas por las cuales IGFBP-2 aumenta la proliferacion de HSC y aumenta la creacion del nicho de celulas madre hematopoyeticas. Puesto que el trasplante de HSC se usa ampliamente como terapia para tumores malignos tanto hematopoyeticos como no hematopoyeticos, estos estudios deben tener amplias implicaciones terapeuticas.

Antecedentes. El potencial del nicho de celulas madre para responder al estres y a las lesiones requiere no solo HSC, sino tambien los osteoblastos que forman el hueso5,6 La Protema de Union al Factor de crecimiento de tipo Insulmico 2 (IGFBP-2) es una de las seis protemas de union a IGF (IGFBP 1-6) que regula la biodisponibilidad de los factores de crecimiento proliferativo IGF-1 e IGF-1I. Los estudios han establecido la importancia de IGFBP-2 en la regulacion de la proliferacion y la diferenciacion de osteoblastos7 . La evidencia preliminar sugiere que la IGFBP-2 puede actuar con independencia de IGF, pero los mecanismos que subyacen a estas acciones aun no se han investigado. Por ejemplo, la movilidad celular en el glioblastoma parece estar mediada por la union de IGFBP-2 al receptor de integrina a5 a traves del dominio Arg-Gly-Asp (RGD)8. Ademas, la escision proteolttica de IGFBP2 produce fragmentos pequenos que incluyen el dominio de union a heparina (HBD). Cuando el HBD se une a la matriz extracelular, puede estimular la proliferacion y el comportamiento metastasico de las celulas de neuroblastoma9. Se ha sintetizado una molecula pequena que contiene el HBD presente en la region conectora de IGFBP-2. De los dos HBD de esta molecula, el sintetizado es unico para IGFBP-2 y no esta representado en otras IGFBP. Este peptido se estudio para determinar su efecto sobre la proliferacion de HSC, la migracion, y el anidamiento de medula osea con el objetivo final de definir la utilidad del HBD como un adyuvante para terapias de trasplante de HSC.

Datos en apoyo de la investigacion propuesta. En el contexto de la formacion de hueso, se investigaron las acciones independientes de IGF de la IGFBP-2 utilizando un peptido sintetizado del HBD contenido en la region conectora de IGFBP-2. Este peptido es distinto de las otras protemas de union a IGF. In vitro, el peptido HBD rescato el fenotipo de mineralizacion osea baja de las celulas estromales de la medula osea y los osteoblastos de boveda craneal Igfbp2-/- (Fig 10) y estimulo la expansion periostica y el crecimiento en transplantes ex vivo de metacarpianos Igfbp2-/-. In vivo, el peptido HBD rescato el fenotipo de baja masa osea de ratones Igfbp2-/-, como se observa por aumento del numero de osteoblastos, la masa osea restaurada, y la mejora de la resistencia osea (Fig 11).

Ademas de sus acciones sobre las celulas mesenquimales, se ha demostrado que la IGFBP-2 es un factor necesario para la proliferacion in vitro de celulas madre hematopoyeticas murinas y humanas. La delecion global de IGFBP-2 da como resultado una hematopoyesis alterada de tal manera que la sangre periferica y bazo de los ratones Igfbp2-/- presentan un incremento significativo de linfocitos B y celulas de linaje mieloide. La administracion in vivo del HBD redujo el numero de celulas linfoides y celulas mieloides diferenciadas a los porcentajes de referencia de controles a los que se habfa inyectado PBS (Fig 12). Por otra parte, en los trasplantes de medula osea por repoblacion competitiva, celulas de donantes Igfbp2-/- no lograron repoblar de manera eficaz la medula osea de los receptores de la misma cepa (Fig 13).

Tomados en conjunto, estos hallazgos indican que HBD puede ser un componente importante de la senalizacion de IGFBP-2 para mejorar la proliferacion celular y suprimir la diferenciacion en HSC. Los estudios descritos en la presente memoria son para determinar si los efectos de promocion del crecimiento de IGFBP-2 sobre las HSC estan mediados por el HBD y son independientes de las acciones de IGF-1.

Investigacion del efecto del peptido del dominio de union a heparina (HBD) de IGFBP-2 sobre la proliferacion y la diferenciacion de celulas madre hematopoyeticas in vitro.

Razon fundamental: El aumento del numero de celulas madre hematopoyeticas a largo plazo (LT) en preparaciones de celulas de medula osea del donante antes del trasplante de medula osea mejora los resultados del trasplante. In vitro, IGFBP-2 actua aumentando la proliferacion de las HSC, pero el mecanismo subyacente a este efecto es desconocido. Se ha demostrado que la IGFBP-2 actua de manera independiente de la senalizacion de IGF-1 a traves de los dominios RGD y HBD. El uso de un peptido de HBD sintetizado unico para IGFBP-2, se sometera a ensayo la capacidad del HBD para aumentar la proliferacion de HSC humanas y murinas y mantener las HSC en un estado indiferenciado. Para delinear los efectos independientes IGFBP-2, se sometera a ensayo el HBD in vitro en HSC de raton recogidas de ratones tanto Igfbp2-/- como Igfbp2+/+.

Diseno y Metodos: El raton Igfbp2-/- fue creado por el Dr. John Pintar en la decada de los 90 y luego fue retrocruzado con B6 por el Dr. Terri Wood a principios de la decada de los 2000. Estos ratones se obtuvieron del Dr.

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Wood y continuaron siendo retrocruzados con C57BL6 en The Jackson Laboratory. El peptido HBD y el peptido control mezclado son proporcionados por David Clemmons, MD, de la UNC Chapel Hill. Para prolongar la corta semivida, el HBD se ha pegilado. Los experimented in vitro han demostrado que el HBD y el HBD pegilado son identicos en su capacidad para estimular la proliferacion y la diferenciacion de osteoblastos. Las hSc humanas aisladas de sangre del cordon umbilical se adquiriran de Stem cell Technologies y se cultivaran en medio para celulas madre Methocult, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las celulas estromales de medula osea murina (BMSC) se recuperaran de los femures de ratones Igfbp2-l- y Igfbp2+/+. Las BMSC se teniran con anticuerpos conjugados con fluorescencia y las HSC se aislaran utilizando el clasificador de celulas FACSAria. Las HSC se definiran como Lin- CD34'Sca-1 + Kit+Flk-2-. Se cultivaran veinte HSC de cada cepa en medio libre de suero StemSpan (Stem Cell Technologies) con un suplemento de heparina, factor de celulas madre, trombopoyetina, y FGF-1, como se informo anteriormente3 Se anadiran HBD, IGFBP-2 completa, o peptido de control revuelto a los cultivos de celulas en concentraciones predeterminadas y durante el tiempo de exposicion optimizado. En el dfa 10 del cultivo, se cuantificara la proliferacion celular de los espedmenes de ensayo y los controles mediante la absorcion de H3 Timidina como recuento de la radiactividad por minuto utilizando el contador de centelleo lfquido L56500. Los resultados se expresaran como el promedio de los ensayos por triplicado. Las celulas tambien seran analizadas por citometna de flujo para determinar los porcentajes de celulas madre hematopoyeticas a corto plazo (ST) y largo plazo (LT) que se define por CD34+Sca-1+Thy1.1+/f° c-kit+ lin- CD135- Slamf1/CD150+ CD11bLo y CD34- Sca-1+Thy1.1+/lD c-kit+ lin- CD135- slamf1/CD150+, respectivamente. Para confirmar que las HSC permanecen indiferenciadas en el cultivo, tambien seran determinados los porcentajes de celulas diferenciadas por citometna de flujo utilizando anticuerpos para marcadores espedficos del linaje incluyendo Ter119 (eritrocitos) LY6G (Gr-1, mieloide), CD3 (celulas T), CD19 (celulas B) y CD11b (Mac-1, macrofagos). Los porcentajes se basaran en la recogida de 20.000 eventos utilizando el citometro de flujo FACSCalibur. Los experimentos de cultivo celular se repetiran tres veces. El analisis de varianza (ANOVA) se utilizo para evaluar las diferencias entre los grupos. El intervalo de confianza se establecera en 95% (p = 0,05).

Investigacion de si los efectos de HBD sobre las celulas madre hematopoyeticas son independientes de la senalizacion de IGF.

Razon fundamental. El IGF-1 es un promotor de crecimiento para celulas normales y malignas. Los niveles elevados de IGFBP-2 en suero se reconocen como un indicador de mal pronostico en la enfermedad metastasica recurrente y en la leucemia mieloide aguda infantil despues de un trasplante de celulas madre hematopoyeticas10,11. Es, por lo tanto, importante determinar si los efectos de la IGFBP-2 sobre la expansion de las HSC in vitro son independientes de la senalizacion de IGF y si existe una sinergia entre el IGF y la IGFBP-2 con respecto a la senalizacion celular.

Diseno y Metodos: Las HSC se cultivaran a partir de celulas estromales de medula osea murina, como se describe en la presente memoria. La senalizacion de IGF sera inhibida por el bloqueo del receptor de IGF utilizando el anticuerpo alfa IR-3 en cultivos de HSC murinas. El anticuerpo alfa IR-3 utilizado en estos experimentos se ha publicado como bloqueador de la senalizacion de IGF en una variedad de tipos de celulas, incluyendo celulas madre hematopoyeticas murinas12. En estos experimentos, se evaluara el bloqueo satisfactorio del receptor IGF mediante la adicion de IGF 1 a cultivos de celulas y medicion de la proliferacion celular por medio de la absorcion de H3 timidina. Tras la confirmacion del bloqueo del receptor, se anadiran el HBD, el peptido revuelto y la IGFBP-2 completa a los cultivos de HSC, y se cuantificara la proliferacion mediante la absorcion de H3 Timidina. Los datos se analizaran por ANOVA como se describe en la presente memoria.

Investigacion de que eventos de senalizacion se inician en las celulas madre hematopoyeticas por el HBD de IGFBP-2.

Razon fundamental. Se ha demostrado que el HBD aumenta la proliferacion de osteoblastos al disminuir la expresion de PTEN e incrementar la fosforilacion de AKT. No se han determinado los mecanismos por los que la IGFBP-2 aumenta la proliferacion de las HSC. Los osteoblastos y las celulas hematopoyeticas residen juntos en estrecha proximidad en la medula osea, y muchas vfas de senalizacion celular son comunes paras los nichos tanto del hueso como hematopoyetico. Para determinar los eventos de senalizacion activados por el HBD, se realizaran los perfiles de expresion genica sobre cultivos de celulas HSC con y sin el HBD, peptido revuelto, e IGFBP-2 completa. A traves de las matrices de genes de PCR, se determinara la contribucion de la proliferacion celular y/o inhibicion de la apoptosis a la expansion de las HSC.

Diseno y Metodos: Las HSC se expondran a HBD, IGFBP-2 completa, y peptido revuelto, como se describe en la presente memoria. El ARN se extraera de las HSC cultivadas el dfa 10 de cultivo. El ADNc se preparara usando el Kit RT2 First Strand (SABiosciences, Frederick, MD), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se anadira una pequena parte alteuota (es decir, 25 pl) del coctel experimental que consiste en ADNc, Syber Green RT2 qPCR Master Mix (SABiosciences) a cada pocillo de la matriz de PCR en un formato de placa de 96 pocillos (SABiosciences). La amplificacion por PCR se realizara utilizando el termociclador Bio-Rad iQ5 con los siguientes ajustes: un ciclo durante 10 minutos a 95°C, seguido de 40 ciclos de 15 segundos cada uno a 95°C y 40 ciclos de un minuto cada uno a 60°C. Los valores de referencia y umbral se determinaran de forma manual. El AACt (cambio de umbral delta) se calculara para cada gen usando el SABiosciences PCR Array Data Analysis Web Portal (http://
www.SABiosciences.com). Una multiplicidad de cambio mayor de 1 entre el ACt experimental (cambio de umbral

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delta) y el ACt del control se considerara regulacion al alza del gen. Una multiplicidad de cambio de menos de 1 se considerara regulacion a la baja de los genes. Los valores de Ct superiores a 35 se consideraran negativos. Se realizaran matrices de PCR para la apoptosis, las celulas madre hematopoyeticas y la hematopoyesis, y las rutas de senalizacion de PI3K-Akt, Wnt, MAP quinasa e insulina.

Investigacion del efecto de HBD de IGFBP-2 sobre el trasplante de medula osea en vivo.

Determinacion de si las HSC se expanden in vitro utilizando el HBD de IGFBP-2 funcional en el trasplante de medula osea.

Razon fundamental: Si bien es importante que las HSC permanezcan indiferenciadas antes del trasplante, el trasplante con exito depende de un numero suficiente de HSC que aniden en la medula osea y se diferencien primero en celulas progenitoras y, finalmente, en eritrocitos y globulos blancos de la sangre maduros y funcionales. Se sometera a ensayo la capacidad de las HSC expandidas in vitro por el peptido HBD para repoblar la medula osea y para mantener la hematopoyesis en estado estacionario al ser implantadas en ratones receptores irradiados letalmente.

Diseno y Metodos: Las HSC murinas recogidos de ratones Igfbp2+/+ y expandidas in vitro por el peptido HBD seran trasplantadas a ratones Igfbp2+/+. Las HSC de sangre del cordon umbilical humano tambien expandidas por el peptido HBD seran trasplantadas a ratones con inmunodeficiencia combinada grave, diabeticos, no obesos (NOD/SCID), una cepa utilizada comunmente para los estudios de trasplante de celulas de medula osea humana. Los ratones receptores recibiran una dosis letal (10 Gy para IGFBP2+/+) o una dosis subletal (3,5 Gy para NOD/SCID) de irradiacion por exposicion a una fuente de Cesio utilizando el irradiador JL Shepherd 143-45 en dos sesiones y con 4 horas entre sesiones. Las HSC humanas y murinas se expandiran en cultivo durante 10 dfas, se someteran a recuento y se resuspenderan en PBS a una concentracion de 10 X 106celulas/ml. Se transplantaran 30 |jL de HSC del donante al plexo retroorbital de los ratones receptores. A las 8 semanas del trasplante, se sometera a ensayo la sangre periferica de los ratones receptores para determinar el exito de injerto de medula osea mediante la determinacion del porcentaje de celulas del donante murino Ly5.2+ y celulas de donantes humanos CD45/71+ por citometna de flujo en ratones Igfbp2+/+ y NOD/SCID respectivamente. La presencia de >80% de celulas donantes sera indicativa de exito en el injerto. Los ratones receptores seran sacrificados a las 16 semanas del trasplante. Los porcentajes de las principales poblaciones de celulas de sangre se determinaran en la sangre periferica por citometna de flujo utilizando anticuerpos conjugados a Ter 119 (eritrocitos), LY6G (Gr-1, mieloide), CD3 (celulas T), CD19 (celulas B), y CD11b (Mac-1, macrofagos). Como ensayo funcional de exito del injerto y evaluacion del potencial de auto renovacion de las HSC trasplantadas, se recogeran las celulas de la medula osea de un femur de ratones receptores a las 16 semanas del trasplante y se utilizaran como celulas del donante para un segundo conjunto de receptores de trasplante. Este segundo conjunto de receptores sera controlado como se ha descrito para los trasplantes originales. Se transplantaran tres ratones para cada condicion de ensayo y de control, y los trasplantes se realizaran en al menos 2 experimentos independientes para N = 6 para cada condicion experimental. Se utilizara ANOVA para analizar las diferencias entre los grupos como se ha descrito anteriormente.

Investigacion de si el HBD aumenta la eficacia de repoblacion de la medula osea despues de la mieloablacion en ratones Igfbp2-/-.

Razon fundamental. Se ha demostrado que la delecion global de la IGFBP-2 en receptores de medula osea Igfbp2-/- , no se opone exito del injerto de celulas de donantes positivos para IGFBP-2. Sin embargo, como se observa en los experimentos de trasplante de repoblacion competitivos, las celulas de donante de ratones Igfbp2-/- injertan de una manera 30% menos eficaz en comparacion con las celulas de donante Igfbp2+/+. En conjunto, estos datos implican a IGFBP-2 como un importante regulador de anidamiento de las HSC en la medula osea y un colaborador para establecer las HSC dentro del nicho de celulas madre hematopoyeticas. Ambos etapas son necesarias para el exito del trasplante. El objetivo de estos experimentos es rescatar la disminucion de la eficacia de injerto de las celulas de donantes Igfbp2-/- por medio de la administracion simultanea del peptido HBD a los receptores de transplantes Igfbp2-/-. Estos experimentos serviran como un ensayo funcional de la capacidad de HBD para mejorar el injerto de celulas de medula osea.

Diseno y Metodos: Se utilizara el sistema del gen Ly5.1/Ly5.2 en los experimentos competitivos para repoblar la medula osea y distinguir las celulas de la medula osea injertada de donantes de las celulas de medula osea endogena del receptor. Se utilizara la cepa de raton B6.SJL-ptprcapepcb/ BoyJ (Ly5.1 positivo) como fuente de celulas de donante de medula osea competidora. Todos los ratones receptores seran Ly5.2 positivo. Los ratones donantes y receptores seran macho y tendran 8 semanas de edad en el momento del trasplante. Para obtener celulas de medula osea de donantes, los ratones se sacrificaran y los femures se recuperaran de forma aseptica. Se recogeran las celulas de medula osea, se lavaran, y se resuspenderan en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentracion de 0,3 X 106 celulas por 30 jL de volumen de inyeccion. Para los trasplantes de repoblacion competitivos, las celulas del donante Ly5.1+ se mezclaran con las celulas de donante Ly5.2+ (igfbp2-/- o igfbp2+/+) en proporciones 1:0 (celulas 100% de donante Ly5.1, control positivo), 1:3 y 1:6. Se anadiran el peptido HBD, el peptido revuelto, o IGFBP2 completa a preparaciones de celulas de donantes a una concentracion optimizada en anteriores experimentos in vivo (50 jg/30 jL). Los ratones receptores se irradiaran letalmente y se trasplantaran, como se describe en la presente memoria. A las 8 semanas del trasplante, se determinaran los

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porcentajes de celulas de donante Ly5.1 positivas y Ly5.2 positivas injertadas en la sangre periferica por medio de citometna de flujo. Los receptores de trasplantes seran sacrificados a las 16 semanas del trasplante, y se analizaran las poblaciones de globulos blancas de la sangre por medio de citometna de flujo. Las HSC presentes en la medula osea se cuantificaran y clasificaran por medio del clasificador de celulas FACSAria. Las celulas clasificadas se cultivaran y se determinara el numero de unidades formadoras de colonias en un analisis de formacion de colonias en cultivo de celulas convencional (Stem Cell Technologies). Ademas, se evaluara la funcionalidad de las HSC trasplantadas por medio de un segundo conjunto de trasplantes, que se realizara como se describe en la presente memoria. Se transplantaran tres ratones para cada condicion de ensayo y de control, y los trasplantes se realizaran en al menos 2 experimentos independientes para N = 6 para cada condicion experimental. Se utilizara ANOVA para evaluar la significacion estadfstica entre las medias del grupo receptores de ensayo (Igfbp2-/-) y de control (Igfbp2+/+). El intervalo de confianza se fijara en <0,05.

Lista de referencias para el Ejemplo 12

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19. Czechowicz, A.; Kraft, D.; Weissman, I. L.; Bhattacharya, D., Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches. Science 2007, 318, (5854), 1296-9.

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25. Haug, J. S.; He, X. C.; Grindley, J. C.; Wunderlich, J. P.; Gaudenz, K.; Ross, J. T.; Paulson, A.; Wagner, K. P.; Xie, Y.; Zhu, R.; Yin, T.; Perry, J. M.; Hembree, M. J.; Redenbaugh, E. P.; Radice, G. L.; Seidel, C.; Li, L., N-cadherin expression level distinguishes reserved versus primed states of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell 2008, 2, (4), 367-79.

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Lo anterior es ilustrativo de la presente invencion, y no ha de interpretarse como limitante de la misma. La invencion se define por las siguientes reivindicaciones, incluyendo la misma los equivalentes de las reivindicaciones.

TABLA 1.

Analisis microTC de femures de IGFBP2+/+ y IGFBP2'/' tratados con PBS o PEG-HBD-peptido

IGFBP2+'+ PBS N = 8 IGFBP2'/‘ PBS N = 12 IGFBP2''- PEG-HBD N = 6

Apofisis media

Grosor cortical

0,198 ± 0,007 0,197 ± 0,003 0,200 ± 0,006

Area de hueso

0,889 ± 0,047 0,868 ± 0:018 0,903 ± 0,024

Area total

1,970 ± 0,062 1,955 ± 0,036 2,076 ± 0,031a

Area de hueso/area total

0,449 ± 0,011 0,444 ± 0,006 0,435 ± 0,014

Femur distal

Volumen de hueso/volumen total

0,143 ± 0,017 0,095 ± 0,007b 0,125 ± 0,012c

Numero trabecular

4,86 ± 0,16 4,29 ± 0,09b 4,47 ± 0,15

Grosor trabecular

0,047 ± 0,003 0,041 ± 0,001 0,048 ± 0,002d

Separacion trabecular

0,200 ± 0,007 0,230 ± 0,005b 0,221 ± 0,008

PEG-HBD; dominio de union a heparina pegilado Los valores se expresan como la media ± ETM. a; p <0,05 vs IGFBP2'/' con PBS b; p <0,01 vs IGFBP2+/+ con PBS c; p <0,05 vs IGFBP2 con PBS d; p <0,01 vs IGFBP2'/' con PBS

TABLA 2. El peptido de union a heparina de IGFBP2-2 reduce la masa grasa

Grupo de tratamiento

Numero de ratones Peso corporal (g) Masa Grasa (g)

IGFBP-2 -/- + placebo

8 30,4±1,5 6,21±0,76

IGFBP-2 -/- + HBD

8 24,9±1,3 3,67±0,36

IGFBP-2 +/+

8 25,2±1,1 3,82±0,67

TABLA 3

Composicion corporal de ratones Igfbp2~'~ antes del tratamiento con PBS o PEG-HBD.

Igfbp2_/_ PBS Igfbp2_/_ PEG-HBD

BMD en todo el cuerpo

0,0378 ± 0,0009 0,0382 ± 0,0008

BMC en todo el cuerpo/peso corporal

0,0115 ± 0,0004 0,0119 ± 0,0006

% de grasa corporal

10,4 ± 0,52 9,8 ± 0,62

PEG-HBD; dominio de union a heparina pegilado BMD; densidad mineral del hueso BMC; contenido mineral oseo BW; peso corporal

5 TABLA 4

Composicion corporal de ratones Igfbp2-

despues de tratamiento con PBS o PEG-HBD.

IgfbpZPBS IgfbpZPEG-HBD

BMD en todo el cuerpo

0,0445 ± 0,0006 0,0459 ± 0,0004

BMC en todo el cuerpo/BW

0,0138 ± 0,0004 0,0147 ± 0,0005

% grasa corporal

10,4± 0,70 10,4 ± 1,02

Peso de la grasa epididimal/BW (mg/g)

12,2± 0,51 12,2± 0,67

PEG-HBD; dominio de union a heparina pegilado DMO; densidad mineral del hueso BMC; contenido mineral oseo BW; peso corporal

TABLA 5

Analisis microTC de las vertebras (L5) de IGFBP2+'+ e IGFBP2'/'tratadas con PBS o PEG-HBD

IGFBP2+'+PBS N = 7 IGFBP2'/‘ PBS N = 9 IGFBP2''- PEG-HBD N = 6

Volumen de hueso/Volumen total

0,314 ± 0,020 0,278 ± 0,010 0,305 ± 0,012

Numero trabecular

6,15 ± 0,36 5,77 ±0,11 5,70 ±0,10

Grosor trabecular

0,052 ± 0,002 0,049 ± 0,001 0,054 ± 0,0028

Separacion trabecular

0,155 ± 0,009 0,160 ± 0,004 0,161 ± 0,004

PEG-HBD; dominio de union a heparina pegilado Los valores se expresan como la media ± ETM. a; p <0,05 vs IGFBP2'/' con PBS

TABLA 6

Analisis histomorfometrico de femur de ratones IGFBP2"'" tratados con PBS o PEG-HBD.

IGFBP2'/' PBS N = 5 IGFBP2'/' PEG-HBD N = 5

OS/BS (%)

2,38 ± 1,11 3,56 ± 0,44

ObS/BS (%)

11,5 ± 1,03 16,26 ± 1,42n

Nob/BPm (/ mm)

12,31 ± 0,52 16,3 ± 1,4a

ES/BS (%)

17,11 ± 0,93 14,79 ± 01,58

OcS/BS (%)

11,02 ± 0,87 9,14 ± 0,90

Noc/BPm (/ mm)

5,19 ± 0,37 4,37 ± 0,39

MAR (|jmMa)

0,873 ± 0,0078 0,91 ± 0,0453

BFR/BSd (|jm3/|jm2^a)

0,0796 ± 0,0164 0,080 ± 0,0191

PEG-HBD; dominio de union a heparina-pegilado, OS; superficie osteoide, BS; superficie del hueso, ObS; superficie de osteoblastos, Nob; numero de osteoblastos, BPm; penmetro del hueso, ES; superficie de erosion, OcS; superficie de osteoclastos, Noc; numero de osteoclastos, MAR; tasa de aposicion mineral, BFR; tasa de formacion de hueso Los valores se expresan como la media ± ETM a; p <0,05 vs IGFBP2'/' con PBS

Claims (16)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos KHHLGLEEPKKLR (SEQ ID NO: 1).
2. 2. El peptido de la reivindicacion 1, caracterizado por que comprende adicionalmente un radical de polietilenglicol (PEG) acoplado a cualquiera de los extremos N o C del mismo.
3. 3. Una composicion que comprende el peptido de una de las reivindicaciones 1 o 2, combinado con un portador farmaceuticamente aceptable.
4. 4. La composicion de la reivindicacion 3, caracterizada por que el portador se selecciona entre a) y b):

   a) en donde dicho portador es un portador lfquido; y

   b) en donde dicho portador es un implante biomedico.
5. 5. Una preparacion combinada del peptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o la composicion de cualquiera de las reivindicaciones 3 o 5 y un inhibidor de la resorcion osea.
6. 6. Una preparacion combinada del peptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o la composicion de cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4 y un agente de control del peso, opcionalmente en donde dicho agente de control del peso se selecciona del grupo que consiste en un supresor del apetito, un inhibidor de lipasa, un antidepresivo, un agente anti-convulsivo y cualquier combinacion de los mismos.
7. 7. El peptido de una de las reivindicaciones 1 o 2, para su uso en terapia.
8. 8. El peptido de una de las reivindicaciones 1 o 2, para su uso en la mejora de la formacion de hueso y la inhibicion de la resorcion osea de forma simultanea.
9. 9. El peptido de una de las reivindicaciones 1 o 2, para su uso en la induccion del deposito y la maduracion de hueso.
10. 10. El peptido de una de las reivindicaciones 1 o 2, para su uso en el tratamiento de una afeccion osea comprometida.
11. 11. El peptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en donde la afeccion osea comprometida se encuentra en un sitio diana de un sujeto, opcionalmente en donde el sitio diana se selecciona del grupo que consiste en un espacio intervertebral, una articulacion facetaria, un sitio de una fractura de hueso, un hueso de la boca, un hueso de la barbilla, un hueso de la mandfbula, un sitio de implante y cualquier combinacion de los mismos.
12. 12. El peptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en donde la afeccion osea comprometida se selecciona del grupo que consiste en un hueso roto, un defecto oseo, un trasplante de hueso, un injerto de hueso, un cancer de hueso, un reemplazo de una articulacion, una reparacion de las articulaciones, una fusion, una reparacion de una faceta, una degeneracion osea, un implante dental, una reparacion dental, un deficit de medula osea y cualquier combinacion de los mismos.
13. 13. El peptido de una de las reivindicaciones 1 o 2, para su uso en el control del peso corporal en un sujeto.
14. 14. El peptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 13, en donde dicho sujeto tiene un mdice de masa corporal de al menos 25 a 30 kg/m2.
15. 15. El peptido de una de las reivindicaciones 1 o 2, para su uso en la mejora de la reconstitucion de la medula osea en un sujeto que lo necesite.
16. 16. El peptido para su uso de la reivindicacion 15, en donde el sujeto se selecciona del grupo que consiste en: un sujeto que recibe o ha recibido quimioterapia, un sujeto que recibe o ha recibido radiacion, un sujeto que tiene anemia aplasica, un sujeto que tiene mielodisplasia, y cualquier combinacion de los mismos