JP6897996B2 - 骨移植片の骨形成潜在能の増強 - Google Patents
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Description
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
骨移植片内の細胞の生存を増強する方法であって、前記骨移植片を、移植時における前記骨移植片の細胞の生存を増強するのに十分な期間にわたり、有効用量のWntポリペプチドでのex vivo処置に供するステップを含む、方法。
(項目2)
骨移植片の骨形成潜在能を増強する方法であって、前記骨移植片を、移植時における前記骨移植片の細胞の生存を増強するのに十分な期間にわたり、有効用量のWntポリペプチドでのex vivo処置に供するステップを含む、方法。
(項目3)
治癒潜在能が低下した被験体に由来する骨移植片を再活性化するための方法であって、前記骨移植片を、移植時における前記骨移植片の細胞の生存を増強するのに十分な期間にわたり、有効用量のWntポリペプチドでのex vivo処置に供するステップを含む、方法。
(項目4)
前記骨移植片が、自家移植片である、項目1から3のいずれか一項に記載の方法。
(項目5)
前記骨移植片が、同種移植片である、項目1から3のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
前記骨移植片が、幹細胞集団を含む、項目1から3のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
前記骨移植片が、骨髄由来幹細胞集団を含む、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記骨移植片が、骨髄由来間葉系幹細胞を含む、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記骨移植片が、ヒト被験体に由来する、項目1から3のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記ヒト被験体が、老齢患者である、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記ヒト被験体が、少なくとも60歳である、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記ヒト被験体が、少なくとも65歳である、項目10に記載の方法。
(項目13)
前記ヒト被験体が、少なくとも70歳である、項目10に記載の方法。
(項目14)
前記ヒト被験体が、少なくとも75歳である、項目10に記載の方法。
(項目15)
前記ヒト被験体が、少なくとも80歳である、項目10に記載の方法。
(項目16)
前記ヒト被験体が、少なくとも85歳である、項目10に記載の方法。
(項目17)
前記ヒト被験体の治癒潜在能が低下している、項目8に記載の方法。
(項目18)
前記ヒト被験体が、喫煙者である、項目16に記載の方法。
(項目19)
前記ヒト被験体が、糖尿病患者である、項目16に記載の方法。
(項目20)
前記ヒト被験体が、栄養不良である、項目16に記載の方法。
(項目21)
前記Wntポリペプチドが、Wnt3aである、項目1から19のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
前記Wntポリペプチドが、ヒトWnt3aである、項目20に記載の方法。
(項目23)
前記Wntポリペプチドが、ヒトリポソームWnt3a(LWnt3a)である、項目21に記載の方法。
(項目24)
前記骨移植片を、レシピエント被験体へと導入するステップをさらに含む、項目1から23のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
前記レシピエント被験体が、ヒト患者である、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記骨移植片が、歯科インプラントを支持するかまたは歯科インプラントの支持を増進するために使用される、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記骨移植片が、骨折を修復するのに使用される、項目25に記載の方法。
(項目28)
前記骨移植片が、罹患した骨を修復または再構築するのに使用される、項目25に記載の方法。
(項目29)
前記骨移植片が、前記レシピエントの股関節、膝、または脊柱において使用される、項目27または28に記載の方法。
本方法について記載する前に、このような方法は、変化することが当然であるので、本発明は、記載される特定の方法に限定されるものではないことを理解されたい。また、本発明の範囲を限定するのは、付属の特許請求の範囲だけであるので、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態だけについて記載することを目的とするものであり、限定的であることを意図するものではないことも理解されたい。値の範囲が提示される場合は、その範囲の上限と下限との間の、文脈によりそうでないことが明確に指示されない限りにおいて、下限の単位の10分の1までの、各中間の値、およびその言明された範囲内の他の任意の言明された値または中間の値が、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立に、本発明に包含されるより小さな範囲内に含まれ、言明された範囲内の、任意の具体的に除外された限界により決まる。そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。Singletonら、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology、2版、J. Wiley & Sons(New York、NY、1994年)は、当業者に、本出願で使用される用語の多くに対する一般的な指針をもたらす。
骨形成能力は、骨移植のための細胞を、有効用量のWntタンパク質、例えば、L−Wnt3Aと共に、骨形成潜在能を増強するのに十分な期間にわたり、インキュベートすることにより増強される。
Wnt3aは、高齢動物に由来する骨移植片に対して骨形成能を再確立する
加齢に伴う骨髄の脂肪変性は、老齢者における骨折治癒の遅延および骨粗鬆症関連骨折に寄与する。この脂肪変化の根底をなす機構は、高齢骨髄腔内のWntシグナル伝達レベルと関連する可能性がある。若齢では、長骨は、ヘムに富む骨髄で満たされているが、年齢と共に、脂肪性骨髄で置きかえられる。骨髄の加齢に伴う脂肪変性は、老齢者における骨格治癒の遅延および骨粗鬆症関連骨折と強く関連し、これは、生物医学的負荷の増大を構成する。結果として、骨髄の、主に脂肪性の組織への転換を理解しようと、多大な努力がなされている。この骨髄の脂肪変性は、骨形成潜在能の喪失と並行して生じ、これは、骨髄を、骨移植の目的で、臨床的に使用する場合に明らかとなる。
動物:全ての手順は、Stanford Committee on Animal Researchにより承認された。Axin2LacZ/+マウスについては、記載されている。ベータ−アクチン増強緑色蛍光タンパク質(ACTB−eGFP)トランスジェニックマウス(The Jackson Laboratory、Sacramento、California)は、骨内、骨髄内、および他の関与性の細胞集団内のGFPの頑健な発現レベルのために選択した。ACTB−eGFPトランスジェニックマウスを、Axin2LacZ/+マウスと交配させて、Axin2LacZ/+マウス、Axin2LacZ/+/ACTB−eGFPマウス、ACTB−eGFPマウス、および野生型(WT)マウスを得;12〜16週齢のマウスを、若齢と考え、40週齢を超えるマウスは、高齢と考えた。高齢(8カ月齢)のニュージーランドホワイトウサギも使用した。ウサギ1匹を、骨移植片ドナーとして用い、ウサギ9匹を、実験動物として用いた。
骨髄移植片は、骨形成潜在能を有する:骨移植片材料の運命を追跡するために、本発明者らは、全骨髄を、ACTB−eGFPトランスジェニックマウスから採取し、等サイズのアリコートへと細分し(図1−A)、次いで、同系宿主マウスの頭蓋冠内に創出された、非治癒性の、臨界サイズの骨格欠損へと移植した(図1−B)。生存可能な移植細胞およびそれらの後代は、それらのGFP標識により、損傷部位内で同定可能であった(図1−C)。ドナーと宿主とが遺伝子的に同一でない場合、移植細胞の大半は死滅したが、この理由で、同系であり、免疫学的に適合性のドナー−宿主の組合せだけを使用した。
自家骨移植片の、幹細胞活性化剤であるWNT3Aによるリエンジニアリング
自家骨移植は、骨欠損を処置するのに、最も一般に使用される手順であるが、老齢患者では信頼できないと考えられている。自家移植片の有効性は、材料内に存在する多能性幹細胞に由来し得る。老化により、これらの幹細胞の生存可能性および機能が弱まることから、骨癒合率は一定でなくなる。本発明者らは、自家移植片の有効性における加齢に伴う変化には、材料内の内因性Wntシグナル伝達の喪失が随伴することを示す。本発明者らは、Wnt阻害剤であるDkk1を過剰発現させることにより、内因性Wntシグナル伝達のこの喪失を模倣し、Wntシグナル伝達が、自家移植片の骨分化に必要であることを見出した。本発明者らは、ex vivoの薬物送達系を開発し、そこで、自家移植片を、WNT3Aタンパク質の安定化処方物中でインキュベートし、次いで、これを、in vivoに導入した。生物工学的に操作された(bioengineered)自家移植片は、受容部位内の生存の著明な改善を示した。WNT活性化自家移植片では、有糸分裂活性および骨分化は、自家移植片単独と比較して、著明に増強された。脊椎固定モデルでは、L−WNT3Aで処置された高齢自家移植片は、自家移植片単独と比較して、優れた骨形成の能力を示した。したがって、L−WNT3A中の短時間のインキュベーションは、自家骨移植の有効性を確実に改善し、これは、老齢者における患者ケアを著明に改善する潜在的可能性を有する。
動物のケア:全ての手順は、Stanford Committee on Animal Researchにより承認されたプロトコールに従った。ベータ−アクチン増強緑色蛍光タンパク質(ACTB−eGFP;The Jackson Laboratory、Sacramento、California)およびCD1野生型同系マウスを使用した。マウス<3カ月齢を若齢と考え、マウス>10カ月間を高齢と考えた。Axin2CreERT/+;R26RmTmG/+マウスは、Jackson Labsから購入した。高齢野生型Lewisラット(Charles Rivers、MA製の「引退した種畜」)は、AAUCガイドラインおよびIUPACガイドライン(プロトコール:13146)に従う脊椎固定術のために活用した。
骨移植片材料は、複数の幹細胞集団/前駆細胞集団を含有する:自家移植片を採取するのに最適な解剖学的部位は、ドナー部位の罹患状態および骨備蓄の利用可能性を含む、多数の因子に依存する。本発明者らは、改変リーマー潅流吸引(RIA:reamer−irrigator−aspirator)法を活用して、BGMを、3カ所の解剖学的部位から採取したところ、大腿骨、腸骨稜、および脛骨は、組織学的外見が顕著に異なるBGMをもたらすことに注目した。造血細胞に加えて、大腿骨のBGMは、若齢動物から採取する場合であってもなお、脂肪細胞を含有した(図7A)。腸骨稜のBGMは大部分、緊密な接着細胞で覆われた骨梁断片を含んだ(図7B)。脛骨に由来するBGMは、大量の線維性間質、および小型の無核細胞(図7C)を含有した。本発明者らは、定量的RT−PCRを使用して、内因性骨形成遺伝子の発現を評価し、3つの供給源のうち、腸骨稜のBGMが、アルカリホスファターゼおよびオステオカルシンを、有意に高レベルで発現することを見出した(図7D)。一般に、自家移植片の骨形成特性は、骨移植片材料(BGM)内の幹細胞集団/前駆細胞集団および骨芽細胞に帰せられると広く考えられる。本発明者らは、BGMを、腎被膜下(SRC)アッセイへと移植することにより、この仮説について直接調べた。SRCは、移植された組織へと血管供給を提供し、細胞の、複数の種類の組織であって、骨、皮膚、筋肉、歯、器官、および腫瘍を含む組織への分化を支援する。BGMを、腸骨稜から採取し、次いで、動物の腎臓被膜下へと移植し(図7A)、7日間にわたり発生させた。BrdUの取込みにより、自家BGM内の細胞の高度な有糸分裂活性が裏付けられた(図7B)。Runx2(図7C)、Sox9(図7D)、およびPPARγ(図7E)についての免疫染色により、BGM内細胞のサブセットは、骨形成、軟骨形成、および脂肪形成への拘束と関連した遺伝子マーカーを発現することが裏付けられた。7日目には、BGM由来細胞の部分集団は、骨(図7F)、軟骨(図7G)、および脂肪(図7H)へと分化していた。まとめると、これらのデータにより、BGMは、3つの系統全てへと分化することが可能な幹細胞/前駆細胞を含有することが裏付けられた。
Claims (12)
- 背骨の修復のための、有効用量の単離された骨移植片材料であって、前記単離された骨移植片材料が、Wntタンパク質を含むリポソームでのex vivo処置に供された幹細胞または前駆細胞を含み、前記細胞が、前記Wntタンパク質を含む前記リポソームでのex vivo処置後に、Axin2、Tcf4またはLef1を含む1または複数のバイオマーカーについての発現のレベルの増大を有し、前記1または複数のバイオマーカーの発現のレベルの前記増大が、前記Wntタンパク質を含む前記リポソームでのex vivo処置に供されていない、単離された骨移植片材料由来の同等の細胞と比べたものであり、前記単離されたヒト骨移植片材料が少なくとも50歳のヒト被験体由来である、有効用量の単離された骨移植片材料。
- 前記細胞が、Runx2、Osterix、オステオカルシンまたはアルカリホスファターゼを含む、1または複数のバイオマーカーについての発現のレベルの増大をさらに有する、請求項1に記載の有効用量の単離された骨移植片材料。
- Axin2またはLef1発現のレベルの前記増大が、Axin2またはLef1遺伝子発現のレベルの増大である、請求項1に記載の有効用量の単離された骨移植片材料。
- Runx2発現のレベルの前記増大が、Runx2タンパク質発現のレベルの増大である、請求項2に記載の有効用量の単離された骨移植片材料。
- 前記Wntタンパク質がWnt3aタンパク質である、請求項1に記載の有効用量の単離された骨移植片材料。
- 前記細胞が骨髄幹細胞または骨髄前駆細胞を含む、請求項1に記載の有効用量の単離された骨移植片材料。
- 前記細胞が間葉系幹細胞を含む、請求項1に記載の有効用量の単離された骨移植片材料。
- 前記単離された骨移植片材料が、前記Wntタンパク質を含む前記リポソームでのex
vivo処置後にアポトーシスの低減を有する細胞を含み、アポトーシスの前記低減が、前記Wntタンパク質を含む前記リポソームでのex vivo処置に供されていない、単離された骨移植片材料由来の同等の細胞と比べたものである、請求項1に記載の有効用量の単離された骨移植片材料。 - 前記細胞におけるカスパーゼ活性の低減が、前記Wntタンパク質を含む前記リポソームでのex vivo処置に供されていない、単離された骨移植片材料由来の同等の細胞と比べたカスパーゼ活性の低減として測定される、請求項8に記載の有効用量の単離された骨移植片材料。
- 前記単離された骨移植片材料が、前記Wntタンパク質を含む前記リポソームでのex vivo処置後に細胞増殖の増大を有する細胞を含み、細胞増殖の前記増大が、前記Wntタンパク質を含む前記リポソームでのex vivo処置に供されていない、単離された骨移植片材料由来の同等の細胞と比べたものである、請求項1に記載の有効用量の単離された骨移植片材料。
- 前記細胞における有糸分裂活性の増大が、前記Wntタンパク質を含む前記リポソームでのex vivo処置に供されていない、単離された骨移植片材料由来の同等の細胞と比べた有糸分裂活性の増大として測定される、請求項10に記載の有効用量の単離された骨移植片材料。
- 前記単離された骨移植片材料が単離されたヒト骨移植片材料である、請求項1に記載の有効用量の単離された骨移植片材料。
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