KR20160032125A - 골 이식편의 골형성 잠재력 강화 - Google Patents

골 이식편의 골형성 잠재력 강화 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Wnt 폴리펩티드, 예컨대 리포솜 Wnt 폴리펩티드의 생체외 처리에 의한 골 이식편의 골형성 잠재력 강화에 관한 것이다.

Description

골 이식편의 골형성 잠재력 강화{ENHANCEMENT OF OSTEOGENIC POTENTIAL OF BONE GRAFTS}
본 발명은 Wnt 폴리펩티드, 예컨대 리포솜 Wnt 폴리펩티드로의 생체외 처리에 의한 골 이식편의 골형성 잠재력의 강화에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 Wnt3a 단백질, 바람직하게는 리포솜 Wnt3a(L-Wnt3a)를 사용한 골 이식편의 생체외 처리에 관한 것이다.
정형외과 및 치과용 임플란트는 다양한 관절 및 치아 대체물에 사용되며 인간 및 동물에서, 특히 둔부와 무릎 관절 및 치아 대체물로 뼈 수복을 촉진시키는데 사용된다. 비록 많은 개체들이 합병증을 수반하지 않고 치유 및 기능 회복을 경험하지만, 전체 관절 대체물에 대해 10-20%로 추산되는, 높은 합병증율도 존재한다. 대부분의 이들 실패 및 후속 교정 수술은 임플란트-뼈 접점에서의 실패로 인해 필요하다. 또한, 치과교정 치아 이동용 정착 장치로 사용되는 임플란트는 실패율이 40%로 추산되고 임플란트-뼈 접점에서의 실패때문에 추가 임플란트의 후속 배치가 필요하다.
정형외과 및 치과용 임플란트는 비교적 불활성("알로플라스틱" 재료)인, 전형적으로 금속 및 세라믹 또는 플라스틱 재료의 조합물로 만들어진다. 정형외과 임플란트 수술 결과를 향상시키기 위한 이전의 접근법은 주로 뼈 형성을 높히도록 디자인된 임플란트 표면에 대한 물리적 변화에 집중되었다. 이러한 접근법들은 뼈 내방성장을 촉진하기 위해 다공성 금속성 표면을 갖는 임플란트의 사용 및 임플란트에 히드록시아파타이트 플라즈마의 분무를 포함한다. 치과용 임플란트를 사용하는 접근법은 또한 표면 거칠기가 예컨대 그리트 블라스팅, 산 에칭, 또는 산화 등의 방법에 의해 부여되는 지형적으로 강화된 티타늄 표면의 사용을 포함한다.
또한 골유착능을 촉진시키기 위한 노력으로, 임플란트 표면은 주요한 개조를 겪었다. 예를 들면, 세포가 RGD 서열을 세포외 매트릭스에 부착시키는데 사용하기 때문에 아르기닌--글리신--아스파르트산(RGD) 서열을 함유하는 짧은 펩티드를 임플란트 표면에 부착시켰다. 조사관들은 개질된 임플란트 표면에 이들 세포 부착을 재생성시키는 시도를 하였지만 이러한 전략은 임플란트 골유착능 및 물리적 고정능을 단지 약하게만 증가시켰다. 대안적으로, 임플란트 주변에 혈관 내방성장을 자극시키기 위한 시도로, 그들 표면을 혈관생성 성장 인자 VEGF를 함유하는 코팅으로 피복시켰다. 염수액에 침지시킨 임플란트가 임플란트 골유착능을 증가시키기 위한 수단으로 출시되었지만 그러한 주장을 입증할만한 데이타가 거의 없거나 전혀 없다.
골유착능을 자극시키기 위해 채택된 다른 전략은 임플란트 표면을 나노-텍스처링하는 것이다. 이러한 전략의 근거는 텍스처링이 표면적을 증가시키고 따라서 임플란트가 임플란트 주변 환경에서 세포에 대해 "슬라이딩"되는 것을 방지한다는 것이다. 그러나, 임상 시도에서, 나노-텍스처링은 측정할 수 있는 장점을 야기시키지 못했다.
임플란트 골유착능을 자극하기 위해 단백질-기반 접근법의 사용이 또한 광범위하게 조사되었다. 재조합 골형성 단백질(BMP)은 골격 골절에서 강건한 뼈 형성을 유도하고 또한 임플란트 주변에 직접적인 뼈 형성을 자극하는 시도에서 적용되었다. 시험관내 결과가 고무적이었지만, 생체내 데이타는 확실성이 덜 하였다. 재조합 BMP는 골수강 내 세포의 골형성 분화를 억제하고 결과적으로, 임플란트 골유착능에 대한 사용이 금지되었다. 다음의 문헌을 참조한다: [Sykaras et al.(2004) Clin Oral Investig 8(4): 196-205]; 및 [Minear et al.(2010) Journal of Bone and Mineral Research 25(6): 1196-207]. BMP의 사용은 이소성 골화 및 비제어적 감염의 높은 발생률과 관련되어 있고 보다 최근의 메타데이타 분석은 또한 높은 암 위험율을 보여주었다.
Wnt 단백질은 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질(LRP) 및 Frizzled에 의해 코딩되는 세포 표면 수용체에 결합하는 고도의 보존성 분비 신호전달 분자의 패밀리를 형성한다. WNT 유전자 패밀리는 분비 신호전달 단백질을 코딩하는 구조적으로 관련된 유전자로 이루어진다. 이들 단백질은 종양형성과, 배아발생 동안의 패터닝 및 세포 운명 조절을 포함한, 몇몇 발생 과정에 연루된다. 결합되면, 리간드는 DNA 결합 단백질 TCF 및 β-카테닌의 핵 활성을 통해 표적 유전자의 전사를 궁극적으로 초래하는 세포내 사건의 캐스캐이드를 개시시킨다(Clevers H, 2004 Wnt signaling: lg-norrin the dogma. Curr Biol 14: R436-R437; Nelson WJ, Nusse R 2004 Convergence of Wnt, beta-catenin, and cadherin pathways. Science 303: 1483-1487; Gordon MD, Nusse 2006 Wnt signaling: Multiple pathways, multiple receptors, and multiple transcription factors. J Bioi Chem 281: 22429-22433).
Wnt는 또한 골형성 프로그램과 연관된 다양한 세포내 결정에 관여된다. 예를 들면, Wnt는 중간엽 전구체 세포의 연골형성 또는 골형성 세포 운명으로의 투입에 영향을 미치는, sox9 및 runx2의 발현 수준을 조절한다. Wnt는 골전구체 세포의 분화 속도에 영향을 미친다. 성체 동물에서, Wnt 신호전달이 골질량을 조절한다는 많은 증거가 존재한다. 예를 들면, 인간 Wnt 공수용체 LRP5의 기능 획득 돌연변이는 제I형 골석화증, 및 골내막 비대증 또는 상염색체 우성 골경화증을 포함한, 몇몇 높은 골질량 증후군과 연관있다. Wnt 기능손실 돌연변이는 골다공증-가신경교종을 포함한 낮은 골질량 질환을 야기시킨다. Wnt 억제인자 Dkk1의 높은 생산은 높은 뼈 재흡수를 그의 두드러진 특징 중 하나로 갖는 질환인, 다발성 골수종과 연관된다. 보다 구체적인 내용을 위해서, [S. Minear et al., Wnt proteins promote bone regeneration. Sci. Transl. Med. 2, 29ra30(2010)]; [Zhao et al., Controlling the in vivo activity of Wnt liposomes, Methods Enzymol 465: 331-47(2009)]; [Popelut et al., The acceleration of implant osseointegration by liposome Wnt3a, Biomaterials 31 9173e9181(2010)]; 및 [Morrell NT, Leucht P, Zhao L, Kim J-B, ten Berge D, et al.(2008) Liposome Packaging Generates Wnt Protein with In Vivo Biological Activity. PLoS ONE 3(8): e2930]를 참조한다.
Wnt 단백질과 지질 소포체(리포솜)의 조합은 생물학적 활성(Minear et al., 2010, 상동; 및 Popelut et al., 2010, 상동)을 갖는 Wnt 제제(Morrell et al., 2008, 상동; 및 Zhao et al., 2009, 상동)를 생성시킴이 확인되었다. 가용성 무시(wingless) 단백질의 생물학적 활성은 문헌 [van Leeuwen et al. (1994) Nature 24: 368(6469): 3424]에 기술되어 있다. 가용성의, 생물학적 활성 척추동물 Wnt 단백질을 사용한 Wnt-Frizzled 상호작용의 생화학적 특징이 [Hsieh et al.(1999) Proc Natl Acad Sci US A 96(7): 3546-51]에 기술되어 있다. [Bradley et al.(1995) Mol Cell Bioi 15(8): 4616-22]는 유사분열 촉진 활성을 갖는 Wnt 단백질의 가용성 형태를 기술하고 있다. 골유착능 향상을 위한 리포솜 Wnt 단백질의 사용이 미국 공개 특허 출원 제20120115788호에 기술되어 있다.
일 측면에서, 본 발명은 골 이식편을 Wnt 폴리펩티드로 생체외 처리하는 단계를 포함하는, 골 이식편의 세포 생존을 강화시키는 방법에 관한 것이다. 다른 측면에서, 본 발명은 제한없이 Wnt3를 포함하는, Wnt 폴리펩티드의 유효량으로 골 이식편을 생체외 처리하는 단계를 포함하는, 골 이식편의 골형성 잠재력을 강화시키는 방법에 관한 것이다. 추가 측면에서, 본 발명은 골 이식편을 Wnt 폴리펩티드로 생체외 처리하는 단계를 포함하는, 치유 잠재력이 감소된 피험체로부터 골 이식편을 재활성화시키는 방법에 관한 것이다. 모든 측면에서, 골 이식편은 자가이식편이거나 또는 동종이식편일 수 있다. 모든 측면에서, 골 이식편은 줄기 세포 집단, 예컨대, 예를 들면, 골수 유래 줄기 세포 집단, 예를 들어 골수 유래 중간엽 줄기 세포를 포함할 수 있다.
골 이식편은 바람직하게는 인간 피험체로부터 유래된다. 일 실시양태에서, 인간 피험체는 노령 환자이다. 일정 실시양태에서, 인간 피험체는 적어도 50세, 적어도 55세, 적어도 60세, 또는 적어도 65세, 또는 적어도 70세, 또는 적어도 75세, 또는 적어도 80세, 또는 적어도 85세이다. 다른 실시양태에서, 인간 피험체는 치유 잠재력이 감소되었으며, 예를 들어 흡연자이거나, 당뇨병이거나, 또는 영양 결핍을 특징으로 하는 인물이다.
모든 측면 및 실시양태에서, Wnt 폴리펩티드는 바람직하게는 Wnt3a, 보다 바람직하게는 인간 Wnt3a, 가장 바람직하게는 리포솜 인간 Wnt3a(L-Wnt3a)이다. 추가 측면에서, 본 발명의 방법은 수령 피험체, 예컨대 인간 환자에게 골 이식편을 도입하는 단계를 더 포함한다. 다양한 실시양태에서, 골 이식편은 뼈 골절을 수복하기 위해, 치과용 임플란트를 지지하는데 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 골 이식편은 질환이 있는 뼈를 수복하거나 또는 재건하는 데 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 골 이식편은 수령자의 둔부, 무릎 또는 척추에 사용된다.
도 1A-1J. 골 이식편은 골형성 잠재력을 갖는다. 도 1-A. 형질이식 베타 액틴-강화된 녹색 형광발광 단백질(β-액틴-eGFP) 수컷 마우스로부터 회수한 전체 골수의 대표적인 분취액 중 전체 DNA의 정량화; 각 분취액은 골 이식편을 구성한다. 도 1-B. 골 이식편은 두정골(백색 수직 파선으로 윤곽표시)을 나누는 시상봉합에 생성된, 2-mm 직경 임계 크기 두개관 결함(원형으로 경계표시)에 이식시켰다. 검은색 파선은 조직 섹션의 평면을 가리킨다. 도 1-C. 이식 1일 후 손상 부위로부터의 대표적인 조직 섹션; GFP 면역염색은 eGFP 도너(n = 5)로부터 이식된 세포를 식별하고; 하부 공간은 하시상 정동맥을 나타낸다. 도 1-D. 이식 5일 후 대표적인 조직 섹션; 브로모데옥시우리딘(BrdU)에 대한 면역염색은 S상 내 세포를 식별한다. 도 1-E. 이식 7일 후에, GFP 면역염색은 골 이식편(노란 점선)을 식별하고; 도 1-E의 박스 영역내 고배율 영상(도 1-F)은 손상 부위 내 대부분의 세포가 GFP-양성 이식편으로부터 유래함을 보여준다. 도 1-G. 이식 후 14일에, 마이크로-CT 재현은 2-mm 두개관 손상이 임계-크기 미치유 결함(n = 6)40으로 구성됨을 입증하였다. 도 1-H. 골 이식편을 처리한 동일 크기 두개관 손상이 치유되었다(n = 6). 도 1-I 및 1-J. 이식후 7일에, 아닐린 블루 염색을 사용해 새로운 유골 매트릭스를 식별하였고; 미처리 손상 부위(노란색 점선)에 유골 매트릭스가 형성되지 않았다. 도 1J는 골 이식편으로 처리된 대표적인 샘플에서 이식 후 7일에 가시적인 유골 매트릭스가 보였다. 약어: IHC = 면역조직화학. 화살표는 온전한 뼈의 모서리를 표시한다. 기준자: 2 ㎜(도 1-B); 200 ㎛(도 1-C 및 1-D); 100 ㎛(도 1-E); 40 ㎛(도 1-F); 2 ㎜(도 1-G); 및 200 ㎛(도 1-I 및 1-J).
도 2A-2I. 골형성 잠재력은 노령 동물 유래의 골 이식편에서 감소하였다. 이식 후 7일(d7)에, 아닐린 블루 염색은 노령 도너(도 2-B) 대비 젊은 도너(도 2-A) 유래 골 이식편에 의해 생성된 유골 매트릭스를 표시한다. 도 2-C. 젊은 골 이식편 및 노령 골 이식편으로부터 형성된 새로운 뼈의 양에 대한 조직형태계측 분석. 도 2-D. 이식 후 7일(d7)에, 녹색 형광발광 단백질(GFP) 면역염색은 도너가 노령 도너와 비교하여 젊은 경우의 뼈 이식편에서 유래된 세포를 식별한다(도 2-E). 도 2-F. 이식편이 노령(백색 막대, n = 13) 도너와 비교하여 젊은(청색 막대, n = 13) 경우 손상 부위 내 GFP-양성(GFP+ ve) 세포의 개수. 이식 후 5일(d5)에, 브로모데옥시우리딘(BrdU) 염색은 젊은 도너(도 2-G) 및 노령 도너(도 2-H) 유래 골 이식편 내 증식 세포를 식별한다. 도 2-I. 노령 및 ?은 동물 유래 골 이식편 내 증식 세포 핵 항원(PCNA)에 대한 정량적 역전사-중합효소 연쇄 반응(qRTPCR)은 균등하다. 단일 별표는 p < 0.05를 나타낸다. 화살표는 온전한 뼈의 모서리를 표시한다. 기준자: 200 ㎛(도 2-A, [도 2-A의 기준자를 도 2-B에도 적용함], 2-D [도 2-D의 기준자를 도 2-E에도 적용함], 및 2-G [도 2-G의 기준자를 도 2-H에도 적용함]).
도 3. Wnt 신호전달이 노령 골 이식편에서 감소한다. 도 3-A. 젊은 도너(청색 막대; n = 3) 및 노령 도너(백색 막대; n = 3)에서 회수한 골수(BM) 내 Wnt 리간드 및 Wnt 표적(도 3-B) 유전자의 상대적 발현도를 평가하기 위한 정량적 RT-PCR. 유전자 발현도는 3-포스페이트 디히드로게나아제(GAPDH)에 대해 정규화하였다. 별표는 p < 0.05를 표시한다.
도 4. 리포솜 Wnt3a는 노령 골 이식편에 대한 골형성능을 복원시킨다. 도 4-A. L-PBS 처리된 노령 골 이식편(n = 5)의 아닐린 블루 염색. 도 4-B. L-Wnt3a 처리된 골 이식편(n = 8)에서 새로운 아닐린-블루 양성 유골 매트릭스. 도 4-C. 이식 후 7일 및 12일에 새로운 골 매트릭스의 조직형태계측적 정량화. 도 4-D. L-PBS 및 L-Wnt3a(도 4-E) 처리된 골 이식편에서 이식 후 12일(d12)에 아닐린 블루 염색. 도 4-F. 베타 갈락토시다아제(β-gal) 활성은 골수 회수물로부터의 세포 집단(미부착, 부유 세포 및 부착 세포)에서 측정된 총 DNA에 대해 정규화하였다. 백색 막대(n = 4)는 L-PBS 처리 후 Wnt 반응성을 나타내고; 청색 막대(n = 4)는 L-Wnt3a 처리(유효 농도 0.15 ㎍/mL Wnt3a) 후 Wnt 반응성을 나타낸다. 도 4-G. 골수 유래 부착 세포에서 줄기 세포 마커 CD45, CD73, CD105, 및 Stro1에 대한 면역 염색. 도 4-H. 베타 갈락토시다아제 활성은 L-PBS 처리(백색 막대, n = 4) 또는 L-Wnt3a 처리(n = 4; 유효 농도 0.15 ㎍/mL Wnt3a) 후 부착 세포 집단의 총 DNA에 대해 정규화하였다. 도 4-I. 대표적인 조직 섹션 상의 Xgal 염색은 L-Wnt3a 처리와 비교한, L-PBS 처리된 노령 Axin2LacZ /+ 마우스 유래 골 이식편의 Wnt 반응성 세포를 식별한다(도 4-J). 도 4-K. 대표적인 조직 섹션 상의 Xgal 염색은 젊은 Axin2LacZ /+ 마우스 유래 L-PBS 처리 골 이식편에서 Wnt 반응성 세포를 식별한다. 단일 별표는 p < 0.05를 나타내고; 4개 별표는 p < 0.0001을 나타낸다. 약어: L-PBS = 리포솜 PBS; L-Wnt3a = 리포솜 Wnt3a; BM = 골수; 및 DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 디히드로클로라이드. 화살표는 온전한 뼈의 모서리를 표시한다. 기준자: 100 ㎜(도 4-A [도 4-A의 기준자를 도 4-B에도 적용함]); 200 mm(도 4-D [도 4-D의 기준자를 도 4-E에도 적용함]); 100 mm(도 4-G); 및 40mm(도 4-I, [도 4-I의 기준자를 도 4-J 및 4-K에도 적용함]).
도 5. L-Wnt3a 처리는 노령 동물 유래 골 이식편에 대한 골형성 잠재력을 복원시킨다. 노령 도너 토끼 유래 골수를 세포 아폽토시스와 연관된 DNA 분획화에 대해 분석하였다. 도 5-A. 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제 dUTP 닉 말단 표지화(TUNEL) 염색(n = 4)은 L-Wnt3a(도 5-B) 처리(유효 농도 = 0.15 ㎍/mL Wnt3a)와 비교하여 L-PBS(10 mL) 처리된 노령 골수에서 아폽토시스 정도를 보여준다. 도 5-C. L-PBS(백색 막대) 또는 L-Wnt3a(청색 막대)로 처리된 노령 골 이식편 샘플에서 캐스파아제 활성의 측정. 도 5-D 내지 5-G. 골수를 노령 토끼로부터 회수하고, L-PBS 또는 L-Wnt3a와 최대 1h 동안 항온반응시킨 후, 척골에 생성된 임계-크기 결함에 이식시켰다. 도 5-D. 골 이식 후 4주에 방사선 평가. L-PBS 처리를 L-Wnt3a(도 5-E) 처리와 비교하였다. 도 5-F. 골 이식 후 8주에 마이크로-CT 등위면 재현. L-PBS 처리를 L-Wnt3a(도 5-G) 처리와 비교하였다. 도 5-H. 골 부피(BV) 및 골 부피/총 부피(BV/TV)를 GE 마이크로뷰 소프트웨어의 골분석 도구를 사용해 계산하였다. 단일 별표는 p < 0.05를 의미한다. 약어: L-PBS = 리포솜 PBS 및 L-Wnt3a = 리포솜Wnt3a. 화살표는 온전한 뼈의 모서리를 표시한다. 기준자: 40 mm(도 5-A 및 5-B); 및 5 mm(도 5-F 및 5-G).
도 6. L-Wnt3a 처리된 노령 골 이식편 유래 재생 뼈의 조직학적 외관. L-PBS(도 6-A) 또는 L-Wnt3a(도 6-B)와 항온반응시킨 노령 골수로 처리된 손상 부위(박스 영역)의 아닐린 블루 염색. 도 6-C. 노령 숙주의 지방 골수강, 및 L-PBS 처리된 노령 골 이식편을 받은 인접한 손상(도 6-D) 영역의 고모리 트리크롬 염색; 섬유 조직은 터퀴스 블루로 염색되었다. 도 6-E. 노령 숙주의 지방 골수강, 및 L-Wnt3a 처리된 노령 골 이식편을 받은 인접한 손상(도 6-F) 영역의 고모리 트리크롬 염색; 성숙한 유골 매트릭스는 진한 터퀴스로 염색되고 골세포 핵은 적색 염색되었다. 도 6-G. 편광 하에서, 피크로시리우스 레드 염색은 L-PBS 처리된 노령 골 이식편으로부터 형성된 섬유성 조직을 식별한다. L-Wnt3a로 처리된 노령 골 이식편으로부터 형성된 유골 매트릭스(도 6-H)와 비교하였다. 약어: L-PBS = 리포솜 PBS, 및 L-Wnt3a = 리포솜 Wnt3a. 화살표는 온전한 뼈의 모서리를 표시한다. 기준자: 500 ㎛(도 6-A 및 6-B); 100 ㎛(도 6-C 내지 6-F); 및 200 ㎛(도 6-G 및 6-H).
도 7. 골 이식편 재료는 줄기 세포 및 전구체 세포 집단을 함유한다. 래트 대퇴골(A) 장골능(B), 및 경골(C)에서 회수한 BGM의 고모리 염색. (D) 표시한 공급원에서 신선하게 회수한 래트 BGM의 내생성 골형성성 유전자 발현의 정량적 RTPCR 분석. (E) 자기유래 BGM을 래트의 SRC에 이식시키는, 실험 디자인의 계략도. (F) 이식 후 7일에 장골능 BGM의 대표적인 조직 섹션을 염색하여 BrdU 유입을 검출하였다. 점선은 BGM에 포함된 섬유주 뼈 조각을 가리킨다. (G) Runx2, (H) Sox9, 및 (I) PPARγ 발현. (J) 유골 매트랙스를 검출하기 위해 아닐린 블루로 염색한 BGM의 대표적인 조직 섹션; 별표는 오래된 뼈 조각(노란색 점선)의 반대쪽 새로운 뼈 매트릭스를 의미한다. 신장 표면은 이 패널, 및 G에서 백색 점선으로 표시하였다. (K) 프로테오글리칸-풍부 연골(적색)을 검출하기 위한 사프라닌 O/패스트 그린 조직학, 및 (L) 지방세포를 검출하기 위한 고모리 트리크롬 염색. 약어: BrdU, 브로모데옥시우리딘; PPARγ, 퍼록시솜 증식인자-활성화된 단백질 감마. 기준자: 50 ㎛, 별표: p<0.05.
도 8. 골 이식편 재료는 (A) 골막 및 (B) 골내막의 면역염색에 의해 가시화된, Axin2CreERT2;R26mTmG 마우스의 Wnt 반응성 GFP 세포이다. (C) 명시된 미시적 시야 내 GFP+ve 세포/총 세포의 정량화. (D) BGM 내 GFP+ve 세포를 형광발광에 의해 가시화시켰다. (E) BGMyoung(녹색 막대) 및 BGMaged(회색 막대)에서의 내생성 Axin2, Lef1, 및 GAPDH 발현에 대한 정량적 절대 RT-PCR 결과. (F) BGMyoung(녹색 막대) 및 BGMaged(회색 막대)에서 Wnt3a, 총 베타 카테닌, Axin2, 및 베타 액틴에 대한 웨스턴 블랏 분석. 기준자 = 50 ㎛. 별표: p<0.05.
도 9. 연령에 따른 BGM 쇠퇴의 골형성 분화 잠재력. (A) BGMyoung(녹색 막대) 및 BGMaged(회색 막대)에서 알칼리 포스파타아제, 오스테릭스, 및 오스테오칼신의 발현에 대한 정량적 RT-PCR 분석. BGM을 ACTB-eGFP 마우스로부터 회수하고 SRC에 이식시켜 명시야(B) 및 형광빛(C) 하에서 가시화하여 BGM 중 GFP 신호를 검출하였다. (D) BGMyoung(N=5) 및 (E) BGMaged(N=5) 유래의 아닐린 블루(삽도)로 염색한 대표적인 조직 섹션. 점선은 신장 표면을 나타낸다. (F) 이식 7일 후 BGM이 차지한 전체 영역 내 아닐린 블루+ve 픽셀의 조직형태계측 분석. (G) BGMyoung(N=5) 및 (H) BGMaged(N=5)로부터 ALP 활성을 검출하기 위해 염색한 대표적인 조직 섹션. (I) 이식 후 7일에 BGM이 차지한 전체 면적 내 ALP+ ve 픽셀의 정량화. (J) BGMyoung(N=5) 및 (K) BGMaged(N=5)로부터의 GFP에 대해 면역염색된 대표적인 조직 섹션. (L) 이식 후 7일에 BGM이 차지한 전체 영역 내 GFP+ ve 픽셀의 정량화. 약어: ALP, 알칼리 포스파타아제; Oc, 오스테오칼신. 기준자: 100 ㎛. 별표: p<0.05; 이중 별표: p<0.01.
도 10. BGM의 골형성성 분화는 내생성 Wnt 신호를 요구한다. 쥣과동물 IgG2α Fc 단편 (Ad-Fc)(A) 또는 가용성 Wnt 길항제 Dkk1(Ad-Dkk1)을 발현하는 아데노바이러스(B)로 처리한 BGM의 ALP 활성에 대해 염색한 대표적인 조직 섹션. Ad-Fc(C) 또는 Ad-Dkk1(D)로 처리한 BGM에서 PPARγ에 대해 면역염색된 대표적인 조직 섹션. Ad-Fc(E) 또는 Ad-Dkk1(F)로 처리된 BGM에서 Dlk1에 대해 면역염색된 대표적인 조직 섹션. Ad-Fc(G) 또는 Ad-Dkk1(H)로 처리된 BGM을 수령한 결함 부위에서 뼈 형성을 검출하기 위한 마이크로-CT 재구성. 원래 결함은 적색 점선 원형으로 표시하였다. (I) 마이크로-CT 데이타로부터 계산된 새로운 골 부피(N=5) ±SEM. Ad-Fc(J) 또는 Ad-Dkk1(K)로 처리된 BGM을 수령한 결함 부위 유래의 대표적인 조직 섹션에 대한 아닐린 블루 염색. (L) 조직형태계측 분석(방법 참조)을 사용한 새로운 골 부피의 정량화. Ad-Fc(I) 또는 Ad-Dkk1(J)로 처리한 BM 이식편에서 PPARγ의 발현. 단일 별표 p<0.05. 기준자: A-B, 200 ㎛, CF, J-K, 50 ㎛, G-H, 2 mm.
도 11. Wnt3a는 BGMaged를 활성화 시키고 그 골형성성 분화 잠재력을 복원시킨다. (A) 노령 ACTB-eGFP 마우스 유래 BGM을 1시간 동안 L-PBS 또는 L-WNT3A(0.15 ㎍/mL)로 처리한 후 24시간 후 표적 유전자 발현에 대해 qRT-PCR로 분석하거나, 또는 7일 동안 SRC에 바로 이식하였다. (B) L-PBS(회색 막대) 또는 L-WNT3A(청색 막대)로 처리한 BGMaged에서 Axin2 및 Lef1 발현의 배수 변화. (C) L-PBS(회색 막대) 또는 L-WNT3A(청색 막대)로 처리된 BGMaged에서 전체 베타 카테닌, Axin2, 및 베타 액틴의 웨스턴 블랏 분석. 이식후 4일에 SRC로부터 BGMaged를 회수한 후, (D) L-PBS(N=5) 및 (E) L-WNT3A 유래의 대표적인 조직 섹션을 BrdU 유입(N=5)에 대해 염색하였다. (F) 골 이식편의 중간에 집중된 미시적 시야 내 BrdU+ve 픽셀의 정량화. 이식 후 7일에 BrdU 유입에 대해 염색된 (G) L-PBS(N=5) 및 (H) L-WNT3A(N=5) 처리된 샘플 유래의 대표적인 조직 섹션. (I) 상기와 같은 BrdU+ve 픽셀의 정량화. 이식 후 7일에 Dlk1 발현에 대해 면역염색된, (J) L-PBS(N=5) 및 (K) L-WNT3A(N=5) 처리된 샘플 유래의 대표적인 조직 섹션. (L) 이식 후 7일에 BGM이 차지한 전체 면적 내 Dlk1+ve 픽셀의 정량화. 이식 후 7일에 Oc 발현에 대해 면역염색된, (M) L-PBS(N=5) 및 (N) L-WNT3A(N=5) 처리된 샘플 유래의 대표적인 조직 섹션. (O) Dlk1에 대해 기술된 바와 같은 Oc+ve 픽셀의 정량화. (P) L-PBS(N=5) 및 (Q) LWNT3A(N=5) 처리된 샘플에서 유골 매트릭스를 검출하기 위해 아닐린 블루로 염색된 대표적인 조직 섹션. (R) 새로운 뼈 매트릭스의 조직형태계측적 정량화; 보다 구체적인 설명은 방법을 참조한다. 이전 도면 설명에서와 같은 약어. 기준자: 100 ㎛. 별표: p<0.05; 이중 별표: p<0.01.
도 12. L-WNT3A는 BGM 줄기 세포를 자극하고 척추 융합을 개선시킨다. (A) 인간 MSC 배양물을 표시된 시간 동안 37℃에서 L-PBS 또는 L-WNT3A로 처리하고 Axin2 발현에 대한 qRTPCR을 사용하여 Wnt-반응을 결정하였다. (B) 쥣과동물 SSC를 12시간 동안 37℃에서 L-PBS 또는 LWNT3A로 처리하고 Wnt 반응을 Axin2 발현에 대한 qRT-PCR로 분석하였다. (C) L-PBS(파선) 또는 L-WNT3A(0.15 ㎍/mL; 청색선)와 실온에서 1시간 항온반응에 대응하는 Axin2 및 Lef1 발현에 대한 정량적 절대 RT-PCR 분석. 데이타는 24시간 동안 RNA 복제물/총 RNA 함량의 비율로 표현하였다. (D) 래트 극상 돌기를 최소 절개를 통해 노출시키고 장골능으로부터의 자가유래 BGM의 표준 부피를 1시간 동안 L-PBS 또는 L-WNT3A로 처리한 후 (E) L4 및 L5 척추뼈의 횡돌기 사이에 이식하였다. POD2에 (F) L-PBS 및 (G) L-WNT3A로 처리된 그래프(핑크)에 대해 마이크로-CT 포착을 수행하였다. POD49에, (H) L-PBS(회색) 및 (I) L-WNT3A(청색)로 처리한 이식부의 골 성장을 평가하기 위해 다시 마이크로-CT 포착을 수행하였다. (I) POD2의 각 이식편 크기를 POD49에서의 그 크기와 비교(상기 나타낸 색상으로 표시)하여, 부피 배수로서 각각의 처리군에 대해 이식부 성장을 그래프화하였다. 약어: L4, 요추 #4, L5, 요추 #5, AP, 정단돌기, SP, 극상돌기, TP, 횡돌기, POD, 수술후 일수.
정의
본원의 방법을 기술하기 전에, 본 발명은 기술된 특정 방법에 국한되지 않고, 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 발명의 범주는 오직 첨부된 청구항에 의해서만 한정되므로, 본원에서 사용되는 용어는 오직 특정 실시양태를 기술하기 위한 목적이며, 이를 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위 및 그 언급된 범위의 임의의 다른 언급되거나 그 사이의 값의 상한치와 하한치 사이의, 달리 언급하지 않으면, 하한치의 단위의 10번째까지, 각각의 사이에 있는 값을 본원에 포함시키는 것으로 이해한다. 이들 유사한 범위의 상한치 및 하한치는 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제되는 한계치외에, 본 발명에 포함되는 보다 작은 범위 내에 독립적으로 포함될 수 있다. 달리 정의하지 않으면, 본원에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 본 발명의 속하는 분야의 숙련가 중 한명이 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons(New York, NY 1994)]는 당분야의 숙련가에게 본 출원에서 사용되는 많은 용어에 대한 일반적인 지침을 제공한다.
본원에 언급된 모든 출판물은 그 출판물이 인용하는 것과 관련하여 방법 및/또는 재료를 개시하고 기술하기 위해 참조하여 본원에 명백하게 편입된다.
Wnt 단백질. Wnt 단백질은 배아발생 동안 세포 대 세포 상호작용을 조절하는 고도로 보존된 분비 신호전달 분자의 패밀리를 형성한다. "Wnts" 또는 "Wnt 유전자 생성물" 또는 "Wnt 단백질" 또는 "Wnt 폴리펩티드"는 상호교환적으로 사용되고 천연 서열 Wnt 폴리펩티드, Wnt 폴리펩티드 변이체, Wnt 폴리펩티드 단편 및 키메라 Wnt 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, Wnt 단백질은 시스테인 잔기에 공유 결합된 팔미테이트를 포함한다. "천연 서열" 폴리펩티드는 그 생성 방법에 사용되는 방법에 무관하게, 자연에서 유래된 Wnt 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 것이다. 이러한 천연 서열 폴리펩티드는 내생성 Wnt 단백질을 생성하는 세포로부터 단리되거나 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 천연 서열 폴리펩티드는 예를 들면, 천연 발생 인간 폴리펩티드, 쥣과동물 폴리펩티드, 또는 임의의 다른 포유동물 종, 또는 비포유동물 종, 예를 들어, 드로소필라(Drosophila), 씨. 엘레강스(C. elegans) 등에서 유래된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
용어 "천연 서열 Wnt 폴리펩티드"는 제한없이, 인간 및 쥣과동물 Wnt 폴리펩티드를 포함한다. 인간 Wnt 단백질은 다음을 포함한다: Wnt1, 유전자은행 참조번호 NP005421.1; 뇌, 시상, 태아 및 성인 폐 및 태반에서 발현되는, Wnt2, 유전자은행 참조번호 NP003382.1; Wnt2B의 2가지 이소폼, 유전자은행 참조번호 NP004176.2 및 NP078613.1. 이소폼 1은 성인 심장, 뇌, 태반, 폐, 전립선, 고환, 난소, 소장 및 결장에서 발현된다. 성인의 뇌에서, 주로 미상핵, 시상하핵 및 시상에서 확인된다. 또한 태아의 뇌, 폐 및 신장에서도 검출된다. 이소폼 2는 태아의 뇌, 태아의 폐, 태아의 신장, 미상핵, 고환 및 암 세포주에서 발현된다. Wnt 3 및 Wnt3A는 신경관 발달의 형태발생 동안 세포-세포 신호전달에서 개별적인 역할을 수행하며, 각각 유전자은행 참조번호 NP11 0380.1 및 X56842(Swiss-Prot P56704)를 갖는다.
천연 인간 Wnt3A 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 구체적으로 각각 서열번호 1 및 2로 개시된다. Wnt3A는 골수에서 발현된다. Wnt 4는 유전자은행 참조번호NP11 0388.2를 갖는다. Wnt 5A 및 Wnt 5B는 유전자은행 참조번호 NP003383.1 및 AK013218을 갖는다. Wnt 6은 유전자은행 참조번호 NP006513.1를 가지며; Wnt 7A는 태반, 신장, 고환, 자궁, 태아의 폐, 및 태아와 성인의 뇌에서 발현되며, 유전자은행 참조번호 NP004616.2이다. Wnt 7B는 태아의 뇌에서 중간정도로 발현되고, 태아의 폐 및 신장에서는 약하게 발현되며, 성인의 뇌, 폐, 및 전립선에서는 아주 약간 발현되고, 유전자은행 참조번호 NP478679.1이다. Wnt 8A는 2가지 교대 전사체를 가지며, 유전자은행 참조번호 NP114139.1 및 NP490645.1을 갖는다. Wnt 8B는 전뇌에서 발현되고, 유전자은행 참조번호 NP003384.1을 갖는다. Wnt 10A는 유전자은행 참조번호 NP079492.2를 갖는다. Wnt 10B는 대부분의 성인 조직에서 검출되는데, 심장 및 골격근에서 최고 수준이다. 이는 유전자은행 참조번호 NP003385.2를 갖는다. Wnt 11은 태아의 폐, 신장, 성인의 심장, 간, 골격근, 및 췌장에서 발현되며, 유전자은행 참조번호 NP004617.2를 갖는다. Wnt 14는 유전자은행 참조번호 NP003386.1을 갖는다. Wnt 15는 태아의 신장 및 성인의 신장에서 중간정도로 발현되며, 뇌에서도 발견된다. 이는 유전자은행 참조번호 NP003387.1을 갖는다. Wnt 16은 교대 스플라이싱에 의해 생성되는, 2가지 이소폼, Wnt-16a 및 Wnt-16b를 갖는다. 이소폼 Wnt-16B는 말초 림프계 기관 예컨대 비장, 맹장, 및 림프절, 신장에서 발현되지만, 골수에서는 발현되지 않는다. 이소폼 Wnt-16a는 췌장에서만 상당한 수준으로 발현된다. 유전자은행 참조번호는 NP057171.2 및 NP476509.1이다. 모든 유전자은행, SwissProt 및 다른 열거된 데이타베이스 서열은 본원에 참조하여 분명하게 편입시킨다.
용어 "천연 서열 Wnt 단백질" 또는 "천연 서열 Wnt 폴리펩티드"는 개시 N-말단 메티오닌(Met)이 있거나 또는 없고, 천연 신호 서열이 있거나 없는 천연 단백질을 포함한다. 이 용어는 구체적으로 그 N 말단 메티오닌(Met)이 있거나 또는 없고, 천연 신호 서열이 있거나 없는 352 아미노산 길이 천연 인간 Wnt3a 폴리펩티드를 포함한다.
"변이체" 폴리펩티드는 천연 서열 폴리펩티드와 서열 동일성이 100% 미만인 이하에 정의된 바와 같은 생물학적 활성 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 변이체는 1 이상의 아미노산 잔기가 천연 서열의 N- 또는 C-말단, 또는 천연 서열 내에 부가되고; 약 1 내지 40 아미노산 잔기가 결실되며, 경우에 따라 1 이상의 아미노산 잔기로 치환되는, 폴리펩티드; 및 최종 생성물이 비천연 발생 아미노산을 갖도록 아미노산 잔기가 공유적으로 개질된 상기 폴리펩티드의 유도체를 포함한다. 일반적으로, 생물학적 활성 Wnt 변이체는 천연 서열 Wnt 폴리펩티드와 서열 동일성이 적어도 약 90%, 바람직하게는 적어도 약 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 99%인 아미노산 서열을 갖게된다.
"키메라" Wnt 폴리펩티드는 이종성 폴리펩티드에 융합되거나 또는 결합된 Wnt 폴리펩티드 또는 이의 일부분(예를 들면, 1 이상의 도메인)을 포함하는 폴리펩티드이다. 키메라 Wnt 폴리펩티드는 일반적으로 천연 서열 Wnt 폴리펩티드와 공통인 적어도 하나의 생물학적 특성을 공유한다. 키메라 폴리펩티드의 예에는, Wnt 폴리펩티드의 일부분을 면역글로불린 서열, 및 "태그 폴리펩티드"에 융합된 Wnt 폴리펩티드 또는 이의 일부분을 포함하는, 에피토프 태깅된 폴리펩티드와 조합된, 면역어드헤신이 포함된다. 태그 폴리펩티드는 항체를 만들 수 있는 에피토프를 제공하기에 충분하지만, Wnt 폴리펩티드의 생물학적 활성을 방해하지 않도록 충분이 짧은 잔기를 갖는다. 적합한 폴리펩티드는 일반적으로 적어도 6 아미노산 잔기, 일반적으로 약 6 내지 60 아미노산 잔기를 갖는다.
천연 서열 Wnt 폴리펩티드의 "기능적 유도체"는 천연 Wnt 폴리펩티드와 공통으로 질적인 생물학적 특성을 갖는 화합물이다. "기능적 유도체"는 제한없이, 상응하는 천연 서열 Wnt 폴리펩티드와 공통인 생물학적 활성을 갖는 한, 천연 서열의 단편 및 천연 서열 Wnt 폴리펩티드의 유도체 및 이의 단편을 포함한다. 용어 "유도체"는 Wnt 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체 및 이의 공유 개질체 둘 모두를 포함한다.
생물학적 활성 Wnt. 본 발명의 방법은 생체 내에서 동물, 예를 들어 포유동물, 예컨대 인간에게 투여시 활성인 Wnt 조성물을 제공한다. 기능적 어세이, 예를 들어 시험관내 어세이에서 활성 수준을 결정하거나, 또는 시험 동물 모델에서 생체내 투여 후, 예를 들어 뼈 재생 촉진, 줄기 세포 증식 상향조절 등, 비기능적 어세이, 예를 들면 면역염색, ELISA에서 존재하는 Wnt 단백질의 양 정량, 쿠마시 또는 은 염색 겔 상에서 정량 등, 및 총 Wnt에 대한 생체내 생물학적 활성 wnt의 비율 결정에 의해 조성물 내 Wnt 단백질의 비활성을 결정할 수 있다.
지질 구조. 본 발명의 방법에서 사용시, 지질 구조는 생체내 투여 후 Wnt 단백질의 활성을 유지하는데 중요한 것으로 확인되었다. Wnt 단백질은 이들 구조의 수층에 캡슐화되지 않지만, 대신 지질막에 통합되어서, 막의 외층에 삽입될 수 있다. 이러한 구조는 예를 들면, 리포솜에 단백질을 제제화하는 통상적인 방법으로 예측되지 않는다. 이러한 지질 구조를 갖는 Wnt 폴리펩티드를 본원에서는 L-Wnt, 예컨대 L-Wnt3a라고 한다. 리포솜 또는 미셀의 외표면에 Wnt 단백질을 묶어두는데 사용되는 방법은 단백질의 엑소리포솜 디스플레이가 두드러지게 서열을 활용하는데, 여기서 미정제 리포솜을 먼저 사전형성시키고, 이어서 Wnt 단백질을 엑소리포솜 Wnt의 부가에 호의적인, 미정제 혼합물에 부가한 후, 크기 여과, 투석 등을 포함하는 다양한 제제화 단계를 후속한다. 적합한 지질은 지방산, 중성 지방 예컨대 트리아실글리세롤, 지방산 에스테르 및 비누, 장쇄(지방) 알콜 및 왁스, 스핑고이드 및 다른 장쇄 염기, 당지질, 스핀고리미드, 카로텐, 폴리프레놀, 스테롤 등을 비롯하여, 터펜 및 이소프레노이드를 포함한다. 예를 들면, 분자 예컨대 디아세틸렌 인지질을 사용할 수 있다. 소수성 및 친수성 모이어티를 갖고, 순 양성 전하이며, 그 자체로 자발적으로 물에서 이중층 소포체 또는 미셀을 형성할 수 있는, 지질, 합성 지질 및 지질 유사체를 포함한, 양이온성 분자를 포함한다. 중성 전하로 제작된 리포솜, 예를 들면 DMPC가 바람직하다. 이 용어는 또한 그 소수성 모이어티가 미셀 또는 이중층막의 내부, 소수성 영역과 접촉하고, 그 극성 헤드 기 모이어티는 막의 외부, 극성면을 향해 배향된, 인지질과 조합하여 지질 미셀 또는 이중층에 안정적으로 도입될 수 있는 임의의 양친매성 분자를 포함한다.
용어 "양이온성 양친매성 분자"는 생리학적 pH에서 양으로 하전된 분자, 보다 구체적으로, 예를 들면 4차 암모늄 염 모이어티를 포함한, 항상 양으로 하전된 분자를 포함하고자 한다. 양이온성 양친매성 분자는 전형적으로 친수성 극성 헤드기 및 친지성 지방족 사슬로 이루어진다. 유사하게, 양이온성 극성 헤드 기를 갖는 콜레스테롤 유도체가 또한 유용할 수 있다. 예를 들면, [Farhood et al.(1992) Biochim. Biophys. Acta 1111:239- 246; Vigneron et al.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 93:9682-9686]를 참조한다. 관심있는 양이온성 양친매성 분자는 예를 들면, 이미다졸리늄 유도체(WO 95/14380), 구아니딘 유도체(WO 95/14381), 포스파티딜 콜린 유도체(WO 95/35301), 및 피페라진 유도체(WO 95/14651)를 포함한다. 본 발명에서 사용할 수 있는 양이온성 지질의 예에는 DOTIM(BODAI라고도 함)(Saladin et al.,(1995) Biochem. 34: 13537-13544), DDAB(Rose et al.,(1991) BioTechniques 10(4):520-525), DOTMA(U.S. Pat. No. 5,550,289), DOTAP(Eibl and Wooley(1979) Biophys. Chern. 10:261-271), DMRIE(Feigner et al.,(1994) J. Bioi. Chern. 269(4): 2550-2561), EDMPC(Avanti Polar Lipids, Alabaster, Ala.에서 시판됨), DCC hoi(Gau and Huang(1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:280-285), DOGS(Behr et al.,(1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86:6982-6986), MBOP(MeBOP라고도 함)(WO 95/14651 ), 및 WO 97/00241에 기술된 것들이 포함된다.
활성에 필요하지 않지만, 일부 실시양태에서, 지질 구조는 표적화 기, 예를 들어 친수성 헤드 기에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 표적화 모이어티에 결합시키기에 유용한 헤드기는 예를 들어, 바이오틴, 아민, 시아노, 카르복실산, 이소티오시아네이트, 티올, 디설피드, 아할로카르보닐 화합물, a,p-불포화 카르보닐 화합물, 알킬 히드라진 등을 포함한다. 표적화 모이어티를 양친매성 분자에 연결시키는데 사용되는 화학기는 또한 당분야에 알려진 바와 같은, 카바메이트; 아미드(카르복실산 더한 아민); 에스테르(카르복실산 더한 알콜), 티오에테르(설프히드릴 더한 할로알칸; 설프히드릴 더한 말레이미드), 쉬프 염기(알데히드 더한 아민), 우레아(이소시아네이트 더한 아민), 티오우레아(이소티오시아네이트 더한 아민), 설폰아미드(설포닐 클로라이드를 더한 아민), 디설피드; 히드로드라존, 지질 등을 포함한다. 예를 들어, 표적화 분자는 시판되는 지질, 예컨대 DAGPE, PEG-PDA 아민, DOTAP 등을 이소시아네이트로 전환시킨 후, 트리에틸렌 글리콜 디아민 스페이서를 처리하여 아민 종결된 티오카바메이트 지질을 생성시키고 표적화 모이어티의 파라-이소티오시아노페닐 글리코시드로 처리하여 목적하는 표적화 당지질을 생성시켜 형성될 수 있다. 이러한 합성은 세포 표면 상의 단백질 수용체에 리간드가 쉽게 접근할 수 있게, 세포 표면 수용체에 결합하는 리간드, 및 나노입자에 통합되는 양친매성 분자 사이에 위치된 수용성 탄성 링커 분자를 제공한다. 리포솜 Wnt 조성물 및 그들의 용도에 관한 추가 정보는 미국 공개 특허 출원 제20120115788호에서 확인할 수 있다.
용어 "골 이식편"은 광의로 본원에서 사용되고 구체적으로 환자 자신의 뼈에서 회수하거나, 또는 개별적으로, 사체를 포함하여, 이식편을 받는 자 이외의 개체에서 유래된, 자가이식편 및 동종 이식편을 포함한다. 용어 "골 이식편"은 또한 자가유래 또는 동종이계 만능 줄기 세포 집단, 예를 들면 골수에서 회수한 줄기 세포, 예를 들면 골수 유래 중간엽 줄기 세포를 포함한다. 골 이식편은 제한없이, 리머, 관주법, 흡입법을 포함한, 다양한 수단에 의해 도너로부터 얻을 수 있다.
실시양태의 상세한 설명
골형성 적격성은 골형성 잠재력을 강화시키기에 충분한 시간 동안, Wnt 단백질, 예를 들면 L-Wnt3A의 유효량과 골 이식을 위한 세포를 항온반응시켜 강화시킨다.
본원에서 사용되는, 골 이식편 재료는 도너로부터 얻은 세포 조성물을 의미하는데, 도너는 살아있거나 또는 사체일 수 있다. 골 이식편 재료는 전형적으로 복합 세포 집단을 포함하고, 줄기 세포 예컨대 중간엽 줄기 세포를 포함하며, 또한 골세포 및 이의 전구체를 포함할 수 있다. 도너는 수령자에 대해 동종이계이거나 또는 자가유래일 수 있다. 골이식을 위한 세포의 양은 도너, 수령자, 이식 목적 등에 따라 다양할 수 있다. 골 이식편은 최대 약 103, 최대 약 104, 최대 약 105, 최대 약 106, 최대 약 107, 최대 약 108, 최대 약 109, 최대 약 1010 또는 그 이상의 세포를 포함한다.
골 이식편 재료는 도너, 예를 들면 장골능, 하악결합(턱 영역)에서 얻고, 대퇴골 및/또는 경골, 비골, 늑골, 전하악 분기; 척추골의 일부, 예를 들어 수술 동안 제거된 것, 사체뼈 등을 리밍, 흡인, 및 관조하여 얻는다. 이식 재료는 골수일 수 있으며, 예를 들어, 적절한 뼈의 골내막 표면으로부터 긁어내거나, 또는 골수를 함유한 블록 이식편 및 뼈의 작은 블록일 수 있다. 동종 이식 뼈는 사체, 뼈 은행 등에서 얻을 수 있으며 예를 들어 둔부 대체 수술로부터의 대퇴골을 구해 얻을 수 있다. 골 이식편 재료는 신선하게 사용하거나, 또는 필요할때까지 당분야에 공지된 대로 저온저장할 수 있다.
골 이식편의 세포는 리포솜 Wnt 단백질, 예를 들어 L-Wnt3A의 유효량 존재 하에 적절한 배양 배지에 현탁시킨다. 임의의 적합한 배지, 예를 들어 DMEM, RPMI, PBS 등을 사용할 수 있다. 세포는 전형적으로 항온반응 과정 동안 생존능을 유지시키는 농도, 예를 들면 최대 약 104/mL, 최대 약 105/mL, 최대 약 106/mL, 최대 약 107/mL로 재현탁된다. 항온반응 온도는 일반적으로, 약 37℃를 넘지 않고, 낮을 수 있으며, 예를 들어 최대 약 32℃, 최대 약 25℃, 최대 약 15℃, 최대 10℃, 최대 약 4℃이지만, 전형적으로 저온저장을 위해 특별히 준비하지 않으면, 영상이다.
Wnt 단백질의 유효 용량은 공급원, 순도, 제조법 등에 따라 다양할 수 있다. Wnt 단백질이 L-Wnt3A인 경우, 유효 용량은 일반적으로 적어도 약 0.1 ㎍/mL, 적어도 약 0.5 ㎍/mL, 적어도 약 1 ㎍/mL, 적어도 약 2.5 ㎍/mL, 적어도 약 5 ㎍/mL, 적어도 약 7.5 ㎍/mL, 적어도 약 10 ㎍/mL, 적어도 약 15 ㎍/mL이고, 적어도 약 25 ㎍/mL, 적어도 약 50 ㎍/mL, 적어도 약 100 ㎍/mL일 수 있다.
골 이식편 재료는 골형성 능력을 강화시키기에 충분한 시간 동안 Wnt 단백질과 항온반응된다. 강화는 다양한 방식, 예를 들면 Axin2의 발현 증가에 의해, 골 이식편 재료에서의 높은 유사분열 활성(이식 후 약 2일 내지 약 6일)에 의해; 이식 후 높은 뼈 형성에 의해, Runx2 또는 오스테오칼신의 높은 발현에 의해, 이식 후 감소된 아폽토시스에 의해, 또는 이식 후 생성된 뼈의 부피에 의해 측정할 수 있다. 증가된 뼈의 부피는 wnt 처리 부재 시에 얻게되는 부피에 비해 약 1.5배, 약 2배, 약 3배 또는 그 이상일 수 있다.
골 이식편 재료는 일반적으로 적어도 약 1시간, 적어도 약 2시간, 및 최대 약 36시간, 최대 약 24시간, 최대 약 18시간, 최대 약 15시간, 최대 약 12시간, 최대 약 8시간, 최대 약 6시간, 최대 약 4시간 동안 Wnt 단백질과 접촉된다.
항온반응 이후, 골 이식편 재료는 예를 들면, 척추뼈, 골절, 치과용 지지체 등의 수복을 위해, 통상적인 프로토콜에 따라 수령자에게 이식될 수 있다.
골형성능은 특히 Wnt 단백질과 항온반응에 의해 노령 골 이식편에서 복원된다. 초기에, 리포솜 Wnt3a 처리는 노령 골 이식편에서 세포 사멸을 감소시킨다. 이후 이식 후, 리포솜 Wnt3a가 처리된 골 이식편은 유의하게 더 많은 뼈를 생성시켰다(p<0.05). 실시예로부터 알 수 있듯이, 리포솜 Wnt3a 처리는 이식편에서 새포 생존을 강화시키고 노령 동물 유래 이식편의 골형성 능력을 재확립시켰다.
따라서, 본 발명은 노령 환자, 및 치유 잠재력이 감소된 다른 환자, 예컨대 흡연자, 당뇨병환자, 또는 영향 결핍 환자 유래의 골 이식편을 재활성화시키기 위한 안전하고, 효과적이며, 임상적으로 적용가능한 재생성 의학 기반 전략을 제공한다.
본 명세서에 인용된 모든 과학 및 특허 출판물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 출판물이 구체적이고 개별적으로 참조하여 편입시킨다고 표시한만큼 참조하여 본원에 편입시킨다. 본 발명의 상세한 설명을 이하의 비제한적인 실시예에서 제공한다.
실시예 1
Wnt3a는 노령 동물 유래의 골 이식편에 대한 골형성능을 재확립시킨다.
골수의 나이 관련 지방 변성은 노인에서 지연되는 골절-치유 및 골다공증 관련 골절의 원인이 된다. 이러한 지방 변화의 근간인 기전은 노화된 골수강 내 Wnt 신호전달 수준과 관련된다. 젊은 경우, 장골이 헴-풍부 골수를 채우고 있지만, 나이가 듦에 따라서 지방 골수로 대체된다. 골수의 나이 관련 지방 변성은 노인에서 지연적인 골격 치유 및 골다공증-관련 골절과 강력하게 연관되며, 이는 증대되는 생물의학 부담을 구성한다. 결과적으로, 골수가 대부분 지방 조직으로 전환되는 것을 이해하는데 상당한 노력을 쏟고있다. 이러한 골수의 지방 변성은 골형성 잠재력 손실과 함께 일어나는데, 이는 골수를 골이식 목적을 위해 임상적으로 사용시 밝혀졌다.
환자 자신의 뼈 및 골수를 "금본위"로 여기지만, 이들 자가이식편은 종종 환자가 노령인 경우 부적절하다. 중간엽 줄기 세포(MSC)를 포함하여, 골수강에 존재하는 적어도 복수의, 구별되는 줄기/전구체 세포 집단이 존재한다. 시험관내에서 배양시 MSC가 연골, 뼈, 지방, 및 근육 세포를 야기시킬 수 있지만, 골수강에 존재하는 MSC 자체만이 골형성 또는 지방 형성 계통으로 분화되고, 늘어난 증거들은 이러한 지방형성-골형성 운명 결정은 베타-카테닌-의존적 Wnt 신호전달에 의해 조절된다고 시사한다. 예를 들면, Wnt LRP5 수용체에 돌연변이를 활성화시켜 Wnt 신호전달 강화는 인간에서 높은 골 질량 표현형을 야기하였다. 시험관내에서, 이와 동일한 활성화된 돌연변이는 인간 중간엽 줄기 세포의 지방세포 분화를 억제하였다. 한편, 예를 들면, 골용해성 질환 다발성 골수종에서 감소된 Wnt 신호전달은 공격적인 골손실 및 조혈을 훼손하는 골수 지방형성의 부수적인 증가와 연관된다. 이들과 함께 관찰들은 Wnt 신호전달이 골형성을 자극하고 지방형성을 억제하는데 양성적인 역할을 한다는 가설을 뒷받침한다.
접목에 관여되는 세포의 운명을 따르기 위해서 동계 골 이식 모델과 함께 형질전환 마우스를 사용하였다. 정량적 어세이와 함께 면역조직화학을 사용하여 ?은 마우스 및 노령 마우스 유래의 골 이식편에서 Wnt 신호전달 및 지방형성 및 골형성 유전자 발현을 평가하였다. 리포솜 Wnt3a 단백질(L-Wnt3a)을 마우스 및 토끼에서 생성된 임계 크기 결함 모델에서 노령 골 이식편에 대해 골형성 잠재력을 복원시키는 그 능력을 시험하였다. 방사선촬영, 마이크로-CT 재현, 조직학, 및 조직형태계측적 측정을 사용하여 L-Wnt3a 또는 대조군, L-PBS 처리에서 얻은 뼈 치유를 정량하였다. 골 이식편의 유전자 발현 프로파일링은 노화가 골형성 프로파일에서부터 지방형성으로 이동되는 것과 연관됨을 입증하였다. 이러한 나이 관련 지방형성 이동은 노령 동물 유래 골 이식편에서 유의하게 감소된 Wnt 발현 및 Wnt 활성(p<0.05)을 수반한다.
이식에 관련된 세포의 운명을 이해하기 위해서 동계 골이식 모델과 함께 형질전환 마우스를 사용하였다. 정량적 어세이와 함께 면역조적화학법을 사용하여 젊은 마우스 및 노령 마우스에서 얻은 골 이식편에서 Wnt 신호전달 및 지방형성 및 골형성 유전자 발현을 평가하였다. 리포솜 Wnt3a 단백질(L-Wnt3a)은 마우스 및 토끼에서 생성된 임계-크기 결함 모델에서 노령 골 이식편에 대한 골형성 잠재력을 복원시키는 그 능력을 시험하였다. 방사선촬영법, 미세 정량적 컴퓨터 단층촬영(마이크로-CT) 재현, 조직학, 및 조직형태계측적 측정법을 사용하여 L-Wnt3a 또는 대조군 물질(리포솜-인산염-완충 염수 용액[L-PBS])으로 얻어진 뼈 치유를 정량하였다.
골 이식편에서 세포의 발현 프로파일링은 나이에 따라서 골형성 유전자 프로파일로부터 지방형성을 향해 이동함을 입증하였다. 이러한 나이 관련 지방형성 이동은 Wnt 신호전달의 유의한 감소(p < 0.05) 및 골형성 잠재력의 손실을 수반하였다. 대형 및 소형 동물 모델 둘 모두에서, 골형성 적격성은 줄기 세포 인자 Wnt3a와의 짧은동안의 항온반응에 의해 노령 골 이식편에서 복원되었다. 또한, 리포솜 Wnt3a는 골 이식편에서 유의하게 세포 사멸을 감소시켰고, 대조군과 비교하여 유의하게 보다 더 골질 재생을 일으켰다.
리포솜 Wnt3a는 노령 환자 유래의 골 이식편을 재활성화시키기 위한 효과적인, 임상적으로 적용가능한, 재생성 의학-기반 전략으로 노령 동물 유래 골 이식편의 골 형성능을 재확립하고 세포 생존을 강화시킨다.
재료 및 방법.
동물. 모든 절차는 동물 연구에 대한 스탠포드 위원회의 승인을 받았다. Axin2LacZ/+ 마우스가 설명되어 있다. 뼈, 골수, 및 다른 관련 세포 집단에서 GFP의 강건한 발현도 때문에 베타-액틴-강화된 녹색 형광발광 단백질(ACTB-eGFP) 형질전환 마우스(The Jackson Laboratory, Sacramento, California)를 선택하였다. ACTB-eGFP 형질전환 마우스를 Axin2LacZ/+ 마우스와 교배하여 Axin2LacZ/+, Axin2LacZ/+/ACTB-eGFP, ACTB-eGFP 및 야생형(WT) 마우스를 얻었고; 12주령 내지 16주령 마우스를 젊은 것으로 간주하였고; 40주령이 넘은 마우스를 노령으로 간주하였다. 노령(8개월) 뉴질랜드 흰색 토끼를 사용하였다. 한마리 토끼를 골 이식편 도너로 제공하였고, 9마리 토끼는 실험 동물로 사용하였다.
마우스에서 골이식. 숙주 마우스(수컷만)를 케타민(80 mg/kg) 및 크실라진(16 mg/kg)의 복강내 주입에 의해 마취시켰다. 3-mm 절개하여 두정골을 노출시키고; 미세 해부용 관상톱을 사용해 2-mm 직경의 둘레, 전층 결함을 생성시켰으며; 경막은 건드리지 않았다. 골 이식편을 대퇴골 및 경골로부터 회수하고, 모아서, 분취물로 나누었다. 각각의 20 ㎕ 분취물을 리포솜 인산염 완충 염수 용액(L-PBS) 또는 리포솜 Wnt3a 단백질(L-Wnt3a)(유효 농도 = 0.15 ㎍/mL)을 함유하고 10% 태아 소혈청(FBS)이 존재하는 10 ㎕의 둘베코 변형 이글 배지(DMED)에서 37℃에서 항온반응시키는 한편 두개관 결함을 준비하였다. 골 이식편을 두개관 결함에 이식하고, 피부를 밀봉하였다.
토끼에서 골이식. 숙주 토끼는 글리코피롤레이트(0.02 mg/kg) 및 부프레노르핀(0.05 mg/kg)의 피하 주사, 케타민(35 mg/kg) 및 크실라진(5 mg/kg)의 근육내 주사, 및 세파졸린(20 mg/kg)의 정맥내 주사로 마취시키고, 1% 내지 3% 이소플루란 하에서 유지시켰다. 2.5-cm 절개를 만들고, 척골 경계를 가시화시키고, 1.5-cm 분절 결함을 왕복톱(Stryker System 5, Kalamazoo, Michigan)을 사용해 만들었다. 그 골막 조직과 함께 분절을 제거하였다. 골 이식편을 골반 및 대퇴골에서 회수하고, 모아서, 분취물로 나누었다. 각각 대략 400-mg 분취물을 L-PBS(500 ㎕) 또는 L-Wnt3a(유효 농도 = 0.5 ㎍/mL)와 배합하고 뒤쪽 테이블 위에 얼음 상에서 유지하는 한편 척골 결함을 숙주 토끼에 생성시켰다. 골 이식편을 척골 결함에 이식하였고, 근육 및 피부를 밀봉하였다. 과정은 양방향으로 수행하였다(즉, 양쪽 면은 L-PBS 또는 L-Wnt3a를 받음). 그러나, 이러한 접근법은 골 이식편이 예상치않은 전신 효과를 가질 가능성을 훨씬 제거하였다.
토끼 골수의 시험관내 Wnt 자극. 노령 토끼 유래 골수를 12시간 동안 37℃에서 L-PBS 또는 L-Wnt3a(유효 농도 = 0.15 ㎍/mL)와 항온반응시켰다. 총 DNA를 피코그린 dsDNA 키트(Life Technologies, Carlsbad, California)를 사용해 분석하여 이식편이 균등한 세포 부피를 가짐을 확인하였다. 캐스파아제 활성은 표준 키트(Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana)를 사용해 분석하였다.
조직 준비. 안락사 직후(각 실험에서 명시한 시점), 근육, 연결 조직, 및/또는 경막을 포함한, 전체 골격 성분을 회수하고, 그 표피를 제거하고, 12시간 동안 4℃에서 4% 파라포름알데히드에 고정시켰다. 샘플은 파라핀, 또는 최적 절개 온도(OCT) 화합물에 삽입시키기 전에 19% EDTA(데틸렌디아민테트라아세트산)에서 석회질제거하였다. 섹션은 10-㎛ 두께였다.
조직학, 면역조직화학, 및 조직형태계측 분석. 면역조직화학법은 이전에 기술된대로 수행하였다. 사용된 항체는 토끼 다클론 항-녹색 형광발광 단백질(항-GFP)(Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts), 토끼 다클론 항-DLK1(EMD Millipore, Billerica, Massachusetts), 항-퍼옥시솜 증식인자 활성화된 수용체-γ(항-PPAR-γ)(Millipore), 및 항-Ki67(ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts)을 포함한다. 브로모데옥시우리딘(BrdU)(Invitrogen, Camarillo, California) 및 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제 dUTP 닉 말단 표지화(TUNEL)(Roche Diagnostics) 어세이는 제조사의 지시에 따라 수행하였다.
모뱃 펜타크롬, 아닐린 블루, Xgal, 및 알칼리 포스파타아제(ALP) 염색을 이전에 기술한 대로 수행하였다. 조직 섹션은 라이카 DM5000B 디지탈 영상 시스템(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 사용해 촬영하였다. 샘플 당 최소 5 조직 섹션을 조직형태계측 분석에 사용하였다.
미세정량 컴퓨터 단층촬영(마이크로-CT) 분석. 마우스는 2% 이소플루란으로 마취시키고 40-mm 해상도로 다중모드 양전자 방출 단층촬영-컴퓨터 단층촬영 데이타-수집 시스템(Inveon PET-CT; Siemens, Erlangen, Germany)을 사용해 스캔하였다. 데이타는 마이크로뷰 소프트웨어(GE Healthcare, Chicago, Illinois)로 분석하였다. 3차원 관심 영역 도구를 사용해 각 샘플에 대해 구조 및 뼈 부피를 지정하였다.
재생 뼈 부피 분획의 평가(총 뼈 부피를 재생 뼈 부피로 나누어 계산한 백분율[BV/TV, %])를 고해상 마이크로-CT(vivaCT 40; Scanco Medical, Bruttisellen, Switzerland) 및 70 kVp, 55 μA, 200-ms 노출 시간, 및 10.5-㎛ 등방성 복셀 크기를 사용해 수행하였다. 목적 영역은 길이가 2 cm였고 결함 모서리에 대해 250 ㎛ 근위에서 시작하여 결함의 반대 모서리를 지나 250 ㎛ 원위로 확장되었다(1.5 cm 총직경). 뼈는 하이드록시아파타이트의 275 mg/㎤ 한계량을 사용해 연조직으로부터 분절하였다.
정량적 역전사-중합효소 사슬 반응(qRT-PCR). 조직 샘플을 TRIzol 용액(Life Technologies)으로 균질화하였다. RNA를 단리하고(RNeasy; Qiagen, Germantown, Maryland) 역전사를 이전에 기술된 대로 수행하였다(SuperScript III 플래티늄 2단계 qRT-PCR 키트, Life Technologies).
통계 분석. 결과는 표준 편차와 함께 평균으로 나타내었고, "n"은 분석한 샘플의 수를 표시한다. 데이타 세트간 유의한 차이는 양방향 스튜던트 t 검정법 및 비모수 윌콕슨 검정법을 사용해 결정하였다. 유의성은 p < 0.05로 획득되었고, 모든 통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad Software, San Diego, California)로 수행하였다.
결과
골수 이식편은 골형성 잠재력을 갖는다. 골이식 재료의 운명을 확인하기 위해서, 본 발명자는 ACTB-eGFP 형질전환 마우스 유래 전체 골수를 회수하고, 균일한 크기의 분취물(도 1-A)로 나눈 후, 동계 숙주 마우스의 두개관에 생성시킨, 미치유의, 임계-크기 골격 결함에 이식시켰다(도 1-B). 살아있는 이식 세포 및 그들의 자손은 그들의 GFP 표지에 의해 손상 부위 내에서 식별가능하였다(도 1-C). 도너 및 숙주가 유전적으로 동일하지 않은 경우, 대부분의 이식 세포는 사멸하였으며, 그러한 이유로, 오직 동계의, 면역학적으로 상용성인 도너-숙주 조합만 사용하였다.
이식 후 1일에, GFP-양성 도너 유래 기질 조직과 함께, GFP-양성 세포가 손상 부위를 차지하였다(도 1-C). 5일에, BrdU 염색은 결함 부위에 세포의 강건한 증식을 확증하였다(도 1-D). 7일에, GFP 면역염색은 이식된 세포, 또는 그들의 자손이 결함 부위에 잔류함을 확증시켜주었다(도 1-E 및 1-F). 이식 세포 및/또는 그들의 자손은 결국에는 골아세포로 분화되고 결함을 치유하였다(도 1-H 및 1-J). 골 이식편이 없는 경우, 결함은 치유되지 않았다(도 1-G 및 1-I).
노령 골 이식편은 지방 변성을 나타냈다. 노화에 따라서, 인간 골수는 지방 변성 및 골형성 잠재력 손실을 겪는다. 비슷한 노화 관련 변화가 마우스에서 관찰되는데, 여기서는 쥣과동물 골수의 전체 외양이 젊은 동물의 헴-풍부, 무지방 조직에서 노령 동물의 지방 골수로 변화되었다. 골 이식편을 구성하는 이종성 세포 집단의 정량적 RT-PCR 분석은 젊은 동물 유래 샘플에 비해서, 노령 동물 유래 샘플은 지방형성성 유전자 지방산-결합 단백질 4(Fabp4)(p < 0.01) 및 퍼록시솜 증식인자-활성화된 수용체 감마(PPAR-γ)(p < 0.01)의 유의하게 보다 높은 발현을 보여주었다. 이러한 지방형성 이동과 동시에, 노령 마우스 유래 골 이식편은 또한 골형성 유전자 ALP(p < 0.05), 오스테오칼신(p < 0.01), 및 오스테릭스(p < 0.05) 발현도의 유의한 감소를 보였다. 따라서, 인간에서 관찰된 골수의 지방 변성은 총 형태적 수준 및 정량화가능한, 분자 수준 둘 모두에서 마우스에서 요약된다.
지방 변성은 골 이식편의 감소된 골형성 잠재력과 연관된다. 젊은 동물 유래 이식편의 골형성능과 비교하여, 노령 동물 유래 이식편은 유의하게 낮게 새로운 뼈를 생성시켰다(도 2-A 및 2-B; 2-C에 정량화; p < 0.05). 골형성 잠재력의 이러한 나이 관련 감소는 이식 효율에서의 차이가 직접적인 원인이 아니다. 이식된 세포를 식별하기 위한 GFP 면역염색을 이용하면, GFP-양성 세포의 분포 및 개수는 젊은 마우스 및 노령 마우스 간에 거의 균등하였다(또 2-D 및 2-E; 2-F에 정량화). Nor는 이식편의 확장에서의 차이의 원인이 될 수 있는 골형성 잠재력의 나이 관련 변경이었다: Brd유입(도 2-G 및 2-H) 및 증식 세포 핵 항원(PCNA)에 대한 qRT-PCR(도 2-I)을 사용하여 젊은 동물 및 노령 동물 유래 골 이식편에서 세포 증식이 거의 균일한 수준임을 확인하였다.
본 발명자는 골수 세포에서 19종 포유동물 Wnt 유전자의 발현도를 평가했을 때 노령 골 이식편의 골형성 잠재력의 손실 및 지방 변성에 대한 근거의 관한 통찰력을 얻었다. Wnt 유전자의 서브셋은 젊은 동물과 비교하여 노령 동물 유래 골수에서 약하게 발현되었다(p < 0.05; 도 3-A). Wnt 유전자 발현의 이러한 감소는 Wnt 직접 표적 유전자 Tcf4, Lef1, 및 Axin2의 유의하게 감소된 발현으로 측정된 바와 같이, Wnt 반응성의 감소와 유사하였다(p < 0.05; 도 3-B). 이들 결과는 Wnt 신호전달이 노령 골수에서 감소됨을 입증하였다.
L-Wnt3a는 노령 마우스 유래 골 이식편의 골형성능을 복원시킨다. 정제된 제1 Wnt 단백질은 Wnt3a였다. Wnt3a는 "규범적" 또는 베타-카테닌 의존적 경로를 통해 작용하는 잘 알려진 골형성 자극이다. 노령 골수에서 감소된 Wnt 신호경로를 고려하여, 본 발명자는 외생성 Wnt 단백질의 부가가 노령 동물에서 유래된 골 이식편의 골형성 잠재력을 재확립시키는데 충분한지 궁금하였다.
모든 척추동물 Wnt 단백질은 소수성이고, 담체없이, 소수성 Wnt3a는 신속하게 변성되고 불활성화된다. 본 발명자는 지질 입자에 소수성 Wnt3a를 포장하여 이러한 생체내 전달 문자를 해결하였다. 이러한 인간 Wnt3a 단백질의 제제, 리포솜 Wnt3a(L-Wnt3a)는 생체내에서 안정하고 변형된 골절 모델에서 강건한 골재생을 촉진한다. 외생적으로 적용된 Wnt3a가 치료 단백질로서 상당한 가능성을 갖지만, 안정성은 주요한 관심사로 남아있다. 골격 손상 부위에 강력산 성장 인자의 고농도 전달은 환자에 잠재적인 발암성 위험성을 함께 수반한다. 성장 인자에 대한 장기적이거나 또는 비제어적인 노출과 관련된 문제를 피하기 위해서, 본 발명자는 L-Wnt3a를 생체외 전달하였다. 이는 수령 부위를 준비하면서, 회수 직후 노령 골 이식편을 L-Wnt3a(n = 30)와 항온반응시켜 수행하였다. 대조군 골 이식편은 동일한 시간 동안 L-PBS(n = 30)에 노출시켰다.
L-PBS(도 4-A)를 처리한 노령 이식편과 비교하여, L-Wnt3a를 처리한 노령 이식편은 새로운 뼈 형성의 극적인 강화를 보였다(도 4-B). 7일 이내에, L-Wnt3a-처리된 이식편을 받은 결함 부위는 L-PBS 처리된 이식편을 받은 부위 보다 새로운 뼈가 2배나 더 존재하였다(도 4-C). 12일까지, L-Wnt3a-처리된 이식편은 L-PBS 처리된 이식편과 비교하여 새로운 뼈가 1.5배 더 많았다(도 4-D 및 4-E; 4-C에 정량화함).
골수 유래 줄기 세포는 Wnt 반응성이다. 골 이식편 내 어떠한 세포 집단(들)이 Wnt 자극에 반응하는지에 대한 통찰력을 얻기 위해서, 본 발명자는 Wnt 반응성에 대해 골수의 상이한 분획을 분석하였다. 전체 골수에서, Wnt 반응성은 검출가능한 수준 이하였다. 본 발명자는 전체 골수를 미부착 집단으로 분리하였으며, 다시 수행한 결과 Wnt 반응성이 검출 한계 이하였다(도 4-F). 하지만, 연결 조직 전구체 세포53,54를 함유하는 부착 집단에서, Wnt 반응성이 검출되었다(도 4-F). 이어서 본 발명자들은 부착 집단으로부터 골수 줄기 및/또는 기질 세포를 더욱 농축시키기 위한 기존 프로토골을 사용하였다. CD45(-), CD73(+), CD105(+), 및 Stro1(+)에 대한 면역염색을 사용하여, 본 발명자는 이 집단이 골수 유래 줄기 세포에 대해 농축되었음을 확인하였다(도 4-G). PBS-처리된 CD45(-), CD73(+), CD105(+), 및 Stro1(+) 세포에 비해, Wnt3a-처리된 집단은 Wnt 반응성이 10배 증가되는 것으로 확인되었다(도 4-H).
본 발명자는 또한 Axin2LacZ/+ 마우스 유래 골수의 Xgal 염색을 사용해 골 이식편에서의 Wnt 반응성을 모니터링하였다. 매우 소수의 Xgal+ve 세포가 노령 골 이식편(도 4-I)에서 발견되었지만 젊은 골 이식편에서는 Xgal+ve 세포가 풍부하였다(도 4-K). 노령 골 이식편은 노출 후 Xgal+ve 양성 세포의 증가로 확인된 바와 같이, L-Wnt3a 자극에 반응할 수 있었다(도 4-J). 쥣과동물 골수강 내 줄기 세포의 출현율이 매우 낮기 때문에, Wnt 반응성 집단은 CD45(-), CD73(+), CD105(+), 및 Stro1(+) 집단보다 더 많은 세포를 포함하는 것으로 예상된다.
L-Wnt3a는 골 이식편에서 아폽토시스를 예방한다. L-Wnt3a의 강건한 뼈 유도능은 본 발명자로 하여금, 대형 동물, 장골 모델로 우리의 실험을 확장시키도록 하였다. 인간처럼, 노령 토끼는 그들 골수의 지방 변성을 경험한다. 본 발명자는 임계-크기 척골 결함 모델 및 L-PBS 또는 L-Wnt3a와 항온반응시킨 노령 골 이식편을 결함부에 이식하였다. 본 발명자는 먼저 골 이식편을 회수할 때 응집을 통해 광범위한 프로그램된 세포 사멸이 존재함을 확인하였다(도 5-A). L-Wnt3a의 부가는 유의하게 이러한 이식편 아폽토시스를 감소시켰다(p < 0.05)(도 5-B). 본 발명자는 세포 아폽토시스의 측정에 따른 캐스파아제 활성을 사용하여, L-Wnt3a의 이러한 프로-생존 효과를 검증하였다. L-Wnt3a는 골 이식편의 세포에서 캐스파아제 활성을 유의하게 감소시켰다(p < 0.05; 도 5-C).
L- Wnt3a 는 노령 골 이식편의 골형성능을 강화시킨다. L-Wnt3a 및 L-PBS-처리된 토끼 골 이식편을 임계 크기 결함에 도입시켰고 다수의 시점에 재생을 평가하였다. 4주에 방사선촬영 평가는 L-Wnt3a-처리된 이식편을 받은 부위에 가교가골의 존재를 밝혀주었고(도 5-E); 비교하여, L-PBS-처리된 골 이식편을 받은 부위는 최소의 가골 형성이 확인되었다(도 5-D).
8주에, 마이크로-CT 분석은 L-PBS 골 이식편을 처리한 부위에 지속적인 갭을 보여주었고(도 5-F) 그에 반해 L-Wnt3a 골 이식편을 처리한 부위는 강건한 뼈 형성이 나타났다(도 5-G). 조직형태계측 분석은 뼈 부피 및 전체 부피로 나눈 뼈 부피 둘 모두에서, 2 그룹간 유의한 차이를 확인시켜주었다(도 5-H).
본 발명자는 뼈 재생 품질을 평가하였다. 대조군(도 6-A)에 비하여, L-Wnt3a-처리된 손상 부위는 새로운 뼈로 채워졌다(도 6-B). 숙주 토끼의 골수는 지방 변성을 겪었고(도 6-C), L-PBS-처리된 재생에서 유사한 외관이 확인되었다(도 6-D). L-Wnt3a 처리된 샘플(도 6-E)에서, 숙주 골수는 대조군 동물에서 확인된 바와 같이 유사한 수준의 지방 변성을 보였지만, L-Wnt3a 골 이식편 유래의 재생부는 무층골(도 6-F)이었고 분절 결함 부위에서의 그 위치 및 그 교직 외관 둘 모두가 기존 층판골과 구별되었다. 편광하에서, 피크로시리우스 레드 염색은 L-Wnt3a-처리된 골 이식편에서 발견되는 성숙한, 유골 조직(도 6-H)을 L-PBS 처리된 골 이식편의 섬유성 조직(도 6-G)과 구분하였다.
골 이식편 내 줄기 세포 및/또는 전구체 세포 집단. 포유동물 골수강은 다수의 줄기 세포 및/또는 전구체 세포 집단을 지지하는 기능적 적소이다. 천연적으로 이종성인, 골수 유래 골 이식편은 일부의 줄기 세포 및/또는 전구체 세포를 포함하여, 다수의 집단을 함유한다. 그러나, 유골 재생에 대한 이들 줄기 세포 및/또는 전구체 세포의 기여는 알려지지 않았다. 다수의 골수 유래 줄기 세포 집단은 Wnt-반응성이고, 기존의 프로토콜을 사용하여, 본 발명자는 골수 내 적어도 CD45(-), CD73(+), CD105(+), 및 Stro1(+) 줄기 세포 및/또는 기질 세포 집단이 Wnt-반응성임을 확인하였다(도 4).
골수의 Wnt 신호전달 및 나이 관련 지방 변성. 시험관내에서, Wnt 신호전달 폐기는 중간엽 줄기 세포가 지방세포로 분화되게 하는 한편, Wnt 신호전달의 강력화는 중간엽 줄기 세포가 골아세포로 분화되게 한다. 이는 직접적인 임상적 관련성을 갖는다: 나이에 따라, 인간 골수는 지방 변성을 겪고 이의 골형성 잠재력이 손실된다. 본 발명자의 데이타는 노령 골 이식편의 골형성 잠재력의 손실이 부분적으로, Wnt 신호전달 수준 감소에 의존적임을 보여준다: 젊은 마우스 유래 골 이식편과 비교하여, 노령 골 이식편은 Wnt 유전자 발현 및 Wnt 반응성의 극적인 감소를 보인다(도 3). 노령 골수에 L-Wnt3a 부가는 그 골형성능을 재확립시킨다(도 4, 5 및 6).
감소된 이동성과 관련된 병태, 예컨대 장기간 침상 안정 및 골다공증은 또한 골수의 지방 변성과 관련된다. 일부 데이타는 지방 변성이 적어도 실험적으로는 가역적이라고 제안한다. 분명하게, 이러한 변성- 및 골격의 나이 관련 변화가 감소되는 정도에 대한 근거의 이해가 노령 환자의 뼈 손상에 대한 새로운 치료를 고안하는데 상당히 중요하다.
성장 인자-증대된 골 재생: 안정성 우선. 안정성 문제는 골격 치유를 증대시키는 데 성장 인자의 사용을 둘러싸고 최근에 부각되었다. 성장 인자 자극은 대체 손상 부위에 존재하는 세포의 증식을 유도하는 것으로 여겨지며; 비제어적인 증식이 발암성 변형의 특징이기 때문에, 이러한 증식성 급성장은 공간적으로 시간적으로 제어되어야만 한다. 이러한 이유로, 본 발명자들은 L-Wnt3a에 대한 전신 노출을 제한하는 접근법을 디자인하였다. 표적화된 세포는 L-Wnt3a와 생체외 항온반응되는, 골 이식편 자체에 있는 것들이다. 활성 인자 자체보다는 활성화된 세포를 이후 결함 부위에 재도입시킨다. 이러한 생체외 접근법은 L-Wnt3a 자극을 공간적으로(숙주 조직이 아닌, 이식편 자체에) 그리고 시간적으로(항온반응 시간 동안만 Wnt 자극에 노출) 제한한다. 이러한 생체외 접근법은 임상 용도로 재단되고 부차적인 절차를 요구하지 않는다. 따라서, Wnt 단백질을 지질입자에 포장하는 것은 특히 치유 잠재력이 감소된 개체들에서의, 골격 손상의 치료를 위한 실행가능한 전략을 구성한다.
실시예 2
줄기 세포 활성인자 WNT3A를 사용한 자가유래 골 이식편의 재조작
자가유래 골 이식은 골 결함을 치료하는 가장 일반적인 과정이지만, 노령 환자에서는 믿을 수 없다고 여겨진다. 자가이식의 효율은 재료 내에 존재하는 다능성 줄기 세포로 소급될 수 있다. 노화는 이들 줄기 세포의 생존능 및 기능을 약화시켜서, 비일관적인 골유합 속도를 초래한다. 본 발명자는 자가이식 효율에서의 나이 관련 변화가 재료 내 내생성 Wnt 신호전달의 손실에 의해 수반됨을 확인하였다. 본 발명자는 Wnt 억제인자 Dkk1을 과발현시켜 내생성 Wnt 신호전달의 손실을 모방하였고 Wnt 신호전달이 자가이식편의 골형성 분화에 필수적임을 발견하였다. 본 발명자는 자가이식편을 WNT3A 단백질의 안정한 제제와 항온반응시킨 후 생체내에 도입시키는 생체외 약물 전달 시스템을 개발하였다. 생물조작된 자가이식편은 집결 부위에서 유의하게 개선된 생존을 보여주었다. 유사분열 활성 및 골형성 분화는 자가이식편 단독과 비교하여 WNT-활성화된 자가이식편에서 유의하게 강화되었다. 척추 융합 모델에서, L-WNT3A 처리된 노령 자가이식편은 자가이식편 단독과 비교하여 우수한 골형성능을 보였다. 따라서, 잠시동안의 L-WNT3A와의 항온반응이 신뢰할만하게 자가유래 골이식 효율을 개선시키고, 이는 노령 환자 관리를 상당히 개선시킬 가능성을 갖는다.
미유합, 지연 유합 및 후경 척추 융합에 대한 가장 일반적인 치료는 자가유래 골이식, 또는 자가이식이다. 자가이식은 대부분의 사례에서 성공적이지만 그들의 뼈 형성(골형성)능에 대한 근거가 완전히 밝혀지지는 않았다. 자가이식은 골수 혈액 산물, 연결 조직 기질, 골 세포외 매트릭스, 및 다양한 조혈성, 혈관성, 및 골형성 줄기 세포 집단의 이종성 집합체이고, 이들은 골유도성, 골전도성, 및 골형성성으로 다양하게 기술되었었다. 하지만, 이들 용어는 오직 세포 과정을 설명하며, 자가이식편의 골형성 잠재력에 대한 근거에 관하나 통찰력을 제공하지는 않는다.
자가이식은 노령 환자에서는 신뢰할 수 없게 되었고, 이러한 변성 상태에 대해 다수의 기연 인자가 존재하는 듯 하다. 일부 데이타는 자가이식편의 골형성능이 골 이식편 재료 내에 함유된 줄기 또는 전구체 세포의 존재에 의존적임을 시사하였고, 줄기 세포의 수는 궁극적으로 세포주기 중지 및 아폽토시스를 일으키는 축적된 DNA 손상때문에 부분적으로 나이에 따라 감소되는 것으로 여겨진다. 다른 데이타는 줄기 세포의 개수 감소보다는, 그들 기능이 나이에 따라 악화된다고 주장한다. 노령 줄기 세포는 또한 그들 환경에서 성장 인자 자극에 덜 반응성이고; 유사하게, 이들 성장 인자 자극의 국소 또는 전신 수준은 노년층에서 감소된다. 노화는 또한 줄기 세포의 유사분열 능력에 영향을 준다: 줄기 세포 노쇠는 나이에 따라 증가하며, 부분적으로 텔로머라아제 활성의 감소와 이후 텔로미어 단축때문이다. 줄기 세포 기능의 이러한 감소는 조직 예컨대 장, 및 근육의 정상적인 강건한 재생성 반응을 제약한다. 노화는 또한 줄기 세포의 유사분열 능력에 영향을 미친다. 유사한 기전이 자가이식편의 골형성 능력의 손실을 담당할 수 있다.
여기서, 본 발명자는 자가이식편의 골형성 잠재력이 이식 재료 내 골형성 줄기 세포에 기인하고, 노화가 이들 줄기/전구체 재체군의 Wnt 반응 상태에 영향을 미치며, 줄기 세포의 WNT-매개 활성화가 노령 동물 유래 자가이식편에 대한 골형성 잠재력을 복원시킨다는 가설을 시험하였다.
방법
동물 관리. 모든 절차는 동물 연구에 대한 스탠포드 위원회에서 승인한 프로토콜을 따랐다. 베타-액틴-강화된 녹색 형광발광 단백질(ACTB-eGFP; The Jackson Laboratory, Sacramento, California) 및 CD1 야생형, 동계 마우스를 사용하였다. 3월령 미만 마우스를 젊은 것으로 간주하였고, 10월령 초과 마우스를 노령으로 간주하였다. Axin2CreERT /+;R26RmTmG/+ 마우스를 Jackson Labs에서 구매하였다. 노령 야생형 루이스 래트(Charles Rivers, MA에서 구매한 "은퇴 교배자")를 AAUC 및 IUPAC 가이드라인(프로토콜 13146)에 따른 척추 융합 수술에 이용하였다.
설치류 모델에 대한 골이식 재료(BGM)의 수집 및 처리. 래트 및 마우스 둘 모두를 이 실험에서 채택하였다. 마우스 모델의 사용은 광범위한 분자 분석에 허용되지만, 자가이식은 이들 소형 동물에 대해 매우 침습성이므로, 본 발명자는 자가이식을 수행시 래트를 사용하였고(예를 들면, 도 7 및 12), 진보된 분자 기술을 사용시 동계 마우스를 사용하였다(도 8-11). 모든 사례에서, 골 이식편 재료(BGM)는 길이방향으로 뼈를 분할하고, 날카로운 장비로 골내막 표면을 부드럽게 긁어, 수집 디쉬에 골수 내용물을 관주하여 대퇴골, 경골 및 장골능에서 회수하였다. 이 방법은 인간에서 사용하는 RIA 기술을 모방한다.
Axin2CreERT/+; R26RmTmG/+ 마우스(도 8)에서 재결합을 유도하기 위해서, 5연속일 동안 IP 주사 또는 위관영양을 통해 체중 g 당 160 ㎍의 타목시펜을 제공하였다. 제1 처리 후 7일에 조직을 회수하고 GFP 면역염색 또는 형광발광으로 분석하였다.
SRC에 이식을 위한 BGM 분취물이 세포 함량면에서 균등한 것을 보장하기 위해서, 3마리 마우스(한배새끼) 유래 BGM을 모으고 이식 분석에서와 똑같이 20 ㎕ 분취물로 나누었다. DNA 내용물을 DNeasy 조직 키트(QIAGEN)를 사용하여 추출하고 상대적 DNA 농도를 Quant-iT PicoGreen dsDNA 키트(Invitrogen) 및 마이크로플레이트 형광발광 판독기(BERTHOLD, Bad Wildbad, Germany)를 사용해 측정하였다. DNA 함량 변동율은 <20%였다. BGMACT를 얻기 위해서, 신선하게 회수한 BGM을 인산염 완충 염수(L-PBS) 또는 WNT3A(L-WNT3A, L-WNT3A 유효 농도 = 0.15 ㎍/mL)의 리포솜 제제를 함유하는 20 ㎕의 배양 배지에 넣고 23℃에서 1시간 동안 유지시켰다.
정량적 역전사-중합효소 사슬 반응(qRT-PCR). 조직 샘플을 TRIzol 용액(Invitrogen)에서 균질화시켰다. 이전에 기술된 바와 같이 RNA를 단리(RNeasy; 미니 키트; QIAGEN, MD, USA)하고 역전사를 수행하였다(SuperScript III First-Strand Synthesis Supermix for qRT-PCR, Invitrogen). 정량적 실시간 PCR을 Prism 7900HT 서열 검출 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 및 파워 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스(Applied Biosystems)를 사용해 수행하였다. 유전자 발현 정도는 CT 방법에 의해 결정하고 그들의 GAPDh 값에 대해 정규화하였다. 모든 방법은 삼중으로 수행하였고 평균 및 표준 편차를 계산하였다. 프라이머 서열(5'에서 3')은 다음과 같다: Axin2, [for-TCATTTTCCGAGAACCCACCGC], [rev-GCTCCAGTTTCAGTTTCTCCAGCC]; Lef1, [for-AGGAGCCCAAAAGACCTCAT], [rev-CGTGCACTCAGCTATGACAT]; GAPDH, [for-ACCCAGAAGACTGTGGATGG [rev-GGATGCAGGGATGATGTTCT]; ALP [for-ACCTTGACTGTGGTTACTGC, [rev-CATATAGGATGGCCGTGAAGG]; 오스테릭스, [for-GGAGACCTTGCTCGTAGATTTC], [rev-GGGATCTTAGTGACTGCCTAAC]; 오스테오칼신, [for- TGTGACGAGCTATCAAACCAG], [rev- GAGGATCAAGTTCTGGAGAGC].
웨스턴 분석. BGM을 젊은 마우스(N=5) 및 노령 마우스(N=5)에서 회수하고 10% 태아 소 혈청(FBS), 100 U/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신이 함유된 둘베코 변형 이글 배지(DMED)에 넣고 37℃에 5% CO2에서 항온반응시켰다. 24시간 후, 미부착 세포를 제거하고, 배지를 교체하고 부착 세포를 그들이 합류점에 도달할때까지 계대하였다. 배지는 3일마다 교환하였다. 일부 실험에서, 3계대 후 세포를 L-PBS 또는 L-WNT3A(유효 농도 = 0.03 ㎍/mL)로 처리하였다. 이들 실험에서, 세포를 24시간 후에 수집하고 RIPA 완충액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용해 용해시켰다. 총 단백질을 웨스턴 블랏 분석을 위해 추출하였다. 팬-액틴을 내부 대조군으로 사용하고 단백질 온전성을 보장하기 위해 사용하였다. WNT3A(R&D, Minneapolis, MN, USA), 비인산화 β-카테닌(Cell Signaling, Danvers, MA, USA), 및 Axin2(Abcam, Cambridge, MA, USA)에 대한 항체를 사용하였다. 웨스턴 블랏팅 결과를 정량하기 위해 통합 강도를 ImageJ(National institute of Health, USA version 1.47v)로 분석하였다.
신피캡슐 이식 수술. 일부 사례에서, 신피 캡슐 어세이(SRCA)가 그 분화 잠재력을 분석하는데 적용되었다. 동계 숙주 마우스가 마취제 흡입후, 피부 절개를 직접적으로 미골부에서 흉곽까지 좌측 옆구리에 만들었다. 복강을 열고 신장을 노출시켰다. 신장 캡슐에 작은 절개를 만들고 연질 플라스틱 배관을 사용해 캡슐 아래에 BGM을 조심스럽게 위치시켰다. 이어서 신장을 복강으로 다시 되돌리고, 복막가 피부를 봉합 밀봉하였다. 부프레노르핀(0.05 mg/kg)을 진통제로 사용하였다. BGM을 Axin2CreERT2; R26mTmG 도너에서 얻은 경우, 숙주에게 이후 5일 동안 0일에 시작하여 위관영양으로 타목시펜(10 mg/mL를 100 ㎕)을 제공하였다. SRC 이식편을 표시된 시점에 회수하였다. 음성 대조군 Fc 아데노바이러스 구성체 및 Wnt 신호전달 DKK1의 2.6 아데토바이러스-매개 억제가 이전에 보고되었다. 아데노바이러스 구성체를 293T 세포에 형질감염시켰다. 2일 후, 세포를 회수하고, 용해시키고, 원심분리 침전시켰다. 정제된 아데노바이러스를 분취하고 -80℃에 보관하였다. Wnt 억제는 BGM을 Ad- Dkk1 및 대조군 Ad-Fc와 2시간 동안 시험관내 항온반응에 의해 달성하였고, BGM 분취물을 이후 두개관 결함에 이식시켰다.
두개관 임계 크기 결함 수술. 마우스를 마취시키고, 3-mm 절개를 만들어 두정골을 노출시켰다. 2-mm 직경의 주변, 전층 결함을 미세-해부용 관상톱으로 생성시키고, 경막은 건드리지 않았다. BGM 분취물을 Ad-Dkk1 및 대조군 Ad-Fc와 2시간 동안 항온반응시켰다. 이어서 BGM 분취물을 두개관 결함에 이식하고 피부를 봉합 밀봉하였다. 수술로부터 회복 후, 진통을 위해 마우스에게 부프레노르핀을 주었다. 미세-컴퓨터 단층촬영(마이크로-CT) 분석을 이전에 기술한 대로 수행하였다.
척추 융합 수술. 루이스 래트를 케타민 70-100 mg/kg 및 크실라진 5-10 mg/kg의 칵테일을 사용해 마취시켰다. 래트의 요추 영역을 면도하여 베타딘함침 거즈로 소독하였다. 피부 절개전에, 래트에게 진통제 부프레노르핀 0.02 mg/kg을 SC/IP 주사하였다. 먼저, 골이식 재료(BGM)를 장골능으로부터 회수하였다. 간략하게, 좌측 장골능을 만져보고 수직 피부 절개를 수행하였다. 장골능의 등쪽 정점에 접근하여 둔적 박리를 통해 노출시켰다. 부착된 근육 및 골막을 들어올려서, 0.3 g의 BGM을 랑게르 집게로 회수하고 소량으로 나누었다. 이어서 BGM을 100 ㎕ L-PBS 또는 100 ㎕의 [0.15 ㎍/mL] L-WNT3A와 항온반응시키면서 횡돌기를 노출시켰다. 횡돌기를 노출시키기 위해서, 후측방 둔적 박리를 수행하고 반전된 척추주변 근육을 견인기를 통해 위치에 유지시켰다. L4-L5의 횡돌기를 골막에서 다듬어 내고 고속 버르 제피하였다. BGM을 L4-L5 횡돌기 상에 그 사이에 분산시켰다. 척추주변 근육을 흡수성 봉합(4-0 비크릴)으로 밀봉하고 피부는 비흡수성 단절 봉합(4-0 나일론)으로 밀봉하였다. 수술 부위를 항생제 연고로 처리하였다. 10 mg/kg 베이트릴을 피하 전달하였다. 부프레노르핀(0.02 mg/kg)을 3일 동안 수술 후 투여하였고, 후속 용량을 통증 제어에 필요시 제공하였다.
샘플 준비, 조직 처리, 조직학. 조직을 4% 파라포름알데히드(PFA)에 밤새 4℃에서 고정시켰다. 샘플을 1일 동안 19% EDTA에서 석회질제거시켰다. 표본을 파라핀 삽입 전에 상승 에탄올 시리즈를 통해 탈수시켰다. 8미크론 두께 세로 섹션을 절단하고 조직학 분석을 위해 수퍼프로스트-플러스 슬라이드 상에 수집하였다. 사프라닌O, 아닐린 블루 및 고모리 염색을 이전에 기술한대로 수행하였다. 조직 섹션을 라이카 DM5000B 디지탈 영상 시스템(Leica Micro-systems, Wetzlar, Germany)으로 촬영하였다.
ALP, TRAP 및 TUNEL 염색. 알칼리 포스파타아제(ALP) 활성은 니트로 블루 염화테트라졸륨(NBT; Roche, Indianapolis, IN, USA), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트(BCIP; Roche), 및 NTM 완충액(100 mM NaCl, 100 mM Tris pH 9.5, 5 mM MgCl)에서 항온반응시켜 검출하였다. 타르트레이트-내성 산 포스파타아제(TRAP) 활성은 백혈구 산 포스파타아제 염색 키트(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 관찰하였다. 발색 후, 슬라이드를 일련의 에탄올에 탈수시키고, Citrisolv(Fisher Scientific)에서 세정하고, 퍼마운트 마운팅 배지(Fisher Scientific)를 사용해 덮개를 덮었다. TUNEL 염색을 위해서, 섹션을 0.1% Triton X-100(Sigma) 및 0.1% 시트르산나트륨(sigma)으로 투과시키고, TUNEL 반응 혼합물(In Situ Cell Death Detection Kit, Roche)과 항온반응시켰다. 섹션을 DAPI 마운팅 배지(Vector Labs, Burlingame, CA, USA)로 고정시키고 에피형광 현미경 하에서 가시화시켰다. 브로모데옥시우리딘(BrdU) 어세이를 위해서, BrdU 표지화 시약(Invitrogen, CA, USA)을 마우스에 복강내 주사하고 주사 4시간 후 안락사시켰다. BrdU 검출은 제조사 지시에 따라서 BrdU 염색 키트(Invitrogen, CA, USA)를 사용해 수해하였다.
면역조직화학. 조직 섹션을 탈파라핀화시키고 PBS에 재수화시켰다. 내생성 퍼록시다아제 활성은 5분간 3% 과산화수소로 켄칭한 후, PBS로 세척하였다. 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 5% 염소 혈청(Vector laboratories)으로 차단하였다. 절절한 1차 항체를 부가하고 밤새 4℃에서 항온반응시켰다. 이어서 샘플을 적절한 바이오틴화 2차 항체(Vector Laboratories) 및 아비딘/바이오틴화 효소 복합체(Vector Laboratories)와 항온반응시키고 DAB 기질 키트(Vector Laboratories)로 발색시켰다. 사용된 항체는 GFP(cell signaling) 및 DLK1(Millipore), Runx2(Santa Cruz), Sox9(Abcam) 및 PPAR-γ(Cell Signaling)를 포함한다.
이식편 성장의 마이크로-CT 분석 및 정량화. 공개된 가이드라인에 첨부된 스캐닝 및 분석]. 마우스를 2% 이소플루란으로 마취시키고 40-mm 해상도에서 다중방식 양전자 방출 단층촬영 컴퓨터 단층촬영 데이타-획득 시스템(Inveon PET-CT; Siemens, Erlangen, Germany)을 사용해 스캐닝하였다. 각 샘플에서 발생된 이식편 성장을 정의하기 위해서, POD2 및 POD49 시점의 스캐닝 데이타를 Osirix 소프트웨어 버전 5.8(Pixmeo, Bernex, Switzerland)에 발송하고, 동일한 방향으로 세분화를 위해 등록하였다. 형성된 새로운 뼈를 이식된 초기 BMG 부피에 대해 비교하였다. 데이타 세트간 차이는 XLStat 소프트웨어 버전(Addinsoft, Paris, France)의 만-위트니 검정법을 이용해 결정하였다. p-값 < 0.05를 통계적으로 유의하다고 간주하였다.
정량화 및 통계 분석. GFP, BrdU, TUNEL, DLK1, 오스테오칼신 및 아닐린 블루 염색을 정량화하였다. 포토샵 CS5(Adobe, version 10.0.1)을 사용하여 손상 부위에서, 관심 영역(ROI)의 픽셀 수를 결정하였다. 마술봉 도구를 사용해 ROI 내 양성 픽셀 영역을 지정하였다. ROI 픽셀에 대한 양성 신호 픽셀의 비율을 백분율로 표시하였다. 손상 부위 전반에 균일하게 자리잡은 적어도 5 섹션을 정량하여 각 샘플의 평균값을 결정하였다. 5 샘플을 각 그룹에 포함시켰다(n=5). 결과는 평균 ± SD로 나타내었다. 스튜던트 t-검정법을 사용하여 본원에 기술된 차이를 정량하였다. P≤0.05를 유의한 것으로 간주하였다.
결과
골 이식편 재료는 다수의 줄기/전구체 세포 집단을 함유한다. 자가이식편을 회수하기에 최적인 해부학상 부위는 뼈 스톡의 이용가능성 및 도너 부위 이환성을 포함한 다수의 인자에 의존적이다. 본 발명자는 변형된 RIA(reamer-irrigator-aspirator) 기술을 사용해 3 해부학적 지점으로부터 BGM을 회수하였으며, 대퇴골, 장골능, 및 경골이 별개의 상이한 조직학적 외관의 BGM을 산출함을 주목하였다. 조혈 세포이외에도, 대퇴골 BGM은 젊은 동물에서 회수할때에도, 지방세포를 함유하였다(도 7A). 장골능 BGM는 대체로 단단하게 부착된 세포가 덮혀진 섬유주 골단편으로 구성되었다(도 7B). 경골 유래 BGM은 상당량의 섬유성 기질 및 소형, 무핵 세포(도 7C)를 함유한다. 본 발명자는 내생성 골형성 유전자를 평가하기 위해 정량적 RT-PCR을 사용하였고, 3 공급원 중에서, 장골능 BGM이 유의하게 보다 높은 수준으로 알칼리 포스파타아제 및 오스테오칼신을 발현함을 발견하였다(도 7D). 대체로, 자기이식편의 골형성 특성은 골이식 재료(BGM) 내 골아세포 및 줄기/전구체 세포에 기인한다고 대체로 여겨진다. 본 발명자는 신피 캡슐(SRC)에 BGM을 이식하는 어세이를 통해 이러한 가설을 직접 조사하였다. SRC는 혈관 공급을 이식된 조직에 제공하고 뼈, 피부, 근육, 치아, 장기, 및 종양을 포함한 다수 유형의 조직으로 세포의 분화를 뒷받침한다. BGM은 장골능으로부터 회수하고 동물의 신장 캡슐 아래에 이식하였으며(도 7A) 7일 동안 발생되게 두었다. BrdU 유입은 자가유래 BGM 내 세포의 높은 유사분열 활성을 입증하였다(도 7B). Runx2(도 7C), Sox9(도 7D) 및 PPARγ(도 7E)에 대한 면역염색은 BGM 내 세포의 세브셋이 골형성, 연골형성 및 지방형성 책무와 관련된 유전자 마커를 발현하는 것을 입증하였다. 7일에, BGM-유래 세포의 하위집단은 뼈(도 7F), 연골(도 7G), 및 지방(도 7H)으로 분화되었다. 함께, 이들 데이타는 BGM이 모든 3 계통으로 분화될 수 있는 줄기/전구체 세포를 함유함을 입증하였다.
골 이식편 재료의 Wnt 신호전달은 나이에 따라 감소한다. Wnt는 골형성 분화를 유도하는 분자 신호에 대해 최고로 연구되었다. Axin2 CreERT2;R26mTmG 리포터 마우스를 사용하여, 본 발명자는 재결합(방법 참조)을 유도시킨 후 골막(도 8A) 및 골내막(도 8B)에서 GFP+ve 사전-골아세포를 식별하였다. 골내막에서 GFP+ve 세포의 빈도는 ∼0.1%였다(도 8C). GFP+ve 세포는 또한 신선하게 회수한 BGM에서도 식별되었다(도 8D). 따라서, 이종성 BGM 내 세포의 서브셋은 Wnt 반응성이다. 본 발명자는 젊은 마우스(3월령 미만) 및 노령 마우스(10월령 초과) 유래 BGM의 Wnt 반응 상태를 비교하였다. 정량적 절대 RT-PCR은 Wnt 표적 유전자 Axin2 및 Lef1의 발현이 젊은 마우스(BGMyoung; 도 8F) 대비 노령 마우스(BGMaged)에서 회수한 BGM에서 거의 2배 낮음을 보여주었다. 웨스턴 분석은 Wnt3a, 인산화 베타 카테닌, 및 Axin2 발현이 BGMyoung(도 8G)와 비교하여 BGMaged에서 모두 유의하게 낮은 것을 확인시켜 주었다. 따라서, BGM의 내생성 Wnt 반응 상태는 나이에 따라 악화된다.
골형성 분화능도 나이에 따라 감소된다. 인간에서, 골 치유 속도는 나이에 따라 감소된다. 본 발명자는 BGM의 골형성능에서 유사한 나이 관련 감소를 발견하였다. 신선하게 회수한 BGMaged는 신선하게 회수한 BGMyoung(도 9A)와 비교하여 골형성 유전자 알칼리 포스파타아제, 오스테릭스 및 오스테오칼신의 발현도가 유의하게 낮은 것으로 확인되었다. 골형성 유전자 발현의 감소가 BGM의 골형성능에 영향을 주는지 여부를 시험하기 위해서, 본 발명자는 SRC 어세이로 돌아갔다. 그러나, 마우스에서 자가이식 수행은 과도한 정신적충격이다. 자가이식을 모방하기 위해, 본 발명자는 동계 도너 및 숙주를 사용하였다. 동계 동물은 매우 밀접하게 관련되므로, 그들의 조직은 면역학적으로 상용성이고 조직의 이식은 면역 반응을 야기하지 않는다. ACTB-eGFP 마우스를 도너로 사용하였고 BGM은 그의 GFP 형광발광에 의해 SRC에서 쉽게 식별할 수 있었다(도 9B,C).
이식 후 7일에, BGM을 회수하고 뼈 형성 증거를 분석하였다. 아닐린 블루 염색된 유골 매트릭스가 BGMyoung(도 9D)에서 명확하였지만 BGMaged(도 9E; F에서 정량화함)에서는 부재하였다. BGMyoung의 유골 매트릭스는 ALP 염색으로 도시한 바와 같이 석화작용을 겪지만(도 9G) BGMaged는 ALP 염색을 보이지 않았다(도 9H; I에서 정량화함). 본 발명자는 BGMaged 및 BGMyoung 간의 이식 효율이 골형성 분화의 차이를 설명할 수 있는지 궁금하였지만, GFP 면역염색은 BGMyoung(도 9J) 및 BGMaged(도 9K) 둘 모두에서 유사한 수의 생존 도너 세포가 존재함을 확인하였다(도 9L에서 정량화). 함께 이들 데이타는 BGM의 골형성 유전자 발현 및 골형성능이 나이에 따라 감소함을 시사하였다.
Wnt 신호전달은 BG의 골형성능에 필수적이다. 내생성 Wnt 반응성, 및 BGM의 골형성능은 나이에 따라 감소한다. 감소된 Wnt 신호전달이 이러한 골형성 잠재력의 나이 관련 감소에 기여하는지 여부를 시험하기 위해서, 본 발명자는 BGM에서 내생성 Wnt 신호전달을 차단하였다. 다른 발명자들 및 본 발명자는 생체내에서 Wnt 신호전달을 일시적으로 제거시키는, Wnt 억제인자, Dkk1의 과발현을 사용하였다. 본 발명자는 Ad-Dkk1 또는 Ad-Fc(대조군)를 젊은 마우스의 골수강에 전달한 후 24시간 후에 BGMyoung을 회수하고 분취물을 임계 크기(미치유) 골격 결함에 이식하였다. 7일 후, 대조군 BGMyoung이 ALP 활성에 대해 강한 양성이었을때(도 10A), Ad-Dkk1 처리된 BGMyoung은 최소 활성을 보였다(도 10B). 대신, Ad-Dkk1 처리된 BGMyoung은 지방형성 단백질 PPAR-γ(도 10C,D) 및 Dlk1(도 10E,F)의 광범위한 발현을 보였다. 뼈 형성은 마이크로-CT(도 10G,H; I에서 정량화) 및 BGM의 조직형태계측 분석(도 10J,K; L에서 정량화)으로 도시한 바와 같이, Ad-Dkk1 처리에 의해 억제되었다. 따라서, BGM의 골형성능은 내생성 Wnt 신호에 의존적이다.
BGM aged 에서 내생성 Wnt 신호전달 증대는 그 골형성능을 복원시킨다. 내생성 Wnt 신호전달은 BGM이 그 골형성능을 나타내는데 필수적이다(도 10J-L). 다음으로 본 발명자는 Wnt 자극이 BGM 효능을 강화시키는지 여부를 조사하였다. BGMaged를 회수하고, L-WNT3A 또는 리포솜 PBS(L-PBS)를 처리한 후 37℃에서 항온반응시켰다(도 11A). 절대 qRT-PCR 분석은 작지만 Axin2 발현이 유의하게 상승함을 보여주었다(도 11B). Lef1은 L-WNT3A에 대응하여 중간정도로 상승하였다(도 11B). 웨스턴 분석은 베타 카테닌 및 Axin2 단백질 둘 모두가 L-WNT3A에 대응하여 상승함을 보여주었다(도 11C). BGM의 유사분열 활성은 L-WNT3A 처리에 의해 증가하였다. 이식 후 4일에, 세포 증식은 LPBS-처리된 BGMaged(도 11D,E; F에서 정량화)와 비교하여 유의하게 증가하였다. 세포 주기에 대한 효과는 일시적이었다: 이식 후 7일까지, BrdU 유입은 L-PBS 및 L-WNT3A 샘플 간에 동등하였다(도 11G,H; I에서 정량화). BGMaged에서 세포 분화를 평가하였다. 지방형성 단백질 Dlk1의 발현은 낮았고(도 11J,K; L에서 정량화) 골형성 단백질 오스테오칼신의 발현은 L-WNT3A 처리된 BGMaged에서 더 높았다(도 11M,N; O에서 정량화됨). 새로운 뼈 형성은 오직 L-WNT3A 처리된 BGMaged에서 확인되었다(도 11P,Q; R에서 정량화됨). LWNT3A 처리는 이식 효율에 영향을 미치지 않았지만, 프로그램된 세포 사멸 분석은 L-WNT3A 처리된 BGMaged가 L-PBS 처리된 샘플 보다 유의하게 낮은 TUNEL+ve 세포를 가짐을 보여주었다. 이식 후 7일에 아폽토시스 감소가 또한 관찰되었다. 새로운 뼈 형성은 골아세포-매개 뼈 리모델링에 대한 자극으로 제공되며 본 발명자는 L-WNT3A 처리된 BGMaged 샘플에서만 새롭게 형성된 유골 매트릭스 주변에서 TRAP 활성을 관찰하였다. 따라서, 본 발명자는 BGM의 골형성능을 강화시키는데 L-WNT3A가 충분하다고 결론내렸다.
L-WNT3A는 BGMaged의 줄기 세포를 활성화시키고 척추 융합 모델에서 골재생을 개선시킨다 . 본 발명자는 골형성능에서 L-WNT3A 매개 급등을 담당하는 BGM 내 세포 집단을 동정하고자 하였다. 본 발명자는 표준 절차를 사용해 VGM으로부터 3종의 줄기 세포 집단을 단리한 후 LPBS(대조군) 또는 L-WNT3A를 사용해 그들의 Wnt 반응성을 평가하였다. 이전의 실험에서, 본 발명자는 줄기 세포 집단에서 Axin2 발현을 믿을만하게 활성화시키는 L-WNT3A의 용량을 결정하였다. 시간 경과 분석은 L-WNT3A 처리에 대한 줄기 세포의 반응을 밝혀주었다: L-WNT3A 노출 15시간 내에, Axin2의 4배 활성화가 관찰되었고, 최대 Axin2 활성화는 36시간에 달성되었다(도 12A). 60h 시점에 줄기 세포에서 감소된 Axin2 발현으로 확인되는 바와 같이, 효과는 일시적이었다(도 12A).
본 발명자는 L-WNT3A에 줄기 세포가 반응하는가를 입증하기 위해 BGM에서 단리한 2차 줄기 세포 집단을 사용하였다(도 12B). BGM의 활성화된 상태는 qRT-PCR에 의해 확인하였다. BGMaged를 회수하고, L-WNT3A 또는 L-PBS를 처리한 후 그 Wnt 반응 상태에 대한 Axin2 및 Lef1 발현을 사용해 분석하였다(도 12C). 12h 이내에, Lef1의 유의한 상승이 검출가능하였고; 24h 이내에, Axin2 및 Lef1 둘 모두가 유의하게 상승되었다(도 12C). 이들 분석은 BGM의 WNT-매개 활성화 상태를 확증하였고, 이후 본 발명자는 이 재료를 BGMACT라고 하였다. 본 발명자의 다음 실험은 래트 척추 융합 모델에서 BGMACT의 치료 잠재력을 검사하였다. 4번째 및 5번째 요추(예를 들여, L4-L5) 척추뼈의 횡돌기를 제피하였고(도 12D) 이 과정 동안, 장골능 유래의 자가유래 BGMaged를 회수하고 1시간 동안 L-WNT3A(또는 L-PBS)를 처리하였다. 최종 물질, BGMACT(또는 BGMaged)을 이후 L4-L5 위 및 그 사이에 이식하였다(도 12E). 수술 후 2일에, BGM의 부피를 마이크로-CT를 통해 평가하였고, 이들 분석은 BGMaged(도 12F) 및 BGMACT(도 12)가 최초에 견줄만한 양의 석화된 조직을 함유함을 검증하였다. 새로운 뼈 형성 부피를 수술 후 49일에 재평가하였다. 마이크로-CT 데이타의 3차원 재현은 척추 융합을 겪은 노령 환자로부터의 유사한 데이타와 일관되게, BGMaged(회색; 도 12G)을 처리한 부위에서 불충분한 골재생을 입증하였다. 대조적으로, BGMACT를 처리한 부위는 강건한 뼈 형성 및 횡돌기의 융합(청색; 도 12H)에 대한 증거를 보여주었다. 횡돌기 사이에 새로운 뼈의 부피를 정량하였고, BGMaged와 비교하여, BGMACT는 유의하게 더욱 석화된 매트릭스를 야기시켰다(도 12I). 따라서, L-WNT3A 처리는 노령 동물 유래 자가이식편의 골형성능을 개선시킨다.
거의 50만 골이식 수술이 매년 수행되어, 자가이식이 미국에서 2번째로 가장 일반적으로 이식되는 조직이 되었다(AATB Annual Survey,). 자가이식편은 동종이계 이식편 및 합성 뼈 대체물보다 상당한 장점을 갖지만, 노인 및 뼈 또는 대사 질환이 있는 환자에서는 사용이 금해졌다. 여기서, 본 발명자들은 자가이식 효율에 중요한 인자를 이해하고, 자가이식 효율을 개선시키는 방법을 검증하려는 노력을 기울였다. 다음의 4가지 주요 인자가 자가이식의 골형성능에 영향을 미쳤다: 먼저, 자가이식편이 회수되는 부위, 두번째, 자가이식편을 회수한 후 취급되는 방식, 세번째, 자가이식편의 성장 인자 구성층; 및 네번째, 자가이식편 내 줄기 세포의 활성화 상태. 여기서, 본 발명자는 WNT 신호가 이들 4가지 핵심적인 변수 중 3가지에 영향을 미치는 증거를 제공한다.
자가이식편 회수 및 취급 최적화. 골형성능, 및 따라서 자가이식의 효율은 회수 부위 및 방법에 의해 영향 받는다. 대부분의 비혈관성 자가이식편을 장골능에서 회수하지만, RIA(reamer/irrigator/aspirator) 접근법으로, 대퇴골 및 경골 수강에도 접근할 수 있다. RIA 및 통상적인 회수법을 통해 수집된 자가이식편의 골형성능은 균등하다. 모의 RIA 접근법을 사용하여, 본 발명자는 장골능, 대퇴골 및 경골에서 회수한 BGM의 세포 구성층에서의 구별되는 차이점을 관찰하였다. 또한, 장골능 BGM은 대퇴골 또는 경골 유래의 BGM과 비교하여 동화작용성 골형성 유전자 발현 수준이 유의하게 더 높았다(도 7). 그러나, 이들 BGM 분취물 모두는 신피 캡슐(SRC) 어세이에서 골형성 잠재력을 나타냈다(도 7). 자가이식의 효율은 또한 환자에 재이식 전에, 재료의 부적절한 취급에 의해 손상될 수 있다. 예를 들면, 신선하게 회수된 BGM을 실온에서 유지시키는 경우에도, 상당한 세포 아폽토시스가 존재한다. L-WNT3A로 BGM을 처리하는 것은 예를 들어 BGM 단독과 비교하여, 세포 생존을 상당히 개선시키며, BGMACT는 ∼50% 낮은 TUNEL-양성 세포를 나타냈다. 유사분열 활성이 또한 L-PBS 처리된 BGM 대비 BGMACT에서 상당히 높았다(도 11D-F). 함께, 세포 증식의 이러한 증가 및 세포 사멸에서의 부수적인 감소는 높은 BGM 생존능으로 이해되고 따라서 개선된 자가이식 효능을 의미한다.
자가이식편에서 성장 인자 활성의 최적화. 자가이식의 효능은 재료 내 성장 인자의 존재에 의존적인 것으로 나타난다. 신선하게 회수된 자가이식편에서, 형질전환 성장 인자 베타, 골형태형성 단백질, 혈관 내피 성장 인자, 및 혈소판 유래 성장 인자를 포함한, 광범위한 성장인자가 동정되었다. 그러나, 탈염된 냉동-건조 동종이식편에서, 이들 인자는 결여되거나 또는 최소로 측정가능한 양으로 존재하였다. 본 발명자의 지식으로, 자가이식편 또는 동종이식편에서 내생성 WNT 신호전달 수준을 보고한 연구는 존재하지 않았다. 그러나, 아마도 Wnt 신호전달 활성을 감소시키는, Wnt 억제인자의 혈청 농도가 노인층에서 상승되어 있음을 명백하게 입증한 수많은 연구들이 존재하였다. 이러한 임상적 발견은 BGM에서 내생성 Wnt 활성이 나이에 따라 감소됨을 보여주는 본 발명자의 데이타와 일치하였다(도 8). 결과적으로, WNT 반응성을 상승시키는 접근법은 자가이식편에 골형성능을 복원시킨다. 본 발명자는 L-WNT3A 처리가 BGM에서 Wnt 신호전달을 활성화시키고, 이는 SRC(도 11) 및 척추 융합 모델(도 12)에서 강건한 골형성과 상관됨을 입증하였다.
L-WNT3A로 자가이식편 줄기 세포 활성화. 자가이식편의 효율의 적어도 일부는 재료 내 줄기/기질 세포로 거슬러갈 수 있다. 골수강에서, 골형성/골격 줄기 세포는 골내막 표면 상에 부착되거나 또는 삽입된다. 결과적으로, 흡인에만 의존적인 회수 방법은 전형적으로 이들 부착 줄기 세포 집단을 회수하는데 실패한다. 사실, 현재 추정으로 골수 흡인물 내 줄기 세포의 수는 1/50,000개 유핵 세포만큼 낮게 존재하고, 노인 환자에서 그 수는 겨우 1/1,000,000개 유핵 세포로 떨어진다. RIA 회수법은 의도적으로 골내막 표면을 제거하여서 골형성 줄기 세포 집단을 더 함유할 수 있는 듯하다. 본 발명자는 Wnt 반응성 세포가 존재하는 골막내 표면을 제거하는 변형된 RIA 접근법을 사용하였고(도 8) 그렇게 하여, 이러한 방식으로 수집된 BGM이 줄기/전구체 세포 집단을 함유하고 구체적으로 내생성 Wnt 신호(도 10)때문에, 강건하게 골형성시킴(도 7)을 확인하였다.
자가이식편이 뼈 재건에 대한 고전적인 예를 계속적으로 대표하지만, 자가이식편 효능 개선에 대해 상당한 여지가 여전히 남아있다. 본원에 도시한 데이타는 L-WNT3A에 대한 생체외 노출이, 높은 골형성 활성에 이르게하는, 신선하게 회수된 자가이식편 내 세포 생존능을 개선시키고 줄기 세포 집단을 활성화시키는 것을 입증하였다. 이들 데이타는 그 고유의 골 형성능이 질병, 질환, 또는 노화에 의해 감소된 위험성있는 환자 집단 유래 자가이식편에 대해 특히, 직접적인 임상 적용성을 갖는다.

Claims (29)

  1. 골 이식편의 세포 생존을 강화시키는 방법으로서, 이식 시 골 이식편의 세포 생존을 강화시키기에 충분한 시간 동안 골 이식편을 Wnt 폴리펩티드의 유효량으로 생체외 처리하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 골 이식편의 골형성 잠재력을 강화시키는 방법으로서, 이식 시 골 이식편의 세포 생존을 강화시키기에 충분한 시간 동안 골 이식편을 Wnt 폴리펩티드의 유효량으로 생체외 처리하는 단계를 포함하는 방법.
  3. 치유 잠재력이 감소된 피험체 유래의 골 이식편을 재활성화시키는 방법으로서, 이식 시 골 이식편의 세포 생존을 강화시키기에 충분한 시간 동안 골 이식편을 Wnt 폴리펩티드의 유효량으로 생체외 처리하는 단계를 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 골 이식편은 자가이식편인 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 골 이식편은 동종이식편인 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 골 이식편은 줄기 세포 집단을 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 골 이식편은 골수 유래 줄기 세포 집단을 포함하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 골 이식편은 골수 유래 중간엽 줄기 세포를 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 골 이식편은 인간 피험체 유래인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 인간 피험체는 노령 환자인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 인간 피험체는 60세 이상인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 인간 피험체는 65세 이상인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 인간 피험체는 70세 이상인 방법.
  14. 제10항에 있어서, 인간 피험체는 75세 이상인 방법.
  15. 제10항에 있어서, 인간 피험체는 80세 이상인 방법.
  16. 제10항에 있어서, 인간 피험체는 85세 이상인 방법.
  17. 제8항에 있어서, 인간 피험체는 치유 잠재력이 감소된 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 인간 피험체는 흡연자인 방법.
  19. 제16항에 있어서, 인간 피험체는 당뇨병 환자인 방법.
  20. 제16항에 있어서, 인간 피험체는 영양 결핍인 방법.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, Wnt 폴리펩티드는 Wnt3a인 방법.
  22. 제20항에 있어서, Wnt 폴리펩티드는 인간 Wnt3a인 방법.
  23. 제21항에 있어서, Wnt 폴리펩티드는 리포솜 인간 Wnt3a(LWnt3a)인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 수령 피험체에 골 이식편을 도입하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 수령 피험체는 인간 환자인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 골 이식편은 치과용 임플란트를 지지하거나 또는 치과용 임플란트의 지지를 증대시키는 데 사용되는 것인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 골 이식편은 골절을 수복하는 데 사용되는 것인 방법.
  28. 제25항에 있어서, 골 이식편은 질환이 있는 뼈를 수복하거나 또는 재건하는 데 사용되는 것인 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 골 이식편은 수령자의 둔부, 무릎 또는 척추에 사용되는 것인 방법.
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