JP7353652B2 - 生体移植用細胞シート及びその製造方法 - Google Patents
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Description
(2)さらに生体適合性の支持体を含む、(1)に記載の細胞シート。
(3)支持体がファイバーからなる3次元構造を有する細胞培養担体である、(2)に記載の細胞シート。
(4)細胞培養担体が、ナノメートル~マイクロメートル単位の平均繊維径を有するファイバーによって細胞との接触面上に形成された開口部を有する、(3)に記載の細胞シート。
(5)開口部の平均径が500nm~1000μmである、(4)に記載の細胞シート。
(6)支持体が、生分解性ポリマーからなるナノファイバーを含有してなる細胞培養担体である、(2)から(5)のいずれか一項に記載の細胞シート。
(7)腎臓病の治療に用いるための、平均細胞密度が1.0×103細胞/cm2~3.0×104細胞/cm2のMSCをその表面に有する、(1)から(6)のいずれか一項に記載の細胞シート。
(8)腎臓の線維被膜下に適用するための、(7)に記載の細胞シート。
(9)脳損傷又は神経変性疾患の治療に用いるための、平均密度が0.5×103細胞/cm2~1.5×104細胞/cm2のMSCをその表面に有する、(1)から(6)のいずれか一項に記載の細胞シート。
(10)脳の損傷部位、変性部位又はそれらの近傍に適用するための、(9)に記載の細胞シート。
(11)MSCが骨髄又は脂肪組織由来のMSCである、(1)から(10)のいずれか一項に記載の細胞シート。
(12)MSCが疾患を有する対象から分離されたMSCである、(1)から(11)のいずれか一項に記載の細胞シート。
(13)ファイバーからなる3次元構造を有する細胞培養担体上に、MSCを3.0×105細胞/cm2以下の細胞数で播種する工程、及び
MSCを培養して、平均細胞密度が3.0×104細胞/cm2以下の細胞シートを調製する工程
を含む、生体移植用細胞シートの製造方法。
(14)細胞培養担体が、ナノメートル~マイクロメートル単位の平均繊維径を有するファイバーによって細胞との接触面上に形成された開口部を有する、(13)に記載の製造方法。
(15)開口部の平均径が500nm~1000μmである、(14)に記載の製造方法。
(16)細胞培養担体が、生分解性ポリマーからなるナノファイバーを含有してなる細胞培養担体である、(13)から(15)のいずれか一項に記載の製造方法。
(17)MSCが骨髄又は脂肪組織由来のMSCである、(13)から(16)のいずれか一項に記載の製造方法。
(18)MSCが疾患を有する対象から分離されたMSCである、(13)から(17)のいずれか一項に記載の製造方法。
本発明の第1の態様は、平均細胞密度が3.0×104細胞/cm2以下のMSCをその表面に有する生体移植用細胞シート(以下、単に細胞シートと表す)に関する。
本発明の細胞シートは、ファイバーからなる3次元構造を有する細胞培養担体上にMSC、例えば疾患を有する対象から分離されたMSCを3.0×105細胞/cm2以下の細胞数で播種する工程、及びMSCを培養して、平均細胞密度が3.0×104細胞/cm2以下の細胞シートを調製する工程を含む方法によって製造することができる。この製造方法は、本発明の別の態様である。
調製される細胞シートの治療効果をより高めるために、本発明の製造方法において、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分とする賦活化剤を含む培地を用いてMSCの培養を行うことが好ましい。
1)賦活化剤の調製
特許文献1の記載にしたがって、ヒト胎盤組織から賦活化剤を調製した。簡潔には、細切したヒト胎盤組織を湿重量50gに対して、100mLの割合で無血清培地(alpha-MEM)に入れ、4℃で72時間、振とうした。遠心分離により上清を回収し、胎盤組織抽出物である賦活化剤を得た。
変形性股関節症患者の人工関節置換術時に採取した骨髄由来のMSC(OA-MSC)を、賦活化剤を含まないMSC培養培地(15%FBS、1%ペニシリン、1%ストレプトマイシン、4500mg/Lグルコース及びL-グルタミンを含有するDMEM)で培養を行った。細胞を回収して、それぞれファイバーからなる3次元構造を有する細胞培養担体であるPreset VECELL 6well(登録商標)(ベセル株式会社)に8×104細胞/well、Cellbed 24well(登録商標)(日本バイリーン株式会社)に2×104細胞/well、3D-insert PS-200 12well及び3D-insert PS-400 12well(3DBiotek社)に3.8×104細胞/wellを播種し、また比較例の培養担体である細胞培養基材A(平均繊維径0.1~0.5μm、空隙率70%以下、平均孔面積0.2μm2、24well)に2×104細胞/wellを播種し、賦活化剤を含まないMSC培養培地を用いて37℃で72時間培養した。基材Aは、その一部にファイバーからなる3次元構造を有するが、3次元構造を持たない平坦な膜状の部分が細胞接着面の約50%を占める基材である。培地を除去した後、タンパク質換算で10μg/mL、1μg/mL若しくは0.1μg/mLの上記賦活化剤を含む又は賦活化剤を含まないMSC培養培地を、それぞれPreset VECELL 6wellに2mL、Cellbed 24well及び基材Aに0.6mL、3D-insert PS-200 12well及び3D-insert PS-400 12wellに1mLを加えて37℃で4日間培養を行った。この培養を1~3回行った後、細胞を回収して、継代数1~3のOA-MSCを調製した。
賦活化剤を含まないMSC培養培地(15%FBS、1%ペニシリン、1%ストレプトマイシン、4500mg/Lグルコース及びL-グルタミンを含有するDMEM)でOA-MSCを培養した。細胞を回収し、2次元培養担体(Corning(登録商標)Costar(登録商標)細胞培養 6wellプレート、Thermo Fisher Science社)に2.5cm×2.5cmの細胞培養基材Bを入れ、8×104細胞のMSCを播種し、1μg/mLの賦活化剤を含むMSC培養培地2mLを加えて、37℃で72時間培養を行うことで、継代数1のOA-MSCのシートを調製した。この方法で調製されたMSCシートは、おおよそ8,500細胞/cm2のMSCを含む。なお細胞培養基材Bは、国際公開WO2016/068266号パンフレット及びLiu L,Kamei K et al. Biomaterials 124(2017) 47-54に記載の方法で製造される、ポリグリコール酸からなるベース部材上にポリグリコール酸からなるナノファイバーを含有する3次元培養担体である。
参考例1及び実施例1で調製したMSCを回収し、Tri Reagent(Molecular Research Center,Inc)を用いてtotal RNAを抽出した。逆転写反応によりclone DNAを合成し、OCT4、Nanog、SOX2、DNMT1、TERT、IL-6、IDO、TSG-6、p16ink4a、p21、p53、α-SMA及び18sRNAについて、表1に示した塩基配列からなるプライマーセットを用いてリアルタイムPCRを実施した。
表中の(F)はフォワードプライマーを、(R)はリバースプライマーを意味する。
実施例3 細胞シートの腎臓病治療効果(急性腎障害を併発した糖尿病性腎症)
糖尿病性腎症を発症している14月齢の雄性OLETFラット腎臓に、実施例1で調製した細胞シートを、実施例3と同様にして腎線維被膜下に移植した(n=2/群)。背部皮膚及び筋膜を切開したのみの偽手術を施したラットをSham群とした。MSCシート移植日、移植後4週及び11週時にラットから血液を採取し、酵素法(SRL)を用いて血清クレアチニンを、UV法(SRL)を用いて尿素窒素(BUN)を測定した。
賦活化剤を含まないMSC培養培地(10%FBS、1%ペニシリン、1%ストレプトマイシン、4500mg/Lグルコース及びL-グルタミンを含有するDMEM)で、OA-MSCを培養した。細胞を回収し、2次元培養担体(Thermo Scientific(商標) Nunc(商標) Lab-TekTM、8well、Thermo Fisher Science社)に、1×0.8cmのネオベールナノ(グンゼ株式会社)を入れ、4×103細胞のMSCを播種し、賦活化剤を含まない200μLのMSC培地を加えて、37℃で24時間培養を行うことで、継代数1のOA-MSCシートを調製した。この方法で調製されたMSCシートは、4781細胞/cm2(調製した各シートの平均細胞密度3923~5884細胞/cm2の平均値)のMSCを含む。
1)細胞シートの調製
実施例1の方法に準じて、表2に示す細胞数のMSCを2.5cm×2.5cmの基材Bに播種し、賦活化剤を含まないMSC培養培地で培養することで、異なる平均細胞密度のMSCを有する細胞シートを調製した。
実施例2と同様にして、細胞シートB、G及びHのMSCにおけるOCT4、Nanog、p16ink4a及びTERTの発現量をリアルタイムPCRによって測定した(図15)。平均細胞密度が低くなるほど全ての遺伝子の発現量が多く、平均細胞密度の低い細胞シート上の個々のMSCの治療効果は、平均細胞密度の高い細胞シート上の個々のMSCよりも高いと推定された。
麻酔下の5週齢の雄性SDラットに腹部正中切開を行った。まず右腎を同定し、右腎動脈を血管用クランプで遮断した。遮断後すぐに上記1)で調製した細胞シートA~Gのそれぞれを、実施例3と同様にして腎線維被膜下に移植した。60分間の遮断の後、血管用クランプを開き、遮断を解除した。左腎についても、上記同様に左腎動脈を遮断し、細胞シートを移植し、60分間遮断の後、遮断を解除した(n=1又は2/群)。また、細胞シートを移植せずに、ゲロータ筋膜、脂肪層及び線維被膜を腎表面から剥がして腎門部に引き寄せた群(Sham-腎被膜処理あり)と、引き寄せた後に元に戻した群(Sham-腎被膜処理なし)を用意した。
1)細胞シートの調製
実施例6の1)の方法に準じて、表3に示す細胞数のMSCを2.5cm×2.5cmの基材Bに播種し、賦活化剤を含まないMSC培養培地で培養することで、異なる平均細胞密度のMSCを有する細胞シートを調製した。
15月齢の雄性APP/PS1マウス(チャールズリバー)を、イソフルラン吸入麻酔下、bregma levelからlambda levelまで8mm×5mmの大きさの開窓部ができるように開頭した。8mm×5mmの大きさに切った細胞シートを開窓部からそれぞれ1枚脳表面に貼り付け、5分間静置した後、頭蓋骨を戻して縫合した。
1)細胞シートの調製
C57BL/6(雄、10週齢)の精巣上体周囲脂肪を採取し、細かく切り刻んだ後、0.4PZ units/mLのリベラーゼ(商標)を含むPBSを脂肪1gあたり1mL加え、37℃で2時間静置した。10%FBSを含むDMEM培地を5mL加えて懸濁後、300g×5分遠心分離して上清を除去した。脂肪1gから回収した細胞ペレットを15cm dish 1枚に播種し、10%FBS、1%PSを含むDMEM培地で4日間培養し、培地を交換後、接着細胞(マウス脂肪組織由来MSC)を回収した。
麻酔下の10-11週齢の雄性C57BL6マウスの右側後背部に切開をいれ、右腎臓を露出させた。右側腎動静脈を結紮し、右腎臓動脈静脈を切除し、右腎を摘出した。出血が無いことを確認し、腎臓を体内の元の位置に戻し、皮膚を閉創した。次に、左側後背部に切開をいれ、左腎臓を露出させ、左腎動静脈を非侵襲性血管用クリップで血流を遮断した。22分間遮断の間、ゲロータ筋膜、脂肪層及び線維皮膜を、副腎を損傷しないように慎重に切開して腎表面から剥がし、腎門部に引き寄せた。45480細胞/cm2の細胞シート(n=4)、27541細胞/cm2の細胞シート(n=4)又は3800細胞/cm2の細胞シート(n=3)を腎臓の全体を包むように貼付し、左腎の虚血開始22分後にクリップを外して血液を再灌流させた。コントロールとして、細胞シートを移植せずに右腎摘出後、左腎を22分間虚血し再灌流させた群(Sham群:n=3)、及び未処置の正常マウス(n=4)を用意した。
Claims (16)
- 間葉系幹細胞と生体適合性の支持体とを含む生体移植用細胞シートであって、
その平均細胞密度が3.0×10 3 細胞/cm 2 ~3.0×10 4 細胞/cm 2 であり、
支持体が、その細胞接触面がナノメートル~マイクロメートル単位の平均繊維径を有するファイバーが3次元方向に積み重なった構造からなる細胞培養担体であり、
細胞培養担体上で間葉系幹細胞を平均細胞密度が3.0×10 3 細胞/cm 2 ~3.0×10 4 細胞/cm 2 となるように培養する工程を含む方法によって調製される、前記細胞シート。 - 細胞培養担体が、ナノメートル~マイクロメートル単位の平均繊維径を有するファイバーによって細胞との接触面上に形成された開口部を有する、請求項1に記載の細胞シート。
- 開口部の平均径が500nm~1000μmである、請求項2に記載の細胞シート。
- 支持体が、生分解性ポリマーからなるナノファイバーを含有してなる細胞培養担体である、請求項1から3のいずれか一項に記載の細胞シート。
- 腎臓病の治療に用いるための、請求項1から4のいずれか一項に記載の細胞シート。
- 腎臓の線維被膜下に適用するための、請求項5に記載の細胞シート。
- 脳損傷又は神経変性疾患の治療に用いるための、平均密度が3.0×10 3 細胞/cm2~1.5×104細胞/cm2の間葉系幹細胞をその表面に有する、請求項1から4のいずれか一項に記載の細胞シート。
- 脳の損傷部位、変性部位又はそれらの近傍に適用するための、請求項7に記載の細胞シート。
- 間葉系幹細胞が骨髄又は脂肪組織由来の間葉系幹細胞である、請求項1から8のいずれか一項に記載の細胞シート。
- 間葉系幹細胞が疾患を有する対象から分離された間葉系幹細胞である、請求項1から9のいずれか一項に記載の細胞シート。
- 細胞培養担体上で、間葉系幹細胞を、平均細胞密度が3.0×10 3 細胞/cm 2 ~3.0×10 4 細胞/cm 2 となるように培養する工程を含む、平均細胞密度が3.0×10 3 細胞/cm 2 ~3.0×10 4 細胞/cm 2 である生体移植用細胞シートの製造方法であって、
細胞培養担体の細胞接触面が、ナノメートル~マイクロメートル単位の平均繊維径を有するファイバーが3次元方向に積み重なった構造からなる、前記製造方法。 - 細胞培養担体が、ナノメートル~マイクロメートル単位の平均繊維径を有するファイバーによって細胞との接触面上に形成された開口部を有する、請求項11に記載の製造方法。
- 開口部の平均径が500nm~1000μmである、請求項12に記載の製造方法。
- 細胞培養担体が、生分解性ポリマーからなるナノファイバーを含有してなる細胞培養担体である、請求項11から13のいずれか一項に記載の製造方法。
- 間葉系幹細胞が骨髄又は脂肪組織由来の間葉系幹細胞である、請求項11から14のいずれか一項に記載の製造方法。
- 間葉系幹細胞が疾患を有する対象から分離された間葉系幹細胞である、請求項11から15のいずれか一項に記載の製造方法。
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