JP2002504412A - 生きたキメラ皮膚置換体 - Google Patents

生きたキメラ皮膚置換体

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ノートン，ゲイル，ケイ．
ピンニー，アール，エメット
マンズブリッジ，ジョナサン，エヌ．
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アドバンスト ティシュー サイエンス インコポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、創傷の治癒を改善する皮膚置換体からなる。一つの具体例で、皮膚置換体はキメラで、患者由来の自己上皮細胞を採集し、それらを、インビトロで培養された同種異型上皮細胞を含む生体適合性基質に接種することからなる。生きたキメラ皮膚置換体は、創傷部位に移植する前に永久的な皮膚置換体上に移植することができる。別の例では、皮膚置換体は、内部、中央及び外部成分からなる複合物で、(a)基体として生物分解性又は除去可能な足場を有する生体適合性皮膚構造物からなる内部成分；(b)上皮細胞からなる中央成分、及び(c)基体として生物分解性又は足場を有し、一時的なカバーと組合わさり、上皮細胞の中央成分に対して内部で面している皮膚部位からなる皮膚構造物でインビトロに培養される上皮細胞からなる外部成分からなる。本発明は、さらに本発明の種々の皮膚置換体を製造する方法及び移植する方法を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、その全体を参照によってここに挿入される、1998年2月24日出願の 合衆国仮出願第60/075,704号の35 U.S.C.§119(e)の下の利益を主張するもので ある。
【０００２】 １. イントロダクション 本発明は、生きたキメラ皮膚置換体(living chimeric skin replacement)に関
する。このキメラ皮膚は、改善された創傷の治癒を促進する。より詳細には、こ
の発明の組成物と方法は、直接移植に利用可能な、インビトロで培養された同種
異型上皮細胞ならびに新たに採集された自己上皮細胞を含む永久的な置換皮膚を
提供することによって創傷の閉鎖をもたらす。したがって、本発明は、創傷の全
範囲に対して細胞を直接供給し、患者自身のケラチノサイトを含む。
【０００３】 ２. 発明の背景 裂傷、火傷、穿刺及び皮膚潰瘍による多数の皮膚の創傷は、しばしば治癒のた
めの臨床的な介入を要する。このような創傷の従来の処置は、しばしば十分とは
言えない結果を招いている。さらに、合衆国で約１万人の人が、ひどい火傷によ
る皮膚の創傷のためだけに毎年亡くなっている。 生命をおびやかす火傷は、あらゆる形態の軍事的戦闘と、あらゆるレベルの軍
務で、かなりの数で発生している。生存率と、例えば火傷のような多くの皮膚の
創傷に苦しんでいる患者への標準的なケアを改善し、治療費を削減することが、
危機的に求められている。 皮膚は、表皮と真皮組織の両方からなる。表皮は、生きている層と生きていな
い層の両方を含む。基底層と棘状層は、時々マルピーギ層と呼ばれる。その機能
は、生きていない最も外部のバリア層、角質層を生じることである。表皮は、そ
の最も深い基底層つまり基底層から発生する。柱型のこの単層のあいだには、優
勢なケラチノサイト(ケラチン産生細胞)、メラノサイトと呼ばれる色素産生細胞
及び骨髄由来で皮膚の免疫機能に重要な役割を果たすランゲルハンス細胞が散在
している。細胞増殖は基底層とより低レベルの有棘層(つまり棘状層)で生じ、そ
こで、細胞は、表面に対して継続的に拡張される。
【０００４】 表皮細胞が表面に移動するにつれて、細胞は薄くなり、乾燥し、硬くなって角
質化される(分化と呼ばれる工程)。棘状層は、実際に幾つかの細胞層からなる。
細胞は有棘層から顆粒層、つまり一般に2〜3個の細胞の厚みがある顆粒形成層に
移動する。時間が経つにつれて、細胞は、顆粒層からケラチン化領域である淡明
層(遷移細胞レベル)に移り、そこで、膜構造がシステイン残基間のジスルフィド
架橋の形成で安定化される。十分に形成され、平たくなり、かたくなった表皮細
胞は、角質層に入る。 真皮は、主として血管と神経枝を含む線維組織からなる支持連結組織である。
真皮は、細胞外マトリクスタンパク質、例えばコラーゲン、フィブロネクチン及
びエラスチンのような連結組織要素を生産する線維芽細胞を含有する。これらの
マトリクスタンパク質は、皮膚の強度と柔軟性に寄与する。基底膜は、幾分、表
皮を真皮に付着させるのに役立っている。皮膚は、毛包や汗腺のような付属の器
官をも含む。創傷のひどさによって、皮膚のこれらの要素のいずれか又は全てが
損傷するか、もしくは失われる。
【０００５】 現在、火傷の創傷の外科的な切除と患者の火傷していない皮膚から採取した自
己移植片の使用が、合衆国における多数の火傷の患者の慣例的な治療法である。
十分に範囲を保護し、かつ遅れを避けるために、メッシュグラフトのような技術
が用いられている。この技術は、スリットを皮膚移植片に切り、それによって、
移植されるべき創傷域の大きさを覆うように皮膚を広げることからなる。さらに
、健康な皮膚の入手が限られているためにドナーの部位での再採集がしばしば要
され、しばしば血液損失(blood loss)のような合併症ならびに感染の機会を招く
こととなり、治癒を遅らす。したがって、これは、広範囲に及ぶ火傷の損傷があ
る患者において重大な問題を提起している。というのは、ドナーの部位が再採集
できるように十分に治癒し、創傷を完全に閉鎖するのに十分な数の自己移植片を
生じるには、何ヶ月も経過する可能性があるためである。この結果、経過を促進
するために、自己移植皮膚は通常網状にされ、大きな創傷域を覆うように伸張さ
れる。このような網状化と伸張により、多数の望ましくない網のパターンが治癒
された皮膚に生じ、永久的な傷跡となる。再構成手術も、何年にもわたって必要
とされるおそれがある。
【０００６】 また、創傷を覆うのに利用可能な火傷していない自己移植皮膚片が、ほんの小
領域である場合には、凍結保存されているか又は新鮮なヒトの死体の皮膚の同種
移植片が、現在では、多数の切除された火傷創傷を覆う標準的な生物学的ドレッ
シングである[Antip 及びBurke, 1983, Curr Prob.Surg.20:623-86；Pruitt 及 びLevine, 1984, Arch.Surg. 119:312 -22；Hansbrough, 1987, In:Boswick J. 編集、The Art and Science of Burn Care. Rockville, Maryland:Aspen Publ.I
nc., 57-63]。 自己移植皮膚片が利用できない際に新鮮な死体の同種移植皮膚片が切除した創
傷を覆うのに優れているが、新鮮な皮膚は供給が限られている。死体の同種移植
皮膚片に関する別の問題は、死体の同種移植皮膚片は、創傷に従属して著しく免
疫抑制されている、火傷のひどい患者の生存を延ばすが、置換から数週間以内に
宿主の免疫拒否を引き出すということである[Ninnemannら、1978, Transplantai
on 25:69-72]。同種移植皮膚片の拒絶は、その反復使用を要するであろう。また
、拒絶は、細菌の集落形成と創傷の感染を伴う場合があり、これにより、同種異
型と自己双方の皮膚のその後の植付けが制限される。さらに、その後の同種移植
片の使用により、たびたび拒絶が早まれ、その結果、レシピエントの免疫系が予
め感作されることとなる。このため、多数の火傷がある患者のケアは、生命をお
びやかす感染や他の合併症が生じる前に十分な移植片で被覆を成し遂げるために
、時間との競争となる。
【０００７】 培養した同種移植片の臨床上の使用は、その使用が1983年に報告されて以来繰
り返し試みられている[Heftonら、Lancet 11:428(1983)]。最初に、これらの培 養した同種移植片の長期間の生存と免疫学的な耐性が、数人の著者によって認め
られた。しかし、これらの研究は部分的に厚みのある創傷について行われており
、毛包のような残存している真皮要素からの上皮形成の可能性は無視できなかっ
た。最近の研究は、培養されたケラチノサイト同種移植片は永久には生存しない
ことを示唆している[Phillips,T.J., Transplantation 44:106 (1987)]。HLAク ラスI分析 [Gielenら、Dermatologica 175:166(1987)]、DNAフィンガープリンテ
ィング[De Lucaら、Burns 15:303(1989)]及びY-染色体分析[Burtら、Br.Med.J.
298:915(1989)；Brainら、Br.Med.J. 298: 917(1989)]は、レシピエントのケラ チノサイトによる同種移植片に関する最終置換を立証している。 移植可能な組織の利用可能性を増す別のアプローチは、患者から損傷のない皮
膚切片を得て、生検に存在する上皮細胞をインビトロの組織培養で成長させるこ
とである。例えば、米国特許第4,016,036号のGreenとRheinwaldは、ケラチノサ イトの一次培養物が全体に厚みのある患者の皮膚(細かく刻まれ、細胞が集まら ないようにトリプシンで処理されている)の生検由来の単細胞懸濁液で開始され ている、ケラチノサイトのようなヒト上皮細胞の連続培養を目的としている。こ
の細胞懸濁液は、種々の成長因子を有する培養培地を含む培養皿にプレートされ
る。細胞懸濁液は、増殖を妨げるように照射したネズミの線維芽細胞層に積層す
る。培養したケラチノサイトをさらに拡大するために、これらの培養物をトリプ
シン処理し、ばらばらの細胞を多くの新しい皿に通して、二次培養を開始する。
細胞が増殖するにつれて、隣り合ったコロニーが融合してケラチノサイトの連続
シートを形成するまで、ケラチノサイトコロニーが広がり続ける。
【０００８】 米国特許第4,304,866号のGreenとKehindeでは、培養した自己ケラチノサイト の培養皿からの剥離も開示されている。皿からケラチノサイトを剥がすため、細
胞-細胞の接着に関与するのに余地を残す一方、プラスチック皿への細胞の癒着 に関与するタンパク質を消化するプロテアーゼであるディスパーゼ(Dispase)で 培養物が処理されている。残念ながら、主要な欠点は、移植に適当な自己細胞シ
ートをつくるのに約3、4週間かかり、治癒がかなり遅れることである。 また、このような自己培養物の長期間の成功率は、しばしば50％未満であるこ
とが報告されている。成功率を低くしている一つの要因は、細胞が中性プロテア
ーゼ(一般にディスパーゼ)を用いて培養皿から酵素的に除かれることにより、細
胞表面の癒着レセプター、つまり創傷への癒着に重要と考えられているインテグ
リンが損傷されているという事実である[Rennekanpffら、J.Surgical Res. 62:2
28-295 (1996)]。
【０００９】 PittelkuoとScott, Mayo [Clin.Proc. 61:771-777(1986)]は、多くの火傷のあ
る患者を自家移植する二相システムを開示している。Pittelkuoでは、最初の相 は、ケラチノサイト培養用の無血清培地中で皮膚の小さい試料を採集し、培養す
ることからなる。第二相は、移植用の分化ケラチノサイトのシートを形成するた
めに、ケラチノサイト細胞を広げて誘導するように分化を誘導することからなる
。この方法は、約3週間を要する。さらに、細胞は膜上で培養されず、上皮細胞 は火傷の患者への移植前にディスパーゼで酵素的に除き、次いでトリプシン処理
しなければならない。 Eisinger(米国特許第4,299,819号)は、pHが約5.6〜5.9の組織培養培地中の皮 膚成分の不在下で表皮を真皮から離し、表皮を表皮細胞と成長中の表皮細胞に分
離する、火傷の被害者を治療する方法を記載した最初の人物である。この表皮シ
ートは、火傷の被害者の痛みのある領域に用いられる。
【００１０】 Gallicoら[New England Journal of Medicine 311(7):448-451(1984)]は、少 量の皮膚-生検試料を培養して得られる自己上皮細胞シートを用いる皮膚置換体 の移植を記載している。この方法は、自己細胞がインビトロで成長している間に
、火傷の被害者が、ヒト-死体皮膚同種移植片か、又はコラーゲン-グリコサミノ
グリカン-サイラスティック(silatic)シートを受ける、多くの操作からなる。自
己皮膚は成長に数週間を要し、自己細胞シートは、さらに移植前にディスパーゼ
を有する培養フラスコから培養シートを剥がす必要がある。また、自己培養物の
移植前に、同種移植片を除く必要がある。この技術に伴って、体温低下と同型移
植片の除去による血液損失の問題が生じる。 Bell(米国特許第4,485,096号)は、コラーゲン格子に線維芽細胞を含み、宿主 のレシピエントから予め生検した表皮細胞で接種されたラットモデルでの皮膚移
植を記載している。この移植片はインビトロで培養され、創傷部位に移植される
。 種々の因子が、皮膚移植の成功率が低い原因となり得る。例えば、組織培養プ
レートから新たに生じた上皮細胞シートを除くのに用いられる酵素処理は、細胞
表面分子を変えるか又は破壊でき、次いで、互いに又は創傷に培養細胞が癒着す
る能力を変えることができる。さらに、多層培養上皮細胞は、増殖状態から分化
状態に変わることができる。しかし、細胞の分化に関連して、ある種の細胞の癒
着分子の発現低下により上記のように互いの及び創傷への細胞の結合が変えられ
、この結果、創傷が閉鎖されない。
【００１１】 臨床上及び研究上の経験から、厚みの深い火傷での純粋な同種異型上皮細胞移
植片の耐性は低いことが立証されている[Phillipsら、1991, Transplantation,
51:937]が、これは主に外来組織に対する宿主の免疫応答の結果である。皮膚に 存在するランゲルハンス細胞と上皮細胞は、宿主の免疫応答の標的であることが
分かっている。しかし、免疫応答は一般に迅速でなく、火傷のようなひどい創傷
ではかなり遅れるおそれがあり、そこで、ランゲルハンス細胞と他の細胞に対す
る免疫応答が創傷自体を囲む損傷を受けた組織によって妥協(compromise)する可
能性がある。 キメラ皮膚の移植において、種々の試験が試みられている。Augerら(WO 94/17
179号及び米国特許第5,610,007号)は、Balb/c及びC3H/HeNマウスケラチノサイト
の50:50及び25:75混合物を融合するまで共培養し、次いでディスパーゼ(Sigma) で酵素的に除いてフラスコ表面から細胞を放す、インビトロでのキメラ上皮細胞
の発生を開示している。 科学者は、そのキメラ移植片は、3〜5週間という従来 の移植可能な細胞シートに要される時間のほぼ半分で製造できると判断している
。同様に、Suzukiら[Transplantation, 59(9):1236-1241(1995)]は、C3H/HeとBa
lB/cマウスケラチノサイトを共培養して、同系(自己)及び同種異型のマウスケラ
チノサイトの移植可能性を調べた。同種異型及びオートジェニックの細胞双方は
再びインビトロで共培養し、ディスパーゼで培養皿から酵素的に除いた。
【００１２】 同種異型と自己のマイクロ皮膚移植片の混合物(10:1拡張(expansion)比)を、 ウサギモデルの全体に厚みのある皮膚創傷に移植し、バイオブラン(BIOBRANE)で
積層する[Linら、Burns 20(1):30-35(1994)]。StarkとKaiser [Burns 20(1):534
-538(1994)]では、部分的に厚みがあり、全体的に皮膚に厚みのある火傷がある 患者の皮膚生検からインビトロで培養した自己ケラチノサイトは、傷を受けて17
〜25日後に、フィブリングルー(glue)に懸濁した非融合性の単細胞として移植し
た。幾つかの創傷では、細胞-フィブリン懸濁液は、別のグリセロール分解され た同種異型の分裂した厚みのある皮膚移植片を接着するのに用いた。移植前のイ
ンビトロでの自己細胞のこのような培養は移植を遅らし、この結果、創傷の治癒
を遅らす。これらの方法の多くは、細胞接着に要される細胞表面分子に有害な作
用を及ぼす、酵素処理による培養細胞の除去を要する。この結果は、望ましい皮
膚移植片としてのその魅力をさらに損なう。最後に、Hansbroughに認可された米
国特許第5,693,332号は、1〜約7日間親水性膜上でケラチノサイトを成長させて 、次いでケラチノサイト含有膜を創傷と接触させることによる、移植用の自己ケ
ラチノサイトの培養に必要な時間を短縮する方法を開示している。 当該分野における前述の問題を考慮して、皮膚に傷のある患者の治療用の優れ
た代替皮膚置換体が必要とされている。理想的には、そのような代替皮膚は迅速
かつ再現可能に創傷に癒着し、拒絶なしに長期間持続し、かつ大量に容易に入手
可能であるべきである。
【００１３】 ３. 発明の要約 本発明は、生きたキメラ皮膚の置換体、その製造法及び例えば裂傷、潰瘍及び
火傷を含む種々の症状によって引き起こされる皮膚創傷のある患者の治療におけ
るその使用法に関する。また、本発明は、創傷の治療で用いるための新規な複合
皮膚置換体を包含する。 本発明は、膜又は他の生体適合性基質上でインビトロで培養されている、ケラ
チノサイトのような同種異型上皮細胞を移植し、移植時又はその頃に、比較的少
量の自己上皮細胞を同種異型細胞-基質構造物に加え、自己上皮細胞を同種異型 細胞と同時に移植することよって創傷の被覆を改善できるという出願人の発見に
、一部分、基づいている。自己細胞は、移植直前に培養した同種異型細胞に接種
されるケラチノサイトであることが好ましい。また、自己細胞は、創傷部位、好
ましくは皮膚置換構造物の上部及び自己細胞の上部に位置する同種異型細胞-基 質構造物(同種異型細胞は創傷に面している)に直接接種することができる。
【００１４】 一つの具他例において、同種異型細胞は、新鮮な移植片の供給物が外科医に利
用しやすいように、膜又は他の生体適合性の基質上でインビトロで培養され、凍
結保存される。好ましい例では、同種異型細胞は、可逆的に水和性の生体適合性
で、生物分解性の膜上で培養される。 別の好ましい例では、自己細胞は、約1x104細胞/移植材cm2の密度で同種異型 移植片に加えられる。 別の好ましい例では、上に記載するキメラ移植片は、深い又は全体的に厚い創
傷においてデルマグラフト(DERMAGRAFT, Advanced Tissue Sciences, Inc., La
Jolla,CA)のような皮膚等価物と組み合わせて用いられる。デルマグラフトは、 間質細胞と、接着する間質細胞によって天然に分泌される連結組織タンパク質を
含み、生体適合性のフレームワーク又は足場を実質的に包含している三次元の生
きた間質組織からなる生きた皮膚置換体である。デルマグラフトは、その開示が
完全にここに参照によって挿入される、米国特許第4,963,489号に詳細に記載さ れている。
【００１５】 別の好ましい例では、複合皮膚置換体が、この発明の方法にしたがって利用さ
れる。ここで、デルマグラフトのような、基体として生物分解性又は除去可能な
足場を有する生体適合性の皮膚構造物を創傷床に置き、患者由来の自己細胞を、
例えば皮膚構造物が血管化した直後又はその後に皮膚構造物の上部に加え、次い
でバイオブラン膜のような一時的なカバーと組合わさり、基体として生物分解性
又は除去可能な足場を有する生体適合性の皮膚構造物からなる皮膚成分上で培養
された同種異型上皮細胞からなる外部成分を、自己細胞の上部に載置する。この
複合皮膚置換体の別の具体例は、複合物の中間又は外部成分での、同種異型細胞
もしくは自己細胞、又はそれらの組み合わせの使用を含む。 さらに別の具体例では、同種異型ならびに自己の上皮細胞は、基質上で同時に
接種し、十分な時間培養して基質に細胞を接着させることができ、次いで細胞が
創傷に面している創傷部位に移植することができる。
【００１６】 ４. 発明の詳細な記載 本発明は、生きたキメラ皮膚置換体に関する。本発明の皮膚置換体は、同種異
型ならびに自己の上皮細胞を含むキメラ構造物からなる永久的な置換体である。
同種異型上皮細胞は、例えば生体適合性膜、皮膚構造物、グルー又はゲルのよう
な基質上でインビトロで培養され、多くの場合、凍結保存される。次いで、同種
異型細胞-基質構造物は(凍結保存されている場合に)溶かされ、ケラチノサイト 、機械的に崩壊した皮膚又はマイクロスキンビット(bit)のような自己上皮細胞(
自己細胞は好ましくは移植直前に生検されている)とともに創傷部位に置かれる 。望ましい場合には、上皮細胞置換体は、創傷が深い場合に永久的な皮膚置換体
とともに移植してもよい。 本発明は、膜又は皮膚構造物のような基質上でインビトロに培養された同種異
型細胞の直接的な皮膚のカバーが、健康な自己の上皮細胞とともに創傷部位に置
かれ、それによって治癒を促進するという、改善された皮膚置換体を提供するも
のである。同種異型細胞に対する自己細胞の割合は、1:5〜1:50の範囲である。 同種異型細胞は、創傷部位で免疫応答が生じる前に、十分なカバーを行う。しか
し、自己上皮細胞は、創傷において生理学的かつ免疫学的な選択的利点を有し、
ついには同種異型細胞を置換する。与える自己細胞の量は、著しい免疫応答が生
じる前に自己細胞の十分な被覆で創傷が治癒するような量である。したがって、
本発明は、自己細胞が加えられるために、著しい免疫拒絶なしに永久的な移植片
である皮膚移植片を迅速に利用することができるという利点を有する。
【００１７】 本発明の一つの具体例において、死体の皮膚からの同種移植片細胞は、宿主の
自己細胞とともに接種され、創傷部位に移植される。次いで、自己細胞は増殖し
、宿主の免疫応答が死組織に対して生じるにつれて、同種移植片組織を連続的に
置換しながら成長する。 同種異型上皮細胞は、必要なときに迅速に移植に利用できるようにインビトロ
で培養される。同種異型上皮細胞は、生体適合性、好ましくは生物分解性の基質
上で成長する。 一例として、かつ限定されることなく、生きたキメラ皮膚置換体は、以下のよ
うにして製造することができる： (a) 同種異型上皮細胞を、生物分解性、生体適合性の基質上でプレートし、約2
5〜90％融合するまで成長させ； (b) 外科医によって必要とされるまで、同種異型細胞と基質を凍結保存して貯 蔵し； (c) 移植直前に細胞を溶かし； (d) 自己上皮細胞を採集して、約1x104/cmの密度で同種異型細胞に接種し、次 いで創傷部位に移植し；かつ (e) キメラ皮膚移植片を、移植片を十分に固定し、機械及び感染の影響から保 護するのに十分なドレッシングで覆う。 本発明のこの方法の工程(b)と(c)は任意であることに留意のこと。
【００１８】 創傷がかなり深いか又は全体に厚みのある場合、本発明の好ましい具体例は、
皮膚置換体が創傷部位に置かれ、その後キメラ皮膚移植片が使用されることをさ
らに提示する。時折、状況によっては、創傷部位への移植前に、数日間、皮膚置
換体上でキメラ移植片を培養することすら望ましい。深い又は厚みのある創傷で
の皮膚置換体の使用により、ケラチノサイトが接着し、増殖する任意の環境を生
じることができる。上皮細胞置換体についての主な問題は、多くの創傷部位で移
植するのに十分な皮膚支持構造の有用性である。それは、皮膚マトリクスが容易
に利用できる場合に最適である。したがって本発明の好ましい例において、深い
又は全体に厚みのある皮膚創傷は、ケラチノサイトの接着と増殖を支持するデル
マグラフト(Advanced Tissue Sciences,Inc., La Jolla,CA)のような培養された
皮膚置換体を使用する。例えば、デルマグラフトは生物分解性ポリグラクチン(p
olygractin)で培養された同種異型の新生児の線維芽細胞からなり、永久的な皮 膚置換体(ポリグラクチンは生物分解性であるため)である。これらの線維芽細胞
には免疫原性がほとんど伴われないため、この移植片に生じる免疫応答は顕著な
ものではない。例えば、限定するものではないが、三次元のキメラ皮膚移植片は
、以下のようにして深い又は全体に厚みのある創傷に生じさせることができる：
(a) 同種異型上皮細胞を、生物分解性、生体適合性の基質上でプレートし、約2
5〜90％融合するまで成長させ； (b) 外科医によって必要とされるまで、同種異型細胞と基質を凍結保存して貯 蔵し； (c) 三次元の皮膚等価物を得て、これを創傷部位に置き； (d) 上記のように、生体適合性基質上の同種異型細胞を溶かし； (e) 自己上皮細胞を採集して、同種異型細胞に接種し； (f) 移植片を皮膚等価物に積層して、キメラ皮膚移植片を創傷に接着させ；か つ (g) 移植片を十分に固定し、機械及び感染の影響から保護するのに十分なドレ ッシングで、キメラ皮膚移植片を覆う。
【００１９】 本発明の別の好ましい例によれば、3つの成分： (1)基体として生物分解性又は除去可能な足場を有する生物分解性皮膚構造物か らなる内部成分；(2)患者又は自家のドナー由来のケラチノサイト又は機械的に 崩壊した皮膚のような自己上皮細胞からなる中央成分、及び(3)バイオブラン膜 のような一時的なカバーと組合わさり、基体として生物分解性又は除去可能な足
場を有する生体適合性の皮膚部位からなる皮膚構造物で培養された、ケラチノサ
イトのような同種異型上皮細胞からなる外部成分 からなるキメラ皮膚置換体が利用される。 本発明の好ましい例によれば、同種異型細胞は、外部成分の皮膚部位(被覆膜 の反対)で成長して接着され、細胞を含有する外部成分の皮膚側は、中央成分の 自己細胞に内部で面している。 この複合皮膚置換体は、その後、火傷のような創傷の治療に用いるためにイン
ビトロで形成することができる。また、この複合物は、移植時に形成することが
できる。つまり、内部の皮膚構造成分を創傷部位に置いて、皮膚成分が血管化し
た直後かその後に、自己細胞を皮膚成分の上部に加え、次いで同種異型細胞を含
有し、皮膚側が内部で面している外部成分を自己細胞の上部に置く。こうして、
複合皮膚置換体の最も外側の層を最も内部の層に向かわすことにより、最も外側
の層が外部成分の膜になり、次いで同種異型細胞を含む成分の皮膚部位、次いで
自己の中央層、次いで最も内部の皮膚置換層となるであろう。
【００２０】 この複合皮膚置換体のさらに別の例によれば、中央成分は、同種異型源由来の
細胞又は自己ならびに同種異型源由来の細胞の組み合わせからなっていてもよい
。さらに、この中央成分の細胞は、単細胞懸濁液、マイクロスキンビット、崩壊
又は分散した皮膚の形態、又はシート形態であってもよい。さらに、本発明の他
の例によれば、外部成分で培養された細胞は、自己細胞又は自己細胞と同種異型
細胞の組み合わせであってもよく、自己もしくは同種異型のタンパク質又はその
組み合わせの存在下又は不在下で培養してもよい。 この複合皮膚置換体の好ましい例によれば、外部成分は、トランスサイト(TRA
NSCYTE)としても公知のデルマグラフト-TCの変型である。デルマグラフト-TCは 、バイオブランのようなサイラスティック(sialastic)膜に接着する目に見えな い皮膚成分からなる皮膚置換構造物である(ここで、その開示が参照により挿入 される米国特許第5,460,939号に記載のとおり)。この発明によれば、トランスサ
イトの変型は、細胞又はタンパク質が付加したこの構造物からなる。より詳細に
は、好ましい例は、例えば成長と増殖を助けるためにタンパク質因子を加えるか
、又は加えないで同種異型上皮細胞が成長している、この皮膚置換構造物である
。
【００２１】 この外部成分は、幾つかの目的にかなっている。それは、湿度の損失を制御し
、感染を妨げるのに良い障壁となっている。また、それは、適切に全ての他の成
分を保持しており、成長を最適化する状況で創傷部位に付着する最もよい機会と
なっている。さらに、それは透明で、このために治癒のあいだ視覚的に観察する
ことができる。 内部成分と外部成分は、ともにインビトロで成長又は形成させ、その後のイン
ビボでの使用のために凍結保存し、貯蔵することができる。したがって、本発明
の好ましい例によれば、能力のないデルマグラフトは、上に位置する患者由来の
機械的に分散又は崩壊した自己の皮膚とともに創傷床に置かれ、一方の面、好ま
しくは創傷に面している側で同種異型ケラチノサイトを培養し、かつ/又はタン パク様溶液でコーティングして変えられたトランスサイトの一片で覆われる。患
者の皮膚細胞は内部のデルマグラフトの上部で成長して融合し、次いで外部成分
が最後に除かれるか、又は捨てられる。 本発明を以下の小項目により詳細に論ずるが、これは記載のためにすぎず、限
定するものではない。記載を明らかにするために、詳細な手順と方法をここに記
載する。これらの技術は、本発明の実際を例示するものにすぎない。同様の手順
と技術も、等しく使用することができる。
【００２２】 ４．１ インビトロで同種異型細胞を培養するための基質 基質は生体適合性、好ましくは、基質が時間をかけて崩壊し、後日、除く必要
がないように、生物分解性であるべきである。また、創傷部位での滲出物の蓄積
を妨げ、創傷の乾燥を妨げるため、滲出物を吸収及び/又は放出できるように、 例えば基質膜のような基質は、可逆的に水和性の基質であるべきである。膜は、
創傷を感染させる細菌の能力を減じるか又は阻害するように、小孔を有すること
が好ましい。基質は創傷に容易に癒着するか又は創傷への癒着が上皮細胞を傷つ
けずに生じ、もしくは膜の透質度(MVTR)を著しく変えないように、生物付着剤で
処理することができる。また、基質は、変化しやすい創傷表面に順応しやすいよ
うに十分に展性であるべきである。 一つの例で、同種異型上皮細胞は、合成物の親水性のポリウレタン膜ドレッシ
ング、例えばハイドロダーム(HYDRODERM, Wilshire Medical, Inc., Dallas, TX
)又はスピロフィルム(SPYROFILM, Polymedica Inc., Denver, CO)上で成長する 。両フィルムとも、水蒸気の透過性は高いが変化しやすく、膜表面の一部を覆う
生体適合性の接着性コーティングを有する。これらのポリウレタン膜は、湿ると
水蒸気透過性を著しく増す。ハイドロダームのMVTRは、膜の湿度の程度の関数で
ある。通常の皮膚は、200〜2000g-m-2-d-1の範囲のMVTRを有する。損傷を受けて
いるか又は火傷している皮膚は、3000〜5000 g-m-2-d-1と同じくらい高度な透湿
度を有する。平衡水含量が1％未満の従来の疎水性ポリウレタンフィルムは、150
0〜2000 g-m-2-d-1の透湿度(MVTR)を有する。しかし、従来の医薬接着剤でコー トする際は、接着剤が透湿性を阻害するために、MVTRが500〜1000 g-m-2-d-1に 低下する。MVTRは、組織の浸軟、チャンネリング及び漏出を可能にし、感染を強
化するものであるべきではない。
【００２３】 別の可能性ある親水性膜は、「ミトラフレクス(MITRAFLEX, PolyMedica Indus
tries, Inc.; Golden CO)」の外層フィルムである。これは、柔軟で透明なポリ ウレタン膜で、蒸気を透過させるが、他の液体と微生物には透過しない[Reed,J.
Biomat. Appl. 6:26-31(1990)参照]。 培養された同種異型上皮細胞は、例えば細胞を膜から酵素的に剥がす必要なし
に創傷に逆に使用してもよい。これらの膜で培養されたケラチノサイトは、創傷
の治癒工程に関与するインテグリンを高度に発現することが分かっている。 また、ヒアルロン酸膜は、ケラチノサイトを培養するのに使用することができ
る。ヒアルロン酸は生体適合性を有し、かつ抗原性の低いことが分かっている[C
ortivoら、Biomaterials 12:727(1991)]。エチル又はベンジル結合を有するヒア
ルロン酸の部分的ないし完全なエステル化は、生体適合性が高く、半減期が中程
度ないし長期の物質を生じる。例えば、レーザースキン(LASERSKIN, Fidia Adva
nced Biocopolymers, Abano Terme, Italy)は、本発明の培養された同種異型ケ ラチノサイトの担持システムとして機能することができる。この200μm厚の膜は
直径が40〜60μmの微孔を有し、これにより蒸気を浸透させ、また細胞を移動さ せる。
【００２４】 本発明の別の例は、フィブロネクチンマットの使用である。Ejimaらは、ケラ チノサイト用のインビトロの支持体としてのフィブロネクチンマットの使用を報
告した[Ejimaら、Biomaterals 14:742(1993)]。さらに、フィブロネクチンは培 養ケラチノサイトの分化を阻害することが示された [Adamsら、Cell 63:425(199
0)]。フィブロネクチンマットで培養されたケラチノサイトは、インテグリンα5
β1のような創傷を治癒している上皮細胞のケラチノサイトにおけるインテグリ ンを強く発現し、αvβ5の発現を増すことが分かった [Prajapatiら、5th Annua
l Meeting of the European Tissue Repair Society, Padova, Italy, 1995年8 〜9月]。 同種異型細胞を培養する別の基質は、基体として生物分解性又は除去可能な足
場を有し、バイオブラン膜のような一時的なカバーと組み合わさった生体適合性
皮膚部位からなる皮膚構造物である。同種異型細胞は、皮膚構造物の面(aspect)
又は側面のいずれかに使用できるが、皮膚の面に使用することが好ましい。同種
異型細胞は、皮膚構造物に使用される別のタンパク質因子とともに又はそれなし
で培養することができる。
【００２５】 本発明の同種異型上皮細胞を培養する別の基質は、フィブリングルー又はコラ
ーゲンゲルである。培養された上皮細胞の成長を支持できるどのような膜又は基
質も、本発明に使用することができる。膜又は基質でいったん培養されれば、細
胞を酵素的に除く必要がないことが好ましい。 膜のような基質で細胞を培養する際は、細胞が膜上で成長している際に膜にし
わが寄ったり、膜が縮むのを避けるために、ある種のフレームワークに接着させ
ることによって膜をきちんと張るべきである。 同種異型細胞を培養するのに使用されるさらに別の基質は、ヒドロゲルである
。これはポリマー組成物で、好ましくは親水性ポリマー、天然又は合成のポリマ
ーが例えば光重合を介して架橋しているものから製造され、水分子を捕捉する三
次元格子の構造物を生じてゲルを形成する。ヒドロゲルを生じるのに有用なポリ
マーは、多糖類又は炭水化物、例えばアルギネート、ポリホスファジン(polypho
sphazine)、ポリエチレングリコール又はポリエチレンオキシドを包含する。好 ましくは、ここで用いられるヒドロゲルは、同種異型細胞の添加前に重合される
。この発明で用いるヒドロゲルの製造についての詳細は、その開示がここに参照
により全体に挿入される、1997年5月23日付け出願の米国出願第08/862, 740号に
記載されている。 創傷部位での移植用のケラチノサイトの培養に適した種々の基質の概念につい
ては、Rennekampfら、J.Surgical Research 62:288-295 (1996)参照のこと。
【００２６】 ４．２ 基質上での同種異型細胞の定着 同種異型上皮細胞は、当該分野で公知のいずれかの適当な手段、例えばDoyle,
A.、Griffiths,J.B.及びNewell, D.G. [“Cell & Tissue Culture: Laboratory
Procedures”Wiley出版(1995)]に包含される方法により本発明の膜及び基質上 で培養することができる。 例えば、限定するものではないが、ケラチノサイトとメラノサイトは、以下の
ようにして単離することができる。組織試料、例えば包皮は、全表面が抗生物質
に曝されやすいように細かく刻んでもよい。例えば、皮下組織は殺菌鋏を用いて
除き、Ca++、Mg++を有する約10mlのPBSを皿に加えて細胞片を洗い落とす。次い で、組織を濃抗生物質溶液で洗浄し、5分放置する。次に、組織を0.25％トリプ シン/EDTAに移し、殺菌したメス又は鋏を用いて約3mm幅のストリップ又は正方形
に縦に切断する。トリプシン中の切断組織を、2.5〜3時間、CO2 5％、湿度90％ 、37℃のCO2インキュベーターに入れる。組織片をトリプシン溶液から除き、曲 がった鉗子を用いて真皮から表皮を分離する。表皮は円錐形チューブに入れ、カ
ルシウム-マグネシウムのないPBS中の約0.15％トリプシンを、組織を単細胞懸濁
液に消化し、この処理を容易にするのに用いる。試料は、パスツールピペット中
とその外で繰り返し吸引する。試料が単細胞懸濁液であるような場合は、300xg で約10分遠心分離し、遠心チューブの底を穏やかに軽くたたいて、細胞ペレット
を再懸濁する。細胞に約1mlのケラチノサイト完全培養培地(KCCM)を加え、チュ ーブをおだやかに軽くたたいて、さらにペレットを懸濁する。次に、KCCM 5mlを
加え、溶液が均質になるまで、細胞懸濁液を数回ピペットで吸い上げ、吸い出す
。次に、細胞を培養器、例えばT150フラスコに移し、フラスコを細胞の分泌が均
一になるように回転さす。CO2 5％、湿度90％、37℃のCO2インキュベーターにフ
ラスコを入れ、細胞を有糸分裂で展開させる。
【００２７】 これらの同種異型上皮細胞を、次いで基質、例えばペトリ皿の膜に塗布し、例
えば37℃、CO2 5％、湿度90％で成長させる。いったん適当な段階、好ましくは 約25〜90％、より好ましくは約70〜80％の融合に達したら、細胞を凍結保存する
か又は移植用に用いる。培養した上皮細胞シートは、当該分野で公知の方法で凍
結保存することができる(例えば、参照により挿入されるTuboら、米国特許第5,1
45,770号に記載の方法を参照のこと) 。基質上の同種異型細胞は、次いで適当な
時間、一般には移植の直前に溶かされる。 この発明の別の例では、同種異型細胞は、基質上で培養する前に遺伝学的に設
計して、移植された同種異型細胞に対する患者の免疫応答を促進する因子を「ノ
ックアウト」発現させることができる。標的遺伝子の発現レベル又は標的遺伝子
の生成物活性レベルを低下さす負の調節技術は、以下に論じる。ここで用いられ
る「負の調節」は、調節処理なしでの標的遺伝子生成物のレベル及び/又は活性 に対する、標的遺伝子生成物のレベル及び/又は活性の低下を意味する。同種異 型細胞本来の遺伝子発現は、多くの技術を用いて減じるか又はノックアウトする
ことができる。例えば、標準的な相同組換え技術を用いて遺伝子を完全に不活化
する(一般に「ノックアウト」という)ことによって、発現を阻害することができ
る。通常は、タンパク質の重要領域をエンコードするエキソン(又はその領域に 対する5'エキソン)は、標的遺伝子から正常なmRNAの生産を妨げる正の選択マー カー(例えばネオ(neo))によって介在され、この結果、遺伝子を不活化させる。 また、遺伝子は、遺伝子の一部を欠失又は全遺伝子を欠失さすこよによって、不
活化される。ゲノムから離れている標的遺伝子に相同な2つの領域を有する構造 物を用いることによって、2つの領域が介在する配列を欠失させることができる
[Mombaertsら、1991, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 88:3084-3087]。
【００２８】 標的遺伝子の発現を阻害するアンチセンス及びリボザイム分子も本発明にした
がって用いて、標的遺伝子の活性レベルを減じることができる。例えば、主要な
組織不適合性遺伝子複合体(HLA)の発現を阻害するアンチセンスRNA分子は、免疫
応答に対して最も用途の広いことが示されている。さらに、適当なリボザイム分
子は、例えばHaseloffら、1988, Nature 334:585-591；Zaugら、1984, Science
224:574-578；Zaug及びCech、1986, Science 231:470-475 によって記載されて いるようにデザインすることができる。さらに、三重らせん分子は、標的遺伝子
活性レベルを減じるのに利用することができる。これらの技術は、L.D.Davisら 編集、Basic Methods in Molecular Biology、第2版、Appleton & Lange, Norwa
lk, Conn. 1994により詳細に記載されている。 前述の技術のいずれかを用いることによって、MHC II群分子の発現は、キメラ
移植体の拒絶の危険性を減じるために、この発明の同種異型細胞で変えることが
できる。 例えば、移植された同種異型細胞の組織不適合性は、望ましくないMHC抗原が ノックアウトされた後に、1以上のレシピエント-適合性HLA抗原をエンコードす る1以上の遺伝子が移植前に同種異型細胞にトランスフェクトされる場合に、増 強又は改善することができる。したがって、公知の遺伝子工学的技術を介して、
同種異型細胞の抗原性を変えて、レシピエント患者の有する細胞の組織適合性を
改善することができる。
【００２９】 ４．３ 自己上皮細胞の採集 自己上皮細胞は、好ましくは移植直前に以下の方法により単離する。自己のド
ナー由来の健康な組織は、70％エタノール、冷プロビオジン(proviodine)、次い
で70％エタノールで洗浄する。洗浄した組織を解剖し、皮膚層から表皮層を除く
。次に、表皮層を冷リン酸緩衝食塩水に洗浄し、2.5mg/mlディスパーゼを有する
0.25％トリプシン-EDTA溶液に懸濁し、室温で10分機械的に粉砕さす。上皮細胞 のペレットは、適当な濃度でPBSに再懸濁する。次に、自己細胞を、上述の基質 表面上で培養した同種異型細胞に加えるか、又は創傷部位に直接移植し、次いで
、細胞をここに記載するように創傷に向かわせて、創傷に反転させた同種異型細
胞-基質構造物でカバーする。
【００３０】 ４．４ 生きたキメラ皮膚移植片の移植 本発明の一つの例によれば、デルマグラフトのような培養された皮膚置換体は
、創傷床に入れる。デルマグラフトは凍結保存され、使用前に溶かしてもよい。
この場合、デルマグラフトは、NaCl溶液(例えば0.9％の通常の生理食塩水)で洗 浄する。創傷部位は、殺菌溶液、例えばヨウ素外科スクラブ(例えば0.75％滴定 可能なヨード)又は0.9％塩化ナトリウム溶液で洗い落とすか洗浄して、移植前に
洗浄/殺菌することが好ましい。創傷にデルマグラフトを置換した後(任意に部位
に縫合されていてもよい)、上記の生体適合性基質上で培養した同種異型細胞を 、上記のようにして自己のドナーから採集した自己上皮細胞とともに接種する。
自己細胞は、同種異型細胞-基質構造物表面に接着(つまり、細胞は、同種異型細
胞を含む構造物表面に接着)し、構造物は逆さにして、創傷部位に置かれる。つ まり、細胞は、創傷とデルマグラフトに対して面するようになる。次に、創傷部
位を保護ドレッシングでカバーするか、又は縫合で閉じて密閉してもよい。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 10933 Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉ ｎｅｓ Ｒｏａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃ Ａ 92037−1005 Ｕ．Ｓ．Ａ． (72)発明者 ピンニー，アール，エメット アメリカ合衆国、カリフォルニア 92126、 サン ディエゴ、パゴダ ウエイ 8744 (72)発明者 マンズブリッジ，ジョナサン，エヌ． アメリカ合衆国、カリフォルニア 92037、 ラ ジョーラ、カル カミル 1685 Ｆターム(参考） 4B065 AA93X BC43 BC46 BC50 CA44 4C081 AA12 AB19 CA171 DA02 4C087 AA01 BB48 BB64 MA63 ZA89

Claims (50)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 患者から自己上皮細胞を採集して、それらを、インビトロで
    培養された同種異型上皮細胞を含む生体適合性基質に接種することからなる方法
    によって製造される生きたキメラ皮膚置換体。
  2. 【請求項２】 同種異型細胞がケラチノサイト及び/又はメラノサイトから なる請求項１に記載の生きたキメラ皮膚置換体。
  3. 【請求項３】 同種異型細胞が融合している請求項１に記載の生きたキメラ
    皮膚置換体。
  4. 【請求項４】 同種異型細胞が約25〜90％融合している請求項１に記載の生
    きたキメラ皮膚置換体。
  5. 【請求項５】 同種異型細胞が遺伝学的に設計された細胞である請求項１に
    記載の生きたキメラ皮膚置換体。
  6. 【請求項６】 自己細胞が、ケラチノサイト及び/又はメラノサイトからな る請求項１に記載の生きたキメラ皮膚置換体。
  7. 【請求項７】 基質が生物分解性である請求項１に記載の生きたキメラ皮膚
    置換体。
  8. 【請求項８】 基質が、合成親水性ポリウレタン膜、ヒアルロン酸膜、フィ
    ブロネクチンマット、フィブリングルー、コラーゲンゲル又はヒドロゲルである
    請求項７に記載の生きたキメラ皮膚置換体。
  9. 【請求項９】 自己細胞が、約1x104/cm2の密度で接種される請求項１に記 載の生きたキメラ皮膚置換体。
  10. 【請求項１０】 同種異型細胞に対する自己細胞の割合が、1:5〜1:50の範 囲である請求項１に記載の生きたキメラ皮膚置換体。
  11. 【請求項１１】 インビトロで培養された同種異型細胞を含む生体適合性基
    質が凍結保存され、自己細胞での接種前に溶かされる請求項１に記載の生きたキ
    メラ皮膚置換体。
  12. 【請求項１２】 (a) 患者から自己上皮細胞を採集し；かつ (b) インビトロで培養した同種異型上皮細胞を含む生体適合性基質に自己細胞 を接種する ことからなる、キメラ皮膚置換体の製造方法。
  13. 【請求項１３】 (a) 患者から自己上皮細胞を採集し； (b) インビトロで培養した同種異型上皮細胞を含む生体適合性基質に自己細胞 を接種して、キメラ皮膚置換体を形成し；かつ (c) 細胞が創傷部位に面するように、キメラ皮膚置換体を逆さにすることによ って、生きたキメラ皮膚置換体を創傷部位に移植する ことからなる、創傷部位にキメラ皮膚置換体を移植する方法。
  14. 【請求項１４】 (a) 患者から自己上皮細胞を採集し； (b) 創傷部位に自己上皮細胞を接種し；かつ (c) 同種異型細胞が自己細胞に対して内部で面するように基質を逆さにするこ とによって、インビトロで培養された同種異型上皮細胞を含む生体適合性基質を
    創傷部位に移植する ことからなる、創傷部位にキメラ皮膚置換体を移植する方法。
  15. 【請求項１５】 同種異型細胞が、ケラチノサイト及び/又はメラノサイト からなる請求項１２、１３又は１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 同種異型細胞が融合している請求項１２、１３又は１４に
    記載の方法。
  17. 【請求項１７】 同種異型細胞が約25〜90％融合している請求項１２、１３
    又は１４に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 同種異型細胞が遺伝学的に設計された細胞である請求項１
    ２、１３又は１４に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 自己細胞が、ケラチノサイト及び/又はメラノサイトから なる請求項１２、１３又は１４に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 基質が生物分解性である請求項１２、１３又は１４に記載
    の方法。
  21. 【請求項２１】 基質が、合成親水性ポリウレタン膜、ヒアルロン酸膜、ヒ
    アルロン酸膜、フィブロネクチンマット、フィブリングルー、コラーゲンゲル又
    はヒドロゲルである請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 自己細胞が、約1x104/cm2の密度で接種される請求項１２ 、１３又は１４に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 同種異型細胞に対する自己細胞の割合が、1:5〜1:50の範 囲である請求項１２、１３又は１４に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 インビトロで培養された同種異型細胞を含む生体適合性基
    質が凍結保存され、自己細胞での接種前に溶かされる請求項１２、１３又は１４
    に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 採集した自己細胞が、培養された同種異型上皮細胞を含む
    生体適合性基質への移植の頃に接種される請求項１３に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 接種された自己細胞が、同種異型上皮細胞を含む生体適合
    性基質上でインビトロで移植前に培養される請求項１３に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 創傷部位が深いか又は全体に厚みのある創傷である請求項
    １３又は１４に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 キメラ皮膚置換体を移植する前に皮膚置換体を創傷部位に
    移植し、キメラ皮膚置換体の細胞が皮膚置換体に対して内部で面するようにキメ
    ラ皮膚置換体が挿入されることからなる請求項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 (a) 基体として生物分解性又は除去可能な足場を有する 生体適合性皮膚構造物からなる内部成分； (b) 上皮細胞からなる中央成分、及び (c) 基体として生物分解性又は除去可能な足場を有する皮膚部位からなり、該 部位が一時的なカバーと組合わさり、上皮細胞の該中央成分に中で面している皮
    膚構造物上でインビトロで培養された上皮細胞からなる外部成分 からなる、内部成分、中央成分及び外部成分を有する複合皮膚置換体。
  30. 【請求項３０】 内部成分の皮膚構造物が間葉幹細胞からなる請求項２９に
    記載の複合皮膚置換体。
  31. 【請求項３１】 外部成分の上皮細胞が、構造物の皮膚部位でインビトロで
    培養される請求項２９に記載の複合皮膚置換体。
  32. 【請求項３２】 外部成分の一時的なカバーが膜である請求項２９に記載の
    複合皮膚置換体。
  33. 【請求項３３】 膜がサイラスティック膜である請求項３２に記載の複合皮
    膚置換体。
  34. 【請求項３４】 外部成分の上皮細胞が、自己、同種異型又は自己細胞と同
    種異型細胞の組み合わせである請求項２９に記載の複合皮膚置換体。
  35. 【請求項３５】 外部成分が、自己、同種異型又は自己と同種異型のタンパ
    ク質の組み合わせを加えてさらに変えられる請求項３４に記載の複合皮膚置換体
    。
  36. 【請求項３６】 中央成分の上皮細胞が、シート、単細胞懸濁液、マイクロ
    スキンビット又は崩壊もしくは分散した皮膚の形態である請求項２９に記載の複
    合皮膚置換体。
  37. 【請求項３７】 中央成分の上皮細胞が、自己、同種異型又は自己細胞と同
    種異型細胞の組み合わせである請求項２９に記載の複合皮膚置換体。
  38. 【請求項３８】 上皮細胞が、ケラチノサイト及び/又はメラノサイトであ る請求項２９、３４又は３７に記載の複合皮膚置換体。
  39. 【請求項３９】 上皮細胞が、遺伝学的に設計されている請求項２９、３４
    又は３７に記載の複合皮膚置換体。
  40. 【請求項４０】 (a) 基体として生物分解性又は除去可能な足場を有する 生体適合性皮膚構造物からなる内部成分； (b) 上皮細胞からなる中央成分、及び (c) 基体として生物分解性又は除去可能な足場を有する皮膚部位からなり、該 部位が一時的なカバーと組合わさって、上皮細胞の該中央成分に中で面している
    皮膚構造物上でインビトロで培養された上皮細胞からなる外部成分 である内部成分、中央成分及び外部成分からなる複合皮膚置換体を創傷部位に移
    植し、 内部成分(a)が創傷部位の最も深い成分に直接接触し、かつ外部成分(c)が創傷部
    位の最も外側の部位に最も近くなるように、皮膚置換体を創傷部位に移植する方
    法。
  41. 【請求項４１】 (a) 基体として生物分解性又は除去可能な足場を有する 、内部が生体適合性の第一皮膚構造物を創傷部位に移植し； (b) 患者から自己上皮細胞を採集し； (c) 創傷部位の内部皮膚構造物の上部に自己上皮細胞を接種し；かつ (d) インビトロで培養された上皮細胞を有し、基体として生物分解性又は除去 可能な足場を有する皮膚部位(一時的なカバーと組合わさっている)からなる外部
    の第二皮膚構造物を、自己細胞の上部に移植し、外部皮膚構造物の上皮細胞が創
    傷部位に面するようにさせる ことからなる、創傷部位でインビボで複合皮膚置換体を製造する方法。
  42. 【請求項４２】 (a) 基体として生物分解性又は除去可能な足場を有する 第一生体適合性皮膚構造物に上皮細胞を接種し；かつ (b) 培養された上皮細胞を有し、基体として生物分解性又は除去可能な足場を 有する皮膚部位(一時的なカバーと組合わさっている)からなる第二皮膚構造物を
    第一皮膚構造物に置き、第二皮膚構造物の細胞が第一皮膚構造物の細胞に面する
    ようにさせる ことからなる、インビトロで複合皮膚置換体を製造する方法。
  43. 【請求項４３】 外部皮膚構造物の上皮細胞が自己、同種異型又は自己細胞
    と同種異型細胞の組み合わせである請求項４１に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 第一皮膚構造物の上皮細胞が自己、同種異型又は自己細胞
    と同種異型細胞の組み合わせである請求項４２に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 第二皮膚構造物の上皮細胞が自己、同種異型又は自己細胞
    と同種異型細胞の組み合わせである請求項４２に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 上皮細胞が、ケラチノサイト及び/又はメラノサイトであ る請求項４０、４１又は４２に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 上皮細胞が、遺伝学的に設計されている請求項４０、４１
    又は４２に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 第二皮膚構造物の上皮細胞が、構造物の皮膚部位でインビ
    トロで培養される請求項４１又は４２に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 一時的なカバーが膜である請求項４０、４１又は４２に記
    載の方法。
  50. 【請求項５０】 膜がサイラスティック膜である請求項４９に記載の方法。
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