JP5219030B2

JP5219030B2 - 刺激応答性分解ゲル

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Inventors: 満明石; 芳樹澤; 典弥松崎
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Filing date: 2006-11-24
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Description

本発明は、ハイドロゲルに関する。より詳しくは、還元刺激応答性分解ゲルに関する。

現在の外科医療では移植医療や再建外科医療が中心であるが、慢性的なドナー不足という社会的問題を抱えており、また患者への負担が大きく、再手術を余儀なくされるため、第三の医療として再生医療が注目され、その実現が求められている。

皮膚や骨、軟骨などその構造が比較的単純な組織では、患者の組織幹細胞と生分解性の足場材料を組み合わせた培養法が有効であり、一部は臨床試験の段階まで進んでいる。しかし、肝臓や腎臓、膵臓など多種類の細胞と細胞外マトリックスから構築され、血管による栄養供給が必要とされる複雑な生体組織に関しては、未だ基礎研究の段階である。複雑な生体組織に関する研究が難航している理由の一つとして、細胞の三次元組織化の問題があげられる。

細胞の組織化は、再生医療分野において活発に研究されている領域の一つである。組織化に関する研究は、感熱応答性高分子グラフト培養皿を用いた二次元細胞シートに関する研究と、多種類の細胞の積層化に関する研究に大別することができる。国内では東京女子医大の岡野らのグループが、感熱応答高分子のマイクロパターン化グラフト表面を用いた血管内皮細胞と肝実質細胞の共培養を研究しており、二次元の共培養細胞シートが調製できることを報告している（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。国外では、ボストン大学のDesaiらのグループがＰＤＭＳスタンプを用いたパターニング表面上に三種類の細胞を積層させた三次元的な細胞の組織化を報告している（非特許文献４）。

しかしながら、細胞シート法では三次元の組織化は達成できず、またDesaiらのような細胞のみの積層化の場合、細胞が移動することで結果的にランダムに混在化し、組織化を制御するまでには至っていない。また、近年、回転培養器を用いた細胞の３次元培養が行われているが、細胞増殖による細胞密度の上昇に伴い栄養供給が困難となり、内部細胞が死滅することが問題とされている。このように、細胞の三次元組織化に関する研究は未だ基礎研究レベルを脱却しきれていないのみならず、三次元組織化に必要とされる基礎的な知見すら得られていない状況にあり、早急な解決案が求められている。

一方、ポリ乳酸やコラーゲンのハイドロゲル（足場材料）を用いた三次元培養・組織化に関する研究が十年来に渡り国内外で盛んに研究されている。これらのハイドロゲルは細胞接着性を有しているが、細胞培養後期には細胞が過密化し、またハイドロゲルのミリからミクロンレベルの緻密な網目構造が内部への栄養供給を阻害するため内部細胞が死滅することが問題とされている。さらに、ポリ乳酸ハイドロゲルは生体内に埋植後も１年以上分解されずに残存し、炎症や腫瘍形成の原因となることが報告されている。これらの問題を解決するためには、足場材料の分解性を制御する必要がある。

しかしながら、これまで、三次元細胞培養用足場材料の分解を自在に制御し、細胞組織体の構築と安全な回収を行った研究は報告例がない。
Y. Tsuda et al.，J. Biomed. Mater. Res. 69A, 70-78 (2004) Y. Tsuda et al.，Biomaterials 26，1885-93 (2005) A. Maya et al.，Biomaterials 23，1121-1130 (2002) W. Tan. et al.，Biomaterials 25，1355 (2004)

本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、三次元細胞培養用足場材料の分解を自在に制御でき、細胞と細胞が産出した細胞外マトリックスのみから形成される完全に生体由来の三次元細胞組織体を構築でき、またその構築された細胞組織体を安全に回収することを可能とする、新規な還元刺激応答性分解ゲルを提供することを目的とする。

すなわち、本発明は水溶性ポリマーを、分子鎖中にジスルフィド結合を有する化合物で架橋してなる刺激応答性ハイドロゲルを提供するものである。

本発明は刺激応答性を有する新規なハイドロゲルを提供した。

ポリ（γ−グルタミン酸）−シスタミンハイドロゲルのＦＴ−ＩＲスペクトルスペクトル。ポリ（γ−グルタミン酸）−シスタミンハイドロゲルおよび該ゲルの分解物のＦＴ−ＩＲスペクトルスペクトル。ポリ（γ−グルタミン酸）−シスタミンハイドロゲルおよび該ゲルの分解物の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルスペクトル。アルギン酸−シスタミンハイドロゲル凍結乾燥体の走査型電子顕微鏡写真。 ε-ポリリシンジチオビスプロピオン酸ゲルの凍結乾燥体の走査型電子顕微鏡写真。ポリ（γ−グルタミン酸）−シスタミンハイドロゲル凍結乾燥体の走査型電子顕微鏡写真（細胞培養前）。ポリ（γ−グルタミン酸）−シスタミンハイドロゲルの走査型電子顕微鏡写真（細胞培養後）。細胞培養で得られた３次元細胞組織体の走査型電子顕微鏡写真。蛍光ラベル化ポリ（γ−グルタミン酸）−シスタミンハイドロゲルの蛍光顕微鏡写真（細胞培養前）。蛍光ラベル化ポリ（γ−グルタミン酸）−シスタミンハイドロゲルの蛍光顕微鏡写真（細胞培養後）。蛍光ラベル化ポリ（γ−グルタミン酸）−シスタミンハイドロゲルの蛍光顕微鏡写真（細胞播種無しで培養後）。蛍光ラベル化ポリ（γ−グルタミン酸）−シスタミンハイドロゲルを分解し１回洗浄後の細胞組織体の蛍光顕微鏡写真。蛍光ラベル化ポリ（γ−グルタミン酸）−シスタミンハイドロゲルを分解し５回洗浄後の細胞組織体の蛍光顕微鏡写真。蛍光ラベル化ポリ（γ−グルタミン酸）−シスタミンハイドロゲルを分解し５回洗浄後の細胞組織体の位相差顕微鏡写真。

本発明に使用できる水溶性ポリマーとしては、ポリアミノ酸、糖、ポリエステル、ポリアミド、ポリエーテル、ビニル系ポリマー、およびその共重合体等の水溶性ポリマーである。「水溶性」が必要なのは、分解後に培地に溶解除去させるためである。水溶性である限り、分子量は特に限定されないが、分子量が低すぎると、細胞接着性と操作性に優れたハイドロゲルを調製できないため、好ましくない。

水溶性ポリアミノ酸の具体例としては、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−グルタミン酸）、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（リシン）、ポリ（アルギニン）、ポリ（グルタミン）、ポリ（セリン）、ポリ（トレオニン）、ポリ（チロシン）、およびその共重合体等、側鎖および末端に−ＮＨ_２、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ等の反応性官能基を有するものが挙げられる。

糖の具体例としては、グルコース、セルロース、アルギン酸、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、およびその共重合体等、側鎖および末端に−ＣＨ_２ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ_２等の反応性官能基を有するものが挙げられる。

水溶性ポリエステルとしては、ポリリンゴ酸、低分子量ポリ乳酸、低分子量ポリグリコール酸、低分子量ポリε−カプロラクトン、ポリβ−ヒドロキシ酪酸等、側鎖および末端に−ＮＨ_２、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ等の反応性官能基を有するものが挙げられる。

水溶性ポリアミドとしては、ポリマンナラアミド、ポリガラクタラミド等、側鎖および末端に−ＮＨ_２、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ等の反応性官能基を有するものが挙げられる。

水溶性ポリエーテルとしては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等、末端に−ＮＨ_２、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ等の反応性官能基を有するものが挙げられる。

水溶性ビニル系ポリマーとしては、ポリアクリル酸、ポリビニルアミン、ポリメタクリル酸、ポリアリルアミン等、側鎖に−ＮＨ_２、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ等の反応性官能基を有するものが挙げられる。

上記水溶性ポリマーとしては、分解後の無毒性等の細胞に対する安全性の観点から、ポリアミノ酸、糖、ポリリンゴ酸等自然由来の水溶性ポリマーが好ましい。特に有機溶媒を使用せずに容易にハイドロゲルを調製できる観点から、ポリアミノ酸、糖が選ばれ、ポリアミノ酸の中では、菌類から大量に回収することができる観点からポリ（ε−リシン）が選ばれ、菌類から大量に回収でき、かつ高分子量体であるため材料化に有利である観点からポリ（γ−グルタミン酸）が選ばれる。糖の中では、エビやカニなどの甲羅に含まれているキチンを化学的処理をすることで大量に回収できる観点からキトサンが選ばれ、海草に大量に含まれているため大量に回収できる観点からアルギン酸が選ばれる。

本発明で使用する「分子鎖中にジスルフィド結合を有する化合物」（以下、単に「架橋剤」という）としては、シスタミン、シスチン、２−ヒドロキシエチルジスルフィド、３，３’−ジチオジプロピオン酸（ＤＴＤＰ）、グルタチオンジスルフィド、３，３’−ジチオプロピオヒドラジド、およびその誘導体等が挙げられる。それらの架橋剤は、末端反応性官能基、天然由来の観点から選択すればよく、例えば、末端に−ＮＨ_２を有し、その物および分解物も天然由来物であるという観点から、シスタミンが好ましく使用される。

水溶性ポリマーを、架橋剤で架橋するには、水溶性ポリマーの有する反応性官能基と、架橋剤の有する反応性官能基とを反応させることにより行う。例えば、ポリ（γ−グルタミン酸）のシスタミンによる架橋は、下記反応により水溶液中でポリ（γ−グルタミン酸）側鎖の−ＣＯＯＨ基と、シスタミンの末端−ＮＨ_２とを縮合させ、アミド結合を形成することにより行う。架橋の結果、ハイドロゲルが得られる。

上記反応の際には、縮合剤、例えば１−エチル３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド（水溶性カルボジイミド：ＷＳＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等をシスタミンに対して等モル〜１０倍モル程度使用してもよい。

反応温度は、水溶性カルボジイミドの副生成物を抑制する観点から、４〜２５℃、好ましくは４℃、反応圧力は常圧下でおこなうようにすればよい。

反応条件の中で重要な条件は、水溶性ポリマーの濃度、官能基のモル比である。理由は、細胞接着性と操作性に適したハイドロゲルを調製する必要があるためである。例えば、上記化１の架橋反応を行う場合は、ポリ（γ−グルタミン酸）の濃度は４〜９重量％、好ましくは５〜７重量％となるようにする。その濃度が高すぎると強固なハイドロゲルとなり操作性に乏しく、低すぎると形状を保つハイドロゲルが調製できないという問題がある。

官能基のモル比は、架橋剤の有する官能基の当量が、水溶性ポリマーの有する官能基半当量以上となるような割合を採用するようにする。そのモル比が小さすぎると、形状を保つハイドロゲルが調製できないという問題がある。

反応の終了は、反応容器を傾け、溶媒である水が流れないことを目安にして行うようにすればよい。

反応生成物は水で洗浄し、水中にそのまま保存してよいし、凍結乾燥等の手段で乾燥してもよい。好ましくは水中に保存しておく。

本発明のハイドロゲルといえるためには、酸性ｐＨや還元剤に応答して分解する特性を有する必要がある。

以上のようにして得られるハイドロゲルは、還元刺激応答性を有している。「還元刺激応答性」とは、「還元雰囲気下もしくは還元剤に応答して分解し、かつ分解を制御できる」ということを意味している。本発明のハイドロゲルは、還元剤の存在有無、濃度等により、分解速度を数分〜日単位で制御可能である。還元剤により架橋剤中に存在する−Ｓ−Ｓ−結合が切断され、チオール基に分解される。

還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）、β−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン、ジチオエリスリトール、システイン(Ｃｙｓ)等が使用できる。グルタチオン（ＧＳＨ）、ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）、システイン(Ｃｙｓ)など生体内に存在する還元物質を用いることで、ハイドロゲル内で増殖した細胞にダメージを与えることなくハイドロゲルのみを分解させることが可能となる。細胞への安全性の観点からは、ＧＳＨ、ＤＨＬＡ，Ｃｙｓを使用することが好ましい。

分解の速度は、ハイドロゲルの種類、還元剤の種類、その濃度、分解温度、圧力等に適宜調節可能である。例えば、下記実施例で示しているように、ポリ（γ−グルタミン酸）−シスタミンハイドロゲルは、数分から日単位でその分解性を制御可能である。

本発明の刺激応答性ポリ（γ−グルタミン酸）−シスタミンハイドロゲルは、細胞培養培地として適しており、ヒト細胞を含む種々の細胞が十分に増殖した後、分解除去することができ、細胞と細胞が産生したコラーゲンなどの細胞外マトリックス成分のみから構成された完全に生体由来の三次元の細胞組織体を回収することができる。また、ハイドロゲルの形状を変えることで目的に応じたサイズ・形状の細胞組織体を得ることができる。還元反応による分解物はポリペプチドであるため細胞毒性がなく、生体吸収性であり極めて安全である。なお、細胞培養培地には、通常使用される細胞増殖に必要な成分、例えば、ウシ胎仔血清等を含有させることはいうまでもない。

上記においては、主にポリ（γ−グルタミン酸）−シスタミンハイドロゲルを例に挙げ説明したが、上記記載および下記実施例を参考にすれば、当業者であればさほど困難を伴わずに、他のハイドロゲルも同様に形成することができ、その分解性も制御できることを見いだせるはずである。

他の応用としては、薬物および遺伝子徐放担体、骨再生材料、歯科材料、隔離膜材料、生体内での組織・臓器誘導のための足場材料等がある。

調製例１〜５
＜ポリ（γ−グルタミン酸）−シスタミンハイドロゲルの調製＞

６４５ｍｇ（５ｕｎｉｔｍｍｏｌ）のポリ（γ−グルタミン酸）（γ−ＰＧＡ）を１０ｍＬの０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に下記表１に示した濃度（ｗｔ％）で溶解し、７７６ｍｇ（５ｍｍｏｌ）の水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ：縮合剤）を加えて４℃で１５分間攪拌した。架橋剤として５６３ｍｇ（２．５ｍｍｏｌ）のシスタミンを添加して数分間攪拌した後、得られた溶液を厚さ１ｍｍのシリコンゴムを挟んだガラス板に流し込み、室温で３時間反応させた。反応終了後、得られたハイドロゲルを超純水で４時間洗浄し、直径１ｃｍのディスク状に打ち抜き、それぞれの評価を行った。評価は、後述する。

上記調製例３で得られたハイドロゲルのＦＴ−ＩＲ（フーリエ変換赤外吸収）スペクトルを図１に示す。
ポリ（γ−グルタミン酸）のカルボキシル基のカルボニルに起因するピーク（vC=O）がシスタミンとの架橋後に小さくなっており、さらにアミドIIのピークの形状が変化していることから、ポリ（γ−グルタミン酸）のカルボキシル基がアミド基へ変化した、つまり、ポリ（γ−グルタミン酸）がシスタミンで架橋されていることがわかる。

調製例６〜９
シスタミンの濃度を１１２６ｍｇ（５．０ｍｍｏｌ）とし、γ−ＰＧＡを表１に示した濃度で溶解した以外、調製例１と同様に行い、ディスク状のハイドロゲルを作製し、同様に評価した。

調製例１０〜１４
＜ポリ（γ−グルタミン酸）−シスチンハイドロゲルの調製＞
６４５ｍｇ（５ｕｎｉｔｍｍｏｌ）のγ−ＰＧＡを１０ｍＬの０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に下記表２に示した濃度（ｗｔ％）で溶解し、７７６ｍｇ（５ｍｍｏｌ）の水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ：縮合剤）を加えて４℃で１５分間攪拌した。架橋剤として９２３ｍｇ（２．５ｍｍｏｌ）のシスタミンを添加して数分間攪拌した後、厚さ１ｍｍのシリコンゴムを挟んだガラス板に流し込み、室温で３時間反応させた。反応終了後、超純水で４時間洗浄し、直径１ｃｍのディスク状に打ち抜き、それぞれの評価を行った。

＜ハイドロゲルの分解試験＞
下記に、ポリ（γ−グルタミン酸）−シスタミンハイドロゲルの分解機構を示しておく。

調製例２、３、４、１２、１３で得られたそれぞれのゲルと凍結乾燥後のゲルを５０ｍＬの超純水（ｍｉｌｌｉＱ水、ミリポア社製）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、細胞培養培地（１０％のウシ胎児血清を含む）（イーグルＭＥＭ（ＥＭＥＭ）：日水製薬株式会社製）に浸漬し、分解までに必要な時間を測定した。分解に要した時間は、目視観察によりゲルが確認できなくなるまでに要した時間とした。

なお、上記分解試験は架橋密度が大きく影響する実験であるため、膨潤度が同程度であるサンプル（調製例７、８、９、１１、１４）および適当なゲルを形成しなかったサンプル（調製例１、５、６、１０）は本実験に用いなかった。

また、還元剤として２５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）または１．０ｍＭのグルタチオン（ＧＳＨ）を含む、超純水、ＰＢＳ、細胞培養培地にゲルを浸漬し、分解までに必要な時間を評価した。分解によるゲルの重量変化は、所定時間後にゲルを溶液から取り出し、キムワイプ（株式会社クレシア製）で余分な水分を除去した後に計測することで確認した。結果を下記表３に示す。

図２に、調製例３で得られたポリ（γ−グルタミン酸）−シスタミンハイドロゲルＦＴ−ＩＲスペクトル（上段）および該ゲルをＤＴＴにより上記の方法で分解した分解物のＦＴ−ＩＲスペクトル（下段）に示した。図３に、調製例３で得られたポリ（γ−グルタミン酸）−シスタミンハイドロゲルの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（上段）、および該ゲルをＤＴＴにより上記の方法で分解した分解物の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（下段）を示した。

図２のＦＴ−ＩＲにおいて、ポリ（γ−グルタミン酸）−シスタミンハイドロゲルでは検出されなかったチオール基のピークが、分解物では２５００ｃｍ^−１付近に検出された。ジスルフィド結合はＩＲスペクトルにおいて検出されないことが知られている。この結果より、ポリ（γ−グルタミン酸）−シスタミンハイドロゲルのジスルフィド結合がＤＴＴでチオール基に分解されたことがわかる。

図３の^１Ｈ−ＮＭＲにおいて、ポリ（γ−グルタミン酸）−シスタミンハイドロゲル分解物では２．８ｐｐｍにチオール基に起因するピークが検出された。この結果より、ポリ（γ−グルタミン酸）−シスタミンハイドロゲルのジスルフィド結合がＤＴＴでチオール基に分解されたことがわかる。

表３に示されているように、本発明のハイドロゲルは、ＤＴＴまたはＧＳＨ等の還元剤の存在有無、濃度等により、分解速度を数分〜日単位で制御可能である。ＤＴＴまたはＧＳＨ等の還元剤を存在させた場合、分解速度がはやい。ＥＭＥＭ培地中にはＧＳＨが極微量存在するので、分解が緩やかに起こっている。超純水（ミリＱ（ｍｉｌｌｉＱ）水）中では全く分解が起こっていない。

＜アルギン酸−シスタミンハイドロゲルの調製＞
４５２ｍｇ（１ｕｎｉｔｍｍｏｌ）のアルギン酸（Ａｌｇ）を８．５９ｍＬの０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に５ｗｔ％の濃度で溶解し、３１０ｍｇ（２ｍｍｏｌ）の水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ：縮合剤）を加えて室温で１５分間攪拌した。架橋剤として２２５ｍｇ（１ｍｍｏｌ）のシスタミンを添加して数分間攪拌した後、得られた溶液を厚さ２ｍｍのシリコンゴムを挟んだガラス板に流し込み、室温で２４時間反応させた。反応終了後、得られたハイドロゲルを超純水で４８時間洗浄し、直径１ｃｍのディスク状に打ち抜いた。

得られたアルギン酸−シスタミンハイドロゲルの凍結乾燥体の走査型電子顕微鏡写真を図４に示す。

上記調製法で得られたゲルと凍結乾燥後のゲルを還元剤として２５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む５０ｍＬの超純水に浸漬し、分解の過程を観察した。分解に要した時間は６０分であった。分解に要した時間は、目視観察によりゲルが確認できなくなるまでに要した時間とした。

＜キトサン−ジチオビスプロピオン酸ゲルの調製＞

９５ｍｇ（０．５ｕｎｉｔｍｍｏｌ）のキトサンを６１ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ）の１−ヒドロキシ１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（キトサン溶解のために必要）を含む９．４ｍＬの超純水に０．５ｗｔ％の濃度で溶解した。２１０ｍｇ（１ｍｍｏｌ）のジチオビスプロピオン酸（ＤＴＤＰ）と３１０ｍｇ（２ｍｍｏｌ）のＷＳＣを含む６．３ｍＬの０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液とキトサン水溶液を混合して数分間攪拌した後、得られた溶液を厚さ２ｍｍのシリコンゴムを挟んだガラス板に流し込み、室温で２４時間反応させた。得られたハイドロゲルを超純水で４８時間洗浄し、直径１ｃｍのディスク状に打ち抜いた。

＜ε-ポリリシンジチオビスプロピオン酸ゲルの調製＞

１６４ｍｇ（１ｕｎｉｔｍｍｏｌ）のε−ポリリシン（ε−ＰＬ）を０．５７ｍＬの０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解した。１０５ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）のＤＴＤＰと１５５ｍｇ（１ｍｍｏｌ）のＷＳＣを含む２ｍＬの０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液とε−ＰＬ水溶液を混合して数分間攪拌した後、得られた溶液を厚さ２ｍｍのシリコンゴムを挟んだガラス板に流し込み、室温で３時間反応させた。得られたハイドロゲルを超純水で４８時間洗浄し、直径１ｃｍのディスク状に打ち抜いた。

得られたε-ポリリシンジチオビスプロピオン酸ゲルの凍結乾燥体の走査型電子顕微鏡写真を図５に示す。

＜ハイドロゲル上での細胞培養およびＧＳＨによるハイドロゲルの分解＞
＜細胞シートの存在＞
γ−ＰＧＡ濃度が６ｗｔ％で調製したシスタミン架橋ハイドロゲル（調製例３）を細胞培養培地（１０％のウシ胎仔血清含有）に３０分間浸漬し、ハイドロゲル中の水分を培地に置換した。その後、ゲルを２４ウェル（well）マルチプレートに設置し、１．０×１０^６個のマウスＬ９２９繊維芽細胞をハイドロゲル上に播種して２ｍＬの培地を加え、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター中で１週間細胞を培養した。その間に、２日に一度古い培地を捨て新しい培地に交換した。

１週間後、培地を除去し、１ｍＭのＧＳＨを含む培地にゲルを６時間浸漬することでハイドロゲルのみを分解した。ハイドロゲル上の細胞およびゲルの分解により回収した細胞シートについて、その細胞の様子を位相差顕微鏡により確認した。

さらに、得られた細胞シートをティッシュカルチャーポリスチレンディッシュ（ＴＣＰＳ）上で３日間培養したところ、細胞シートからＴＣＰＳへの細胞移動が確認された。これは、得られた細胞シートが生存していることを示している。

＜三次元細胞組織体の調製＞
６４５ｍｇ（５ｕｎｉｔｍｍｏｌ）のポリ（γ−グルタミン酸）（γ−ＰＧＡ）を１０ｍＬの０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に６ｗｔ％の濃度で溶解し、７７６ｍｇ（５ｍｍｏｌ）の水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ：縮合剤）を加えて４℃で１５分間攪拌した。架橋剤として５６３ｍｇ（２．５ｍｍｏｌ）のシスタミンを添加して数分間攪拌した後、得られた溶液を厚さ２ｍｍのシリコンゴムを挟んだガラス板に流し込み、室温で２４時間反応させた。反応終了後、得られたハイドロゲルを超純水で４８時間洗浄し、直径１ｃｍのディスク状に打ち抜き、３日間凍結乾燥した。得られたゲルの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察結果を図６（培養前）に示す。

凍結乾燥後のハイドロゲルを細胞培養培地（１０％のウシ胎仔血清含有）に３０分間浸漬した。その後ゲルを６ウェル（well）マルチプレートに設置し、１．０×１０^６個のマウスＬ９２９繊維芽細胞をハイドロゲル上に播種して５ｍＬの培地を加え、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター中で１０日間培養した。その間に、２日に一度古い培地を捨て新しい培地に交換した。

１０日間培養後のゲルのＳＥＭ観察を図７に示す。ＳＥＭ観察の結果より、ゲル内部の空孔に細胞が侵入していることが分かる。

１０日後、培地を除去し、５ｍＭのシステインを含む５０ｍＬの培地にゲルを１２時間浸漬することでハイドロゲルのみを分解した。
ゲルのみを分解させた後には、ゲルの大きさから転写された直径１ｃｍ，厚さ２ｍｍの組織体が得られた。分解により得られた細胞と細胞が産出した細胞外マトリックスから構成される組織体のＳＥＭ観察を図８に示した。

図８から細胞１個当たりの大きさは１０μｍ程度である。この１０μｍの細胞が直径１ｃｍ，厚さ２ｍｍの組織体を構成するためには、細胞が縦方向・横方向に緻密に存在する必要がある。単純に２ｍｍの厚さを形成するためには、２００個の細胞が縦に連なることが必要になる。ゲルの大きさから転写された直径１ｃｍ，厚さ２ｍｍの組織体を構成することは到底不可能であるので、細胞が細胞が産出したコラーゲン成分と緻密に三次元的に存在することがわかる。図８の電子顕微鏡の写真からも、細胞が横方向だけでなく縦方向にも連なっている。すなわち三次元的に細胞が集まった組織体が得られていることは明らかである。

＜蛍光ラベル化ハイドロゲルを用いた三次元細胞組織体形成後のハイドロゲル分解成分の残存評価＞
（蛍光ラベル化γ−ＰＧＡの合成）
２０ｍｇ（１５６ｕｎｉｔ μｍｏｌ）のポリ（γ−グルタミン酸）（γ−ＰＧＡ）を１０ｍＬの０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解し、１．０ｍｇ（６４４μｍｏｌ）の水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ：縮合剤）を加えて４℃で１５分間攪拌した。遮光後、蛍光試薬である１ｍｇ（１．５６μｍｏｌ）のAlexa Fluor 488 cadaverine, sodium asltを添加して４℃で１時間、室温で２４時間反応させた。反応終了後、遮光しながら３日間超純水で透析を行うことで精製し、３日間遮光下で凍結乾燥することで蛍光ラベル化γ−ＰＧＡを得た。

（蛍光ラベル化ゲル・細胞培養）
７ｍｇの蛍光ラベル化γ−ＰＧＡ（０．０５ｕｎｉｔ μｍｏｌ）と６３８ｍｇ（４．９５ｕｎｉｔ μｍｏｌ）のポリ（γ−グルタミン酸）（γ−ＰＧＡ）を１０ｍＬの０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に６ｗｔ％の濃度で溶解し、７７６ｍｇ（５ｍｍｏｌ）の水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ：縮合剤）を加えて遮光下４℃で１５分間攪拌した。架橋剤として５６３ｍｇ（２．５ｍｍｏｌ）のシスタミンを添加して数分間攪拌した後、得られた溶液を厚さ２ｍｍのシリコンゴムを挟んだガラス板に流し込み、室温・遮光下で２４時間反応させた。反応終了後、得られたハイドロゲルを超純水で４８時間洗浄し、直径１ｃｍのディスク状に打ち抜き、３日間凍結乾燥した。細胞培養前のゲルの蛍光顕微鏡観察写真が図９である。

蛍光ラベル化ゲルを細胞培養培地（１０％のウシ胎仔血清含有）に３０分間浸漬した。その後ゲルを６ウェル（well）マルチプレートに設置し、１．０×１０^６個のマウスＬ９２９繊維芽細胞をハイドロゲル上に播種して５ｍＬの培地を加え、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター中で２週間培養した。その間に、２日に一度古い培地を捨て新しい培地に交換した。２週間培養後のゲルの蛍光顕微鏡観察による写真が図１０である。また、比較として細胞を播種せずに同じ条件で２週間培地中でインキュベートしたゲルの蛍光顕微鏡観察による写真が図１１である。

（細胞培養蛍光ラベル化ゲルの分解）
２週間後、培地を除去し、５ｍＭのシステインを含む５０ｍＬの培地にゲルを１２時間浸漬することでハイドロゲルのみを分解した。１２時間後リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で一度洗浄した後の分解により得られた組織体の蛍光顕微鏡観察の写真を図１２に示した。若干蛍光が観察されることから、分解物の残存が確認された。その後、ＰＢＳにて５回洗浄した後の蛍光顕微鏡写真および同じ場所の位相差顕微鏡写真を図１３および図１４に示した。位相差顕微鏡で組織体が観察される場所で蛍光が観察されなかったことから、分解物が完全に除去されていることが確認された。

本発明の刺激応答性ハイドロゲルは、細胞と細胞が産出した細胞外マトリックスのみから形成される完全に生体由来の三次元細胞組織体を構築可能であり、また安全に回収することが可能となることから、再生医療産業の分野に利用可能である。
その他、環境に対しても安全であるため、保水剤など環境分野に利用可能である。

Claims

水溶性ポリ（γ−グルタミン酸）を、分子鎖中にジスルフィド結合を有する化合物で架橋してなる刺激応答性ハイドロゲルからなる三次元細胞組織化のための足場材料。
水溶性ポリ（γ−グルタミン酸）を、分子鎖中にジスルフィド結合を有する化合物で架橋してなる刺激応答性ハイドロゲルからなる細胞組織化のための足場材料で細胞を培養する工程、および
刺激応答性ハイドロゲルを生体内存在還元物質で分解し、培養細胞を該ハイドロゲルから分離する工程、
を経ること特徴とする三次元組織化細胞の製造方法。
生体内存在還元物質が、グルタチオン（ＧＳＨ）、ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）またはシステイン(Ｃｙｓ)である、請求項２に記載の三次元組織化細胞の製造方法。
分子鎖中にジスルフィド結合を有する化合物が、シスタミン、シスチンまたは３，３’−ジチオジプロピオン酸である、請求項１に記載の足場材料。
分子鎖中にジスルフィド結合を有する化合物が、シスタミンまたはシスチンである、請求項１に記載の足場材料。
分子鎖中にジスルフィド結合を有する化合物が、シスタミン、シスチンまたは３，３’−ジチオジプロピオン酸である、請求項２に記載の三次元組織化細胞の製造方法。
分子鎖中にジスルフィド結合を有する化合物が、シスタミンまたはシスチンである、請求項２に記載の三次元組織化細胞の製造方法。