TWI452138B - 用於細胞培養及片狀細胞層脫著之支撐物及片狀細胞層脫著之方法 - Google Patents
用於細胞培養及片狀細胞層脫著之支撐物及片狀細胞層脫著之方法 Download PDFInfo
- Publication number
- TWI452138B TWI452138B TW100119314A TW100119314A TWI452138B TW I452138 B TWI452138 B TW I452138B TW 100119314 A TW100119314 A TW 100119314A TW 100119314 A TW100119314 A TW 100119314A TW I452138 B TWI452138 B TW I452138B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- cells
- support
- substrate
- conjugate
- cell
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 28
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 110
- 239000010410 layer Substances 0.000 claims description 58
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 49
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 claims description 28
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 claims description 28
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 22
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 18
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 12
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 10
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims description 10
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 8
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 8
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 claims description 8
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 8
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 7
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 7
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 claims description 7
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 7
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 6
- 238000009832 plasma treatment Methods 0.000 claims description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 108700022290 poly(gamma-glutamic acid) Proteins 0.000 claims description 5
- 239000010453 quartz Substances 0.000 claims description 5
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 4
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000003795 desorption Methods 0.000 claims description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 4
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 claims description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 claims description 4
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 3
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 3
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 2
- GBHCABUWWQUMAJ-UHFFFAOYSA-N 2-hydrazinoethanol Chemical compound NNCCO GBHCABUWWQUMAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 claims description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Polymers OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 2
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical group SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 claims description 2
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 2
- OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N cystamine Chemical group CCSSCCN OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 claims description 2
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 2
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 2
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 claims description 2
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 claims description 2
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims 2
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N Formic acid Chemical compound OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 claims 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- -1 spacer Amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 6
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 5
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 5
- 229940058401 polytetrafluoroethylene Drugs 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 3
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 description 3
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000592 Artificial Cell Substances 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 2
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 208000031737 Tissue Adhesions Diseases 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000011557 critical solution Substances 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 2
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 2
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- GTJOHISYCKPIMT-UHFFFAOYSA-N 2-methylundecane Chemical compound CCCCCCCCCC(C)C GTJOHISYCKPIMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229920002845 Poly(methacrylic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001665 Poly-4-vinylphenol Polymers 0.000 description 1
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 238000004833 X-ray photoelectron spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229910052797 bismuth Inorganic materials 0.000 description 1
- JCXGWMGPZLAOME-UHFFFAOYSA-N bismuth atom Chemical compound [Bi] JCXGWMGPZLAOME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNSISZSEWVHGLH-UHFFFAOYSA-N butanamide Chemical compound CCCC(N)=O DNSISZSEWVHGLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940108928 copper Drugs 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 229940099500 cystamine Drugs 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000005660 hydrophilic surface Effects 0.000 description 1
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 239000005014 poly(hydroxyalkanoate) Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000903 polyhydroxyalkanoate Polymers 0.000 description 1
- 229920001195 polyisoprene Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920000098 polyolefin Polymers 0.000 description 1
- 229920006324 polyoxymethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011176 polyphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229920000208 temperature-responsive polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
本發明係關於一種用於細胞培養及片狀細胞層脫著之支撐物、該支撐物之製備方法及由培養容器脫著片狀細胞層之方法。特定而言，該支撐物包含一具有生物相容性及非生物降解性之聚合物基材，其表面共價連結至一接合物。
組織工程已成為治療受損或病變器官及組織(例如血管及膀胱)之一種關鍵治療手段。組織工程試圖於體外提供再生之組織結構，然其尚未能成功創造出可替代天然結構之厚實、高度血管化且多功能之組織。為了克服組織工程之問題，片狀細胞層工程旋而被提出。片狀細胞層工程可避免使用諸如生物可降解性之骨架或細胞懸浮液注射法等組織重建之限制，如此，體外建構之片狀細胞層可能使用於不同之臨床情況以再生組織(尤其是上皮組織)，例如人工皮膚或人工角膜等。
片狀細胞層可使用各種生物組織和器官的細胞製得，其可單獨作為移植之組織，亦可與由其他細胞組成之片狀薄層組合使用，且可單獨使用或於複數片狀細胞層中疊合使用。細胞通常可緊貼於親水表面，但無法牢貼於疏水表面。當細胞在例如培養皿等正常容器中培養時，能增生並形成單層片狀薄層。該等細胞於結構上藉由細胞間之接合蛋白相互連接，並藉由黏著蛋白與培養皿表面黏結。在此技術領域中，通常會使用蛋白水解酶來破壞黏著蛋白，使片狀細胞層自皿上脫著。然而，在脫離過程中若使用蛋白水解酶，不僅可能使細胞受損，亦可能分解培養過程中生成的細胞外基質。此外，由於大多數的蛋白水解酶源自動物性材料，將這種蛋白水解酶應用於再生醫學之片狀細胞層時，可能會有安全上之疑慮。因此，於培養階段結束時，仍希望能不使用生化或化學試劑，即可回收片狀細胞層結構中之單層細胞。
隨後，片狀細胞層於感溫性培養皿中發育。將感溫性聚合物共價接枝至培養皿上，可允許不同類型之細胞附著並於37℃下增生，且當溫度降至32℃以下時，由於該感溫性聚合物之天然特性以及其因溫度下降造成之細胞代謝變化，該細胞可自行脫落而無需使用酶。美國第6,956,077號專利即揭露一種高分子化合物、該高分子化合物的製備方法、包含該化合物之熱感高分子材料、使用包含該熱感高分子材料之材料的分離方法以及使用該材料分離化學物品、生物性聚合物(蛋白質、肽等)及生物樣品(細胞等)之方法，其中之高分子化合物會因為溫度變化導致該化合物本身極性的變化，進而產生拉伸和凝聚作用。Hironobu Takahashi等人示範了表面引發RAFT技術，其可實現用於收取片狀細胞層之新型溫感N-isopropylarylamide(PIPAAm)刷毛表面(「Controlled Chain Length and Graft Density of Thermoresponsive Polymer Brushes For Optimizing Cell Sheet Harvest」Biomacromolecules
,Vol. 11,No. 8,2010,pp. 1991-1999)。美國第2006/0240552 A1號專利公開案揭露一種眼前節相關的片狀細胞層或三維結構以及一種使用高或低臨界溶解溫度為0至80℃的溫感聚合物生產該眼前節相關片狀細胞層或三維結構之方法。美國第2008/0131476 A1號專利公開案揭露一種具有良好組織黏著度及撓性之培養片狀細胞層，其藉由在特定支撐物上培養細胞獲得，該支撐物之一表面塗有高或低臨界溶解溫度為0至80℃的溫感聚合物與表面蛋白或交聯抑制劑。
上述之先前技術文獻係將溫感聚合物接於培養皿表面，並藉由控制溫度以剝離經培養之細胞。然而該等聚合物之單體(如PIPAAm)可能殘留於培養皿中而產生毒性，且溫度控制過程並非易事。因此，仍有開發低毒性及可改良細胞附著及脫著之支撐物的需求，以及開發能簡單地將片狀細胞層自培養容器上脫著之方法的需要。
本發明提供一種用於培養細胞及片狀細胞層脫著之支撐物，其具有一生物可相容基材，其表面塗有一經由-C(=O)NH-之肽鍵連結之具有式-P-L-S-S-R-K-Q的接合物，其中L及R可為相同或不同且獨立表示含硫醇的胺基酸殘基，-S-S表示由氧化L及R之硫醇基團所形成之雙硫鍵，P及K可為相同或不同且獨立表示0至3個胺基酸殘基，及Q為一生物性聚合物。
本發明亦提供一種具有本發明支撐物之培養容器。
本發明進一步提供一種生產本發明之用於培養細胞及片狀細胞層脫著之支撐物的方法，其包含下列步驟：
(a)於一基材之表面產生一羧酸基團(-COOH)，及
(b)將一具有式-P-L-S-S-R-K-Q之接合物與該基材共價連接，其係藉由直接縮合該基材之該羧酸基團(-COOH)與該接合物之P之胺基，或於該基材上原位逐一合成該接合物之P、L、R、K及Q或預合成具有式-P-L-S-S-R-K-Q之接合物之一或多個片段，再將該等片段原位連結至該基材上，其中L及R可為相同或不同且獨立表示含硫醇胺基酸殘基，-S-S表示由氧化L及R之硫醇基團生成之雙硫鍵，P及K可為相同或不同，且獨立表示0至3個胺基酸殘基，及Q為一生物性聚合物。
藉此獲得一包含表面經由-C(=O)NH-之肽鍵共價連結至具有式-P-L-S-S-R-K-Q接合物之基材的支撐物。
本發明亦進一步提供一種自具有本發明支撐物的培養容器上使片狀細胞層脫著之方法，其包含下列步驟：(a)於一具有本發明支撐物的培養容器中培養細胞以形成片狀細胞層，及(b)添加還原劑以切斷本發明支撐物中之接合物的雙硫鍵，使片狀細胞層自該容器之該表面脫著。
本發明亦進一步提供一種片狀細胞層，其係藉由本發明之片狀細胞層之脫著方法獲得。
本發明係關於一種用於培養細胞及使片狀細胞層脫著之支撐物，其具有一基材，該基材之表面塗有一接合物，該接合物具有做為間隔物之含雙硫鍵胺基酸以及可增強細胞附著、遷移或分化之生物性聚合物。出乎意料之外地，將細胞植種於此支撐物之後，該細胞可生長形成一個或多個片狀細胞層，且可藉由添加還原劑切斷雙硫鍵，使該等片狀細胞層輕易地自該支撐物脫著。據此，本發明亦提供了一種簡易且無毒之片狀細胞層的脫著方法。
於本文中，「殘基」一詞係指一分子與其他一個或多個分子反應後剩餘之部分。例如，本發明之連接物中的胺基酸殘基通常對應到氨基酸的一部分，該部分至多到(但不包括)胺基酸上的反應基團與本發明連接物實體上的反應基團反應後產生的共價連結，於本文中，「連接物」一詞係指一分子(例如氨基酸分子)共價連結至一生物可相容材料或生物性聚合物所形成的實體。
於本文中，「細胞」或類似詞彙係指通常具有微小質量之小型原生質，其外部被半透膜限制，其可包括一個或多個細胞核和其他各種細胞器，能夠單獨運作或與其他類似的群體交互運作，以執行生命所有的基本功能，並形成能獨立運作之生命體最小結構單元。其包括合成細胞架構、細胞模型系統以及類似之人工細胞系統等。
於本文中，「附著(attach,attachment)」、「黏著(adhere,adhered,adherent)」或類似名詞通常係指藉由例如物理吸附、化學鍵結及類似程序或其結合，使例如一基團或一化合物靜止或固定於一表面上。
本發明之一目的係提供一種用於細胞培養及片狀細胞層脫著之支撐物，其包含一生物可相容之基材，該基材之表面塗有一經由-C(=O)NH-之肽鍵連結之具有式-P-L-S-S-R-K-Q的接合物，其中L及R可為相同或不同且獨立表示含硫醇的胺基酸殘基，-S-S表示由氧化L及R之硫醇基團生成之雙硫鍵，P及K可為相同或不同且獨立表示0至3個胺基酸殘基，及Q為一生物性聚合物。
根據本發明，任何適合的生物相容材料皆可做為本發明之基材。基材之實例包括(但不限於)玻璃、石英、石英玻璃及以下的聚合物片段或聚合物：聚對苯二甲酸乙二酯(PET)、聚乙烯、聚二氟乙烯(PVDF)、聚二甲基矽氧烷(PDMS)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚苯乙烯(TCPS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯、聚烯烴、乙烯醋酸乙烯、聚丙烯、聚碸、聚四氟乙烯、聚矽氧、聚(甲基)丙烯酸、聚醯胺、聚氯乙烯、聚乙烯苯酚、其共聚物及混合物。較佳地、該基材為透明的。更佳地、該基材為玻璃、石英、石英玻璃、聚對苯二甲酸乙二酯(PET)、聚乙烯、聚二氟乙烯(PVDF)、聚二甲基矽氧烷(PDMS)、聚四氟乙烯(PTFE)和聚苯乙烯(TCPS)。更佳地、該基材為透明的。更佳地、該支撐物為TCPS、PET、聚偏氟乙烯、玻璃、石英或石英玻璃。更佳地、該基材為透明之TCPS、PET、PVDF、玻璃、石英或石英玻璃。更佳地、該基材為透明的PVDF。
根據本發明，基材可為具有平滑或多孔質表面之薄膜或軟式微影蝕刻圖案化之薄膜。
根據本發明，具有式-P-L-S-S-R-K-Q之接合物經由-C(=O)NH-之肽鍵連接至該基材之表面，其中L與R可為相同或不同且獨立表示含硫醇的胺基酸殘基，-S-S表示由氧化L及R之硫醇基團生成之雙硫鍵，P及K可為相同或不同且獨立表示0至3個胺基酸殘基，及Q為一生物性聚合物。
根據本發明，L及R可為相同或不同且獨立表示含硫醇的胺基酸殘基。較佳地，該含硫醇的胺基酸殘基為半胱胺酸、胱胺或高半胱胺酸殘基。
根據本發明，-S-S表示由氧化L及R之硫醇基團生成之雙硫鍵。雙硫鍵通常藉由氧化-SH官能基團形成。
根據本發明，P及K可為相同或不同且獨立表示0至3個胺基酸殘基。較佳地，P及K為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、麩醯胺、酪胺酸、半胱胺酸、離胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、麩胺酸或天門冬胺酸。更佳地，P及K為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、白胺酸或異白胺酸。更佳地，P及K不存在。
根據本發明，Q為生物性聚合物，較佳為天然生物性聚合物。本發明之生物性聚合物可改進細胞附著、增生、遷移或分化。有下列七種主要類型之生物性聚合物：多核苷酸、聚醯胺、多醣、聚異戊二烯、聚磷酸鹽或聚羥基脂肪酸酯。較佳地該可降解生物性聚合物為聚離胺酸、γ-聚麩胺酸(γ-PGA)、膠原蛋白、聚葡萄胺糖、玻尿酸、明膠、聚乳酸(PLA)或聚乙交酯。
本發明之支撐物係用於細胞培養以及片狀細胞層之脫著。根據本發明，片狀細胞層可為單層或多層。利用標準細胞培養技術，可將各種細胞培養於本發明之支撐物上。一般來說，用於本發明之細胞包含黏著細胞類，此種細胞在適合的條件下培養時會分裂並延伸以覆蓋並黏著於細胞生長基材上。該等細胞種類可相對於提供該等細胞以衍生成組織結構的個體而言，異體或自體地最終移植或使用。該等細胞的實例包括角膜細胞、軟骨細胞、成骨細胞、成纖維細胞、表皮細胞、上皮細胞、脂肪細胞、肝細胞、胰腺細胞、肌肉細胞、及該等細胞之前驅細胞、間質幹細胞或胚胎幹細胞(ES細胞)。
另一方面，本發明提供一種培養容器，其具有本發明之用於細胞培養及片狀細胞層脫著之支撐物。
根據本發明，一培養容器可包括任何數目的材料及組合物，其中有許多現為商業上可獲得者，包括例如：培養罐(culture vessel)、培養瓶(vulture flask)、多孔質培養插入物(culture well insert)、具有生長區域約1 cm2
至大於500 cm2
之方形或圓形培養板、具有2孔至超過90孔之多孔質培養板，以及用於顯微鏡分析之標本玻片。其他細胞生長表面及裝置對於技藝人士來說為顯而易見的。
從不同類型的細胞生成的片狀細胞層係於培養容器中經數日到數週之期間生長。通常情況下，細胞片之生長視其應用、捐贈者年齡、特定細胞群的生存能力以及類似因素而定，需時約1至24週。
在多數細胞培養應用中，黏著細胞培養於細胞自基材剝落前只能維持數天到數週個星期的時間。在培養過程中，可用試劑促進細胞的生長、生存能力及/或黏著性。例如，可添加抗壞血酸、視黃酸及銅等試劑以增加外基質蛋白質之產量，從而生成更穩固的細胞片狀組織層。此外，使用外基質蛋白質或其他因子(例如明膠、纖維蛋白等蛋白質)處理細胞培養表面/基材，可延長其黏著。
另一方面，本發明進一步提供一種製造本發明之用於細胞培養及片狀細胞層脫著之支撐物的方法，其包含以下步驟：
(a)於一基材之表面產生一羧酸基團(-COOH)，及
(b)將一具有式-P-L-S-S-R-K-Q之接合物與該支撐物共價連接，其係藉由直接縮合該基材之該羧酸基團(-COOH)與該接合物中P之胺基，或於該基材上原位逐一合成該接合物之P、L、R、K及Q，或預合成具有式-P-L-S-S-R-K-Q之接合物之一或多個片段，再將該等片段原位連結至該基材上，其中L及R可為相同或不同且獨立表示含硫醇胺基酸殘基，-S-S表示由氧化L及R之硫醇基團生成之雙硫鍵，P及K可為相同或不同且獨立表示0至3個胺基酸殘基，及Q為一生物性聚合物，
藉此獲得一包含表面經由-C(=O)NH-之肽鍵共價連結至具有式-P-L-S-S-R-K-Q接合物之基材之支撐物。
在本發明之一實施例中，基材中之羧酸基團(-COOH)係藉由電漿處理產生於基材的表面上。較佳地，該電漿處理為CO2
或N2
電漿處理。
根據本發明，具有式-P-L-S-S-R-K-Q之接合物係藉由基材上之羧機(-COOH)與接合物-P-L-S-S-R-K-Q中P之胺基直接縮合而連結至基材。或者，接合物的P、L、R、K及Q可原位逐一合成於基材上以形成-P-L-S-S-R-K-Q之結構。或者，可預合成式-P-L-S-S-R-K-Q之片段，再於基材上原位連接該等片段。
在一實施例中，於步驟(a)後，所產生之基材上的羧基可進一步與碳二亞胺反應以接合(參Bauminger and Wilchek,Meth. Enzymol. 70:151-159(1980))。碳二亞胺包含通式為RN=C=NR'之化合物族群，其中R和R'可為脂肪族或芳香族，並可用於合成多肽鍵。其製備之過程簡單、相對快速且於溫和條件下進行。碳二亞胺化合物攻擊羧基團以將其轉變為游離胺基酸基團之反應性位址。較佳地，碳二亞胺為N-羥基丁二醯亞胺、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(EDC)、N,N-二環己碳二亞胺(DCC)或N,N-二異丙基碳二亞胺(DIC)或其混合物。更佳地，碳二亞胺為EDC。
其後，將具有雙硫鍵之胺基酸與所獲得之基材-碳二亞胺接合物反應，以形成基材-胺基酸殘基-S-S-胺基酸殘基之結構。隨後，經由碳二亞胺接合反應，將生物性聚合物與胺基酸殘基結合以形成基材-胺基酸殘基-S-S-胺基酸殘基-生物性聚合物之結構，其中胺基酸及生物性聚合物如前文所定義。
另一方面，本發明提供了一種使片狀細胞層自具有本發明支撐物之容器表面脫著的方法，其包括下列步驟：(a)於一具有本發明支撐物之培養容器中培養細胞以形成片狀細胞層，及(b)添加還原劑以切斷本發明支撐物之接合物的雙硫鍵，使片狀細胞層自該容器之該表面脫著。據此，本發亦提供一種片狀細胞層，其係由本發明之上述方法獲得。在本發明之一實施例中，片狀細胞層可為單層或多層。
根據本發明，可使用硫醇做為切斷材料中接合物之雙硫鍵的還原劑。較佳地，還原劑為麩胱甘肽、2-羥基-1-乙硫醇、半胱胺酸、高半胱胺酸、巰乙醇(ME)、二硫蘇糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)。
藉由使用本發明之支撐物與脫著方法，可獲得具有優異組織附著性及撓性之片狀細胞層。該等片狀細胞層能輕易且有效地自培養容器上脫著，所獲得之片狀細胞層可保持完整狀態，並可使用於各種人類自體組織移植產品。
除了薄膜形成能力外，高透明度亦為合適基材材料之較佳特性。然而，市售之PVDF產品通常為非透明之白色，類似Teflon薄膜。本發明提供一種透明之PVDF薄膜。
在嘗試多種溶劑後，PVDF可藉由溶解於N-甲基吡咯烷酮(NMP)中並將該溶液以各種厚度塗於玻璃上獲得。直接藉由塗佈及乾燥獲得之PVDF薄膜原為非透明白色薄膜，但令人驚訝的是，吾人發現進一步將塗佈完成後的非透明PVDF薄膜加熱，可使其轉為透明。此種透明外觀之PVDF薄膜符合本發明之實用需求。
將製備好之透明PVDF薄膜以CO2
及N2
電漿處理，再塗以由胱氨酸及γ-聚麩氨酸(γ-PGA)以羥基丁二醯亞胺與1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺之混合物交聯獲得之天然生物性聚合物。測量該經塗佈之PVDF薄膜之接觸角已判斷該塗層之特性。
經CO2
電漿處理之薄膜之測量結果顯示經塗佈之PVDF薄膜表面與γ-PGA以共價鍵之形式相結合，其接觸角由72.83°(未經處理之PVDF)下降至42.20°，故其親水性有明顯上升。經N2
電漿處理薄膜之測量結果亦顯示接觸角由70.98°(未經處理之PVDF)下降至30.26°，可知其親水性亦明顯上昇。
為了解由前述製備程序獲得之PVDF薄膜之表面是否符合需求，使用化學分析電子光譜儀(ESCA)測量其表面。圖1顯示PVDF之光譜，其中氟(F)於690 eV處之強度與碳(C)於400 eV處之強度相當，且氮(N)於400 eV處未出現峰值。相較之下，氮(N)之峰值出現在經塗佈之PVDF薄膜之頻譜中。下表顯示有關元素峰值。對於PVDF薄膜而言，其碳與氮之比例約為1:1；而對於經塗佈或經降解之PVDF薄膜而言，其γ-PGA中之氮(N)與半胱胺酸之硫亦符合預期。
以纖維母細胞株NIH3T3測定生物相容性及細胞脫著。由生物相容性測試可發現接枝PVDF薄膜具有高生物相容性並能增加細胞增生。播植24小時後，以以具還原性的半胱胺酸處理NIH3T3。處理3個小時後，細胞由紡錘狀回復至圓形而自薄膜脫離。將脫離之細胞收集後，重新播植到TCPS培養皿。發現細胞可重新貼附並增生。
圖1顯示PVDF之光譜，其中氟(F)於690eV之強度相當於碳(C)400eV之強度，且氮(N)於400eV無峰值。相對地，氮(N)之峰值出現於經塗佈之PVDF薄膜之光譜中。
(無元件符號說明)
Claims (20)
- 一種用於細胞培養及片狀細胞層脫著之支撐物，其包含一具羧基之生物可相容基材，該基材之表面原位接枝有一經由-C(=O)NH-之肽鍵連接之具有式-P-L-S-S-R-K-Q之接合物，其中L與R可為相同或不同且獨立表示含硫醇的胺基酸殘基，-S-S表示由氧化L及R之硫醇基團生成之雙硫鍵，P及K可為相同或不同且獨立表示0至3個胺基酸殘基，及Q為一生物性聚合物；其中P經由肽鍵連接至生物可相容基材，或如P為0個胺基酸殘基時，L連接至生物可相容基材且其中生物可相容基材是透明之TCPS、PET、PVDF、玻璃、石英或石英玻璃，及其中該接合物之Q為聚離胺酸、γ-聚麩胺酸(γ-PGA)、膠原蛋白、聚葡萄胺糖(Chitosan)、玻尿酸、明膠、聚乳酸(PLA)或聚乙交酯。
- 如請求項1之支撐物，其中該生物可相容之基材為透明之PVDF。
- 如請求項1之支撐物，其中該接合物之L及R可為相同或不同且獨立表示半胱胺酸、高半胱胺酸或胱胺殘基。
- 如請求項1之支撐物，其中該接合物之P及K可為相同或不同且獨立表示甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、麩醯胺、酪胺酸、半胱胺酸、離胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、麩胺酸或天門冬胺酸。
- 如請求項1之支撐物，其中該接合物之P及K為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、白胺酸 或異白胺酸。
- 如請求項1之支撐物，其中該接合物之P及K不存在。
- 如請求項1之支撐物，其中該片狀細胞層係源自角膜細胞、軟骨細胞、成骨細胞、成纖維細胞、表皮細胞、上皮細胞、脂肪細胞、肝細胞、胰腺細胞、肌肉細胞、及該等細胞之前驅細胞、間質幹細胞或胚胎幹細胞(ES細胞)。
- 如請求項1之支撐物，其中該片狀細胞層係源自角膜細胞、軟骨細胞、成骨細胞、成纖維細胞、表皮細胞、上皮細胞、脂肪細胞、肝細胞、胰腺細胞、肌肉細胞、及該等細胞之前驅細胞、間質幹細胞或胚胎幹細胞(ES細胞)。
- 如請求項1之支撐物，其中該基材可為具有平滑或多孔質表面之薄膜或軟式微影蝕刻圖案化之薄膜。
- 一種培養容器，其具有請求項1之支撐物。
- 如請求項17之培養容器，其為培養罐(culture vessel)、培養瓶(culture flask)、多孔質培養插入物(culture well insert)、培養板或多孔質培養板。
- 一種生產用於培養細胞及片狀細胞層脫著之支撐物的方法、其包含下列步驟：(a)於一基材之表面產生一羧酸基團(-COOH)，其中該基材為透明材料，及(b)將一具有式-P-L-S-S-R-K-Q之接合物與該支撐物共價連接，其係藉由原位直接縮合該基材之該羧酸基團(- COOH)與該接合物中P之胺基，或於該基材上原位逐一合成該接合物之P、L、R、K及Q，或預合成具有式-P-L-S-S-R-K-Q之接合物之一或多個片段，再將該等片段原位連結至該基材上，其中L及R可為相同或不同且獨立表示含硫醇胺基酸殘基，-S-S表示由氧化L及R之硫醇基團生成之雙硫鍵，P及K可為相同或不同且獨立表示0至3個胺基酸殘基，及Q為一生物性聚合物，藉此獲得一包含表面經由-C(=O)NH-之肽鍵共價連結至具有式-P-L-S-S-R-K-Q接合物之基材之支撐物。
- 如請求項12之方法，其中羧酸基團(-COOH)藉由電漿處理產生於一生物可相容及非生物降解性之聚合物基材表面上。
- 如請求項13之方法，其中該電漿處理為CO2 或N2 電漿處理。
- 一種自培養容器上脫著片狀細胞層之方法，其包含下列步驟：(a)於一具有請求項1之支撐物的培養容器中培養細胞以形成片狀細胞層，及(b)添加還原劑以切斷請求項1之支撐物中之接合物的雙硫鍵，使片狀細胞層自該容器之該表面脫著。
- 如請求項15之方法，其中該片狀細胞層為單層或多層。
- 如請求項15之方法，其中該還原劑為一種硫醇。
- 如請求項15之方法，其中該還原劑為麩胱甘肽、2-羥基-1-乙硫醇、半胱胺酸、高半胱胺酸、巰乙醇(ME)、二硫蘇糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)。
- 一種片狀細胞片，其係由請求項24之方法獲得。
- 如請求項19之片狀細胞片，其為單層或多層。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW100119314A TWI452138B (zh) | 2011-06-01 | 2011-06-01 | 用於細胞培養及片狀細胞層脫著之支撐物及片狀細胞層脫著之方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW100119314A TWI452138B (zh) | 2011-06-01 | 2011-06-01 | 用於細胞培養及片狀細胞層脫著之支撐物及片狀細胞層脫著之方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW201249994A TW201249994A (en) | 2012-12-16 |
| TWI452138B true TWI452138B (zh) | 2014-09-11 |
Family
ID=48139152
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW100119314A TWI452138B (zh) | 2011-06-01 | 2011-06-01 | 用於細胞培養及片狀細胞層脫著之支撐物及片狀細胞層脫著之方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| TW (1) | TWI452138B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI672374B (zh) * | 2018-07-27 | 2019-09-21 | 和椿科技股份有限公司 | 培養膜與培養皿 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040028657A1 (en) * | 2000-07-21 | 2004-02-12 | Teruo Okano | Cultured epidermal cell sheet, laminated cultured skin sheet and process for producing the same |
| US20070092492A1 (en) * | 2003-08-01 | 2007-04-26 | Hikaru Matsuda | Three-dimentional tissue structure |
| US20090117656A1 (en) * | 2005-11-24 | 2009-05-07 | Mitsuru Akashi | Stimuli-responsive degradable gel |
-
2011
- 2011-06-01 TW TW100119314A patent/TWI452138B/zh not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040028657A1 (en) * | 2000-07-21 | 2004-02-12 | Teruo Okano | Cultured epidermal cell sheet, laminated cultured skin sheet and process for producing the same |
| US20070092492A1 (en) * | 2003-08-01 | 2007-04-26 | Hikaru Matsuda | Three-dimentional tissue structure |
| US20090117656A1 (en) * | 2005-11-24 | 2009-05-07 | Mitsuru Akashi | Stimuli-responsive degradable gel |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI672374B (zh) * | 2018-07-27 | 2019-09-21 | 和椿科技股份有限公司 | 培養膜與培養皿 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW201249994A (en) | 2012-12-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10550366B2 (en) | Thermoresponsive cell culture supports | |
| JP5080848B2 (ja) | 細胞培養支持体とその製造方法 | |
| Tang et al. | Recent development of temperature-responsive surfaces and their application for cell sheet engineering | |
| JP4111446B2 (ja) | 動物の培養細胞のスフェロイドを含む培養細胞構築物およびその使用 | |
| Kumashiro et al. | Cell attachment–detachment control on temperature-responsive thin surfaces for novel tissue engineering | |
| Higuchi et al. | External stimulus-responsive biomaterials designed for the culture and differentiation of ES, iPS, and adult stem cells | |
| Liu et al. | Poly (N-isopropylacrylamide)-based thermo-responsive surfaces with controllable cell adhesion | |
| JPS6339583A (ja) | 細胞・組織の基体への付着方法 | |
| De Bartolo et al. | Novel membranes and surface modification able to activate specific cellular responses | |
| US9546349B2 (en) | Supports for cell culture and cell sheet detachment and methods for cell sheet detachment | |
| Rusen et al. | Temperature responsive functional polymeric thin films obtained by matrix assisted pulsed laser evaporation for cells attachment–detachment study | |
| Utrata-Wesołek et al. | Thermoresponsive polymer surfaces and their application in tissue engineering | |
| JP2007020444A (ja) | 細胞培養器具及びその製造方法 | |
| Akiyama et al. | Temperature-responsive polymers for cell culture and tissue engineering applications | |
| JP4161106B2 (ja) | 細胞剥離剤及び細胞シート剥離方法 | |
| JPH03501978A (ja) | 細胞の付着および増殖のための材料 | |
| TWI452138B (zh) | 用於細胞培養及片狀細胞層脫著之支撐物及片狀細胞層脫著之方法 | |
| JP2008295382A (ja) | 培養方法及び培養装置 | |
| JP2014518636A (ja) | 温度感受性の生物活性なバイオポリマーおよび細胞を回収する関連する方法 | |
| JP4989108B2 (ja) | 血管平滑筋細胞の培養方法、培養器材および培養によって得られる医療用材料 | |
| JP4545605B2 (ja) | 細胞培養材料 | |
| JP4336756B2 (ja) | 動物細胞の培養構築物 | |
| US9492842B2 (en) | Cell culture membrane, cell culture substrate, and method for manufacturing cell culture substrate | |
| Civantos et al. | Polymeric and Non‐Polymeric Platforms for Cell Sheet Detachment | |
| JP2006055157A (ja) | 細胞培養器具及びその製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees | ||
| MM4A | Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees |