JPS6339583A - 細胞・組織の基体への付着方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、細胞、［織及びその他の生物学的活性部の
種々の基体（５ｕｂｓｔｒａｔｅ）への接着を促進する
ためのバイオｍ温性ポリフェノール蛋白質の利用に係る
、細胞・組織の基体への付着方法に関する。

この発明において、′バイオ接着剤”とは試験管内又は
生体内で生きた組織、細胞及びその他の生物学的活性部
（ａｃｔＬｖｅ　＊ｏｉｅｔ、ｉｅｇ）の新陳代謝。

國細書の予力（内容に変更な− 成長又は機能と適合する接石剤を意味する。バイオ接Ｌ
”性ポリフェノール蛋白質は次のような交差結合の反復
デカペプチドの１１１列に基づく。

＾ｕ　　　　　ＬＹＳ　　　　ＰｒｏハイＹＰ　ＳＯ’
ｌ／ＴＨＲＴＷＩ／Ｄｏ日−２日（ＱＨＹＩンＰりｃｙ
ｍ　　５ＥＲ７ＴＨＲ丁Ｙ日VＤＯＰ＾　　　ＬＹＳ これは、“バイ第４庭石性ポリフェノール蛋白質から生
成されたデカペプチド”と称する米国特許第４，５８５
，５８５号に記載されている８反復デカペプチドから生
成したバイオ接看剤はそれらか蛋白質ＤＮＡ、ホルモン
及び抗生物質等の細胞及びその他の生物学的な活性部分
を〕５体（又は基１に付着てきるようにしたか故に理想
的なものである。

試験管内ての適用は研究用の診断、ａ胞生成物の生成及
び細胞の新陳代謝の研究を含むものである。生体内の過
用では人工臓器、特に心１藏血管の人工臓器の表面」二
の融合性細胞単層の製造を含むものである。

［従来の技術］ Ｍｌｌ織方により生体内て保持され増殖するＭｌ織から
の細胞の取得は、医学と生化学研究においては重要な課
題のひとつである０組織の培養は、形成された滋Ａ環境
における有機体（植物メは動物）に起源をもつＡＩＩａ
又は細胞の新陳代謝を増殖及び／又は支援する技術であ
る。おたやかな組織分離によって一度び遊離されると、
細胞は生命機能を支えることかできる滋養媒体内に培養
される。わずかな例外を除けば、細胞は正常な新陳化１
の機能、成長及び分配を行うための底質（ｓｕｂ−ｓＬ
ｒａｔｕｍ）への付着を必要とする。Ｍ１織において、
細胞成長のためのマトリックス（ｍａｔ、ｒｉｘ）を提
供するこの底質は、コラーゲンと、ラミニンとファイブ
ロネクチンから成る。生体内において、この底質はほと
んどプラスチッつて出来ているか、グラス及び多孔セル
ローズフィルターも時々その代科物として使用される。

組織培養を介して生成された細胞利用の例は下記の通り
である。

（イ）細胞の新陳代議、細胞内の寄生動物の新陳代謝（
すなわち、ウィルス、バクテリア等）１種々の細胞タイ
プの相互作用新陳化１（すなわち、上皮細胞、ファイブ
ロブラスト。

免疫能力のある細胞、チモサイト、血小板竿）、外因性
に素の細胞の新陳代謝に対する影響及び細胞の遺伝的組
成（体内診Ｆｌｉ）に関する研究。

（ロ）特定配合物すなわち遺伝子、蛋白質又はその他の
細胞成分の製造。

（ハ）皮膚、角膜移植片、脳、導管移植片及び生体内受
精に関する細胞の再移植。

ここ数年、コラーゲン、ラミニン及びファイブロネクチ
ンか動物の組織から抽出されかつ純化され、そして細胞
接着の助触媒として細胞・Ｍ１織暗培養究名に販売され
てきた０合成ポリー〇−リジン及びポリーＬ−リジンも
またこのような目的のために販売されてきた。このため
の第一の理由は、プラスチック又はガラス等の基対か、
体内で生物学的に不活性で、かつ適りな細胞又は組織に
対し十分な付着をもたらしていない。貧弱なＵｉ若効率
を説明する特定の実施例は、第一の細胞遊離体と、低密
度で種を生じた細胞と、生反応器又は中空管培養組織等
の連続フロー組織で種を生じた細胞を含むものである。

加えて、多孔フィルターや導管移植片用にしたテフロン
材等の基体は、低表面エネルギーにより細胞接着は不可
能である。

接着助触媒は効果的に付着問題の解決に寄与したが、不
完全さは、なおｍ著である。まず第１に、その作用モー
ドは、生理的であるけれども、これらの要素は確かに接
着性はないという事実に基づく。すなわち、これらの要
素は細胞に対し物理的支持を提供するに過ぎない。

第２に、これらの要素は細胞培養用に従来使用した物質
（例えば、ボッスチレン、ニトロセルロース）以外の種
々の基体上に簡単に利用することかできないし各要素を
全ての種類の細胞に対し等しい効果で使用することもて
きない。

第３に、一度再構成されると、これらの要素の多くは、
−２０°Ｃて約４週間の保存期間をもつ。

第４に、ポリ−Ｄ−とポリーＬ−リジンの場合を除いて
、これらの要素は生物源から抽出されなければならない
。これらの要素を商業的に販売できる費用て合成するこ
とはできない。

第５に、認知ｉＪｆ能な潜在的な健康上の危険か細胞質
の接着助触媒て生じる、例えば人間の血液からのファイ
ブロネクチンの抽出を含む、生体内の適用の場合、融合
性の細胞単層は人工臓器、特に心臓血管の人工臓器に対
し望ましい、内皮細胞は通常かかる導管の内腔を内張す
し、かつ心臓病の患者にとって主要問題である血栓症を
防止する。

これらの細胞はまた基本膜材すなわち傷治療のためのマ
トリックスを生成する。現在、これらの人工臓器はテフ
ロン（登録商標）製で、細胞付着を促進しない基体であ
る。その他の公知の付着要素はテフロン（登録商標）の
細胞付着をもたらすことはない。

バイオ接着性ポリフェノール蛋白質の使用はこれらの問
題を取除く。それは水の存在する中て種々の基板によく
接着し、かつ連続的に湿性な環境の中て接着不能とはな
らない、真の接着剤である場合、接着性ポリフェノール
蛋白質は、基体と種々の細胞の双方１Ｍ１織及びその他
の生物学的活性部分に急速に付着する。また、このバイ
オ接着性ポリフェノー−ル蛋白質は、ａ能の低下又は損
失なしに少なくともｌＯカ月間４℃て、並びに少なくと
も１力月間室温で保存することかてきる。更に、これを
固相ペプチド合成又は遺伝子工学て合成することもでき
、それによって大きな量の標準化を実現可能にする。二
枚只に起源をもつバイオ接着性ポリフェノール蛋白質の
反復デカペプチドの化学構造は、“バイオ接着性ポリフ
ェノール蛋白質から生成したデカペプチド”と称し、米
国特許第４，５８５，５８５号に記載されている。バイ
オ接着性ポリフェノール蛋白質の調製方法は従来より周
知である（Ｗａｉｔｅ＆　Ｔａｎｚｅｒ、　１９８１．
５ｃｉｅｎｃｅ　２１２゜ｉｏ３ｇ）。

［発明の目的］ この発明の第一の目的は、プラスチック、ガラス、金属
、微小多孔フィルター（セルロース、ナイロン、ガラス
繊維、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリエチレン
、テレフタレート及び他の合成及び非合成材料で、合成
ポリマー材料になされた変形物質の結果である他の合成
ポリマー材料と生成物を含む）及び組織又は人工Ｉ臓器
の移植方法で利用できる合成又は異形可塑材に対し、付
着効率、接着率及び／又は接着力、細胞の成育及び機能
を促進又は増加させる接着剤として有益な調製剤を提供
すると共に、細胞・組織の基体への付着方法を提供する
ものである。

この発明の第２の目的は、上述の種々の基体に対し、４
ｉ白Ｈ，ＤＮＡ、ホルモン及び抗生物質等の生物学的活
性部の付着効率、Ｉｉｉ着率及び／又は接着力を促進又
は増加させる接着剤として有益な調製剤を提供すること
にある。

この発明の第３の目的は、バイオ接着性ポリフェノール
蛋白質をもつ基体の調製又は塗布及びかかる塗布層の上
記パラメータに対する有効性を調査するために用いる分
析を提供することにある［発明の構成と作用］ イｆ　’ｏ（能細胞９Ｍ１織及びその他の生物学的活性
部の基体への付着方法を提供するもので、 具体的には、 （ａ）下記の反復デカペプチド単位を有する３５乃至１
００瓜量％の純粋バイオ接着性ポリフェノール蛋白質を
含有するポリフェノール蛋白質から成る無Ｉ！Ｉ組成物
で基体を被覆すること、ＡＬＡ　　ＬＹＳ　　＃　ＳＥ
Ｒ／ＩＨＲＴＶＲ／ＤＯＲＩＬ　ＰＩＱＨＴＦρＦＫＩ
／ＨｖＰ　ＳＥＲ／＋ＨＲ７’＃０ＯＰＡ　　ＩＪｓ」
；記構造式において、Ｎは約１０乃至約１００の範囲の
整数で、各Ｘは水酸基と水素から成る基から独立して選
択され、かつ各Ｒは水素とメチルから成る基から独立し
て選択されており。

（ｂ）前記基体上の前記被覆を乾燥すること。

（Ｃ）前記基体上の前記被覆を固定すること。

（ｄ）前記基体に確実に付着されていない異質物質を除
去するため前記基体を洗浄すること、並びに ＣＣ）生育１ｊｆ能訓胞、　Ｍｌ織又はその他の生物学
的活性部を前記被覆ノ、（体に塗１（ｉ　Ｌ／、それに
よって前記活性部か前記被覆基体に付〕ｔされることか
ら成る。

バイオ４ＢＲ性ポリフエノール蛋白質のＣ度と組成は、
ノ、（体の種類又は特別な細胞１組織又は生物学的活性
部の付着要件に従って変更Ｕｆ能である。

生イｒ可能細胞を付着する場合、滋五環境の存在か細胞
か、その正常な新陳代謝の機能を果すために必要とされ
る。

ｔ（核細胞の成長と正常な新陳代謝は、基体に対し対面
延伸した細胞層で付着することを必要とする。従来、細
胞の培養はプラスチック製〕λ体を用いており、細胞の
付着と繁殖のためガラスと微小多孔フィルターを用いる
こともある。

最近ては、プラスチック製基体の代りに、コラーゲン、
ラミニン、ファイブロネクチン、ポリ−〇−及びポリ＝
し一リジン等の生理的基体か用いられている。これは低
い種生成密度て細胞Ｊ？７　ｈ内に固有な問題点を回避
するためて、新しくＭ尊した細胞を利用したり、付着に
あまり適さない基体（例えばテフロン、登録商標）て利
用する場合をさず。バイオ接着性ボッフェノール蛋白質
は、細胞と種々な基体の双方に対し高い拘束親和性の故
に好ましい成分である。バイオ接着性ポリフェノール蛋
白￥（、ｔｉｔ成物は、細胞培養に対する試験管内て細
胞を拘束する際、その効率か晶い故にこれまて評価され
てきた。

テストされた上記組成物は、自然源から調製された９５
％の純粋ポリフェノール蛋白質（組成ｌと称す）及び自
然源から調製された４５％の純粋バイオ接着性ボッフェ
ノール蛋白質（、Ｍｌ戒２と称す）から成る。米国特許
第４，５８５，５８５号に開示された方法に従ってバイ
オ接着性ボッフェノール蛋白質を調製した後、これらの
組成物は、高性能液体クロマトグラフィ、Ｌ−ドーパの
量決定のための分析、アミノ酸分析及びポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を利用して生化学的に全体としての特
徴をもった。

このバイオ接若性ポリフェノール蛋白質Ｍ１成中の基本
アミノ酸の組成物は第１表に示されている。

第１表 １．０００の残留物ごとの残留物中のバイオ接着性ポリ
フェノール蛋白質のアミノ酸組成物９５ｍのバイオ　　
　１５ｚのバイオ 接着製ボリフェ　接着製ポリフェ ノール蛋白質　　ノール蛋白質 ３−ヒドロキシン　　２７　　　　　　　４．：］プロ
リン ４−ヒドロキシン　　８８　　　　　　３３．４プロリ
ン プロリン　　　　　　７９　　　　　　　７２．５グリ
シン　　　　　　Ｓ　Ｌ　　　　　　　１３８．３１／
２シスチン　　　　　９７．７ Ｌ−３，４−ジヒドロ　　　９６．５　　　　　　４２
．３キシフエニル アラニン チロシン　　　　　　Ｓ　４　　　　　　３９１リジン
　　　　　　１７５　　　　　１０３．９Ｍｌ成２にお
いて、コラーゲンは残留５５％の大半からなる。バイオ
接着性ポリフェノール蛋白質の基本単位は、　７５乃至
８５回の同一デカペプチドへの共有結合を介して反復さ
れるデカペプチド（１０アミノ酸の連鎖）である。

バイオ接着性ポリフェノール蛋白質に基づくこれらのＭ
ｌ成物は、ｌＯカ月以上の間５％（Ｖ　／　Ｖ　）酢酸
中に温度４°Ｃ被びにｐＨ２，８の下で安定し、かつ接
着Ｊａ能を有した。

４０乃至５０％のコラーゲンを含有ｒる抽出された調製
剤は、５％（ｖ／ｖ）酢酸中に室温て、かつｐＨ２，８
で安定しており、引き続き少なくとも２力月間プラスチ
ック基体上で乾燥された。

バイオ接着性ポリフェノール蛋白質の種々の基体に強く
付着するスオ力は、組成、適用、細胞に伴う問題点をか
かえた種々の表面に対する細胞の付若、新陳代訓並びに
成長を可能にする。利用回部なこの基体は、従来の細胞
培養研究及びひとまとまりの細胞培養や遺伝子工学で用
いたバイオ反応器から生成した細胞生成用のプラスチッ
ク、ガラス及び微小多孔フィルター（例えば、セルロー
ス、ナイロン、ガラス繊維、ポリエステル、ポリカーボ
ネート）、更に細胞生成用の中空ｉａｍ管及びポリテト
ラフルオロエチレン（テフロン、登録商標）′Ｓの人工
導管の移植材から成る。これらの表面の多くは純真の′
電荷をもち、それ故バイオ接着性ポリフェノール蛋白質
などの純正の電荷素材を強く締結するｍｌ向がある。細
胞は純真の電荷をもち、結果として未処理表面かられず
かにはね返され、一方純正の電荷をもつ中間バイオ接着
性ポリフェノール蛋白質に引きつけられる。バイオ接着
性ポリフェノール蛋白質は、付着効率と、付着率と付着
強度を増大させる。この最後のパラメータは細胞単層に
わたって流体の通過を可能とする導管移植片の細胞の再
移植や、細胞生成の適用分野では重大である。更に１組
織からの遊離又は細胞のタイプにより不十分に付着する
細胞及び血液細胞と懸濁組織培養細胞（組織球すンパ腫
、血小板、白血球と赤血球等）等の正常に付着しない細
胞も又基体に付着することができる。更に１種々の基体
に強く付ｌｉてきるバイオ接着性ポリフェノール蛋白質
は、ＤＮＡ、蛋白質、ホルモン及び抗生物質等の多くの
生物学的活性部への付着を実現１１Ｔ能とする。

バイオ接着性ポリフェノール蛋白質組成物による基体の
波束及び基体のへの付着は次の川に行なわれる。

ｌ　　ｃｒｎ’当りの最終濃度に基いて、戸ｌ当りｌＯ
乃至６０μｇの無菌バイオ接若性ポリフェノール蛋白質
約ｌ乃至２膳１’ａ’１ｃｒｎ’の基体に均等に塗１１
ｉする。生成した膜を、薄層フローフートの中にその基
体をのせて急速に乾燥する。乾燥するやいなや、　１１
！２（フィルム）は洗い落しと固着のため３５〜ｌＯＯ
％のエタノール又はイソプロパツールで処理され、次に
は残留アルコール及び非吸看異質部を除去するため無菌
組織培養媒体て処理される。基体は直ちに使用すること
も出来るし、貯蔵用に乾燥してもよい。膜に付着される
細胞又はその他の生物学的活性部は望ましい濃度に：Ｊ
Ｊ節され、無血清培地又は血清を含有する媒体中て基体
に付加される。

種々の時間間隔の中での細胞付着の場合、細胞は付着、
成長又は機能について評価され、また組織培養中に付着
細胞を必要とする実験目的に従って処理される。

更に、バイオ接着性ポリフェノール蛋白質を生物学的活
性部に付着させることもてきる。この時生成した生物学
的活性部は基体に付着ｕｆ能である。

以下に、その付着方法の工程について説明する。

（イ）無血清溶液に前記生物学的活性部を分散する工程 （ロ）下記のデカペプチド単位をもつ約３５乃至１００
正量％の純粋バイオ接着性ポリフェノール蛋白質を含有
するポリフェノール蛋白質からなる無菌組成物を混合す
る工程−Ｌ二記構造式において、Ｎは約　１０乃至約１
００の範囲の整数て、各Ｘは水酸基と水素から成るノ、
（から独立して選択され、各Ｒは水素とメチルから成る
基から独立して選択されており、それにより生物学的活
性部の前記分散によって前記バイオ接着性ポリフェノー
ル蛋白質を前記生物学的活性部にイ・１着する工程。

（ハ）その結果′Ｌ成した生物学的活性部を再生する］
二程、並びに （ニ）　＋ｉｉｉ記ＩＩｆ生した生物学的活性部を前記
基体に付着する工程から成る。

［実施例］ 以下にこの発明の実施例を添付１１面に基づいて説明す
る。

実施例１ 細胞拘束効率の評価 ９５％のハイ第１妾着性ポリフェノール蛋白質（Ｍｌ成
１）又は４５％のバイオ接着性ポリフェノール蛋白質（
′Ｍｌ成２）のいずれかを含有する組成物か、５％（ｖ
／ｖ）酪酸中１皿につき５０ルｇて３５１１１１組織（
９（ｒｒｒ’）の培養プラスチック製ベトリ皿上に均等
に塗布され、直ちに乾燥、固着され１００％のエタノー
ルでゆずいて、殺菌した。

この時、皿は無菌の３倍の蒸留水てゆずかれた。細胞は
次の手順て付着分析用に調製された。

ウシ科の動物の角膜内皮細胞はトリプシン、すなわち細
胞付着蛋白質を消化させるプロティアーゼて処理され、
次に湿気を含んた培養器て温度３７°Ｃ空気中５％ＣＯ
の条件て２次」８五の成長を認めた。

細胞単層はトリプシン化と干渉しあう過剰な血清及び媒
体を除去するため無血清培地でゆすぎ、１０分間０．０
５％トリプシン−０，０２％のエチレンシアミンチ１−
ラ酢酸（ＥＤＴＡ）て培養した。トリプシンの作用て分
離された細胞は、ピペットで移され、次に２５０％ｇで
ゆっくりと遠心分離された。生成されたベレットは、血
清に妨げられない最小媒体（Ｅａ　ｒ　ｌの塩）中にｉ
’ｆ浮遊され、細胞表面から残りの血清蛋白質とトリプ
シンを除去し、ＩＩｆび遠心分離された。生ｆｆ　ｉ’
＋ｆ能細胞は染料除外試験を用いて（すられ、細胞の整
除できる数か、１５％のウシ科の動物の１Ｍ＋児の血清
を含有する最小媒体中でｍｌにつき最終濃度２ＸＩＯの
細胞に再浮遊された。細胞は未処理のプラスチック製組
織培養ベト９皿ｔｆｌで、並びにバイオ接着性ポリフェ
ノール蛋白質て塗ＩＩｉされた組織培養皿中て種を生成
した。１分、２．５分、５分。

１２．５分及び約２０分の間隔て、３つの実験用プレー
トか末付ｒｉの細胞の量を決めるため無作為に選択され
た。未付着の細胞は洗い落すことによりプレートから除
去され、ヘマシｌ〜マー（１）Ｃ■ａｃｙＬｏ＋＊ｅｒ
）上てカウントされた。使用済みて、しかし皿に添加さ
れなかった細胞の反復整除可能数は３回数えられた。デ
ータは未付着細胞の数を塗布された細胞の全数から差引
くことによって付ｚｉ６細胞の比率を計算した。細胞の
バイオ接着性組成物への付着率を示すデータか比較の−
１−、下記第２表及び第１　［Ｊに示されている。

第２表 プラスチックと、％Ｌ＋＆ｌ及び２の付６′率の比較時
間（分）　　物　　　質　　推定付着比率５．０　　プ
ラスチック　　　　２５ 組　成　　１　　　　６２ 組成　２７０ １２．５　　プラスチック　　　　７６組　成　　１　
　　　８５ 組成　２８７ ２０．０　　プラスチック　　　　８９組成　１　　９
７ ｎｔ　　或　　２　　　９７ この表より明かな通り、わずか５分間以内に、１紺成２
（すなわち高いコラーゲン成分）中の細胞の付着は、細
胞のプラスチックへの付着よりも２倍以上となっている
。更に、全ての時間間隔ては細胞のポリフェノール蛋白
ｒ１への結合力は細胞のプラスチックに対する結合力を
上回る。結果は組成ｌに対し同様であるか、他のデータ
は、組成２か細胞付着物質及び組織培養物質として望ま
しいことを示唆している。Ｍ１成２は、長期の保存に１
耐え１１する極めて安定した物質である。

アミノ酸分析によりテストすると、Ｌ−ドーパ対蛋白質
の比率は４℃及び−２０℃の温度条件で４力月後に組成
２において安定していた。

一方、２５％までの下落は同様の条件で組成ｌについて
見られた。

第３表 ４°Ｃ及び−２０°Ｃの温度条件で、期間経過後に残存
するバイオＪｉｉ着性ポリフェノール蛋白質の％（アミ
ノ酸分析による決定） □　組成１　　．１４１成２ ３ケ月　４ケ月　　３ケ月　４ケ月 ４＠　　　　９７％　　　７６ｚ　　　１００％　　　
９８＄−２０”　　　９７Ｘ　　　８２％　　　１０１
％　　１００ｚ生化学レベルでの生物学的活性部の安定
性は組織培養システムにおいて極めて望ましいのて、組
成２は細胞付着効率を高める目的上好ましい物質である
ことか認められた。

Ｘ五■ス 血Ｖ＋ｉの細胞結合力とその効率に対する影！実験口的
に従って、細胞の付着の間及び付着後にいくふんかの血
清を必要としてもよい。血清の細胞結合力に対する効果
は、　１５％のウシ科の血清（Ｆ　Ｂ　Ｓ　）又は０．
５％のウシ科の血清のアルブミン（ＢＳＡ）を含有する
媒体中の細胞を用いてテストされた。

ウシ科の血清はＦＢＳ中の主要な蛋白質構成要素である
。付着力は基体からトリプシンにより付着した細胞を除
去することの能力の有無によって間接的に評価された。

使用したウシ科の血清アルブミンの濃度は０．５％乃至
１％のＦＢＳ中に見られた濃度に等しい。！ｌａ培養ベ
トリ皿の組成２による被覆は実施例１において完成され
た。

細胞は三重のプラスチック及び接ＩＪ′被覆ベトリ皿上
で種を生成し、未付着の細胞は２．５分、５分及び１５
分毎に洗い落して除去した。未付着の細胞は０．８ｍｌ
の０．０５％トリプシン−０，０２％ＥＤＴＡを用いて
１０分間トリープシン化され、それから０．２％ＦＢＳ
を含有する管に移され、細胞上のトリプシンの作用を阻
止した。再生した付着及び未付着の細胞はへマシトマー
を用いて数えられ、かつ付着細胞を表わすデータは各々
の皿から１１ｆ生された全細胞の比率として計算された
。第４表はそのデータである。

第４表 血清のプラスチック及びバイオ接Ｉｉ性ポリフェノール
イに白質からの細胞の再生に対する効果時　間　　物　
　質　　付着率　再　生　推　定（分）　　　　　　　
　　　％　　された　付着率細胞％　　％ ２．５　ＦＢＳ−プラスチック　　２　　　１００　　
　　２Ｆ口Ｓ−バイオ接着剤　　２８５２ ［１３八−プラスチ・ンク　　５　　　　７９　　　２
６ＢＳＡ−バイオ接着剤　３１　　　　！０５　　　．
２８５、ＯＦＢＳ−プラスチック　　５　　　　８２　
　　２２ＦＢＳ−バイオ接着剤　４９　　　　　’１９
　　　５０ＢＳＡ−プラスチック　３１　　　　５１　
　　６５ＢＳＡ−バイオ接着剤　２８　　　６０　　　
５６１５、ＯＦＢＳ−プラスチック　６５　　　　８３
　　　７１ＦＢＳ−バイオ接着剤　７４　　　　７４　
　　８１ＢＳＡ−プラスチック　４０　　　３３７７Ｂ
ＳＡ−バイオ接着剤　６２　　　１９　　　８５第４表
のデータから明かな通り、細胞は初めの数分間ではプラ
スチックよりバイオ接着性ポリフェノール蛋白質により
強力に付ノｉする。更に明かなことは、もし媒体中のＦ
ＢＳかウシ科の血７．′ｊアルフミンと代科されるなら
ば、トリプシン化による細胞の内生は減少する。これは
４４′Ｆに細胞か確実なノ、゛座（５分）を形成しでシ
坦化し初める（１５分）時に見られる。１５分経過して
、３３％及び３９％の＋＋ｉ生は、プラスチック及び接
着培−１−ｈでのＦＢＳによる８コ％及び７４％のｔｌ
）生と比較すると、プラスチック及び接！ｉ剤被覆ベト
リ皿七てのＢＳＡにより実現された。プレートのＷＪ微
鏡による観察はこれらのデータの正しさを確認した。

この研究における他の測定結果は、実施例２て説明した
細胞付着の直接評価か未着の細胞だけをカウントするこ
とによる間接的測定と相互関連していることを論証して
いる（カウントの詳細な実施′例を参照のこと）。

第２図はこれらの測定結果を示すものである。

実施例３ 非付し′細胞のバイオ接、容性ポリフェノール帯白賀へ
の付着 分離に続いてＭｌ織から得られた細胞タイプの大部分を
効率程度を変化させてプラスチック基体に付着すること
か可能である。しかしなから、ある種の細胞はプラスチ
ック基体に付着しない。かかる細胞を付着させる能力は
、これら細胞の固定化を必にとする診断及び研究用の分
析に対する手段を提供し、かつ細胞生Ｊ＆物を得るため
のバイオ反応器フィルターに細胞を固Ｌ゛させる能力を
提供する点て有益である。更に、かかる付着能力は１組
織の項五付着要素として作用するバイオ接着性ポリフェ
ノール蛋白質に対する可能性を明かに論証している。細
胞系ｕ９３７は肋膜の流出からＭ敲した悪性細胞から確
立された人間の組織球のリンパ腫である。これらの細胞
はＲＰＭＩすなわち１０％のウシ科の胎児の血清で補わ
れた１６４０組織培養媒体中の懸濁液で連続的に成長す
る。

ｕ９３７は結成の存在の中でプラスチックによく付６し
ない。１縄培養のベトリ皿（３５ｍ　ｍの皿）は実施例
１て説明した方法に係るバイオ接着性ポリフェノール蛋
白質て被覆された。ｕ９３７は管を遠心分離するため、
移されて、実施例１に記載した方法て調製された。細胞
はｌｏＯｇｇバイオ接着性ポリフェノール蛋白質（組成
２）て被覆されたプラスチック組織培養皿上て播種され
、そして伺着効率に関しては５分、１２．５分及び２０
分の間隔て測定した（実施例１を参照）。

（第３　ｆＪに示す）第５表の結果はバイオ接着性ポリ
フェノール蛋白質のｕ９３７細胞の付着に対する効果を
実証している０期待した通り、細胞はプラスチック皿に
よく付着しなかった。しかし、５分以内に７５％の播種
細胞か被覆した皿に付若し、２０分以内に８７％の細胞
か被覆した皿に付着した。

第５表 ｕ９３７細胞の付着％ 時　間　　　非　被　覆　　組成２て被覆した（９エ　
　プラスチック　　　プラスチック５．０　　　　　　
　　３　％　　　　　　　　　　　７５　　％１２．５
　　　　　　　　　　５　　％　　　　　　　　　　　
　８４　　％２０．０　　　　　　　　　８　　％　　
　　　　　　　　　８７　　％Ｘ凰１ バイオ接着性ポリフェノール蛋白質と市販可能細胞付着
要、ｋに関する細胞成２の比較例細胞の基質への付着は
、生体内ての培養で細胞を形成するための第１の要件で
ある。第２の要件は重要て、細胞か成長するということ
である。しかしなから、組織の分裂に伴い、得られた細
胞の数はしばしば極めて低い。低細胞の播種数は、わず
かの細胞のみか生存のチャンスを減少させているか故に
、培養の成立に不利な影響を及ぼす。

これはｒｉ純な数学的確率及び細胞自身により生成した
代謝物に対する必要性（密１１従属代謝物）に基づくも
ので、これら代Ｊｌ物は細胞の付着と成長にとって必要
とされている。細胞の数か低いと、、ｍ胞の適ちな数か
付ｚｉするという確（ぺか低くなり、それ自体か球体形
状から基質への細胞の平１■↓にとって必要である。一
度び平坦化されると、新陳代謝か細胞の成長と分裂の媒
体を調製するために生じる。容易に接着しない及び又は
、低密度で播種される細胞の付着と伝播を高めるため、
種々のペプチド及び蛋白質付着物質か市販されてきた。

それらはコラーゲン、ラミニン、ポリ−ローリシン及び
ファイブロネクチン等から成る。これらの物質の全ては
、播種された細胞の種類に応して生物学的不活性基質上
て作用する。低播種密度で細胞の成長を可能にする際、
バイオ接着性ポリフェノール蛋白質の有効性をこれらの
物質と比較するため、ウシ科の角膜内皮細胞か、プラス
チック、バイオ接着性ポリフェノール蛋白質、コラーゲ
ン、ラミニン、ポリ−ローリジン又はファイブロネクチ
ンのいずれかの上に組織培養ベトリ皿（直径３５ｍｍ、
　９．６５　ｃｒｎ’）　１枚につき　２５０細胞の密
度て播種された。これらの細胞は５　Ｆ１間てＪ！、長
し、この期間に細胞集落（コロニー）のサイズ（１つの
コロニー毎の細胞の数）と各プレー）−（１ｊのコロニ
ーの数か細胞を結晶性すみれ色で塗ることによって各変
数ごとに決められた。ここて得たデータは、これらの物
質の各々の付着（コロニーの数）および成長（コロニー
のサイズ）に対する効果を定めるために使用された。

バイオ１妾看性ポリフエノール蛋白質て被覆された細胞
と皿は実施例１に記載された通り用意された。皿と他の
付着物質との被覆は製造メーカーの用いる方法に従って
行なわれた。

コラーゲン：コラーゲン被覆板は１部の冷たい（４℃）
コラーゲン消散剤を、６部の冷たい５０％メタノールに
希薄することによって調製された。この混合物は数分間
よく混合し、皿の底部だけがカバーされるようにベトリ
皿にピペットで移された。２０秒以内にコラーゲンか吸
引により除去され１皿は乾燥蓋に対し３０’上下傾斜さ
せた。　ｌ；５層フローフード内ての１時間の乾燥の後
、皿はただちに使用された。

ラミニン・ラミニンは生理塩中１１の５０ＩＩＭのトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの中に１１ｍ添加
された。−２０℃乃至４℃でラミニン溶液のゆっくりし
た尊解後、工０乃至１５．ｇのラミニン溶液か、ｐ１１
７て０．５ｍの０．０１Ｍりん酸ナトリウム緩衝剤中の
ベトリ皿にピペットで移された。皿は３７℃て乾燥され
た。乾燥後ただちに。

皿は使用された。

ファイブロネクチン：　ファイブロネクチンは凍結乾燥
粉としてｌ　ｍ　ｇ用意された。使用するに先立ち、フ
ァイブロネクチンは、４°Ｃでの保存の後室温に適合で
きるようにされた。

粉末は１１の殺菌蒸留水で再構成され、それから３０分
間可溶化の処理をほどこした。１０乃至２０μｇのファ
イブロネクチン溶液か各皿に０．５ｍｌ添加され、それ
から空気乾燥を行った。

この時、皿は細胞播種用に用、なされた。

の凍結乾燥粉に添加された。使用に先立ち、この粉末は
４℃の保存の後に室温に適合するようにされた０皿は１
　ｍ　ｌの殺菌蒸留水中でＳｏ　ｍｇ被被覆れ、５分間
室温に放置された。この時、溶液は吸引され、皿はｌ　
、Ｓｍ　ｌの殺菌蒸留水て２回ゆすがれた。各ゆすぎの
後、液体は完全に吸引された。皿を直ちに乾燥して使用
した。

各要素に播種された細胞の被覆効率は細胞を結晶性すみ
れ色に塗って測定した。これはまず、過剰蛋白質を除去
するため無血清培地てコロニー含有の皿をゆすぎ、それ
から！＃Ｊｌｌｌを１０％の中性緩衝ホルマリンで１０
分間固着することによって実現された。この時ホルマリ
ンは吸引によってプレートから除去され、水道水中の０
．１％の結晶性すみれ色か７分間プレートに添加された
。着色後すぐに、結晶性すみれ色か注入され細胞は水道
水のビーカーてよくゆすぎ、過剰の着色を除去した。

プレートか完全に乾燥した後、それぞれの物質を示すコ
ロニーを数えた。それから各プレートごとに無作為に選
択されたコロニーの中の１細胞な散えた。この実施例か
ら１１にだデータは第６表に示されており、第４［Ａに
は、ハークラフて図示している。図面より明かな通り、
バイオ接着性ポリフェノール蛋白質（Ｕ）て被覆された
プレート上の第４図のコロニーの数はポリーＤ−リシン
（ＰＤＬ）によってのみつり合わされた。コラーゲン（
Ｃ）、プラスチック（Ｐ）、ファイブロネクチン（Ｆ）
及びラミニン（Ｌ）を含む全ての要素は、第４図にＩＡ
示されている通り結果は不良てあった。同様にバイオ接
着性ポリフェノール蛋白質て被覆されたプレート上に発
見されたｌコロニー　４ｔｊの細胞の平均数はポリー〇
−リシンにより、つり合わされた。コラーゲン、ブラス
チウク、ファイブロネクチン及びラミンの成長効率は貧
弱であることを示している。バイオ接着性ポリフェノー
ル蛋白質とポリー〇−リシン（これらの分子の各々に発
見されたりシンの高レベルにより）との間には何らの重
要な相違もないけれども、付着要素としてのバイオ接着
性ポリフェノール蛋白質の使用は次の様な性濠をもつ故
に、！、Ｓｉ質として有益である。（１）水を置換てき
る。（２）金属とテフロン（例えば人工臓器）から成る
材料に伺着てきる。

（３）生体内及び試験管内で利用できる。（４）し−ド
ーパ、ヒドロキシル化された、かつリシンのアミノ酸残
ｆ！ｉ物に基づく高い強度をもつ接着剤を形成すること
かてきる。

第６表 種々な組織培養ノ＾質上ての細胞成長後のコロニーの数
とサイズ ５目経過後の　コロニーごとの 物質ごとの　　細胞の平均数 コロニー 組成２　　１００　　１４７ ボリーＤ−リシン　　１０７　　　　　　１７３コラー
ゲン　　　　　　２７　　　　　１０１プラスチツク　
　　　５７　　　　　１０５フアイプロ ネクチン　　　４７　　　　　６７ ラミニン　　　　　　　　０　　　　　　２０実Ｊｕ生
互 ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）は、血Ｉ：？
移植に対し通常使用される基馴である。この材料の使用
に伴う主たる問題点は、ＰＴＦＥ上の血管、＊胞の播種
かその高い疎水性により極めて困難であるということで
ある。多くの移植組織にとって、その表面の融合性細胞
中層は凝固形成を防１Ｆする６内皮細胞のＰＴＦＥへの
付２゛１に対する仲介媒体として作用するバイオ接着性
ポリフェノール蛋白質の有効性をテストするため、血管
移植材をバイオ接着性ポリフェノール蛋白質（組Ｉ＆、
２）のｃｍ’につき　２００鉢ｇのＵ被Ｙｇシた。この
時５０万の内皮細胞かバイオ接着性ポリフェノール３ｊ
（白質に付着された。細胞は又バイオ接着性ポリフェノ
ール蛋白質で被Ｙｇせずにテフロン上に播種された。そ
して、テフロンは対照サンプルとして作用する細胞の播
種なしにバイオ接着性ポリフェノール蛋白質でもって被
覆された。

付着後１５分経過して、過剰細胞は血管移植材から洗い
落され、それから血管移植材をホルマリンで結果し、結
晶性すみれ色て着色し、第４図に示ず手順て乾帰した。

この実施例の結果は、第５図に示されている。着色は細
胞なしのバイオ４Ｂ、Ｅ性ポリフェノール蛋白質で処理
されたテフロン（サンプルｌ）及び接着剤て処理はされ
ないか、細胞で播種されるテフロン（サンプル２）上に
見られるけれども、最大の着色又は細胞付着は内皮細肋
を金石する処理済みテフロン（サンプル３）に生じた。

かくて、バイオ接着性ポリフェノール蛋白質は、血管移
植を内皮細胞による播種を増加させる効果をもち、それ
により、血管移植手術の後に凝固形成を最小化又は軽減
することも出来る。

実施例６ ４５％純粋純粋バイ着接ポリフェノール蛋白質の抽出方
法 ２枚貝、ｃｄｕｌｉｓの足３００グラムを、石版の高速
ミキサーで９００１の中性塩緩衝剤て入念に混合し結合
した。この中性塩緩衝剤は１Ｍｋ１．化ナトリウム、０
．０５Ｍ＋−リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（
ｐＨ７，５）　、　ｌ　ｍＭフェニルメチルスルフォニ
ルフルオライド ミド、　０．０２５　Ｍエチレンジアミンテトラ酢酸及
び１１１１Ｍシアン化カリウムプラス９１の反発泡ｃｌ
ｉｉ剤を含イ１する．この混合によりバイオ接着性ポリ
フェノール蛋白質を沈澱させた。混合物を１５分間１０
Ｋｒｐｍて遠心分離した。ベレットは高速ミキサーを用
いて９　０　０　ｍｌｓの５％酢酸中に再浮遊された。

バイオ接着性ポリフェノール蛋白質は４５分にわたる　
ｌＯＫｒｐｍでの遠心分離中表面浮遊剤中に残った．約
１，０００ａｌｓの表面浮遊剤は連続攪拌により氷のハ
スに入れた．５１Ｓの２Ｍはう酸ナトリウムプラス９５
１５の５ＭａＪ化ナトツナトリウム攪拌ナトリウムに添
加した．混合物は１５分間１０Ｋｒｐｍ遠心分敲された
．新しい表面浮遊剤は２Ｍはう酸ナトリウムと　５Ｍ塩
化ナトリウムの４倍の添加により上述の通り処理された
。

再び混合物を１５分間１０にで遠心分離した。

ベレットは次の混合物の中で再浮遊された．すなわちそ
れは７．５　１１１１５の２Ｍはう酸ナトリウム。

５０＋ｓｌｓの５ＭＩｉｊ化ナトリウム、　５　０　ｃ
ｌｓの蒸留水、５％酢酸中３　７．５１１１Ｓの８Ｍ尿
素及び５．６ｎｆｓの濃縮酢酸から成る．混合物は約１
６時間ゆっくりと攪拌した。懸濁液は１５分間１０Ｋｒ
ｐｍて遠心分離した．表面浮遊剤は約１６時間，５％酢
酸に対し透析された。（８−１２に分子縁切断＋１２り
．アミノ酸分析によれば，抽出物か４５％の純粋バイオ
接着性ポリフェノール蛋白質を含有している。抽出物の
純度は抽出の数によって決められる。純粋バイオ接着性
ポリフェノール蛋白質の生成は抽出物の数か増加するに
つれ減少する．ここに述べた手順は４℃で行なわれた。

クロマトグラフィによる純粋化 液体クロマトグラフィを用いると，ＳＥセファデックス
樹脂は５％の酢酸中５．５％のグアニジン塩ｓｔｕ　（
　Ｇｕ　ＩＩＣＬ）の中にポリフェノール蛋白質を保持
する．この時、蛋白質は酢酸中５．５〜２０χのＧｕ　
ＩＩＣＩの変化度で樹脂から抽出された。ピーク領域は
液かたまり、Ｇｌｌ　ＨＣＩを除去するため５％の酢酸
に対し透析された。蛋白質の保存は５％の酢酸中４°Ｃ
で最も安定している．接着剤としての使用に先立ち，体
内もしくは生きた細胞と接触して、バイオ接着性ポリフ
ェノール蛋白質は溶液のｐＨを中性近くまてに上げるた
め、水に対して透析されなければならない。そして３と
ｌ　Ｏ　ｍｇ／ｍｌの間で濃縮されなければならない。

これは：ｌＯ，０００ないしそれ以下の孔径をもつ超ろ
過膜を用いて実現される。これはバイオ接着性ポリフェ
ノール蛋白質が使用前に不活性基質上で乾燥される場合
は不要である。

実施例７ ４５％の純粋バイオ接着性ポリフェノール蛋白質（組成
２）はヘパリン、特別の反染固剤を有するマコボリ糖類
、ベロキシダーゼ、かつベロキシダーゼを酸化させる蛋
白質酵素を固着させるため使用した．これは、バイオ接
着性ポリフェノール蛋白質の中間媒体を介して他の物質
をプラスチック製品に効率的に接着可能であることを示
すために行なわれた．７ｇｇのバイオ接着性ポリフェノ
ール蛋白質を３．５ｇ／ｃｍ′の最終濃度を得るため組
繊細胞のプラスチック皿」二て乾燥させた。プロティン
を１００％のエタノールて洗浄し、更に第１実施例記載
の水て２度洗浄した。５つの異った濃度をもつヘパリン
を，上記皿に添加した。その濃度はそれぞれ９　０，　
６　０，３　０．１　５及び１５てあった．全てのテス
トは２度行なわれた。プレートはゆるく結束したヘパリ
ンを除去するため使用前に０．１Ｍりん酸緩新剤で洗浄
した。ヘパリン活性の分析は２３℃て１つの培養皿毎に
０．５１の緘で６皿に新鮮な人間の血液を添加すること
によって行なわれる。凝固時間は肉眼で観察記録された
。

その結果は第７表に示されている。

第７表 凝固Ｉｌ！７１１　　（分） ヘパリン　バイオ接着性　　　バイオ接着性弔　位　ポ
リフェノール　　ポリフェノール蛋白質をもつ場合　蛋
白質がない場合 ９０　　１本ＮＣ本家ＮＣ ６ｉｌ　　　　　Ｎ　ＣＮ　Ｃ ：ｌＯＮＣ６１，１０４ Ｉｓ　　　　　ＮＣ３０，２９ ５ＮＣ：ｌＯ，２７ ０２８，２９１：ｌ、　　１．１ １　数値は２度の分析による。

１よ　ＮＣ−２４時間後凝固なし。

ヘパリンはバイオ接着性ポリフェノール蛋白質を利用し
てプラスチックに極めて効率的に固定された。ヘパリン
なわずかに投与した場合てさえ、２４時間後に凝固は全
く見られなかった。　５０単位以下の全ての投グ・ては
２時間又はそれ以下て凝結し、ヘパリンは直接ブラスチ
ウク材に付着した。

投与を増加すると十分なヘパリンかプラスチック材をム
１１東し、楽固を阻止した。

ベロキシダーゼは同様の方法て固定された。すなわち、
５つの異った濃度のベロキシターゼ（１゜０．５，０．
１，０．ロ５，０．０２５弘ｇ／−皿）を、バイオ接着
性ポリフェノール蛋白質で２回被覆したプラスチック皿
及び未被覆プラスチック皿の双方に添加した。ヘパリン
と共に、　Ｏ，１Ｍりん酸緩新剤の洗浄剤を用いて、ゆ
るく結束した酵素を除去した。

ベロキシターゼの分析は混合物と、りん酸緩衝塩中の過
酸化物プラスＯ−フェニレンシアミン（ＯＰＤ）の添加
を含む。基質混合物は、　１ｍｌにつき、＋００＝＋の
過酸化物（５０１の水の中に／１０１Ｌ＋の３０％過酸
化物）プラス１００ｇ１のＯＰ　Ｐ　（８，５６ｍ１の
水の中に１０．７ｍｇ）及び８００鉢Ｉりん酸緩衝塩か
ら成る。１１が６皿に添加された。２３℃で５分間の培
養の後、１００μｌの４Ｎ硫酸を添加して１反応を止め
た。これは４９０ｎ鳳の最適波長をもつ色度測定分析で
ある。その分析データは第８表に示す４！１０　ｎｍて
の吸光度として示されている。

第８表 濤ｇ　　バイオ接着性ポリ　バイオ接着性ポリベロキシ
　フェノール蛋白質　フェノール蛋白質ムニ土　　をも
つ場合　　　　のない場合１．０　　　　　　＋、５．
１．：ｌ　　　　　１．４．　１．２０．５　　　　　
０．６，０．７　　　　０．５．　０．５ｏ、ｔ　　　
　　　　　　　　ｏ、ｚ、ｏ、ｚ　　　　　　　　　ｏ
、ｏｓ、　　　ｏ、口６０、＋１５　　　　０．１．０
．１　　　　０．０４．　０．０４０．０２５　　　　
　　０．口５，０．０５　　　　　　０．０４．　　０
．０４実施例８ バイオ接着性ポリフェノール蛋白質は１組織学と細胞学
における組織・細胞用の基質として役立つように発見さ
れたものである。この実施例では４５％バイオ接着性ポ
リフェノール蛋白質（組成２）か、内皮細胞標本をもつ
ウシ科のＤｃｓ（ｅ■ｅｌｌ漠をクラススライド（ｇｌ
ａｓｓｓｌｉｄｅｓ）に付着するために使用された。全
角膜は、屠殺直後の牛から摘出したもので、生理塩又は
１０％の中性Ａｌ＋ホルマリンに漬けた。この時、Ｄｅ
ｓｃｅＩｌｅ　Ｌ膜はゆっくりとしだ分蕩により角１模
の後面から除去された。組織かスライド面（５％の酢酸
て予め？＋’ｊ　ｆ’ｈされた）に移され、ＳＯ＝ｇの
バイオ接着性ポリフェノール蛋白質で被覆した。それか
ら、組織標本を室温でバイオ接着性ポリフェノール蛋白
質上に又は５５℃の熱プレート上て、２０分間乾燥させ
た。ホルマリン固定Ｍｉ織を使用する場合、組織はバイ
オ接着性ポリフェノール蛋白質に付着する前に過剰ホル
マリンを除去するため塩類で洗浄された。乾燥後、！ｌ
ａｌミスライドはその組織をバイオ接着性ポリフェノー
ル蛋白質に５分間固着させるためホルマリンて処理され
た。この方法て処理された組織は、水溶液中でａｉＩ！
間バイオ接着性ポリフェノール蛋白質上に放置された。

更に、水、塩、希薄剤及び１［１０％のエタノール及び
キシレンの中ての入念な攪拌の後組織はなおもとのまま
であった。ハイオ接ｒｉ性ポリフェノール蛋白質か欠除
した場合、Ｍｌａのスライド面への付着は第一のホルマ
リン処理より長もちすることはなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の実施例１における細胞の付り対峙間
（分）の比率を示すグラフ、第２図は実施例における細
胞の付着対時間（分）の比率を示すグラフ、第３図は実
施例３における細胞の付着対時間（分）の比率を示すグ
ラフ、第４図は実施例４におけるプレート毎のコロニー
の数と各要素のコロニー毎の平均細胞数を示す棒グラフ
、第５図は結晶性すみれ色で着色後のポリテトラフルオ
ロエチレン（ＰＴＦＥ）の３つのサンプルの写真て、左
側のサンプルはｆｆ１Ｊｊｃ、２で被覆されたＰＴＦＥ
、中央のサンプルは細胞て播種された、しかし組成２で
被覆されないＰＴＦＥ、右側のサンプルは組Ｉ＆、２で
被覆され細胞で播種されたＰＴＦＥである。 Ｇ４ＰＩＩｒり】 ｑＭ（≦「） 手続著口正書（方式） ％式％） ３、補正をする者 事件との関係　　出願人 名　称　　バイオーボリマーズ インコーボレーテット ４、代　理　人 住所　東京都港区新橋５丁目２９番７号５、補正命令の
日付　昭和６２年７月２８日（発進口） ６、補正の対象明細書「全槽」、 図面（第５図） ・　ε、２１ ア、補正の内容 明１細書、図面について次のとおり訂正する。 （イ）明細：Ｉｔにつき１ベージ〜１１ベージおよび１
８ベージの浄書・別紙のとおり（内容に変更なし） （ロ）明細書５５ベージの１１行目から１８行目にかけ
て「のコロニー毎のモ均細胞数を示す棒グラフ・・・・
・・　ＰＴＦＥである。」とあるのを「のコロニー毎の
平均細胞数を示す棒グラフである。」と訂正する。 （ハ）図面第５図を削除する。

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. （１）生物学的活性部の基体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）へ
   の付着方法において、 （ａ）下記の反復デカペプチド単位を有する３５乃至１
   ００重量％の純粋バイオ接着性 ポリフェノール蛋白質を含有するポリフェノール蛋白質
   から成る無菌組成物で基体を被覆すること、 ▲数式、化学式、表等があります▼ 上記構造式において、Ｎは約１０乃至約 １００の範囲の整数で、各Ｘは水酸基と水素から成る基
   から独立して選択されかつ各Ｒは水素とメチルから成る
   基から独立して選択されており、 （ｂ）前記基体上の前記被覆を乾燥すること、（ｃ）前
   記基体上の前記被覆を固定すること、（ｄ）前記被覆さ
   れた（ｃｏａｔｅｄｓｕｂｓｔｒａｔｅ）基体に確実に
   付着されていない異質物質を除去するため前記被覆基体
   を洗浄すること、並びに（ｅ）生物学的活性部を前記被
   覆基体に塗布し、それによって前記生物学的活性部が前
   記被覆基体に付着されてなる 細胞・組織の基体への付着方法。
2. （２）前記基体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）はその１ｃｍ＾
   ２当り１０乃至６０μｇ／μｌのバイオ接着性ポリフェ
   ノール蛋白質を含有する０．１乃至２μｌの前記組成物
   で被覆されてなる特許請求の範囲第１項記載の細胞・組
   織の基体への付着方法。
3. （３）前記被覆は前記基体を無水の生物学的適合可能無
   菌媒体で洗い落すことによって前記基体に固着されてな
   る特許請求の範囲第１項記載の細胞・組織の基体への付
   着方法。
4. （４）前記無菌媒体は３０乃至１００％のエタノールで
   ある特許請求の範囲第３項記載の細胞・組織の基体への
   付着方法。
5. （５）前記無菌媒体は３０乃至１００％のイソプロパノ
   ールである特許請求の範囲第３項記載の細胞・組織の基
   体への付着方法。
6. （６）前記被覆基体は水又は緩衝溶液で異質物質を除去
   するため洗い落されてなる特許請求の範囲第１項記載の
   細胞・組織の基体への付着方法。
7. （７）前記基体は合成ポリマー材料、ガラス、金属及び
   微小多孔フィルター等のグループから選択されてなる特
   許請求の範囲第１項記載の細胞・組織の基体への付着方
   法。
8. （８）前記基体はポリテトラフルオロエチレンである特
   許請求の範囲第７項記載の細胞・組織の基体への付着方
   法。
9. （９）生育可能細胞の基体への付着方法において、（ａ
   ）下記の反復デカペプチド単位を有する３５乃至１００
   重量％の純粋バイオ接着性 ポリフェノール蛋白質を含有するポリフェ ノール蛋白質から成る無菌組成物で基体を 被覆すること、 ▲数式、化学式、表等があります▼ 上記構造式において、Ｎは約１０乃至約 １００の範囲の整数で、各Ｘは水酸基と水 素から成る基から独立して選択され、かつ 各Ｒは水素とメチルから成る基から独立し て選択されており、 （ｂ）前記基体上の前記被覆を乾燥すること。 （ｃ）前記基体上の前記被覆を固定すること。 （ｄ）前記基体に確実に付着されていない異質物質を除
   去するため前記基体を洗浄するこ と、並びに （ｅ）前記生育可能細胞を前記被覆基体に塗布し、それ
   によって前記細胞が前記被覆基体に付着されかつ滋養環
   境の中で正常な新陳代謝の細胞機能を果す細胞・組織の
   基体への付着方法。
10. （１０）前記基体はその１ｃｍ＾２当り１０乃至６０μ
    ｇ／μｌのバイオ接着性ポリフェノール蛋白質を含有す
    る０．１乃至２μｌの前記組成物で被覆されてなる特許
    請求の範囲第９項記載の細胞・組織の基体への付着方法
    。
11. （１１）前記被覆は前記基体を無水の生物学的適合可能
    無菌媒体で洗浄することによって前記基体に固着されて
    なる特許請求の範囲第９項記載の細胞に組織の基体への
    付着方法。
12. （１２）前記無菌媒体は３０乃至１００％のエタノール
    である特許請求の範囲第１１項記載の細胞・組織の基体
    への付着方法。
13. （１３）前記無菌媒体は３０乃至１００％のイソプロパ
    ノールである特許請求の範囲第１１項記載の細胞・組織
    の基体への付着方法。
14. （１４）前記被覆基体は殺菌水の無血清組織培養媒体で
    異質物質を除去するため洗浄されてなる特許請求の範囲
    第９項記載の細胞・組織の基体への付着方法。
15. （１５）前記被覆基体は水又は緩衝液で異質物質を除去
    するため洗浄される特許請求の範囲第９項記載の細胞・
    組織の基体への付着方法。
16. （１６）前記成育可能細胞は結成含有媒体中の被覆基体
    に付着される特許請求の範囲第９項記載の細胞・組織の
    基体への付着方法。
17. （１７）前記成育可能細胞は無血清培地媒体中の前記被
    覆基体に付着されてなる特許請求の範囲第９項記載の細
    胞・組織の基体への付着方法。
18. （１８）前記基体は生体内の基質である特許請求の範囲
    第９項記載の細胞・組織の基体への付着方法。
19. （１９）前記基体は合成ポリマー材料、ガラス、金属及
    び微小多孔膜フィルター等のグループから選択されてな
    る特許請求の範囲第１８項記載の細胞・組織の基体への
    付着方法。
20. （２０）前記基体はポリテトラフルオロエチレンである
    特許請求の範囲第１９項記載の細胞・組織の基体への付
    着方法。
21. （２１）前記基体は試験管内の基質である特許請求の範
    囲第９項記載の細胞・組織の基体への付着方法。
22. （２２）前記基体はコラーゲン、ラミニン、ファイブロ
    ネクチン、人工の移植材料及びポリリジン等のグループ
    から選択されてなる特許請求の範囲第２１項記載の細胞
    ・組織の基体への付着方法。
23. （２３）前記基体はポリテトラフルオロエチレンである
    特許請求の範囲第２２項記載の細胞・組織の基体への付
    着方法。
24. （２４）基体と、下記反復デカペプチド単位をもつ約３
    ５乃至１００重量％を含有するポリフェノール蛋白質か
    ら成る無菌組成物の前記基体への被覆体を具え、 ▲数式、化学式、表等があります▼ 上記構造式において、Ｎは約１０乃至１００の範囲の整
    数で、各Ｘは水酸基と水素からなる基から独立して選択
    され、かつ各Ｒは水素とメチルから成る基から独立して
    選択され、更に前記被覆基質に被覆した生存性細胞と、
    前記細胞に接触する滋養媒体を具え、それによって前記
    細胞が正常な新陳代謝の細胞機能を果す細胞培養システ
    ム。
25. （２５）前記基体は試験管内の基質である特許請求の範
    囲第２４項記載の細胞培養システム。
26. （２６）前記基体は合成ポリマー材料、ガラス、金属及
    び微小多孔膜フィルター等のグループから選択されてな
    る特許請求の範囲第２５項記載の細胞培養システム。
27. （２７）前記基体はポリテトラフルオロエチレンである
    特許請求の範囲第２６項記載の細胞培養システム。
28. （２８）前記基体は生体内の基質である特許請求の範囲
    第２４項記載の細胞培養システム。
29. （２９）前記基体はコラーゲン、ラミニン、ファイブロ
    ネクチン、人工移植片及びポリリジンからなるグループ
    から選択されてなる特許請求の範囲第２８項記載の細胞
    培養システム。
30. （３０）前記基体はポリテトラフルオロエチレンである
    特許請求の範囲第２９項記載の細胞培養システム。
31. （３１）生物学的活性部の基体への付着方法において、 （イ）無血清溶液に前記生物学的活性部を分散すること
    、 （ロ）下記のデカペプチド単位をもつ約３５乃至１００
    重量％の純粋バイオ接着性ポリ フェノール蛋白質を含有するポリフェノー ル蛋白質から成る無菌組成物を混合す ること、 ▲数式、化学式、表等があります▼ 上記構造式において、Ｎは約１０乃至約 １００の範囲の整数で、各Ｘは水酸基と水 素から成る基から独立して選択され、各Ｒ は水素とメチルから成る基から独立して選 択されており、それにより生物学的活性部 の前記分散によって前記バイオ接着性ポリ フェノール蛋白質を前記生物学的活性部に 付着すること、 （ハ）その結果生成した生物学的活性部を再生すること
    、並びに （ニ）前記再生した生物学的活性部を前記基体に付着す
    ることからなる細胞・組織の基体 への付着方法。