JPH02181628A

JPH02181628A - 生物活性部分の基質への固定方法、生きた細胞の基質への固定方法および細胞培養方法

Info

Publication number: JPH02181628A
Application number: JP1181652A
Authority: JP
Inventors: Nishith Chaturvedi; ニシス　チャターベデイ; Paul T Picciano; ポール　テイ．ピッチアーノ
Original assignee: Bio Polymers Inc
Current assignee: Bio Polymers Inc
Priority date: 1988-07-13
Filing date: 1989-07-13
Publication date: 1990-07-16
Also published as: ATE102649T1; EP0350714A2; EP0350714B1; DE68913602T2; DE68913602D1; EP0350714A3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］この発明は、組織学的、免疫組織学的、または染色や検
出方法のために１組織片や組織の構成物を固定化すると
きの１合成重合物のポリアリルアミンの使用に関するも
のである。染色や検出の方法は、酸、塩基、界面活性剤
、加水分解剤およびこれらの組合わせを用いた多くの段
階を含、従来の診断や分析の染色ては、比較的長い工程
のある段階でガラススライドから、かなりの組織片や他
の資料か失われ、しばしば染色の失敗や遅延を弓き起こ
した。ポリアリルアミン用いると、多くの激しい処理を
しても、組織片のガラスへの保持効率が高まることが発
見された。

市原されている合成重合物のポリアリルアミンは、相手
がどのような基質でも、細胞を固定させる効果があり、
細胞固定促進剤として理想的なものであることが判明し
た。試験管内での応用として、研究用＃斯学、細胞生産
物の収穫、細胞代謝研究があげられる。生体での応用と
しては、要部移植、気管再生時の人工補綴物、そして特
に心臓血管の人工補綴物の表面での密着した細胞単層の
成育があげられる。

［従来技術と発明の背景］組織培養による試験管内での維持と増殖のために組織か
らの細胞の収穫は、医学と生化学研究において主な手法
である０組織培養は１人工的な栄養培地で、有機体の組
織や細胞を増殖したり、あるいはその代謝を保持する技
術や過程である。ひとたび、穏やかな組織の解離によっ
て単離された細胞は、生命機構を維持できる培地で培養
される。少数の例外を除いて、正常な代謝機能を発揮し
成育分裂するには、細胞は基質に付着する必要がある。

組織においては細胞成育に必要なもの（マトリックス）
を提供する基質は、コラーゲン、ラミニン、フィブロネ
クチンからなる。試験管内では、基質は多くの場合プラ
スチックであり、時にガラスや、細孔質のセルロース濾
紙が用いられる。

組織培養を通しての細胞利用の例としては、：（１）細
胞の代謝、細胞ないての寄生者（ウィルス、細菌など）
の代謝、異なる細胞の型（上皮細胞、＆Ｉ維芽細胞、免
疫関与細胞、胸腺細胞、血小板など）の相互代謝、細胞
代謝への外部因子の影響、細胞の遺伝的構造（試験管内
診断）の研究、（２）特異的な成分の生産、（３）皮膚
、角膜移植、脳、血管移植、試験管内授精のための再内
移植がある。

近年、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンは、動
物組織から抽出精製され、細胞固定促進剤として細胞お
よび組織培養研究者に提供されている０合成ポリー〇−
リジンとポリーＬ−リジンもそのような目的で販売され
ている。その他、ポリエチレンイミン、ゼラチン、カゼ
イン膠、溶剤から生れたアクリル膠などもガラススライ
ドへの組織片付着用に用いられてきた。最近、ウェイト
とタンザーは、海面化で波力と潮力に適応して生息して
いるムラサキガイから分泌されるいくつかの天然産の最
も強力な接着力の生物固定ポリフェノールタンパク質を
固定した。（サイエンス、ｌ９８１）そしてこのような
抽出精製された生物固定ポリフェノールタンパク質を含
有した商品が出回っている。（セルタック固定剤（登録
商標）、バイオポリマー社、ファーミン・トン、コネチ
カット州）。

まず１合成ポリー〇−リジン、ポリーＬ−リジンやポリ
エチレンイミンのような合成陽イオン物質の例外を除い
て、これらの要素は生物資源から抽出しなければならな
い０次にこれら要素は、−度溶液にすると一２０℃でお
よそ４週間の貯蔵寿命である。さらに生物起源の微量危
険物混入の可能性を避けるためには、合成重合物の使用
が望ましい。

妥当なコストで高分子物質として提供されるポリ−ロー
リジンとポリーＬ−リジンは抽出された生物固定ポリフ
ェノールタンパク質と比較すると、細胞固定にそれほど
効果的ではなかった。

ここで、ポリアリルアミンが大変有効な細胞固定剤であ
ることが発見され、事実、これは市場に現在量も出回つ
ているポリーＬ−リジンよりも優れ、生物固定ポリフェ
ノールタンパク質より易いわけではないが同程度の効力
がある。プラスチックやガラスは生物学的に不活性で、
適当な組織や細胞の固定に十分な基質固定性を持たない
ので細胞固定促進剤の必要性がある。低い固定効率の例
として、−時単離細胞、低細胞密度で供試された細胞、
そしてバイオリアクターや中空管培養での、連続フロー
システムへ供試される細胞での場合がある。さらに、い
くつかの細孔質の濾紙や血管移植に用いられるテフロン
材のような特定の基質は低い表面エネルギーのために細
胞付着を起さない。

固定促進剤は、付着問題の解決に相当有効だがまだ不都
合な点がある。まず第１に、それらの作用形態が生理的
ではあるか、本当の意味の接着性によっておらず、細胞
の物理的支持や補足をする因子に基いている点である。

第２にそれらはこれまで細胞培養に用いられてきた以外
の様々な基質（ポリスチレン、ニトロセルロースなど）
では簡単に利用できなかったり、全ての細胞の型に同じ
ように効果的に用いられるわけでも無い点である。第３
に例えば１人体の血液からのフィブロネクチンの抽出に
見られるように、特定の細胞固定促進剤について、健康
への危険の可能性が認められる点である。生体での応用
としそは、特に心臓血管に関するような人工補綴物に密
着した細胞単層へのものが望まれる。内皮細胞には、普
通そのような血管の細胞間隙を綱ぎ、心臓血管秒の患者
の扱で大きな問題である血栓症を効果的に防ぐ。

これらの細胞は、その後の傷の治癒のための基質となる
基底膜材を形成する。現在、これらの人工補綴物は、細
胞固定を促進しない基質のテフロンで作られている。他
には、テフロンへの細胞固定の媒体となる付着因子は知
られていない。

ポリアリルアミンの使用は、これらの問題を解決する。

それは水の中で様々な基質に良く付着し、恒常的に多湿
な環境でも平気である。ポリアリルアミンは多様な基質
と多様な細胞、細胞構成物、組織片の双方に迅速に付着
することが見出された。それは変質や失活することなく
、４℃で少なくとも１０力月、室温で少なくとも１力月
貯蔵可能である。更にそれは、市販されており、妥当な
価格で大証に入手できる。

それ故にこの発明は、プラスチック、ガラス、金属、細
孔質濾紙（セルロース誘導体、ナイロン、ガラス繊維、
ポリエステル、ポリカーボネート、その他合成、天然に
かかわらず、その他の合成重合物やそれを修飾した製品
）、組織や人工補綴物の移植時に用いられる合成あるい
は変性プラスチック製品（人工心臓、テフロン関連の血
管移植材料など）といった組織培養やそれ以外の材料や
基質と、細胞の固定、成育、特殊機能の固定の効率や割
合または強度を促進したり、増大する固定因子として有
効な調合材を提供することを目的とする。

この発明のもう一つの目的として、工程中に激しい処理
操作の宥る組織学用の標本の強固な固定における有効性
を示すことである。

更にこの発明の他の目的は、タンパク質、ＤＮＡ、ホル
モン、抗生物質のような他の生活活性部分の一部前記し
た様々な基質への固定の固定効率１割合、強度を促進し
増大させる固定因子として有用な調合剤を提供すること
である。

また更にこの発明の他の目的とするところは、ポリアリ
ルアミンと基質の調合や層形成、および前述の要因に照
らしたそのような層の有効性の研究に用いられる検定方
法を提供することにある。

［発明の構成］生きた細胞、組織、その他のタンパク質、ＤＮＡ、ホル
モン、抗生物質のような生物活性部分を基質に固定する
方法を提供するこの発明によつて前述のあるいはその他
の目的、長所、特色が達成されるか、それは次の過程よ
りなる。

（イ）約０．Ｏｌから１．０重量２のポリアリルアミン
からなる膜形成ポリアリルアミン混液を基質に塗布する
過程、（ロ）前記基質に良く付着していない処理剤を除去する
過程、（ハ）生きた細胞、組織、その他生物活性部分を前記基
質へ塗布し固定する過程。

ボッアリルアミンの濃度や２混液の組成は、基質の種類
や使用される特定細胞、組織、生活活性部分の固定の要
件によりて変えるこ′とができる。

生きた細胞を固定する場合は、細胞が正常な代謝機能を
行えるように栄養培地が必要である。

真核細胞の成育と正常な代謝には、基質面上に直接広か
った細胞層によって基質に付着することが必要である。

従来、細胞培養は、細胞の付着や増殖用に主にプラスチ
ックの基質を、時にはガラス、細孔質濾紙、ビーズの基
質を使用している。

ごく最近、低い移植細胞濃度、単離されたばかりの細胞
の使用、付着しにくい基質（テフロン等）での細胞培養
につきものの問題を避けるために、生理的基質（コラー
ゲン、ラミニン、フィブロネクチン）と合成ポリ−〇−
リジンおよびポリーＬ−リジンが、プラスチックに塗膜
されて、付着性向上の目的に使用されてきた０組織と細
胞生物由来または不活性の様々な基質両方に高い結合親
和性を有するために、以外にもポリアリルアミンが適し
た代替品となることか発見された。

様１な基質に強力に付着するポリアリルアミンの性質は
、これまで気質の成分や、適応性や、固定の必要な細胞
の型により問題のあった表面へ細胞を固定させて保持し
、成育させるのに都合が良い。

使用可能な基質としては、従来の細胞培養研究や、バッ
チ式細胞培養や生物工学で用いられるバイオリアクター
からの細胞生成物の収穫のためのプラスチック、ガラス
、細孔質濾紙（セルロース誘導体、ナイロン、ガラス繊
維、ポリエステル。

ポリカーボネート）、細胞生成物収穫用の中空繊維管と
ビーズ、そしてポリテトラフルオロエチレン（テフロン
）とその関連材料のような人工補綴用血管移植材料があ
る。

コレラノ表面のほとんどは全体としては負電荷を帯び、
ポリアリルアミンのような多陽イオン物質を強固に固定
する。細胞は負電荷を帯び、その結果、無処理表面から
れずかに反発しているが。

正電荷を帯びている中間のポリアリルアミンには付着す
る。ポリアリルアミンは固定の効率、割合、強度を増大
する。この最後の特性要因は、細胞生成物収穫操作や、
ｍ簡単層上の液体の通路を含む血管移植での細胞の再内
移植への応用時に重大なものである。さらに、組織から
の単離後、または細胞の壓による固定不良の細胞や、血
液細胞やけんたく組織培養細胞のように通常付着しない
細胞（リンパ組織球、血小板、白血球、赤血球など）も
この媒体を通して気質へ固定することができた。

その上、ポリアリルアミンの様々な気質への強固な付着
性によりＤＮＡ、タンパク質、ホルモン、抗生物質のよ
うな他の多くの生物活性部分の固定が可能である。基質
へのポリアリルアミンの塗布は通常法のように行なわれ
る。平方センチメートル（ｃｍ”　）当りに必要な最終
濃度によつて５約０．１から１０．ｇ／μｌの範囲のポ
リアリルアミンがＣｍ”当り約１．０から１００ＭＩ均
一に気質に塗布される。ポリアリルアミンの酸性膜形成
液をクリーンベンチ内で塗布された基質を急速に乾燥す
ることにより、Ｍか形成される。あるいは。

ポリアリルアミンはシャーレやスライド上て２０分、中
性から塩基性の溶液と反応させ、液を吸引することによ
り吸着できる。このような条件で均一なポリアリルアミ
ンの膜が表面に残る。形成された膜は水か滅菌済みの組
織培養地で洗浄し吸着しなか９た付与溶媒を除去する。

気質はすぐ用いることも、貯蔵のため乾燥させることも
できる。

膜に固定しようとする細胞や他の生物活性の部分は、望
ましい密度に調整して、血清添加または無添加培地や緩
衝液中の基質へ添加する０色々な時間間隔での細胞の固
定の場合は、細胞は固定性。

成育、機能を調べられ、処方された目的や組織培養の固
定細胞が必要な実験によりて処理される。

切片作成直後の組織片の固定の場合には、適当な切片（
パラフィン、エポキシ、凍結によるもの等）をスライド
に乗せ適切に乾燥し処理する。逆に場合によっては、ポ
リアリルアミンを生物活性部分に付着させ、生じた生活
活性部分を気質へ固定させることが可能である。

この次の方法は次の過程からなる。

（イ）生活活性部分を無血清液に分布させる、（ロ）約
０．旧から１．ｏｉａ量％のポリアリルアミンからなる
めつきんした組成液を前記生活活性部分の分散系と混合
し、それによって前記ポリアリルアミンを前記生活活性
部分に付着する、（ハ）生成された生活活性部分を回収
し。

（ニ）回収された生活活性部分を前記基質に固定する。

以下にこの発明の詳細な説明する。特に記述がない限り
全てのパーセントや割合は重量に基ずくものである。

実施例１この実施例と次の実施例では、ウェイトとタンザー（サ
イエンス、２１２巻、ベージ１０３８〜１０４０．１９
８９，５．２９）によって記述された、抽出精製された
生物固定ポリフェノールタンパク買を含有し、コネチカ
ット州ファーミントンのバイオポリマー社から市販され
ているセルタック固定剤（登録商標）が用いられる。セ
ルタック固定剤は、５％（Ｖ／Ｖ）の酢酸中に４℃で貯
蔵される。セルタック固定剤への付着性と被膜していな
い組織培養プラススチック製品、ポリアリルアミンおよ
びポリーＬ−リジン因子により被膜されたプラスチック
製品への付着力を比較するのに、３種類の哺乳動物細胞
が用いられた０足場依存性子ハムスター肝細胞（ＢＨＫ
−２１：ＡＴＣＣＣＣＬ　１０）は、１０％牛血清と１
０％トリプトース燐酸液を含んだイーグルの基本培地（
ＢＭＥ）で培養した。ヒト組織球性リンパ種細胞（ＩＪ
−９３７；ＡＴＣＣＣＲＬ　　１５９３　　）は、１０
％牛血清含有のＲＰＭＩ　　１６４０培地で培養した。

リンパ球性細胞（ＰＳＸ６３−Ａｇ８．　６５３：ＡＴ
ＣＣＣＲＬ　　１５８０　　）も、２０％の熱処理質活
性牛血清を含有する点を除けば同様の培地で培養した。

あとの２種の細胞型は足場依存性ではないのて、懸濁培
養て操作される。

すべての固定化剤は溶液塗布法によって組織プラスチッ
ク製品に被膜された。すべての実験において、マイクロ
リッター容量の１０諷ｇ／謹ｌ溶液を、１０ｃｍ”の３
５ｍｍのプラスチックシーヤシ上に最終濃度０．５　５
　ＪＬｇ／ｃｍ”になるように散布乾燥させる。空気乾
燥後シャーレをエタノール（９５％Ｖ／　ｖ　）で１回
、蒸留水で２回すすぐ。

付着力検定は３７．５℃での２０分間培養後の固定細胞
数を数えるように、計画された。ＢＨＫ細胞は平板皿か
らトリプシン化され遠心分離により新鮮培地で洗浄され
、１０％の牛血清を含有した新鮮ＲＰＭＩ　　１６４０
培地に２Ｘ　１０’細胞／　ｍ　１の密度に懸濁された
。懸濁培養されるＵ−９３７とＰ３ｘ細胞は、遠心分離
で洗浄され、同様の細胞密度に再懸濁された。懸濁培養
物は、無処理の組織培養シャーレ（対照）と固定化タン
パク質や合成重合物で処理されたシャーレにまかれた。

２０分後、３回繰返しで、試験および対照のシャーレを
無作為に選んで未固定の細胞数を計測した。

これらを穏やかに振動させてシャーレから分離して血球
計数盤で数えた。データは、まかれた全細胞数から、シ
ャーレより収穫された固定しなかった細胞数（３回の平
均）を引いて得た固定化細胞数を、まかれた全体細胞数
で割った商を１００倍してパーセン１−に計算した。

この検定の条件は、セルタック固定剤被膜シャーレにつ
いて適したものであった。これにより抽出物の性能より
も優れた重合物の被膜を観察することができた。表−１
に種々の固定化剤について得られた効率の範囲を示した
。データによれば、ポリアリルアミンとポリーＬ−リジ
ンが細胞固定の効率適な媒介物であり、ポリアリルアミ
ンがセルタックやポリーＬ−リジンよりも低い濃度で効
果的に使用可能なことを示している。

３種類の固定化剤の存在下に呻乳動物細胞の成長率か調
べられ、固定化剤による抑制効果の可能性が調べられた
。子ハムスター肝細胞（ＢＨＫ）株を１５％牛血清含有
のＭＥＭ培地で十分培養し、トリプシン化しＭＥＭ培地
中て遠心分離に数回かけ洗浄した。ＦＪ濁細胞（５ｘ１
０’細胞数／ｍ　１　）を、無処理３５ｍｍシャーレ（
対照）およびセルタック、ポリアリルアミン、ポリーＬ
−リジン（それぞれ５ｇ／ｃｍ”）処理のシャーレに１
５％牛血清含有ＭＥＭ培地とともにまいた。５％ＣＯ下
、３７．５°Ｃて培養し、種々の時間毎にシャーレを３
回繰返して回収した。固定化された細胞を表面からトリ
プシン化して洗浄し、けっきφう計数盤で計測した。

ＢＨＫ−２１細胞の成長率は、無処理対照と比較してす
べての固定化剤により影響を受けなかった。これらの固
定化剤の存在で成長率が増大も減少もしない点はｆｆ１
ｆｆである。

表−ＩＪ織固定パーセント細胞の型固定化剤ＢＨＫ−２１３Ｘ１５μｇ２５μｇ１０μｍ　１５μｍセルタックポリーＬ−リジンポリアリルアミンプラスチック２５μｇ実施例２パラフィン包埋組織を１０μｍに切り、セルタック固定
剤、ポリアリルアミン、ポリーＬ−リジンを５ＡＬｇず
つ被膜した顕微鏡用ガラススライド上に載せた。２つの
切片をそれぞれ載せた３つのスライドをポリアリルアミ
ン、セルタック固定剤用にｍａｔ、、た、１０切片がポ
リーＬ−リジン用に固定化された。４５℃のホットプレ
ート上で１時間乾燥した後、スライドをキシレンで５分
ずつ２回洗浄、９５％エタノールで３回、７０％エタノ
ールで１回、３分間の水洗を１回行なって脱ワツクス処
理をした。スライドは次表の一連の処理に供試した。

仄立旦庄鳳セルタック番°すＴツル１ミン［上社座シ　　匹里Δ １、　１００ｍ１ｌ　　ＰＢＳ、　　ｐｔｌ　　Ｂ。

１６分２）　　ＩＯａＭ　ＰＢＳ、　ｐＨ７，０，３％ｉｌｕ
化水素水、　　０．３％　　）５４）＞ｉ＋−１００２
時間３、ｉｉ水　１６分４、　　）！１７’シン／）：ＤＴＡ（０，０５％１０
．０２％）３０分、３７℃ ６、　トリプシン化３０分、３７℃ ６、流水　１５分？、０．１篤ＳＤＳ水Ｉ８液１５．６時間Ｂ、流水　２６分９、　へ”７″シン（５０００ＩＩ／ｍ１）２０分、３
７℃ １流水浸漬１６分 ε ポリアリルアミンとセルタック固定剤は、これらのすべ
ての処理を通して同様の性能だった。しかし、ポリーＬ
−リジンで固定化された切片は。

７ばんめの処理かその直前ですべて消失した。

［発明の効果］以上説明したように　、この発明は、プラスチック、ガ
ラス、金属、細孔質濾紙（セルロース誘導体、ナイロン
、ガラス繊維、ポリエステル、ポリカーボネート、その
他合成、天然にかかわらずその他の合成重合物やそれを
修飾した製品）、組織や人工補綴物の移植時に用いられ
る合成あるいは変性プラスチック製品（人工石＋ｔａ、
テフロン関連の血管移植材料など）といった組織培養や
それ以外の材料や基質と、細胞の固定、成育、特殊機箋
の固定の効率や割合または強度を促進し増大する。また
、工程中に激しい処理操作の有る組織学用の標本の強固
な固定において有効性である。更にまた。この発明よれ
ば、タンパク質、ＤＮＡ、ホルモン、抗生物質のような
他の生活活性部分の一部前記した様々な基質への固定の
固定効率、割合、強度を促進し増大させる固定因子とし
て有用な調合剤を実現し得る。

また更にこの発明によれば、ポリアリルアミンと基質の
調合や層形成、および前述の要因に照らしたそのような
層の有効性の研究に用いられる検定方法を実現し得る。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次の過程からなる生物活性部分の基質への固定方
法。イ、約０．０１ないし１．０重量％のポリアリルアミン
からなる膜形成ポリアリルアミン混液を基質へ塗布する
過程、ロ、前記基質に強固に付着していない処理剤を除去する
過程、ハ、生物活性部分を前記基質に塗布し、生物活性部分を
前記基質に固定する過程。
（２）特許請求の範囲第１項において、基質の表面ｃｍ
＾２当り、約０．１から１０μｇ／μｌのポリアリルア
ミンを有する約１．０から１００μｌの前記膜形成混液
を前記基質へ塗布することを特徴とする生物活性部分の
基質への固定方法。
（３）特許請求の範囲第１項において、前記膜形成混液
は酸性であり、前記基質に強固に付着していない部分が
、前記基質から蒸発されることを特徴とする生物活性部
分の基質への固定方法。
（４）特許請求の範囲第１項において、前記膜形成混液
は中性か塩基性で、一定の処理時間後、前記基質に強固
に付着していない部分が吸引により除去されることを特
徴とする生物活性部分の基質への固定方法。
（５）特許請求の範囲第１項において、前記膜形成混液
は滅菌済みであることを特徴とする生物活性部分の基質
への固定方法。
（６）特許請求の範囲第１項において、付加溶媒を除去
するために前記基質は水や緩衝液ですすがれることを特
徴とする生物活性部分の基質への固定方法。
（７）特許請求の範囲第１項において、前記基質は合成
重合物、ガラス、金属、細孔質濾紙の中から選択したこ
とを特徴とする生物活性部分の基質への固定方法。
（８）特許請求の範囲第１項において、前記基質はポリ
テトラフルオロエチレンであることを特徴とする生物活
性部分の基質への固定方法。
（９）特許請求の範囲第１項において、生活活性部分は
、組織片、細胞、細胞構成体、血清其他の体液構成物の
中から選択されることを特徴とする生物活性部分の基質
への固定方法。
（１０）次の過程からなる生きた細胞の基質への固定方
法。イ、約０．０１から１．０重量％のポリアリルアミンか
らなる膜形成ポリアリルアミン混液を基質へ塗布する過
程、ロ、前記基質に強固に付着していない処理剤を除去する
過程、ハ、生きた細胞を前記基質に塗布し、これを基質に固定
して栄養液の存在のもとに正常な代謝機能を発揮させる
過程。
（１１）特許請求の範囲第１０項において、基質の表面
ｃｍ＾２当り、約０．１から１０μｇ／μｌのポリアリ
ルアミンを有する約１．０から１００μｌの前記膜形成
混液を前記基質へ塗布することを特徴とする生きた細胞
の基質への固定方法。
（１２）特許請求の範囲第１０項において、前記基質に
強固に付着していない部分が、前記基質から蒸発される
ことを特徴とする生きた細胞の基質への固定方法。
（１３）特許請求の範囲第１０項において、前記膜形成
混液は中性か塩基性で、一定の処理時間後、前記基質に
強固に付着していない部分が吸引により除去されること
を特徴とする生きた細胞の基質への固定方法。
（１４）特許請求の範囲第１０項において、前記膜形成
混液は滅菌済みであることを特徴とする生きた細胞の基
質への固定方法。
（１５）特許請求の範囲第１０項において、外来溶媒を
除去するために、前記基質は無菌無血清組織培養培地で
そそがれることを特徴とする生きた細胞の基質への固定
方法。
（１６）特許請求の範囲第１０項において、付加溶媒を
除去するために前記基質は水や緩衝液ですすがれること
を特徴とする生きた細胞の基質への固定方法。
（１７）特許請求の範囲第１０項において、生きた細胞
が血清含有培地中で前記基質へ塗布されることを特徴と
する生きた細胞の基質への固定方法。
（１８）特許請求の範囲第１０項において、生きた細胞
が無血清培地中で前記基質へ塗布されることを特徴とす
る生きた細胞の基質への固定方法。
（１９）特許請求の範囲第１０項において、前記基質は
試験管内基質であることを特徴とする生きた細胞の基質
への固定方法。
（２０）特許請求の範囲第１９項において、前記基質は
合成重合物、ガラス、金属、細孔質濾紙の中から選択し
たことを特徴とする生きた細胞の基質への固定方法。
（２１）特許請求の範囲第２０項において、前記基質は
ポリテトラフルオロエチレンであることを特徴とする生
きた細胞の基質への固定方法。
（２２）特許請求の範囲第１０項において、前記基質は
試験管内基質であることを特徴とする生きた細胞の基質
への固定方法。
（２３）特許請求の範囲第２２項において、前記基質は
コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、人口補綴植
材、ポリリジンの中から選択されることを特徴とする生
きた細胞の基質への固定方法。
（２４）特許請求の範囲第２３項において、前記基質は
ポリテトラフルオロエチレンであることを特徴とする生
きた細胞の基質への固定方法。
（２５）基質、基質上膜形成ポリアリルアミン、被膜基
質固定化された生きた細胞、細胞が正常な代謝機能を発
揮する細胞接触の栄養液、からなる細胞培養方法。
（２６）特許請求の範囲第２５項において、前記基質は
試験管内基質であることを特徴とする細胞培養方法。
（２７）特許請求の範囲第２６項において、前記基質は
合成重合物、ガラス、金属、細孔質濾紙の中から選択し
たことを特徴とする細胞培養方法。
（２８）特許請求の範囲第２７項において、前記基質は
ポリテトラフルオロエチレンであることを特徴とする細
胞培養方法。
（２９）特許請求の範囲第２５項において、前記基質は
試験管内基質であることを特徴とする細胞培養方法。
（３０）特許請求の範囲第２５項において、前記基質は
コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、人工補綴植
材、ポリリジンの中から選択されることを特徴とする細
胞培養方法。
（３１）次の過程からなる生物活性部分の基質への固定
方法。イ、無血清溶液に生物活性部分を分散する過程、ロ、約
０．０１から１．０重量％のポリアリルアミン含有の混
液を前記生物活性部分と混合し、ポリアリルアミンを生
物活性部分に付着させる過程ハ、生成された生物活性部分を回収する過程、ニ、回収
された前記生物活性部分を前記基質へ固定する過程。