JPS63264069A - 細胞接着性材料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は医療分野において用いられる新規な細胞接着性
材料に関するものである。さらに詳しくいえば、本発明
は、医療用接着剤、人口臓器、細胞分離材、組織培養用
人工基質などの医用材料に有用な、細胞接着活性および
生体適合性などに優れた細胞接着性材料に関するもので
ある。

［従来の技術］ 近年、医療技術の進展に伴い、たとえば手術における医
療用接着剤、各種人工臓器、細胞分離材、あるいは組織
培養用人工基質など医用材料に有用な、生体適合性を有
する細胞接着性材料が注目されている。

こあような用途に用いられる細胞接着性材料としては、
正常組織との接着性が適当で、かつ組繊細胞の機能低下
をもたらすことがなく、場合によっては細胞の増殖や活
性化も行いうるものが要求され、さらに、生体適合性に
優れるとともに、生体に対して安全であることも要求さ
れる。

他方、生体組織の修複や生体防御作用を有するフィブロ
ネクチンが細胞接着に有用であることが知られている。

このフィブロネクチンは正常繊維芽細胞や内皮細胞の表
面、腸管上皮細胞の基底膜面、そのほか種々の細胞同士
の接着面に存在する糖タンパク質で、分子量２３５．０
００のＡ鎖と２３０．０００のＢ鎖の末端がジスルフィ
ド結合したヘテロダイマーを最小単位とするものであり
、この構造単位の中でアルギニン−グリシン−アスパラ
ギン酸の配列部分が細胞接着活性を示すことが明らかに
されている。

このように、フィブロネクチンにおいては、その細胞接
着活性を示す部分はごく一部であるので、このものを従
来から行われている吸着法により、高分子材料などの人
工基質に固定化する場合、細胞接着活性に関与していな
い部分が該基質表面に広く覆うため、十分な接着活性が
得られないという欠点がある。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明は、このようなフィブロネクチンが有する欠点を
克服し、医用材料に有用な、細胞接着活性に優れるとと
もに、生体適合性にも優れた細胞接着材料を提供するこ
とを目的としてなされたものである。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは前記の優れた特性を有する細胞接着性材料
を開発するために鋭意研究を重ねた結果、フィブロネク
チンの細胞接着活性がアルギニン−グリシン−アスパラ
ギン酸の配列部分にあることに着目し、該配列のトリペ
プチド単位を有するオリゴペプチドまたはポリペプチド
を、高分子基質に導入した官能基に結合させることによ
り、その目的を達成しうろことを見い出し、この知見に
基づいて本発明を完成するに至った。すなわち、本発明
は、高分子基質に導入した官能基に、少なくともアルギ
ニン−グリシン−アスパラギン酸の配列のトリペプチド
単位を有するオリゴペプチドまたはポリペプチドを結合
させてなる細胞接着性材料を提供するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明材料において用いられる高分子基質としては、た
とえばシリコーンラバー、ポリウレタン、ポリ塩化ビニ
ル、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリイミド、ポリ
エステル、セルロースなどが好ましく挙げられる。

本発明においては、これらの高分子基質に該オリゴペプ
チドまたはポリペプチドを固定するために、前記高分子
基質に官能基を導入し、この官能基に該オリゴペプチド
またはポリペプチドを結合させる方法が用いられる。高
分子基質に導入する官能基については、該オリゴペプチ
ドまたはポリペプチド中の官能基に対して反応性を有す
るものであればよく、特に制限はないが、通常アミノ基
、水酸基、カルボキシル基、エポキシ基などが好ましい
官能基として導入される。

これらの官能基を前記高分子基質に導入する方法につい
ては特に制限はなく、通常慣用されている方法を用いる
ことができる。この官能基を導入する方法について、シ
リコーンラバーにアミン基を導入する場合を例に挙げて
説明すると、たとえばアミノアルキル基を含有するポリ
ジメチルシロキサン中に、所望の大きさのシリコーンラ
バーのフィルムを浸せきすることにより、該フィルムの
表面にアミノ基を容易に付与することができる。

このように、高分子基質にアミン基を導入する場合には
、必要に応じ、官能基の含有割合が大きな化合物、たと
えばポリアリルアミンなどを、酸化合物を介して高分子
基質に導入したアミノ基と結合させることにより、該基
質上の官能基の密度が高められ、オリゴペプチドやポリ
ペプチドを高密度４’ｍＪ分子基質に導入することがで
きる。

４一 本発明材料においては、前記のようにして高分子基質に
導入された官能基に、フィブロネクチンの細胞接着活性
部分と同じアミノ酸配列単位を有するオリゴペプチドま
たはポリペプチドが結合される。

このオリゴペプチドまたはポリペプチドは、アルギニン
（＾ｒＩ？）−グリシン（Ｇｌｙ）−アスパラギン酸（
＾ｓｐ）の配列のトリペプチド単位を必須単位として有
するものであり、このようなものとしては、たとえば＾
ｒｇ−Ｇｌｙ−八Ｓｐからなるへリペプチド、＾ｒｇ−
Ｇ１ｙ−八ｓｐ−セリン（Ｓｅｒ）、Δｒｇ−Ｇｌｙ−
八ｓｐ−バリンへＶａ　ｌ　）、＾ｒｇ−Ｇｌｙ−＾Ｓ
ｐ−スレオニン（Ｔｈｒ）、へｒｇ４１ｙ−＾ｓｐ−ア
ラニン（＾Ｉｎ）などのテトラペプチド、あるいはこれ
らのシーケンスを鎖中または末端に有するポリペプチド
などを挙げることができる。本発明材料においては、こ
れらのペプチドを１種結合させてもよいし、２種以上を
組み合わせて結合させてもよい。

これらのオリゴペプチドやポリペプチドの製造方法につ
いては特に制限はなく、従来ペプチド合成において慣用
されている方法の中がら任意の方法を選択して用いるこ
とができる。このペプチド合成においては、各アミノ酸
をアミド結合により、１個ずつ順次結合させていっても
よいし、あるいはまず複数個のペプチドを製造し、これ
らを結合してポリペプチドを製造してもよく、また、液
相法、固相法のいずれを用いてもよい。

前記のオリゴペプチドやポリペプチドに用いられるアミ
ノ酸は、グリシンを除いていずれも光学活性を有し、Ｌ
体、０体、ＤＬ体（ラセミ体）があり、本発明において
はいずれも使用することができるが、細胞タンパクが通
常Ｌ−アミノ酸配列であることから、Ｌ−アミノ酸を用
いることが好ましい。

このようにして得られたオリゴペプチドまたはポリペプ
チドは、官能基として少なくともアミン基およびカルボ
キシル基を有しており、またペプチドの種類によ、って
は、さらに水酸基、メルカプト基を有することもある。

これらの官能基と前記の高分子基質に導入された官能基
とを反応させることにより、該オリゴペプチドまたはポ
リペプチドが高分子基質に固定され、本発明の細胞接着
性材料が得られる。

前記オリゴペプチドまたはポリペプチドを高分子基質に
導入された官能基に結合させる方法としでは、たとえば
縮合剤を含む適当な有機溶媒または水性媒体中に、該ペ
プチドを適当な濃度に溶解し、この溶液中に、官能基が
導入された高分子基質を浸せきし、適当な温度で所要時
間反応させる方法を用いることができる。

有機溶媒としては、たとえば塩化メチレン、ク　　　　
−ロロホルム、ジオキサン、ジメチルホルムアミドなど
が用いられ、またこの際使用される縮合剤としては、た
とえばＮ、Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド、Ｎ
、Ｎ’−カルボニルジイミダゾール、Ｎ−アセチルイミ
ダゾールなどが挙げられる。

一方、水性媒体としては、水または水と低級アルコール
との混合物などが用いられ、この際使用される縮合剤と
しては、たとえば水溶性の１−エチル−３（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミドなどが挙げられる。

このようにして、高分子基質に導入された官能基に、少
なくともＡｒｙ−Ｇｌｙ−八ｓｐの配列のトリペプチド
単位を有するオリゴペプチドまたはポリペプチドを結合
させてなる本発明の細胞接着性材料が得られる。

［発明の効果］ 本発明の細胞接着性材料は、高分子基質に、フィブロネ
クチンの細胞接着活性部分と同じアミノ酸配列単位を有
するオリゴペプチドまたはポリペプチドを固定したもの
であって、従来のフィブロネクチンを高分子基質に固定
したものに比べて、細胞接着活性部分を高密度に有して
いるため、細胞接着性に優れており、また、この材料は
生体適合性や生体に対する安全性にも優れている。

このように、本発明の細胞接着性材料は優れた特性を有
することから、たとえば医療用接着剤、人工臓器、細胞
分離材、組織培養用人工基質などの医用材料に好適に用
いることができる。

［実施例］ 次に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本
発明はこれらの例によってなんら限定されるものではな
い。

（実施例１） （１）宮　　基　　　への　、基の寸 高分子基質としてシリコーンラバーを用い、その５１ｆ
ｆＩＩ四方のフィルム片を、アミノアルキル基を含有す
るポリジメチルシロキサン（分子量７６００）中に室温
で１時間浸せきして、該フィルム片の表面にアミノ基を
付与した。次いで該フィルム片を取出して蒸留水、ジメ
チルホルムアミドで順次洗浄したのち、結合剤のシュウ
酸と触媒の１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミドを含有する水溶液中に浸せきし、０
℃で１２時間放置後、該フィルム片を取出した。次に、
このフィルム片を、分子量６０，０００のポリアリルア
ミンの１０重量％濃度の水溶液中に浸せきし、０℃で１
２時間放置後、水洗した。これにより、フィルム片に付
与されたアミノ基に、シュウ酸を介してポリアリルアミ
ンのアミン基が結合した構造のものが得られた。

このようにして得られたフィルム片の表面のアミン基を
次の手順により定量した。すなわち、０゜０１モル濃度
のピクリン酸水溶液中に、該フィルム片を浸せきして、
ピクリン酸塩を形成したたのち、水洗した。次いでこれ
を３０重量％濃度のトリエチルアミン水溶液中に浸せき
して、ピクリン酸塩を遊離させ、この溶液を分光光度計
により比色定量した。この結果、アミノ基の数は７．１
３Ｘ　１０−’モル／ｃ１１２であった。

（２）　　リゴベプ　ドの　ム オリゴペプチドとして、Ｌ−アルギニン−グリシン−Ｌ
−アスパラギン酸−Ｌ−セリンの配列からなるテトラペ
プチド（ペプチド研究断裂）を用い、これを触媒の１−
エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミドの１０重量％濃度の水溶液中に、該テトラペプチド
濃度が１０ｗｇ／ｘｉになるように溶解した。この溶液
中に、前記（１）で得られた表面処理フィルム片を浸せ
きし、０℃において１２時間反応させ、細胞接着性材料
を作製した。このもののテトラペプチドの導入量は、赤
外線吸収スペクトル分析により定量した。

その結果を第１表に示す。

（３）細胞接着性の評価 前記（２）で得られたテトラペプチドを結合したフィル
ム片を、！＋（：ｒで標識したマウスの線維芽細胞を含
む含ウシ胎児血清（Ｅａｇｌｅ　ＭＥＮ培地）中に浸せ
きして、３７℃において１時間インキュベートした。次
いで、このフィルム片をリン系の緩衝液に１０秒間浸せ
きして、接着しなかった細胞を除去した。接着した細胞
の数は、γ線量を測定することにより求めた。その結果
を第１表に示す。

（実施例２．３） 実施例１の（２）におけるテトラペプチドの濃度を０．
１ｘｇ／ｚβ（実施例２）、０．０１ｚｇ＃＋４（実施
例３）に代えた以外は、実施例１と同様にして、細胞接
着性材料を作製し、細胞接着性を評価した。

その結果を第１表に示す。

（比較例１） 実施例１の（１）で得られたアミン基の付与されたフィ
ルム片に、オリゴペプチドを結合させることなく、細胞
接着性を評価した。

その結果を第１表に示す。

（実施例４） 実施例１の（１）における分子量６０，０００のポリア
リルアミンの代りに、分子量１０，０００のポリアリル
アミンを用いた以外は、実施例１と同様にして、細胞接
着性材料を作製し、細胞接着性を評価した。

その結果を第１表に示す。

（比較例２） オリゴペプチドに代えて、ウシ・アキレス健コラーゲン
（Ｔｙｐｅ　Ｉ　）を用い、これをリン系緩衝液中に懸
濁させ、この懸濁液中に表面処理を施していないシリコ
ーンラバーのフィルム片を浸せきし、このものの細胞接
着性を評価した。

その結果を第１表に示す。

（比較例３） オリゴペプチドに代えて、フィブロネクチン（血６２８
９型）を用い、これをリン系緩衝液中に懸濁させ、この
懸濁液中に、表面処理を施してないシリコーンラバ−９
５フイルム片を浸せきし、このものの細胞接着性を評価
した。

その結果を第１表に示す。

（以下、余白）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）高分子基質に導入した官能基に、少なくともアル
   ギニン−グリシン−アスパラギン酸の配列のトリペプチ
   ド単位を有するオリゴペプチドまたはポリペプチドを結
   合させてなる細胞接着性材料。