JPH03500046A

JPH03500046A - フィブロネクチン活性を有するポリペプチド

Info

Publication number: JPH03500046A
Application number: JP63507449A
Authority: JP
Inventors: フルヒト、レオ・ティー; マッカーシー、ジェイムズ・ビー
Original assignee: リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・ミネソタ
Priority date: 1987-08-25
Filing date: 1988-08-24
Publication date: 1991-01-10
Anticipated expiration: 2012-12-17
Also published as: EP0366728A1; WO1989001942A1; US5019646A; AU605637B2; AU2385988A; EP0366728B1; DE3880139D1; DE3880139T2; JP2690767B2; CA1305084C

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】フィブロネクチン活性を有するポリペプチド関連出願に関する相互参照この出願は、１９８７年８月２５日付けのアメリカ合衆国特許出願第８９０７３号の一部継続出願である。

助成に関する情報この発明は、ナショナル・インスティテユート・オブ・ヘルスからの給費番号ＣＡ２１４６３の助成を受けて為され１こ。政府は、この発明においである種の権利を有する。

発明の背景は乳類細胞の細胞外マトリックスへの接着は、成長、接着、運動性および適切な細胞表現型の発生の調節において基本的に重要である。このことは、正常な発達、傷の治癒、慢性炎症性疾患および腫よう転移と密接な関係を有する。過去数年間にわたって蓄積された証拠は、正常細胞および形質転換細胞の両方の接着に関する分子的基礎が複雑であり、恐らく幾つかの独特な細胞表面分子が含まれ得ることを示唆している。細胞外マトリックスは、３タイプの巨大分子、すなわちコラーゲン、プロテオグリカンおよび非コラーゲン糖蛋白質により構成される。細胞接着に関して最も熱心に研究されてきに細胞外マトリックス分子は、血しょう、細胞マトリックス、基底板および細胞表面に存在する非コラーゲン細胞接着糖蛋白質のフィブロネクチンである。フィブロネクチンの血しょう形態は、４５００００ダルトンの分子量を有するジスルフィド結合した２量体により構成される。各々約２２００００ダルトンである２種のサブユニット鎖（７Ａｌおよび「Ｂ」）は、還元条件下で観察される。以後、フィブロネクチンのこの形態を「フィブロネクチン」と称する。

細胞外マトリックスの他の成分の場合と同様に、フィブロネクチンは、それ自体分子上の独立した領域を介して他のマトリックス成分および細胞表面へ結合する能力を有する。例えばフィブロネクチンは、懸濁した細胞のコラーゲンへの結合を促進する。（Ｌ、Ｔ、ファークト、「モダン・セル・バイオロジー」、Ｂ、サティア編、アラン・アール・リス、インコーホレイテッド、二ニーヨーク、第１巻（１９８３年）、５３−１１７頁参照）。フィブロネクチン内の一接着配列の一次構造は、初めはモノクローナル抗体データおよび直接配列分析を用いてＭ、Ｄ、ピエルシュバッヒエル等により導き出された。

この配列は、アルギニル−グリシル−アスパルチル−セリン（ＲＧＤＳ）から成るテトラペプチドであることが見出された［Ｍ、Ｄ、ピエルシエバツヒエルおよびＥ、ルオスラーテイ、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ、ニー・ニス・ニー」、１上、５９８５（１９８４）］。ＲＧＤＳ配列を含むペプチドは、ある種の細胞タイプの接着を直接促進し得、高レベルの可溶性ＲＧＤＳは、無傷フィブロネクチンへの細胞接着を部分的に崩壊させる。フィブロネクチンにおけるＲＧＤＳ配列への細胞接着は、「インテグリン」と称する細胞表面糖蛋白質複合体とこの配列との相互作用により行なわれると信じられている。

フィブロネクチン介在細胞接着におけるＲＧＤＳ／インテグリン複合体は重要であるが、幾つかの明白な情報は、このプロセスにおける追加的細胞レセプターおよび異なるフィブロネクチン決定基の関与を指摘している。多くの細胞タイプは、無傷フィブロネクチン上に焦点状接着を形成する。これらの構造は、原形質膜および基質間における近接した状態の領域を表す。これらの部位はまた、アクチンに富む緊張線維の挿入点を表し、幾つかのアクチン関連細胞骨格蛋白質を含むことが示された。焦点状接着部位はまた、インテグリン、ヘパリンスルフェート、コンドロイチン・スルフェートまたは他のプロテオグリカンおよびガングリオシドを含む、細胞接着に関与する幾つかの種類の細胞表面分子を含む。

フィブロネクチンに関する多重レセプターの作用は、接着プラーク形成に関係している。ＲＧＤＳ含有フラグメントまたはヘパリン結合性接着促進性リガンド（例、血小板因子４またはフィブロネクチンのヘパリン結合フラグメント）の一方へ接着する細胞は、密な接点しか形成しない。反対に、ＲＧＤＳ含有フラグメントおよびヘパリン結合リガンドの両方に接着する細胞は、充分発達した焦点状接着を示す。さらに、フィブロネクチンのヘパリン結合フラグメントに対する抗体は、焦点状接着形成を阻止するが、無傷フィブロネクチンにおける細胞接着レベルを徹底的に阻害することは無い。集約すると、これらの結果は、正常および悪性細胞接着の促進並びに細胞の表現型発現の調節におけるフィブロネクチンのヘパリン結合領域（複数も可）の役割を支持している。

最近Ｊ、Ｂ、マツカーシー等は、「ジャーナル・オブ・セル・パイ性機構により転移性メラノーマ細胞の接着および拡大を促進するフィブロネクチンの３３ｋＤカルボキシル末端ヘパリン結合フラグメントを同定する結果を発表した。このフラグメントはフィブロネクチン分子のＡ鎖から始まる。それはヘパリンスルフェート・プロテオグリカンと結合し、またニューロンの接着およびこれらの細胞による神経突起の伸長を促進する。

従って、その広範な生物学的活性に関与するこのフラグメント内のペプチドのサブセットの単離および特性検定が要望される。それらの低分子量オリゴペプチドは、３３ｋＤフラグメントよりも容易に入手可能であり、かつ狭い生物学的活性プロフィールを呈するたぬ、治療まＬは診断薬としてのそれらの潜在的宵用性の高まることが予想される。

発明の簡単な記載この発明は、フィブロネクチンのＡ鎖に位置する３３ｋＤカルポリペプチドを提供する。慣用的固相ペプチド合成により実質的に純粋形で製造され得るこれらのポリペプチドのうちの２種は、式％式％を有する。ポリペプチドＩは形式上単離されｆニフィブロネクチン残基１９０６ −１９２４を表し、ポリペプチド■は形式上単離されたフィブロネクチン残基１９４６−１９６３を表す。これらのポリペプチドに関する一文字アミノ酸コードは、各々ＹＥＫＰＣ；５ＰＰＲＥＶＶＰＲＰＲＰＧＶおよびＫＮＮＱＫＳＥＰＬＩＧＲＫＫＴＤＥしてある。

ペプチドＩはフィブロネクチンの全アイソ形態（ｉｓｏｆｏｒｍ）で存在する。

これと異なって、ペプチドＨの最初の１５残基は全アイソ形態で存在するが、ペプチド■における最後の３残基は、フィブロネクチンにおいである種のアイソ形態（Ａ鎖と称す）でのみ生じる構造上不均一な領域の一部である。血しょうフィブロネクチンの場合、タイプｍｃｓと称する構造上不均一なこの領域は８９以下の残基風であり得る。３３ｋＤヘパリン結合フラグメントはＡ鎖から生じ、このタイプｍｃｓ配列の一部を含む。

最近、ハンフリーズ等は、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、主車２．６８８６−６８９２（１９８７）において、フィブロネクチンのタイプＵｌｃｓ結合セグメントが細胞接着促進活性を有することを報告した。ハンフリーズ等は、全タイプｌｌＩｃ５配列を表す部分的重複ペプチドを構築し、線維芽細胞およびメラノーマ細胞の接着および拡大を促進する能力についてこれらのペプチドを試験した。これらの試験の結果は、このタイプＩｄｌｅｓ結合配列の最初の２４残基がメラノーマ細胞の接着および拡大を促進することを示した。

Ｃ９Ｉと称する生物学的活性ペプチドの配列は、ａｓｐ−ｇｌｕ　−ｌｅａ　− ｐｒｏ　−ｇｌｎ　−１ｅｕ　−ｖａｌ　−ｔｈｒ　−１ｅｕ　−ｐｒｏ　−ｈｉｓ　−ｐｒｏ　−ａｓｎ　−１ｅｕ　−ｈｉｓ　−ｇｌｙ　−ｐｒｏ　−ｇｌｕ　−ｉｌｅ　−１ｅｕ　−ａｓｐ　−ｖａｌ　−ｐｒｏ　−ｓｅｒ　−ｔｈｒ（ＤＥ　Ｌ　Ｐ　Ｑ　Ｌ　Ｖ　Ｔ　Ｌ　Ｐ　ＨＰ　Ｎ　Ｌ　ＨＧ　Ｐ　Ｅ　Ｉ　Ｌ　Ｄ　Ｖ　Ｐ　Ｓ　Ｔ　）テアリ、残基１９６１−１９８５に対応する。すなわち部分的重複は、ペプチドＨの最後の３残基およびハンフリーズ等により報告されたＣ５■ペプチドの最初の３残基間に存在する。しかしながら、ハンフリーズ等Ｉこより報告されたペプチドは、ペプチドＩまたは■とは化学的に異なる。

ＣＳ　Ｉは疎水性が高く、リジンまたはアルギニン残基を完全に欠く。各ペプチドの重要な化学的特性を下記第１表に要約する。

第１表ペプチド　残基番号　バイトロバシー指数　正味電荷１　１９０６−１９２４　 −２４．３　＋２Ｕ　１９４６−１９８３　−３２．５　＋　２ＣＳ　Ｉ　１９６１−１９８５　−　９．９　−４「バイトロバシー指数」は、カイトおよびトウーリトル、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー」、１５７．１０５−１３２（１９Ｂ２）の方法に従い計算される。この方法によると、値が（ −）で大きい数のとき、親水性も高い。すなわち、ＣＳ　Ｉペプチドは、ペプチドＩおよび■よりも疎水性がかなり高い。

各ペプチドの正味電荷は、（＋１）ｉＪ荷を各リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）残基に割り当て、（−１）電荷を各グルタミン酸（Ｅ）およびアスパラギン酸（Ｄ）残基に割り当てることにより計算される。追加の残基は非荷電状態であるとみなす。これらの電荷は、はぼ中性（ｐＨ６、８〜７．４）で行なわれる、ヘパリン結合および細胞接着検定の条件下で予想される。電荷合計に顕著に影響し得る唯一の他の残基はヒスチジン（Ｈ）であり、ＣＳ　Ｉペプチドでは２回見出されるが、使用された検定のｐＨ条件下では非荷電状態である。

Ｃ５Ｉおよびペプチド■間の化学的特性は相異するが、ペプチドＨの生物学的活性がペプチドＣＳ　Ｉとの３残基部分的重複（残基＝１９６１−１９６３、ＤＥＬ）に関係しているか否かを測定するために実験を行っに。すなわち、ポリペプチド■の最初の１５アミノ酸残基を含むポリペプチドを合成した。このポリペプチドの式（■ａ）を下記に示す。

ｌｙｓ　−ａｓｎ　−ａｓｎ　−ｇｉｎ　−１ｙｓ　−ｓｅｒ　−ｇｌｕ　−ｐｒｏ　−１ｅｕ　−ｉ　ｌｅ　−ｇｌｙ−ａｒｇ　−１ｙｓ　−１ｙｓ　−ｔｈｒ　（ＩＩ　ａ）このポリペプチドの一文字アミノ酸コードはＫＮＮＱＫＳＥＰＬＩＧＲＫＫＴであり、残基１９４６−１９６０に対応する。このペプチドは、ａ）合計正味電荷が（＋４）であり、合計バイトロバシー指数が−２９，３である点でペプチドＩとは異なる。

１１ａは濃度依存方式でヘパリンと結合するが、ペプチドＣＳ　Ｉはいかなる試験濃度でもヘパリンと結合し得ないことが見出された。

従って、各ペプチドの生物学的活性は、別個で特有の構造決定基に因るものである。

この発明はまた、ポリペプチドＬ　ＩＩおよびＩｌａの生物学的活性ペプチド・フラグメントに関するものである。例えば、この発明はまた、ペプチド■のアミノ末端３基（Ｉｌａ−Ａ）、中央部３基（Ｉ［ａ−Ｂ）およびカルボキシル末端３基（ａ−Ｃ）配列に対応する３種のポリペプチドを提供する。具体的には、これらのペプチドは下記第２表に示された配列を有する。

第２表名称　主な配列　正味電荷 ■（アミノ’）　ＫＮＮＱＫＳＥＰ　＋　１（Ｉｆ　ａ　−Ａ）　（ｌｙｓ−ａｓｎ−ａｓｎ−ｇｌｎ−１ｙｓ−ｓｅｒ−ｇｌ　ｕ−ｐｒｏ） ■（中央部）　ＫＳＥＰＬＩＧＲ＋ｌ（ＩＩ　ａ　−Ｂ　）　（ｌｙｓ−ｓｅｒ−ｇｌｕ−ｐｒｏ−１ｅｕ−ｉｌｅ− ｇｌｙ−ａｒｇ） ■（カルボキシル）　ＬＩＧＲＫＫＴ　＋３（ｎ　ａ　−Ｃ）　（ｌｅｕ−ｉｌｅ−ｇｌｙ−ａｒｇ−１ｙｓ−１ｙｓ−ｔｈｒ）この発明はまた、同じくフィブロネクチンのＡ鎖に位置する３３ｋＤカルボキシル末端ヘパリン結合領域のフラグメントを表す追加的生物活性ポリペプチドを提供する。これらのポリペプチド■、■および■は、構造上互いにおよびペプチドＩおよびＩｌａとは区別されるが、それらは、下記第３表に要約されているある種の化学特性を共有する。

第３表１１１１　ＹＲＶＲＶＴＰＫＥＫＴＧＰＭＫＥ　１７２１−１７３６　−２３　、７　＋３（ｔｙｒ−ａｒｇ−ｖａｌ−ａｒｇ− ｖａｌ−ｔｈｒ−ｐｒｏ−１ｙｓ− ｇｌｕ−１ｙｓ−ｔｈｒ−ｇｌｙ− ｐｒｏ−ｍｅｔ−１ｙｓ−ｇｌｕ）ＩＶ　５ＰＰＲＲＡＲＶＴ　１７８４−１７９２　−１２　、２　＋　３（ｓｅｔ−ｐｒｏ−ｐｒｏ−ａｒｇ− ａｒｇ−ａｌａ−ａｒｇ−ｖａｌ− ｔｈｒ）Ｖ　ＶＱＰＰＲＡＲｌ　１８９２−１８９９−１０．８　＋２（ｔｒｐ−ｇｌｎ −ｐｒｏ−ｐｒｏ− ａｒｇ−ａｌａ−ａｒｇ−ｉｌｅ）各ペプチドは異なる塩基性残基からその電荷を誘導しているが、各ペプチドは同じ正味電荷を有する。ペプチド■は、２つのアルギニン（Ｒ）残基および３つのリジン（Ｋ）残基を含む。ペプチド■およびＶはアルギニン残基のみを含む。さらに、電荷はペプチド■およびＶでは集中しているが、ペプチド■における陽性電荷はさらに分散している。ペプチドｍ内の電荷の分散は、現在までにこの領域から同定された他の４種のヘパリン結合ペプチドの場合とは異なっている。ペプチド■の親水性は、ペプチド■または■の場合よりも高いが、ペプチドＩまたは ■の場合よりも低い。

これらの合成ポリペプチドを生物活性について検定し几結果、次の特性のうち少なくとも１つを呈することが見出され１こ。すなわち、それらは、（ａ）神経突起の伸長を促進、（ｂ）内皮細胞の接着および拡大を促進、（ｃ）メラノーマ細胞の接着および拡大を促進、および／または（ｄ）合成基質へのヘパリンの結合を促進する。従って、これらのポリペプチドは、（ａ）神経再生における補助、（ｂ）創傷治疹および移植体受容の促進、（ｃ）培養基質への細胞結合の促進、（ｄ）悪性細胞の転移阻止、および／または（ｅ）ヘパリン療法中にインビボで生じ得る状態である、過剰ヘパリンの結合に有用であり得るものと考えられる。

これらのポリペプチドが呈する生物活性の範囲は異なるため、それらの混合物もまたこの発明の範囲内に含まれる。

さらに、後続してインビトロまＬはインビボでポリペプチド１１■、Ｕａおよび ■−■を消化／加水分解すると、実質的に均等な生物活性を有するフラグメントが得られると予想されるため、それらの低分子量ポリペプチドはこの発明の範囲内に含まれるものと考え第１図は、血しょうフィブロネクチンの概略図であり、Ａ鎖の３３ｋＤカルボキシル末端ヘパリン結合フラグメントに位置する、この発明のヘパリン結合ペプチドＩ−Ｖに関する蛋白質上のＲＧＤＳおよびＣ５−１の相対位置を示す。

第２図は、この発明のペプチドＩおよび■のヘパリン結合活性を描いたグラフであるにトロセルロース結合検定）。

第３図は、フィブロネクチン（ｆｎ）のヘパリン結合活性を描いたグラフであるにトロセルロース結合検定）。

第４図は、ペプチドＩｌａおよびＣＳ　Ｉの相対ヘパリン結合活性を描いたグラフである（イムロンＣ結合検定）。

第５図は、ペプチドＩｌａ　Ａｓ　ｎａ　Ｂおよびｌ１ａ−Ｃのヘパリン結合活性を描いたグラフである（イムロンＣ結合検定）。

第６図は、ペプチドＬ　Ｉｌａおよび■−■の相対ヘパリン結合活性を描いたグラフである（イムロンＣ結合検定）。

第７図は、ペプチドＩｌａにより促された神経突起の伸長を描いたグラフである。

第８図は、ペプチドＣＳ　Ｉにより促された神経突起の伸長を描いたグラフである。

第９図は、ペプチド■により促された神経突起の伸長を描いたグラフである。

第１０図は、ペプチドＩｌａおよび■により促された相対メラノーマ細胞接着を描いたグラフである。

第１１図は、これらのペプチドが形式上誘導される血しようフィブロネクチン分子の部分のアミノ酸配列の概略図である。

第１図に注目すると、血しょうフィブロネクチンの２タイプの鎖（ＡおよびＢ）は、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）結合したヘテロダイマーとして示されている。

先の命名法（Ｌ、Ｔ、ファークト、「モダン・セル・バイオロジー」、Ｂ、サティア編、アラン・アール・リス、インコーホレイテッド、ニューヨーク（１９８３）５３−１１７頁）に従い、フィブロネクチンの６つの領域（１−Ｖｒ）を標識する。各領域内の生物活性には、（Ｉ）弱いヘパリン結合、（ＩＩ）非共有コラーゲン結合、（Ｉ［１）ＤＮＡ結合、（ＩＶ）ボックス（０）として示されたＲＧＤＳ−介在性細胞接着、（Ｖ）ヘパリン結合、ＲＧＤＳ非依存性細胞接着、および（Ｘｌ）遊離水硫基が含まれる。各領域を含む蛋白質加水分解フラグメントの分子量評価は、先に記載した消化および精製概要に基づく。（Ｊ、Ｂ、マツカーシー、「ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー」、Ｌ免２Ｓ　１７９（１９８６））。蛋白質加水分解開裂部位（Ｘ）は、トリプシン（Ｔ）およびカテプシンＤ（Ｃ）について示されている。これらの概要によると、Ｂ鎖の消化物から単離された領域Ｖおよび■は６６ｋＤフラグメントに位置する。反対に、Ａ鎖消化物は、３３ｋＤフラグメント（領域■）および３１ｋＤフラグメント（領域■ ）を含む。この差異は、太い線として示されたＡ鎖特異タイプ１１［ｃｓ挿入体におけるトリプシン感受性部位の結果である。

フィブロネクチンの全−次構造は、直接的に決定され几か（Ｔ、Ｅ。

ビーダーリン等、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・エーロ、１立、１３７（１９８３））、まｆ二は組換えＤＮＡ技術により予測されｆ二、（Ｊ、Ｅ、シュパル゛ソバウェル等、πセルニ、１３５．４２１（１９８３））、）リブシン／カテズシン（ｔ／ｃ）３３ｋＤ、ｔ／ｃ６６ｋＤおよびトリプシン（ｔ）３１　ｋＤフラグメントのアミノ末端配列は、既知ヒト配列に関してこれろのフラグメントの正確な位置を決定するため、アプライド・バイオシステムズ・ガス相シーケネーター（モデル４７０Ａ）における直接アミノ酸配列決定法により確立された。

最初の２１アミノ酸がｔ／ｃ６６ヘバリン結合フラグメントについて決定され１：（第１１図、ラインｌで始まり、ライン２に続く下線を引いに残基）。このフラグメントは、無傷血しょうフィブロネクチンの残基■５８３に対応するアミノ酸アラニンから出発する（Ａ。

Ｒ，コーンブリット等、：ＥＭＢＯジャーナル」、４．１７５５（１９８５））。無傷フィブロネクチンにおけるこのアラニンのアミノ末端側に対するチロシンの存在は、芳香族残基を伴うペプチド結合に関するカテプシンＤの優先性と一致している。ｔ／ｃ６６フラグメントの配列は、残基番号１５９９のトレオニン（ダブル・アステリスクの後、ライン１の最後のスラッシュ）から残基１６９０のアラニン（第１残基、ライン２）へと進むため、ＥＤＩＩＩ挿入体を含まない。

ＥＤ■領域を欠くというこの事実は、細胞または線維芽細胞由来のフィブロネクチンから血しょうまたは肝臓由来のフィブロネクチンを区別する特徴である。

ｔ／ｃ３３フラグメントはまた、１５８３位のアラニンから始まる、ｔ／ｃ６６フラグメントと共通のアミノ末端配列を共有しく第１１図、ライン１）、それはま几ＥＤｍ領域を欠いている。これらの結果は、これらのフラグメントのアミノ末端配列が同一であることを説明し、ｔ／ｃ３３およびｔ／ｃ６６ヘパリン結合フラグメントのサイズ不均一性は、血しょうフィブロネクチンのＡ鎖のタイプｍｃｓ挿入体内におけるトリプシンの作用によるものであるという主張を支持する。

血しょうフィブロネクチンのＡ鎖内の３３ｋＤヘパリン結合フラグメントの配置は、トリプシン３１ｋＤフラグメントの最初の２１アミノ酸のアミノ末端配列を決定することにより確立された。３３および６６ｋＤヘパリン結合フラグメントの精製中に生成されるこのフラグメントは、遊離水硫基を含み、血しょうフィブロネクチンのＡ鎖のカルボキシル末端から始まる。Ｄ、Ｅ、スミスおよびＬ　、Ｔ、。

ファークト、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、■、６５１８（１９Ｂ２）参照。さらに、３１ｋＤフラグメントはまた、フィブロネクチンの３３ｋＤヘパリン結合フラグメントを与えるフィブロネクチン分子のサブセットから始まる。

ｔ３１フラグメントのアミノ末端は、ヒスチジン残基２０４０から始まる（下線部、第１１図のラインＯ）Ｃこのヒスチジンのアミノ末端側に対する残基はアルギニンであるため、これはトリプシンの既知特異性と一致している。この配列は、フィブロネクチン分子のサブセットに見出されるタイプＩｄｌｅｓ挿入体に存在する。このフラグメントはタイプｎ１ｃｓ挿入体からの９個の追加アミノ酸を含み、この挿入体の最後の３１アミノ酸（第１１図、ライン５、括弧内）を飛ばし、次いでこの配列情報が終わる残基２０６２のチロシンまでタイプ■相同体（第１１図、ライン６、下線部）として続く。これらの結果は、ｔ３１フラグメントが最大限可能な１２０残基タイプｍｃｓ挿入配列の一部分（最初の８９アミノ酸）を含み、血しょうフィブロネクチンのこの領域に関して先に確立された配列データと一致することを立証している。この配列情報は、タイプｍｃｓ挿入体内での（第１１図、ライン５）、アルギニン残基２０３９におけるｔ／ｃ３３ヘパリン結合フラグメントの最大限可能なカルボキシル末端限界を示す。

ポリペプチドの合成。メリフィールド固相方法を用いてこの発明のポリペプチドを合成し几。これは、ペプチド合成に使用される最も一般的な方法であり、「ソリッド・フェーズ・ペブタイド・シンセシス」、ピアス・ケミカル・カンパニー出版、ロックフォード、イリノイ（第２版、１９８４年）においてＪ　、Ｍ、スチニワートおよびＪ、Ｄ、ヤングにより詳細に記載されている（この開示を引用して説明の一部とする）。

ペプチド合成のメリフィールド・システムは、ベンジルクロリド基により官能化された１％架橋ポリスチレン樹脂を使用する。ハロゲンは、保護アミノ酸の塩と反応した場合エステルを形成し、それを樹脂と共有結合さ仕る。ベンジルオキシ −カルボニル（ＢＯＣ）基を用いて、アミノ酸の遊離アミノ基を保護する。この保護基をジクロロメタン（ＤＣＭ）中２５％トリフルオロ酢酸（ＴＣＡ）により除去する。新たに露出し１二アミノ基を、ＤＣＭ中１０％トリエチルアミン（ＴＥＡ）ｌこより遊離塩基に変換する。次いで、ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の使用により、次のＢＯＣ保護アミノ酸を先のアミノ酸の遊離アミンに結合させる。ＴＦＡ安定性ベンジル誘導体による合成中、アミノ酸の側鎖官能基を保護する。これらの反復性反応は全てオートメーション化され得るものであり、この発明のペプチドは、ベックマン・システム９９０ペプチド合成装置の使用によりユニバージティー・オブ・ミネソタ・マイクロケミカル・ファシリティ −において合成されｆ０樹脂上におけるブロック・ポリペプチドの合成後、ポリペプチド樹脂を無水フッ化水素酸（ＨＦ）で処理することにより、樹脂とのベンジルエステル結合を開裂させ、すなわち遊離ポリペプチドを放出させる。ベンジル誘導側鎖保護基はまた、ＨＦ処理により除去される。次いで、１．０モル酢酸を用いてポリペプチドを樹脂から抽出した後、抽出物を凍結乾燥する。

Ｃ−１８カラムにおける逆相技術によるプレパラティブ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、凍結乾燥した粗ポリペプチドを精製する。一般的な溶離勾配は、Ｈ２ｏ中０．１％ＴＦＡを用いた０％〜６０％アセトニトリルである。溶離剤の吸光度を２２０ｎｍでモニターし、フラクションを集め、凍結乾燥する。

精製ポリペプチドの特性検定はアミノ酸分析により行なわれる。

システィンまたはトリプトファンが存在する場合、まずポリペプチドを、６モルＭＣＩ（一定の沸騰状態）または４Ｎメタンスルホン酸中１１０℃で２４時間嫌気的に加水分解する。加水分解されたアミノ酸を、ベックマンにより供給されたくえん酸緩衝液を用い、ベックマン・システム６３００アミノ酸分析装置を用いたイオン交換クロマトグラフィーにより分離する。４４０および５７０ｎｍでの吸光度により定量を行い、標準曲線と比較する。さるに、配列決定によりポリペプチドの特性検定を行い得る。アミノ酸組成データが本質的にあまり情報を与えるものではない場合、この方法は長いポリペプチドに対して特に有用である。配列決定は、Ｒ，Ｍ、ヒユーウィック等、「ジャーナル・才ブ・バイオロジカル・ケミストリーｊ、２５６−１７９９０（１９８１）の方法による、モデル４７０Ａガス相シーケネーター（アプライド・バイオシステムズ、インコーホレイテッド）においてオートメーション化された、アミノ末端からの逐次エドマン分解法により行なわれる。

以下、詳細な実施例によりこの発明についてさらに詳しく記載する。

実施例１ヘパリン結合検定。

ヘパリン結合検定では、基質としてニトロセルロース・シートを利用することにより、ヘパリン結合活性に関して試験されるペプチドまたは蛋白質を結合させる。ペプチド■および■または無傷フィブロネクチン（ｆｎ）を５０ミリモル（ＮＨ−）ｔｃＯｈ中で可溶化し、第２図および第３図に示した濃度に希釈し几。５０ミリモルＮＨ，ＧＯ１に予め浸漬しておいたニトロセルロース・シートを、９６ウエルのドツト・プロット装置（ベゼスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、ベゼスダ、メリーランド）に設置し、２５０μ（の様々な５度の各ペプチドをウェルから吸引した。次いで、各ウェルを結合緩衝液（１０ミリモルノドリア、−ＨＣｌ、ｐＨ８，０％　０．１５％ルＮａＣ１）ｌ：より３回洗浄し、ろ液を除去し、−夜風乾させ几。次いで、フィルターを、ｌＯミリモルＣａ　Ｃ］　を含有結合緩衝液中５分間室温で平衡状態にした。次いで、３Ｈ−ヘパリンを結合緩衝液（Ｃａ　含有）中５００００ｃｐｍ／ｘρの濃度に希釈し、ニトロセルロース・シートを２時間この混合物の存在下でインキコベーションした。次いで、フィルターを結合緩衝液？こより４回洗浄し、風乾し几。試料の個々のスポットをニトロセルロースから切り取り、結合しｆ；ヘパリンを液体ンンチレーション計数管により定量しに。

Ａ、ポリペプチドＩおよび■ 結果は、ペプチド■が濃度に依存しに形で３Ｈ−ヘパリンと結合したことを示す（第２図）。反対に、３Ｈ−ヘパリンは、いがなる試験濃度でちペプチドＩとはあまり結合しなかった。３Ｈ−ヘパリン結合を促進するペプチドＨの最低濃度は０．２５　Ｘ　１０−’モルてあり、結合の飽和はさらに高いコーティング濃！ｆ（０，２５−０，５ｘｌｏ−’モル）で観察され几。同様に、フィブロネクチンはまに１濃変に依存した形で３Ｈ−ヘパリンと結合し、ｉｏ−’モルのフィブロネクチンで最大結合か観察された（第３図）。

Ｂ、ポリペプチドＩｌａおよびＣＳ　１追加のりジン残基をＣＳ　Ｉのカルボキシル末端に加えることにより、このペプチドとこの検定で使用される基質との結合を容易にした。

次に、ペプチドＩｌａおよびＣＳ　１の両方を相対ヘパリン結合活性について比較しＬＨプラスチック・イムロンＣプレート（ダイナチク、アレクサンドリア、バージニア）に、記載された通り指示レベルのペプチドＩｌａ、Ｃ５ＩまたはＢ５Ａ１００μρ（トリブリケイトで）を吸着させた。また３３ｋＤフラグメントのヘパリン結合能を比較用に測定したが、前記ペプチドと比較したこのフラグメントの相対サイズであるために、異なるコーティング濃度を使用し几。３３ｋＤフラグメントの実際のコーティング・レベルは４．２０．１００および５００μ ９／Ｋ（ｌであった。ＢＳＡによる非特異的結合部位のブロック後、１分当たりの崩壊数（ｄｐｉ）が約４０００のこのリガンドを加えることにより、これらの様々な基質の３Ｈ−ヘパリン結合能を測定した。この検定の全条件は、アメリカ合衆国特許出願第８９０７３号に記載された通りであった（この開示を引用して説明の一部とする）。

第４図に示す通り、ペプチドｎａは、濃度に依存した形で３Ｈ−ヘパリンとの結合能を保持していた。反対に、ペプチドＣＳ　Ｉはいかなる試験濃度でもヘパリンと結合し得なかっ乙。これは、ペプチドＨに帰因するヘパリン結合活性がＣＳ　１との構造上の部分的重複領域を必要としないことを示す。

Ｃ，ポリペプチドｌ１ａ−Ａ、　Ｈａ−ＢおよびＩｌａ　Ｃ。

ペプチドＩｌａおよび無傷ペプチドＩｌａから誘導された３種のペプチドを、指示濃度（１００μＱ／ウエル）でイムロンＣプレートに吸着させ（同じことを３回反復）、上記と同様に３Ｈ−ヘパリンとの結合能について試験した。この試験の結果を第５図に要約する。これらのデータが立証する通り、ペプチドＩ［ａ− Ａは非常に乏しいヘパリン結合活性を呈し、ペプチドｌ１ａ−Ｂは高いコーティング濃度で僅かに高いヘパリン活性を呈するが、ペプチドｌ１ａ−Ｃは、非常に低いコーティング濃度で使用した場合でも非常に高いヘパリン結合活性を呈する。ペプチドｌ１ａ−Ｃにおける正味電荷が（＋３）であるのに対し、ペプチドＩｌａにおける正味電荷が（〒４）であるという事実にも拘わらず、ペプチドｌ１ａ−Ｃは、事実、親ペプチド（ペプチド■ａ）の場合よりもかなり良好にヘパリンと結合する。これは、正味電荷自体、フィブロネクチンから誘導された合成ペプチドにおいて観察されるヘパリン結合活性に関する唯一の主たる重要事項ではないことを立証している。どちらかと言えば、特異的な一次構造がこの活性にとっては重大である。ペプチドＩｌａの場合、（ＫＮＮＱＫＳＥＰＬ　Ｉ　ＧＲＫＫＴ）ヘパリン結合活性は、このペプチドのカルボキシル末端３基（配列Ｌ　Ｉ　ＧＲＫＫＴ、ペプチドＩ［ａ−Ｃに対応する）に対して局在し得る。さらに、アルギニンを含Ｌ・ペプチドＩＩ−（中央部）は、同じアルギニンおよび２個の追加的リジンを含むペプチド■（カルボキシル）よりもかなり弱くヘパリンと結合することから、このペプチドにおける２個のりジン残基のうち少なくとも１つはヘパリン結合活性にとって重要である。

Ｄ、ポリペプチド■−■。

ペプチドＩ、Ｕａおよび■−■を、上記と同様に指示濃度（１００μＱ／ウエル）でイムロンＣプレートに吸着させた（同じことを３回反復）。ペプチド■−■ は、第６図に示す通り、固相ヘパリン結合検定において３Ｈ−ヘパリンと実質的に結合し、ペプチド■および■は、ペプチド■よりもさらに強くヘパリンと結合する。重要なことに、ニトロセルロース結合検定においてヘパリンと充分には結合しなかったペプチドＩは、イムロンＣ結合検定ではヘパリンと充分かっ特異的に結合し几。

ヘパリン結合に関する各ペプチドの特異性は、デキストランスルフェートま乙はコンドロイチン／ゲルマタンスルフェートにより誘発される３Ｈ−ヘパリン結合の５０％阻害点が、ヘパリンが呈する値よりも１〜３オーダー（等級）高い大きさの濃度であるという事実により示さメ−る。これらの結果は、無傷フィブロネクチンまに：よペプチドＩおよびｎにおいて観察された結果と類似している。

実施例２ペプチドＩ、　ＩＩ、Ｉｌａ、Ｉ［Ｉ、ＣＳ　Ｉまたは無傷フィブロネクチンをポラ−緩衝液（０，０５モル炭酸緩衝液、ｐＨ９，６）中で希釈し、各濃度１００μＱを９６ウ工ル組織培養プレート中に分配しｙ：（同じことを３回反復）。

次いで、プレートを一夜無菌フード中に置くことにより、緩衝液を濃縮し、ペプチドをプレート上に乾燥させた。

翌朝、５巧／πＱ牛血清アルブミン含有燐酸緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ　／ＢＳＡＸＰＢＳ＝燐酸緩衝食塩水）２００μＱを各ウェルに加え、プレートをさらに３時間インキュベーションした。その時点で、ＰＢＳ／ＢＳＡを吸引し、適当な培地中の細胞を各ウェルに加えた。

Ｂ、ニューロンの単離および神経突起伸長に関する　定。

ロジャーズ等、「デベロップメンタル・バイオロジーｊ、ＬＬ：、２１２−２２０（１９８３）の方法により、胚芽ＣＮＳニューロン培養を調製した。簡単に述べると、６日令の胚芽期ひながら得たを髄を＋＋単離し、それらの背側半分を除去し、Ｃａ　−Ｍｇ　不含有（ＣＭＦ）バンク平衡塩溶液中に３７℃で１０分間置いに０運動ニユーロンを顕著に含む腹部分のみを培養用に調製した。次いで、３７℃で２５分間ＣＭＦハング中０．２５％トリプシン（バクトドリブシン、ディフコ）中でを髄を解離した。トリプシン含有培地を、ＨＥＰＥＳにより緩衝状態にし、ｌＯ％牛脂児血清を補充したハムのＦ１２と置き換え、細胞を繰り返しピペットで取って完全に解離させた。

単一細胞懸濁液を遠心分離により沈澱させ、ハムのＦ　１２−ＨＥＰＥＳ十血清でリンスし、遠心分離し、重炭酸ナトリウムおよびグルタミン（２ミリモル）、ペニシリン（１００Ｌ！／πの、ストレプトマイシン（１００Ｕ／Ｊ１１２）を補充したハムのＦ１２に再懸濁し、指示濃度のヘパリンの存在下および非存在下後記要領で調製しておいたウェルに入れた。培養物を５％ＣＯを中加湿インキ二ベーターにおいて２４時間３７℃でインキュベーションし、次いでグルタルアルデヒドに固定させＬ０解剖用顕微鏡の助けを借りてｌＯ視野を無作為に試料採取することにより、神経突起を有するニューロンの数を定量した。

Ｃ，ポリペプチドＩおよび■。

この検定の結果を下記第４表および第５表に要約する。

Ｉ　１２．３＊＊　３ＩＩ　２２０；１９４＊＊　７５対照（ＢＳＡ）　２　２＊５００μ９／Ｊ！１２．　＊＊デュプリケイト値として示されたデータ。

第５表、ペプチドＨの用量応答。

ペプチド■のコ　神経突起を有するーティング濃度　ニューロンの数＊２１９／πＱ　３９；７０１！９／ｒ１２　４７；５１５００μ９／２Ｑ　４７　；３２２５０μ９／ｘＱ　１６　；４２基底値　８；８＊デュプリケイト値として示されｆニデータ。

これらの結果は、神経突起の伸長を促進する点で、ペプチド■がペプチドＩよりもかなり有効であること、およびペプチド■の神経突起促進活性がこのペプチドのヘパリン結合活性と明らかに関係していることを示す。すなわち、ペプチド■ は、神経再生が望ましい状況で（例、粉砕損傷で）神経生長を促進する合成基質の提供に有用であり得る。

Ｄ、ポリペプチドＩｌａおよびＣ５Ｉ。

これらのペプチドにより被覆されＬ基質上に置かれた場合に中枢および末梢系胚芽期ひなニューロンが呈する神経突起の生長を調べることにより、ペプチドＩ［ａおよびＣＳ　Ｉの特徴的な性質に関するさらに別の証拠が得られた。

上記と同様、１００μＣの示されたペプチドの５００μ９７ｒ、ｃ溶液まＬはフィブロネクチンの３３ｋＤヘパリン結合フラグメントの５μ９／２Ｃ溶液により基質を被覆しｆ；。ＢＳＡにより非特異的部位をブロック後、胚芽期ひなのを髄から単離された中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロン、まには胚芽期ひなの抜根神経節から単離された末梢神経系（ＰＮＳ）ニューロンの懸濁液を、様々な被覆基質上に置いた。

データは、これらの培養において神経突起を発現するニューロンの平均数を表し、トリブリケイト培養の平均を表す。

第７図および第８図に示されている通り、両ペプチドとも胚ニューロンによる神経突起伸長を促進することができた。しかしながら、ＣＮＳニューロンは好ましくはペプチドＣＳ　Ｉにより刺激されると思われるが、ペプチドＩｌａは末梢ニューロンによる神経突起伸長の刺激に最も有効であると思われた。すなわち、我々は、ペプチド■およびペプチドＣ９１間の３残基部分的重複にも拘わらず、各ペプチドの生物学的活性は別個の特有な構造決定基によるものであるという結論に達した。

Ｅ、ペプチドｍ０インビトロでの胚芽期ひなニューロンによる神経突起伸長の促進能力についてペプチド■を試験しＬ０第９図に示されている通り、ペプチドＩｌａおよび■は、ＰＮＳおよびＣＮＳニューロンによる神経突起伸長を促進する能力において明確な差異を示した。ペプチド１１ａおよび■は両方とも両集団のニューロンにおいて神経突起促進活性を示すが、ペプチド■の方はＣＮＳニューロンによる神経突起伸長をはるかに促進させ得、ペプチド■ａはＰＮＳニューロンによる神経突起伸長の促進により有効であると思われる。

実施例３次のプロトコルに従い、ウシ大動脈内皮細胞を単離した。近くの屠殺場から大動脈を得、冷燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳＸＩ　３６　ミリモルＮａＣ１，２，６ミリモルＫＣＩ、１５．２ミリモルＮ　ａ　Ｉ　ＨＰ　Ｏ４、ｐＨ７，２）中で洗浄し、２時間以内に処理した。粗コラゲナーゼ（ＣＬＳＩ［［、乾燥重量ｌ巧当たり１２５−１４５単位、クーパー・バイオメディカル）を、ダルベツコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭＸギブコ）中２ｖ９／ｒ、Ｑの割合で使用した。管の遠位末端を締め付け、コラゲナーゼ−ＰＢＳ溶液で満たし、１０分間消化を行っＬ０管腔内容物を採取後、さらに２回１０分間かけて新鮮なコラゲナーゼを加えた。

酵素−細胞懸濁液を等容量の１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭに加えて酵素を阻害し、１０分間４００Ｘｇでの遠心分離にかけた。生成した細胞沈澱物を、ｌＯ％ＦＢＳ、１００単位／ｘＱのぺニジリンＧ１１００μ９／Ｗ（ｌのストレプトマイシンおよび１００μｍ／宵Ｑの粗線維芽細胞成長因子を含むＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍに再懸濁し１ニ。３７℃で加湿した５％ＣＯ２雰囲気中７５ｃｘ”フラスコにおいて細胞を培養した。培養に同培地をｉ１２回供給し、約７５％全面生長時点て細胞を検定で使用した。特徴的な丸石形態、全面生長到達後の生長の接触阻害、および第〜１因子・ＲＡｇに関する陽性免疫蛍光染色（マイルズ・ラボラトリーズ）により、細胞は事実上内皮細胞として同定されたＣＳ、シュバルッ、「インビトロ」、１土、９６６（１９７８）Ｊ。

内皮細胞、血小板生成細胞および血小板のみ、第Ｘ１因子：ＲＡｇを含むことが知られている。この方法は、位相差顕微鏡および免疫染色から判断すると、常用の手順で平滑筋細胞、周囲細胞まＬは線帷芽細胞による汚染を殆ど伴わずに（５％未満）内皮細胞を高収率で与える。

Ｂ、大動脈内皮細胞接着検　。

フィブロネクチンまにはペプチドＩおよび■を吸着さｔ）ｆ；９６ウエルのマイクロタイター・プレートを用いて接着性を測定した。６０−８０％全面生長した細胞培養を、ｌＯμＣｉ／ｘ６の３８・アミノ酸を加えることにより一夜代謝標識した。検定当日、細胞をトリプシン処理により採取し、血清を加えることによりトリプシンを阻害し、細胞を洗浄してこの混合物を除き、ＨＥＰＥＳで緩衝させ几ｐＨ７゜２のＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍに再懸濁した。接着培地はま几５７．９／ＩＱのＢＳＡを含んでい１：。細胞を３−４ｘｌＯ’／πＱの濃度に調節し、この細胞懸濁液１００μＱをウェルに加えた。次いで、検定混合物を３７°Ｃで９０分間インキュベーションしｔ０インキュベーションの最後に、ウェルを、１０ミリモルＣａ　を含む温ＰＢＳで洗浄し、接着性集団を、１％ドデシル硫酸ナトリウムを含む０．５ＮのＮａＯＨにより可溶化した。次いで、液体シンチレーション計数管を用いて可溶化しん細胞を定量した。各測定を３回反復して行っに。この試験の結果を下記第６表に要約する。

第６表４０μ９／ズＱ　１０２４４００μ９７Ｋ（１１１０７４０００ｕ９／ｘＱ　９８１ペプチド■ ４０μ９７ＲＱ　９０１４００μｇ／π１２１７３４４０００μｙ／ｚρ　１４］９９フイブロネクチン５μ９／Ｗ（ｌ　ｌ　３７１４これらの結集は、ペプチド■が内皮細胞接着促進においてペプチドＩよりもかなり有効であることを示すもので、ニエーロンに関して観察された結果と一致する。すなわち、ペプチド■は、人工または天然基質への内皮細胞接着を促進するのに有用であり得る。

実施例４癌細胞の接着。

Ａ、転移性メラノーマ細胞の単離。

高転移性ネズミ・メラノーマ細胞に１７３５Ｍ４は、初めテキサス、ヒユーストンの１．Ｊ、フィドラー博士により提供された。細胞を受け取ったとき、多数の初期継代細胞が伸長し、液体窒素中で冷凍されていた。腫よう細胞は、通常６週間以下の期間インビトロ培養される。この期間の後、細胞を捨て、別のインビトロまたはインビボ実験で使用するために新しい細胞を貯蔵庫から引き出す。この予防措置を行うことにより、連続インビトロ継代の結果として生じ得る表現型浮動を最少限に抑える。５％加熱不活化胎児ウシ血清を含むダルベツコ修飾イーグル培地で細胞を培養した。５％ＣＯを含有加湿雰囲気により培養物を３７℃インキエベーター中で生長させた。０．０５％トリプシンおよび１ミリモルＥＤＴＡを用いて、フラスコから細胞を静かに放出させることにより、細胞を！２回継代培養した。

アミノ酸の代わりに２μＣｉ／３１！’ＨＴｄ（）リチウム化チミジン）を各培養に加えること以外は、上記内皮細胞の場合と同じ方法でメラノーマ細胞を適用した。内皮細胞に関する記載と同様に標識細胞を採取した。この細胞接着検定は、上記ウシ大動脈内皮細胞検定の場合と同じであった。

１、ポリペプチドＩおよびｎｏこの検定の結果を下記第７表に要約する。

第７表、Ｉｉよう細胞接着＊４０μ９７ＲＱ　３９００２００μ９７Ｒ（１３５００４００μ汁りＱ　３０００２０００μ９／靜　４０００ペプチド■ ４０ｕ９／ｌ（１４６００２００μ９／Ｊ（１４７００４００μ９／祿　４３００２０００μ９／ｒ（１３９００フイブロネクチン１μ９７Ｍ（１４７００１Ｏμ９／ＨＱ　７９００５０μ９／ｘ（１１１０００１００μ９／騒　９７００＊検定開始の１時間後に測定。

ニューロンおよび内皮細胞を用いて得られた上記結果とは反対に、ペプチドＩおよび■は両方ともメラノーマ細胞の接着を促進することができる。これは、フィブロネクチンのこの領域に対する異なる細胞夕、イブの接着における特異ｌ１５Ｊｔ差異を示唆し得る。

２、ポリペプチド■、ＩｌａおよびＣＳ　Ｉ。

メラノーマ細胞の接着を促進する能力についてポリペプチド■、１１ａおよびＣＳ　Ｉを試験した。メラノーマ接着促進活性の比較を下記第８表に示す。

第８表ポリペプチドへのメラノーマ細胞の接着ペプチドＵ（８０）１３．７ペプチドＩＩ（４００）　１１．３ペプチドｌ１ａ（８０）　６．４ペプチドＩ［ａ（４００）　１８．１ペプチドＣＳ　Ｉ（８０）　７１．７ベブチドＣＳ　Ｉ（４００）　７１．０ウシ血清アルブミン　３．５第８表におけるデータが立証する通り、ペプチド■、ＩｌａおよびＣＳ　Ｉは、培養中のメラノーマ細胞の接着を促進した。重要なことに、ペプチド■からのＤＥＬ配列の欠失は、このペプチドの細胞接着促進能力を排除しなかった。さらに、ＣＳ　Ｉにおけるメラノーマ接着促進活性の比較的高いレベルは、ペプチドがｍＨ−ヘパリンと結合し得なかったのは、基質上にペプチドを欠いたためではなかったことを示す（細胞接着およびヘパリン結合検定の両方に同じコーティング・プロトコルを使用し几ため）。

ペプチドｎａおよびＣＳ　Ｉが異なる機構によってメラノーマ細胞と結合することは明らかである。Ｉｌａのヘパリン結合活性は、このペプチドへのメラノーマ細胞の接着がこのペプチドのヘパリン結合特性と関係していることを強く示唆している。これらの結果は、メラノーマ細胞上の細胞表面プロテオグリカン−グリコサミノグリカン（＾、バリン様特質を有する）と相互作用するペプチドＩｒａの能力と一貫している。反対に、ペプチドＣＳ　１は、明らかにヘパリン非依存性機構による腫よう細胞の接着を促進する。すなわち、メラノーマ細胞はＣＳ　ＩおよびペプチドＩ［ａの両方に接着するが、各ペプチドの生物学的活性は異なるものである。

３、ペプチド■ 上記と同様に、メラノーマ細胞接着および拡大促進能力についてペプチド■を試験した。

第１Ｏ図に示されている通り、ペプチド■は、濃度に依存した形でメラノーマ細胞接着の促進において活性を示す。事実、ペプチド■は最高試験濃度でペプチドＩ１ｇの２倍の活性を示し、メラノーマ細胞の表面に関してペプチドＩｌａよりも高い親和力を有し得ることを示唆している。この結果は、ペプチドＩｌａと比較して、低濃度のペプチド■の方が３Ｈ−ヘパリンとの結合能力の大きいことと一致している。

これらのポリペプチドの幾つかの実践的適用について構想を１；てることができる。それらの適用には、体内に天然または合成基質を埋め込むことにより生じる傷の治癒促進が含まれる。それらの合成基質には、細胞接着が正常宿主組繊による合成移植体の受け入れにおける重要因子である、人工血管、眼内コンタクトレンズ、股関節部置換移植体、神経ガイドなどが含まれ得る。

アメリカ合衆国特許第４５７８０７９号に記載されている通り、これらのポリペプチドを利用して、細胞をインビボ表面に誘引するか、または移植前に特定表面における所望の細胞タイプの生長を促進させる医療装置を設計することができる。その方法の一例は、補綴装置、例えば血管または脈管移植における内皮細胞生長の誘導であり、これは一般に合成樹脂、例えばニトロセルロース、膨張性ポリテトラフルオロエチレンまたはポリエステル繊維、特にダクロン（商標）（ポリエチレンテレフタレート）繊維から織られるか編まれる。

またヒドロゲル、例えばポリメチロールメタクリルアミド（ＰＭＭＡ）は、体内での移植体または粘膜と接触した形で使用される物体、例えばコンタクトレンズに使用され得る。アメリカ合衆国特許第３９６６９０２号参照。

心臓への挿入を意図した装置には、一時的左心室補助装置、心臓バルブ、大動脈内バルーン・ポンプおよび人工心臓がある。それらの装置：よ、好ましくは合成樹脂、例えばポリエーテル−タイプのポリウレタン・エラストマー（カーディオタン（商標）、コントロン）または加硫ポリオレフィン・ゴム（ヘキスシン（商標）、グツドイヤー）から形成される。

殆どのタイプの細胞はフィブロネクチンおよびこれらのポリペプチドに接着するが、内皮細胞、上皮細胞および線維芽細胞は特にこれらのポリペプチドに誘引される。後者の点は、事故または手術後の傷口の閉鎖および治癒を助けるためのパッチ移植などのコーティングにおける前記ポリペプチドの潜在的有用性を示している。合成ポリマーのコーティングおよび移植はまた、粉砕性外傷、例えばを髄損傷後の神経再生を助は得る。

それらの場合、ペプチドを生物分子、例えばコラーゲン、グリコサミノグリカンまたはプロテオグリカンに結合させることは有利であり得る。コラーゲン、プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンは、結合組織および基底膜の主成分である。場合によっては、合成ポリマーの代わりに天然は乳類組織から完全または部分的に形成された補綴装置が使用される。−例は、欠陥のあるヒト心臓バルブの代用としてのブタ心臓バルブの使用である。それらの人工バルブはまた、ヒト硬膜またはウシ６膜を含み得る。別の例は、血管移植体としてのウシ動脈の使用である。

インビボでの細胞応答を修飾することにより治療成果を改善するために、これらのポリペプチドを用いてこれらの基質の表面を被覆することは有用であり得る。

これは、当業界で知られている様々な方法、例えば上記親和力に基づいて標的表面へポリペプチドを直接結合させるか、または様々な架橋反応または試薬を用いてポリペプチドを基質と共有結合させることにより達成され得る。補綴装置における合成樹脂および生体適合物質の使用の概説については、「ケミカル・アンド・エンジニアリング・ニュースＪ（１９８６年４月１４日）３０−４８頁参照（この開示を引用して説明の一部とする）。

それはまた、体内、例えば血管または腹腔中への一時的または半永久的挿入体（経皮的装置と称する場合もある）として用いることを意図した補綴装置のコーティング表面におけるそれらの価値の指標である。それらの装置には、カテーテル、および制御形薬剤デリバリー貯蔵器または注入ポンプがある。

また、ポリペプチド、例えばｌおよび■を用いて、インビトロでの使用を意図した天然または人工基質への内皮細胞、線維芽細胞または上皮細胞の接着を促進させることができる。例えば、培養基質、例えばマイクロタイター・プレートのウェルまたは微多孔質繊維もしくはビーズの培地接触表面は、細胞付着ポリペプチドにより被覆され得る。これは培地におけるフィブロネクチンの使用をうまく回避し得るため、培養に関してより充分に定義された条件およびより良好な再生性を提供し得る。

細胞付着表面の商業用途の一例として、ファルマシアにより製造されたサイトデックス粒子をゼラチンで被覆することにより、皿の場合よりもかなり小さい容量の培地において同数の接着しに細胞を生長させることが可能となる。これらのビーズの活性は、一般に生長培地におけるフィブロネクチンの使用により異なり、これらのポリペプチドは、それらの目的に対して改善され、化学的に特定されたコーティングを提供するものと予想される。他の表面または材料、例えばガラス、アガロース、合成樹脂ま几は長鎖多糖類を被覆することにより、付着性を高めることができる。

様々な具体的で好ましい実施態様および技術を述べながらこの発明の説明を行った。しかしながら、この発明の精神および範囲から逸脱せずに、多くの変形および修飾が為され得るものと理解すべきである。

ＦＩＧ、ＩＦＩＧ、ＩＯぺ１テ）”　ｕｇ／ｍ１ＦＩＧ、　２Ｍ　ｆｎＦＩＧ、４ＡＰ７デドゝ　ｕｇ／ｍ＋ＦＩＧ、５Ａ？７０テド　ｕｇ／ｍｌＦＩＧ、６ＡＦ　７’ｆド゛　ｕｇ／ｍ１ＢＳＡ　３３に　Ｉｌａ：Ｌ　（ｆＦＩＧ、ＢｋｌＦＩＧ、９ −１９６１−１９６３、ＤＥＬ）に関係しているか否かを測定するために実験を行った。すなわち、ポリペプチドＨの最初の１５アミノ酸残基を含むポリペプチドを合成した。このポリペプチドの式（ＩＩａ）を下記に示す。

ｌｙｓ　−ａｓｎ　−ａｓｎ　−ｇｌｎ　−１ｙｓ　−ｓｅｒ　−ｇｌｕ　−ｐｒｏ　−１ｅｕ　−ｉ　ｌｅ　−ｇｌｙ−ａｒｇ−１ｙｓ−１ｙｓ−ｔｈｒ　（Ｉｌａ）このポリペプチドの一文字アミノ酸コードはＫＮＮＱＫＳＥＰＬＩＧＲＫＫＴであり、残基１９４６−１９６０に対応する。このペプチドは、ａ）合計正味電荷が（＋４）であり、合計バイトロバシー指数が−２９，３である点でペプチドＩとは異なる。

Ｉ［ａは濃度依存方式でヘパリンと結合するが、ペプチドＣＳ　Ｉはいかなる試験１度でもヘパリンと結合し得ないことが見出された。

ポリペプチドＩ、■およびＩＩａの生物学的活性ペプチド・フラグメントも製造されたが、これはペプチドＨのアミノ末端３基（Ｉ［ａ−Ａ）、中央部３基（Ｉｌａ−Ｂ）およびカルボキシル末端３基（ａ−Ｃ）配列に対応する３種のポリペプチドを含む。具体的には、これらのペプチドは下記第２表に示されに配列を有する。

第２表名称　主な配列　正味電荷 ■（アミノ）　ＫＮＮＱＫＳＥＰ　−１（ＩＩ　ａ　−Ａ　）　（ｌｙｓ−ａｓｎ−ａｓｎ−ｇｌｎ−Ｉｙｓ−ｓｅｒ−ｇｌｕ−ｐｒｏ） ■（中央部）　ＫＳＥＰＬＩＧＲ＋１（ＩＩ　ａ　−Ｂ　）　（ｌｙｓ−ｓｅｒ−ｇｌｕ−ｐｒｏ−１ｅｕ−ｉｌｅ− ｇｌｙ−ａｒｇ） ■（カルボキシル）　ＬＩＧＲＫＫＴ　＋３（Ｉｆ　ａ　−Ｃ）　（ｌｅｕ−ｉｌｅ−ｇｌｙ−ａｒｇ−１ｙｓ−１ｙｓ−ｔｈｒ）ペプチドｌ１ａ−Ｃは、極めて高レベルのヘパリン結合活性を有することが見出され、それ故この発明の範囲内にあるものとする。

この発明はまた、同じくフィブロネクチンのＡ鎖に位置する３３ｋＤカルボキシル末端ヘパリン結合領域のフラグメントを表す追加的生物活性ポリペプチドを提供する。これらのポリペプチド■、■および■は、構造１互いにおよびペプチドＩおよびｎａとは区別されるが、それらは、下記第３表に要約されているある種の化学特性国際調査報告＋１＋１＠１１ｍｌｌ１ｍＭｌ　＾ｅｅｍａ＋ｍ　ＩＩＬ　Ｆｃ？／ｌ：Ｓ　ε ＩＩ１０２９１３国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

（１）【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】から成る群から選ばれた式で示されるポリペプチドおよびそれらの混合物により本質的に構成される組成物。
（２）【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】から成る群から選ばれた式で示されるポリペプチドおよびそれらの混合物により本質的に構成される組成物により被覆された表面を含むインビボ設置用に設計された補綴装置。
（３）表面が血管移植体の一部分を構成する、請求項２記載の補綴装置。
（４）表面が眼内コンタクトレンズの一部分を構成する、請求項２記載の補綴装置。
（５）表面が心臓バルブの一部分を構成する、請求項２記載の補綴装置。
（６）表面が股関節部置換移植体の一部分を構成する、請求項２記載の補綴装置。
（７）表面が経皮的装置の一部分を構成する、請求項２記載の補綴装置。
（８）表面が合成樹脂でできている、請求項２記載の補綴装置。
（９）合成樹脂が、ニトロセルロース、ポリウレタン、膨張ポリテトラフルオロエチレン、ポリエステルおよびポリオレフィンから成る群から選ばれる、請求項８記載の補綴装置。
（１０）表面が天然組織でできている、請求項２記載の補綴装置。
（１１）【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】から成る群から選ばれた式で示されるポリペプチドおよびそれらの混合物により本質的に構成される組成物により被覆された表面を有する細胞培養基質。
（１２）表面が合成樹脂でできている請求項１１記載の細胞培養基質。
（１３）表面がビーズの一部分を構成する、請求項１１記載の細胞培養基質。
（１４）表面が微多孔質繊維の一部分を構成する、請求項１１記載の細胞培養培地。
（１５）表面がマイクロタイター・プレートのウェルを構成する、請求項１１記載の細胞培養培地。