JPS6289699A - フイブロネクチン - Google Patents
フイブロネクチンInfo
- Publication number
- JPS6289699A JPS6289699A JP61151315A JP15131586A JPS6289699A JP S6289699 A JPS6289699 A JP S6289699A JP 61151315 A JP61151315 A JP 61151315A JP 15131586 A JP15131586 A JP 15131586A JP S6289699 A JPS6289699 A JP S6289699A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- collagen
- polypeptide
- binding
- fibronectin
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 title claims abstract description 32
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 title claims abstract description 32
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 53
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 45
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 25
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 21
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 claims abstract description 17
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 claims abstract description 16
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 13
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 6
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 6
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 4
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 4
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 4
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- NNRFRJQMBSBXGO-CIUDSAMLSA-N (3s)-3-[[2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]acetyl]amino]-4-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NNRFRJQMBSBXGO-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000829980 Homo sapiens Ral guanine nucleotide dissociation stimulator Proteins 0.000 description 2
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102100023320 Ral guanine nucleotide dissociation stimulator Human genes 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102400000524 Fibrinogen alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 101710137044 Fibrinogen alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Substances CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000890996 Rattus norvegicus Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000245026 Scoliopus bigelovii Species 0.000 description 1
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241001672648 Vieira Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 235000012467 brownies Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 102000053391 human F Human genes 0.000 description 1
- 108700031895 human F Proteins 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000006548 oncogenic transformation Effects 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 235000008001 rakum palm Nutrition 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 235000015042 sahti Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000000547 structure data Methods 0.000 description 1
- 239000003760 tallow Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Inorganic Fibers (AREA)
- Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Compounds Of Alkaline-Earth Elements, Aluminum Or Rare-Earth Metals (AREA)
- Hydrogenated Pyridines (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
フィブロくクチン(FHs )はIamの付着性および
拡散、細胞の移動、細胞の形態制御、分化および腫瘍遺
伝子の形質転換のような背椎動物の各種接触方法に鍵と
なる役割を有する一種の高分子量グリコ−タン白を構成
する。すべてのこれらの生物学的活性はFNと細胞およ
びFNと細胞外物質の相互作用を意味する。コラー2ン
、ヘパリン、フィブリン、a泡表面、細菌およびDNA
に対する結合活性はFMJ分子のそれぞれ異る領域にあ
る(総説に対してはヤマダ、1986参照)OFNは機
能的にも、構造的にももつとも多面的既知タン白の1つ
である。FN分子は通例相似するが、同一ではない分子
量=250,000のポリペゾチVの二量体である。細
胞FNは噴維芽細胞および他の訓胞タイプの細胞外マト
リックスの細繊維成分に見出される。血漿FNは血漿に
高濃度で(500μ9/ml)含まれる可溶性分子で、
恐らくはオゾソニン作用、創傷の癒合および止血(ヤマ
ダ、1985 ; Hynes&Yamada、 19
82 )に含まれるものであろう。部分的−文構造デー
タは2個のFN形間および異る種からのFNのうちの双
方に高保持アミノ酸配列を示した:牛の血漿(Pete
−rs enら、198!l)、牛の細胞質(Korn
blihttら、1983)、ヒトの血q (Pand
e & 5hively 1982; Garcia−
Pardoら、1985)、ヒトの細胞質(Kornb
lihttら、1985.1984a; Oldber
gら、1985)、ラットの血漿(5cbyarzba
uerら、1985)。これらのデータは基本的FN−
リペデチドは5つの異るタイプの内部反復を含むことを
確証するのに役立った〔牛血漿FNに最初に示されるよ
うに相同タイプIX IFおよび■、それぞれ約40.
60および90個のアミノ酸の長さく Skorste
ngaardら、1982 ; Petersenら、
1983))。この基本的フィブロネクチン構造の変化
は細胞質および血漿フィブロネクチン間の差異および画
形のzリペデチド鎖間の差異をも説明する。フィブロネ
クチンの多様形は第二の(alternative )
スプライシングt−経た通常の前駆体に1個の遺伝子を
転写することにより生ずるように思われる( Vibe
−Pedersenら、1984)。
拡散、細胞の移動、細胞の形態制御、分化および腫瘍遺
伝子の形質転換のような背椎動物の各種接触方法に鍵と
なる役割を有する一種の高分子量グリコ−タン白を構成
する。すべてのこれらの生物学的活性はFNと細胞およ
びFNと細胞外物質の相互作用を意味する。コラー2ン
、ヘパリン、フィブリン、a泡表面、細菌およびDNA
に対する結合活性はFMJ分子のそれぞれ異る領域にあ
る(総説に対してはヤマダ、1986参照)OFNは機
能的にも、構造的にももつとも多面的既知タン白の1つ
である。FN分子は通例相似するが、同一ではない分子
量=250,000のポリペゾチVの二量体である。細
胞FNは噴維芽細胞および他の訓胞タイプの細胞外マト
リックスの細繊維成分に見出される。血漿FNは血漿に
高濃度で(500μ9/ml)含まれる可溶性分子で、
恐らくはオゾソニン作用、創傷の癒合および止血(ヤマ
ダ、1985 ; Hynes&Yamada、 19
82 )に含まれるものであろう。部分的−文構造デー
タは2個のFN形間および異る種からのFNのうちの双
方に高保持アミノ酸配列を示した:牛の血漿(Pete
−rs enら、198!l)、牛の細胞質(Korn
blihttら、1983)、ヒトの血q (Pand
e & 5hively 1982; Garcia−
Pardoら、1985)、ヒトの細胞質(Kornb
lihttら、1985.1984a; Oldber
gら、1985)、ラットの血漿(5cbyarzba
uerら、1985)。これらのデータは基本的FN−
リペデチドは5つの異るタイプの内部反復を含むことを
確証するのに役立った〔牛血漿FNに最初に示されるよ
うに相同タイプIX IFおよび■、それぞれ約40.
60および90個のアミノ酸の長さく Skorste
ngaardら、1982 ; Petersenら、
1983))。この基本的フィブロネクチン構造の変化
は細胞質および血漿フィブロネクチン間の差異および画
形のzリペデチド鎖間の差異をも説明する。フィブロネ
クチンの多様形は第二の(alternative )
スプライシングt−経た通常の前駆体に1個の遺伝子を
転写することにより生ずるように思われる( Vibe
−Pedersenら、1984)。
今日までこのタイプの変化が起こる少なくとも2つの領
域が記載されている。あるヒトのセルラインでは(繊維
芽細胞、Hs 578T ) FNmRNAは正確に相
同タイプ■の1つをコード化する270ニユ一クレオチ
ド部分(HD) Kより区別することができる。このE
D部分は血漿FHの起源である肝細胞mRNAに存在し
ないようである( Kornblihttら、1985
.1984 b )o Schwarzbauerら
(1985)はgn領域タタン白3′カルざキシ末端側
部に位置する区域(II[C8)で異るラット肝臓の第
二のスプライシングにより生ずる3つの異るF N m
RNAを報告した。異る配列は既知内部相同のいずれに
も稿さず、最後の2つのタイゾ■相同反復間に、末端C
0OHの近くに挿入される。さらに悔涙ら(1985)
はヒト肝臓F N mRNAの等し14[[CS区域に
、この区域に対し全体f、5のモチーフに導く別の変化
を報告し念。FNdeリペゾチド間に認められる差異は
シレーmRNAの少なくとも2つの特殊領域における第
二のスプライシングに基づ< (Tamkunら、19
84 ; ’vibe−Pedersenら、1984
;悔涙ら、1985)内部−次起動の変化の結果である
( Kornblihttら、1984 a 、 l
934 b ; 5cbyarzbauerら、19
85)。
域が記載されている。あるヒトのセルラインでは(繊維
芽細胞、Hs 578T ) FNmRNAは正確に相
同タイプ■の1つをコード化する270ニユ一クレオチ
ド部分(HD) Kより区別することができる。このE
D部分は血漿FHの起源である肝細胞mRNAに存在し
ないようである( Kornblihttら、1985
.1984 b )o Schwarzbauerら
(1985)はgn領域タタン白3′カルざキシ末端側
部に位置する区域(II[C8)で異るラット肝臓の第
二のスプライシングにより生ずる3つの異るF N m
RNAを報告した。異る配列は既知内部相同のいずれに
も稿さず、最後の2つのタイゾ■相同反復間に、末端C
0OHの近くに挿入される。さらに悔涙ら(1985)
はヒト肝臓F N mRNAの等し14[[CS区域に
、この区域に対し全体f、5のモチーフに導く別の変化
を報告し念。FNdeリペゾチド間に認められる差異は
シレーmRNAの少なくとも2つの特殊領域における第
二のスプライシングに基づ< (Tamkunら、19
84 ; ’vibe−Pedersenら、1984
;悔涙ら、1985)内部−次起動の変化の結果である
( Kornblihttら、1984 a 、 l
934 b ; 5cbyarzbauerら、19
85)。
成人ヒトFNポリペプチドの完全なアミノ酸配列は下記
複数のcDNAクローンのニュークレオチド配列から決
定されるようになった。ポリペプチドの長さは内部に別
のスプライシングが起こることにより2146〜232
5アミノ酸に変化する。
複数のcDNAクローンのニュークレオチド配列から決
定されるようになった。ポリペプチドの長さは内部に別
のスプライシングが起こることにより2146〜232
5アミノ酸に変化する。
本発明はフィブロネクチン分子の任意の所望部分、特に
その他のものとは別のフィブロネクチンの各結合活性を
有するポリペプチドを供することができる。第2図では
FNアミノ酸配列の各部分の結合部位が示される。これ
らのいくつかのものha知であるが、ヒトコラーテン結
合部位の配列は新しい(図のライン8〜13)。タイプ
■相同をきむライン9および10は特別の意fit−有
し、コラーゲン結合能の大部分又はすべてを含むと信じ
られる。
その他のものとは別のフィブロネクチンの各結合活性を
有するポリペプチドを供することができる。第2図では
FNアミノ酸配列の各部分の結合部位が示される。これ
らのいくつかのものha知であるが、ヒトコラーテン結
合部位の配列は新しい(図のライン8〜13)。タイプ
■相同をきむライン9および10は特別の意fit−有
し、コラーゲン結合能の大部分又はすべてを含むと信じ
られる。
本発明は第2図に示す277〜577のアミノ酸配列を
実質的に有し、又はコラーゲン結合能を有するその任意
の連続部分、特に679〜445の配列を有する新規ポ
リペプチドを供する。実際にこのようなポリペプチドは
フィブロネクチン分子自体の付加的残基を含む、コラー
ゲン結合ポリペプチドの所望の末端使用に影響しないさ
らに別のアミノ酸残基に結合することができる@同様に
フィブロネクチン分子の他の配列は他の分子に結合する
これらの能力に対し利用できる0@2図に示すように2
1〜241のポリペプチド配列はフィブリン、ヘパリン
および5taphylococcusaureuSに対
する結合に連結する。示されるように他の配列はDNA
、細胞および別のヘパリンおよびフィブリン結合部位
に対する結合に連結する。
実質的に有し、又はコラーゲン結合能を有するその任意
の連続部分、特に679〜445の配列を有する新規ポ
リペプチドを供する。実際にこのようなポリペプチドは
フィブロネクチン分子自体の付加的残基を含む、コラー
ゲン結合ポリペプチドの所望の末端使用に影響しないさ
らに別のアミノ酸残基に結合することができる@同様に
フィブロネクチン分子の他の配列は他の分子に結合する
これらの能力に対し利用できる0@2図に示すように2
1〜241のポリペプチド配列はフィブリン、ヘパリン
および5taphylococcusaureuSに対
する結合に連結する。示されるように他の配列はDNA
、細胞および別のヘパリンおよびフィブリン結合部位
に対する結合に連結する。
新規ポリペプチドはぼりペプチドをコーvし、代謝産物
からtie +7ペゾチドを分離する内在DNAを含む
細胞を培養することにより製造できる。適当なりNA配
列はE、 coli又は他の微生物、例えばSacch
aromyces cerevisiaeのような酵母
のコンぎテント株をクローンすることができる。後者は
培養され、次に所望のポリペプチドは培養生成物から単
離される。°第6図はフィブロネクチンおよび関連アミ
ノ酸残基の完全なりNA配列を示し、これからフィブロ
ネクチン分子の任意の所望部分の発現をクローニングす
るための所要のcNDA配列は容易に決定できる。
からtie +7ペゾチドを分離する内在DNAを含む
細胞を培養することにより製造できる。適当なりNA配
列はE、 coli又は他の微生物、例えばSacch
aromyces cerevisiaeのような酵母
のコンぎテント株をクローンすることができる。後者は
培養され、次に所望のポリペプチドは培養生成物から単
離される。°第6図はフィブロネクチンおよび関連アミ
ノ酸残基の完全なりNA配列を示し、これからフィブロ
ネクチン分子の任意の所望部分の発現をクローニングす
るための所要のcNDA配列は容易に決定できる。
コラーテン結合ポリペプチドをコードするDNA配列は
1147配位〜1351配位にあり、フィシリン結合ポ
リペプチドをコードする配列は75〜758配位にある
。
1147配位〜1351配位にあり、フィシリン結合ポ
リペプチドをコードする配列は75〜758配位にある
。
しかし、さらに詳細に本発明によれば、pF’H54,
1)FHl 34、pF’H16およびpFH6とじて
記載するクローンおよび同様のクローンはE、 col
i沿よび他の適当な微生物に発現することにより相当す
るポリペゾチrの製造に使用できる。pFH134匂よ
びpFH16はフィブロネクチン分子のコラーテン結合
部分に対するI)NA配列を含み、フィブロネクチンの
コラーーン結合活性を有し、他の結合親和性を有しない
ポリペプチドを生成するために使用できる。I)FH6
はポリペプチド結合フィブリンおよびヘパリンの発現に
対しコンビテン) E、 coli t−形質変換する
ために使用することができる。
1)FHl 34、pF’H16およびpFH6とじて
記載するクローンおよび同様のクローンはE、 col
i沿よび他の適当な微生物に発現することにより相当す
るポリペゾチrの製造に使用できる。pFH134匂よ
びpFH16はフィブロネクチン分子のコラーテン結合
部分に対するI)NA配列を含み、フィブロネクチンの
コラーーン結合活性を有し、他の結合親和性を有しない
ポリペプチドを生成するために使用できる。I)FH6
はポリペプチド結合フィブリンおよびヘパリンの発現に
対しコンビテン) E、 coli t−形質変換する
ために使用することができる。
クローンpFa54、pFH134およびpFH16を
得る方法は下記する。引用方法の反復により本質的に同
一か又は僅かに異る実用性を有する同様のクローンが得
られるであろう。これに関連して適当な起源、すなわち
所望のタン白又はポリペプチドをもともと発現できる細
胞からの全細胞質RNA ’i使用する有用なcDNA
の単離は現在利用できる技rrt−使用し、特に水切I
fm書における場合のように所望タン白又はポリペプチ
ドの実際のアミノ酸配列および相当するDNA配列はい
ずれも既知である場合、当業者には日常的試験に属する
事柄であることが認められるであろう。下記試験部分は
有効であることがわかった適当な技術を記載するが、他
の既知技術も同様に適用できることは予期されるであろ
う。試験者が入手しうる多数の材料から形質変換に対し
RNA 、ベクターおよびコンぎテント微生物の適当な
起源の同様の選択は当業者の通常技術内にある。
得る方法は下記する。引用方法の反復により本質的に同
一か又は僅かに異る実用性を有する同様のクローンが得
られるであろう。これに関連して適当な起源、すなわち
所望のタン白又はポリペプチドをもともと発現できる細
胞からの全細胞質RNA ’i使用する有用なcDNA
の単離は現在利用できる技rrt−使用し、特に水切I
fm書における場合のように所望タン白又はポリペプチ
ドの実際のアミノ酸配列および相当するDNA配列はい
ずれも既知である場合、当業者には日常的試験に属する
事柄であることが認められるであろう。下記試験部分は
有効であることがわかった適当な技術を記載するが、他
の既知技術も同様に適用できることは予期されるであろ
う。試験者が入手しうる多数の材料から形質変換に対し
RNA 、ベクターおよびコンぎテント微生物の適当な
起源の同様の選択は当業者の通常技術内にある。
フィブロネクチンの所望のアミノ酸配列が形質変換微生
物により発現される場合、微生物自体のポリペプチド特
性と連合できることは認められるであろう。これはポリ
ペプチドの意図的使用に対し重要ではないが、ある場合
例えばぼりペプチドが治療に使用される場合、付加的ア
ミノ酸残基の存在は許容しえない。その場合ポリペプチ
ドは例えばデqテアーゼにより付加的処理して望ましく
ない付和的アミノ酸残基を含まない所望のぼりペプチド
を分離しなければならない。
物により発現される場合、微生物自体のポリペプチド特
性と連合できることは認められるであろう。これはポリ
ペプチドの意図的使用に対し重要ではないが、ある場合
例えばぼりペプチドが治療に使用される場合、付加的ア
ミノ酸残基の存在は許容しえない。その場合ポリペプチ
ドは例えばデqテアーゼにより付加的処理して望ましく
ない付和的アミノ酸残基を含まない所望のぼりペプチド
を分離しなければならない。
上記のように、本発明はコラーゲンおよび/又はフィブ
リンに結合しうるポリペプチドを発現することができる
ように適当な微生物を形質変換する手段を供することに
特別の関心がある。コラー2ンに結合できるポリペプチ
ドは例えば貴重なポリペプチドの親和精製を助けるため
に使用できる。
リンに結合しうるポリペプチドを発現することができる
ように適当な微生物を形質変換する手段を供することに
特別の関心がある。コラー2ンに結合できるポリペプチ
ドは例えば貴重なポリペプチドの親和精製を助けるため
に使用できる。
コラーゲン結合ポリペデチrは別の関心のある?リペプ
チドに結合する形で発現される場合、又はこのような&
IJペプチドに単離後結合する場合、結合ポリペプチ
ドは結合ゼラチン(すなわちコラーゲン)カラム上で親
和クロマト“グラフィにより、filf製し、次にf#
製後後所望ポリペプチドは例えIl!酵素加水分解によ
りコラーゲン結合ポリペプチドから分離できる。
チドに結合する形で発現される場合、又はこのような&
IJペプチドに単離後結合する場合、結合ポリペプチ
ドは結合ゼラチン(すなわちコラーゲン)カラム上で親
和クロマト“グラフィにより、filf製し、次にf#
製後後所望ポリペプチドは例えIl!酵素加水分解によ
りコラーゲン結合ポリペプチドから分離できる。
フィブリンに結合できるポリペプチドは天然フィブリン
、例えば血餅に対する治療剤を目標とする治療に使用で
きる。例えば、ポリペプチドに結合するフィシリン分解
酵素は改良された血餅溶解性をπ1これはその目標に対
する改良粘着性を百するからである。
、例えば血餅に対する治療剤を目標とする治療に使用で
きる。例えば、ポリペプチドに結合するフィシリン分解
酵素は改良された血餅溶解性をπ1これはその目標に対
する改良粘着性を百するからである。
図面において、第1図はヒ) F N mRNA0前1
ノ囚尾部から7392ニユークレオチドをカバーする7
つのc DNAクローンの制限酵素マツプを示す。
ノ囚尾部から7392ニユークレオチドをカバーする7
つのc DNAクローンの制限酵素マツプを示す。
ヒトF N mRNAは7900ニユークレオチrの長
さであると見積もられる( Kornblihttら、
1985)。
さであると見積もられる( Kornblihttら、
1985)。
クローンは成熟タン白質(下図は結合部位を示す)に対
する完全なコード領域および5′非コード領域をカバー
する。点線は相当するcDNAクローンて存在しない部
分を示すが、これは最初のストランドcDNA反応で合
成されなければならない。そしてこれはフレノウ酵素の
不足の結果として失なわれ、二次cDNAストランドを
完結させる。マツプの数字は塩基対にある。
する完全なコード領域および5′非コード領域をカバー
する。点線は相当するcDNAクローンて存在しない部
分を示すが、これは最初のストランドcDNA反応で合
成されなければならない。そしてこれはフレノウ酵素の
不足の結果として失なわれ、二次cDNAストランドを
完結させる。マツプの数字は塩基対にある。
第2図はヒ)FN!l?リペゾチドの完全なアミノ酸配
列を示す。残基1および2525は成熟タン白のNH2
および末i C0OHである。配列は第1図描写のcD
NAクローンのニュークレオチド配列(第5図参照)か
ら推定される。線列は内部相同を示す。ギヤングは相同
t−最高化するために導入された。1タイプの相同内の
同一残基は枠組みされる。
列を示す。残基1および2525は成熟タン白のNH2
および末i C0OHである。配列は第1図描写のcD
NAクローンのニュークレオチド配列(第5図参照)か
ら推定される。線列は内部相同を示す。ギヤングは相同
t−最高化するために導入された。1タイプの相同内の
同一残基は枠組みされる。
細胞認識テトラペゾチドRGDS (Pierschb
acher &Ru081ahtil 1984 )は
強調される。位置17(Ser ) 、21 (Cys
)および42 (Val )はGarcia−Par
doら(1983)によりそれぞれCys 。
acher &Ru081ahtil 1984 )は
強調される。位置17(Ser ) 、21 (Cys
)および42 (Val )はGarcia−Par
doら(1983)によりそれぞれCys 。
8erおよびAlaとして報告される。この図に示され
るFNポリペプチドは分子量=255,905を有する
2525残基を有する。炭水化物側鎖を有し、9%のタ
ン白マスであると評価される(珈−11983)マスが
添加される場合このFNNポリペブチの分子量は約27
9,000に増加するであろう。この数字はSDS −
PAGEにより評価されるFNモノマーの分子量(2り
0−250.D 00 )よりかなり高いと思われる
。ずれはその範囲の適当なタン白標準物の不足と共に高
分子汲タン白の範囲におけるSDS rルの貧弱な分解
により説明できるであろう。
るFNポリペプチドは分子量=255,905を有する
2525残基を有する。炭水化物側鎖を有し、9%のタ
ン白マスであると評価される(珈−11983)マスが
添加される場合このFNNポリペブチの分子量は約27
9,000に増加するであろう。この数字はSDS −
PAGEにより評価されるFNモノマーの分子量(2り
0−250.D 00 )よりかなり高いと思われる
。ずれはその範囲の適当なタン白標準物の不足と共に高
分子汲タン白の範囲におけるSDS rルの貧弱な分解
により説明できるであろう。
記号は欠の通りであるニー、遊離SH基;人炭水化物側
鎖部位;Δ、キモトリプシンの開裂部位;^、プラスミ
ンの開裂部位。複数のフイゾロネクチンボリペデチドは
ライン26および50の別のスプライス領域のすべての
可能な順列により生成させることができる(下記説明)
。
鎖部位;Δ、キモトリプシンの開裂部位;^、プラスミ
ンの開裂部位。複数のフイゾロネクチンボリペデチドは
ライン26および50の別のスプライス領域のすべての
可能な順列により生成させることができる(下記説明)
。
第5図は第1図のcDNAクローンの配列から推定した
第2図のヒ)FNt?リペデチ1の完全なニュークレオ
チド配列全示す。
第2図のヒ)FNt?リペデチ1の完全なニュークレオ
チド配列全示す。
、第4図はFN−次構造の変化を示す。Aは成熟タン白
の完全な構造である。黒ぬり枠はタイプ■相同であり、
斜線枠はタイプ■相同であり、白枠はタイプ■相同であ
る。BおよびCはED頌域IB)およびll[cs領領
域C)で認められる複数F N mAの翻訳により生じ
うる異るFNポリペプチドを図示する。相当するコード
化mRNA種を表わすcDNAクローンの名称は各ポリ
ペプチドの右側に示される。△に接触を示す。λr1+
2はラットの肝″5J、 CDNAライブラリから(S
chwarz bauerら、1985)。
の完全な構造である。黒ぬり枠はタイプ■相同であり、
斜線枠はタイプ■相同であり、白枠はタイプ■相同であ
る。BおよびCはED頌域IB)およびll[cs領領
域C)で認められる複数F N mAの翻訳により生じ
うる異るFNポリペプチドを図示する。相当するコード
化mRNA種を表わすcDNAクローンの名称は各ポリ
ペプチドの右側に示される。△に接触を示す。λr1+
2はラットの肝″5J、 CDNAライブラリから(S
chwarz bauerら、1985)。
pFHL 1および8はヒト肝@ cDNAライブラリ
から、およびpFH1はHs 578 Tセルラインc
DNAライブラリから(Kornblihttら、19
85)単離された。すべての変化はコラーゲンおよびフ
ィブリンに結合する区域を含むことは注目される。
から、およびpFH1はHs 578 Tセルラインc
DNAライブラリから(Kornblihttら、19
85)単離された。すべての変化はコラーゲンおよびフ
ィブリンに結合する区域を含むことは注目される。
第5図は第1図よりさらに詳細にコラ−rン結合領域の
位置および内部相同(■、■および■)を示すフィブロ
ネクチンタン白の部分を示す。下記細菌発現試験におい
て使用されるCDNA系列の位置および大きさく塩基対
における)が下記される。cDNA pXFN 1〜8
に関連する制限酵素部位のみが示される。pFH154
およびpFH16の側部Hind l[およびBan
H1部位はベクターのポリリンカーに存在する。
位置および内部相同(■、■および■)を示すフィブロ
ネクチンタン白の部分を示す。下記細菌発現試験におい
て使用されるCDNA系列の位置および大きさく塩基対
における)が下記される。cDNA pXFN 1〜8
に関連する制限酵素部位のみが示される。pFH154
およびpFH16の側部Hind l[およびBan
H1部位はベクターのポリリンカーに存在する。
第1図はヒ) F N mRNAの成熟タン白に対する
5′非コード領域および完全コータ領域をカバーする異
るcDNAクローンの°制限マツプを示す。クローンp
FHI XpFHmおよびpFH154の単離は上記し
た( Kornblihttら、1983.1984
a)、そして後者のニュークレオチド配列および推定ア
ミノ酸配列は以前公刊された( Kornblihtt
ら、1984b)。クローンpFH54、pFH154
、pFH16おjびpFH(5は新規である。図の5′
の了全カバーするこれら4つのcDNAクローンの単離
はオリゴニュークレオチドゾライマーの合成を含んだ。
5′非コード領域および完全コータ領域をカバーする異
るcDNAクローンの°制限マツプを示す。クローンp
FHI XpFHmおよびpFH154の単離は上記し
た( Kornblihttら、1983.1984
a)、そして後者のニュークレオチド配列および推定ア
ミノ酸配列は以前公刊された( Kornblihtt
ら、1984b)。クローンpFH54、pFH154
、pFH16おjびpFH(5は新規である。図の5′
の了全カバーするこれら4つのcDNAクローンの単離
はオリゴニュークレオチドゾライマーの合成を含んだ。
プライマーの配列(すなわち、
5−GCTC)AACCATTTGCTGAGC)はク
ローンpFH154の5′の端末に近い領域のmRNA
配列を相補するものであった。オリゴニュークレオチド
はHs578 T細胞からの全RNAの最初の逆転写に
使用しく Hackettら、1977)およびc D
NAライブラリは下記のように調製した。クローンpF
H54、pFH154、pFH6およびpFH16はさ
らに分析するため選択された。これらのクローンの完全
なニュークレオチド配列は測定され、7392 bpか
ら成り、そのうちの6972 ’bpはコード領域に、
720 bpは3′非翻訳領域およびぼり(A)尾部に
和尚する。配列は第3図に示すFNの完全DNA配列に
含まれる。
ローンpFH154の5′の端末に近い領域のmRNA
配列を相補するものであった。オリゴニュークレオチド
はHs578 T細胞からの全RNAの最初の逆転写に
使用しく Hackettら、1977)およびc D
NAライブラリは下記のように調製した。クローンpF
H54、pFH154、pFH6およびpFH16はさ
らに分析するため選択された。これらのクローンの完全
なニュークレオチド配列は測定され、7392 bpか
ら成り、そのうちの6972 ’bpはコード領域に、
720 bpは3′非翻訳領域およびぼり(A)尾部に
和尚する。配列は第3図に示すFNの完全DNA配列に
含まれる。
、 第1図のクローンのニュークレオチド配列から推定
されるヒトフィブロネクチンのアミノ酸配列は第2図に
示される。第2図の線列は内部相同を最高化する。完全
なFN鎖は6つの異るタイプの内部相同(タイプ■、■
およびm)t−有する区域および分子内に同族対応を有
しない区域を供する。
されるヒトフィブロネクチンのアミノ酸配列は第2図に
示される。第2図の線列は内部相同を最高化する。完全
なFN鎖は6つの異るタイプの内部相同(タイプ■、■
およびm)t−有する区域および分子内に同族対応を有
しない区域を供する。
後者1NH2端末およびC0OH端末部分および内部連
管ストランにである。MB2−からC00H−末端に、
FNは1つの20残基の長さのMB2−末1部分(第2
図ライン1)、5ユニツトのタイプI相同又はフィンカ
ー(ライン2〜6)、1つの連結ストラン1(ライン7
)、1つのフィンガー(ライン8)、2ユニツトのタイ
プ■相同(ライン9および10)、5つのフィンが−(
ライン11.12および13)、1ユニツトのタイプ■
相同(ライン14)、1つの連結ストランド(ライン1
5)、14ユニツトのタイプ■相同(ライン16〜29
、EDポリペプチドをきむ)、1つの連結ストランド(
rx c’ S。
管ストランにである。MB2−からC00H−末端に、
FNは1つの20残基の長さのMB2−末1部分(第2
図ライン1)、5ユニツトのタイプI相同又はフィンカ
ー(ライン2〜6)、1つの連結ストラン1(ライン7
)、1つのフィンガー(ライン8)、2ユニツトのタイ
プ■相同(ライン9および10)、5つのフィンが−(
ライン11.12および13)、1ユニツトのタイプ■
相同(ライン14)、1つの連結ストランド(ライン1
5)、14ユニツトのタイプ■相同(ライン16〜29
、EDポリペプチドをきむ)、1つの連結ストランド(
rx c’ S。
ライン30)、1ユニツトのタイプ■相同(ライン51
)、1連皓ストランド(ライン52)、3フインガー(
ライン55.54および35)およびC00H−末端部
分(ライン56)により形成される。
)、1連皓ストランド(ライン52)、3フインガー(
ライン55.54および35)およびC00H−末端部
分(ライン56)により形成される。
FNの一次構造に順序のレベルおよび任童の他のタン白
に以前に見られない複雑さを反映する。
に以前に見られない複雑さを反映する。
16ユニツトのタイプ■相同の配列における対称性は特
に興味がある。2ユニツトのタイプm(第2図、ライン
14および61)は並列方法で残りの14を有する中心
ブロックから連結ストランド(ライン15および50)
により分離される。タイ−1mユニット内の相同度は非
常に高い。5つの残基はすべてのユニット、すなわちT
rp(第2図、上部の残4599を有する枠部分)、L
eu(上部の残基640を有する枠部分)およびTyr
(上部の残基646を有する枠部分)に保持される。
に興味がある。2ユニツトのタイプm(第2図、ライン
14および61)は並列方法で残りの14を有する中心
ブロックから連結ストランド(ライン15および50)
により分離される。タイ−1mユニット内の相同度は非
常に高い。5つの残基はすべてのユニット、すなわちT
rp(第2図、上部の残4599を有する枠部分)、L
eu(上部の残基640を有する枠部分)およびTyr
(上部の残基646を有する枠部分)に保持される。
保持残基は非相同の谷により分離されたTrpおよびT
yrの周囲の2個のピークに分配される。タイプ■配列
の順序および保持の度合いはFNの中心領域の二次構造
の特別の拘束を反映しなければならない。この領域にジ
サルファイド橋により安定化されない。それはタイ7°
rII配列に含まれる(第2図の位置1201および2
075)僅か2個のCY8残基が還元形で存在すること
が示されたからである( Vibe−Pedersen
ら、1982;Sm1thら、1982)。
yrの周囲の2個のピークに分配される。タイプ■配列
の順序および保持の度合いはFNの中心領域の二次構造
の特別の拘束を反映しなければならない。この領域にジ
サルファイド橋により安定化されない。それはタイ7°
rII配列に含まれる(第2図の位置1201および2
075)僅か2個のCY8残基が還元形で存在すること
が示されたからである( Vibe−Pedersen
ら、1982;Sm1thら、1982)。
^くつかの結合活性はFN分子の異る領域に制癌てられ
た(第1図および@2図参照)。しかし、細胞結合能力
の場合においてのみ、実際の結合部位が今までに確認さ
れた。実際にPierschbacherおよびRuo
lsahti (1984)はテトラペプチドArg−
Gly−Asp−8er (RGDS)はF’Nの細胞
付着活性の原因となることを実証した。このテトラペプ
チドは1つのタイプ■ユニット内の1495〜1496
位置で第149配列に唯一度だけ存在する。第2図はこ
の区域のタイプ■配列の最適線列は、テトラペプチドが
特別の要素であると考えられる場合にのみ得られ、タイ
プ■ユニットの残りの相当する領域に4つのギャップを
与えることも示す。細胞結合部位と同様にタイプ■配列
内の他の結合部位又は生物学的活性は非保持ストレッチ
に存することは確かなようである。他のテトラペプチド
は細胞付N活性を示すフイブリノーゲンのα鎖tt6他
のタン白(Pierschbacher & Ruol
sahti 。
た(第1図および@2図参照)。しかし、細胞結合能力
の場合においてのみ、実際の結合部位が今までに確認さ
れた。実際にPierschbacherおよびRuo
lsahti (1984)はテトラペプチドArg−
Gly−Asp−8er (RGDS)はF’Nの細胞
付着活性の原因となることを実証した。このテトラペプ
チドは1つのタイプ■ユニット内の1495〜1496
位置で第149配列に唯一度だけ存在する。第2図はこ
の区域のタイプ■配列の最適線列は、テトラペプチドが
特別の要素であると考えられる場合にのみ得られ、タイ
プ■ユニットの残りの相当する領域に4つのギャップを
与えることも示す。細胞結合部位と同様にタイプ■配列
内の他の結合部位又は生物学的活性は非保持ストレッチ
に存することは確かなようである。他のテトラペプチド
は細胞付N活性を示すフイブリノーゲンのα鎖tt6他
のタン白(Pierschbacher & Ruol
sahti 。
1984)にも見出された。
FN遺伝子発現の重要な特徴は通常のmRNA前躯体の
分化ゾロセツシングによる僅かに異るぼりペデチーの生
成である( Vibe−Pedersenら、1984
)。
分化ゾロセツシングによる僅かに異るぼりペデチーの生
成である( Vibe−Pedersenら、1984
)。
第4図AはFN分子に沿って今まで認められた可変性の
2つの領域の局限化を図で示す(Schwarz−ba
uerら、l 985 ; Kornblihttら、
1984a1984b)。第4図BおよびCはED(第
2図、ライン26)および1icS(第2図、ライン5
0)領域でそれぞれ生成する異るmRNAの翻訳により
生じうる式リペゾチドのタイプを示す。この図はヒトお
よびラット双方のフィブロネクチンに対しなされ九観察
を組み合せる。少なくとも10の異るFNボリペゾチド
はHDおよびllIc5部分間のすべての順列が可能で
あると仮定する場合1個の遺伝子から生成することがで
きる。これは生体内に見出された細胞質および血漿FN
の二次元のデル電気泳動分析で認められたFNポリペデ
チド不均質性と一致する。同種又は異種二量体FN分子
はFNボリペゾチドゾールから形成することができる。
2つの領域の局限化を図で示す(Schwarz−ba
uerら、l 985 ; Kornblihttら、
1984a1984b)。第4図BおよびCはED(第
2図、ライン26)および1icS(第2図、ライン5
0)領域でそれぞれ生成する異るmRNAの翻訳により
生じうる式リペゾチドのタイプを示す。この図はヒトお
よびラット双方のフィブロネクチンに対しなされ九観察
を組み合せる。少なくとも10の異るFNボリペゾチド
はHDおよびllIc5部分間のすべての順列が可能で
あると仮定する場合1個の遺伝子から生成することがで
きる。これは生体内に見出された細胞質および血漿FN
の二次元のデル電気泳動分析で認められたFNポリペデ
チド不均質性と一致する。同種又は異種二量体FN分子
はFNボリペゾチドゾールから形成することができる。
この複合状態の生物学的意義は尚明らかではない。しか
しFDおよび■C8の変動領域はn」胞−ヘパリンおよ
びヘパリン−フィブリン結合部位間に介在することは注
目されることである。分子のこれらの生物学的活性部位
間の距離はFN機能に対し臨界的である。例えば、血漿
FNは形態および線列を形質変換噴維芽細胞セルライン
に復帰するのく細胞質フィブロネクチンより活性の低い
1〜2オーダーの大きさである( Yamada &K
ennedy、 1979 ) oさらにlliiD部
分を有するmRNAは繊維芽細胞に存在する(JBI胞
質FNの1起源)が、肝細胞には存在しない(血[FN
の1起#) (Kornblihttら、1984b)
o EDの機能は細胞結合テトラペプチドおよびヘパリ
ン結合部位間の距離全増加させることで、細胞質F’N
分子の結合活性を増強することになる。
しFDおよび■C8の変動領域はn」胞−ヘパリンおよ
びヘパリン−フィブリン結合部位間に介在することは注
目されることである。分子のこれらの生物学的活性部位
間の距離はFN機能に対し臨界的である。例えば、血漿
FNは形態および線列を形質変換噴維芽細胞セルライン
に復帰するのく細胞質フィブロネクチンより活性の低い
1〜2オーダーの大きさである( Yamada &K
ennedy、 1979 ) oさらにlliiD部
分を有するmRNAは繊維芽細胞に存在する(JBI胞
質FNの1起源)が、肝細胞には存在しない(血[FN
の1起#) (Kornblihttら、1984b)
o EDの機能は細胞結合テトラペプチドおよびヘパリ
ン結合部位間の距離全増加させることで、細胞質F’N
分子の結合活性を増強することになる。
試 験
RNA調製
ヒトセルライア Hs 578 T (Hackett
ら、1977)を10%牛脂児血清を含むDulbec
co修正Eagle培地で培養した。総RNA f:グ
アニジンーHC1法により集密的細胞単層から抽出した
( Chirgwinら、1979)。2〜41R9間
の総RNAを4X108M胞から抽出した。
ら、1977)を10%牛脂児血清を含むDulbec
co修正Eagle培地で培養した。総RNA f:グ
アニジンーHC1法により集密的細胞単層から抽出した
( Chirgwinら、1979)。2〜41R9間
の総RNAを4X108M胞から抽出した。
RNAの他の起源は好ましい場合、例えば喰維芽細砲又
は肝細胞を使用できる。
は肝細胞を使用できる。
第1図に描写したすべてのcDNAクローンは鋳型とし
てHs 578T細胞RNAを使用して得た。オリゴニ
ュークレオチドデローデによるクローンpFH1の単離
はKornblihttら(198!l)により記載さ
れた。クローンpFH111およびpFH154のr
mRNA歩行(walking ) J (オリゴニュ
ークレオチドゾライミング(priming ) ]に
よる単雛はKornblihttら(1984a)によ
り記載された。この最後の手順は新規クローンpFH5
4、pFH154、pFH16およびpFH6の単離に
使用された。pFHl 54の5′末端に近接するmR
NA領域に相補的なオリゴニュークレオチドゾライマー
はGai tら(1980)の方法により合成された。
てHs 578T細胞RNAを使用して得た。オリゴニ
ュークレオチドデローデによるクローンpFH1の単離
はKornblihttら(198!l)により記載さ
れた。クローンpFH111およびpFH154のr
mRNA歩行(walking ) J (オリゴニュ
ークレオチドゾライミング(priming ) ]に
よる単雛はKornblihttら(1984a)によ
り記載された。この最後の手順は新規クローンpFH5
4、pFH154、pFH16およびpFH6の単離に
使用された。pFHl 54の5′末端に近接するmR
NA領域に相補的なオリゴニュークレオチドゾライマー
はGai tら(1980)の方法により合成された。
オリテニュークレオチドはas578T!胞からの総R
NAのプライム逆転写に使用された( Hackett
ら、1977)、プラント末4 ds cDNAは調製
され、上記のように’B、 coli M CI Q
(5l (Korn−blihtt ラ、19El)の
デフ x ミF pAT 155/ p’vu n /
8 (Ansonら、1984)にクローンされた。
NAのプライム逆転写に使用された( Hackett
ら、1977)、プラント末4 ds cDNAは調製
され、上記のように’B、 coli M CI Q
(5l (Korn−blihtt ラ、19El)の
デフ x ミF pAT 155/ p’vu n /
8 (Ansonら、1984)にクローンされた。
コロニーは一端でフィリングすることによりラベルされ
た、プライマー配列を欠(pFH154の5′末端から
の制限断片をプローブとして使用してスクリーニングし
た。この方法で、クローンpFH54およびpFH15
4が得られた。第2工程ではクローンpFH16および
6がクローンpFH154の5′末端に対する末端ラベ
ルゾローデによりスクリーニングすることにより得られ
た。
た、プライマー配列を欠(pFH154の5′末端から
の制限断片をプローブとして使用してスクリーニングし
た。この方法で、クローンpFH54およびpFH15
4が得られた。第2工程ではクローンpFH16および
6がクローンpFH154の5′末端に対する末端ラベ
ルゾローデによりスクリーニングすることにより得られ
た。
フィブロネクチンcNDAの制限断片はDNAポリメラ
ーゼIのフレノウ断片を満たし、そしてSamIカット
/ホスファターゼ処理pgxL2又は5ベクターにプラ
ント末端を連結した。形質変換はカナマイシン耐性を特
定し、01857対立遺伝子を有するシラスミドpc
1857 (Remautら翫19831含むE、 c
oli株L K I[(Zabeanら、1982)を
使用して行なった。コロニーはwhatman 541
個紙に移しく Gergenら、1985)、り末端ラ
ベル(Maxamら、1977)又はニック翻訳プロー
ブ(Rigbyら、1977)のいずれかによりスクリ
ーンされた。
ーゼIのフレノウ断片を満たし、そしてSamIカット
/ホスファターゼ処理pgxL2又は5ベクターにプラ
ント末端を連結した。形質変換はカナマイシン耐性を特
定し、01857対立遺伝子を有するシラスミドpc
1857 (Remautら翫19831含むE、 c
oli株L K I[(Zabeanら、1982)を
使用して行なった。コロニーはwhatman 541
個紙に移しく Gergenら、1985)、り末端ラ
ベル(Maxamら、1977)又はニック翻訳プロー
ブ(Rigbyら、1977)のいずれかによりスクリ
ーンされた。
配列の決定
クローンからのインサートはアがロースデル電気泳動で
分離され、電気溶離により回収された( Girwit
zら、1980)ベクターDNAから適当な制限酵素で
消化することにより除去された。大部分の配列はMa:
camおよびG11bert (1980)の化学的分
解処理により行なわれた。いくつかの領域は連鎖ターミ
ネータ法(Sangerら、1977)により配列され
た。この目的に対し、関連断片は単離され、AluI又
はHae l[のいずれかにより消化され、そのサーキ
ュラ−化を阻止するために子牛暢ホスファターゼにより
予め処理されたSma I消化M13mp9ベクターに
連結された( Messinggo Vieira、
1982 )。連結混合物はコンビテン) E、 co
li J M 101 t−形質変換するために使用さ
れ、再結合物はβ−がラクトシダーゼ遺伝子のインサー
ト不活性化により透明ゾラークとして選択された( M
essingら、1981)。1個のストランp DN
Aは標準手順により製造され(Winter&Fiel
ds 、 1980 )、インサートハ「万能的」17
−ニュークレオチドのゾライマーを使用して配列された
C Duckworthら、1981)。
分離され、電気溶離により回収された( Girwit
zら、1980)ベクターDNAから適当な制限酵素で
消化することにより除去された。大部分の配列はMa:
camおよびG11bert (1980)の化学的分
解処理により行なわれた。いくつかの領域は連鎖ターミ
ネータ法(Sangerら、1977)により配列され
た。この目的に対し、関連断片は単離され、AluI又
はHae l[のいずれかにより消化され、そのサーキ
ュラ−化を阻止するために子牛暢ホスファターゼにより
予め処理されたSma I消化M13mp9ベクターに
連結された( Messinggo Vieira、
1982 )。連結混合物はコンビテン) E、 co
li J M 101 t−形質変換するために使用さ
れ、再結合物はβ−がラクトシダーゼ遺伝子のインサー
ト不活性化により透明ゾラークとして選択された( M
essingら、1981)。1個のストランp DN
Aは標準手順により製造され(Winter&Fiel
ds 、 1980 )、インサートハ「万能的」17
−ニュークレオチドのゾライマーを使用して配列された
C Duckworthら、1981)。
再結合シラスミrを有する細菌は50℃で2T時間生長
させ、CrO/β−がラクトシダーゼ融合タン白の発現
は2時間42℃に変えることにより誘導した。細菌は1
200!qのペレットにし、50ミリモルトリスHCt
Xp)l 7.4.170ミリモルkctにより洗滌
した。細胞はりゾチーム(2,51n97 ml )
tl−含む同じ緩衝液に再懸濁し、2分間氷上で音波処
理した。分解物は4℃で50分、 45,000yで遠
心分離した。ペレットは10ミリモルトリスHC1中の
7モル尿素、pH7,4,1ミリモルBDTA中に再懸
濁し、30分室温でインキュベートした。
させ、CrO/β−がラクトシダーゼ融合タン白の発現
は2時間42℃に変えることにより誘導した。細菌は1
200!qのペレットにし、50ミリモルトリスHCt
Xp)l 7.4.170ミリモルkctにより洗滌
した。細胞はりゾチーム(2,51n97 ml )
tl−含む同じ緩衝液に再懸濁し、2分間氷上で音波処
理した。分解物は4℃で50分、 45,000yで遠
心分離した。ペレットは10ミリモルトリスHC1中の
7モル尿素、pH7,4,1ミリモルBDTA中に再懸
濁し、30分室温でインキュベートした。
可溶化抽出物は4℃で50ミリモルトリスHCtpH7
,4に対し広く透析し、次に4℃で50分、45,00
0gで遠心分離した。
,4に対し広く透析し、次に4℃で50分、45,00
0gで遠心分離した。
ゼラチン−セファロースはSigma Chemica
ls(St、 Louis、 Mo、 USA )から
得るか、又はゼラチン(豚皮タイプ■、Sigma C
hemicals )をCNB r−活性化セファロー
スCL 、 4 B (Pharmacia IUpp
sala、 Sweden )に結合させることにより
製造した。ゼラチン−セファロース上の細菌抽出物のり
cyマドグラフィ14 Ruoslahtiら(198
2)による記載のように行なった。ゼラチン−セファロ
ースマトリックスの効力は精製ヒト血漿フイブロネクチ
y (Sigma Chemicals )に使用して
立証された。
ls(St、 Louis、 Mo、 USA )から
得るか、又はゼラチン(豚皮タイプ■、Sigma C
hemicals )をCNB r−活性化セファロー
スCL 、 4 B (Pharmacia IUpp
sala、 Sweden )に結合させることにより
製造した。ゼラチン−セファロース上の細菌抽出物のり
cyマドグラフィ14 Ruoslahtiら(198
2)による記載のように行なった。ゼラチン−セファロ
ースマトリックスの効力は精製ヒト血漿フイブロネクチ
y (Sigma Chemicals )に使用して
立証された。
5DS−ポリアクリルアミドデル電気泳動を7.5%(
W/V )アクリルアミドスラブデル(19)上でトリ
ス/グリシン緩衝液中の0.1%(W/V )SDSで
行なった。デルはメタノール/水/酢酸(4二5:1、
容量で)中の0.1%クローンーブルーで染色した。イ
ムノプロッティングはTbwbinら(1979)によ
る記載のように行なった。電気泳動によりニトロセルロ
ースに移動したポリペゾチドはウサゼ抗(ヒト血漿フィ
ブロネクチン)血清(1:500、ホスフェート緩衝塩
水、10%新生子牛血清および0.05%ツイーン20
中で)によりゾローブされた。結合免疫グロブリンはア
ルカリ性ホスファターゼ抱合山羊抗−(ウサギIgG
) (1: I D OO; Sigma Chemi
cals ) f使用して可視化した。
W/V )アクリルアミドスラブデル(19)上でトリ
ス/グリシン緩衝液中の0.1%(W/V )SDSで
行なった。デルはメタノール/水/酢酸(4二5:1、
容量で)中の0.1%クローンーブルーで染色した。イ
ムノプロッティングはTbwbinら(1979)によ
る記載のように行なった。電気泳動によりニトロセルロ
ースに移動したポリペゾチドはウサゼ抗(ヒト血漿フィ
ブロネクチン)血清(1:500、ホスフェート緩衝塩
水、10%新生子牛血清および0.05%ツイーン20
中で)によりゾローブされた。結合免疫グロブリンはア
ルカリ性ホスファターゼ抱合山羊抗−(ウサギIgG
) (1: I D OO; Sigma Chemi
cals ) f使用して可視化した。
タン自分析
タン白は標準として牛血清アルブミンを使用してBra
dford法(1973)により評価した。
dford法(1973)により評価した。
性表示
ヒトフィブロネクチンcDNAクローンのpFHi34
およびpFH16はタン白のタン自分解開裂により確認
されたフィブロネクチンのコラーゲン結合領域のすべて
又は一部を包含する(第1図および第5図参照)。従っ
てこれらのc DNAはE、 coliの機能的コラー
ゲン結合部位の発現を研究するため出発点として選択さ
れた。クローニングに対し使用されるpEXベクターは
外因性遺伝子配列をλ孜プロモーターの調整下にcro
−Laczバイブリド遺伝子の6′末端ですべての5つ
の読み枠のボ+J IJンカーにインサートすることが
できる( 5tanleyら、1984)。1)FH1
34およびpFH16の1.74bおよび1.01cb
インサートの5′末端はCDNAおよびpEX 2のS
ma r部位にクローン化されるプラント末端の読み枠
を確定するために配列された( Maxmaら、198
0)。再結合プラスミドは温度感受性λPrリプレッサ
ー、01857ftコード化するシラスミドにより予め
形質変換されたE。
およびpFH16はタン白のタン自分解開裂により確認
されたフィブロネクチンのコラーゲン結合領域のすべて
又は一部を包含する(第1図および第5図参照)。従っ
てこれらのc DNAはE、 coliの機能的コラー
ゲン結合部位の発現を研究するため出発点として選択さ
れた。クローニングに対し使用されるpEXベクターは
外因性遺伝子配列をλ孜プロモーターの調整下にcro
−Laczバイブリド遺伝子の6′末端ですべての5つ
の読み枠のボ+J IJンカーにインサートすることが
できる( 5tanleyら、1984)。1)FH1
34およびpFH16の1.74bおよび1.01cb
インサートの5′末端はCDNAおよびpEX 2のS
ma r部位にクローン化されるプラント末端の読み枠
を確定するために配列された( Maxmaら、198
0)。再結合プラスミドは温度感受性λPrリプレッサ
ー、01857ftコード化するシラスミドにより予め
形質変換されたE。
coli株に導入された。これはcro /β−がラク
トシダーゼタン白の温度訪導性発現を考慮する。発現構
造体によるフィブロネクチン融合タン白の生産を試験す
るためにバイブリド形成陽性のクローンを50℃で2T
時間生長させ、次にさらに2時間42℃に変えた。総細
菌分解物をSDSポリアクリルアミドデル電気泳動によ
り分析した。シ1oのpXFH154構造体およびレフ
pXFH16構造体はcDNAインテートの長さC〜1
85KDおよび〜165KD、それぞれ)と一致する大
きさの高分子量ポリペデチげの生産を示した。pXFI
(154および])XFH16のフィブロネクチン配列
の正しい配向は制限酵素分析により確証された。
トシダーゼタン白の温度訪導性発現を考慮する。発現構
造体によるフィブロネクチン融合タン白の生産を試験す
るためにバイブリド形成陽性のクローンを50℃で2T
時間生長させ、次にさらに2時間42℃に変えた。総細
菌分解物をSDSポリアクリルアミドデル電気泳動によ
り分析した。シ1oのpXFH154構造体およびレフ
pXFH16構造体はcDNAインテートの長さC〜1
85KDおよび〜165KD、それぞれ)と一致する大
きさの高分子量ポリペデチげの生産を示した。pXFI
(154および])XFH16のフィブロネクチン配列
の正しい配向は制限酵素分析により確証された。
pXFH154およびpXFH16により生産された融
合タン白はこのベクターシステムに対し既報文と一致す
る約20%の全細菌タン白を証明した( 5tanle
yら、1984)。両融合タン白、特にpXFH1ろ4
ボリペゾチドはめくらかのタン自分解全示し、これμ野
生タイプのcro /β−がラクトシダーゼ(116K
D)の大きさに部分開裂されるらしい。誘導期間(0〜
120分)に合成されたタン白の分析はタン自分解が融
合タン白の合成に付随して起ったことを示した。
合タン白はこのベクターシステムに対し既報文と一致す
る約20%の全細菌タン白を証明した( 5tanle
yら、1984)。両融合タン白、特にpXFH1ろ4
ボリペゾチドはめくらかのタン自分解全示し、これμ野
生タイプのcro /β−がラクトシダーゼ(116K
D)の大きさに部分開裂されるらしい。誘導期間(0〜
120分)に合成されたタン白の分析はタン自分解が融
合タン白の合成に付随して起ったことを示した。
pXFH1Z、 4 オよびpXFH16のフィブロネ
クチン抗原決定基の発現はウサギポリクローナル抗−(
ヒト血漿フィブロネクチン)血清を使用してイムノプロ
ッティングにより研究された。抗血清はpXFH134
により合成された1 85 KDポリペプチドと反応す
るが、pXFH16融合タン白又鉱cr。
クチン抗原決定基の発現はウサギポリクローナル抗−(
ヒト血漿フィブロネクチン)血清を使用してイムノプロ
ッティングにより研究された。抗血清はpXFH134
により合成された1 85 KDポリペプチドと反応す
るが、pXFH16融合タン白又鉱cr。
/β−がラクトシダーゼボリペデチPとは反応しない。
これは抗血清によV認識されるエピトープはタイプ■相
同ユニットおよび隣接するタイプ■リピートの外側にあ
ることを示す(第5図)0この観察は既報(Ruosl
ahtiら、1979)のヒトフィブロネクチンのコラ
ーゲン結合領域の弱い抗原性と一致し、十中へ九はこの
領域における非常に高レベルのアミノ酸保持を反映する
ものであろう(第2図)。
同ユニットおよび隣接するタイプ■リピートの外側にあ
ることを示す(第5図)0この観察は既報(Ruosl
ahtiら、1979)のヒトフィブロネクチンのコラ
ーゲン結合領域の弱い抗原性と一致し、十中へ九はこの
領域における非常に高レベルのアミノ酸保持を反映する
ものであろう(第2図)。
ゼラチン−セファロース親和クロマトグラフィE、 c
oliのβ−がラクトシダーゼ融合の過生産は不溶性混
合体として細胞にタン白の沈St生ずる( Willi
amsら、19 B 2 ; Cbeng 1983
;8tanley 1985 ) o pXFH15
4プラスミドを発現する細菌が音波処理により分解され
、遠心分離される場合、フィブロネクチン融合タン白は
不溶性ペレットにもっばら見出された。このフラクショ
ンは細菌分解物の全タン白の約50%を表わした。この
材料の可溶化は7M尿素による処理およびその後透析を
要し、60%のタン白が溶液中に残った。融合タン日中
に非常に強化されたこのフラクションH50ミリモルト
リスHC’tXpH7,4中で平方化された5Mのゼラ
チン−セファロースカラムに直接適用された。カラムは
通過流のE280が< 0.01になるまで50ミリモ
ルトリスHC1。
oliのβ−がラクトシダーゼ融合の過生産は不溶性混
合体として細胞にタン白の沈St生ずる( Willi
amsら、19 B 2 ; Cbeng 1983
;8tanley 1985 ) o pXFH15
4プラスミドを発現する細菌が音波処理により分解され
、遠心分離される場合、フィブロネクチン融合タン白は
不溶性ペレットにもっばら見出された。このフラクショ
ンは細菌分解物の全タン白の約50%を表わした。この
材料の可溶化は7M尿素による処理およびその後透析を
要し、60%のタン白が溶液中に残った。融合タン日中
に非常に強化されたこのフラクションH50ミリモルト
リスHC’tXpH7,4中で平方化された5Mのゼラ
チン−セファロースカラムに直接適用された。カラムは
通過流のE280が< 0.01になるまで50ミリモ
ルトリスHC1。
pi17.4中の0.5モルNaC6により洗滌した。
cro/β−がラクトシダーゼフイデロネクチンハイプ
リドタン白は同じ緩衝液中の4モル尿素により1つの対
称ピークとしてカラムから溶離された。これらの条件下
でフィブロネクチンはぜラチンーセファロースから特定
的に溶離される( Ruoslahtiら、1982)
。pEX 2のみを使用する対照試験では、野生タイプ
のcro /β−がラクトシダーゼタン白の結合は全く
認められなかった。
リドタン白は同じ緩衝液中の4モル尿素により1つの対
称ピークとしてカラムから溶離された。これらの条件下
でフィブロネクチンはぜラチンーセファロースから特定
的に溶離される( Ruoslahtiら、1982)
。pEX 2のみを使用する対照試験では、野生タイプ
のcro /β−がラクトシダーゼタン白の結合は全く
認められなかった。
機能的コラーゲン結合部位は従ってpXFH154融合
タン白中で再、購成された。しかし、特定的にカラムか
ら溶離される融合タン白はカラムに適用された融合タン
白のく5%を表わした。こうして細浦細胞中の融合タン
白の不溶化によりかなりの活性が失なわれることは意外
なことではない。その後これらを再溶解するために烈し
い処理が必要である。
タン白中で再、購成された。しかし、特定的にカラムか
ら溶離される融合タン白はカラムに適用された融合タン
白のく5%を表わした。こうして細浦細胞中の融合タン
白の不溶化によりかなりの活性が失なわれることは意外
なことではない。その後これらを再溶解するために烈し
い処理が必要である。
pXFH16Kより生産されるフィブロネクチン融合タ
ン白もゼラチン結合に対し試験がなされ、pXFH15
4と同様の活性を示した。これはコラーゲン結合領域が
タン白レベルの規定領域内に存在し、2つのタイプ■お
よび隣接するタイプI相同ユニットに強く関係すること
を示した(第5図参照)。さらに結合部位を局限するた
めに一連の重複表現構造物をpFH16から製造しく第
5図)、ゼラチン結合活性を系統的に分析した。結果は
表1に要約し、タイプ■相同ユニットの一貫した関連性
を示す(pXFN 2 、sおよび6)。
ン白もゼラチン結合に対し試験がなされ、pXFH15
4と同様の活性を示した。これはコラーゲン結合領域が
タン白レベルの規定領域内に存在し、2つのタイプ■お
よび隣接するタイプI相同ユニットに強く関係すること
を示した(第5図参照)。さらに結合部位を局限するた
めに一連の重複表現構造物をpFH16から製造しく第
5図)、ゼラチン結合活性を系統的に分析した。結果は
表1に要約し、タイプ■相同ユニットの一貫した関連性
を示す(pXFN 2 、sおよび6)。
表 1
pXF!(154+
pXFH16+
pXFN l −
pXFN2 +
pXFN 5+
pXFN 4 −p
XFN 5 −pX
FN 6 +pX
FN 7 −pXFN
F3 −pEX2ベク
ターのみ −1)XF’H54の結合活性
は2つのタイプ「相同ユニットから成る構造物によりほ
とんど完全に説明される( pXFN 3 )。pxF
N5オヨヒpXFN6(双方共活性)とpXFN 5お
よびpXFN 8 (双方共不活(4)を比奴すること
により、結合に対し臨界的のアミノ酸結合はpXl[i
”N 5のフィブロネクチン断片の半分のC−末端にあ
り、さらに詳ri’jfJにはHinfl(第6図の配
u1147)からRsa(部位(第5図の配u1551
)にあると推定できる。この66アミノ酸配列はフィブ
ロネクチンのほとんど全体の第2のタイ7°II相同ユ
ニツトプラス隣接タイプI相同ユニツトの少数のアミノ
酸を表わす(第2図参照)。
XFN 5 −pX
FN 6 +pX
FN 7 −pXFN
F3 −pEX2ベク
ターのみ −1)XF’H54の結合活性
は2つのタイプ「相同ユニットから成る構造物によりほ
とんど完全に説明される( pXFN 3 )。pxF
N5オヨヒpXFN6(双方共活性)とpXFN 5お
よびpXFN 8 (双方共不活(4)を比奴すること
により、結合に対し臨界的のアミノ酸結合はpXl[i
”N 5のフィブロネクチン断片の半分のC−末端にあ
り、さらに詳ri’jfJにはHinfl(第6図の配
u1147)からRsa(部位(第5図の配u1551
)にあると推定できる。この66アミノ酸配列はフィブ
ロネクチンのほとんど全体の第2のタイ7°II相同ユ
ニツトプラス隣接タイプI相同ユニツトの少数のアミノ
酸を表わす(第2図参照)。
引用文献
Anion r D、+Choo +に、H,、R66
1i1+D、J 、G、+Giannelli 、F、
+Couldl K、+ )Iu(1d168tonl
J 、A、!Ln(I Brownies +G、
G。
1i1+D、J 、G、+Giannelli 、F、
+Couldl K、+ )Iu(1d168tonl
J 、A、!Ln(I Brownies +G、
G。
(1984) guao J、3.1053−1064
゜Braarord u、(xc+7s)+Anat、
Biocham、+72+24s−2s4゜Chirg
win l J 、M、 +PrZybyla+ A、
E−+MaCDOnald+ R,J 、 an(I
Rutter、W、J、(1979) Biochem
istry 1815294−5299゜Cjh6nl
f Y、(1983) r Biochem、 Bio
phy 9 + Res 、Commun、1111.
104−111゜ Duckworth、lJ、L、 +Ga1t+M、J
、 +GO616t+P、+HOng+G、F、、 5
inqh、 M、 and Titmas、 R,C,
(1981)Nucl、Ac1ds Res、9,16
91−1706゜Ga1t、 M、J、 et al−
(1980) 、Nucl、Ac1ds Res、 8
−、1081−1096゜ Garcia−Pardo、 A、、 Pearlst
sin、 E、 and Frangione。
゜Braarord u、(xc+7s)+Anat、
Biocham、+72+24s−2s4゜Chirg
win l J 、M、 +PrZybyla+ A、
E−+MaCDOnald+ R,J 、 an(I
Rutter、W、J、(1979) Biochem
istry 1815294−5299゜Cjh6nl
f Y、(1983) r Biochem、 Bio
phy 9 + Res 、Commun、1111.
104−111゜ Duckworth、lJ、L、 +Ga1t+M、J
、 +GO616t+P、+HOng+G、F、、 5
inqh、 M、 and Titmas、 R,C,
(1981)Nucl、Ac1ds Res、9,16
91−1706゜Ga1t、 M、J、 et al−
(1980) 、Nucl、Ac1ds Res、 8
−、1081−1096゜ Garcia−Pardo、 A、、 Pearlst
sin、 E、 and Frangione。
B、 (1983) 、J、Biol、Chem、 2
58.12670−12674゜Gergen J、P
、、 5tern R,H,、and Wersink
P、C,(1979)。
58.12670−12674゜Gergen J、P
、、 5tern R,H,、and Wersink
P、C,(1979)。
Nucl、Ac1ds Res、 フ、2115−
2136゜Girwitz、 S、C,、Bacche
tti、 S、、 Rainbow、 A、J、 an
dGraham、 F、L* (1980) Anal
、 Biochem、 106.492−496゜ Hackett、 A、J、、 Sm1th、 H,S
、、 5prinqer、 EEL、、 Owens。
2136゜Girwitz、 S、C,、Bacche
tti、 S、、 Rainbow、 A、J、 an
dGraham、 F、L* (1980) Anal
、 Biochem、 106.492−496゜ Hackett、 A、J、、 Sm1th、 H,S
、、 5prinqer、 EEL、、 Owens。
RoB、、 Ne1son−Raes、 W、A、、
Rlgqs、 J、L、 andGardnar、 M
、B、 (1977) 、J、NatlaCancer
工nst、 58゜1795−1800゜ Hynas、 R,O,and Yar+zada、
K、M、 (1982) 、JaCell、Biol
。
Rlgqs、 J、L、 andGardnar、 M
、B、 (1977) 、J、NatlaCancer
工nst、 58゜1795−1800゜ Hynas、 R,O,and Yar+zada、
K、M、 (1982) 、JaCell、Biol
。
95、 369−377゜
Kornblihtt、 A、R,、Vibe−Ped
ersen、 T1.、 and Baralle。
ersen、 T1.、 and Baralle。
F、E、 (1983) 、Proc、 Natl、
Acad、Sci、t7SA 80゜321B−32
22゜ Kornblihtt、 A、R,、Vibe−Pai
ersen、 K、 and Baralle。
Acad、Sci、t7SA 80゜321B−32
22゜ Kornblihtt、 A、R,、Vibe−Pai
ersen、 K、 and Baralle。
F、E、 (1984a) 、EMBOJ、 2.22
1−226゜Kornblihtt、 A、R,、Vi
be−Pedersen、 L and Barall
e。
1−226゜Kornblihtt、 A、R,、Vi
be−Pedersen、 L and Barall
e。
F、E、 (1984b) 、rゴuc1.Ac
1ds Res、 二12. 5853−5868
゜Maxam、 A、M、 and G11bert、
W、 (1977) Proc、 Natl、A
cad。
1ds Res、 二12. 5853−5868
゜Maxam、 A、M、 and G11bert、
W、 (1977) Proc、 Natl、A
cad。
Sci、U、S、A、74,560−569゜Maxa
m、 A、M、 and G11berし、 w、
(1980) Meth、Enzym、 65゜499
−580゜ Messinq、 J、 and Vieira、 J
、 (1982) 、Gene 19.269−27
3゜Messing、 J、、 Crea、 R,an
d 5eeburq、 P、H,(1981)Nucl
、Ac1ds Res、9,309−321゜01db
erg、 As、 Linney、 E、 and R
uoslahti、 E、 (1983)J、Bio
l、Chem、258,10193−10196゜Pa
nde、 Ha and 5hively、 J、E、
(1982) 、Arch、Biochem。
m、 A、M、 and G11berし、 w、
(1980) Meth、Enzym、 65゜499
−580゜ Messinq、 J、 and Vieira、 J
、 (1982) 、Gene 19.269−27
3゜Messing、 J、、 Crea、 R,an
d 5eeburq、 P、H,(1981)Nucl
、Ac1ds Res、9,309−321゜01db
erg、 As、 Linney、 E、 and R
uoslahti、 E、 (1983)J、Bio
l、Chem、258,10193−10196゜Pa
nde、 Ha and 5hively、 J、E、
(1982) 、Arch、Biochem。
Biophys、 21旦、 25B−265゜Pet
ersen、T、、Thφqersen、H,C,、S
korstengaard、に、。
ersen、T、、Thφqersen、H,C,、S
korstengaard、に、。
Vibe−Pedersen、に、、5ahl、P、、
5ottrup−Jensen。
5ottrup−Jensen。
L、 and Magnusson、 S、 (19
83) 1’roc、Natl、Acad。
83) 1’roc、Natl、Acad。
Sci、USA 80,137−141゜Piersc
hbache′I;、 M、D、 and Ruosl
ahti、 E、 (1984)Nature 30
9,30−33゜ Ramaut E、、 Tsao H,and Fie
rs W、 (1983) 、Gene、 22゜1
03−113゜ Rlqby P、W、J、、 Dieckmama H
,Rhodes C,、and Berg P。
hbache′I;、 M、D、 and Ruosl
ahti、 E、 (1984)Nature 30
9,30−33゜ Ramaut E、、 Tsao H,and Fie
rs W、 (1983) 、Gene、 22゜1
03−113゜ Rlqby P、W、J、、 Dieckmama H
,Rhodes C,、and Berg P。
(1977)、J、Mo1. Biol、 ユi3
. 23フ−251゜Ruoslahti、 E、、
Hayman、 E、G、、 K1nn5ela P、
、 5hivelyJ、E、、 arid Enqva
ll E、、 (1979)、 J、Biol、Ch
em。
. 23フ−251゜Ruoslahti、 E、、
Hayman、 E、G、、 K1nn5ela P、
、 5hivelyJ、E、、 arid Enqva
ll E、、 (1979)、 J、Biol、Ch
em。
254.6054−6059゜
Ruoslahti、 E−t Hayman EaG
−t Piersbacher M−# andEng
vall E、 (1982)、 Meth、 En
zymol* 82.803−831゜8anger、
F、、 rJicklen、 s、 and Cou
lson、 A、R,(1977)Proc、Natl
、Acad、Sci、USA 74. 5463−5
467゜Schwarzbauer、 JsE*、 T
amkun、 J、W*、 TAmischka、工、
R0and Hynes、 R,O,(1983) 、
Ce1l 35.421−431゜!9korsten
qaard、 K、、Th(llqersen、
H,C,、Vibe−Pedersen。
−t Piersbacher M−# andEng
vall E、 (1982)、 Meth、 En
zymol* 82.803−831゜8anger、
F、、 rJicklen、 s、 and Cou
lson、 A、R,(1977)Proc、Natl
、Acad、Sci、USA 74. 5463−5
467゜Schwarzbauer、 JsE*、 T
amkun、 J、W*、 TAmischka、工、
R0and Hynes、 R,O,(1983) 、
Ce1l 35.421−431゜!9korsten
qaard、 K、、Th(llqersen、
H,C,、Vibe−Pedersen。
K、、 Petersen、 T、E、 and Ma
qnusson、、 S、、 (1982)]?ur、
J、R1ochem、 128. 605−623゜
Sm1th、 D、G、、 Mo5her、 D、F、
、 Johnson、 R,B、 and Furch
t。
qnusson、、 S、、 (1982)]?ur、
J、R1ochem、 128. 605−623゜
Sm1th、 D、G、、 Mo5her、 D、F、
、 Johnson、 R,B、 and Furch
t。
L、T、 (1982) J、Biol、 Chem
、 257.5831−5838゜5tanley K
、に、 (1983)、 Nucl、 Ac1ds R
es、 11.4077−4092゜ 5tanley K、に、 and Thuzio、
P、 (1984) 、EMnOJ、 3゜1429−
1434゜ Tarnkun、J−に−# Schwarzbaue
r、 J、E−and Hynes、 R−0−(19
84) 、Proc、Natl、 Acad、 Sci
、USA 81.5140−5144゜Towbin
H,、5taehlin T、 and Gordon
、:r、 (1979)。
、 257.5831−5838゜5tanley K
、に、 (1983)、 Nucl、 Ac1ds R
es、 11.4077−4092゜ 5tanley K、に、 and Thuzio、
P、 (1984) 、EMnOJ、 3゜1429−
1434゜ Tarnkun、J−に−# Schwarzbaue
r、 J、E−and Hynes、 R−0−(19
84) 、Proc、Natl、 Acad、 Sci
、USA 81.5140−5144゜Towbin
H,、5taehlin T、 and Gordon
、:r、 (1979)。
Proc、Natl、、 Acad、 Sci、U、S
、A、、 73、4350−4354゜Urtieza
wa、 K、、 Kornblihtt、 A、R,a
nd Baralle、 F、E。
、A、、 73、4350−4354゜Urtieza
wa、 K、、 Kornblihtt、 A、R,a
nd Baralle、 F、E。
(1985) 、submitted to FEBS
Lett。
Lett。
Vibe−Pedersen、 K、、5ahl、P
、、 5korstenqaard、 K、 a
ndPetersen、 T、E、 (1982)
、FEBS Lett、 142.27−30゜Vib
e−Pedersen、 K、、 Kornbliht
t、 A、R,and Baralle。
、、 5korstenqaard、 K、 a
ndPetersen、 T、E、 (1982)
、FEBS Lett、 142.27−30゜Vib
e−Pedersen、 K、、 Kornbliht
t、 A、R,and Baralle。
F、E、 (1984) 、EMBOJ、 2.251
1−2516゜Williams D、C,、Vani
″Frank R,M、、 Muth W、L、 an
dBurnett J、P、 (1982)、 5ci
ence 215.687−689゜Winter、
G、 and Fields、 S、 (19RO
) 、Nucl、Ac1ds Ras。
1−2516゜Williams D、C,、Vani
″Frank R,M、、 Muth W、L、 an
dBurnett J、P、 (1982)、 5ci
ence 215.687−689゜Winter、
G、 and Fields、 S、 (19RO
) 、Nucl、Ac1ds Ras。
8.1965−1974゜
Yamada、 K、M、 and Kennedy、
D、W、 (1979) 、J、Ce1l、Bio
l。
D、W、 (1979) 、J、Ce1l、Bio
l。
80.492−498゜
Yamada、 LM、 (1983) 、Ann、
Rev、Biochem、 52.731−799゜Z
abeau M、 and 5tanley K、に、
(1982) EMBOJ、、 1.1217−1
224゜
Rev、Biochem、 52.731−799゜Z
abeau M、 and 5tanley K、に、
(1982) EMBOJ、、 1.1217−1
224゜
第1図は7つの0DNkクローンを含むヒ)FNmRN
Aの制限酵素マツプを示す。 第2図はヒ)FNNポリペブチの完全なアミノ酸配列を
示す。 第6亀図〜第3h図は第2図に示したヒ)FNポリベデ
チrの完全なニュークレオチド配列を示す。 第4図はFN−次構造の変化を示す。 第5図はコラーゲン結合領域および内部相同の位置を示
すフィブロネクチンタン白の部分を示す。
Aの制限酵素マツプを示す。 第2図はヒ)FNNポリペブチの完全なアミノ酸配列を
示す。 第6亀図〜第3h図は第2図に示したヒ)FNポリベデ
チrの完全なニュークレオチド配列を示す。 第4図はFN−次構造の変化を示す。 第5図はコラーゲン結合領域および内部相同の位置を示
すフィブロネクチンタン白の部分を示す。
Claims (14)
- (1)コラーゲンおよび/又はフイブリンに対し特異的
親和性を有し、かつフイブロネクチンのコラーゲン結合
部分および/又はフイブリン結合部分のアミノ酸残基と
実質的に同じ順序のアミノ酸残基を含有する、ポリペプ
チド配列。 - (2)少なくとも第2図に示すアミノ配列の277〜5
77のコラーゲン結合部分を含む、特許請求の範囲第1
項記載のポリペプチド。 - (3)少なくとも第2図に示すコラーゲン結合アミノ酸
配列379〜445を含む、特許請求の範囲第1項記載
のポリペプチド。 - (4)少なくとも第2図に示すアミノ酸配列21〜24
1のフイブリン結合部分を含む、特許請求の範囲第1項
記載のポリペプチド。 - (5)フイブロネクチンに存在しないポリペプチドに結
合した、特許請求の範囲第1項から第4項のいずれか1
項に記載のポリペプチド。 - (6)物質の精製方法において、その物質とフイブロネ
クチンのコラーゲン結合部分との抱合体を固定化コラー
ゲンと接触させ、この抱合体をこのコラーゲンに結合さ
せ、次に抱合体を溶離することを特徴とする、上記方法
。 - (7)溶離抱合体を次に開裂してコラーゲン結合部分を
除去し、次にこの物質を単離する、特許請求の範囲第6
項記載の方法。 - (8)治療剤と結合したフイブリン結合アミノ酸配列を
含む、特許請求の範囲第1項又は第4項に記載のポリペ
プチド。 - (9)コラーゲンおよび/又はフイブリンに対し特異的
親和性を有するフイブロネクチンのポリペプチド配列を
コードするcDNA配列。 - (10)第3b図の1147〜1351に示す構造を有
する、特許請求の範囲第9項記載のcDNA配列。 - (11)第3a図の73〜738に示す構造を有する、
特許請求の範囲第9項記載のcDNA配列。 - (12)特許請求の範囲第9項から第11項のいずれか
1項に規定したcDNA配列を含むプラスミド又は他の
ベクター。 - (13)特許請求の範囲第12項に特許請求したベクタ
ーを包含することにより修飾した微生物。 - (14)特許請求の範囲第12項に特許請求したベクタ
ーを包含することにより修飾した¥Escherich
ia coli¥。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB858516421A GB8516421D0 (en) | 1985-06-28 | 1985-06-28 | Fibronectins |
GB8516421 | 1985-06-28 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6289699A true JPS6289699A (ja) | 1987-04-24 |
Family
ID=10581489
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61151315A Pending JPS6289699A (ja) | 1985-06-28 | 1986-06-27 | フイブロネクチン |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0207751B1 (ja) |
JP (1) | JPS6289699A (ja) |
AT (1) | ATE58381T1 (ja) |
AU (1) | AU603059B2 (ja) |
DE (1) | DE3675591D1 (ja) |
DK (1) | DK306386A (ja) |
ES (1) | ES2000178A6 (ja) |
FI (1) | FI862756A (ja) |
GB (1) | GB8516421D0 (ja) |
ZA (1) | ZA864791B (ja) |
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH01180900A (ja) * | 1988-01-05 | 1989-07-18 | Takara Shuzo Co Ltd | 細胞接着活性ポリペプチド |
JPH01206998A (ja) * | 1988-02-16 | 1989-08-21 | Takara Shuzo Co Ltd | 細胞接着活性ポリペプチド |
JPH01261398A (ja) * | 1988-04-13 | 1989-10-18 | Takara Shuzo Co Ltd | 機能性ポリペプチド |
JPH0297397A (ja) * | 1988-06-30 | 1990-04-09 | Takara Shuzo Co Ltd | 細胞接着活性ポリペプチド |
JPH02152990A (ja) * | 1988-12-02 | 1990-06-12 | Takara Shuzo Co Ltd | 細胞接着活性ポリペプチド |
JPH02311498A (ja) * | 1989-05-26 | 1990-12-27 | Takara Shuzo Co Ltd | 機能性ポリペプチド |
JPH03500046A (ja) * | 1987-08-25 | 1991-01-10 | リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・ミネソタ | フィブロネクチン活性を有するポリペプチド |
WO1993020228A1 (en) * | 1992-03-31 | 1993-10-14 | Toray Industries, Inc. | Novel, physiologically active protein and hemopoietic stem cell growth promoter |
JPH08275788A (ja) * | 1996-04-22 | 1996-10-22 | Takara Shuzo Co Ltd | 機能性ポリペプチド |
JPH08275787A (ja) * | 1996-04-22 | 1996-10-22 | Takara Shuzo Co Ltd | 機能性ポリペプチド遺伝子 |
JPH08275786A (ja) * | 1996-04-22 | 1996-10-22 | Takara Shuzo Co Ltd | 機能性ポリペプチド |
WO1997018318A1 (en) * | 1995-11-13 | 1997-05-22 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Method for gene introduction into target cells by retrovirus |
Families Citing this family (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3716513A1 (de) * | 1987-05-16 | 1988-11-24 | Basf Ag | Proteine mit tnf-wirkung |
WO1989012677A1 (en) * | 1988-06-14 | 1989-12-28 | Chiron Corporation | Superoxide dismutase analogs having novel binding properties |
US5270030A (en) * | 1988-12-29 | 1993-12-14 | Bio-Technology General Corp. | Fibrin binding domain polypeptide and method of producing |
US7087722B1 (en) * | 1988-12-29 | 2006-08-08 | Savient Pharmaceuticals, Inc. | Fibrin binding domain polypeptides and uses and methods of producing same |
US5679320A (en) * | 1988-12-29 | 1997-10-21 | Bio-Technology General Corp. | Fibrin binding domain polypeptides and uses and methods of producing same |
KR910700339A (ko) * | 1988-12-29 | 1991-03-14 | 보겔, 티그바 | 인체 피브로넥틴의 폴리펩티드 유사체의 클로닝과 제조및 이 폴리펩티드 유사체의 이용방법 |
WO1990008833A1 (en) * | 1989-02-02 | 1990-08-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Expression of recombinant fibronectin in genetically engineered cells |
JP2878341B2 (ja) * | 1989-03-03 | 1999-04-05 | 学校法人藤田学園 | 人工機能性ポリペプチド |
ATE92107T1 (de) * | 1989-04-29 | 1993-08-15 | Delta Biotechnology Ltd | N-terminale fragmente von menschliches serumalbumin enthaltenden fusionsproteinen. |
US5198423A (en) * | 1989-05-26 | 1993-03-30 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Functional polypeptide containing a cell binding domain and a heparin binding domain of fibronectin |
DE69012950T2 (de) * | 1989-10-13 | 1995-03-16 | Takara Shuzo Co | Antikrebsmittel. |
GB9023149D0 (en) * | 1990-10-24 | 1990-12-05 | British Bio Technology | Proteins and nucleic acids |
WO1994016085A2 (en) * | 1992-12-30 | 1994-07-21 | Zymogenetics, Inc. | Hybrid proteins having cross-linking and tissue-binding activities |
JP3192067B2 (ja) * | 1995-10-09 | 2001-07-23 | 科学技術振興事業団 | ペプチドとコラーゲン収縮阻害剤 |
WO1997043314A2 (en) | 1996-05-16 | 1997-11-20 | The Texas A & M University System | Collagen binding protein compositions and methods of use |
US5922676A (en) * | 1996-09-20 | 1999-07-13 | The Burnham Institute | Methods of inhibiting cancer by using superfibronectin |
GB9726539D0 (en) * | 1997-12-16 | 1998-02-11 | Univ Dundee | Polypeptides, polynucleotides and uses thereof |
EP1314780A4 (en) * | 2000-08-15 | 2004-07-28 | Terumo Corp | Collagen-binding hybrid polypeptides |
TWI315740B (ja) | 2001-08-15 | 2009-10-11 | Takara Bio Inc | |
US7094549B2 (en) * | 2001-11-23 | 2006-08-22 | Syn X Pharma, Inc. | Fibronectin biopolymer marker indicative of insulin resistance |
GB0201273D0 (en) * | 2002-01-21 | 2002-03-06 | Isis Innovation | Fibronectin variants and screening methods |
ATE491021T1 (de) | 2002-03-25 | 2010-12-15 | Takara Bio Inc | Verfahren zur produktion eines zytotoxischen lymphozyten |
KR101331746B1 (ko) * | 2003-08-22 | 2013-11-20 | 다카라 바이오 가부시키가이샤 | 세포 상해성 림프구의 제조 방법 |
KR101279172B1 (ko) | 2005-08-17 | 2013-06-27 | 다카라 바이오 가부시키가이샤 | 림프구의 제조 방법 |
ES2583002T3 (es) | 2007-04-09 | 2016-09-16 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Proteínas de fusión de un dominio de enlazamiento a colágeno y hormona paratiroidea |
WO2013090770A2 (en) | 2011-12-14 | 2013-06-20 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Delivery of therapeutic agents by a collagen binding protein |
WO2013120060A1 (en) | 2012-02-09 | 2013-08-15 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Delivery of therapeutic agents by a collagen binding protein |
WO2018148573A1 (en) | 2017-02-10 | 2018-08-16 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Collagen-binding agent compositions and methods of using the same |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CH472219A (de) * | 1963-06-15 | 1969-05-15 | Spofa Vereinigte Pharma Werke | Hochporöse Kollagen-Gewebe-Blutgefässprothese und Verfahren zur Herstellung derselben |
US3272204A (en) * | 1965-09-22 | 1966-09-13 | Ethicon Inc | Absorbable collagen prosthetic implant with non-absorbable reinforcing strands |
US4278594A (en) * | 1979-06-19 | 1981-07-14 | David Amrani | Process for separation and isolation of AHF, von Willebrand's ristocetin cofactor (VWF:RCF) and fibronectin from blood plasma |
WO1984000540A1 (en) * | 1982-08-04 | 1984-02-16 | Jolla Cancer Res Found | Polypeptide |
JPS59134732A (ja) * | 1983-01-21 | 1984-08-02 | Green Cross Corp:The | フイブロネクチン・生理活性物質複合体の製造法 |
-
1985
- 1985-06-28 GB GB858516421A patent/GB8516421D0/en active Pending
-
1986
- 1986-06-27 AT AT86304998T patent/ATE58381T1/de active
- 1986-06-27 ES ES8600023A patent/ES2000178A6/es not_active Expired
- 1986-06-27 FI FI862756A patent/FI862756A/fi not_active Application Discontinuation
- 1986-06-27 AU AU59315/86A patent/AU603059B2/en not_active Ceased
- 1986-06-27 EP EP86304998A patent/EP0207751B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-06-27 DK DK306386A patent/DK306386A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-06-27 ZA ZA864791A patent/ZA864791B/xx unknown
- 1986-06-27 JP JP61151315A patent/JPS6289699A/ja active Pending
- 1986-06-27 DE DE8686304998T patent/DE3675591D1/de not_active Expired - Lifetime
Cited By (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH03500046A (ja) * | 1987-08-25 | 1991-01-10 | リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・ミネソタ | フィブロネクチン活性を有するポリペプチド |
JPH01180900A (ja) * | 1988-01-05 | 1989-07-18 | Takara Shuzo Co Ltd | 細胞接着活性ポリペプチド |
JPH01206998A (ja) * | 1988-02-16 | 1989-08-21 | Takara Shuzo Co Ltd | 細胞接着活性ポリペプチド |
JPH01261398A (ja) * | 1988-04-13 | 1989-10-18 | Takara Shuzo Co Ltd | 機能性ポリペプチド |
JPH0297397A (ja) * | 1988-06-30 | 1990-04-09 | Takara Shuzo Co Ltd | 細胞接着活性ポリペプチド |
JPH02152990A (ja) * | 1988-12-02 | 1990-06-12 | Takara Shuzo Co Ltd | 細胞接着活性ポリペプチド |
JPH02311498A (ja) * | 1989-05-26 | 1990-12-27 | Takara Shuzo Co Ltd | 機能性ポリペプチド |
WO1993020228A1 (en) * | 1992-03-31 | 1993-10-14 | Toray Industries, Inc. | Novel, physiologically active protein and hemopoietic stem cell growth promoter |
WO1997018318A1 (en) * | 1995-11-13 | 1997-05-22 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Method for gene introduction into target cells by retrovirus |
US7446170B2 (en) | 1995-11-13 | 2008-11-04 | Takara Bio Inc. | Method for gene transfer into target cells with retrovirus |
US7790849B2 (en) | 1995-11-13 | 2010-09-07 | Takara Bio Inc. | Enhancement of retroviral gene transduction employing polypeptides comprising the fibronectin heparin II binding domain |
JPH08275788A (ja) * | 1996-04-22 | 1996-10-22 | Takara Shuzo Co Ltd | 機能性ポリペプチド |
JPH08275787A (ja) * | 1996-04-22 | 1996-10-22 | Takara Shuzo Co Ltd | 機能性ポリペプチド遺伝子 |
JPH08275786A (ja) * | 1996-04-22 | 1996-10-22 | Takara Shuzo Co Ltd | 機能性ポリペプチド |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE3675591D1 (en) | 1990-12-20 |
ATE58381T1 (de) | 1990-11-15 |
EP0207751B1 (en) | 1990-11-14 |
FI862756A0 (fi) | 1986-06-27 |
EP0207751A1 (en) | 1987-01-07 |
AU603059B2 (en) | 1990-11-08 |
ES2000178A6 (es) | 1988-01-01 |
GB8516421D0 (en) | 1985-07-31 |
DK306386D0 (da) | 1986-06-27 |
DK306386A (da) | 1986-12-29 |
FI862756A (fi) | 1986-12-29 |
ZA864791B (en) | 1987-02-25 |
AU5931586A (en) | 1987-01-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JPS6289699A (ja) | フイブロネクチン | |
Ninomiya et al. | Differential expression of two basement membrane collagen genes, COL4A6 and COL4A5, demonstrated by immunofluorescence staining using peptide-specific monoclonal antibodies. | |
Sugrue et al. | Immunoidentification of type XII collagen in embryonic tissues. | |
Carnemolla et al. | A tumor-associated fibronectin isoform generated by alternative splicing of messenger RNA precursors. | |
Owens et al. | Mapping the collagen‐binding site of human fibronectin by expression in Escherichia coli. | |
Toyoshima et al. | Collagen-binding domain of a Clostridium histolyticum collagenase exhibits a broad substrate spectrum both in vitro and in vivo | |
Hinek et al. | The 67-kD elastin/laminin-binding protein is related to an enzymatically inactive, alternatively spliced form of beta-galactosidase. | |
Sage | Collagens of basement membranes | |
FI79120C (fi) | Fusionerad gen och foerfarande foer framstaellning av ett terapeutiskt anvaendbart hybridprotein. | |
EP0407008A2 (en) | Fibronectin fragment | |
US5629291A (en) | Methods of modulating fibronectin extracellular matrix assembly | |
Bruckner et al. | The structure of human collagen type IX and its organization in fetal and infant cartilage fibrils. | |
EP0399806A1 (en) | Fibronectin derivative | |
Peters et al. | Human endothelial cells synthesize, process, and secrete fibronectin molecules bearing an alternatively spliced type III homology (ED1) | |
CA2339331A1 (en) | Expression and export of angiogenesis inhibitors as immunofusins | |
EP0349342B1 (en) | Polypeptides with cell-spreading activity | |
Chiquet et al. | Isolation of chick tenascin variants and fragments: AC‐terminal heparin‐binding fragment produced by cleavage of the extra domain from the largest subunit splicing variant | |
JP2829405B2 (ja) | 機能性ポリペプチド | |
Lethias et al. | Flexilin: A new extracellular maxtrix glycoprotein localized on collagen fibrils | |
JP3011274B2 (ja) | 組み換え技術により産生した、3−デス−ヒドロキシ−シスタチンcポリペプチドまたはその修飾物 | |
JPH025869A (ja) | Dna配列、組換えdna分子及びリポコルチン類3、4、5並びに6の製造方法 | |
Schulze et al. | Structural and cell-adhesive properties of three recombinant fragments derived from perlecan domain II | |
EP0624196B1 (en) | Polypeptides with fibronectin binding sites as modulators for matrix assembly | |
JP3442383B2 (ja) | 細胞結合を強める合成ペプチド | |
EP0329413B1 (en) | Polypeptides with cell-spreading activity |