JPH0297397A - 細胞接着活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、フィブロネクチン様の細胞接着活性タンパク
質に関し、更に詳しくは、ヒトフィブロネクチンの細胞
接着活性を有するポリペプチド及びその製造方法に関す
る。

〔従来の技術〕

フィブロネクチンは、動物の種々の組織や体液中、また
、培養細胞表面などに広く分布する多機能糖タンパク質
であり、細胞の接着、伸展、移動、分化、増殖、負負作
用などの生理作用を示し、組織修復、組織構築、生体防
御などに関与していることが知られている。

フィブロネクチンは、分子量約２５万のポリペプチドが
Ｃ末端付近でＳ−Ｓ結合で２ｉ１体を形成している。分
子内アミノ酸配列は、繰返し構造を有し、Ｉ、Ｉｔ、Ｉ
型に分けられる。更に、種々の機能を有するドメイン構
造を有し、細胞接着、コラーゲン、ヘパリン及びフィブ
リン等に対する結合活性を示す。これらのドメインのう
ち、細胞接着ドメインについては、その生物活性から産
業上の利用が考えられており、例えば、培養基質のコー
ティング剤として、細胞が付着する基質の調↓に使用す
ることができる。

また、細胞付着の促進剤として、点眼液、ローション、
外傷治療薬等に使用することができる。

フィブロネクチンの細胞接着ドメインの基本構造につい
ては、その最小必要単位としてＲ−Ｇ−Ｄ−８配列が明
らかにされており〔ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）第６
０９巻、第３０〜３５頁（１９８４）Ｌ　この配列を含
む１０８アミノ酸残基からなる分子量１，１５万のポリ
ペプチドが、細胞接着活性ペプチドとして％表昭５９−
５０１５４８号公報に記載てれている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、この分子量＋、１５万のポリペプチドの
細胞接着活性は、天然のフィブロネクチンに比べて非常
に弱く、前記の用途として用いるには必ずしも実用的と
はいい難い。このことについては、例えばジャーナル　
オブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊ、　ＢｉｏＬ
　Ｃｈｅｍ、　）第２６０巻、第１３２５６〜１５２６
０頁（１９８５）に記載されている。また、本発明者ら
は、前記分子量１＃１５万のポリペプチドを遺伝子工学
的に製造し、そのＮＲ’に細胞（ラット腎細胞）に対す
る細胞接着活性を、天然のフィブロネクチンと比較した
。その結果、フィブロネクチンはＩ］、１〜１μｆ／ウ
エルで活性がみられたのに対し、分子量１．＋５万のポ
リペプチドでは５０μ２／ウエルでも活性は認められな
かった。

本発明の目的は、フィブロネクチンの細胞結合ドメイン
ペプチドとして、新たに細胞接着活性を有するアミノ酸
配列を明らかにし、その製造方法を提供することにある
。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は細胞接着活
性ポリペブチ て、下記一般式Ｉ： Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　ＰｈｅＰｒ
ｏ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　ＶａｎＰｒｏ　
Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　ＬｅｕＶａｎ　Ａｒ
ｇＴｙｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　ＶａｌＡｓｐ　ＶａＩＡｈ
ａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　ＢａｒＡｓｐ　Ａｓｎ　Ａｌａ　
Ｖａｌ　Ｖａｌ　ＬｅｕＰｒｏ　Ｇａｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌ
ｕ　Ｔｙｒ　Ｖａ１８ｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　
Ｇｌｎ　ＨｌｓＬｅｕ　ＡｒｇＧｌｙ　ＡｒｇＧｉｎ　
Ｌｙｓ８ｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇａｙ　Ｉｃｅ　Ａｓ
ｐＴｈｒ　Ａ’ｌａ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ
Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ｌ１ｅ１１
ｅ　Ａｒｇ　Ｈｌｓ　Ｈｌｓ　Ｐｒｏ　ＧｌｕＡｒｇ　
Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　ＡｒｇＡｒｇ　Ａｓ
ｎ　８ｅｒ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　ＬｅｕＰｒｏ　Ｇｌｙ　
Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　ＶａｌＡｌａ　Ｌｅｕ　Ａａ
ｎ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　ＧｌｕＬｅｕ　Ｉ’ｌｅ　Ｇｌｙ
　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｓａｒドに関する発明であつ Ｔｈｒ　　Ａｓｎ　　ｌ１ｅ Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ａｌａ Ｔｈｒ　　Ａｓｎ　　Ｐｈｅ Ｌｙｓ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｕ １：１ｅ　　８ｅｒ　　Ｐｒ。

Ｔｈｒ　　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　Ｍａｌ Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ Ｐｈｅ　　Ｂｅｒ　Ａｓｐ Ｖａｎ　　Ｈｌｓ　　Ｔｒｐ Ｔｈｒ　Ｇｕｙ　Ｔｙｒ Ｈｌｓ　　Ｐｈｅ　　Ｓｅｒ Ｍａｌ　　Ｐｒｏ　　Ｈｌｓ Ｔｈｒ　　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ Ｖａｎ　　８ｅｒ　　Ｉｃｅ Ｇｌｕ　　Ｓａｒ　　Ｐｒ。

Ｔｈｒ　　ＶａＩ　Ｓｅｒ １ｙ Ｐｒ。

Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｓａｒ ＬθＵ Ｓａｒ Ｐｒ。

Ａｓｐ 工１ｅ Ｉｃｅ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｂｅｒ Ｔｈｒ ＶａＩ Ｌｅｕ ｓｐ Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　　Ａｒｇ　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　Ｇｌ
ｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｌａ　ＡｈａＴｈｒ　　Ｐｒｏ
　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　　１１１３
　　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　ＡｓｐＡｌａ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　
Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ａ
ｒｇＩＩｓ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ
　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　　５ｅｒＰｒｏ　　Ｖａｌ
　　Ｇｌｎ　　Ｇｌｕ　　Ｐｈｅ　　Ｔｈｒ　Ｖａ’ｌ
　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｙ　　５ｅｒＬｙｓ　　Ｓｅｒ　　
Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　　Ｉｌｅ　　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ
　Ｌｅｕ　ＬｙｅＰｒｏ　　（）ｌｙ　Ｖａｌ　Ａｓｐ
　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　工１ｅ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　ＴｙｒＡ
ｌａ　Ｖａｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓ
ｐ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　　ＡｈａＳｅｒ　　Ｓｅｒ　Ｌｙ
ｅ　　Ｐｒｏ　　ＩＩｓ　　Ｓｅｒ　　ＩＩｓ　Ａｓｎ
　Ｔｙｒ　ＡｒｇＴｈｒ　Ｇｌｕ　Ｉｃｅ　Ａｓｐ　　
　　　　　　　　　　−−−−−−−−−［１］で表さ
れるアミノ酸配列で示されることを特徴とする。

また本発明の第２の発明は前記一般式■で表される細胞
接着活性ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有せしめ
た組換体プラスミドに関し、また本発明の第３の発明は
前記組換体プラスミドを導入せしめた形質転換体に関す
る。更に本発明の第４の発明は前記形質転換体を培養し
、該培養物より前記一般式ｌで表される細胞接着活性ポ
リペプチドを採取する細胞接着活性ポリペプチドを製造
する方法に関する。

本発明者らは、ヒトフィブロネクチン（以下、ＦＮと略
記する）の細胞接着活性ポリペプチドとして特許出願さ
れている１１．５ｋＤ（１０８アミノ酸残基）のポリペ
プチドには細胞接着活性がほとんどないが、そのＮ末を
伸長した２８５アミノ酸残基ペプチド（Ａｌａ””　−
Ｍｅｔ”’　）　　にはＦＮと同等の接着活性があるこ
とを見出し、その遺伝子工学的製造法を開発して既に特
許出願した（特願昭６’５−１４８号）。

なお、本明細書において、アミノ酸に付された肩数字は
、ＫＭＢ　Ｌデータバンク（ＥＭＢＬ、　ＤＡＴＡＢＡ
ＮＫ　）　　のＦＮアミノ酸に付与されたＮ末からのア
ミノ酸残基数を示す。

更に本発明者らは２Ｂ５アミノ酸残基ベグテドのＮ末側
から、アミノ酸又はペプチド配列を欠失した鎖長の異な
る細胞接着ドメインペプチドを遺伝子工学的に調製し、
それらの細胞接着活性を測定してペプチドの鎖長と接着
活性の詳細な関係を明らかにした。更にその過程でＮ末
領域のアミノ酸配列によってペプチドの発現が著しく変
化することを見出し、接着活性が強く、かつ大量発現に
適したペプチドの配列として、例えば、２７９アミノ酸
残基ペプチド（Ｐｒｏ＋ｔｓｔ−Ｍｅｔ”’）ｋ明らか
にし、それらの遺伝子工学的製造法を開発して、既に特
許出願した（特願昭６３−３１８２０号）０ 本発明者らは更に研究を進め、２７９アミノ酸残基ペプ
チド（Ｐｒｏ１２”　−Ｍｅｔ１５１’　）　　のＣ末
側５アミノ酸残基を欠失させた２７４アミノ酸残基ペグ
テド（Ｐｒ　ｏ　１２　Ｎ？−Ａｓ　ｐ　＋　５　＋　
１　）　　を遺伝子工学的に調製し、その細胞接着活性
を測定してＦＮと実質上はぼ同等の活性があることを明
らかにした。本発明はこれらの知見に基づいて達成され
た。

以下本発明を具体的に説明する。

２７９アミノ酸残基ペプチド（Ｐｒｏ＋２”　−Ｍｅｔ
”’　）をコードするプラスミドの調製については、特
願昭６５−１１８２０号明細書に記載された方法により
行うことができる。

ＦＮのＡｌｈ””　−Ｍｅｔ”’　　をコードするｐＴ
Ｆ３０１の開始コドンの少し上流の一箇所を適当な制限
酵素で切断した後、エキンニュクレアーゼを作用させて
、５′側の配列を除去することができる。反応条件を変
えることにより、コード領域の５′末端が適当に除去さ
れたプラスミドが得られる。これらのプラスミドのコー
ド領域の終止コドンの少し下流の１箇所を適当な制限酵
素で切断し、断片化したＤＮＡをゲル電気泳動で精製す
ることにより、５′末端が種々の部位まで除去されたｃ
ＤＮＡ断片が得られる。これらのｃＤＮＡ断片を適当な
発現ベクターに接続することによシ、Ａｌａ”Ｂｓ−Ｍ
ｅｔ１６１’（２８５アミノ酸残基）のＮ末領域が除去
されｆｃ種々の鎖長のペプチドを発現させることができ
る。

発現ベクターとしては、既存のすべてのベクターを使用
することができるが、本発明者らは、リボゾーム結合部
位と開始コドンの距離を最適化し＊　１）ＵＣ系ベクタ
ーを用いる直接発現で好結果を得ている。

更に、ｐＵＣ系ベクターの終止コドンの下流に転写終結
シグナルを接続することにより、発現レベルを向上させ
ることが可能である。

細胞接着活性ペプチドが発現されている組換体の選択は
、イムノスクリーニングによって行うのが好都合である
。すなわち、鎖長の異なるｃＤＮＡ断片を接続した発現
ベクターを常法にょシ大腸菌に導入し、得られた形質転
換体をニトロセルロースフィルター上で生育させ、溶菌
後、菌体タンパク質をフィルター上に固定させる。

フィルターをウシ血清アルブミン等でブロンキングした
後、ＦＮの細胞接着ドメインを認識すルモノクローナル
抗体を作用させる。フィルターに結合したモノクローナ
ル抗体を、標識２次抗体で検出する。このようにして、
細胞接着ドメインペプチドを発現している組換体を選択
することができる。

次に、選択された組換体を発現に適した条件下に培養し
、細胞接着ドメインペプチドの発現を誘導する。発現の
確認には、イムノブロッティングの手法が用いられる。

すなわち、培養菌体の全タンパク質を８Ｄ８を含むバッ
ファー中で加熱溶塀し、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動で分離し、泳動パターンを、ニトロセルロースや
ナイロンメンブランに移し取る。メンプランに、ＦＮの
細胞接着ドメインに特異的なモノクローナル抗体を作用
させ、次いで酵素標識第２抗体を作用させて、結合した
抗体の酵素活性を、発色基質で発色させることにより、
細胞接着ドメインペプチドのバンドを確認することがで
きる。

更に、得られたクローンについて挿入断片５′側の塩基
配列を解析することにより、発現しているペプチドのＮ
末端を同定することができる。

２７４アミノ酸残基ペプチド（ｐｒｏｌ！１？　−ＡＢ
ｐＨｉ１２　）を遺伝子工学的に調製する方法としては
、以上の実験によシ得られた、２７９アミノ酸残基ペプ
チド（Ｐｒｏ””　−Ｍａｔ”’　）　　をコードする
プラスミドｐＴＦＤ　７０７を用いるのが好都合である
。

２７９アミノ酸残基ペプチドのＣ末端より５残基目のＬ
ｙ８＋５＋５　のコドンＡＡＡを終止コドンＴＡＡに変
換することにより２７４アミノ酸残基ペプチド（ｐｒｏ
＋２Ｂ９−　Ａｓｐ１５＋２　）をコードするプラスミ
ドを調製することができる。この塩基の変換は、部位特
異的変異の導入により行うことができる。

組換体からの細胞接着ドメインペプチドの精製は、例え
ば次のようにする。菌体ベレットラバソファ−に懸濁し
、超音波処理により可溶性画分と不溶性画分に分ける。

後者は更に７Ｍ尿素を含むバッファーで可溶化する。可
溶性画分を集めて、イムノブロッティングに用いた抗体
を結合させたセファロース４Ｂのカラムにかけ、アフイ
ニデイ精製を行う。溶出にはｐＩ（２，５付近のバッフ
ァーを用いる。イムノブロッティングで目的画分を集め
ることにより、細胞接着ドメインペプチドを得ることが
できる。必要とあれば、　ＦＰＬＣ又はＨＰＬＣで更に
精製することができる。

得られた細胞接着ドメインペプチドは、ＮＨＫ細胞（正
常ラット腎細胞）に対する細胞接着活性の測定に用いる
。試料をバッファーに溶がして、マイクロプレートに吸
着させ几後、ＮＨＫ細胞を添加し、６７℃で一定時間イ
ンキユベートする。顕微鏡下で細胞の伸展を観察し、伸
展活性を発現するウェル当りの最少量を天然のＦＮと比
較することにより、細胞接着活性の強さを表すことがで
きる。

以上の一連の実験によシ、前記一般式１で表される配列
を有する２７４アミノ酸残基ペプチド（ｐｒ　ｏ　＋　
２３？　−Ａ８　ｐ　＋　６＋　２　）がＦＮと実質上
はぼ同等の細胞接着活性を示すことが明らかとなった。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されない。

参考例１ ２７９アミノ酸残基ペプチド（Ｐｒｏ””−Ｍｅｔ”’
　）をコードするプラスミドｐＴＦＤ７０７及びｐＴＦ
７０２１の構築 ２７９アミノ酸残基ペプチドをコードするプラスミドｐ
ＴＦＤ　７０７及びｐＴＦ７０２＋　１７）構築方法に
ついては、特願昭６５−５１８２０号明細書に詳細に記
載されている。以下これを概説する。

２８′５アミノ酸残基ペプチド（Ａｈａ１２”−Ｍｅｔ
１５１’　）をコードするプラスミドｐＴＦ　５０１　
ｆ　Ｘｂａ　ｌで分解した後、ＢＡＬ５ｊヌクレアーゼ
−８を作用させ、経時的にサンプリングした。サンプリ
ングした反応液を１つにまとめ、ＤＮＡを精製、回収し
、フレノウ酵素によシ末端を修復した後、Ｈｌｎｄｌで
分解、これをアガロースゲル電気泳動にかけ、０．５ｋ
ｂ−０，８ｋｌ）に相当する断片を回収した。このＤＮ
Ａ断片に、リン酸化ＮｃｏＩリンカ−ｄ［ｐＡＧｃｃＡ
ＴＧＧｃＴ］をＴ４　ＤＮＡリガーゼによシ接続し、　
Ｎｃｏｌ及びＨｌｎｄｌにて分解後、セファロースＣＬ
−４Ｂのカラムにかけて遊離のリンカ−を防出した。得
られ几ＤＮＡ断片を、あらかじめＮｃｏｌ及びＨｌｎｄ
ｌで処理して脱リン酸したプラスミドｐＵｃ１ｊ９Ｎに
接続し、大腸菌ＨＢｊＯ＋を形質転換した。得られた形
質転換体をアンビシ！Ｊ　７　含有Ｌ　９！　天培地上
のニトロセルロースフィルターに移し、５７℃にて培養
し、生育した：１Ｏ＝−に９０ロホルム蒸気中に接触さ
せた後、リゾチーム、ＤＮａｓｅ　ｌ処理、ＢＳＡによ
るブロッキングを行った。フィルターにＦＮの細胞接着
ドメインを特異的に認識する抗ＦＮモノクローナル抗体
ＦＮ−１０［全酒造（株）販売〕、次いでパーオキシダ
ーゼ標識第２抗体を作用させ、過酸化水素と４−クロロ
−１−ナフトールの存在下で発色させることにより、発
現している形質転換体を選別した。得られたクローンを
Ｌ−プロスで振とり培養後、全菌体タンパク質を８ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気法１＋１７（Ｓｎ２−Ｐ
ＡＧＥ　）で分離し、抗ＦＮモノクローナル抗体ＦＮ−
１０と反応する、２２　ｋＤａ　〜５２　ｋＤａのポリ
ペプチドが生産されていることをｍ認した。これらのう
ち、１１クローンについて挿入断片５′側の塩基配列を
決定し友ところ、Ｃ末端をＭθｔ１１８７　　として、
それぞれ２７９，２５８．２１９．２１５．２０７．２
０６．１９Ｂ、１９５．１９０．１Ｂ６．１７８アミノ
酸残基をコードしていた。これらのペプチドの発現量を
５ＤＳ−ＰＡＧＥで比較したところ、最も発現量の多い
ペプチドが２７９アミノ酸残基ペプチドであシ、これを
ｐＴＦＤ　７０７と命名した。更に、ｐＴＦＤ　７０７
に含まれる、ベクター由来のＡｌａに対応する配列（Ｇ
ＣＴ）を部位特異的変異の手法（特願昭６５−１４８号
）により除去した。更に、発現レベルを上げるために、
分泌発現ベクターｐＩＮＩ　−ｏｍｐＡｌから’３−ｐ
ｐターミネーター配列をＨｌｎｃｌｌ　−Ｓａ’ｌ　ｌ
断片として取出し、ｐＴＦＤ７０７のＨｌｎｄｌ　−８
ａｌ　ｌサイトに接続して、ｐＴＦ７０２１を構築し友
。

実施例１ ２７４アミノ酸残基ペプチド（ｐｒｏ　＋　１８ｔ　−
Ａｓ　ｐ　ｊｌｌｌｌ　）をコードするプラスミドの構
築 １ｊＴＦＤ７０７への部位特異的変異の導入は、クンケ
ル（ｋｕｎｋｅｌ　）　　らの方法〔プロシーデイング
ズ　オブ　ザ　ナショナル　アカデミ−オプ　サイエン
ス　オプ　ザ　Ｕ、　８．Ａ、　（Ｐｒｏｃｅｅｄ−ｉ
ｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅ
ｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓｏｆ　ｔｈｅ　Ｕ、Ｓ、
Ａ、　）第８２巻、第４８８〜４９２ｊＦ（＋９８５）
、メンツズ　イン　エンチイモロジー（ＭｅｔｈＯｄ８
　ｉｎ　Ｅｎｉｙｍｏｌｏｇｙ　）第１５４巻、第５６
７〜５８２頁〕に準じて構成された、サイト−ダイレフ
テッド　ムタゲネシス　システム　ミュータン−Ｋ　（
５ｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅ−ｎｅｓｉ
ｓ　ｓｙｓｔｅｍ　Ｍｕｔａｎ　−Ｋ　）　　［全酒造
（株）販売〕を用いて行った。

ｐＴＦＤ　７０７を大腸菌ＢＷｌ１５に導入し、５０μ
ｆ／ｌｎｔのアンピシリンを含む１００−の２ｘＹＴ培
地（１，６％バクトドリプトン、１チ酵母エキス、α５
％ＮａＣｔ）　　で５７℃にて振とり培養した。６６０
　ｎｍの吸光度が０．′５の時点で１０１゜ｐｆｕ　／
　ｍｌ　ＯＭｌ　！ｌ　ＫＧ　７フアージ液１−を加え
、更に３７℃で１６時間培養を続けた。遠心分離により
上清を回収し、２．５　ＭＮａＣｔ、　　２０％ポリエ
チレングリコ−ルナ６０００の２５１ｎｔを加え、室温
で１０分放置した。遠心分離し、沈殿を５−のＴＥバッ
ファー〔１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｔ、　　ｐ
Ｈ１１０、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　）に溶解し、フェノール
：クロロホルム処理、更にクロロホルム処理後、エタノ
ール沈殿によシー本鎖ＤＮＡを回収した。得られた一本
鎖ＤＮＡ５０ｎｆを、１μｌのアニーリングバッファー
（２０ｍＭ　トリス・ＨＣＺ　ｓ　　ｐＨａ　Ｏ，１０
ｍＭ　ＭｇＣＺ２．５０　ｒｎＭＮａＣｌ　ｓ　　＋　
ｍＭ　Ｄ　Ｔ　Ｔ　）に溶解し、あらかじめリン酸化し
たオリゴヌクレオチド　ｄ［ｐＧＧＡＴＧ（）ＴＴＡＧ
ＴＣＡＡＴＴＴＣＩ　１　ｐｍｏｌを含む１μｔの溶液
を加え、６５℃１５分、３７℃１５分静置した。これに
、２５μｔの伸長バッファー（５０ｍＭ　）　！Ｊス・
ＨＣ１％　ｐＨａＯ１６０ｍＭ酢酸アンモニウム、５ｍ
ＭＭｇｃｔ２．５　ｍＭＤ　Ｔ　Ｔ、　　１　ｍＭＮ　
Ａ　Ｄ、　０．５ｍＭａＡＴＰ　、　　ｄＧＴＰ　、　
　ＣＣＴＰ　１ｄＴＴＰ　）、６０ユニツトのＥ、　ｃ
ｏｌｉ　ＤＮＡリガーゼ、１ユニツトのＴ４ＤＮＡポリ
メラーゼを加え、２５℃２時間静置し、３ａｔ　の１２
　Ｍ　ＥＤＴＡ　、　　ｐＨ８，０を加え、６５℃５分
静置した。反応液３μｔ　と、大腸菌ＢＭＨ７１−１８
ｍｕｔｓ　　：ｌ　ンビテントセＡｙ５０ｐｌを混合し
、０℃３０分、４２℃４５秒、０℃２分静置した。これ
に３００μｔのＬ−ブロスを加え、３７℃１時間静置し
、次いで、１０μｔのＭ１５ＫＯ７フアージ液を加え、
３７℃５０分静置し、更に１５０μｍ／１ｒＬ１．のア
ンピシリン、７０μ２／−のカナマイシンを含む２ｘＹ
Ｔ培地１−を加え、３７℃で１６時間振とうした。遠心
分離により、上清を回収し、得られた上清２０μｔと、
大腸菌、ＴＭｌ（３９の終液培養液８０　Ａｔ　を混合
し、６７℃１０分静置した後、一部を５０μｆ／ｌＮｔ
のアンピシリンを含むＬ−寒天培地に塗布し、５７℃で
一夜静置した。得られ窺組換体のうち６クローンについ
て塩基配列の解析を行ったところ、５クローンに目的の
変異が認められた。得られた組換体プラスミドをｐＴＦ
Ｄ７０７−Δ５と命名した。

２μりのｐＴＦＤ７０７−Δ５をＢａｍＨｌ及びＨｌｎ
Ｊで分解し、アガロースゲル電気泳動にかけ、０．５ｋ
ｂ　　のフラグメントを回収した。一方、２μｆのｐＴ
Ｆ７０２１　をＢａｍＨ３及びＳｃａ　ｌで分解し、ア
ガロースゲル電気泳動し、２ｉｋｂ　　の７ラグメント
を回収した。更に、２μ２のｐＴＦ７０２１をＨｌｎａ
ｌ　＆び５ｃａｌ　で分解し、アガロースゲル電気泳動
にかけ、２．４ｋｌ）の７ラグメントを回収した。得ら
れた０、５ｋｂ　フラグメント５ｎｆ。

２、１　ｋｂフラグメント２０ｎｆ、２．４ｋｂフラグ
メント２０　ｎｓ’　　を含む３μｔの溶液に、１２μ
ｔのＤＮＡライゲーションキット〔宝酒造（株）販売〕
Ａ液、６μｌＱＢ液を加え、１６℃で３０分インキュベ
ートした。反応液１０μｔを用いて大腸菌ＪＭ１０９を
形質転換し、ＦＮのＰｒｏ１２Ｂ９−Ａθｐｌｓ１２　
（２７４アミノ酸残基）をコードし、１ｐｐのターミネ
ータ−配列をもつプラスミドを得、ｐＴ’Ｆ７２２ｊと
命名した。ｐＴＦ７２２Ｍを導入した大腸菌ＪＭ１０９
をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ＋０９７ｐ
ＴＦ７２２１と表示し、工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託した〔微工研条寄第１９１５号（ＦＥＲＭＢｐ
−１９＋　５　）　］。

ＪＭ＋０９７ｐＴＦ７２２１を培養して、細胞接着活性
ポリペプチドの発現を調べたところ、全菌体タンパク質
の少なくとも３０％の発現が認められた。

実施例２ ２７４アミノ酸残基ペプチド（ｐｒｏ　＋２Ｓ９−　Ａ
８ｐ′Ｂ＋２　）の精製 ＦＮのＰｒｏ１２”−Ａ８ｐ”１２（２７４アミノ酸残
基）をコードするＤＮＡを発現ベクターに接続して得ら
れたプラスミドｐＴＦ７２２Ｍを導入したＥｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ＋　０９　／　ｐＴＦ　７
２２１を、５０μ２／−のアンピシリンを添加した５−
のＬ−グロスを含む試験管で３７℃、−夜振とり培養し
た。これを５００−の同培地を含む２ｔの三角フラスコ
に接種し、　　ｔ　ａ　ｏ　ｒ、ｐ−ｍで培養を続けた
。６６０　ｎｍの吸光度が０，３０時点で２鮨のＩＰＴ
Ｇ　（インプロピル−β−チオガラクトシド）を添加し
、２０時間後に集菌した。菌体の一部を用いてイムノプ
ロッティングを行った。

すなわち、全菌体タンパク質を５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離
し、泳動パターンをニトロセルロースメンブランに転写
した後、ＦＮの細胞接着ドメインを特異的に認識するモ
ノクローナル抗体［ＦＮ−１０、宝酒造（株）販売〕を
作用させ、次いでパーオキシダーゼ標識第２抗体を作用
させた。結合した第２抗体のパーオキシダーゼ活性を４
−クロロナフトールと過酸化水素の存在下で発色させ、
２７９アミノ酸より低分子側！ｌ　４　ｋｂ付近に目的
のバンドを確認した。次に、全菌体ベレットを　１０ｍ
Ｍ　　　ト　リ　ス　ＨＣ’ｔ　（ｐＨ７，５）　　、
　　５　　ｍＭ　　ＥＤＴＡ。

５　ｍＭ　メルカプトエタノールを含む溶液に懸濁して
超音波処理を行った。遠心分離により上清を採取し、２
０ｍＭ　　トリスＨＣｔ（ｐＨ７，５）　　に対して透
析した。透析内液をモノクローナル抗体ＦＮ−１０を結
合させたセファロース４Ｂのカラム（８１ｎｌ）に通し
た。カラムを洗浄バッファーＡ（２０ｍＭ　　　ト　リ
　ス　ＨＣ’ｔ　、　　　ｐＨａ　　Ｏ、０，１５ＭＫ
Ｃｌ　）で洗浄し、更に洗浄バッファーＢ（２０ｍＭ　
　トリスＨＣＬ％ｐＨ＆　４．０．１５　Ｍ　Ｋｃｔ　
）で洗浄した。最後に溶出バッファー（５０ｍＭグリシ
ンＨＣ４％　ｐＨ２，３、ＣＬ　２　Ｍ　ｘｃｚ　）　
　で溶出し、分画シた。イムノブロッティングによシ目
的画分を集め、脱塩、凍結乾燥して、電気泳動的にほぼ
単一なペプチド約５１ｎ９を得た。次いで該ペプチドを
アミノペプチダーゼＰ（１９８′５年、朝食書店発行、
酵素ハンドブック、第５５４頁参照）処理を行い、Ｎ末
のＭｅｔを除去後、前述の方法によジペプチドを再精製
した。本ペプチドのＮ末端から約１０アミノ酸残基のア
ミノ酸配列を調べたところ、Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−ｘ１８−Ｃ
）１７の配列がｉ認され、目的ペプチドのＮ末端配列と
一致した。

実施例６ 細胞接着活性の測定 前記実施例２で得られｆｃ２７４アミノ酸残基ペプチド
、２７９アミノ酸残基ペプチド（特願昭６３−５１８２
０号）及びＦ”Ｎの細胞接着活性をルオスラーティ（Ｒ
ｕｏ日’１ａｈｔｉ　）らの方法〔メンッズ　イン　エ
ンザイモロジー（ＭｅｔｈＯｄ８ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｚｙ　）第８２巻、第８０３〜８３１頁（Ｂａ１）：
ＩＫ：準じて測定した。試料を生理食塩水又は蒸留水に
溶かして段階的に希釈し、その５０μｔを９６穴マイク
ロプレートに分注し、４℃、−夜インキユペートして、
試料をプレートに吸着させた。次に、ＰＢＳ（ＩＪン酸
緩衝化生理食塩水）でプレートを２回洗浄し、３％ＢＡ
Ａを１００μを加え、５７℃、１時間インキュベートし
て、プレートをブロックした。

ＰＢＳで２回プレートを洗浄し友後、あらかじめイーグ
ルの最小培地（ＭＥＭ）に１０６細胞／−となるように
懸濁させたラット腎細胞（ＮＨＫ−４９Ｆ）を１００μ
ｔ／ウエルの割合で分注し、３７℃で２〜３時間インキ
ュベートした。なお、使用したＮＨＫ−４９Ｆ細胞は、
凍結保存した株を前培養した後、トリプシン処理したも
のを用いた。顕微鏡下で細胞の伸展を観察し、細胞接着
活性に必要な最少量を決定した。その結果を第１表に示
す。

第　　１　　表 〔発明の効果〕 以上詳細に説明したように、本発明により−ＦＮと実質
上向等の細胞接着活性を有するポリペプチド、及びその
遺伝子工学的な製造方法が提供された。上記ポリペプチ
ドは創傷治癒、点眼薬、ガン転移防止、人工臓器の人体
への定着剤等の医薬品として、また化粧品、歯磨等に使
用される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記一般式 I ： 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】・・・・・・〔 I 〕で表
   されるアミノ酸配列で示されることを特徴とする細胞接
   着活性ポリペプチド。 ２、請求項１記載の細胞接着活性ポリペプチドをコード
   するＤＮＡを含有せしめた組換体プラスミド。 ３、請求項２記載の組換体プラスミドを導入せしめた形
   質転換体。 ４、請求項５記載の形質転換体を培養し、該培養物より
   請求項１記載の細胞接着活性ポリペプチドを採取するこ
   とを特徴とする細胞接着活性ポリペプチドの製造方法。