KR101331746B1 - 세포 상해성 림프구의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 배지 중에 있어서의 혈청 및 혈장의 총함유 농도가 0용량% 이상 5용량% 미만인 배지를 사용하여, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들의 혼합물의 존재하에 세포 상해성 림프구의 유도, 유지 및 확대 배양 중에서 선택되는 적어도 하나를 실시하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 상해성 림프구의 제조 방법을 제공한다.
Description
본 발명은, 의료 분야에서 유용한, 세포 상해성 림프구를 취득하는 방법에 관한 것이다.
생체는 주로 면역 응답에 의해 이물로부터 보호되고 있고, 면역 시스템은 여러가지 세포와 그것이 만들어내는 가용성 인자에 의해 성립되어 있다. 그 중에서도 중심적인 역할을 하고 있는 것이 백혈구, 특히 림프구이다. 이 림프구는 B 림프구 (이하, B 세포로 기재하는 경우도 있다) 와 T 림프구 (이하, T 세포로 기재하는 경우도 있다) 라는 2종류의 주요한 타입으로 나뉘어지며, 어느 것이나 항원을 특이적으로 인식하여, 이것에 작용하여 생체를 방어한다.
T 세포는, CD (Cluster of Differentiation) 4 마커를 갖고, 주로 항체 생성의 보조나 각종 면역 응답의 유도에 관여하는 헬퍼 T 세포 (이하, TH 로 기재한다), CD 8 마커를 갖고, 주로 세포 상해 활성을 나타내는 세포 상해성 T 세포 [TC; 세포 상해성 T 림프구 (cytotoxic T lymphocyte), 킬러 T 세포라고도 불린다. 이하, CTL 로 기재하는 경우도 있다] 로 아분류된다. 종양 세포나 바이러스 감염 세포 등을 인식하여 파괴, 제거하는 데에 가장 중요한 역할을 하고 있는 CTL 은, B 세포와 같이 항원에 대하여 특이적으로 반응하는 항체를 생성하는 것은 아니고, 표적세포막 표면 상에 존재하는 주요 조직 적합 복합체〔MHC (major histocompatibility complex): 인간에 있어서는 인간 백혈구 항원 (HLA) 으로 칭하는 경우도 있다] 클래스 I 분자에 회합한 표적세포 유래의 항원 (항원 펩티드) 을 직접 인식하여 작용한다. 이 때, CTL 막 표면의 T 세포 리셉터 (이하, TCR 로 칭한다) 가 전술한 항원 펩티드 및 MHC 클래스 I 분자를 특이적으로 인식하여, 항원 펩티드가 자기 유래의 것인지, 또는 비(非)자기 유래의 것인지를 판단한다. 그리고, 비자기 유래로 판단된 표적세포는 CTL 에 의해서 특이적으로 파괴, 제거된다.
최근, 약제 치료법이나 방사선 치료법과 같이 환자에게 무거운 육체적 부담을 주는 치료법이 재검토되어, 환자의 육체적 부담이 가벼운 면역 치료법에 대한 관심이 높아지고 있다. 특히 면역 기능이 정상인 인간 유래의 림프구로부터 목적으로 하는 항원에 대하여 특이적으로 반응하는 CTL 을 생체외 (ex vivo) 에서 유도한 후, 또는 유도하지 않고, 림프구를 확대 배양하여, 환자에게 이입하는 양자(養子) 면역 요법의 유효성이 주목받고 있다. 예를 들어, 동물 모델에 있어서 양자 면역 요법이 바이러스 감염 및 종양에 대하여 유효한 치료법임이 시사되어 있다 (예를 들어, Greenberg, P. D. 저, 1992년 발행, Advances in Immunology 및 Reusser P. 외 3명, Blood, 1991년, Vol.78, No.5, P1373∼1380). 이 치료법에서는 CTL 의 항원 특이적 상해 활성을 유지 또는 증강시킨 상태에서 그 세포수를 유지 또는 증가시키는 것이 중요하다.
상기한 바와 같은 양자 면역 요법에 있어서, 치료 효과를 얻기 위해서는 일정량 이상의 세포수의 세포 상해성 림프구를 투여할 필요가 있다. 즉, 생체외 (ex vivo) 에서 이들의 세포수를 단시간에 얻는 것이 최대의 문제라고 할 수 있다.
CTL 의 항원 특이적 상해 활성을 유지 및 증강시키기 위해서는, CTL 에 관해서 항원에 특이적인 응답을 유도할 때, 목적으로 하는 항원을 사용한 자극을 반복하는 방법이 일반적이다. 그러나, 통상적으로 이 방법에서는 최종적으로 얻어지는 CTL 수가 감소하여, 충분한 세포수가 얻어지지 않는다.
질병의 치료에 유효한 T 세포를 조제하는 방법으로는, 예를 들어, 림포카인 활성화 킬러 세포 (LAK 세포) 를 사용하는 양자 면역 요법 (예를 들어, Rosenberg S. A. 외, N. Engl. J. Med. 1987년, Vol.316, No.15, P889∼897), 고농도의 인터류킨-2 (IL-2) 를 사용하여 유도한 종양 침윤 림프구 (TIL) 를 사용하는 양자 면역 요법 (예를 들어, Rosenberg S. A. 외, N. Engl. J. Med. 1988년, Vol.319, No.25, P1676∼1680 및 Ho M. 외 9명, Blood, 1993년, Vol.81, No.8, P2093∼2101) 가 알려져 있다.
다음으로, 항원 특이적인 CTL 의 조제에 관해서는, 자기 CMV 감염 선유아세포와 IL-2 (예를 들어, Riddell S. A. 외 4명, J. Immunol., 1991년, Vol.146, No.8, P2795∼2804), 또는 항 CD3 모노클로날 항체 (항 CD3 mAb) 와 IL-2 를 사용하여, 각각 CMV 특이적 CTL 클론을 단리 그리고 대량 배양하는 방법 (예를 들어, Greenberg P. D. 외 1명, J. Immunol. Methods, 1990년, Vol.128, No.2, P189∼201) 이 보고되어 있다.
또, 국제 공개 제96/06929호 팜플렛에는 REM 법 (rapid expansion method) 이 개시되어 있다. 이 REM 법은, 항원 특이적 CTL 및 TH 를 함유하는 T 세포의 초기 집단을 단기간에 증식 (Expand) 시키는 방법이다. 즉, 개개의 T 세포 클론을 증식시켜 대량의 T 세포를 제공할 수 있고, 항 CD3 항체, IL-2, 및 방사선 조사에 의해 증식성을 없앤 PBMC (peripheral blood mononuclear cell, 말초혈 단핵세포) 와 엡스타인바 바이러스 (Epstein-Barr virus, 이하 EBV 로 약기한다) 감염 세포를 사용하여 항원 특이적 CTL 수를 증가시키는 것이 특징이다.
또한, 국제 공개 제97/32970호 팜플렛에는 개변 REM 법이 개시되어 있고, 당해 방법은 PBMC 와는 구별되는 T 세포 자극 성분을 발현하는 분열되어 있지 않은 포유동물 세포주를 피더 세포로서 사용하여, PBMC 의 사용량을 저감시키는 방법이다.
림포카인 활성화 킬러 세포 (LAK 세포) 는, 림프구를 함유한 말초혈액 (말초혈 백혈구) 나 제대혈, 조직액 등에 IL-2 를 첨가하여, 수일간 시험관 내에서 배양함으로써 얻어지는 세포 상해 활성을 갖는 기능적 세포 집단이다. 이 때, 항 CD3 항체를 첨가하여 배양함으로써, 더욱 LAK 세포의 증식이 가속된다. 이렇게 해서 얻어진 LAK 세포는 비특이적으로 다양한 암세포나 그 밖의 타겟에 대하여 상해 활성을 갖는다. LAK 세포도 상기 CTL 과 마찬가지로, 양자 면역 요법에 사용된다.
상기한 바와 같이, 세포 상해성 림프구, 예를 들어 CTL, LAK세포, TIL 등을 취득하는 공정에서는 IL-2 의 이용을 빠뜨릴 수 없다. IL-2 가 세포 표면의 인터류킨-2 리셉터 (IL-2R) 에 결합함으로써 세포는 더욱 활성화된다. 또한, IL-2R 은 림프구의 활성화 마커로서 알려져 있다. 이러한 점들에서, 세포 표면의 IL-2R 의 발현을 상승시키는 것이 중요하다. 또한, CTL 의 유도에 있어서는, 항원에 의한 자극에 제공된 CTL 의 전구세포가 CTL 로서 유도되는 효율을 향상시키는 것, 즉, 유도 후의 세포군에 있어서의 CD8 양성 세포의 비율을 향상시키는 것이 중요하다.
또한 이들 림프구를 체외에서 확대 배양할 때에는 통상적으로 혈청 또는 혈장이 5용량% 내지 20용량% 첨가된다. 이 혈청ㆍ혈장은 림프구 등의 세포를 ex vivo 에서 배양할 때에 필요한 성분이지만, 혈청ㆍ혈장은 비자기(非自己) 동물 (인간ㆍ소 등) 의 혈액을 그 유래로 하기 때문에 각종 바이러스 감염 등의 위험성을 배제할 수 없다. 또한, 현재의 검출 기술에서는 검출할 수 없는 바이러스나 병원성 미생물의 존재를 완전히 부정하기란 불가능하다.
이러한 관점에서, 최근 환자 유래의 혈청ㆍ혈장 (자기 혈청ㆍ혈장) 의 사용이 추진되고 있다. 그러나, 배양에 필요한 양의 혈청ㆍ혈장을 확보하기 위해서 환자 자신의 혈액을 다량으로 채취하는 것은, 환자에 대한 육체적 부담이 크고, 생명의 위험으로 이어질 가능성도 있다. 이 위험을 회피하기 위해, 소량의 혈청ㆍ혈장을 사용하여 치료에 필요한 림프구를 얻는 확대 배양을 실시하면 필연적으로 저농도 혈청ㆍ혈장에서의 배양이 된다. 일반적으로 림프구 등의 세포는 저혈청ㆍ저혈장 조건에서의 배양에 의해서는 증식이 불안정해져 치료에 필요한 양의 세포를 얻을 수 없다. 또, 상기 서술한 육체적 부담 및 감염의 위험성을 회피하기 위해서는 무혈청 배양이 강하게 요구되지만, 이러한 배양 조건에서는 거의 대부분의 세포가 증식하지 않게 된다.
이 때문에, 저혈청ㆍ무혈청 (저혈장ㆍ무혈장) 에서의 림프구 확대 배양 방법이 강하게 요구되고 있다.
무혈청 (무혈장) 조건하에서의 림프구 확대 배양 방법이 확립되면, 혈청ㆍ혈장의 로트간 차를 배제할 수 있어, 환자 혈청ㆍ혈장에 유래하는 마이너스 요인 (면역 억제 성분 등) 을 배제하는 것이 가능하기 때문에, 이 계의 확립에 의해 얻어지는 이익은 헤아릴 수 없다.
피브로넥틴 (fibronectin) 은 동물의 혈액 중, 배양세포 표면, 조직의 세포외 매트릭스에 존재하는 분자량 25만의 거대한 당단백질로, 다채로운 기능을 갖는 것이 알려져 있다. 그 도메인 구조는 7개로 나뉘어져 있고 (이하, 도 1 참조), 또한 그 아미노산 서열 중에는 3종류의 유사 서열이 포함되고 있으며, 이들 각 서열의 반복으로 전체가 구성되어 있다. 3종류의 유사 서열은 I 형, II 형, III 형으로 불리우고, 이 중, III 형은 아미노산 잔기 71∼96개의 아미노산 잔기로 구성되어 있고, 이들 아미노산 잔기의 일치율은 17∼40% 이다. 피브로넥틴 중에는 14 의 III 형 서열이 존재하지만, 그 중 8번째, 9번째, 10번째 (이하, 각각 III-8, III-9, III-10 으로 부른다.) 는 세포 결합 도메인에, 또한 12번째, 13번째, 14번째 (이하, 각각 III-12, III-13, III-14 로 부른다.) 는 헤파린 결합 도메인에 포함되어 있다. 또한, III-10 에는 VLA (very late activation antigen)-5 결합 영역이 포함되어 있고, 이 코어 서열은 RGDS 이다. 또한, 헤파린 결합 도메인의 C 말단측에는 IIICS 로 불리는 영역이 존재한다. IIICS 에는 25 아미노산으로 이루어지는 VLA-4 에 대하여 결합 활성을 갖는 CS-1 로 불리우는 영역이 존재한다 (예를 들어, Deane F. Momer 저, 1988년 발행, FIBRONECTIN, ACADEMIC PRESS INC., P1∼8, Kimizuka F. 외 8명, J. Biochem., 1991년, Vol.110, No.2, p284-291 및 Hanenberg H. 외 5명, Human Gene Therapy, 1997년, Vol.8, No.18, p2193-2206).
발명의 개시
본 발명의 목적은, 안전성이 높고, 의료에 대한 사용에 적합하며, 세포 상해 활성을 높은 레벨로 유지한 세포 상해성 림프구를 취득하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명을 개략 설명하면, 본 발명의 제 1 발명은, 배지 중에 있어서의 혈청 및 혈장의 총함유 농도가 0용량% 이상 5용량% 미만인 배지를 사용하여, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들의 혼합물의 존재하에 세포 상해성 림프구의 유도, 유지 및 확대 배양 중에서 선택되는 적어도 하나를 실시하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 상해성 림프구의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 제 1 발명에 의해 제조되는 세포 상해성 림프구로는, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들의 혼합물의 비존재하에 제조된 것과 비교하여, 인터류킨-2 리셉터를 고(高)발현하는 세포 상해성 림프구가 예시된다. 또한, 본 발명의 제 1 발명에 의해 제조되는 세포 상해성 림프구로는, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들의 혼합물의 비존재하에 제조된 것과 비교하여, CD8 양성 세포를 고비율로 함유하는 세포 상해성 림프구가 예시된다. 또한, 본 발명의 제 1 발명에 의해 제조되는 세포 상해성 림프구로는, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들의 혼합물의 비존재하에서의 세포 상해성 림프구의 제조 방법에 의해 제조된 것과 비교하여, 확대 배양률이 높은 세포 상해성 림프구가 예시된다. 또한, 본 발명의 제 1 발명에 의해 제조되는 세포 상해성 림프구로는, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들의 혼합물의 비존재하에 제조된 것과 비교하여, 세포 상해 활성이 증강되거나 또는 높은 세포 상해 활성이 유지된 세포 상해성 림프구가 예시된다.
본 발명의 제 1 발명에 있어서, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들의 혼합물의 사용에 관해서는, 이들이 고상에 고정화되어 사용되는 것이 예시된다. 여기서 고상으로는 세포 배양용 기재(器材) 또는 세포 배양용 담체가 예시된다. 세포 배양용 기재로는, 샤알레, 플라스크 또는 백(bag) 을 예시할 수 있고, 세포 배양용 담체로는, 비즈, 멤브레인 또는 슬라이드 유리를 예시할 수 있다.
본 발명의 제 1 발명에 있어서, 세포 상해성 림프구로서, 림포카인 활성화 킬러 세포가 예시된다.
본 발명의 제 1 발명에 있어서, 피브로넥틴의 프래그먼트로는, 서열표의 서열번호 1∼8 로 나타내는 어느 하나의 아미노산 서열을 적어도 1개 함유하여 이루어지는 폴리펩티드 (m) 이거나, 또는 상기 어느 하나의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 적어도 1개 함유하여 이루어지는 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드 (m) 과 동등한 기능을 갖는 폴리펩티드 (n) 이 예시된다. 피브로넥틴의 프래그먼트로는, 세포 접착 활성 및/또는 헤파린 결합 활성을 갖는 것이 예시된다. 또한, 피브로넥틴의 프래그먼트가, 서열표의 서열번호 9∼20 및 25 로 나타내는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 폴리펩티드가 예시된다.
본 발명의 제 1 발명에 있어서, 당해 제조 방법을 세포 배양용 기재 중에서 실시하는 경우의 일 양태로서,
(a) 배양 개시시의 세포수와 세포 배양용 기재에 있어서의 배양 면적의 비율이, 1cell/㎠∼5×105cells/㎠ 인, 및/또는
(b) 배양 개시시의 배지 중의 세포의 농도가, 1cell/mL∼5×105cells/mL 인
조건을 만족하는 것이 예시된다.
또한, 이러한 제조 방법으로는, 세포 배양액을 희석하는 공정을 필요로 하지 않는 방법이 예시된다.
본 발명의 제 1 발명에 있어서, 세포 상해성 림프구의 유도, 유지 및 확대 배양 중 적어도 어느 하나를, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들의 혼합물의 존재하, 배지를 포함하는 세포 배양용 기재 중에서 실시하는 경우, 예를 들면, 적어도 1회의, 세포 배양액의 희석 공정, 배지의 교환 공정 또는 세포 배양용 기재의 교환 공정을 포함하고, 또한 적어도 1회의, 세포 배양액의 희석 공정 직후, 배지의 교환 공정 직후 또는 세포 배양용 기재의 교환 공정 직후의 배양 조건이,
(c) 세포 배양액 중의 세포의 농도가 2×105cells/mL∼1×108cells/mL 인, 또는
(d) 세포 배양액 중의 세포수와 세포 배양용 기재에 있어서의 배양 면적의 비율이 1×105cells/㎠∼1×108cells/㎠ 인,
조건을 만족하는 것이 예시된다.
본 발명의 제 1 발명의 제조 방법에 있어서, 세포 상해성 림프구의 유도, 유지 및 확대 배양 중 적어도 어느 하나를, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들의 혼합물의 존재하, 배지를 포함하는 세포 배양용 기재 중에서 실시하는 경우, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 적어도 1회의, 세포 배양액의 희석 공정, 배지의 교환 공정 또는 세포 배양용 기재의 교환 공정을 포함하고, 또한 적어도 1회의, 세포 배양액의 희석 공정 직후, 배지의 교환 공정 직후 또는 세포 배양용 기재의 교환 공정 직후의 배지 중에 있어서의 혈청 및 혈장의 총함유 농도가 배양 개시시와 동일하거나, 또는 배양 개시시보다 저감되어 있는 것이 예시된다.
본 발명의 제 1 발명에 있어서, 세포 상해성 림프구에 외래 유전자를 도입하는 공정을 추가로 포함하는 방법이 예시된다. 여기서 외래 유전자의 도입으로는, 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 수반 바이러스 또는 시미안 바이러스 (simian virus) 를 사용하여 도입하는 것이 예시된다.
본 발명의 제 2 발명은, 본 발명의 제 1 발명의 방법에 의해 얻어지는 세포 상해성 림프구에 관한 것이다.
본 발명의 제 3 발명은 본 발명의 제 1 발명의 방법에 의해 얻어지는 세포 상해성 림프구를 유효성분으로서 함유하는 의약에 관한 것이다.
본 발명의 제 4 발명은, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들의 혼합물을 유효성분으로서 함유하고, 또한 혈청 및 혈장의 총함유 농도가 0용량% 이상 5용량% 미만인 것을 특징으로 하는 세포 상해성 림프구 배양용 배지에 관한 것이다.
발명을 실시하기
위한 최선의 형태
본 발명은, 세포 상해성 림프구의 유도, 유지 또는 확대 배양 방법에 있어서, 피브로넥틴 및/또는 피브로넥틴 프래그먼트의 존재하에 세포 상해성 림프구를 조제함으로써, 배지 중의 혈청이나 혈장의 함유량을 저감 또는 제거하더라도 높은 확대 배양률에서 충분한 세포 상해 활성을 갖고, IL-2R 의 발현량이 높으며, 또한 CD8 양성 세포의 비율이 높은 세포 상해성 림프구가 얻어지는 것을 발견하여, 완성하기에 이른 것이다.
또, 본 명세서에 있어서 세포 상해성 림프구의 제조는, 당해 세포의 유도 (활성화), 유지, 확대 배양의 각 공정, 또는 이들을 조합한 공정을 포함하는 조작을 가리킨다. 또한, 본 발명의 세포 상해성 림프구의 제조를, 세포 상해성 림프구의 배양이라고도 부른다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
(1) 본 발명에 사용되는 피브로넥틴, 및 그 프래그먼트
본 명세서 중에 기재된 피브로넥틴 및 그 프래그먼트는, 천연에서 얻어진 것, 또는 인위적으로 합성된 것 중 어느 것이라도 상관없다. 피브로넥틴 및 그 프래그먼트는, 예를 들어 루오슬라티 E. 외 [Ruoslahti E., et al., 저널 오브 바이오로지칼 케미스트리 (J. Biol. Chem.), 제256권, 제14호, 제7277∼7281페이지 (1981)] 의 개시에 기초하여, 천연 기원의 물질로부터 실질적으로 순수한 형태로 제조할 수 있다. 여기서, 본 명세서에 기재된 실질적으로 순수한 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 프래그먼트란, 이들이 천연에 있어서 피브로넥틴과 함께 존재하는 다른 단백질을 본질적으로 함유하고 있지 않은 것을 의미한다. 상기 피브로넥틴 및 그 프래그먼트는 각각 단독으로, 또는 복수 종류의 것을 혼합하여 본 발명에 사용할 수 있다.
또, 피브로넥틴은 다수의 스플라이싱 변이체 (splicing variant) 의 존재가 알려져 있지만, 본 발명에 사용되는 피브로넥틴으로는, 본 발명이 소망하는 효과를 발현하는 것이면 어떠한 변이체도 사용할 수 있다. 예를 들어, 혈장 유래의 피브로넥틴의 경우, 세포 결합 도메인의 상류에 존재하는 ED-B 라고 불리우는 영역, 세포 결합 도메인과 헤파린 결합 도메인 사이에 존재하는 ED-A 라고 불리우는 영역이 결실되어 있음이 알려져 있지만, 이러한 혈장 유래의 피브로넥틴도 본 발명에 사용할 수 있다.
본 발명에 사용할 수 있는 피브로넥틴 프래그먼트, 및 그 프래그먼트의 조제에 관한 유용한 정보는, 키미즈카 F. 외 [Kimiduka F., et al., 저널 오브 바이오케미스트리 (J. Biochem.), 제110권, 제284∼291페이지 (1991)], 콘브릿트 A. R. 외 [Kornbrihtt A. R., et al., EMBO 저널 (EMBO J.), 제4권, 제7호, 1755∼1759 (1985)], 및 세키구치 K. 외 [Sekiguchi K., et al., 바이오케미스트리 (Biochemistry), 제25권, 제17호, 4936∼4941 (1986)] 등에서 얻을 수 있다. 또한, 피브로넥틴의 아미노산 서열에 관해서는, Genbank Accession No. NM_002026 (NP_002017) 에 개시되어 있다.
본 발명에 있어서, 피브로넥틴 프래그먼트로는, 예를 들어, III-8 (서열표의 서열번호 1 로 나타내는 아미노산 서열), III-9 (서열표의 서열번호 2 로 나타내는 아미노산 서열), III-10 (서열표의 서열번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열), III-11 (서열표의 서열번호 4 로 나타내는 아미노산 서열), III-12 (서열표의 서열번호 5 로 나타내는 아미노산 서열), III-13 (서열표의 서열번호 6 으로 나타내는 아미노산 서열), III-14 (서열표의 서열번호 7 로 나타내는 아미노산 서열), 및 CS-1 (서열표의 서열번호 8 로 나타내는 아미노산 서열) 중 어느 하나의 영역을 구성하는 아미노산 서열을 적어도 1개 함유하여 이루어지는 폴리펩티드 (m) (도 1 참조) 이나, 상기 어느 하나의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 적어도 1개 함유하여 이루어지는 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드 (m) 과 동등한 기능을 갖는 폴리펩티드 (n) 이 예시된다.
또한, 당해 프래그먼트로는, 세포 접착 활성 및/또는 헤파린 결합 활성을 갖는 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 세포 접착 활성은, 본 발명에서 사용되는 프래그먼트 (그 세포 결합 도메인) 와 세포의 결합을 공지된 방법을 사용하여 분석함으로써 조사할 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법에는, 윌리암즈 D. A. 외의 방법 [Williams D. A., et al., 네이쳐 (Nature), 제352권, 제438∼441페이지 (1991)] 이 포함된다. 당해 방법은, 배양 플레이트에 고정화한 프래그먼트에 대한 세포의 결합을 측정하는 방법이다. 또한, 헤파린 결합 활성은, 본 발명에 사용되는 프래그먼트 (그 헤파린 결합 도메인) 와 헤파린의 결합을 공지된 방법을 사용하여 분석함으로써 조사할 수 있다. 예를 들어, 상기한 윌리암즈 D. A. 외의 방법에 있어서, 세포를 대신하여 헤파린, 예를 들어 표지 헤파린을 사용함으로써, 같은 방법에 의해 프래그먼트와 헤파린의 결합 평가를 실시할 수 있다.
그리고 피브로넥틴의 프래그먼트로는, C-274 (서열표의 서열번호 9 로 나타내는 아미노산 서열), H-271 (서열표의 서열번호 10 으로 나타내는 아미노산 서열), H-296 (서열표의 서열번호 11 로 나타내는 아미노산 서열), CH-271 (서열표의 서열번호 12 로 나타내는 아미노산 서열), CH-296 (서열표의 서열번호 13 으로 나타내는 아미노산 서열), C-CS1 (서열표의 서열번호 14 로 나타내는 아미노산 서열), 또는 CH-296Na (서열표의 서열번호 25 로 나타내는 아미노산 서열) 로부터 선택되는 폴리펩티드가 예시된다. 또, CH-296Na 에 관해서는 본원에 있어서 처음으로 제작된 폴리펩티드이다.
상기한 CH-271, CH-296, CH-296Na, C-274, C-CS1 의 각 프래그먼트는 VLA-5 에 결합하는 활성을 갖는 세포 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드이다. 또한, C-CS1, H-296, CH-296, CH-296Na 는 VLA-4 에 결합하는 활성을 갖는 CS-1 을 갖는 폴리펩티드이다. 그리고, H-271, H-296, CH-271, CH-296 및 CH-296Na 는 헤파린 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드이다. 또, CH-296Na 는 혈장 유래의 피브로넥틴에 있어서의 세포 결합 도메인으로부터 CS-1 까지를 포함하는 폴리펩티드이다. 즉, CH-296Na 는 Genbank Accession No.NM_002026 (NP_002017) 에 개시되어 있는 피브로넥틴의 아미노산 서열의 1270번째 프롤린 (proline) 으로부터 2016번째의 트레오닌까지를 포함하는 폴리펩티드로부터, 1631번째의 아스파라긴으로부터 1720번째의 트레오닌에 걸친 영역 (ED-A) 이 결실된 폴리펩티드이다.
본 발명에 있어서는, 상기의 각 도메인이 개변(改變)된 프래그먼트도 사용할 수 있다. 피브로넥틴의 헤파린 결합 도메인은 3개의 III 형 서열 (III-12, III-13, III-14) 에 의해 구성되어 있다. 상기 III 형 서열 중 하나 또는 두개가 결실된 헤파린 결합 도메인을 포함하는 프래그먼트도 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들어, 피브로넥틴의 세포 결합 부위 (VLA-5 결합 영역, Pro1239∼Ser1515) 와 하나의 III 형 서열이 결합된 프래그먼트인 CHV-89 (서열표의 서열번호 15 로 나타내는 아미노산 서열), CHV-90 (서열표의 서열번호 16 으로 나타내는 아미노산 서열), CHV-92 (서열표의 서열번호 17 로 나타내는 아미노산 서열), 또는 두개의 III 형 서열이 결합된 프래그먼트인 CHV-179 (서열표의 서열번호 18 로 나타내는 아미노산 서열), CHV-181 (서열표의 서열번호 19 로 나타내는 아미노산 서열) 이 예시된다. CHV-89, CHV-90, CHV-92 는 각각 III-13, III-14, III-12 를 함유하는 것이고, CHV-179 는 III-13 과 III-14 를, CHV-181 은 III-12 와 III-13 을 각각 함유하고 있다.
또한, 상기한 각 프래그먼트에 추가로 아미노산을 부가한 프래그먼트도 본 발명에 사용할 수 있다. 당해 프래그먼트는, 예를 들어, 후술하는 제조예에 기재된 H-275-Cys 의 제조 방법에 준하여 상기 각 프래그먼트에 원하는 아미노산을 부가함으로써 제조 가능하다. 예를 들어, H-275-Cys (서열표의 서열번호 20 으로 나타내는 아미노산 서열) 는, 피브로넥틴의 헤파린 결합 도메인을 갖고, 또한 C 말단에 시스테인 잔기를 갖는 프래그먼트이다.
또, 본 발명에 사용되는 프래그먼트로는, 본 발명이 소망하는 효과가 얻어지는 한, 상기에 예시한 천연 피브로넥틴의 아미노산 서열의 적어도 일부를 함유하는 프래그먼트와 동등한 기능을 갖는, 당해 프래그먼트를 구성하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 1 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드로 이루어지는 것이어도 된다.
아미노산의 치환 등은, 원래의 폴리펩티드 기능이 유지될 수 있는 범위 내에서 그 폴리펩티드의 물리화학적 성상(性狀) 등을 변화시킬 수 있는 정도의 것이 바람직하다. 예를 들어, 아미노산의 치환 등은, 원래의 폴리펩티드가 갖는 성질 (예를 들어, 소수성, 친수성, 전하, pK 등) 을 실질적으로 변화시키지 않는 범위의 보존적인 것이 바람직하다. 예를 들어, 아미노산의 치환은, 1. 글리신, 알라닌; 2. 발린, 이소류신, 류신; 3. 아스파라긴산, 글루타민산, 아스파라긴, 글루타민: 4. 세린, 트레오닌; 5. 리신, 아르기닌; 6. 페닐알라닌, 티로신의 각 그룹 내에서의 치환이고, 아미노산의 결실, 부가, 삽입은, 폴리펩티드에 있어서의 이들 대상 부위 주변의 성질과 유사한 성질을 갖는 아미노산의, 대상 부위 주변의 성질을 실질적으로 변화시키지 않는 범위에서의 결실, 부가, 삽입이 바람직하다.
아미노산의 치환 등은 종간이나 개체차에 기인하여 천연적으로 생기는 것이어도 되고, 또는 인공적으로 유발된 것이어도 된다. 인공적인 유발은 공지된 방법에 의해 실시하면 되고, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 공지된 수법에 의해, 천연의 피브로넥틴 유래의 상기 영역이나 소정의 프래그먼트를 코딩하는 핵산에 있어서 1 또는 복수개의 염기가 치환, 결실, 부가 또는 삽입된 소정의 핵산을 제작하고, 그것을 사용하여, 천연의 피브로넥틴 유래의 상기 영역이나 소정의 프래그먼트와 동등한 기능을 갖는, 당해 프래그먼트 등을 구성하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 치환 등을 갖는 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
또한, 본 명세서에 있어서 「동등한 기능을 갖는다」라는 것은, 비교 대조인 폴리펩티드가, 천연 유래의 피브로넥틴 프래그먼트가 갖는, (i) 세포 상해성 림프구의 세포 상해 활성의 증강 또는 유지 기능, (ii) IL-2R 의 발현량의 증강 기능, (iii) CD8 양성 세포의 비율 향상 기능, 또는 (iv) 세포 상해성 림프구의 확대 배양률의 향상 기능 중 적어도 어느 하나의 기능을 갖는 것을 말한다. 상기 기능은 후술하는 실시예에 기재된 방법에 준하여 적절히 확인할 수 있다. 또한, 아미노산의 치환 등을 갖는 폴리펩티드로 이루어지는 프래그먼트로는, 세포 접착 활성 및/또는 헤파린 결합 활성을 갖는 것이 바람직하다. 세포 접착 활성 및 헤파린 결합 활성은, 그들의 상기 활성 측정 방법에 준하여 평가할 수 있다.
아미노산의 치환 등을 갖는 폴리펩티드로 이루어지는 프래그먼트로서, 예를 들어, 2개의 다른 도메인 간에 링커로서 1 이상의 아미노산이 삽입된 프래그먼트도 본 발명에 사용할 수 있다.
또, 피브로넥틴에 관해서도, 상기한 프래그먼트와 마찬가지로, 그 폴리펩티드의 아미노산 서열에 1 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로서, 적어도 상기 (i)∼(iv) 중 어느 하나의 기능을 갖는 폴리펩티드를, 본 발명에 있어서 사용할 수 있다.
본 명세서 중에 기재된 피브로넥틴 프래그먼트는, 예를 들어, 미국 특허 제5,198,423호 명세서의 기재에 기초하여 유전자 재조합체로부터 제조할 수도 있다. 예를 들어, 상기한 H-271 (서열번호 10), H-296 (서열번호 11), CH-271 (서열번호 12), CH-296 (서열번호 13) 의 각 프래그먼트 및 이들을 취득하는 방법은 당해 특허 명세서에 상세히 기재되어 있다. 또한, CH-296Na (서열번호 25) 와 그 제조 방법에 관해서는 후술하는 (3) CH-296Na 에 관해서, 및 실시예에 기재되어 있다. 또한, 상기한 C-274 (서열번호 9) 프래그먼트는 미국 특허 제5,102,988호 명세서에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있다. 그리고, C-CS1 (서열번호 14) 프래그먼트는 일본 특허 제3104178호 명세서에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있다. 상기 CHV-89 (서열번호 15), CHV-90 (서열번호 16), CHV-179 (서열번호 18) 의 각 프래그먼트는, 일본 특허 제2729712호 명세서에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있다. 또한, CHV-181 (서열번호 19) 프래그먼트는 국제 공개 제97/18318호 팜플렛에 기재된 방법에 준하여 얻을 수 있다. CHV-92 (서열번호 17) 프래그먼트는, 일본 특허 제2729712호 명세서 및 국제 공개 제97/18318호 팜플렛을 참조하여, 이들 문헌에 기재된 플라스미드에 기초하여 정형적으로 플라스미드를 구축하고, 그 플라스미드를 사용하여 유전자 공학적으로 취득할 수 있다.
이러한 프래그먼트 또는 이들 프래그먼트로부터 정형적으로 유도할 수 있는 프래그먼트는, 우편번호 305-8566 일본국 이바라기현 쯔꾸바시 히가시 1쵸메 1반찌 1 중앙 제 6 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물 기탁센터에 하기 수탁번호하에 기탁된 미생물을 사용하여 제조하거나, 또는 각 미생물이 유지하는 플라스미드를 공지된 방법에 의해 개변함으로써 제조할 수 있다;
FERM BP-2264 (H-271 을 코딩하는 플라스미드를 보유하는 대장균: 기탁일 1989년 1월 30일),
FERM BP-2800 (CH-296 을 코딩하는 플라스미드를 보유하는 대장균; 기탁일 1989년 5월 12일),
FERM BP-2799 (CH-271 을 코딩하는 플라스미드를 보유하는 대장균; 기탁일 1989년 5월 12일),
FERM BP-7420 (H-296 을 코딩하는 플라스미드를 보유하는 대장균; 기탁일 1989년 5월 12일),
FERM BP-1915 (C-274 를 코딩하는 플라스미드를 보유하는 대장균; 기탁일 1988년 6월 17일),
FERM BP-5723 (C-CS1 을 코딩하는 플라스미드를 보유하는 대장균; 기탁일 1990년 3월 5일),
FERM BP-10073 (CH-296Na 를 코딩하는 플라스미드; 기탁일 2004년 7월 23일)
FERM P-12182 (CHV-89 를 코딩하는 플라스미드를 보유하는 대장균; 기탁일 1991년 4월 8일),
FERM P-12183 (CHV-179 를 코딩하는 플라스미드를 보유하는 대장균; 기탁일 1991년 4월 8일).
피브로넥틴은 거대 당단백질이기 때문에, 천연 기원의 단백질을 조제하여 사용하는 것이 산업상 및 의약품 제조상에 있어서 반드시 용이하지는 않다. 또한, 피브로넥틴은 다기능 단백질이기 때문에, 그 사용 상황에 따라서는 본 발명의 방법에 효과를 나타내는 영역과는 다른 영역에 기인하는 문제가 일어나는 경우도 있을 수 있다. 이러한 점에서, 본 발명에서는, 입수, 취급의 용이함 및 안전면의 관점에서, 바람직하게는 피브로넥틴 프래그먼트, 더욱 바람직하게는 상기와 같은 방법으로 얻어지는 재조합 피브로넥틴 프래그먼트를 사용할 수 있다. 또, 후술하는 림프구의 확대 배양률의 향상, 확대 배양된 림프구에 있어서의 IL-2R 의 발현량의 상승, 및 확대 배양된 림프구 집단 중의 CD8 양성 세포의 비율의 향상, 세포 상해 활성의 상승 등의 효과를 나타낼 수 있는 피브로넥틴 프래그먼트가 특히 바람직하게 사용된다. 또한, 본 발명에 사용되는 피브로넥틴 프래그먼트의 분자량으로는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 1∼200kD, 보다 바람직하게는 5∼190kD, 더욱 바람직하게는 10∼180kD 이다. 당해 분자량은, 예를 들어, SDS-폴리아크릴 아미드겔 전기 영동에 의해 측정할 수 있다.
또, 본 발명의 피브로넥틴 프래그먼트를 구성하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 천연 유래의 피브로넥틴 프래그먼트를 구성하는 폴리펩티드의 아미노산 서열 이외의 아미노산 서열 부분은, 본 발명이 소망하는 효과의 발현을 저해하지 않는 한 임의이고, 특별히 한정되는 것이 아니다.
(2) 본 발명의 세포 상해성 림프구의 제조 방법
이하, 본 발명의 세포 상해성 림프구의 제조 방법에 관해서 구체적으로 설명한다. 본 발명의 방법은, 배지 중에 있어서의 혈청 및 혈장의 총함유 농도가 0용량% 이상 5용량% 미만인 배지를 사용하여, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들의 혼합물의 존재하에 세포 상해성 림프구의 유도, 유지 및 확대 배양 중 적어도 어느 하나를 실시하는 세포 상해성 림프구의 제조 방법이다.
본 명세서에 있어서 세포 상해성 림프구란 세포 상해성 림프구를 함유하는 세포군을 의미한다. 또, 협의로는 상기 세포군에 함유되어 있는 세포 상해성 림프구만을 가리키는 경우가 있다. 또한, 본 발명에 있어서 세포 상해성 림프구의 제조란, 본 발명의 세포 상해성 림프구로 될 수 있는 전구세포로부터 세포 상해 활성을 갖는 림프구로의 유도, 세포 상해성 림프구의 유지, 세포 상해성 림프구 및/또는 전구세포를 사용한 세포 상해성 림프구의 확대 배양, 모두를 포함하는 의미이다. 본 발명의 세포 상해성 림프구의 제조 방법에 있어서는, 그 방법에 사용되는 세포의 종류나, 배양 조건 등을 적절히 조정함으로써 세포 상해성 림프구의 유도, 유지 또는 확대 배양이 실시되게 된다.
본 발명의 세포 상해성 림프구로는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 세포 상해 활성을 갖는 림포카인 활성화 킬러 세포 (LAK 세포), 세포 상해성 T 세포 (CTL), 종양 침윤 림프구 (TIL), NK 세포 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 세포 상해성 림프구로 될 수 있는, 즉 그 림프구로의 분화능을 갖는 전구세포로는, 말초혈 단핵구 (PBMC), NK 세포, 나이브 세포, 메모리 세포, 조혈 줄기세포, 제대혈 단핵구 등이 예시된다. 또한, 혈구계 세포이면 본 발명에 있어서 전구세포로서 사용할 수 있다. 이들 세포는 생체로부터 채취된 것을 그대로 사용하거나 또는 동결 보존시킨 것 등 어느 것이나 사용할 수 있다. 또, 본 발명의 세포 상해성 림프구의 제조 방법에서는, 상기 세포를 함유하는 재료, 예를 들어, 말초혈액, 제대혈 등의 혈액이나, 혈액으로부터 적혈구나 혈장 등의 성분을 제거한 것, 골수액 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 세포 상해성 림프구의 제조 방법은, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들의 혼합물에서 선택되는 유효성분의 존재하에 세포 상해성 림프구를 제조하는 것을 하나의 큰 특징으로 한다. 또, 본 발명의 세포 상해성 림프구의 제조 방법은, 세포 상해성 림프구의 배양의 전기간, 또는 임의의 일부 기간에 있어서 실행된다. 즉, 세포 상해성 림프구의 제조 공정의 일부에 상기 공정을 포함하는 것이면 본 발명에 포함된다.
또, 종래의 세포 상해성 림프구의 확대 배양 방법에서는, 배지 중에 5∼20용량% 의 혈청ㆍ혈장의 첨가가 필요했던 것에 반하여, 본 발명의 세포 상해성 림프구의 제조 방법은, 이들 혈청 및 혈장의 배지 중의 총함유 농도를 0용량% 이상 5용량% 미만으로 하는 것을 특징으로 한다. 혈청 및 혈장의 배지 중 총함유 농도는, 바람직하게는 0용량% 이상 4용량% 이하, 특히 바람직하게는 0용량% 이상 3용량% 이하로 할 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 양태에 있어서는, 배지 중에 혈청ㆍ혈장을 전혀 첨가하지 않고 충분하게 세포 상해성 림프구를 제조할 수 있어, 안전면이나 환자에 대한 부담을 경감시키는 점에서 매우 유용한 방법이다. 또한, 본 발명에 있어서, 사용하는 혈청ㆍ혈장의 사용량을 더욱 저감시키고 싶은 경우에는, 배양 도중에 있어서 혈청ㆍ혈장의 사용량을 단계적으로 저감시킬 수 있다. 즉, 배양 개시시의 혈청ㆍ혈장 농도에 대하여, 후술하는 세포 배양액의 희석, 배지 교환 또는 세포 배양용 기재의 교환시에 사용되는 새로운 배지 중의 혈청ㆍ혈장 농도를 저감시키거나 또는 첨가하지 않음으로써, 혈청ㆍ혈장의 사용량을 통상보다 저감시키는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명에 의하면, 적어도 1회의, 세포 배양액의 희석 공정, 배지의 교환 공정 또는 세포 배양용 기재의 교환 공정을 포함하고, 또한 적어도 1회의, 세포 배양액의 희석 공정 직후, 배지의 교환 공정 직후 또는 세포 배양용 기재의 교환 공정 직후의 배지 중에 있어서의 혈청 및 혈장의 총함유 농도가 배양 개시시와 동일하거나, 또는 배양 개시시보다 저감되어 있는 세포 상해성 림프구의 제조 방법이 제공된다.
또, 혈청 또는 혈장의 유래로는, 자기 (사용하는 세포 상해성 림프구의 전구세포와 유래가 동일한 것을 의미한다) 또는 비자기 (사용하는 세포 상해성 림프구의 전구세포와 유래가 다른 것을 의미한다) 중 어느 것도 상관없지만, 바람직하게는 안전성의 관점에서 자기 유래의 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 세포 상해성 림프구의 제조, 즉 세포 상해성 림프구의 유도, 유지 및/또는 확대 배양은, 통상적으로 본 발명의 상기 유효성분의 존재하에, 소정 성분을 함유하는 배지 중에서 실시된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 있어서, 세포 상해성 림프구의 유도 또는 확대 배양을 의도하는 경우, 본 발명에 있어서 사용되는 배양 개시시의 세포 (세포 상해성 림프구 및/또는 전구세포) 수로는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 1cell/mL∼1×108cells/mL, 바람직하게는 1cell/mL∼5×107cells/mL, 더욱 바람직하게는 1cell/mL∼2×107cells/mL 가 예시된다. 또한, 배양 조건에 특별히 한정은 없고, 통상적인 세포 배양에 사용되는 조건을 사용할 수 있다. 예를 들어, 37℃, 5% CO2 등의 조건으로 배양할 수 있다. 또한, 적당한 시간 간격으로 세포 배양액을 신선한 배지를 추가하여 희석하거나, 배지를 교환하거나, 또는 세포 배양용 기재를 교환할 수 있다.
본 발명의 세포 상해성 림프구의 제조 방법에 있어서 사용되는 배지에는 혈청 및 혈장의 총함유 농도를 제외하고는 특별한 한정은 없고, 세포 상해성 림프구, 그 전구세포의 유지, 생육에 필요한 성분을 혼합하여 제작된 공지의 배지를 사용할 수 있고, 예를 들어 시판되는 배지를 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 이들 배지는 그 원래의 구성 성분 이외에 적당한 단백질, 사이토카인류, 그 밖의 성분을 함유하고 있어도 된다. 바람직하게는, IL-2 를 함유하는 배지가 본 발명에 사용된다. IL-2 의 배지 중의 농도로는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 바람직하게는 0.01∼1×105U/mL, 보다 바람직하게는 0.1∼1×104U/mL 이다.
본 발명의 세포 상해성 림프구의 제조 방법에 있어서 사용되는 세포 배양용 기재로는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 샤알레, 플라스크, 백, 대형 배양조, 바이오 리액터 등을 사용할 수 있다. 또, 백으로는, 하기 실시예 34∼38 및 45∼52 에 기재된 것과 같이 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 사용할 수 있다. 또한, 공업적으로 대량의 림프구를 제조하는 경우에는, 대형 배양조를 사용할 수 있다. 또한, 배양은 개방계, 폐쇄계 모두 사용할 수 있지만, 바람직하게는 얻어지는 림프구의 안전성 관점에서 폐쇄계에서 배양하는 것이 바람직하다.
또한, 항 CD3 항체를 추가로 함유하는 배지 중에서 세포 상해성 림프구로 될 수 있는 전구세포를 배양할 수도 있다. 항 CD3 항체의 배지 중의 농도로는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 0.001∼100㎍/mL, 특히 0.01∼100㎍/mL 가 바람직하다. 항 CD3 항체는 림프구 상의 리셉터를 활성화할 목적으로 첨가할 수 있다. 또한, 이밖에, 렉틴 등의 림프구 자극 인자를 첨가할 수도 있다. 당해 성분의 배지 중의 농도는, 소망하는 효과가 얻어진다면 특별히 한정되지 않는다.
또, 본 발명의 유효성분을 함유하고, 상기 성분은 배지 중에 용해하여 공존시키는 것 외에, 적절한 고상, 예를 들어 샤알레, 플라스크, 백 등의 세포 배양용 기재 (개방계의 기재, 및 폐쇄계의 기재를 모두 포함한다), 또는 비즈, 멤브레인, 슬라이드 유리 등의 세포 배양용 담체에 고정화하여 사용해도 된다. 또, 비즈에 대한 고정화로는, 하기 실시예 61 및 62 에 기재된 대로 실시할 수 있고, 제조된 비즈는 하기 실시예 63 및 64 에 기재된 것과 같이 사용할 수 있다. 이들 고상의 재질은 세포 배양에 사용 가능한 것이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 그 성분을, 예를 들어 상기 기재에 고정화하는 경우, 배지를 그 기재에 넣었을 때에, 그 성분을 배지 중에 용해시켜 사용하는 경우의 소망 농도와 같은 비율이 되도록 기재에 넣은 배지량에 대하여 각 성분의 일정량을 고정화하는 것이 바람직하고, 당해 성분의 고정화량은 소망하는 효과가 얻어진다면 특별히 한정되는 것은 아니다. 상기 담체는, 세포 배양시에 세포 배양용 기재 중의 배양액에 침지하여 사용된다. 상기 성분을 상기 담체에 고정화하는 경우, 그 담체를 배지에 넣었을 때, 그 성분을 배지 중에 용해시켜 사용하는 경우의 소망 농도와 같은 비율이 되도록, 기재에 넣은 배지량에 대하여 각 성분의 일정량을 고정화하는 것이 바람직하고, 당해 성분의 고정화량은 소망하는 효과가 얻어진다면 특별히 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 피브로넥틴의 프래그먼트의 고정화는, 국제 공개 제97/18318호 팜플렛, 및 국제 공개 제00/09168호 팜플렛에 기재된 방법에 의해 실시할 수 있다.
상기한 각종 성분이나, 본 발명의 유효성분을 고상에 고정화시켜 두면, 본 발명의 방법에 의해 세포 상해성 림프구를 얻은 후, 그 림프구와 고상을 분리시키는 것만으로 유효성분 등과 그 림프구를 용이하게 분리할 수 있어, 그 림프구에 대한 유효성분 등의 혼입을 방지할 수 있다.
또, 국제 공개 제02/14481호 팜플렛에 기재된, 항원 특이적인 세포 상해 활성을 갖는 세포 상해성 T 세포의 유도에 유효한 산성 다당, 산성 올리고당, 산성 단당 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물이나, 하기 (A)∼(D)에서 선택되는 물질을 상기 성분과 함께 사용해도 된다.
(A) CD44 에 결합 활성을 갖는 물질
(B) CD44 리간드가 CD44 에 결합함으로써 발해지는 시그널을 제어할 수 있는 물질
(C) 성장 인자의 성장 인자 리셉터에 대한 결합을 저해할 수 있는 물질
(D) 성장 인자가 성장 인자 리셉터에 결합함으로써 발해지는 시그널을 제어할 수 있는 물질
상기 CD44 에 결합 활성을 갖는 물질로는, 예를 들어 CD44 리간드 및/또는 항 CD44 항체가 예시된다. CD44 리간드가 CD44 에 결합함으로써 발해지는 시그널을 제어할 수 있는 물질로는, 예를 들어 각종 인산화 효소 및 탈인산화 효소의 저해제 또는 활성화제를 들 수 있다. 성장 인자의 성장 인자 리셉터에 대한 결합을 저해할 수 있는 물질로는, 예를 들어 성장 인자에 결합 활성을 갖고, 성장 인자와 복합체를 형성함으로써 성장 인자가 성장 인자 리셉터에 결합하는 것을 저해하는 물질, 또는 성장 인자 리셉터에 결합 활성을 갖고, 성장 인자가 성장 인자 리셉터에 결합하는 것을 저해하는 물질을 들 수 있다. 또, 성장 인자가 성장 인자 리셉터에 결합함으로써 발해지는 시그널을 제어할 수 있는 물질로는, 예를 들어 각종 인산화 효소 및 탈인산화 효소의 저해제 또는 활성화제를 들 수 있다. 이들 성분의 배지 중 농도는, 소망하는 효과가 얻어진다면 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한, 이들 성분은 배지 중에 용해하여 공존시키는 것 외에, 상기한 바와 같은 적절한 고상에 고정화하여 사용해도 된다.
또, 상기한 각종 물질은 단독으로 사용하거나, 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 유효성분의 존재하란, 세포 상해성 림프구의 유도, 유지 또는 확대 배양을 실시할 때에 상기 유효성분이 그 기능을 발휘할 수 있는 상태로 존재하는 것을 말하고, 그 존재 상태는 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 유효성분을 사용하는 배지에 용해시키는 경우, 배양하는 배지 중에 있어서의, 본 발명의 유효성분의 함유량은 소망하는 효과가 얻어진다면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 바람직하게는 0.0001∼10000㎍/mL, 보다 바람직하게는 0.001∼10000㎍/mL, 더욱 바람직하게는 0.005∼5000㎍/mL, 특히 바람직하게는 0.01∼1000㎍/mL 이다.
본 발명의 제조 방법에 의해 얻어진 세포 상해성 림프구에 관해서 IL-2R 의 발현량을 측정하면, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들의 혼합물의 비존재하에서 유도, 유지 및 확대 배양 중 적어도 어느 하나를 실시한 세포 상해성 림프구와 비교하여 유의한 IL-2R 발현량의 증가가 인정된다. 여기서, IL-2R 발현량은 공지된 방법, 예를 들어 항 IL-2R 항체를 사용하여 측정할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 세포 상해성 림프구는 IL-2R 의 발현량이 증가되어 있다. IL-2R 은 활성화 T 세포 표면에 발현되는 활성화 마커로, 이 분자의 발현에 동반하여 사이토카인 생성, 세포 상해 활성, 증식 활성 등이 활성화된다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 얻어지는 세포 상해성 림프구는 높은 기능을 갖는 세포군이다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 얻어지는 세포 상해성 림프구는, IL-2R 의 발현량이 증가되어 있기 때문에, 배지 중에 첨가된 IL-2, 또는 세포 상해성 림프구의 전구세포, 림프구 자체 또는 공존하는 기타 세포가 생성한 IL-2 에 의한 자극에 대한 감수성이 향상되어 있다. 이 때문에, IL-2 가 적은 환경하 (예를 들어 체내 등) 에서도 스스로 활성화할 수 있다.
또, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 세포 상해성 림프구에서는, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들의 혼합물의 비존재하에 유도, 유지 및 확대 배양 중 적어도 어느 하나를 실시한 것과 비교하여 CD8 마커를 갖는 (CD8 양성) 세포가 존재하는 비율이 높다. 이것은, 예를 들어, 1. CD8 양성 세포는 인터페론-γ 등의 사이토카인을 생성하여, 면역 부활을 야기하고, 헬퍼 T 세포 밸런스를 Th1 계로 한다, 2. CD8 양성 세포는 세포성 면역 담당 세포로, 바이러스나 종양 세포 등의 이물을 효율적으로 배제할 수 있다, 3. CD8 양성 세포를 얻는 경우에는, 종래에는 마그넷 비즈나 플로우 사이토미터(Flow cytometer)로 CD8 양성 세포를 정제했었지만, 본 발명의 방법에서는 배양하면서 CD8 양성 세포를 풍부하게 할 수 있고, 4. CD8 양성 세포비가 많기 때문에, CTL 을 유도할 때 전구세포로서 사용하기에 적합하다, 5. CD8 양성 세포비가 적은 세포 집단으로부터도, CD8 양성 세포 비율을 높이면서 배양할 수 있다는 등의 이점이 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 세포 상해성 림프구의 조제에 있어서 매우 유용하다.
또, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 세포 상해성 림프구에 있어서의 CD8 양성 세포의 비율은 특별히 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어 항 CD8 항체를 사용하여 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 조제된 세포 상해성 림프구는 배양 후의 세포를 장기간에 걸쳐 유지, 또는 이것을 증식시키더라도, 종래에 관찰된 높은 세포 상해 활성이 유지되어 있다고 하는 성질을 가지고 있다. 즉, 그 세포 상해성 림프구는, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들의 혼합물의 비존재하에 유도, 유지 및 확대 배양 중 적어도 어느 하나를 실시한 것과 비교하여, 세포 상해 활성이 높게 유지된다. 따라서, 배양된 세포 상해성 림프구를 클론화함으로써, 안정된 세포 상해 활성을 갖는 림프구로서 유지할 수도 있다. 또한, 유도된 세포 상해성 림프구에 항원, 각종 사이토카인, 항 CD3 항체 자극을 제공함으로써 증식시켜, 확대 배양할 수 있다. 이 세포 상해성 림프구의 유지, 확대 배양에는 특별히 한정된 것은 없고, 공지된 방법을 사용할 수 있다.
상기한 세포 상해성 림프구의 유지란, 세포 상해성 림프구를, 세포 상해 활성을 보유한 채로 유지하는 것을 말한다. 그 때의 배양 조건에 특별히 한정은 없고, 통상적인 세포 배양에 사용되는 조건을 적용할 수 있다. 예를 들어, 37℃, 5% CO2 등의 조건에서 배양할 수 있다. 또한, 적당한 시간 간격으로 배지를 신선한 것으로 교환할 수 있다. 사용되는 배지나, 동시에 사용되는 그 밖의 성분 등은 상기와 동일하다.
본 발명의 방법에 있어서의 세포 상해성 림프구의 유지 및 확대 배양은, 본 발명의 유효성분, 즉 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들의 혼합물의 존재하, 배지 중에 있어서의 혈청 및 혈장의 총함유 농도가 0용량% 이상 5용량% 미만인 배지 중에서 세포 상해성 림프구를 각각 계속 배양 및 확대 배양하는 것을 하나의 큰 특징으로 한다. 확대 배양에 의하면, 세포 상해성 림프구가 갖는 세포 상해 활성을 유지시킨 상태에서 그 세포수를 증가시킬 수 있다. 즉, 본 발명의 방법은, 일 양태로서 세포 상해성 림프구의 확대 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 의해 얻어지는 세포 상해성 림프구는 소망하는 표적세포를 인식하는 능력을 가지고 있고, 예를 들어 표적이 되는 세포를, 그 세포 상해 활성에 의해 파괴한다. 이 세포 상해성 림프구의 세포 상해 활성은 공지된 방법에 의해 평가할 수 있다. 예를 들어, 방사성 물질, 형광 물질 등으로 표지한 표적세포에 대한 세포 상해성 림프구의 세포 상해 활성을, 세포 상해성 림프구에 의해 파괴된 표적세포에 유래하는 방사 활성이나 형광 강도를 측정함으로써 평가할 수 있다. 또한, 세포 상해성 림프구나 표적세포로부터 특이적으로 유리되는 GM-CSF, IFN-γ 등의 사이토카인량을 측정함으로써 검출할 수도 있다. 기타 형광 색소 등에 의해 표지된 항원 펩티드-MHC 복합체를 사용하여 직접 확인할 수도 있다. 이 경우, 예를 들어 세포 상해성 림프구를 세포 상해성 림프구 특이성 항체와 커플링시킨 제 1 형광 마커와 접촉시킨 후에 제 2 형광 마커와 커플링시킨 항원 펩티드-MHC 복합체를 접촉시키고, 그리고 2중 표지 세포의 존재를 FACS (fluorescence-activated cell sorting) 분석함으로써 세포 상해성 림프구의 세포 상해 활성을 평가할 수 있다.
또, 본 발명의 세포 상해성 림프구의 제조 방법의 특징으로서, 저세포수로부터 배양을 시작하는 것이 가능하다. 양자 면역 요법을 실시하기 위해서는 대량의 림프구가 필요하지만, 환자로부터 대량의 림프구를 취득하기란 곤란하다. 또한, 통상적인 세포 상해성 림프구의 확대 배양에서는, 사용하는 세포수에 따른 적절한 배양 면적을 갖는 세포 배양용 기재의 선택이나, 적절한 배지량에서의 배양이 필요하게 된다. 즉, 통상은 세포 배양용 기재에 있어서의 배양 면적 [즉, 배지에 접촉하고 있는 기재 표면 부분의 면적 (㎠)] 에 대한 세포량 (개수) 은 1×106cells/㎠ 이상, 세포 농도는 1×106cells/mL 이상의 고밀도에서 배양이 시작되고, 이 이하의 세포량 조건에서는 확대 배양률 [확대 배양 전의 세포수에 대한 확대 배양 후의 세포수의 비 (확대 배양 후의 세포수/확대 배양 전의 세포수)] 이 매우 낮아져, 대량의 세포 상해성 림프구를 얻기까지 장기의 배양 기간을 필요로 한다. 따라서, 일반적으로는, 예를 들어 작은 세포 배양용 기재를 사용하여 배양을 시작한 후, 단계적으로 큰 스케일의 세포 배양용 기재를 사용하거나, 또는 세포 배양용 기재의 수를 늘려 희석 조작을 반복하는 등의 방법에 의해 대량의 림프구를 제조하는 것이 현실이었다. 이와 같이, 통상적인 세포 상해성 림프구의 확대 배양에서는, 복수의 배양계를 필요로 한다.
본 발명의 방법에 의해, 소량의 세포량으로부터 시작된 경우라도 세포 배양용 기재의 크기에 상관없이 높은 확대 배양률로 배양할 수 있다. 따라서, 종래와 같은 번거로운 세포 배양용 기재나 세포 배양액의 교환, 세포 배양액의 희석 조작이 필요없게 된다. 즉, 본 발명의 방법에 의하면, 1개의 세포 배양용 기재를 사용한 배양 조작에 의해, 바꾸어 말하면, 하나의 배양계에 의해 충분한 세포 상해성 림프구의 확대 배양을 실시할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해, 세포 배양액을 희석하는 공정을 필요로 하지 않는 세포 상해성 림프구의 제조 방법을 실현할 수 있다. 특히, 본 발명의 방법으로 LAK 세포를 확대 배양하는 경우, 대용량의 세포 배양용 기재에 LAK 세포로 될 수 있는 전구세포와 배지를 첨가하고, 그 이후에는 IL-2 를 첨가하는 것만으로 LAK 세포의 확대 배양을 실시하는 것이 가능하다. 간편한 조작으로 대량의 LAK 세포를 얻을 수 있다는 점에서, 본 발명은 매우 유용하다. 이 때, 사용하는 본 발명의 유효성분으로는, 보다 높은 확대 배양률을 얻는다는 관점에서, 바람직하게는 피브로넥틴 프래그먼트를 사용할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 방법에 의하면, 단시간에 필요량의 세포 상해성 림프구를 얻을 수 있다.
예를 들어, 세포 상해성 림프구의 유도, 유지 및 확대 배양 중 적어도 어느 하나를, 본 발명의 유효성분의 존재하, 배지를 포함하는 세포 배양용 기재 중에서 저세포수로부터 시작하는 경우, 배양 개시시에 있어서, 하기 (a) 및 (b) 에서 선택되는 조건을 만족하는 저농도 또는 저밀도의 세포량을 사용하여 실시할 수 있다.
(a) 사용하는 세포 배양용 기재에 있어서의 배양 면적에 대한 세포량의 비율이, 바람직하게는 1cell/㎠∼5×105cells/㎠, 보다 바람직하게는 10cells/㎠∼1×105cells/㎠, 특히 바람직하게는 1×102cells/㎠∼5×104cells/㎠ 이다.
(b) 배지 중의 세포 농도가, 바람직하게는 1cell/mL∼5×105cells/mL, 보다 바람직하게는 10cells/mL∼1×105cells/mL, 특히 바람직하게는 1×102cells/mL∼5×104cells/mL 이다.
또, 여기서 세포량이란, 세포 상해성 림프구 및/또는 전구세포의 개수를 말한다.
또한, 본 발명의 방법에 있어서는, 세포 배양액의 희석 조작 공정을 필요로 하지 않는, 세포 상해성 림프구의 유도, 유지 및 확대 배양 중 적어도 어느 하나를 하나의 배양계에서 실시하는 방법이 예시된다.
그리고 본 발명의 세포 상해성 림프구의 제조 방법의 특징으로서, 고세포수에서 배양을 실시하는 것도 가능해진다. 즉, 세포 상해성 림프구의 제조를 배지를 포함하는 세포 배양용 기재 중에서 실시하는 방법으로서, 배양 도중에, 적어도 1회의, 세포 배양액을 신선한 배지에 의해 희석하는 공정, 배지를 교환하는 공정, 또는 세포 배양용 기재를 교환하는 공정을 포함하는 경우, 이들 공정 직후의 배양 조건을 고농도 (예를 들어, 세포 배양액 중의 세포의 농도가 2×105cells/mL∼1×108cells/mL, 바람직하게는 2×105cells/mL∼5×107cells/mL, 더욱 바람직하게는 2×105cells/mL∼2×107cells/mL) 또는 고밀도 (예를 들어, 세포 배양액 중의 세포수와 세포 배양용 기재에 있어서의 배양 면적의 비율이 1×105cells/㎠∼1×108cells/㎠, 바람직하게는 1×105cells/㎠∼5×107cells/㎠, 더욱 바람직하게는 1×105cells/㎠∼2×107cells/㎠) 로 설정한 경우에 있어서도, 본 발명의 방법은 종래법과 비교하여 양호한 확대 배양률을 실현할 수 있다. 통상적인 세포 상해성 림프구의 확대 배양에 있어서는, 배양 개시시에는 세포수를 비교적 고농도 또는 고밀도로 설정하는 경우가 많지만, 세포의 증식률이 올라가면 세포 배양액 중의 세포 농도나 세포 배양용 기재 중의 세포 밀도가 낮게 설정된다. 본 발명의 고세포수에서의 배양이란, 이러한 배양 도중의 세포 농도나 세포 밀도의 설정시에 있어서 세포 배양액 중의 세포의 농도가, 2×105cells/mL∼1×108cells/mL, 또는 세포 배양액 중의 세포수와 세포 배양용 기재에 있어서의 배양 면적의 비율이 1×105cells/㎠∼1×108cells/㎠ 라는 고농도 또는 고밀도 조건으로 설정되는 세포 상해성 림프구의 제조를 말한다. 또, 여기서 말하는 세포 배양액을 신선한 배지에 의해 희석하는 공정 직후, 배지를 교환하는 공정 직후, 또는 세포 배양용 기재를 교환하는 공정 직후란, 배양 개시시를 포함하는 것은 아니다.
이러한 고세포수에서의 배양을 실시할 수 있는 이점으로는, 사용하는 배지, 혈청ㆍ혈장 등의 배지 첨가물, 세포 배양용 기재, 노동력 및 배양 스페이스의 삭감을 들 수 있다. 양자 면역 요법에서는 대량의 림프구를 필요로 하기 때문에 사용되는 배지나 세포 배양용 기재가 매우 많이 필요하게 되고, 거기에 따라서 대규모의 배양 스페이스나 많은 인원도 필요하게 된다. 이들은 양자 면역 요법이 보급되는 과정에 있어서 큰 과제가 되는 것이다. 따라서, 본 발명의 방법은 이러한 과제를 해결할 수 있다는 점에서 시설의 설치, 운영상, 매우 의의가 있는 발명이다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 방법은, 저농도 또는 저밀도에서의 세포 배양, 고농도 또는 고밀도에서의 세포 배양 중 어디에도 적용 가능한 방법이기 때문에, 본 발명의 방법을 사용함으로써, 배양 상황에 맞춰 다양한 세포 농도 또는 세포 밀도에 있어서의 세포 상해성 림프구의 제조가 가능해진다.
또한, 본 발명의 방법에 있어서는, 적절한 피더 세포와 공(共)배양할 수도 있다. 세포 상해성 림프구를 피더 세포와 공배양하는 경우에는, 세포 상해성 림프구 및 피더 세포 양자의 유지, 생육에 적합한 배지인 것이 바람직하다. 당해 배지로는, 시판되는 배지를 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 피더 세포는, 항 CD3 항체와 협동하여 세포 상해성 림프구를 자극하고, T 세포 리셉터를 활성화하는 것이면 특별히 한정되지는 않는다. 본 발명에는, 예를 들어, PBMC 나 엡스타인바 바이러스에 의해 형질 전환된 B 세포 (EBV-B 세포) 가 사용된다. 통상, 피더 세포는 방사선 조사와 같은 수단으로 증식능을 빼앗은 후에 사용된다. 또, 피더 세포의 배지 중에 있어서의 함유량은 공지된 방법에 따라서 결정하면 되고, 예를 들어, 1×105cells/mL∼1×107cells/mL 가 바람직하다.
특히 바람직한 양태에 있어서는, 피더 세포로서, 비바이러스 감염 세포, 예를 들어 EBV-B 세포 이외의 것이 사용된다. 이것에 의해, 확대 배양된 세포 상해성 림프구 중에 EBV-B 세포가 혼재할 가능성을 배제할 수 있어, 양자 면역 요법과 같은 세포 상해성 림프구를 이용한 의료의 안전성을 높이는 것이 가능해진다.
또한, 본 발명의 방법에 있어서는, 적절한 항원 제시 세포와 공배양할 수도 있다. 항원 제시 세포는, 항원 제시능을 갖는 세포에 항원 펩티드를 부가하고, 그 표면에 항원 펩티드를 제시시킴으로써 조제할 수 있다 [예를 들어, 벤드나렉 M. A. 외 (Bendnarek M. A., et al.), J. Immunol., 제147권, 제12호, 제4047∼4053페이지 (1991) 를 참조]. 또한, 항원 제시능을 갖는 세포가 항원을 처리 (process) 하는 능력을 갖고 있는 경우에는, 당해 세포에 항원을 부하함으로써 항원이 세포 내에 주입되어 프로세싱되어, 단편화된 항원 펩티드가 세포 표면에 제시된다. 또, 항원 펩티드를 항원 제시능을 갖는 세포에 부가하는 경우, 사용되는 항원 제시세포, 유도하고자 하는 세포 상해성 림프구의 MHC 구속성에 합치하는 항원 펩티드 또는 MHC 비구속성의 항원 펩티드가 사용된다.
또, 본 발명에 있어서 사용되는 항원은 특별히 한정되는 것이 아니라, 예를 들어, 세균, 바이러스 등의 외래성 항원이나 종양 관련 항원 (암 항원) 등의 내존성 항원 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서는, 항원 제시 세포는 비증식성으로 하는 것이 바람직하다. 세포를 비증식성으로 하기 위해서는, 예를 들어 X 선 등의 방사선 조사 또는 마이토마이신 (mitomycin) 등의 약제에 의해 처리하면 된다.
본 발명의 제조 방법에 의해 LAK 세포를 제조하는 경우, 상기 유효성분의 존재하, IL-2 와 함께 LAK 세포로 될 수 있는 전구세포를 인큐베이트함으로써 실시된다. LAK 세포로 될 수 있는 전구세포로는 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들어 말초혈 단핵구 (PBMC), NK 세포, 제대혈 단핵구, 조혈 줄기세포, 이들 세포를 함유하는 혈액 성분 등을 들 수 있다.
또한, LAK 세포를 배양하기 위한 일반적인 조건은, 상기 배지를 사용하는 점을 제외하고는, 공지된 조건 [예를 들어, 세포 공학, Vol.14, No.2, p223∼227, (1995년): 세포 배양, 17, (6), p192∼195, (1991년); THE LANCET, Vol.356, p802∼807, (2000); Current Protocols in Immunology, supplement 17, UNIT 7.7 을 참조] 에 따르면 된다. 배양 조건은 특별히 한정되지 않고, 통상적인 세포 배양에 사용되는 조건을 사용할 수 있고, 예를 들어, 37℃, 5% CO2 등의 조건하에서 배양할 수 있다. 이 배양은 통상 2∼15일 정도 실시된다. 또한, 적당한 시간 간격으로 세포 배양액을 희석하는 공정, 배지를 교환하는 공정 또는 세포 배양용 기재를 교환하는 공정을 실시해도 된다.
상기한 LAK 세포의 유도, 유지, 확대 배양과 마찬가지로, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들의 혼합물의 존재하에 배양함으로써, CTL, TIL 에 관해서도 높은 세포 상해 활성을 갖는 세포군을 조제할 수 있다. 본 발명에 있어서는, 이들 세포의 활성화 조작에 있어서 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들의 혼합물을 공존시키고, 또한 배지 중에 있어서의 혈청 및 혈장의 총함유 농도가 0용량% 이상 5용량% 미만인 배지를 사용하는 것 외에는 특별한 한정은 없고, 상기 세포의 배양, 활성화에 적합한 배지를 사용하여 실시할 수 있다. 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들의 혼합물의 사용량, 첨가 방법 등에 관해서는 상기 방법에 준하여 적절한 것을 선택하면 된다.
또, 본 발명의 세포 상해성 림프구의 확대 배양 방법에 관해서는, 상기 유효성분이 당해 방법에 사용되는 배양계에 존재하고 있고, 또 배지 중의 혈청 및 혈장의 총함유 농도가 0용량% 이상 5용량% 미만이면 특별히 한정되지 않고, 상기 이외의 종래의 세포 상해성 림프구의 확대 배양 방법에 있어서, 그 배양계에 상기 유효성분을 존재시키고, 또한 배지 중의 혈청 및 혈장의 총함유 농도가 0용량% 이상 5용량% 미만이면 본 발명에 포함된다.
본 발명의 방법에 의해 제조되는 세포 상해성 림프구가 투여되는 질환으로는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 암, 악성 종양, 간염이나, 인플루엔자 등의 바이러스, 세균, 곰팡이가 원인이 되는 감염성 질환을 예시할 수 있다. 또한, 후술하는 바와 같이 추가로 외래 유전자를 도입한 경우에는, 각종 유전자 질환에 대해서도 효과를 기대할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 세포 상해성 림프구는 골수 이식이나 방사선 조사 후의 감염증 예방을 목적으로 한 도너 림프구 수주 등에도 이용할 수 있다.
본 발명의 별도 양태로서, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들의 혼합물을 유효성분으로서 함유하고, 또한 배지 중에 있어서의 혈청 및 혈장의 총함유 농도가 0용량% 이상 5용량% 미만인 세포 상해성 림프구 배양용 배지가 제공된다. 당해 배지는, 추가로 그 밖의 임의의 성분, 예를 들어 공지되어 있는 세포 배양에 사용되는 배지 성분, 단백질, 사이토카인류 (바람직하게는 IL-2), 기타 원하는 성분으로 이루어진다. 또, 당해 배지는, 본 발명의 유효성분, 및 배지 중의 총함유 농도가 0용량% 이상 5용량% 미만이 되도록 자기 또는 비자기의 혈청이나 혈장을 사용하고, 공지된 방법에 준하여 제조할 수 있다. 당해 배지 중의 본 발명의 유효성분 등의 함유량은, 본 발명의 소망하는 효과가 얻어지면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 본 발명의 방법에 사용되는 상기 배지 중의 유효성분 등의 함유량에 준하여, 원하는 만큼 적절히 결정할 수 있다. 본 발명의 배지의 일 양태로는, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들의 혼합물이 고정화된 세포 배양용 담체를 함유하는 배지, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들의 혼합물이 고정화된 세포 배양용 기재에 봉입되어 제공되는 배지가 포함된다.
상기한 세포 상해성 림프구의 제조 방법을 사용하여 얻어진 림프구 함유 배양물 중에는, 통상, 헬퍼 T 세포 등의 세포 상해성 림프구 이외의 세포도 혼재되어 있다. 그러나, 본 발명에 의해 얻어진 림프구 함유 배양물 중에는 세포 상해 활성을 유지하는 림프구가 많이 함유되어 있기 때문에, 그 배양물로부터 원심분리 등에 의해 그 배양물 중의 세포를 회수하여, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 세포 상해성 림프구로서 그대로 사용할 수 있다. 또한, 상기 유효성분 등을 세포 배양용 기재 등에 고정화시켜 두면, 얻어진 세포 상해성 림프구에 있어서 그 성분 등이 혼입될 우려가 없다.
또한, 그 위에 그 배양물로부터 공지된 방법에 의해 세포 상해성 림프구를 고함유하는 세포 집단 (또는 배양물) 을 분리하여, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 세포 상해성 림프구로서 사용할 수도 있다. 즉, 본 발명의 세포 상해성 림프구의 제조 방법은, 당해 방법에 의해 얻어진 배양물로부터 세포 상해성 림프구를 고함유하는 세포 집단을 선택하는 공정을 포함할 수 있다.
세포 상해성 림프구를 고함유하는 그 세포 집단의 선택 방법에 관해서는 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들어 배양물로부터 소망하는 세포 표면 상에 발현되어 있는 세포 표면 항원에 대한 항체, 예를 들어 항 CD8 항체를 결합시킨 세포 배양용 기재 또는 담체를 사용하여 원하는 세포만을 선택적으로 회수하는 방법이나, 플로우 사이토미터를 사용하는 방법을 들 수 있다. 상기 담체로는 자기 비즈나 칼럼이 예시된다. 또한, 배양물로부터 원하는 세포 이외의 세포를 흡착 제거함으로써, 원하는 세포를 고함유하는 세포 집단을 얻을 수도 있다. 예를 들어, 헬퍼 T 세포 표면 상에 발현되어 있는 세포 표면 항원에 대한 항체, 예를 들어 항 CD4 항체를 사용하여, 당해 림프구 배양물로부터 헬퍼 T 세포를 제거할 수 있다. 이 공정에는 플로우 사이토미터를 사용할 수도 있다.
그리고 본 발명은, 상기한 본 발명의 세포 상해성 림프구의 제조 방법에 의해 얻은, 세포 상해성 림프구를 제공한다. 당해 림프구는 높은 세포 상해 활성을 가지고 있고, 장기간에 걸친 계속 배양이나 확대 배양을 실시하더라도 세포 상해 활성의 저하가 적다는 성질을 갖는다. 또한, 본 발명은, 당해 림프구를 유효성분으로서 함유하는 의약 (치료제) 을 제공한다. 특히, 당해 림프구를 함유하는 상기 치료제는 양자 면역 요법에의 사용에 적합하다. 양자 면역 요법에 있어서는, 환자의 치료에 적합한 세포 상해 활성을 갖는 림프구가, 예를 들어 정맥에 대한 투여에 의해 환자에게 투여된다. 당해 치료제는 전술한 질환이나 도너 림프구 수주에서의 사용에 있어서 매우 유용하다. 당해 치료제는 제약 분야에서 공지된 방법에 따라서, 예를 들어 본 발명의 방법에 의해 조제된 당해 림프구를 유효성분으로 하고, 예를 들어 공지된 비경구 투여에 적합한 유기 또는 무기의 담체, 부형제, 안정제 등과 혼합함으로써 조제할 수 있다. 또, 치료제에 있어서의 본 발명의 림프구의 함유량, 치료제의 투여량, 당해 치료제에 관한 여러 조건은 공지된 양자 면역 요법에 따라서 적절히 결정할 수 있다.
본 발명의 세포 상해성 림프구의 제조 방법에 있어서는, 당해 림프구에 외래 유전자를 도입하는 공정을 추가로 포함할 수 있다. 즉, 본 발명은, 그 일 양태로서, 세포 상해성 림프구에 외래 유전자를 도입하는 공정을 추가로 포함하는 세포 상해성 림프구의 제조 방법을 제공한다. 또, 「외래」란, 유전자 도입 대상의 림프구에 대하여 외래인 것을 의미한다.
본 발명의 세포 상해성 림프구의 제조 방법, 특히 세포 상해성 림프구의 확대 배양 방법을 실시함으로써, 배양되는 림프구의 증식능이 증강된다. 따라서, 본 발명의 세포 상해성 림프구의 제조 방법을 유전자의 도입 공정과 조합함으로써, 유전자 도입 효율의 상승을 기대할 수 있다.
외래 유전자의 도입 수단에는 특별히 한정은 없고, 공지된 유전자 도입 방법에 의해 적절한 것을 선택하여 사용할 수 있다. 유전자 도입의 공정은, 세포 상해성 림프구의 제조시, 임의의 시점에서 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 림프구의 유도, 유지 및/또는 확대 배양 중 어느 하나의 공정과 동시에, 또는 그 공정의 나중에 실시하는 것이 작업 효율의 관점에서 바람직하다.
상기한 유전자 도입 방법으로는, 바이러스 벡터를 사용하는 방법, 그 벡터를 사용하지 않는 방법, 모두를 본 발명에 사용할 수 있다. 이들 방법의 상세한 내용에 관해서는 이미 많은 문헌에 공표되어 있다.
상기 바이러스 벡터에는 특별히 한정은 없고, 통상, 유전자 도입 방법에 사용되는 공지된 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터, 시미안 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 또는 센다이 바이러스 벡터 등이 사용된다. 특히 바람직하게는, 바이러스 벡터로서, 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 수반 바이러스 또는 시미안 바이러스가 사용된다. 상기 바이러스 벡터로는, 감염된 세포 중에서 자기 복제할 수 없도록 복제능을 결손시킨 것이 바람직하다.
레트로 바이러스 벡터는, 당해 벡터가 도입되는 세포의 염색체 DNA 중에 그 벡터에 삽입되어 있는 외래 유전자를 안정적으로 삽입시킬 수 있어, 유전자 치료 등의 목적으로 사용되고 있다. 당해 벡터는 분열, 증식 중인 세포에 대한 감염 효율이 높다는 점에서, 본 발명에 있어서의, 세포 상해성 림프구의 제조 공정, 예를 들어 확대 배양 공정에서 유전자 도입을 실시하는 데에 있어서 적합하다.
바이러스 벡터를 사용하지 않는 유전자 도입 방법으로는, 본 발명을 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어, 리포솜, 리간드-폴리리신 등의 담체를 사용하는 방법이나 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법, 파티클건법 등을 사용할 수 있다. 이 경우에는 플라스미드 DNA 나 직쇄상 DNA 에 삽입된 외래 유전자가 도입된다.
본 발명에 있어서 세포 상해성 림프구에 도입되는 외래 유전자에는 특별히 한정은 없고, 상기 세포에 도입하는 것이 기대되는 임의의 유전자를 선택할 수 있다. 이러한 유전자로는, 예를 들어 단백질 (예를 들어, 효소, 사이토카인류, 리셉터류 등) 을 코딩하는 것 외에, 안티센스 핵산이나 siRNA (small interfering RNA), 리보자임을 코딩하는 것을 사용할 수 있다. 또한, 유전자 도입된 세포의 선택을 가능하게 하는 적당한 마커 유전자를 동시에 도입해도 된다.
상기한 외래 유전자는, 예를 들어, 적당한 프로모터의 제어하에 발현되도록 벡터나 플라스미드 등에 삽입하여 사용할 수 있다. 또한, 고효율의 유전자 전사를 달성하기 위해, 프로모터나 전사 개시 부위와 협동하는 다른 조절 요소, 예를 들어, 인핸서 서열이나 터미네이터 서열이 벡터 내에 존재하고 있어도 된다. 또, 외래 유전자를 상동 재조합에 의해 도입 대상인 림프구의 염색체로 삽입하는 것을 목적으로 하여, 예를 들어 그 염색체에 있어서 그 유전자의 원하는 표적 삽입 부위의 양측에 있는 염기 서열에 각각 상동성을 갖는 염기 서열로 이루어지는 플랭킹 서열 (flanking sequence) 사이에 외래 유전자를 배치시켜도 된다. 도입되는 외래 유전자는 천연 유전자일 수도 있고, 또는 인공적으로 제작된 것일 수도 있으며, 또는 기원을 달리하는 DNA 분자가 라이게이션 (ligation) 등의 공지된 수단에 의해 결합된 것이어도 된다. 또, 그 목적에 따라서 천연 서열에 변이가 도입된 서열을 갖는 것이어도 된다.
본 발명의 방법에 의하면, 예를 들어, 암 등의 환자의 치료에 사용되는 약제에 대한 내성에 관련된 효소를 코딩하는 유전자를 세포 상해성 림프구에 도입하여 그 림프구에 약제 내성을 부여할 수 있다. 그와 같은 세포 상해성 림프구를 사용하면 양자 면역 요법과 약제 요법을 조합할 수 있고, 따라서 보다 높은 치료 효과를 얻는 것이 가능해진다. 약제 내성 유전자로는, 예를 들어, 다제 내성 유전자 (multidrug resistance gene) 가 예시된다.
한편, 상기 양태와는 거꾸로, 특정한 약제에 대한 감수성을 부여하는 유전자를 세포 상해성 림프구에 도입하여, 그 약제에 대한 감수성을 부여할 수도 있다. 이러한 경우, 생체에 이식한 후의 림프구를 당해 약제의 투여에 의해 제거하는 것이 가능해진다. 약제에 대한 감수성을 부여하는 유전자로는, 예를 들어 티미딘 키나아제 유전자 (thymidine kinase gene) 가 예시된다.
(3) CH-296Na 에 관해서
본 발명에 있어서는, 서열표의 서열번호 25 에 기재된 아미노산 서열 (x) (CH-296Na), 또는 아미노산 서열 (x) 에 있어서 1 또는 복수개의 아미노산이 결실, 삽입, 부가 또는 치환된 아미노산 서열 (y) 를 갖는 폴리펩티드로서, 아미노산 서열 (y) 를 갖는 폴리펩티드가 아미노산 서열 (x) 를 갖는 폴리펩티드와 동등한 기능을 갖는 것인, 신규 폴리펩티드 및 이것을 코딩하는 핵산도 제공된다. 당해 핵산으로서는, (1) 서열번호 26 에 기재된 염기 서열로 이루어지는 DNA (CH-296Na 를 코딩하는 핵산), (2) 서열번호 26 에 기재된 염기 서열에 있어서 1 또는 복수개의 염기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 또한 DNA (1) 로 코딩되는 폴리펩티드와 동등한 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA, 또는 (3) 서열번호 26 에 기재된 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 DNA (1) 로 코딩되는 폴리펩티드와 동등한 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 로 이루어지는 핵산이 예시된다.
또, 본 명세서에 있어서, 상기 신규 폴리펩티드를 본 발명의 폴리펩티드로 부르고, 이것을 코딩하는 핵산을 본 발명의 핵산이라고 부르는 경우가 있다.
이하, 본 발명의 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 그 폴리펩티드의 제조 방법에 관해서 설명한다.
본 발명의 폴리펩티드는, 전술한 바와 같은 세포 상해성 림프구의 제조에 있어서 소망하는 기능 [상기 (i)∼(iv) 의 기능] 중 어느 하나를 갖는 것이면, 상기 아미노산 서열에 있어서 1 내지 복수개의 치환, 결실, 삽입 또는 부가 중 하나 이상이 발생한 서열을 갖는 것도 본 발명의 폴리펩티드에 포함된다. CH-296Na 이외의 본 발명의 폴리펩티드로는, 바람직하게는 서열표의 서열번호 25 에 기재된 아미노산 서열에 1∼20개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가 중 어느 하나이상이 생긴 것, 보다 바람직하게는 1∼10개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가 중 어느 하나 이상이 생긴 것, 더욱 바람직하게는 1∼5개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가 중 어느 하나 이상이 생긴 것이 예시된다. 또, 아미노산의 치환 등은, 원래의 폴리펩티드 기능이 유지될 수 있는 범위 내에서 그 폴리펩티드의 물리화학적 성상 등을 변화시킬 수 있는 정도의 것이어도 된다. 그 상세한 내용과 그 폴리펩티드의 제작법은 상기한 바와 같다.
본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 서열표의 서열번호 26 으로 나타내는 핵산은 혈장 유래의 인간 피브로넥틴을 코딩하는 cDNA 를 주형으로 PCR 반응을 실시하여, CH-296Na 를 코딩하는 DNA 단편으로서 취득할 수 있다. 이 때에 사용되는 프라이머로는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 서열표의 서열번호 27, 28 에 기재되는 Primer CH-296Na1, Primer CH-296Na2 를 사용할 수 있다. 또한, 당해 핵산으로는, 전술한 FERM BP-2800 (CH-296 을 코딩하는 플라스미드를 보유하는 대장균) 의 플라스미드와, 네이티브의 혈장 유래 피브로넥틴의 세포 결합 도메인과 헤파린 결합 도메인 사이에 존재하는 서열 (도 1 에 있어서의 III 형 반복 서열의 11) 을 갖는 DNA 단편을 적당한 제한효소 사이트를 사용하여 결합함으로써 취득할 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산으로는, 서열표의 서열번호 26 으로 나타내는 핵산의 염기 서열에 있어서, 1 내지 복수개의 치환, 결실, 삽입 또는 부가 중 어느 하나 이상이 생긴 것도 포함된다. 예를 들어 서열표의 서열번호 26 에 기재된 염기 서열로부터 1∼60염기의 치환, 결실, 삽입 또는 부가 중 어느 하나 이상이 생긴 것, 보다 바람직하게는 1∼30염기의 치환, 결실, 삽입 또는 부가 중 어느 하나 이상이 생긴 것, 더욱 바람직하게는 1∼15염기의 치환, 결실, 삽입 또는 부가 중 어느 하나 이상이 생긴 것이 예시된다. 또, 염기의 치환 등은, 핵산으로 코딩되는 폴리펩티드의 기능이 유지될 수 있는 범위 내에서 그 폴리펩티드의 물리화학적 성상 등을 변화시킬 수 있는 정도의 것이어도 된다. 그 상세한 내용, 염기의 치환 등의 방법에 관해서는 전술한 아미노산의 치환 등에 관련된 기재에 준한다.
그리고 서열번호 26 에 기재된 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하여 본 발명의 폴리펩티드와 동등한 기능, 즉 전술한 세포 상해성 림프구의 제조에 있어서의 상기 (i)∼(iv) 중 적어도 어느 하나의 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산도 본 발명의 핵산에 포함된다. 상기 「엄격한 조건」이란 특별히 한정되지 않고, 서열번호 26 에 기재된 염기 서열로 이루어지는 DNA 에 하이브리다이즈시키는 DNA 에 따라서 하이브리다이제이션시의, 바람직하게는 추가로 세정시의 온도 및 염의 농도를 적절히 결정함으로써 설정할 수 있지만, 엄격한 조건으로는, 예를 들어, 몰레큘러 클로닝 어 래보러토리 매뉴얼 제3판 [샘브룩 (sambrook) 외, Molecular cloning, A laboratory manual 3rd edition, 2001년, 콜드 스프링 하버 래보러토리 프레스 (Cold Spring Harbor Laboratory Press) 사 발행] 등의 문헌에 기재된 조건을 들 수 있다.
구체적으로는, 예를 들어, 6×SSC (1×SSC 는, 0.15M NaCl, 0.015M 시트르산나트륨, pH7.0) 와 0.5% SDS 와 5×덴하르트 [Denhardt's, 0.1% 소혈청 알부민 (BSA), 0.1% 폴리비닐피롤리돈, 0.1% 피콜400] 와 100㎍/mL 연어 정자 DNA 를 함유하는 용액 중, 50℃, 바람직하게는 65℃ 에서 보온하는 조건이 예시된다. 상기 온도는 사용하는 DNA 의 Tm 치가 기지(旣知)인 경우에는, 그 값보다 5∼12℃ 낮은 온도로 해도 된다. 그리고, 비특이적으로 하이브리다이즈한 DNA 를 세정에 의해 제거하는 단계, 여기서, 보다 정밀도를 높이는 관점에서 보다 저이온 강도, 예를 들어 2×SSC, 보다 엄격하게는 0.1×SSC 등의 조건 및/또는 보다 고온, 예를 들어, 사용되는 핵산의 Tm 치에 따라 다르지만, 25℃ 이상, 보다 엄격하게는 37℃ 이상, 더욱 엄격하게는 42℃ 이상, 보다 더 엄격하게는 50℃ 이상 등의 조건하에서 세정을 실시한다는 조건 등을 추가해도 된다.
보다 낮은 단계의 엄격한 하이브리다이제이션 조건으로 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 하이브리다이즈하는 핵산분자도 또한 본 발명에 포함된다. 하이브리다이제이션의 엄격함 및 시그널 검출의 변화는, 주로 포름아미드 농도 (보다 낮은 백분율의 포름아미드가 저하된 스트린젠시를 만든다), 염 농도, 또는 온도의 조작에 의해 실시된다. 예를 들어, 보다 낮은 단계의 엄격한 조건은, 6×SSPE (20×SSPE=3M NaCl; 0.2M NaH2 PO4; 0.02M EDTA, pH7.4), 0.5% SDS, 30% 포름아미드, 100㎍/mL 연어 정자 블로킹 DNA 를 함유하는 용액 중에서 37℃ 에서의 하룻밤 인큐베이션; 이어서 1×SSPE, 0.1% SDS 를 사용한 50℃ 에서의 세정을 포함한다. 그리고, 보다 낮은 단계의 엄격함을 달성하기 위해, 엄격한 하이브리다이제이션 후에 실시되는 세정은, 보다 높은 염 농도 (예를 들어, 5×SSC) 에서 실시할 수 있다.
상기한 조건은, 하이브리다이제이션 실험에 있어서 백그라운드를 억제하기 위해 사용되는 대체적인 블로킹 시약을 첨가 및/또는 치환함으로써 개변할 수 있다. 대표적인 블로킹 시약으로는, 덴하르트 시약, BLOTTO, 헤파린, 변성 연어 정자 DNA, 및 시판되는 제품 처방물을 들 수 있다. 또한, 이 개변에 따라서는, 상기한 하이브리다이제이션 조건의 다른 요소의 개변이 필요한 경우도 있다.
한편, 이렇게 해서 얻어진 핵산을 사용하여, 서열표의 서열번호 25 로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 유전자 공학적으로 취득할 수 있다. 즉, 당해 핵산을 적절한 발현용 벡터, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 pET 벡터나 pCold 벡터 등에 삽입하고, 공지된 방법에 의해 당해 폴리펩티드를, 예를 들어 대장균 등에서 발현시킴으로써 취득할 수 있다.
본 발명에 의해, 안전성이 높고, 환자에 대한 부담이 경감된 세포 상해성 림프구의 제조 방법이 제공된다.
도 1 은 피브로넥틴의 도메인 구조를 나타내는 모식도이다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 전혀 이들 기재에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1 피브로넥틴 프래그먼트의 조제
(1) 피브로넥틴 프래그먼트의 조제
인간 피브로넥틴 유래의 프래그먼트 H-271 은, Escherichia coli HB101/pHD101 (FERM BP-2264) 로부터, 미국 특허 제5,198,423호 명세서에 기재된 방법에 의해 조제하였다.
또한, 인간 피브로넥틴 유래의 프래그먼트 H-296, CH-271, CH-296 은 각각, Escherichia coli HB101/pHD102 (FERM BP-7420), Escherichia coli HB101/pCH101 (FERM BP-2799), Escherichia coli HB101/pCH102 (FERM BP-2800) 를 사용하여 이것을 상기한 명세서에 기재된 방법으로 배양하고, 그 배양물로부터 조제하였다.
인간 피브로넥틴 유래의 프래그먼트 C-274 는, Escherichia coli JM109/pTF7221 (FERM BP-l915) 을 사용하여 이것을 미국 특허 제5,102,988호 명세서에 기재된 방법으로 배양하고, 그 배양물로부터 조제하였다.
인간 피브로넥틴 유래의 프래그먼트 C-CS1 은, Escherichia coli HB101/pCS25 (FERM BP-5723) 를 사용하여 일본 특허 3104178호 명세서에 기재된 방법으로 배양하고, 그 배양물로부터 조제하였다.
인간 피브로넥틴 유래의 프래그먼트 CHV-89, CHV-179 는, 각각 Escherichia coli HB10l/pCHV89 (FERM P-12182), Escherichia coli HB101/pCHV179 (FERM P-12183) 를 사용하여 일본 특허 2729712호 명세서에 기재된 방법으로 배양하고, 그 배양물로부터 조제하였다.
또한, 인간 피브로넥틴 유래의 프래그먼트 CHV-90 은 일본 특허 2729712호 명세서에 기재된 방법으로 조제하였다. 즉, 당해 명세서에 기재된 조작에 의해서 플라스미드 pCHV90 을 구축한 다음, 그 플라스미드를 보유하는 형질 전환체를 배양하고, 그 배양물로부터 CHV-90 을 조제하였다.
인간 피브로넥틴 유래의 프래그먼트 CHV-181 은, 국제 공개 제97/18318호 팜플렛에 기재된 방법으로 CHV-181 을 코딩하는 DNA 를 함유하는 플라스미드 (pCHV181) 를 구축한 후, 그 플라스미드가 도입된 대장균 (Escherichia coli HB101/pCHV181) 을 배양하고, 그 배양물로부터 상기한 CHV-179 와 동일한 방법으로 조제하였다.
(2) CHV-92 의 조제
상기한 폴리펩티드 CHV-181 을 발현시키기 위한 플라스미드 pCHV181 에 관해서, CHV-181 을 코딩하는 영역 중의 III-13 영역을 코딩하는 영역이 결실된 플라스미드 CHV92 를 구축하였다. 결실 조작은 일본 특허 2729712호 명세서에 기재된, 플라스미드 pCHV179 로부터의 III-14 코드 영역의 결실 조작에 준하여 실시하였다.
상기한 플라스미드 pCHV92 에 의해 형질 전환된 대장균 HB101 (Escherichia coli HB101/pCHV92) 을 배양하고, 그 배양물로부터 일본 특허 제2729712호 명세서에 기재된 CHV-89 폴리펩티드의 정제 방법에 준하여 정제 조작하여, 정제 CHV-92 표품을 얻었다.
(3) H-275-Cys 의 조제
폴리펩티드 H-275-Cys 를 발현시키기 위한 플라스미드는 이하에 나타내는 조작에 따라서 구축하였다. Escherichia coli HB101/pCHl02 (FERM BP-2800) 로부터 플라스미드 pCH102 를 조제하였다. 이 플라스미드를 주형으로 하여, 서열표의 서열번호 21 에 염기 서열을 나타내는 프라이머 12S 와 서열표의 서열번호 22 에 염기 서열을 나타내는 프라이머 14A 를 사용한 PCR 을 실시하여, 피브로넥틴의 헤파린 결합 도메인을 코딩하는 약 0.8kb 의 DNA 단편을 얻었다. 얻어진 DNA 단편을 NcoI, BamHI (모두 다카라바이오사 제조) 로 소화한 후, NcoI, BamHI 로 소화한 pTV118N (다카라바이오사 제조) 과 라이게이션 함으로써, 플라스미드 pRH1 을 구축하였다.
플라스미드 벡터 pINIII-ompA1 [그라이예브 J. 외 (Ghrayeb J., et al.), EMBO J., 제3권, 제10호, 제2437∼2442페이지 (1984)] 을 BamHI 과 HincII (다카라바이오사 제조) 로 소화하고, 리포프로테인 터미네이터 영역을 포함하는 약 0.9kb 의 DNA 단편을 회수하였다. 이것을 BamHI 과 HincII 로 소화한 상기한 플라스미드 pRH1 과 혼합하여 라이게이션하여, lac 프로모터, 헤파린 결합 도메인을 코딩하는 DNA 단편 및 리포프로테인 테미네이터를 이 순서대로 함유하는 플라스미드 pRHl-T 를 얻었다.
이 플라스미드 pRHl-T 를 주형으로 하여, 서열표의 서열번호 23 에 염기 서열을 나타내는 프라이머 Cys-A 와 서열표의 서열번호 24 에 염기 서열을 나타내는 프라이머 Cys-S 를 사용한 PCR 반응 후, 회수한 증폭 DNA 단편을 NotI (다카라바이오사 제조) 로 소화하고, 다시 그 DNA 단편을 셀프 라이게이션시켰다. 이렇게 해서 얻어진 환형 DNA 를 SpeI 과 ScaI (다카라바이오사 제조) 로 소화하여 얻어지는 2.3kb 의 DNA 단편과, 플라스미드 pRH1-T 를 SpeI 과 ScaI (다카라바이오사 제조) 로 소화하여 얻어지는 2.5kb 의 DNA 단편을 혼합하여 라이게이션하여, 플라스미드 pRH-Cys 를 얻었다. 그 플라스미드에는, 상기한 H-271 의 N 말단측에 Met-Ala-Ala-Ser 의 4 아미노산이 부가되고, 또 C 말단에 Cys 가 부가된 폴리펩티드 H-275-Cys 가 코딩되어 있다.
폴리펩티드 H-275-Cys 는 이하의 방법에 의해 조제하였다. 상기한 플라스미드 pRH-Cys 에 의해 형질 전환된 대장균 HB101 (Escherichia coli HB101/pRH-Cys) 을 120mL 의 LB 배지 중, 37℃ 에서 하룻밤 배양하였다. 배양액으로부터 회수한 균체를 40mL 의 파쇄용 완충액 (50mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 150mM NaCl, 1mM DTT, 1mM PMSF, pH7.5) 에 현탁하고, 초음파 처리하여 균체를 파쇄하였다. 원심분리하여 얻어진 상청을 정제용 완충액 (50mM Tris-HCl, pH7.5) 으로 평형화된 하이트랩-헤파린 칼럼 (파르마시아사 제조) 에 넣었다. 동 완충액으로 칼럼 내의 비흡착 획분을 세정한 후, 0∼1M NaCl 농도 구배를 갖는 정제용 완충액으로 용출시켰다. 용출액을 SDS-폴리아크릴 아미드겔 전기 영동으로 분석하여, H-275-Cys 의 분자량에 상당하는 획분을 모아 정제 H-275-Cys 표품을 얻었다.
실시예 1 저혈청 배지를 사용한 LAK 세포 (Lymphokine-activated killer cells) 배양계에서의 확대 배양률의 측정
(1) PBMC 의 분리 및 보존
인폼드 콘센트(informed-consent)를 얻은 건강한 정상인 인간 도너로부터 성분 채혈을 실시 후, 채혈액을 PBS(-) 로 2배 희석하고, Ficoll-paque (파르마시아사 제조) 상에 중층(重層)하여 500×g 으로 20분간 원심분리하였다. 중간층의 말초혈 단핵세포 (PBMC) 를 피펫으로 회수, 세정하였다. 채취한 PBMC 는 90% FBS, (Bio Whittaker 사 제조)/10% DMSO (SIGMA 사 제조) 로 이루어지는 보존액에 현탁하여, 액체 질소 중에서 보존하였다. LAK 유도시에는 이들 보존 PBMC 를 37℃ 수욕(水浴) 중에서 급속 융해하여, 10㎍/mL DNase (Calbiochem 사 제조) 를 함유하는 RPMI1640 배지 (Bio Whittaker 사 제조) 로 세정 후, 트리판 블루 (trypan blue) 염색법으로 생(生)세포수를 산출하여 각 실험에 사용하였다.
(2) 항 인간 CD3 항체 및 FN 프래그먼트 고정화
이하의 실험에서 사용하는 배양 기재에 항 인간 CD3 항체 및 FN 프래그먼트를 고정화하였다. 즉 24 웰 세포 배양 플레이트 또는 12.5㎠ 세포 배양 플라스크 (Falcon 사 제조) 에 항 인간 CD3 항체 (얀센협화사 제조) (최종농도 5㎍/mL) 를 함유하는 PBS 를 1mL (24 웰 플레이트의 경우) 또는 2mL (12.5㎠ 플라스크의 경우) 씩 첨가하였다. 이 때, FN 프래그먼트 첨가군에는 제조예 1 에 기재된 각피브로넥틴 프래그먼트 (FNfr) 를 최종농도 10㎍/mL (24 웰 플레이트의 경우) 또는 25㎍/mL (12.5㎠ 플라스크의 경우) 가 되도록 첨가하였다. 대조로서, FNfr 을 첨가하지 않은 군도 설정하였다.
이들 배양 기재를 실온에서 5시간 인큐베이트 후, 사용시까지 4℃ 에서 보존하였다. 사용 직전에는 이들 배양 기재로부터 항체ㆍFNfr 을 함유하는 PBS 를 흡인 제거 후, 각 웰을 PBS 로 2회, XVIVO20 배지 (Bio whittaker 사 제조) 로 1회 세정하여 각 실험에 사용하였다.
(3) LAK 세포의 유도 및 배양
1% human AB 혈청을 함유하는 XVIVO20 (이하 1% XVIVO20 으로 약기한다) 에 1×106cells/mL 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 현탁 후, 실시예 1-(2) 에서 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 플레이트, 또는 항 인간 CD3 항체 및 FNfr 고정화 플레이트에 1mL/웰씩 뿌리고, 최종농도 1000U/mL 가 되도록 IL-2 (시오노기제약사 제조) 를 첨가하였다. 이들 플레이트를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째). 배양 개시 후 2일째, 3일째에는 1000U/mL 의 IL-2 를 함유하는 1% XVIVO20 을 1mL/웰씩 첨가하였다. 배양 개시 후 4일째에는 적절히 1% XVIVO20 을 사용하여 희석한 배양액을 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 플라스크로 옮겨, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양을 계속하여, 2∼3일마다 배양 개시 4일째와 동일하게 적절히 1% XVIVO20 을 사용하여 희석하고 최종농도 300∼500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 후 11일째 또는 15일째에 트리판 블루 염색법으로 생세포수를 계측하여, 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률로서 산출하였다. 결과를 표 1 에 나타낸다.
표 1 에 나타나는 바와 같이, 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용한, LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 대조군과 비교하여 LAK 세포의 확대 배양률이 높다. 이 사실로부터 각 피브로넥틴 프래그먼트는 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용한 LAK 세포 배양시에 바람직하게 사용되는 것이 분명해졌다.
실시예 2 저혈청 배지를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (반복 자극에 의한 확대 배양)
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
0.5% 또는 1% XVIVO20 에 1×106cells/mL 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 현탁 후, 실시예 1-(2) 에서 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 플레이트, 또는 항 인간 CD3 항체 및 FNfr 고정화 플레이트에 1mL/웰씩 뿌리고, 최종농도 1000U/mL 가 되도록 IL-2 (시오노기제약사 제조) 를 첨가하였다. 이들 플레이트를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째). 배양 개시 후 2일째, 3일째에는 1000U/mL 의 IL-2 를 함유하는 0.5% 또는 1% XVIVO20 을 1mL/웰씩 첨가하였다. 배양 개시 후 4일째에는 적절히 0.5% 또는 1% XVIVO20 을 사용하여 희석한 배양액을 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 플라스크로 옮겨, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 9일째에는 실시예 1-(2) 와 동일한 방법으로 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 플라스크, 또는 항 인간 CD3 항체 및 FNfr 고정화 플라스크 (단, 고정화에 사용하는 항 인간 CD3 항체의 농도는 0.5㎍/mL 로 하였다) 로 적절히 0.5% 또는 1% XVIVO20 을 사용하여 희석한 배양액을 옮기고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 12일째에 다시 적절히 0.5% 또는 1% XVIVO20 을 사용하여 희석한 배양액을 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 플라스크로 옮겨, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 15일째에 트리판 블루 염색법으로 생세포수를 계측하여, 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률로서 산출하였다. 결과를 표 2 에 나타낸다.
표 2 에 나타나는 바와 같이, 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용한, LAK 세포 유도시 초기 및 중기에 반복하여 각 피브로넥틴 프래그먼트 및 항 CD3 항체를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 대조군과 비교하여 LAK 세포의 확대 배양률이 높다. 이들의 확대 배양률은, LAK 세포 유도시 초기 및 중기에 반복하여 항 CD3 항체만을 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서의 확대 배양률보다도 훨씬 높은 것이었다. 즉 LAK 세포 유도 초기 및 중기에 피브로넥틴 프래그먼트 및 항 CD3 항체를 사용하여 자극함으로써, 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용한 경우라도 높은 확대 배양률로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 3 저혈청 배지를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 IL-2 리셉터 (IL-2R) 발현의 유도
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 2-(1) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다.
(2) LAK 세포에 있어서의 IL-2R 발현율의 측정
실시예 3-(1) 에서 조제한 2×105cells 의 LAK 세포를 1% 파라포름알데히드 (나카라이테스크사 제조) 를 함유하는 PBS (닛스이사 제조) 를 사용하여 고정한 후, PBS 로 세정하였다. 고정세포를 1% BSA (SIGMA 사 제조) 를 함유하는 100μL 의 PBS 중에 현탁하고, FITC 표지 마우스 IgG1 또는 FITC 표지 마우스 항 인간 IL-2R (CD25) 항체 (모두 DAKO 사 제조) 를 첨가 후, 얼음 위에서 30분간 인큐베이트하였다. 인큐베이트 후, 세포를 PBS 로 세정하고, 다시 1% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS 에 현탁하였다. 이 세포를 FACS Vantage (BectonㆍDickinson 사 제조) 를 사용한 플로우 사이토메트리에 제공하여, IL-2R 발현 양성 세포 함유율을 측정하였다. 결과를 표 3 에 나타낸다. 이러한 표에서는 IL-2R 발현 양성 세포 함유율 (%) 을 IL-2R 발현율 (%) 로 표시한다.
표 3 에 나타나는 바와 같이, 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용한, LAK 세포 유도 초기 및 중기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 배양 중의 LAK 세포 표면 상에서의 IL-2R 발현율을 높게 유도할 수 있었다. 즉 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용하여 LAK 세포를 유도할 때에 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써, IL-2R 발현율을 높게 하면서 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 4 저혈청 배지를 사용한 LAK 세포 집단 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유 비율
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 2-(1) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다.
(2) LAK 세포에 있어서의 CD8 양성 세포 집단 함유 비율의 측정
실시예 4-(1) 에서 조제한 2×105cells 의 LAK 세포를 1% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS 를 사용하여 고정한 후, PBS 로 세정하였다. 고정세포를 1% BSA 를 함유하는 100μL 의 PBS 중에 현탁하고, FITC 표지 마우스 IgG1 또는 FITC 표지 마우스 항 인간 CD8 항체 (모두 DAKO 사 제조) 를 첨가 후, 얼음 위에서 30분간 인큐베이트하였다. 인큐베이트 후, 세포를 PBS 로 세정하고, 다시 1% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS 에 현탁하였다. 이 세포를 FACS Vantage 를 사용한 플로우 사이토메트리에 제공하여, CD8 양성 세포의 함유율을 측정하였다. 결과를 표 4 에 나타낸다.
표 4 에 나타나는 바와 같이, 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용한, LAK 세포 유도 초기 또는 초기 및 중기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 배양 중의 LAK 세포 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유율을 높게 유도할 수 있었다. 즉 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용하여 LAK 세포를 유도할 때에 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써, LAK 세포 중의 CD8 양성 세포의 함유율을 높게 하면서 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 5 무혈청 배지를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
혈청을 함유하지 않은 XVIVO20 (이하 0% XVIVO20 로 약기한다) 에 1×106cells/mL 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 현탁 후, 실시예 1-(2) 에서 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 플레이트, 또는 항 인간 CD3 항체 및 FNfr 고정화 플레이트에 1mL/웰씩 뿌리고, 최종농도 1000U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 이들 플레이트를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째). 배양 개시 후 2일째, 3일째에는 1000U/mL 의 IL-2 를 함유하는 0% XVIVO20 을 1mL/웰씩 첨가하였다. 배양 개시 후 4일째에는 적절히 0% XVIVO20 을 사용하여 희석한 배양액을 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 플라스크로 옮기고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양을 계속하여, 2∼3일마다 배양 개시 4일째와 동일하게 적절히 0% XVIVO20 을 사용하여 희석하고 최종농도 300∼500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 후 11일째 또는 15일째에 트리판 블루 염색법으로 생세포수를 계측하여, 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률로서 산출하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
표 5 에 나타나는 바와 같이, 혈청을 함유하지 않은 배지를 사용한, LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 대조군과 비교하여 LAK 세포의 확대 배양률이 높다. 이 사실로부터 각 피브로넥틴 프래그먼트는 혈청을 함유하지 않은 배지를 사용한 LAK 세포 배양시에 바람직하게 사용되는 것이 분명해졌다.
실시예 6 무혈청 배지에서의 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (반복 자극에 의한 확대 배양)
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
0% XVIVO20 에 1×106cells/mL 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 현탁 후, 실시예 1-(2) 에서 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 플레이트, 또는 항 인간 CD3 항체 및 FNfr 고정화 플레이트에 1mL/웰씩 뿌리고, 최종농도 1000U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 이들 플레이트를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째). 배양 개시 후 2일째, 3일째에는 1000U/mL 의 IL-2 를 함유하는 0% XVIVO20 을 1mL/웰씩 첨가하였다. 배양 개시 후 4일째에는 적절히 0% XVIVO20 을 사용하여 희석한 배양액을 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 플라스크로 옮기고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 9일째에는 실시예 1-(2) 와 동일한 방법으로 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 플라스크, 또는 항 인간 CD3 항체 및 FNfr 고정화 플라스크 (단, 고정화에 사용한 항 인간 CD3 항체의 농도는 0.5㎍/mL 로 하였다) 로 적절히 0% XVIVO20 을 사용하여 희석한 배양액을 옮기고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 12일째에 다시 적절히 0% XVIVO20 을 사용하여 희석한 배양액을 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 플라스크로 옮기고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 15일째에 트리판 블루 염색법으로 생세포수를 계측하여, 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률로서 산출하였다. 결과를 표 6 에 나타낸다.
표 6 에 나타나는 바와 같이, 혈청을 함유하지 않은 배지를 사용한, LAK 세포 유도시 초기 및 중기에 반복하여 각 피브로넥틴 프래그먼트 및 항 CD3 항체를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 대조군과 비교하여 LAK 세포의 확대 배양률이 높다. 이들의 확대 배양률은, LAK 세포 유도시 초기 및 중기에 반복하여 항 CD3 항체만을 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서의 확대 배양률보다도 훨씬 높은 것이었다. 즉 LAK 세포 유도 초기 및 중기에 피브로넥틴 프래그먼트 및 항 CD3 항체를 사용하여 자극함으로써, 혈청을 함유하지 않은 배지를 사용한 경우라도 높은 확대 배양률로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 7 무혈청 배지를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 IL-2R 발현의 유도
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 6-(1) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다.
(2) LAK 세포에 있어서의 IL-2R 발현율의 측정
실시예 3-(2) 와 동일한 방법으로, IL-2R 발현 양성 세포 함유율을 측정하였다. 결과를 표 7 에 나타낸다. 이러한 표에서는 IL-2R 발현 양성 세포 함유율 (%) 을 IL-2R 발현율 (%) 로 표시한다.
표 7 에 나타나는 바와 같이, 혈청을 함유하지 않은 배지를 사용한, LAK 세포 유도 초기 및 중기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 배양 중의 LAK 세포 표면 상에서의 IL-2R 발현율을 높게 유도할 수 있었다. 즉 혈청을 함유하지 않은 배지를 사용하여 LAK 세포를 유도할 때에 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써, IL-2R 발현율을 높게 하면서 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 8 무혈청 배지 (AIM V) 를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 5-(1) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 단, 이 때 사용하는 배지를 혈청을 함유하지 않은 AIM V 배지 (인비트로겐사 제조, 이하 0% AIM V 로 약기한다) 로 변경하였다. 결과를 표 8 에 나타낸다.
표 8 에 나타나는 바와 같이, 혈청을 함유하지 않은 배지를 사용한, LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 대조군과 비교하여 LAK 세포의 확대 배양률이 높다. 또한 이 효과는 무혈청 배양용의 기본 배지를 바꾸더라도 발휘된다. 이 사실로부터 각 피브로넥틴 프래그먼트는 혈청을 함유하지 않은 배지를 사용한 LAK 세포 배양시에 바람직하게 사용되는 것이 분명해졌다.
실시예 9 무혈청 배지에서의 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (저세포수로부터의 LAK 세포 유도ㆍ배양/희석 조작을 실시하지 않은 배양)
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
XVIVO20 (혈청을 함유하지 않음) 에 1×105cells/mL 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 현탁 후, 실시예 1-(2) 와 동일한 방법으로 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 플레이트, 또는 항 인간 CD3 항체 및 FNfr 고정화 6 웰 플레이트에 1mL/웰씩 뿌리고, XVIVO20 (혈청을 함유하지 않음) 4mL 를 첨가하고 (1×104cells/㎠), 다시 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 이들 플레이트를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째). 배양 개시 후 2일째, 3일째, 4일째에는 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양을 계속하여, 배양 개시 후 7일째 이후 2∼3일마다 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 이 동안 배양액의 희석 조작은 전혀 실시하지 않았다.
배양 개시 후 15일째에 트리판 블루 염색법으로 생세포수를 계측하여, 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률을 산출하였다. 결과를 표 9 에 나타낸다.
표 9 에 나타나는 바와 같이, 저세포수로부터의 LAK 세포 유도시에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 유도 도중의 세포의 희석 조작을 필요로 하지 않고서 배양 개시 후 15일째에 높은 확대 배양률이 얻어졌다. 이에 대하여 대조군에서는 배양 개시 15일째에도 거의 증식되지 않았다. 즉 무혈청 배지를 사용하여 저세포수로부터 LAK 세포를 유도할 때에 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써, 전혀 희석 조작을 필요로 하지 않고서, 높은 확대 배양률로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 10 무혈청 배지를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 IL-2R 발현의 유도 (저세포수로부터의 LAK 세포 유도ㆍ배양/희석 조작을 실시하지 않은 배양)
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 9-(1) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다.
(2) LAK 세포에 있어서의 IL-2R 발현율의 측정
실시예 3-(2) 와 동일한 방법으로, IL-2R 발현 양성 세포 함유율을 측정하였다. 결과를 표 10 에 나타낸다. 이러한 표에서는 IL-2R 발현 양성 세포 함유율 (%) 을 IL-2R 발현율 (%) 로 표시한다.
표 10 에 나타나는 바와 같이, 저세포수로부터의 LAK 세포 유도시에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 유도 도중의 세포의 희석 조작을 필요로 하지 않고서 배양 중의 LAK 세포 표면 상에서의 IL-2R 발현율을 높게 유도할 수 있었다. 즉 무혈청 배지를 사용하여 저세포수로부터 LAK 세포를 유도할 때에 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써, 전혀 희석 조작을 필요로 하지 않고서, IL-2R 발현율을 높게 하면서 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 11 무혈청 배지 (AIM V) 를 사용하여 배양한 LAK 세포 집단 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유 비율
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 8-(1) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다.
(2) LAK 세포에 있어서의 CD8 양성 세포 집단 함유 비율의 측정
실시예 4-(2) 와 동일한 방법으로 CD8 양성 세포의 함유율을 측정하였다. 결과를 표 11 에 나타낸다.
표 11 에 나타나는 바와 같이, 혈청을 함유하지 않은 배지를 사용한, LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 배양 중의 LAK 세포 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유율을 높게 유도할 수 있었다. 즉 혈청을 함유하지 않은 배지를 사용하여 LAK 세포를 유도할 때에 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써, LAK 세포 중의 CD8 양성 세포의 함유율을 높게 하면서 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 12 저혈청 배지 (AIM V) 를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 1-(3) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 단, 이 때 사용하는 배지를 1% 또는 5% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 배지 (이하, 1% AIM V 또는 5% AIM V 로 약기한다) 로 변경하였다. 결과를 표 12 에 나타낸다.
표 12 에 나타나는 바와 같이, 저농도의 혈청을 함유하는 배지 (AIM V) 를 사용한, LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 대조군과 비교하여 LAK 세포의 확대 배양률이 높다. 이 사실로부터 각 피브로넥틴 프래그먼트는 저농도의 혈청을 함유한 AIM V 배지를 사용한 LAK 세포 배양시에 바람직하게 사용되는 것이 분명해졌다.
실시예 13 각종 저혈청 배지를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 효과
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 1-(3) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 단, 이 때 사용하는 배지를 1% human AB 혈청을 함유하는 XVIVO20 배지ㆍXVIVO10 배지 또는 AIM V 배지 (이하 각각 1% XVIVO20ㆍ1% XVIVO10 또는 1% AIM V 로 약기한다) 로 변경하고, 각 배지에 있어서의 확대 배양률을 측정하였다. 결과를 표 13 에 나타낸다.
표 13 에 나타나는 바와 같이, 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용한, LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 대조군과 비교하여 LAK 세포의 확대 배양률이 높다. 또한 이 효과는 기본 배지를 바꾸더라도 발휘된다. 이 사실로부터 각 피브로넥틴 프래그먼트는 저농도의 혈청을 함유하는 임의의 배지를 사용한 LAK 세포 배양시에도 바람직하게 사용되는 것이 분명해졌다.
실시예 14 저혈청 배지를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 1-(3) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 단, 이 때 사용하는 배지를 0.2% human AB 혈청을 함유하는 XVIVO20 배지로 변경하였다. 결과를 표 14 에 나타낸다.
표 14 에 나타나는 바와 같이, 저농도 (0.2%) 의 혈청을 함유한 배지 (XVIVO20) 를 사용한, LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 대조군과 비교하여 LAK 세포의 확대 배양률이 높다. 이 사실로부터 각 피브로넥틴 프래그먼트는 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용한 LAK 세포 배양시에 바람직하게 사용되는 것이 분명해졌다.
실시예 15 저혈청 배지를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (반복 자극에 의한 확대 배양)
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 2-(1) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 이 때 사용하는 배지를 0.2% human AB 혈청을 함유하는 XVIVO20 배지 또는 1% human AB 혈청을 함유하는 XVIVO10 으로 변경하였다. 결과를 표 15 에 나타낸다.
표 15 에 나타나는 바와 같이, 저농도의 혈청 (0.2%) 을 함유한 배지를 사용한, LAK 세포 유도시 초기 및 중기에 반복하여 각 피브로넥틴 프래그먼트 및 항 CD3 항체를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 대조군과 비교하여 LAK 세포의 확대 배양률이 높다. 이들의 확대 배양률은, LAK 세포 유도시 초기 및 중기에 반복하여 항 CD3 항체만을 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서의 확대 배양률보다도 훨씬 높은 것이었다. 또한 이 효과는 기본 배지를 바꾸더라도 발휘된다. 즉 LAK 세포 유도 초기 및 중기에 피브로넥틴 프래그먼트 및 항 CD3 항체를 사용하여 자극함으로써, 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용한 경우라도 높은 확대 배양률로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 16 저혈청 배지를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 IL-2 리셉터 (IL-2R) 발현의 유도
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 2-(1) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 이 때 사용하는 배지를 0.2% human AB 혈청을 함유하는 XVIVO20 배지 또는 1% human AB 혈청을 함유하는 XVIVO10 으로 변경하였다.
(2) LAK 세포에 있어서의 IL-2R 발현율의 측정
실시예 3-(2) 와 동일한 방법으로, IL-2R 발현 양성 세포 함유율을 측정하였다. 결과를 표 16 에 나타낸다. 이러한 표에서는 IL-2R 발현 양성 세포 함유율 (%) 을 IL-2R 발현율 (%) 로 표시한다.
표 16 에 나타나는 바와 같이, 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용한, LAK 세포 유도 초기 및 중기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 배양 중의 LAK 세포 표면 상에서의 IL-2R 발현율을 높게 유도할 수 있었다. 또한 이 효과는 기본 배지를 바꾸더라도 발휘된다. 즉 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용하여 LAK 세포를 유도할 때에 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써, IL-2R 발현율을 높게 하면서 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 17 저혈청 배지를 사용한 LAK 세포 집단 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유 비율
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 1-(3) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 이 때 사용하는 배지를 0.2% 또는 1% human AB 혈청을 함유하는 XVIVO20 배지 또는 1% human AB 혈청을 함유하는 XVIVO10 으로 변경하였다.
(2) LAK 세포에 있어서의 CD8 양성 세포 집단 함유 비율의 측정
실시예 4-(2) 와 동일한 방법으로 CD8 양성 세포의 함유율을 측정하였다. 결과를 표 17 에 나타낸다.
표 17 에 나타나는 바와 같이, 저혈청을 함유하는 배지를 사용한, LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 배양 중의 LAK 세포 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유율을 높게 유도할 수 있었다. 또한 이 효과는 기본 배지를 바꾸더라도 발휘되었다. 즉 저농도의 혈청을 함유하는 배지를 사용하여 LAK 세포를 유도할 때에 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써, LAK 세포 중의 CD8 양성 세포의 함유율을 높게 하면서 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 18 저혈청 배지를 사용한 LAK 세포 집단 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유 비율 (반복 자극에 의한 확대 배양)
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 2-(1) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 이 때 사용하는 배지를 0.2% human AB 혈청을 함유하는 XVIVO20 배지 또는 1% human AB 혈청을 함유하는 XVIVO10 으로 변경하였다.
(2) LAK 세포에 있어서의 CD8 양성 세포 집단 함유 비율의 측정
실시예 4-(2) 와 동일한 방법으로 CD8 양성 세포의 함유율을 측정하였다. 결과를 표 18 에 나타낸다.
표 18 에 나타나는 바와 같이, 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용한, LAK 세포 유도 초기 또는 중기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 배양 중의 LAK 세포 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유율을 높게 유도할 수 있었다. 또한 이 효과는 기본 배지를 바꾸더라도 발휘되었다. 즉 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용하여 LAK 세포를 유도할 때에 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써, LAK 세포 중의 CD8 양성 세포의 함유율을 높게 하면서 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 19 무혈청 배지를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 5-(1) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 단, 이 때 사용하는 배지를 혈청을 함유하지 않은 XVIVO10 배지 또는 AIM V 배지로 변경하였다. 결과를 표 19 에 나타낸다.
표 19 에 나타나는 바와 같이, 혈청을 함유하지 않은 배지를 사용한, LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 대조군과 비교하여 LAK 세포의 확대 배양률이 높다. 또한 이 효과는 기본 배지를 바꾸더라도 발휘되었다. 이 사실로부터 각 피브로넥틴 프래그먼트는 혈청을 함유하지 않은 배지를 사용한 LAK 세포 배양시에 바람직하게 사용되는 것이 분명해졌다.
실시예 20 무혈청 배지에서의 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (반복 자극에 의한 확대 배양)
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 6-(1) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 단, 이 때 사용하는 배지를 혈청을 함유하지 않은 XVIVO10 배지로 변경하였다. 결과를 표 20 에 나타낸다.
표 20 에 나타나는 바와 같이, 혈청을 함유하지 않은 배지를 사용한, LAK 세포 유도시 초기 및 중기에 반복하여 각 피브로넥틴 프래그먼트 및 항 CD3 항체를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 대조군과 비교하여 LAK 세포의 확대 배양률이 높다. 이들의 확대 배양률은, LAK 세포 유도시 초기 및 중기에 반복하여 항 CD3 항체만을 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서의 확대 배양률보다도 훨씬 높은 것이었다. 또한 이 효과는 기본 배지를 바꾸더라도 발휘되었다. 즉 LAK 세포 유도 초기 및 중기에 피브로넥틴 프래그먼트 및 항 CD3 항체를 사용하여 자극함으로써, 혈청을 함유하지 않은 배지를 사용한 경우라도 높은 확대 배양률로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 21 무혈청 배지를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 IL-2R 발현의 유도
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 6-(1) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 단, 이 때 사용하는 배지를 혈청을 함유하지 않은 XVIVO10 배지로 변경하였다.
(2) LAK 세포에 있어서의 IL-2R 발현율의 측정
실시예 3-(2) 와 동일한 방법으로, IL-2R 발현 양성 세포 함유율을 측정하였다. 결과를 표 21 에 나타낸다. 이러한 표에서는 IL-2R 발현 양성 세포 함유율 (%) 을 IL-2R 발현율 (%) 로 표시한다.
표 21 에 나타나는 바와 같이, 혈청을 함유하지 않은 배지를 사용한, LAK 세포 유도 초기 및 중기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 배양 중의 LAK 세포 표면 상에서의 IL-2R 발현율을 높게 유도할 수 있었다. 즉 혈청을 함유하지 않은 배지를 사용하여 LAK 세포를 유도할 때에 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써, IL-2R 발현율을 높게 하면서 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 22 무혈청 배지를 사용하여 배양한 LAK 세포 집단 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유 비율
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 5-(1) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 단, 이 때 사용하는 배지를 혈청을 함유하지 않은 XVIVO20 또는 XVIVO10 또는 AIM V 배지로 변경하였다.
(2) LAK 세포에 있어서의 CD8 양성 세포 집단 함유 비율의 측정
실시예 4-(2) 와 동일한 방법으로 CD8 양성 세포의 함유율을 측정하였다. 결과를 표 22 에 나타낸다.
표 22 에 나타나는 바와 같이, 혈청을 함유하지 않은 배지를 사용한, LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 배양 중의 LAK 세포 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유율을 높게 유도할 수 있었다. 또한 이 효과는 기본 배지를 바꾸더라도 발휘되었다. 즉 혈청을 함유하지 않은 배지를 사용하여 LAK 세포를 유도할 때에 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써, LAK 세포 중의 CD8 양성 세포의 함유율을 높게 하면서 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 23 무혈청 배지를 사용한 LAK 세포 집단 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유 비율 (반복 자극에 의한 확대 배양)
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 6-(1) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 단, 이 때 사용하는 배지를 혈청을 함유하지 않은 XVIVO20 또는 XVIVO10 배지로 변경하였다.
(2) LAK 세포에 있어서의 CD8 양성 세포 집단 함유 비율의 측정
실시예 4-(2) 와 동일한 방법으로 CD8 양성 세포의 함유율을 측정하였다. 결과를 표 23 에 나타낸다.
표 23 에 나타나는 바와 같이, 혈청을 함유하지 않은 배지를 사용한, LAK 세포 유도 초기 또는 초기 중기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 배양 중의 LAK 세포 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유율을 높게 유도할 수 있었다. 또한 이 효과는 기본 배지를 바꾸더라도 발휘되었다. 즉 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용하여 LAK 세포를 유도할 때에 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써, LAK 세포 중의 CD8 양성 세포의 함유율을 높게 하면서 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 24 저혈청 배지를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 IL-2R 발현의 유도 (저세포수로부터의 LAK 세포 유도ㆍ배양/희석 조작을 실시하지 않은 배양)
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
1% human AB 혈청을 함유하는 XVIVO20 (이하 1% XVIVO20 으로 약기) 에 1×105cells/mL 또는 5×104cells/mL 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 현탁 후, 실시예 1-(2) 와 동일한 방법으로 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 플레이트, 또는 항 인간 CD3 항체 및 FNfr 고정화 6 웰 플레이트에 1mL/웰씩 뿌리고, 1% XVIVO20 4mL 를 첨가하고 (1×104cells/㎠ 또는 5×103cells/㎠), 다시 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 (시오노기제약사 제조) 를 첨가하였다. 이들 플레이트를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째). 배양 개시 후 2일째, 3일째, 4일째에는 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양을 계속하여, 배양 개시 후 7일째 이후 2∼3일마다 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 이 동안 배양액의 희석 조작은 전혀 실시하지 않았다. 배양 개시 후 16일째에 세포를 회수하였다.
(2) LAK 세포에 있어서의 IL-2R 발현율의 측정
실시예 3-(2) 와 동일한 방법으로, IL-2R 발현 양성 세포 함유율을 측정하였다. 이러한 표에서는 IL-2R 발현 양성 세포 함유율 (%) 을 IL-2R 발현율 (%) 로 표시한다. 결과를 표 24 에 나타낸다.
표 24 에 나타나는 바와 같이, 저세포수로부터의 LAK 세포 유도시에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 유도 도중의 세포의 희석 조작을 필요로 하지 않고서 배양 중의 LAK 세포 표면 상에서의 IL-2R 발현율을 높게 유도할 수 있었다. 즉 저혈청 배지를 사용하여 저세포수로부터 LAK 세포를 유도할 때에 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써, 전혀 희석 조작을 필요로 하지 않고서, IL-2R 발현율을 높게 하면서 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 25 무혈청ㆍ저혈청 배지를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 세포 상해 활성의 측정
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 1-(3) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 이 때 사용하는 배지를 0% 에서 5% human AB 혈청을 함유하는 XVIVO20 또는 0% 에서 5% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 배지 또는 5% human AB 혈청을 함유하는 XVIVO10 배지로 변경하였다.
(2) 배양한 LAK 세포의 세포 상해 활성의 측정
실시예 25-(1) 에서 조제한 배양 후 15일째인 LAK 의 세포 상해 활성은, Calcein-AM 을 사용한 세포 상해 활성 측정법 [리히텐펠즈 R. 외 (Lichtenfels R., et al.), J. Immnol. Methods, 제172권, 제2호, 제227∼239페이지 (1994)] 으로 평가하였다. 세포주 K562, Daudi 를 1×106cells/mL 가 되도록 5% FBS (Bio Whittaker 사 제조) 를 함유하는 RPMI1640 배지에 현탁 후, 최종농도 25μM 가 되도록 Calcein-AM (도타이트사 제조) 을 첨가하여, 37℃ 에서 1시간 배양하였다. 세포를 Calcein-AM 을 함유하지 않는 배지로 세정 후, Calcein 표지 표적세포로 하였다.
실시예 25-(1) 에서 조제한 LAK 세포를 이펙터세포로 하여 1×106∼3×106cells/mL 가 되도록 5% human 혈청을 함유하는 RPMI (이하 5HRPMI 로 약기) 에서 단계 희석 후, 96 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 100μL/웰씩 분주해 두고, 이들에 1×105cells/mL 로 조제한 Calcein 표지 표적세포를 100μL/웰씩 첨가하였다. 상기 세포 현탁액이 들어있는 플레이트를 400×g 으로 1분간 원심 후, 37℃ 의 습식 CO2 인큐베이터 안에서 4시간 인큐베이트하였다. 4시간 후, 각 웰로부터 배양 상청 100μL 를 채취하여, 형광 플레이트 리더 (485㎚/538㎚) 에 의해 배양 상청 중으로 방출된 calcein 양 (형광강도) 을 측정하였다. LAK 세포의 세포 상해 활성은 이하의 식 1 에 따라서 산출하였다.
식 1:
세포 상해 활성 (%)=[(각 웰의 측정치－최소 방출량)/(최대 방출량－최소 방출량)]×100
상기 식에 있어서 최소 방출량은 표적세포만 함유하는 웰의 calcein 방출량으로, 표적세포로부터의 calcein 자연 방출량을 나타낸다. 또한, 최대 방출량은 표적세포에 계면 활성제인 Triton X-100 (나카라이테스크사 제조) 를 최종농도 0.05% 가 되도록 첨가하여 세포를 완전 파괴했을 때의 calcein 방출량을 나타내고 있다. 결과를 표 25 에 나타낸다. 또, 표 중, 「E/T」란 이펙터세포와 표적세포의 세포수에 기초하는 비 (이펙터세포/표적세포) 를 나타낸다.
표 25 에 나타나는 바와 같이, 혈청을 함유하지 않은 배지 또는 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용한, LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 대조군과 비교하여 LAK 세포의 세포 상해 활성이 높다. 또한 이 효과는 기본 배지를 바꾸더라도 발휘되었다. 이 사실로부터 각 피브로넥틴 프래그먼트는 혈청을 함유하지 않은 배지 또는 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용한 LAK 세포 배양시에 바람직하게 사용되는 것이 분명해졌다.
실시예 26 저혈청 배지 (AIM V) 를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (반복 자극에 의한 확대 배양)-1
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 2-(1) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 이 때 사용하는 배지를 1% human AB 혈청을 함유하는 배지 AIM V 로 변경하였다. 결과를 표 26 에 나타낸다.
표 26 에 나타나는 바와 같이, 저농도의 혈청 (1%) 을 함유하는 AIM V 배지를 사용한, LAK 세포 유도시 초기 및 중기에 반복하여 각 피브로넥틴 프래그먼트 및 항 CD3 항체를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 대조군과 비교하여 LAK 세포의 확대 배양률이 높다. 이들의 확대 배양률은, LAK 세포 유도시 초기 및 중기에 반복하여 항 CD3 항체만을 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서의 확대 배양률보다도 훨씬 높은 것이었다. 즉 LAK 세포 유도 초기 및 중기에 피브로넥틴 프래그먼트 및 항 CD3 항체를 사용하여 자극함으로써, 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용한 경우라도 높은 확대 배양률로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 27 저혈청 배지 (AIM V) 를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (반복 자극에 의한 확대 배양)-2
(1) 항 인간 CD3 항체 및 FN 프래그먼트 고정화
이하의 실험에서 사용하는 배양 기재 (용기) 에 항 인간 CD3 항체 및 FN 프래그먼트를 고정화하였다. 즉 12 웰 세포 배양 플레이트 또는 12.5㎠ 세포 배양 플라스크 (Falcon 사 제조) 에 항 인간 CD3 항체 (최종농도 5㎍/mL) 를 함유하는 PBS 를 1.9mL (12 웰 플레이트의 경우) 또는 2mL (12.5㎠ 플라스크의 경우) 씩 첨가하였다. 이 때, FN 프래그먼트 첨가군에는 제조예 1 에 기재된 각 피브로넥틴 프래그먼트 (FNfr) 를 최종농도 10㎍/mL (12 웰 플레이트의 경우) 또는 25㎍/mL (12.5㎠ 플라스크의 경우) 가 되도록 첨가하였다. 대조로서, FNfr 을 첨가하지 않은 군도 설정하였다.
이들 배양 기재를 실온에서 5시간 인큐베이트 후, 사용시까지 4℃ 에서 보존하였다. 사용 직전에는 이들 배양 기재로부터 항체ㆍFNfr 을 함유하는 PBS 를 흡인 제거 후, 각 웰을 PBS 로 2회, AIM V 배지로 1회 세정하여 각 실험에 사용하였다.
(2) LAK 세포의 유도 및 배양
1% AIM V 에 5×105cells/mL 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 현탁 후, 실시예 27-(1) 에서 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 플레이트, 또는 항 인간 CD3 항체 및 FNfr 고정화 플레이트에 1mL/웰씩 뿌리고, 최종농도 1000U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 이들 플레이트를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째). 배양 개시 후 2, 3일째에는 1000U/mL 의 IL-2 를 함유하는 1% AIM V 를 1mL/웰씩 첨가하였다. 배양 개시 후 4일째에는 배양액을 아무 것도 고정화되어 있지 않은 25㎠ 세포 배양 플라스크 (Falcon 사 제조) 로 옮기고, 다시 1% AIM V 7mL 를 첨가하고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 7일째에는 1% AIM V 를 사용하여 세포 농도를 2×105cells/mL 로 조정한 배양액의 일부를 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 플라스크로 옮기고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 9일째에는 실시예 27-(1) 과 동일한 방법으로 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 플라스크, 또는 항 인간 CD3 항체 및 FNfr 고정화 플라스크 (단, 고정화에 사용하는 항 인간 CD3 항체의 농도는 0.5㎍/mL 로 하였다) 로 1% AIM V 를 사용하여 세포 농도를 2×105cells/mL 로 조정한 배양액의 일부를 옮기고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 12일째에 다시 적절히 1% AIM V 를 사용하여 세포 농도를 2×105cells/mL 로 조정한 배양액의 일부를 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 플라스크로 옮기고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 15일째에 트리판 블루 염색법으로 생세포수를 계측하여, 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률로서 산출하였다. 같은 조건에서 n=3 으로 확대 배양을 실시하여, 그 평균±표준편차의 각 결과를 표 27 에 나타낸다.
표 27 에 나타나는 바와 같이, 저농도의 혈청 (1%) 을 함유하는 AIM V 배지를 사용한, LAK 세포 유도시 초기 및 중기에 반복하여 각 피브로넥틴 프래그먼트 및 항 CD3 항체를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 대조군과 비교하여 LAK 세포의 확대 배양률이 높다. 이들의 확대 배양률은, LAK 세포 유도시 초기 및 중기에 반복하여 항 CD3 항체만을 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서의 확대 배양률보다도 훨씬 높은 것이었다. 즉 LAK 세포 유도 초기 및 중기에 피브로넥틴 프래그먼트 및 항 CD3 항체를 사용하여 자극함으로써, 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용한 경우라도 높은 확대 배양률로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 28 무혈청 배지 (AIM V) 를 사용한 LAK 세포 집단 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유 비율 (반복 자극에 의한 확대 배양)
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 2-(1) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 이 때 사용하는 배지를 human AB 혈청을 함유하지 않은 AIM V 로 변경하였다.
(2) LAK 세포에 있어서의 CD8 양성 세포 집단 함유 비율의 측정
실시예 4-(2) 와 동일한 방법으로 CD8 양성 세포의 함유율을 측정하였다. 결과를 표 28 에 나타낸다.
표 28 에 나타나는 바와 같이, 혈청을 함유하지 않은 AIM V 배지를 사용한, LAK 세포 유도 초기 또는 중기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 배양 중의 LAK 세포 후 세포 집단에 있어서의 CD8 양성 세포 함유율을 높게 유도할 수 있었다. 즉 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용하여 LAK 세포를 유도할 때에 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써, LAK 세포 중의 CD8 양성 세포의 함유율을 높게 하면서 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 29 저혈청 배지 (AIM V) 를 사용한 LAK 세포 집단 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유 비율 (반복 자극에 의한 확대 배양)
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 2-(1) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 이 때 사용하는 배지를 1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 로 변경하였다.
(2) LAK 세포에 있어서의 CD8 양성 세포 집단 함유 비율의 측정
실시예 4-(2) 와 동일한 방법으로 CD8 양성 세포의 함유율을 측정하였다. 결과를 표 29 에 나타낸다.
표 29 에 나타나는 바와 같이, 저농도의 혈청을 함유한 AIM V 배지를 사용한, LAK 세포 유도 초기 또는 초기 및 중기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 배양 후의 LAK 세포 집단에 있어서의 CD8 양성 세포 함유율을 높게 유도할 수 있었다. 즉 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용하여 LAK 세포를 유도할 때에 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써, LAK 세포 중의 CD8 양성 세포의 함유율을 높게 하면서 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 30 무혈청 배지 (AIM V) 를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 IL-2 리셉터 (IL-2R) 발현의 유도
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 2-(1) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 이 때 사용하는 배지를 human AB 혈청을 함유하지 않은 AIM V 배지로 변경하였다.
(2) LAK 세포에 있어서의 IL-2R 발현율의 측정
실시예 3-(2) 와 동일한 방법으로, IL-2R 발현 양성 세포 함유율을 측정하였다. 결과를 표 30 에 나타낸다. 이러한 표에서는 IL-2R 발현 양성 세포 함유율 (%) 을 IL-2R 발현율 (%) 로 표시한다.
표 30 에 나타나는 바와 같이, 혈청을 함유하지 않은 AIM V 배지를 사용한, LAK 세포 유도 초기 및 중기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 배양 후의 LAK 세포 표면 상에서의 IL-2R 발현율을 높게 유도할 수 있었다. 즉 혈청을 함유하지 않은 배지를 사용하여 LAK 세포를 유도할 때에 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써, IL-2R 발현율을 높게 하면서 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 31 저혈청 배지 (AIM V) 를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 IL-2 리셉터 (IL-2R) 발현의 유도 (반복 자극에 의한 확대 배양)
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 2-(1) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 이 때 사용하는 배지를 1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 배지로 변경하였다.
(2) LAK 세포에 있어서의 IL-2R 발현율의 측정
실시예 3-(2) 와 동일한 방법으로, IL-2R 발현 양성 세포 함유율을 측정하였다. 결과를 표 31 에 나타낸다. 이러한 표에서는 IL-2R 발현 양성 세포 함유율 (%) 을 IL-2R 발현율 (%) 로 표시한다.
표 31 에 나타나는 바와 같이, 저농도의 혈청을 함유한 AIM V 배지를 사용한, LAK 세포 유도 초기 및 중기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 배양 중의 LAK 세포 표면 상에서의 IL-2R 발현율을 높게 유도할 수 있었다. 즉 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용하여 LAK 세포를 유도할 때에 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써, IL-2R 발현율을 높게 하면서 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 32 저혈청 배지 (AIM V) 를 사용한 LAK 세포 집단 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유 비율
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 1-(3) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 이 때 사용하는 배지를 1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 배지로 변경하였다.
(2) LAK 세포에 있어서의 CD8 양성 세포 집단 함유 비율의 측정
실시예 4-(2) 와 동일한 방법으로 CD8 양성 세포의 함유율을 측정하였다. 결과를 표 32 에 나타낸다.
표 32 에 나타나는 바와 같이, 저혈청을 함유하는 AIM V 배지를 사용한, LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 배양 중의 LAK 세포 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유율을 높게 유도할 수 있었다. 즉 저농도의 혈청을 함유하는 배지를 사용하여 LAK 세포를 유도할 때에 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써, LAK 세포 중의 CD8 양성 세포의 함유율을 높게 하면서 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 33 무혈청ㆍ저혈청 배지를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 세포 상해 활성의 측정
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 1-(3) 또는 실시예 2-(1) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 이 때 사용하는 배지를 0% 또는 1% human AB 혈청을 함유하는 XVIVO10, XVIVO20 또는 AIM V 배지로 변경하였다.
(2) 배양한 LAK 세포의 세포 상해 활성의 측정
실시예 25-(2) 와 동일한 방법으로 배양 후 15일째의 LAK의 세포 상해 활성을 측정하였다. 결과를 표 33 에 나타낸다.
표 33 에 나타나는 바와 같이, 혈청을 함유하지 않은 배지 또는 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용한, LAK 세포 유도 초기 또는 초기 및 중기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 대조군과 비교하여 LAK 세포의 세포 상해 활성이 높다. 또한 이 효과는 기본 배지를 바꾸더라도 발휘되었다. 이 사실로부터 각 피브로넥틴 프래그먼트는 혈청을 함유하지 않은 배지 또는 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용한 LAK 세포 배양시에 바람직하게 사용되는 것이 분명해졌다.
실시예 34 저혈청 배지 (XVIVO10) 를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 사용한 배양)
(1) 항 인간 CD3 항체 및 FN 프래그먼트 고정화
이하의 실험에서 사용하는 배양 기재 (세포 배양용 CO2 가스 투과성 백) 에 항 인간 CD3 항체 및 FN 프래그먼트를 고정화하였다. 즉 85㎠ 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백 (Baxter 사 제조) 에 항 인간 CD3 항체 (최종농도 5㎍/mL) 를 함유하는 PBS 를 20mL 씩 첨가하였다. 이 때, FN 프래그먼트 첨가군에는 제조예 1 에 기재된 각 피브로넥틴 프래그먼트 (FNfr) 를 최종농도 42.5㎍/mL 가 되도록 첨가하였다. 대조로서, FNfr 을 첨가하지 않은 군도 설정하였다.
이들 배양 기재를 실온에서 5시간 인큐베이트 후, 사용시까지 4℃ 에서 보존하였다. 사용 직전에는 이들 배양 기재로부터 항체ㆍFNfr 을 함유하는 PBS 를 제거 후, 각 백을 PBS 로 2회, 1% human AB 혈청을 함유하는 XVIVO10 배지 (이하 1% XVIVO10 로 약기한다) 로 1회 세정하여 각 실험에 사용하였다.
(2) LAK 세포의 유도 및 배양
1% XVIVO10 에 1×106cells/mL 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 현탁 후, 실시예 34-(1) 에서 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백, 또는 항 인간 CD3 항체 및 FNfr 고정화 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백에 10mL/백씩 세포 현탁액을 넣고, 최종농도 1000U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 이들 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째). 배양 개시 후 2일째에는 1000U/mL 의 IL-2 를 함유하는 1% XVIVO10 을 20mL/백씩 첨가하였다. 배양 개시 4일째에는 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 후 6일째에는 1% XVIVO10 을 30mL/백씩 첨가하고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 후 8일째에는 배양액의 일부를 적절히 희석한 후, 아무 것도 고정화되어 있지 않은 85㎠ 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백으로 옮기고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 11, 13일째에는 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 15일째에 트리판 블루 염색법으로 생세포수를 계측하여, 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률로서 산출하였다. 결과를 표 34 에 나타낸다.
표 34 에 나타나는 바와 같이, 저농도 (1%) 의 혈청을 함유한 배지 (XVIVO10) 와 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 사용한, LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 사용한 군에 있어서는, 대조군과 비교하여 LAK 세포의 확대 배양률이 높다. 이 사실로부터 각 피브로넥틴 프래그먼트는 저농도의 혈청을 함유한 배지 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 사용한 LAK 세포 배양시에 바람직하게 사용되는 것이 분명해졌다.
실시예 35 저혈청 배지(XVIVO10) 를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 배양)
(1) 항 인간 CD3 항체 및 FN 프래그먼트 고정화
이하의 실험에서 사용하는 배양 기재 (25㎠ 세포 배양용 플라스크) 에 항 인간 CD3 항체 및 FN 프래그먼트를 고정화하였다. 즉 25㎠ 세포 배양용 플라스크 (코닝사 제조) 에 항 인간 CD3 항체 (최종농도 5㎍/mL) 를 함유하는 PBS 를 6mL 씩 첨가하였다. 이 때, FN 프래그먼트 첨가군에는 제조예 1 에 기재된 각 피브로넥틴 프래그먼트 (FNfr) 를 최종농도 42.5㎍/mL 가 되도록 첨가하였다. 대조로서, FNfr 을 첨가하지 않은 군도 설정하였다.
이들 배양 기재를 실온에서 5시간 인큐베이트 후, 사용시까지 4℃ 에서 보존하였다. 사용 직전에는 이들 배양 기재로부터 항체ㆍFNfr 을 함유하는 PBS 를 제거 후, 각 플라스크를 PBS 로 2회, 1% human AB 혈청을 함유하는 XVIVO10 배지 (이하 1% XVIVO10 으로 약기한다) 로 1회 세정하여 각 실험에 사용하였다.
(2) LAK 세포의 유도 및 배양
1% XVIVO10 에 1×106cells/mL 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 현탁 후, 실시예 35-(1) 에서 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 플라스크, 또는 항 인간 CD3 항체 및 FNfr 고정화 플라스크에 3mL/플라스크씩 세포 현탁액을 넣고, 최종농도 1000U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 이들 플라스크를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째). 배양 개시 후 1일째 또는 2일째에는 1000U/mL 의 IL-2 를 함유하는 1% XVIVO10 을 7mL/플라스크씩 첨가하였다. 이하 항 CD3 항체±CH-296 자극 기간에 따라 2 가지 방법으로 배양하였다. (i) 배양 개시 후 4일째에 배양액을 아무 것도 고정화되어 있지 않은 85㎠ 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백으로 옮긴 후, 1% XVIVO10 을 20mL/백씩 첨가하여 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하고, 다시 배양 개시 후 6일째에 1% XVIVO10 을 30mL/백씩 첨가 후, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다 (항 CD3 항체±CH-296 자극 기간 4일간). (ii) 배양 개시 4일째 또는 5일째에 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하고, 배양 개시 후 6일째에 배양액을 아무 것도 고정화되어 있지 않은 85㎠ 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백으로 옮긴 후, 1% XVIVO10 을 50mL/백씩 첨가하고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다 (항 CD3 항체±CH-296 자극 기간 6일간). 양 조건 모두에서 배양 개시 후 8일째에는 배양액의 일부를 적절히 희석한 후, 아무 것도 고정화되어 있지 않은 85㎠ 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백으로 옮기고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 11, 13일째에는 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 15일째에 트리판 블루 염색법으로 생세포수를 계측하여, 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률로서 산출하였다. 결과를 표 35 에 나타낸다.
표 35 에 나타나는 바와 같이, 저농도 (1%) 의 혈청을 함유한 배지 (XVIVO10) 를 사용하여, 세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 세포 배양용 플라스크를 사용한 군에 있어서는, 대조군과 비교하여 LAK 세포의 확대 배양률이 높다. 이 사실로부터 각 피브로넥틴 프래그먼트는 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용하여, 세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 LAK 세포 배양시에 바람직하게 사용되는 것이 분명해졌다.
실시예 36 저혈청 배지 (AIM V) 를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 배양)
(1) 항 인간 CD3 항체 및 FN 프래그먼트 고정화
이하의 실험에서 사용하는 배양 기재 (25㎠ 세포 배양용 플라스크) 에 실시예 35-(1) 과 동일하게 항 인간 CD3 항체 및 FN 프래그먼트를 고정화하였다. 사용 직전에는 이들 배양 기재로부터 항체ㆍFNfr 을 함유하는 PBS 를 제거 후, 각 플라스크를 PBS 로 2회, 1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 배지 (이하 1% AIM V 로 약기한다) 로 1회 세정하여 각 실험에 사용하였다.
(2) LAK 세포의 유도 및 배양
1% AIM V 에 1×106cells/mL 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 현탁 후, 실시예 36-(1) 에서 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 플라스크, 또는 항 인간 CD3 항체 및 FNfr 고정화 플라스크에 3mL/플라스크씩 세포 현탁액을 넣고, 최종농도 1000U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 이들 플라스크를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째). 배양 개시 후 1일째에는 1000U/mL 의 IL-2 를 함유하는 1% AIM V 를 7mL/플라스크씩 첨가하였다. 배양 개시 후 4일째에는 배양액을 아무 것도 고정화되어 있지 않은 85㎠ 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백으로 옮긴 후, 1% AIM V 를 20mL/백씩 첨가하고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 6일째에는 1% AIM V 를 30mL/백씩 첨가하고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 후 8일째에는 배양액의 일부를 적절히 희석한 후, 아무 것도 고정화되어 있지 않은 85㎠ 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백으로 옮기고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 11, 13일째에는 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 15일째에 트리판 블루 염색법으로 생세포수를 계측하여, 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률로서 산출하였다. 결과를 표 36 에 나타낸다.
표 36 에 나타나는 바와 같이, 저농도 (1%) 의 혈청을 함유한 배지 (AIM V) 를 사용하여, 세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 세포 배양용 플라스크를 사용한 군에 있어서는, 대조군에 비교하여 LAK 세포의 확대 배양률이 높다. 이 사실로부터 각 피브로넥틴 프래그먼트는 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용하여, 세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 LAK 세포 배양시에 바람직하게 사용되는 것이 분명해졌다.
실시예 37 저혈청 배지 (XVIVO10) 를 사용한 LAK 세포 집단 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유 비율 (세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 사용한 배양)
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 34-(2) 와 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다.
(2) LAK 세포에 있어서의 CD8 양성 세포 집단 함유 비율의 측정
실시예 4-(2) 와 동일한 방법으로 CD8 양성 세포의 함유율을 측정하였다. 결과를 표 37 에 나타낸다.
표 37 에 나타나는 바와 같이, 저농도 (1%) 의 혈청을 함유한 배지 (XVIVO10) 와 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 사용한, LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 사용한 군에 있어서는, 배양 후의 LAK 세포 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유율을 높게 유도할 수 있었다. 이 사실로부터 각 피브로넥틴 프래그먼트는, 저농도의 혈청을 함유한 배지 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 사용한 LAK 세포 배양시에 바람직하게 사용되는 것이 분명해졌다.
실시예 38 저혈청 배지 (XVIVO10) 를 사용한 LAK 세포 집단 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유 비율 (세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 배양)
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 35-(2) 와 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다.
(2) LAK 세포에 있어서의 CD8 양성 세포 집단 함유 비율의 측정
실시예 4-(2) 와 동일한 방법으로 CD8 양성 세포의 함유율을 측정하였다. 결과를 표 38 에 나타낸다.
표 38 에 나타나는 바와 같이, 저농도 (1%) 의 혈청을 함유한 배지 (XVIVO10) 를 사용하여, 세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 세포 배양용 플라스크를 사용한 군에 있어서는, 대조군에 비교하여 배양 후의 LAK 세포 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유율을 높게 유도할 수 있었다. 이 사실로부터 각 피브로넥틴 프래그먼트는, 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용하여, 세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 LAK 세포 배양시에 바람직하게 사용되는 것이 분명해졌다.
실시예 39 저혈청 배지 (AIM V) 를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (배양 개시시, 계대(繼代)시의 농도)
LAK 세포 배양계에서의 배양 개시시 및 계대시의 세포 농도가 확대 배양률에 미치는 영향을 확인하였다.
배양 개시시의 세포 농도로서 0.5×106cells/mL 및 1×106cells/mL 를 설정하였다. 배양 4일째의 계대 세포 농도로서, 0.025×106cells/mL 및 0.05×106cells/mL 를 설정하였다. 배양 7, 9 및 11일째의 계대 세포 농도로서, 0.2×106cells/mL 및 0.5×106cells/mL 를 설정하였다. 하기 표 39-1 에 상기 패턴을 나타낸다.
(1) 항 인간 CD3 항체 및 FN 프래그먼트 고정화
이하의 실험에서 사용하는 배양 기재에 항 인간 CD3 항체 및 FN 프래그먼트를 고정화하였다. 즉 24 웰 세포 배양 플레이트에 항 인간 CD3 항체 (최종농도 5㎍/mL) 를 함유하는 PBS 를 1mL 씩 첨가하였다. 이 때, FN 프래그먼트 첨가군에는 제조예 1 에 기재된 피브로넥틴 프래그먼트 (CH-296) 를 최종농도 25㎍/mL 가 되도록 첨가하였다. 대조로서, CH-296 을 첨가하지 않은 군도 설정하였다.
이들 배양 기재를 실온에서 5시간 인큐베이트 후, 사용시까지 4℃ 에서 보존하였다. 사용 직전에는 이들 배양 기재로부터 항 인간 CD3 항체ㆍCH-296 을 함유하는 PBS 를 흡인 제거 후, 각 웰을 PBS 로 2회, RPMI 배지로 1회 세정하여 각 실험에 사용하였다.
(2) LAK 세포의 유도 및 배양
1% 의 human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 세포 농도 패턴 1, 2 및 3 으로 배양하는 구분은 0.5×106cells/mL 가 되도록, 세포 농도 패턴 4, 5 및 6 으로 배양하는 구분은 1×106cells/mL 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 현탁 후, (1) 에서 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 플레이트, 또는 항 인간 CD3 항체 및 CH-296 고정화 플레이트에 1mL/웰씩 뿌리고, 최종농도 1000U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 이들 플레이트를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째). 배양 개시 후 2, 3일째에는 1000U/mL 의 IL-2 를 함유하는 1% AIM V 를 1mL/웰씩 첨가하였다.
배양 개시 후 4일째에 세포 농도 패턴 1 및 4 로 배양하는 구분은 0.025×106cells/mL 가 되도록, 또한 세포 농도 패턴 2, 3, 5, 6 으로 배양하는 구분은 0.05×106cells/mL 가 되도록 1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 최대 6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 12.5㎠ 세포 배양 플라스크로 각각 옮겼다. 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 후 7, 9 및 11일째에는 세포 농도 패턴 1, 2, 4 및 5 로 배양하는 구분은, 0.2×106cells/mL 가 되도록, 또한 세포 농도 패턴 3, 6 으로 배양하는 구분은, 0.5×106cells/mL 가 되도록 1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 최대 6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 12.5㎠ 세포 배양 플라스크로 각각 옮겼다. 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 15일째에 트리판 블루 염색법으로 생세포수를 계측하여, 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률로서 산출하였다. 각 실험은 3벌로 실시하였다. 그 평균의 각 결과를 표 39-2 에 나타낸다.
표 39-2 에 나타나는 바와 같이, 배양 개시시 및 계대시에 있어서 각종 세포 농도에서의 LAK 세포 배양에 있어서, 모든 세포 농도 구분에 있어서, 대조군 (항 CD3 항체에만 의한 자극) 과 비교하여 CH-296 및 항 CD3 항체에 의해 자극한 군에 있어서 높은 확대 배양률이 얻어졌다. 즉, 여러 상황하에서 변화할 수 있는 배양 개시시 및 계대시의 세포 농도에 대하여, CH-296 에 의해 자극함으로써, 분명히 높은 확대 배양률로 LAK 세포를 유도ㆍ배양할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 40 저혈청 배지 (AIM V) 를 사용하여 배양한 LAK 세포 집단 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유 비율 (배양 개시시, 계대시의 농도)
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 39 와 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다.
(2) LAK 세포에 있어서의 CD8 양성 세포 집단 함유 비율의 측정
실시예 4-(2) 와 동일한 방법으로 CD8 양성 세포의 함유율을 측정하였다. 결과를 표 40 에 나타낸다.
표 40 에 나타나는 바와 같이, 배양 개시시 및 계대시에 있어서 각종 세포 농도에서의 LAK 세포 배양에 있어서, 모든 세포 농도 구분에 있어서, 대조군 (항 CD3 항체에만 의한 자극) 과 비교하여 CH-296 및 항 CD3 항체에 의해 자극한 군에 있어서 배양 중의 LAK 세포 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유율을 높게 유도할 수 있었다. 즉, 여러 상황하에서 변화할 수 있는 배양 개시시 및 계대시의 세포 농도에 대하여, CH-296 에 의해 자극함으로써, 확실하게 LAK 세포 중의 CD8 양성 세포의 함유율을 높게 하면서 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 41 저혈청 배지 (AIM V) 를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (고농도ㆍ고밀도 배양)
LAK 세포 배양계에 있어서, 최종 배양 액량 및 최종 배양 면적을 최대한 억제할 수 있으면, 배지, 자재 및 노동력을 저감할 수 있다. 세포를 고농도, 고밀도로 배양하였을 때의 확대 배양률에 미치는 영향을 확인하였다.
계대시의 세포 농도 및 세포 밀도를 억제하지 않은 구분 (보통 배양 구분), 배양 7 및 10일째의 계대시의 세포 농도를 보통 배양 구분의 각각 1.8배 및 약 6배로 한 구분 (고농도 배양 구분, 단 세포 밀도는 농도에 비례하여 마찬가지로 1.8배 및 약 6배가 된다), 배양 7 및 10일째의 계대시의 세포 농도를 보통 배양 구분의 각각 1.3배 및 약 2.5배로, 또한 세포 밀도를 각각 약 3.9배 및 7.5배로 한 구분 (고농도ㆍ고밀도 배양 구분) 을 설정하였다. 하기 표 41-1 에 상기 각 군에서의 계대시 세포 농도 및 세포 밀도를 나타낸다.
(1) 항 인간 CD3 항체 및 FN 프래그먼트 고정화
이하의 실험에서 사용하는 배양 기재에 항 인간 CD3 항체 및 FN 프래그먼트를 고정화하였다. 즉 12 웰 세포 배양 플레이트에 항 인간 CD3 항체 (최종농도 5㎍/mL) 를 함유하는 PBS 를 1.9mL 씩 첨가하였다. 이 때, FN 프래그먼트 첨가군에는 제조예 1 에 기재된 피브로넥틴 프래그먼트 (CH-296) 를 최종농도 25㎍/mL 가 되도록 첨가하였다. 대조로서, CH-296 을 첨가하지 않은 군도 설정하였다.
이들 배양 기재를 실온에서 5시간 인큐베이트 후, 사용시까지 4℃ 에서 보존하였다. 사용 직전에는 이들 배양 기재로부터 항 인간 CD3 항체ㆍCH-296 을 함유하는 PBS 를 흡인 제거 후, 각 웰을 PBS 로 2회, RPMI 배지로 1회 세정하여 각 실험에 사용하였다.
(2) LAK 세포의 유도 및 배양
각 배양 구분 모두 1% 의 human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 0.33×106cells/mL 가 되도록, 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 현탁 후, 실시예 41-(1) 에서 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 플레이트, 또는 항 인간 CD3 항체 및 CH-296 고정화 플레이트에 3mL/웰씩 뿌리고, 최종농도 1000U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 이들 플레이트를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째).
배양 개시 후 4일째에 각 배양 구분 모두, 0.05×106cells/mL 가 되도록 1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 최대 6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 12.5㎠ 세포 배양 플라스크로 옮겼다. 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 후 7일째에는, 보통 배양 구분은 0.1×106cells/mL 가 되도록, 고농도 배양 구분은 0.18×106cells/mL 가 되도록 1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 최대 6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 12.5㎠ 세포 배양 플라스크로 옮겼다. 또한, 고농도ㆍ고밀도 배양 구분은 0.13×106cells/mL 가 되도록 1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 최대 9mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것으로 옮겼다. 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 후 10일째에는, 보통 배양 구분은 0.15×106cells/mL 가 되도록, 고농도 배양 구분은 0.893×106cells/mL 가 되도록 1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 최대 6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 12.5㎠ 세포 배양 플라스크로 옮겼다. 또한, 고농도ㆍ고밀도 배양 구분은 0.38×106cells/mL 가 되도록 1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 최대 9mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것으로 옮겼다. 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 후 11일째에는 각 구분에 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 15일째에 트리판 블루 염색법으로 생세포수를 계측하여, 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률로서 산출하였다. 각 실험은 2벌로 실시하였다. 그 평균의 각 결과를 41-2 에 나타낸다.
표 41-2 에 나타나는 바와 같이, 보통 배양 구분 또는 고농도 배양 구분 또는 고농도ㆍ고밀도 배양 구분에 있어서, 모든 구분에 있어서, 대조군 (항 CD3 항체에만 의한 자극) 과 비교하여 CH-296 및 항 CD3 항체에 의해 자극한 군에 있어서 높은 확대 배양률이 얻어졌다. 즉, 배지, 자재 및 노동력을 저감할 수 있는 고농도ㆍ고밀도 배양에 있어서 CH-296 에 의한 자극에 의해 확실하게 확대 배양에 대한 효과가 인정되었다.
실시예 42 저혈청 배지 (AIM V) 를 사용하여 배양한 LAK 세포 집단 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유 비율 (고농도, 고밀도 배양)
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 41 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다.
(2) LAK 세포에 있어서의 CD8 양성 세포 집단 함유 비율의 측정
실시예 4-(2) 와 동일한 방법으로 CD8 양성 세포의 함유율을 측정하였다. 결과를 표 42 에 나타낸다.
표 42 에 나타나는 바와 같이, 보통 배양 구분 또는 고농도 배양 구분 또는 고농도ㆍ고밀도 배양 구분에 있어서, 모든 구분에 있어서, 대조군 (항 CD3 항체에만 의한 자극) 과 비교하여 CH-296 및 항 CD3 항체에 의해 자극한 군에 있어서 배양 중의 LAK 세포 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유율을 높게 유도할 수 있었다. 즉, 배지, 자재 및 노동력을 저감할 수 있는 고농도ㆍ고밀도 배양에 있어서 CH-296 에 의한 자극에 의해, 확실하게 LAK 세포 중의 CD8 양성 세포의 함유율을 높게 하면서 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 43 저혈청 배지 (AIM V) 를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (혈청 농도 0%, 0.15%, 5%→0.1%)
LAK 세포 배양에 있어서 1회에 30mL 를 채혈하면, 대체로 15mL 의 혈장이 얻어진다. 이것을 최종 10L 까지 배지에 의해 배양하는 것을 고려하면, 혈장 농도로서 0.15% 가 된다. 또한, 5% 의 혈장 농도로부터 배양을 시작하면 4일째 이후, 세포를 계대, 희석할 때의 배지에 있어서의 혈장 농도는 0.1% 정도가 된다. 이상을 감안하여 LAK 세포 배양계에서의 혈청 농도의 영향을 확인하였다.
배양 개시시에 human AB 혈청이 0%, 0.15% 또는 5% 각각 함유되는 구분을 설정하였다. 각 농도의 human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 0.33×106cells/mL 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 현탁 후, 실시예 41-(1) 에서 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 플레이트, 또는 항 인간 CD3 항체 및 CH-296 고정화 플레이트에 3mL/웰씩 뿌리고, 최종농도 1000U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 이들 플레이트를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째).
배양 개시 후 4일째에 0%, 0.15% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에서 배양한 구분은, 최대 0.05×106cells/mL 가 되도록, 각각 0% 또는 0.15% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고, 아무 것도 고정화되어 있지 않은 12.5㎠ 세포 배양 플라스크로 배양액을 옮겼다 (액량 2.5mL). 5% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에서 배양한 구분은, 0.05×106cells/mL 가 되도록 0.1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 12.5㎠ 세포 배양 플라스크로 옮겼다. 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 7일째에는 0%, 0.15% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에서 배양한 구분은 각각 동 농도의 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 0.11×106cells/mL 가 되도록 희석하고, 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것으로 옮겼다 (액량 최대 12.6mL). 5% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에서 배양한 구분은, 0.1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 0.11×106cells/mL 가 되도록 희석하고, 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것으로 옮겼다 (액량 최대 12.6mL). 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 10일째에는 0%, 0.15% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에서 배양한 구분은 각각 동 농도의 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 0.22×106cells/mL 가 되도록 희석하고, 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것으로 옮겼다 (액량 최대 12.6mL). 5% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에서 배양한 구분은, 0.1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 0.6×106cells/mL 가 되도록 희석하고, 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것으로 옮겼다 (액량 최대 12.6mL). 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 15일째에 트리판 블루 염색법으로 생세포수를 계측하여, 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률로서 산출하였다. 각 실험은 2벌로 실시하였다. 그 평균의 각 결과를 표 43 에 나타낸다.
표 43 에 나타나는 바와 같이, 각 혈청 농도를 함유한 AIM V 배지를 사용한 LAK 세포 배양에 있어서, 모든 혈청 농도 구분에 있어서, 대조군 (항 CD3 항체에만 의한 자극) 과 비교하여 CH-296 및 항 CD3 항체에 의해 자극한 군에 있어서 높은 확대 배양률이 얻어졌다. 즉, 30mL 채혈을 상정한 혈청 농도에 있어서의 LAK 세포 배양에 있어서, CH-296 및 항 CD3 항체에 의해 자극함으로써 확실하게 높은 확대 배양률로 LAK 세포를 유도ㆍ배양할 수 있었다. 또한, 이 때의 배양에 있어서의 세포는 고농도ㆍ고밀도로, CH-296 에 의해 자극함으로써 이러한 조건하에서도 확실하게 높은 확대 배양률이 얻어지므로, CH-296 의 유효성이 인정되었다.
실시예 44 저혈청 배지 (AIM V) 를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (혈청 농도 3%→1%→0%→0%, 3%→1%→0.1%→0%, 3%→0.5%→0.2%→0.2% (최종 배양액량 약 절반량), 3%→0.5%→0.2%→0.05%)
실시예 43 과 동일한 관점에서 30mL 채혈에 의해 얻어지는 혈장 농도를 고려하여 LAK 세포 배양계에서의 혈청 농도의 영향을 확인하였다.
human AB 혈청 농도는 배양 개시시에는 3% 이고, 배양 4일째에 1% 또는 0.5% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 배지로 세포를 희석하는 군, 배양 7일째에 0%, 0.1% 또는 0.2% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 배지로 세포를 희석하는 군, 배양10일째에 0%, 0.05% 또는 0.2% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 배지로 세포를 희석하는 군을 각각 설정하였다. 하기 표 44-1 에 상기 패턴을 나타낸다.
3% 의 human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 0.33×106cells/mL 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 현탁 후, 실시예 41-(1) 에서 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 플레이트, 또는 항 인간 CD3 항체 및 CH-296 고정화 플레이트에 3mL/웰씩 뿌리고, 최종농도 1000U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 이들 플레이트를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째).
배양 개시 후 4일째에 혈청 농도 패턴 1 및 2 로 배양하는 구분은, 0.05×106cells/mL 가 되도록 1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 12.5㎠ 세포 배양 플라스크로 옮겼다. 혈청 농도 패턴 3 및 4 로 배양하는 구분은, 0.058×106cells/mL 가 되도록 0.5% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 12.5㎠ 세포 배양 플라스크로 옮겼다. 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 7일째에는 혈청 농도 패턴 1 로 배양하는 구분은, 0.28×106cells/mL 가 되도록 human AB 혈청을 함유하지 않은 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 12.6mL), 또한 혈청 농도 패턴 2 로 배양하는 구분은, 0.28×106cells/mL 가 되도록 0.1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하여 (액량 12.6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것으로 각각 옮겼다. 혈청 농도 패턴 3 및 4 로 배양하는 구분은, 0.48×106cells/mL 가 되도록 0.2% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 12.6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것으로 옮겼다. 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 10일째에는 혈청 농도 패턴 1 및 2 로 배양하는 구분은, 0.51×106cells/mL 가 되도록 human AB 혈청을 함유하지 않은 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 12.6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것으로 옮겼다. 혈청 농도 패턴 3 으로 배양하는 구분은, 0.839×106cells/mL 가 되도록 0.2% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 12.6mL), 또한 혈청 농도 패턴 4 로 배양하는 구분은, 0.43×106cells/mL 가 되도록 0.05% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 12.6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것으로 각각 옮겼다. 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 15일째에 트리판 블루 염색법으로 생세포수를 계측하여, 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률로서 산출하였다. 각 실험은 2벌로 실시하였다. 그 평균의 각 결과를 표 44-2 에 나타낸다.
표 44-2 에 나타나는 바와 같이, 각 혈청 농도를 함유한 AIM V 배지를 사용한 LAK 세포 배양에 있어서, 모든 혈청 농도 구분에 있어서, 대조군 (항 CD3 항체에만 의한 자극) 과 비교하여 CH-296 및 항 CD3 항체에 의해 자극한 군에 있어서 높은 확대 배양률이 얻어졌다. 즉, 30mL 채혈을 상정한 혈청 농도에 있어서의 LAK 세포 배양에 있어서, CH-296 및 항 CD3 항체에 의해 자극함으로써, 항 CD3 항체 단독으로 자극하는 것보다도, 확실하게 높은 확대 배양률로 LAK 세포를 유도ㆍ배양할 수 있었다. 또한, 이 때의 배양에 있어서의 세포는 고농도ㆍ고밀도로, CH-296 에 의해 자극함으로써 이러한 조건하에서도 확실하게 높은 확대 배양률이 얻어지므로, CH-296 의 유효성이 인정되었다.
실시예 45 저혈청 배지 (AIM V) 를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 배양).
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 36-(2) 와 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 결과를 표 45 에 나타낸다.
표 45 에 나타나는 바와 같이, 저농도 (1%) 의 혈청을 함유한 배지 (AIM V) 를 사용하여, 세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 세포 배양용 플라스크를 사용한 군에 있어서는, 대조군과 비교하여 LAK 세포의 확대 배양률이 높다. 이 사실로부터 각 피브로넥틴 프래그먼트는 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용하여, 세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 LAK 세포 배양시에 바람직하게 사용되는 것이 분명해졌다.
실시예 46 신선 분리 PBMC 및 자기 혈장 함유 배지를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (0.5% 자기 혈장을 함유하는 AIM V 배지ㆍ세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 배양)
(1) PBMC 의 분리 및 보존
인폼드 콘센트(informed-consent)를 얻은 건강한 정상인 인간 도너로부터 채혈용 주사통으로 30mL 채혈을 실시 후, 채혈액을 500×g 으로 20분간 원심하여, 자기 혈장 및 버피 코트(buffy coat)층을 회수하였다. 회수한 버피 코트층은 PBS 로 희석 후 Ficoll-paque (파르마시아사 제조) 상에 중층하여 500×g 으로 20분간 원심분리하였다. 중간층의 말초혈 단핵세포 (PBMC) 를 피펫으로 회수, 세정하였다. 채취한 신선 분리 PBMC 는 트리판 블루 염색법으로 생세포수를 산출하여 각 실험에 사용하였다.
회수한 자기 혈장은 56℃ 30분 비동화(非動化)후, 800×g 으로 30분간 원심분리하여, 그 상청을 비동화 자기 혈장으로서 사용하였다 (이하 자기 혈장이라고 약기한다).
(2) 항 인간 CD3 항체 및 FN 프래그먼트 고정화
이하의 실험에서 사용하는 배양 기재 (25㎠ 세포 배양용 플라스크) 에 실시예 35-(1) 과 동일하게 항 인간 CD3 항체 및 FN 프래그먼트를 고정화하였다. 사용 직전에는 이들 배양 기재로부터 항체ㆍFNfr 을 함유하는 PBS 를 제거 후, 각 플라스크를 PBS 로 2회, AIM V 배지로 1회 세정하여 각 실험에 사용하였다.
(3) LAK 세포의 유도 및 배양
0.5% 자기 혈장을 함유하는 AIM V (이하 0.5% 자기 혈장 AIM V 로 약기한다) 에 1×106cells/mL 가 되도록 실시예 46-(1) 에서 조제한 신선 분리 PBMC 를 현탁 후, 실시예 46-(2) 에서 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 플라스크, 또는 항 인간 CD3 항체 및 FNfr 고정화 플라스크에 3mL/플라스크씩 세포 현탁액을 넣고, 최종농도 1000U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 이들 플라스크를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째). 배양 개시 후 1일째에는 1000U/mL 의 IL-2 를 함유하는 0.5% 자기 혈장 AIM V 를 7mL/플라스크씩 첨가하였다. 배양 개시 후 4일째에는 배양액을 아무 것도 고정화되어 있지 않은 85㎠ 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백 (옵티사이트 백 또는 X-Fold 백 BAXTER 사 제조) 으로 옮긴 후, 0.5% 자기 혈장 AIM V 를 20mL/백씩 첨가하고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 6일째에는 0.5% 자기 혈장 /AIM V 를 30mL/백씩 첨가하고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 후 8일째에는 배양액의 일부를 적절히 희석한 후, 아무 것도 고정화되어 있지 않은 85㎠ 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백 (옵티사이트 백 또는 X-Fold 백) 으로 옮기고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 11, 13일째에는 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 15일째에 트리판 블루 염색법으로 생세포수를 계측하여, 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률로서 산출하였다. 결과를 표 46 에 나타낸다.
표 46 에 나타나는 바와 같이, 저농도 (0.5%) 의 자기 혈장을 함유한 배지 (AIM V) 를 사용하여, 세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 세포 배양용 플라스크를 사용한 군에 있어서는, 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백의 종류에 의하지 않고 LAK 세포의 확대 배양률이 높다. 이 사실로부터 각 피브로넥틴 프래그먼트는 저농도의 혈장을 함유한 배지를 사용한, 세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 LAK 세포 배양시에 바람직하게 사용되는 것이 분명해졌다.
실시예 47 신선 분리 PBMC 및 자기 혈장 함유 배지를 사용한 LAK 세포 집단 중에 있어서의 CD8 양성 세포비율의 측정 (0.5% 자기 혈장을 함유하는 AIM V 배지ㆍ세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 배양)
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 46-(3) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 배양 개시 15일째에 실시예 4-(2) 와 동일한 방법으로 CD8 양성 세포의 함유율을 측정하였다. 결과를 표 47 에 나타낸다.
표 47 에 나타나는 바와 같이, 저농도 (0.5%) 의 자기 혈장을 함유한 배지 (AIM V) 를 사용하여, 세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 세포 배양용 플라스크를 사용한 군에 있어서는, 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백의 종류에 상관없이 LAK 세포 집단 중의 CD8 세포 양성 비율이 높다. 이 사실로부터 각 피브로넥틴 프래그먼트는 저농도의 혈장을 함유한 배지를 사용한, 세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 LAK 세포 배양시에 바람직하게 사용되는 것이 분명해졌다.
실시예 48 신선 분리 PBMC 및 자기 혈장 함유 배지를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (0.5% 자기 혈장을 함유하는 AIM V 배지ㆍ세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 배양)
(1) 항 인간 CD3 항체 및 FN 프래그먼트 고정화
이하의 실험에서 사용하는 배양 기재 (25㎠ 세포 배양용 플라스크) 에 실시예 35-(1) 과 동일하게 항 인간 CD3 항체 및 FN 프래그먼트를 고정화하였다. 사용 직전에는 이들 배양 기재로부터 항체ㆍFNfr 을 함유하는 PBS 를 제거 후, 각 플라스크를 PBS 로 2회, AIM V 배지로 1회 세정하여 각 실험에 사용하였다.
(2) LAK 세포의 유도 및 배양
0.5% 자기 혈장을 함유하는 AIM V (이하 0.5% 자기 혈장 AIM V 로 약기한다)에 1×106cells/mL 가 되도록 실시예 46-(1) 과 동일한 방법으로 조제한 신선 분리 PBMC 를 현탁 후, 실시예 48-(1) 에서 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 플라스크, 또는 항 인간 CD3 항체 및 FNfr 고정화 플라스크에 3mL/플라스크씩 세포 현탁액을 넣고, 최종농도 1000U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 이들 플라스크를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째). 배양 개시 후 1일째에는 1000U/mL 의 IL-2 를 함유하는 0.5% 자기 혈장 AIM V 를 7mL/플라스크씩 첨가하였다. 배양 개시 후 4일째에는 배양액을 아무 것도 고정화되어 있지 않은 85㎠ 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백 (옵티사이트 백) 으로 옮긴 후, 0.5% 자기 혈장 AIM V 를 20mL/백씩 첨가하고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 6일째에는 0.5% 자기 혈장 /AIM V 를 30mL/백씩 첨가하고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 후 8일째에는 배양액의 일부를 적절히 희석한 후, 아무 것도 고정화되어 있지 않은 85㎠ 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백 (옵티사이트 백) 으로 옮기고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 11, 13일째에는 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다.
또한, 마찬가지로 4일째까지 배양한 배양액을 아무 것도 고정화되어 있지 않은 180㎠ 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백으로 일부 (10mL 중 7mL) 옮긴 후, 0.5% 자기 혈장 AIM V 를 58mL/백씩 첨가하고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 6일째에는 0.5% 자기 혈장/AIM V 를 65mL/백씩 첨가하고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 후 8일째에는 배양액의 일부를 적절히 희석한 후, 아무 것도 고정화되어 있지 않은 180㎠ 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백 (옵티사이트 백) 으로 옮기고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 11, 13일째에는 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 이 때 배양 개시 11일째에 0.5% 자기 혈장/AIM V 를 130mL 첨가하는 계도 설정하였다. 배양 개시 15일째에 트리판 블루 염색법으로 생세포수를 계측하여, 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률로서 산출하였다. 결과를 표 48 에 나타낸다.
표 48 에 나타나는 바와 같이, 저농도 (0.5%) 의 자기 혈장을 함유한 배지 (AIM V) 를 사용하여, 세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 세포 배양용 플라스크를 사용한 군에 있어서는, 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백의 배양 면적ㆍ배양 방법ㆍ최종 배지량에 상관없이 LAK 세포의 확대 배양률이 높다. 이 사실로부터 각 피브로넥틴 프래그먼트는 저농도의 혈장을 함유한 배지를 사용한, 세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 LAK 세포 배양시에 바람직하게 사용되는 것이 분명해졌다.
실시예 49 신선 분리 PBMC 및 자기 혈장 함유 배지를 사용한 LAK 세포 집단 중에 있어서의 CD8 양성 세포 비율의 측정 (0.5% 자기 혈장을 함유하는 AIM V 배지ㆍ세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 배양)
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 48-(2) 와 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 배양 개시 15일째에 실시예 4-(2) 와 동일한 방법으로 CD8 양성 세포의 함유율을 측정하였다. 결과를 표 49 에 나타낸다.
표 49 에 나타나는 바와 같이, 저농도 (0.5%) 의 자기 혈장을 함유한 배지 (AIM V) 를 사용하여, 세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 세포 배양용 플라스크를 사용한 군에 있어서는, 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백의 배양 면적ㆍ배양 방법ㆍ최종 배지량에 상관없이 LAK 세포 집단 중의 CD8 세포 양성 비율이 높다. 이 사실로부터 각 피브로넥틴 프래그먼트는 저농도의 혈장을 함유한 배지를 사용하여 서의 세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 LAK 세포 배양시에 바람직하게 사용되는 것이 분명해졌다.
실시예 50 신선 분리 PBMC 및 자기 혈장 함유 배지를 사용한 LAK 세포 배양배양계에서의 세포 상해 활성의 측정 (0.5% 자기 혈장을 함유하는 AIM V 배지ㆍ세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 배양)
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 46-(3) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다.
(2) 배양한 LAK 세포의 세포 상해 활성의 측정
실시예 25-(2) 와 동일한 방법으로 배양 후 15일째의 LAK 의 세포 상해 활성을 측정하였다. 결과를 표 50 에 나타낸다.
표 50 에 나타나는 바와 같이, 저농도 (0.5%) 의 자기 혈장을 함유한 배지 (AIM V) 를 사용하여, 세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 세포 배양용 플라스크를 사용한 군에 있어서는, 대조군과 비교하여 LAK 세포의 세포 상해 활성이 높다. 이 사실로부터 각 피브로넥틴 프래그먼트는 저농도의 혈장을 함유한 배지를 사용한, 세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 LAK 세포 배양시에 바람직하게 사용되는 것이 분명해졌다.
실시예 51 신선 분리 PBMC 및 자기 혈장 함유 배지를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (0.5% 자기 혈장을 함유하는 AIM V 배지ㆍ세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 배양)
(1) 항 인간 CD3 항체 및 FN 프래그먼트 고정화
이하의 실험에서 사용하는 배양 기재 (25㎠ 세포 배양용 플라스크) 에 실시예 35-(1) 과 동일하게 항 인간 CD3 항체 및 FN 프래그먼트를 고정화하였다. 사용 직전에는 이들 배양 기재로부터 항체ㆍFNfr 을 함유하는 PBS 를 제거 후, 각 플라스크를 PBS 로 2회, AIM V 배지로 1회 세정하여 각 실험에 사용하였다.
(2) LAK 세포의 유도 및 배양
0.5% 자기 혈장을 함유하는 AIM V (이하 0.5% 자기 혈장 AIM V 로 약기한다) 에 5×105cells/mL 가 되도록 (단, 생세포수의 계측은 터크액 (칸토화학사 제조) 으로 실시하였다.) 실시예 46-(1) 과 동일한 방법으로 조제한 신선 분리 PBMC 를 현탁 후, 실시예 51-(1) 에서 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 플라스크, 또는 항 인간 CD3 항체 및 FNfr 고정화 플라스크에 3mL/플라스크씩 세포 현탁액을 넣고, 최종농도 1000U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 이들 플라스크를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째). 배양 개시 후 1일째에는 1000U/mL 의 IL-2 를 함유하는 0.5% 자기 혈장 AIM V 를 7mL/플라스크씩 첨가하였다. 배양 개시 후 4일째에는 배양액을 아무 것도 고정화되어 있지 않은 180㎠ 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백으로 일부 (10mL 중 7mL) 옮긴 후, 0.5% 자기 혈장 AIM V를 58mL/백씩 첨가하고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 6일째에는 0.5% 자기 혈장/AIM V 를 65mL/백씩 첨가하고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 후 8일째에는 배양액의 일부를 적절히 희석한 후, 아무 것도 고정화되어 있지 않은 180㎠ 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백 (옵티사이트 백) 으로 옮기고, 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 11, 13일째에는 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 이 때 배양 개시 11일째에 자기 혈장을 함유하지 않은 AIM V 또는 0.5% 자기 혈장/AIM V 를 130mL 첨가하는 계도 설정하였다. 배양 개시 15일째에 트리판 블루 염색법으로 생세포수를 계측하여, 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률로서 산출하였다. 결과를 표 51 에 나타낸다.
표 51 에 나타나는 바와 같이, 저농도 (0.5%) 의 자기 혈장을 함유한 배지 (AIM V) 를 사용하여, 세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 세포 배양용 플라스크를 사용한 군에 있어서는, 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백의 배양 면적ㆍ배양 방법ㆍ최종 배지량에 상관없이 LAK 세포의 확대 배양률이 높다. 이 사실로부터 각 피브로넥틴 프래그먼트는 저농도의 혈장을 함유한 배지를 사용한, 세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 LAK 세포 배양시에 바람직하게 사용되는 것이 분명해졌다.
실시예 52 신선 분리 PBMC 및 자기 혈장 함유 배지를 사용한 LAK 세포 집단 중에 있어서의 CD8 양성 세포 비율 측정 (0.5% 자기 혈장을 함유하는 AIM V 배지ㆍ세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 배양)
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 51-(2) 와 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 배양 개시 15일째에 실시예 4-(2) 와 동일한 방법으로 CD8 양성 세포의 함유율을 측정하였다. 결과를 표 52 에 나타낸다.
표 52 에 나타나는 바와 같이, 저농도 (0.5%) 의 자기 혈장을 함유한 배지 (AIM V) 를 사용하여, 세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 LAK 세포 유도 초기에 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 세포 배양용 플라스크를 사용한 군에 있어서는, 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백의 배양 면적ㆍ배양 방법ㆍ최종 배지량에 상관없이 LAK 세포 집단 중의 CD8 양성 세포 비율이 높다. 이 사실로부터 각 피브로넥틴 프래그먼트는 저농도의 혈장을 함유한 배지를 사용한, 세포 배양용 플라스크 및 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 조합한 LAK 세포 배양시에 바람직하게 사용되는 것이 분명해졌다.
실시예 53 저혈청 배지 (AIM V) 를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 IL-2 리셉터 (IL-2R) 발현의 유도
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 1-(3) 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다. 이 때 사용하는 배지를 1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 배지로 변경하였다.
(2) LAK 세포에 있어서의 IL-2R 발현율의 측정
실시예 3-(2) 와 동일한 방법으로, IL-2R 발현 양성 세포 함유율을 측정하였다. 결과를 표 53 에 나타낸다. 이러한 표에서는 IL-2R 발현 양성 세포 함유율 (%) 을 IL-2R 발현율 (%) 로 표시한다.
표 53 에 나타나는 바와 같이, 저농도의 혈청을 함유한 AIM V 배지를 사용한, LAK 세포 유도 초기 각 피브로넥틴 프래그먼트를 고정화한 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 배양 중의 LAK 세포 표면 상에서의 IL-2R 발현율을 높게 유도할 수 있었다. 즉 저농도의 혈청을 함유한 배지를 사용하여 LAK 세포를 유도할 때에 피브로넥틴 프래그먼트를 공존시킴으로써, IL-2R 발현율을 높게 하면서 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 54 레트로넥틴 (retronectine) 변이체 단백질의 발현 (CH-296Na)
(1) CH-296Na 발현 벡터의 구축
서열번호 27, 28 의 합성 DNA 프라이머 (각각 Primer CH-296Na1 및 Primer CH-296Na2) 를 사용하여, CH-296 발현 벡터인 pCH102 를 주형으로 PCR 반응을 실시하고, 얻어진 DNA 단편을 NdeI 및 HindIII 에 의해 제한효소 처리하였다. 한편, 국제 공개 제99/27117호 팜플렛의 실시예 5 에 기재된 pCold04 로부터 동 팜플렛의 실시예 4 의 방법에 따라서 조제한 번역 개시 코돈 자리에 NdeI 사이트를 갖는 pCold14ND2 벡터를 제작하였다. pCold14ND2 벡터의 NdeI-HindIII 제한효소 부위에 상기 DNA 단편을 삽입함으로써, 벡터 pCo1d14ND2-CH296 을 얻었다. 다음으로, 피브로넥틴의 세포 결합 도메인의 일부에서 C 말단까지를 코딩하는 cDNA 를 갖는 pLF2435 벡터를 주형으로, 서열번호 28, 29 의 합성 DNA 프라이머 (각각 primer CH-296Na2 및 Primer CH-296Na3) 를 사용하여 PCR 반응을 실시하고, 얻어진 DNA 단편을 BamHI 및 HindIII 에 의해 제한효소 처리하였다. 이렇게 해서 얻어진 DNA 단편을 pCold14ND2-CH296 을 BamHI 및 HindIII 에 의해 제한효소 처리한 것과 라이게이션함으로써 CH-296Na 발현용 벡터를 작성하였다.
(2) CH-296Na 의 발현, 정제
상기 실시예 54-(1) 에서 조제한 pCold14-CH296Na 를 사용하여 대장균 BL21 을 형질 전환하고, 그 형질 전환체를 1.5%(w/v) 농도의 한천을 함유하는 LB 배지 (앰피실린 50㎍/mL 함유) 상에서 생육시켰다. 생육한 콜로니를 30mL 의 LB 액체 배지 (앰피실린 50㎍/mL 함유) 에 식균하여, 37℃ 에서 하룻밤 배양하였다. 전량을 3L 의 동 LB 배지에 식균하고, 37℃ 에서 대수 증식기까지 배양하였다. 또, 이 배양시에는, 5L 용(容) 미니 쟈 퍼먼트 (Jar fermenter: Biott 사 제조) 를 사용하여, 150rpm, Air=1.0L/min 의 조건으로 배양하였다. 상기 배양 후, 15℃ 까지 냉각한 후, IPTG 를 최종농도 1.0mM 가 되도록 첨가하고, 그대로 15℃ 에서 24시간 배양하여 발현 유도시켰다. 그 후 균체를 원심분리에 의해 모으고, 균체 용량의 4배량의 세포 파쇄 용액 [50mM Tris-HCl (pH7.5), 1mM EDTA, 1mM DTT, 1mM PMSF, 50mM NaCl] 에 재현탁하였다. 초음파 파쇄에 의해 균체를 파쇄하고, 원심분리 (11,000rpm 20분) 에 의해 상청의 추출액과 침전으로 분리하였다. 이것을 2L 의 buffer A [50mM Tris-HCl (pH7.5), 50mM NaCl] 로 투석하고, 그 약 40mL 를 사용하여 또 이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제를 다음과 같이 실시하였다.
즉, 수지 용적으로 100mL 분의 SP-Sepharose (아마샴파르마시아사 제조) 를 buffer A 로 포화시킨 칼럼 (φ4㎝ 20㎝) 을 준비하고, 여기에 투석 후의 샘플을 어플라이하였다. 300mL 의 buffer A 로 칼럼을 세정한 후, bufter B [50mM Tris-HCl (pH7.5), 200mM NaCl], buffer C [50mM Tris-HCl (pH7.5), 300mM NaCl], buffer D [50mM Tris-HCl (pH7.5), 500mM NaCl] 의 각 200mL 를 사용하여 순차적으로 칼럼으로부터 용출시키고, 약 100mL 씩 분취하여 획분 1∼6 을 얻었다. 분취한 분획을, 10% SDS-PAGE 에 제공하고, 그 결과, 분자량 약 71kDa 의 목적 단백질을 많이 함유하는 것을 알 수 있었던 획분 2, 3 (약 200mL) 을 회수하여, 2L 의 buffer A 로 투석을 실시하였다.
다음으로, 수지 용적으로 50mL 분의 Q-Sepharose (아마샴파르마시아사 제조) 를 buffer A 로 포화시킨 칼럼 (φ3㎝ 16㎝) 을 준비하고, 여기에 투석 후의 샘플을 어플라이하였다. 칼럼을 200mL 의 buffer A 로 세정한 후, buffer E [50mM Tris-HCl (pH7.5), 140mM NaCl], buffer B, buffer C 의 각 150mL 를 사용하여 순차적으로 칼럼으로부터 용출시키고, 약 100mL 씩 분취하여 획분 1∼5 를 얻었다. 10% SDS-PAGE 에 제공하고, 그 결과, 목적 단백질만을 많이 함유하는 것을 알 수 있었던 획분 1 약 100mL 를 회수하여, 2L 의 buffer F [50mM 탄산나트륨 완충액 pH9.5] 으로 투석을 실시하였다.
그 후, 센트리콘 10 (미리포어사 제조) 으로 약 4배인 25mL 까지 농축하고, 10% SDS-PAGE 에 의해 확인한 결과, 분자량 약 71kDa 의 목적 단백질이 거의 단일 밴드로 검출되어, 이것을 CH-296Na 로 하였다. 그 후, MicroBCA 키트 (피어스사 제조) 를 사용하여 단백질 농도를 측정한 결과, 3.8㎎/mL 였다.
실시예 55 저혈청 배지 (AIM V) 를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (혈청 농도 5%→1%→0%→0%, 5%→1%→0.05%→0.05%, 3%→1%→0.05%→0.05%, 3%→1%→0.1%→0.05%, 1%→1%→0.1%→0.05%)
실시예 43 과 동일한 관점에서 30mL 채혈에 의해 얻어지는 혈장 농도를 고려하여 LAK 세포 배양계에서의 혈청 농도의 영향을 확인하였다.
human AB 혈청 농도가 배양 개시시에 5%, 3% 또는 1% 함유하는 구분을 설정하고, 이후 하기 표 54 에 나타내는 human AB 혈청 농도를 함유하는 AIM V 배지에 의해 희석하는 군을 각각 설정하였다. 또, 하기 표 54 에 나타내는 바와 같이 각 계대째에 계대 농도를 변경한 구분도 각각 설정하였다.
5%, 3% 또는 1% 의 human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 0.33×106cells/mL 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 현탁 후, 실시예 41-(1) 에서 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 플레이트, 또는 항 인간 CD3 항체 및 CH-296 고정화 플레이트에 3mL/웰씩 뿌리고, 최종농도 1000U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 이들 플레이트를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째).
배양 개시 후 4일째에 혈청 농도 패턴 1-1, 2-1 및 3-1 로 배양하는 구분은 0.1×106cells/mL 가 되도록, 혈청 농도 패턴 1-2 및 2-2 로 배양하는 구분은 0.2×106cells/mL 가 되도록, 혈청 농도 패턴 3-2 및 3-3 으로 배양하는 구분은 0.05×106cells/mL 가 되도록, 1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 12.5㎠ 세포 배양 플라스크로 옮겼다. 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 7일째에는 혈청 농도 패턴 1-1 로 배양하는 구분은, 0.321×106cells/mL 가 되도록 human AB 혈청을 함유하지 않은 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 12.6mL), 혈청 농도 패턴 1-2 및 2-1 로 배양하는 구분은, 0.321×106cells/mL 가 되도록 0.05% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 12.6mL), 또한 혈청 농도 패턴 2-2 및 3-1 로 배양하는 구분은 0.321×106cells/mL 가 되도록, 혈청 농도 패턴 3-2 으로 배양하는 구분은 0.417×106cells/mL 가 되도록, 혈청 농도 패턴 3-3 으로 배양하는 구분은 0.23×106cells/mL 가 되도록 각각 0.1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 각각 희석하고 (액량 12.6mL), 각 구분은 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것으로 각각 옮겼다. 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 10일째에는 혈청 농도 패턴 1-1 로 배양하는 구분은, 0.873×106cells/mL 가 되도록 human AB 혈청을 함유하지 않은 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 12.6mL), 혈청 농도 패턴 1-2 로 배양하는 구분은 0.841×106cells/mL 가 되도록, 혈청 농도 패턴 2-1 로 배양하는 구분은 0.746×106cells/mL 가 되도록, 혈청 농도 패턴 2-2 및 3-1 로 배양하는 구분은 0.643×106cells/mL 가 되도록, 혈청 농도 패턴 3-2 로 배양하는 구분은 1.214×106cells/mL 가 되도록, 0.05% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 각각 희석하고 (액량 12.6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것으로 옮겼다. 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 15일째에 트리판 블루 염색법으로 생세포수를 계측하여, 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률로서 산출하였다. 각 실험은 2벌로 실시하였다. 그 평균의 각 결과를 표 55 에 나타낸다.
표 55 에 나타나는 바와 같이, 각 혈청 농도를 함유하는 AIM V 배지를 사용한 LAK 세포 배양에 있어서, 모든 혈청 농도 구분, 그리고 모든 계대 농도 구분에 있어서, 대조군 (항 CD3 항체에만 의한 자극) 과 비교하여 CH-296 및 항 CD3 항체에 의해 자극한 군에 있어서 높은 확대 배양률이 얻어졌다. 즉, 30mL 채혈을 상정한 혈청 농도에 있어서의 LAK 세포 배양에 있어서, CH-296 및 항 CD3 항체에 의해 자극함으로써, 항 CD3 항체 단독으로 자극하는 것보다도, 확실하게 높은 확대 배양률로 LAK 세포를 유도ㆍ배양할 수 있었다. 또한, 이 때의 배양에 있어서의 세포는 고농도ㆍ고밀도로, CH-296 로 자극함으로써 이러한 조건하에서도 확실하게 높은 확대 배양률이 얻어지므로, CH-296 의 유효성이 인정되었다.
실시예 56 저혈청 배지 (AIM V) 를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (IL-2 농도, 100U/mL→150U/mL→150U/mL→300U/mL, 200U/mL→300U/mL→300U/mL→400U/mL, 1000U/mL→500U/mL→500U/mL→500U/mL)
LAK 세포 배양계에서의 IL-2 농도의 영향을 확인하였다.
배양 개시시 및 계대시에 첨가하는 IL-2 농도를 하기 표 56-1 에 나타내는 바와 같이 설정하였다.
3% 의 human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 0.33×106cells/mL 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 현탁 후, 실시예 41-(1) 에서 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 플레이트, 또는 항 인간 CD3 항체 및 CH-296 고정화 플레이트에 3mL/웰씩 뿌리고, 최종농도 100U/mL, 200U/mL 또는 1000U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 이들 플레이트를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째).
배양 개시 후 4일째에 각 구분 모두 0.1×106cells/mL 가 되도록 1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 12.5㎠ 세포 배양 플라스크로 각각 옮겼다. IL-2 농도 패턴 1 에 있어서는 최종농도 150U/mL 가 되도록, IL-2 농도 패턴 2 에 있어서는 300U/mL 가 되도록, IL-2 농도 패턴 3 에 있어서는 500U/mL 가 되도록 각각 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 7일째에는 각 구분 모두 0.262×106cells/mL 가 되도록 0.05% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 12.6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것으로 각각 옮겼다. IL-2 농도 패턴 1 에 있어서는 최종농도 150U/mL 가 되도록, IL-2 농도 패턴 2 에 있어서는 300U/mL 가 되도록, IL-2 농도 패턴 3 에 있어서는 500U/mL 가 되도록 각각 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 10일째에는 각 구분 모두, 0.585×106cells/mL 가 되도록 0.05% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 12.6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것으로 각각 옮겼다. IL-2 농도 패턴 1 에 있어서는 최종농도 300U/mL 가 되도록, IL-2 농도 패턴 2 에 있어서는 400U/mL 가 되도록, IL-2 농도 패턴 3 에 있어서는 500U/mL 가 되도록 각각 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 15일째에 트리판 블루 염색법으로 생세포수를 계측하여, 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률로서 산출하였다. 각 실험은 2벌로 실시하였다. 그 평균의 각 결과를 표 56-2 에 나타낸다.
표 56-2 에 나타나는 바와 같이, 계대시에 각종 IL-2 농도로 배양한 LAK 세포 배양에 있어서, 모든 IL-2 농도 구분에 있어서, 대조군 (항 CD3 항체에만 의한 자극) 과 비교하여 CH-296 및 항 CD3 항체에 의해 자극한 군에 있어서 높은 확대 배양률이 얻어졌다. 즉, IL-2 농도를 변경하더라도, CH-296 및 항 CD3 항체에 의해 자극함으로써, 항 CD3 항체 단독으로 자극하는 것보다 확실하게 높은 확대 배양률로 LAK 세포를 유도ㆍ배양할 수 있었다. 또한, 이 때의 배양에 있어서의 세포는 고농도ㆍ고밀도이고, 또 혈청 농도도 30mL 채혈로 총 배양액량이 10L 인 것을 상정하고 있어, CH-296 으로 자극함으로써 이러한 조건하에서도 확실하게 높은 확대 배양률이 얻어지므로, CH-296 의 유효성이 인정되었다.
실시예 57 저혈청 배지 (AIM V) 를 사용하여 배양한 LAK 세포 집단 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유 비율 (IL-2 농도의 검토)
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 56 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다.
(2) LAK 세포에 있어서의 CD8 양성 세포 집단 함유 비율의 측정
실시예 4-(2) 와 동일한 방법으로 CD8 양성 세포의 함유율을 측정하였다. 결과를 표 57 에 나타낸다.
표 57 에 나타나는 바와 같이, 배양 개시시 및 계대시에 IL-2 농도를 변경한 어떠한 구분에 있어서도, 대조군 (항 CD3 항체에만 의한 자극) 과 비교하여 CH-296 및 항 CD3 항체에 의해 자극한 군에 있어서 배양 중의 LAK 세포 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유율을 높게 유도할 수 있었다. 즉, IL-2 농도를 변경하더라도 CH-296 에 의한 자극에 의해, 확실하게 LAK 세포 중의 CD8 양성 세포의 함유율을 높게 하면서 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
실시예 58 저혈청 배지 (AIM V) 를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (배양 개시 초기 농도의 검토)
30mL 채혈, 최종 배양액량 약 10L 로 상정했을 때의 LAK 세포 배양계에 있어서의 배양 개시시에 세포 초기 농도가 확대 배양률에 미치는 영향을 확인하였다.
배양 개시 초기 세포 농도가 0.083×106cells/mL, 0.167×106cells/mL 또는 0.33×106cells/mL 인 각 구분을 설정하였다.
(1) 항 인간 CD3 항체 및 FN 프래그먼트 고정화
이하의 실험에서 사용하는 배양 기재에 항 인간 CD3 항체 및 FN 프래그먼트를 고정화하였다. 즉 12 웰 세포 배양 플레이트 또는 6 웰 세포 배양 플레이트 (팔콘사 제조) 에 항 인간 CD3 항체 (최종농도 5㎍/mL) 를 함유하는 PBS 를 1.9mL 또는 4.8mL 씩 각각 첨가하였다. 이 때, FN 프래그먼트 첨가군에는 제조예 1 에 기재된 피브로넥틴 프래그먼트 (CH-296) 를 최종농도 25㎍/mL 가 되도록 첨가하였다. 대조로서, CH-296 을 첨가하지 않은 군도 설정하였다.
이들 배양 기재를 실온에서 5시간 인큐베이트 후, 사용시까지 4℃ 에서 보존하였다. 사용 직전에는 이들 배양 기재로부터 항 인간 CD3 항체ㆍCH-296 을 함유하는 PBS 를 흡인 제거 후, 각 웰을 PBS 로 2회, RPMI 배지로 1회 세정하여 각 실험에 사용하였다.
(2) LAK 세포의 유도 및 배양
3% 의 human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 0.083×106cells/mL, 0.167×106cells/mL 또는 0.33×106cells/mL 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 각각 현탁 후, 0.083×106cells/mL 또는 0.167×106cells/mL 로 배양 개시하는 구분은 실시예 58-(1) 에서 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 6 웰 세포 배양 플레이트, 또는 항 인간 CD3 항체 및 CH-296 고정화 6 웰 세포 배양 플레이트에 7.5mL/웰씩, 또한, 0.33×106cells/mL 로 배양 개시하는 구분은 실시예 58-(1) 에서 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 12 웰 세포 배양 플레이트, 또는 항 인간 CD3 항체 및 CH-296 고정화 12 웰 세포 배양 플레이트에 3mL/웰씩 각각 뿌리고, 최종농도 1000U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 이들 플레이트를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째).
배양 개시 후 4일째에 각 구분은, 최대 0.1×106cells/mL 가 되도록 1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 12.5㎠ 세포 배양 플라스크로 옮겼다. 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 7일째에는 0.083×106cells/mL 로 배양 개시한 구분은 0.227×106cells/mL 가 되도록, 0.167×106cells/mL 로 배양 개시한 구분은 0.276×106cells/mL 가 되도록, 또한, 0.33×106cells/mL 로 배양 개시한 구분은 0.465×106cells/mL 가 되도록, 각각 0.05% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 최대 12.6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것으로 각각 옮겼다. 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 10일째에는 0.083×106cells/mL 로 배양 개시한 구분은 0.58×106cells/mL 가 되도록, 0.167×106cells/mL 로 배양 개시한 구분은 0.75×106cells/mL 가 되도록, 또한, 0.33×106cells/mL 로 배양 개시한 구분은 0.79×106cells/mL 가 되도록, 각각 0.05% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 12.6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것으로 각각 옮겼다. 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 15일째에 트리판 블루 염색법으로 생세포수를 계측하여, 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률로서 산출하였다. 각 실험은 2벌로 실시하였다. 그 평균의 각 결과를 표 58 에 나타낸다.
표 58 에 나타나는 바와 같이, 어떤 세포 농도로 배양 개시한 구분에 있어서도, 대조군 (항 CD3 항체에만 의한 자극) 과 비교하여 CH-296 및 항 CD3 항체에 의해 자극한 군에 있어서 높은 확대 배양률이 얻어졌다. 즉, 각종 세포 농도로 배양 개시하더라도 CH-296 및 항 CD3 항체에 의해 자극함으로써, 항 CD3 항체 단독으로 자극하는 것보다 확실히 높은 확대 배양률로 LAK 세포를 유도ㆍ배양할 수 있었다. 또한, 이 때의 배양은 30mL 채혈, 최종 배양액량 10L 를 상정한 것으로, CH-296 에 의해 자극함으로써 이러한 조건하에서도 확실하게 높은 확대 배양률이 얻어지므로, CH-296 의 유효성이 인정되었다. 그리고, 대조군에 있어서는 배양 개시 세포 초기 농도에 의해 확대 배양률이 크게 변동하는 모습이 확인되었지만, CH-296 에 의해 자극한 구분에서는, 배양 개시 세포 초기 농도에 상관없이 안정된 확대 배양률이 얻어졌다.
실시예 59 저혈청 배지 (AIM V) 를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (자극 기간)
LAK 세포 배양계에 있어서, 항 CD3 항체 단독 또는 항 CD3 항체 및 CH-296 에 의한 배양 개시시에 있어서의 자극의 일수가 확대 배양률에 미치는 영향에 관해 확인하였다.
자극 일수로서 2일, 3일 또는 4일의 각 구분을 설정하였다.
3% 의 human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 각 구분 모두 0.33×106cells/mL 가 되도록, 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 각각 현탁 후, 실시예 41-(1) 에서 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 플레이트, 또는 항 인간 CD3 항체 및 CH-296 고정화 플레이트에 3mL/웰씩 뿌리고, 최종농도 1000U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 이들 플레이트를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째).
배양 개시 후 2일째 또는 3일째에 각각 2일 자극 구분, 3일 자극 구분을 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 12 웰 배양 플레이트로 그대로 옮겼다.
배양 개시 후 4일째에 각 구분 모두 0.1×106cells/mL 가 되도록 1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 12.5㎠ 세포 배양 플라스크로 각각 옮겼다. 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 각각 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 7일째에는 각 구분 모두 0.45×106cells/mL 가 되도록 0.05% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 12.6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것으로 각각 옮겼다. 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 각각 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 10일째에는 각 구분 모두 0.6×106cells/mL 가 되도록 0.05% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 12.6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것으로 각각 옮겼다. 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 각각 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 15일째에 트리판 블루 염색법으로 생세포수를 계측하여, 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률로서 산출하였다. 각 실험은 2벌로 실시하였다. 그 평균의 각 결과를 표 59 에 나타낸다.
표 59 에 나타나는 바와 같이, 배양 개시시부터 각종 자극 기간으로 배양한 LAK 세포 배양에 있어서, 어떠한 자극 기간 구분에 있어서도, 대조군 (항 CD3 항체에만 의한 자극) 과 비교하여 CH-296 및 항 CD3 항체에 의해 자극한 군에 있어서 높은 확대 배양률이 얻어졌다. 즉, 자극 기간을 변경하더라도, CH-296 및 항 CD3 항체에 의해 자극함으로써, 항 CD3 항체 단독으로 자극하는 것보다 확실하게 높은 확대 배양률로 LAK 세포를 유도ㆍ배양할 수 있었다. 또한, 이 때의 배양에 있어서의 세포는 고농도ㆍ고밀도이고, 또한 혈청 농도도 30mL 채혈로 총배양액량이 10L 인 것을 상정하고 있어, CH-296 으로 자극함으로써 이러한 조건하에 있어서도 확실하게 높은 확대 배양률이 얻어지므로, CH-296 의 유효성이 인정되었다.
실시예 60 저혈청 배지 (AIM V) 를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (CH-296Na)
FN 프래그먼트로서 CH-296Na 를 사용하였을 때의 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률을 측정하였다.
CH-296Na 는 세포 배양 플레이트에 고정화하는 구분과 그대로 세포 배양액 중에 첨가하는 구분을 설정하였다.
(1) 항 인간 CD3 항체 및 FN 프래그먼트 고정화
이하의 실험에서 사용하는 배양 기재에 항 인간 CD3 항체 및 FN 프래그먼트를 고정화하였다. 즉 12 웰 세포 배양 플레이트에 항 인간 CD3 항체 (최종농도 5㎍/mL) 를 함유하는 PBS 를 1.9mL 씩 각각 첨가하였다. 이 때, FN 프래그먼트 첨가군에는 실시예 54 에 기재된 피브로넥틴 프래그먼트 (CH-296Na) 를 최종농도 28.6㎍/mL 가 되도록 첨가하였다. 대조로서, CH-296Na 를 첨가하지 않은 군도 설정하였다.
이들 배양 기재를 실온에서 5시간 인큐베이트 후, 사용시까지 4℃ 에서 보존하였다. 사용 직전에는 이들 배양 기재로부터 항 인간 CD3 항체ㆍCH-296Na 를 함유하는 PBS 를 흡인 제거 후, 각 웰을 PBS 로 2회, RPMI 배지로 1회 세정하여 각 실험에 사용하였다.
(2) LAK 세포의 유도 및 배양
3% 의 human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 0.33×106cells/mL 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 각각 현탁 후, 실시예 60-(1) 에서 조제한 항 인간 CD3 항체 고정화 세포 배양 플레이트, 또는 항 인간 CD3 항체 및 CH-296Na 고정화 세포 배양 플레이트에 3mL/웰씩 뿌렸다. 또한, CH-296Na 를 세포 배양액 중에 그대로 첨가하는 구분에 있어서는, 항 인간 CD3 항체 고정화 세포 배양 플레이트에 뿌린 세포에 대하여 최종농도 1㎍/mL 가 되도록 CH-296Na 를 첨가하였다. 각각의 구분에 있어서 최종농도 1000U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 이들 플레이트를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째).
배양 개시 후 4일째에, 각 구분 모두 0.1×106cells/mL 가 되도록 1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 12.5㎠ 세포 배양 플라스크로 옮겼다. 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 7일째에는 각 구분 모두 0.5×106cells/mL 가 되도록, 각각 0.05% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 12.6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것으로 각각 옮겼다. 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 10일째에는 각 구분 모두 0.94×106cells/mL 가 되도록, 각각 0.05% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 12.6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것으로 각각 옮겼다. 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 15일째에 트리판 블루 염색법으로 생세포수를 계측하여, 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률로서 산출하였다. 각 실험은 2벌로 실시하였다. 그 평균의 각 결과를 표 60 에 나타낸다.
표 60 에 나타나는 바와 같이, 대조군 (항 CD3 항체에만 의한 자극) 과 비교하여 CH-296Na 를 고정화하거나 또는 용액으로 첨가한 모든 구분에 있어서 높은 확대 배양률이 얻어졌다. 즉, CH-296Na 및 항 CD3 항체에 의해 자극함으로써, 항 CD3 항체 단독으로 자극하는 것보다 확실히 높은 확대 배양률로 LAK 세포를 유도ㆍ배양할 수 있었다. 또한, 이 때의 배양은 30mL 채혈, 최종 배양액량 10L 를 상정한 것으로, CH-296Na 에 의해 자극함으로써 이러한 조건하에서도 확실하게 높은 확대 배양률이 얻어지므로, CH-296Na 의 유효성이 인정되었다.
실시예 61 CH-296 비즈의 작성
CH-296 을 고정화하기 위한 비즈로서, Dynabeas M-450 Epoxy (Dynal 사 제조) 를 사용하였다. 2.8×108개의 Dynabeas M-450 Epoxy 를 0.1M 인산 완충액 (pH7.0) 으로 3회 세정하였다. 세정한 Dynabeas M-450 Epoxy 2.8×108개를 CH-296 140㎍ 을 함유하는 PBS 0.7mL 에 현탁하고, 가볍게 혼합하면서 4℃에서 하룻밤 고정화 반응시켰다. 반응액을 제거하고, 0.1% 의 인간 혈청 알부민 (HSA) 을 함유하는 PBS 0.7mL 로 3회 치환한 후, 4℃ 에서 보존한 것을 CH-296 비즈로 하였다.
또한, CH-296 을 함유시키지 않고 비즈를 동일하게 처리한 것을 대조 비즈로 하였다.
실시예 62 CD3/CH-296 비즈의 제작
CH-296 과 항 인간 CD3 항체를 고정화하기 위한 비즈로서, Dynabeas M-450 Epoxy 를 사용하였다. 4×108개의 Dynabeas M-450 Epoxy 를 0.1M 인산 완충액 (pH7.0) 으로 3회 세정하였다. 세정한 Dynabeas M-450 Epoxy 4×108개를 CH-296 160㎍, 항 인간 CD3 항체 32㎍ 을 함유하는 PBS 1mL 에 현탁하고, 가볍게 혼합하면서 4℃ 에서 하룻밤 고정화 반응시켰다. 반응액을 제거하고, 0.1% 의 인간 혈청 알부민 (HSA) 을 함유하는 PBS 1mL 로 3회 치환한 후, 4℃ 에서 보존한 것을 CD3/CH-296 비즈로 하였다.
실시예 63 저혈청 배지 (AIM V) 를 사용한 LAK 세포 배양계에서의 확대 배양률의 측정 (FNfr 고정화 비즈에 의한 자극)
세포 배양용 담체 (비즈) 에 고정화된 피브로넥틴 프래그먼트 (CH-296) 를 사용한 LAK 세포 배양에 대한 효과를 확인하였다.
항 CD3 항체가 비즈에 고정화되어 있는 CD3 비즈와 아무 것도 고정화되어 있지 않은 대조 비즈에 의해 자극하는 구분 (CD3 비즈 구분), CD3 비즈와 CH-296 이 비즈에 고정화되어 있는 CH-296 비즈에 의해 자극하는 구분 (CD3 비즈＋CH-296 비즈 구분), 항 CD3 항체와 CH-296 이 비즈에 고정화되어 있는 CD3/CH-296 비즈에 의해 자극하는 구분 (CD3/CH-296 비즈 구분) 을 설정하였다.
1% 의 human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 0.33×106cells/mL 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 현탁 후, 아무 것도 고정화되어 있지 않은 12 웰 배양 플레이트에 3mL/웰씩 뿌리고, CD3 비즈 구분은 CD3 비즈 (Dynabeads M-450 CD3 (panT), 베리타스사, DB11113) 를 1×106개/웰, 실시예 61 에서 조제한 대조 비즈를 3.8×106개/웰이 되도록, CD3 비즈＋CH-296 비즈 구분은 CD3 비즈를 1×106개/웰, 실시예 61 에서 조제한 CH-296 비즈를 0.76×106개/웰이 되도록, 또한, CD3/CH-296 비즈 구분은 실시예 62 에서 조제한 CD3/CH-296 비즈를 2.3×106개/웰이 되도록 첨가하였다. 각 웰에는 최종농도 10OOU/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 이들 플레이트를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째).
배양 개시 후 4일째에 각 구분 모두 배양액 중에 포함되는 각 비즈를 마그네틱 스탠드에 의해 제거한 후, 0.07×106cells/mL 가 되도록 1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 12.5㎠ 세포 배양 플라스크로 옮겼다. 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 7일째에는 각 구분 모두 0.25×106cells/mL 가 되도록 1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 각각 희석하고 (액량 12.6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것으로 각각 옮겼다. 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 10일째에는 각 구분 모두 0.685×106cells/mL 가 되도록, 1% human AB 혈청을 함유하는 AIM V 에 의해 희석하고 (액량 12.6mL), 아무 것도 고정화되어 있지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것으로 옮겼다. 각 구분에 있어서 최종농도 500U/mL 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다.
배양 개시 15일째에 트리판 블루 염색법으로 생세포수를 계측하여, 배양 개시시의 세포수와 비교한 확대 배양률로서 산출하였다. 각 실험은 2벌로 실시하였다. 그 평균의 각 결과를 표 61 에 나타낸다.
표 61 에 나타나는 바와 같이, 각 비즈에 의해 자극한 LAK 세포 배양에 있어서, CD3 비즈 구분과 비교하여 CD3 비즈＋CH-296 비즈 구분 및 CD3/CH-296 비즈 구분에 의해 자극한 구분에 있어서 높은 확대 배양률이 얻어졌다. 즉, 세포 배양용 담체로서 비즈를 사용한 LAK 세포 배양에 있어서, CH-296 및 항 CD3 항체를 고정화한 비즈에 의해 자극함으로써, 항 CD3 항체 단독인 비즈에 의해 자극하는 것보다 확실히 높은 확대 배양률로 LAK 세포를 유도ㆍ배양할 수 있었다. 또, 이 때의 배양에 있어서의 세포는 고농도ㆍ고밀도로, CH-296 비즈로 자극함으로써 이러한 조건하에서도 확실히 높은 확대 배양률이 얻어지므로, CH-296 의 유효성이 인정되었다.
실시예 64 저혈청 배지 (AIM V) 를 사용하여 배양한 LAK 세포 집단 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유 비율 (FNfr 고정화 비즈에 의한 자극)
(1) LAK 세포의 유도 및 배양
실시예 63 과 동일한 방법으로 LAK 세포를 유도ㆍ배양하였다.
(2) LAK 세포에 있어서의 CD8 양성 세포 집단 함유 비율의 측정
실시예 4-(2) 와 동일한 방법으로 CD8 양성 세포의 함유율을 측정하였다. 결과를 표 62 에 나타낸다.
표 62 에 나타나는 바와 같이, 각 비즈에 의해 자극한 LAK 세포 배양에 있어서, CD3 비즈 구분과 비교하여 CD3 비즈＋CH-296 비즈 구분 및 CD3/CH-296 비즈 구분에 의해 자극한 구분에 있어서 배양 중의 LAK 세포 중에 있어서의 CD8 양성 세포 함유율을 높게 유도할 수 있었다. 즉, 세포 배양용 담체로서 비즈를 사용한 LAK 세포 배양에 있어서, CH-296 및 항 CD3 항체를 고정화한 비즈에 의해 자극함으로써, 항 CD3 항체 단독인 비즈로 자극하는 것보다 확실하게 LAK 세포 중의 CD8 양성 세포의 함유율을 높게 하면서 LAK 세포를 유도ㆍ배양하는 것이 가능함이 분명해졌다.
서열표 프리텍스트
본 발명의 세포 상해성 림프구의 제조 방법에 의하면, 무혈청ㆍ저혈청 농도 배지를 사용한 경우라도, 확대 배양률이 높고, 세포 상해 활성이 높게 유지되며, IL-2R 의 발현량이 유의하게 상승하고, CD8 양성 세포의 비율이 향상된 세포 상해성 림프구가 얻어진다. 당해 림프구는, 예를 들어 양자 면역 요법에 바람직하게 사용된다. 따라서, 본 발명의 방법은, 의료 분야에 있어서 막대한 공헌이 기대된다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (1)
- 배지 중에 있어서의 혈청 및 혈장의 총함유 농도가 0용량% 이상 3용량% 이하인 배지를 사용하여, 서열표의 서열번호 11, 13 및 25 로 나타내는 아미노산 서열에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 재조합 피브로넥틴 프래그먼트 또는 그들의 혼합물의 존재하에서, 세포 상해성 림프구로의 분화능을 갖는 전구세포를 배양하고, 세포 상해성 림프구의 유도, 유지 및 확대 배양 중에서 선택되는 적어도 하나를 실시하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 상해성 림프구의 제조 방법으로서, 상기 전구세포가 항원 제시 세포의 비존재하에 배양되는 세포 상해성 림프구의 제조 방법.
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