JP2002507387A

JP2002507387A - 乳癌の免疫療法および診断のための化合物ならびにそれらの使用のための方法

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Publication number: JP2002507387A
Application number: JP2000526543A
Authority: JP
Inventors: スティーブンジー．リード，; ジャンチュンクー，
Original assignee: コリクサコーポレイション
Priority date: 1997-12-24
Filing date: 1998-12-22
Publication date: 2002-03-12
Also published as: WO1999033869A3; EP1992640A1; EP1042360A2; CA2316397A1; WO1999033869A2; AU2010699A

Abstract

(57)【要約】乳癌の処置および診断のための化合物および方法が提供される。本願化合物は、乳房腫瘍タンパク質の少なくとも一部を含むポリペプチドを含む。このようなポリペプチドを含む、乳癌の免疫療法のためのワクチンおよび薬学的組成物、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子もまた、本願ポリペプチドを調製するためのポリヌクレオチド分子とともに提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、一般に、乳癌の処置および診断のための組成物および方法に関する
。本発明は、より詳細には、乳房腫瘍組織で優先的に発現されるタンパク質の一
部を少なくとも一部含むポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド分子に関する。そのようなポリペプチドは、乳癌の処置の
ためのワクチンおよび薬学的組成物において使用され得る。さらに、そのような
ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、乳癌の免疫診断において使用され得る
。

【０００２】（発明の背景）乳癌は、米国および世界中で、女性についての重大な健康問題である。その疾
患の検出および処置において、進歩が成されてきたが、乳癌は、女性の癌関係の
第二番目の死因のままであり、毎年、米国で１８０，０００人を超える女性が罹
患している。北米の女性に関して、生存中の乳癌に罹る可能性は、現在８人に１
人である。

【０００３】現在のところ利用可能である、乳癌の予防または処置のためのワクチンまたは
他の一般に優れた方法は存在しない。その疾患の対応は、現在のところ、早期の
診断（慣用的な乳房のスクリーニング手順を通じて）および積極的な処置の組み
合わせに依存し、その処置は、手術、放射線治療、化学療法、およびホルモン療
法のような、１以上の種々の処置を含み得る。特定の乳癌の処置の過程は、しば
しば、特異的な腫瘍マーカーの分析を含む、種々の予後のパラメーターに基づい
て選択される。例えば、Ｐｏｒｔｅｒ−ＪｏｒｄａｎおよびＬｉｐｐｍａｎ、Ｂ
ｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒ８：７３−１００（１９９４）を参照のこと。しか
し、確立されたマーカーの使用は、しばしば、解釈が難しい結果を導き、そして
乳癌患者において観察される高い死亡率は、その疾患の処置、診断、および予防
において、改善が必要とされることを示している。

【０００４】従って、当該分野において、乳癌の治療および診断の改善された方法の必要性
が存在する。本発明は、これらの必要性を満たし、さらに他の関係する利点を提
供する。

【０００５】（発明の要旨）本発明は、乳癌の免疫治療のための化合物および方法を提供する。１つの局面
において、単離されたポリペプチドを提供し、それは、乳房腫瘍タンパク質また
は保存的置換および／または改変においてのみ異なるそのタンパク質の改変体の
少なくとも免疫原性部分を含む。ここで、乳房腫瘍タンパク質は、以下からなる
群より選択される部分配列を有するポリヌクレオチド分子によりコードされるア
ミノ酸配列を含む；（ａ）配列番号３、１０、１７、２４、４５〜５２、および
５５〜６７，７２，７３、および８９〜９４に示されるヌクレオチド配列、（ｂ
）それらのヌクレオチド配列の相補体、および（ｃ）中程度のストリンジェント
条件下で、（ａ）または（ｂ）の配列にハイブリダイズする配列。

【０００６】関連する局面において、上記のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌ
クレオチド分子を提供する。特定の実施態様において、そのようなポリヌクレオ
チド分子は、配列番号３、１０、１７、２４、４５〜５２、および５５〜６７，
７２，７３、および８９〜９４に提供される部分配列を有する。本発明はさらに
、上記のポリヌクレオチド分子を含む発現ベクター、およびそのような発現ベク
ターで形質転換した、またはトランスフェクトした宿主細胞を提供する。好まし
い実施態様において、その宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、および哺乳動物細
胞からなる群より選択される。

【０００７】別の局面において、本発明は、第一および第二の本発明のポリペプチドを含む
融合タンパク質、あるいは、本発明のポリペプチドおよび公知の乳房抗原を含む
融合タンパク質を提供する。

【０００８】本発明はまた、少なくとも１つの上記のポリペプチド、またはそのようなポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド分子、および生理学的に受容可能なキャ
リアを含む薬学的組成物を、少なくとも１以上のそのようなポリペプチドまたは
ポリヌクレオチド分子を非特異的な免疫応答エンハンサーと組み合わせて含むワ
クチンと共に提供する。１以上の上記の融合タンパク質を含む、薬学的組成物お
よびワクチンもまた提供する。

【０００９】関連する局面において、少なくとも１つのポリペプチドおよび生理学的に受容
可能なキャリアを含む、乳癌処置のための薬学的組成物を提供する。ここで、そ
のポリペプチドは、乳房腫瘍タンパク質またはその改変体の免疫原性部分を含み
、その乳房腫瘍タンパク質は、以下からなる群より選択される部分配列を有する
ポリヌクレオチド分子によりコードされる；（ａ）配列番号１、２、４〜９、１
１〜１６、１８〜２３、２５〜４４，５３、５４、６８〜７１、および７４〜８
８に示されるヌクレオチド配列、（ｂ）それらのヌクレオチドの相補体、および
（ｃ）中程度のストリンジェント条件下で、（ａ）または（ｂ）の配列にハイブ
リダイズする配列。本発明はまた、そのようなポリペプチドを非特異的な免疫応
答エンハンサーと組み合わて含む、乳癌の処置のためのワクチンを、配列番号１
、２、４〜９、１１〜１６、１８〜２３、２５〜４４，５３、５４、６８〜７１
、および７４〜８８に提供される部分配列を有する、少なくとも１つのポリヌク
レオチド分子を含む薬学的組成物およびワクチンと共に提供する。

【００１０】さらに別の局面において、患者における乳癌の発生を阻害するための方法を提
供し、それは、有効量の少なくとも１つの上記の薬学的組成物および／またはワ
クチンを投与する工程を含む。

【００１１】本発明はまた、乳癌の免疫診断の方法を、そのような方法において使用するキ
ットと共に提供する。本発明の１つの特定の局面において、患者内の乳癌を検出
する方法を提供し、それは、以下を含む；（ａ）患者から採取した生物学的サン
プルを、本発明のポリペプチドの１つに結合し得る、結合剤と接触させる工程；
および（ｂ）そのサンプルにおいて、結合剤に結合したタンパク質またはポリペ
プチドを検出する工程。好ましい実施態様において、結合剤は抗体であり、最も
好ましくは、モノクローナル抗体である。

【００１２】関連する局面において、患者内の乳癌の進行をモニターするための方法を提供
し、それは、以下を含む；（ａ）患者から採取した生物学的サンプルを、上記の
ポリペプチドの１つに結合し得る、結合剤と接触させる工程；（ｂ）そのサンプ
ルにおいて、その結合剤に結合するタンパク質またはポリペプチドの量を決定す
る工程；（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程；および工程（ｂ）およ
び（ｃ）で検出されたポリペプチドの量を比較する工程。

【００１３】関係する局面において、本発明は、本発明のポリペプチドに結合する抗体、好
ましくはモノクローナル抗体、ならびにそのような抗体を含む診断キット、およ
び乳癌の発生を阻害するためにそのような抗体を使用する方法を提供する。

【００１４】本発明はさらに、乳癌を検出する方法を提供し、それは以下を含む；（ａ）患
者から生物学的サンプルを採取する工程；（ｂ）そのサンプルを、ポリメラーゼ
連鎖反応において第一および第二のオリゴヌクレオチドプライマーと接触する工
程で、そのオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つは、上記のポリペプ
チドの１つをコードするＤＮＡ分子に特異的である、工程；および（ｃ）第一お
よび第二のオリゴヌクレオチドプライマーの存在下で増幅するＤＮＡ配列を、そ
のサンプルにおいて検出する工程。好ましい実施態様において、少なくとも１つ
のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１〜９４からなる群より選択され
る部分配列を有するＤＮＡ分子の、少なくとも約１０の連続したヌクレオチドを
含む。

【００１５】さらなる局面において、本発明は、患者内の乳癌を検出する方法を提供し、そ
れは以下を含む；（ａ）患者から生物学的サンプルを採取する工程；（ｂ）その
サンプルを、上記のポリペプチドの１つをコードするポリヌクレオチド分子に特
異的なオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程；および（ｃ）そのオリゴ
ヌクレオチドプローブにハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を、そのサン
プルにおいて検出する工程。好ましくは、そのオリゴヌクレオチドプローブは、
配列番号１〜９４からなる群より選択される部分配列を有するＤＮＡ分子の、少
なくとも約１５の連続したヌクレオチドを含む。

【００１６】関係する局面において、上記のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー
を含む診断キットを提供する。

【００１７】本発明のこれらの、または他の局面は、以下の詳細な説明を参照して明らかと
なる。本明細書に記載される全ての参考文献は、各々が個々に援用されるように
、その全体が参考として本明細書に援用される。

【００１８】（発明の詳細な説明）上記のように、本発明は、一般的に、乳癌の免疫治療および診断のための組成
物および方法に関する。本発明の組成物は、一般的に、乳房腫瘍タンパク質の少
なくとも一部分を含む単離されたポリペプチドである。本発明のポリペプチドに
結合する分子（例えば、抗体またはそのフラグメント）もまた、本発明内に含ま
れる。このような分子は、本明細書中で「結合因子」といわれる。

【００１９】特に、本発明は、ヒト乳房腫瘍タンパク質の少なくとも一部分を含むポリペプ
チド、またはその改変体を開示する。ここで、乳房腫瘍タンパク質は、以下から
なる群より選択される配列を含むポリヌクレオチド分子によってコードされるア
ミノ酸配列を含む：配列番号１〜９４に記載されるヌクレオチド配列、このヌク
レオチド配列の相補物、およびそれらの改変体。本明細書中で使用される用語「
ポリペプチド」は、任意の長さのアミノ酸鎖を含み、これらには、全長タンパク
質が含まれ、ここでアミノ酸残基は、共有ペプチド結合によって連結される。従
って、上記の乳房タンパク質のうちの１つの一部分を含むポリペプチドは、完全
にこの部分から構成されてもよいし、またはこの部分は、さらなる配列を含むよ
り大きなポリペプチド内に存在してもよい。このさらなる配列は、天然タンパク
質由来であってもよいし、異種であってもよく、このような配列は、免疫反応性
および／または抗原性であってもよい。

【００２０】本明細書中で記載される、ヒト乳房腫瘍タンパク質の「免疫原性部分」は、乳
癌に罹患する患者における免疫応答を惹起させ得る部分であり、そして乳癌患者
由来の血清に存在する抗体に結合する。このような免疫原性部分は、一般的に、
少なくとも約５つのアミノ酸残基、より好ましくは、少なくとも約１０のアミノ
酸残基、そして最も好ましくは、少なくとも約２０のアミノ酸残基を含む。本明
細書中に記載されるタンパク質の免疫原性部分は、抗体結合アッセイで同定され
得る。このようなアッセイは、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒ，ＮＹ，１９８８に記載されるように、一般的に当業者に公知の任意の種
々の手段によって行われ得る。例えば、ポリペプチドは、（以下に記載のように
）固体支持体上に固定化され得、そして固定化されたポリペプチドに血清中の抗
体が結合されるように、患者血清と接触される。次いで、非結合血清は取り除か
れ得、そして結合抗体は、例えば、¹²⁵Ｉ標識プロテインＡを用いて検出され得る。あるいは、ポリペプチドは、乳癌患者の血中または他の体液中のポリペプチ
ドを検出することに使用するためのモノクローナル抗体およびポリクローナル抗
体を生成するために使用され得る。公知の配列の抗原の免疫原性部分を調製およ
び同定する方法は、当該分野で周知である、そしてこれらの方法としては、Ｐａ
ｕｌ，ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｒａｖｅｎ
Ｐｒｅｓｓ，１９９３，第２４３〜２４７頁に要約される方法が挙げられる。

【００２１】本明細書中で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオ
チド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味し、
そしてこれらには、ＤＮＡ分子および対応するＲＮＡ分子（ＨｎＲＮＡおよびｍ
ＲＮＡ分子、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む）が挙げられ、そして
ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および組換えＤＮＡ、ならびに全体的または部分的に
合成されたポリヌクレオチドが含まれる。ＨｎＲＮＡ分子はイントロンを含み、
そして一般的に１対１の様式でＤＮＡ分子に対応する。ｍＲＮＡ分子は、ＨｎＲ
ＮＡおよびＤＮＡ分子に対応するが、これらからは、イントロンは除外される。
ポリヌクレオチドは、遺伝子全体から構成されてもよいし、そのいずれかの部分
から構成されてもよい。作動可能なアンチセンスポリヌクレオチドは、対応する
ポリヌクレオチドのフラグメントを含み得、そのために「ポリヌクレオチド」の
定義は、このような全ての作動可能なアンチセンスフラグメントを含む。

【００２２】本発明の組成物および方法はまた、上記のポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ドの改変体を含む。本明細書中で使用されるポリペプチド「改変体」は、このポ
リペプチド治療的特性、抗原性特性、および／または免疫原性特性が保持される
ように、保存的置換および／または改変においてのみ、記載されるポリペプチド
とは異なるポリペプチドである。好ましい実施態様において、改変ポリペプチド
は、５以下のアミノ酸の置換、欠失または付加によって同定される配列とは異な
る。このような改変体は、一般的に、上記ポリペプチド配列のうちの１つを改変
し、そして例えば、本明細書中に記載される代表的な手順を用いて改変されたポ
リペプチドの抗原性特性を評価することによって同定され得る。ポリペプチド改
変体は、同定されたポリペプチドに対して、好ましくは、少なくとも約７０％の
同一性、より好ましくは、少なくとも約９０％の同一性、そして最も好ましくは
、少なくとも約９５％の同一性（以下に記載されるように決定される）を示す。

【００２３】本明細書中で記載される「保存的置換」は、アミノ酸が、類似の特性を示す別
のアミノ酸と置換されている置換をいい、そのために、ペプチド化学の当業者は
実質的に変化されないポリペプチドの二次構造および疎水親水指数特性を予測す
る。一般的に、以下のアミノ酸群は、保存的変更を示す：（１）ａｌａ、ｐｒｏ
、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、
ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐ
ｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、
ｈｉｓ。

【００２４】改変体はまた、あるいは、他の改変を含み得、これらは、ポリペプチドの抗原
性性質、二次構造および疎水親水指数の性質に対して最小の影響を有するアミノ
酸の欠失または付加を含む。例えば、ポリペプチドは、タンパク質のＮ末端でシ
グナル（またはリーダー）配列と結合され得、このシグナル（またはリーダー）
配列は、翻訳と同時にまたは翻訳後にタンパク質の輸送に指向する。このポリペ
プチドはまた、ポリペプチドの合成、精製もしくは同定を容易にするため（例え
ば、ポリＨｉｓ）に、または固体支持体へのポリペプチドの結合を増大するため
に、リンカーまたはその他の配列と結合され得る。例えば、ポリペプチドは、イ
ムノグロブリンＦｃ領域に結合され得る。

【００２５】ヌクレオチド「改変体」は、１つ以上のヌクレオチド欠失、置換、または付加
を有することにおいて記載されたヌクレオチド配列とは異なる配列である。この
ような改変は、標準的な変異誘発技術（例えば、Ａｄｅｌｍａｎら（ＤＮＡ２
：１８３，１９８３）に教示される、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的変異
誘発）を使用して、容易に導入され得る。ヌクレオチド改変体は、天然に存在す
る対立遺伝子改変体または天然には存在しない改変体であり得る。改変ヌクレオ
チド配列は、好ましくは、記載された配列に対して、少なくとも約７０％、より
好ましくは、少なくとも約８０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９０％
の同一性（以下に記載されるように決定される）を示す。

【００２６】本発明によって提供される抗原は、本明細書中に詳細に記載される１つ以上の
ＤＮＡ配列に対して実質的に相同なＤＮＡ配列によってコードされる改変体を含
む。本明細書中で使用される「実質的な相同性」とは、中程度にストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ配列をいう。適切な、中程度にストリ
ンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭＥＤＴＡ（
ｐＨ８．０）の溶液中での予備洗浄；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣ、一晩、また
は交叉種（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ）相同性の事象においては、０．５×Ｓ
ＳＣで４５℃でのハイブリダイゼーション；次いで０．１％ＳＤＳを含む、２
×、０．５×、および０．２×ＳＳＣで、６５℃で２０分、それぞれ２回洗浄を
含む。このようなハイブリダイズするＤＮＡ配列はまた、本発明の範囲内である
。コード縮重に起因して、ハイブリダイズするＤＮＡ配列によってコードされる
免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も同様に含まれる。

【００２７】２つのヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、以下に記載のように最大
の対応でアラインするときに２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の
配列が同じである場合、「同一」であるといわれる。２つの配列間の比較は、代
表的には、比較ウインドウによって配列を比較して、配列類似性の局所的領域を
同定および比較することによって行われる。本明細書中で使用される「比較ウイ
ンドウ」とは、少なくとも約２０の連続する位置、通常は３０〜約７５、より好
ましくは、４０〜約５０の連続する位置のセグメントをいう。ここで、配列は、
２つの配列が必要に応じてアラインされた後、同じ数の連続する位置の参照配列
に対して比較され得る。

【００２８】比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅｓｕｉｔ
ｅｏｆｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｓｏｆｔｗａｒｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ
，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用い、デ
フォルトパラメーターを使用して行われ得る。このプログラムは、以下の参考文
献に記載されるいくつかのアラインメントスキームを含む：

【００２９】

【表１】好ましくは、「配列同一性のパーセント割合」は、少なくとも２０の位置の比
較ウインドウによって、２つの最適にアラインされた配列を比較することによっ
て決定される。ここで、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の部分は、２
つの配列の最適なアラインメントについて参照配列（これは、付加または欠失を
有さない）と比較して、２０％以下、通常は５〜１５％、または１０〜１２％の
付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセント割合は、位
置の数（ここで、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列で生じて、マ
ッチした位置の数を得る）を決定し、参照配列中の位置の総数（すなわち、ウイ
ンドウサイズ）でマッチした位置の数を割り、そして結果に１００をかけて配列
同一性のパーセント割合を得ることによって計算される。

【００３０】本明細書に記載されるヌクレオチド配列をコードする遺伝子の対立遺伝子もま
た本発明の範囲に含まれる。本明細書に使用される「対立遺伝子」または「対立
遺伝子の配列」は、核酸配列における少なくとも１つの変異に起因し得る、遺伝
子の代替形態である。対立遺伝子は、構造または機能が変化しても変化しなくと
もよい、変化したｍＲＮＡまたはポリペプチドを生じ得る。任意の所定の遺伝子
は、対立遺伝子形態を有さないか、１つ以上の対立遺伝子形態を有し得る。対立
遺伝子を生じさせる通常の変異的な変化は、一般的に、ヌクレオチドの自然な欠
失、付加、または置換に起因する。これらの変化のそれぞれの型は、単独でまた
は他との組み合わせで、所定の配列中に１回以上生じ得る。

【００３１】あるいは、免疫反応性特性を有する乳房腫瘍ポリペプチドについては、改変体
は、上述のポリペプチドのうちの１つのアミノ酸配列を改変し、そして改変され
たポリペプチドの免疫反応性を評価することにより同定され得る。診断用結合薬
剤を産生するために有用な乳房腫瘍ポリペプチドについては、改変体は、乳癌の
存在または不在を検出する抗体を産生する能力について、改変されたポリペプチ
ドを評価することにより同定され得る。このような改変された配列は、例えば、
本明細書に記載される代表的な手順を用いて、調製および試験され得る。

【００３２】本発明の乳房腫瘍タンパク質およびそのようなタンパク質をコードするポリヌ
クレオチド分子が、当該分野で周知である種々の方法のいずれかを用いて乳房腫
瘍組織から単離され得る。本発明の乳房腫瘍タンパク質の１つをコードする遺伝
子（またはその一部）に対応するポリヌクレオチド配列が、以下で詳細に記載さ
れる差し引き（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）技術を用いて乳房腫瘍ｃＤＮＡライブ
ラリーから単離され得る。このようなＤＮＡ配列の例が、配列番号１〜９４にお
いて提供される。このようにして、得られた部分的ポリヌクレオチド配列は、当
該分野で周知の技術を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における、全長ポ
リヌクレオチド配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計する
ために用いられ得る（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒＳｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、５１：２６３、１９８７；Ｅｒ
ｌｉｃｈ編、ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ、
ＮＹ、１９８９を参照のこと）。一旦、ポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド配列が得られると、上述の改変のいずれかが、例えば、Ａｄｅｌｍａｎら
（ＤＮＡ、２：１８３、１９８３）によって教示されるように、オリゴヌクレオ
チド指定部位特異的変異誘発のような標準的な変異誘発技術を用いて容易に導入
され得る。

【００３３】本明細書に開示される乳房腫瘍ポリペプチドはまた、合成手段または組換え手
段により作製され得る。約１００より少ないアミノ酸、および一般的に、約５０
より少ないアミノ酸を有する合成ポリペプチドが、当業者に周知の技術を用いて
作製され得る。例えば、このようなポリペプチドは、伸長しているアミノ酸鎖に
アミノ酸が順次加えられるＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法（例えば、Ｍｅｒｒ
ｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１４６、１９
６３を参照のこと）のような、商業的に利用可能な固相技術のいずれかを用いて
合成され得る。ポリペプチドの自動合成装置は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ａ
ｐｐｌｉｅｄＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓＤｉｖｉｓｉｏｎ（ＦｏｓｔｅｒＣｉ
ｔｙ、ＣＡ）のような供給業者から市販されており、そして製造業者の使用説明
書に従って操作し得る。

【００３４】あるいは、上述のポリペプチドのいずれかは、ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド配列を発現ベクター中に挿入すること、および適切な宿主において
、このタンパク質を発現することによって、組換えにより産生され得る。当業者
に公知である種々の発現ベクターのいずれかが、本発明の組換えポリペプチドを
発現するために用いられ得る。発現は、組換えポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド分子を含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた任
意の適切な宿主細胞において達成され得る。適切な宿主細胞は、原核生物、酵母
および高等真核生物細胞を含む。好ましくは、用いられる宿主細胞は、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ、酵母またはＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞株である。この手法により発
現されるポリヌクレオチド配列は、天然に生じるポリペプチド、天然に生じるポ
リペプチドの一部、またはそれらの他の改変体をコードし得る。

【００３５】一般的に、調製方法に関係なく、本明細書に開示されるポリペプチドは、単離
された実質的に純粋な形態で調製される（すなわち、ポリペプチドは、アミノ酸
組成および一次配列分析によって決定した場合に均質である）。好ましくは、こ
のポリペプチドは、少なくとも約９０％純粋であり、より好ましくは、少なくと
も約９５％純粋であり、そして最も好ましくは、少なくとも約９９％純粋である
。以下にさらに詳細に記載される、特定の好ましい実施態様において、実質的に
純粋なポリペプチドは、本明細書に開示された１つ以上の方法において使用する
ための薬学的組成物またはワクチンに組み入れられる。

【００３６】関連した局面において、本発明は、本発明の第一および第二のポリペプチドを
含む融合タンパク質、またはあるいは本発明のポリペプチドおよび公知の乳房腫
瘍抗原を含む融合タンパク質を、このような融合タンパク質の改変体とともに提
供する。

【００３７】本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、第一および第
二のポリヌクレオチドをコードする別々のポリヌクレオチド配列を適切な発現ベ
クター中へ組み立てるために公知の組換えＤＮＡ技術を用いて構築される。第一
のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の３’末端は、配列のリーデ
ィングフレームが第一および第二のポリペプチドの両方の生物学的活性を保持す
る単一の融合タンパク質への２つのＤＮＡ配列のｍＲＮＡ翻訳が可能となるよう
に組み合わせて、第二のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’
末端にペプチドリンカーと共にまたはペプチドリンカーなしで連結される。

【００３８】ペプチドリンカー配列は、各ポリペプチドがその二次構造および三次構造へと
折り畳まれるのを保証するために十分な距離によって第一および第二のポリペプ
チドを隔てるために用いられ得る。このようなペプチドリンカー配列は、当該分
野で周知の標準的な技術を用いて融合タンパク質中に取り込まれる。適切なペプ
チドリンカー配列は、以下の要素に基づいて選択され得る：（１）フレキシブル
な伸長したコンホメーションを採る能力；（２）第一および第二のポリペプチド
上の機能的なエピトープと相互作用し得る二次構造を採ることができないこと；
および（３）ポリペプチドの機能的なエピトープと反応し得る疎水性または荷電
した残基の欠損。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅ
ｒ残基を含む。ＴｈｒおよびＡｌａのような中性に近い他のアミノ酸もまた、リ
ンカー配列に用いられ得る。リンカーとして有用に用いられ得るアミノ酸配列は
、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ４０：３９−４６、１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：８２５８−８２６２
、１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１
８０号に開示されるアミノ酸配列を含む。リンカー配列は、１から約５０アミノ
酸長であり得る。ペプチド配列は、第一および第二のポリペプチドが、機能的ド
メインを分離するため、および立体的な干渉を防ぐために用いられ得る非必須Ｎ
末端アミノ酸領域を有する場合、必要とされない。

【００３９】連結されたポリヌクレオチド配列は、適切な転写または翻訳調節エレメントに
作動可能に連結される。ポリヌクレオチドの発現を担う調節エレメントは、第一
のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’側にのみ位置する。同
様に、翻訳および転写終結シグナルを終了するために必要とされる停止コドンは
、第二のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の３’側にのみ存在す
る。

【００４０】本発明のポリペプチドを関係のない免疫原性タンパク質とともに含む融合タン
パク質もまた提供される。好ましくは、免疫原性タンパク質は、リコール（ｒｅ
ｃａｌｌ）応答を惹起し得る。このようなタンパク質の例としては、破傷風タン
パク質、結核タンパク質および肝炎タンパク質が挙げられる（例えば、Ｓｔｏｕ
ｔｅら、ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３６：８６−９１（１９９７）を
参照のこと）。

【００４１】乳房腫瘍タンパク質の免疫原性部分を含む本発明のポリペプチドは、一般的に
、乳癌の免疫治療に用いられ得、ここで、このポリペプチドは、乳房腫瘍細胞に
対する患者自身の免疫応答を刺激する。さらなる側面において、本発明は、配列
番号１〜９４において提供される配列を有するポリヌクレオチド分子によってコ
ードされる１つ以上の免疫応答性ポリペプチド（または、１つ以上のそのような
ポリペプチドおよび／もしくはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドを含む融合タンパク質）を患者における乳癌の免疫治療のために用いるた
めの方法を提供する。本明細書に用いられる、「患者」は、任意の温血動物、好
ましくはヒトをいう。患者は、疾患に罹患していてもよいし、検出可能な疾患を
有さなくともよい。従って、上述の免疫応答性ポリペプチド（または、融合タン
パク質もしくはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子）は
、乳癌を処置するために用いられ得るか、または乳癌の進行を阻害するために用
いられ得る。ポリペプチドは、原発性腫瘍の外科的除去および／または放射線治
療および従来の化学療法薬物の投与による処置に先だってか、またはそれに続い
てかのいずれかで投与され得る。

【００４２】これらの側面において、ポリペプチドまたは融合タンパク質は、一般的に、薬
学的組成物および／またはワクチン内に存在する。薬学的組成物は、上述の配列
のうちの１つ以上（または、それらの変異体）をそれぞれ含み得る１つ以上のポ
リペプチド、および生理的に受容可能なキャリアを含み得る。ワクチンは、１つ
以上のこのようなポリペプチドおよび非特異的免疫応答エンハンサーを含み得、
ここで、この非特異的免疫応答エンハンサーは、外来抗原に対する免疫応答を誘
発または増強し得る。非特異的免疫応答エンハンサーの例としては、アジュバン
ト、生体分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ガラクチド（ｐｏｌｙｌａｃ
ｔｉｃｇａｌａｃｔｉｄｅ））およびリポソーム（この中に、ポリペプチドが
取り込まれる）が挙げられる。薬学的組成物およびワクチンはまた、組み合わせ
ポリペプチド（すなわち、複数のエピトープを含む単一ポリペプチド）中に組込
まれて、または別々のポリペプチド内に存在してのいずれかで、乳房腫瘍抗原の
他のエピトープを含み得る。

【００４３】あるいは、薬学的組成物またはワクチンは、上記の１つ以上のポリぺプチドを
コードするポリヌクレオチドを含み得るため、ポリぺプチドはインサイチュで産
生される。このような薬学的組成物およびワクチンにおいて、ポリヌクレオチド
は、核酸発現系、細菌およびウイルス発現系を含む、当業者に公知の種々の送達
系のいずれかの中に存在し得る。適切な核酸発現系は、患者における発現に必要
なポリヌクレオチド配列（例えば、適切なプロモーター）を含む。細菌送達系は
、細胞表面に存在する乳房腫瘍細胞抗原のエピトープを発現する細菌（例えば、
Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ）の投与を包含する。好
ましい実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、ウイルス発現系（例えば、
痘疹または他のポックスウイルス、レトロウイルス、あるいはアデノウイルス）
を使用して導入され得、この系は、非病原性（欠損）の、複製コンピテント細胞
の使用を含み得る。適切な系は、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら，ＰＮＡＳ
８６：３１７−３２１，１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６−１０３，１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら，Ｖａｃｃ
ｉｎｅ８：１７−２１，１９９０；米国特許第４，６０３，１１２号、同第４
，７６９，３３０号、および同第５，０１７，４８７号；ＷＯ８９／０１９７
３；米国特許第４，７７７，１２７号；ＧＢ２，２００，６５１；ＥＰ０，
３４５，２４２；ＷＯ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ６：６１６−６２７，１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ２５２：４３１−４３４，１９９１；Ｋｏｌｌｓら，ＰＮＡＳ９１：
２１５−２１９，１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら，ＰＮＡＳ９０：１１
４９８−１１５０２，１９９３；Ｇｕｚｍａｎら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ８
８：２８３８−２８４８，１９９３；およびＧｕｚｍａｎら，Ｃｉｒ．Ｒｅｓ
７３：１２０２−１２０７，１９９３に開示される。このような発現系にポリヌ
クレオチドを組み入れるための方法は、当業者に周知である。ポリヌクレオチド
はまた、「裸（ｎａｋｅｄ）」であり得る（例えば、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ
９０／１１０９２，およびＵｌｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１７４５
−１７４９，１９９３，Ｃｏｈｅｎによる評論，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１６
９１−１６９２，１９９３に記載される）。裸のポリヌクレオチドの取り込みは
、ポリヌクレオチドを生分解可能なビーズ上に被覆することによって増加され得
、これは、細胞内に効率的に輸送される。

【００４４】投与の経路および頻度、ならびに投薬量は、個人間で変化し、そして他の疾患
の免疫治療において現在使用されるそれらと類似し得る。一般的に、薬学的組成
物およびワクチンは、注射（例えば、皮内、筋内、静脈内または皮下）、鼻腔内
（例えば、吸引により）または経口で投与され得る。１から１０用量が、３−２
４週間にわたって投与され得る。好ましくは、３ヶ月間隔で４用量を投与し、そ
してその後に、追加免疫投与が定期的に行われ得る。代替のプロトコルは、各患
者に適し得る。適切な用量は、処置患者における乳房腫瘍細胞に対する免疫応答
（細胞性および／または体液性）を生じるのに効果的な、ポリぺプチド分子また
はポリヌクレオチド分子の量である。適切な免疫応答は、基底（すなわち、未処
理）レベルより少なくとも１０〜５０％上回る。一般的に、１用量に存在する（
または１用量のポリヌクレオチドによってインサイチュで産生される）ポリぺプ
チドの量は、宿主１ｋｇあたり約１ｐｇ〜約１００ｍｇの範囲にわたり、代表的
には、約１０ｐｇ〜約１ｍｇ、そして好ましくは、約１００ｐｇ〜約１μｇであ
る。適切な用量サイズは、患者のサイズに伴って変化するが、代表的には、約０
．０１ｍＬ〜約５ｍＬの範囲にわたる。

【００４５】当業者に公知の任意の適切なキャリアが、本発明の薬学的組成物に利用され得
るが、キャリアの型は投与の様式に依存して変化する。非経口的な投与（例えば
、皮下注射）のためには、キャリアは好ましくは、水、生理食塩水、アルコール
、脂質、ワックスおよび／または緩衝液を含む。経口投与のためには、上記のキ
ャリアまたは固体キャリア（例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ス
テアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石（ｔａｌｃｕｍ）、セル
ロース、グルコース、スクロース、および／または炭酸マグネシウム）のいずれ
かが利用され得る。生分解可能なマイクロスフェア（例えば、ポリ乳酸グリコリ
ド（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃｇｌｙｃｏｌｉｄｅ））もまた、本発明の薬学的組
成物のためのキャリアとして利用され得る。適切な生分解可能なマイクロスフェ
アは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号および同第５，０７５，１０９
号に開示される。

【００４６】種々の非特異的免疫応答増強剤のいずれかが、本発明のワクチンに利用され得
る。例えば、アジュバントが含まれ得る。ほとんどのアジュバントは、迅速な異
化作用から抗原を保護するために設計された物質を含む（例えば、水酸化アルミ
ニウムまたは鉱油、およびリピドＡ、Ｂｏｒｄｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓま
たはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのような免疫応答
の非特異的な刺激物質）。このようなアジュバントは、例えば、フロイント不完
全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）ならびにメルクアジュバント６５（Ｍｅ
ｒｃｋａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ）として市販
されている。

【００４７】本明細書に開示されたポリぺプチドはまた、癌の処置のための養子免疫治療に
おいて用いられ得る。養子免疫治療はまた、広範には、能動的免疫治療または受
動的免疫治療のいずれかに分類され得る。能動的免疫治療において、処置は、内
因性の宿主免疫系のインビボでの刺激に依存し、免疫応答改変薬剤（例えば、腫
瘍ワクチン、細菌アジュバント、および／またはサイトカイン）の投与で腫瘍に
反応する。

【００４８】受動的免疫治療において、処置は、確立された腫瘍−免疫反応性を有する生物
学的試薬（例えば、エフェクター細胞または抗体）の送達を包含する。この確立
された腫瘍−免疫反応性は、抗腫瘍効果を直接的または間接的に媒介し得、そし
てインタクトの宿主免疫系に必ずしも依存しない。エフェクター細胞の例として
は、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＤ４＋Ｔヘルパー
、腫瘍浸潤性リンパ球）、キラー細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞、リンフ
ォカイン活性化キラー細胞）、Ｂ細胞、または開示された抗原を発現する抗原提
示細胞（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）が挙げられる。本明細書に開
示されたポリぺプチドはまた、受動的免疫治療のために、抗体または抗イディオ
タイプ抗体を産生するため（米国特許第４，９１８，１６４号と同様）に使用さ
れ得る。

【００４９】養子免疫治療のための適当数のＴ細胞を調達する優勢な方法は、インビトロで
免疫Ｔ細胞を増殖することである。単一の抗原特異的なＴ細胞をインビボでの抗
原認識の保持を伴って数十億数まで拡大するための培養条件は、当該分野で周知
である。これらのインビトロ培養条件は、代表的には、しばしばＩＬ−２のよう
なサイトカインおよび非分裂（ｎｏｎ−ｄｉｖｉｄｉｎｇ）フィーダー細胞の存
在下における、抗原を用いた断続的刺激を利用する。上記に記載したように、本
明細書に記載された免疫反応性ポリぺプチドは、免疫治療のための十分数の細胞
数を生成するために、抗原特異的なＴ細胞培養物を迅速に拡大するために使用さ
れ得る。特に、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージまたはＢ細胞
）は、当該分野に周知の標準的な技術を使用して、免疫反応性ポリぺプチドでパ
ルス（ｐｕｌｓｅ）され得るか、またはポリヌクレオチド配列（複数または単数
）を用いてトランスフェクトされ得る。例えば、抗原提示細胞は、ポリヌクレオ
チド配列を用いてトランスフェクトされ得（ここでこの配列は、発現を増大させ
るために適したプロモーター領域を含む）、そして組換えウイルスまたは他の発
現系の一部として発現され得る。培養Ｔ細胞が治療において有効であるためには
、培養Ｔ細胞は、増殖し、かつ、広範に分布し得、かつ、インビボで長期生存し
得なければならない。研究は、培養Ｔ細胞が、ＩＬ−２を補充された抗原での反
復刺激により、インビボで増殖し、かつ、実質的な数において長期生存するよう
に誘導され得ることを明らかにした（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒ，Ｍ．ら、「Ｔｈ
ｅｒａｐｙＷｉｔｈＣｕｌｔｕｒｅｄＴＣｅｌｌｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌ
ｅｓＲｅｖｉｓｉｔｅｄ」ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ，１
５７：１７７，１９９７を参照のこと）。

【００５０】本明細書中に開示されたポリぺプチドはまた、腫瘍反応性のＴ細胞を生成およ
び／または単離するために用いられ得、このＴ細胞は、次いで、患者に投与され
得る。１つの技術において、抗原特異的なＴ細胞株は、開示されたポリぺプチド
の免疫原性部分に対応する短いペプチドを用いて、インビボで免疫化することに
よって生成され得る。得られた抗原特異性ＣＤ８＋ＣＴＬクローンが患者から
単離され得、標準的な組織培養技術を使用して拡大され得、そして患者に戻され
得る。

【００５１】あるいは、ポリぺプチドの免疫原性部分に対応するペプチドは、例えば、Ｃｈ
ａｎｇら（Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２２（３），２
１３，１９９６）に記載されるように、自己Ｔ細胞のインビトロでの選択的な刺
激および拡大によって腫瘍反応性のＴ細胞サブセットを生成し、続いて患者に移
入され得る抗原特異的なＴ細胞を提供するために用いられ得る。Ｔ細胞のような
免疫系の細胞は、例えば、ＣｅｌｌＰｒｏＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ’ｓ（Ｂ
ｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）ＣＥＰＲＡＴＥ^TMシステム（米国特許第５，２４０，８５
６号；米国特許第５，２１５，９２６号；ＷＯ８９／０６２８０；ＷＯ９１
／１６１１６およびＷＯ９２／０７２４３を参照のこと）のような市販の細胞
分離システムを使用して、患者の末梢血から単離され得る。分離された細胞は、
送達ビヒクル（例えば、マクロスフェア）内に含まれる免疫反応性ポリぺプチド
の１つ以上で刺激され、抗原特異性のＴ細胞を提供する。次いで、腫瘍抗原特異
的なＴ細胞の集団が、標準的な技術を使用して拡大され、そしてその細胞は患者
に戻し投与される。

【００５２】別の実施態様において、ポリぺプチドに特異的なＴ細胞および／または抗体レ
セプターがクローン化され得、拡大され得、そして養子免疫治療における使用の
ために、他のベクターまたはエフェクター細胞に移入され得る。

【００５３】さらなる実施態様において、同系または自己樹状細胞は、本明細書に開示され
たポリぺプチドの少なくとも免疫原性部分に対応するペプチドでパルスされ得る
。得られた抗原特異的な樹状細胞は、患者に移入され得るか、またはＴ細胞を刺
激して順に患者に投与され得る抗原特異的なＴ細胞を提供するために用いられ得
るかのいずれかである。抗原特異的なＴ細胞を生成するためのペプチドパルスさ
れた樹状細胞の使用、ならびにマウスモデルにおいて腫瘍を根絶するためのこの
ような抗原特異的なＴ細胞の続く使用が、Ｃｈｅｅｖｅｒら（Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ，１５７：１７７，１９９７）により示される。

【００５４】さらに、開示されたポリヌクレオチドを発現するベクターは、患者から採取さ
れた幹細胞に導入され得、そして同患者への自己移植のためにインビトロでクロ
ーン増殖され得る。

【００５５】本発明のポリぺプチドはまた、あるいは、代替的に、転移性のヒト乳房腫瘍を
検出し得る結合薬剤（例えば、抗体またはそれらのフラグメント）を生成するた
めに使用される。本発明の結合薬剤は、一般的に、本明細書に記載した代表的な
手順を含む、当業者に公知の方法を使用して調製され得る。結合薬剤は、本明細
書に記載の代表的なアッセイを使用して、乳癌を有する患者と有さない患者との
間を区別し得る。つまり、乳房腫瘍タンパク質に対して産生された抗体または他
の結合薬剤、あるいはそれらの適切な部分は、その疾患に冒されている患者の少
なくとも約２０％において、原発性または転移性の乳癌の存在を示すシグナルを
生成し、ならびに原発性または転移性の乳癌を有さない個体の少なくとも約９０
％において、疾患の非存在を示す陰性シグナルを生成する。このような乳房腫瘍
タンパク質の適切な部分は、乳癌が完全長タンパク質を使用して示される実質的
に全て（すなわち、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％）の患
者において、原発性または転移性の乳癌の存在を示し、ならびに完全長のタンパ
ク質を用いて試験される場合、陰性である実質的に全てのサンプルにおいて、乳
癌の非存在を示す結合薬剤を生成し得る部分である。以下に記載される代表的な
アッセイ（例えば、２抗体サンドイッチアッセイ（ｔｗｏ−ａｎｔｉｂｏｄｙ
ｓａｎｄｗｉｃｈａｓｓａｙ））は、一般的に、転移性のヒト乳房腫瘍を検出
する結合薬剤の能力を評価するために用いられ得る。

【００５６】原発性ヒト乳房腫瘍または転移性ヒト乳房腫瘍を検出し得る抗体を産生する、
本明細書中に記載のように調製されたポリペプチドの能力は、一般に、このポリ
ペプチドに対する１つ以上の抗体を惹起することによって（例えば、本明細書中
に記載の代表的な方法を使用して）、および患者におけるこのような腫瘍を検出
するためのこのような抗体の能力を決定することによって評価され得る。この決
定は、生じた抗体に結合するポリペプチドの存在について、原発性ヒト乳房腫瘍
または転移性乳房腫瘍を有するかあるいは有さない患者由来の生物学的サンプル
をアッセイすることによって行われ得る。このような試験アッセイは、例えば、
下記に示す代表的な手順を用いて実行され得る。このような手順によって、原発
性ヒト乳房腫瘍または転移性ヒト乳房腫瘍の少なくとも２０％を検出し得る抗体
を産生するポリペプチドは、原発性ヒト乳房腫瘍または転移性のヒト乳房腫瘍を
検出するためのアッセイに有用であると考えられる。ポリペプチド特異的抗体は
、感度を改善するために単独でまたは組み合せて使用され得る。

【００５７】原発性ヒト乳房腫瘍または転移性ヒト乳房腫瘍を検出し得るポリペプチドは、
乳癌を診断するためまたは患者の疾患の進行をモニタリングするためのマーカー
として使用され得る。１つの実施態様において、患者の乳癌は、患者から得られ
た生物学的サンプルの、あらかじめ決定されたカットオフ値に関する１つ以上の
上記ポリペプチドのレベルについて評価されることによって診断され得る。本明
細書中で使用される場合、適切な「生物学的サンプル」には、血液、血清および
尿が挙げられる。

【００５８】１つ以上の上記ポリペプチドのレベルは、このポリペプチドに対して特異的な
任意の結合剤を使用して評価され得る。本発明の状況における「結合剤」とは、
上記のようなポリペプチドに結合する任意の薬剤（例えば、化合物または細胞）
である。本明細書で使用される場合、「結合」とは、２つの別々の分子（各分子
が遊離し得るか（すなわち、溶液中）、または細胞もしくは固体支持体の表面上
に存在し得る）間での、「複合体」が形成されるような非共有結合的な会合をい
う。このような複合体は、遊離であり得るかまたは支持物質上に固定化され得る
（共有結合的にもしくは非共有結合的にのいずれかで）。結合能力は、一般に、
複合体の形成に対する結合定数を決定することによって、評価され得る。この結
合定数は、複合体の濃度が成分の濃度の積で除算された場合に得られる値である
。一般に、本発明の状況において、複合体形成についての結合定数が約１０³Ｌ／ｍｏｌを超える場合、２つの成分は「結合」するといわれる。結合定数は、当
業者に周知の方法を用いて決定され得る。

【００５９】上記の要求をみたす任意の薬剤は、結合剤であり得る。例えば、結合剤は、ペ
プチド成分を有するかまたは有さないリボソーム、ＲＮＡ分子あるいはペプチド
であり得る。好ましい実施態様において、この結合パートナーは、抗体であり、
またはそのフラグメントである。このような抗体は、ポリクローナル抗体であり
得るか、またはモノクローナル抗体であり得る。さらに、この抗体は、単鎖抗体
、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、またはヒト化抗体であり得る。抗体は、本明細
書中に記載の方法および当業者に周知の他の方法によって、調製され得る。

【００６０】サンプルにおいてポリペプチドマーカーを検出するための結合パートナーの使
用について、当業者に公知の種々のアッセイ様式が存在する。例えば、Ｈａｒｌ
ｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａ
ｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、１
９８８を参照のこと。好ましい実施態様において、このアッセイは、サンプルの
残余物中のポリペプチドと結合し、そしてそこからポリペプチドを除去するため
に固体支持体上に固定化される結合パートナーの使用を含む。次いで、この結合
したポリペプチドは、レポーター基を含む第２の結合パートナーを使用して検出
され得る。適切な第２の結合パートナーには、結合のパートナー／ポリペプチド
複合体に結合する抗体が挙げられる。あるいは、ポリペプチドが、レポーター基
で標識され、そしてサンプルと結合パートナーとのインキュベーションの後、固
定化された結合パートナーへの結合を可能にする競合アッセイが利用され得る。
サンプル成分が、標識されたポリペプチドの結合パートナーへの結合を阻害する
程度は、固定化された結合パートナーとのサンプルの反応性を示す。

【００６１】固体支持体は、抗原が付着され得る、当業者に公知の任意の物質であり得る。
例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレートの試験ウェル、またはニトロ
セルロース膜もしくは他の適切な膜であり得る。あるいは、この支持体は、ビー
ズまたはディスク（例えば、ガラス、ファイバーガラス、ラテックス、またはプ
ラスチック物質（例えば、ポリスチレンもしくはポリ塩化ビニル））であり得る
。この支持体はまた、磁気性粒子または光ファイバーセンサー（ｆｉｂｅｒｏ
ｐｔｉｃｓｅｎｓｏｒ）（例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に開示さ
れるようなもの）であり得る。結合剤は、当業者に公知の種々の技術を使用して
固体支持体上に固定化され得、これは特許および科学文献に十分に記載されてい
る。本発明の状況において、用語「固定化」とは、非共有結合的な会合（例えば
、吸着）および共有結合的な付着（これは、抗原と支持体上の官能基との間で直
接結合され得るかまたは架橋剤を用いて結合され得る）の両方をいう。マイクロ
タイタープレートのウェル、または膜への吸着による固定化は好ましい。このよ
うな場合、吸着は、適切な緩衝液中で固体支持体を用いて適切な時間で結合剤に
接触させることによって達成され得る。接触時間は、温度によって変化するが、
代表的には、約１時間から約１日の間である。一般的には、約１０ｎｇ〜約１０
μｇ、そして好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの範囲の量の結合剤とプラスチ
ックマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル）
のウェルを接触させることは、適切な量の結合剤を固定化するのに十分である。

【００６２】固体支持体への結合剤の共有結合的付着は、一般に、支持体および結合剤上の
官能基（例えば、水酸基またはアミノ基）の両方と反応する二官能性試薬と支持
体を最初に反応させることによって達成され得る。例えば、この結合剤は、ベン
ゾキノンを用いるかまたは結合パートナー上のアミンおよび活性水素を用いる支
持体上のアルデヒド基の縮合によってコートする適切なポリマーを有する支持体
に、共有結合的に付着され得る（例えば、ＰｉｅｒｃｅＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙＣａｔａｌｏｇａｎｄＨａｎｄｂｏｏｋ、１９９１、Ａ１２
−Ａ１３を参照のこと）。

【００６３】特定の実施態様において、このアッセイは、２抗体サンドイッチアッセイであ
る。本アッセイは、最初に、固体支持体（通常、マイクロタイタープレートのウ
ェル）上で固定化されている抗体をサンプルと接触させて、サンプル内のポリペ
プチドを固定化抗体に結合させることによって実施され得る。次いで、非結合サ
ンプルは固定化ポリペプチド−抗体複合体から除去され、そしてそのポリペプチ
ド上の異なる部位に結合し得る第２の抗体（レポーター基を含む）が添加される
。次いで、固体支持体に結合したままである第２の抗体の量が、特定のレポータ
ー基に関して適切な方法を用いて決定される。

【００６４】より詳細には、一旦抗体が上記のように支持体上に固定化されると、支持体上
の残りのタンパク質結合部位は、通常ブロックされる。任意の適切なブロック剤
（例えば、ウシ血清アルブミンまたはＴｗｅｅｎ２０^TM（ＳｉｇｍａＣｈｅｍ
ｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））は、当業者に公知である。固定
化抗体は次いで、サンプルとインキュベートされ、そしてポリペプチドをこの抗
体に結合させる。インキュベーションの前に、このサンプルは適切な希釈液（例
えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））で希釈され得る。概して、適切な接
触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、乳癌を有する個体から得られ
たサンプル内のポリペプチドの存在を検出するのに十分な時間である。好ましく
は、この接触時間は、結合ポリペプチドと非結合ポリペプチドとの間の平衡が少
なくとも約９５％で達成される結合レベルを達成するのに十分な時間である。当
業者は、ある時間にわたって起こる結合レベルをアッセイすることによって、平
衡に達するまでに必要な時間が容易に決定され得ることを認識する。室温では、
一般に、約３０分間のインキュベーション時間で十分である。

【００６５】次いで、非結合サンプルが、適切な緩衝液（例えば、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０ ^TM を含むＰＢＳ）を用いて固体支持体を洗浄することによって除去される。レポ
ーター基を含む第２の抗体が次いで、固体支持体に添加され得る。好ましいレポ
ーター基は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、基質、補因子、イ
ンヒビター、色素、放射性核種、発光基、蛍光基およびビオチンを含む。レポー
ター基への抗体の結合体化は、当業者に公知の標準方法を使用して達成され得る
。

【００６６】次いで、第２の抗体が、結合されたポリペプチドを検出するのに十分な量の時
間、固定化抗体−ポリペプチド複合体とインキュベートされる。適切な量の時間
は、一般に、ある時間にわたって起こる結合のレベルをアッセイすることによっ
て決定され得る。次いで、非結合の第２の抗体は除去され、そして結合した第２
の抗体は、レポーター基を用いて検出される。レポーター基を検出するために使
用される方法は、レポーター基の性質に依存する。放射性基について、一般的に
は、シンチレーション計数法またはオートラジオグラフィー法が適切である。分
光法は、色素、発光基および蛍光基を検出するために使用され得る。ビチオンは
、異なるレポーター基（一般に、放射性もしくは蛍光基または酵素）に結合され
たアビジンを使用して検出され得る。酵素レポーター基は、一般に、基質の添加
（一般には、特定の時間の間）、続いて反応産物の分光分析または他の分析によ
り検出され得る。

【００６７】乳癌の存在または非存在を決定するために、固体支持体に結合したままのレポ
ーター基から検出されるシグナルが、一般に、所定のカットオフ値と対応するシ
グナルと比較される。１つの好ましい実施態様において、このカットオフ値は、
固定化抗体を、乳癌を有さない患者由来のサンプルとインキュベートした際に得
られた平均シグナル値である。概して、所定のカットオフ値を３標準偏差上回る
シグナルを生じるサンプルが、乳癌に対して陽性とみなされる。代わりの好まし
い実施態様において、このカットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：ＡＢａｓｉｃＳｃｉｅｎｃｅｆｏｒＣ
ｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＬｉｔｔｌｅＢｒｏｗｎａｎｄＣｏ
．，１９８５，１０６〜７頁の方法に従って、レシーバーオペレーターカーブ（
ＲｅｃｅｉｖｅｒＯｐｅｒａｔｏｒＣａｒｖｅ）を使用して決定される。簡
単に言うと、本実施態様において、このカットオフ値は、診断試験結果について
各可能なカットオフ値に対応する真の陽性割合（すなわち、感度）および偽陽性
割合（１００％−特異性）の対のプロットから決定され得る。プロット上の上方
左手角に最も近いカットオフ値（すなわち、最大領域を囲む値）が、最も正確な
カットオフ値であり、そして本方法によって決定されたカットオフ値より高いシ
グナルを生ずるサンプルが陽性と見なされ得る。あるいは、カットオフ値は、偽
陽性割合を最小にするためにプロットに沿って左へシフトされ得るか、または偽
陰性割合を最小にするために右へシフトされ得る。概して、本方法によって決定
されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが、乳癌に対して陽性と
見なされる。

【００６８】関連の実施態様において、このアッセイは、フロースルー試験形式またはスト
リップ試験形式で実行される（ここで、抗体は、ニトロセルロースのような膜上
で固定化される）。フロースルー試験では、サンプル内のポリペプチドは、サン
プルが膜を通過するにつれて固定化抗体に結合する。次いで、第２の標識化され
た抗体が、この第２の抗体を含む溶液がその膜を介して流れるにつれて、抗体−
ポリペプチド複合体と結合する。次いで、結合した第２の抗体の検出は、上記の
ように実行され得る。ストリップ試験形式では、抗体が結合される膜の一端をサ
ンプルを含む溶液中に浸す。このサンプルは、膜に沿って、第２の抗体を含む領
域を通って、そして固定化抗体の領域まで移動する。固定化抗体の領域での第２
の抗体の濃度が、乳癌の存在を示す。代表的には、その部位での第２の抗体の濃
度は、視覚的に読みとられ得るパターン（例えば、線）を生成する。このような
パターンを示さないことは陰性の結果を示す。概して、この膜上に固定化される
抗体の量は、生物学的サンプルが、上記の形式において、２抗体サンドイッチア
ッセイにおいて陽性シグナルを生じるのに十分であるレベルのポリペプチドを含
む場合、視覚的に識別可能なパターンを生じるように選択される。好ましくは、
膜上に固定化される抗体の量は、約２５ｎｇ〜約１μｇの範囲であり、そしてよ
り好ましくは、約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの範囲である。このような試験は、代
表的には、非常に少ない量の生物学的サンプルを用いて実行され得る。

【００６９】もちろん、本発明の抗原または抗体との使用に適する多数の他のアッセイ手順
が存在する。上記の記載は、例示のみを意図する。

【００７０】別の実施態様において、上記のポリペプチドは、乳癌の進行に対するマーカー
として用いられ得る。この実施態様において、乳癌の診断のための上記のような
アッセイは、経時的に実施され得、そして反応性ポリヌクレオチド（単数または
複数）のレベルにおける変化が評価され得る。例えば、このアッセイは、６ヶ月
〜１年の期間、２４〜７２時間ごとに行われ得、その後は必要な場合に行われ得
る。一般に、乳癌は、結合剤によって検出されるポリペプチドのレベルが、経時
的に増加するような患者において進行している。対照的に、反応性ポリペプチド
のレベルが時間と共に一定に保たれるか、または低下するかのいずれかの場合、
乳癌は、進行していない。

【００７１】上記の方法における使用のための抗体は、当業者に公知の任意の多様な技術に
よって調製され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。このような技術の
１つに、抗原性ポリペプチドを含有する免疫原が、任意の広範な種々の哺乳動物
（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、およびヤギ）の中に初めに注射さ
れる。この工程において、本発明のポリペプチドは、改変することなく免疫原と
して供され得る。あるいは、特に比較的短いポリペプチドに対して、このポリペ
プチドが、キャリアタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホール
リンペットヘモシニアン）と結合される場合、優れた免疫応答が惹起され得る。
この免疫原は、（好ましくは１つ以上の追加免疫を組み入れる、所定のスケジュ
ールに従って）動物宿主中へ注射され、そしてこの動物は定期的に採血される。
次いで、このポリペプチドに対して特異的なポリクローナル抗体は、このような
抗血清から、例えば、適切な固体支持体に結合されたポリペプチドを用いるアフ
ィニティクロマトグラフィーによって精製され得る。

【００７２】目的の抗原性ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体が、例えば、Ｋｏｈ
ｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５
１９，１９７６の技法およびそれに対する改良を利用して調製され得る。手短に
言えば、これらの方法は、所望する特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの
反応性）を有する抗体を産生し得る不死化細胞株の調製を含む。このような細胞
株は、例えば、上記のように免疫化された動物から得られた脾臓細胞から調製さ
れ得る。次いで、この脾臓細胞は、例えば、（好ましくは、免疫化された動物と
同質遺伝子的である）ミエローマ細胞融合パートナーとの融合によって不死化さ
れ得る。種々の融合技術が利用され得る。例えば、脾臓細胞およびミエローマ細
胞は、数分間、非イオン性の界面活性剤と組み合わされ得、次にハイブリット細
胞の増殖を支持するがミエローマ細胞の増殖を支持しない選択培地上に低密度で
プレートされ得る。好ましい選択技法は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテ
リン、チミジン）選択を用いる。十分な時間（通常約１〜２週間）の後、ハイブ
リッドのコロニーが観察される。単一コロニーが選択され、そしてポリペプチド
に対する結合活性について試験される。高い反応性および特異性を有するハイブ
リドーマが、好ましい。

【００７３】モノクローナル抗体は、増殖するハイブリドーマコロニーの上清から単離され
得る。さらに、適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹腔内へのハイブリド
ーマ細胞株の注射のような種々の技法が、収量の増加のために利用され得る。次
いで、モノクローナル抗体は、腹水または血液から収集され得る。共雑物は、ク
ロマトグラフィー、ゲルろ過、沈降、および抽出のような従来の技法によってこ
の抗体から除去され得る。本発明のポリペプチドは、例えば、アフィニティクロ
マトグラフィー工程における精製プロセスにおいて用いられ得る。

【００７４】本発明のモノクローナル抗体はまた、乳癌を消滅または除去する治療薬として
用いられ得る。この抗体は、それら自身で（例えば、転移を阻止するために）用
いられ得るか、または１つ以上の治療薬と組み合わせられ得る。この点において
、適切な物質として、放射性核種、分化誘導物質、薬物、毒素、およびそれらの
誘導体が挙げられる。好ましい放射性核種として、⁹⁰Ｙ、¹²³Ｉ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、²¹¹Ａｔ、および²¹²Ｂｉが挙げられる。好ましい薬物とし
て、メトトレキセート、ならびにピリミジンアナログおよびプリンアナログが挙
げられる。好ましい分化誘導物質として、フォルボールエステルおよび酪酸が挙
げられる。好ましい毒素として、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒
素、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、シュードモナス外毒素、赤痢菌毒素、および
アメリカヤマゴボウ抗ウィルス性タンパク質が挙げられる。

【００７５】治療薬は、適切なモノクローナル抗体と、直接的にかまたは（例えば、リンカ
ー基を介して）間接的にかのいずれかで結合（例えば、共有結合）され得る。各
々が、他と反応し得る置換基を有する場合、物質と抗体との間の直接的な反応が
可能である。例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基のような求核基は、無水
物または酸ハロゲン化物のようなカルボニル含有基と、あるいは他方では良好な
脱離基（例えば、ハロゲン化物）を有するアルキル基と反応し得る。

【００７６】あるいは、リンカー基を介して治療薬と抗体と結合することが望ましいであろ
う。リンカー基は、結合能力の妨害を避けるために、物質から抗体を離すスペー
サーのように機能し得る。リンカー基はまた、物質または抗体上の置換基の化学
反応性を増大するために供し得、従って結合効率を増大する。化学反応性の増大
はまた、（さもなければ不可能である）物質または物質上の官能基の使用を容易
にし得る。

【００７７】ホモ官能性およびヘテロ官能性の両方の種々の二官能性試薬または多官能性試
薬（例えば、これらは、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｒｏｃｋｆ
ｏｒｄ，ＩＬのカタログに記載されている）が、リンカー基として利用され得る
ことが当業者に明らかである。カップリングは、例えば、アミノ基、カルボキシ
ル基、スルフヒドリル基、または酸化された炭化水素残基を通じてなされ得る。
このような方法論（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらに与えられた、米国特許第４，６
７１，９５８号）を記載する多数の参考文献が存在する。

【００７８】本発明の免疫複合体の抗体部分がないときに治療薬がより効き目のある場合は
、細胞中への内在化の間か、あるいは内在化の際に切断され得るリンカー基を用
いることが望ましいだろう。多数の異なる切断可能なリンカー基が、記載されて
いる。これらリンカー基からの物質の細胞内放出に関するメカニズムとして、ジ
スルフィド結合の還元（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒに与えられた、米国特許第４，
４８９，７１０号）、感光性結合の照射（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらに与えられた
、米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導されたアミノ酸側鎖の加水分解（Ｋ
ｏｈｎらに与えられた、米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体を媒介し
た加水分解（Ｒｏｄｗｅｌｌらに与えられた、米国特許第４，６７１，９５８号
）、および酸触媒加水分解（例えば、Ｂｌａｔｔｅｒらに与えられた、米国特許
第４，５６９，７８９号）による切断が挙げられる。

【００７９】抗体に対する１つ以上の物質の結合が所望される得る。１つの実施態様におい
て、物質の複数の分子が、１つの抗体分子に対して結合される。別の実施態様に
おいて、１つ以上のタイプの物質が、１つの抗体分子に対して結合され得る。特
定の実施態様に関係なく、１つ以上の物質を有する免疫複合体が、多様な方法で
調製され得る。例えば、１つ以上の物質が、抗体分子に直接的に結合され得るか
、または付着のための複数の部位を提供するリンカーが用いられ得る。あるいは
、キャリアが用いられ得る。

【００８０】キャリアは、直接的にかまたはリンカー基を介してかのいずれかで共有結合を
含む、多様な方法でこの物質を保持し得る。適切なキャリアとして、アルブミン
ようなタンパク質（例えば、Ｋａｔｏらに与えられた、米国特許第４，５０７，
２３４号）、アミノデキストランのようなペプチドおよびポリサッカライド（例
えば、Ｓｈｉｈらに与えられた、米国特許第４，６９９，７８４号）が挙げられ
る。キャリアはまた、非共有結合によるか、またはカプセル化（例えば、リポソ
ーム小胞中（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および米国特許第４，８
７３，０８８号））により物質を運び得る。放射性核種物質に特異的なキャリア
として、放射ハロゲン化（ｒａｄｉｏｈａｌｏｇｅｎａｔｅｄ）低分子およびキ
レート化合物が挙げられる。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号は、代表
的な放射ハロゲン化低分子およびそれらの合成を開示する。放射性核種キレート
は、金属放射性核種、または金属酸化物放射性核種を結合するための供与体原子
として、窒素原子および硫黄原子を含むようなキレート化合物から形成され得る
。例えば、Ｄａｖｉｓｏｎらに与えられた、米国特許第４，６７３，５６２号は
、代表的なキレート化合物およびそれらの合成を開示する。

【００８１】この抗体および免疫複合体に関して種々の投与経路が用いられ得る。代表的に
は、投与は、静脈内、筋肉内、皮下、または切除した腫瘍の床（ｂｅｄ）内であ
る。抗体／免疫複合体の正確な用量は、用いる抗体、腫瘍に対する抗原密度、お
よび抗体のクリアランス速度に依存して変化する。

【００８２】本発明の診断試薬はまた、１つ以上の上記ポリヌクレオチドをコードするポリ
ヌクレオチド配列、または１つ以上のそれらの部分を含み得る。例えば、少なく
とも２つのオリゴヌクレオチドプライマーが、生物学的サンプル由来の乳癌特異
的ｃＤＮＡを増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセ
イにおいて利用され得、ここで、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマ
ーが、本発明の乳癌タンパク質をコードするＤＮＡ分子に特異的である。次いで
、増幅したｃＤＮＡの存在は、ゲル電気泳動のような当該分野で周知の技法を用
いて検出される。同様に、本発明の乳癌タンパク質をコードするＤＮＡ分子に特
異的なオリゴヌクレオチドプローブは、生物学的サンプルにおける本発明のポリ
ペプチドの存在を検出するために、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて用
いられ得る。

【００８３】本明細書で用いられるように、用語「ＤＮＡ分子に特異的なオリゴヌクレオチ
ドプライマー／プローブ」とは、問題のＤＮＡ分子に対して、少なくとも約６０
％、好ましくは少なくとも約７５％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％
の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を意味する。本発明の診断方法におい
て有用に利用され得るオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは
、好ましくは少なくとも約１０〜４０ヌクレオチドを有する。好ましい実施態様
において、このオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１〜９４から選択さ
れる部分配列を有するＤＮＡ分子の少なくとも約１０の連続したヌクレオチドを
含有する。好ましくは、本発明の診断方法における使用のためのオリゴヌクレオ
チドプローブは、配列番号１〜９４において提供される部分配列を有するＤＮＡ
分子の少なくとも約１５の連続したオリゴヌクレオチドを含有する。ＰＣＲに基
づくアッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイの両方に関する技法は、当
該分野において周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら前述；Ｅｈｒｌｉｃｈ，前
述を参照のこと）。従って、プライマーまたはプローブは、血液、尿、および／
または乳癌組織を含む生物学的サンプルにおいて乳癌に特異的な配列を検出する
ために用いられ得る。

【００８４】以下の実施例は、例示を目的として提供され、限定を目的とはしない。

【００８５】（実施例）（実施例１）（乳房腫瘍ポリペプチドの単離と特徴づけ）本実施例は、乳房腫瘍ｃＤＮＡライブラリー由来の乳房腫瘍ポリペプチドの単
離を記載する。

【００８６】ヒトの乳房腫瘍ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、製造業者のプロトコールに従っ
て、ｃＤＮＡ合成およびプラスミドクローニングキット（ＢＲＬＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ２０８９７）のた
めのスーパースクリプトプラスミドシステムを用いて、３人の患者由来の乳房腫
瘍ポリＡ⁺ＲＮＡのプールから構築した。詳細には、乳房腫瘍組織を、ポリトロン（ｐｏｌｙｔｒｏｎ）（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で
ホモジナイズし、そして全ＲＮＡを、製造業者により指示されるようにＴｒｉｚ
ｏｌ試薬（ＢＲＬＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて抽出した。
次いで、ポリＡ⁺ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、Ｑｉａｇｅｎｏｌ
ｉｇｏｔｅｘスピンカラムｍＲＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，ＳａｎｔａＣ
ｌａｒｉｔａ，ＣＡ９１３５５）を用いて精製した。第１のｃＤＮＡ鎖を、Ｎ
ｏｔＩ／Ｏｌｉｇｏ−ｄＴ１８プライマーを用いて合成した。二本鎖ｃＤＮＡを
合成し、ＥｃｏＲＩ／ＢｓｔＸＩアダプター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてライゲーションし、そしてＮｏｔＩで切断した。Ｃ
ｈｒｏｍａＳｐｉｎ−１０００カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ９４３０３）でのサイズ分画後、このｃＤＮＡを、ｐＣＤＮＡ３．１
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結し、そしてエレクト
ロポレーションによりＥｌｅｃｔｒｏＭａｘＥ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂ細胞（
ＢＲＬＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換した。

【００８７】同じ手順を用いて、正常なヒト乳房ｃＤＮＡ発現ライブラリーを４つの正常乳
房組織試料のプールから調製した。このｃＤＮＡライブラリーは、独立したコロ
ニー数、インサートを保有するクローンの百分率（パーセンテージ）、平均イン
サートサイズを決定すること、および配列分析により特徴付けられる。乳房腫瘍
ライブラリーは、１．１４×１０⁷の独立したコロニーを含み、コロニーの９０％より多くが明白なインサートを有しており、そして平均インサートサイズは、
９３６塩基対であった。正常な乳房ｃＤＮＡライブラリーは、６×１０⁶の独立したコロニーを含み、コロニーの８３％がインサートを有しており、そして平均
インサートサイズは、１０１５塩基対であった。配列決定分析は、両方のライブ
ラリーが、ｒＲＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡの混入配列が最小限である、ｍ
ＲＮＡから合成された良好な複合ｃＤＮＡクローンを含むことを示した。

【００８８】ｃＤＮＡライブラリーの差し引きを、Ｈａｒａら（Ｂｌｏｏｄ，８４：１８９
〜１９９、１９９４）によって記載されたように（いくつかの改変を伴い）、上
記の乳房腫瘍ｃＤＮＡライブラリーおよび正常乳房ｃＤＮＡライブラリーを用い
て実行した。詳細には、乳房腫瘍特異的に差し引きされた（ｓｕｂｔｒａｃｔｅ
ｄ）ｃＤＮＡライブラリーを以下の様に作製した。正常乳房ｃＤＮＡライブラリ
ー（７０μｇ）をＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩおよびＳｆｕＩで消化し、次に、ＤＮＡ
ポリメラーゼクレノウフラグメントで充填反応を行った。フェノール−クロロホ
ルム抽出およびエタノール沈殿の後、そのＤＮＡを１００μｌのＨ₂Ｏに溶解し、熱変性し、そして１００μｌ（１００μｇ）の光プローブビオチン（Ｐｈｏｔ
ｏｐｒｏｂｅｂｉｏｔｉｎ）（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ），と混合し、得られた混合物に２０分間、氷上で２
７０Ｗの太陽灯を照射した。さらなる光プローブビオチン（５０μｌ）を添加し
、そしてビオチン化反応を繰り返した。ブタノールでの５回の抽出後、ＤＮＡを
エタノール沈殿し、そして２３μｌのＨ₂Ｏに溶解し、ドライバー（ｄｒｉｖｅｒ）ＤＮＡを形成した。

【００８９】トレーサーＤＮＡを形成するため、１０μｇの乳房腫瘍ｃＤＮＡライブラリー
をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断し、フェノールクロロホルム抽出し、そして
Ｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ−４００カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を通過させた。エタノール沈殿後、このトレーサーＤＮＡを５μｌのＨ₂Ｏに溶解した。トレーサーＤＮＡを１５μｌのドライバーＤＮＡおよび２０μｌの２×ハイブリダイゼー
ション緩衝液（１．５ＭＮａＣｌ／１０ｍＭＥＤＴＡ／５０ｍＭＨＥＰ
ＥＳｐＨ７．５／０．２％ドデシル硫酸ナトリウム）と混合し、鉱油でオーバ
ーレイし、そして完全に熱変性した。このサンプルを直ちに６８℃の水槽に移し
、そして２０時間インキュベートした（長期ハイブリダイゼーション［ＬＨ］）
。次いで、反応混合物をストレプトアビジン処理にかけ、次いでフェノール／ク
ロロホルム抽出を行った。このプロセスをさらに３回、繰り返した。差し引きし
たＤＮＡを沈殿し、１２μｌのＨ₂Ｏに溶解し、８μｌのドライバーＤＮＡおよび２０μｌの２×ハイブリダイゼーション緩衝液と混合し、そして６８℃で２時
間のハイブリダイゼーションに供した（短期ハイブリダイゼーション［ＳＨ］）
。ビオチニル化二本鎖ＤＮＡの除去後、差し引きされたｃＤＮＡをクロラムフェ
ニコール耐性ｐＢＣＳＫ⁺（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ９２０３７）のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位にライゲーションし、そしてエレクト
ロポレーションによってＥｌｅｃｔｒｏＭａｘＥ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換し、乳房腫瘍特異的な差し引きｃＤＮＡライブラリーを作製した。

【００９０】差し引きｃＤＮＡライブラリーを分析するため、差し引き乳房腫瘍特異的ライ
ブラリーから無作為に選択された１００の独立クローンからプラスミドＤＮＡを
調製し、そしてＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓＤｉｖｉｓｉｏｎのＡｕｔｏｍａｔｅｄＳｅｑｕｅｎｃｅｒ３７３Ａモ
デル（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）を用いたＤＮＡ配列決定により特徴付けた。３８個の異なるｃＤＮＡクローンを差し引き乳房腫瘍特異的ｃＤＮＡライブ
ラリーにおいて見出した。これらのクローンの１４について決定された３’ｃＤ
ＮＡ配列を配列番号１〜１４に提供する。これは配列番号１５〜２８にそれぞれ
に提供される５’ｃＤＮＡ配列と対応する。残りのクローンについて決定された
一本鎖（５’または３’）ｃＤＮＡ配列は、配列番号２９〜５２に提供する。Ｅ
ＭＢＬおよびＧｅｎＢａｎｋデータベース（Ｒｅｌｅａｓｅ９７）を用いた遺伝
子バンク（ジーンバンク）での公知の配列とのこれらのｃＤＮＡ配列の比較は、
配列番号３、１０、１７、２４、および４５〜５２に提供された配列に対して有
意な相同性がないことを明らかにした。配列番号１、２、４〜９、１１〜１６、
１８〜２３、２５〜４１、４３および４４に提供される配列は、公知のヒト遺伝
子に対する相同性を少なくともある程度を示すことを見出した。配列番号４２の
配列は、公知の酵母遺伝子に対するいくらかの相同性を示すことが見出された。

【００９１】ＧＥＭＴＯＯＬＳソフトウエアのＳｙｎｔｅｎｉを用いてデータを分析した。
２１の異なるｃＤＮＡクローンが乳房腫瘍では過剰発現し、試験されたすべての
正常な組織では低レベルで発現することを見出した。これらのクローンについて
決定された部分的なｃＤＮＡ配列を、配列番号５３〜７３に提供する。上記のよ
うな遺伝子バンクの配列と配列番号５３、５４および６８〜７１の配列の比較は
、以前に同定されたヒト遺伝子に対するいくらかの相同性を表した。配列番号５
５〜６７、７２（ＪＪ９４３４，７１１７と呼ばれる）、および７３（Ｂ５３
５Ｓと呼ばれる）の配列に有意な相同性は見出されなかった。

【００９２】さらなる実験において、ＤＮＡマイクロアレイ（微小整列：ｍｉｃｒｏａｒｒ
ａｙ）により分析されたｃＤＮＡフラグメントは、上記のように、従来のサブト
ラクションによって得られた２つのサブトラクションライブラリーから得られた
。１つの例では、テスターは、原発性乳房腫瘍に由来した。第２の例では、転移
性の乳房腫瘍を、テスターとして用いた。ドライバーは、正常な乳房からなる。

【００９３】これらの２つのライブラリー由来のｃＤＮＡフラグメントをＤＮＡマイクロア
レイ分析のためのテンプレートとして提示した。ＤＮＡチップを、腫瘍組織およ
び正常組織の両方に由来するｍＲＮＡ由来の蛍光プローブを用いてハイブリダイ
ズすることにより分析した。このデータの分析を、プローブのセットから３つの
群を作製することにより達成した。これらのプローブ群の組成物を、乳房腫瘍／
ｍｅｔｓ、正常非乳房組織、および転移性乳房腫瘍とよぶ。改変Ｇｅｍｔｏｏｌ
ｓ分析を用いて２つの比較を実施した。第１の比較は、乳房腫瘍における発現増
加を有するテンプレートを同定することであった。第２は、転移性乳房腫瘍にお
いて発現増加を生じる第１の比較において回収されないテンプレートを同定する
ことであった。発現上昇の任意のレベル（正常組織発現の平均に対する腫瘍発現
の平均）を約２．２で設定した。

【００９４】乳房腫瘍における過剰発現を同定するための第１回の比較において、２つの新
規な遺伝子配列（本明細書において以降、Ｂ５３４ＳおよびＢ５３８Ｓ（配列番
号８９，９０）という）ならびに、以前に同定された遺伝子とある程度の相同性
を示す６つの配列（配列番号７４〜７９）を同定した。さらに、転移性乳房腫瘍
における発現上昇を同定するための第２の比較において、５つの新規な配列を同
定し、本明細書において以降Ｂ５３５Ｓ（この分析および上記の分析において過
剰発現した）、これをＢ５４２Ｓ、Ｂ５４３Ｓ、Ｐ５０１ＳおよびＢ５４１Ｓ（
配列番号７３、および９１〜９４）という。また公知の遺伝子とある程度の相同
性を示す９つの遺伝子（配列番号８０〜８８）を同定した。クローンＢ５３４Ｓ
およびＢ５３８Ｓ（配列番号８９，および９０）が乳房腫瘍および転移性乳房腫
瘍の両方において過剰発現されることを見出した。

【００９５】（実施例２）（乳房腫瘍抗原を発現する抗原提示細胞を認識するヒトＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ
細胞の産生）本実施例は、１０１６−Ｆ８（配列番号５６）としても公知のＢ５１１Ｓ抗原
を発現する標的細胞を認識するＴ細胞の産生を例証する。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を
以下の様に、Ｂ５１１Ｓを発現するように操作された組換えワクシニアウイルス
で感染した樹状細胞を用いてインビトロでＢ５１１Ｓ遺伝子産物へ刺激（ｐｒｉ
ｍｅ）した（Ｙｅｅら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９
６）１５７（９）：４０７９〜４０８６も参照のこと）。樹状細胞（ＤＣ）を、
５０μｇ／ｍｌのＧＭＣＳＦおよび３０μｇ／ｍｌのＩＬ−４の存在下で５日間
の分化により末梢血由来単球から産生した。ＤＣを収集し、２×１０⁵細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートのウェルにプレートし、そして５の感染多重度
でワクシニアを発現するＢ５１１Ｓで１２時間、感染した。次いで、ＤＣを３μ
ｇ／ｍｌのＣＤ４０−リガンドの添加により一晩成熟し、そして１０分間１００
μＷでＵＶ照射した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を磁気ビーズを用いて単離し、そしてプラ
イミング培養を、７×１０⁵個のＣＤ８＋Ｔ細胞および１×１０⁶個の照射ＣＤ８
枯渇化ＰＢＭＣを用いて個々のウェル（代表的には、２４ウェルプレートの２４
ウェルプレート中）で開始した；１日目に１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７を培養物に
添加した。Ｂ５１１Ｓおよび同時刺激分子Ｂ７．１を用いてレトロウイルスによ
り形質導入された自己の初代線維芽細胞を用いて７〜１０日ごとに培養を再刺激
した。培養物に１５Ｉ．Ｕ．のＩＬ−２を１日目に追加した。このような４回
の刺激サイクルの後、インターフェロンγＥｌｉｓｐｏｔアッセイ（Ｌａｌｖａ
ｎｉらＪ．ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ（１９９７）１８６
：８５９〜９６５参照のこと）を用いて、Ｂ５１１Ｓで形質導入された自己の線
維芽細胞を特異的に認識するＣＤ８＋の能力について、ＣＤ８＋培養を試験した
。簡略にいえば、個々の微小培養由来のＴ細胞を、Ｂ５１１Ｓまたは陰性コント
ロール抗原のＥＧＦＰのいずれかを発現するように形質導入した自己線維芽細胞
を含む９６ウェルのＥｌｉｓｐｏｔプレートに添加し、そして３７℃で一晩イン
キュベートした；ウェルはまた、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２も含んだ。培養物
が、Ｂ５１１Ｓで形質導入された線維芽細胞への応答でのみインターフェロンγ
を特異的に産生したことを確認した；このような株をさらに増殖し、そしてまた
Ｂ５１１Ｓでレトロウイルスにより形質導入された自己Ｂ−ＬＣＬでの限界希釈
によりクローニングした。細胞株およびクローンがＢ５１１で形質導入された自
己Ｂ−ＬＣＬを特異的に認識し得るが、コントロール抗原ＥＧＦＰまたはＨＬＡ
−Ａ３で形質導入された自己Ｂ−ＬＣＬは認識しないことを確認した。標的を発
現するＢ５１１５を特異的に認識し、そして溶解するこのような実験に由来する
ヒトＣＴＬ細胞株の能力を実証する例を図１に示す。

【００９６】（実施例３）（ポリペプチドの合成）ポリペプチドは、ＨＰＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−
テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）活性化を用いるＦＭＯ
Ｃ化学を使用しＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓＤｉｖｉｓｉｏｎのペプチド合成装置４３０Ａで合成し得る。Ｇｌｙ−Ｃ
ｙｓ−Ｇｌｙ配列は、ペプチドのアミノ末端に付着し、固定化表面またはペプチ
ドの標識に結合する結合体化の方法を提供し得る。固体支持体からのペプチドの
切断は、以下の切断混合物を用いて実行され得る：トリフルオロ酢酸：エタンジ
チオール：チオアニソール：水：フェノール（４０：１：２：２：３）。２時間
の切断の後、このペプチドを、冷却したメチル−ｔ−ブチル−エタノール中に沈
殿し得た。次いで、このペプチドペレットを０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）を含有する水に溶解し、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣによる精製の前に凍結乾燥し得
た。水（ＴＦＡ０．１％含有）中での０％〜６０％のアセトニトリル（ＴＦＡ０
．１％含有）の勾配をペプチド溶出のために使用し得た。純粋な画分の凍結乾燥
後に、エレクトロスプレーまたは他のタイプの質量分析法を用い、そしてアミノ
酸分析によりペプチドを特徴付け得た。

【００９７】前述により、本発明の特定の実施態様が、例証の目的のために本明細書中に記
載されているが、種々の改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなくな
され得ることが理解される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１ＡおよびＢは、それぞれ、第一のおよび第二のＢ５１１Ｓ特異的ＣＴＬク
ローンの溶解比活性を示し、それらは、Ｂ５１１（黒四角）またはＨＬＡ−Ａ３
（白四角）を形質導入した自己のＬＣＬについて測定された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 16/18 ４Ｃ０８５Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｈ０４５ 16/18 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/08 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＭＣ１２Ｐ 21/08 33/577 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＧ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号０９／１１８，６２７ (32)優先日平成10年７月17日(1998．7．17) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０９／１１８，５５４ (32)優先日平成10年７月17日(1998．7．17) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA31 BA41 CA01 CA04 CA07 CA09 DA02 DA06 DA12 EA04 FA06 GA11 HA12 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ43 QR32 QR36 QR56 QR62 QR82 QS34 QX02 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01 DA14 4B065 AA26X AA72X AA90X AA94X AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA45 CA46 4C084 AA02 AA07 BA02 BA41 BA42 CA25 NA14 ZB262 4C085 AA03 AA14 AA19 AA25 BB11 CC21 CC23 EE01 EE06 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 BA41 CA40 DA75 DA76 DA86 EA28 EA31 EA51 FA34 FA72 FA73 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、乳房
タンパク質、または保存的置換および／もしくは修飾においてのみ異なる該タン
パク質の改変体の免疫原性部分を含み、ここで該タンパク質は、ポリヌクレオチ
ド分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、該ポリヌクレオチド分子は、
以下：（ａ）配列番号３、１０、１７、２４、４５〜５２、５５〜６７、７２、
７３、および８９〜９４に列挙されるヌクレオチド配列；（ｂ）該ヌクレオチド
配列の相補体；ならびに（ｃ）中程度のストリンジェントな条件下で（ａ）また
は（ｂ）の配列にハイブリダイズする配列、からなる群より選択される配列を含
む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】請求項１に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３】配列番号３、１０、１７、２４、４５〜５２、５５〜６７、
７２、７３、および８９〜９４に提供される配列を含む、単離されたポリヌクレ
オチド分子。
【請求項４】請求項２および３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド
分子を含む、発現ベクター。
【請求項５】請求項４に記載の発現ベクターを用いて形質転換した、宿主
細胞。
【請求項６】前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母および哺乳動物細胞株
からなる群より選択される、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】請求項１に記載のポリペプチドおよび生理的に受容可能なキ
ャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項８】請求項１に記載のポリペプチドおよび非特異的免疫応答エン
ハンサーを含む、ワクチン。
【請求項９】前記非特異的免疫応答エンハンサーがアジュバントである、
請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】請求項２および３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
ド分子ならびに非特異的免疫応答エンハンサーを含む、ワクチン。
【請求項１１】前記非特異的免疫応答エンハンサーがアジュバントである
、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】乳癌の処置のための薬学的組成物であって、該組成物は、
ポリペプチドおよび生理的に受容可能なキャリアを含み、該ポリペプチドは、乳
房タンパク質の免疫原性部分を含み、ここで該タンパク質は、ポリヌクレオチド
分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、該ポリヌクレオチド分子は、以
下：（ａ）配列番号１、２、４〜９、１１〜１６、１８〜２３、２５〜４４、５
３、５４、６８〜７１、および７４〜８８に列挙されるヌクレオチド配列；（ｂ
）該ヌクレオチド配列の相補体；ならびに（ｃ）中程度のストリンジェントな条
件下で（ａ）または（ｂ）の配列にハイブリダイズする配列、からなる群より選
択される配列を含む、薬学的組成物。
【請求項１３】乳癌の処置のためのワクチンであって、該ワクチンは、ポ
リペプチドおよび非特異的免疫応答エンハンサーを含み、該ポリペプチドは、乳
房タンパク質の免疫原性部分を含み、ここで該タンパク質は、ポリヌクレオチド
分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、該ポリヌクレオチド分子は、以
下：（ａ）配列番号１、２、４〜９、１１〜１６、１８〜２３、２５〜４４、５
３、５４、６８〜７１、および７４〜８８に列挙されるヌクレオチド配列；（ｂ
）該ヌクレオチド配列の相補体；ならびに（ｃ）中程度のストリンジェントな条
件下で（ａ）または（ｂ）の配列にハイブリダイズする配列、からなる群より選
択される配列を含む、ワクチン。
【請求項１４】前記非特異的免疫応答エンハンサーがアジュバントである
、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】乳癌の処置のためのワクチンであって、該ワクチンは、ポ
リヌクレオチド分子および非特異的免疫応答エンハンサーを含み、該ポリヌクレ
オチド分子は、以下：（ａ）配列番号１、２、４〜９、１１〜１６、１８〜２３
、２５〜４４、５３、５４、６８〜７１、および７４〜８８に列挙されるヌクレ
オチド配列；（ｂ）該ヌクレオチド配列の相補体；ならびに（ｃ）中程度のスト
リンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）の配列にハイブリダイズする配列、
からなる群より選択される配列を含む、ワクチン。
【請求項１６】前記非特異的免疫応答エンハンサーがアジュバントである
、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１７】患者における乳癌の発達を阻害するための医薬の製造に使
用するための、請求項７または１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】患者における乳癌の発達を阻害するための医薬の製造に使
用するための、請求項８、１０、１３、または１５のいずれか１項に記載のワク
チン。
【請求項１９】請求項１に記載のポリペプチドを少なくとも１つ含む、融
合タンパク質。
【請求項２０】請求項１９に記載の融合タンパク質および生理的に受容可
能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項２１】請求項１９に記載の融合タンパク質および非特異的免疫応
答エンハンサーを含む、ワクチン。
【請求項２２】前記非特異的免疫応答エンハンサーがアジュバントである
、請求項２１に記載のワクチン。
【請求項２３】患者における乳癌の発達を阻害するための医薬の製造に使
用するための、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】患者における乳癌の発達を阻害するための医薬の製造に使
用するための、請求項２１に記載のワクチン。
【請求項２５】患者における乳癌を検出するための方法であって、該方法
は以下の工程：（ａ）患者からの生物学的サンプルを、ポリペプチドに結合し得る結合剤と接
触させる工程であって、該ポリペプチドは、乳房タンパク質の免疫原性部分を含
み、ここで該タンパク質は、ポリヌクレオチド分子によってコードされるアミノ
酸配列を含み、該ポリヌクレオチド分子は、配列番号１〜９４に列挙されるヌク
レオチド配列、該ヌクレオチド配列の相補体、および中程度のストリンジェント
な条件下で配列番号１〜９４で提供される配列にハイブリダイズする配列からな
る群より選択される配列を含む、工程；ならびに（ｂ）サンプル中の、該結合剤に結合するタンパク質またはポリペプチドを検
出し、それによって該患者における乳癌を検出する工程、を包含する、方法。
【請求項２６】前記結合剤がモノクローナル抗体である、請求項２５に記
載の方法。
【請求項２７】前記結合剤がポリクローナル抗体である、請求項２６に記
載の方法。
【請求項２８】患者における乳癌の進行をモニタリングするための方法で
あって、該方法は以下の工程：（ａ）患者からの生物学的サンプルを、ポリペプチドに結合し得る結合剤と接
触させる工程であって、該ポリペプチドは、乳房タンパク質の免疫原性部分を含
み、ここで該タンパク質は、ポリヌクレオチド分子によってコードされるアミノ
酸配列を含み、該ポリヌクレオチド分子は、配列番号１〜９４に列挙されるヌク
レオチド配列、該ヌクレオチド配列の相補体、および中程度のストリンジェント
な条件下で配列番号１〜９４で提供される配列にハイブリダイズする配列からな
る群より選択される配列を含む、工程；（ｂ）該サンプル中の、該結合剤に結合するタンパク質またはポリペプチドの
量を決定する工程；（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程；ならびに（ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）において検出されたポリペプチドの量を比較し
て、該患者における乳癌の進行をモニタリングする工程、を包含する、方法。
【請求項２９】ポリペプチドに結合するモノクローナル抗体であって、該
ポリペプチドは、乳房タンパク質、または保存的置換および／もしくは修飾にお
いてのみ異なる該タンパク質の改変体の免疫原性部分を含み、ここで該タンパク
質は、ポリヌクレオチド分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、該ポリ
ヌクレオチド分子は、以下：（ａ）配列番号３、１０、１７、２４、４５〜５２
、５５〜６７、７２、７３、および８９〜９４に列挙されるヌクレオチド配列；
（ｂ）該ヌクレオチド配列の相補体；ならびに（ｃ）中程度のストリンジェント
な条件下で（ａ）または（ｂ）の配列にハイブリダイズする配列、からなる群よ
り選択される配列を含む、モノクローナル抗体。
【請求項３０】患者における乳癌の発達を阻害するための医薬の製造にお
ける使用のための、請求項２９に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３１】前記モノクローナル抗体が治療用薬剤と結合体化される、
請求項３０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３２】患者における乳癌を検出するための方法であって、該方法
は以下の工程：（ａ）患者からの生物学的サンプルを、ポリメラーゼ連鎖反応における少なく
とも２つのオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程であって、該オリゴ
ヌクレオチドの少なくとも１つは、乳房タンパク質の免疫原性部分を含むポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド分子に特異的であり、ここで該タンパク質
は、ポリヌクレオチド分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、該ポリヌ
クレオチド分子は、配列番号１〜９４に列挙されるヌクレオチド配列、該ヌクレ
オチド配列の相補体、および中程度のストリンジェントな条件下で配列番号１〜
９４の配列にハイブリダイズする配列からなる群より選択される配列を含む、工
程；ならびに（ｂ）サンプル中の、該オリゴヌクレオチドプライマーの存在下で増幅するポ
リヌクレオチド配列を検出し、それにより乳癌を検出する工程、を包含する、方法。
【請求項３３】前記オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つが、
配列番号１〜９４から選択される配列を含むポリヌクレオチド分子の少なくとも
約１０の連続するヌクレオチドを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】診断用キットであって、以下：（ａ）請求項２９に記載の１つ以上のモノクローナル抗体；および（ｂ）検出試薬、を含む、キット。
【請求項３５】診断用キットであって、以下：（ａ）ポリヌクレオチド分子によってコードされるポリペプチドに結合する１
つ以上のモノクローナル抗体であって、該ポリヌクレオチド分子は、配列番号１
、２、４〜９、１１〜１６、１８〜２３、２５〜４４、５３、５４、６８〜７１
、および７４〜８８からなる群より選択されるヌクレオチド配列、該配列の相補
体、ならびに中程度のストリンジェントな条件下で配列番号１、２、４〜９、１
１〜１６、１８〜２３、２５〜４４、５３、５４、６８〜７１または７４〜８８
の配列にハイブリダイズする配列からなる群より選択される配列を含む、モノク
ローナル抗体；ならびに（ｂ）検出試薬、を含む、キット。
【請求項３６】前記モノクローナル抗体が固体支持体に固定されている、
請求項３４または３５に記載のキット。
【請求項３７】前記固体支持体が、ニトロセルロース、ラテックス、また
はプラスチック材料を含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】前記検出試薬が、結合剤に結合体化されたレポーター基を
含む、請求項３４または３５に記載のキット。
【請求項３９】前記結合剤が、抗イムノグロブリン、プロテインＧ，プロ
テインＡ、およびレクチンからなる群より選択される、請求項３８に記載のキッ
ト。
【請求項４０】前記レポーター基が、放射性同位体、蛍光基、発光基、酵
素、ビオチン、および色素粒子からなる群より選択される、請求項３８に記載の
キット。
【請求項４１】少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む診
断用キットであって、該オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つは、乳
房タンパク質の免疫原性部分を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
分子に特異的であり、該タンパク質はポリヌクレオチド分子によってコードされ
るアミノ酸配列を含み、該ポリヌクレオチド分子は、配列番号１〜９４に列挙さ
れるヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列の相補体、および中程度のストリン
ジェントな条件下で配列番号１〜９４の配列にハイブリダイズする配列からなる
群より選択される配列を含む、診断用キット。
【請求項４２】前記オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つが、
配列番号１〜９４から選択される配列を含むポリヌクレオチド分子の少なくとも
約１０の連続するヌクレオチドを含む、請求項４１に記載の診断用キット。
【請求項４３】患者における乳癌を検出するための方法であって、該方法
は以下の工程：（ａ）該患者から生物学的サンプルを得る工程；（ｂ）該生物学的サンプルを、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分
子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程であって、該ポリペ
プチドは、乳房タンパク質の免疫原性部分を含み、該タンパク質は、ポリヌクレ
オチド分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、該ポリヌクレオチド分子
は、配列番号１〜９４に列挙されるヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列の相
補体、および中程度のストリンジェントな条件下で配列番号１〜９４の配列にハ
イブリダイズする配列からなる群より選択される配列を含む、工程；ならびに（ｃ）該サンプル中の、該オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする
ポリヌクレオチド配列を検出し、それにより該患者における乳癌を検出する工程
、を包含する、方法。
【請求項４４】前記オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１〜９４か
らなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチド分子の少なくとも約１５の
連続するヌクレオチドを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子に特異的
なオリゴヌクレオチドプローブを含む診断用キットであって、該ポリペプチドは
、乳房タンパク質の免疫原性部分を含み、該タンパク質は、ポリヌクレオチド分
子によってコードされるアミノ酸配列を含み、該ポリヌクレオチド分子は、配列
番号１〜９４に列挙されるヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列の相補体、お
よび中程度のストリンジェントな条件下で配列番号１〜９４の配列にハイブリダ
イズする配列からなる群から選択される配列を含む、診断用キット。
【請求項４６】前記オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１〜９４か
らなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチド分子の少なくとも約１５の
連続するヌクレオチドを含む、請求項４５に記載の診断用キット。
【請求項４７】Ｔ細胞が増殖するように請求項１に記載の少なくとも１つ
のポリペプチドの存在下でインキュベートした、患者における乳癌を処置するた
めの医薬の製造における使用のための、患者からの末梢血細胞。
【請求項４８】前記Ｔ細胞が１回以上反復される、請求項４７に記載の末
梢血細胞。
【請求項４９】患者における乳癌の処置のための組成物であって、請求項
１に記載のポリペプチドの存在下で増殖したＴ細胞を、薬学的に受容可能なキャ
リアと組み合わせて含む、組成物。
【請求項５０】請求項１に記載の少なくとも１つのポリペプチドの存在下
でインキュベートした、患者における乳癌を処置するための医薬の製造における
使用のための、抗原提示細胞。
【請求項５１】前記抗原提示細胞が、樹状細胞およびマクロファージ細胞
からなる群より選択される、請求項５０に記載の細胞。
【請求項５２】患者における乳癌の処置のための組成物であって、請求項
１に記載のポリペプチドの存在下でインキュベートした抗原提示細胞を、薬学的
に受容可能なキャリアと組み合わせて含む、組成物。