PT2266603E

PT2266603E - Vacinas tumorais

Info

Publication number: PT2266603E
Application number: PT10170408T
Authority: PT
Inventors: Jean Stephenne; Nathalie Garcon; Catherine Marie Ghislaine Gerard
Original assignee: Glaxosmithkline Biolog Sa
Priority date: 2000-10-18
Filing date: 2001-10-16
Publication date: 2012-11-02
Also published as: KR100831139B1; DK2266603T3; DE60131670T2; PT1889630E; CY1108526T1; JP2008285487A; EP2266603B1; DK1889630T3; HK1117729A1; ATE534401T1; EP2266603A1; PL211151B1; DE60131670D1; ES2377077T3; CY1113735T1; IL155282A; PT1326638E; US20050019340A1; ES2392943T3; KR20030044015A

Description

DESCRIÇÃO "VACINAS TUMORAIS" A presente invenção refere-se a uma nova composição imunogénica compreendendo uma combinação de um antigénio ASCL-1 ou ASCL-2 de cancro e uma composição de adjuvante combinada compreendendo um oligonucleótido imunoestimulador, uma saponina e compreendendo um lipopolissacárido, como definido na reivindicação 1.

Apesar de enormes investimentos de recursos financeiros e humanos, o cancro permanece uma das principais causas de morte. Por exemplo, o cancro é a principal causa de morte em mulheres entre as idades de 35 e 74 anos. 0 cancro da mama é a doença maligna mais comum em mulheres e a incidência para desenvolver cancro da mama está a aumentar. Estima-se que uma em nove mulheres será diagnosticada com a doença. As abordagens convencionais para a cura do cancro da mama centraram-se à volta de uma combinação de cirurgia, radiação e quimioterapia. Estas abordagens resultaram em alguns sucessos extraordinários em algumas doenças. Contudo, o cancro da mama é, na maioria das vezes, incurável quando diagnosticado para lá de um certo estádio. São necessárias abordagens alternativas para o diagnóstico precoce e terapia. 0 documento WO 01/62778 publicado em 30.08.2011 divulga composições imunogénicas compreendendo HASH-2 e um adjuvante compreendendo CpG e saponina ou QS21 e 3D-MPL. 1

Os oligonucleótidos imunoestimuladores contendo dinucleótidos CpG não metilados ("CpG") e são conhecidos na técnica como sendo adjuvantes quando administrados por via sistémica e mucosa (documentos WO 96/02555, EP 468520, Davis et al., J. Immunol, 1998,160 (2): 870-876; McCluskie e Davis, J. Immunol., 1998, 161(9):4463-6). CpG é uma abreviatura para motivos de dinucleótidos de citosina-guanosina presentes no ADN. Historicamente, foi observado que a fracção de ADN de BCG podia exercer um efeito anti-tumoral. Em estudos posteriores, foi demonstrado que oligonucleótidos sintéticos derivados de sequências de genes de BCG eram capazes de induzir efeitos imunoestimuladores {in vitro e in vivo). Os autores destes estudos concluíram que certas sequências palindrómicas, incluindo um motivo central CG, continham esta actividade. O papel central do motivo CG na imunoestimulação foi mais tarde elucidado numa publicação por Krieg, Nature 374, p546, 1995. A análise detalhada mostrou que o motivo CG tem de estar num certo contexto da sequência e que tais sequências são comuns no ADN bacteriano mas são raras em ADN de vertebrados. A sequência imunoestimuladora é frequentemente: Purina, Purina, C, G, pirimidina, pirimidina; em que o motivo dinucleótido CG não é metilado, mas outras sequências CpG não metiladas são conhecidas como sendo imunoestimuladoras e podem ser utilizadas na presente invenção.

Em certas combinações dos seis nucleótidos está presente uma sequência palindrómica. Alguns destes motivos, seja como repetições de um motivo ou uma combinação de diferentes motivos, podem estar presentes no mesmo oligonucleótido. A presença de uma ou mais destas sequências imunoestimuladoras contendo oligonucleótidos pode activar vários subconjuntos imunitários, incluindo células assassinas naturais (que produzem interferão γ 2 e possuem actividade citolítica) e macrófagos (Wooldrige et al., Vol 89 (n° 8), 1977). No entanto sequências contendo CpG não metilado não possuindo esta sequência de consenso mostraram agora ser imunomoduladoras.

CpG, quando formulado em vacinas, é geralmente administrado em solução livre em conjunto com antigénio livre (documento WO 96/02555; McCluskie e Davis, supra) ou covalentemente conjugado a um antigénio (Publicação PCT N° WO 98/16247) ou formulado com um veiculo, tal como hidróxido de alumínio ((Antigénio de superfície da hepatite) Davis et al., supra; Brazolot-Millan et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 1998, 95 (26), 15553-8).

As combinações de adjuvante da presente invenção incluem, pelo menos, um adjuvante derivado de lipopolissacárido enterobacteriano. É sabido, desde há muito, que o lipopolissacárido enterobacteriano (LPS) é um estimulador potente do sistema imunitário, embora a sua utilização em adjuvantes tenha sido abreviada pelos seus efeitos tóxicos. Um derivado não tóxico de LPS, monofosforil-lípido A (MPL), produzido por remoção do grupo carbo-hidrato central e o fosfato da glucosamina da extremidade redutora, foi descrito por Ribi et al., (1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NI, p407- 419) e possui a seguinte estrutura: 3

Uma outra versão destoxifiçada de MPL resulta da remoção da cadeia acilo da posição 3 da estrutura do dissacárido e é denominada monofosforil-lipido A 3-0-Desacilado (3D-MPL). Pode ser purificado e preparado pelos métodos ensinados no documento GB 2122204B, cuja referência divulga, também, a preparação de difosforil-lipido A e suas variantes 3-0-desaciladas. Uma forma preferida de 3D-MPL é na forma de uma emulsão, possuindo um tamanho de partículas pequeno inferior a 0,2 pm em diâmetro e o seu método de preparação é divulgado no documento WO 94/21292. As formulações aquosas compreendendo monofosforil-lipido A e um agente tensioactivo foram descritas no documento WO 98/43670A2.

Os adjuvantes derivados de lipopolissacárido bacteriano a serem formulados nas combinações de adjuvante da presente invenção podem ser purificados e processados de fontes bacterianas ou, alternativamente, estes podem ser sintéticos. Por exemplo, monofosforil-lipido A purificado é descrito em Ribi et al., 1986 (supra) e monofosforil- ou difosforil-lipido A 3-O-desacilado derivado de Salmonella sp. é descrito nos documentos GB 2220211 e US 4912094. Foram descritos outros 4 lipopolissacáridos purificados e sintéticos (documentos WO 98/01139; US 6005099 e EP 0729473 Bl; Hilgers et al., 1986,

Int. Arch. Allergy. Immunol., 79 (4): 392-6; Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1): 141-6; e documento EP 0549074 Bl).

Adjuvantes de lipopolissacárido bacteriano particularmente preferidos são 3-D-MPL e os disssacáridos β(1-6) glucosamina descritos nos documentos US6005099 e EP 0729473 Bl.

Consequentemente, os derivados de LPS que podem ser utilizados na presente invenção são DPL, MPL ou 3D-MPL.

Um adjuvante dissacárido preferido é um lípido A purificado ou sintético da seguinte fórmula:

em que R2 pode ser H ou P03H2; R3 pode ser uma cadeia acilo ou um resíduo β-hidroximiristoilo ou um 3-aciloxiacilo tendo a fórmula: 5 I c*"0 CHj CH—O (CHi)r R4 CH|

O

R em que e em que X e Y têm um valor de desde 0 até cerca de 20.

As combinações de adjuvantes 3D-MPL e saponina derivados da casca de Quillaja Saponaria molina foram descritas no documento EP 0761231B. O documento WO 95/17210 divulga um sistema de adjuvante em emulsão baseado no esqualeno, α-tocoferol e monooleato de polioxietileno sorbitano (TWEEN80), formulados com o imunoestimulante QS21, opcionalmente com 3D-MPL.

As saponinas são conhecidas como adjuvantes em vacinas para administração sistémica. A actividade adjuvante e hemolitica das saponinas individuais têm sido extensamente estudadas na técnica (Lacaille-Dubois e Wagner, supra). Por exemplo, Quil A (derivada da casca da árvore da América do Sul Quillaja Saponaria Molina) e suas fracções são descritas no documento US 5057540 e "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55; e documento EP 0362279 Bl.

Estruturas particuladas, denominadas Complexos Imunoestimuladores (ISCOMS), compreendendo fracções de Quil A, são hemolíticas e foram utilizadas na preparação de vacinas 6 (Morein, B., documento EP 0109942 Bl). Estas estruturas foram reportadas como possuindo actividade adjuvante (documentos EP 0109942 Bl; WO 96/11711).

As saponinas hemolíticas QS21 e QS17 (fracções de Quil A purificadas por HPLC) foram descritas como adjuvantes sistémicos potentes e o método da sua produção é divulgado na Patente US N° 5057540 e documento EP 0362279 Bl. Também descrito nestas referências está a utilização de QS7 (uma fracção não hemolítica de Quil-A) que actua como um potente adjuvante para vacinas sistémicas. A utilização de QS21 é ainda descrita em Kensil et al. , (1991. J. Immunoloqy vol 146, 431-437). As combinações de QS21 e polissorbato ou ciclodextrina são também conhecidas (documento WO 99/10008). Sistemas de adjuvante particulados compreendendo fracções de QuilA, tais como QS21 e QS7, são descritos nos documentos WO 96/33739 e WO 96/11711.

Outras saponinas que foram utilizadas em estudos de vacinação sistémica incluem os derivados de outras espécies de plantas, tais como Gypsophila e Saponaria (Bomford et al., Vaccine, 10(9):572-577, 1992).

As saponinas são também conhecidas por terem sido utilizadas em estudos de vacinas aplicadas em mucosas e que obtiveram sucesso variável na indução de respostas imunitárias. Foi previamente demonstrado que a saponina Quil-A não tinha efeito na indução de uma resposta imunitária quando o antigénio é administrado intranasalmente (Gizurarson et al., 1994. Vaccine Research 3, 23-29). Ao mesmo tempo, outros autores utilizaram este adjuvante com sucesso (Maharaj et al., Can. J. Microbiol, 1986, 32 (5) : 414-20; Chavali e Campbell, Immunobiology, 174(3): 347-59). ISCOM compreendendo saponina Quil A foram utilizados em 7 formulações de vacina intragástrica e intranasal e exibiam actividade adjuvante (Mel Mowat et al., 1991, Immunology, 72, 317-322; Mel Mowat e Donachie, Immunology Today, 12, 383-385). QS21, a fracção não tóxica de Quil A, foi também descrita como um adjuvante oral ou intranasal (Sumino et al., J Virol., 1998, 72 (6) : 4931-9; documento WO 98/56415).

As saponinas são apresentadas em: Lacaille-Dubois, M e Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine, vol 2, pp 363-386). As saponinas são esteróides ou triterpenoglicósidos vastamente distribuídas nos reinos das plantas e dos animais marinhos. As saponinas são notadas por formar soluções coloidais em água que formam espuma com agitação e por precipitar colesterol. Quando as saponinas estão próximas das membranas celulares criam estruturas do tipo poro na membrana o que provoca o rebentamento da membrana. A hemólise de eritrócitos é um exemplo deste fenómeno, que é uma propriedade de algumas, mas não todas, as saponinas. A presente invenção refere-se à observação surpreendente de que combinações de oligonucleótidos imunoestimuladores (CpG), saponina e opcionalmente um lipopolissacárido são adjuvantes extremamente potentes. Consequentemente, é proporcionada uma combinação de vacina compreendendo uma combinação de saponina e um oligonucleótido imunoestimulador e um lipopolissacárido com um dos antigénios de cancro ASCL 1 (HASH-1) ou ASCL 2 (HASH-2), de um modo preferido, QS21, um oligonucleótido imunoestimulador e um 3D-MPL.

De um modo preferido, a vacina da presente invenção pode ainda compreender um veículo. os oligonucleótidos, nas composições de adjuvante e vacina, podem actuar sinergicamente com o combinado saponina/lipopolissacárido na indução de respostas imunitárias específicas para antigénio que levam a uma regressão tumoral aumentada. As formulações são potentes na indução de respostas imunitárias convencionalmente associadas com o sistema imunitário do tipo Thl. Consequentemente, as combinações de adjuvante não são apenas adequadas para imunoprofilaxia de doenças, mas, também, para imunoterapia de doenças, tal como cancro.

As formulações contêm um antigénio anti-tumoral e são úteis para o tratamento imunoterapêutico de cancros.

Os oligonucleótidos preferidos para utilização em adjuvantes ou vacinas da presente invenção contêm, de um modo preferido, dois ou mais motivos de dinucleótido CpG separados por, pelo menos, três, de um modo mais preferido, pelo menos, seis ou mais nucleótidos. Os oligonucleótidos da presente invenção são, tipicamente, desoxinucleótidos. Numa forma de realização preferida, o internucleótido no oligonucleótido é fosforoditioato ou, de um modo mais preferido, uma ligação fosforotioato, embora a ligação internucleótido fosfodiéster e outras estejam no âmbito da invenção, incluindo oligonucleótidos com ligações internucleótido mistas. Os métodos para produzir oligonucleótidos fosforotioato ou fosforoditioato são descritos nos documentos US 5666153, US 5278302 e W095/26204.

Os exemplos de oligonucleótidos preferidos têm as sequências que se seguem. As sequências contêm, de um modo preferido, ligações internucleótido modificadas com fosforotioato. 9 OLIGO 1 (SEQ ID N°: 1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) OLIGO 2 (SEQ ID N°: 2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)

OLIGO 3 (SEQ ID N°: 3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG OLIGO 4 (SEQ ID N° : 4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) OLIGO 5 (SEQ ID N°: 5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668).

Os oligonucleótidos CpG alternativos podem compreender as sequências preferidas acima, na medida em que estas possuem deleções ou adições inconsequentes. Os oligonucleótidos CpG utilizados na presente invenção podem ser sintetizados por qualquer método conhecido na técnica (e. g., documento EP 468520). Convenientemente, estes oligonucleótidos podem ser sintetizados utilizando um sintetizador automático. Estes têm, tipicamente, entre 10-50 bases de comprimento.

Os oligonucleótidos utilizados na presente invenção são tipicamente desoxinucleótidos. Numa forma de realização preferida, o internucleótido ligado ao oligonucleótido é fosforoditioato ou, de um modo mais preferido, ligação fosforotioato, embora os fosfodiésteres estejam no âmbito da presente invenção. São contemplados os oligonucleótidos compreendendo diferentes ligações internucleótido, e. g., fosfodiésteres e fosforotioato misturados. Podem ser utilizadas outras ligações internucleótido que estabilizam o oligonucleótido.

As saponinas que podem ser utilizadas nas combinações de adjuvante da presente invenção incluem as derivadas da casca de Quillaja Saponaria Molina, denominada Quil A e suas fracções, descritas no documento US 5057540 e "Saponins as vacinai adjuvants ", Kensil, C.R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1—2):1—55; e documento EP 0362279 BI. São 10 particularmente preferidas as fracções de Quil A QS21, QS7 e QS17. A β-escina é outra saponina hemolitica preferida para utilização nas composições de adjuvante da presente invenção. A escina é descrita no Merck Index (12a ed: entrada 3737) como uma mistura de saponinas que ocorre na semente do castanheiro da índia, Lat: Aesculus hippocastanum. 0 seu isolamento é descrito por cromatografia e purificação (Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)) e por resinas de troca iónica (Erbring et al., documento US 3238190). As fracções de escina, cx e β, foram purificadas e mostraram ser biologicamente activas (Yoshikawa M, et al., (Chem Pharm Buli (Tóquio) Ago. 1996; 44 (8): 1454-1464)). A β-escina é também conhecida como aescina.

Outra saponina hemolitica preferida para utilização na presente invenção é a Digitonina. A digitonina é descrita no

Merck index (12a Edição, entrada 3204) como uma saponina, sendo derivada de sementes de Digitalis purpurea e purificada de acordo com o processo descrito Gisvold et al., J. Am. Pharm Assoe., 1934, 23, 664; e Ruhenstroth-Bauer, Physiol. Chem., 1955, 301, 621. A sua utilização é descrita como sendo um reagente clinico para a determinação de colesterol.

As combinações de adjuvante podem ainda compreender um veiculo, de modo a que a saponina ou CpG, ou lipopolissacárido possam ser associados com uma entidade veiculo particulada para aumentar a capacidade de adjuvante da combinação. As vacinas sistémicas particularmente preferidas compreendem, por exemplo, uma molécula transportadora. O CpG utilizado nas combinações de adjuvante pode estar 11 livre em solução ou pode estar complexado com veículos part iculados, tais como sais minerais (por exemplo, mas não se restringindo a sais de alumínio ou cálcio), lipossomas, ISCOM, emulsões (óleo-em-água, água-em-óleo, água-em-óleo-em-água) , polímeros (tais como, mas não se restringindo a poliláctico, poliglicólico, polifosfazina, poliaminoácido, alginato, quitosano) ou micropartículas. De um modo preferido, os referidos veículos são catiónicos. As vacinas da presente invenção compreendem ainda um antigénio que pode ser associado com o veículo complexo CpG-veículo ou pode não ser associado com o complexo CpG-veículo. Neste caso, o antigénio pode ser a suspensão livre ou associada com um veículo separado.

As saponinas podem ser separadas na forma de micelas ou podem estar na forma de grandes estruturas ordenadas, tal como ISCOM (documento EP 0109942 Bl) ou lipossomas (documento WO 96/33739) quando formuladas com colesterol e lípido, ou na forma de uma emulsão óleo em água (documento WO 95/17210). As saponinas podem, de um modo preferido, estar associadas com um sal metálico, tal como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio (documento WO 98/15287). Alternativamente, a saponina pode ser associada com um veículo particulado, tal como quitosano. A saponina pode também estar num estado seco, tal como um pó. As formulações finais de vacina na forma em que são administrados à superfície da mucosa são, de um modo preferido, hemolíticos por natureza. A saponina pode ou não estar associada fisicamente com o antigénio através de ligação directa ou por co-interacção com a mesma molécula de veículo particulado (documentos GB9822712.7; WO 98/16247). O CpG e saponina e lipopolissacárido nas vacinas da presente invenção podem, por si só, estar separados ou 12 associados. Por exemplo, o CpG e saponina podem estar livres numa suspensão ou podem ser associados através de um veículo, de um modo mais preferido, um veiculo particulado, tal como hidróxido de alumínio ou através de lipossoma catiónico ou ISCOM.

Uma combinação de adjuvante preferida é composta de um ou mais oligonucleót idos CpG contendo, pelo menos 3, de um modo preferido, pelo menos, 6 nucleótidos entre dois motivos CG adjacentes, em conjunto com QS21 e 3D-MPL, e um veículo particulado seleccionado do grupo compreendendo uma emulsão óleo-em-água ou DQ. 0 lipopolissacárido é um derivado de lípido di ou monofosforilo, de um modo preferido, 3 des-O-acilado, em particular, Monofosforil-lípido A 3 des-O-acilado. De um modo muito preferido, a combinação de ajuvante compreende CpG 2006 (SEQ ID N°: 4) ou CpG 1758 (SEQ ID N°: 2) ou CpG 1826 (SEQ ID N°: 1) misturado com QS21. Consequentemente, as vacinas particularmente preferidas compreendem, por exemplo, essas combinações de adjuvante e un antigénio. A vacina preferida da presente invenção é utilizada para produzir respostas imunitárias sistémicas, após a administração a um indivíduo através de via sistémica.

As combinações de adjuvante podem compreender uma emulsão com base em óleo. Os adjuvantes em emulsão de óleo foram conhecidos durante muitos anos, incluindo trabalho em adjuvantes de Freund completos e incompletos em emulsão de óleo mineral. Uma vez que, nessa altura, foi efectuado muito trabalho para conceber alternativas estáveis e bem toleradas a estas formulações de adjuvante, potentes, mas reactogénicas.

Foram descritos muitos sistemas de emulsão simples ou em multi-fase. Os adjuvantes em emulsão de óleo em água foram, per 13 se, sugeridos como úteis como composições de adjuvante (documento EP 0399843B), também combinações de emulsões óleo em água e outros agentes activos foram descritos como adjuvantes para vacinas (documentos WO 95/17210; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241) . Foram descritos outros adjuvantes em emulsão de óleo, tal como emulsões água em óleo (documentos US 5422109; EP 0480982 B2) e água em emulsões óleo em água (documentos US 5424067; EP 0480981 B).

Os adjuvantes em emulsão de óleo podem ser naturais ou sintéticos e podem ser minerais ou orgânicos. Os exemplos de óleos minerais e orgânicos tornar-se-ão rapidamente óbvios para o especialista da técnica.

De modo a que qualquer composição óleo em água seja adequada para administração humana, a fase óleo do sistema de emulsão compreende, de um modo preferido, um óleo metabolizável. O significado do termo metabolizável é bem conhecido na técnica. Metabolizável pode ser definido como "sendo capaz de ser transformado pelo metabolismo" (Dorland's Illustrated Medicai Dictionary, W. B. Sanders Company, 25a edição (1974)). O óleo podem ser qualquer óleo vegetal, óleo de peixe, óleo animal ou óleo sintético, que não é tóxico para o receptor e é capaz de ser transformado pelo metabolismo. As nozes (tal como óleo de amendoim), sementes e grãos são fontes comuns de óleos vegetais. Os óleos sintéticos são também parte desta invenção e podem incluir óleos comercialmente disponíveis, tais como NEOBEE® e outros. O esqualeno (2,6, 10,15,19,23-Hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosa-hexaeno) é um óleo insaturado que é encontrado em grandes quantidades em óleo de fígado de tubarão e em pequenas quantidades em azeite, óleo de germe de milho, óleo de arroz óleo de bagos de arroz e leveduras, e é um óleo particularmente 14 preferido para utilização nesta invenção. 0 esqualeno é um óleo metabolizável em virtude do facto de ser um intermediário na biossintese de colesterol (Merck Index, 10a Edição, entrada n° 8619) .

As emulsões de óleo particularmente preferidas sao emulsões óleo em água e, em particular, o esqualeno em emulsões em água.

Além disso, os adjuvantes em emulsão de óleo muito preferidos compreendem um antioxidante, que é, de um modo preferido, o óleo α-tocoferol (vitamina E, documento EP 0382271 Bl) .

Os documentos WO 95/17210 e WO 99/11241 divulgam adjuvantes de emulsão com base em esqualeno, α-tocoferol e TWEEN 80, opcionalmente formulados com os imunoestimulantes QS21 e/ou 3D-MPL. O documento WO 99/12565 divulga uma melhoria destas emulsões de esqualeno com a adição de um esterol na fase de óleo. Adicionalmente, pode ser adicionado um triglicérido, tal como tricaprilina (C27H5006) à fase de óleo, de modo a estabilizar a emulsão (documento WO 98/56414). O tamanho das gotas de óleo encontradas na emulsão óleo em água estável é, de um modo preferido, inferior a 1 micron, pode estar no intervalo de substancialmente 30-600 nm, de um modo preferido, substancialmente cerca de 30-500 nm de diâmetro e, de um modo muito preferido, substancialmente 150-500 nm de diâmetro e, em particular, cerca de 150 nm de diâmetro, como medido por espectroscopia de correlação de fotões. A este respeito, 80% das gotas de óleo, em número, devem estar nos intervalos preferidos, de um modo mais preferido, mais do que 90% e, de modo muito preferido, mais do que 95% das gotas de óleo, em número, estão 15 nos intervalos de tamanho definidos. As quantidades dos componentes presentes nas emulsões de óleo estão, convencionalmente, no intervalo de 2 a 10% em óleo, tal como o esqualeno; e quando presente, de 2 a 10% de alfa-tocoferol; e de 0,3 a 3% de tensioactivo, tal como monooleato de sorbitano de polioxietileno. De um modo preferido, a proporção de óleo:alfa-tocoferol é igual ou inferior a 1, uma vez que proporciona uma emulsão mais estável. Span 85 pode também estar presente a um nivel de cerca de 1%. Em alguns casos, pode ser vantajoso que as vacinas da presente invenção contenham, adicionalmente, um estabilizante. O método de produção de emulsões óleo em água é bem conhecido do especialista na técnica. Normalmente, o método compreende a mistura da fase óleo com um tensioactivo, tal como uma solução PBS/TWEEN80™, seguida pela homogeneização utilizando um homogeneizador, será óbvio para um especialista na técnica que um método compreendendo passar a mistura duas vezes através de uma agulha de seringa será adequado para homogeneizar pequenos volumes de liquido. Do mesmo modo, o processo de emulsificação em microfluidizante (máquina microfluidos M110S, máximo de 50 passos, durante um período de 2 minutos, à pressão máxima de entrada de 6 bar (pressão de saída de cerca de 850 bar) ) pode ser adaptado pelo especialista na técnica para produzir volumes de emulsão mais pequenos ou maiores. Esta adaptação pode ser conseguida por experiências de rotina compreendendo a medida da emulsão resultante até ser conseguida uma preparação com gotas de óleo com o diâmetro desejado.

As combinações de adjuvante podem ser utilizadas como adjuvante sistémico ou de mucosa. Numa forma particular da invenção é proporcionada uma vacina sistémica para ser 16 administrada através das vias sistémica ou parentérica, tal como a administração intramuscular, intradérmica, transdérmica, subcutânea, intraperitoneal ou intravenosa. Uma via preferida de administração é através da via transdérmica, por exemplo, por pensos na pele.

As preparações de vacina sistémica da presente invenção podem ser utilizadas para proteger ou tratar um mamífero susceptível ou a sofrer de doença, através da administração da referida vacina por administração intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intravenosa ou subcutânea. Os métodos de administração sistémica das preparações de vacina podem incluir seringas e agulhas convencionais ou dispositivos concebidos para distribuição balística de vacinas sólidas (documento WO 99/27961) ou dispositivos sem agulhas de pressão de jacto de líguido (documentos US 4596556; US 5993412) ou pensos transdérmicos (documentos WO 97/48440; WO 98/28037), e podem também ser utilizados para aumentar a imunogenicidade de antigénios aplicados na pele (administração transdérmica ou transcutênea, documentos WO 98/20734; WO 98/28037). É divulgado um dispositivo de distribuição para administração sistémica, pré-carregado com as composições de vacina da presente invenção. Conseguentemente, é proporcionado um método para indução de uma resposta imune num indivíduo compreendendo a administração de uma vacina como definida nas reivindicações, ao indivíduo, em que a vacina é administrada através da via parentérica ou sistémica.

Alternativamente, as preparações de vacina da presente invenção podem ser utilizadas para proteger ou tratar um mamífero susceptível a, ou a sofrer de doença, através da administração da referida vacina através de uma via mucosa, tal 17 como a via oral/alimentar ou nasal. As vias de mucosa alternativas são intravaginal e intra-rectal. A via de administração mucosa preferida é a via nasal, denominada vacinação intranasal. Os métodos de vacinação intranasal são bem conhecidos na técnica, incluindo a administração de uma forma de vacina em gota, spray ou pó seco na nasofaringe do indivíduo a ser imunizado. As formulações de vacina nebulizada ou em aerossol também fazem parte desta invenção. As formulações entéricas, tais como cápsulas e grânulos gastro-resistentes para administração oral, supositórios para administração rectal ou vaginal também fazem parte desta invenção.

As combinações de adjuvante representam uma classe de adjuvantes de mucosa adequadas para aplicação em humanos para substituir a vacinação sistémica por vacinação mucosa. Numa forma preferida, saponinas puras, tais como Quil A ou seus derivados, incluindo as saponinas QS21; Escina; Digitonina; ou Gypsophila ou Chenopodium quinoa em combinação com oligonucleótidos imunoestimuladores, podem ser utilizadas como adjuvantes para a administração de antigénios mucosa para conseguir uma resposta imunitária sistémica.

As combinações de adjuvante são utilizadas na formulação de vacinas, vacinas essas que podem ser administradas através da via sistémica ou de mucosa. De um modo preferido, quando as vacinas são utilizadas para administração mucosa, a combinação de adjuvante compreende uma saponina hemolítica.

Para administração mucosa, de um modo preferido, a composição da invenção compreende uma saponina hemolítica. A saponina hemolítica ou preparação de saponina, no âmbito desta invenção, é para ser determinada com referência ao seguinte 18 ensaio . 1. Sangue fresco de cobaios é lavado com solução salina tamponada com fosfato (PBS), 3 vezes, numa centrífuga de bancada. Após ressuspensão no volume original o sangue é posteriormente diluído 10 vezes em PBS. 2. 50 pL desta suspensão de sangue são adicionados a 800 pL de PBS contendo diluições de duas vezes de tensioactivo ou saponina. 3. Após 8 horas a hemólise é avaliada visualmente ou através da medida da densidade óptica do sobrenadante. A presença de um sobrenadante vermelho que absorve luz a 570 nm indica a presença de hemólise. 4. Os resultados são expressos como a concentração da primeira diluição de saponina até que não ocorra mais hemólise.

Para os propósitos desta invenção, a preparação de adjuvante de saponina é hemolítica se lisar os eritrócitos a uma concentração inferior a 0,1%. Como meio de referência, amostras substancialmente puras de QuilA, QS21, QS7, Digitonina e β-escina são todas saponinas hemolíticas como definido neste ensaio. Na variabilidade experimental inerente de tal ensaio biológico, as saponinas têm, de um modo preferido, uma actividade hemolítica de, aproximadamente, entre 0,5-0,00001%, de um modo mais preferido, entre 0,05-0,00001%, de um modo ainda mais preferido, entre 0,005-0,00001% e, de um modo muito preferido, entre 0,001-0,0004%. Idealmente, as referidas saponinas devem ter uma actividade hemolítica semelhante (i. e., numa diferença de dez vezes) à de QS21. 19

As vacinas da presente invenção podem também ser administradas através da via oral. Nestes casos, o excipiente farmaceuticamente aceitável pode, também, incluir tampões alcalinos ou cápsulas ou microgrânulos entéricos. As vacinas da presente invenção podem também ser administradas pela via vaginal. Nestes casos, os excipientes farmaceuticamente aceitáveis podem, também, incluir emulsificantes, polímeros, tal como CARBOPOL® e outros estabilizantes conhecidos de cremes vaginais e supositórios. As vacinas da presente invenção podem também ser administradas pela via rectal. Nestes casos, os excipientes podem, também, incluir ceras e polímeros conhecidos na técnica para formar supositórios rectais.

As preparações de mais do que uma saponina nas combinações de adjuvante também fazem parte da presente invenção. Por exemplo, as combinações de, pelo menos, dois do grupo que se segue, compreendendo QS21, QS7, Quil A, β-escina, ou digitonina. Além disso, as composições da presente invenção podem compreender combinações de mais do que um oligonucleótido imunoestimulador.

Alternativamente, as formulações podem ser combinadas com veículos de vacina compostos de quitosano ou outros polímeros policatiónicos, partículas poliláctido e poliláctido-co-glicolido, matriz de polímero com base em poli-N-acetilglucosamina, partículas compostas de polissacáridos ou polissacáridos quimicamente modificados, lipossomas e partículas baseadas em lípido, partículas compostas de monoésteres de glicerol, etc. As saponinas podem também ser formuladas na presença de colesterol para formar estruturas particuladas, tais como lipossomas ou ISCOM. Além disso, as 20 saponinas podem ser formuladas em conjunto com um éter ou éster de polioxietileno, numa solução ou suspensão não particulada, ou numa estrutura particulada, tal como um lipossoma paucilamelar ou ISCOM. As saponinas podem, também, ser formuladas com excipientes, tal como CarbopolR, para aumentar a viscosidade ou podem ser formuladas numa forma de pó seco com um excipiente em pó, tal como lactose.

Os adjuvantes particularmente preferidos são combinações de 3D-MPL e QS21 (documento EP 0671948 Bl), emulsões óleo em água compreendendo 3D-MPL e QS21 (documentos WO 95/17210, WO 98/56414) em combinação com os oligonucleótidos CpG como aqui descrito. A quantidade de CpG ou oligonucleótidos imunoestimuladores nos adjuvantes ou vacinas da presente invenção é geralmente pequena, mas dependendo da formulação de vacina, pode estar na região de 1-1000 pg por dose, de um modo preferido, 1-500 pg por dose e, de um modo mais preferido, entre 1 a 100 pg por dose. A quantidade de saponina para utilização nos adjuvantes pode estar na região de 1-1000 pg por dose, de um modo preferido, 1-500 pg por dose, de um modo mais preferido, 1-250 pg por dose e, de um modo muito preferido, entre 1 a 100 pg por dose. A proporção CpG:saponina (p/p) estará, deste modo, no intervalo de 1:1000 a 1000:1 e estará, tipicamente, no intervalo de 1:100 a 100:1 e, de um modo preferido, no intervalo de 1:10 a 1:1 ou 1:1 a 10:1 e, de um modo muito preferido, 1:1, 4:1 ou 10:1.

As formulações da presente invenção podem ser utilizadas para propósitos profilácticos e terapêuticos. Consequentemente, é proporcionada a utilização como definido na reivindicação 6, 21 de uma combinação de uma saponina, um lipopolissacárido e uma molécula CpG, na preparação de uma vacina para a profilaxia e tratamento de cancro, em particular, carcinomas da mama e da próstata. Num aspecto adicional da presente invenção, é proporcionada uma combinação de vacina como definido na reivindicação 7, compreendendo um lipopolissacárido, uma saponina e CpG, como aqui descrito para utilização como um medicamento. A preparação de vacinas é geralmente descrita em New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, E.U.A., 1978.

Os exemplos de excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados para utilização nas combinações da presente invenção incluem água, solução salina tamponada com fosfato, soluções tampão isotónicas.

Nenhum dos seguintes exemplos está no âmbito das reivindicações anexas, mas ilustra o efeito da composição adjuvante.

Exemplo 1: 0 ECD-PD foi produzido em células CHO, de acordo com os métodos do documento WO 00/44899. As formulações foram testadas em murganhos e coelhos.

As formulações foram comparadas contra vários controlos. 22 SBAS1+SBAS7: ECD-PD formulado com o oligonucleótido CpG 2006 3D-MPL, QS21 em lipossomas.

Formulação SBAS1

Compreendendo QS21 em lipossomas e 3D-MPL associados com os lipossomas foram preparados de acordo com os processos do documento EP 0822831.

Formulação SBAS1+SBAS7 o oligonucleótido CpG 2006 foi misturado com a formulação de

Para a formulação acima adicionado. O antigénio foi adjuvante antes da utilização.

Formulações com base em SBAS7+SBAS2 (murganhos)

Para uma dose de 50 pL de vacina, a proteína ECD-PD (25 pg) foi diluída em PBS 10 vezes concentrado pH 6,8 e H20 antes da adição consecutiva de uma emulsão óleo em água compreendendo SB62: que é preparada por e compreende 5% de esqualeno, 5% de tocoferol, 2,0% de tween 80; o tamanho de partícula foi de 180 nm. 23

Preparação de emulsão SB62 (2 vezes concentrada)

Tween 80 é dissolvido em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para produzir uma solução a 2% em PBS. Para proporcionar 100 mL de emulsão duas vezes concentrada, 5 g de DL alfa-tocoferol e 5 mL de esqualeno são levados ao vórtice para misturar intensamente. São adicionados 90 mL de solução PBS/Tween e mistura-se intensamente. A emulsão resultante é, então, passada através de uma seringa e, finalmente, microfluidizada utilizando uma máquina microfluidics M110S. As gotas de óleo resultantes possuem um tamanho de, aproximadamente, 180 nm, 3D-MPL (10 pg) , QS21 (10 pg) . 50 pg de

CpG ODN 2006 foram, depois, adicionados, seguidos pela adição, 30 minutos mais tarde, de 50 pg/mL de tiomersal, como conservante. Todas as incubações foram efectuadas à temperatura ambiente com agitação.

As formulações SBAS 2 foram preparadas como acima, mas sem a adição do oligonucleótido CpG. SBAS7 é o oligonucleótido CpG 2006.

Formulações com base em SBAS7+SBAS2 (Coelho)

Para uma dose de 500 pL de vacina, a proteína ECD-PD (100 pg) foi diluída em PBS 10 vezes concentrado a pH 6,8 e H20 antes da adição consecutiva de SB62 250 pL, 3D-MPL (100 pg) , QS21 (100 pg) e 500 pg de CpG ODN 2006 seguidos pela adição, 30 minutos mais tarde, pela adição de 50 pg/mL de tiomersal como conservante. Todas as incubações foram efectuadas à temperatura ambiente com agitação. 24

Exemplo 2: Experiências de exposição de tumor

Grupos de murganhos F1 (C57 x Balbc) (8 murganhos/grupo) foram injectados com 1/10 da dose humana de antigénio (25 pg) nos dias 0-14-28-42 e desafiados no dia 56 com células TC1 que expressam Her2 próximo de 2 x 10e6 células TC1 Her2/animal administradas subcutaneamente.

As células TC1 para V2 dos baços de animais foram recolhidas ao dia 56 e os animais foram sangrados.

Como apresentado na figura 1, a adição de um oligonucleótido CpG para uma formulação 3D-MPL/QS21 aumenta sinergeticamente a regressão tumoral e apenas estas formulações apresentaram regressão tumoral completa nos murganhos.

Exemplo 3: Imunogenicidade de ECD-PD em diferentes adjuvantes em coelhos 6 grupos de 4 coelhos foram imunizados nos dias 0, 21 e 42, respectivamente, com 100 pg de ECD-PD em AS02, AS01, AS05, AS06 (CpG 2006 absorvido em alúmen), AS07 e AS02B+AS07. A serologia foi analisada 14 dias pós III e a tabela 1 mostra que as formulações da presente invenção foram superiores a outras formulações testadas no aumento de respostas com um elevado titulo de anticorpos. 25

Tabela 1 pré 14 após III AS02B 50 96923 AS01B 173 196637 AS 5 144 76221 AS 6 142 74180 AS07A 480 3904 AS02B+AS07A 94 362713

Exemplo 4: Imunogenicidade de Her 2 neu, ECD-PD em macacos Rhesus adultos

Os macacos Rhesus adultos foram imunizados com ECD-PD em várias formulações de adjuvante: AS 02 B AS 01 AS 05 AS 06 ASO 7 AS02B+AS0 7 QS21,3DMPL, em emulsão óleo água QS21 3D-MPL em lipossomas QS21 em lipossomas

CpG 2006 alum

CpG 2006 ver exemplo 1 para detalhes. A vacinação estimulou uma resposta mais elevada de anticorpos nas formulações da presente invenção (AS)2 + AS07).

Ver figura 1. A análise posterior mostrou que a resposta de anticorpos era policlonal e demonstrou uma actividade inibidora no crescimento in vitro de uma linha celular humana de cancro da 26 mama (SKBR3) que sobre-expressam a molécula Iter 2 neu. Herceptina, um anticorpo monoclonal para o tratamento de tumores que expressam Her 2 neu é capaz de inibir o crescimento desta linha celular.

Verificou-se, assim, que os anticorpos produzidos após vacinação activa com a formulação eram funcionais.

Exemplo 5: Imunização de murganhos com o antigénio ECD-PD

Esta experiência foi concebida para investigar um intervalo de formulações de adjuvante com o antigénio que é uma fusão do domínio extracelular de Her 2 neu ligado ao domínio de fosforilação (ECD-PD), que foi produzido em células CHO de acordo com os métodos do documento WO 00/44899.

Grupo Antigénio(25 pg) Adjuvante 1 ECD-PD nenhum (Solução Salina Tamponada Fosfatos (PBS)) com 2 ECD-PD Lipossomas com QS21 e 3D-MPL membrana na 3 ECD-PD tocol contendo emulsão óleo em com QS21 e 3D-MPL água 4 ECD-PD CpG 5 ECD-PD Lipossomas com QS21 e 3D-MPL membrana + CpG na 6 ECD-PD tocol contendo emulsão óleo em com QS21 e 3D-MPL + CpG água 7 ECD-PD 3D-MPL + CpG 8 ECD-PD QS21 + CpG 9 ECD-PD tocol contendo emulsão óleo em 27 (continuação)

Grupo Antigénio(25 pg) Adjuvante água + CpG 10 ECD-PD Lipossomas com QS21 na membrana + CpG 11 ECD-PD Lipossomas com 3D-MPL na membrana + CpG 0 tocol contendo emulsões óleo em água utilizado nos grupos acima utilizaram grupos D, L-tocoferol (CAS N° 10191-41-0; nome químico: (2RS,4'RS,8'RS)-2,5,7,8-tetrametil-2-(4',8 ', 12 ' -trimetil-tridecil)-6-cromanol)); que está comercialmente disponível da ROCHE™. Se presente, o tocol estava presente numa emulsão óleo em água compreendendo 2,5% em volume, em combinação com esqualeno a 2,5% em volume. Ambos os óleos foram misturados, e foi adicionado monooleato de sorbitano de polioxietileno (Tween 80™), antes da microfluidização (máquina microfluidics M110S, máximo de 50 passos, por um período de 2 minutos, a uma pressão máxima de entrada de 6 bar (pressão de saída de cerca de 850 bar) como descrito no documento WO 95/17210). Consequentemente, os grupos 3, 6 e 9 foram baseados na emulsão de tocol acima com a adição de QS21,3D-MPL ou CpG aquoso. QS21 e 3D-MPL, se presentes em qualquer dos grupos de vacina, acima foram incluídos a 5 pg/dose; foi adicionado CpG (OLIGO 4 (SEQ ID N°:4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT) a dose de 50 pg.

Os adjuvantes como utilizados para o grupo 2, 5, 10 foram preparados de acordo com técnicas, como descrito no documento EP 0822831 BI (cujos conteúdos são aqui incorporados por referência). O Grupo 11 compreendeu 3D-MPL na membrana de um lipossoma. Resumidamente, a 3D-MPL, dioleoil fosfatidilcolina e 28 colesterol foram misturados em conjunto e microfluidizados em lipossomas unilamelares (como descrito no documento EP 0822831 Bl- com a omissão de QS21).

Os adjuvantes utilizados nos grupos 4, 7 e 8 foram em suspensão aquosa ou solução.

Processo de vacinação

Grupos de murganhos B6F1 foram vacinados em quatro ocasiões (em volumes de 50 pL), intramuscularmente, a 14 dias de distância. 14 dias após a 4a dose de vacina, os murganhos foram desafiados subcutaneamente com células tumorais 2X106 TC1 que expressam o Her 2 neu.

As linhas das células tumorais de Her 2 neu-TCl foram produzidas por transdução de células TC1 por vectores retrovirais codificando para Her 2 neu. Após um período de selecção com blastocidina, foram isolados e rastreados clones resistentes por FACS para expressão de Her 2 neu. O clone com a expressão mais elevada de Her 2 neu foi seleccionado e uma dose de desafio de 2X106 foi identificada como possuindo uma Cinética de crescimento semelhante como as células de TC1 de tipo selvagem e para dar origem a um tumor em desenvolvimento em 100% dos animais de controlo. O tamanho dos tumores individuais foi medido duas vezes por semana e expresso como uma média do grupo. 29

Resultados A Figura 3 apresenta os resultados do crescimento do tumor para os grupos 1, 2, 4, 5 e 6. A Figura 4 apresenta os resultados do crescimento do tumor para os grupos 1, 5, 6, 7 e 11. A Figura 5 apresenta os resultados do crescimento do tumor para os grupos 1, 5, 6, 8, 9 e 10. As únicas vacinas que induziram uma regressão completa do tumor foram vacinas contendo ambos, o oligonucleótido imunoestimulador e uma saponina.

As Figuras 6 e 7 apresentam a linfoproliferação de esplenócitos in vitro após incubação com os 5 pg/mL de imunogénio (ECD-PD) ou domínio extracelular (ECD) ou domínio intracelular (ICD) ou Her 2 neu.

As Figuras 8 e 9 apresentam a resposta imunitária humoral para o imunogénio (ECD-PD) em termos de Ig total como medido por ELISA (FIG. 8) ou distribuição do isotipo IgG nestas respostas (FIG. 9).

Conclusão:

Após 3 injecções, a indução por anticorpo é AS02B+AS07A > AS01B > AS02B = AS06 = AS05 > AS07A

Conclusão geral 0 adjuvante testado (AS1, AS2, AS7) tem efeito semelhante. Contudo, a combinação de AS1 e AS7 ou AS2 e AS7 são adjuvantes 30 mais eficazes. A CMI é claramente apresentada após 4 vacinações em animais que receberam o adjuvante combinado na molécula total de ECD-PD, mas, também, em cada parte separadamente (ECD e ICD). As formulações da presente invenção são muito eficazes na indução da regressão do tumor.

Exemplo 6: Imunização de murganhos com antigénio P703P

Esta experiência foi concebida para investigar uma gama de formulações de adjuvante com o antigénio que é uma fusão do antigénio Prostase (Ferguson, et al., (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1999, 96, 3114-3119)) e o fragmento N-terminal 1-81 de NS1 do vírus Influenza (P703P-NS1).

Grupo Antigénio (25 pg) Adjuvante 1 P703P-NS1 nenhum (Solução Salina Tamponada com Fosfatos (PBS)) 2 P703P-NS1 CpG 3 P703P-NS1 Lipossomas com QS21 na membrana + CpG 4 P703P-NS1 Lipossomas com QS21 e 3D-MPL na membrana + CpG 5 P703P-NS1 tocol contendo emulsão óleo em água com QS21 e 3D-MPL + CpG 6 P703P-NS1 tocol contendo emulsão óleo em água + CpG 0 tocol contendo emulsões óleo em água utilizado nos grupos 31 acima utilizou D,L,α-tocoferol (CAS N° 10191-41-0; nome químico: (2RS,4 'RS,8'RS)-2,5,7,8-tetrametil-2-(4',8',12'-trimetil-tridecil)-6-cromanol)); que está comercialmente disponível da ROCHE™. Se presente, o tocol estava presente numa emulsão óleo em água compreendendo 2,5% em volume, em combinação com esqualeno a 2,5% em volume. Ambos os óleos foram misturados, e foi adicionado monooleato de polioxietileno sorbitano (Tween 80™), antes da microfluidização (máquina microfluidics M110S, máximo de 50 passos, por um período de 2 minutos, a pressão máxima de entrada de 6 bar (pressão de saída de cerca de 850 bar) como descrito no documento WO 95/17210). Consequentemente, os grupos 5 e 6 foram baseados na emulsão de tocol acima com a adição de QS21, 3D-MPL e/ou CpG aquoso. QS21 e 3D-MPL se presentes em qualquer dos grupos de vacina acima foram incluídos a 5 pg/dose; CpG (OLIGO 4 (SEQ ID N°: 4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT) foi adicionado a 5 pg por dose.

Os adjuvantes, como utilizados para o grupo 3 e 4, foram preparados de acordo com técnicas como descrito no documento EP 0822831 BI (cujo contéudo é aqui incorporado por referência).

Processo de vacinação

Grupos de murganhos B6F1 foram vacinados em quatro ocasiões (em volumes de 50 pL), intramuscularmente, com 14 dias de intervalos. 32

Resultados

As Figuras 10 e 11 mostram a linfoproliferação in vitro de esplenócitos após a segunda e 14 dias após a quarta vacinação, após incubação in vitro com os 3 pg/mL de imunogénio (NS1-P703P) ou P703P expresso em Pichia (15 pg/mL) ou uma proteína de fusão não específica NSl-OspA.

As Figuras 12 e 13 mostram a resposta imunitária humoral ao imunogénio (NS1-P703P) em termos de Ig total como medido por ELISA de título de ponto médio (FIG. 10) ou distribuição de isotipo de IgG nestas respostas (FIG. 11).

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> GlaxoSmithKline Biologicals s.a. <120> Vacinas

<130> B45245D2EP <150> GB0000025573 <151> 2000-10-18 <150> GB0000025574 <151> 2000-10-18 <150> US20000690921 <151> 2000-10-18 33 <160> 5 <1 7 0> Patentln versão 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> oligonuclótido imunoestimulador <400> 1 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 2 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Sequência imunoestimuladora <400> 2 tctcccagcg tgcgccat 18 <210> 3 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial 34 <220> <223> oligonuclótido imunoestimulador <400> 3 accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg 30 <210> 4 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> oligonuclótido imunoestimulador <400> 4 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 5 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> oligonuclótido imunoestimulador <400> 5 tccatgacgt tcctgatgct 20

Lisboa, 24 de Outubro de 2012 35

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composição imunogénica compreendendo um antigénio de cancro seleccionado do grupo: (i) ASCL 1 (HASH-1) e (ii) ASCL 2 (HASH-2), uma composição adjuvante compreendendo uma saponina; um oligonucleótido imunoestimulador; e um lipopolissacárido seleccionado do grupo (a) Monofosforil-lípido A (b) Monofosforil-lipido A 3-0-desacilado (c) Difosforil-lipido A.
2. Composição como reivindicado na reivindicação 1, em que a saponina é QS21.
3. Composição imunogénica como reivindicado na reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o oligonucleótido imunoestimulador é seleccionado do grupo: SEQ ID N° 1 - TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) SEQ ID N° 2 - TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) SEQ ID N° 3 - ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG SEQ ID N° 4 - TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) SEQ ID N° 5 - TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) 1
4. Composição como reivindicada em qualquer das reivindicações 1 a 3, em que a saponina é formulada para formar ISCOMS ou lipossomas.
5. Composição como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 3, em que a saponina está presente numa emulsão óleo em água.
6. Utilização de uma combinação de uma saponina; um oligonucleótido imunoestimulador; um lipopolissacárido seleccionado do grupo: a) Monofosforil-Lipido A, b) Monofosforil-Lipido A 3-0-Desacilado, e c) Disfosforil-5-Lipido A e um antigénio de cancro seleccionado do grupo: i) ASCL 1 (HASH-1) e ii) ASCL 2 (HASH-2); na preparação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de tumores.
7. Combinação de uma saponina; um oligonucleótido imunoestimulador; um lipopolissacárido seleccionado do grupo: a) Monofosforil-Lipido A, b) Monofosforil-Lipido A 3-0-Desacilado, e c) Disfosforil-Lipido A 2 e um antigénio de cancro seleccionado do grupo: i) ASCL 1 (HASH-1) e ii) ASCL 2 (HASH-2); para utilização num método para o tratamento ou profilaxia de tumores. Lisboa, 24 de Outubro de 2012 3