KR20080056266A - Ｔ 세포 집단의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

T 세포를 함유하는 세포 집단을 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 존재하에서 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단의 제조 방법.

Description

Ｔ 세포 집단의 제조 방법{METHOD FOR PRODUCTION OF T CELL POPULATION}
본 발명은, 의료 분야에 있어서 유용한 T 세포 집단을 제조하는 방법에 관한 것이다.
생체는 주로 면역 응답에 의해 이물질로부터 보호되고 있고, 면역 시스템은 다양한 세포와 그것이 만들어 내는 가용성 인자에 의해 성립되고 있다. 그 중에서도 중심적인 역할을 하고 있는 것이 백혈구, 특히 림프구이다. 이 림프구는 B 림프구 (이하, B 세포라고 기재하는 경우가 있다) 와 T 림프구 (이하, T 세포라고 기재하는 경우가 있다) 라는 2 종류의 주요한 타입으로 나누어지고, 모두 항원을 특이적으로 인식하고, 이것에 작용하여 생체를 방어한다.
T 세포는, 말초에서는 CD (Cluster of Differentiation) 4 마커를 갖는 CD4 T 세포와 CD8 마커를 갖는 CD8T 세포가 대부분을 차지한다. CD4T 세포의 대부분은, 헬퍼 T 세포 (이하, TH 라고 기재한다) 라고 불리고, 항체 산생의 보조나 여러 가지 면역 응답의 유도에 관여하며, 항원 자극에 의해 산생되는 사이토카인의 종류가 상이한 Th1 형 혹은 Th2 형으로 분화된다. CD8T 세포의 대부분은, 항원 자극에 의해 세포 상해 활성을 나타낸 세포 상해성 T 세포 [Tc : 세포 상해성 T 림 프구 (cytotoxic T lymphocyte), 별명 : 킬러 T 세포, 이하, CTL 라고 기재하는 경우가 있다] 로 분화된다.
예를 들어, 암의 병태에 있어서, 외과 수술, 화학 요법, 방사선 요법에 이은 제 4 의 치료법으로서, 면역 요법이 최근 관심을 모으고 있다. 면역 요법은 본래 인간이 갖는 면역력을 이용하기 때문에, 환자에 대한 육체적 부담이 다른 치료법과 비교하여 가볍다고 일컬어지고 있다. 면역 요법에는 체외에서 유도한 CTL 나 말초혈 림프구 등으로부터 여러가지 방법으로 확대 배양하여 얻어지는 림포카인 활성화 세포, NKT 세포, γδT 세포 등을 이입하는 요법, 체내에서의 항원 특이적 CTL 의 유도를 기대하는 수상(樹狀) 세포 이입 요법이나 펩티드 백신 요법, Th1 세포 요법, 또한 이들 세포에 여러 가지 효과를 기대할 수 있는 유전자를 체외에서 도입하여 체내에 이입하는 면역 유전자 치료법 등이 알려져 있다.
피브로넥틴은 동물의 혈액 중, 배양 세포 표면, 조직 세포 외 매트릭스에 존재하는 분자량 25만의 거대한 당 단백질이며, 다채로운 기능을 갖는 것이 알려져 있다. 그 도메인 구조는 7 개로 나누어져 있고 (이하, 도 1 참조), 또 그 아미노산 배열 중에는 3 종류의 유사 배열이 함유되어 있으며, 이들 각 배열의 반복으로 전체가 구성되어 있다. 3 종류의 유사 배열은 I 형, Ⅱ 형, Ⅲ 형이라고 불리고, 이 중, Ⅲ 형은 71∼96 개의 아미노산 잔기로 구성되어 있고, 이들 아미노산 잔기의 일치율은 17∼40% 이다. 피브로넥틴 중에는 14 의 Ⅲ 형의 배열이 존재하지만, 그 중에서 8 번째, 9 번째, 10 번째 (이하, 각각 Ⅲ-8, Ⅲ-9, Ⅲ-10 이라고 칭한다) 는 세포 결합 도메인에, 그리고 12 번째, 13 번째, 14 번째 (이하, 각 각 Ⅲ-12, Ⅲ-13, Ⅲ-14 라고 칭한다) 는 헤파린 결합 도메인에 함유되어 있다. 또, Ⅲ-10 에는 VLA (very late activation antigen)-5 결합 영역이 함유되어 있고, 이 코어 배열은 RGDS 이다. 또, 헤파린 결합 도메인의 C 말단측에는 ⅢCS 라고 불리는 영역이 존재한다. ⅢCS 에는 25 아미노산으로 이루어지는 VLA-4 에 대해 결합 활성을 갖는 CS-1 이라고 불리는 영역이 존재한다 (예를 들어, 비특허 문헌 1∼3).
면역 요법 중에서, 체외에서 유도한 CTL 나 말초혈 림프구 등으로부터 IL-2와 항CD3 항체의 작용에 의해 확대 배양하여 얻어지는 림포카인 활성화 세포를 이입하는 요법에 있어서, 체외에서 유도한 항원 특이적 CTL 를 확대 배양할 때에 세포 상해 활성을 얼마나 유지할지, 림프구를 체외에서 얼마나 효율적으로 확대 배양할 수 있을지 등의 문제에 대해서는, 피브로넥틴이나 그 프래그먼트를 사용하는 것에 의한 효과가, 이미 본 발명자들에 의해 검토되어 왔다 (예를 들어, 특허 문헌 1∼3).
최근, 면역 요법에서 사용되는 T 림프구는, 이미 종말 분화된 이펙터 T 세포보다, 보다 미(未)분화된 상태의 나이브 T 세포나 센트럴 메모리 T 세포를 투여하는 것이, 생체에 대한 투여에 있어서 훨씬 높은 치료 효과를 기대할 수 있음이 보고되어 있다 (예를 들어 비특허 문헌 4, 5). 또한, 체내에서의 항원 특이적 CTL 의 유도를 기대하는 수상 세포 이입 요법이나 펩티드 백신 요법 등에 있어서도, 예를 들어 암이 진행된 환자의 체내에서는 CTL 에 유도될 수 있는 근원이 되는 나이브 T 세포가 적은 것으로 생각할 수 있기 때문에, 충분한 효과를 기대할 수 없 는 경우가 많다.
비특허 문헌 1 : Deane F.Momer 저, 1988년 발행, FIBRONECTIN, ACADEMIC PRESS INC., P1∼8
비특허 문헌 2 : Kimizuka F. 외 8명, J.Biochem., 1991년, Vol.110, No.2, p284-291
비특허 문헌 3 : Hanenberg H. 외 5명, Human Gene Therapy, 1997년, Vol.8, No.18, p2193-2206
비특허 문헌 4 : Gattinoni L. 외 9명, J.Clin.Invest.2005년, Vol.115, No.6, P1616∼1626
비특허 문헌 5 : Benigni F 외 10명, J.Immunol.2005년, Vol.175, No.2, P739∼748
특허 문헌 1 : 국제 공개 제03/016511호 팜플렛
특허 문헌 2 : 국제 공개 제03/080817호 팜플렛
특허 문헌 3 : 국제 공개 제2005/019450호 팜플렛
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명의 목적은, 생체에 대한 투여에 유효한 T 세포 집단의 제조 방법을 제공하는 것에 있다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명의 제 1 발명은, T 세포를 함유하는 세포 집단을 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 존재하에서 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 제 1 발명에 있어서, 배양하는 공정을 포함하는 총배양 일수로는 4∼14일간이 예시된다. 또, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 존재하에서의 배양은, 적어도 배양 개시시에 실시되는 것이 예시되고, 또한 당해 배양은, 적어도 1일 이상 실시되는 것이 바람직하다. 또, 본 발명의 제 1 발명에 있어서, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 존재하에서 배양하는 공정은, CD3 리간드의 존재하에서 실시되는 것이 예시된다. 또, CD3 리간드로는, 항CD3 항체가 예시된다. 본 발명의 제 1 발명에 있어서, 피브로넥틴의 프래그먼트로는, 서열목록의 배열 번호 1∼8 로 표시되는 아미노산 배열을 적어도 하나 함유하여 이루어지는 폴리펩티드 (m) 이거나, 또는 상기 어느 하나의 아미노산 배열에 있어서 하나 혹은 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 혹은 부가된 아미노산 배열을 적어도 하나 함유하여 이루어지는 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드 (m) 와 동등한 기능을 갖는 폴리펩티드 (n) 가 예시된다. 또, 피브로넥틴의 프래그먼트로는, 서열목록의 배열 번호 1∼3 및 5∼8 로 표시되는 아미노산 배열 모두를 함유하는 폴리펩티드가 예시된다. 또, 본 발명의 제 1 발명에 있어서, 추가로, CD45RA, CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 세포를 분리하는 공정을 포함하는 제조 방법도 예시된다. 또한, 본 발명의 제 1 발명에 있어서는, 추가로 세포 집단에 외래 유전자를 도입하는 공정을 포함하는 제조 방법도 예시된다. 당해 제조 방법에 있어서, 외래 유전자의 도입에는 레트로 바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터 또는 시미안 바이러스 벡터를 사용할 수 있다.
본 발명의 제 2 발명은, 본 발명의 제 1 발명의 방법에 의해 얻어지는, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단에 관한 것이다.
본 발명의 제 3 발명은, 본 발명의 제 1 발명에 의해 얻어지는, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단을 유효 성분으로서 함유하는 의약에 관한 것이다.
본 발명의 제 4 발명은, 피험체에, 유효량의 본 발명의 제 1 발명의 방법에 의해 얻어지는, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단을 투여하는 공정을 포함하는 질환의 치료 방법 또는 예방 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 5 발명은, 의약의 제조를 위한, 본 발명의 제 1 발명의 방법에 의해 얻어지는, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단의 사용에 관한 것이다.
본 발명의 제 6 발명은, 본 발명의 제 1 발명의 방법에 의해 얻어지는, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단에 대해, 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포, 항원이 제시된 세포, 항원, CD3 리간드, CD28 리간드, 사이토카인, 케모카인 및 사이토카인을 산생하는 능력을 갖는 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 자극 인자에 의해 자극을 부여하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 T 세포 집단의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 7 발명은, 본 발명의 제 6 발명의 방법에 의해 얻어지는 T 세포 집단에 관한 것이다.
본 발명의 제 8 발명은, 본 발명의 제 6 발명의 방법에 의해 얻어지는 T 세포 집단을 유효 성분으로서 함유하는 의약에 관한 것이다.
본 발명의 제 9 발명은, 피험체에, 유효량의 본 발명의 제 6 발명의 방법에 의해 얻어지는 T 세포 집단을 투여하는 공정을 포함하는 질환의 치료 방법 또는 예방 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 10 발명은, 의약 제조를 위한, 본 발명의 제 6 발명의 방법에 의해 얻어지는 T 세포 집단의 사용에 관한 것이다.
본 발명의 제 11 발명은, (a) 본 발명의 제 1 발명의 방법에 의해 얻어지는, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단을 유효 성분으로서 함유하는 제제, 및
(b) 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포, 항원이 제시된 세포, 항원, CD3 리간드, CD28 리간드, 사이토카인, 케모카인 및 사이토카인을 산생하는 능력을 갖는 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 자극 인자를 유효 성분으로서 함유하는 제제를 함유한 의약으로서, 당해 제제는 동시에 또는 각각 투여되는 2 개의 각각의 제제로서 함유되는 의약에 관한 것이다.
본 발명의 제 12 발명은, 하기 (a) 및 (b) 의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
(a) 본 발명의 제 1 발명의 방법에 의해 얻어지는, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단을 환자에게 투여하는 공정,
(b) 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포, 항원이 제시된 세포, 항원, CD3 리간드, CD28 리간드, 사이토카인, 케모카인 및 사이토카인을 산생하는 능력을 갖는 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 자극 인자를 환자에게 투여하는 공정.
발명의 효과
본 발명의 제조 방법에 의해, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단이 제공된다. 당해 제조 방법에 의해 얻어지는 세포 집단은, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포의 비율이 높아, 세포 의료에 의한 질환의 치료에 매우 유용하다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명은, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들의 혼합물 (이하, 본 발명의 유효 성분이라고 칭하는 경우가 있다) 의 존재하에서 배양하는 공정을 함유함으로써, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포가 고비율로 함유되어 있는 세포 집단이 얻어지는 것을 알아내어, 완성하기에 이른 것이다.
또한, 본 명세서에 있어서, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단이란, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포를 고비율로 함유하는 T 세포 집단을 의미한다. 또, 여기에서 고비율이란, 본 발명의 유효 성분의 유무 이외에는 동등한 조건에서 배양을 실시했을 경우에, 본 발명의 유효 성분 존재하에 있어서의 배양에 의해 얻어진 T 세포 집단 중의, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 비율이, 본 발명의 유효 성분 비존재하의 경우와 비교하여 높은 것을 의미한다. 바람직하게는 본 발명의 유효 성분 비존재하의 경우와 비교하여 5% 이상, 보다 바람직하게는 10% 이상 높은 T 세포 집단인 것이 바람직하다. 얻어지는 세포 집단 중의, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포의 비율은, 여러 가지 환경 요인, 예를 들어 말초혈 단핵구 (PBMC) 등 T 세포의 제조에 사용되는 세포를 공급하는 인간의 개인 차나 컨디션 등에 의해 변동하는 것인 점에서, 상기의「고비율」을 한 마디로 수치에 의해 규정하는 것은 불가능하다. 또, 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 T 세포 집단은, T 세포를 함유하는 집단을 의미하고, T 세포 이외의 세포, 예를 들어 NK 세포 등의 그 밖의 림프구나 림프구 이외의 혈구계 성분이 함유되어 있어도 된다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
(1) 본 발명에 사용되는 피브로넥틴, 및 그 프래그먼트
본 명세서 중에 기재된 피브로넥틴 및 그 프래그먼트는, 천연에서 얻어진 것, 또는 인위적으로 합성된 것 중 어느 하나이어도 된다. 피브로넥틴 및 그 프래그먼트는, 예를 들어, 루오스라티 E.들〔Ruoslahti E., et al., 저널·오브·바이올로지컬·케미스트리 (J.Biol.Chem.), 제256권, 제14호, 제7277∼7281페이지 (1981)〕의 개시에 기초하여, 천연 기원의 물질로부터 실질적으로 순수한 형태로 제조할 수 있다. 여기에서, 본 명세서에 기재된 실질적으로 순수한 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 프래그먼트란, 이들이 천연에 있어서 피브로넥틴과 함께 존재하는 다른 단백질을 본질적으로 함유하고 있지 않은 것을 의미한다. 상기의 피브로넥틴 및 그 프래그먼트는, 각각 단독으로, 혹은 복수 종류의 것을 혼합하여 본 발명에 사용할 수 있다.
또한, 피브로넥틴은 많은 스플라이싱 바리안트 (splicing variant) 의 존재가 알려져 있지만, 본 발명에 사용되는 피브로넥틴으로는, 본 발명의 원하는 효과를 발현하는 것이면, 어느 바리안트도 사용할 수 있다. 예를 들어, 혈장 유래의 피브로넥틴의 경우, 세포 결합 도메인의 상류에 존재하는 ED-B 라고 불리는 영역, 세포 결합 도메인과 헤파린 결합 도메인 사이에 존재하는 ED-A 라고 불리는 영역이 결실되어 있는 것이 알려져 있지만, 이와 같은 혈장 유래의 피브로넥틴도 본 발명에 사용할 수 있다.
본 발명에 사용할 수 있는 피브로넥틴 프래그먼트, 그리고 그 프래그먼트의 조제에 관한 유용한 정보는, 키미즈카 F.들〔Kimiduka F., et al., 저널·오브·바이오케미스트리 (J.Biochem.), 제110권, 284∼291페이지 (1991)〕, 콘브리트 A.R.들〔Kornbrihtt A.R., et al., EMBO 저널(EMBO J), 제4권, 제7호, 1755∼1759(1985)〕, 및 세키구치 K.들〔Sekiguchi K., et al., 바이오케미스트리 (Biochemistry), 제25권, 제17호, 4936∼4941(1986)〕등으로부터 얻을 수 있다. 또, 피브로넥틴을 코드하는 핵산 배열 또는 피브로넥틴의 아미노산 배열에 대해서는, Genbank Accession No.NM_002026, NP_002017 에 개시되어 있다.
본 발명에 있어서, 피브로넥틴 프래그먼트로는, 예를 들어, Ⅲ-8 (서열목록의 배열 번호 1 로 표시되는 아미노산 배열), Ⅲ-9 (서열목록의 배열 번호 2 로 표시되는 아미노산 배열), Ⅲ-10 (서열목록의 배열 번호 3 으로 표시되는 아미노산 배열), Ⅲ-11 (서열목록의 배열 번호 4 로 표시되는 아미노산 배열), Ⅲ-12 (서열목록의 배열 번호 5 로 표시되는 아미노산 배열), Ⅲ-13 (서열목록의 배열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 배열), Ⅲ-14 (서열목록의 배열 번호 7 로 표시되는 아미노산 배열), 및 CS-1 (서열목록의 배열 번호 8 로 표시되는 아미노산 배열) 중 어느 하나의 영역을 구성하는 아미노산 배열을 적어도 하나 함유하여 이루어지는 폴리펩티드 (m) (도 1 참조) 또는, 상기 어느 하나의 아미노산 배열에 있어서 하나 혹은 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 혹은 부가된 아미노산 배열을 적어도 하나 함유하여 이루어지는 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드 (m) 와 동등한 기능을 갖는 폴리펩티드 (n) 가 예시된다. 프래그먼트의 길이로는, 예를 들어, 아미노산의 수로서 20∼1000 이 바람직하고, 100∼800 이 보다 바람직하다. 또한, 본 명세서에 있어서, 복수개란 수 개를 포함하는 개념이며, 2∼12 개가 바람직하고, 2∼10 개가 보다 바람직하고, 2∼8 개가 더욱 바람직하며, 이하에 있어서도 동일하다.
또, 당해 프래그먼트로는, 세포 접착 활성 및/또는 헤파린 결합 활성을 갖는 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 세포 접착 활성은, 본 발명에서 사용되는 프래그먼트 (그 세포 결합 도메인) 와 세포의 결합을 공지된 방법을 사용하여 검정함으로써 조사할 수 있다. 예를 들어, 이와 같은 방법에는, 윌리엄스 D.A.들의 방법〔Williams D.A., et al., 네이쳐 (Nature), 제352권, 438∼441페이지 (1991)〕이 포함된다. 당해 방법은, 배양 플레이트에 고정화시킨 프래그먼트에 대한 세포의 결합을 측정하는 방법이다. 또, 헤파린 결합 활성은, 본 발명에 사용되는 프래그먼트 (그 헤파린 결합 도메인) 와 헤파린의 결합을 공지된 방법을 사용하여 검정함으로써 조사할 수 있다. 예를 들어, 상기의 윌리엄스 D.A.들의 방법에 있어서, 세포를 대신하여 헤파린, 예를 들어 표지 헤파린을 사용함으로써, 동일한 방법으로 프래그먼트와 헤파린의 결합을 평가할 수 있다.
또한 피브로넥틴의 프래그먼트로는, C-274 (서열목록의 배열 번호 9 로 표시되는 아미노산 배열), H-271 (서열목록의 배열 번호 10 으로 표시되는 아미노산 배열), H-296 (서열목록의 배열 번호 11 로 표시되는 아미노산 배열), CH-271 (서열목록의 배열 번호 12 로 표시되는 아미노산 배열), CH-296 (서열목록의 배열 번호 13 으로 표시되는 아미노산 배열), C-CS1 (서열목록의 배열 번호 14 로 표시되는 아미노산 배열), 및 CH-296Na (서열목록의 배열 번호 15 로 표시되는 아미노산 배열) 로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리펩티드가 예시된다.
상기의 CH-271, CH-296, CH-296Na, C-274, C-CS1 의 각 프래그먼트는 VLA-5 에 결합하는 활성을 갖는 세포 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드이다. 또, C-CS1, H-296, CH-296, CH-296Na 는 VLA-4 에 결합하는 활성을 갖는 CS-1 을 갖는 폴리펩티드이다. 또한, H-271, H-296, CH-271, CH-296 및 CH-296Na 는 헤파린 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드이다. 또한, CH-296Na 는 혈장 유래의 피브로넥틴에 있어서의 세포 결합 도메인으로부터 CS-1 까지를 함유하는 폴리펩티드이다.
본 발명에 있어서는, 상기의 각 도메인이 개변된 프래그먼트도 사용할 수 있다. 피브로넥틴의 헤파린 결합 도메인은 3 개의 Ⅲ 형 배열 (Ⅲ-12, Ⅲ-13, Ⅲ-14) 에 의해 구성되어 있다. 상기 Ⅲ 형 배열 중 하나 혹은 두개를 결실한 헤파린 결합 도메인을 함유하는 프래그먼트도 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들어, 피브로넥틴의 세포 결합 부위 (VLA-5 결합 영역, Pro1239∼Ser1515) 와 하나의 Ⅲ 형 배열이 결합된 프래그먼트인 CHV-89 (서열목록의 배열 번호 16 으로 표시되는 아미노산 배열), CHV-90 (서열목록의 배열 번호 17 로 표시되는 아미노산 배열), CHV-92 (서열목록의 배열 번호 18 로 표시되는 아미노산 배열), 혹은 두 개의 Ⅲ 형 배열이 결합된 프래그먼트인 CHV-179 (서열목록의 배열 번호 19 로 표시되는 아미노산 배열), CHV-181 (서열목록의 배열 번호 20 으로 표시되는 아미노산 배열) 이 예시된다. CHV-89, CHV-90, CHV-92 는 각각 Ⅲ-13, Ⅲ-14, Ⅲ-12 를 함유하는 것이고, CHV-179 는 Ⅲ-13 과 Ⅲ-14 를, CHV-181 은 Ⅲ-12 와 Ⅲ-13 을 각각 함유하고 있다.
또, 상기의 각 프래그먼트에 추가로 아미노산을 부가한 프래그먼트도 본 발명에 사용할 수 있다. 당해 프래그먼트는, 예를 들어, 상기 각 프래그먼트에 원하는 아미노산을 부가함으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, H-275-Cys (서열목록의 배열 번호 21 로 표시되는 아미노산 배열) 는, 피브로넥틴의 헤파린 결합 도메인을 가지고, 또한 C 말단에 시스테인 잔기를 갖는 프래그먼트이다.
또한, 본 발명에 사용되는 프래그먼트로는, 본 발명의 원하는 효과가 얻어지는 한, 상기에 예시한 천연 피브로넥틴의 아미노산 배열 중 적어도 일부를 함유하는 프래그먼트와 동등한 기능을 갖는, 당해 프래그먼트를 구성하는 폴리펩티드의 아미노산 배열에 하나 혹은 복수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 혹은 부가를 갖는 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드로 이루어지는 것이어도 된다.
아미노산의 치환 등은, 본래의 폴리펩티드의 기능이 유지될 수 있는 범위 내에서 그 폴리펩티드의 물리 화학적 성상 등을 변화시킬 수 있는 정도인 것인 것이 바람직하다. 예를 들어, 아미노산의 치환 등은, 본래의 폴리펩티드가 갖는 성질 (예를 들어, 소수성, 친수성, 전하, pK 등) 을 실질적으로 변화시키지 않는 범위의 보존적인 것이 바람직하다. 예를 들어, 아미노산의 치환은, 1.글리신, 알라닌 ; 2.발린, 이소류신, 류신 ; 3.아스파르트산, 글루타민산, 아스파라긴, 글루타민 ; 4.세린, 트레오닌 ; 5.리신, 아르기닌 ; 6.페닐알라닌, 티로신의 각 그룹 내에서의 치환이며, 아미노산의 결실, 부가, 삽입은, 폴리펩티드에 있어서의 그들의 대상 부위 주변의 성질에 유사한 성질을 갖는 아미노산의, 대상 부위 주변의 성질을 실질적으로 변화시키지 않는 범위에서의 결실, 부가, 삽입이 바람직하다.
또한, 본 발명에 사용되는 프래그먼트를 유전자 공학적으로 취득했을 경우, 예를 들어 대장균 등을 숙주로 하여 제조하는 경우에는, 대장균 유래의 메티오닌 펩티다아제 등의 영향에 의해, N 말단의 메티오닌이 결실되는 경우가 있는데, 이와 같은 폴리펩티드도 본 발명에 있어서 사용할 수 있다. 즉, 서열목록의 배열 번호 15 및 21 에 기재된 폴리펩티드의 N 말단의 메티오닌이 결실된 폴리펩티드도 본 발명에 있어서는 바람직하게 사용할 수 있다.
아미노산의 치환 등은 종간이나 개체 차이에서 기인하여 천연으로 발생하는 것이어도 되고, 또, 인공적으로 유발된 것이어도 된다. 인공적인 유발은 공지된 방법에 의해 실시하면 되고, 특별히 한정은 없지만, 예를 들어, 공지된 수법에 의해, 천연 피브로넥틴 유래의 상기 영역이나 소정의 프래그먼트를 코드하는 핵산에 있어서 하나 혹은 복수개의 염기가 치환, 결실, 부가 혹은 삽입된 소정의 핵산을 제조하고, 그것을 사용하여, 천연 피브로넥틴 유래의 상기 영역이나 소정의 프래그먼트와 동등한 기능을 갖는, 당해 프래그먼트 등을 구성하는 폴리펩티드의 아미노산 배열에 치환 등을 갖는 아미노산 배열을 함유하는 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
또, 본 명세서에 있어서「동등한 기능을 갖는다」란, 폴리펩티드를 사용하여 얻어지는 T 세포 집단 중의 CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포의 비율이, 비교 대조의 폴리펩티드의 비존재하에서 얻어지는 T 세포 집단보다 높은 것을 말한다. 상기 작용은 후술하는 실시예 1, 2, 6 에 기재된 방법 등에 준하여 적절히 확인할 수 있다. 또, 아미노산의 치환 등을 갖는 폴리펩티드로 이루어지는 프래그먼트로는, 세포 접착 활성 및/또는 헤파린 결합 활성을 갖는 것이 바람직하고, 또 CS-1 도메인을 갖는 것도 바람직하다. 세포 접착 활성 및 헤파린 결합 활성은, 그들의 상기 활성 측정 방법에 준하여 평가할 수 있다.
아미노산의 치환 등을 갖는 폴리펩티드로 이루어지는 프래그먼트로서, 예를 들어, 2 개의 상이한 도메인 간에 링커로서 1 이상의 아미노산이 삽입된 프래그먼트도 본 발명에 사용할 수 있다.
또한, 피브로넥틴에 대해서도, 상기의 프래그먼트와 동일하게, 그 폴리펩티드의 아미노산 배열에 하나 혹은 복수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 혹은 부가를 갖는 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드로서, 당해 폴리펩티드를 사용하여 얻어지는 T 세포 집단 중의 CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포의 비율이, 비교 대조의 폴리펩티드의 비존재하에서 얻어지는 T 세포 집단보다 높은 폴리펩티드를, 본 발명에 있어서 사용할 수 있다.
또, 본 발명에 사용되는 피브로넥틴 또는 그 프래그먼트로는, 본 발명의 원하는 효과가 얻어지는 한, 상기에 예시한 천연 피브로넥틴이나 그 아미노산 배열의 적어도 일부를 함유하는 프래그먼트와 동등한 기능을 갖는, 당해 피브로넥틴 또는 그 프래그먼트를 구성하는 폴리펩티드의 아미노산 배열과 50% 이상의 호몰로지(homology)를 갖는 폴리펩티드, 바람직하게는 70% 이상의 호모로지를 갖는 폴리펩티드, 보다 바람직하게는 90% 이상의 호모로지를 갖는 폴리펩티드, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 호모로지를 갖는 펩티드를 사용할 수 있다. 또한, 호모로지의 산출에는, 예를 들어 DNASIS Pro Ver.2.6 (다카라 바이오 (주) 제조) 를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 가장 바람직하게 사용되는 피브로넥틴의 프래그먼트로는, 아미노산 배열 중에 Ⅲ-8 (서열목록의 배열 번호 1 로 표시되는 아미노산 배열), Ⅲ-9 (서열목록의 배열 번호 2 로 표시되는 아미노산 배열), Ⅲ-10 (서열목록의 배열 번호 3 으로 표시되는 아미노산 배열), Ⅲ-12 (서열목록의 배열 번호 5 로 표시되는 아미노산 배열), Ⅲ-13 (서열목록의 배열 번호 6 으로 표시되는 아미노산 배열), Ⅲ-14 (서열목록의 배열 번호 7 로 표시되는 아미노산 배열) 및 CS-1 (서열목록의 배열 번호 8 로 표시되는 아미노산 배열) 의 모든 것을 함유하는, 즉 헤파린 결합 도메인, 세포 결합 도메인 및 CS-1 을 포함하는 폴리펩티드를 들 수 있고, 더 바람직하게는 전술한 CH-296, 혹은 CH-296 과 동등한 기능을 갖는, 당해 프래그먼트를 구성하는 폴리펩티드의 아미노산 배열에 하나 혹은 복수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 혹은 부가를 갖는 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드를 들 수 있다. 그 밖에, 본 발명에 있어서 바람직하게 사용되는 피브로넥틴의 폴리펩티드로는, 실시예 18 에 나타내는 바와 같이, H-296, CH-271, H-271, C-CS1, 혹은 이들과 동등한 기능을 갖는, 당해 프래그먼트를 구성하는 폴리펩티드의 아미노산 배열에 하나 혹은 복수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 혹은 부가를 갖는 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드를 들 수 있다.
본 명세서 중에 기재된 피브로넥틴 프래그먼트는, 예를 들어, 미국 특허 제5,198,423호 명세서의 기재에 기초하여 유전자 재조합체로부터 재조합 피브로넥틴프래그먼트로서 제조할 수도 있다. 예를 들어, 상기의 H-271 (배열 번호 10), H-296 (배열 번호 11), CH-271 (배열 번호 12), CH-296 (배열 번호 13) 의 각 프래그먼트에 이들을 취득하는 방법은 당해 특허 명세서에 상세하게 기재되어 있다. 또, CH-296Na (배열 번호 15) 와 그 제조 방법에 대해서는 국제 공개 제2005/019450호 팜플렛에 기재되어 있다. 또, 상기의 C-274 (배열 번호 9) 프래그먼트는 미국 특허 제5,102,988호 명세서에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있다. 또한, C-CS1 (배열 번호 14) 프래그먼트는 일본 특허 제3104178호 명세서에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있다. 상기 CHV-89 (배열 번호 16), CHV-90 (배열 번호 17), CHV-179 (배열 번호 19) 의 각 프래그먼트는, 일본 특허 제2729712호 명세서에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있다. 또, CHV-181 (배열 번호 20) 프래그먼트는 국제 공개 제97/18318호 팜플렛에 기재된 방법에 준하여 얻을 수 있다. CHV-92 (배열 번호 18) 프래그먼트는, 일본 특허 제2729712호 명세서 및 국제 공개 제97/18318호 팜플렛을 참조하고, 그들 문헌에 기재된 플라스미드에 기초하여 정형적으로 플라스미드를 구축하고, 그 플라스미드를 사용하여 유전자 공학적으로 취득할 수 있다.
이들 프래그먼트 또는 이들의 프래그먼트로부터 정형적으로 유도할 수 있는 프래그먼트는, (우)305-8566 일본 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1 반치 1 중앙 제 6 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 하기 수탁 번호 하에서 기탁된 미생물을 사용하여 제조하거나, 혹은 각 미생물이 보유하는 플라스미드를 공지된 방법에 의해 개변함으로써 제조할 수도 있다 ;
FERM BP-2264 (H-271 을 코드하는 플라스미드를 보유하는 대장균 ; 기탁일 1989년 1월 30일),
FERM BP-2800 (CH-296 을 코드하는 플라스미드를 보유하는 대장균 ; 기탁일 1989년 5월 12일),
FERM BP-2799 (CH-271 을 코드하는 플라스미드를 보유하는 대장균 ; 기탁일 1989년 5월 12일),
FERM BP-7420 (H-296 을 코드하는 플라스미드를 보유하는 대장균 ; 기탁일 1989년 5월 12일),
FERM BP-1915 (C-274 를 코드하는 플라스미드를 보유하는 대장균 ; 기탁일 1988년 6월 17일),
FERM BP-5723 (C-CS1 을 코드하는 플라스미드를 보유하는 대장균 ; 기탁일 1990년 3월 5일),
FERM BP-10073 (CH-296Na 를 코드하는 플라스미드 ; 기탁일 2004년 7월 23일)
FERM P-12182 (CHV-89 를 코드하는 플라스미드를 보유하는 대장균 ; 기탁일 1991년 4월 8일),
FERM P-12183 (CHV-179 를 코드하는 플라스미드를 보유하는 대장균 ; 기탁일 1991년 4월 8일).
피브로넥틴은 거대한 당 단백질이기 때문에, 천연 기원의 단백질을 조제하여 사용하는 것은 산업상 및 의약품 제조상, 반드시 용이하지 않다. 또, 피브로넥틴은 다기능 단백질인 점에서, 그 사용 상황에 따라서는, 본 발명의 방법에 효과를 나타내는 영역과는 상이한 영역에서 기인하는 문제가 발생하는 경우도 생각할 수 있다. 이런 점들에서, 본 발명에 있어서는, 입수, 취급의 용이함, 안전면의 관점에서, 바람직하게는 피브로넥틴 프래그먼트, 더욱 바람직하게는 상기와 같이 하여 얻어지는 재조합 피브로넥틴 프래그먼트를 사용하는 것이 바람직하다. 또, 높은 확대 배양률을 실현한다는 관점에서도, 전술한 피브로넥틴 프래그먼트를 사용하는 것이 바람직하다. 또, 본 발명에 사용되는 피브로넥틴 프래그먼트의 분자량으로는, 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는 1∼200kD, 보다 바람직하게는 5∼190kD, 더욱 바람직하게는 10∼180kD 이다. 당해 분자량은, 예를 들어, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 피브로넥틴 프래그먼트를 구성하는 폴리펩티드의 아미노산 배열에 있어서, 천연 유래의 피브로넥틴 프래그먼트를 구성하는 폴리펩티드의 아미노산 배열 이외의 아미노산 배열 부분은, 본 발명의 원하는 효과의 발현을 저해하지 않는 한 임의이며, 특별히 한정되는 것은 아니다.
(2) T 세포 집단의 제조 방법
이하, 본 발명의 T 세포 집단의 제조 방법에 대해 구체적으로 설명한다. 본 발명은 CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포, 바람직하게는 CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L 및 CCR7 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포를 고비율로 함유하는 세포 집단을 제조하는 방법이다. 본 발명의 방법은, 전술한 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 존재하에서 T 세포를 함유하는 세포 집단을 배양하는 공정을 함유하는 것을 특징으로 한다.
CD45RA, CD62L, CCR7, CD27, CD28 은 모두 림프구의 세포 표면 항원 마커이며, 나이브 T 세포와 같은 미분화된 세포에 있어서 발현하는 것이 알려져 있다. 즉, 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 세포 집단에 고비율로 함유되는 CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포는, 세포 표면 항원 마커의 표현형으로 하면, 메모리 T 세포로 분화되기 전의 미분화 세포, 즉 나이브 T 모양 세포로서 분류할 수 있다. 전술한 비특허 문헌 4 및 5 에 기재된 바와 같이, 나이브 T 세포는 생체에 투여했을 때의 생체 내에서의 생존률, 세포 증식 효과, 종양에 대한 집적 효과, 종양 특이적 이펙터 세포의 산생률이 높아, 세포 의료 분야에 있어서 유용하다는 것이 기재되어 있다.
또한 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 T 세포 집단은, 후술하는 실시예 3 에 나타내는 바와 같이, 항CD3 항체나 항CD28 항체에 의해 자극을 부여함으로써, IL-2 를 많이 산생하는 활성화된 T 세포가 된다. 또, 후술하는 실시예 4 에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 T 세포 집단은, 케모카인인 CCL21 에 대해 반응하고, 주화성을 나타내는 점에서, 림프절로의 이행능도 갖는다. 또, 후술하는 실시예 5∼8 에 나타내는 바와 같이, 당해 T 세포 집단에 대해 항원 자극을 부하함으로써 항원 특이적 세포 상해 활성을 갖는 CTL 가 유도된다. 또한 후술하는 실시예 9 에 나타내는 바와 같이, 당해 T 세포 집단은, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 비존재하에서 제조된 T 세포 집단과 비교하여, 소량의 IL-2 존재하 혹은 비존재하에서의 생존성이 높은 점에서, 생체 내에서의 생존성도 높은 것이 예상된다. 실제로, 후술하는 실시예 11 에서는, 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 T 세포 집단을 NOD/scid 마우스에게 투여했을 경우, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 비존재하에서 제조된 T 세포 집단을 투여했을 경우와 비교하여, T 세포의 비장(脾臟) 에 대한 생착률이 높고 생존률도 높은 것이 나타나고 있고, 또한 이 실시예에서는 투여한 T 세포 집단은 GVHD 반응도 일으키는 점에서, 높은 세포 상해 활성을 갖는 세포가 유도되는 것도 나타나고 있다. 이런 점들에서, 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 T 세포 집단은, 세포 표면 항원 마커의 표현형만이 아니라, 나이브 T 세포가 갖는 세포 의료 분야에 대한 사용에 적절한 기능도 갖고 있다.
그러나, 놀랍게도, 실시예 7-(4), 8-(2), 15-(4) 및 16-(2) 에서 나타나는 바와 같이, 상기 방법에 의해 제조되는 T 세포 집단으로부터, 또한 후술하는 CD45RA, CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 세포 집단을 분리하는 공정을 실시하여 얻어지는 T 세포 집단은, PBMC 로부터 얻어지는 나이브 T 세포나 본 발명의 유효 성분의 비존재하에서 얻어지는 동일한 표현형을 나타내는 T 세포와 비교하여, 유도되는 CTL 의 세포 상해 활성이 높고, 또 특이적 항원 인식 능력도 높다. 즉, 이와 같은 분리 조작을 실시하여 얻어지는 T 세포 집단은, CTL 로 분화되었을 때의 세포 상해 활성이, 통상적인 나이브 T 세포와 비교하여 유의(有意)하게 높고, 이 점에서 나이브 T 세포와는 상이한, 보다 효과적인 특징을 갖는 신규 나이브 T 모양 세포를 함유하는 세포 집단이다.
상기와 같은 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 T 세포 집단의 높은 치료 효과는 CD8+, CD4+ 중 어느 나이브 T 모양 세포에서도 동일하게 기대된다. 또한, 전술한 특허 문헌 2 에 기재된 바와 같이, 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 존재하에 T 세포의 확대 배양을 실시함으로써, 매우 높은 증식률을 실현할 수 있는 점에서, 본 발명의 방법에 의해 얻어지는 T 세포 집단은 세포 의료 분야에 대한 사용에 매우 적합하다.
본 발명의 제조 방법에 사용되는, T 세포를 함유하는 세포 집단으로는, PBMC, 나이브 T 세포, 메모리 T 세포, 조혈 간세포, 제대혈 단핵구 등이 예시된다. 또, 혈구계 세포이면 본 발명에 사용할 수 있다. 이들의 세포는 생체로부터 채취된 것, 혹은 생체 외에서의 배양을 거쳐 얻어진 것, 예를 들어 본 발명의 방법에 의해 얻어진 T 세포 집단을 그 상태로 혹은 동결 보존한 것 모두 사용할 수 있다. 또, 예를 들어 생체로부터 얻어진 상기의 T 세포 집단의 제조에 사용되는 세포로부터 여러 가지의 분리 조작을 거쳐 얻어진 세포 집단, 예를 들어, PBMC 등의 세포를 CD8+ 혹은 CD4+ 세포로 분리되어 얻어진 어느 하나의 세포 집단을 사용할 수도 있다. 또한, 본 발명의 T 세포 집단의 제조 방법에서는, 상기 세포를 함유하는 재료, 예를 들어, 말초 혈액, 제대혈 등의 혈액이나, 혈액으로부터 적혈구나 혈장 등의 성분을 제거한 것, 골수액 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 T 세포 집단의 제조 방법은, 바람직하게는 총 배양 일수를 4∼14일간으로 하는 것이 바람직하다. 즉, 총 배양 일수가 4∼14일간인 경우, 얻어지는 T 세포 집단 중의, CD45LV 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포의 비율이 높아, 세포 의료 분야에 대한 사용에 매우 적합하다. 또한, 총 배양 일수가 4일 미만인 경우에는, 일반적인 면역 요법에 사용하는 데에는 만족할 수 있는 세포 수를 얻을 수 없다. 본 발명에 있어서, 총 배양 일수로는, 보다 바람직하게는 5∼14일간, 더욱 바람직하게는 7∼14일간이 바람직하다.
본 발명의 T 세포 집단의 제조 방법에 있어서, 특히 바람직하게는 전체 배양 기간 중의 적어도 초기 단계에 있어서 본 발명의 유효 성분 존재하에 배양을 실시하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 적어도 배양 개시시에 본 발명의 유효 성분 존재하에서의 배양을 실시하고 있는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 유효 성분 존재하에서의 배양은 배양 기간 중의 전체 기간이어도 되고, 또 임의의 일부 기간이어도 된다. 즉, T 세포의 제조 공정의 일부에 상기 공정을 포함하는 것이면 본 발명에 포함된다. 바람직하게는 본 발명의 유효 성분 존재하에서의 배양을, 배양 개시시부터 적어도 1일 이상, 보다 바람직하게는 3일 이상, 더욱 바람직하게는 4일 이상 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 피브로넥틴, 그 프래그먼트, 또는 그들 혼합물의 배양 중의 농도로는, 특별히 한정은 없고, 예를 들어 0.001∼500㎍/㎖, 특히 0.01∼500㎍/㎖ 가 바람직하다.
본 발명에 있어서는, T 세포의 TCR-CD3 복합체에 대한 자극을 효과적으로 실시하여, 세포를 증식시킨다는 관점에서, 피브로넥틴, 그 프래그먼트, 또는 그들 혼합물의 존재하에서의 배양을, CD3 리간드의 존재하에서 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, CD3 리간드로는, CD3 에 결합 활성을 갖는 물질이면 특별히 한정은 없지만, 예를 들어 항CD3 항체가 예시되고, 특히 바람직하게는 항CD3 모노클로날 항체가 예시되고, 예를 들어 OKT3 가 예시된다. CD3 리간드의 배지 중의 농도로는, 특별히 한정은 없고, 예를 들어 항CD3 모노클로날 항체를 사용하는 경우에는, 예를 들어 0.001∼100㎍/㎖, 특히 0.01∼100㎍/㎖ 이 바람직하다.
또, 본 발명에 있어서는, 필요에 따라 CD28 리간드 등의 그 밖의 부자극 인자를 첨가하여 부자극을 도입할 수도 있다. 예를 들어, 항CD28 항체, CD80, B7-1, B7-2 등이 예시된다.
본 발명의 T 세포 집단의 제조 방법에 있어서 사용되는 배지는 특별히 한정은 없고, T 세포의 확대 배양에 필요한 성분을 혼합하여 제조된 공지된 배지를 사용할 수 있고, 예를 들어 시판되는 배지를 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 이들 배지는 그 본래의 구성 성분 이외에 사이토카인류, 적당한 단백질, 그 밖의 성분을 함유하고 있어도 된다. 사이토카인류로는, 예를 들어 IL-2, IL-7, IL-12, IFN-γ 등이 예시되고, 바람직하게는, IL-2 를 함유하는 배지가 사용된다. IL-2 의 배지 중의 농도로는, 특별히 한정은 없지만, 예를 들어, 바람직하게는 0.01∼1×105U/㎖, 보다 바람직하게는 0.1∼1×104U/㎖ 이다. 또, 적당한 단백질로는, 예를 들어 항 IL-4 항체가 예시된다. 또, 그 밖에, 렉틴 등의 림프구 자극 인자를 첨가할 수도 있다. 당해 성분의 배지 중의 농도는, 원하는 효과가 얻어지면 특별히 한정되는 것은 아니다.
또한, 배양에 있어서는, 배지 중에 혈청이나 혈장을 첨가할 수도 있다. 이들 배지 중에 대한 첨가량은 특별히 한정은 없지만, 0 용량%∼20 용량% 가 예시되고, 또 배양 단계에 따라 사용하는 혈청이나 혈장의 양을 변경할 수 있다. 예를 들어, 혈청 또는 혈장 농도를 단계적으로 줄여 사용할 수도 있다. 또한, 혈청 또는 혈장의 유래로는, 자기 (배양하는 세포와 유래가 동일한 것을 의미한다) 혹은 비자기 (배양하는 세포와 유래가 상이한 것을 의미한다) 중 어느 하나이어도 되지만, 바람직하게는 안전성의 관점에서 자기 유래인 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 T 세포 집단의 제조는, 통상적으로 본 발명의 상기 유효 성분 존재하에, 소정의 성분을 함유하는 배지 중에서 실시된다. 본 발명에 있어서 사용되는 배양 개시시의 세포 수로는 특별히 한정은 없지만, 예를 들어 바람직하게는 1cell/㎖∼1×108cells/㎖, 보다 바람직하게는 1cell/㎖∼5×107cells/㎖, 더욱 바람직하게는 1cell/㎖∼2×107cells/㎖ 가 예시된다. 또, 배양 조건에 특별히 한정은 없고, 통상적인 세포 배양에 사용되는 조건을 사용할 수 있다. 예를 들어, 37℃, 5%CO2 등의 조건에서 배양할 수 있다. 또, 적당한 시간 간격으로 세포 배양액을 신선한 배지를 첨가하여 희석하거나, 배지를 교환하거나, 혹은 세포 배양용 기재(器材)를 교환할 수 있다.
본 발명의 T 세포 집단의 제조 방법에 있어서 사용되는 세포 배양용 기재로는 특별히 한정은 없지만, 예를 들어, 샬레, 플라스크, 백, 대형 배양조, 바이오리액터 등을 사용할 수 있다. 또한, 백으로는, 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 사용할 수 있다. 또, 공업적으로 대량의 T 세포를 제조하는 경우에는, 대형 배양조를 사용할 수 있다. 또, 배양은 개방계, 폐쇄계 중 어느 것에서도 실시할 수 있지만, 바람직하게는 얻어지는 T 세포의 안전성의 관점에서 폐쇄계에서 배양을 실시하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 유효 성분이나 CD3 리간드, 그 밖의 부자극 인자, 상기 배지 중에 함유되는 적당한 단백질, 사이토카인류, 그 밖의 성분은 배지 중에 용해하여 공존시키는 것 외에, 적절한 고상, 예를 들어 샬레, 플라스크, 백 등의 세포 배양용 기재 (개방계인 것, 및 폐쇄계인 것 중 어떠한 것도 포함한다), 또는 비즈, 멤브레인, 슬라이드 글라스 등의 세포 배양용 담체에 고정화시켜 사용해도 된다. 그들 고상의 재질은 세포 배양에 사용 가능한 것이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 그 성분을, 예를 들어, 상기 기재에 고정화시키는 경우, 배지를 그 기재에 넣었을 때에, 그 성분을 배지 중에 용해시켜 사용하는 경우의 원하는 농도와 동일한 비율이 되도록, 기재에 넣는 배지량에 대해 각 성분의 일정량을 고정화시키는 것이 바람직하지만, 당해 성분의 고정화량은 원하는 효과를 얻을 수 있으면 특별히 한정되는 것은 아니다. 상기 담체는, 세포 배양시에 세포 배양용 기재 중의 배양액에 침지하여 사용된다. 상기 성분을 상기 담체에 고정화시키는 경우, 그 담체를 배지에 넣었을 때에, 그 성분을 배양 중에 용해하여 사용하는 경우의 원하는 농도와 동일한 비율이 되도록, 기재에 넣는 배지량에 대해 각 성분의 일정량을 고정화시키는 것이 바람직하고, 당해 성분의 고정화량은 원하는 효과가 얻어지면 특별히 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 유효 성분이나 CD3 리간드, 그 밖의 부자극 인자의 고상에 대한 고정화 방법으로는 특별히 한정은 없지만, 예를 들어, 적당한 완충액 중에서 이들 물질을 고상과 접촉시킴으로써 고정화시킬 수 있다.
또, 피브로넥틴의 프래그먼트의 고상에 대한 고정화에 대해서는, 국제 공개 제97/18318호 팜플렛, 그리고 국제 공개 제00/09168호 팜플렛에 기재된 방법에 의해서도 고정화를 실시할 수 있다.
상기의 여러 가지 성분이나, 본 발명의 유효 성분을 고상에 고정화시켜 두면, 본 발명의 방법에 의해 T 세포 집단을 얻은 후, 그 T 세포 집단과 고상을 분리하는 것만으로, 유효 성분 등과 그 T 세포 집단을 용이하게 분리할 수 있고, 그 T 세포 집단에 대한 유효 성분 등의 혼입을 방지할 수 있다.
또, 본 발명의 제조 방법은, 본 발명의 유효 성분 존재하에서 배양하여 얻어진 T 세포 집단을, 또한 CD45RA, CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단을 분리하는 공정을 포함할 수도 있다. 즉, 전술한 바와 같이 본 발명의 유효 성분 존재하에서 배양하여 얻어진 T 세포 집단에는 고비율로 CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포가 함유되어 있는 점에서, 또한 CD45RA, CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 표면 항원 마커를 발현하는 세포의 분리 조작을 실시함으로써, 보다 효율적으로 나이브 T 모양 세포 혹은 나이브 T 모양 세포를 더욱 고함유하는 T 세포 집단을 취득할 수 있다. 이 경우, 분리되는 T 세포로는, 특별히 한정은 없지만, 예를 들어 CD45RA 를 발현하는 세포가 예시되고, 바람직하게는 CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 세포, 보다 바람직하게는 CD45RA 및 CD62L 를 발현하는 세포, CD45RA 및 CCR7 를 발현하는 세포가 예시된다. 분리 조작으로는, 특별히 한정은 없지만, 예를 들어 셀소터, 자기 비즈, 칼럼 등을 사용하여 공지된 수법으로 분리할 수 있다. 예를 들어, CD45RA 및 CCR7 를 발현하는 세포를 분리하는 경우에는, 후술하는 실시예 3-(3) 에 기재된 바와 같이 실시할 수 있다.
또, 본 발명의 방법에 의해 제조된 T 세포를 클론화함으로써, 안정적인 T 세포로서 유지할 수도 있다. 또, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 T 세포 집단을 사용하고, 또한 본 발명의 방법이나 공지된 방법에 의해 배양함으로써 새롭게 T 세포 집단을 얻을 수도 있다. 또, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 T 세포 집단을 사용하고, 공지된 방법, 예를 들어 후술하는 실시예 5∼8 과 동일한 방법에 의해 항원 자극 등을 가함으로써 항원 특이적인 CTL 를 제조할 수도 있다.
본 발명의 방법에 의해 얻어지는 T 세포 집단에는, 전술한 바와 같이 미분화된 T 세포인 CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포를 고비율로 함유하고 있지만, 배양에 사용되는 세포의 종류에 따라서는 당해 T 세포 집단 중에 세포 상해 활성을 갖는 T 세포도 함유되어 있다. 당해 T 세포 집단의 세포 상해 활성은 공지된 in vitro 에서의 시험에 의해 평가할 수도 있지만, 본 발명에 의해 얻어지는 T 세포 집단은 전술한 바와 같이 미분화된 나이브 T 모양 세포를 고비율로 함유하는 점에서, 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 T 세포 집단은 이와 같은 평가계에 있어서 반드시 높은 세포 상해 활성을 나타내는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 의해 제조되는 T 세포 집단이 투여되는 질환으로는, 특별히 한정은 없지만, 예를 들어, 암, 백혈병, 악성 종양, 간염이나, 인플루엔자, HIV 등의 바이러스, 세균, 진균이 원인이 되는 감염성 질환, 예를 들어 결핵, MRSA, VRE, 심재성 진균증이 예시된다. 또, 후술하는 바와 같이 추가로 외래 유전자를 도입한 경우에는, 각종 유전자 질환에 대해서도 효과가 기대된다. 또, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 T 세포 집단은, 골수 이식이나 방사선 조사 후의 감염증 예방, 재발 백혈병의 관해를 목적으로 한 도너 림프구 수주(輸注) 등에도 이용할 수 있다.
또한 본 발명은, 상기 본 발명의 T 세포 집단의 제조 방법에 의해 얻어진 CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단을 제공한다. 또, 본 발명은, 당해 T 세포 집단을 유효 성분으로서 함유하는 의약 (치료제) 을 제공한다. 당해 T 세포 집단을 함유하는 상기 치료제는 면역 요법에 대한 사용에 적합하다. 면역 요법에 있어서는, 환자의 치료에 적절한 T 세포가, 예를 들어 주사나 점적에 의한 정맥, 동맥, 피하, 복강 내 등의 투여 방법에 의해 환자에게 투여된다. 당해 치료제는 전술한 질환이나 도너 림프구 수주(輸注)에서의 사용에 있어서 매우 유용하다. 당해 치료제는 제약 분야에서 공지된 방법에 따라, 예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 조제된 당해 T 세포 집단을 유효 성분으로 하고, 공지된 비경구 투여에 적합한 유기 또는 무기의 담체, 부형제, 안정제 등과 혼합하여, 점적제, 주사제로서 조제할 수 있다. 또한, 치료제에 있어서의 본 발명의 T 세포 집단의 함유량, 치료제의 투여량, 당해 치료제에 관한 모든 조건은 공지된 면역 요법에 따라 적절히 결정할 수 있다. 예를 들어, 의약에 있어서의 본 발명의 T 세포 집단의 함유량으로는, 특별히 한정은 없지만, 예를 들어, 바람직하게는 1×103∼1×1011cells/㎖, 보다 바람직하게는 1×104∼1×1010cells/㎖, 더욱 바람직하게는 1×105∼1×109cells/㎖ 가 예시된다. 또, 본 발명의 의약의 투여량으로는 특별히 한정은 없지만, 예를 들어, 성인 하루 당, 바람직하게는 1×106∼1×1012cells/일, 보다 바람직하게는 1×107∼5×1011cells/일, 더욱 바람직하게는 1×108∼2×1011cells/일이 예시된다. 또한, 당해 치료제에 의한 면역 요법과, 공지된 약제 투여에 의한 약제 치료나 방사선 치료, 외과적 수술에 의한 치료와의 병용을 실시할 수도 있다.
본 발명의 T 세포 집단의 제조 방법에 있어서, 당해 T 세포에 외래 유전자를 도입하는 공정을 추가로 포함할 수 있다. 즉, 본 발명은, 그 일 양태로서, T 세포에 외래 유전자를 도입하는 공정을 추가로 포함하는 T 세포 집단의 제조 방법을 제공한다. 또한,「외래 유전자」란, 유전자 도입 대상의 T 세포에 인위적으로 도입되는 유전자를 의미하고, 유전자 도입 대상의 T 세포와 동종 유래인 것도 포함된다.
본 발명의 T 세포의 제조 방법을 실시함으로써, 배양되는 T 세포의 증식능이 증강되지만, 본 발명의 T 세포의 제조 방법을, 유전자의 도입 공정과 조합함으로써, 유전자 도입 효율의 상승이 기대된다.
외래 유전자의 도입 수단에는 특별히 한정은 없고, 공지된 유전자 도입 방법에 의해 적절한 것을 선택하여 사용할 수 있다. 유전자 도입의 공정은, T 세포 집단의 제조시, 임의의 시점에서 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 T 세포 집단의 제조와 동시 혹은 도중에, 혹은 그 공정 후에 실시하는 것이 작업 효율의 관점에서 바람직하다.
상기의 유전자 도입 방법으로는, 바이러스 벡터를 사용하는 방법, 그 벡터를 사용하지 않는 방법 모두를 본 발명에 사용할 수 있다. 그들 방법의 상세한 것에 대해서는 이미 많은 문헌이 공표되어 있다.
상기 바이러스 벡터에는 특별히 한정은 없고, 통상적으로 유전자 도입 방법에 사용되는 공지된 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터, 시미안 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 또는 센다이 바이러스 벡터 등이 사용된다. 특히 바람직하게는, 바이러스 벡터로는, 레트로 바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터 또는 시미안 바이러스 벡터가 사용된다. 상기 바이러스 벡터로는, 감염된 세포 중에서 자기 복제할 수 없도록 복제능을 결손시킨 것이 바람직하다. 또, 유전자 도입시에 레트로넥틴 (등록 상표, 다카라 바이오사 제조) 등의 유전자 도입 효율을 향상시키는 물질을 사용할 수도 있다.
레트로 바이러스 벡터 및 렌티 바이러스 벡터는, 당해 벡터가 도입되는 세포의 염색체 DNA 중에 그 벡터에 삽입되어 있는 외래 유전자를 안정적으로 끼워 넣을 수 있어, 유전자 치료 등의 목적으로 사용되고 있다. 당해 벡터는 분열, 증식 중의 세포에 대한 감염 효율이 높은 점에서, 본 발명에 있어서의 제조 공정에 있어서 유전자 도입을 실시하는 데 바람직하다.
바이러스 벡터를 사용하지 않는 유전자 도입 방법으로는, 본 발명을 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어, 리포솜, 리간드-폴리리신 등의 담체를 사용하는 방법이나 인산 칼슘법, 일렉트로 포레이션법, 파티클 암법 등을 사용할 수 있다. 이 경우에는 플라스미드 DNA, 직쇄상 DNA 나 RNA 에 끼워 넣어진 외래 유전자가 도입된다.
본 발명에 있어서 T 세포에 도입되는 외래 유전자에는 특별히 한정은 없고, 상기 세포에 도입되는 것이 요망되는 임의의 유전자를 선택할 수 있다. 이와 같은 유전자로는, 예를 들어, 단백질 (예를 들어, 효소, 사이토카인류, 리셉터류 등) 을 코드하는 것 외에, 안티센스 핵산이나 siRNA (small interfering RNA), 리보자임을 코드하는 것을 사용할 수 있다. 또, 유전자 도입된 세포의 선택을 가능하게 하는 적당한 마커 유전자를 동시에 도입해도 된다.
상기의 외래 유전자는, 예를 들어, 적당한 프로모터의 제어하에 발현되도록 벡터나 플라스미드 등에 삽입하여 사용할 수 있다. 또, 효율이 양호한 유전자의 전사를 달성하기 위해서, 프로모터나 전사 개시 부위와 협동하는 다른 조절 요소, 예를 들어, 인핸서 배열이나 터미네이터 배열이 벡터 내에 존재하고 있어도 된다. 또, 외래 유전자를 상동 재조합에 의해 도입 대상의 T 세포의 염색체에 삽입하는 것을 목적으로 하여, 예를 들어, 그 염색체에 있어서의 그 유전자가 원하는 표적 삽입 부위의 양측에 있는 염기 배열에 각각 상동성을 갖는 염기 배열로 이루어지는 플랭킹 배열 사이에 외래 유전자를 배치시켜도 된다. 도입되는 외래 유전자는 천연의 것이어도 되거나, 또는 인공적으로 제조된 것이어도 되며, 혹은 기원을 달리하는 DNA 분자가 라이게이션 등의 공지된 수단에 의해 결합된 것이어도 된다. 또한, 그 목적에 따라 천연의 배열에 변이가 도입된 배열을 갖는 것이어도 된다.
본 발명의 방법에 의하면, 예를 들어, 암 등의 환자의 치료에 사용되는 약제에 대한 내성에 관련되는 효소를 코드하는 유전자를 T 세포에 도입하여 그 T 세포에 약제 내성을 부여할 수 있다. 그러한 T 세포를 사용하면, 면역 요법과 약제 요법을 조합할 수 있고, 따라서, 보다 높은 치료 효과를 얻는 것이 가능해진다. 약제 내성 유전자로는, 예를 들어, 다제 내성 유전자 (multidrug resistance gene) 가 예시된다.
한편, 상기의 양태와는 반대로, 특정 약제에 대한 감수성을 부여하는 유전자를 T 세포에 도입하여, 그 약제에 대한 감수성을 부여할 수도 있다. 이러한 경우, 생체에 이식한 후의 T 세포를 당해 약제의 투여에 의해 제거하는 것이 가능해진다. 약제에 대한 감수성을 부여하는 유전자로는, 예를 들어, 티미딘 키나아제 유전자가 예시된다.
그 외에, 도입되는 유전자로는, 표적 세포의 표면 항원을 인식하는 TCR 를 코드하는 유전자나, 표적 세포의 표면 항원에 대한 항체의 항원 인식 부위를 가지고, 또한 TCR 의 세포 내 영역 (CD3 등) 을 포함하는 키메라 리셉터를 코드하는 유전자가 예시된다.
본 발명은 또, 피험체에, 유효량의 전술한 방법에 의해 얻어지는 T 세포 집단을 투여하는 것을 포함하는, 질환의 치료 방법 또는 예방 방법을 제공한다. 본 명세서 중에 있어서 피험체란 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는 본 발명의 방법에 의해 제조되는 T 세포 집단이 투여되는 전술에 기재하는 바와 같은 질환의 환자를 나타낸다.
또, 본 명세서 중에 있어서 유효량이란, 상기 T 세포 집단을 상기 피험체에 투여했을 경우에, 그 T 세포 집단을 투여하지 않는 피험체와 비교하여, 치료 혹은 예방 효과를 발휘하는 그 T 세포 집단의 양이다. 구체적인 유효량으로는, 투여 형태, 투여 방법, 사용 목적 및 피험체의 연령, 체중, 증상 등에 의해 적절히 설정되어 일정하지는 않지만, 바람직하게는, 상기의 의약과 동일하게 하면 된다. 투여 방법에도 한정은 없고, 예를 들어, 상기의 의약과 동일하게, 점적이나 주사 등에 의해 투여하면 된다.
또, 본 발명은, 의약 제조를 위한 전술한 T 세포 집단의 사용도 제공된다. 당해 의약의 제조 방법은 전술한 의약과 동일하게 실시된다. 또, 당해 의약이 투여되는 질환에 대해서도 특별히 한정은 없지만, 전술한 의약과 동일하다.
또, 본 발명은, 전술한 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단에 대해, 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포, 항원이 제시된 세포, 항원, CD3 리간드, CD28 리간드, 사이토카인, 케모카인 및 사이토카인을 산생하는 능력을 갖는 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 자극 인자에 의해 자극을 부여함으로써, 활성화된 T 세포 집단을 제조할 수 있다. 또한 본 발명은, 상기의 제조 방법에 의해 얻어진 T 세포 집단을 제공한다. 이와 같이 하여 얻어지는 활성화된 T 세포 집단은, 전술한 제조 방법에 의해 얻어지는 T 세포 집단과 동일하게 의약의 유효 성분으로서 사용할 수 있다. 여기에서 자극 인자에 의한 자극이란, 자극 인자에 의해 전술한 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 T 세포 집단이 활성화되는 것이면 특별히 한정은 없지만, 예를 들어, 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 T 세포 집단과 자극 인자의 공존하에서 배양을 실시하는 것이 예시된다.
본 명세서에 있어서, 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포로는, 일반적으로 항원 제시 세포로서 사용되는 세포이면 특별히 한정은 없지만, 예를 들어, 수상 세포, γδT 세포, 단구, B 세포, T 세포, 매크로파지, 선유아 세포, 랑게르한스 세포, 이들 중 적어도 1 종의 세포를 함유하는 세포 집단이 예시되고, 특히 바람직하게는 수상 세포, γδT 세포, T 세포, B 세포, 단구, 매크로파지, 이들 중 적어도 1 종의 세포를 함유하는 세포 집단이 예시된다. 또, 당해 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포의 유래로는, 투여되는 환자에게 있어서, 자기, 비자기 중 어느 하나이어도 되지만, 자기 유래의 것이 바람직하게 사용된다. 또한, 본 명세서에 있어서, 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포란, 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖지만, 항원을 제시하고 있지 않는 세포를 의미한다.
본 명세서에 있어서, 항원이 제시된 세포로는, 상기 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포에 인위적으로 적당한 항원이 부가된 세포, 혹은 생체로부터 채취했을 때에 이미 항원을 제시하고 있는 세포 모두를 사용할 수 있다. 항원이 제시된 세포는, 후술하는 실시예 5-(5) 에 기재된 방법과 동일하게 제조하여, 사용할 수도 있다. 또한, 본 명세서에 있어서,「항원이 제시된 세포」라는 문언의 의미에 있어서,「항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포」는 포함되는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서, 항원으로는, 항원 제시 세포 상에 펩티드가 제시되고, T 세포에 의해 인식되어, T 세포를 효율적으로 활성화시킬 수 있는 것이면 특별히 한정은 없지만, 예를 들어 펩티드, 당 펩티드, 종양 세포 추출물, 종양 세포 초음파 처리물 및 종양 세포 열수 처리물, 바이러스, 세균, 단백질 등이 예시된다.
또, 여기에서 CD3 리간드, CD28 리간드의 구체예로는, 전술된 CD3 리간드나 CD28 리간드가 예시된다. 또한, 후술하는 실시예 3 과 같이 전술한 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단에 대해, 항CD3 항체 및 항CD28 항체에 의한 공자극을 부여함으로써, 사이토카인 산생능을 갖는 활성화된 림프구 집단을 제조할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 사이토카인이란, T 세포에 작용하여 활성화할 수 있는 것이면 특별히 한정은 없지만, 예를 들어 IL-2, IFN-γ, TGF-β, IL-15, IL-7, IFN-α, IL-12, CD40L, IL-27 등이 예시되고, 세포성 면역을 증강시키는 관점에서 특히 바람직하게는, IL-2, IFN-γ, IL-12 가 예시된다.
본 명세서에 있어서, 케모카인이란, T 세포에 작용하여 유주 활성을 나타내는 것이면 특별히 한정은 없지만, 예를 들어 RANTES, CCL21, MIP1α, MIP1β, CCL19, CXCL12, IP-10, MIG 가 예시된다.
본 명세서에 있어서, 사이토카인을 산생하는 능력을 갖는 세포로는, 전술한 사이토카인을 산생할 수 있는 능력을 갖는 세포이면 특별히 한정은 없지만, 예를 들어, 세포성 면역을 증강시킨다는 관점에서는 Th1 세포가 바람직하게 사용된다.
또, 전술한 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 T 세포 집단은 미분화이고 항원 자극을 받지 않은 나이브 T 모양 세포를 고비율로 함유하는 점에서, 여기에서 사용되는 자극 인자로는, 특히 바람직하게는 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포, 항원이 제시된 세포, 및/또는 항원을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어 후술하는 실시예 5-(5), 6-(8), 7-(2), 8-(1), 14-(7) 및 15-(2) 에 나타내는 바와 같이, 전술한 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 T 세포 집단에 대해 항원 자극을 부하함으로써, 매우 세포 상해 활성이 높고, 항원 인식능도 높은 유용한 항원 특이적 CTL 를 유도할 수 있다. 또, 당해 배양은 상기 자극 인자 외에, 전술한 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들의 혼합물이나, T 세포의 배양에 사용되는 공지 성분 존재하에서 배양을 실시할 수 있다. 이와 같이 하여 제조된 T 세포 집단은, 치료 효과가 높아 매우 유용한 T 세포 집단이 된다.
본 발명은 또, 피험체에, 유효량의 전술한 방법에 의해 얻어지는 활성화된 T 세포 집단을 투여하는 것을 포함하는, 질환의 치료 방법 또는 예방 방법을 제공한다. 또, 본 발명은, 의약 제조를 위한 전술한 활성화된 T 세포 집단의 사용도 제공된다. 당해 의약의 제조 방법은 전술한 의약과 동일하게 실시된다. 또, 당해 의약이 투여되는 질환에 대해서도 특별히 한정은 없지만, 전술한 의약과 동일하다.
또한, 본 발명은, (a) 전술한 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단을 유효 성분으로서 함유하는 제제, 및
(b) 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포, 항원이 제시된 세포, 항원, CD3 리간드, CD28 리간드, 사이토카인, 케모카인 및 사이토카인을 산생하는 능력을 갖는 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 자극 인자를 유효 성분으로서 함유하는 제제를 포함하는 의약으로서, 당해 제제는 동시에 또는 각각 투여되는 2 개의 각각의 제제로서 함유되는 의약이 제공된다. 전술하는 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 얻어지는 T 세포 집단은 나이브 T 모양 세포를 고비율로 함유하는 점에서, 당해 T 세포 집단과 동시에, 또는 각각 이들의 자극 인자를 환자에게 투여함으로써, 투여되는 T 세포 집단의 효과를 최대한으로 발휘할 수 있어, 보다 높은 질환의 치료 효과를 발현할 수 있다. 여기에서 자극 인자로는, 항원 자극을 부여할 수 있는 것, 즉 백신으로서 사용할 수 있는 것, 예를 들어, 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포, 항원이 제시된 세포, 항원, CD3 리간드, CD28 리간드, 사이토카인, 케모카인 및 사이토카인을 산생하는 능력을 갖는 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나가 바람직하고, 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포, 항원이 제시된 세포, 또는 항원이 본 발명에 의해 바람직하게 사용된다.
당해 의약 중의 (a) 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단을 유효 성분으로서 함유하는 제제는, 전술한 당해 T 세포 집단을 유효 성분으로서 함유하는 의약과 동일하게 제조, 제제화할 수 있다. 또 당해 의약 중의 CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단의 함유량이나 투여량, 투여 형태로는 특별히 한정은 없지만, 예를 들어 전술한 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 T 세포 집단을 함유하는 의약과 동일하게 할 수 있다.
또, 당해 의약 중의, (b) 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포, 항원이 제시된 세포, 항원, CD3 리간드, CD28 리간드, 사이토카인, 케모카인 및 사이토카인을 산생하는 능력을 갖는 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 자극 인자를 유효 성분으로서 함유하는 제제로는, 예를 들어 당해 자극 인자를 적당한 담체와 조합하여 제제화한 것을 사용할 수 있다. 또, 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포, 항원이 제시된 세포, 항원, CD3 리간드, CD28 리간드, 사이토카인, 케모카인 및 사이토카인을 산생하는 능력을 갖는 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 자극 인자의 구체예로는, 예를 들어, 전술에 예시되는 것을 사용할 수 있다.
예를 들어 자극 인자로서 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포, 항원이 제시된 세포, 항원 또는 사이토카인을 산생하는 능력을 갖는 세포를 사용하는 경우, 특별히 한정은 없지만, 적절한 점적용 혹은 주사용의 의약 담체와 조합하여 제제화할 수 있다. 또, 항원 펩티드를 사용하는 경우, 특별히 한정은 없지만, 적당한 애쥬번트와 조합할 수 있다. 또, 사이토카인이나 케모카인을 사용하는 경우에는, 공지된 방법으로 리포솜 중에 끼워 넣도록 제제화할 수도 있다. 또, 당해 자극 인자 제제 중의 함유량으로는, 사용되는 자극 인자의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있고, 특별히 한정은 없지만, 예를 들어 자극 인자로서 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포, 항원이 제시된 세포 혹은 사이토카인을 산생하는 능력을 갖는 세포를 사용하는 경우, 예를 들어 바람직하게는 1×103∼1×109cells/㎖, 보다 바람직하게는 1×103∼1×108cells/㎖, 더욱 바람직하게는 1×104∼1×107cells/㎖ 가 예시된다. 또, 당해 자극 인자의 투여 형태로는, 사용되는 자극 인자의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있고, 특별히 한정은 없지만, 예를 들어 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 피하 투여, 복강 내 투여, 경구 투여 등에 의해 투여된다. 투여량으로는, 환자의 질환을 치료 또는 개선하는 데 유효한 양이면 특별히 한정은 없지만, 예를 들어 항원을 제시하는 능력을 갖는 세포를 투여하는 경우에는, 예를 들어, 바람직하게는 1×103∼1×1011cells/일, 보다 바람직하게는 1×103∼1×1010cells/일, 더욱 바람직하게는 1×104∼1×109cells/일이, 또 항원 펩티드를 투여하는 경우에는, 예를 들어, 바람직하게는 0.001∼100mg/일, 보다 바람직하게는 0.003∼30mg/일, 특히 바람직하게는 0.01∼10mg/일이 예시된다.
또한, (b) 의 제제 투여의 바람직한 예로는, 예를 들어 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포와 항원을 조합하여 (b) 의 제제로서 투여하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 수상 세포와 항원 펩티드를 조합하여 투여하는 것이 바람직하다. 이 경우, 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포나 항원의 제제 중의 함유량이나 투여량에 대해서는 전술한 바와 같이 실시할 수 있다.
또, 당해 의약에 있어서의 (a) 의 제제와 (b) 의 제제의 투여는, 동시에 또는 각각 환자에게 투여되는 것이지만, 여기에서「동시에」란 시간적으로 동시에, 각각의 제제로서 환자에게 투여하는 것이나, 환자에게 투여하기 전에 (a) 의 제제와 (b) 의 제제를 혼합하여 투여하는 것을 의미한다. 예를 들어, (a) 의 제제 및 (b) 의 제제를 점적제로서 투여하는 경우에는, 투여 전에 이들 제제를 혼합하여 환자에게 투여하는 양태가 본 발명에 포함된다. 또,「각각」이란, 시간적으로 각각 (a) 의 제제와 (b) 의 제제를 투여하는 것을 의미하고, (a) 의 제제와 (b) 의 제제의 투여 간격에 대해서는, 환자 체내에서 (a) 의 제제에 함유되는 T 세포 집단에 대해, (b) 의 제제에 함유되는 자극 인자의 자극이 가해지는 것이면 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, (a) 의 제제를 투여한 후, (b) 의 제제를 투여하는 것이 바람직하다. 또 투여 횟수에 대해서도 특별히 한정은 없고 각각 1 회 혹은 수 회로 나누어 투여할 수 있다.
또, 본 발명은, (a) 전술한 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단을 환자에게 투여하는 공정, 및 (b) 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포, 항원이 제시된 세포, 항원, CD3 리간드, CD28 리간드, 사이토카인, 케모카인 및 사이토카인을 산생하는 능력을 갖는 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 자극 인자를 환자에게 투여하는 공정을 포함하는 질환의 치료 방법도 제공한다.
당해 치료 방법은, 전술하는 바와 같이, 매우 높은 치료 효과를 발휘할 수 있다. 여기에서 자극 인자로는, 항원 자극을 부여할 수 있는 것, 즉 백신으로서 사용할 수 있는 것, 예를 들어, 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포, 항원이 제시된 세포, 항원, CD3 리간드, CD28 리간드, 사이토카인, 케모카인 및 사이토카인을 산생하는 능력을 갖는 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나가 바람직하고, 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포, 항원이 제시된 세포, 또는 항원이 본 발명에 의해 바람직하게 사용된다.
당해 치료 방법에 있어서, (a) 본 발명의 방법에 의해 얻어진 T 세포 집단을 환자에게 투여하는 공정으로는 특별히 한정은 없지만, 예를 들어 전술한 의약의 투여 방법과 동일한 투여량, 투여 형태를 채용하여 실시할 수 있다. 또, (b) 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포, 항원이 제시된 세포, 항원, CD3 리간드, CD28 리간드, 사이토카인, 케모카인 및 사이토카인을 산생하는 능력을 갖는 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 자극 인자를 환자에게 투여하는 공정에 대해서도 특별히 한정은 없지만, 예를 들어 전술한 의약과 동일한 투여량, 투여 형태를 채용하여 실시할 수 있다.
또, 상기 (a) 의 공정과 (b) 의 공정의 투여 간격에 대해서는, 전술한 (a) 의 제제와 (b) 의 제제를 포함하는 의약과 동일하게 실시할 수 있고, 즉 환자 체내에서 (a) 의 공정에 의해 투여되는 T 세포 집단에 대해 (b) 의 공정에 의해 투여되는 자극 인자의 자극이 가해지는 것이면 특별히 한정은 없지만, 동시에, 혹은 각각 실시할 수 있고, 바람직하게는, (a) 의 투여 공정 후, (b) 의 투여 공정을 실시하는 것이 바람직하다. 또 투여 횟수에 대해서도 특별히 한정은 없고 각각 1 회 혹은 수 회로 나누어 투여할 수 있다.
이하, 실시예를 들어, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들의 기재에 조금도 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 CD45RA+CD62L+ T 세포의 해석
(1) PBMC 의 분리 및 보존
인폼드·컨센트가 얻어진 인간 정상인 도너로부터 성분 채혈을 실시 후, 채혈액을 인산 완충 생리 식염수 (이하, PBS 라고 기재) 로 2 배 희석하고, Ficoll-paque (아마샴 바이오 사이언스사 제조) 상에 중층(重層)하여 600×g 으로 20 분간 원심하였다. 중간층의 말초혈 단핵구 세포 (이하, PBMC 라고 기재) 를 피펫으로 회수, 세정하였다. 채취한 PBMC 는 90% FBS (Cambrex 사 제조/10% DMSO (시그마사 제조) 로 이루어지는 보존액 혹은 8% 인간 혈청 알부민 (Baxter 사 제조, 이하, HSA 라고 기재) 을 함유하는 CP-1 (극동 제약사 제조) 와 RPMI1640 배지 (시그마사 제조) 의 등량 혼합액으로 이루어지는 보존액에 현탁하고, 액체 질소 중에서 보존하였다. T 세포 확대 배양시에는 이들 보존 PBMC 를 37℃ 수욕 중에서 급속 융해하고, 10㎍/㎖ DNase (카르비오켐사 제조) 를 함유하는 RPMI1640 배지로 세정 후, 트리판블루 염색법으로 생세포 수를 산출하여 각 실험에 제공하였다.
(2) 항인간 CD3 항체 및 CH-296 프래그먼트 고정화
이하의 실험에서 사용하는 배양 기재에 항인간 CD3 항체 및 CH-296 프래그먼트를 고정화시켰다. 즉 12 웰 세포 배양 플레이트 (벡톤·디킨슨사 제조) 에 항인간 CD3 항체 (얀센파마사 제조) (최종 농도 5㎍/㎖) 를 함유하는 PBS 를 1.9㎖ 씩 첨가하였다. 이 때, CH-296 첨가군에는 CH-296 을 최종 농도 (25㎍/㎖) 가 되도록 첨가하였다.
이들의 배양 기재를 실온에서 5시간 인큐베이트 후, 사용시까지 4℃ 로 보존하였다. 사용 직전에는 이들의 배양 기재로부터 항체·CH-296 을 함유하는 PBS 를 흡인 제거 후, 각 웰을 PBS 로 2 회, RPMI1640 배지로 1 회 세정하여 각 실험에 제공하였다.
(3) T 세포 집단의 확대 배양
1% Human AB형 혈청 (Cambrex 사 제조) 을 함유하는 AIM-V (인비트로젠사 제조, 이하 1% AIM-V 로 약칭한다) 에 1×106cells/㎖ 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 현탁하여 세포액을 조제 후, 실시예 1-(2) 에서 조제한 항인간 CD3 항체 고정화 플레이트, 또는 항인간 CD3 항체 및 CH-296 고정화 플레이트에 1% AIM-V 를 2㎖/웰로 첨가해 두고, 상기 세포액을 1㎖/웰씩 첨가하였다. 최종 농도 1000U/㎖ 가 되도록 IL-2 (프로로이킨 : 카이론사 제조) 를 첨가하고, 이들 플레이트를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째). 배양 개시 4일째 이후에는, 1% AIM-V 를 사용하여 아무것도 고정화시키지 않은 새로운 12.5㎠ 세포 배양 플라스크 (벡톤·디킨슨사 제조) 에 계대를 실시하고, 최종 농도 500U/㎖ 의 IL-2 를 첨가하였다 (배양액량 6㎖). 즉, 배양 개시 후 4일째에는 0.05×106cells/㎖, 7일째에는 0.1×106cells/㎖, 10일째에는 0.15×106cens/㎖ 로 계대를 실시하였다. 배양 개시 후 7, 10, 14일째에 트리판블루 염색법으로 생세포 수를 계측하고, 배양 개시시의 세포 수와 비교하여 확대 배양률을 산출하였다. 결과를 표 1 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00001
표 1 에 나타내는 바와 같이, T 세포 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 대조군과 비교하여 어느 배양 시점에서도 T 세포 집단의 확대 배양률이 높았다.
(4) 각 배양 일시에서의 CD45RA+CD62L+ T 세포의 해석
실시예 1-(3) 의 각 배양 일시에 조제한 세포를 PBS, 1% 우혈청 알부민 (시그마사 제조, 이하, BSA 라고 기재) 을 함유하는 PBS (이하, 1% BSA/PBS 라고 기재) 에서 세정하였다. 세포를 1% BSA/PBS 중에 현탁하고, 네거티브 컨트롤로서 FITC 표지 마우스 IgG1/RD1 표지 마우스 IgG1/PC5 표지 마우스 IgG1 (베크만 쿨터사 제조) 를 첨가하였다. 마찬가지로 FITC 표지 마우스 항인간 CD62L 항체 (시그마사 제조)/RD1 표지 마우스 항인간 CD45RA 항체 (베크만 쿨터사 제조) 를 첨가하였다. 각각의 항체를 첨가 후, 얼음 상에서 30분 인큐베이트하였다. 인큐베이트 후, 세포를 1% BSA/PBS 로 세정하여, 다시 PBS 에 현탁하였다. 이 세포를 플로우 사이토메트리 (Cytomics FC500 : 베크만 쿨터사 제조) 에 제공하여, CD45RA+CD62L+ T 세포의 비율을 산출하였다. 결과를 표 2 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00002
표 2 에 나타내는 바와 같이, CH-296 프래그먼트를 고정화시킨 배양 용기를 사용한 군에 있어서는, 대조군과 비교하여, 배양 중의 T 세포에 있어서의 CD45RA+CD62L+ T 세포 집단이 배양 7일째, 10일째, 14일째 중 어느 것에 있어서도 높은 결과를 얻을 수 있었다. 이들의 결과로부터 확대 배양 초기에 CH-296 프래그먼트를 공존시킴으로써, 7∼14일간까지의 확대 배양으로 T 세포 집단의 CD45RA+CD62L+ T 세포 집단 비율을 높이면서 T 세포를 확대 배양할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 2 CD45RA+CCR7+ T 세포의 해석
(1) T 세포 집단의 확대 배양
3% Human AB형 혈청을 함유하는 AIM-V (이하 3% AIM-V 로 약칭한다) 에 1×106cells/㎖ 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 현탁하여 세포액을 조제 후, 실시예 1-(2) 에서 조제한 항인간 CD3 항체 고정화 플레이트, 또는 항인간 CD3 항체 및 CH-296 고정화 플레이트에 3% AIM-V 를 2㎖/웰로 첨가해 두고, 상기 세포액을 1㎖/웰씩 첨가하였다. 최종 농도 1000U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가하고, 이들 플레이트를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째). 배양 개시 4일째에, 각 군 모두 0.075×106cells/㎖ 가 되도록 1% Human AB형 혈청을 함유하는 AIM-V 에 의해 희석하고 (액량 6㎖), 배양액을 아무것도 고정화시키지 않은 12.5㎠ 세포 배양 플라스크에 옮겨, 최종 농도 500U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 혈청 농도는, 30㎖ 채혈로부터 얻어진 PBMC 를 배지 10L 로 배양하는 것을 상정하여 결정하였다. 배양을 계속하여, 7일째에는 각 군 모두 0.25×106cells/㎖ 가 되도록, 0.05% Human AB형 혈청을 함유하는 AIM-V 를 사용하여 희석한 배양액 (액량 12.6㎖) 을 아무것도 고정화시키지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크 (벡톤·디킨슨사 제조) 를 세운 것에 옮겼다. 모두 최종 농도 500U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 후 11일째에는, 7일째와 동일한 혈청 농도의 Human AB형 혈청을 함유하는 AIM-V 를 사용하여 1.04×106cells/㎖ 가 되도록 세포액을 희석하고 (액량 12.6㎖), 아무것도 고정화시키지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것에 각각 옮겼다. 각 군에 있어서 최종 농도 500U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 후 14일째에 트리판블루 염색법으로 생세포 수를 계측하고, 배양 개시시의 세포 수와 비교하여 확대 배양률을 산출하였다. 결과를 표 3 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00003
표 3 에 나타내는 바와 같이, T 세포 집단 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 군에 있어서는, 대조군과 비교하여 T 세포의 확대 배양률이 높다. 현재까지, CH-296 프래그먼트는 T 세포 확대 배양시에 바람직하게 사용되는 것이 명백하게 되어 있지만, 당해 실시예에 있어서 CH-296 프래그먼트는 14일간 T 세포 확대 배양시에도 바람직하게 사용되는 것이 분명해졌다.
(2) 배양 후의 CD8+ T 세포 및 CD8- T 세포 서브 세트에 있어서의 CD45RA+CCR7+ T 세포의 해석
실시예 2-(1) 에서 조제한 세포를 PBS, 1% BSA/PBS 로 세정하였다. 세포를 1% BSA 를 함유하는 PBS 중에 현탁하고, 네거티브 컨트롤로서 FITC 표지 마우스 IgG1/RD1 표지 마우스 IgG1/PC5 표지 마우스 IgG1＋ECD 표지 마우스 IgG1 (베크만 쿨터사 제조) 를 첨가하였다. 마찬가지로, RD1 표지 마우스 항인간 CD45RA 항체/FITC 표지 마우스 항인간 CCR7 항체 (R&D Systems 사 제조)/ECD 표지 마우스 항체 (베크만 쿨터사 제조) 를 첨가하였다. 각각의 항체를 첨가 후, 얼음 상에서 30분간 인큐베이트하였다. 도중에, 10분마다 천천히 교반을 실시하였다. 인큐베이트 후, 세포를 1% BSA/PBS 로 세정하고, 다시 PBS 에 현탁하였다. 이 세포를 플로우 사이토메트리 (flow cytometry) 에 제공하고, CD8 의 염색성에 의해 CD8+ T 세포 영역과 CD8- T 세포 영역으로 분류하였다. 각각의 세포 집단에 대해, CD45RA+CCR7+ T 세포의 비율을 산출하였다. 결과를 표 4 및 표 5 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00004
Figure 112008030960796-PCT00005
표 4 에 나타내는 바와 같이, CH-296 프래그먼트를 고정화시킨 배양 용기를 사용한 군에 있어서는, 대조군과 비교하여, 배양 중의 T 세포에 있어서의 CD45RA+CCR7+ T 세포 집단이 높은 결과를 얻을 수 있었다. 이 현상은 CD8- T 세포, 즉 그 대부분이 CD4+ T 세포인 세포 집단에 대해 해석했을 경우에도 동일하였다 (표 5). 이들 결과로부터 14일간의 확대 배양 초기에 CH-296 프래그먼트를 공존시킴으로써, T 세포의 CD45RA+CCR7+ T 세포 집단 비율을 높이면서 T 세포 집단을 확대 배양할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 3 CH-296 을 사용하여 확대 배양한 T 세포 집단 중의 CD45RA+CCR7+ T 세포 및 CD45RA-CCR7- T 세포의 사이토카인 산생성의 해석
(1) T 세포 집단의 확대 배양
0.5% Human AB형 혈청 및 0.2% HSA 를 함유하는 GT-T503 배지 (다카라 바이오사 제조, 이하 0.5% GT-T503 라고 기재) 에 0.25×106cells/㎖ 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 현탁하고 세포액을 조제 후, 실시예 1-(2) 에서 조제한 항인간 CD3 항체 고정화 플레이트, 또는 항인간 CD3 항체 및 CH-296 고정화 플레이트에 0.5% GT-T503 을 0.5㎖/웰로 첨가해 두고, 상기 세포액을 1㎖/웰씩 첨가하였다. 최종 농도 1000U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가하고, 이들 플레이트를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째). 배양 개시 4일째에, 각 군의 배양액을 0.5% GT-T503 을 사용하여 약 8 배가 되도록 희석하고, 희석액 6㎖ 를 아무것도 고정화시키지 않은 12.5㎠ 세포 배양 플라스크에 옮겨, 최종 농도 500U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양을 계속하여, 7일째에는 각 군의 배양액을 0.5% GT-T503 을 사용하여 약 4.2 배 희석하고, 희석액 12.6㎖ 를 아무것도 고정화시키지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것에 옮겼다. 모두 최종 농도 500U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 후 10일째에는, 0.2% HSA 를 함유하는 GT-T503 배지를 사용하여, 각 군의 세포 배양액을 약 2 배 희석하고, 아무것도 고정화시키지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것에 희석액 12.6㎖ 를 각각 옮겼다. 각 군에 있어서 최종 농도 500U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 후 14일째에 트리판블루 염색법으로 생세포 수를 계측하고, 배양 개시시의 세포 수와 비교하여 확대 배양률을 산출하였다. 결과를 표 6 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00006
표 6 에 나타내는 바와 같이, T 세포 집단 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 군 (이하 CH-296 군) 에 있어서는, 대조군과 비교하여 T 세포 집단의 확대 배양률이 높았다.
(2) CD45RA+CCR7+ T 세포의 해석
실시예 3-(1) 에서 조제한 세포를 실시예 1-(4) 와 동일한 방법에 의해 각 항체로 염색하여 해석을 실시하였다. 단, 항체의 조합은 이하와 같이 실시하였다. 즉, FITC 표지 마우스 IgG1/RD1 표지 마우스 IgG1/PC5 표지 마우스 IgG1 및 RD1 표지 마우스 항인간 CD45RA 항체/FITC 표지 마우스 항인간 CCR7 항체로 염색을 실시하였다. 이들을 플로우 사이토미터에 의해 해석하고, CD45RA+CCR7+ T 세포의 비율을 산출하였다. 결과를 표 7 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00007
표 7 에 나타내는 바와 같이, CH-296 군에 있어서는, 대조군과 비교하여, 배양 중의 T 세포 집단에 있어서의 CD45RA+CCR7+ T 세포 집단이 높은 결과를 얻을 수 있었다.
(3) T 세포 집단 확대 배양 후의 세포로부터의 CD45RA+CCR7+ T 세포와 CD45RA-CCR7- T 세포의 단리
실시예 3-(1) 에서 조제한 세포를 실시예 2-(2) 와 동일한 방법에 의해 염색한 후, 세포를 1% BSA/PBS 로 세정하여, GT-T503 배지에 현탁하였다. 이 세포를 Moflo (Dako 사 제조) 로 CD8+ T 세포의 CD45RA+CCR7+ T 세포와 CD45RA-CCR7- T 세포로, 동일하게 CD8- T 세포, 즉 그 대부분이 CD4+ T 세포의 CD45RA+CCR7+ T 세포와 CD45RA-CCR7- T 세포로 소팅 (sorting) 하였다. 또 동일한 소팅 전의 염색 세포를 플로우 사이토메트리에 제공하고, CD8 의 염색성에 의해 CD8+ T 세포 영역과 CD8- T 세포 영역으로 분류하고, 각각의 세포 집단에 대해, CD45RA+CCR7+ T 세포의 비율을 산출하였다. 결과를 표 8 및 표 9 에 나타낸다.
CD8+ T 세포
CD45RA+CCR7+ T 세포 (%)
대조 (CH-296 비고정화) 15.9
CH-296 52.6
CD8- T 세포 (CD4+ T 세포)
CD45RA+CCR7+ T 세포 (%)
대조 (CH-296 비고정화) 5.4
CH-296 34.0
표 8 에 나타내는 바와 같이, CD8+ T 세포에 대해 CH-296 군에 있어서는, 대조군과 비교하여, 배양 후의 T 세포 집단에 있어서의 CD45RA+CCR7+ T 세포 집단의 비율이 높은 결과를 얻을 수 있었다. 이 현상은 CD8- T 세포, 즉 그 대부분이 CD4+ T 세포인 세포 집단에 대해 해석했을 경우에도 동일하였다 (표 9).
(4) 항인간 CD3 항체 및 항인간 CD28 항체의 고정화
이하의 실험에서 사용하는 배양 기재에 항인간 CD3 항체 및 항인간 CD28 항체를 고정시켰다. 즉 96 웰 세포 배양 플레이트 (벡톤·디킨슨사 제조) 에 항인간 CD3 항체 (2㎍/㎖) 를 함유하는 아세트산 완충액 (pH5.3) 을 80μL 씩 첨가하고, 추가로 항인간 CD28 항체 (Dako 사 제조) (20㎍/㎖) 를 함유하는 아세트산 완충액을 80μL 씩 첨가하였다. 항인간 CD3 항체는 최종 농도 1㎍/㎖, 항인간 CD28 항체는 최종 농도 10㎍/㎖ 가 되도록 하였다. 이들의 배양 기재를 실온에서 5시간 인큐베이트 후, 사용시까지 4℃ 로 보존하였다. 사용 직전에 이들 기재로부터 항체를 함유하는 아세트산 완충액을 흡인 제거 후, 각 웰을 PBS 로 2 회, GT-T503 배지로 1 회 세정하여 실험에 제공하였다.
(5) 세포의 자극
나이브 T 세포나 센트럴 메모리 T 세포는 체내에서 항원 자극을 받았을 때에, IL-2 를 많이 산생하는 것이 알려져 있다. 또, 이펙터 메모리 T 세포는 항원 자극을 받았을 때에 IFN-γ 나 IL-4 를 많이 산생하는 것이 알려져 있다. 실시예 3-(3) 에서 얻어진 각 세포 획분이 이들의 기능을 유지하고 있는지를 확인하기 위해서, 항CD3 항체 및 항CD28 항체로 자극했을 때의 사이토카인 산생능을 측정하였다. 실시예 3-(3) 에서 얻어진 각 세포 집단을 회수 후, 0.5% GT-T503 에 현탁하여 세포 수를 계측하였다. 실시예 3-(4) 에서 조제한 항인간 CD3 항체 및 항인간 CD28 항체 고정화 플레이트에 2×105cells/0.2㎖ 가 되도록 세포를 각 웰에 첨가하고, 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다. 24시간 후 배양 상청을 회수하고, ELISA 법에 의한 사이토카인 측정 실험에 제공하였다.
(6) ELISA 법에 의한 사이토카인 산생의 측정
실시예 3-(3) 에서 나타난 바와 같이, CH-296 군에 있어서는, 대조군과 비교하여 CD45RA+CCR7+ T 세포 비율이 높은 결과를 얻을 수 있었다. 이 CD45RA+CCR7+ T 세포 집단이 나이브 T 모양 세포로서의 성질을 유지하고 있는지를 확인하기 위해서, T 세포 집단 확대 배양 후에 분리된 CD45RA+CCR7+ T 세포와 CD45RA-CCR7- T 세포의 사이토카인 산생성을 평가하였다. IL-2, IFN-γ 의 산생은, ELISA Development Kit (R&D Systems 사 제조) 를 사용하고, 또 IL-4 의 산생은 READY-SET-GO! Human Interleukin-4 (eBioscience 사 제조) 를 사용하여 측정을 실시하였다. 대조군 및 CH-296 군에 있어서의 각 사이토카인 산생의 결과를 각각 표 10 및 표 11 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00008
Figure 112008030960796-PCT00009
표 10, 11 에 나타내는 바와 같이, 대조군 및 CH-296 군에 있어서도, IL-2의 산생이 확인되었다. 어느 군에 있어서도 CD8- T 세포가 CD8+ T 세포보다, 또 CD45RA+CCR7+ T 세포가 CD45RA-CCR7- T 세포보다 산생량이 많았다. 이런 점에서, T 세포 집단 확대 배양에서 얻어진 CD45RA+CCR7+ T 세포 집단은 나이브 T 모양 세포로서의 성질을 갖는 것이 나타났다. 한편, IFN-γ 및 IL-4 에 대해서는, 대조군 및 CH-296 군에 있어서도 CD45RA-CCR7- T 세포에 우위로 산생되고, CD45RA-CCR7- T 세포 집단이 이펙터 메모리 기능을 유지하고 있는 집단인 것이 시사되었다.
실시예 4 CH-296 을 사용하여 확대 배양한 T 세포 집단의 주화성의 해석
(1) 항인간 CD3 항체 및 CH-296 프래그먼트 고정화
실시예 1-(2) 와 동일한 방법으로 실시하였다. 단, 항인간 CD3 항체 (최종 농도 5㎍/㎖) 를 함유하는 PBS 는 0.45㎖ 씩 첨가하였다.
(2) T 세포 집단의 확대 배양
배양 개시 4일째에, 약 14 배가 되도록 희석하고, 희석액 10㎖ 를 25㎠ 세포 배양 플라스크 (코닝사 제조) 를 세운 것에, 배양 개시 8일째에는 약 2 배로 희석하고, 희석액 10㎖ 를 25㎠ 세포 배양 플라스크 (코닝사 제조) 를 세운 것에, 배양 개시 11일째에는 0.2% HSA 를 함유하는 GT-T503 배지를 각 플라스크에, 10㎖ 첨가한 것 이외에는 실시예 3-(1) 에 준하여 실시하였다. 확대 배양률의 결과를 표 12 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00010
표 12 에 나타내는 바와 같이, T 세포 집단 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 군 (이하 CH-296 군) 에 있어서는, 대조군과 비교하여 T 세포 집단의 확대 배양률이 높았다.
(3) CD45RA+CCR7+ T 세포의 해석
실시예 4-(2) 에서 조제한 세포를 실시예 3-(2) 와 동일한 방법으로, CD45RA+CCR7+ T 세포의 비율을 산출하였다. 결과를 표 13 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00011
표 13 에 나타내는 바와 같이, CH-296 군에 있어서는, 대조군과 비교하여, 배양 중의 T 세포 집단에 있어서의 CD45RA+CCR7+ T 세포 집단이 높은 결과가 얻어졌다.
(4) 주화성의 해석
CH-296 군에 있어서는 대조군과 비교하여 CD45RA+CCR7+ T 세포 집단 비율이 높은 결과가 얻어졌다. 나이브 T 세포나 센트럴 메모리 T 세포 등의 CCR7 양성 세포는 케모카인 CCL21 에 대해 반응하여, 주화성을 나타낸다. 이것은, 이들 세포가 혈관으로부터 림프절로 이행하는 데 중요한 이벤트이며, 확대 배양 후에 얻어진 세포가 CCL21 에 대한 주화성을 갖는지 확인하였다. 실시예 4-(2) 에서 얻어진 세포를 원심하여, 상청을 제거 후, 5×106cells/㎖ 가 되도록 0.5% BSA 함유 RPMI1640 배지 (이하 반응 배지로 표기) 에 현탁하였다. 트랜스웰 플레이트 (Transwell Polycarbonate 24well 5μm pore size, 코닝사 제조) 의 하층에 최종 농도 1㎍/㎖ CCL21 (R&D Systems 사 제조) 를 함유하는 반응 배지 600μL 를 첨가하고, 상층에 조정한 세포 현탁액 100μL 를 첨가하였다. 37℃ 에서 2시간 배양 후의 하층으로 이동한 세포 수 및 상층에 남아 있는 세포 수를 측정하였다. 주화된 세포의 비율은 이하의 식 (1) :
주화된 세포의 비율 (%) = (하층으로 이동한 세포 수÷(상층에 남아 있는 세포 수＋하층으로 이동한 세포 수))×100
에 의해 산출하였다. 이 결과를 표 14 에 나타낸다.
주화된 세포의 비율 (%)
대조 (CH-296 비고정화) 43.2
CH-296 58.8
표 14 에 나타내는 바와 같이 대조군 및 CH-296 군 중 어느 것에 있어서도 CCL21 에 반응하여 주화성을 나타낸 세포가 확인되었지만, 그 비율은 CH-296 군이 높았다. 즉, T 세포 집단의 확대 배양시에 CH-296 을 사용함으로써, 림프절에 대한 이행능을 갖는 세포가 많이 얻어지는 것이 분명해졌다.
실시예 5 CH-296 을 사용하여 확대 배양한 세포 집단으로부터의 항MART-1 CTL 의 유도
(1) 항인간 CD3 항체 및 CH-296 프래그먼트 고정화
실시예 4-(1) 과 동일한 방법으로 실시하였다.
(2) T 세포 집단의 확대 배양
실시예 4-(2) 와 동일한 방법으로 실시하였다. 확대 배양률의 결과를 표 15 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00012
표 15 에 나타내는 바와 같이 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 군 (이하, CH-296 군) 에 있어서는, 대조군과 비교하여 확대 배양률이 높았다.
(3) CD45RA+CCR7+, CD45RA+CD62L+ T 세포의 해석
실시예 5-(2) 에서 조제한 세포를 실시예 1-(4) 와 동일한 방법에 의해 각 항체로 염색하여 해석을 실시하였다. 단, 항체의 조합은 이하와 같이 실시하였다. 즉, FITC 표지 마우스 IgG1/RD1 표지 마우스 IgG1 (모두 Dako 사 제조), RD1 표지 마우스 항인간 CD45RA 항체/FITC 표지 마우스 항인간 CCR7 항체 RD1 표지 마우스 항인간 CD45RA 항체/FITC 표지 마우스 항인간 CD62L 항체 (이 이후, 항인간 CD62L 항체는 eBioscience 사 제조) 에 의해 염색을 실시하였다. 이들을 플로우 사이토미터에 의해 해석하고, CD45RA+CCR7+, CD45RA+CD62L+ T 세포의 비율을 산출하였다. 결과를 표 16 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00013
표 16 에 나타내는 바와 같이, CH-296 군에 있어서는 대조군과 비교하여, 어느 세포 표면 마커에 있어서도 높은 값을 나타내었다.
(4) 배양 세포의 보존
실시예 5-(2) 에서 조제한 배양 14일째의 세포는 90% FBS/10% DMSO 또는 8% HSA 를 함유하는 CP-1 과 RPMI1640 배지의 등량 혼합액으로 이루어지는 보존액에 현탁하고, 액체 질소 중에서 보존하였다. CTL 유도시에는 이들의 보존 배양 세포를 37℃ 수욕 중에서 급속 융해하고, 10㎍/㎖ DNase 를 함유하는 RPMI1640 배지로 세정 후, 트리판블루 염색법으로 생세포 수를 산출하여 각 실험에 제공하였다.
(5) 항종양 관련 항원 (MART-1) 특이적 CTL 의 유도
실시예 5-(4) 에서 조제한 세포를 사용하여 항종양 관련 항원 (Melanoma antigen recognized by Tcells, MART-1) 특이적 CTL 의 유도를 실시하였다. 항종양 관련 항원 (MART-1) 특이적 CTL 의 유도는 프레반스키 M.들의 방법〔Plebanski M. et al., Eur.J.Immunol., 제25권, 제6호, 1783∼1787페이지 (1995)〕를 일부 개변하여 실시하였다. 즉, 항원 제시 세포로서 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 사용하고, 항원 펩티드로서 40㎍/㎖ 의 멜라노마 항원 MART-1 유래 에피토프 펩티드 (서열목록의 배열 번호 22 에 기재된 멜라노마 항원 MART-1 유래 HLA-A2.1 결합성 펩티드) 및 3㎍/㎖ 의 β2 마이크로 글로블린 (Scrips 사 제조) 을 함유하는 5% Human AB형 혈청, 0.1mM NEAA mixture, 1mM Sodium pyruvate, 2mM L-글루타민 (모두 Cambrex 사 제조), 100㎍/㎖ 황산 스트렙토마이신 (메이지 제과사 제조) 을 함유하는 RPMI1640 배지 (이하 5HRPMI 로 약칭한다) 중에서, 37℃ 에서 2시간 5% CO2 인큐베이터 내에서 인큐베이트하였다. 인큐베이트 종료 후, X 선 조사 (1.42C/kg) 하고, 5HRPMI 로 3∼4×106cells/㎖ 가 되도록 조제하였다.
한편, 실시예 5-(4) 에서 조제한 배양 세포를 2×106cells/㎖ 가 되도록 5HRPMI 에 현탁하고, 24 웰 세포 배양 플레이트 (벡톤·디킨슨사 제조) 에 0.5㎖/웰씩 첨가하였다. 각 웰에 상기 방법에 의해 조제한 항원 제시 세포를 0.5㎖/웰씩 첨가하고, IL-7 (R&D Systems 사 제조) 및 KLH (카르비오켐사 제조) 를 각각 최종 농도 25ng/㎖, 5㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 플레이트를 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃ 에서 배양하였다. 배양 개시 후 1일째에 60U/㎖ 의 IL-2 를 함유하는 5HRPMI 1㎖ 를 각 웰에 첨가하였다. 배양 개시 후 4일째에는 배양 상청을 절반 제거 후, 60U/㎖ 의 IL-2 를 함유하는 5HRPMI 1㎖ 를 각 웰에 첨가하였다. 또, 7일째에 상기와 동일하게 하여 항원 제시 세포를 조제한 후, X 선 조사 (1.42C/kg) 하여, 4×106cells/㎖ 가 되도록 조제하고, 새로운 24 웰 세포 배양 플레이트에 0.5㎖/웰씩 첨가하였다.
1 주일 배양한 리스폰더 세포 (일부의 세포는 세포 상해 활성 측정용으로 그대로 배양 계속) 를 1.8∼2.0×106cells/㎖ 가 되도록 5HRPMI 에 현탁, 동일한 플레이트에 0.5㎖/웰씩 첨가하고, 추가로 최종 농도 25ng/㎖ 의 IL-7 을 첨가하여 재자극하였다. 배양 개시 8일째에, 60U/㎖ 의 IL-2 를 함유하는 5HRPMI 1㎖ 를 각 웰에 첨가하였다. 배양 개시 11일째에는 각 웰 내의 세포를 현탁 후, 반량씩 2 웰로 나누어 60U/㎖ 의 IL-2 를 함유하는 5HRPMI 1㎖ 를 각 웰에 첨가하고, 15일째까지 배양을 계속하였다.
(6) 확대 배양률의 측정
실시예 5-(5) 에서 얻어진 세포에 대해 배양 개시 후 7일째, 14일째에 트리판블루 염색법으로 생세포 수를 계측하고, 배양 개시시의 세포 수와 비교하여 확대 배양률을 산출하였다. 결과를 표 17 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00014
표 17 에 나타내는 바와 같이, CH-296 군으로부터 유도한 CTL 집단에 있어서는, 대조군과 비교하여 CTL 집단의 확대 배양률이 높았다. 즉, T 세포 집단 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 배양 세포로부터 CTL 유도를 실시함으로써 보다 많은 CTL 집단이 얻어지는 것이 분명해졌다.
(7) 세포 상해 활성의 측정
실시예 5-(5) 에서 조제한 유도 개시 후 15일째의 CTL 의 세포 상해 활성은, Calcein-AM 을 사용한 세포 상해 활성 측정법〔리히텐펠즈 R.들 (Lichtenfels R.et al.), J.Immunol.Methods, 제172권, 제2호, 227∼239페이지 (1994)〕으로 평가하였다. 즉, 하룻밤 에피토프 펩티드와 공배양 혹은 에피토프 펩티드 비존재하에서 배양한 HLA-A2.1 유지 세포주 T2 세포 (ATCC CRL-1992) 를 1×106cells/㎖ 가 되도록 5% FBS 를 함유하는 RPMI1640 배지에 현탁 후, 최종 농도 25μM 가 되도록 Calcein-AM (도진 화학 연구소사 제조) 를 첨가하여, 37℃ 에서 1시간 배양하였다. 세포를 Calcein-AM 을 함유하지 않는 배지로 세정 후, Calecein 표지 표적 세포로 하였다. Calcein 표지 표적 세포는 30 배량의 K562 세포 (휴먼 사이언스 연구 자원 뱅크 JCRB0019) 와 혼합하여, 세포 상해 활성 측정용 세포로 하였다. 또한, K562 세포는 리스폰더 세포 중에 혼입되는 NK 세포에 의한 비특이적 상해 활성을 배제하기 위해서 사용하였다.
실시예 5-(5) 에서 조제한 CTL 를 이펙터 세포로서 3×105∼3×106cells/㎖ 가 되도록 5HRPMI 로 단계 희석 후, 96 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 100μL/웰씩 분주해 두고, 이들에 Calcein 표지 표적 세포가 1×105/㎖ 가 되도록 조제한 세포 상해 활성 측정용 세포를 100μL/웰씩 첨가하였다. 이 때, Calcein 표지 표적 세포 (T) 에 대한 이펙터 세포 (E) 의 비를 E/T 비로서 나타내고, E/T 비 30, 10, 3 에 대해 측정을 실시하였다. 상기 세포 현탁액이 들어간 플레이트를 400×g 로 1 분간 원심 후, 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃ 에서 4시간 인큐베이트하였다. 그 후, 각 웰로부터 배양 상청 100μL 를 채취하고, 형광 플레이트 리더 (베르톨드사 제조) (여기 485nm/측정 538 또는 535nm) 에 의해 배양 상청 중에 방출된 Calcein 량을 측정하였다. 「특이적 세포 상해 활성 (%)」는 이하의 식 (2):
특이적 세포 상해 활성 (%)=
{(각 웰의 측정치-최소 방출량)/(최대 방출량-최소 방출량)} ×100
에 따라 산출하였다. 상기 식에 있어서 최소 방출량은 세포 상해 활성 측정용 세포만 함유하는 웰의 Calcein 방출량이며, Calcein 표지 표적 세포로부터의 Calcein 자연 방출량을 나타낸다. 또, 최대 방출량은 세포 상해 활성 측정용 세포에 0.1% 계면 활성제 TritonX-100 (나카라이테스크사 제조) 을 첨가하여 세포를 완전 파괴했을 때의 Calcein 방출량을 나타내고 있다. 세포 상해 활성 측정의 결과를 표 18 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00015
표 18 에 나타내는 바와 같이, CH-296 군으로부터 유도한 CTL 집단에 있어서는, 대조군과 비교하여 CTL 집단의 특이적 세포 상해 활성이 높았다. 즉, T 세포 집단 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 배양 세포는, 특이적 세포 상해 활성이 보다 높은 CTL 집단에 유도될 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 6 CH-296 의 초기 자극 후 가스 투과성 배양 백을 사용하여 확대 배양한 세포 집단의 Allogeneic MLR 및 항MART-1 CTL 의 유도
(1) 항인간 CD3 항체 및 CH-296 프래그먼트 고정화
이하의 실험에서 사용하는 배양 기재에 항인간 CD3 항체 및 CH-296 을 고정화시켰다. 즉, 75㎠ 세포 배양 플라스크 (벡톤·디킨슨사 제조) 에 항인간 CD3 항체 (최종 농도 5㎍/㎖) 를 함유하는 PBS 를 9㎖ 씩 첨가하였다. 이 때, CH-296 첨가군에는 CH-296 을 최종 농도 (25㎍/㎖) 가 되도록 첨가하였다.
이들의 배양 기재를 실온에서 5시간 인큐베이트 후, 사용시까지 4℃ 에 보존하였다. 사용 직전에는 이들의 배양 기재로부터 항체·CH-296 을 함유하는 PBS 를 흡인 제거 후, 각 플라스크를 PBS 로 2 회, RPMI 배지로 1 회 세정하여 각 실험에 제공하였다.
(2) T 세포 집단의 확대 배양
0.5% GT-T503 에 0.5×106cells/㎖ 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 현탁하여 세포액을 조제 후, 실시예 6-(1) 에서 조제한 항인간 CD3 항체 고정화 플라스크, 또는 항인간 CD3 항체 및 CH-296 고정화 플라스크에 0.5% GT-T503 을 21㎖/플라스크 첨가해 두고, 상기 세포액을 9㎖/플라스크씩 첨가하였다. 최종 농도 1000U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가하고, 이들 플라스크를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째). 배양 개시 4일째에, 각 군의 배양액 중 14㎖ 및 0.5% GT-T503 186㎖ 를 아무것도 고정화시키지 않은 가스 투과성 배양 백 (200㎠, 다카라 바이오사 제조, 상품 코드 KB610) 에 새로 옮겼다. 추가로 최종 농도 500U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양을 계속하여, 8일째에는 각 군의 배양액 100㎖ 를 제거, 100㎖ 를 백 내에 남기고, 0.5% GT-T503 을 사용하여 2 배 희석하여, 백 내의 세포 희석액을 200㎖ 로 하였다. 모두 최종 농도 500U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 후 11일째에는, 0.2% HSA 를 함유하는 GT-T503 배지를 200㎖ 첨가하고, 각 군의 세포 배양액을 2 배 희석하였다. 추가로 각 군에 있어서 최종 농도 500U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 후 14일째에 트리판블루 염색법으로 생세포 수를 계측하고, 배양 개시시의 세포 수와 비교하여 확대 배양률을 산출하였다. 이 결과를 표 19 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00016
표 19 에 나타내는 바와 같이, 가스 투과성 배양 백을 사용한 배양시에도, T 세포 집단 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 군(이하, CH-296 군) 에 있어서는, 대조군과 비교하여 T 세포 집단의 확대 배양률이 높았다.
(3) 가스 투과성 배양 백에서 배양한 T 세포 집단에 있어서의 CD45RA+CCR7+, CD45RA+CD62L+, CD45RA+CD27+, CD45RA+CD28+, CD27+CD28+, CD45RA+CCR7+CD62L+ T 세포의 해석
실시예 6-(2) 에서 조제한 세포를 실시예 1-(4) 와 동일한 방법에 의해 각 항체로 염색하여 해석을 실시하였다. 단, 항체의 조합은 이하와 같이 실시하였다. 즉, FITC 표지 마우스 IgG1/RD1 표지 마우스 IgG1/PC5 표지 마우스 IgG1, RD1 표지 마우스 항인간 CD45RA 항체/FITC 표지 마우스 항인간 CCR7 항체, RD1 표지 마우스 항인간 CD45RA 항체/PC5 표지 마우스 항인간 CD62L 항체 (베크만 쿨터사 제조), RD1 표지 마우스 항인간 CD45RA 항체/FITC 표지 마우스 항인간 CD28 항체 (eBioscience 사 제조), RD1 표지 마우스 항인간 CD45RA 항체/PC5 표지 마우스 항인간 CD27 항체 (베크만 쿨터사 제조) 및 RD1 표지 마우스 항인간 CD45RA 항체/FITC 표지 마우스 항인간 CCR7 항체/PC5 표지 마우스 항인간 CD62L 항체에 의해 염색을 실시하였다. 이들을 플로우 사이토미터에 의해 해석하고, CD45RA+CCR7+, CD45RA+CD62L+, CD45RA+CD27+, CD45RA+CD28+, CD27+CD28+, CD45RA+CCR7+CD62L+ T 세포의 비율을 산출하였다. 결과를 표 20 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00017
표 20 에 나타내는 바와 같이, CH-296 군에 있어서는 대조군과 비교하여, 어느 세포 표면 마커에 있어서도 높은 값을 나타내었다. CD27 이나 CD28 은 나이브 T 세포 등의 미분화 세포에 있어서 발현율이 높은 것이 알려져 있고, 이들 마커로 해석해도, 배양 초기에 CH-296 을 작용시킴으로써 배양 중의 T 세포 집단에 있어서의 나이브 T 모양 세포 집단 비율을 높이는 것이 분명해졌다.
(4) Allogeneic MLR
실시예 6-(2) 에서 조제한 세포를 사용하여, Allogeneic MLR 을 실시하였다. 즉, 실시예 1-(1) 과 동일한 방법으로 조제한 Allogeneic donor (비자기 도너 : 실시예 6-(2) 에서 사용한 도너와는 상이한 도너) 유래의 PBMC 를 X 선 조사 (0.88C/kg) 하여, 5HRPMI 로 2×106cells/㎖ 가 되도록 조제하였다 (Stimulator cell). 한편, 실시예 6-(2) 에서 조제한 배양 세포를 2×106cells/㎖ 가 되도록 5HRPMI 에 현탁하였다 (Responder cell). 24 웰 세포 배양 플레이트에 조제한 Stimulator cell 및 Responder cell 을 각 0.5㎖/웰씩 첨가하였다. 각 웰에 최종 농도 500U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가 후, 플레이트를 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃ 에서 배양하였다. 배양 개시 후 3일째에 1000U/㎖ 의 IL-2 를 함유하는 5HRPMI 1㎖ 를 각 웰에 첨가하였다. 배양 개시 후 5일째에는 배양 상청을 절반 제거 후, 1000U/㎖ 의 IL-2 를 함유하는 5HRPMI 1㎖ 를 각 웰에 첨가하였다. 7일째에는 각 웰 내의 세포를 현탁 후, 반량씩 2 웰로 나누어 1000U/㎖ 의 IL-2 를 함유하는 5HRPMI 1㎖ 를 각 웰에 첨가하여, 10일째까지 배양을 계속하였다.
(5) 확대 배양률의 측정
실시예 6-(4) 에서 얻어진 세포에 대해 배양 개시 후 7일째, 10일째에 트리판블루 염색법으로 생세포 수를 계측하고, 배양 개시시의 세포 수와 비교하여 확대 배양률을 산출하였다. 결과를 표 21 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00018
표 21 에 나타내는 바와 같이, CH-296 군을 사용하여 Allogeneic MLR 을 실시한 경우에는, 대조군과 비교하여 반응 후의 확대 배양률이 높았다. 즉, T 세포 집단 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 배양 세포를 사용하여 Allogeneic MLR 을 실시하면, 보다 많은 알로 항원 인식 세포가 증식하는 것이 분명해졌다.
(6) 세포 상해 활성의 측정
실시예 6-(4) 에서 조제한 유도 개시 후 10일째의 세포의 세포 상해 활성은, 실시예 5-(7) 과 동일한 방법으로 실시하였다. 단, 이 때의 표적 세포로서 Phytohemagglutinin (이하 PHA 로 약칭한다) 으로 10일간 유약화 (幼若化 ; 블라스트) 시킨 자기 PBMC 또는 비자기 PBMC 를 카르세인 표지 표적 세포로 하였다. 세포 상해 활성 측정시에는 30 배량의 K562 세포와 카르세인 표지 표적 세포를 혼합하였다. 세포 상해 활성 측정의 결과를 표 22 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00019
표 22 에 나타내는 바와 같이, CH-296 군으로부터 Allogeneic MLR 을 실시한 경우에는, 대조군과 비교하여 반응 후의 알로 항원 특이적 세포 상해 활성이 높았다. 즉, T 세포 집단 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 배양 세포에 있어서는, Allogeneic MLR 에 의해 알로 항원 특이적 세포 상해 활성이 보다 강한 세포 집단이 얻어지는 것이 분명해졌다.
(7) 배양 세포의 보존
실시예 6-(2) 에서 조제한 배양 14일째의 세포는 실시예 5-(4) 와 동일한 방법으로 동결 보존·융해하여, 각 실험에 제공하였다.
(8) 항종양 관련 항원 (MART-1) 특이적 CTL 의 유도
실시예 1-(1) 및 6-(7) 에서 조제한 세포를 사용하여, 실시예 5-(5) 와 동일한 방법으로 항종양 관련 항원 (MART-1) 특이적 CTL 의 유도를 실시하고, 13일간 배양 계속하였다. 단, 이하의 점에 대해 변경을 실시하였다. 실시예 6-(7) 에서 조제한 배양 세포를 1×106cells/㎖ 가 되도록 5HRPMI 에 현탁한 점, 배양 개시 2일째에 60U/㎖ 의 IL-2 를 함유하는 5HRPMI 1㎖ 를 각 웰에 첨가한 점, 배양 개시 6일째에 리스폰더 세포를 0.3∼1.3×106cells/㎖ 가 되도록, 항원 제시 세포를 1.6×106cells/㎖ 가 되도록 5HRPMI 에 현탁한 점 및, 배양 개시 7일째에, 60U/㎖ 의 IL-2 를 함유하는 5HRPMI 1㎖ 를 각 웰에 첨가하고, 배양 개시일 10일째에는 각 웰 내의 세포를 현탁 후, 반량씩 2 웰로 나누어, 60U/㎖ 의 IL-2 를 함유하는 5HRPMI 1㎖ 를 각 웰에 첨가한 점.
(9) 세포 상해 활성의 측정
실시예 6-(8) 에서 조제한 유도 개시 후 13일째의 CTL 의 세포 상해 활성의 측정은, E/T 비 90 을 새롭게 설정한 것 이외에는, 실시예 5-(7) 과 동일한 방법으로 실시하였다. 세포 상해 활성 측정의 결과를 표 23 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00020
표 23 에 나타내는 바와 같이, CH-296 군으로부터 유도한 CTL 집단에 있어서는, 대조군 및 PBMC 군과 비교하여 CTL 집단의 특이적 세포 상해 활성이 높았다. 즉, T 세포 집단 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 배양 세포는, 특이적 세포 상해 활성이 보다 높은 CTL 집단에 유도될 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 7 확대 배양 세포 유래 CD45RA+CCR7+CD8+ T 세포 및 CD45RA-CCR7-CD8+ T 세포로부터의 항MART-1 CTL 유도
(1) CD45RA+CCR7+CD8+ T 세포 및 CD45RA-CCR7-CD8+ T 세포의 단리
실시예 1-(1) 및 실시예 6-(7) 에서 조제한 세포를 실시예 2-(2) 와 동일한 방법에 의해 염색 후, 1% BSA/PBS 로 세포를 세정하고, IMDM 배지 (인비트로젠사 제조) 에 현탁하였다. 이 세포를 고속 셀소터 Moflo 에 제공하고, CD45RA+CCR7+CD8+ 획분 및 CD45RA-CCR7-CD8+ 획분을 각각 단리하여, 순도 92∼99% 의 획분을 얻었다.
(2) 항종양 관련 항원 (MART-1) 특이적 CTL 의 유도
실시예 7-(1) 에서 조제한 세포를 사용하여, 실시예 6-(8) 와 동일한 방법으로 항종양 관련 항원 (MART-1) 특이적 CTL 의 유도를 실시하여, 13일간 배양 계속하였다. 단, 이하의 점에 대해 변경을 실시하였다. 배양 개시시에 배양 개시 세포 및 항원 제시 세포를 0.25㎖ 씩 48 웰 배양 플레이트 (벡톤·디킨슨사 제조) 에 첨가한 점, 배양 개시 후 2일째에 60U/㎖ 의 IL-2 를 함유하는 5HRPMI 0.5㎖ 를 각 웰에 첨가, 배양 개시 후 4일째에는 배양 상청을 절반 제거 후, 60U/㎖ 의 IL-2 를 함유하는 5HRPMI 0.5㎖ 를 각 웰에 첨가한 점.
(3) 확대 배양률의 측정
실시예 7-(2) 에서 얻어진 세포에 대해 배양 개시 후 13일째에 트리판블루 염색법으로 생세포 수를 계측하고, 배양 개시시의 세포 수와 비교하여 확대 배양률을 산출하였다. 결과를 표 24 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00021
표 24 에 나타내는 바와 같이, T 세포 집단 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 배양 세포 (이하 CH-296 군) 로부터 단리한 CD45RA+CCR7+CD8+ T 세포를 사용하여 유도한 CTL 집단에 있어서는, 대조군과 비교하여 CTL 집단의 확대 배양률이 높았다. 즉, T 세포 집단 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 배양 세포에 고비율로 함유되는 CD45RA+CCR7+ T 세포로부터 CTL 유도를 실시함으로써, 보다 많은 CTL 집단이 얻어지는 것이 분명해졌다.
(4) 세포 상해 활성의 측정
실시예 7-(2) 에서 조제한 유도 개시 후 13일째의 CTL 의 세포 상해 활성은, 실시예 5-(7) 과 동일한 방법으로 실시하였다. 세포 상해 활성 측정의 결과를 표 25 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00022
표 25 에 나타내는 바와 같이, CH-296 군으로부터 단리된 CD45RA+CCR7+CD8+ T 세포를 사용하여 유도한 CTL 집단에 있어서는, 대조군 및 PBMC군과 비교하여 CTL 집단의 특이적 세포 상해 활성이 높았다. 또한, CD45RA-CCR7-CD8+ T 세포를 사용하여 유도한 CTL 집단과 비교하여도, 특이적 세포 상해 활성이 높았다. 즉, T 세포 집단 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 배양 세포에 고율로 함유되는 CD45RA+CCR7+ T 세포는, 특이적 세포 상해 활성이 보다 높은 CTL 집단에 유도될 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 8 CTL 의 항원 인식능 측정
(1) 항종양 관련 항원 (MART-1) 특이적 CTL 의 유도
실시예 1-(1) 및 6-(7) 에서 조제한 세포를 사용하여, 실시예 6-(8) 와 동일한 방법으로 항종양 관련 항원 (MART-1) 특이적 CTL 의 유도를 실시하고, 14일간 배양 계속하였다.
(2) 항원 인식능의 측정
실시예 8-(1) 에서 조제한 유도 개시 후 14일째의 CTL 의 항원 인식능은, ValmoriD 들의 방법〔Valmori D. et al., J.Immuno1., 제160권, 1750∼1758페이지 (1998)〕를 일부 개변하여 실시하였다. 즉 T2 세포를 1×106cells/㎖ 가 되도록 5% FBS 를 함유하는 RPMI1640 배지에 현탁 후, 최종 농도 25μM 가 되도록 Calcein-AM 를 첨가하여, 37℃ 에서 1시간 배양하였다. 인큐베이트 후의 세포를 Calcein-AM 를 함유하지 않는 배지로 세정 후, 2×105cells/㎖ 로 조제하였다. Calcein 표지 표적 세포를 96 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 50μL/웰씩 분주하였다. 이들 세포가 들어간 웰에 0∼20μM 의 항원 펩티드 (멜라노마 항원 MART-1 유래 에피토프 펩티드) 를 함유하는 5HRPMI 를 50μL/웰씩 첨가하였다. 상기 플레이트를 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃ 에서 1시간 인큐베이트하였다. 인큐베이트 후의 각 웰에 30 배량의 K562 세포를 함유하는 세포 현탁액 (6×106cells/㎖ 로 조정) 을 50μL/웰씩 첨가하였다.
실시예 8-(1) 에서 조제한 CTL 을 이펙터 세포로서 6×106cells/㎖ 가 되도록 5HRPMI 로 조정 후, 플레이트의 각 웰에 50μL/웰씩 첨가하였다. 상기 세포 현탁액이 들어간 플레이트를 400×g 으로 1 분간 원심 후, 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃ 에서 4시간 인큐베이트하였다. 그 후, 각 웰로부터 배양 상청 100μL 를 채취하고, 형광 플레이트 리더 (485nm/535nm) 에 의해 배양 상청 중에 방출된 Calcein 량을 측정하였다. 「특이적 세포 상해 활성 (%)」는 전술한 식 (2) 에 따라 산출하였다. 항원 인식능 측정의 결과를 표 26 에 나타낸다. 항원 인식능은 표적 세포에 부가된 펩티드 농도가 10μM 일 때의 세포 상해 활성을 100 으로 했을 경우의, 각 부가 펩티드 농도에 있어서의 세포 상해 활성의 상대치로서 표기하였다.
Figure 112008030960796-PCT00023
표 26 에 나타내는 바와 같이, CH-296 군으로부터 유도한 CTL 집단에 있어서는, 대조군 및 PBMC 군과 비교하여 보다 저농도인 항원 펩티드가 부가된 표적 세포까지도 살상되었고, CTL 집단의 특이적 항원 인식 능력이 높았다. 즉, T 세포 집단 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 배양 세포는, 보다 특이적 항원 인식 능력이 높은 CTL 집단에 유도될 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 9 CH-296 을 사용한 T 세포 집단 확대 배양의 세포 집단의 생존성 시험
(1) T 세포 집단의 확대 배양
항인간 CD3 항체 및 CH-296 프래그먼트의 고정화에 아세트산 완충액 (pH 5.3) 을 사용한 것, 배양 개시 4일째에 약 14 배가 되도록 희석하고, 희석액 6.3㎖ 를 25㎠ 배양 플라스크를 세운 것에, 배양 개시 8일째에는 약 2 배가 되도록 희석하고, 희석액 6.3㎖ 를 25㎠ 배양 플라스크를 세운 것에 옮긴 것 이외에는, 실시예 3-(1) 에 준하여 실시하였다. 결과를 표 27 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00024
표 27 에 나타내는 바와 같이, T 세포 집단 확대 배양 초기에 CH-296 프래그먼트를 고정화시킨 배양 기재를 고정화시킨 군 (이하, CH-296 군) 은, 대조군과 비교하여 높은 확대 배양률이 얻어졌다.
(2) CD45RA+CCR7+ T 세포, CD45RA+CD62L+ T 세포의 해석
실시예 9-(1) 에서 조제한 세포를 실시예 1-(4) 와 동일한 방법에 의해 각 항체로 염색하여 해석을 실시하였다. 단, 항체의 조합은 이하와 같이 실시하였다. 즉, FITC 표지 마우스 IgG1/RD1 표지 마우스 IgG1/PC5 표지 마우스 IgG1 및 FITC 표지 마우스 항인간 CCR7 항체/RD1 표지 마우스 항인간 CD45RA 항체/PC5 표지 마우스 항인간 CD62L 항체에 의해 염색을 실시하였다. 이들을 플로우 사이토미터에 의해 해석하고, CD45RA+CCR7+, CD45RA+CD62L+ T 세포의 비율을 산출하였다. 결과를 표 28, 표 29 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00025
Figure 112008030960796-PCT00026
표 28, 표 29 의 결과로부터, CH-296 군에 있어서는, 대조군과 비교하여, CD45RA+CCR7+ T 세포 집단, CD45RA+CD62L+ T 세포 집단이 높은 결과가 얻어졌다.
(3) (1) 의 세포의 Feeder 세포를 사용한 배양
실시예 9-(1) 에서 얻어진 확대 배양 후의 세포를 5HRPMI 를 사용하여 2×106cells/㎖ 가 되도록 조제하고, 24 웰 세포 배양 플레이트에 0.5㎖/웰씩 첨가하였다. 또, 실시예 1-(1) 에서 조제한 자기 PBMC 를 5HRPMI 에 현탁한 후 X 선 조사 (0.90C/kg) 하고, 다시 5HRPMI 를 사용하여 2×106cells/㎖ 에 조제하였다 (Feeder 세포로 한다). 이 Feeder 세포를 상기 서술한 24 웰 세포 배양 플레이트에 0.5㎖/웰씩 첨가하고, 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃ 에서 7일간 배양을 실시하였다. 이 사이에, IL-2 등의 사이토카인은 전혀 첨가하지 않고 배양하였다.
(4) AnnexinV+7AAD+ 세포의 해석
실시예 9-(3) 에서 얻어진 세포를 회수하고, 아포토시스를 발생시킨 세포를 측정하기 위해서, AnnexinV/7AAD 키트 (베크만 쿨터사 제조) 의 프로토콜에 따라 염색하였다. 이 세포를 플로우 사이토메트리에 제공하여, 각각의 세포 집단에 대해, AnnexinV+7AAD+ 세포 즉 아포토시스를 발생시킨 세포의 비율을 산출하였다. 결과를 표 30 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00027
표 30 의 결과로부터, T 세포 집단 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 고정화시킨 군에 있어서는, 대조군과 비교하여, AnnexinV+7AAD+ 세포 집단이 낮고, 아포토시스 세포의 비율이 낮은 것이 나타났다. 즉, T 세포 집단의 확대 배양에 CH-296 프래그먼트를 사용함으로써, 예를 들어, IL-2 가 적은 환경하에서도 생존성이 높은 세포를 우위로 증식할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 10 마우스 동계 종양 모델을 사용한 이입 T 세포 효과의 검토
CH-296 을 사용하여 확대 배양한 T 세포의 종양에 대한 효과를 확인하기 위해서, 마우스 동계 종양 모델을 사용하여 시험을 실시하였다.
(1) 마우스 CH-296 의 조제
서열목록의 배열 번호 23 으로 나타내는 마우스 CH-296 은, 인간 CH-296 의 배열을 근거로 마우스 피브로넥틴 프래그먼트로부터 설계하고, 통상적인 방법에 따라 플라스미드를 구축하고 그 플라스미드를 사용하여 유전자 공학적으로 취득하였다. 즉, 그 플라스미드를 보유하는 대장균 HB101 를 배양, 발현 유도하였다. 그 후, 균체를 파쇄하여 조(粗) 단백질을 조제 후, 양이온 교환 칼럼, 음이온 교환 칼럼, 겔 여과 칼럼에 의해 목적의 단백질을 정제하여 무균 여과 후, -80℃ 에서 사용할 때까지 보존하였다.
(2) 담암 마우스로부터의 비장 림프구의 조제
암컷 CDF1 마우스 (닛폰 SLC사 제조) 의 복강에 IMC carcinoma (이하 IMC 라고 기재) 를 이식하고, 복수를 만들어, 7일마다 다른 마우스에 이식하여 계대하였다. 계대하여 7일째의 복수를 채취하고, PBS 로 세정 후 5×107cells/㎖ 가 되도록 PBS 에 현탁하였다. 이 세포 현탁액 0.1㎖ 를 CDF1 마우스의 우측 복부 피하에 이식하여, 고형 종양을 형성시켰다. 21일 후, 비장을 적출하여 RPMI1640 배지 중에서 슬라이드 글라스를 사용하여 갈아으깼다. RPMI1640 배지를 사용하여 7 마리분 모아서 튜브에 회수하여 45㎖ 로 하여 얼음 상에 5 분간 정치 후, 새로운 튜브에 40μm 셀 스트레이너 (벡톤·디킨슨사 제조) 를 통과하여 옮겼다. 원심 후 상청을 제거하여 용혈 조작으로서 ACK 버퍼 (0.15M NH4Cl, 0.01M KHCO3, 0.01mM Na2EDTA, pH7.4) 2㎖ 에 현탁하고, 추가로 ACK 버퍼 2㎖ 를 첨가하여 현탁 후 RPMI1640 배지를 세포 현탁액이 50㎖ 가 되도록 첨가하였다. 원심 후 상청을 제거하여 RPMI1640 배지 10㎖ 에 현탁하고 새로운 튜브에 셀 스트레이너를 통과하여 옮겼다. RPMI1640 배지를 세포 현탁액이 40㎖ 가 되도록 첨가 후, 원심하여 상청을 제거한 후, RPMI1640 배지와 8% HSA 를 함유하는 CP-1 을 등량 혼합한 것에 현탁하고, 사용할 때까지 액체 질소 중에서 보존하였다.
(3) 항마우스 CD3 항체 및 마우스 CH-296 프래그먼트의 고정화
이하의 실험에서 사용하는 배양 기재에 항마우스 CD3 항체 및 마우스 CH-296 프래그먼트를 고정화시켰다. 즉, 24 웰 세포 배양 플레이트에 항마우스 CD3 항체 (R&D Systems 사 제조) (최종 농도 14㎍/㎖) 를 함유하는 아세트산 완충액 (pH5.3) 을 400μL 씩 첨가하여, 4℃ 에서 종액 인큐베이트하였다. 그 후, 실시예 10-(1) 에서 조제한 마우스 CH-296 을 최종 농도 25㎍/㎖ 가 되도록 첨가하고, 추가로 5시간 실온에서 인큐베이트하였다. 사용 직전에는 배양 기재로부터 항체·마우스 CH-296 을 함유하는 아세트산 버퍼를 흡인 제거 후, 각 웰을 PBS 로 2 회, RPMI1640 배지로 1 회 세정하여 실험에 제공하였다.
(4) 비장 림프구의 나일론 화이버에 의한 정제
실시예 10-(2) 에서 조제한 비장 림프구를 림프구의 순도를 높이기 위해서 나일론 화이버를 사용하여 정제를 실시하였다. 10㎖ 의 실린지 (데루모사 제조) 에 0.6g 의 나일론 화이버 (와코 순약사 제조) 를 충전하고, PBS 로 평형화한 후, 121℃ 에서 20 분 멸균하였다. 이 칼럼을 10% FBS (다이닛폰 제약사 제조) 함유 RPMI1640 배지로 평형화시켜, 5% CO2 인큐베이터에서 37℃ 에서 1시간 인큐베이트하였다. 실시예 10-(2) 에서 조제한 비장 림프구를 2×108cells 를 초과하지 않도록 10% FBS 함유 RPMI1640 배지 2∼3㎖ 에 현탁하고, 칼럼에 어플라이 후, 5% CO2 인큐베이터에서 37℃ 에서 1시간 인큐베이트하였다. 미리 37℃ 로 보온시켜 둔 10% FBS 함유 RPMI1640 배지 15㎖ 를 칼럼에 첨가하여 용출된 세포를 회수하였다.
(5) 마우스 T 세포 집단의 확대 배양
10% FBS, 0.1mM NEAA mixture, 1mM Sodium pyruvate, 50μM 2-mercaptoethanol (나카라이테스크사 제조) 함유 RPMI1640 배지 (이하, mRPMI 배지라고 기재) 에 1.5×106cells/㎖ 가 되도록 실시예 10-(4) 에서 조제한 림프구를 현탁 후, 실시예 10-(3) 에서 조제한 항마우스 CD3 항체 및 마우스 CH-296 고정화 플레이트에 mRPMI 배지를 0.7㎖/웰로 첨가해 두고, 상기 세포액을 0.5㎖/웰씩 첨가하고, 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째). 배양 2일째에 세포를 1×105cells/㎖ 가 되도록 mRPMI 배지를 사용하여 희석하고, 아무것도 고정화하시키지 않은 새로운 75㎠ 세포 배양 플라스크에 전체량을 옮겼다. 이 때, 최종 농도 100U/㎖ 가 되도록 마우스 IL-2 (R&D Systems 사 제조) 를, 또 최종 농도 10ng/㎖ 가 되도록 마우스 IL-7 (R&D Systems 사 제조) 을 첨가하였다. 배양 5일째에는 세포를 1.5×106cells/㎖ 가 되도록 한 것 이외에는 배양 2일째와 동일하게 계대를 실시하였다. 배양 7일째에 세포를 회수하여 이하의 동계 종양 모델에서의 시험에 공여하였다.
(6) CDF1-IMC 의 동계 종양 모델에 있어서의 이입 T 세포 집단의 종양 거절 작용의 평가
6 주령 암컷 CDF1 마우스에 마취하에서 IMC 를 실시예 10-(2) 와 동일하게 우측 복부 피하에 이식하였다. 실시예 10-(5) 에서 조제한 세포는 3×108cells/㎖ 가 되도록 PBS 에 현탁하고, 꼬리 정맥으로부터 0.1㎖ 투여하였다 (투여 0일째). 투여 0일째부터 4일간 연속으로 복강에 마우스 IL-2 (3×104U/0.2㎖) 를 투여하였다. 대조로서 확대 배양한 세포를 투여하지 않은 군을 설정하였다. 종양의 크기는 IMC 이식 후 21일까지, 정기적으로 긴 직경과 짧은 직경을 측정하여 종양 면적 (㎠) 으로서 나타내었다. 결과를 도 2 에 나타낸다. 도 2 는 IMC 를 이식한 후의 일수와 종양의 크기를 나타낸 것이고, 검은 삼각은 대조군을, 검은 동그라미는 T 세포 투여군을 나타낸다. 도 2 에 나타내는 바와 같이 CH-296 존재하 배양한 세포를 투여한 군 (T 세포 투여군) 에서 유의하게 종양의 형성이 억제되는 것이 확인되었다.
실시예 11 CH-296 을 사용하여 확대 배양한 인간 T 세포 집단의 NOD/scid 마우스에 있어서의 GVHD 유도에 의한 평가
(1) T 세포 집단의 확대 배양
대량으로 세포를 조제하기 위해서, 배양 기재를 변경하였다. 즉, 175㎠ 배양 플라스크 (벡톤·디킨슨사 제조) 에 항인간 CD3 항체 (최종 농도 5㎍/㎖) 를 함유하는 PBS 를 21㎖ 첨가하였다. 이 때, CH-296 첨가군에는 CH-296 을 최종 농도 25㎍/㎖ 가 되도록 첨가하고, 실온에서 5시간 인큐베이트하였다. 사용 직전에 이들의 배양 기재로부터 항체·CH-296 을 함유하는 PBS 를 흡인 제거 후, 각 플라스크를 PBS 로 2 회, RPMI 배지로 1 회 세정하였다. 신선 PBMC 는, 인간 정상인 도너로부터 54㎖ 채혈로 조제하였다. 0.5% 자기 혈장 및 0.2% HSA 를 함유하는 GT-T503 배지 (이하, 0.5% 자기 혈장 GT-T503 라고 기재) 에 0.5×106cells/㎖ 가 되도록 PBMC 를 현탁하고, 조제한 항CD3 항체 고정화 플라스크, 또는 항CD3 항체 및 CH-296 고정화 플라스크에 21㎖ 씩 첨가하여, IL-2 를 최종 농도 1000U/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 이들 플라스크를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양을 개시하였다 (배양 0일째). 다음날, 0.5% 자기 혈장 GT-T503 을 49㎖ 씩 플라스크에 첨가하고, 첨가한 배지량에 대해 최종 농도 1000U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 4일째에, 각 군의 배양액 중 42㎖ 와 0.5% 자기 혈장 GT-T503 158㎖ 를 아무것도 고정화되어 있지 않은 가스 투과성 배양 백 (600㎠, 다카라 바이오사 제조, 상품 코드 KB610) 에 새로 옮겼다. 추가로 최종 농도 500U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가하여 배양을 계속하였다. 배양 개시 6일째에는, 0.5% 자기 혈장 GT-T503 을 400㎖ 와 IL-2 를 최종 농도 500U/㎖ 가 되도록 첨가하였다.(600㎖ 배양). 2일 후, 600㎖ 배양 중 반량의 배양액을 빼내, 동일한 양의 0.5% 자기 혈장 GT-T503 과 IL-2 (최종 농도 500U/㎖) 를 첨가하였다 (배양 8일째). 배양 개시 11일째에는, 0.2% HSA 를 함유하는 GT-T503 배지를 600㎖, 및 IL-2 를 최종 농도 500U/㎖ 가 되도록 첨가하여 14일째까지 배양을 계속하였다. 배양 후의 세포는 8% HSA 를 함유하는 CP-1 과 RPMI1640 배지의 등량 혼합액으로 이루어지는 보존액에 현탁하여, 사용시까지 액체 질소 중에 보존하였다.
(2) 군 나누기
세포 투여 전날에, NOD/scid 마우스 (닛폰 쿠레아사 제조) 8 주령, 암컷 10 마리의 체중을 측정하여 4 군으로 군을 나누었다. 본 실시예에 있어서의 군 구성은 이하와 같이 하였다.
A 군 : 용매＋피더＋인간 IL-2＋항아시알로 GM1 항체
B 군 : PBL＋피더＋인간 IL-2＋항아시알로 GM1 항체
C 군 : 확대 배양 후의 세포 (CH-296 비고정화)＋피더＋인간 IL-2＋항아시아로 GM1
D 군 : 확대 배양 후의 세포 (CH-296 고정화)＋피더＋인간 IL-2＋항아시아로
GM1
A 군 및 B 군은 n=2, C 군 및 D 군은 n=3 으로 하였다.
(3) 항아시아로 GM1 항체의 투여
항아시아로 GM1 항체 처리는 NOD/scid 마우스에 있어서 NK 세포를 제거하여 인간 세포의 생착을 높이는 것이 알려져 있다. 확대 배양한 세포의 투여 전날에, 항아시아로 GM1 항체 (와코 순약사 제조) 20μL 를 0.4% HSA 를 함유하는 생리 식염수 (이하, 0.4% HSA 가생 식수라고 약칭한다) 에 희석하여, 0.4㎖ 복강 내에 투여하였다.
(4) 투여 세포의 조제와 투여
실시예 11-(1) 에서 동결 보존한 확대 배양 세포 및 실시예 1-(1) 과 동일한 방법으로 조제한 동일한 도너의 동결 보존 PBMC 를 37℃ 수욕 중에서 급속 융해하였다. 말초혈 림프구 (이하, PBL 라고 기재) 농도는, PBMC 중의 CD3 양성 세포율을 70% 로서 산출하였다. 용매는 4% HSA 가생 식수를 사용하고, PBL 의 일부를 피더로서 0.5×107cells/마우스를, 또 PBL 및 확대 배양 후의 세포는 1.0×108cells/마우스를 각각 필요 세포 수가 되도록 용매에 현탁하여 투여용의 세포로 하였다. 세포 투여 전에 모든 마우스를 X 선 조사 (0.090C/kg) 하고, 준비한 세포를 A 군에서부터 차례로 0.3㎖ 복강 내에 투여하였다.
(5) 인간 IL-2 의 투여
T 세포 확대 배양시에 사용한 인간 IL-2 를, 2×104U/마우스가 되도록 0.4% HSA 가생 식수로 조제하고, 실시예 11-(4) 에서 세포의 투여가 끝난 마우스로부터 복강 내에 0.2㎖ 투여하였다. 인간 IL-2 는, 세포 투여일부터 1일 1 회로 연속 4 회 투여하였다.
(6) 세포 투여 후의 마우스 체중의 추이
체중의 측정은 투여일부터 21일째까지 적당한 간격으로 실시하였다. 그 결과, PBL 를 투여한 B 군에서는, 8일째부터 체중 감소가 보이고, 13일째에 1 마리 사망하였다. 그 밖의 군에서는 21일째까지 사망하지 않고 모두 생존하였다. 체중 감소율을 보면, A 군 및 C 군에서는 도중에 변동되었지만 21일째에는 처음 체중을 유지, D 군에서 약간 감소 경향이 보였다. 체중 감소를 지표로 하는 Xeno-GVHD 반응에 있어서, PBL 에서 우위로 반응이 확인되고, CH-296 고정화 조건에서의 확대 배양 세포가 비고정화 조건의 그것보다 유효하다고 나타났다.
(7) 비장 중 인간 T 세포의 생착
B 군 이외의 군은 세포 투여 개시 21일째의 부검시에 비장을 적출하고, 비장 중 인간 CD3 양성 세포의 비율을 플로우 사이트 메리트로 해석하였다. B 군은 13일째에 1 마리가 사망했으므로, 이 마우스는 사망 직후의 비장을 적출하고, 나머지 1 마리도 13일째에 부검하여 비장을 적출하였다. 적출된 비장은, 슬라이드 글래스로 갈아서 으깬 후, 나일론 메시 여과하여 원심 조작을 실시하였다. 상청을 제거하고 ACK 버퍼로 용혈 후, RPMI1640 배지로 세정하여 세포를 조제하였다. 염색은 FITC 표지 마우스 항인간 CD3 항체 (Dako 사 제조) 를 사용하였다. 그 결과, 13일째에 해석한 B 군에서 비장 세포 중에 차지하는 CD3 양성률은 약 70%, 또 21일째에 해석한 D 군에서 약 59% 를 나타내었다. A 군에서는 1% 미만, 또 C 군에서도 수% 의 양성률이었다. 이런 점에서, CH-296 고정화 조건에서의 확대 배양 세포는, 비고정화 조건과 비교하여 비장에서의 생착률이 높아 21일간 유지되는 것을 알 수 있었다.
실시예 12 IL-2, IL-12, IFN-γ, 항IL-4 항체를 첨가한 림프구의 확대 배양
(1) 항인간 CD3 항체 및 CH-296 프래그먼트 고정화
실시예 1-(2) 와 동일하게 실시하였다. 단, 항인간 CD3 항체와 CH-296 프래그먼트의 고정화에 ACD-A 액 (pH 5.0) 을 사용하고, 12 웰 세포 배양 플레이트에 대한 ACD-A 액 첨가량을 0.45㎖ 로 변경하였다.
(2) GT-T503 배지를 사용한 T 세포 집단의 확대 배양
0.5% GT-T503 에 0.25×106cells/㎖ 가 되도록 실시예 1-(1) 에서 조제한 PBMC 를 현탁 후, 실시예 12-(1) 에서 조제한 항인간 CD3 항체 고정화 플레이트, 또는 항인간 CD3 항체 및 CH-296 고정화 플레이트에 0.5% GT-T503 을 0.5㎖/웰로 첨가해 두고, 세포액을 1㎖/웰씩 첨가하여, 이들 플레이트를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째). 배양 개시 4일째에, 각 군의 배양액을 0.5% GT-T503 을 사용하여 약 14 배가 되도록 희석하고, 희석액 6.3㎖ 를 아무것도 고정화시키지 않은 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것에 옮겼다. 배양을 계속하여, 7일째에는 각 군의 배양액을 0.5% GT-T503 을 사용하여 약 2 배 희석하고, 희석액 6.3㎖ 를 아무것도 고정화시키지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것에 옮겼다. 배양 개시 후 11일째에는, 0.2% HSA 를 함유하는 GT-T503 배지를 사용하고, 각 군의 세포 배양액을 약 2 배 희석하여, 아무것도 고정화시키지 않은 새로운 25㎠ 세포 배양 플라스크를 세운 것에 희석액 12.6㎖ 를 각각 옮겼다. 또한, IL-2 는 배양 0일째부터 최종 농도 100U/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 또, IL-2 이외의 것에 대해서는, 배양 4일째에 IL-12 (R&D Systems 사 제조) 50U/㎖, IFN-γ (R&D Systems 사 제조) 20ng/㎖, 항인간 IL-4 항체 (벡톤·디킨슨사 제조) 2㎍/㎖ 의 최종 농도가 되도록 첨가하고, 배양 7일째와 11일째에는 새롭게 첨가하는 배지에 대해 상기 서술한 최종 농도가 되도록 각 사이토카인·항체를 첨가하였다. 배양 개시 후 14일째에 트리판블루 염색법으로 생세포 수를 계측하고, 배양 개시시의 세포 수와 비교하여 확대 배양률을 산출하였다. 결과를 표 31 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00028
표 31 에 나타내는 바와 같이, T 세포 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 군에 있어서, 대조군과 비교하여 T 세포 집단의 확대 배양률이 높았다.
(3) CD45RA+CCR7+ T 세포, CD45RA+CD62L+ T 세포의 해석
실시예 12-(2) 에서 조제한 세포를 실시예 1-(4) 와 동일한 방법에 의해 각 항체로 염색하여, 해석을 실시하였다. 단, 항체의 조합은 이하와 같이 실시하였다. 즉, 네거티브 컨트롤로서 FITC 표지 마우스 IgG1/RD1 표지 마우스 IgG1/PC5 표지 마우스 IgG1+ECD 표지 마우스 IgG1, RD1 표지 마우스 항인간 CD45RA 항체/FITC 표지 마우스 항인간 CCR7 항체/ECD 표지 마우스 항인간 CD4 항체/PC5 표지 마우스 항인간 CD8 항체 혹은 RD1 표지 마우스 항인간 CD45RA 항체/FITC 표지 마우스 항인간 CD62L 항체/ECD 표지 마우스 항인간 CD4 항체/PC5 표지 마우스 항인간 CD8 항체에 의해 염색을 실시하였다. 이 세포를 플로우 사이토메트리에 제공하고, T 세포 영역 전체, CD8+ T 세포 영역 혹은 CD4+ T 세포 영역 중의 CD45RA+CCR7+ T 세포, CD45RA+CD62L+ T 세포의 비율을 산출하였다. 결과를 표 32 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00029
표 32 에 나타내는 바와 같이, CH-296 프래그먼트를 고정화시킨 배양 용기를 사용한 군에 있어서는, 대조군과 비교하여, 배양 중의 T 세포에 있어서의 CD45RA+CCR7+ T 세포 집단 및 CD45RA+CD62L+ T 세포 집단이 높은 결과를 얻을 수 있었다. 이상으로부터, GT-T503 배지에 IL-2, IL-12, IFN-γ, 항인간 IL-4 항체를 첨가한 배양에 있어서, 확대 배양 초기에 CH-296 프래그먼트를 공존시킴으로써, T 세포의 CD45RA+CCR7+ 혹은 CD45RA+CD62L+ T 세포 집단 비율을 높이면서 T 세포 집단을 확대 배양할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 13 신선 분리 PBMC 로부터 CH-296 초기 자극 후에 가스 투과성 배양 백을 사용하여 확대 배양한 세포 집단의 Allogeneic MLR
(1) 신선혈로부터의 PBMC 의 분리
사전동의 (informed consent) 가 얻어진 인간 정상인 도너로부터 50㎖ 채혈을 실시 후, 채혈액으로부터 실시예 1-(1) 과 동일한 방법으로 PBMC 를 분리하였다. 채취한 PBMC 를 트리판블루 및 터크 염색법 (터크액 나카라이테스크 제조) 에 의해 세포 수를 산출하여, 동결 보존하지 않고 그대로 각 실험에 제공하였다.
(2) 항인간 CD3 항체 CH-296 프래그먼트 고정화
실시예 6-(1) 과 동일한 방법으로 실시하였다.
(3) T 세포 집단의 확대 배양
0.5% 자기 혈장 GT-T503 에 0.5×106cells/㎖ 가 되도록 실시예 13-(1) 에서 조제한 PBMC 를 현탁하고 세포액을 조제 후, 실시예 13-(2) 에서 조제한 항인간 CD3 항체 고정화 플라스크, 또는 항인간 CD3 항체 및 CH-296 고정화 플라스크에 0.5% GT-T503 을 21㎖/플라스크 첨가해 두고, 상기 세포액을 9㎖/플라스크씩 첨가하였다. 최종 농도 1000U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가하고, 이들 플라스크를 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다 (배양 0일째). 배양 개시 4일째에, 각 군의 배양액 중 21㎖ 및 0.5% 자기 혈장 GT-T503 279㎖ 를 아무것도 고정화시키지 않은 가스 투과성 배양 백 (300㎠, 다카라 바이오사 제조, 상품 코드 KB610) 에 새로 옮겼다. 추가로 최종 농도 500U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양을 계속하고, 8일째에는 각 군의 배양액 150㎖ 를 제거, 150㎖ 를 백 내에 남기고, 0.5% 자기 혈장 GT-T503 을 사용하여 2 배 희석하고, 백 중의 세포 희석액을 300㎖ 로 하였다. 모두 최종 농도 500U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 후 11일째에는, 0.2% HSA 를 함유하는 GT-T503 배지를 300㎖ 첨가하고, 각 군의 세포 배양액을 2 배 희석하였다. 추가로, 각 군에 있어서 최종 농도 500U/㎖ 가 되도록 IL-2 를 첨가하였다. 배양 개시 후 14일째에 트리판블루 염색법으로 생세포 수를 계측하고, 배양 개시시의 세포 수와 비교하여 확대 배양률을 산출하였다. 이 결과를 표 33 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00030
표 33 에 나타내는 바와 같이, 가스 투과성 배양 백을 사용한 배양시에도, T 세포 집단 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 군(이하, CH-296 군) 에 있어서는, 대조군과 비교하여 T 세포 집단의 확대 배양률이 높았다.
(4) 가스 투과성 배양 백에서 배양한 T 세포 집단에 있어서의 CD45RA+CCR7+, CD45RA+CD62L+, CD45RA+CD27+, CD45RA+CD28+, CD27+CD28+, CD45RA+CCR7+CD62L+ T 세포의 해석
실시예 13-(3) 에서 조제한 세포를 실시예 6-(3) 과 동일한 방법에 의해 각 항체로 염색하여 해석을 실시하였다. 결과를 표 34 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00031
표 34 에 나타내는 바와 같이, CH-296 군에 있어서는 대조군과 비교하여, 어느 세포 표면 마커에 있어서도 높은 값을 나타내었다.
(5) 배양 세포의 보존
실시예 13-(3) 에서 조제한 배양 14일째의 세포는 실시예 5-(4) 와 동일한 방법으로 동결 보존·융해하여, 각 실험에 제공하였다.
(6) Allogeneic MLR
실시예 13-(5) 에서 조제한 세포를 사용하여 Allogeneic MLR 을 실시예 6-(4) 와 동일한 방법으로 실시하였다. 단, 이하의 점에 대해 변경을 실시하였다. Stimulator cell 및 Responder cell 의 세포 농도를 1 또는 2×106cells/㎖ 가 되도록 조제한 점 및 배양 5일째에 각 웰 내의 세포를 현탁 후, 반량씩 2 웰로 나누어, 1000U/㎖ 의 IL-2 를 함유하는 5HRPMI 1㎖ 를 각 웰에 첨가하고, 7일째까지 배양을 계속한 점.
(7) 확대 배양률의 측정
실시예 13-(6) 에서 얻어진 세포에 대해 배양 개시 후 7일째에 트리판블루 염색법으로 생세포 수를 계측하고, 배양 개시시의 세포 수와 비교하여 확대 배양률을 산출하였다. 결과를 표 35 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00032
표 35 에 나타내는 바와 같이, CH-296 군을 사용하여 Allogeneic MLR 을 실시한 경우에는, 대조군과 비교하여 반응 후의 확대 배양률이 높았다. 즉, T 세포 집단 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 배양 세포를 사용하여 Allogeneic MLR 을 실시하면, 보다 많은 알로 항원 인식 세포가 증식하는 것이 분명해졌다.
(8) 세포 상해 활성의 측정
실시예 13-(6) 에서 조제한 유도 개시 후 7일째의 세포의 세포 상해 활성은, 실시예 6-(6) 과 동일한 방법으로 실시하였다. 단, 이 때의 표적 세포로서 PHA 로 7일간 유약화 (블라스트) 시킨 자기 PBMC 또는 비자기 PBMC 를 카르세인 표지 표적 세포로 하였다. 세포 상해 활성 측정시에는 30 배량의 K562 세포와 카르세인 표지 표적 세포를 혼합하였다. E/T 비를 90∼3 으로 설정하였다. 세포 상해 활성 측정의 결과를 표 36 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00033
표 36 에 나타내는 바와 같이, CH-296 군으로부터 Allogeneic MLR 을 실시한 경우에는, 대조군과 비교하여 반응 후의 알로 항원 특이적 세포 상해 활성이 높았다.
즉, T 세포 집단 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 배양 세포에 있어서는, Allogeneic MLR 에 의해 알로 항원 특이적 세포 상해 활성이 보다 강한 세포 집단이 얻어지는 것이 분명해졌다.
실시예 14 CH-296 의 초기 자극시 및 그 후의 배양시에 가스 투과성 배양 백을 사용하여 확대 배양한 세포 집단의 Allogeneic MLR 및 항MART-1 CTL 의 유도
(1) 항인간 CD3 항체 및 CH-296 프래그먼트 고정화
이하의 실험에서 사용하는 배양 기재에 항인간 CD3 항체 및 CH-296 을 고정화하였다. 즉, 가스 투과성 배양 백 (배양 면적 75㎠, 다카라 바이오사 제조, 상품 코드 KB620) 에 항인간 CD3 항체 (최종 농도 5㎍/㎖) 를 함유하는 PBS 를 9㎖ 씩 첨가하였다. 이 때, CH-296 첨가군에는 항인간 CD3 항체 (최종 농도 5㎍/㎖) 및 CH-296 을 최종 농도 (25㎍/㎖) 를 함유하는 PBS 를 동량 첨가하였다.
이들 배양 기재를 실온에서 5시간 인큐베이트 후, 사용시까지 실온에 보존하였다. 사용 직전에는 이들 배양 기재로부터 항체·CH-296 을 함유하는 PBS 를 실린지로 제거 후, 각 백을 PBS 로 2 회, RPMI 배지로 1 회 세정하여 각 실험에 제공하였다.
(2) T 세포 집단의 확대 배양
CH-296 자극시의 배양 기재로서, 배양 플라스크가 아니라 실시예 14-(1) 에서 조제한 백을 사용한 것 이외에는, 실시예 13-(3) 과 동일한 방법으로 실시하였다. 배양 개시 후 14일째의 결과를 표 37 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00034
표 37 에 나타내는 바와 같이, CH-296 에서의 초기 자극시 및 그 후의 배양시에 가스 투과성 배양 백을 사용한 배양시에도, T 세포 집단 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 군 (이하, CH-296 군) 에 있어서는, 대조군과 비교하여 T 세포 집단의 확대 배양률이 높았다.
(3) CH-296 에서의 초기 자극시 및 그 후의 배양시에 가스 투과성 배양 백에서 배양한 T 세포 집단에 있어서의 CD45RA+CCR7+, CD45RA+CD62L+, CD45RA+CD27+, CD45RA+CD28+, CD27+CD28+, CD45RA+CCR7+CD62L+ T 세포의 해석
실시예 14-(2) 에서 조제한 세포를 실시예 6-(3) 과 동일한 방법에 의해 각 항체로 염색하여 해석을 실시하였다. 결과를 표 38 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00035
표 38 에 나타내는 바와 같이, CH-296 군에 있어서는 대조군과 비교하여, 어느 세포 표면 마커에 있어서도 높은 값을 나타내었다.
(4) Allogeneic MLR
실시예 14-(2) 에서 조제한 세포를 사용하여 실시예 6-(4) 와 동일한 방법으로 Allogeneic MLR 을 실시하였다.
(5) 세포 상해 활성의 측정
실시예 14-(4) 에서 조제한 유도 개시 후 10일째의 세포의 세포 상해 활성은, E/T 비 90 을 새롭게 설정한 것 이외에는, 실시예 6-(6) 과 동일한 방법으로 실시하였다. 세포 상해 활성 측정의 결과를 표 39 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00036
표 39 에 나타내는 바와 같이, CH-296 군으로부터 Allogeneic MLR 을 실시한 경우에는, 대조군과 비교하여 반응 후의 알로 항원 특이적 세포 상해 활성이 높았다. 즉, T 세포 집단 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 배양 세포에 있어서는, Allogeneic MLR 에 의해 알로 항원 특이적 세포 상해 활성이 보다 강한 세포 집단이 얻어지는 것이 분명해졌다.
(6) 배양 세포의 보존
실시예 14-(2) 에서 조제한 배양 14일째의 세포는 실시예 5-(4) 와 동일한 방법으로 동결 보존·융해하여, 각 실험에 제공하였다.
(7) 항종양 관련 항원 (MART-1) 특이적 CTL 의 유도
실시예 1-(1) 및 14-(6) 에서 조제한 세포를 사용하고, 실시예 5-(5) 와 동일한 방법으로 항종양 관련 항원 (MART-1) 특이적 CTL 의 유도를 실시하여, 14일간 배양 계속하였다. 단, 이하의 점에 대해 변경을 실시하였다. Responder cell 를 1×106cells/㎖ 가 되도록 5HRPMI 에 현탁하고, 24 웰 세포 배양 플레이트에 0.5㎖/웰씩 첨가한 점, 배양 개시 3일째에 배양 상청을 절반 제거 후, 60U/㎖ 의 IL-2 를 함유하는 5HRPMI 1㎖ 를 각 웰에 첨가한 점, 1 주일 후에 배양 세포를 1.5∼3.0×106cells/㎖ 로, 항원 제시 세포를 1.0×106cells/㎖ 로 조정하고, 0.5㎖/well 씩 첨가한 점, 배양 개시 10일째에 배양 상청을 절반 제거 후, 60U/㎖ 의 IL-2 를 함유하는 5HRPMI 1㎖ 를 각 웰에 첨가한 점.
(8) 세포 상해 활성의 측정
실시예 14-(7) 에서 조제한 유도 개시 후 14일째의 CTL 의 세포 상해 활성의 측정은, 실시예 6-(9) 와 동일한 방법으로 실시하였다. 세포 상해 활성 측정의 결과를 표 40 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00037
표 40 에 나타내는 바와 같이, CH-296 군으로부터 유도한 CTL 집단에 있어서는, 대조군 및 PBMC 군과 비교하여 CTL 집단의 특이적 세포 상해 활성이 높았다. 즉, T 세포 집단 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 배양 세포는, 특이적 세포 상해 활성이 보다 높은 CTL 집단에 유도될 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 15 CH-296 의 초기 자극시 및 그 후의 배양시에 가스 투과성 배양 백을 사용하고 확대 배양한 세포 유래 CD45RA+CCR7+CD8+ T 세포 및 CD45RA-CCR7-CD8+ T 세포로부터의 항MART-1 CTL 유도
(1) CD45RA+CCR7+CD8+ T 세포 및 CD45RA-CCR7-CD8+ T 세포의 단리
실시예 1-(1) 및 실시예 14-(6) 에서 조제한 세포를 실시예 7-(1) 과 동일한 방법에 의해 CD45RA+CCR7+CD8+ 획분 및 CD45RA-CCR7-CD8+ 획분을 각각 단리하여, 순도 93%∼99% 의 획분을 얻었다.
(2) 항종양 관련 항원 (MART-1) 특이적 CTL 의 유도
실시예 15-(1) 에서 조제한 세포를 사용하고, 실시예 14-(7) 과 동일한 방법으로 항종양 관련 항원 (MART-1) 특이적 CTL 의 유도를 실시하여, 14일간 배양 계속하였다. 단, 이하의 점에 대해 변경을 실시하였다. Responder cell 를 1×106cells/㎖ 가 되도록 5HRPMI 에 현탁하고, 48 웰 세포 배양 플레이트에 각각 0.25㎖/웰씩 첨가한 점, 배양 개시 1일째에 60U/㎖ 의 IL-2 를 함유하는 5HRPMI 0.5㎖ 를 각 웰에 첨가한 점, 배양 개시 3일째에 배양 상청을 절반 제거 후, 60U/㎖의 IL-2 를 함유하는 5HRPMI 0.5㎖ 를 각 웰에 첨가한 점, 및 1 주일 후에 배양 세포를 0.2∼1.7×106cells/㎖ 로, 항원 제시 세포를 1.0×106cells/㎖ 로 조정하고, 24 웰 세포 배양 플레이트에 각각 0.5㎖/well 씩 첨가한 점, 배양 개시 10일째에 배양 상청을 절반 제거 후, 60U/㎖ 의 IL-2 를 함유하는 5HRPMI 1㎖ 를 각 웰에 첨가한 점.
(3) 확대 배양률의 측정
실시예 15-(2) 에서 얻어진 세포에 대해 배양 개시 후 14일째에 트리판블루 염색법으로 생세포 수를 계측하고, 배양 개시시의 세포 수와 비교하여 확대 배양률을 산출하였다. 결과를 표 41 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00038
표 41 에 나타내는 바와 같이, T 세포 집단 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 배양 세포 (이하 CH-296 군) 로부터 단리한 CD45RA+CCR7+CD8+ T 세포를 사용하여 유도한 CTL 집단에 있어서는, 대조군과 비교하여 CTL 집단의 확대 배양률이 높았다. 즉, T 세포 집단 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 배양 세포에 고비율로 함유되는 CD45RA+CCR7+ T 세포로부터 CTL 유도를 실시함으로써 보다 많은 CTL 집단이 얻어지는 것이 분명해졌다.
(4) 세포 상해 활성의 측정
실시예 15-(2) 에서 조제한 유도 개시 후 14일째의 CTL 의 세포 상해 활성은, E/T 비를 30∼3 으로 설정한 것 이외에는 실시예 6-(9) 와 동일한 방법으로 실시하였다. 세포 상해 활성 측정의 결과를 표 42 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00039
표 42 에 나타내는 바와 같이, CH-296 군으로부터 단리된 CD45RA+CCR7+CD8+ T 세포를 사용하여 유도한 CTL 집단에 있어서는, 대조군 및 PBMC군과 비교하여 CTL 집단의 특이적 세포 상해 활성이 높았다. 또한, CD45RA-CCR7-CD8+ T 세포를 사용하여 유도한 CTL 집단과 비교하여도, 특이적 세포 상해 활성이 높았다. 즉, T 세포 집단 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 배양 세포에 고율로 함유되는 CD45RA+CCR7+ T 세포는, 특이적 세포 상해 활성이 보다 높은 CTL 집단에 유도될 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 16 CTL 의 항원 인식능 측정
(1) 항종양 관련 항원 (MART-1) 특이적 CTL 의 유도
실시예 1-(1) 및 14-(6) 에서 조제한 세포를 사용하고, 실시예 14-(7) 과 동일한 방법으로 항종양 관련 항원 (MART-1) 특이적 CTL 의 유도를 실시하여, 15일간 배양 계속하였다.
(2) 항원 인식능의 측정
실시예 16-(1) 에서 조제한 유도 개시 후 15일째의 CTL 의 항원 인식능은, 실시예 8-(2) 와 동일한 방법으로 측정하였다. 항원 인식능 측정의 결과를 표 43 에 나타낸다. 항원 인식능은 표적 세포에 부가한 펩티드 농도가 10μM 일 때의 세포 상해 활성을 100 으로 했을 경우의, 각 부가 펩티드 농도에 있어서의 세포 상해 활성의 상대치로서 표기하였다.
Figure 112008030960796-PCT00040
표 43 에 나타내는 바와 같이, CH-296 군으로부터 유도한 CTL 집단에 있어서는, 대조군 및 PBMC 군과 비교하여 보다 저농도인 항원 펩티드가 부가된 표적 세포까지도 살상되었고, CTL 집단의 특이적 항원 인식 능력이 높았다. 즉, T 세포 집단 확대 배양 초기에 CH-296 을 고정화시킨 배양 기재를 사용한 배양 세포는, 보다 특이적 항원 인식 능력이 높은 CTL 집단에 유도될 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 17 CH-296 의 초기 자극시 및 그 후의 배양시에 가스 투과성 배양 백을 사용하여 확대 배양한 세포 유래 CD45RA+CCR7+ T 세포의 사이토카인 산생성의 평가
(1) CD45RA+CCR7+ T 세포와 CD45RA-CCR7- T 세포의 단리
실시예 14-(6) 에서 조제한 세포를 실시예 3-(3) 과 동일한 방법으로 염색 및 소팅을 하였다.
(2) 항인간 CD3 항체 및 항인간 CD28 항체의 고정화와 세포의 자극
단리된 세포를 자극하기 위해서 실시예 3-(4) 의 방법과 동일하게 배양 플레이트에 항인간 CD3 항체 및 항인간 CD28 항체의 고정화를 실시하였다. 실시예 17-(1) 에서 얻어진 각 세포 집단을 0.5% GT-T503 에 현탁하고, 조제한 플레이트에 2×105cells/0.2㎖ 가 되도록 세포를 각 웰에 첨가하여, 5% CO2 중 37℃ 에서 배양하였다. 24시간 후 배양 상청을 회수하고, ELISA 법에 의한 사이토카인 측정 실험에 제공하였다.
(3) ELISA 법에 의한 IL-2 산생의 측정
임상에서의 림프구 확대 배양에는 폐쇄계에서 배양할 수 있는 가스 투과성 배양 백이 사용되고 있다. 실시예 14 에 있어서 백을 사용하여 확대 배양했을 때에도, CH-296 군에 있어서는, 대조군과 비교하여 CD45RA+CCR7+ T 세포 집단 비율이 높은 결과가 얻어졌다. 이 CD45RA+CCR7+ T 세포 집단이 나이브 T 모양 세포로서의 성질을 유지하고 있는지를 확인하기 위해서, 실시예 3-(6) 와 마찬가지로 CD45RA+CCR7+ T 세포와 CD45RA-CCR7- T 세포의 IL-2 산생성을 평가하였다. 결과를 표 44 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00041
표 44 에 나타내는 바와 같이, CD8+ T 세포 및 CD8- T 세포 모두, CD45RA+CCR7+ T 세포에서의 IL-2 산생이 우위였다. 이미 실시예 3-(6) 에서도 나타내어진 바와 같이, 본 실시예에 있어서도, CH-296 을 사용하여 백 배양한 동결 세포의 CD45RA+CCR7+ T 세포 집단은 나이브 T 모양 세포로서의 성질을 갖는 것이 나타났다.
실시예 18 H-296, CH-271, H-271, C-CS1 를 사용하여 확대 배양한 T 세포 집단 중의 CD45RA+CCR7+ T 세포의 해석
(1) 항인간 CD3 항체 및 H-296, CH-271, H-271, C-CS1 프래그먼트 고정화
실시예 4-(1) 과 동일한 방법으로 실시하였다. 단, CH-296 프래그먼트는 사용하지 않고, 프래그먼트 첨가군에는 대신에 H-296, CH-271, H-271, C-CS1 의 각 프래그먼트를 최종 농도 (25㎍/㎖) 가 되도록 첨가하였다.
(2) T 세포 집단의 확대 배양
배양 개시 4일째에, 약 14 배가 되도록 희석하고, 희석액 10㎖ 를 25㎠ 세포 배양 플라스크 (코닝사 제조) 를 세운 것에 옮긴 것, 7일째의 계대 조작을 실시하지 않은 것 이외에는 실시예 3-(1) 에 준하여 실시하고, 9일간 배양 계속 하였다. 배양 개시 8일째의 확대 배양률의 결과를 표 45 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00042
표 45 에 나타내는 바와 같이, T 세포 집단 확대 배양 초기에 H-296, CH-271, H-271, C-CS1 를 고정화시킨 배양 기재를 사용한 군 (이하 프래그먼트군) 에 있어서는, 대조군과 비교하여 T 세포 집단의 확대 배양률이 높았다.
(3) CD45RA+CCR7+ T 세포의 해석
실시예 18-(2) 에서 조제한 세포를 실시예 3-(2) 와 동일한 방법으로, 배양 개시 9 일째의 CD45RA+CCR7+ T 세포의 비율을 산출하였다. 결과를 표 46 에 나타낸다.
Figure 112008030960796-PCT00043
표 46 에 나타내는 바와 같이, 프래그먼트군에 있어서, 대조군과 비교하여, 배양 중의 T 세포 집단에 있어서의 CD45RA+CCR7+ T 세포 집단이 높은 결과가 얻어졌다.
본 발명에 의해, T 세포 집단의 제조 방법이 제공된다. 당해 방법은 CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포를 고비율로 함유하는 T 세포 집단으로 하여, 예를 들어, 면역 요법에 바람직하게 사용된다. 따라서, 본 발명의 방법은, 의료 분야에 대한 다대한 공헌이 기대된다.
도 1 은 피브로넥틴의 도메인 구조를 나타내는 모식도이다.
도 2 는 T 세포 투여에 의한 마우스의 종양 형성 억제 작용을 나타내는 도면이다.
[서열목록 프리텍스트]
Figure 112008030960796-PCT00044
SEQUENCE LISTING <110> TAKARA BIO INC. <120> Method for Production of T cell Population <130> 06-040-PCTJP/TW <150> JP 2005-288983 <151> 2005-09-30 <150> JP 2006-102103 <151> 2006-04-03 <150> JP 2006-196950 <151> 2006-07-19 <150> JP 2006-241773 <151> 2006-09-06 <160> 23 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> partial region of fibronectin named III-8 <400> 1 Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg Val 1 5 10 15 Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu Val Arg 20 25 30 Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu Ser Ile Ser 35 40 45 Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu Pro Gly Thr Glu 50 55 60 Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln His Glu Ser Thr Pro 65 70 75 80 Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr 85 <210> 2 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> partial region of fibronectin named III-9 <400> 2 Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn 1 5 10 15 Ser Phe Thr Val 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Claims (22)

  1. T 세포를 함유하는 세포 집단을 피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 존재하에서 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    배양하는 공정을 포함하는 총 배양 일수가 4∼14일간인 제조 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 존재하에서의 배양이 적어도 배양 개시시에 실시되는 제조 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 존재하에서의 배양이 적어도 1일 이상 실시되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    피브로넥틴, 그 프래그먼트 또는 그들 혼합물의 존재하에서 배양하는 공정이 CD3 리간드의 존재하에서 실시되는 제조 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    CD3 리간드가 항CD3 항체인 제조 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    피브로넥틴의 프래그먼트가, 서열목록의 배열 번호 1∼8 로 표시되는 아미노산 배열을 적어도 하나 함유하여 이루어지는 폴리펩티드 (m) 이거나, 또는 상기 어느 하나의 아미노산 배열에 있어서 하나 혹은 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 혹은 부가된 아미노산 배열을 적어도 하나 함유하여 이루어지는 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드 (m) 와 동등한 기능을 갖는 폴리펩티드 (n) 인 제조 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    피브로넥틴의 프래그먼트가, 서열목록의 배열 번호 1∼3 및 5∼8 로 표시되는 아미노산 배열 모두를 함유하는 폴리펩티드인 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가로 CD45RA, CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 세포 집단을 분리하는 공정을 포함하는 제조 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가로 세포 집단에 외래 유전자를 도입하는 공정을 포함하는 제조 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    외래 유전자를 레트로 바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터 또는 시미안 바이러스 벡터를 사용하여 도입하는 제조 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단.
  13. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단을 유효 성분으로서 함유하는 의약.
  14. 피험체에, 유효량의 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단을 투여하는 공정을 포함하는 질환의 치료 방법 또는 예방 방법.
  15. 의약의 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단의 사용.
  16. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단에 대해, 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포, 항원이 제시된 세포, 항원, CD3 리간드, CD28 리간드, 사이토카인, 케모카인 및 사이토카인을 산생하는 능력을 갖는 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 자극 인자에 의해 자극을 부여하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 T 세포 집단의 제조 방법.
  17. 제 16 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 T 세포 집단.
  18. 제 16 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 T 세포 집단을 유효 성분으로서 함유하는 의약.
  19. 피험체에, 유효량의 제 16 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 T 세포 집단을 투여하는 공정을 포함하는 질환의 치료 방법 또는 예방 방법.
  20. 의약 제조를 위한, 제 16 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 T 세포 집단의 사용.
  21. (a) 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단을 유효 성분으로서 함유하는 제제, 및
    (b) 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포, 항원이 제시된 세포, 항원, CD3 리간드, CD28 리간드, 사이토카인, 케모카인 및 사이토카인을 산생하는 능력을 갖는 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 자극 인자를 유효 성분으로서 함유하는 제제를 포함하는 의약으로서, 당해 제제는 동시에 또는 각각 투여되는 2 개의 각각의 제제로서 함유되는 의약.
  22. 하기 (a) 및 (b) 의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 질환의 치료 방법,
    (a) 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는, CD45RA 를 발현하고, 또한 CD62L, CCR7, CD27 및 CD28 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 발현하는 T 세포 집단을 환자에게 투여하는 공정,
    (b) 항원을 제시할 수 있는 능력을 갖는 세포, 항원이 제시된 세포, 항원, CD3 리간드, CD28 리간드, 사이토카인, 케모카인 및 사이토카인을 산생하는 능력을 갖는 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 자극 인자를 환자에게 투여하는 공정.
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